CN116437823A

CN116437823A - 包含经培养的动物细胞的挤出食品组合物及其制作方法

Info

Publication number: CN116437823A
Application number: CN202180073007.4A
Authority: CN
Inventors: 李萌; N·帕克; V·E·桑托
Original assignee: Fine Meat Co
Current assignee: Fine Meat Co
Priority date: 2020-08-28
Filing date: 2021-08-27
Publication date: 2023-07-14
Also published as: WO2022047263A1; CA3191121A1; US20220079194A1; EP4203705A1

Abstract

本发明提供了包含经培养的动物细胞和植物蛋白的挤出食品。本发明还提供了制备挤出食品的方法。

Description

包含经培养的动物细胞的挤出食品组合物及其制作方法

发明领域

本发明涉及包含经培养的动物细胞的挤出食品以及制作挤出食品的方法。

发明背景

几千年来，养殖动物的肉类一直是人类饮食的一部分。家禽、牛肉、猪肉及其他动物在世界各地均有消费，众所周知，动物养殖对全球变暖有重大影响。2006年，联合国粮食及农业组织估计，畜牧业产生的温室气体约占人类活动产生的温室气体总量的18％。据联合国估计，畜牧业产生的温室气体超过了整个交通运输业产生的温室气体，包括汽车、卡车、火车、轮船和飞机产生的温室气体总和。

此外，食用养殖动物亦存在健康风险。动物的屠宰和加工使动物尸体暴露于微生物污染，并使人们暴露于残留在肉上的潜在致命微生物。在2012年全美鸡肉产品的随机调查中，责任医学医师委员会发现48％的样本含有粪便，美国农业部(USDA)2009年的一项研究发现，87％的鸡尸体在包装前检测出普通大肠杆菌阳性，这是粪便污染的迹象。虽然彻底煮熟可杀死污染微生物，但如果煮熟不彻底，一些微生物便可能会存活下来，引起食源性疾病。

使用挤压烹饪来制作人造肉产品可追溯到1960年代。然而，目前现有的技术均使用从大豆、小麦、马铃薯或大米等植物中提取的普通淀粉和蛋白质。与含有经培养的动物细胞的产品相比，仅使用植物性资源制作人造肉的传统方法和工艺所提供的营养价值和感官性能均有限。

培养肉类产品非常有潜力：(1)大幅减少对屠宰动物的食用依赖，(2)减轻饲养动物作为食物供应的环境负担，以及(3)提供既安全又质量稳定的可靠蛋白质来源。

与仅使用植物蛋白的人造肉相比，用经培养的动物细胞制成的挤出食品所生产的食品具有卓越的感官性能及更好的营养成分。

发明摘要

本发明提供了包含经培养的动物细胞、植物蛋白和至少一种其他成分的挤出物。

所述经培养的动物细胞在含或不含动物血清的生长培养基中进行体外培养。

在一些实施方案，所述经培养的动物细胞是禽类细胞、牛类细胞、猪类细胞或鱼类细胞。

在一些实施方案，所述挤出物包含植物蛋白。在一些实施方案，所述植物蛋白是植物蛋白分离物或植物蛋白浓缩物。

在一些实施方案，所述挤出产品任选地包含肽交联剂。

在一些实施方案，所述挤出物中的所述至少一种其他成分，在一些实施方案，是脂质、盐、糖、纤维、湿润剂、调味剂、着色剂、和/或防腐剂。

在一些实施方案，所述盐选自由以下组成的组：磷酸二钠、六偏磷酸钠、柠檬酸钠、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、二乙酸钠、磷酸钠、氯化钾、硫酸钾、磷酸钾、柠檬酸钙、氯化钙、柠檬酸镁、和氯化镁。

在一些实施方案，所述挤出物具有纤维结构。

在一些实施方案，所述挤出物具有在5N至300N之间的Warner-Bratzler评分。

在一些实施方案，其中所述挤出物是支架(scaffold)。

在一些实施方案，其中所述挤出物是用于3D打印的基材。

本发明提供了制备包含植物蛋白、至少一种其他成分、和任选地肽交联酶的挤出物的方法。所述方法包含通过使水和植物蛋白接触来制备面团。将所述面团放置入挤出机的料斗中。将所述面团从所述料斗转移至挤出机的机筒中，并在机械压力下输送通过所述机筒。任选地，可在输送所述面团通过所述机筒的过程中加热所述面团。可通过向所述机筒内输注蒸汽或通过加热所述机筒来加热所述面团。在输送所述面团通过所述机筒的过程中，将所述经培养的动物细胞或细胞膏(cell paste)注入所述机筒中，以制备所述面团/细胞掺和物。接下来，将所述面团/细胞掺和物通过模具挤出，以制作所述挤出物。在一些实施方案，可在将所述面团放置入所述料斗之前，将所述至少一种其他成分添加至所述面团中。在一些实施方案，在将所述经培养的动物细胞注入所述机筒中之前、期间、之后或同时，将所述至少一种其他成分注入所述挤出机的所述机筒中。

本发明提供了制备包含经培养的动物细胞、植物蛋白、至少一种其他成分、和任选地肽交联剂的挤出物的方法。所述方法包含使水、植物蛋白和经培养的动物细胞接触来制备面团/细胞掺和物。将所述面团/细胞掺和物放置入挤出机的料斗中。将所述面团/细胞掺和物从所述料斗转移至挤出机的机筒中。在机械压力下，将所述面团/细胞掺和物输送通过所述机筒。任选地，可在输送通过所述机筒的过程中加热所述所述面团/细胞掺和物。将所述面团/细胞掺和物通过模具挤出，以制作所述挤出物。在一些实施方案，在将所述面团/细胞掺和物放置入所述料斗之前，将所述至少一种其他成分掺入所述面团/细胞掺和物中。在一些实施方案，在将所述面团/细胞掺和物输送通过所述机筒的过程中，将所述至少一种其他成分注入所述机筒中。

在一些实施方案，所述面团或所述面团/细胞掺和物的所述加热是通过向所述机筒内输注蒸汽或通过加热所述机筒来完成。

在一些实施方案，所述挤出方法是湿式挤出法或干式挤出法。

所述挤出机，在一些实施方案，是单螺杆挤出机，或在其他实施方案，是双螺杆挤出机。

在所述方法的一些实施方案中，所述肽交联酶与所述面团接触。在其他实施方案，所述肽交联酶与所述面团/细胞掺和物接触。在其他实施方案，所述肽交联酶与所述面团和所述面团/细胞掺和物接触。

本发明提供了体外培养禽类成纤维细胞以用于制备挤出食品的方法。本发明还阐述了制作和使用产品的方法。

在一些实施方案，本发明提供了制作包含动物细胞的食品的方法。在一些实施方案，所述动物细胞是肌肉细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、上皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、结缔组织细胞、造血细胞、诱导多能干细胞、分离的多能干细胞、分化成各种细胞类型(包括肌肉细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、上皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、结缔组织细胞、造血细胞和其他细胞类型)的诱导或分离的干细胞。

在一些实施方案，本发明提供了制作包含体外培养的禽类成纤维细胞的食品的方法，所述方法包含在能够维持禽类成纤维细胞的生长培养基中体外培养所述禽类成纤维细胞的群体，回收所述禽类成纤维细胞，以及通过挤压将所述回收的禽类成纤维细胞配制成可食用食品。在一些实施方案，所述禽类成纤维细胞包含原代禽类成纤维细胞。在一些实施方案，所述禽类成纤维细胞包含继代禽类成纤维细胞。在一些实施方案，所述禽类成纤维细胞是体外分化的成纤维细胞。

在一些实施方案，本发明提供了制作包含禽类肌肉细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、上皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、结缔组织细胞、造血细胞、诱导多能干细胞、分离的多能干细胞、分化成各种细胞类型(包括体外培养的肌肉细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、上皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、结缔组织细胞、造血细胞和其他禽类细胞类型)的诱导或分离的干细胞的食品的方法，所述方法包含在能够维持禽类细胞的生长培养基中体外培养所述禽类细胞的群体，回收所述细胞，以及通过挤压将所述回收的禽类细胞配制成可食用食品。在一些实施方案，所述禽类细胞包含原代细胞。在一些实施方案，所述禽类细胞包含继代细胞。在一些实施方案，所述禽类细胞在体外分化成所需的禽类细胞类型。

在一些实施方案，本发明提供了制作包含牛类肌肉细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、上皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、结缔组织细胞、造血细胞、诱导多能干细胞、分离的多能干细胞、分化成各种细胞类型(包括体外培养的肌肉细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、上皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、结缔组织细胞、造血细胞和其他禽类细胞类型)的诱导或分离的干细胞的食品的方法，所述方法包含在能够维持牛类细胞的生长培养基中体外培养所述牛类细胞的群体，回收所述细胞，以及通过挤压将所述回收的牛类细胞配制成可食用食品。在一些实施方案，所述牛类细胞包含原代细胞。在一些实施方案，所述牛类细胞包含继代细胞。在一些实施方案，所述牛类细胞在体外分化成所需的禽类细胞类型。

在一些实施方案，本发明提供了制备由体外生长的禽类成纤维细胞制成的食品的方法，所述方法包含以下步骤：用磷酸盐调节水以制备调理水，用所述调理水使植物蛋白分离物或植物蛋白浓缩物水合以生成水合植物蛋白，使所述细胞膏(cell paste)与所述水合植物蛋白接触以生成细胞和豆类蛋白质混合物，分步加热所述细胞和植物蛋白质混合物，其中所述步骤包含下列至少之一：

将所述细胞和蛋白质混合物的所述温度斜升至40-65℃之间的温度，将所述细胞和蛋白质混合物的所述温度保持在40-65℃之间的温度1至30分钟，将所述细胞和蛋白质混合物的所述温度斜升至60-85℃之间的温度，将所述细胞和蛋白质混合物冷却至-1-25℃之间的温度，和将所述细胞和蛋白质混合物与脂肪混合以制成预烹饪产品。无需进一步烹饪即可食用所述预烹饪产品。或者，将所述预烹饪产品烹饪以生成所述可食用食品。任选地，所述预烹饪产品可在室温、冷藏温度或冷冻下储存。

在一些实施方案，本发明提供了由禽类成纤维细胞制成的食品，其包含：细胞膏，所述细胞膏含量为至少5重量％，和其中所述细胞膏由体外生长的禽类成纤维细胞制成；植物蛋白分离物或植物蛋白浓缩物，所述植物蛋白含量为至少5重量％；脂肪，所述脂肪含量为至少5重量％；和水，所述水含量为至少5重量％。

在一些实施方案，所述食品组合物或食品包含约1重量％-100重量％的湿细胞膏。

在一些实施方案，所述植物蛋白分离物或植物蛋白浓缩物得自选自由以下组成的组的豆类：干豆、扁豆、绿豆、蚕豆、干豌豆、鹰嘴豆、豇豆、班巴拉豆(bambara beans)、木豆、羽扇豆、野豌豆、小豆、普通菜豆(common beans)、胡芦巴、长豆、利马豆、红花菜豆、宽叶菜豆、大豆、或黧豆。在多个实施方案中，本发明提供的豆类蛋白分离物或植物蛋白浓缩物衍生自赤豆(Vigna angularis)、蚕豆(Vicia faba)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、小扁豆(Lens culinaris)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、豇豆(Vigna unguiculata)、刚果落花生(Vigna subterranea)、木豆(Cajanus cajan)、羽扇豆属(Lupinus sp.)、野豌豆属(Vetchsp.)、胡芦巴(Trigonella foenum-graecum)、棉豆(Phaseolus lunatus)、荷包豆(Phaseolus coccineus)或尖叶菜豆(Phaseolus acutifolius)。在一些实施方案，所述豆类蛋白分离物衍生自绿豆。在一些实施方案，所述绿豆是绿豆(Vigna radiata)。

在一些实施方案，动物蛋白分离物和动物蛋白浓缩物均得自动物或动物产品。动物蛋白分离物或动物蛋白浓缩物的实例包括乳清、酪蛋白和蛋蛋白。

在一些实施方案，植物蛋白分离物得自小麦、水稻、画眉草、燕麦、玉米、大麦、高粱、黑麦、小米、黑小麦、苋菜、荞麦、藜麦、杏仁、腰果、山核桃、花生、核桃、澳洲坚果、榛子、开心果、巴西坚果(brazil)、栗子、可乐果、葵花籽、南瓜子、亚麻籽、可可、松子、银杏、及其他坚果类。

在一些实施方案，本发明提供了包含经培养的动物细胞的细胞膏。当所述湿细胞膏的细胞密度为1x 10⁹至100x 10⁹个细胞/ml之间时，在30℃和95℃之间的温度下，储能模量(G')是在5Pa和100Pa之间。

附图简要说明

图1描绘了培养禽类成纤维细胞的流程图。

图2描绘了收获经培养的禽类成纤维细胞的流程图。

图3描绘了用于制作培养鸡肉产品(JUST7、JUST8、JUST9)的鸡细胞库的三个生物学重复(JUST1、JUST2、JUST3)的转录组分析的层次聚类。

图4A描绘了鸡成纤维细胞在低血清培养基中的适应性，表明细胞活力随培养时间的变化。图4B描绘了鸡成纤维细胞在低血清培养基中的适应性，表明群体倍增时间随传代数的变化。

图5A描绘了鸡成纤维细胞在补充有脂肪酸和生长因子的基础培养基中随培养时间变化的适应性。图5B描绘了鸡成纤维细胞在不含生长因子的基础培养基中随培养时间变化的适应性。图5C描绘了鸡成纤维细胞在补充有生长因子的无血清基础培养基中随培养时间变化的适应性。生长因子包含胰岛素样生长因子、表皮样生长因子和成纤维细胞样生长因子。

图6A描绘了在本发明定义的ITSEEF存在下，C1F鸡细胞在FBS浓度降低的培养基中，随培养时间变化的适应性。图6B描绘了鸡成纤维细胞对无血清培养基的适应性，表明群体倍增时间随传代数的变化。图6C描绘了图6A和6B中所示培养物随时间变化的细胞活力。

图7A示出了当温度从30℃增至95℃时，湿鸡细胞膏(重复)、湿牛细胞膏(重复)和7％绿豆蛋白分离物(重复)溶液的储能模量。图7B示出了湿鸡细胞膏、湿牛细胞膏和7％绿豆蛋白分离物响应增幅振荡应变的储能模量。

图8是含有65％经培养鸡细胞的挤出物的照片。所述挤出物具有与鸡的鸡胸肉的纤维结构非常相似的纤维结构。

图9是示出传统鸡胸肉、不含鸡细胞的基于植物蛋白的挤出物、以及含有65％经培养鸡细胞的挤出物的硬度的图表。

发明详述

提供以下描述以使本领域普通技术人员能够制作和使用所公开的主题并将其并入应用背景中。各种修改或修饰以及在不同应用中的各种用途对于本领域技术人员而言均将是显而易见的，并且本发明定义的一般原理可应用于广泛的实施方案。因此，本发明不旨在限于所呈现的实施方案，而是赋予与本发明公开的原理和新颖特征一致的最宽范围。

定义

本发明使用的“外来的”是指一种或多种污染物，例如但不限于：病毒类、细菌类、支原体类和真菌类。

本发明使用的“基础培养基”是指促进多种类型的微生物和/或细胞生长且不需要任何特殊营养补充剂的非补充培养基。

本发明使用的术语“分批培养”是指具有营养物、温度、压力、通气及其他环境条件从而优化生长的封闭培养系统。由于在孵育过程中未添加营养物，亦未去除废物，分批培养可在营养物耗尽和生长停止之前完成有限数量的生命周期。

本发明使用的“细胞膏(cell paste)”或“湿细胞膏(wet cell paste)”是指从细胞培养物中收获的细胞的糊体，其中所需量的水已从所述收获的细胞培养基中去除。从细胞培养基中除去水以制作包含经培养的细胞的细胞膏，均在技术人员的能力范围内。根据美国农业部的数据，包括家禽在内的动物肉的天然水分含量为约75％的水。技术人员可通过离心、冻干、加热或任何其他众所周知的除水技术从所述收获的培养细胞培养基中除去水分，以制作细胞膏。在一些实施方案，本发明提供的细胞膏包含大量的水。本发明使用的“细胞膏”或“湿细胞膏”包含约1％-99％、5％-99％、10％-99％、20％-99％、25％-99％、25％-99％、25％-99％、25％-95％、25％-90％的水、25％-85％的水、25％-80％的水、25％-75％的水、25％-70％的水、25％-65％的水、25％-60％的水、25％-55％的水、25％-50％的水、30％-90％的水、30％-85％的水、30％-80％的水、30％-75％的水、30％-70％的水、30％-65％的水、30％-60％的水、30％-55％的水、30％-50％的水、35％-90％的水、35％-85％的水、35％-80％的水、35％-75％的水、35％-70％的水、35％-65％的水、35％-60％的水、35％-55％的水、35％-50％的水、40％-90％的水、40％-85％的水、40％-80％的水、40％-75％的水、40％-70％的水、40％-65％的水、40％-60％的水、40％-60％的水、40％-55％的水、40％-50％的水、45％-90％的水、45％-85％的水、45％-80％的水、45％-75％的水、45％-70％的水、45％-75％的水、45％-70％的水、45％-65％的水、45％-60％的水、45％-55％的水、45％-50％的水、50％-90％的水、50％-85％的水、50％-80％的水、50％-75％的水、50％-70％的水、50％-65％的水、50％-60％的水、50％-55％的水、85％-99％的水、85％-95％的水、90％-99％的水、90％-95％的水、95％-99％的水、或95％-98％的水。细胞膏或湿细胞膏是培养肉类的另一个术语。如果充分干燥，细胞膏可呈现粉末状。

本发明使用的术语“经培养的动物细胞”是最初从动物或动物的一部分获得的在生长培养基中培养或繁殖的细胞。

本发明使用的术语“面团”是指水和植物蛋白以及任选地至少一种其他成分和进一步任选地肽交联剂的混合物。

本发明使用的术语“面团/细胞掺和物”是指水、植物蛋白和经培养的动物细胞、以及任选地至少一种其他成分和进一步任选地肽交联剂的组合。

本发明使用的术语“可食用食品”是指人类食用安全的食品。譬如，其包括但不限于政府或监管机构(例如，美国食品药品监督管理局)普遍认为安全的食品。在某些实施方案，技术人员认为此食品可安全食用。任何适合人类食用的可食用食品亦应适合另一种动物食用，并且此类实施方案亦旨在属于本发明范围内。

本发明使用的术语“酶”或“酶促”是指生物催化剂。酶加速或催化化学反应。酶通过降低活化能来提高反应速率。

本发明使用的术语“表达”是来自基因的信息用于合成功能性基因产物的过程。

本发明使用的术语“挤出物”或“挤出产品”是指包含经培养的动物细胞、植物蛋白、至少一种其他成分、和任选地肽交联酶的产品，所述挤出物通过使用挤出机制备得到。所述挤出物可任选地包含肽交联酶。

本发明使用的术语“补料分批培养”是指一种操作技术，其中一种或多种营养物，例如底物，在培养过程中以连续或周期性模式被送入生物反应器，其中产物保留在生物反应器中直至运行完毕。另一种描述是一种培养，其中基础培养基支持初始细胞培养，并添加补料培养基以防止营养物耗尽。在补料分批培养中，可将培养液中补料底物的浓度控制在所需水平以支持连续生长。

本发明使用的术语“纤维”是得自植物的碳水化合物聚合物，其在食用时不能被人体消化系统完全分解。可溶性纤维可溶于水，而不溶性纤维则不溶于水。

本发明使用的术语“纤维状”或“纤维结构”用于指挤出物或其他产品，其中大分子如蛋白质纤维和/或经培养的细胞基本上沿一个方向排列。从俯视图观察时，存在于挤出物中的大多数植物蛋白纤维和/或与经培养的动物细胞共价连接的植物蛋白纤维以约75°角或更小、65°角或更小、60°角或更小、55°角或更小、50°角或更小、45°角或更小、或40°角或更小的角度彼此对齐。

本发明使用的“成纤维细胞”是指负责细胞外基质、上皮分化以及炎症和伤口愈合调节的间充质衍生细胞。此外，成纤维细胞还负责分泌生长因子并作为其他细胞类型的支架。成纤维细胞是在传统肉类中发现的一种细胞类型。

本发明使用的术语“凝胶化”、“胶凝”或其类似物是材料的一种特性，例如，湿细胞膏或蛋白质形成凝胶，其中凝胶化后的材料(胶凝材料)与未凝胶化的材料相比表现出粘弹性或弹性固体行为。通过受热、添加交联剂、搅拌或在所需条件下孵育，所述材料可从未胶凝化状态转化为胶凝状态。材料(例如，分离的蛋白质)的凝胶化是一种常见的现象。譬如，蛋类在受热、暴露于酸(例如，醋或盐)时会凝胶化(凝结)。炒蛋亦是一种凝胶食品。同样，胶原蛋白的水溶液在特定温度和浓度下会凝胶化并形成明胶。

本发明使用的“基因产物”是由基因表达产生的生化物质，RNA或蛋白质。

本发明使用的“生长培养基”是指支持微生物或细胞或小植物生长的媒介或培养基。生长培养基可以是但不限于固体或液体或半固体。生长培养基亦应与“生长介质”同义。

本发明使用的术语“湿润剂”或“保湿剂”是吸湿性物质。湿润剂的实例包括未改性淀粉、改性淀粉和多元醇类。黄原胶、瓜尔胶、藻酸盐、角叉菜胶、甘油、丙二醇和聚葡萄糖均是食品中常用的湿润剂。

本发明使用的“体外”是指在试管、培养皿、生物反应器或活生物体外部的其他地方进行或发生的过程。在本发明的正文中，产品亦可称为体外产品，在此种情况下，体外应是形容词，其含义应是所述产品是采用活生物体外部的方法或过程生成的。

本发明使用的术语“脂质”或“脂肪”是指可溶于非极性溶剂的化合物类。脂质的实例包括三酰甘油类、二酰甘油类、单酰甘油类、游离脂肪酸类、和甾醇类。

本发明使用的“肽交联酶”或“交联酶”是催化一种或多种多肽之间共价键形成的酶。转谷氨酰胺酶是肽交联酶的一个实例。

本发明使用的“增殖”是指使得细胞数量增加的过程。其特征是细胞分裂与通过细胞死亡或分化所导致的细胞损失之间的平衡。

本发明使用的“原代禽类成纤维细胞”是指来自亲本动物的细胞，其在合适的生长培养基中，例如在受控环境条件下保持生长。原代培养的细胞与原始组织中的细胞具有相同的核型(真核细胞的核中染色体的数量和外观)。

本发明使用的“蛋白浓缩物”是从植物来源或动物来源获得的一种或多种不同多肽的集合。蛋白浓缩物的蛋白质百分比(按干重计)大于25％的蛋白质(按干重计)。

本发明使用的“蛋白分离物”是从植物来源或动物来源获得的一种或多种不同多肽的集合。蛋白浓缩物的蛋白质百分比(按干重计)大于50％的蛋白质(按干重计)。

本发明使用的“调味料”是指一种或多种呈固体和液体形式的草药和香料。

本发明使用的“继代禽类成纤维细胞(secondary avian fibroblast cells)”是指经历遗传转化并永生化以使得无限增殖的原代细胞。

本发明使用的术语“储能模量”是粘弹性材料的刚度的量度。储能模量是材料响应于赋予粘弹性材料的扰动而测得的弹性响应。储能模量是力的单位，通常以帕斯卡(Pascal)为单位量度。

本发明使用的“基本上纯的”是指按干重计为至少80％细胞的细胞。基本上纯的细胞为按干重计在80％-85％之间的细胞、按干重计在85％-90％之间的细胞、按干重计在90％-92％之间的细胞、按干重计在92％-94％之间的细胞、按干重计在94％-96％之间的细胞、按干重计在96％-98％之间的细胞、或按干重计在98％-99％之间的细胞。

本发明使用的“悬浮培养”是指其中单个细胞或细胞的小聚集体在悬浮于搅动的液体培养基中时进行增殖的培养类型。其亦指细胞培养或细胞悬浮培养。

本发明使用的“转谷氨酰胺酶”或“TG”是指催化γ-羧酰胺基团和各种伯胺之间形成肽(酰胺)键的酶(R-谷氨酰-肽胺谷氨酰转移酶)，分类为EC 2.3.2.13。转谷氨酰胺酶催化多肽间共价键形成，从而使多肽交联。交联酶如转谷氨酰胺酶用于食品工业以改善某些食品如乳制品、肉类和谷物产品的质构。其可从细菌来源、真菌、霉菌、鱼、哺乳动物、或植物中分离得到。

如本发明所用，除非另有说明，否则百分比(％)是指通常基于干重的总的重量％，除非另有说明。

术语“约”或“大约”表示并涵盖指定值及高于和低于所述值的范围。在某些实施方案，术语“约”表示指定值±10％、±5％或±1％。在某些实施方案，术语“约”表示指定值±所述值的一个标准偏差。

在本发明中，提出了体外培养禽类来源细胞的方法。本发明方法提供了增殖细胞培养物、回收细胞培养物和监测细胞培养物纯度的方法。所述细胞可用于例如一种或多种食品。

本发明公开内容阐述了包含体外生长的禽类来源细胞的禽类食品组合物的实施方案。在一些实施方案，所述组合物包含植物蛋白、细胞膏、脂肪、水及肽交联酶。

本发明公开内容阐述了制备由体外生长的禽类来源细胞制成的禽类食品的方法的实施方案。禽类食品是可食用食品。

细胞

在一些实施方案，所述经培养的动物细胞是禽类细胞、牛类细胞、猪类细胞或海鲜类细胞。海鲜类细胞包括源自生活在海洋、河流湖泊及河岸栖息地的动物细胞的细胞。海鲜类细胞包括但不限于鱼类细胞、软体动物类细胞、甲壳类动物细胞、及其他可食用生物的细胞。在一些实施方案，所述禽类细胞选自但不限于：鸡、野鸡、鹅、天鹅、乳鸽、鸽子、火鸡和鸭。在一些实施方案，所述细胞包含原代禽类成纤维细胞。在一些实施方案，所述细胞包含继代禽类成纤维细胞。在一些实施方案，所述经培养的动物细胞是以下属的细胞：原鸡属(Gallus)、火鸡属(Meleagris)、鸭属(Anas)、牛属(Bos)、或猪属(Sus)。

在一些实施方案，所述细胞是UMNSAH/DFl(C1F)细胞。在某些实施方案，所述细胞是于1996年10月11日保藏在美国菌种保藏中心(ATCC，Manassas，Virginia，USA)的市售鸡细胞系。在一些实施方案，所使用的细胞源自ATCC保藏号CRL12203。

在一些实施方案，所述禽类细胞系具有自发永生化的成纤维细胞表型。在一些实施方案，所述禽类细胞系具有高增殖率。在某些实施方案，所述细胞具有永生化的成纤维细胞表型和高增殖率两者。

在一些实施方案，所述细胞并非以任何方式进行重组或改造的(即，为非转基因)。在一些实施方案，所述细胞未暴露于任何病毒和/或病毒DNA。在某些实施方案，所述细胞既非重组的，也未暴露于任何病毒和/或病毒DNA和/或RNA。

在一些实施方案，制备所述经培养的细胞的细胞膏，使得所述细胞膏的细胞浓度在1x 10⁹个细胞/ml至100x 10⁹个细胞/ml之间。湿细胞膏可通过从生物反应器中收获细胞并对所述收获的培养基进行脱水以浓缩所述细胞制备得到。或者，生物反应器中的培养基可在所需的细胞密度下进行收获，在此种情况下，可取消脱水步骤，或者可对培养基进行最低限度的脱水以达到所述湿细胞膏的所需细胞密度。细胞培养完成后，收获含有经培养的细胞的培养基并去除水分以增加培养基中细胞的浓度，来制备细胞膏或湿细胞膏。譬如，在收获1000L培养基后，去除培养基中存在的999L水(及其他培养基成分)以制备1L细胞膏，从而使细胞浓度增加1,000倍。每毫升含有1x 10⁶个细胞的收获培养基将制备每毫升1x 10⁹个细胞的细胞膏。类似地，可浓缩每毫升含有50x 10⁶个细胞的收获培养基，以制备每毫升50x10⁹个细胞的细胞膏。

在一些实施方案，所述湿细胞膏的细胞密度是在1x 10⁹个细胞/ml至100x 10⁹个细胞/ml之间、在1x 10⁹个细胞/ml至90x 10⁹个细胞/ml之间、在1x 10⁹个细胞/ml至80x 10⁹个细胞/ml之间、在1x 10⁹个细胞/ml至70x 10⁹个细胞/ml之间、在1x 10⁹个细胞/ml至60x 10⁹个细胞/ml之间、在1x 10⁹个细胞/ml至50x 10⁹个细胞/ml之间、在1x 10⁹个细胞/ml至40x10⁹个细胞/ml之间、在1x 10⁹个细胞/ml至30x 10⁹个细胞/ml之间、在1x 10⁹个细胞/ml至20x 10⁹个细胞/ml之间、在1x 10⁹个细胞/ml至10x 10⁹个细胞/ml之间、在10x 10⁹个细胞/ml至20x 10⁹个细胞/ml之间、在20x 10⁹个细胞/ml至30x 10⁹个细胞/ml之间、在30x 10⁹个细胞/ml至40x 10⁹个细胞/ml之间、在50x 10⁹个细胞/ml至60x 10⁹个细胞/ml之间、在70x10⁹个细胞/ml至80x 10⁹个细胞/ml之间、在80x 10⁹个细胞/ml至90x 10⁹个细胞/ml之间、或在90x 10⁹个细胞/ml至100x 10⁹个细胞/ml之间。

在一些实施方案，所述湿细胞膏在30℃和95℃之间的温度下，其储能模量(G')是在5Pa和300Pa之间、在5Pa和250Pa之间、在5Pa和200Pa之间、在5Pa和150Pa之间、在5Pa和100Pa之间、在5Pa和90Pa之间、在5Pa和80Pa之间、在5Pa和70Pa之间、在5Pa和60Pa之间、在5Pa和50Pa之间、在5Pa和40Pa之间、在5Pa和30Pa之间、在5Pa和25Pa之间、在5Pa和20Pa之间、在5Pa和15Pa之间、或在5Pa和10Pa之间。

在一些实施方案，所述湿细胞膏的凝胶化温度是在30℃和95℃之间、在35℃和95℃之间、在40℃和95℃之间、在45℃和95℃之间、在50℃和95℃之间、在50℃和85℃之间、在50℃和75℃之间、在50℃和70℃之间、在50℃和65℃之间、或在50℃和60℃之间。

培养基与生长

在一些实施方案，增殖发生在悬浮或贴壁条件下，含或不含饲养细胞和/或在含血清或无血清培养基条件下。在一些实施方案，用于增殖的培养基含有氨基酸类、肽类、蛋白质类、碳水化合物类、必需金属类、矿物质类、维生素类、缓冲剂类、抗微生物剂类、生长因子类、和/或附加组分中的一种或多种。

在一些实施方案，增殖通过本领域技术人员已知的任何方法进行测定。在一些实施方案，增殖通过直接细胞计数进行测定。在某些实施方案，增殖通过血细胞计数器进行测定。在一些实施方案，增殖通过自动细胞成像进行测定。在某些实施方案，增殖通过库尔特计数器(Coulter counter)进行测定。

在一些实施方案，增殖是通过使用活力染色进行测定。在某些实施方案，所使用的染色剂包含台盼蓝。

在一些实施方案，增殖通过总DNA进行测定。在一些实施方案，增殖通过BrdU标记进行测定。在一些实施方案，增殖通过代谢测定法进行测定。在某些实施方案，增殖通过使用四唑盐类进行测定。在某些实施方案，增殖通过ATP耦合发光进行测定。

在一些实施方案，所述培养基是基础培养基。在一些实施方案，所述基础培养基是DMEM、DMEM/F12、MEM、HAMS’s F10、HAM’s F12、IMDM、McCoy's培养基和RPMI。

在一些实施方案，所述基础培养基包含氨基酸。在一些实施方案，所述基础培养基包含生物素。在一些实施方案，所述基础培养基包含氯化胆碱。在一些实施方案，所述基础培养基包含D-泛酸钙。在一些实施方案，所述基础培养基包含叶酸。在一些实施方案，所述基础培养基包含烟酰胺。在一些实施方案，所述基础培养基包含盐酸吡哆醇。在一些实施方案，所述基础培养基包含核黄素。在一些实施方案，所述盐酸硫胺素是基础培养基(DMEM/F12)的一部分。在一些实施方案，所述基础培养基包含维生素B12(亦称为氰钴胺素)。在一些实施方案，所述基础培养基包含i-肌醇(myo-inositol)。在一些实施方案，所述基础培养基包含氯化钙。在一些实施方案，所述基础培养基包含硫酸铜。在一些实施方案，所述基础培养基包含硝酸铁。在一些实施方案，所述基础培养基包含氯化镁。在一些实施方案，所述基础培养基包含硫酸镁。在一些实施方案，所述基础培养基包含氯化钾。在一些实施方案，所述基础培养基包含碳酸氢钠。在一些实施方案，所述基础培养基包含氯化钠。在一些实施方案，所述基础培养基包含磷酸二钠。在一些实施方案，所述基础培养基包含磷酸二氢钠。在一些实施方案，所述基础培养基包含硫酸锌。在一些实施方案，所述生长培养基包含糖类。在一些实施方案，所述糖类包括但不限于D-葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、或其任何组合。在一个实施方案，所述糖类包括D-葡萄糖和甘露糖两者。在葡萄糖和甘露糖均用于生长培养基中以培养细胞的实施方案中，所述生长培养基(培养基)中葡萄糖的量是介于0.1-10g/L之间、0.1-9g/L、0.1-8g/L、0.1-7g/L、0.1-6g/L、0.1-5g/L、0.1-4g/L、0.1-3g/L、0.1-2g/L、0.1-1g/L、0.5-10g/L、0.5-9g/L、0.5-8g/L、0.5-7g/L、0.5-6g/L、0.5-5g/L、0.5-4g/L、0.5-3g/L、0.5-2g/L、0.5-1g/L、1-10g/L、1-9g/L、1-8g/L、1-9g/L、1-8g/L、1-7g/L、1-6g/L、1-5g/L、1-4g/L、1-3g/L、1-2g/L、2-10g/L、2-9g/L、2-8g/L、2-9g/L、2-8g/L、2-7g/L、2-6g/L、2-5g/L、2-4g/L、2-3g/L、3-10g/L、3-9g/L、3-8g/L、3-9g/L、3-8g/L、3-7g/L、3-6g/L、3-5g/L、3-4g/L、4-10g/L、4-9g/L、4-8g/L、4-9g/L、4-8g/L、4-7g/L、4-6g/L、4-5g/L、5-10g/L、5-9g/L、5-8g/L、5-9g/L、5-8g/L、5-7g/L、或5-6g/L，和所述生长培养基中甘露糖的量是介于0.1-10g/L之间、0.1-9g/L、0.1-8g/L、0.1-7g/L、0.1-6g/L、0.1-5g/L、0.1-4g/L、0.1-3g/L、0.1-2g/L、0.1-1g/L、0.5-10g/L、0.5-9g/L、0.5-8g/L、0.5-7g/L、0.5-6g/L、0.5-5g/L、0.5-4g/L、0.5-3g/L、0.5-2g/L、0.5-1g/L、1-10g/L、1-9g/L、1-8g/L、1-9g/L、1-8g/L、1-7g/L、1-6g/L、1-5g/L、1-4g/L、1-3g/L、1-2g/L、2-10g/L、2-9g/L、2-8g/L、2-9g/L、2-8g/L、2-7g/L、2-6g/L、2-5g/L、2-4g/L、2-3g/L、3-10g/L、3-9g/L、3-8g/L、3-9g/L、3-8g/L、3-7g/L、3-6g/L、3-5g/L、3-4g/L、4-10g/L、4-9g/L、4-8g/L、4-9g/L、4-8g/L、4-7g/L、4-6g/L、4-5g/L、5-10g/L、5-9g/L、5-8g/L、5-9g/L、5-8g/L、5-7g/L、或5-6g/L。技术人员将理解可使用所述这些量的葡萄糖和甘露糖的组合，例如介于2-5克葡萄糖和1-4克甘露糖之间。

在一些实施方案，所述基础培养基包含亚油酸。在一些实施方案，所述基础培养基包含硫辛酸。在一些实施方案，所述基础培养基包含腐胺-2HCl。在一些实施方案，所述基础培养基包含1,4-丁二胺。在一些实施方案，所述基础培养基包含Pluronic F-68。在一些实施方案，所述基础培养基包含胎牛血清。在某些实施方案，所述基础培养基包含本段中的每一种成分。在某些实施方案，所述基础培养基是DMEM/F12。

在一些实施方案，所述生长培养基包含血清。在一些实施方案，所述血清选自小牛血清、鸡血清、及其任何组合。

在一些实施方案，所述生长培养基包含至少10％胎牛血清。在某些实施方案，所述禽类成纤维细胞群体在具有至少10％胎牛血清的培养基中生长，随后在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于2％。

在另一实施方案，所述培养基不含血清，包括胎牛血清、胎小牛血清、或任何动物来源的血清。

在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于1.9％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于1.7％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于1.5％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于1.3％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于1.1％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于0.9％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于0.7％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于0.5％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于0.3％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于0.1％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至小于或等于0.05％胎牛血清。在某些实施方案，在回收细胞之前将胎牛血清降低至约0％胎牛血清。

在一些实施方案，所述基础培养基是DMEM/F12且比例为3:1、2:1、或1:1。在某些实施方案，所述基础培养基是DMEM/F12且比例为约3:1。在某些实施方案，所述基础培养基是DMEM/F12且比例为约2:1。在某些实施方案，所述基础培养基是DMEM/F12且比例为约1:1。

在一些实施方案，所述生长培养基经修饰以优化来自细胞信号传导通路的至少一种基因的表达，所述细胞信号传导通路选自由以下组成的组：蛋白酶体、类固醇生物合成、氨基酸降解、氨基酸生物合成、药物代谢、粘着斑、细胞周期、MAPK信号传导、谷胱甘肽代谢、TGF-β、吞噬体、萜类化合物生物合成、DNA复制、糖酵解、糖异生、蛋白质输出、丁酸代谢、以及酮体的合成和降解。

在一些实施方案，针对生成禽类成纤维细胞的步骤的一种或多种细胞信号传导通路的基因表达进行监测。在某些实施方案，根据从所述监测基因表达获得的数据，在细胞生成的各个阶段调整生长培养基。

在一些实施方案，通过向生长培养基添加足以诱导一种或多种脂质蓄积的量的一种或多种化合物或从生长培养基去除足以诱导一种或多种脂质蓄积的量的一种或多种化合物，从而诱导禽类成纤维细胞蓄积脂质。

在一些实施方案，通过生长因子类、蛋白质类、肽类、脂肪酸类、元素类、小分子类、植物水解产物类、定向进化、基因工程、培养基组成、生物反应器设计、和/或支架设计中的一种或多种，改善在任何培养条件下禽类成纤维细胞的以下中的一种或多种：维持、增殖、分化、脂质蓄积、脂质含量、纯化倾向和/或收获效率、生长速率、细胞密度、细胞重量、抗污染性、禽类成纤维细胞特异性基因表达和/或蛋白质分泌、剪切敏感性、风味、质构、颜色、气味、香气、味觉质量、营养质量、最小化的生长抑制性副产物分泌、和/或最小化的培养基需求。在某些实施方案，所述脂肪酸包含十八碳四烯酸(SDA)。在某些实施方案，所述脂肪酸包含亚油酸。在某些实施方案，所述生长因子包含胰岛素或胰岛素样生长因子。在某些实施方案，所述生长因子包含成纤维细胞生长因子或类似物。在某些实施方案，所述生长因子包含表皮生长因子或类似物。在某些实施方案，所述蛋白质包含转铁蛋白。在某些实施方案，所述元素包括硒。在某些实施方案，所述小分子包含乙醇胺。培养中乙醇胺的量是在0.05-10mg/L之间、0.05-10mg/L、0.1-10mg/L、0.1-9.5mg/L、0.1-9mg/L、0.1-8.5mg/L、0.1-8.0mg/L、0.1-7.5mg/L、0.1-7.0mg/L、0.1-6.5mg/L、0.1-6.0mg/L、0.1-5.5mg/L、0.1-5.0mg/L、0.1-4.5mg/L、0.1-4.0mg/L、0.1-3.5mg/L、0.1-3.0mg/L、0.1-2.5mg/L、0.1-2.0mg/L、0.1-1.5mg/L、和0.1-1.0mg/L。

在某些实施方案，所述培养基可补充有植物水解产物。在某些实施方案，所述水解产物包含酵母提取物、小麦蛋白胨、大米蛋白胨、植物蛋白胨、yeastolate、豌豆蛋白胨、大豆蛋白胨、豌豆蛋白胨、马铃薯蛋白胨、绿豆蛋白水解物或sheftone。用于培养的水解产物的量是在0.1g/L至5g/L之间、0.1g/L至4.5g/L之间、0.1g/L至4g/L之间、0.1g/L至3.5g/L之间、0.1g/L至3g/L之间、0.1g/L至2.5g/L之间、0.1g/L至2g/L之间、0.1g/L至1.5g/L之间、0.1g/L至1g/L之间、或0.1g/L至0.5g/L之间。

在一些实施方案，所述小分子包含乳酸脱氢酶抑制剂。如以下实施例中所述，乳酸脱氢酶抑制剂抑制乳酸形成。由禽类细胞生成的乳酸会抑制细胞的生长。示例性乳酸脱氢酶抑制剂选自由以下组成的组：草氨酸盐、培黄素(galloflavin)、棉酚、喹啉3-磺胺类、N-羟基吲哚类抑制剂、和FX11。在一些实施方案，发酵培养基中乳酸脱氢酶抑制剂的量是在1-500mM之间、1-400mM、1-300mM、1-250mM、1-200mM之间、1-175mM、1-150mM、1-100mM、1-50mM、1-25mM、25-500mM、25-400mM、25-300mM、25-250mM、25-200mM、25-175mM、25-125mM、25-100mM、25-75mM、25-50mM、50-500mM、50-400mM、50-300mM、50-250mM、50-200mM、50-175mM、50-150mM、50-125mM、50-100mM、50-75mM、75-500mM、75-400mM、75-300mM、75-250mM、75-200mM、75-175mM、75-150mM、75-125mM、75-100mM、100-500mM、100-400mM、100-300mM、100-250mM、100-200mM、100-150mM、100-125mM、和100-500mM。

在一些实施方案，所述经培养的动物细胞在悬浮培养系统中生长。在一些实施方案，所述经培养的动物细胞是在分批、补料分批、半连续(填充和抽取)或灌注培养系统或其某种组合中生长。当在悬浮培养中生长时，所述悬浮培养可在所需尺寸的容器(发酵罐、生物反应器)中进行。所述容器的尺寸适合禽类细胞生长，而不会出现不可接受的细胞破裂。在一些实施方案，所述悬浮培养系统可在至少25升(L)、50L、100L、200L、250L、350L、500升(L)、1,000L、2,500L、5,000L、10,000L、25,000L、50,000L、100,000L、200,000L、250,000L、或500,000L的容器中进行。对于较小规模的悬浮培养，细胞的培养可在至少125mL、250mL、500mL、1L、1.5L、2L、2.5L、3L、5L、10L或更大的烧瓶中进行。

在一些实施方案，所述悬浮培养的细胞密度是0.25x 10⁶个细胞/ml、介于0.5x10⁶个细胞/ml和1.0x10⁶个细胞/ml之间、介于1.0x 10⁶个细胞/ml和2.0x 10⁶个细胞/ml之间、介于2.0x 10⁶个细胞/ml和3.0x 10⁶个细胞/ml之间、介于3.0x 10⁶个细胞/ml和4.0x 10⁶个细胞/ml之间、介于4.0x 10⁶个细胞/ml和5.0x 10⁶个细胞/ml之间、介于5.0x 10⁶个细胞/ml和6.0x 10⁶个细胞/ml之间、介于6.0x 10⁶个细胞/ml和7.0x 10⁶个细胞/ml之间、介于7.0x10⁶个细胞/ml和8.0x 10⁶个细胞/ml之间、介于8.0x 10⁶个细胞/ml和9.0x 10⁶个细胞/ml之间、介于9.0x 10⁶个细胞/ml和10x 10⁶个细胞/ml之间、介于10x 10⁶个细胞/ml和15.0x 10⁶个细胞/ml之间、介于15x 10⁶个细胞/ml和20x 10⁶个细胞/ml之间、介于20x 10⁶个细胞/ml和25x 10⁶个细胞/ml之间、介于25x 10⁶个细胞/ml和30x 10⁶个细胞/ml之间、介于30x 10⁶个细胞/ml和35x 10⁶个细胞/ml之间、介于35x 10⁶个细胞/ml和40x 10⁶个细胞/ml之间、介于40x 10⁶个细胞/ml和45x 10⁶个细胞/ml之间、介于45x 10⁶个细胞/ml和50x 10⁶个细胞/ml之间、介于50x 10⁶个细胞/ml和55x 10⁶个细胞/ml之间、介于55x 10⁶个细胞/ml和60x10⁶个细胞/ml之间、介于60x 10⁶个细胞/ml和65x 10⁶个细胞/ml之间、介于70x 10⁶个细胞/ml和75x 10⁶个细胞/ml之间、介于75x 10⁶个细胞/ml和80x 10⁶个细胞/ml之间、介于85x10⁶个细胞/ml和90x 10⁶个细胞/ml之间、介于90x 10⁶个细胞/ml和95x 10⁶个细胞/ml之间、介于95x 10⁶个细胞/ml和100x 10⁶个细胞/ml之间、介于100x 10⁶个细胞/ml和125x 10⁶个细胞/ml之间、或介于125x 10⁶个细胞/ml和150x 10⁶个细胞/ml之间。

在一些实施方案，所述经培养的动物细胞在嵌入支架中或附着于支架材料时生长。在一些实施方案，所述禽类成纤维细胞在生物反应器和/或支架上分化或增殖。在一些实施方案，所述支架包含微载体、类器官和/或血管化培养物、自组装共培养物、单层、水凝胶支架、脱细胞禽类成纤维细胞和/或可食用基质中的至少一种或多种。在一些实施方案，所述支架包含塑料和/或玻璃或其他材料中的至少一种。在一些实施方案，所述支架包含基于天然的(生物)聚合物甲壳质、藻酸盐、硫酸软骨素、角叉菜胶、结冷胶、透明质酸、纤维素、胶原蛋白、明胶、和/或弹性蛋白。在一些实施方案，所述支架包含蛋白质或多肽，或经修饰的蛋白质或经修饰的多肽。未经修饰的蛋白质或多肽或经修饰的蛋白质或多肽包含从植物或其他生物体中分离的蛋白质或多肽。示例性植物蛋白分离物或植物蛋白浓缩物包含豆类蛋白、野豌豆蛋白、谷物蛋白、坚果蛋白、大型藻类蛋白、微藻类蛋白、及其他植物蛋白。豆类蛋白可从干豆、扁豆、绿豆、蚕豆、干豌豆、鹰嘴豆、豇豆、班巴拉豆(bambara beans)、木豆、羽扇豆、野豌豆、小豆、普通菜豆(common beans)、胡芦巴、长豆、利马豆、红花菜豆、宽叶菜豆、大豆、或黧豆获得。野豌豆蛋白可从豌豆属获得。谷物蛋白可从小麦、大米、画眉草、燕麦、玉米、大麦、高粱、黑麦、小米、黑小麦、苋菜、荞麦、藜麦和其他谷物获得。坚果蛋白可从杏仁、腰果、山核桃、花生、核桃、澳洲坚果、榛子、开心果、巴西坚果(brazil)、栗子、可乐果、葵花籽、南瓜子、亚麻籽、可可、松子、银杏和其他坚果得到。从动物来源获得的蛋白质亦可用作支架，包括乳蛋白、乳清、酪蛋白、蛋蛋白及其他动物蛋白。在一些实施方案，自组装共培养物包含球状体和/或聚集体。在一些实施方案，单层具有或不具有细胞外基质。在一些实施方案，水凝胶支架包含透明质酸、藻酸盐和/或聚乙二醇中的至少一种。在一些实施方案，可食用基质包含脱细胞植物组织。在一些实施方案，用于经培养的动物细胞的支架是本发明所述的经培养的动物细胞的挤出物。在一个实施方案，首先制备本发明的挤出物，然后用作在其上培养动物细胞的支架。

在一些实施方案，原代或继代禽类成纤维细胞如前述段落中的任一段所述进行修饰或生长。

细胞回收

可通过技术人员显而易见的任何技术来回收所述经培养的动物细胞。在一些实施方案，将禽类成纤维细胞与生长培养基分离或从生物反应器或支架中移出。在某些实施方案，所述禽类成纤维细胞通过离心、机械挤压/压滤、过滤、絮凝或凝结或重力沉降或干燥或其某种组合来分离。在某些实施方案，过滤方法包含切向流过滤、真空过滤、旋转真空过滤及类似方法。在某些实施方案，干燥可通过快速干燥、床干燥、盘式干燥和/或流化床干燥及类似方法来完成。在某些实施方案，将所述禽类成纤维细胞进行酶促分离。在某些实施方案，将所述禽类成纤维细胞进行机械分离。

细胞安全性

在一些实施方案，所述经培养的动物细胞群体是基本上纯的。

在一些实施方案，在细胞培养的一个或多个步骤中进行测试以确定所述经培养的动物细胞是否基本上纯。

在一些实施方案，针对经培养的动物细胞是否存在细菌进行测试。在某些实施方案，测试的细菌类型包括但不限于：肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejunim)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、粪链球菌(Fecal streptococcus)、支原体属(Mycoplasma genus)、肺支原体(Mycoplasma pulmonis)、大肠菌群(Coliforms)和大肠杆菌(Escherichia coli)。

在一些实施方案，针对细胞培养基的组分进行测试，例如胎牛血清，以确定病毒是否存在。在某些实施方案，所述病毒包括但不限于：蓝舌病、牛腺病毒、牛细小病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛科病毒性腹泻病毒、狂犬病、呼肠孤病毒、腺相关病毒、BK病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、疱疹病毒6型、疱疹病毒7型、疱疹病毒8型、HIV1、HIV-2、HPV-16、HPV18、人巨细胞病毒、人泡沫病毒、人T淋巴细胞病毒、约翰坎宁安病毒(John Cunninghamvirus)和细小病毒B19。

在一些实施方案，针对是否存在酵母菌和/或霉菌进行测试。

在一些实施方案，通过质谱法，例如电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)，对金属浓度进行测试。在某些实施方案，所测试的金属包括但不限于：砷、铅、汞、镉和铬。

在一些实施方案，针对培养物中产生的激素进行测试。在某些实施方案，所述激素包括但不限于：17β-雌二醇、睾酮、黄体酮、右环十四酮酚、醋酸美伦孕酮(melengesterolacetate)、醋酸群勃龙、醋酸甲地孕酮、醋酸美伦孕酮(melengesterol acetate)、醋酸氯地孕酮、己二烯雌酚、己烯雌酚、己烷雌酚、左环十四酮酚、玉米赤霉酮、和右环十四酮酚。

在一些实施方案，所述这些测试符合美国食品药品监督管理局详细规定的当前良好生产工艺过程。

表型分析、过程监测和数据分析

在一些实施方案，可通过本领域技术人员已知的任何技术来监测细胞。在一些实施方案，在使用RT-qPCR提取总RNA之后使用分化的转录标记来测定和/或确证分化，然后将目的转录基因的水平与参比例如持家基因进行比较。

食品组合物

在某些实施方案，本发明提供了包含经培养的动物细胞的挤出食品组合物或食品。在一些实施方案，将经培养的动物细胞与其他物质或成分组合以制备组合物，所述组合物为挤出食品组合物。在某些实施方案，所述经培养的动物细胞单独用于挤出食品。在某些实施方案，所述挤出食品组合物是类似于以下的产品：牛排、肉块、嫩肉、胸肉、牡蛎、足、翅、香肠、饲料或皮。在某些实施方案，所述挤出产品类似于鸡肉产品。

在一些实施方案，将所述回收的经培养的动物细胞与其他成分制备成组合物。在某些实施方案，所述组合物包含细胞膏、植物蛋白、脂肪(脂质)和水。

在某些实施方案，所述挤出食品组合物或食品具有至少100重量％、90重量％、80重量％、75重量％、70重量％、65重量％、60重量％、50重量％、40重量％、30重量％、35重量％、25重量％、15重量％、10重量％、5重量％、或1重量％的湿细胞膏含量。在某些实施方案，所述挤出食品组合物或食品具有在10重量％-20重量％之间、20重量％-30重量％、30重量％-40重量％、40重量％-50重量％、60重量％-70重量％、80重量％-90重量％、或90重量％-100重量％的湿细胞膏含量。在某些实施方案，所述挤出物或食品具有在10重量％-20重量％之间、20重量％-30重量％、30重量％-40重量％、40重量％-50重量％、60重量％-70重量％、80重量％-90重量％、或90重量％-100重量％的经培养的动物细胞含量。在某些实施方案，所述组合物包含至少75重量％、70重量％、60重量％、50重量％、40重量％、30重量％、25重量％、20重量％、或15重量％的植物蛋白含量。在某些实施方案，所述挤出食品具有在10重量％-20重量％之间、20重量％-30重量％、30重量％-40重量％、40重量％-50重量％、60重量％-70重量％、80重量％-90重量％、或90重量％-95重量％的植物蛋白含量。在某些实施方案，所述挤出物包含至少50重量％、40重量％、30重量％、25重量％、20重量％、15重量％、10重量％、5重量％、或1重量％的脂肪含量。在某些实施方案，所述挤出食品组合物或食品具有在10重量％-20重量％之间、20重量％-30重量％、30重量％-40重量％、40重量％-50重量％、60重量％-70重量％、80重量％-90重量％、或90重量％-95重量％的脂肪含量。在某些实施方案，所述挤出物包含至少50重量％、40重量％、30重量％、25重量％、20重量％、15重量％、10重量％、或5重量％的水含量。在某些实施方案，所述挤出物具有在10重量％-20重量％之间、20重量％-30重量％、30重量％-40重量％、40重量％-50重量％、60重量％-70重量％、80重量％-90重量％、或90重量％-95重量％的水含量。在某些实施方案，所述挤出物包含在2％-5％之间、5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、50％-55％、55％-60％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、或90％-95％的湿细胞膏含量。

在一些实施方案，所述挤出物包含至少一种其他成分。所述至少一种其他成分的量是在0.1重量％至0.2重量％之间、在0.2重量％至0.3重量％之间、在0.3重量％至0.4重量％之间、在0.4重量％至0.5重量％之间、在0.5重量％至0.6重量％之间、在0.6重量％至0.7重量％之间、在0.7重量％至0.8重量％之间、在0.8重量％至0.9重量％之间、在0.9重量％至1重量％之间、在1重量％至2重量％之间、在2重量％至3重量％之间、在3重量％至4重量％之间、在4重量％至5重量％之间、在5重量％至7.5重量％之间、在7.5重量％至10重量％之间、在10重量％至12.5重量％之间、在12.5重量％至15重量％之间、在15重量％至20重量％之间、在20重量％至25重量％之间、在25重量％至30重量％之间、在30重量％至40重量％之间、在40重量％至50重量％之间、在50重量％至60重量％之间、或在60重量％至75重量％之间。

在一些实施方案，所述挤出物包含肽交联酶，例如，含量在0.0001-0.025％之间的转谷氨酰胺酶。

在某些实施方案，所述挤出物或食品包含至少1重量％、1重量％、5重量％、10重量％、15重量％、20重量％、25重量％、30重量％、35重量％、40重量％、45重量％、50重量％、55重量％、60重量％、65重量％、70重量％、75重量％、80重量％、85重量％、90重量％、95重量％、或99重量％的细胞干重含量。在某些实施方案，所述挤出物或食品包含在2％-5％之间、5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、50％-55％、55％-60％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、或90％-95％的细胞干重含量。

在某些实施方案，所述挤出物或食品包含至少1重量％、至少3重量％、至少5重量％、至少10重量％、至少15重量％、至少20重量％、至少25重量％、至少30重量％、至少35重量％、至少40重量％、至少45重量％、至少50重量％、至少55重量％、至少60重量％、至少65重量％、至少70重量％、至少75重量％、至少80重量％、至少85重量％、至少90重量％、至少95重量％、或至少99重量％的湿细胞膏含量。

在某些实施方案，所述挤出物或食品包含在2％-5％之间、5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、50％-55％、55％-60％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、或90％-95％的细胞干重含量。

在某些实施方案，所述挤出物或食品包含至少2重量％、5重量％、10重量％、15重量％、20重量％、25重量％、30重量％、35重量％、40重量％、45重量％、50重量％、55重量％、60重量％、65重量％、70重量％、75重量％、80重量％、85重量％、90重量％或95重量％的豆类蛋白含量。在某些实施方案，所述挤出物或食品包含在2％-5％之间、5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、50％-55％、55％-60％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、或90％-95％的豆类蛋白含量。在一些实施方案，所述豆类蛋白是绿豆蛋白。

在某些实施方案，所述挤出物或食品包含至少1重量％的脂肪含量、至少2重量％的脂肪含量、至少5重量％的脂肪含量、至少7.5重量％的脂肪含量、或至少10重量％的脂肪含量、至少15重量％、至少20重量％、至少25重量％、至少30重量％、至少35重量％、至少40重量％、至少45重量％、至少50重量％、至少55重量％、至少60重量％、至少70重量％、至少75重量％、至少80重量％、至少85重量％、至少90重量％、或至少95重量％的脂肪含量。在一些实施方案，所述挤出物或食品包含在1％-5％之间、5％-10％之间、10％-15％之间、15％-20％之间、20％-25％之间、25％-30％之间、30％-35％之间、35％-40％之间、45％-50％之间、50％-55％之间、55％-60％之间、60％-65％之间、65％-70％之间、70％-75％之间、75％-80％之间、80％-85％之间、85％-90％之间、或90％-95％之间的脂肪含量。

在某些实施方案，所述挤出物或食品包含至少5重量％、至少10重量％、至少15重量％、至少20重量％、至少25重量％、至少30重量％、至少35重量％、至少40重量％、至少45重量％、至少50重量％、至少55重量％、至少60重量％、至少65重量％、至少70重量％、至少75重量％、至少80重量％、至少85重量％、至少90重量％、或至少95重量％的水含量。

在一个实施方案，所述挤出物或食品包含在25重量％-75重量％之间的湿细胞膏含量、在15重量％-45重量％之间的绿豆蛋白含量、在10重量％-30重量％之间的脂肪含量、和在20重量％-50重量％之间的水含量。

在某些实施方案，所述挤出物或食品包含肽交联酶。示例性肽交联酶选自由以下组成的组：转谷氨酰胺酶、分选酶、枯草杆菌蛋白酶、酪氨酸酶、漆酶、过氧化物酶、和赖氨酰氧化酶。在某些实施方案，所述组合物包含介于0.0001重量％-0.025重量％之间、0.0001重量％-0.020重量％、0.0001重量％-0.0175重量％、0.0001重量％-0.0150重量％、0.0001重量％-0.0125重量％、0.0001重量％-0.01重量％、0.0001重量％-0.0075重量％、0.0001重量％-0.005重量％、0.0001重量％-0.0025重量％、0.0001重量％-0.002重量％、0.0001重量％-0.0015重量％、0.0001重量％-0.001重量％、或0.0001重量％-0.00015重量％的交联酶。在某些实施方案，所述食品组合物或食品包含介于0.0001重量％-0.025重量％之间、0.0001重量％-0.020重量％、0.0001重量％-0.0175重量％、0.0001重量％-0.0150重量％、0.0001重量％-0.0125重量％、0.0001重量％-0.01重量％、0.0001重量％-0.0075重量％、0.0001重量％-0.005重量％、0.0001重量％-0.0025重量％、0.0001重量％-0.002重量％、0.0001重量％-0.0015重量％、0.0001重量％-0.001重量％、或0.0001重量％-0.00015重量％的转谷氨酰胺酶含量。不受理论的束缚，据信所述肽交联酶交联所述豆类蛋白或野豌豆蛋白，并且据信所述肽交联酶将所述豆类蛋白或野豌豆蛋白交联至禽类细胞。

在一个实施方案，相对于不含转谷氨酰胺酶的细胞膏，以体积为基础表示，所述挤出物或食品包含0.0001％至0.0125％的转谷氨酰胺酶，并表现出降低或显著降低的脂氧合酶活性或降低或显著降低的氧化脂质的其他酶。更优选地，所述挤出物或食品基本上不含脂氧合酶或可氧化脂质的酶。在一些实施方案，观察到氧化酶活性相对于组合物降低了5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、或80％。脂氧合酶催化脂质的氧化，其帮助形成赋予组合物不良风味的化合物。

在一些实施方案，绿豆蛋白被基于植物的蛋白质替代，所述基于植物的蛋白质包含来自鹰嘴豆、蚕豆、黄豌豆、甜糙米、黑麦、金扁豆、开边扁豆(chana dal)、大豆、小豆、高粱、发芽的绿小扁豆、杜风小扁豆(du pung style lentil)、和/或白利马豆的蛋白质。

在一些实施方案，附加可食用成分的添加可用于制备食品的所述食品组合物。可食用食品成分包含质构改性成分，例如，诸如淀粉类、改性淀粉类、树胶类及其他亲水胶体类(hydrocolloids)的湿润剂类。其他食品成分包含pH调节剂类、抗结块剂类、色素类、乳化剂类、调味剂类、增味剂类、发泡剂类、消泡剂类、湿润剂类、甜味剂类、及其他可食用成分。湿润剂的添加使得所述挤出物中水分保留。此外，不受理论的束缚，据信湿润剂的添加会在所述挤出物中产生更多的纤维结构。

在某些实施方案，所述方法和食品组合物或食品包含与所述食品组分联合的有效量的添加防腐剂。

防腐剂防止食品因细菌、霉菌、真菌、或酵母而变质(抗微生物剂类)；减缓或防止颜色、风味或质构变化并延迟酸败(抗氧化剂类)；保持新鲜度。在某些实施方案，防腐剂是下列中的一种或多种：抗坏血酸、柠檬酸、苯甲酸钠、丙酸钙、异抗坏血酸钠、亚硝酸钠、山梨酸钙、山梨酸钾、BHA、BHT、EDTA、生育酚类(维生素E)和抗氧化剂类，其可防止脂肪类和油类以及含有其的所述食品变质或产生异味。

所述挤出食品具有类似于得自养殖动物的肉类的质构。Warner-Bratzler剪切力测试对切开一块农场饲养的肉、培养肉或挤出培养肉所需的力进行测定。换言之，Warner-Bratzler评分是衡量肉硬度的指标。Warner-Bratzler剪切力测试设备可从许多制造商处购得。Warner-Bratzler评分是以牛顿或磅为单位的力的度量单位。在一些实施方案，所述挤出物或所述食品的Warner-Bratzler评分是在5N至300N之间、在5N至50N之间、在50N至75N之间、在75N至100N之间、在100N至125N之间、在125N至150N之间、在150N至175N之间、在175N至200N之间、在200N至225N之间、在225N至250N之间、在250N至275N之间、和在275N至300N之间。

另一种测定食品硬度的方法是使用穿刺试验来测定将食品穿刺至预定深度所需的力。市售的质构分析仪可测定穿刺所述培养肉产品所需的力。示例性质构分析仪是由Stable Micro Systems制造的TA.XTplus质构分析仪。在一些实施方案，穿刺所述挤出食品所需的力具有通过穿刺试验测得的介于1N和50N之间、介于1N和45N之间、介于1N和40N之间、介于1N和35N之间、介于1N和30N之间、介于1N和25N之间、介于1N和20N之间、介于1N和15N之间、介于1N和10N之间、介于1N和9N之间、介于1N和8N之间、介于1N和7N之间、介于1N和6N之间、介于1N和5N之间、介于1N和4N之间、介于1N和3N之间、介于1N和2N之间、介于2N和15N之间、介于2N和10N之间、介于2N和9N之间、介于2N和8N之间、介于2N和7N之间、介于2N和6N之间、介于2N和5N之间、介于2N和4N之间、或介于2N和3N之间的硬度。

在一些实施方案，所述挤出物用作3D打印的基材。在一些实施方案，所述3D打印材料是可食用的。3D打印是一种制造工艺，其中从基材开始，将各种所需的层按顺序添加至基材上。3D打印过程被描述为“增材过程”。在食品原料的3D打印中，此过程从可食用基材开始，然后将其他可食用材料沉积到基材上。在一些实施方案，本发明所述的挤出物用作3D打印的基材。在一些实施方案，将各种细胞例如成纤维细胞、脂肪细胞、肌肉细胞及其他细胞类型沉积到所述挤出物上。此外，将其他成分例如但不限于脂肪类、盐、糖、香料类、调味剂类、气味剂类、聚合物类例如多糖类和/或多肽类沉积到所述挤出物上。

挤出工艺方法

在一些实施方案，本发明提供了制备挤出食品的方法。所述挤出食品在挤出机中制备得到。

挤压烹饪是一种热机械操作，其提供连续的混合、揉捏和成型。常用的挤出机包括四种类型：单螺杆湿式挤出机、单螺杆干式挤出机、单螺杆断续飞行挤出机和双螺杆挤出机。双螺杆挤出机可用于湿法挤出或干法挤出。

本发明所述的挤出工艺方法包括：制备面团或面团/细胞掺和物并将其放置入与体积进料器或重力进料器连接的料斗中，进入挤出机的固定机筒中。将所述面团或面团/细胞掺和物送入所述机筒中，并经由旋转螺杆通过机械压力输送通过所述旋转螺杆和所述固定机筒之间的通道。所述固定机筒可进行加热，通常是蒸汽加热。当所述面团或所述面团/细胞掺和物沿所述机筒输送时，一个或多个端口可用于注入液体成分，包括经培养的动物细胞、油、水、糖溶液和/或至少一种其他成分。当所述面团或所述面团/细胞掺和物被输送至所述机筒的末端时，所述挤出物通过模具(通常是小出口)离开挤出机。在一些实施方案，将所述面团或所述面团/细胞掺和物加热。当所述面团或所述面团/细胞掺和物被输送通过所述机筒时，可通过加热所述固定机筒或通过向所述机筒内输注蒸汽来加热所述面团或面团/细胞掺和物。

根据挤出物所需的物理性能，可采用湿法挤出工艺或干法挤出工艺。不受理论的束缚，据信湿法挤出工艺可产生具有更明显的纤维结构的挤出物。据信，在输送所述面团或所述面团/细胞掺和物通过所述机筒的过程中的层流，蛋白质分子和/或共价连接至经培养的动物细胞的蛋白质分子经历层流并重新排列成纤维束，从而产生类似于得自养殖动物的肉类的质构的产品。

在“湿法挤出”工艺方法中，所述面团或所述面团/细胞掺和物的水分含量高于40％。在“湿法挤出”工艺方法中，所述面团或所述面团/细胞掺和物的水分含量是40％-45％、45％-50％、50％-55％、55％-60％、60％-65％、65％-70％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、或90％-95％。

在“干法挤出”工艺方法中，所述面团或所述面团/细胞掺和物的水分含量低于40％。在“干法挤出”工艺方法中，所述面团或所述面团/细胞掺和物的水分含量是5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、或35％-40％。

在一些实施方案，将干燥成分放置在料斗中，所述干燥成分包含植物蛋白。在一些实施方案，所述干燥成分包含植物蛋白、至少一种其他成分和/或干燥肽交联剂以制备干燥的成分混合物。在其他实施方案，所述干燥成分包含植物和干燥的经培养动物细胞。可使用包括冷冻干燥在内的常规干燥方法或通过对经培养的动物细胞施加热和/或真空来干燥所述经培养的动物细胞。将所述干燥的成分混合物以所需的加载速率放置入挤出机的机筒中。当所述干燥的成分混合物被输送通过机筒时，通过向机筒内输注蒸汽或水来制备面团或面团/细胞掺和物。将所述面团或所述面团/细胞掺和物输送通过机筒并且任选地加热。在所述经培养的动物细胞不为干成分的一些实施方案中，将所述经培养的动物细胞注入机筒中以制备所述面团/细胞掺和物。在其他实施方案，通过模具挤出所述面团/细胞掺和物以制备所述挤出物。

挤出机的螺杆配置可分为两大类：单螺杆和双螺杆。在单螺杆挤出机中，螺杆设计可具有多种配置，包括螺距减小、芯增大、螺纹筒、锥形筒或交替销型螺杆，或其他螺杆设计。在双螺杆挤出机中，其具有两个螺杆。此两个螺杆可设置成以同向方式或异向方式旋转。在同向双螺杆设计中，两个螺杆同向旋转，即两个螺杆均顺时针或逆时针旋转。在异向双螺杆设计中，两个螺杆反向旋转，即其中一个(第一个)螺杆顺时针旋转，另一个(第二个)螺杆逆时针旋转。在此两个同向和异向设计中，两个螺杆可相互啮合或不相互啮合(相切)。在非啮合设计中，两个螺杆的轴间距离被设计成使得其中一个螺杆的飞行路径不会渗入第二个螺杆的飞行路径。在相互啮合的双螺杆设计中，螺杆的轴间距离被设计成使得其中一个螺杆的飞行路径渗入第二个螺杆的飞行路径。根据渗入深度，螺杆配置可描述为自清洁或部分自清洁。此外，螺杆的旋向可以变化。从仰视或俯视的特定角度来看，挤出机的一个或两个螺杆可以是右旋或左旋的。

现代挤出机通常使用模块化螺杆设计，允许使用具有不同配置的不同螺杆，以快速实施工艺变更。螺杆配置的设计方式可优化拖动速度、压力速度及其他参数，以实现最佳混合、剪切和/或热传递，从而获得培养细胞挤出物所需的层压内部结构。在一个实施方案，螺杆组合可以是以下几种：1)全啮合异向旋转式双螺杆设计；2)全啮合同向旋转式双螺杆设计，3)非啮合(切向)异向旋转式双螺杆设计，4)非啮合(切向)同向旋转式双螺杆。花键轴通常用于固定不同配置的螺杆部分：正向螺距、反向螺杆、正向桨叶和反向桨叶、捏合盘、压缩盘。

螺杆包含一个或多个部分，包括传输部分和捏合部分(有时称为熔化区)，并且还可包括计量部分，在计量部分中，熔化的材料在通过模具排出之前进行额外的混合。螺杆的半径取决于挤出装置的尺寸。对于台式挤出机，螺杆半径可小至8mm，对于商用生产机器，螺杆半径可大至100mm或更大。螺杆的螺距可以有各种尺寸和角度。螺杆各部分的螺距通常具有30°-90°之间的角度。螺杆的螺距角(螺旋角)可以是30°-35°、35°-40°、40°-45°、45°-50°、50°-55°、55°-60°、60°-65°、65°-70°、70°-75°、75°-80°、80°-85°、或85°-90°。通常，角度越大，剪切力越强。螺杆相对于螺杆直径的旋转频率是螺杆的常用设计参数。对于螺距为0.5D的螺杆，螺杆以0.5的直径完成一整圈(360°)。常用螺杆0.25D、0.5D、0.75D、1.0D及其他螺距参数螺杆均有市售，亦可由供应商定制。

对于异向旋转式啮合双螺杆设计的挤出机机筒设计，所述机筒可以是圆柱形或圆锥形。

机筒中的压力在螺杆的不同区域可能不同。不同区域的压力可低至1bar，高至300bar甚至更高。对于干法挤出，机筒内的压力通常高于湿法挤出。用于制备本发明所述挤出物的挤出机机筒内的压力可以是在1-10bar之间、10-20bar、20-30bar、30-40bar、40-50bar、50-60bar、60-70bar、70-80bar、80-90bar、90-100bar、100-110bar、110-120bar、120-130bar、130-140bar、140-150bar、150-160bar、160-170bar、170-180bar、190-200bar、200-210bar、210-220bar、220-230bar、230-240bar、240-250bar、250-260bar、260-270bar、270-280bar、280-290bar、或290-300bar。

直径、长度、温度、压力、输送时间和通过机筒的输送时间、螺杆配置、螺杆速度、从料斗送入机筒的进料速率以及本发明讨论的其他参数均受到控制。

在输送通过机筒和模具的过程中，可将面团或面团/细胞掺和物进行冷却或加热。模具某些部分的主动冷却可用于限制面团或面团/细胞掺和物的膨胀。具有不同直径和长度的模具喷嘴用于控制对所述面团/细胞掺和物的压力，以控制所述面团/细胞掺和物在离开模具时的膨胀。此外，所述面团/细胞掺和物通过模具的流速亦受到控制。通过限制膨胀，挤出物具有更多的纤维质构，并复制了来自养殖动物的肉类的口感和食用体验。

在一些实施方案，本发明提供了用于制备食品的工艺方法，其包含将豆类蛋白、细胞膏和磷酸盐组合至水中并分三个步骤加热所述混合物。在某些实施方案，所述方法包含向水中添加磷酸盐，从而调节水以制备调理水。在某些实施方案，将豆类蛋白添加至所述调理水中以使豆类蛋白水合，从而制备水合植物蛋白。在一些实施方案，将细胞膏添加至所述水合植物蛋白(已添加植物蛋白的调理水)以生成细胞蛋白质混合物。在一些实施方案，所述植物蛋白是豆类蛋白。在一些实施方案，所述豆类蛋白是绿豆蛋白。

在一些实施方案，所述磷酸盐选自由磷酸二钠(DSP)、六偏磷酸钠(SHMP)、焦磷酸四钠(TSPP)组成的组。在一个特定实施方案中，添加至水中的磷酸盐是DSP。在一些实施方案，添加至水中的DSP的量为至少或约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、或大于0.15％。

在一些实施方案，所述工艺方法包括经历三个加热步骤。在一些实施方案，第一加热步骤包含将所述细胞和蛋白质混合物加热至40-65℃之间的温度，其中加入调味料。在一些实施方案，第二步包含将所述细胞和蛋白质混合物在40-65℃之间的温度下保持至少10分钟，其中加入肽交联酶(例如，转谷氨酰胺酶)。在一些实施方案，第三加热步骤包含将所述细胞和蛋白质混合物的温度升高至60-85℃之间的温度，其中向水中加入油。在一些实施方案，所述方法包含将温度降低至5-15℃之间温度的温度以制备预烹饪产品的第四步骤。

在一些实施方案，将调味料加至第一步、第二步、第三步或第四步中。在一些实施方案，调味料包括但不限于盐、糖、辣椒粉、洋葱粉、大蒜粉、黑胡椒、白胡椒、和天然鸡肉调味剂(素食)。

在一些实施方案，所加入的油(脂肪)用于第一步、第二步、第三步或第四步，以制备预烹饪产品。油选自包含以下的组：植物油、花生油、菜籽油、椰子油、橄榄油、玉米油、大豆油、葵花籽油、人造黄油、植物起酥油、动物油、黄油、牛油、猪油、人造黄油、或食用油。

在一些实施方案，可在无额外准备或烹饪的情况下食用所述预烹饪产品，或者可使用众所周知的烹饪技术进一步烹饪所述预烹饪产品。

在一些实施方案，所述方法包含通过放置在烹饪模具中来制备禽类食品。在一些实施方案，所述方法包含对烹饪模具施加真空，从而有效地改变禽类食品的密度和质构。

在一些实施方案，将所述禽类食品裹上面包屑。

在一些实施方案，所述禽类食品被蒸、煮、炒、炸、烘焙、烧烤、炙烤、微波、脱水、真空低温烹饪法烹制、压力烹制、或冷冻，或其任何组合进行烹制。

在一些实施方案，所述挤出物通过穿刺试验测定的硬度是在1N和50N之间、在1N和45N之间、在1N和40N之间、在1N和35N之间、在1N和30N之间、在1N和25N之间、在1N和20N之间、在1N和15N之间、在1N和10N之间、在1N和9N之间、在1N和8N之间、在1N和7N之间、在1N和6N之间、在1N和5N之间、在1N和4N之间、在1N和3N之间、在1N和2N之间、在2N和15N之间、在2N和10N之间、在2N和9N之间、在2N和8N之间、在2N和7N之间、在2N和6N之间、在2N和5N之间、在2N和4N之间、或在2N和3N之间。

实施例

实施例1：培养细胞

细胞是衍生自市售鸡细胞系UMNSAH/DF1(C1F是申请人对所述细胞的内部名称)的子细胞系，所述鸡细胞系UMNSAH/DF1于1996年10月11日保藏在美国菌种保藏中心(ATCC，Manassas，Virginia，USA)。

培养基配方是基础培养基(DMEM/F12)，包含氨基酸类、维生素类、无机盐类和补充有FBS或BCS(小牛血清)的其他成分。

创建主工作细胞库(MCWB)

从C1F主细胞库(MCB)检索得到单瓶细胞以建立C1F MWCB。简言之，将C1F MCB冷冻小瓶从液氮储存器中取出并立即放入37℃水浴中。通过轻轻摇动小瓶使细胞悬液快速解冻。将C1F细胞悬液在层流罩中逐渐转移至15mL锥形管中，其中含有10mL预热的培养基。将所得稀释的C1F细胞悬液以300xg离心5分钟。在不干扰细胞团块(cell pellet)的情况下无菌吸出上清液。将C1F细胞轻轻重悬于培养基中，并转移至250mL旋转培养瓶中，最终工作体积为50mL。测定解冻后的细胞密度和活力以监测C1F的健康状况及对已建立的MCB进行质量控制。

C1F细胞在125rpm的搅拌下培养总共9天，并进行四个放大步骤。首先，将细胞在5％ CO₂的加湿培养箱中于37℃下培养2天。然后将培养物以300xg离心5分钟。倒出培养物上清液，将C1F细胞团块重新悬浮在新鲜培养基中，并接种在500mL摇瓶中，最终体积为130mL。其次，将C1F细胞在37℃和5％ CO₂的加湿培养箱中以125rpm搅拌再培养2天。然后将培养物再次以300xg离心5分钟；在1L摇瓶中，将细胞团块重悬于新鲜培养基中至培养基的终体积为340mL。最后，培养2天后，收集细胞培养物并以300xg离心5分钟；将C1F细胞团块重悬于新鲜培养基中，最终工作体积为880mL，置于2L摇瓶中。C1F细胞在相同条件下培养2天，以300xg离心5分钟；将细胞团块重悬于新鲜培养基中，最终体积为2.3L，置于5L摇瓶中。将C1F细胞培养物在含有5％ CO₂的加湿培养箱中于搅拌下再放置1天，并收获以创建MWCB。

收集最终扩增培养物中的C1F细胞并以300xg离心5分钟。将细胞重新悬浮在较小体积的培养基中，并使用半自动细胞计数系统(Vi-Cell)对浓缩的C1F细胞进行取样和计数。C1F细胞经历另一个300xg离心循环持续5分钟，并以20-25百万个细胞/mL的浓度重新悬浮于冷冻保存培养基(含10％ DMSO)中。在异丙醇室中，在16至24小时内，将细胞在印有条形码的冷冻管中以-1℃/min的速率从4℃冷冻至-80℃。然后将细胞转移并储存在气相液氮储存系统(Taylor Wharton(<-175℃))。小瓶内容物和库存存储位置均记录在受控数据库中。

CGMP监管链文件(小瓶身份确证)用来确保从MWCB检索得到适当小瓶，用于细胞库释放测试及培养肉生成。

实施例2：培养鸡肉(Cultured Chicken)生成

一次性系统用于示例性制作过程中的种子扩增和细胞生长。与培养基接触时间长的处理系统包括用于大型500L生物反应器的摇瓶、波浪式生物反应器(Wave Bags)、培养基保持袋和搅拌罐生物反应器袋。图1描绘了细胞培养禽类成纤维细胞的流程图。图2描绘了收获细胞的流程图。

种子扩增通过解冻来自MWCB的细胞小瓶开始，并于工作体积为100mL的500mL摇瓶中培养。含有5％ FBS的DMEM/F12用于种子扩增。然后将培养物按1:3至1:6的比例分流并接种到工作体积为300mL的1L摇瓶中。

C1F细胞在大型摇瓶中以1:3至1:6的分流比在3L烧瓶中以900mL进行放大培养，然后在5L烧瓶中将900mL培养物分流为2.7L进行放大培养。最后，使用1:3分流比将5L烧瓶中的2.7L培养物进一步分成3个2.7L烧瓶，以便转移至波浪式生物反应器(Wave Bag)中。

波浪式生物反应器(WAVE BAG)中的细胞培养

在无菌条件下，按照先前针对摇瓶培养物(8.1L细胞悬浮液+15.9L新鲜培养基)指示的1:3分流比，使用来自3个5L摇瓶(2.7L培养物)的培养物接种波浪式生物反应器(总体积为50L，最大工作体积为25L)。低血清培养基(DMEM/F12+1.25％ FBS)用于生产系统(波浪式生物反应器(Wave Bag)或500L生物反应器)中的细胞生长。如果将5％血清用作500L生物反应器的种子，则其在波浪式生物反应器(Wave Bag)中用于细胞生长。

波浪式生物反应器(Wave Bag)中的C1F培养物被收获用于生产或用于接种500L生物反应器。

500L生物反应器中的培养

将波浪式生物反应器(Wave Bag，25L)中的内容物无菌转移至具有100L初始培养基(具有1:3至1:6分流比，总体积为125L)的大型生物反应器(总体积700L，最大工作体积500L)中。

培养3天(+/-0.5天)后，通过添加375L新培养基将培养基体积增至500L，并继续再培养3天(+/-0.5天)。定期对培养物取样以测定细胞数量和活力。离线监测生物反应器培养物的pH值、乳酸、葡萄糖、谷氨酰胺及谷氨酸水平。

浓缩和回收

使用垂直轴流通过滗析器离心机浓缩细胞培养液(cell culture broth，25-100倍)。细胞分离的方法可包括离心、过滤、絮凝及其组合。离心机的速度为500-1000rcf，每碗尺寸的流速为0.4-1.2min^-1。收集浓缩的细胞培养浆液并移至下一阶段的清洗流程。

清洗细胞

通过在离心后有效清洗细胞团块，可减少培养肉中培养基成分的残留。具体而言，在细胞培养结束时，将用过的培养基离心后得到的细胞团块通过使用5倍(w/v)0.45％NaCl溶液进行重悬浮&离心流程依次清洗两次。通过清洗，培养肉中培养基成分的残留有效减少至少25倍。除了葡萄糖、谷氨酰胺&钠，根据经验估计，培养基成分的残留量非常低，基于清洗结束时的25倍稀释，<10ppm。葡萄糖和谷氨酰胺在细胞培养过程中均作为碳/氮源被消耗。

清洗效率通过测定第二次清洗溶液中Pluronic F-68的保留量来追踪。PluronicF-68在生长培养基中的初始浓度为0.1％w/v(1000mg/L)。未检测到第二次清洗溶液中的Pluronic F-68浓度(<<0.01％w/v)，证实清洗在去除其他可溶性培养基成分方面的效率。

使用对牛血清白蛋白具有高灵敏度和特异性的牛白蛋白ELISA试剂盒(LifespanBiosciences)来检测和定量所述清洗溶液中的白蛋白。在最终清洗液中，所测定的白蛋白浓度低于10mg/L，可能在0-100ppm(mg/L)范围内。

在用于最终产品配方之前，将清洗的细胞(培养鸡肉(Cultured Chicken))储存在密封的食品安全级容器中，温度低于或等于-20℃。

实施例3：测试细胞对细菌和病毒的安全性

在细胞生长和收获的所有阶段检测细胞的安全性和有效性。评估经培养的C1F细胞是否存在病毒、酵母和细菌的外来病原体。

使用FDA细菌学分析手册(BAM)中的方案来分析鸡肉产品中是否存在细菌。

总平板计数(TPC)与需氧菌平板计数(APC)同义。正如美国FDA细菌学分析手册(BAM)第3章所述，所述检测旨在表明产品中的微生物水平。简言之，所述方法包括对样品进行适当的十进制稀释，并接种至琼脂平板的非选择性培养基中。孵育约48小时后，计算菌落形成单位(CFU)并报告为总平板计数。

根据美国FDA细菌学分析手册(BAM)第18章中概述的方法学，分析酵母和霉菌。简言之，所述方法包括在0.1％蛋白胨水中连续稀释样品，然后分配到含有营养物质和抗生素的培养皿上，所述抗生素抑制微生物生长但便于酵母和霉菌计数。平板在25℃下孵育并在5天后计数。或者，通过使用0.1％蛋白胨水中的10倍连续稀释样品并将1mL分配到测试片(Petrifilm)上来分析酵母和霉菌，测试片(Petrifilm)含有营养物质和抗生素，可便于酵母和霉菌计数。测试片(Petrifilm)在25℃或28℃下孵育48小时，结果报告为CFU。

根据美国FDA细菌学分析手册(BAM)第4章中概述的方法学，分析大肠杆菌和大肠菌群。所述方法包括在月桂基硫酸盐胰蛋白胨培养基中进行连续十进制稀释，并于35℃下孵育并检查气体形成情况。下一步涉及由充气管(使用3mm环)转移至BGLB培养基中，并于35℃下孵育48+/-2小时。结果报告为MPN(最大可能数)大肠菌群数/g。

如BAM第9章所述，使用CMMEF方法分析链球菌。检测原理基于链球菌对酸形成的检测，并通过颜色由紫色变为黄色来指示。KF链球菌琼脂培养基与氯化三苯基四唑鎓(TTC)一同用于选择性分离和计数。在35+/-2℃下有氧孵育46-48小时后，培养响应报告为CFU。

根据美国FDA细菌学分析手册(BAM)第5章中概述的方法学，分析沙门氏菌。简言之，准备分析物以分离沙门氏菌，然后通过转移至选择性富集培养基进行分离，将其在亚硫酸铋(BS)琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐(XLD)琼脂和Hektoen肠溶(HE)琼脂上铺板。重复此步骤并转移至RV培养基上。平板在35℃下孵育24+/-2小时，并检查是否存在可能是沙门氏菌的菌落。根据所采用的试验/底物及所产生的结果，通过各种方法学进一步测试推定的沙门氏菌，以观察沙门氏菌的生化及血清学反应。从500L收获产品中测试的数量符合FDABAM–第5章。

通过与上述实施例一致的方法制备得到培养鸡肉。表1表明与美国FDA指南相比，细菌污染可以忽略不计。

表1：培养鸡肉的微生物分析

支原体污染

如果使用MycoAlert^TM支原体检测试剂盒解冻至少3％或0.4倍(n的平方根，其中n是储存于待测细胞库的动物细胞的冷冻管总数)的随机选择和受试的每个细胞库的细胞小瓶，并且其培养上清液提供阴性结果，则认为所培养的C1F细胞对支原体(Mycoplasma)检测有效。按照试剂盒指南，将受试样品根据发光读数B和发光读数A的比值进行分类：比值<0.9，支原体阴性；0.9<比值<1.2临界值(24小时后需重新检测细胞)；比值>1.2，支原体污染。

病毒评估

病毒评估是通过第三方(查尔斯河研究动物诊断服务(Charles River ResearchAnimal Diagnostic Services))–人类基本清除小组(Human Essential CLEAR Panel)；禽类病毒和细菌小组(Avian Virus and Bacteria Panel)进行的传染病聚合酶链反应(PCR)分析外来的人类及禽类病毒和细菌病原体而进行。

如果来自测试库的至少3％的独立细胞小瓶或0.4倍(

其中n是储存于待测细胞库的动物细胞的冷冻管总数)被解冻，并且其细胞团块针对所有外来病原体均提供阴性结果，则认为来自细胞库的C1F对病毒评估有效。

经培养的C1F细胞被认为不存在外来的禽类及人类病毒和细菌病原体，因为来自每个细胞库的独立细胞团块对于整个人类和禽类小组均呈阴性。

实施例4：培养鸡肉(Cultured Chicken)分析

将培养鸡肉的营养成分与传统鸡肉进行比较。

采用水分、蛋白质含量、脂肪含量、灰分含量、碳水化合物等指标对培养鸡肉进行化学分析。使用重量分析烘箱干燥法分析水分含量，使用10克培养鸡肉的受试部分于105℃下在对流烘箱中干燥24小时以上。使用LECO FP 628氮/蛋白质分析仪基于通过杜马斯燃烧法(Dumas combustion)测定的总氮来分析总的粗蛋白。脂肪含量测定为蓄积脂肪酸甲酯(FAME)与起始受试部分的质量之比。将30mg干燥的细胞受试部分通过甲醇盐酸进行直接酯交换，然后经由液-液萃取到庚烷中进行分离以通过GC-FID进行FAME分析。通过将10-十七碳烯酸甲酯作为内标添加至受试样品和校准标准品中来实现定量。在所述方法中鉴定的FAME是从Nuchek Prep公司购买的GLC-74X分析标准品的成分，其是15种常见的饱和及不饱和FAME的混合物，介于辛酸甲酯和二十二烷酸甲酯之间。GC色谱图中的所有其他显著峰均根据其最靠近洗脱峰的校准曲线进行定量。使用Milestone Pyro 260微波炉基于重量法来分析总灰分含量。将样品于50分钟内加热至900℃，然后在900℃下保持1小时。碳水化合物含量通过与水分、蛋白质、灰分和脂肪含量的总和的差计算得到。

表2总结了与传统去骨鸡胸肉相比，培养鸡肉的灰分、碳水化合物、蛋白质和脂肪的百分比。

表2：培养鸡肉与传统去骨鸡胸肉的营养分析比较

表3总结了与传统去骨鸡胸肉相比，培养鸡肉的饱和脂肪、单不饱和脂肪和多不饱和脂肪的百分比。脂肪值表示为样本中特定脂肪相对于总脂肪的百分比(％)。

表3：培养鸡肉的饱和脂肪、单不饱和脂肪和多不饱和脂肪百分比汇总

将每100克干细胞膏的克数与干生鸡肉进行比较时，培养鸡肉与传统鸡肉相似。传统鸡胸肉与培养鸡肉的整体热量值相近。单不饱和脂肪(通常称为健康类型的脂肪)代表了传统鸡肉和培养鸡肉中较高百分比的脂肪类型(分别为34.1％和50％)，其次是饱和脂肪和多不饱和脂肪。有趣的是，培养鸡肉中的高灰分含量是由于残留的盐分所致，主要来自用于制备所述材料的0.45％ NaCl清洗液，以及来自用于培养鸡细胞的培养基。培养鸡肉中的钠含量(3.6％)亦证实了这一点。从分析中去除灰分后，其蛋白质、脂肪和碳水化合物水平在培养鸡肉和传统鸡肉之间均非常一致。

实施例5：禽类食品组合物

代表性的禽类食品组合物如下表4中所述(按重量百分比)。

表4：示例禽类食品组合物

成分	重量％
		水	20-40
细胞膏	25-50
		绿豆	10-20
脂肪	5-20
		转谷氨酰胺酶	0.0001-0.1

实施例6：对用于制作的鸡细胞进行测序分析

将用于制作的鸡细胞的测序分析与亲本细胞进行比较，以评估培养条件诱导的潜在遗传漂移。

简言之，基于参考出版物，使用R程序DESeq2_1.20.0进行差异基因表达分析。之后，使用ClusterProfiler：cluster_2.0.7-1对样本进行层次聚类。

图3描绘了在亲本鸡细胞库的3个生物学重复和用于制作培养鸡肉的鸡细胞库的3个生物学重复之间进行的聚类分析。

图3绘制了超过10,400个基因，统计学上差异表达的基因选择为p<0.01，不同表达基因的比例以热图形式呈现。

样品JUST1-JUST3得自于培养基贴壁条件下培养的亲本鸡细胞，培养基补充有高(10％v/v)血清浓度。样品JUST 7-JUST9在培养基悬浮液中培养，培养基补充有低(1.25％v/v)血清浓度。如图3所示，每个组内的样品聚集在一起，表明每个培养条件下生物重复样品之间的同质性。

基于原鸡(Gallus gallus)数据库(GenomeInfoDbData_1.1.0和Org.Gg.eg.db(Gallus数据库)v2.1，更新于2018年4月9日)上的注释，使用丰富的KEGG进行通路富集，以验证不同表达的基因是否在某些通路中分组。

受影响的通路包括与DNA复制、蛋白酶体、核糖体、细胞凋亡和类固醇生物合成机制相关的那些通路。上调基因及下调基因均与代谢物、蛋白质或其他对人类消费有害的毒素无关。

实施例7：降低血清含量的影响

分析了低血清培养基对细胞活力(图4A)和群体倍增时间(图4B)的影响。细胞最初在0.5％(v/v)血清浓度下生长，然后降至0％(v/v)–无血清。

研究了在补充有脂肪酸和生长因子的无血清基础培养基(图5A)中以及在补充有脂肪酸和生长因子的无血清基础培养基(图5C)中，对C1F细胞生长的影响，并与在不含血清及不含生长因子的基础培养基中生长的C1F细胞进行比较(图5B)。所使用的生长因子是胰岛素样生长因子、表皮样生长因子和成纤维细胞样生长因子，浓度在5-200μg/mL之间。图5A和图5C在实验过程中使用了100μg/mL的生长因子。使用50μg/mL的生长因子亦观察到类似的效果。其结果证明补充有生长因子的无血清培养基达到与补充有生长因子的含血清基础培养基相似的活细胞密度。

实施例8：对无血清条件的适应

在确保细胞从前一步适应成功后，基于每一步血清百分比的依次降低，采用逐步适应的方法学。细胞对较低血清浓度的适应并非一个直接的过程，而是需要一段时间来适应新的微环境，并在血清降低的每个阶段获得健康的外观和明显生长。首先，我们确定了FBS的阈值浓度，低于所述浓度的悬浮液中细胞表现出显著的生长停滞。将维持在含有5％FBS的培养基中的C1F细胞转移至2％、1％和0.5％ FBS中。当FBS浓度降低至1％(v/v)以下时，细胞表现出生长减少。为了使细胞适应低血清浓度，将含有1％v/v和0.5％(v/v)FBS的培养基补充有胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺(ITSE)(ThermoFisher)和生长因子(表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(FGF)，Peprotech)。ITSE、EGF和碱性FGF一同使用被称为ITSEEF。图6公开了适于在无血清培养基中生长的细胞的活力、群体倍增时间和群体倍增水平。图6a示出了血清断奶过程中的活细胞密度。图6b示出了血清断奶过程中的群体倍增时间。图6c示出了C1F细胞从含有0.5％ FBS的培养基过渡到含有0％ FBS的培养基时的活力。

为了在无血清培养基中达到更高的细胞密度，测试了额外的由化学成分定义的补充剂。如表5所示(JUST基础培养基)，维生素、脂质和痕量元素均与生长因子和ITSE的断奶一同筛选。在本实施例中，粉体(ThermoFisher，目录号A42914EK)和补充有Pluronic-F68和ITSEEF(称为JUST Basal(JB)培养基)的液体(基础培养基(DMEM/F-12，目录号11320-033)形式的DMEM/F12培养基均被使用。液体DMEM/F12用于大部分适应性研究。具有标准渗透压(约330mOsm/Kg)的SFM(SFC-2)使用市售的DMEM/F12粉体形式制备，而具有低渗透压(约280mOsm/Kg)的SFM(SFC-4)使用定制的粉体DMEM/F12变体(不含葡萄糖、HEPES缓冲液、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和氯化钠)制备。SFC-4的缺失组分单独添加，并根据氯化钠添加量的不同调整渗透压。内部自制的RO/DI水用于由粉体配方制备DMEM/F12基础培养基。

表5.在适应无血清条件的不同阶段优化的不同SFM的组成

无血清C1F(SF-C1F)细胞扩增及冷冻保存

基于活细胞密度，确定了用于扩增C1F细胞的分流比，其通常为1:3(v/v)。在无血清培养基(SFM)中培养的C1F细胞从具有50mL工作培养物的125mL烧瓶扩增至最后一步中具有2.5L工作体积的5L烧瓶，经由多个增量传代步骤：100mL于250mL烧瓶中，300mL于500mL烧瓶中，900mL于2.8L烧瓶中。每次细胞传代后，按照先前描述的相同方案对细胞密度和活力进行新的测定。

SF-C1F细胞库由5L摇瓶中生长活跃的培养物制备得到。以300x g离心含有需要储存的细胞数量的C1F细胞悬液体积。在不干扰C1F细胞团块的情况下，无菌倒出或吸出上清液。将细胞团块轻轻重悬于冷冻保存培养基中。筛选了各种内部自制和市售冷冻培养基以确定性能最佳的培养基(表6)。通过向SFM(SFC-2)培养基中添加FBS和/或DMSO来制备内部自制冷冻培养基。市售冷冻保存培养基购自BioLife Solutions(CryoStor CS2、CS5、CS10)和PromoCell(Cryo-SFM)。SF-C1F细胞库以2000万至3000万个细胞等分试样在-185℃下储存在液氮冷冻机的气相中。将用于内部自制冷冻保存培养基的一(1)mL等分试样和用于商购冷冻培养基的2mL等分试样分装到低温储存小瓶中。在异丙醇室中，在16至24小时内，将细胞在印有条形码的冷冻管中以-1℃/min的速率从4℃冷冻至-80℃。然后将C1F细胞转移并储存在气相液氮储存系统(Taylor Wharton(<-175℃))中。小瓶内容物和库存存储位置均记录在受控数据库中。GMP监管链文件(小瓶身份确证)用于确保从细胞库中检索得到适当的小瓶。

SF-C1F细胞库的两小瓶于37℃水浴中解冻不到2分钟，并在使用SFM(SFC-2)进行10倍稀释后重新悬浮。以300x g离心后，去除上清液，将细胞重新悬浮于新鲜SFM中，密度介于0.3x 10⁶-0.6x 10⁶个细胞/mL之间。进行自旋传代，直至细胞通过生长至活细胞密度(VCD)为1.2x10⁶个细胞/mL或高于1.2x10⁶个细胞/mL，表示回收。回收后，细胞按照1:3的比例分流传代。通过将细胞以300x g离心5分钟，并弃去上清液，进行自旋传代。然后将细胞团块重悬于新鲜培养基中。在分流传代方法中，将一部分细胞培养物转移至含有预定量新鲜培养基的新烧瓶中。对于1:3的细胞分流比，将原始C1F悬浮液总体积的三分之一转移至含有新鲜培养基总体积的三分之二的烧瓶中。VCD根据实施例12中公开的方法进行测定。

表6：针对SF-C1F细胞测试的冷冻保存培养基

出于定量活细胞密度和活力的目的，将1mL的C1F悬浮液收集在Eppendorf管中并以300x g离心5分钟。弃去上清液，或将上清液用于测定代谢物浓度。将C1F细胞团块重新悬浮于500μL TrypLE Express(Gibco)中，并于37℃下在摇床中孵育5-8分钟，然后通过添加500μL培养基使酶活性失活。将总体积(每个样品的最小体积为550mL)转移至Vi-Cell^tm XR细胞活力分析仪(Beckman Coulter)的采样杯中。使用Vi-Cell分析仪量化细胞密度和活力。Nova Flex生物分析仪(Nova Biomedical，USA)用于评估pH、葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸、铵、钾和钠的值。一(1)mL样品(用过的培养基或新鲜培养基)用于培养基组分和代谢物分析。采用OsmoPro渗透压计(Advanced Instruments)使用20μL样品测定新鲜和用过培养基的渗透压。根据以下公式计算群体倍增时间(PDT)和群体倍增水平(PDL)：

PDT＝t*log10(2)/((log10(n/n0))，其中t＝培养时间，n＝最终细胞数量，和n0＝接种细胞数量。

PDL＝3.32[log10(n/n0)]，其中n＝最终细胞数量，和n0＝接种细胞数量。

在C1F细胞成功适应0.5％ FBS后，将FBS逐步降低至0.25％、0.1％、0.05％和0％FBS。在ITSEEF存在下，C1F细胞在不含FBS的情况下成功生长，但是，细胞密度和增殖率略低于在含有5％ FBS的培养基中生长的细胞。

实施例9：附加培养基组分

本实施例公开了向无血清培养基添加营养成分，以提高细胞密度和增殖率。表5中公开的培养基称为JUST Basal(JB)培养基。之前有报道称从ThermoFisher购买的脂质溶液(CD-lipid)有助于细胞培养基中FBS断奶。脂质，尤其是必需脂肪酸和乙醇胺已被证明可促进细胞(包括成纤维细胞)生长。其储存能量并充当细胞膜的组成部分；其还有助于信号传导和传输。补充由化学成分定义的维生素和脂质可将无血清C1F细胞的VCD从约0.8x10⁶-1.0x10⁶个细胞/mL提高至1.5x10⁶个细胞/mL。VCD根据实施例13中公开的方法进行测定。

接下来，我们添加痕量元素，以增加VCD和增殖率。譬如，众所周知，硒作为谷胱甘肽(GSH)合成酶的辅因子，可有助于自由基解毒。其他痕量元素如铜、锌和三羧酸，尽管其数量很少，但对于细胞生长和增殖而言均是必需的。微量营养素对于某些酶的功能和维持亦是必不可少的。对从康宁(Corning)购买的痕量元素A、B和C进行了测试。痕量元素A(TraceA)混合物包含规定浓度的CuSO₄、ZnSO₄、亚硒酸钠和柠檬酸铁。当与痕量元素A(Trace A)(JB-VLA)一同培养时，C1F细胞能够随时间的推移达到～2x10⁶个细胞/mL或更高的VCD。有趣的是，痕量元素B(Trace B)和痕量元素C(Trace C)均对SFM中C1F鸡细胞的生长没有可观测到的影响。VCD根据实施例12中公开的方法进行测定。

实施例10：生长因子的减少

本实施例公开了SFM中生长因子的减少。将C1F细胞如实施例8中公开的那样进行培养，但通过缓慢减少添加至培养基中的生长因子的量以进行调整适应，从而最小化生长因子的添加。随着时间的推移，C1F细胞在不含EGF和FGF的培养基中，以类似于实施例8所示的VCD和增殖率成功生长。

减少ITSE的实验成功地将ITSE补充量减少了10倍，而不影响SFM中鸡细胞的生长和增殖。VCD根据实施例12中公开的方法进行测定。

实施例11：禽类细胞的大规模制造

使用无血清(C1F-SFM)和含血清培养基(C1F-SCM)对一次性使用的C1F细胞和规模高达1,000L的不锈钢生物反应器中的C1F细胞进行了多次大规模制造。本发明描述了无血清培养基和含血清培养基。

随着发酵容器尺寸的增加，高压、混合时间、营养流、较低的O₂水平和CO₂积累以及剪切作用会抑制或阻止细胞生长或细胞裂解。随着发酵容器尺寸的高度增加，容器底部的压力会非常高，从而导致细胞裂解。禽类细胞可在大型发酵罐中培养，这是令人惊讶且出乎意料的结果。禽类细胞不具有保护细胞免受高压影响的保护性细胞壁。

一次性波浪式生物反应器(wavebag)用于分批细胞培养模式或灌注模式。

对于分批细胞培养模式，来自5L摇瓶的培养物用于在无菌条件下接种50L摇动波浪式生物反应器(wavebag)，以得到所需分流比。在达到所需细胞密度后，将额外的培养基添加至波浪式生物反应器(wavebag)以达到所需分流比。此时，总培养体积为50L。在所述50L波浪式生物反应器培养完成后，将两个波浪式生物反应器的分批培养物的全部内容物用于接种200L不锈钢生物反应器。

对于用于生成500L生物反应器接种物的灌注波浪式生物反应器(wavebag)培养物，用来自5L摇瓶的培养物接种单个50L波浪式生物反应器(wavebag)，并加入新鲜培养基以实现所需分流比。接种后，使细胞培养物生长1天，然后在第1天开始进行灌注流程。持续灌注预定量的时间，在灌注的最后一天，按照所需分流比转移细胞培养物并用于接种500L一次性生物反应器。

进行多次200L和1,000L不锈钢生物反应器培养以制造经培养的鸡细胞。将上文讨论的波浪式生物反应器(wavebag)培养的内容物转移至200L生物反应器并将培养基添加至所述生物反应器以实现所需分流比。在培养期间，离线监测生物反应器培养物的pH、溶解氧、葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸、铵和渗透压水平。在培养过程中，收集样品以确证不存在微生物。

1,000L不锈钢和500L一次性使用生物反应器亦可采用抽取和填充方法运行。通过此流程，将所需量的生物反应器培养物，譬如，750L的1,000L生物反应器培养物或375L的500L生物反应器培养物收集到临时储存容器(一次性生物袋(BioBag))中，并立即将新鲜培养基添加至剩余的培养物中，使总体积恢复至1,000L或500L。在进行再填充操作的同时，将收集的细胞培养物浓缩以用于收获目的。一旦生物反应器重新填充至其所需体积，继续培养以达到所需细胞密度。抽取和填充程序可执行多次，最终收获采集整个培养物体积。

细胞收获定义为从生长培养基/液体中分离和收集细胞。通常，收获是通过离心并清洗残余培养基组分来完成。细胞可用任何清洗溶液清洗，通常是含有0.45％(w/v)NaCl的水。收获的产品，培养鸡肉，亦称为“细胞膏”，是指离心和清洗后产生的湿细胞团块。

常规获得远远超过200万个细胞/mL的细胞密度。

实施例12：减少乳酸生成

在细胞生长期间，代谢物(例如，乳酸、氨、氨基酸中间体)蓄积已被证明在某些浓度下对细胞生长和生产力有害(Claudia Altamirano et al.,2006；Freund&Croughan,2018；Lao&Toth,1997；Pereira et al.,2018)。在分批补料过程中，乳酸蓄积导致培养物pH值降低，需要添加碱以将pH值维持在设定值或生理学范围内。不利的是，添加碱会使得培养基的渗透压增加，并且已表明较高的渗透压水平会强烈抑制大多数细胞系的生长和蛋白质生成(Christoph Kuper et al.,2007；Kiehl et al.,2011；McNeil et al.,1999)。

乳酸蓄积的主要途径是由乳酸脱氢酶(LDH)催化的丙酮酸与乳酸的相互转化。在哺乳动物细胞中，研究表明LDH以带有亚基A或B的同源四聚体或异源四聚体形式存在，分别由LDHA或LDHB编码(Urbańska&Orzechowski,2019)。此外，已表明LDHA催化正向反应(丙酮酸到乳酸)，而LDHB催化逆向反应(乳酸到丙酮酸)。LDHA在Warburg效应中发挥关键作用，所述效应发生在细胞系中，这些细胞系不会通过柠檬酸循环驱动丙酮酸分解，即使在氧气存在的情况下也不会从丙酮酸生成乳酸。

草氨酸盐，丙酮酸盐的类似物，是一种强竞争性的LDHA抑制剂，通过引导大部分葡萄糖经由三羧酸(TCA)循环分解–一个更节能的过程，来阻止Warburg效应(Wang et al.,2019)。然而，此分子的使用可抑制细胞增殖，这是大多数工业哺乳动物细胞系早期阶段生成的关键因素(Kim et al.,2019；Wang et al.,2019)。

C1F细胞采用悬浮培养进行培养，并添加1.25％牛血清。测试了不同浓度的草氨酸钠：1mM、3mM、5mM、10mM、30mM、60mM、100mM和200mM，并测定了乳酸的生成、葡萄糖消耗、细胞生长速率和细胞密度。

在细胞培养期间，使用每日活细胞浓度和代谢物浓度计算比速率。比净生长率(μN)使用方程式(1)计算为在时间间隔t₁至t₂内VCD的变化：

比葡萄糖消耗率(qGluc)或比乳酸生成率(qLac)使用方程式(2)确定，其中P是葡萄糖或乳酸浓度：

活细胞密度(VCD)和活力通过台盼蓝排除法使用Vi-cell ^TM(Beckman Coulter)，从摇瓶细胞培养物每天取样1mL的样品进行测定。采用Bioprofile Flex分析仪(NovaBiomedical)测定气体和pH值，包括代谢物(葡萄糖、乳酸谷氨酰胺、谷氨酸、铵)浓度。使用OsmoPro多样品微渗透压计(Advanced Instruments)，其采用冰点技术，来测定渗透压。

用不同浓度的草氨酸钠(1mM、3mM、5mM和10mM)处理的C1F-SCM细胞，包括未经处理的对照细胞，均使用重复摇瓶以分批模式培养3天。我们观察到，与对照条件相比，经10mM草氨酸盐处理的细胞的乳酸生成量减少了28％(p<0.05)，并且在第2天测试的其他浓度的草氨酸盐处理的细胞中乳酸生成量明显减少。此外，我们观察到草氨酸盐对第2天经草氨酸盐处理细胞中乳酸生成和葡萄糖消耗的浓度依赖性影响，即，草氨酸盐浓度增加导致乳酸生成量减少。其他控制参数均在可接受的生理学范围内。

当在为期3天的分批细胞培养中使用更高浓度的草氨酸钠(10mM、15mM、20mM和30mM)进行草氨酸钠重复实验时，乳酸生成量以浓度依赖性方式降低，乳酸生成量降低了约52％。

我们继续为为期3天的分批培养进一步增加草氨酸盐的浓度(30mM、60mM、100mM和200mM)。正如预期的那样，在用草氨酸盐处理的细胞中观察到乳酸生成量的浓度依赖性降低。

为了进一步检测草氨酸盐在细胞培养中的作用是否与已存在的代谢副产物相似，我们使用新鲜培养基以1:3(v/v)分液(1/3用过的培养基和2/3新鲜培养基)对用30mM草氨酸盐处理的细胞进行传代。在培养中使用几天后，残留的培养基总是含有细胞消耗所产生的残留量(残留)代谢物。

用30mM草氨酸盐处理的C1F细胞在培养的第5天显示出持续的线性增殖，峰值为2.79x10⁶个细胞/mL。对照培养物在培养的第3天达到峰值，为1.64x10⁶个细胞/mL，此后滞后。因此，经草氨酸盐处理的培养物显示出最大活细胞密度显著增加约44％。尽管经草氨酸盐处理的细胞在第5天表现出更高的细胞密度，但与对照组相比，这些C1F细胞的蓄积乳酸生成量仍减少了约23％。此外，经草氨酸盐处理的C1F细胞表现出比葡萄糖消耗率(qGluc)降低。培养基的细胞活力和渗透压并未因添加草氨酸盐而受到损害。相对于未经草氨酸盐处理的对照，在培养的第3天和第5天之间，经草氨酸盐处理的培养物的铵蓄积量激增。对于对照培养物，培养基的pH值为约7.0，而对于经草氨酸盐处理的C1F细胞，培养基的pH值为约7.2。

经草氨酸盐处理的细胞的细胞密度增加是令人惊讶且出乎意料的。使用草氨酸盐对癌细胞进行的研究显示，其可抑制细胞增殖。草氨酸盐对细胞增殖的抑制作用可能是由于癌细胞依赖糖酵解途径作为能量来源，因为糖酵解途径代表了比经由TCA循环更快的ATP生成途径(Kim et al.,2019；Lu et al.,2014)。

实施例13：替代糖类

我们评估了替代糖类(甘露糖、果糖和半乳糖)对在含有1.25％ FBS的悬浮培养物中生长的内部自制C1F鸡细胞生长和代谢的影响。比净生长率(μN)和比葡萄糖消耗率(qGluc)或比乳酸生成率(qLac)均根据实施例12中公开的方程式1或2计算得到。

本发明所述的悬浮培养物使用从第0天添加的3g/L的相应糖类进行培养，并以分批模式培养至第3天。在取样后的第3天，将另外3g/L的每种糖添加至各自的烧瓶。到第3天，在细胞密度达到峰值时，使用葡萄糖作为碳源的烧瓶具有最高的活细胞密度(～2.805x10⁶个细胞/mL)，其次是含有甘露糖的烧瓶(～2.40x10⁶个细胞/mL)，然后是果糖(1.935x10⁶个细胞/mL)，最后是半乳糖(0.915x10⁶个细胞/mL)。

虽然甘露糖饲喂的烧瓶在第2天具有较低的总乳酸生成量，但当归一化到第3天VCD时，与用葡萄糖培养的细胞相比，所生成的乳酸显示出1.7％的轻微增加。

由于我们观察到C1F细胞可利用果糖作为碳源，因此我们评估了不同起始果糖浓度的影响。在一个实验中，从第0天起将6g/L的果糖添加至一组重复烧瓶中，并且从第0天开始将3g/L的果糖添加至另一组重复烧瓶中。在用3g/L果糖开始的烧瓶中，在其中一个重复的第1天和另一个重复的第2天添加额外的3g/L果糖。总体而言，这些烧瓶在第2天表现出相似的细胞密度和生长速率曲线，尽管从第0天开始用6g/L果糖培养的烧瓶显示乳酸蓄积量从第1天略微增加，到第3天高出36％。

我们接下来评估了葡萄糖、甘露糖和果糖的组合对生长和乳酸生成的影响。采用实验设计(DOE)方法，进行了17个批量摇瓶运行，以评估作为悬浮鸡C1F细胞能源的葡萄糖、甘露糖和果糖浓度的不同组合。所使用的实验设计包括3个因子(葡萄糖、甘露糖和果糖)及4个水平(0g/L、0.5g/L、1.5g/L和3.0g/L)。到第3天，具有基础碳源3.0葡萄糖/0.5果糖/0.5甘露糖的细胞具有最高的活细胞密度(VCD)，为3.8x10⁶个细胞/mL，其次是3.0葡萄糖/0.0果糖/3.0甘露糖以及3.0葡萄糖/3.0果糖/3.0甘露糖。此外，到第4天，3.0葡萄糖/3.0果糖/3.0甘露糖烧瓶的VCD从3.54x10⁶个细胞/mL增加至3.78x10⁶个细胞/mL。有趣的是，上述烧瓶均显示出与对照烧瓶相似的乳酸分布曲线。

为了最大化VCD，DOE分析表明葡萄糖的存在非常显著(p值＝0.001)。随后是甘露糖的存在。此外，DOE分析表明，为了最大化VCD，需要优化最小的乳酸、葡萄糖和甘露糖组合。此外，果糖组合表现出最低的乳酸蓄积水平和较低的VCD。与具有更多葡萄糖和一定量甘露糖的培养物相比，具有最低葡萄糖量(或无葡萄糖或低甘露糖/无甘露糖)的培养物表现不佳。同时，具有3.0g/L葡萄糖和至少≥1.5g/L甘露糖的三个烧瓶(3葡萄糖/1.5果糖/3甘露糖、3.0葡萄糖/0.0果糖/3.0甘露糖和3.0葡萄糖/3.0果糖/3.0甘露糖)均表现出葡萄糖消耗缓慢。

由于我们发现了培养物中存在葡萄糖的重要性以及甘露糖对细胞培养寿命的额外好处，因此我们使用DOE筛选了不同的葡萄糖/甘露糖比率。所使用的DOE设计包括2个因子(葡萄糖和甘露糖)和4个水平(0.5g/L、1.5g/L、3.0g/L和4.0g/L)。到细胞培养的第4天，我们观察到与对照(仅3.0g/L葡萄糖)相比，含有3.0g/L葡萄糖和额外1.5-3.0g/L甘露糖的烧瓶表现出最高的VCD(与对照相比增加了约10-25％)并延长了细胞培养寿命。含有3.0g/L葡萄糖和1.5g/L甘露糖的烧瓶的VCD为约3x10⁶个细胞/mL，而含有3.0g/L葡萄糖和不含甘露糖的对照烧瓶的VCD为约2.5x10⁶个细胞/mL。

实施例14：湿法挤出

制备包含60％-65％的水、10％-60％的植物蛋白、2％-50％的经培养细胞和0.01％-2％的氯化钠、以及所需量的多糖的面团。用于湿法挤出的所述面团的示例性配方提供在下表7中。将经培养的动物细胞混合至面团中以制备面团/细胞掺和物，并装入料斗。面团/细胞掺和物由双螺杆挤出机挤出，冷却模具连接在挤出机的末端。

表7：湿法挤出配方

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将面团以1-10kg/小时的速率送入双螺杆挤出机中。将水以0.5-10kg/小时的速率注入料斗中心点下游0.1m处的螺杆外壳中，以制备具有所需水分含量(例如60％)的面团，螺杆转速设置为200-2000rpm。机筒温度在机筒的前四个温区中以逐步的方式分别增至70℃、100℃、130℃和140℃。机筒第5和第6温区温度均保持在160℃。将机筒中的面团送入冷却模具中以制备挤出物。

收集挤出物并将其储存在密封容器中，任选地储存在冰箱中。任选地，可使用常规烘箱或对流烘箱或其他干燥方法，将挤出物干燥至所需水分含量。挤出物通过切碎、切削、混合、成型、调味工艺进一步加工，以制作食品。

实施例15：干法挤出

制备包含20％-35％的水、10％-60％的植物蛋白、2％-50％的经培养细胞和0.01％-2％的氯化钠、以及所需量的多糖的面团。用于干法挤出的所述面团的示例性配方提供在下表8中。将经培养的动物细胞混合至面团中以制备面团/细胞掺和物，并装入料斗。面团/细胞掺和物由双螺杆挤出机挤出，冷却模具连接在挤出机的末端。

表8：干法挤出配方

成分	百分比
		湿细胞质量占细胞干重的5-15％	20-70％
食用油	1-10％
		绿豆蛋白(60-100％蛋白质)	5-50％
大豆蛋白(60-100％蛋白质)	5-50％
		淀粉和/或纤维	0-20％
糖和/或多糖类	0-20％
		香料、调味剂和/或气味剂	0-10％
按需加水以使水分含量达到5-40％	按需

实施例16：经培养鸡细胞的流变学特性

收获于500L或1,000L生物反应器中培养的实施例11所示鸡细胞和牛细胞，用水清洗并脱水至其典型水分含量为约88-94％的水，以湿法制备细胞膏。鸡细胞和牛细胞均大约含有70-80％的水。

采用动态振荡流变学来表征经培养的鸡细胞和牛细胞的流变学特性。流变仪(Discovery Hybrid Rheometer，TA instruments)配备有平面平行板几何形状(直径40mm)，用于监测细胞在暴露于升高的温度时的粘弹性质。湿细胞膏的样品按原样测定，不添加任何其他成分，以确定经培养细胞的胶凝和流变特性。收获的湿细胞膏含有90.7％的水分、7.1％的蛋白质、0.8％的脂肪、0.9％的灰分、和0.5％的碳水化合物。收获的湿细胞膏的细胞密度范围为1x 10⁹至1.25x 10⁹个细胞/kg细胞膏(1x 10⁶至1.25x 10⁶个细胞/ml)。

7％绿豆蛋白溶液作为对照，测定其流变学特性。

将约1.5mL的湿细胞膏或绿豆蛋白溶液加载至流变仪的下板上，并根据标准程序进行修整。装有2mL蒸馏水的溶剂捕集器用于防止测定过程中样品内的水分蒸发。

在温度从30℃斜升至95℃期间，连续记录储能模量(G′)和损耗模量(G″)。在较小变形条件下(0.1％应变)，加热速率为5℃/min，恒定角频率为10rad/s，然后于95℃下保持1分钟。在此保持之后，将材料的温度降低至50℃，并以10rad/s的恒定频率进行从0.01％到100％应变的振幅扫描测试，以表征凝胶材料的线性粘弹性区域。每个样品一式两份运行。

如动态温度扫描(Oscillation Temperature Ramp)捕获的数据所示，鸡肉湿细胞膏和牛肉湿细胞膏均表现出良好的胶凝能力。牛肉B4M-t6-S1细胞的凝胶化起始温度为约52℃。鸡肉BR08-121818细胞的凝胶化起始温度为约65℃。牛肉细胞和鸡肉细胞所形成的凝胶均是软弹性凝胶，刚度低。随着振荡应变的增加，储能模量逐渐下降而非急剧下降。

如图7A所示，当温度升高至65℃左右时，湿鸡细胞膏的储能模量保持不变。在65℃时，湿鸡细胞膏的储能模量开始增加，表明湿鸡细胞膏开始凝胶化。同样，当温度升高至52℃左右时，湿牛细胞膏的储能模量保持不变。在52℃时，湿牛细胞膏的储能模量开始增加，表明湿牛细胞膏开始凝胶化。7％的绿豆蛋白分离物对照组即使于95℃下也不胶凝，这可从未变化的储能模量看出。

图7B示出了在增加振荡应变时对储能模量的影响。实验于50℃下进行。图7B显示，在增加振荡应变的情况下，储能模量降低。在10％的低振荡应变下，湿鸡细胞膏的储能模量为约85Pa，而在60％的高振荡应变下，储能模量降至约25Pa。在10％的低振荡应变下，湿牛细胞膏的储能模量为约125Pa，而在60％的高振荡应变下，储能模量降至约25Pa。

实施例17：经培养鸡细胞的挤出

收获于500L或1000L生物反应器中培养的实施例11所示鸡细胞，并制备如实施例13所述的湿细胞膏并冷冻。将250g湿鸡细胞膏解冻并装入挤出机的液体进料储器中。然后经由进料探针采用蠕动泵将所述鸡细胞膏泵入挤出机机筒中。在挤出过程中，细胞膏的进料速率保持恒定。

将包括大豆蛋白、小麦蛋白和食盐在内的干成分均匀混合并转移至干燥进料器的料斗中。在挤出过程中，干成分的进料速率保持恒定。

含有65％经培养鸡细胞膏的鸡细胞挤出物的照片如图8所示。所述挤出物的纤维质构与来自农场饲养的鸡的鸡胸肉的纤维质构非常相似。

实施例18：经培养鸡细胞挤出物的质构分析

对实施例14所示挤出物的质构进行测定，并将其与农场饲养的鸡的烹制鸡胸肉进行比较。

农场饲养的鸡的鸡胸肉购自当地超市。将鸡胸肉真空包装并于70℃下真空低温烹制2小时。许多食谱均参考了此种烹制条件，以产生最理想的嫩度。实施例14所示挤出物，其含有65％经培养的鸡肌肉细胞、20％大豆蛋白浓缩物、14％小麦蛋白和0.05％ NaCl，在挤出过程后原样收集，挤出后不进行调味和整形。使用相同的挤出参数，制作含有植物蛋白分离物且不含动物细胞的基于植物的对照挤出物。此种基于植物的样品含有65％的水、20％的大豆蛋白浓缩物、14％的小麦蛋白和0.05％ NaCl。

在从注射器中排出之前，使上述样品冷却至室温。将所有样品切成8mm x 15mm x35mm的立方体，用于在Stable Micro Systems制造的TA.XTplus质构分析仪上进行质构分析。

在配备有TA-65多穿刺探针的TA.XTplus质构分析仪上记录仪器质构特征参数。此穿刺探针利用13根针刺穿样品，硬度定义为所有13根针在穿刺过程中受到的总力。以3mm/s的测试速度对样品进行穿刺试验，将样品穿刺至4mm的总深度。样品的硬度定义为穿刺过程中达到的最大力。

图9表明，鸡细胞挤出物的硬度为约5N，与传统鸡胸肉相似。不含经培养的鸡细胞的基于植物的对照挤出物则表现出较低的硬度。

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Claims

1.挤出物，其包含经培养的动物细胞、植物蛋白、至少一种其他成分、和任选地肽交联酶。

2.根据权利要求1所述的挤出物，其中所述经培养的动物细胞选自由禽类细胞、牛类细胞、猪类细胞、和海鲜类细胞组成的组。

3.根据权利要求2所述的挤出物，其中所述禽类细胞选自由鸡细胞、火鸡细胞、鸭细胞、鹅细胞、野鸡细胞、和乳鸽细胞组成的组。

4.根据权利要求1-3任一项所述的挤出物，其中所述经培养的动物细胞是以下属的细胞：原鸡属(Gallus)、火鸡属(Meleagris)、鸭属(Anas)、牛属(Bos)、或猪属(Sus)。

5.根据权利要求1-4任一项所述的挤出物，其中所述挤出物包含经培养的动物细胞，所述经培养的动物细胞的量是在1干重％至90干重％之间。

6.根据权利要求5所述的挤出物，其中所述挤出物包含经培养的动物细胞，所述经培养的动物细胞的量是在10干重％至90干重％之间、20干重％至90干重％、30干重％至90干重％、40干重％至90干重％、50干重％至90干重％、60干重％至90干重％、70干重％至90干重％、或80干重％至90干重％。

7.根据权利要求1-6任一项所述的挤出物，其中所述植物蛋白是植物蛋白分离物或植物蛋白浓缩物。

8.根据权利要求1-7任一项所述的挤出物，其中所述植物蛋白分离物或植物蛋白浓缩物得自植物，所述植物选自由分离自豆类、野豌豆(vetch)、谷物、坚果、大型藻类、和微藻类的蛋白质组成的组。

9.根据权利要求1-8任一项所述的挤出物，其中所述植物蛋白是豆类蛋白。

10.根据权利要求1-9任一项所述的挤出物，其中所述豆类植物蛋白是选自由以下组成的组的豆类：干豆、扁豆、绿豆、蚕豆、干豌豆、鹰嘴豆、豇豆、班巴拉豆(bambara bean)、木豆、羽扇豆、野豌豆、小豆、普通菜豆(common bean)、葫芦巴(fenugreek)、长豆、利马豆、红花菜豆、宽叶菜豆、大豆、和黧豆。

11.根据权利要求10所述的挤出物，其中所述豆类蛋白得自绿豆(Vigna radiata)。

12.根据权利要求1-11任一项所述的挤出物，其中所述挤出物包含植物蛋白，所述植物蛋白的量是在1干重％至90干重％之间。

13.根据权利要求12所述的挤出物，其中所述挤出物包含植物蛋白，所述植物蛋白的量是在1干重％至90干重％之间、5干重％至10干重％、10干重％至15干重％、15干重％至20干重％、25干重％至30干重％、30干重％至35干重％、35干重％至40干重％、45干重％至50干重％、50干重％至55干重％、55干重％至60干重％、60干重％至65干重％、65干重％至70干重％、或70干重％至75干重％。

14.根据权利要求1-13任一项所述的挤出物，其中所述挤出物包含肽交联酶。

15.根据权利要求14所述的挤出物，其中所述肽交联酶选自由以下组成的组：转谷氨酰胺酶、分选酶、枯草杆菌蛋白酶、酪氨酸酶、漆酶、过氧化物酶、和赖氨酰氧化酶。

16.根据权利要求15所述的挤出物，其中所述肽交联酶是转谷氨酰胺酶。

17.根据权利要求14-16任一项所述的挤出物，其中所述交联酶以0.0001重量％-0.025重量％之间的量存在。

18.根据权利要求17所述的挤出物，其中所述交联酶以0.0001重量％-0.025重量％之间、0.0001重

量％-0.020重量％、0.0001重量％-0.0175重量％、0.0001重量％-0.0150重量％、0.0001重量％-0.0125重量％、0.0001重量％-0.01重量％、0.0001重量％-0.0075重量％、0.0001重量％-0.005重量％、0.0001重量％-0.0025重量％、0.0001重量％-0.002重量％、0.0001重量％-0.0015重量％、0.0001重量％-0.001重量％、或0.0001重量％-0.00015重量％的量存在。

19.根据权利要求1-18任一项所述的挤出物，其中所述至少一种其他成分选自由脂质、盐、糖、纤维、湿润剂、调味剂、着色剂、和防腐剂组成的组。

20.根据权利要求19所述的挤出物，其中所述脂质的组成是游离脂肪酸、三酰甘油、或甾醇。

21.根据权利要求20所述的挤出物，其中所述游离脂肪酸或三酰甘油包含饱和脂肪酸类或不饱和脂肪酸类。

22.根据权利要求19-21任一项所述的挤出物，其中所述脂质得自植物。

23.根据权利要求22所述的挤出物，其中所述脂质是选自由以下组成的组的植物油：海藻油、菜籽油、椰子油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、花生油、米糠油、红花油、大豆油、葵花籽油、及其混合物。

24.根据权利要求19-23任一项所述的挤出物，其中所述脂质以1重量％至90重量％之间、5重量％至10重量％、10重量％至15重量％、15重量％至20重量％、25重量％至30重量％、30重量％至35重量％、35重量％至40重量％、45重量％至50重量％、50重量％至55重量％、55重量％至60重量％、60重量％至65重量％、65重量％至70重量％、或70重量％至75重量％的量存在。

25.根据权利要求19所述的挤出物，其中所述盐选自由以下组成的组：氯化钠、硫酸铵、磷酸铵、氯化铵、氯化钾、硫酸钾、或磷酸钾、以及磷酸盐。

26.根据权利要求25所述的挤出物，其中所述磷酸盐选自由磷酸二钠(DSP)、六偏磷酸钠(SHMP)、和焦磷酸四钠(TSPP)组成的组。

27.根据权利要求19-26任一项所述的挤出物，其中所述挤出物包含可溶性纤维和/或不溶性纤维。

28.根据权利要求27所述的挤出物，其中所述纤维以1干重％至50干重％之间、5干重％至10干重％、10干重％至15干重％、15干重％至20干重％、25干重％至30干重％、30干重％至35干重％、35干重％至40干重％、或45干重％至50干重％的量存在。

29.根据权利要求19-28任一项所述的挤出物，其中所述挤出物包含湿润剂。

30.根据权利要求29所述的挤出物，其中所述湿润剂选自由改性淀粉、未改性淀粉、和多元醇组成的组。

31.根据权利要求30所述的挤出物，其中所述多元醇选自由甘油、丙二醇、和聚葡萄糖组成的组。

32.根据权利要求29-31任一项所述的挤出物，其中所述湿润剂以1干重％至25干重％之间、1干重％至20干重％、1干重％至15干重％、1干重％至10干重％、或1干重％至5干重％的量存在。

33.根据权利要求1-32任一项所述的挤出物，其中所述挤出物的密度是在0.1g/cm³至约1g/cm³之间、在0.1g/cm³至约0.15g/cm³之间、在0.15g/cm³至0.2g/cm³之间、在0.2g/cm³至0.25g/cm³之间、在0.25g/cm³至0.3g/cm³之间、在0.3g/cm³至0.35g/cm³之间、在0.35g/cm³至0.4g/cm³之间、在0.4g/cm³至0.45g/cm³之间、在0.45g/cm³至0.5g/cm³之间、在0.5g/cm³至0.55g/cm³之间、在0.55g/cm³至0.6g/cm³之间、在0.6g/cm³至0.65g/cm³之间、在0.65g/cm³至0.7g/cm³之间、在0.7g/cm³至0.75g/cm³之间、在0.75g/cm³至0.8g/cm³之间、在0.8g/cm³至0.85g/cm³之间、在0.85g/cm³至0.9g/cm³之间、在0.9g/cm³至0.95g/cm³之间、或在0.95g/cm³至1g/cm³之间。

34.根据权利要求1-33任一项所述的挤出物，其中所述挤出物具有纤维结构。

35.根据权利要求1-34任一项所述的挤出物，其中所述挤出物具有在5N至100N之间、在5N至10N之间、在5N至15N之间、在15N至20N之间、在20N至25N之间、在25N至30N之间、在35N至40N之间、在40N至45N之间、在45N至50N之间、在55N至60N之间、在60N至65N之间、在65N至70N之间、在70N至75N之间、在75N至80N之间、在80N至85N之间、在85N至90N之间、在90N至95N之间、或在95N至100N之间的Warner-Bratzler评分。

36.根据权利要求1-35任一项所述的挤出物，其中所述挤出物通过穿刺试验测定的硬度是在1N和50N之间、在1N和45N之间、在1N和40N之间、在1N和35N之间、在1N和30N之间、在1N和25N之间、在1N和20N之间、在1N和15N之间、在1N和10N之间、在1N和9N之间、在1N和8N之间、在1N和7N之间、在1N和6N之间、在1N和5N之间、在1N和4N之间、在1N和3N之间、在1N和2N之间、在2N和15N之间、在2N和10N之间、在2N和9N之间、在2N和8N之间、在2N和7N之间、在2N和6N之间、在2N和5N之间、在2N和4N之间、或在2N和3N之间。

37.根据权利要求1-36任一项所述的挤出物，其中所述经培养的动物细胞采用悬浮培养或贴壁培养进行培养。

38.根据权利要求37所述的挤出物，其中所述经培养的动物细胞在含动物血清的生长培养基中进行培养。

39.根据权利要求37所述的挤出物，其中所述经培养的动物细胞在不含动物血清的生长培养基中进行培养。

40.根据权利要求1-39任一项所述的挤出物，其中所述挤出物是支架(scaffold)。

41.根据权利要求1-40任一项所述的挤出物，其中所述挤出物是用于3D打印的基材。

42.制备包含经培养的动物细胞、植物蛋白、至少一种其他成分、和任选地肽交联酶的挤出物的方法，所述方法包含以下步骤：

a)使水和植物蛋白接触来制备面团(dough)；

b)将所述面团放置入挤出机的料斗中；

c)将所述面团从所述料斗转移至所述挤出机的机筒中；

d)在机械压力下，将所述面团输送通过所述机筒，任选地加热所述机筒中的所述面团；

e)在输送所述面团的过程中，将所述经培养的动物细胞注入所述机筒中，以制备面团/细胞掺和物；和

f)通过模具挤出所述面团/细胞掺和物，以制作所述挤出物；

其中，在将所述面团放置入所述料斗之前，将所述至少一种其他成分添加至所述面团中，或者在将所述经培养的动物细胞注入所述机筒之前、期间、之后或同时，将所述至少一种其他成分注入所述机筒中。

43.制备包含经培养的动物细胞、植物蛋白、至少一种其他成分、和任选地肽交联酶的挤出物的方法，所述方法包含以下步骤：

a)通过使水、植物蛋白和所述经培养的动物细胞接触来制备面团/细胞掺和物；

b)将所述面团/细胞掺和物放置入挤出机的料斗中；

c)将所述面团/细胞掺和物从所述料斗转移至所述挤出机的机筒中；

d)在机械压力下，将所述面团/细胞掺和物输送通过所述机筒，任选地加热所述机筒中的所述面团/细胞掺和物；

e)通过模具挤出所述面团/细胞掺和物，以制作所述挤出物；和

f)其中，在将所述面团/细胞掺和物放置入所述料斗之前，将所述至少一种其他成分掺入所述面团/细胞掺和物中，或者在将所述面团/细胞掺和物输送通过所述机筒的过程中，将所述至少一种其他成分注入所述机筒中。

44.制备包含经培养的动物细胞、植物蛋白、至少一种其他成分、和任选地肽交联酶的挤出物的方法，所述方法包含以下步骤：

a)将干燥的植物蛋白装入，和任选地将干燥的至少一种其他成分和/或干燥的肽交联酶装入挤出机的料斗中，以制备干燥的成分混合物；

b)将所述干燥的成分混合物放置入所述挤出机的机筒中；

c)通过向所述机筒内输注蒸汽或水，在所述机筒内制备面团；

e)在输送所述面团的过程中，将经培养的动物细胞注入所述机筒中，以制备面团/细胞掺和物；和

f)通过模具挤出所述面团/细胞掺和物，以制作所述挤出物。

45.根据权利要求42-44任一项所述的方法，其中所述面团或所述面团/细胞掺和物的所述加热是通过向所述机筒内输注蒸汽或通过加热所述机筒来进行。

46.根据权利要求42-45任一项所述的方法，其中所述挤出方法是湿式挤出法或干式挤出法。

47.根据权利要求42-46任一项所述的方法，其中所述挤出机是单螺杆挤出机或双螺杆挤出机。

48.根据权利要求43-47任一项所述的方法，其中所述肽交联酶与所述面团或所述面团/细胞掺和物接触。

49.根据权利要求43-48任一项所述的方法，其中将所述经培养的动物细胞进行冷冻或干燥。

50.根据权利要求42-49任一项所述的方法，其中所述经培养的动物细胞采用悬浮培养或贴壁培养进行培养。

51.根据权利要求42-50任一项所述的方法，其中所述经培养的动物细胞在含动物血清的生长培养基中进行培养。

52.根据权利要求42-50任一项所述的方法，其中所述经培养的动物细胞在不含动物血清的生长培养基中进行培养。

53.湿细胞膏(wet cell paste)，其包含经培养的动物细胞，其中当所述湿细胞膏的细胞密度在1x 10⁶个细胞/ml至10x 10⁶个细胞/ml之间时，在30℃和95℃之间的温度下，储能模量(G')是在5Pa和300Pa之间。

54.根据权利要求53所述的湿细胞膏，其中所述经培养的动物细胞是禽类细胞、牛类细胞、猪类细胞、或海鲜类细胞。

55.根据权利要求53-54任一项所述的湿细胞膏，其中所述禽类细胞选自由鸡细胞、火鸡细胞、鸭细胞、鹅细胞、野鸡细胞、和乳鸽细胞组成的组。

56.根据权利要求53-55任一项所述的湿细胞膏，其中所述经培养的动物细胞是以下属的细胞：原鸡属(Gallus)、火鸡属(Meleagris)、鸭属(Anas)、牛属(Bos)、或猪属(Sus)。

57.根据权利要求53-56任一项所述的湿细胞膏，其中所述禽类细胞是原鸡属(Gallus)的细胞。

58.根据权利要求53-56任一项所述的湿细胞膏，其中所述禽类细胞是牛属(Bos)的细胞。

59.根据权利要求53-58任一项所述的湿细胞膏，其中所述湿细胞膏具有在35℃和95℃之间的凝胶化温度。

60.根据权利要求53-58任一项所述的湿细胞膏，其中所述湿细胞膏具有在40℃和95℃之间的凝胶化温度。

61.根据权利要求53-58任一项所述的湿细胞膏，其中所述湿细胞膏具有在45℃和95℃之间的凝胶化温度。

62.根据权利要求53-58任一项所述的湿细胞膏，其中所述湿细胞膏具有在50℃和95℃之间的凝胶化温度。

63.根据权利要求53-58任一项所述的湿细胞膏，其中所述湿细胞膏具有在50℃和85℃之间的凝胶化温度。

64.根据权利要求53-58任一项所述的湿细胞膏，其中所述湿细胞膏具有在50℃和75℃之间的凝胶化温度。

65.根据权利要求53-58任一项所述的湿细胞膏，其中所述湿细胞膏具有在50℃和70℃之间的凝胶化温度。

66.根据权利要求53-58任一项所述的湿细胞膏，其中所述湿细胞膏具有在50℃和65℃之间的凝胶化温度。

67.根据权利要求53-58任一项所述的湿细胞膏，其中所述湿细胞膏具有在50℃和60℃之间的凝胶化温度。