CN107686828A - 一种nk细胞无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种NK细胞无血清培养基及其配制方法，该配制方法包括将脂肪酸负载到无脂肪酸白蛋白上后，再将所获得的白蛋白溶液添加到基础培养基中，由此获得的NK细胞无血清培养基成分更稳定，功能一致性更好，不会因白蛋白的种属来源或加工批次的差异有所不同。本发明的培养基中还加入了聚肌胞，聚肌胞可诱导免疫细胞的分化、成熟或者分泌细胞因子，如IL‑12、IL‑15、TNFa、IFN‑r等，促进免疫细胞的活化增殖的能力；聚肌胞还可以促进膜结合型IL‑15Ra表达的能力，IL‑15Ra可与IL‑15紧密结合，这种结合状态的IL‑15对NK细胞有更强烈的促活化和促增殖的效应。本发明提供的NK细胞无血清培养基更适合高效培养NK细胞，提高增值倍数。

Description

一种NK细胞无血清培养基
技术领域
本发明涉及一种NK细胞无血清培养基及其配制方法，属于细胞培养技术领域。
背景技术
无血清培养基是指不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基，可以应用于培养免疫细胞，例如淋巴细胞(例如，T淋巴细胞、B细胞、NK细胞等)、树突状细胞(也称DC细胞)、单核/巨噬细胞等。
通常来说，免疫细胞在体外存活和扩增所需要的营养物质包括：白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、氨基酸、维生素、糖、脂质、无机盐、生长因子等。这些成分中，白蛋白对细胞生长和存活的影响最大，也是功能和组成最复杂的成分。而无血清培养基中，白蛋白所发挥的功能主要是由它所携带的脂肪酸和微量元素等成分决定的。
不同来源的白蛋白，例如不同种属的牛白蛋白和人白蛋白，它们所携带的脂肪酸差异很大；例如，重组白蛋白与人血白蛋白所携带的脂肪酸不同；例如在重组白蛋白中，水稻胚乳提取的与酵母菌发酵生产的重组白蛋白所携带的脂肪酸不同；不同产地的，也有不同。另外，后期生产加工过程也会造成白蛋白所携带的脂肪酸差异，例如不同生产厂家生产的、不同的批次的白蛋白所携带的脂肪酸也有很大的不同。总之，以上这些差异就导致添加了白蛋白的无血清培养基的成分复杂、不稳定。
无血清培养基中添加的白蛋白，其所携带的脂肪酸被细胞摄取后，用于构建细胞膜结构、信号传导分子、转化成能量、或者参与其它物质的合成等。因此，培养基中的白蛋白所携带的脂肪酸的差异会影响到免疫细胞的生长增殖、细胞功能等各个方面。特别是，往往某些脂肪酸含量过高或过低也会不利于免疫细胞的增殖及其杀伤活性，比如过高含量的亚麻酸或过低含量的亚油酸对免疫细胞增殖和杀伤活性不利。
特别是，对于淋巴细胞来说，体外富集、活化，并扩增淋巴细胞，可用于回输治疗多种诸如恶性肿瘤、感染、自身免疫病的疾病。然而，在体外扩增的过程中，需要用到适宜体外支持淋巴细胞存活和扩增的培养基。
目前，一些文献公开了一些无血清培养基，例如适合培养T淋巴细胞的无血清培养基，但都没有公开针对白蛋白的组成复杂性的解决方案，也没有公开一种专门培养NK细胞的无血清培养基。
另外，利用目前市售的培养基培养的NK细胞扩增倍数低、存活时间短、活性低，不能满足临床应用的问题。
发明内容
鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明提供了一种成分更稳定的NK细胞无血清培养基及其配制方法，改善了因白蛋白的组成复杂性而导致的培养基成分不稳定的情况。本发明的培养基中还加入了聚肌胞[Poly(I:C)]，聚肌胞可诱导免疫细胞的分化、成熟或者分泌细胞因子，如IL-12、IL-15、TNFa、IFN-r等，促进免疫细胞的活化增殖的能力；聚肌胞还可以促进膜结合型IL-15Ra表达的能力，IL-15Ra可与IL-15紧密结合，这种结合状态的IL-15对NK细胞有更强烈的促活化和促增殖的效应。本发明提供的NK细胞无血清培养基更适合高效培养NK细胞，提高增值倍数。
本发明提供了一种应用于NK细胞无血清培养基，所述NK细胞无血清培养基包括基础培养基、适用于所述NK细胞无血清培养基的血清替代物、聚肌胞，所述血清替代物包含白蛋白、人转铁蛋白、胰岛素和胆固醇，所述白蛋白是通过在无脂肪酸白蛋白上负载脂肪酸而形成的。
优选的，所述白蛋白是通过在无脂肪酸白蛋白上负载特定的脂肪酸而形成的；所述特定的脂肪酸由棕榈酸和/或硬脂酸、油酸和亚油酸组成；按照每1mmol无脂肪酸白蛋白添加0.4-2mmol的棕榈酸和/或硬脂酸，0.4-2mmol的油酸和0.4-2mmol的亚油酸的比例，将所述特定的脂肪酸添加到所述无脂肪酸白蛋白的溶液中混合而形成。
优选的，所述特定的脂肪酸还包括花生四烯酸，所述花生四烯酸与所述亚油酸的添加量的比值为1:6～1:1。
优选的，所述特定的脂肪酸包括棕榈酸和硬脂酸、油酸和亚油酸，所述硬脂酸与所述棕榈酸的添加量的比值为1:6～1:1。
优选的，所述NK细胞无血清培养基中，所述白蛋白的添加量为0.015～0.15mmol/L，以基础培养基的体积为基准。
优选的，所述的白蛋白为牛血清白蛋白、人血白蛋白或重组人血白蛋白。
优选的，所述的重组白蛋白为水稻胚乳表达的重组人血白蛋白或者转基因酵母菌表达的重组人血白蛋白。
优选的，所述的基础培养基为IMDM培养基，以基础培养基的体积为基准，所述人转铁蛋白的添加量为1～100mg/L，所述胰岛素的添加量为1～100mg/L，所述胆固醇的添加量为1～10mg/L。
优选的，聚肌胞的浓度为0.1-1000μg/ml。
优选的，所述血清替代物还包含乙醇胺，其添加量为1～10mg/L，以基础培养基的体积为基准。
优选的，所述NK细胞无血清培养基的pH值为6.8～7.5。
本发明再一方面还提供了上述的NK细胞无血清培养基在培养NK细胞方面的应用。
本发明的NK细胞无血清培养基配制方法，将脂肪酸负载到无脂肪酸白蛋白上后，再将获得的成分稳定的白蛋白溶液添加到基础培养基中，由此获得的NK细胞无血清培养基成分更稳定，功能一致性更好，不会因白蛋白的种属来源或加工批次的差异有所不同。本发明的培养基中还加入了聚肌胞，更适合高效培养NK细胞，提高增值倍数。
附图说明
图1为实施例1～4的NK细胞无血清培养基的细胞增殖能力的结果；
图2为对比例1～4的NK细胞无血清培养基的细胞增殖能力的结果；
图3为实施例1～11与对比例5～7的NK细胞无血清培养基的细胞增殖能力的结果；
图4为实施例1～11与对比例5～7的NK细胞无血清培养基培养的NK细胞杀瘤能力的结果。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。
实施例1～4
实施例1～4的NK细胞无血清培养基的配制过程如下：
步骤一：获取无脂肪酸白蛋白；
实施例1取牛血清白蛋白(购自SIGMA公司的A1933产品)1.5mmol，加注射用水配成2000ml溶液，加入50g活性炭，混匀；采用2mol/L的盐酸溶液调pH值到pH3.0；置于56℃水浴中30分钟或4℃放置过夜；离心处理(4000转/分钟)去除活性炭；再用2mol/L的NaOH溶液调pH值到pH7.0；最后过滤除菌获得实施例1的无脂肪酸白蛋白溶液；
实施例2取人血白蛋白(购自基立福(Grifols)公司的人血白蛋白(产品规格为20％50ml*10g/瓶，其中辛酸钠的含量不超过5mol/mol白蛋白))1.5mmol，具体操作过程同实施例1，获得实施例2的无脂肪酸白蛋白溶液；
实施例3取人血白蛋白(购自武汉生物制品研究所有限责任公司的人血白蛋白(产品规格20％50ml*10g/瓶，其中辛酸钠的含量不超过10mol/mol白蛋白))1.5mmol，具体操作过程同实施例1，获得实施例3的无脂肪酸白蛋白溶液；
实施例4取水稻重组白蛋白(购自武汉禾元生物科技股份有限公司的植物源重组人血白蛋白(冻干粉)产品)1.5mmol，具体操作过程同实施例1，获得实施例4的无脂肪酸白蛋白溶液。
步骤二：将特定的脂肪酸负载到所述无脂肪酸白蛋白上；
取1.2mmol棕榈酸、1.2mmol油酸和1.2mmol亚油酸加入到10ml无水乙醇中溶解，配制相同的4组，分别加入到实施例1-4的步骤一获得的无脂肪酸白蛋白溶液中(相当于每1mmol无脂肪酸白蛋白溶液中添加了0.8mmol棕榈酸、0.8mmol油酸和0.8mmol亚油酸)；0-37.5℃条件下，搅拌(100转/分钟)至少4小时，获得实施例1-4的白蛋白溶液。
步骤三：配制NK细胞无血清培养基；
称取IMDM培养基粉末(购自SIGMA公司的I7633产品)用注射水配制成IMDM培养基溶液，配制相同的4份。
在这4份IMDM培养基溶液中，按每一升IMDM培养基溶液，分别添加实施例1-4的步骤二所获得的白蛋白溶液(含0.0375mmol白蛋白)；再在每份中，继续添加以下物质：重组人转铁蛋白50mg(购自SIGMA公司的T3705产品)、重组人胰岛素10mg(购自江苏万邦生化医药股份有限公司的胰岛素注射液产品)、胆固醇2mg(购自SIGMA公司的C1231产品)、乙醇胺2mg(购自SIGMA公司的E0135产品)、抗坏血酸2.5mg(购自SIGMA公司的A4544产品)、硫酸庆大霉素10000IU(购自上海第一生化药业有限公司的硫酸庆大霉素注射液产品)、硫酸铜0.001mg、硫酸锌0.5mg和氯化锰0.0005mg，聚肌胞10μg/ml(购自Sigmaaldrich的P9582-50MG产品)。搅拌使充分溶解；
再用0.1mol/L盐酸和0.1mol/L NaOH溶液调节pH值为6.8-7.5之间，0.1um滤膜过滤除菌，分装，4-8摄氏度保存。
实施例5～8
实施例5～8的NK细胞无血清培养基的配制过程如下：
步骤一和三同实施例2的；
步骤二的操作过程同实施例2的，不同之处仅在于步骤二中的脂肪酸添加量的不同；
实施例5：
3mmol棕榈酸、3mmol油酸和3mmol亚油酸；
实施例6：
0.6mmol棕榈酸、0.6mmol油酸和0.6mmol亚油酸；
实施例7：
1.6mmol棕榈酸、1.6mmol油酸和1.6mmol亚油酸；
实施例8：
2.0mmol棕榈酸、2.0mmol油酸和2.0mmol亚油酸；
在本发明的一个具体实施方案中，所述特定的脂肪酸还包括花生四烯酸，所述花生四烯酸与所述亚油酸的添加量比值的1:6～1:1。优选的，比值可以为1:5、1:4、1:3、1:2、2:3、3:4、4:5、5:6等。更优选的，比值可以为1:3。本发明的一个优选实施例参见实施例9。
所述特定的脂肪酸还包括硬脂酸，所述硬脂酸与所述棕榈酸的添加量比值为1:6～1:1。优选的，比值可以为1:5、1:4、1:3、1:2、2:3、3:4、4:5、5:6等。更优选的，比值可以为1:2。本发明的一个优选实施例参见实施例10。
实施例9
实施例9的NK细胞无血清培养基的配制过程如下：
步骤一同实施例1；
步骤二中，取1.2mmol棕榈酸、1.2mmol油酸、1.2mmol亚油酸和0.4mmol花生四烯酸，加入到10ml无水乙醇中溶解，再加入到步骤一获得的无脂肪酸白蛋白溶液中；0-37.5℃条件下，搅拌(100转/分钟)至少4小时，获得白蛋白溶液；
步骤三中，在每一升IMDM培养基溶液中，加入步骤二所获得的白蛋白溶液(含0.03mmol白蛋白)、重组人转铁蛋白10mg、重组人胰岛素20mg、胆固醇6mg、乙醇胺5mg、抗坏血酸5mg、硫酸庆大霉素10000IU、硫酸铜0.0005mg、硫酸锌0.1mg、氯化锰0.001mg、聚肌胞0.1μg/ml。
实施例10
实施例10的NK细胞无血清培养基的配制过程如下：
步骤一同实施例1；
步骤二中，取0.8mmol棕榈酸、1.2mmol油酸、1.2mmol亚油酸和0.4mmol硬脂酸加入到10ml无水乙醇中溶解；再加入到步骤一获得的无脂肪酸白蛋白溶液中；0-37.5℃条件下，搅拌(100转/分钟)至少4小时，获得白蛋白溶液；
步骤三中，在每一升IMDM培养基溶液中加入步骤二所获得的白蛋白溶液(含0.075mmol白蛋白)、重组人转铁蛋白100mg、重组人胰岛素5mg、胆固醇4mg、乙醇胺10mg、抗坏血酸1mg、硫酸庆大霉素10000IU、硫酸铜0.001mg、硫酸锌0.5mg、氯化锰0.0005mg、聚肌胞1000μg/ml。
实施例11
实施例11的NK细胞无血清培养基的配制过程如下：
步骤一同实施例1；
步骤二中，取1.2mmol硬脂酸、1.2mmol油酸、1.2mmol亚油酸加入到10ml无水乙醇中溶解；再加入到步骤一获得的无脂肪酸白蛋白溶液中；0-37.5℃条件下，搅拌(100转/分钟)至少4小时，获得白蛋白溶液；
步骤三中，在每一升IMDM培养基溶液中加入步骤二所获得的白蛋白溶液(含0.0375mmol白蛋白)、重组人转铁蛋白50mg、重组人胰岛素10mg、胆固醇4mg、乙醇胺10mg、抗坏血酸1mg、硫酸庆大霉素10000IU、硫酸铜0.001mg、硫酸锌0.5mg和氯化锰0.0005mg、10μg/ml聚肌胞。
效果对比数据
对比例1～4
对比例1～4的NK细胞无血清培养基的配制：
称取IMDM培养基粉末用注射水配制成IMDM培养基溶液，配制相同的4份。
在这4份IMDM培养基溶液中，按每一升IMDM培养基溶液，分别添加对比例1-4的白蛋白；
对比例1：牛血清白蛋白(购自SIGMA公司的A1933产品)的水溶液50ml，其中含有牛血清白蛋白0.0375mmol；
对比例2：人血白蛋白(购自基立福(Grifols)公司的人血白蛋白(产品规格为20％50ml*10g/瓶，其中辛酸钠的含量不超过5mol/mol白蛋白))的水溶液50ml，其中含有人血白蛋白0.0375mmol；
对比例3：人血白蛋白(购自武汉生物制品研究所有限责任公司的人血白蛋白(产品规格20％50ml*10g/瓶，其中辛酸钠的含量不超过10mol/mol白蛋白))的水溶液50ml，其中含有人血白蛋白0.0375mmol；
对比例4：水稻重组人血白蛋白(购自武汉禾元生物科技股份有限公司的植物源重组人血白蛋白(冻干粉)产品)的水溶液50ml，其中含有水稻重组人血白蛋白0.0375mmol；
再在每一份中，继续添加以下物质：重组人转铁蛋白50mg、重组人胰岛素10mg、胆固醇2mg、乙醇胺2mg、抗坏血酸2.5mg、庆大霉素10000IU、硫酸铜0.001mg、硫酸锌0.5mg和氯化锰0.0005mg、聚肌胞10μg/ml，搅拌使充分溶解；再用0.1mol/L盐酸和0.1mol/L NaOH溶液调节pH值为6.8-7.5之间，0.1um滤膜过滤除菌，分装，4-8摄氏度保存。
对比例5～7
对比例5：市售的CellGro SCGM Medium；
对比例6：市售的TAKARA公司的GT-T551；
对比例7：市售的友康免疫细胞无血清培养基(NK)。
淋巴细胞增殖能力实验
在6孔板中，按照每种培养基三个复孔，每孔加入2ml NK细胞无血清培养基，再加入1×106外周血淋巴细胞，再加入300IU/ml IL-2和50ng/ml OKT3，进行培养，当细胞密度大于2×106/ml时进行补液培养，补液培养时将细胞密度调整为1×106/ml，加入300IU/mlIL-2。第10天取每孔的样品进行细胞计数，并计算细胞增殖的倍数。
实施例1～4的NK细胞无血清培养基的细胞增殖能力的结果参见图1；
对比例1～4的NK细胞无血清培养基的细胞增殖能力的结果参见图2；
实施例1-11、对比例5～7的NK细胞无血清培养基的细胞增殖能力的结果参见图3。
结论：从图2的结果可以看出，不同种属来源的白蛋白(牛血清白蛋白、人血白蛋白和水稻重组人血白蛋白)、不同厂家生产的白蛋白(对比例2和3的人血白蛋白)按照现有技术方法配制成的NK细胞无血清培养基的细胞增殖倍数差异很大，即细胞培养效果差异很大；
然而，从图1的结果可以看出，不同种属来源的白蛋白(牛血清白蛋白、人血白蛋白和水稻重组白蛋白)、不同厂家生产的白蛋白(实施例2和3的人血白蛋白)，经本发明的方法配制成的NK细胞无血清培养基的细胞培养效果(细胞增殖倍数)基本处于同一水平，差异不大。
这说明采用本发明的方法获得的NK细胞无血清培养基的成分更稳定，功能一致性更好。
另外，分别对比实施例1-4与对比例1-4的结果，可以看出实施例1-4的NK细胞无血清培养基的细胞增殖能力优于对比例1-4的，因此，这说明采用本发明的方法获得的NK细胞无血清培养基不仅成分更稳定，功能一致性更好，并且细胞增殖能力得到提高。
对比实施例1-4与对比例5-7的结果，可以看出本发明的实施例1-4的NK细胞无血清培养基的细胞增殖能力优于对比例5-7的培养基的。
淋巴细胞毒性实验
将上述细胞增殖能力实验中培养第10天的NK细胞作为效应细胞，以Daudi细胞为靶细胞。
首先配制效应细胞溶液：取实施例1-11，以及对比例5-7的培养基所培养10天的NK细胞，用IMDM培养基洗2次，用培养基配成1x106/ml细胞悬液。靶细胞daudi细胞用IMDM培养基洗一次，配成1x105/ml细胞悬液。按效靶比10:1接种到96孔板内，同时设置效应细胞孔和靶细胞孔，按每种培养基3个复孔，37度5％CO2培养24小时。用MTT法测吸光度值，计算杀瘤率。
杀瘤率％＝1-(试验孔-效应细胞孔)/靶细胞孔。
结果参见图4。
结论：从图4可以看出，本发明实施例1-11的NK细胞无血清培养基所培养出来的NK淋巴细胞的杀瘤率，高于市售的AIM-V培养基、GT-T561培养基和含5％热灭活自体血浆的RPMI1640培养基。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种应用于NK细胞的NK细胞无血清培养基，所述NK细胞无血清培养基包括基础培养基、适用于所述NK细胞无血清培养基的血清替代物、聚肌胞，所述血清替代物包含白蛋白、人转铁蛋白、胰岛素和胆固醇，其特征在于：
所述白蛋白是通过在无脂肪酸白蛋白上负载脂肪酸而形成的；
所述白蛋白是通过在无脂肪酸白蛋白上负载特定的脂肪酸而形成的；
所述特定的脂肪酸由棕榈酸和/或硬脂酸、油酸和亚油酸组成；按照每1mmol无脂肪酸白蛋白添加0.4-2mmol的棕榈酸和/或硬脂酸，0.4-2mmol的油酸和0.4-2mmol的亚油酸的比例，将所述特定的脂肪酸添加到所述无脂肪酸白蛋白的溶液中混合而形成；或者，
所述特定的脂肪酸由棕榈酸和/或硬脂酸、油酸、亚油酸和花生四烯酸组成，所述步骤二中，按照每1mmol无脂肪酸白蛋白添加0.4-2mmol的棕榈酸和/或硬脂酸，0.4-2mmol的油酸和0.4-2mmol的亚油酸的比例，所述花生四烯酸与所述亚油酸的添加量的比值为1:6～1:1，将所述特定的脂肪酸添加到所述无脂肪酸白蛋白的溶液中混合而形成。
2.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：所述特定的脂肪酸由棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸组成，所述硬脂酸与所述棕榈酸的添加量的比值为1:6～1:1。
3.如权利要求1所述的NK细胞无血清培养基，其特征在于：所述NK细胞无血清培养基，所述白蛋白的添加量为0.015～0.15mmol/L，以基础培养基的体积为基准。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的NK细胞无血清培养基，其特征在于：所述的白蛋白为牛血清白蛋白、人血白蛋白或重组人血白蛋白。
5.如权利要求4所述的NK细胞无血清培养基，其特征在于：所述的重组白蛋白为水稻胚乳表达的重组人血白蛋白或者转基因酵母菌表达的重组人血白蛋白。
6.如权利要求1-5中任意一项所述的NK细胞无血清培养基，其特征在于：所述的聚肌胞浓度为0.1-1000μg/ml。
7.如权利要求1-6中任意一项所述的NK细胞无血清培养基，其特征在于：所述的基础培养基为IMDM培养基，以基础培养基的体积为基准，所述人转铁蛋白的添加量为1～100mg/L，所述胰岛素的添加量为1～100mg/L，所述胆固醇的添加量为1～10mg/L。
8.如权利要求7所述的NK细胞无血清培养基，其特征在于：所述血清替代物还包含乙醇胺，其添加量为1～10mg/L，以基础培养基的体积为基准。
9.如权利要求1-3中任意一项所述的NK细胞无血清培养基，其特征在于：所述NK细胞无血清培养基的pH值为6.8～7.5。
10.如权利要求1-9中任意一项所述的配制方法所配制的NK细胞无血清培养基，或者，如权利要求1-9中任意一项所述的NK细胞无血清培养基，在培养NK细胞方面的应用。
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