CN107475181A - 未成熟卵母细胞的体外成熟培养液及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养，具体公开了一种未成熟卵母细胞的培养方案其可促进未成熟卵母细胞的体外成熟，具体其包含卵泡颗粒细胞和培养该卵泡颗粒细胞的培养液，所述培养该卵泡颗粒细胞的培养液中含有CNP或其变体或其类似物和HDAC(组蛋白去乙酰化酶)抑制剂。本发明进一步地提供了包含CNP或其变体或其类似物和HDAC抑制剂的体外成熟培养液及其相关组合物，以及上述培养基、培养液以及组合物在促进未成熟卵母细胞体外成熟的应用。

Description

未成熟卵母细胞的体外成熟培养液及其应用
技术领域
本发明涉及未成熟卵母细胞的体外成熟培养液、相关组合物及培养方法，属于医药生物领域。
背景技术
在人类临床辅助生殖中，广泛采用促性腺激素对女性患者做超数排卵操作，之后利用所获成熟卵母细胞施行体外受精或单精子注射等，实现其孕育后代的目标。但是由于环境、精神压力以及个体对促性腺激素的响应性存在差异等原因，导致部分患者在实施超数排卵操作后，往往出现所得卵母细胞有相当一部分没有成熟的情况，这就大大降低了对该患者施行辅助生殖助孕的成功率，降低了对所采集的卵母细胞的利用效率。遗憾的是，目前临床上所用的卵母细胞成熟培养方法及所使用的培养液，一定程度上都不能解决上述问题。因此，如果能够开发出一种全新的体外培养人类未成熟卵母细胞的方法，使得这部分未成熟卵母细胞能够在体外培养一段时间后，成熟并具备相应的发育潜能，将在很大程度上促进辅助生殖技术的进步，提高助孕的成功率，为患者带来福音。
目前，制约我国家畜繁殖业发展的一个重要因素是优质种畜的数量少且繁育速度慢，造成了生产性能落后的局面。胚胎工程技术的发展极大地促进了繁殖技术体系的进步。为此，利用胚胎工程技术体系，将体外受精所得胚胎进行移植成为一种促进畜牧业发展的技术平台和方向。一般采用的方法是，从无激素刺激的卵巢中采集获得未成熟卵母细胞，在体外培养体系中培养至成熟后用于胚胎生产和动物繁殖等。但遗憾的是，目前体外生产的胚胎的数量明显低于体内，这反映了卵母细胞体外培养体系尚不理想。同时，体外受精胚胎质量的好坏也影响着胚胎移植后的妊娠率，以及移植后后代成活率等。因此，优化和改进卵母细胞体外成熟培养体系，有助于增加可用于体外受精生产胚胎的卵母细胞的数量，促进胚胎质量的提高。因此，完善家畜胚胎工程体系中，体外培养未成熟卵母细胞的培养液以及培养方法，促进卵母细胞体外成熟率的增加，有助于提高胚胎工程的效率，促进家畜繁殖。
近年来人们对哺乳动物卵母细胞体外成熟培养(IVM)方法进行了多项改进，取得了较大进展。基本途径是：模拟体内环境开发卵母细胞体外两段成熟的培养方法，即通过体外使用减数分裂抑制剂暂时可逆阻滞卵母细胞减数分裂恢复，同时促进卵母细胞生长和胞质成熟；然后将卵母细胞移出减数分裂的抑制环境，进行体外成熟。这种方法的目的是：延长颗粒细胞与卵母细胞通过间隙连接进行物质和信息交流的时间，促进卵母细胞积累丰富的mRNA和蛋白质。
例如，专利CN102140435A公开了一种水牛卵母细胞体外成熟培养液，其通过添加胰岛素、转铁蛋白和硒来改善水牛卵母细胞成熟率。CN101591637A公开了一种牛卵母细胞体外成熟培养液，其通过IVM培养基内添加羊膜上皮细胞和其培养液的上清液，利用上皮细胞的特性，利用其分泌、合成牛卵母细胞体外成熟生物活性物质，从而提高牛卵母细胞成熟率。CN100432219C公开了一种牛卵母细胞体外成熟培养液，其主要是以茶多酚为抗氧化剂，利用其抗自由基和激活细胞内抗氧化防御系统的特点，从而获得了一种可促进牛卵母细胞体外成熟的营养基。CN102899286A公开了一种牛卵母细胞体外成熟培养液，其通过向TCM199培养基添加CNP，而CNP可促进核成熟和胞质成熟同步，从而提高了体外发育能力。
这些方法，要么有助于促进卵母细胞减数分裂恢复和体外成熟；要么通过阻滞卵母细胞减数分裂过早出现来实现提高卵母细胞的体外发育能力的目的。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的主要目的是提供促进未成熟卵母细胞的成熟率及发育潜能的体外成熟培养。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种培养基，其可促进未成熟卵母细胞的体外成熟，具体其包含卵泡颗粒细胞和培养该卵泡颗粒细胞的培养液，所述培养该卵泡颗粒细胞的培养液中含有CNP或其变体或其类似物和HDAC(组蛋白去乙酰化酶)抑制剂。
在一个实施方案中，所述培养基通过培养该卵泡颗粒细胞的培养液培养卵泡颗粒细胞4-6h而获得。
在又一个实施方案中，所述HDAC抑制剂选自HDAC1抑制剂、HDAC2抑制剂和HDAC3抑制剂。
进一步地，所述HDAC抑制剂为HDAC3抑制剂；所述HDAC3抑制剂选自HDACi 4b、Entinostat(MS-275)、BG45、RG2833(RGFP109)、RGFP966中的一种或更多种。
在又一个实施方案中，所述CNP为C型钠肽。
在另一个实施方案中，所述培养该卵泡颗粒细胞的培养液，其含有30-120ng/mL的CNP或其变体或其类似物和1-10μM的HDAC抑制剂。
在进一步的实施方案中，所述培养该卵泡颗粒细胞的培养液，其含有40-80ng/mL的CNP或其变体或其类似物和3-7μM的HDAC抑制剂。
在另一个实施方案中，所述培养该卵泡颗粒细胞的培养液还含有：5-15％FBS，0.01-0.5mg/mL谷氨酰胺，10-200IU/mL青霉素，10-200IU/mL链霉素。
在一个优选的实施方案中，所述培养该卵泡颗粒细胞的培养液，其为含有60ng/mL的CNP或其变体或其类似物，5μM的HDAC抑制剂，10％的FBS，0.1mg/mL谷氨酰胺，100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的TCM199培养液。
另一方面，本发明还提供一种体外成熟培养液，其可用于未成熟卵母细胞的体外成熟培养，所述培养液中含有CNP或其变体或其类似物和HDAC抑制剂。其通过与卵泡颗粒细胞接触进而构成一种用于未成熟卵母细胞的体外成熟培养的培养基。
在一个实施方案中，所述HDAC抑制剂选自HDAC1抑制剂、HDAC2抑制剂和HDAC3抑制剂。
进一步优选地，所述HDAC抑制剂为HDAC3抑制剂；所述HDAC3抑制剂选自HDACi 4b、Entinostat(MS-275)、BG45、RG2833(RGFP109)、RGFP966中的一种或更多种。
在又一个实施方案中，所述CNP为C型钠肽。
在另一个实施方案中，所述培养液，其含有30-120ng/mL的CNP或其变体或其类似物和1-10μM的HDAC抑制剂。
在一个优选的实施方案中，所述培养液，其含有40-80ng/mL的CNP或其变体或其类似物和3-7μM的HDAC抑制剂。
在另一个实施方案中，所述培养液还含有：5-15％FBS，0.01-0.5mg/mL谷氨酰胺，10-200IU/mL青霉素，10-200IU/mL链霉素中的一种或更多种。
在一个优选的实施方案中，所述培养液还含有：5-10％FBS，0.05-0.2mg/mL谷氨酰胺，50-150IU/mL青霉素，50-150IU/mL链霉素中的一种或更多种。优选的，所述培养液还含有：10％FBS，0.1mg/mL谷氨酰胺，100IU/mL青霉素，100IU/mL链霉素中的一种或更多种。
在一个具体的实施方案中，所述培养液，其为含有60ng/mL的CNP或其变体或其类似物，5μM的HDAC抑制剂，10％的FBS，0.1mg/mL谷氨酰胺，100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的TCM199培养液。
再一方面，本发明还提供一种组合物，其用于未成熟卵母细胞的体外成熟培养，所述组合物由CNP或其变体或其类似物和HDAC抑制剂组成。所述组合物可以通过添加到本领域常规的培养基中来用于对未成熟卵母细胞的体外成熟培养。
在一个实施方案中，当用于对未成熟卵母细胞的体外成熟培养时，所述组合物在培养基中的浓度为30-120ng/mL的CNP或其变体或其类似物和1-10μM的HDAC抑制剂。
又一方面，本发明提供一种促进卵母细胞体外成熟的培养方法，其包括用前述培养基对从对象分离的未成熟卵母细胞培养的步骤。
在一个优选的实施方案中，所述培养方法具体为：采集对象的卵泡中的颗粒细胞，用前述体外成熟培养液进行细胞单层贴壁培养以用做饲养层细胞，然后收取处于生发泡期的卵母细胞，直接在含饲养层细胞的成熟液中培养20h-25h。
在一个实施方案中，所述对象包括人、牛、猪、羊和啮齿类动物等。
在又一个实施方案中，成熟后的卵母细胞可用于孤雌激活、体外受精或单精子注射，然后进行胚胎培养，再行胚胎移植用于助孕或畜牧业生产。
在一个优选的实施方案中，当所述对象为人时，所述方法具体包括如下步骤：
1)对透明质酸酶消化后的颗粒细胞和卵母细胞分类采集；
2)将颗粒细胞放在前述体外成熟培养液中进行贴壁培养；
3)将消化后体外培养4-6h后，仍处于生发泡期的卵母细胞，放入步骤2)处理后的含饲养层细胞的成熟培养液中进行培养。
又一方面，本发明还提供了前述体外成熟培养液在促进未成熟卵母细胞体外成熟的应用。
进一步地，本发明还提供了含有CNP或其变体或其类似物和HDAC抑制剂的组合物在制备用于促进临床女性超排后未成熟卵母细胞恢复减数分裂和提高发育潜能中的应用。
本发明的有益效果在于：
对人类临床患者来讲，本发明首次采用针对促性腺激素处理后仍无法成熟的卵母细胞进行成熟培养，提高了卵母细胞成熟率和后期发育的潜能。不仅充分利用了超排后的卵母细胞资源，提高了受精后的早期胚胎发育能力，也增加了辅助生殖病人受孕成功的几率。对动物(以啮齿类小鼠为例)未成熟卵母细胞的培养而言也有相似功效。
本发明采用颗粒细胞作为饲养层诱导卵母细胞成熟的培养方法，应用CNP或其变体或其类似物和HDAC抑制剂处理卵巢卵泡来源的颗粒细胞，通过促进颗粒细胞中促卵母细胞发育的因子的表达及分泌，提高了卵母细胞体外发育能力。该方法因此能够成为新型的促卵母细胞成熟药物，在人类辅助生殖临床上推广应用。
本发明所涉及的CNP为卵泡内活性肽类物质，对卵母细胞的毒害作用小，而HDAC抑制剂也已经证明对生物个体及卵母细胞毒性作用非常弱。
附图说明
图1示出HDAC3抑制剂HDACi 4b促进人卵母细胞成熟及发育效果。
图1A示出HDACi 4b促进人GV期卵母细胞发育成熟至第二次减数分裂中期(MII)。
图1B示出MII期卵母细胞经ICSI受精后的双原核(2PN)受精卵数目显示对照及处理组受精率基本相同。
图1C示出HDACi 4b处理的卵母细胞受精后卵裂能力显著提高。
图1D示出对照组及HDACi 4b诱导成熟的卵母细胞受精后体外培养得到囊胚。
图1E示出囊胚计数结果显示HDACi 4b诱导成熟的卵母细胞受精后胚胎发育能力显著提高。
图1F示出抑制人卵巢颗粒细胞可以显著促进AREG表达。
图1G示出囊胚内细胞团特异性蛋白OCT4和滋养外胚层特异性蛋白CDX2免疫荧光结果显示HDACi 4b诱导成熟的卵母细胞发育至囊胚的质量显著提高。
图2示出HDAC3抑制剂HDACi 4b可以显著促进小鼠卵母细胞成熟及发育能力。
图2A示出体外卵泡模型培养下，HDACi 4b可以显著促进小鼠卵泡中卵母细胞减数分裂恢复。
图2B示出在体外成熟培养基中，HDACi 4b处理后卵母细胞恢复减数分裂能力与对照组相似。
图2C示出HDACi 4b显著促进卵母细胞跨越第一次减数分裂并阻滞于第二次减数分裂中期(MII)。
图2D示出HDACi 4b诱导成熟的卵母细胞组与对照组卵母细胞受精后的卵裂能力基本相同。
图2E示出小鼠GV期卵母细胞经HDACi 4b诱导后受精发育至胚胎的能力显著提高。
图2F示出HDACi 4b处理的卵母细胞受精后发育至囊胚的能力显著提高。
图2G示出对照组及HDACi 4b处理组囊胚培养结果。
图2H示出囊胚计数结果显示GV期卵母细胞经HDACi 4b处理后受精发育至囊胚的能力显著提高。
图2I示出内细胞团特异性蛋白OCT4免疫荧光结果显示HDACi 4b处理的卵母细胞的囊胚质量显著提高。
具体实施方式
还可进一步通过实施例来理解本发明，其中所述实施例说明了一些制备或使用方法。然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。
术语定义
本说明书中使用的各种术语具有技术人员所熟知的意义。然而，为便于参考，下文定义了其中一些术语。
术语"培养基"应理解为表示维持和/或增殖卵母细胞或胚胎的液体环境。
术语"分离的"应理解为表示有时将卵母细胞从其天然环境中取出或纯化(至少部分)。分离卵母细胞的例子是作为卵泡、卵丘卵母细胞复合物(cumulus oocyte complex)的一部分而从对象分离的卵母细胞或剥蚀的卵母细胞(denuded oocyte)。
术语"变体"应理解为表示有一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列。变体可以具有"保守性"改变，这种改变中取代的氨基酸具有被取代氨基酸的相似结构或化学特性(例如，用异亮氨酸替代亮氨酸)。变体还可具有一个或多个氨基酸的"非保守性"改变(例如，用色氨酸替代甘氨酸)或缺失和/或插入。
术语"类似物"应理解为表示具有与参比分子相似的结构、调节或生物化学功能的分子，包括该参比分子的生物学活性片段。
术语"对象"应理解为表示女人、雌性哺乳动物，包括灵长类、牲畜(例如，马、牛、绵羊、猪、山羊)、陪伴动物(例如，狗、猫)、实验室测试动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)或兽医学有意义的动物。
术语"辅助生殖"应理解为表示涉及产生能植入的胚胎的任何技术，包括采用体外培养的卵母细胞或胚胎的技术(例如，卵母细胞的体外成熟)、体外受精(IVF；抽吸卵母细胞，实验室内受精和将胚胎转移入受者)、输卵管内配子移植术(GIFT；将卵母细胞和精子置于输卵管中)、受精卵输卵管内转移(ZIFT；将受精的卵母细胞置于输卵管中)、输卵管胚胎转移(tubal embryo transfer)(TET；将分裂的胚胎置于输卵管中)、卵母细胞和精子腹腔内移植(POST；将卵母细胞和精子置于骨盆腔中)、精子卵浆内注射技术(ICSI)、睾丸精子提取(TESE)、显微外科手术附睾精子吸取(MESA)、核转移、全能干细胞扩增和单性生殖活化(parthenogenic activation)。本领域已知辅助生殖的方法。
最近的一项研究表明，LH通过体细胞所诱导的卵母细胞胞质成熟对卵母细胞发育能力的提高有关键作用(Chen J,Torcia S,Xie F,Lin CJ,Cakmak H,Franciosi F,HornerK,Onodera C,Song JS,Cedars MI,Ramalho-Santos M,Conti M.Nat Cell Biol.2013Dec；15(12):1415-23.doi:10.1038/ncb2873.Epub 2013Nov 24)。
与此相符，我们的实验方法是：在体外培养环境下，模拟出体内LH作用于颗粒细胞促进卵母细胞成熟的效果，以期实现促进卵母细胞成熟的同时，提高其发育潜能的目的。结果显示，在CNP存在的条件下，短时间抑制卵母细胞核成熟，同时通过向有颗粒细胞饲养层的培养液中添加HDAC3抑制剂，就可以起到类似LH的效果，即促使颗粒细胞分泌EGF样生长因子(如AREG、EREG等)并促进卵母细胞成熟。
我们的结果证明，在不使用LH的前提下，通过借助本发明培养基或培养液的功效，就可以促进卵母细胞质中蛋白质的积累，在体外明显促进生发泡期卵母细胞的成熟及发育潜能的提高。
可将本发明各种组合产品中的培养基、培养液和组合物以多用途或单位形式独立包装在合适的容器(通常是无菌的)，例如安瓿、瓶或小瓶中。可在充填后密封这些容器。对于蛋白质的稳定性和/或应用，可以含有其它添加剂。本领域已知包装各种组分的方法。
预计将卵母细胞与所述培养基不仅会改善植入和辅助生殖技术的结果，还会减少植入失败、流产，包括自发流产、先兆子痫、子宫内生长受限、早产和胎盘早剥。此外，还预计通过改善胎盘发育和/或降低妊娠并发症的风险和/或可能性可促进植入从而能改善分娩后结果。
在一个实施方式中，本发明各种形式的卵母细胞是人卵母细胞或哺乳动物卵母细胞。合适哺乳动物的例子包括灵长类、牲畜(例如，马、牛、绵羊、猪、山羊)、陪伴动物(例如，狗、猫)、实验室测试动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)。在一个实施方式中，所述卵母细胞是人卵母细胞。
在这点上，卵母细胞可以是，例如卵母细胞是卵泡的一部分、丘卵母细胞复合物(COC)的一部分，或者可以是裸露的卵母细胞。
本发明的培养基不仅适用于人类，还可用于培养动物的卵母细胞和胚胎。因此，本发明不仅可应用于人类的辅助生殖技术，还可应用于非人动物的辅助生殖技术，以及在非人动物中产生胚胎的其它技术，例如采用单性生殖活化、核转移和利用全能干细胞。
本领域已知收集合适女性供体的卵母细胞并使该卵母细胞体外受精的方法。例如，可如《辅助生殖教材：实验室和临床前景》，(2003)，Gardner,D.K.，Weissman，A.，Howies,CM.，Shoham，Z.编，马丁邓提斯有限公司，伦敦，联合王国(Textbook of AssistedReproduction:Laboratory and Clinical Perspectives(2003)Editors Gardner,D.K.,Weissman,A.,Howies,CM"Shoham，Z.Martin Dunits Ltd,London,UK)所述进行人类体外受精。可如Gordon,I.，(2003)，《牛胚胎的实验室制备》，第二版，CABI出版公司，牛津郡，联合王国(Gordon,I.(2003)Laboratory Production of Cattle Embryos 2nd Edition CABIPublishing,Oxon,UK)所述进行牛体外受精。
CNP的变体是氨基酸序列中有一个或多个天然氨基酸改变的CNP分子形式。在一个实施方式中，变体在氨基酸水平与天然CNP的同源性大于75％。在另一实施方式中，变体与天然CNP的同源性大于90％。在还有一实施方式中，变体与天然CNP的同源性大于95％。
CNP的类似物是结构(即，结构类似物)、调节功能(即，调节类似物)或生物化学功能(即，功能类似物)与CNP相似的分子，包括CNP的生物学活性片段。
在本发明中，所述CNP或其变体或其类似物在所述培养基、培养液或组合物中，其浓度为30-120ng/mL，在具体地实施方案中，所述CNP或其变体或其类似物在所述培养基、培养液或组合物中的浓度为30、40、50、60、70、80、90、100、110或120ng/ml。
所述HDAC抑制剂在所述培养基、培养液或组合物中，其浓度为1-10μM，在具体地实施方案中，所述HDAC抑制剂在所述培养基、培养液或组合物中的浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μM。
实施例1体外成熟培养液的配制
将FBS、HDACi 4b、CNP、谷氨酰胺、青霉素和链霉素溶于TCM-199中，制备得到含有10％FBS，5μM HDACi 4b，60ng/mL CNP，0.1mg/mL谷氨酰胺，100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的TCM-199培养液，即为体外成熟培养液。
实施例2体外成熟培养液的配制
将FBS、HDACi 4b、CNP、谷氨酰胺、青霉素和链霉素溶于TCM-199中，制备得到含有5％FBS，3μM HDACi 4b，80ng/mL CNP，0.05mg/mL谷氨酰胺，100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的TCM-199培养液，即为体外成熟培养液。
实施例3体外成熟培养液的配制
将FBS、HDACi 4b、CNP、谷氨酰胺、青霉素和链霉素溶于TCM-199中，制备得到含有15％FBS，7μM HDACi 4b，40ng/mL CNP，0.2mg/mL谷氨酰胺，100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的TCM-199培养液，即为体外成熟培养液。
实施例4体外成熟培养液的配制
将HDACi 4b和CNP溶于TCM-199中，制备得到含有5μM HDACi4b，60ng/mL CNP的TCM-199培养液，即为体外成熟培养液。
实施例5体外成熟培养液的配制
将HDACi 4b和CNP溶于TCM-199中，制备得到含有1μM HDACi4b，100ng/mL CNP的TCM-199培养液，即为体外成熟培养液。
实施例6体外成熟培养液的配制
将HDACi 4b和CNP溶于TCM-199中，制备得到含有10μM HDACi4b，30ng/mL CNP的TCM-199培养液，即为体外成熟培养液。
实施例7体外成熟培养基的制备
在医院辅助生殖中心取到不同病人的颗粒细胞及卵母细胞。供体精液来自精子中心。
颗粒细胞的微滴培养：将用透明质酸酶从患者超数排卵所得的卵丘卵母细胞复合体中消化得到的颗粒细胞离心后，分别置入实施例1-6体外成熟培养液进行微滴贴壁培养。微滴上覆盖石蜡油。待颗粒细胞贴壁后，即可作为用于未成熟卵母细胞的体外成熟培养基1-6。
实施例8卵母细胞的体外成熟培养
将患者超排后获得的卵母细胞，经鉴定后为未成熟者，放入含饲养层细胞的体外成熟培养基1(即采用实施例1配制得到的体外成熟培养液获得的培养基)中微滴培养。每个微滴放入1-2个卵母细胞，培养时间为20h-25h。培养条件为37℃、含5％的CO2和6％O2的空气，湿度100％；未成熟卵母细胞经体外成熟培养基1微滴培养后的发育效果参见图1。
成熟卵母细胞进行细胞质单精子注射(ICSI)：未成熟卵母细胞经体外培养20h-25h后，观察其成熟情况。将达到第二次减数分裂中期(MII期)的卵母细胞，置于显微操作仪下，进行ICSI注射。
卵母细胞受精后胚胎培养：将G-1PLUS(Vitrolife，Sweden)胚胎培养液在35mm的培养皿中，制成数个50μL的微滴。在液滴表面以矿物油覆盖。该培养液适于培养从受精(第0天)到8-cell前的胚胎。
将G-2PLUS(Vitrolife，Sweden)胚胎培养液在35mm的培养皿中，制成数个50μL的微滴。在液滴表面以矿物油覆盖。该培养液适于培养发育到8细胞以后的胚胎，直到囊胚期。
采用本方法所得人类未成熟卵母细胞的成熟率和早期胚胎发育率，与对照组常规方法的比较，如表1所示。实验结果表明，本次实验中HDACi 4b+CNP进行体外成熟培养处理20h，其ICSI后的卵裂率和囊胚率均显著高于对照组(P<0.01)。
表1.未成熟卵母细胞在不同培养液中培养后的效果对比
注：同列不同字母表示差异显著(P<0.01)；卵裂率＝卵裂数/卵母细胞数，囊胚率＝囊胚数/卵裂数。所述常规成熟培养液为M199培养基。
结论：由以上结果可知，HDACi 4b+CNP的药物组合加入常规培养液中，能显著促进未成熟卵母细胞成熟率的提高，也使得该卵母细胞受精后的卵裂率和囊胚发育率提高到对照组的2倍-3倍。
另外，需要说明的是，本发明制备体外成熟培养基2-6(即采用实施例2-6配制得到的体外成熟培养液获得的培养基)同样取得了类似实施例8中的技术效果，即，HDACi 4b+CNP的药物组合加入常规培养液中，能显著促进未成熟卵母细胞成熟率的提高，也使得该卵母细胞受精后的卵裂率和囊胚发育率提高到对照组的2倍-3倍。并且更换HDAC3抑制剂类型后效果仍然有效。这说明利用本发明所述的培养液和培养方法，有助于促进未成熟卵母细胞的成熟率的提高和体外发育能力的增强。证明该方法具有潜在的临床和畜牧业生产上的利用价值。
实施例9小鼠未成熟卵母细胞的体外成熟
具体培养方法参见实施例8，区别在于将患者来源的颗粒细胞换成C57/BL6J品系小鼠的颗粒细胞，将患者来源的卵母细胞换成该品系小鼠来源的卵丘卵母细胞复合体，小鼠卵母细胞的体外发育效果参见图2。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (21)

1.一种培养基，其包含卵泡颗粒细胞和培养该卵泡颗粒细胞的培养液，其中培养该卵泡颗粒细胞的培养液中含有CNP或其变体或其类似物和HDAC抑制剂。
2.根据权利要求1所述的培养基，其中所述培养基通过培养该卵泡颗粒细胞的培养液培养卵泡颗粒细胞4-6h而获得。
3.根据权利要求1所述的培养基，其中所述HDAC抑制剂选自HDAC1抑制剂、HDAC2抑制剂和HDAC3抑制剂中的一种或更多种。
4.根据权利要求3所述的培养基，其中所述HDAC抑制剂为HDAC3抑制剂；所述HDAC3抑制剂选自HDACi 4b、Entinostat(MS-275)、BG45、RG2833(RGFP109)、RGFP966中的一种或更多种。
5.根据权利要求1所述的培养基，其中培养该卵泡颗粒细胞的培养液含有30-120ng/mL的CNP或其变体或其类似物和1-10μM的HDAC抑制剂。
6.根据权利要求5所述的培养基，其中培养该卵泡颗粒细胞的培养液含有40-80ng/mL的CNP或其变体或其类似物和3-7μM的HDAC抑制剂。
7.根据权利要求5或6所述的培养基，其中培养该卵泡颗粒细胞的培养液还含有：5-15％FBS，0.01-0.5mg/mL谷氨酰胺，10-200IU/mL青霉素，10-200IU/mL链霉素。
8.一种体外成熟培养液，其可用于未成熟卵母细胞的体外成熟培养，所述培养液中含有CNP或其变体或其类似物和HDAC抑制剂，其通过与卵泡颗粒细胞接触进而构成一种用于未成熟卵母细胞的体外成熟培养的培养基。
9.根据权利要求8所述的体外成熟培养液，其中所述HDAC抑制剂选自HDAC1抑制剂、HDAC2抑制剂和HDAC3抑制剂中的一种或更多种。
10.根据权利要求9所述的体外成熟培养液，其中所述HDAC抑制剂为HDAC3抑制剂；所述HDAC3抑制剂选自HDACi 4b、Entinostat(MS-275)、BG45、RG2833(RGFP109)、RGFP966中的一种或更多种。
11.根据权利要求8所述的体外成熟培养液，其中所述培养液含有30-120ng/mL的CNP或其变体或其类似物和1-10μM的HDAC抑制剂。
12.根据权利要求11所述的体外成熟培养液，其中所述培养液含有40-80ng/mL的CNP或其变体或其类似物和3-7μM的HDAC抑制剂。
13.根据权利要求11或12所述的体外成熟培养液，其中所述培养液还含有：5-15％FBS，0.01-0.5mg/mL谷氨酰胺，10-200IU/mL青霉素，10-200IU/mL链霉素中的一种或更多种。
14.一种组合物，其用于未成熟卵母细胞的体外成熟培养，所述组合物由CNP或其变体或其类似物和HDAC抑制剂组成；所述组合物通过添加到本领域常规的培养基中来用于对未成熟卵母细胞的体外成熟培养。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物在培养基中的浓度为30-120ng/mL的CNP或其变体或其类似物和1-10μM的HDAC抑制剂。
16.一种促进卵母细胞体外成熟的培养方法，其包括采用权利要求1-7任一所述的培养基对从对象分离的未成熟卵母细胞培养的步骤。
17.根据权利要求16所述的促进卵母细胞体外成熟的培养方法，所述培养方法具体为：采集对象的卵泡中的颗粒细胞，用前述体外成熟培养液进行细胞单层贴壁培养以用做饲养层细胞，然后收取处于生发泡期的卵母细胞，直接在含饲养层细胞的成熟液中培养20h-25h。
18.根据权利要求16所述的促进卵母细胞体外成熟的培养方法，所述对象包括人、牛、猪、羊和啮齿类动物等。
19.根据权利要求17所述的促进卵母细胞体外成熟的培养方法，当所述对象为人时，所述方法具体包括如下步骤：
1)对透明质酸酶消化后的颗粒细胞和卵母细胞分类采集；
2)将颗粒细胞放在所述体外成熟培养液中进行贴壁培养；
3)将消化后体外培养4-6h后，仍处于生发泡期的卵母细胞，放入步骤2)处理后的含饲养层细胞的成熟培养液中进行培养。
20.权利要求8-13任一所述体外成熟培养液在促进未成熟卵母细胞体外成熟的应用。
21.权利要求14或15任一所述组合物在制备用于促进临床女性超排后未成熟卵母细胞恢复减数分裂和提高发育潜能中的应用。
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