JPH06209676A - 低分子チオール化合物を用いた牛胚の培養法および輸送法 - Google Patents
低分子チオール化合物を用いた牛胚の培養法および輸送法Info
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- JPH06209676A JPH06209676A JP50A JP2323093A JPH06209676A JP H06209676 A JPH06209676 A JP H06209676A JP 50 A JP50 A JP 50A JP 2323093 A JP2323093 A JP 2323093A JP H06209676 A JPH06209676 A JP H06209676A
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- cultured
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- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
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- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
Abstract
(57)【要約】
【構成】 牛胚を培養するにあたり、低分子チオール化
合物を含む培地にて培養することを特徴とする牛胚の培
養法並びに牛胚を輸送するにあたり、低分子チオール化
合物を含む輸送用液を用いることを特徴とする牛胚の輸
送法。 【効果】 本発明によれば、牛胚の培養において、低分
子チオール化合物を培養液に添加することにより、従来
行われていた生体内培養法や培養細胞との共培養法を用
いることなく、胚を効率的に胚盤胞にまで発育させるこ
とが可能である。また、低分子チオール化合物を輸送用
培地に添加することにより、輸送後の胚をほぼ１００％
の生存性を維持した状態で移植に用いることが可能であ
る。この方法によれば、従来の胚の凍結輸送を行う際に
必要であった融解処理施設および生存性判定技術を用い
ることなく、輸送後直ちに移植が可能となる。
合物を含む培地にて培養することを特徴とする牛胚の培
養法並びに牛胚を輸送するにあたり、低分子チオール化
合物を含む輸送用液を用いることを特徴とする牛胚の輸
送法。 【効果】 本発明によれば、牛胚の培養において、低分
子チオール化合物を培養液に添加することにより、従来
行われていた生体内培養法や培養細胞との共培養法を用
いることなく、胚を効率的に胚盤胞にまで発育させるこ
とが可能である。また、低分子チオール化合物を輸送用
培地に添加することにより、輸送後の胚をほぼ１００％
の生存性を維持した状態で移植に用いることが可能であ
る。この方法によれば、従来の胚の凍結輸送を行う際に
必要であった融解処理施設および生存性判定技術を用い
ることなく、輸送後直ちに移植が可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、牛胚の移植を行う際の
胚の効果的な培養法および輸送法に関する。
胚の効果的な培養法および輸送法に関する。
【０００２】
【従来の技術】牛胚の培養法としては、体外受精後ない
し生体より採取後の胚を兎あるいは羊の卵管内に移植
し、数日間培養を行い、再び回収する方法や、卵管上皮
細胞，卵丘細胞の単層細胞との共培養をする方法があ
り、これらの手法を用いることによって、胚の発育を維
持させることが可能である。また、体外培養によって得
られた胚を移植の目的で遠隔地域に長距離輸送をする際
の手法としては、ごく一部でグリセロールやショ糖など
の耐凍剤を用いて凍結し、液体窒素と共に輸送すること
が試みられているにすぎない。
し生体より採取後の胚を兎あるいは羊の卵管内に移植
し、数日間培養を行い、再び回収する方法や、卵管上皮
細胞，卵丘細胞の単層細胞との共培養をする方法があ
り、これらの手法を用いることによって、胚の発育を維
持させることが可能である。また、体外培養によって得
られた胚を移植の目的で遠隔地域に長距離輸送をする際
の手法としては、ごく一部でグリセロールやショ糖など
の耐凍剤を用いて凍結し、液体窒素と共に輸送すること
が試みられているにすぎない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】牛胚は体外で培養した
場合、発生初期の段階で発育停止が起こることが知られ
ている。このような問題を解消するために、これまでは
胚を生体内で培養したり、他の培養細胞と共培養する方
法が行われている。しかし、生体内培養法は動物の開腹
手術を移植時と回収時の２回行うため、その労力および
胚の回収率の低下が問題になる。また、共培養を行う方
法は共培養細胞の調製および培養や維持に要する労力や
費用の他に増殖した共培養細胞の被覆により胚が変形す
る等の問題点がある。そこで、より簡易で効果的な牛胚
の培養法の開発が強く要望されている。
場合、発生初期の段階で発育停止が起こることが知られ
ている。このような問題を解消するために、これまでは
胚を生体内で培養したり、他の培養細胞と共培養する方
法が行われている。しかし、生体内培養法は動物の開腹
手術を移植時と回収時の２回行うため、その労力および
胚の回収率の低下が問題になる。また、共培養を行う方
法は共培養細胞の調製および培養や維持に要する労力や
費用の他に増殖した共培養細胞の被覆により胚が変形す
る等の問題点がある。そこで、より簡易で効果的な牛胚
の培養法の開発が強く要望されている。
【０００４】また、牛胚を輸送する際に、凍結した状態
で輸送する手法では、胚の凍結および融解の過程におけ
る胚の損失が大きく、さらに凍結胚を融解後、移植を行
うまでの処理設備および胚の生存性判定技術が必要であ
る。そこで、優良な胚を確実に輸送する簡易な手法の開
発が求められている。
で輸送する手法では、胚の凍結および融解の過程におけ
る胚の損失が大きく、さらに凍結胚を融解後、移植を行
うまでの処理設備および胚の生存性判定技術が必要であ
る。そこで、優良な胚を確実に輸送する簡易な手法の開
発が求められている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、牛胚の培養および
長距離輸送する際に、細胞内環境を還元状態に維持する
ことが有効であることを見出し、かかる目的には低分子
チオール化合物が適していることを知見して本発明を完
成するに至った。
を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、牛胚の培養および
長距離輸送する際に、細胞内環境を還元状態に維持する
ことが有効であることを見出し、かかる目的には低分子
チオール化合物が適していることを知見して本発明を完
成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明は牛胚を培養するにあた
り、低分子チオール化合物を含む培地にて培養すること
を特徴とする牛胚の培養法並びに牛胚を輸送するにあた
り、低分子チオール化合物を含む輸送用液を用いること
を特徴とする牛胚の輸送法を提供するものである。
り、低分子チオール化合物を含む培地にて培養すること
を特徴とする牛胚の培養法並びに牛胚を輸送するにあた
り、低分子チオール化合物を含む輸送用液を用いること
を特徴とする牛胚の輸送法を提供するものである。
【０００７】本発明において、低分子チオール化合物と
はチオール基を有する低分子化合物を意味し、具体的に
はβ−メルカプトエタノール（以下、β−ＭＥと略記す
ることがある。），β−メルカプトエチルアミン（以
下、システアミンと略記することがある。），グルタチ
オン（以下、ＧＳＨと略記することがある。），ジチオ
スレイトール（以下、ＤＴＴと略記することがあ
る。），α−チオグリセロールなどを挙げることができ
る。
はチオール基を有する低分子化合物を意味し、具体的に
はβ−メルカプトエタノール（以下、β−ＭＥと略記す
ることがある。），β−メルカプトエチルアミン（以
下、システアミンと略記することがある。），グルタチ
オン（以下、ＧＳＨと略記することがある。），ジチオ
スレイトール（以下、ＤＴＴと略記することがあ
る。），α−チオグリセロールなどを挙げることができ
る。
【０００８】牛胚（牛体外授精胚など）を培養して胚盤
胞にまで発育させるにあたり、上記低分子チオール化合
物を培地に添加するが、その添加量は１０〜１００μ
Ｍ、好ましくは１０〜５０μＭが適当である。ここで、
培養液として通常用いられるものは、ＴＣＭ（Tissue C
ulture Medium)−１９９液，ＣＭＲＬ１０６６液，ＤＭ
ＥＭ液，ＭＥＭ液，ＮＣＴＣ１０９液などの液に１０％
の濃度で牛胎児血清（ＦＣＳ）を添加した培地や子牛血
清（ＣＳ），ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），ポリビニ
ルアルコール（ＰＶＡ），ポリビニルピロリドン（ＰＶ
Ｐ）などを適宜添加した培地などである。
胞にまで発育させるにあたり、上記低分子チオール化合
物を培地に添加するが、その添加量は１０〜１００μ
Ｍ、好ましくは１０〜５０μＭが適当である。ここで、
培養液として通常用いられるものは、ＴＣＭ（Tissue C
ulture Medium)−１９９液，ＣＭＲＬ１０６６液，ＤＭ
ＥＭ液，ＭＥＭ液，ＮＣＴＣ１０９液などの液に１０％
の濃度で牛胎児血清（ＦＣＳ）を添加した培地や子牛血
清（ＣＳ），ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），ポリビニ
ルアルコール（ＰＶＡ），ポリビニルピロリドン（ＰＶ
Ｐ）などを適宜添加した培地などである。
【０００９】また、牛胚を輸送する場合は、通常の輸送
液に対し上記低分子チオール化合物を１０〜１５０μ
Ｍ、好ましくは１００〜１５０μＭの割合で添加するこ
とが適当である。ここで、輸送液として通常用いられる
ものは、修正ＴＣＭ−１９９液に２０％の濃度で子牛血
清（ＣＳ）を添加した輸送液や上記培地などである。
液に対し上記低分子チオール化合物を１０〜１５０μ
Ｍ、好ましくは１００〜１５０μＭの割合で添加するこ
とが適当である。ここで、輸送液として通常用いられる
ものは、修正ＴＣＭ−１９９液に２０％の濃度で子牛血
清（ＣＳ）を添加した輸送液や上記培地などである。
【００１０】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１ 屠場より採取した牛卵巣の直径２〜６ｍｍの卵胞から１
８Ｇの注射針を付けた５ｍｌシリンジを用いて卵胞卵を
吸引採取した後、ＴＣＭ−１９９液に１０％のＦＣＳ，
黄体形成ホルモン（ＬＨ），卵胞刺激ホルモン（ＦＳ
Ｈ）を添加した培地で２４時間成熟培養を行った。成熟
培養終了後に、カフェイン，ヘパリンを含むBrackett &
Oliphant （ＢＯ）液中で凍結融解精子を用いて１×１
０7 ／ｍｌの濃度で体外受精を行った。受精後、１０％
ＦＣＳを含むＴＣＭ−１９９液中で４０時間発生培養を
行うことにより得られた６〜８細胞期胚を卵丘細胞除去
後、培養試験に供した。
る。 実施例１ 屠場より採取した牛卵巣の直径２〜６ｍｍの卵胞から１
８Ｇの注射針を付けた５ｍｌシリンジを用いて卵胞卵を
吸引採取した後、ＴＣＭ−１９９液に１０％のＦＣＳ，
黄体形成ホルモン（ＬＨ），卵胞刺激ホルモン（ＦＳ
Ｈ）を添加した培地で２４時間成熟培養を行った。成熟
培養終了後に、カフェイン，ヘパリンを含むBrackett &
Oliphant （ＢＯ）液中で凍結融解精子を用いて１×１
０7 ／ｍｌの濃度で体外受精を行った。受精後、１０％
ＦＣＳを含むＴＣＭ−１９９液中で４０時間発生培養を
行うことにより得られた６〜８細胞期胚を卵丘細胞除去
後、培養試験に供した。
【００１１】一方、対照区として、一般的に用いられて
いる培養液であるＴＣＭ−１９９液に１０％の濃度でＦ
ＣＳを添加した区（ＴＣＭ−１９９＋ＦＣＳ）を設定
し、試験区としてβ−ＭＥまたはシステアミンを１０μ
Ｍおよび５０μＭの濃度で添加した区を設定し、共培養
のための単層細胞なしに培養を行った。培養７日目に観
察を行い、胚の発育ステージを調べた。結果を第１表に
示す。表から明らかなように、牛体外培養胚の発生にお
いて、β−ＭＥの１０μＭおよび５０μＭ添加区におけ
る胚盤胞形成率は２4.３％および３4.５％であり、シス
テアミンの場合は、１０μＭ添加区で１8.９％、５０μ
Ｍ添加区で２9.４％である。いずれも対照区に比べで有
意に高い発生率が得られた。
いる培養液であるＴＣＭ−１９９液に１０％の濃度でＦ
ＣＳを添加した区（ＴＣＭ−１９９＋ＦＣＳ）を設定
し、試験区としてβ−ＭＥまたはシステアミンを１０μ
Ｍおよび５０μＭの濃度で添加した区を設定し、共培養
のための単層細胞なしに培養を行った。培養７日目に観
察を行い、胚の発育ステージを調べた。結果を第１表に
示す。表から明らかなように、牛体外培養胚の発生にお
いて、β−ＭＥの１０μＭおよび５０μＭ添加区におけ
る胚盤胞形成率は２4.３％および３4.５％であり、シス
テアミンの場合は、１０μＭ添加区で１8.９％、５０μ
Ｍ添加区で２9.４％である。いずれも対照区に比べで有
意に高い発生率が得られた。
【００１２】
【表１】
【００１３】実施例２ この例では、実施例１で得た培養７日目に胚盤胞に発育
した胚（形態学的な観察により正常と判定されたもの）
を輸送試験に供した。まず、対照区として修正ＴＣＭ−
１９９液に２０％の濃度で子牛血清（ＣＳ）を添加した
輸送液を用い、試験区として２０％子牛血清添加修正Ｔ
ＣＭ−１９９液にβ−ＭＥを１０，５０，１００および
１５０μＭの各濃度で添加した輸送液を用いた。胚を0.
２５ｍｌの移植用ストローに封入し、生体温に近い３７
℃の保温輸送箱で長距離輸送（東京−札幌間）を行い、
輸送後の胚の生存率並びに移植可能胚を判定した。さら
に、移植可能と判定された胚を発情周期を合わせた受卵
牛に非外科的に移植し、受胎性を検討した。結果を第２
表に示す。
した胚（形態学的な観察により正常と判定されたもの）
を輸送試験に供した。まず、対照区として修正ＴＣＭ−
１９９液に２０％の濃度で子牛血清（ＣＳ）を添加した
輸送液を用い、試験区として２０％子牛血清添加修正Ｔ
ＣＭ−１９９液にβ−ＭＥを１０，５０，１００および
１５０μＭの各濃度で添加した輸送液を用いた。胚を0.
２５ｍｌの移植用ストローに封入し、生体温に近い３７
℃の保温輸送箱で長距離輸送（東京−札幌間）を行い、
輸送後の胚の生存率並びに移植可能胚を判定した。さら
に、移植可能と判定された胚を発情周期を合わせた受卵
牛に非外科的に移植し、受胎性を検討した。結果を第２
表に示す。
【００１４】表から明らかなように、輸送後の優良胚の
割合は、対照区で５3.６％であったのに対し、β−ＭＥ
添加区では８０％以上と有意に高く、特に１００および
１５０μＭ添加区では輸送胚のすべてが優良胚と判定さ
れ、高い生存率を示した。
割合は、対照区で５3.６％であったのに対し、β−ＭＥ
添加区では８０％以上と有意に高く、特に１００および
１５０μＭ添加区では輸送胚のすべてが優良胚と判定さ
れ、高い生存率を示した。
【００１５】
【表２】
【００１６】また、β−ＭＥを添加した輸送液を用いて
輸送した後、移植を行い、受胎率を調べた。結果を第３
表に示す。表から明らかなように、受胎が確認されたこ
とより、β−ＭＥの胚に対する悪影響は認められなかっ
た。
輸送した後、移植を行い、受胎率を調べた。結果を第３
表に示す。表から明らかなように、受胎が確認されたこ
とより、β−ＭＥの胚に対する悪影響は認められなかっ
た。
【００１７】
【表３】
【００１８】
【発明の効果】本発明によれば、牛胚の培養において、
低分子チオール化合物を培養液に添加することにより、
従来行われていた生体内培養法や培養細胞との共培養法
を用いることなく、胚を効率的に胚盤胞にまで発育させ
ることが可能である。また、低分子チオール化合物を輸
送用培地に添加することにより、輸送後の胚をほぼ１０
０％の生存性を維持した状態で移植に用いることが可能
である。この方法によれば、従来の胚の凍結輸送を行う
際に必要であった融解処理施設および生存性判定技術を
用いることなく、輸送後直ちに移植が可能となる。
低分子チオール化合物を培養液に添加することにより、
従来行われていた生体内培養法や培養細胞との共培養法
を用いることなく、胚を効率的に胚盤胞にまで発育させ
ることが可能である。また、低分子チオール化合物を輸
送用培地に添加することにより、輸送後の胚をほぼ１０
０％の生存性を維持した状態で移植に用いることが可能
である。この方法によれば、従来の胚の凍結輸送を行う
際に必要であった融解処理施設および生存性判定技術を
用いることなく、輸送後直ちに移植が可能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高橋 昌志 茨城県つくば市吾妻１−1481−１−401− 819 (72)発明者 假屋 堯由 北海道札幌市豊平区羊ヶ丘１ 北海道農業 試験場内 (72)発明者 角川 博哉 北海道札幌市豊平区羊ヶ丘１ 北海道農業 試験場内 (72)発明者 平子 ひとみ 北海道札幌市豊平区羊ヶ丘１ 北海道農業 試験場内 (72)発明者 桑山 正成 神奈川県横浜市港南区最戸１−14−20 (72)発明者 浜野 晴三 東京都新宿区大京町26
Claims (4)
- 【請求項１】 牛胚を培養するにあたり、低分子チオー
ル化合物を含む培地にて培養することを特徴とする牛胚
の培養法。 - 【請求項２】 低分子チオール化合物が、β−メルカプ
トエタノール，β−メルカプトエチルアミン，グルタチ
オン，ジチオスレイトールおよびα−チオグリセロール
のいずれかである請求項１記載の牛胚の培養法。 - 【請求項３】 牛胚を輸送するにあたり、低分子チオー
ル化合物を含む輸送用液を用いることを特徴とする牛胚
の輸送法。 - 【請求項４】 低分子チオール化合物が、β−メルカプ
トエタノール，β−メルカプトエチルアミン，グルタチ
オン，ジチオスレイトールおよびα−チオグリセロール
のいずれかである請求項３記載の牛胚の輸送法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5023230A JP2525713B2 (ja) | 1993-01-19 | 1993-01-19 | 低分子チオ―ル化合物を用いた牛胚の培養法および輸送法 |
| US08/018,546 US6238920B1 (en) | 1993-01-19 | 1993-02-17 | Culture and transportation of bovine embryos |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5023230A JP2525713B2 (ja) | 1993-01-19 | 1993-01-19 | 低分子チオ―ル化合物を用いた牛胚の培養法および輸送法 |
| US08/018,546 US6238920B1 (en) | 1993-01-19 | 1993-02-17 | Culture and transportation of bovine embryos |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06209676A true JPH06209676A (ja) | 1994-08-02 |
| JP2525713B2 JP2525713B2 (ja) | 1996-08-21 |
Family
ID=26360553
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5023230A Expired - Lifetime JP2525713B2 (ja) | 1993-01-19 | 1993-01-19 | 低分子チオ―ル化合物を用いた牛胚の培養法および輸送法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6238920B1 (ja) |
| JP (1) | JP2525713B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112690248A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-04-23 | 浙江九龙山国家级自然保护区管理中心 | 一种崇安髭蟾卵剥卵工具及其使用方法 |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69830598T2 (de) | 1997-01-31 | 2006-05-18 | The Horticulture And Food Research Institute Of New Zealand Limited | Optische vorrichtung und methode |
| US6149867A (en) | 1997-12-31 | 2000-11-21 | Xy, Inc. | Sheath fluids and collection systems for sex-specific cytometer sorting of sperm |
| CA2338194C (en) | 1998-07-30 | 2013-09-10 | Edward L. Squires | Equine system for non-surgical artificial insemination |
| US7208265B1 (en) | 1999-11-24 | 2007-04-24 | Xy, Inc. | Method of cryopreserving selected sperm cells |
| CA2408939C (en) | 2000-05-09 | 2011-11-08 | Xy, Inc. | High purity x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations of spermatozoa |
| CA2411462A1 (en) * | 2000-06-12 | 2001-12-20 | Colorado State University Research Foundation | Integrated herd management system utilizing isolated populations of x-chromosome bearing and y-chromosome bearing spermatozoa |
| AU2002220018A1 (en) | 2000-11-29 | 2002-06-11 | Colorado State University | System for in-vitro fertilization with spermatozoa separated into x-chromosome and y-chromosome bearing populations |
| US7713687B2 (en) | 2000-11-29 | 2010-05-11 | Xy, Inc. | System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations |
| US8486618B2 (en) | 2002-08-01 | 2013-07-16 | Xy, Llc | Heterogeneous inseminate system |
| MXPA05001100A (es) | 2002-08-01 | 2005-04-28 | Xy Inc | Sistema de separacion de baja presion para celulas de esperma. |
| WO2004017041A2 (en) | 2002-08-15 | 2004-02-26 | Xy, Inc. | High resolution flow cytometer |
| US7169548B2 (en) | 2002-09-13 | 2007-01-30 | Xy, Inc. | Sperm cell processing and preservation systems |
| DK2309245T3 (en) | 2003-03-28 | 2016-01-04 | Inguran Llc | Methods for providing sex-sorted animal semen |
| NZ544103A (en) | 2003-05-15 | 2010-10-29 | Xy Llc | Efficient haploid cell sorting for flow cytometer systems |
| EP2151243B1 (en) | 2004-03-29 | 2012-10-24 | Inguran, LLC | Sperm suspensions for sorting into X or Y chromosome-bearing enriched populations |
| CA2574499C (en) | 2004-07-22 | 2016-11-29 | Monsanto Technology Llc | Process for enriching a population of sperm cells |
| US7618770B2 (en) * | 2005-07-29 | 2009-11-17 | Xy, Inc. | Methods and apparatus for reducing protein content in sperm cell extenders |
| CN104982419B (zh) * | 2015-07-29 | 2017-01-11 | 广西壮族自治区水牛研究所 | 一种结合激光破膜的水牛胚胎冷冻方法 |
| BR112020010127A2 (pt) | 2017-11-21 | 2020-11-10 | Membrane Protective Technologies, Inc. | métodos e sistemas para abordagem contínua e sinergística para tratamento e preservação de células biológicas. |
-
1993
- 1993-01-19 JP JP5023230A patent/JP2525713B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-02-17 US US08/018,546 patent/US6238920B1/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112690248A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-04-23 | 浙江九龙山国家级自然保护区管理中心 | 一种崇安髭蟾卵剥卵工具及其使用方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6238920B1 (en) | 2001-05-29 |
| JP2525713B2 (ja) | 1996-08-21 |
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