KR101635042B1 - 배아배양 조성물 - Google Patents

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Abstract

배아배양에 적합한 조성을 포함하는 배아배양용 조성물을 제공한다. (a) 이하의 테이블A의 조성을 포함하는 배아배양용 조성물을 제공한다.

Description

배아배양 조성물{COMPOSITION FOR EMBRYO CULTURE}
본 발명은 배양용 조성물에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 배아배양용 조성물에 관한 것이다.
체외수정, 배아배양 및 배아이식 등은 경제가치가 높은 동물의 개량 및 생산, 및 재생의료, 생식의료 등 폭넓은 분야에서 중요한 기술이다. 체외수정 및 배아배양에서는 생체외에서 배우자 또는 배아를 취급하게 된다. 현재까지 다양한 배아배양용 배지, 예를 들면 배아발생 중의 주변체액 환경의 변화를 모방한 순차 배양배지, 혈청이 첨가된 혈청배지 및 취급이 용이한 무혈청의 단일배지가 개발되어 왔다. 단일배지라면, 순차 배양배지와 같이 배아의 발생단계에 맞춘 배지교환의 필요가 없다. 무혈청배지라면, 혈청배지와 같이 생체유래 산물이기 때문에 품질의 불균일이나 바이러스 오염 등의 위험성을 저감할 수 있다.
무혈청 단일배지의 하나로 KSOM 배지가 알려져 있다(비특허문헌 1 및 2). KSOM 배지에서 배양된 배아는 KSOM의 등장이전의 배지에서 배양된 배아와 비교해서, 배반포의 세포수가 증가했지만(비특허문헌 3), 생체내에서 발생한 배반포의 세포수에는 미치지 못하고 있었다(비특허문헌 4 및 5).
아미노산은 생합성의 전구체, 에너지원, 유기성 삼투압 조절물질, 세포내 pH완충물질, 항산화 물질, 킬레이트 물질 등의 작용이 있고, 아미노산의 배아배양용 배지로의 첨가는 배아발생에 유효하게 작용하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 6). KSOM 배지는 개발 당초, 아미노산으로서 글루타민만을 포함하는 배지이었지만, KSOM 배지에 20종류의 아미노산을 첨가함으로써, 배반포 도달율, 해칭율, 및 배반포의 세포수가 향상하는 것이 밝혀졌다(비특허문헌 7).
인간 착상전 배아의 배양용의 배지를 개발하는데 있어서, 마우스 배아를 사용한 연구가 추천되고 있다(비특허문헌 8 및 9). KSOM 배지 또는 20종류의 아미노산을 첨가한 KSOMaa 배지는 마우스 배아를 사용해서 연구되었지만(비특허문헌 4 및 7), 인간의 배아뿐만 아니라, 소, 토끼, 붉은털 원숭이, 돼지, 랫트 등 다양한 동물배아의 배양에 적합하다는 것이 확인되고 있어, 현재 널리 사용되고 있다.
Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104(36): 14289-14293. 마우스 배아의 조작 매뉴얼 제3판 2005; 149-193. Fertil Steril 2006; 86: 1252-1265. Biol Reprod 1994; 50: 1027-1033. Reproduction 2009; 137: 271-283. Semin Reprod Med 2000; 18(2): 205-218. Mol Reprod Dev 1995; 41(2): 232-238. Human Reproduction 1998; 13(4): 173-183. Human Reproduction Update 2003; 9(6): 557-582.
배양용 배지 중의 각 성분의 효과는 다른 성분의 농도에 의존하기 때문에 (비특허문헌 9), 20종류의 아미노산을 각각 조합해서 배아발생에 적합한 농도로 설정하기 위해서는, 방대한 수의 검토가 필요하다. 부가해서, 착상전기배아의 연구에 있어서는, 그 샘플의 희소성 때문에, 그러한 대규모의 해석은 곤란했다. 이 때문에, KSOMaa 배지를 비롯해서, 배아배양용 배지에 첨가되고 있는 아미노산 농도는 그 대부분이 체세포의 증식능을 지표로 결정된 농도이고, 배아발생에 최적화되어 있지 않다.
예를 들면, KSOMaa 배지에 첨가되고 있는 아미노산 농도는 Eagle들이 체세포의 영양 요구성을 지표로 정한 특정농도의 필수 아미노산 그룹에 속하는 13종류(Science 1959; 130, 432-437)와 기타의 비필수 아미노산 그룹에 속하는 7종류를, 각각 1/2의 농도로 설정하고 있을 뿐이다. 또, 인간 배아배양용으로 개발된 배양액 G1 또는 G2에 있어서도, 첨가되고 있는 아미노산 농도는 Eagle이 체세포의 영양 요구성을 지표로 정한 농도가 그대로 사용되고 있다.
그 때문에 생체 외에서의 배아배양에 적합한 아미노산 농도를 가지는 배양용 배지의 개발이 여전히 소망되고 있다.
본 발명자들은 이러한 요망을 감안하고, 예의 연구를 거듭한 결과, 배아배양에 적합한 아미노산 농도를 발견했다.
본 발명의 형태는 이하의 테이블A의 조성을 포함하는 배아배양용 조성물을 제공한다.
Figure 112014007250733-pct00001
본 발명의 하나의 실시형태는 상기의 테이블 A의 조성에, 전해질, 유기산, 당질, pH지시약, pH조정제, pH완충제, 항생물질, 비타민류, 미량 금속원소, 킬레이트제, 호르몬, 세포성장인자, 지질 또는 그 구성성분, 담체 단백질, 세포외 기질성분, 환원 물질, 및 폴리머로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 성분을 추가로 포함하는 배아배양용 조성물을 제공한다.
본 발명의 하나의 실시형태는 상기의 테이블 A의 조성 및 전해질을 포함하는 배아배양용 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 실시예는, 상기의 테이블 A의 조성, 전해질, 및 유기산 및/또는 당질을 포함하는 배아배양용 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 실시형태는 상기의 테이블 A의 조성, 전해질, 및 유기산 및/또는 당질을 포함하고, 추가로 pH지시약, pH조정제, pH완충제, 항생물질, 비타민류, 미량 금속원소, 킬레이트제, 호르몬, 세포성장인자, 지질 또는 그 구성성분, 담체 단백질, 세포외 기질성분, 환원 물질, 및 폴리머로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함하는 배아배양용 조성물도 또 제공한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 「배아배양용 조성물」은 배우자 또는 배아를 취급하기 위한 조성물을 의미한다. 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 배아배양용 조성물은 수정란 또는 난할구를 배반포까지, 혹은 배반포가 해칭될 때까지 배양할 수 있다. 「배반포까지 배양할 수 있다」는 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 수정란 또는 난할구를 2∼8세포기 배아 또는 상실배까지 배양하는 것을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시형태에 따른 배아배양용 조성물은 정자 또는 난세포의 채취, 성숙, 유지 또는 세정에, 혹은 난세포를 체외에서 수정시킬 때에 사용할 수도 있다. 본 발명의 하나의 실시형태에 따른 배아배양용 조성물은 한정하는 것은 아니지만, 배아배양의 사이에, 신선한 본 발명의 실시형태에 따른 배아배양용 조성물로 교환할 수 있다.
「배우자」는 정자 또는 난자를 의미한다. 본 명세서에 있어서 「배아」는 수정란, 초기 배아 및 핵이식 배아 등의 재구축 배아를 포함하며, 한정하는 것은 아니지만, 인간, 마우스, 소, 토끼, 붉은털 원숭이, 돼지, 랫트 등의 포유동물에 유래하는 배아를 포함한다. 「포유동물」은 한정하는 것은 아니지만, 인간, 마우스, 소, 토끼, 붉은털 원숭이, 돼지 또는 랫트일 수 있다.
배반포는 포유동물의 초기발생에 있어서 난할기가 끝난 배아를 나타낸다. 배반포는 투명대(수정막)에 둘러싸여진 내부 세포괴, 포배강 및 영양외배엽으로 이루어진다. 배반포의 해칭은 배아가 투명대를 탈출하는 과정을 나타내며, 배아가 착상에 이르기 위해서 필수적인 과정이다.
배아의 구조나 생리기능에 이상이 있는 배양배아는 해칭이 지연되거나, 또는 해칭되지 않는 것이 알려져 있다(Reprod Biomed Online 2003; 7: 228-234). 한편, 소정의 기간 내에 해칭된 배반포는 소정기간 내에 해칭되지 않는 배반포와 비교해서, 착상율이 높은 것(Fertil Steril 2000; 74: 163-165) 등이 알려져 있다.
배반포의 세포수, 태아 발생율과 양으로 상관하는 것(J Reprod Fertil 1997; 109: 153-164), 및 염색체의 정상율과 양으로 상관하는 것이 알려져 있다(Hum Reprod; 2010: 1916-1926).
배양배아의 품질의 평가방법으로서는 현미경을 사용해서 배아의 형태학적 특징, 예를 들면 발생 속도, 배반포 도달율, 투명대로부터의 탈출율(해칭율) 등을 평가하는 방법이나, 핵염색을 사용해서 배반포의 세포수를 계측하는 평가방법 등이 있다.
이들 평가방법 중, 해칭에 의거하는 평가방법은 양질의 배양배아를 선발하기 위한 호적한 평가방법의 하나이다. 배반포의 세포수도 또한, 배양배아의 품질을 평가하는 중요한 평가방법의 하나이다.
본 발명의 하나의 실시형태에 따른 배아배양용 조성물이 함유하는 아미노산은 유리형 또는 약리학적으로 허용되는 염의 형태일 수 있다. 본 발명의 다른 실시형태에 따른 배아배양용 조성물이 함유하는 아미노산은 가수분해 등에 의해 분해되어 유리아미노산으로 변환될 수 있는 것일 수도 있다. 그러한 아미노산은 예를 들면, 에스테르체, N-아실체, 올리고펩티드 등일 수도 있다.
예를 들면, 글루타민은 글리실-L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-류실-L-글루타민, L-발릴-L-글루타민, 또는 L-이소류실-L-글루타민 등의 글루타민 유도체일 수도 있다. 이것들의 글루타민 유도체는 1종 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 조합해서 사용할 수도 있다. 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 글루타민 유도체는 예를 들면, 글리실-L-글루타민 또는 L-알라닐-L-글루타민이다. 본 발명의 다른 실시예에 있어서, 글루타민 유도체는 글리실-L-글루타민이다. 본 발명의 다른 실시예에 있어서, 글루타민 유도체는 L-알라닐-L-글루타민이다.
별도로는, 예를 들면, 시스틴은 그 일부 또는 전부가 시스테인일 수도 있다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 배아배양용 조성물이 함유하는 타우린은 유리형 또는 약리학적으로 허용되는 염의 형태일 수 있다. 본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 배아배양용 조성물이 함유하는 타우린은 탈수소반응 등에 의해 타우린으로 변환될 수 있는 것 일 수도 있다. 예를 들면, 그러한 타우린은 하이포타우린일 수도 있다.
발명의 하나의 실시형태에 따른 배아배양용 조성물은 필요에 따라, 전해질, 유기산, 당질, pH지시약, pH조정제, pH완충제, 항생물질, 비타민류, 미량 금속원소, 킬레이트제, 호르몬, 세포성장인자, 지질 또는 그 구성 성분, 담체 단백질, 세포외 기질성분, 환원 물질, 및 폴리머 등으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함할 수도 있다.
전해질로서는 한정하는 것은 아니지만, 염화나트륨, 염화칼륨, 인산 2수소 나트륨, 염화칼슘 2수화물, 황산마그네슘 7수화물, 탄산수소나트륨, 염화칼슘, 글루콘산 칼슘, 염화마그네슘, 황산마그네슘, 및 인산수소 2칼륨 등을 들 수 있다. 이것들의 전해질은 1종 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 조합해서 사용할 수도 있다.
유기산으로서는 한정하는 것은 아니지만, 피루브산, 아세트산, 시트르산, 숙신산, 말릭산, α-케토글루탈산, 푸마르산, 옥살로아세트산, 이소시트르산, 옥살로숙신산, 타르타르산, 아디프산, 락트산 및 이것들의 염을 들 수 있다. 이것들의 유기산은, 1종 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 조합해서 사용할 수도 있다.
당질로서는 한정하는 것은 아니지만, 글루코스, 말토오스, 프룩토오스, 크실리톨, 소르비톨 및 트레할로오스 등을 들 수 있다. 이것들의 당질은, 1종 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 조합해서 사용할 수도 있다.
pH 지시약으로서는 한정하는 것은 아니지만, 페놀레드 등을 들 수 있다.
pH 조정제로서는 한정하는 것은 아니지만, 염산, 아세트산, 수산화 나트륨 등을 들 수 있다.
pH 완충제로서는 한정하는 것은 아니지만, HEPES(N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산), MOPS(3-모폴리노프로판설폰산), 트리스[하이드록시메틸]아미노메탄, N-트리스[하이드록시메틸]메틸-2-아미노에탄설폰산 등을 들 수 있다. 이것들의 pH완충제는 1종 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 조합해서 사용할 수도 있다.
항생물질로서는 한정하는 것은 아니지만, 페니실린, 스트렙토마이신, 카나마이신, 겐타마이신, 에리트로마이신, 안호테리신B, 나이스타틴 등을 들 수 있다. 이것들의 항생물질은 1종 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 조합해서 사용할 수도 있다.
비타민류로서는 한정하는 것은 아니지만, 비타민A, 비타민B군, 비타민C, 비타민D군, 비타민E, 니코틴산, 비오틴, 엽산 등을 들 수 있다. 이것들의 비타민류는 1종 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 조합해서 사용할 수도 있다.
미량 금속원소로서는 한정하는 것은 아니지만, 아연, 철, 망간, 구리, 요오드, 셀렌, 코발트를 들 수 있다. 이것들의 미량 금속원소는 한정하는 것은 아니지만, 유리형으로 사용해도 되는 하고, 또는 이것들의 미량 금속원소를 함유하는 약리학적으로 허용되는 화합물로서 사용할 수도 있다. 이것들의 미량 금속원소는 1종 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 조합해서 사용할 수도 있다.
킬레이트제로서는 한정하는 것은 아니지만, EGTA(에틸렌글리콜비스 4초산), EDTA(에틸렌디아민 4초산), EDDA(에틸렌디아민 2초산), 및 DTPA(디에틸렌트리아민 5초산)등을 들 수 있다.　이것들의 킬레이트제는 1종　단독으로 사용할 수도 있고, 2종　이상을 조합해서 사용할 수도 있다.
호르몬으로서는 한정하는 것은 아니지만, 인슐린, 하이드로코르티손, 덱사메타손, 트리요오드티로닌, 고나도트로핀, 에스트로겐, 프로게스테론　등을 들 수 있다.　이것들의 호르몬은 1종　단독으로 사용할 수도 있고, 2종　이상을 조합해서 사용할 수도 있다.
세포성장인자로서는 한정하는 것은 아니지만, 표피성장인자, 섬유아 세포 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 인슐린 유사성장인자, 성장호르몬 등을 들 수 있다. 이것들의 세포성장인자는 1종 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 조합해서 사용할 수도 있다.
지질 또는 그 구성 성분으로서는 한정하는 것은 아니지만, 올레산, 리놀산, 리놀렌산, 아라키돈산, 팔미트산, 올레산, 팔미톨레산, 스테아린산, 미리스틴산　등의 지방산 및 이것들의 염, 또는 콜레스테롤, 에탄올아민, 콜린, 스핑고미에린, 카이디올리핀 등을 들 수 있다. 이것들의 지질 또는 그 구성 성분은 1종 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 조합해서 사용할 수도 있다.
담체 단백질로서는 한정하는 것은 아니지만, 알부민, 트랜스페린, 셀룰로프라스민 등을 들 수 있다. 이것들의 담체　단백질은 1종 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 조합해서 사용할 수도 있다. 알부민으로서는 한정하는 것은 아니지만, 소 혈청 알부민, 인간혈청 알부민, 재조합 소혈청 알부민, 또는 재조합 인간혈청 알부민, 또는 이것들의 혼합물일 수 있다.
세포외 기질성분으로서는 한정하는 것은 아니지만, 피브로넥틴, 콜라겐, 젤라틴, 히알루로난 등을 들 수 있다. 이것들의 세포외 기질성분은 1종 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 조합해서 사용할 수도 있다.
환원물질로서는 한정하는 것은 아니지만, 2-메르캅토에탄올, 디티오트레이톨, 환원형 글루타티온 등을 들 수 있다.이것들의 환원 물질은, 1종 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 조합해서 사용할 수도 있다.
폴리머로서는 한정하는 것은 아니지만, PVP( 폴리비닐피롤리돈), PVA(폴리비닐알코올), 덱스트란 등을 들 수 있다. 이것들의 폴리머는 1종　단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 조합해서 사용할 수도 있다.
본 발명의 실시형태에 따른 배아배양용 조성물은 통상의 방법에 의해 구성성분을 배합함으로써 제조할 수 있다. 예를 들면, 배아배양용 조성물은 통상의 방법에 의해 무균용액의 형태, 희석형의 무균농축액의 형태, 또는 용해형의 무균동결건조제의 형태로 제조 또는 공급될 수 있다.
따라서 본 발명의 실시형태에 따른 배아배양용 조성물은 무균용액의 형태, 무균농축액의 형태, 또는 무균동결건조제의 형태일 수 있다. 본 발명의 실시형태에 따른 배아배양용 조성물이 상기의 무균농축액의 형태 또는 무균동결건조제의 형태인 경우, 한정하는 것은 아니지만, 사용 전에 멸균수를 사용해서 희석 또는 용해해서, 무균용액의 형태의 배아배양용 조성물로 할 수 있다.
실시예
실시예 1
배지조성
표 2는 좌측 칼럼으로부터 배지가 함유하는 성분명, 그 분자량(M.W.) 및 함유량을, 대조구로서의 KSOMaa 배지(비교예 1)의 조성, 및 실시예 1의 배지의 조성에 대해서 나타낸다.
Figure 112014007250733-pct00002
정자의 회수
ICR계 웅성 마우스(일본SLC)를 도살 후, 정소상체미부를 절단했다. 그 정소상체미부 중앙의 정소상체관을 절개해서 수득된 정자괴(정자덩어리)를, 미네랄오일 하에 제작한 0.4% 소혈청 알부민 함유 TYH 배지 300㎕ 중에 채취했다. 채취한 정자덩어리를 37℃, 6% CO2 조건하에서 1시간, 전 배양했다.
난자의 회수
ICR계 자성 마우스(일본SLC)에, PMSG(임마 혈청성 성선자극호르몬, ASKA Pharmaceutical Co., Ltd., Cello tropine(상표))를 7.5 국제단위복강 내에 투여한 48시간 후에, hCG(인간 융모성 성선자극호르몬, ASKA Pharmaceutical Co., Ltd., GONATROPIN(상표))를 7.5 국제단위복강 내에 투여하고, 과배란을 유발시키고, hCG 투여의 15시간 후에 당해 마우스를 도살했다. 도살 후 곧 난관을 절단했다. 그 난관의 난관팽대부로부터 난자-난구세포 집합체를 미네랄오일 하에 제작한 0.4% 소혈청 알부민 함유 TYH배지 300㎕ 중에 채취했다. 채취한 난자-난구세포 집합체를 체외수정까지 37℃, 6% CO2 조건하에서 배양했다.
체외수정
채취한 난자-난구세포 집합체를 포함하는 TYH배지 중에, 전 배양한 정자를 150마리/㎕이 되도록 첨가했다. 37℃, 6% CO2의 조건하에서6시간, 체외 수정한 후, 제2극체 및 자웅전핵을 관찰할 수 있었던 난을 수정란으로 판정하고, 즉시 이하의 실험에 적용했다.
배아배양 시험
실시예 1의 배지 및 비교예 1의 배지에 대해, 60mm 직경의 배양접시에서, 0.1% 소혈청 알부민을 첨가한 각 배지의 100㎕드롭을 미네랄오일 하에 제작하고, 37℃, 5% O2, 6% CO2의 조건하에서 하룻밤 방치하고, 평형화했다.
평형화 후의 각 배지의 드롭에 수정란을 이동했다. 수정란을, 복수의 드롭 중을 이동시키는 것에 의해 세정했다. 세정한 수정란을 신선한 각 배지의 드롭에 이동하고, 37℃, 5% O2, 6% CO2의 조건하에서4일간 배양했다. 배양 4일째의 배아를 현미경으로 관찰하고, 수정란으로부터 배반포 혹은 해칭 단계에 도달한 배아의 비율을 산출했다. 수득된 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure 112014007250733-pct00003
평균값±표준오차
* 비교예 1의 배지와 비교해서 유의차 있음(p=0.0065, Wilcoxon검정)
배양 4일째에 수득된 배반포를 DAPI(4',6-Diamidine-2'-phenylindoledihydrochloride)(Roche사)를 사용해서 형광염색하고, 배반포의 세포수를 계측했다. 수득된 결과를 표 4에 나타낸다.
Figure 112014007250733-pct00004
평균값±표준오차
** 비교예 1의 배지와 비교해서 유의차 있음(p=0.0003, Wilcoxon검정)
표 3, 표 4와 같이, 비교예 1의 배지에서 배양한 그룹과 비교해서, 실시예 1의 배지에서 배양한 그룹에서는, 해칭율이 유의하게 향상하고, 또한 배반포의 세포수가 유의하게 증가했다. 이 결과는, 본 발명의 하나의 실시형태에 따른 실시예 1의 배지가, 비교예 1의 배지보다 배아발생의 촉진작용 및 질적향상을 가져올 수 있다는 점에서 우수하다는 것을 나타낸다.
실시예 2
상기 표 2의 비교예 1의 배지가 함유하는 아미노산 조성을, 표 2의 실시예 1의 배지가 함유하는 타우린을 포함하는 아미노산 조성으로 바꿔 놓은 배지(실시예 2)를 제작했다(표 5).
Figure 112014007250733-pct00005
비교예 1의 배지 및 실시예 2의 배지를 사용해서, 배아배양 시험을 실시예 1에 기재돈 배아배양 시험과 동일한 조건으로 실시했다.수득된 결과를 표 6에 나타낸다.
Figure 112014007250733-pct00006
평균값±표준오차
* 비교예 1의 배지와 비교해서 유의차 있음(p=0.0467, wilcoxon검정)
표 6과 같이, 비교예 1에서 배양한 그룹과 비교해서, 본 발명의 하나의 실시형태에 따른 실시예 2의 배지에서 배양한 그룹에서는, 배반포의 세포수가 유의하게 증가했다. 이렇게, 본발명의 실시형태에 따른 배아배양용 조성물이 함유하는 타우린을 포함하는 아미노산 조성은, 상기의 조성 이외의 배지조성에 관계없이, 배아의 발생을 촉진하는 작용을 가지고 있다.
실시예 3 및 4
표 2에 나타낸 실시예 1의 배지가 함유하는 타우린을 포함하는 아미노산 조성의 농도를, 0.7배로 한 조성을 포함하는 배지(실시예 3) 및 1.3배로 한 조성을 포함하는 배지(실시예 4)를 제작했다(표 7).
Figure 112014007250733-pct00007
표 7 중, 특별하게 기재가 없는 한, 각 성분의 농도의 단위는 mM이다.
실시예 1의 배지, 실시예 3의 배지 및 실시예 4의 배지를 사용해서, 배아배양 시험을 실시예 1에 기재된 배아배양 시험과 동일한 조건으로 실시했다. 수득된 결과를 표 8 및 표 9에 나타낸다.
Figure 112014007250733-pct00008
평균값±표준오차
각 그룹간에서 유의차 없슴(Steel-Dwass검정)
Figure 112014007250733-pct00009
평균값±표준오차
각 그룹간에서 유의차 없슴(Steel-Dwass검정)
표 8, 표 9와 같이, 실시예 1의 배지가 함유하는 타우린을 포함하는 아미노산 조성의 농도를, 0.7배로 변화시킨 조성을 포함하는 배지(실시예 3)라고 해도, 1.3배로 변화시킨 조성을 포함하는 배지(실시예 4)라고 해도, 그 유효성에 유의한 차이는 인정되지 않았다. 이것으로, 본 실시예에 따른 배아배양용 조성물인 실시예 1의 배지가 함유하는 타우린을 포함하는 아미노산 조성의 유효성은, 적어도 0.7배에서 1.3배의 농도범위에서 손상되는 경우가 없는 것이 분명하다.
실시예 5
인간 배아배양 시험
표 10은, 좌측 칼럼으로부터 배지가 함유하는 성분명, 그 분자량(M.W.)및 함유량을, 실시예 5의 배지의 조성에 대해서 나타낸다.
Figure 112014007250733-pct00010
실시예 5의 배지에 0.05% 유전자 재조합 인간 알부민을 첨가한 배지의 20㎕드롭을 35mm직경의 배양접시의 미네랄오일 하에 제작하고, 37℃, 4% O2, 6% CO2의 조건하에서 하룻밤 방치해서 평형화했다.
인간 수정란은 향후 치료에 사용하는 의사가 없고, 연구사용에 대한 동의가 수득된 동결 융해 후의 수정란을 사용했다. 동결 용해 후의 인간 수정란을 1개씩, 평형화 후의 각 배지에 이동했다. 이어서, 인간 수정란을, 복수의 드롭 중을 이동시키는 것에 의해 세정했다. 세정한 수정란을, 신선한 각 배지의 드롭에 이동하고, 37℃, 4% O2, 6% CO2의 조건하에서 5∼6일간 배양했다. 배양개시 2일째부터 연일배아를 현미경으로 관찰하고, 배아의 발생 스테이지를 관찰했다. 수득된 대표적인 결과를 표 11에 나타낸다.
Figure 112014007250733-pct00011
표 11과 같이, 본 발명의 하나의 실시형태에 따른 실시예 5의 배지가, 양호한 인간 배아의 배양배지인 것이 분명하다.

Claims (5)

  1. 배아를 배양할 수 있는 배지에 포함되어 배아의 배반포 도달률을 향상시키는 것을 특징으로 하는, 이하의 테이블A의 조성을 포함하는 배아배양용 조성물.
    Figure 112016049888097-pct00016
  2. 제 1 항에 있어서, 추가로, 전해질을 포함하는 배아배양용 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 유기산 및 당질로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 배아배양용 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, pH지시약, pH조정제, pH완충제, 항생물질, 비타민류, 미량금속원소, 킬레이트제, 호르몬, 세포성장인자, 지질 또는 그 구성성분, 담체 단백질, 세포외 기질성분, 환원 물질, 및 폴리머로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 성분을 추가로 포함하는 배아배양용 조성물.
  5. 삭제
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