JP7138359B2 - 未成熟卵母細胞の体外成熟培養液、及びその応用 - Google Patents
未成熟卵母細胞の体外成熟培養液、及びその応用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7138359B2 JP7138359B2 JP2020517106A JP2020517106A JP7138359B2 JP 7138359 B2 JP7138359 B2 JP 7138359B2 JP 2020517106 A JP2020517106 A JP 2020517106A JP 2020517106 A JP2020517106 A JP 2020517106A JP 7138359 B2 JP7138359 B2 JP 7138359B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- oocytes
- culture
- vitro
- maturation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0608—Germ cells
- C12N5/0609—Oocytes, oogonia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/065—Modulators of histone acetylation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/24—Genital tract cells, non-germinal cells from gonads
- C12N2502/243—Cells of the female genital tract, non-germinal ovarian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
- C12N2517/10—Conditioning of cells for in vitro fecondation or nuclear transfer
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
現在、我国の家畜繁殖産業の発展を制限する重要な要因は、高品質の種畜の数が少なく、繁殖速度が遅いことであり、生産能力が落伍する状況になる。生殖工学技術の発展は、繁殖技術の進歩を大きく促進する。そのため、生殖工学技術を利用して体外受精により得られた胚を移植するのは、畜産業の発展を促進する技術基盤・方向となる。一般的に用いられる方法は、ホルモン無刺激下の卵巣から未成熟卵母細胞を採取し、体外培養系で培養して成熟させた後、胚生産及び動物繁殖などに適用する。しかし残念ながら、現在、体外生産した胚の数は生体内によるものよりも有意に低く、卵母細胞の体外培養系は理想的ではないことを反映する。同時に、体外受精由来胚の品質は、胚移植後の妊娠率、および移植後の胚の生存率などにも影響を及ぼす。従って、卵母細胞の体外成熟培養系の最適化及び改良するのは、体外受精により胚を生産するための卵母細胞の数を増加させ、胚品質の向上を促進するのに役立つ。従って、家畜生殖工学システムでは、体外培養下の未成熟卵母細胞の培養液及び培養方法を改良するのは、卵母細胞の体外成熟率の増加を促進し、胚工学の効率を高め、家畜繁殖を促進するのに役立つ。
例えば、中国特許CN102140435Aは、インスリン、トランスフェリン、及びセレンを添加することにより水牛卵母細胞の成熟率を改善する水牛卵母細胞の体外成熟培養液を開示している。CN101591637Aは、IVM培地内に羊膜上皮細胞及びその培養上清液を添加し、上皮細胞の特性により、それより牛卵母細胞の体外成熟生物活性物質を分泌、合成することにより牛卵母細胞の成熟率を向上させる牛卵母細胞の体外成熟培養液を開示している。CN100432219Cは、主に茶ポリフェノールを酸化防止剤とし、それがフリーラジカルを消去し、細胞内抗酸化防御システムを活性化する特徴を利用することにより、牛卵母細胞の体外成熟を促進できる培地を取得する、牛卵母細胞の体外成熟培養液を開示している。CN102899286Aは、TCM199培地に核成熟と細胞質成熟の同期化を促進できるCNPを添加することにより、体外発生能力を向上させる牛卵母細胞の体外成熟培養液を開示している。
それらの方法は、卵母細胞の減数分裂の再開及び体外成熟を促進するのに寄与したり、卵母細胞減数分裂の早すぎる開始を停止することにより、卵母細胞の体外発生能力を向上させる目的に達成する。
一側面において、本発明は、未成熟卵母細胞の体外成熟を促進できる培地を提供し、具体的には、それは、卵胞顆粒膜細胞、及び当該卵胞顆粒膜細胞を培養する培養液を含み、前記の当該卵胞顆粒膜細胞を培養する培養液は、CNP又はその変異体又はその類似体、及びHDAC(ヒストン脱アセチル化酵素)阻害剤を含む。
一つの実施形態において、前記培地は、当該卵胞顆粒膜細胞を培養する培養液により卵胞顆粒膜細胞を4~6h培養して得られる。
他の実施形態において、前記HDAC阻害剤は、HDAC1阻害剤、HDAC2阻害剤、及びHDAC3阻害剤から選ばれる。
さらに、前記HDAC阻害剤は、HDAC3阻害剤であり、前記HDAC3阻害剤は、HDACi 4b、Entinostat (MS-275)、BG45、RG2833 (RGFP109)、RGFP966から選ばれる1種以上である。
他の実施形態において、前記CNPは、C型ナトリウム利尿ペプチドである。
更に他の実施形態において、前記の当該卵胞顆粒膜細胞を培養する培養液は、30~120ng/mLのCNP又はその変異体又はその類似体、及び1~10μM HDAC阻害剤を含む。
更に他の実施形態において、前記の当該卵胞顆粒膜細胞を培養する培養液は、40~80ng/mLのCNP又はその変異体又はその類似体、及び3~7μM HDAC阻害剤を含む。
更に他の実施形態において、前記の当該卵胞顆粒膜細胞を培養する培養液は、さらに、5~15% FBS、0.01~0.5mg/mL グルタミン、10~200IU/mL ペニシリン、10~200IU/mL ストレプトマイシンを含む。
好ましい実施形態において、前記の当該卵胞顆粒膜細胞を培養する培養液は、60ng/mLのCNP又はその変異体又はその類似体、5μM HDAC阻害剤、10% FBS、0.1mg/mL グルタミン、100IU/mL ペニシリン、及び100IU/mL ストレプトマイシンを含むTCM199 培養液である。
一つの実施形態において、前記HDAC阻害剤は、HDAC1阻害剤、HDAC2阻害剤、及びHDAC3阻害剤から選ばれる。
さらに好ましくは、前記HDAC阻害剤は、HDAC3阻害剤であり、前記HDAC3阻害剤は、HDACi 4b、Entinostat(MS―275)、BG45、RG2833 (RGFP109)、RGFP966から選ばれる1種以上である。
他の実施形態において、前記CNPは、C型ナトリウム利尿ペプチドである。
更に他の実施形態において、前記培養液は、30~120ng/mL CNP又はその変異体又はその類似体、及び1~10μM HDAC阻害剤を含む。
好ましい実施形態において、前記培養液は、40~80ng/mL CNP又はその変異体又はその類似体、及び3~7μM HDAC阻害剤を含む。
更に他の実施形態において、前記培養液は、さらに、5~15% FBS、0.01~0.5mg/mL グルタミン、10~200IU/mL ペニシリン、10~200IU/mL ストレプトマイシンの1種以上を含む。
好ましい実施形態において、前記培養液は、さらに、5~10% FBS、0.05~0.2mg/mL グルタミン、50~150IU/mL ペニシリン、50~150IU/mL ストレプトマイシンの1種以上を含む。好ましくは、前記培養液は、さらに、10% FBS、0.1mg/mL グルタミン、100IU/mL ペニシリン、100IU/mL ストレプトマイシンの1種以上を含む。
一つの具体的な実施形態において、前記培養液は、60ng/mL CNP又はその変異体又はその類似体、5μM HDAC阻害剤、10% FBS、0.1mg/mL グルタミン、100IU/mL ペニシリン、及び100IU/mL ストレプトマイシンを含むTCM199 培養液である。
一つの実施形態において、未成熟卵母細胞の体外成熟培養に使用する場合には、前記組成物の培地中の濃度は、30~120ng/mL CNP又はその変異体又はその類似体、及び1~10μM HDAC阻害剤である。
好ましい実施形態において、前記培養方法は、具体的は、対象の卵胞内の顆粒膜細胞を採取し、フィーダー細胞として用いるように、前記体外成熟培養液により細胞の単層・接着培養を行い、その後、卵核胞期(GV期)にある卵母細胞を回収し、そのままフィーダー細胞含有成熟液に20h~25h培養する。
一つの実施形態において、前記対象は、ヒト、牛、豚、羊、及びげっ歯類動物などを含む。
他の実施形態において、成熟後の卵母細胞は、単為発生誘起、体外受精、又は卵細胞質内精子注入に用いられ、その後、胚培養を行い、さらに、胚移植を行い、生殖補助医療又は畜産生産に用いられることができる。
好ましい実施形態において、前記対象がヒトである場合には、前記方法は、具体的には、
1)ヒアルロニダーゼ消化後の顆粒膜細胞及び卵母細胞を分類し採取するステップと、
2)顆粒膜細胞を前記体外成熟培養液に入れ、接着培養を行うステップと、
3)消化後で4~6h体外培養してからまた卵核胞期にある卵母細胞を、ステップ2)で処理されたフィーダー細胞を含む成熟培養液に入れ、培養するステップと、を含む。
また、本発明は、さらに、CNP又はその変異体又はその類似体、及びHDAC阻害剤を含む組成物の、臨床的女性の過剰排卵後の未成熟卵母細胞の減数分裂の再開を促進し、潜在的な胚発生能力を向上させるための培地を製造することにおける応用を提供する。
ヒト患者にとっては、本発明は、臨床的には、初めて性腺刺激ホルモンで処理された後まだ成熟できない卵母細胞により成熟培養を行い、卵母細胞の成熟率及び後期の潜在的な胚発生能力を向上させる。過剰排卵後の卵母細胞資源を十分に活用するだけでなく、受精後の初期胚発生能力を向上させ、生殖補助患者の妊娠成功率を高める。動物(げっ歯類マウスを例として)未成熟卵母細胞の培養については、同様の効果もある。
本発明は、フィーダー細胞として顆粒膜細胞を用いて卵母細胞成熟を誘導する培養方法により、CNP又はその変異体又はその類似体、及びHDAC阻害剤を使用して卵巣中の卵胞由来の顆粒膜細胞を処理し、顆粒膜細胞の卵母細胞の発育促進因子の発現・分泌を促進することにより、卵母細胞の体外発生能力を向上させる。従って、その方法は、新規の卵母細胞成熟促進医薬を作製し、臨床的にヒト生殖補助医療に応用することができる。
本発明に係るCNPは、卵胞内活性ペプチド類物質であり、卵母細胞に対する毒性が低く、また、HDAC阻害剤は、生物体及び卵母細胞に対する毒性も非常に低いことが確認されている。
本明細書で用いられる様々な用語は、当業者に周知の意味を持つ。しかしながら、以下、参照を容易にするために、これらの用語のいくつかを定義する。
「培地」という用語とは、卵母細胞又は胚を、維持及び/又は増殖する液体環境を意味することを理解すべきである。
「単離された」という用語とは、卵母細胞をその自然環境から取り出し又は精製する(少なくとも一部)ことがあることを理解すべきである。卵母細胞が単離される例は、卵胞、卵丘・卵母細胞複合体(cumulus oocyte complex)の一部として対象から単離された卵母細胞又は裸化卵母細胞(denuded oocyte)である。
「変異体」という用語とは、1つ又は複数のアミノ酸が変化したアミノ酸配列を理解すべきである。変異体は、「保存的」な変化を持ってもよく、この変化は、置換したアミノ酸は、置換されたアミノ酸と類似する構造又は化学的性質を持つ(例えば、ロイシンをイソロイシンで置き換える)。変異体は、さらに、1つ又は複数のアミノ酸の「非保存的」な変化(例えば、グリシンをトリプトファンで置き換える)、あるいは、欠失及び/又は挿入を持ってもよい。
「対象」という用語とは、女性、雌性哺乳動物であり、霊長類、家畜(例えば、馬、牛、綿羊、豚、ヤギ)、ペット動物(例えば、犬、猫)、実験室試験動物(例えば、マウス、ラット、モルモット)又は獣医学的に意味のある動物を含むことを理解すべきである。
「生殖補助」という用語とは、移植可能な胚の発生の任意技術に関し、体外培養の卵母細胞又は胚を利用する技術(例えば、卵母細胞の体外成熟)、体外受精(IVF、卵母細胞を吸引し、実験室で受精して胚を被験体に移植)、配偶子卵管内移植(GIFT、卵母細胞と精子とを卵管内に移植)、接合子卵管内移植(ZIFT、受精卵を卵管内に移植)、卵管受精卵移植(tubal embryo transfer)(TET、卵管内に分割期胚を移植)、卵母細胞・精子腹腔内移植(POST、卵母細胞と精子を骨盤腔に移植)、卵細胞質内精子注入法(ICSI)、精巣内精子採取術(TESE)、顕微鏡下精巣上体精子吸引法(MESA)、核移植、多能性幹細胞増幅、及び単為生殖活性化(parthenogenic activation)などの当分野での公知の生殖補助方法を含むことを理解すべきである。
それに対応して、本発明者の実験方法は、卵母細胞の成熟を促進するとともに、その潜在的な胚発生能力を向上させる目的を達成するために、体外培養環境下、生体内でLHが顆粒膜細胞に作用して卵母細胞の成熟を促進する效果を模擬したところ、CNP存在下、短時間で卵母細胞の核成熟を抑制し、同時に顆粒膜細胞のフィーダー細胞層を含む培養液にHDAC3阻害剤を添加することにより、LHと類似する效果を奏し、即ち、顆粒膜細胞によるEGF様成長因子(例えば、AREG、EREGなど)の分泌を促進し、並びに卵母細胞の成熟を促進することが示された。
本発明に係る種々の組み合わせ製品中の培地、培養液、及び組成物を多用途又は単位形態で、アンプル、瓶またはバイアルのような適切な容器(通常は、無菌)中に独立に包装することができる。充填後でこれらの容器を密閉することができる。タンパク質の安定性及び/又は応用については、他の添加剤を含むことができる。各種成分を包装する方法は当該分野で公知である。
この点において、卵母細胞は、例えば、卵胞の一部、卵丘・卵母細胞複合体(COC)の一部、又は裸化卵母細胞であってもよい。
当該分野で、適合な女性ドナーに由来する卵母細胞を採取し、その卵母細胞を体外で受精させる方法は、知られている。例えば、「生殖補助教材:実験室及び臨床展望」、(2003)、 Gardner, D.K.、Weissman、A.、Howies, CM.、Shoham、 Z.編、Martin Dunits社、ロンドン、イギリス(Textbook of Assisted Reproduction: Laboratoryand Clinical Perspectives (2003) Editors Gardner, D.K., Weissman, A., Howies, CM" Shoham、 Z. Martin Dunits Ltd, London, UK)に記載のヒトの体外受精は知られている。例えば、Gordon, I.、(2003)、「ウシ胚の実験室調製」、第二版、CABI出版社、オックスフォードシャー、イギリス(Gordon, I.(2003) Laboratory Production of Cattle Embryos 2nd Edition CABI Publishing, Oxon, UK)に記載のウシの体外受精は知られている。
CNPの類似体は、構造(即ち、構造類似体)、調節機能(即ち、調節類似体)又は生物学的・化学的機能(即ち、機能類似体)がCNPと類似する分子であり、CNPの生物学的活性断片を含む。
上記HDAC阻害剤は、上記培地、培養液又は組成物中の濃度が1~10μMであり、具体的な実施形態では、上記HDAC阻害剤は、上記培地、培養液又は組成物中の濃度が1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10μMである。
FBS、HDACi 4b、CNP、グルタミン、ペニシリン、及びストレプトマイシンをTCM-199に溶解させ、10% FBS、5μM HDACi 4b、60ng/mL CNP、0.1mg/mL グルタミン、100IU/mL ペニシリン、及び100IU/mL ストレプトマイシンを含むTCM-199培養液を調製し、体外成熟培養液とした。
FBS、HDACi 4b、CNP、グルタミン、ペニシリン、及びストレプトマイシンをTCM-199に溶解させ、5% FBS、3μM HDACi 4b、80ng/mL CNP、0.05mg/mL グルタミン、100IU/mL ペニシリン、及び100IU/mL ストレプトマイシンを含むTCM-199培養液を調製し、体外成熟培養液とした。
FBS、HDACi 4b、CNP、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンをTCM-199に溶解させ、15% FBS、7μM HDACi 4b、40ng/mL CNP、0.2mg/mL グルタミン、100IU/mL ペニシリン、及び100IU/mL ストレプトマイシンを含むTCM-199培養液を調製し、体外成熟培養液とした。
HDACi 4bとCNPをTCM-199に溶解させ、5μM DACi 4b、60ng/mL CNPを含むTCM-199培養液を調製し、体外成熟培養液とした。
HDACi 4bとCNPをTCM-199に溶解させ、1μM HDACi 4b、100ng/mL CNPを含むTCM-199培養液を調製し、体外成熟培養液とした。
HDACi 4b及びCNPをTCM-199に溶解させ、10μM HDACi 4b、30ng/mL CNP的TCM-199培養液を調製し、体外成熟培養液とした。
病院の生殖補助治療センターから異なる患者の顆粒膜細胞及び卵母細胞を採取した。ドナー精液は、精子センターに由来した。
顆粒膜細胞の微小滴培養:患者の過剰排卵による卵丘・卵母細胞複合体からヒアルロニダーゼによる消化によって得られた顆粒膜細胞を遠心した後、それぞれ実施例1~6の体外成熟培養液に入れて微小滴の接着培養を行った。微小滴上にパラフィン油を覆った。顆粒膜細胞が培養器壁に付着した後、未成熟卵母細胞の体外成熟培地1~6として用いられることができる。
患者の過剰排卵後で得られた卵母細胞は、未成熟卵母細胞と同定されたものを、フィーダー細胞が含まれた体外成熟培地1(実施例1で調製された体外成熟培養液により得られた培地)に入れて微小滴培養を行った。各微小滴当たり1~2個の卵母細胞を移植し、培養時間は、20h~25hである。培養条件は、37℃、5% CO2及び6% O2を含む空气、湿度100%であり、未成熟卵母細胞の体外成熟培地1による微小滴培養後の発育效果は、図1を参照する。
成熟卵母細胞は、卵細胞質内精子注入(ICSI)を行い、未成熟卵母細胞は、体外で20h~25h培養した後、その成熟状況を観察した。第二減数分裂中期(MII期)に達した卵母細胞をマイクロマニピュレータにセットし、ICSIを行った。
G-2 PLUS(Vitrolife、Sweden)胚培養液を35mmの培養皿において複数の50μL 微小滴を作製した。液滴表面を鉱物油で覆った。その培養液は、8細胞期の後まで発育した胚を胚盤胞期まで培養するために適する。
本方法で得られたヒト未成熟卵母細胞の成熟率及び早期胚胎発育率と、対照群で一般的な方法との比較は、表1に示された。実験結果により、この実験においてHDACi 4b+CNPにより体外成熟培養処理を20h行い、ICSI後の卵割率及び胚盤胞率はいずれも対照群より有意に高いことが明らかになった(P<0.01)。
具体的な培養方法は、実施例8を参照し、相違点は、患者に由来する顆粒膜細胞をC57/BL6Jマウスの顆粒膜細胞で置き換え、患者に由来する卵母細胞を同マウスに由来する卵丘・卵母細胞複合体で置き換えることにあり、マウス卵母細胞の体外発育結果は、図2を参照する。
Claims (15)
- 卵胞顆粒膜細胞、及び当該卵胞顆粒膜細胞を培養する培養液を含む培地において、当該卵胞顆粒膜細胞を培養する培養液は、30~120ng/mL CNP、及び1~10μM HDAC3阻害剤を含む、培地。
- 前記培地は、当該卵胞顆粒膜細胞を培養する培養液により卵胞顆粒膜細胞を4~6h培養して得られる、請求項1に記載の培地。
- 前記HDAC3阻害剤は、HDACi 4b、Entinostat(MS-275)、BG45、RG2833(RGFP109)、RGFP966から選ばれる1種以上である請求項2に記載の培地。
- 当該卵胞顆粒膜細胞を培養する培養液は、40~80ng/mL CNP、及び3~7μM HDAC3阻害剤を含む請求項1に記載の培地。
- 当該卵胞顆粒膜細胞を培養する培養液は、さらに、5~15% FBS、0.01~0.5mg/m グルタミン、10~200IU/mL ペニシリン、10~200IU/mL ストレプトマイシンを含む請求項1に記載の培地。
- 未成熟卵母細胞の体外成熟培養液であって、30~120ng/mL CNP、及び1~10μM HDAC3阻害剤を含む、体外成熟培養液。
- 前記HDAC3阻害剤は、HDACi 4b、Entinostat(MS-275)、BG45、RG2833 (RGFP109)、RGFP966から選ばれる1種以上である請求項6に記載の体外成熟培養液。
- 前記培養液は、40~80ng/mL CNP、及び3~7μM HDAC阻害剤を含む請求項6に記載の体外成熟培養液。
- 前記培養液は、さらに、5~15% FBS、0.01~0.5mg/mL グルタミン、10~200IU/mL ペニシリン、10~200IU/mL ストレプトマイシンの1種以上を含む請求項6に記載の体外成熟培養液。
- 未成熟卵母細胞の体外成熟培養に使用する組成物であって、30~120ng/mL CNP、及び1~10μM HDAC3阻害剤からなり、培地に添加することにより未成熟卵母細胞の体外成熟培養に使用し、該培地がTCM-119である、組成物。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載の培地により対象から単離した未成熟卵母細胞を培養するステップを含む卵母細胞の体外成熟を促進する培養方法。
- 請求項11に記載の卵母細胞の体外成熟を促進する培養方法であって、対象の卵胞中の卵胞顆粒膜細胞を卵丘・卵母細胞複合体からインビトロで単離し、フィーダー細胞として用いるように、前記卵胞顆粒膜細胞を培養するための培地により前記卵胞顆粒膜細胞の微小滴培養を行い、単離した未成熟卵母細胞をフィーダー細胞を含む成熟液に20h~25h培養する、培養方法。
- 前記単離した未成熟卵母細胞は、ヒト、牛、豚、羊又はげっ歯類動物に由来する、請求項11に記載の卵母細胞の体外成熟を促進する培養方法。
- 未成熟卵母細胞の体外成熟を促進のために使用される、請求項6~9の何れかに記載の体外成熟培養液。
- インビトロにおける、成熟女性の過剰排卵後の未成熟卵母細胞の減数分裂の再開を促進し、潜在的な胚発生能力を向上させるために使用される、請求項10に記載の組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710920296.2A CN107475181B (zh) | 2017-09-30 | 2017-09-30 | 未成熟卵母细胞的体外成熟培养液及其应用 |
CN201710920296.2 | 2017-09-30 | ||
PCT/CN2017/106067 WO2019061560A1 (zh) | 2017-09-30 | 2017-10-13 | 未成熟卵母细胞的体外成熟培养液及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020534020A JP2020534020A (ja) | 2020-11-26 |
JP7138359B2 true JP7138359B2 (ja) | 2022-09-16 |
Family
ID=60605013
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020517106A Active JP7138359B2 (ja) | 2017-09-30 | 2017-10-13 | 未成熟卵母細胞の体外成熟培養液、及びその応用 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11767506B2 (ja) |
EP (1) | EP3690031A4 (ja) |
JP (1) | JP7138359B2 (ja) |
CN (1) | CN107475181B (ja) |
WO (1) | WO2019061560A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110547235A (zh) * | 2019-08-28 | 2019-12-10 | 浙江海洋大学 | 虎斑乌贼育苗饵料收集与室内暂养方法 |
CN110669123B (zh) * | 2019-09-03 | 2020-10-13 | 南京市妇幼保健院 | 一种分泌型内源性多肽pdff-co3及其应用 |
CN111518748A (zh) * | 2019-12-09 | 2020-08-11 | 赵义清 | 基于cnp的人未成熟卵母细胞双相体外成熟技术 |
CN110951738B (zh) * | 2019-12-23 | 2021-10-15 | 华南农业大学 | 猪hdac2基因的表达抑制剂及其应用 |
CN112695012B (zh) * | 2020-12-11 | 2022-05-06 | 中国农业大学 | Tubastatin A在制备原始卵泡体外激活剂中的应用 |
CN113174366B (zh) * | 2021-03-29 | 2023-04-11 | 广西壮族自治区畜牧研究所 | 含有丁苯羟酸的猪卵母细胞体外成熟体系及应用 |
CN113444683B (zh) * | 2021-07-12 | 2022-11-04 | 华南农业大学 | 提高卵母细胞体外成熟质量的添加剂、培养方法及应用 |
WO2023170667A1 (en) * | 2022-03-09 | 2023-09-14 | Foreve Labs Ltd. | Compositions comprising histone acetyltransferase inhibitors or reverse transcriptase inhibitors and use thereof |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102899286A (zh) | 2012-09-18 | 2013-01-30 | 中国农业大学 | C型钠肽在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用 |
CN103468639A (zh) | 2013-08-31 | 2013-12-25 | 内蒙古大学 | 组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理卵母细胞的方法及其应用 |
CN104342400A (zh) | 2014-06-24 | 2015-02-11 | 新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心 | 一种提高绵羊卵母细胞体外发育能力的方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100432219C (zh) | 2006-07-28 | 2008-11-12 | 浙江大学 | 一种含茶多酚的牛卵母细胞体外成熟培养液及其培养方法 |
CN101591637B (zh) | 2008-05-26 | 2011-11-09 | 李荣旗 | 新型牛卵母细胞体外成熟培养液 |
CN102140435A (zh) | 2010-11-22 | 2011-08-03 | 广西大学 | 一种提高水牛体外胚胎生产效率的方法 |
US10011818B2 (en) | 2012-09-18 | 2018-07-03 | China Agriculture University | Method for in vitro oocyte maturation |
BR112015006176B1 (pt) * | 2012-09-21 | 2023-04-18 | Intensity Therapeutics, Inc | Uso de um agente terapêutico e de um agente de intensificação de permeação intracelular |
CN107208057A (zh) * | 2014-12-19 | 2017-09-26 | Vrije布鲁塞尔大学 | 哺乳动物卵丘卵母细胞复合体的体外成熟 |
-
2017
- 2017-09-30 CN CN201710920296.2A patent/CN107475181B/zh active Active
- 2017-10-13 EP EP17926780.2A patent/EP3690031A4/en active Pending
- 2017-10-13 JP JP2020517106A patent/JP7138359B2/ja active Active
- 2017-10-13 US US16/650,168 patent/US11767506B2/en active Active
- 2017-10-13 WO PCT/CN2017/106067 patent/WO2019061560A1/zh active Application Filing
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102899286A (zh) | 2012-09-18 | 2013-01-30 | 中国农业大学 | C型钠肽在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用 |
CN103468639A (zh) | 2013-08-31 | 2013-12-25 | 内蒙古大学 | 组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理卵母细胞的方法及其应用 |
CN104342400A (zh) | 2014-06-24 | 2015-02-11 | 新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心 | 一种提高绵羊卵母细胞体外发育能力的方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Journal of Agricultural Biotechnology,2016年,Vol.24, No.9,pp.1450-1456 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US11767506B2 (en) | 2023-09-26 |
US20200224158A1 (en) | 2020-07-16 |
EP3690031A1 (en) | 2020-08-05 |
CN107475181B (zh) | 2021-03-02 |
JP2020534020A (ja) | 2020-11-26 |
CN107475181A (zh) | 2017-12-15 |
EP3690031A4 (en) | 2021-06-23 |
WO2019061560A1 (zh) | 2019-04-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7138359B2 (ja) | 未成熟卵母細胞の体外成熟培養液、及びその応用 | |
Abeydeera | In vitro production of embryos in swine | |
Luvoni et al. | Factors involved in vivo and in vitro maturation of canine oocytes | |
Li et al. | Influence of co-culture during maturation on the developmental potential of equine oocytes fertilized by intracytoplasmic sperm injection (ICSI) | |
Kharche et al. | Factors influencing in-vitro embryo production efficiency of caprine oocytes: A review | |
AU2017371402B2 (en) | Compositions and methods for maturation of oocytes in vitro | |
US6107543A (en) | Culture of totipotent embryonic inner cells mass cells and production of bovine animals | |
Mochizuki et al. | Effect of the number of granulosa cells added to culture medium for in vitro maturation, fertilization and development of bovine oocytes | |
Gasparrini et al. | Influence of the duration of in vitro maturation and gamete co-incubation on the efficiency of in vitro embryo development in Italian Mediterranean buffalo (Bubalus bubalis) | |
Singhal et al. | Effect of including growth factors and antioxidants in maturation medium used for in vitro culture of buffalo oocytes recovered in vivo | |
US20210017490A1 (en) | Medium supplement to increase the efficiency of oocyte maturation and embryo culture in vitro | |
JP2012526520A (ja) | 卵母細胞の回収および成熟のための方法 | |
KR20050084889A (ko) | 다능성 줄기 세포 배양용 조성물 및 이의 용도 | |
EP2603581B1 (en) | Cocultures of cumulus cells and embryos during in vitro fertilization procedures | |
Chandra et al. | Effect of growth factors (epidermal growth factor, platelet derived growth factor, and insulin-like growth factor-1) on buffalo (Bubalus bubalis) embryos produced in vitro | |
JP6436284B2 (ja) | 卵子活性化方法及びその用途 | |
EP2740790B1 (en) | Composition for embryo culture | |
Mermillod | In vitro production of ruminant embryos: results, limits and perspectives | |
US11208622B2 (en) | Processing and use of reproductive tract fluids to improve the in vitro production of mammalian embryos | |
CN112914784B (zh) | 牛胚胎分割的方法 | |
MOHSHINA et al. | EFFECTS OF DIFFERENT CO-CULTURE ON BOVINE IN VITRO EMBRYO PRODUCTION: AN OVERVIEW | |
Jain et al. | Headway in reproductive biotechniques for genetic improvement of buffaloes | |
Garcia-Garcia et al. | Assisted Reproductive Technologies | |
WO2023141683A1 (en) | Methods of embryo multiplication | |
Juanpanich et al. | Effects of gel-embedded embryos on developmental competence of separated bovine blastomeres |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200323 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210421 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210720 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210921 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211021 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220201 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220428 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220823 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220830 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7138359 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |