ES2122951T3 - Cromatografia de heparina para eritropoyetinas. - Google Patents
Cromatografia de heparina para eritropoyetinas.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE DIRIGE A UN PROCESO SIMPLE Y EFICIENTE PARA LA RECUPERACION DE ERITROPOYETINAS A PARTIR DE FLUIDOS BIOLOGICOS Y MEDIOS DE CULTIVO UTILIZANDO CROMATOGRAFIA DE HEPARINA. LA PRESENTE INVENCION PUEDE USARSE PARA OBTENER CANTIDADES COMERCIALES Y PARA INVESTIGACION DE ERITROPOYETINA.
Description
Cromatografía de Heparina para
eritropeyetinas.
La presente invención se dirige a procedimientos
sencillos y eficaces para la recuperación de eritropoyetinas de
líquidos biológicos y de cultivo, utilizando Cromatografía de
Heparina. La presente invención puede utilizarse para obtener
cantidades de eritropoyetinas para la investigación y el
comercio.
La Heparina es un glicosaminoglicano altamente
sulfatado. Específicamente, la Heparina es un mucopolisacárido que
consiste en la repetición de un dímero de ácido
L-dipiranurónico 2-sulfato y
2-desoxi-2-sulfamino-D-glucopiranosa
6-sulfato, con un peso molecular en un intervalo de
5.000-30.000. La purificación que utiliza la
afinidad de la Heparina por diversas proteínas, se consigue
generalmente uniendo covalentemente la Heparina a una matriz de
soporte, por ejemplo, la Heparin Sepharose® CL-6B
consiste en heparina unida a la matriz de Sepharose®
CL-6B mediante el método de bromuro de
cianógeno.
La Cromatografía de Heparina se basa en dos modos
principales de interacción con proteínas: (1) como un ligando de
afinidad y (2) como un intercambiador de cationes con el elevado
contenido de grupos de sulfato aniónicos. Sin embargo, para
proteínas individuales, la naturaleza exacta de la interacción con
la Heparina se realiza frecuentemente mediante una combinación de
interacciones de afinidad y de intercambio iónico, y la naturaleza
exacta de tales interacciones no puede predecirse con exactitud.
La Cromatografía de Heparina se ha aplicado a la
purificación de una amplia variedad de proteínas (Affinity
Chromatography, Principles and Methods; Pharmacia Publication
18-1022029): Estas incluyen enzimas (proteasas de
células cebadas, lipoproteín-lipasa, enzimas de la
coagulación, superóxido dismutasa); inhibidores de proteasas de
serina (antitrombina III, nexinas de proteasa); factores de
crecimiento (factor de crecimiento de fibroblastos, factor de
crecimiento de células de Schwann, factor de crecimiento de células
endoteliales); proteínas de la matriz extracelular (fibronectina,
vitronectina, laminina, trombospondina, colágenos); proteínas de
unión a ácido nucleico (factores de iniciación, endonucleasas de
restricción, DNA ligasa, DNA y RNA polimerasas); receptores de
hormonas (receptores de estrógenos y andrógenos) y
lipoproteínas.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar una etapa cromatográfica adecuada en una estrategia
global de purificación de eritropoyetinas. Como tal, la
Cromatografía de Heparina puede utilizarse como una primera etapa, o
como una etapa subsiguiente en un procedimiento de etapas múltiples.
La Cromatografía de Heparina proporciona una etapa de purificación
adecuada para la eliminación selectiva de contaminantes no duplicada
por otros procedimientos de purificación descritos en la técnica y,
de esta forma, ofrece una importante etapa de purificación
alternativa en la preparación de eritopoyetinas homogéneas. Las
fuentes de eritropoyetina pueden ser diversas, incluyendo un
organismo (por ejemplo eritropoyetina urinaria humana), líquido de
cultivo celular después de la introducción de un gen de
eritropoyetina intacto en células de mamífero, o líquido de cultivo
celular después de la activación del gen de la eritropoyetina en
células humanas.
La Cromatografía de Heparina de la presente
invención es particularmente adecuada para ser incorporada en un
esquema global de purificación, dirigido a obtener preparaciones
homogéneas de eritropoyetina. Generalmente, para ser viable
comercialmente, dicho procedimiento consiste en una secuencia de
etapas que son fácilmente escalables con rendimientos que son
capaces de cumplir los requerimientos de producción farmacéuticos.
La etapa de Cromatografía de Heparina descrita aquí es capaz de
incorporarse en un esquema de purificación a gran escala, con alta
recuperación, para la purificación de eritropoyetinas. Un dato de la
presente invención es la capacidad de la Cromatografía de Heparina
para ser incorporada como una primera etapa cromatográfica adecuada
en una estrategia global de purificación de eritropoyetinas, o como
una etapa subsiguiente, para utilización en cualquier posición en un
procedimiento de etapas múltiples.
Muchas etapas cromatográficas no se adecuan bien
para utilizarse como una primera etapa cromatográfica. Una primera
etapa cromatográfica debe ser capaz de manejar la mayoría de
nutrientes y proteínas presentes inicialmente en un líquido
biológico o de cultivo. Una primera etapa cromatográfica adecuada
proporciona purificación razonable de la proteína, con elevada
recuperación de la proteína deseada y además tiene una capacidad
adecuada para la interacción con la carga de la masa de proteína y
sustituyentes del medio. Por ejemplo, la Cromatografía de Heparina
sirvió como una primera etapa de purificación adecuada
independientemente de las condiciones de cultivo, por ejemplo,
crecimiento en fermentadores o frascos de agitación, como células
dependientes de anclaje o independientes de anclaje, con o sin
proteínas séricas. Se ha encontrado que la presente etapa de
Cromatografía de Heparina cumple estos criterios como una primera
etapa adecuada en la purificación de eritropoyetinas.
La Cromatografía de Heparina también es adecuada
para incorporarse como una etapa subsiguiente para purificación
posterior de eritropoyetinas después del fraccionamiento inicial
mediante un número de etapas de purificación, incluyendo, pero no
limitándose a cromatografía de intercambio iónico, interacción
hidrófoba, exclusión por tamaño, o afinidad, mediante
fraccionamiento mediante precipitación por sal o alcohol, mediante
electroforesis preparativa en gel, o mediante enfoque isoeléctrico
preparativo. La incorporación de la Cromatografía de Heparina en un
esquema global de purificación puede también aumentar la efectividad
de las etapas posteriores de purificación, mediante la eliminación
selectiva de contaminantes que no se separan particularmente bien
mediante etapas de purificación posteriores.
La Cromatografía de Heparina ofrece una etapa de
purificación útil para obtener eritropoyetinas biológicamente
activas, de líquidos biológicos o de cultivo, con alta recuperación.
Además, la Cromatografía de Heparina puede llevarse a cabo con solo
disolventes acuosos, lo que representa una ventaja más como será
apreciado por los expertos en la técnica. La utilización de solo
disolventes acuosos tiene ventajas en cuanto a que la etapa de
purificación puede diseñarse de tal forma que la proteína no se
someta a desnaturalizantes, disolventes orgánicos, o ácidos, que
pueden ser perjudiciales para la recuperación de proteína
estructuralmente intacta y biológicamente activa. Además, la
Cromatografía de Heparina puede realizarse en condiciones muy
delicadas, por ejemplo a pH neutro, y/o a concentraciones bajas de
sal. Esta propiedad es particularmente valiosa ya que la
eritropoyetina es sensible a la agregación o la desialación a pH
bajo o alto y en condiciones de elevada concentración de sal (Endo,
Y., et al., J. of Biochem. 112, 700-706 (1992)). Así
esta técnica ofrece condiciones acuosas muy delicadas que sirven
para prevenir la pérdida de actividad biológica durante la
cromatografía de moléculas de eritropoyetina.
El objetivo de la presente invención se refiere a
una etapa cromatográfica en la purificación de eritropoyetinas, que
comprende: a) poner en contacto un líquido biológico que contiene
eritropoyetina con un soporte de afinidad de heparina, bajo
condiciones tales que dichas moléculas de eritropoyetina se unan a
dicho soporte de afinidad de heparina; b) eluir dichas moléculas de
eritropoyetina con una solución de tampón de elución; y c)
recolectar dicha eritropoyetina. La etapa cormatográfica mencionada
arriba puede utilizarse bien como una primera etapa cromatográfica
en la purificación de eritropoyetina, o para inclusión en cualquier
momento de un proceso de etapas múltiples. La etapa cromatográfica
es particularmente útil para eliminar proteínas contaminantes de las
eritropoyetinas, tales como proteínas séricas, particularmente, pero
no limitadas a las seleccionadas del grupo de suero de ternera,
suero bovino, suero bovino fetal, albúmina sérica, y transferrina.
Dentro del ámbito de la presente invención para la purificación de
eritropoyetinas, está incluido un método cromatográfico cuando el
líquido biológico que se pone en contacto es un líquido de
cultivo.
La presente invención también se refiere a una
etapa cromatográfica de heparina, para su inclusión en cualquier
momento de un proceso de etapas múltiples en la purificación de
eritropoyetinas, tales como, pero no limitadas a, un proceso de
etapas múltiples, que incluye adicionalmente una o más etapas
cromatográficas seleccionadas del grupo de intercambio iónico,
interacción hidrófoba, exclusión por tamaño, de fase inversa o
cromatografía de afinidad.
La invención además se refiere a una etapa
cromatográfica en la purificación de eritropoyetinas que puede
también comprender que el líquido biológico que se pone en contacto
se clarifica, tal como puede hacerse, pero no limitada a
centrifugación. Independientemente, los líquidos biológicos pueden
centrifugarse, filtrarse, ultrafiltrarse, dializarse, o una
combinación de estos procedimientos. Cuando un líquido biológico se
ultrafiltra, esto puede llevarse a cabo sobre, pero no se limita a,
una membrana de exclusión de punto de corte de
5.000-100.000 D o a una membrana de exclusión de
punto de corte de 10.000-30.000 D. Cuando un líquido
biológico se filtra puede obtenerse opcionalmente, pero no limitarse
a , una membrana de 45 micrones.
En la presente invención, la unión de dichas
moléculas de eritropoyetina puede, pero no se limita a, tener lugar
en una solución de tampón de equilibrio. Tales soluciones de tampón,
incluyen, pero no se limitan a, solución de tampón de ácido
4-(2-hidroxietil)-1-piperacinoetano-sulfónico
(MES), solución de tampón de
tris(hidroximetil)aminoetano (Tris) o de fosfato, o
cualquier otra solución de tampón que proporcione una solución de
tampón adecuada para la unión de eritropyetinas. Además, la unión de
dichas moléculas de eritropoyetina puede tener lugar, pero no se
limita a, un pH de alrededor de 4,9 a 8,0, y preferiblemente a un pH
de alrededor de 5,9 a 7,5, y más preferiblemente a un pH de 6,2 ó0
7.
Además, las etapas cromatográficas de la presente
invención comprenden eluir dichas eritropoyetinas variando la
solución de tampón de elución, opcionalmente, pero no limitándose a,
incrementar la concentración de sal en la solución de tampón, lavar
la columna con solución de tampón adicional, o variar el pH operante
de la solución de tampón de elución. La concentración de sal de la
solución de tampón de elución puede ajustarse mediante, pero no
limitado a, la adición de haluros alcalinos, tales como cloruro
sódico (NaCl). Una realización más de la presente invención incluye
opcionalmente añadir a cualquiera de las soluciones de tampón un
anti-adsorbente, tales como, pero no limitados a,
Tween.
Las etapas cromatográficas de la presente
invención incluyen además intercambiar la solución de tampón del
medio que contiene eritropoyetina, tal como, pero no limitado a, un
líquido biológico o la muestra recolectada. Tales procedimientos de
intercambio de solución de tampón incluyen, pero no se limitan a, la
utilización de sistemas de flujo tangencial, fibras huecas, filtros
espirales, sistemas de agitación de células, diálisis,
diafiltración, etapa de filtración, o mediante cromatografía
convencional. Cuando el intercambio de la solución de tampón se
realiza mediante una membrana de diálisis o de diafiltración, puede
utilizarse opcionalmente, pero no limitarse a,, membranas de peso
molecular de 5.000 a 10.000 o de 10.000 a 30.000. El intercambio de
solución de tampón puede realizarse a un pH y concentración de sal
de la solución de tampón elegidos, tales como, pero no limitados a,
aquellos pH entre pH de 6 y 8, 5,9 y 7,5 y 6,2 a 7, y contra una
solución de tampón con 0 a 200 mM de sal, o más preferiblemente a 0
a 10 mM de sal.
Otra realización de la presente invención
anticipa la utilización de un número de soportes de afinidad que
están disponibles comercialmente, tales como, pero no limitados a,
Heparin Sepharose CL-GB®, Heparin Sepharose 6 Fast
Flow®, hitrap Heparin®, Affigel Heparin®, Heparin Agarose®, Heparin
Sepharose®, Heparin Hyper D®, y Heparin Agarose 6XL®.
Las eritropoyetinas producidas por células de
mamíferos in vitro o in vivo, son glicoproteínas que tienen una
secuencia madura de aminoácidos de 165 aminoácidos y contienen tres
cadenas de oligosacáridos ligadas a N y una ligada a O. Las cadenas
de oligosacáridos ligadas a N ocurren en los residuos de asparagina
24, 38 y 83, mientras que la cadena de oligosacárido ligada a O
ocurre en el residuo 126 de serina. Lai et al., J. Biol. Chem. 261,
3116 (1986); Broudy et al. Arch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988).
La región de codificación de 165 aminoácidos y la secuencia líder
procesada de la eritropoyetina se conocen en parte, a partir del
aislamiento de clones genómicos y de cDNA del gen de la
eritropoyetina humana. Jacobs et al. Nature 313, 806 (1985), Lin,
F.K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 7580 (1985).
Un gran número de artículos científicos, patentes
y solicitudes de patentes tienen que ver con el aislamiento de la
eritropoyetina. Un breve resumen de las referencias relacionadas
indica que se han aplicado una amplia variedad de etapas
cromatográficas al aislamiento de eritropoyetinas. Las siguientes
referencias, indicadas más adelante, son un listado de fuentes y
procedimientos, pero no se ha hecho ningún intento para describir en
detalle la operación de cada etapa cromatográfica. Además, las
siguientes referencias solo pretenden indicar el estado actual de la
situación de forma global, y no deben considerarse como una lista
exhaustiva de todo lo que se conoce en la técnica.
La utilización de cromatografía de intercambio
tanto aniónica como catiónica para la purificación de
eritropoyetinas, se ha descrito en la literatura científica: (1)
(Mono Q®) Broudy, V.C. (1988) Arch. of Biochem. and Biophys. 265,
329-336; (2) (DEAE Sephacel®) Ghanem, A. B. et al.
(1994) Preparative Biochemistry 24, 127-142; Quelle,
F. W. et al. (1989) Blood, 74, 652-657; (3) (DEAE
Agarose®) Miyake, T. et al. (1977) J. Biol. Chem 252,
5558-5564; (4) (S-Sepharose®) Fibi,
M.R., et al (1991) Blood 77, 1203-1210; (5)
(Sulfoethyl Sephadex®) Goldwasser, E. and Kung, C.K.H. (1971) PNAS
68, 697-698; y (6) (Sulfopropoyl Sephadex®) Miyake,
T. et al. (1977) J. Biol. Chem. 252, 5558-5564.
La utilización particular de resinas de
intercambio aniónico débilmente básicas, tales como DEAE, como una
primera etapa cromatográfica, está bien descrita en la literatura de
patentes: (1) Documento US 4397840 (Solicitud Prioritaria
81JP-0034727); y (2) Documento JP 56016496A
(Solicitud Prioritaria 79JP-0092999). La utilización
de resinas de intercambio aniónico fuertemente básicas, para aislar
isoformas de eritropoyetina utilizando Q-Sepharose®
está descrita en la literatura de patentes: (1) Documentos EP
4282267A2, WO91058677 y EP 428267A (Prioridad
89US-0421444). La utilización de resinas de
intercambio iónico fuertes como un método general para separar las
proteínas deseadas de las impurezas, está publicada en la literatura
de patentes: Documentos EP 313343A, EP 391934A, y WO8903840A
(Solicitud Prioritaria 87US-0111886).
El Documento
GB-A-886712 describe métodos para la
preparación de concentrados de factor eritropoyetina, utilizando un
polímero insoluble que contiene grupos de intercambio iónico.
La cromatografía de afinidad utilizando tinciones
de Cibacron Blue se ha descrito en la literatura científica en la
purificación de eritropoyetinas: (1) (CM Affi-Gel
Blue®) Krystal, G. et al. (1984) Brit. J. of Hematology 58,
533-64; (2) (CM Affi-Gel Blue®)
Broudy, V. et al. (1988), Arch. of Biochem and Bioph, 265,
329-336; (3) (CM Affi-Gel Blue®)
Krystal, G. et al. (1986), Blood, 67, 71-79; (4) (CM
Affi-Gel Blue®) Yanagi, H., et al (1989), DNA, 8,
419-427; (5) (Blue Trisacryl M®) Fibi, M.R. et al
(1991) Blood, 77, 1203-1210.
La utilización de antraquinonas, como las
tinciones de Cibacron Blue, también se conoce en la literatura de
patentes: (1) Documento JP 59065021A (Solicitud Prioritaria
82JP-0174678); (2) (grupos carboximetilos ligados y
Cibacron Blue F3GA® como CM Affi-Gel Blue®),
Documento JP01165393A (Solicitud Prioritaria
87JP-0324910).
La utilización de la cromatografía de exclusión
por tamaño para la purificación de eritropoyetinas se ha descrito en
la literatura científica y en la de patentes: (1) (TSK G3000SW®)
Yanagi, H. et al. (1989) DNA 8, 419-427; (2) Fibi,
M.R., et al. (1991) Blood 77, 1203-1210; (3)
(Sephadex G-100®) Goto, m. et al. (1988)
Biotechnology 6, 67-70; Yanagawa, S. et al. (1984)
J. Biol. Chem. 259, 2707-2701; Miyake T. et al
(1977) J. Biol. Chem. 252, 5558-5564; (4) Documento
JP 01165393A (Solicitud Prioritaria
87JP-0324910).
La utilización de la hidroxiapatita para
purificar eritropoyetinas se ha descrito en la literatura científica
y en la de patentes: Krystal, G. et al (1986) Blood 67,
71-79; Yanagi, H. et al. (1989) DNA 8,
419-427; (BioRad HPHT®) Goto, M. et al. (1988)
Biotechnology 6, 67-70; (gel de fosfato cálcico)
Goldwasser, E. y Kung, C.K.H. (1971) PNAS 68,
697-698; (BioRad BioGel HT®) Miyake, T. et al.
(1977) J. Biol. Chem. 252, 5558-5564; Documento JP
01165393A (Solicitud Prioritaria 87JP-0324910). La
separación de las impurezas de proteínas que contienen metioninas
iniciadoras (Met-proteínas) utilizando
hidroxiapatita, especialmente en un modo HPLC, o en una combinación
de etapas, está reflejada en los documentos US 4798886, WO8602068A,
EP176299A y EP 239311A (Solicitudes Prioritarias
84WO-JP00460, 86JP-0066399 y
87JP-0066940); Documentos US 5256769 y EP
176299B.
La utilización general de anticuerpos
inmovilizados para cromatografía de inmunoafinidad de
eritropoyetinas, se conoce en la literatura científica: Miyazaki, H.
et al. (1988) J. of Immunological Methods, 113,
261-267; Goto, M. et al. (1988) Biotechnology 6,
67-70; Yanagawa, S. et al., (1984) Preparative
Biochemistry 24, 127-142; Ghanem, A. B. et al.
(1994) Preparative Biochemistry 24, 127-142;
Wojchowski, D.M. et al. (1987) Biochim. Biophys. Acta 913,
\hbox{170-177}.
La utilización general de anticuerpos
inmovilizados para cromatografía de inmunoafinidad es también
conocida en la literatura de patentes: Documento EP 249932A
(Solicitud Prioritaria 86JP-0139142), y más
específicamente para la eritropoyetina en los Documentos US 4558006,
US 5106760 y EP 116446B1 (Solicitud Prioritaria
83US-0463724); Documento JP 56108798A (Solicitud
Prioritaria 80JP-0011685); Documentos JP 4117400A,
JP 59116297A y JP 94089040B2 (Solicitud Prioritaria
82JP-0231539), JP 940866480B2, JP 04117400 A, US
4465624 (Solicitud Prioritaria 83JP-0026399), US
4831118 (Solicitud Prioritaria 87US-0083670), US
4568488 (Solicitud Prioritaria 84US-0570075), y US
4558005.
La utilización de cromatografía líquida de alta
presión de fase inversa (RP-HPLC) como etapa en la
purificación global de eritropoyetinas, se conoce tanto en la
literatura científica como en la de patentes: (1)
(DEAE-C4 RP-HPLC - Con A Agarose)
Quelle, F. W. et al. (1989) Blood, 74, 652-657; (2)
(Blue Trisacryl M® - S-Sepharose® - C8
RP-HPLC - Exclusión por tamaño) Fibi, M.R., et al.
(1991) Blood, 77, 1203-1210; (3)
(RP-HPLC - molecular sieve chromatography),
Documento JP 62036400A (Solicitud Prioritaria
85JP-0177337).
La RP-HPLC también se ha descrito
como una etapa cromatográfica final en la literatura científica y en
la de patentes: Jacobs, K. et al. (1989), Nature 313,
806-810; (cromatografía de intercambio catiónico -
RP-HPLC) Broudy, V. et al. (1988), Arch of Biochem
and Bioph 265, 329-336; Krystal, G. et al. (1986),
Blood, (DEAE-Agarose® -
Sulphopropyl-Sephadex® - filtración en gel -
hidroxiapatita - RP-HPLC), Documentos EP 209539B1 y
US 5322837 (Solicitud Prioritaria 85US-0690853);
Patente de EE. UU. 4.677.016, Documentos EP 228452A, WO 8607594A
(Solicitud Prioritaria 86US-0872152).
Se conocen un número de etapas adicionales para
la purificación de eritropoyetinas en la literatura científica y en
la de patentes: (1) (cromatografía de afinidad de lectina) Krystal
G. et al. (1986) Blood 67, 71-79 (Wheat Germ);
Quelle, F.W. et al. (1989) Blood 74, 652-657;
Documento EP 358463A (Solicitud Prioritaria
88ZA-0006645) (2) (Chromatofocusing) Krystal, G. et
al. (1986) Blood, 67, 71-79. PBE94;
(SDS-PAGE preparativa) Krystal, G. et al (1986)
Blood, 67, 71-79; y (4) (Albúmina
metilada-Kieseeguhr); Goldwasser, E. y Kung, C.K.H.
(1971) PNAS 68, 697-698; (5) (absorción al soporte
de poliestireno poroso, chitosan o tierra diatomácea), Documento US
4303650 que tiene como solicitud prioritaria la
79JP-01306677; (6) (Cromatografía de interacción
hidrófoba) Lee Haung et al. (1980), Blood, 56,
620-624; Wojchowski et al. (1987) Biochim. et
Biophys. 913, 170-178.
Entre las extensas técnicas referidas en la
literatura científica y en la de patentes para la purificación de
eritropoyetinas, ninguna de las mencionadas anteriormente emplean la
Cromatografía de Heparina. La presente invención ofrece así una
nueva y ventajosa etapa de purificación en la purificación de
eritropoyetinas.
La Figura 1 es un cromatograma que muestra el
fraccionamiento en Heparin-Sepharose®
CL-6B de sobrenadante de cultivo de una línea
celular que expresa GA-EPO. Las células se propagan
como un cultivo dependiente de anclaje en un Cell Cube (Costar) en
medio que contiene 4% de suero bovino fetal. El sobrenadante de
cultivo ultrafiltrado, diafiltrado descrito en el Ejemplo 1, se
separa sobre Heparin-Sepharose®
CL-6B a pH 6,2, y el contenido de
GA-EPO de las fracciones se determina mediante ELISA
(_1_). La línea ___ representa la absorbancia a 280 nm. La línea -
- - representa el gradiente de ClNa.
La Figura 2 es un cromatograma que muestra el
fraccionamiento con Heparin-Sepharose®
CL-6B de GA- EPO derivada de sobrenadantes de
cultivo de una línea celular que expresa GA-EPO. Las
células se propagan con un cultivo dependiente de anclaje en un
CellCube (Costar) en medio que contiene suero bovino fetal al 2%. El
sobrenadante de cultivo ultrafiltrado, diafiltrado del Ejemplo 2, se
separa sobre Heparin-Sepharose®
CL-6B a pH de 6,2, y el contenido en
GA-EPO de las fracciones se determina mediante ELISA
(_1_). La línea (____) representa la absorbancia a 280 nm. La línea
(- - -) representa el gradiente de ClNa.
La Figura 3 es un cromatograma que muestra el
fraccionamiento con Heparin-Sepharose®
CL-6B de GA-EPO derivada de
sobrenadante de cultivo de una línea celular que expresa
GA-EPO. Las células se propagan en suspensión en
frascos en agitación en
\vskip1.000000\baselineskip
medio libre de suero. El sobrenadante de cultivo
ultrafiltrado, diafiltrado del Ejemplo 3, se separa sobre
Heparin-Sepharose® CL-6B a pH de
6,2, y el contenido en GA-EPO de las fracciones se
determina mediante ELISA (_1_). La línea (____) representa la
absorbancia a 280 nm. La línea (- - -) representa el gradiente de
ClNa.
La Figura 4 es un cromatograma que muestra el
fraccionamiento sobre Heparin-Sepharose® 6 Fast
Flow, de GA-EPO derivada de sobrenadante de cultivo
de una línea celular que expresa GA-EPO. Las células
se propagan como un cultivo dependiente de anclaje en un Cell Cube
(Costar), en medio que contiene suero bovino fetal al 4%. El
sobrenadante de cultivo ultrafiltrado, diafiltrado del Ejemplo 4, se
separa sobre Heparin-Sepharose® 6 Fast Flow a pH de
7,0, y el contenido en GA-EPO de las fracciones se
determina mediante ELISA (_1_). La línea (____) representa la
absorbancia a 280 nm. La línea (- - -) representa el gradiente de
ClNa.
La Figura 5 es un cromatograma que muestra el
fraccionamiento sobre HiTrap Heparin® (Pharmacia), de
GA-EPO derivada de sobrenadante de cultivo de una
línea celular que expresa GA-EPO. Las células se
propagan en botellas girantes en medio que contiene suero de ternera
fetal al 2%. El fraccionamiento inicial mediante cromatografía de
intercambio iónico utilizando Pharmacia Streamline® DEAE, se
continua con cromatografía de interacción hidrófoba sobre Phenyl
Sepharose® Fast Flow (Pharmacia), y cromatografía de intercambio
iónico sobre Q-Sepharose® Fast Flow (Pharmacia). El
material parcialmente purificado eluido de la resina
Q-Sepharose® se dializa y se separa sobre HiTrap
Heparin® a pH de 6,2, y el contenido en GA-EPO de
las fracciones se determina mediante ELISA (_1_). La línea (____)
representa la absorbancia a 280 nm. La línea (- - -) representa el
gradiente de ClNa.
La Figura 6 es un cromatograma que muestra el
fraccionamiento sobre HiTrap Heparin® (Pharmacia), de
GA-EPO derivada de sobrenadante de cultivo de una
línea celular que expresa GA-EPO. Las células se
propagan en botellas girantes en medio que contiene suero de ternera
fetal al 2%. El fraccionamiento inicial se realiza mediante
cromatografía de interacción hidrófoba sobre Phenyl Sepharose® 6
Fast Flow (Pharmacia), y cromatografía de intercambio iónico sobre
Q-Sepharose® Fast Flow (Pharmacia). El material
parcialmente purificado eluido de esta resina se dializa y se separa
sobre HiTrap Heparin® a pH de 5,2, y el contenido en
GA-EPO de las fracciones se determina mediante ELISA
(_1_). La línea (____) representa la absorbancia a 280 nm. La línea
(- - -) representa el gradiente de ClNa.
La Figura 7 es un cromatograma que muestra el
fraccionamiento sobre HiTrap Heparin® (Pharmacia) de eritropoyetina
derivada de células de Ovario de Hamster Chino (CHO) (R&D
Systems), insertadas en medio diafiltrado, no condicionado, que
contiene suero de ternera fetal al 2%. El medio diafiltrado se
separa sobre HiTrap Heparin® a pH de 7,0, y el contenido en
GA-EPO de las fracciones se determina mediante ELISA
(-_-). La línea sólida (____) representa la absorbancia a 280 nm. La
línea quebrada (- - -) representa el gradiente de ClNa.
Tabla
1
La Tabla 1 recopila algunos de los datos
obtenidos utilizando Cromatografía de Heparina como una etapa
cromatográfica primera o subsiguiente. Los ejemplos que se exponen
más adelante muestran una amplia variedad de condiciones de cultivo,
incluyendo células dependientes de anclaje e independientes de
anclaje, y con o sin suero bovino fetal o suero de ternera fetal, a
varias concentraciones en el medio. De forma similar, los ejemplos
demuestran una amplia variedad de condiciones cromatográficas.
Secuencialmente en la tabla están el nº de Ejemplo (columna 1), las
Condiciones de Cultivo (columna 2), las Condiciones de Purificación
(columna 3), las Unidades/mg en el ELISA (actividad específica
expresada como EU/mg; columna 4), Tasa de Purificación (columna 5),
y porcentaje (%) de recuperación (columna 6).
La eritropoyetina regula el crecimiento y la
maduración final de las células eritroides progenitoras para madurar
hasta convertirse en hematíes. La eritropoyetina se produce en el
ser humano adulto en el riñón, las células eritroblastoides, y en
las células fetales hepáticas. Los pacientes con función renal
alterada tienen una disminución en la producción de eritropoyetina,
lo que da lugar a anemia grave. La utilización de eritropoyetina
purificada natural y recombinante ha sido un tratamiento eficaz para
pacientes con anemia crónica (Canaud, B. (1990), Am. J. Kidney Dis.
15, 169-175; Faulds, D. et al. (1989), Drugs 38,
863.899; Winearles, C. G. et al. (1986) Lancet
1175-1178).
La eritropoyetina se compone actualmente de un
vasto número de especies químicamente distintas, debido a una
compleja formación de modificaciones
post-traducionales, particularmente la
glicosilación. Las eritropoyetinas descritas aquí tienen los dos
siguientes hechos en común: (1) tienen una secuencia de aminoácidos
que se asemeja suficientemente a la codificada por el gen de la
eritropoyetina humana; y (2) poseen in vivo propiedades biológicas
que ocasionan un aumento de la producción de reticulocitos y
hematíes.
Como se ha mencionado previamente, tanto la
eritropoyetina urinaria humana como la recombinante producida por
células de mamífero, son glicoproteínas que tienen una secuencia de
aminoácidos madura de 165 aminoácidos, y contiene tres cadenas de
oligosacáridos ligadas a N y una ligada a O. Las cadenas de
oligosacáridos ligadas a N ocurren en los residuos de asparagina 24,
38 y 83, mientras que la cadena de oligosacáridos ligada a O ocurre
en el residuo de serina 126. Lai et al. J. Biol. Chem. 261, 3116
(1986); Broudy et al. Arch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988).
La eritropoyetina (EPO) tiene un peso molecular
aparente que varía dependiendo de las condiciones de electroforesis
en gel (véase por ejemplo Broudy, V., et al., Arch of Biochem
Biophys. 265, 329-336 (1998); Krystal, G., et al.
Blood 67 (1), 71-79 (1986); Yanagi, H., et al., DNA
8 (6), 419-427 (1989). El peso molecular real es
variable y cubre un intervalo de tamaños, debido a la diversidad de
estructuras de carbohidratos ligadas a la porción proteica de la
molécula. Esta diversidad depende en parte del tipo de células que
producen la proteína in vivo o in vitro.
Las eritropoyetinas purificadas de la presente
invención pueden ser una cualquiera de las eritropoyetinas conocidas
de interés biológico y/o farmacéutico. Como aquí se utiliza, el
término "eritropoyetina" o la expresión "producto de
eritropoyetina" se entiende que incluyen (1) eritropoyetina
aislada de una fuente in vivo, por ejemplo orina humana, como
describió Miyake, T., et al. (1977) J. of Biol. Chem. 252 (15)
5558-5564, (2) la producida a partir de la
activación del gen de eritropoyetina en células derivadas de seres
humanos, tales como la descrita en el Documento WO 94/12650 (también
indicada como GA-EPO), (3) la producida a partir de
la introducción de un gen de eritropoyetina en una célula hospedante
humana, por ejemplo como la descrita por Yanagi, H., et al. (1989)
DNA 8 (6), 419-427, y (4) la producida a partir de
la introducción de un gen de eritropoyetina en una célula hospedante
no humana, tal como la descrita en la Patente de EE. UU.
4.703.008.
Las "células productoras" pueden ser células
de origen eucariótico, preferiblemente de origen vertebrado, y más
preferiblemente de origen de mamífero, y más preferiblemente de
origen humano. Las células productoras son capaces, después de
cultivo en un medio adecuado, de producir la eritropoyetina deseada
en una cantidad recuperable. Ejemplos representativos de estas
células incluyen fibroblastos, quertinocitos, células epiteliales
(por ejemplo, células epiteliales de mamífero, células epiteliales
intestinales), células endoteliales, células gliales, células
neurales, células sanguíneas (por ejemplo linfocitos, células de
médula ósea), células musculares, y precursores de estos tipos de
células somáticas. Como se ha mencionado, estas células son más
preferiblemente de origen mamífero (por ejemplo de ratón, rata,
conejo, gato, perro, cerdo, vaca, pájaro, oveja, cabra, caballo,
mono, ser humano), y más preferiblemente son de origen de primate o
humano. Las células productoras también abarcan células
transfectadas primarias, secundarias e inmortalizadas de origen
vertebrado, particularmente de origen mamífero, y más
preferiblemente de origen de primate o humano, transfectadas con
material genético exógeno que directamente o indirectamente hace que
las células produzcan cantidades recuperables de eritropoyetina.
El proceso de Cromatografía de Heparina de la
presente invención se dirige al aislamiento de la eritropoyetina a
partir de "líquidos biológicos". Como aquí se utiliza, la
expresión "líquidos biológicos" incorpora las eritropoyetinas
aisladas del interior de una célula, tal como del citoplasma o de
los cuerpos de inclusión o de las vacuolas, o aislada del medio, tal
como cuando las células secretan la eritropoyetina. Las moléculas
secretadas pueden encontrarse y después aisladas de un líquido
biológico, tal como sangre,
leche, ascitis u orina, o un líquido de cultivo celular.
leche, ascitis u orina, o un líquido de cultivo celular.
En los casos en los que se cultivan células, la
eritropoyetina se secreta al "líquido de cultivo". El proceso
de Cromatografía de Heparina para el aislamiento de eritropoyetina
es particularmente adecuado para la recuperación de la
eritropoyetina contenida en un líquido de cultivo de una célula
productora de eritropoyetina. Como aquí se utiliza, la expresión
líquido de cultivo preferiblemente se refiere a cualquier líquido
utilizado o derivado de células cultivadas capaces de producir
eritropoyetina.
Preferiblemente, el líquido biológico o de
cultivo utilizado para la purificación de la eritropoyetina, ha sido
separado de la células y de los restos celulares mediante
filtración, ultrafiltración, centrifugación, o mediante otras
técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Además, la
expresión "líquido clarificado", se utiliza para indicar un
líquido biológico o de cultivo que se ha separado de las células,
restos celulares, o materias particuladas mediante centrifugación,
filtración, ultrafiltración o técnicas similares conocidas en la
técnica. Como las moléculas de eritropoyetina son más frecuentemente
purificadas a partir de un "líquido clarificado", es ventajoso
separar las células y los restos particulados del medio, sea un
líquido biológico o de cultivo. Este proceso puede hacerse a lo
largo de un número de etapas, incluyendo centrifugación y
filtración, incluyendo ultrafiltración (Uf), como es bien conocido
en la técnica. La expresión "líquido clarificado" puede también
incluir líquidos que contienen eritropoyetina, que han sido
sometidos a una etapa previa cromatográfica o de purificación, en la
que la célula y los restos celulares, así como otros contaminantes
de las células y de los medios se han eliminado de la muestra.
Frecuentemente se desea "intercambiar la
solución de tampón" al medio que contiene la eritropoyetina, con
una solución de tampón de laboratorio conocida. Dicha etapa puede
realizarse independientemente o como una etapa separada, o en
conjunción con otras etapas. El "intercambio de la solución de
tampón" puede realizarse mediante un número de procedimientos
bien conocidos para los expertos en la técnica, incluyendo, pero no
limitándose a, sistemas de flujo tangencial, fibras huecas, filtros
espirales, o un sistema de agitación de células, o mediante
cromatografía convencional, como se conoce en la técnica. Un proceso
más preferido como aquí se utiliza es la diafiltración (Df). En
tales casos, preferiblemente, la membrana es una membrana de
polisulfona o una membrana de celulosa regenerada de los tipos
comercialmente disponibles, por ejemplo de Millipore o Amicon Inc.
También son preferidas para utilizar en una etapa de filtración,
aquellas membranas que tienen un punto de corte de alrededor de
5.000 a 100.000 de peso molecular, y más preferiblemente un punto de
corte de alrededor de 10.000 30.000 de peso molecular. La parte
retenida se somete después opcionalmente a diálisis y/o
diafiltración, según los procedimientos conocidos en la técnica,
preferiblemente en la misma solución de tampón, que tiene un pH
entre 6 y 8. La sal está presente preferiblemente entre 0 y 200 mM,
y todavía más preferiblemente, la sal está entre 0 y 10 mM. El pH es
preferiblemente de 4,9 a 8,0, más preferiblemente de 5,9 a 7,5, y
más preferiblemente alrededor de un pH de 6,2 a 7,0.
Generalmente, las principales proteínas
contaminantes en los líquidos de cultivo de células de mamífero se
derivan de las proteínas de suero añadido al medio. Esto es en parte
debido a la dependencia de muchos tipos celulares a la presencia de
una cantidad significativa de suero. Los medios de cultivo
comerciales se adquieren frecuentemente con, o se les tiene que
añadir, suero de ternera, suero bovino, suero bovino fetal, o
albúmina sérica u otras proteínas séricas purificadas o parcialmente
purificadas, tales como transferrina o sus combinaciones, a partir
de los cuales debe purificarse la proteína deseada. Así, es
frecuentemente deseable que la primera etapa del proceso de
purificación se dirija a eliminar los componentes séricos.
El proceso de Cromatografía de Heparina no se
limita a la primera etapa del proceso de purificación. Es adecuada
para incluir en un proceso de purificación en cualquier punto en un
proceso de etapas múltiples. La preparación de eritropoyetinas
parcialmente purificadas mediante cualquier procedimiento de
fraccionamiento, o procedimiento cromatográfico, incluyendo, pero no
limitándose a, intercambio iónico, interacción hidrofóbica,
exclusión por tamaño, fase inversa o afinidad, puede realizarse
antes de la Cromatografía de Heparina.
La expresión "soporte de afinidad de
heparina" se refiere a cualquier soporte cromatográfico conocido,
portador de moléculas de heparina, en el que la heparina está ligada
establemente a un soporte de resina y que se utiliza para la
Cromatografía de Heparina. Los soportes de afinidad de heparina
están disponibles de un número de proveedores comerciales. Los
soportes de afinidad de heparina disponibles comercialmente
incluyen, pero no se limitan a, Heparin Sepharose®
CL-6B, Heparin Sepharose® 6 Fast Flow, HiTrap
Heparin® (Pharmacia), Affigel Heparin® (BioRad), Heparin Agarose®,
Heparin Sepharose® Tipo I y Tipo II, Tipo IIS, Tipo IIS (Sigma);
AF-Heparin Toyopearl 650®,
Heparin-650M® (TosoHaas); Cellufine Heparin®
(Amicon); Heparin Hyper D® (Biosepra); Heparin Agarose 6xL® (tipos
I, II, y III) (American International Chemical). Una matriz sólida
preferible es una basada en agarosa, más preferiblemente Sepharose®
o derivados de Sepharose® en forma de bolas. Pueden también
utilizarse otras matrices sólidas tales como celulosas o
poliacrilamidas.
La Cromatografía de Heparina puede llevarse a
cabo en lotes o mediante elución en columna. Preferiblemente el
soporte de heparina está en un sistema cromatógrafico de columna.
Cuando se utiliza en sistemas de cromatografía en columna, el
soporte de afinidad de heparina se utiliza preferiblemente entre 0ºC
y 30ºC, más preferiblemente entre 4ºC y 25ºC, más preferiblemente a
alrededor de 4ºC. Preferiblemente la resina de Heparina generalmente
se equilibra, se prepara y se mantiene según las especificaciones
del fabricante (por ejemplo, la Heparin Sepharose® CL6B se prepara
como se describe en el Manual de Instrucciones de Pharmacia
71-7078-00).
La unión de moléculas de eritropoyetina a un
soporte de heparina se consigue primero equilibrando el soporte en
una "solución de tampón de equilibrio". La "solución de
tampón de equilibrio" es un estado hídrico en el que el soporte
se coloca para unir las moléculas de eritropoyetina cuando se pone
en contacto con un líquido biológico o de cultivo. La unión de
eritropoyetina a la columna se consigue a alrededor de un pH de 4,9
a 8,0, y más preferiblemente alrededor de 5,9 a 7,5, y más
preferiblemente alrededor de 6,2 ó 7,0. Un número de soluciones de
tampón son adecuados para utilizar con soportes de Heparina. Las
soluciones de tampón preferidas incluyen MES (ácido
2-[N-Morfolino]etanosulfónico, Tris
(tris[hidroximetil]aminometano) o fosfato. La
concentración seleccionada preferiblemente para la solución de
tampón está alrededor de 20 mM, con una conductividad preferida de
alrededor de 2 mS/cm.
Antes de eluir la eritropoyetina unida del
soporte de Heparina, pueden eluirse los contaminantes lavando la
columna con solución de tampón de equilibrio, o con solución de
tampón de equilibrio que contiene sales o soluciones de tampón
añadidas, o mediante la variación del pH operativo, o mediante sus
combinaciones. Por ejemplo, la unión de la eritropoyetina puede
conseguirse a pH 6,2, y algunos contaminantes pueden eluirse a pH
7,4, sin pérdida de eritropoyetina. La alteración de los sistemas de
soluciones de tampón, mediante la manipulación de sus componentes,
de esta forma, puede utilizarse para conseguir una adecuada
purificación de moléculas de eritropoyetina. Por ejemplo, la elución
de eritropoyetina del soporte de Heparina puede conseguirse
incrementando la concentración de sal presente en la solución de
tampón de elución. Las sales preferidas son los haluros alcalinos, y
más preferiblemente es la utilización de NaCl.
Opcionalmente, las soluciones de tampón para
equilibrar o eluir eritropoyetina contienen un
"anti-adsorbente". Un
"anti-adsorbente" es cualquier sustancia que
reduce la adsorción de eritropoyetina a superficies del contenedor o
a otras proteínas, o a sí misma (por ejemplo, agregación). Ejemplos
preferidos de anti-adsorbentes son los derivados de
polioxietileno sorbitán o ácidos grasos conocidos como "Tween",
siendo el "Tween® 20" (monolaurato de sorbitan polioxietileno),
el surfactante preferido actualmente. El surfactante, si está
presente, se emplea preferiblemente a una concentración de alrededor
de 0,01 a 0,5% y más preferiblemente alrededor de 0,1%
(peso/peso).
La presente etapa de purificación de Heparina
puede incorporarse a una estrategia global de purificación para
eritropoyetina. Por ejemplo, la presente etapa puede emplearse con
etapas cromatográficas tradicionales, tales como intercambio iónico,
cromatografía de permeación en gel, y HPLC de fase
inversa.
inversa.
Las etapas de intercambio iónico en combinación
con la etapa de Heparina (antes o después de la Cromatografía de
Heparina), incluyen la utilización de cromatografía de intercambio
aniónico o de intercambio catiónico. Soportes generalmente conocidos
comercialmente disponibles para intercambio aniónico en la
purificación de eritropoyetina, portan grupos funcionales de amonio
cuaternario. Las matrices preferidas para utilización en el
procedimiento presente son matrices basadas en agarosa o celulosa,
tales como celulosa microcristalina o agarosas entrecruzadas.
También son particularmente preferidas aquellas matrices que portan
grupos funcionales dietilo, aminoetilo, trietil aminometilo, o
trimetil aminometilo. Una matriz de intercambio aniónico
particularmente preferida es la agarosa entrecruzada
trimetil-aminometilo, que está disponible
comercialmente, por ejemplo Q-Sepharose Fast Flow®
(Pharmacia). Soportes de intercambio catiónico generalmente
conocidos comercialmente disponibles, que pueden utilizarse en la
purificación de eritropoyetina, portan funcionalidades ácidas,
incluyendo ácidos carboxilo y sulfónico. Las matrices que contienen
las funcionalidades catiónicas incluyen diversas formas de matrices
basadas en celulosas y poliestireno. Por ejemplo, intercambiadores
catiónicos débiles conocidos en la técnica incluyen, pero no se
limitan a, Carboxymethyl- Cellulose®,
Carboxymethyl-Sephadex® y
Carboxymethyl-Sepharose®. Intercambiadores
catiónicos fuertes conocidos en la técnica incluyen, pero no se
limitan a, poliestirenos sulfonados (AG 50W®,
Bio-Rex 70®) celulosas sulfonadas
(SP-Sephadex®) y sefarosas sulfonadas
(S-Sepharose®).
La etapa cromatográfica que implica a esas
matrices se conduce más preferiblemente como una etapa de
cromatografía en columna, que opcionalmente puede realizarse a una
temperatura entre 4 y 25 grados centígrados. Generalmente, se añade
una sal a una solución de tampón de lavado o de elución para
incrementar la fuerza iónica de la aplicación de la solución de
tampón de equilibrio. Cualquiera de las sales utilizadas
convencionalmente puede emplearse para este propósito, como puede
determinar fácilmente cualquier experto en la técnica, siendo NaCl
una de las sales más frecuente y convenientemente utilizadas.
Puede utilizarse también una etapa de filtración
en gel convencional, en combinación con la etapa del proceso de
Heparina. Ejemplos representativos de estas matrices son los
polidextranos entrecruzados con acrilamidas, tales como geles
hidrófilos, compuestos preparados mediante entrecruzamiento de
alil-dextrano con
N,N'-metilen-bisacrilamida, y geles
de celulosa entrecruzada. Las dextran-acrilamidas
entrecruzadas comercialmente disponibles se conocen bajo el nombre
comercial de Sephacryl®, y están disponibles de Pharmacia. Un gel de
Sephacryl® preferido es el Sephacryl S-200 HR®.
Ejemplos de geles de celulosa entrecruzada son los geles de celulosa
porosa entrecruzada disponibles comercialmente, por ejemplo GLC 300®
o GLC 1.000® que están disponibles de Amicon Inc.
Los siguientes ejemplos son solo ilustrativos y
no se incluyen para limitar el alcance de la invención reivindicada.
El material de inicio para la purificación de eritropoyetinas puede
ser derivado de líquidos biológicos, o de células cultivadas,
dependientes de anclaje o independientes de anclaje, en cualquier
medio de cultivo adecuado, con o sin diversas cantidades de suero
bovino añadido u otro componente derivado de suero o no de suero. El
material de inicio puede ser producido en una variedad de tipos
celulares humanos y no humanos. Ejemplos de líneas celulares humanas
inmortalizadas útiles para la producción de eritropoyetina incluyen,
pero no se limitan a, células HeLa y derivados de células HeLa (ATCC
CCL 2, 2.1 y 2.2), células de cáncer de mama MCF-7
(ATCC HTB 22), células de leucemia K-562 (ATCC CCL
243), células de carcinoma KB (ATCC CCL 86), células de carcinoma de
ovario 2780AD (Van der Blick, A.M. et al., Cancer Res,
48:5927-5932 (1988)), células Raji (ATCC CCL 86),
células Jurkat (ATCC TIB 152), células Namalwa (ATCC CRL 1432),
células HL-60 (ATCC CCL 240), células WiDr (ATCC
CCL218), células HT1080 (ATCC CCL 121), células Daudi (ATCC CCL213),
células RPMI 8226 (ATCC CCL 121), células U-937
(ATCC CRL 1582), células de melanoma de Bowes (ATCC CRL 9607),
células WI-38VA13 de la sublínea 2R4 (ATCC CCL 75,1)
y células MOLT-4 (ATCC CRL 1582), así como células
de heterohibridoma producidas mediante la fusión de células humanas
y células de otras especies. Pueden utilizarse cepas secundarias de
fibroblastos humanos, tales como la WI-38 (ATCC CCL
75) y MRC-5 (ATCC CCL 171). Además, pueden
utilizarse células primarias humanas para la producción de
eritropoyetina. La eritropoyetina puede producirse mediante
activación del gen de la eritropoyetina en células humanas
primarias, secundarias o inmortalizadas, esencialmente como se
describió en el Documento WO 94/12650, o mediante transfección de un
gen de eritropoyetina en células de origen humano o no humano
primarias, secundarias o inmortalizadas.
Los ejemplos ilustrativos muestran la
versatilidad de la Cromatografía de Heparina como etapa primera o
subsecuente de purificación. Los siguientes ejemplos también
demuestran que la Cromatografía de Heparina funciona bien con una
variedad de resinas de Heparina comerciales, y también demuestra la
escalabilidad de la etapa desde la utilización analítica a la
preparativa. Los Ejemplos 1-6, y 8-9
se realizaron utilizando GA-EPO aislada de células
humanas con el gen activado, producida esencialmente como se
describe en le Documento WO 94/12650. El Ejemplo 7 se realiza
utilizando eritropoyetina de una fuente disponible comercialmente,
que se ha producido mediante expresión del gen de la eritropoyetina
humana, después de transfección en células CHO.
Se obtuvo medio condicionado que contenía suero
bovino fetal al 4%, de una línea celular humana adherente, que
expresa GA-EPO propagada en un Cell Cube (Costar).
El medio se clarifica mediante centrifugación, seguida de filtración
a través de una unidad de filtro Nalgene de 0,45 micrones. La
ultrafiltración/diafiltración (Uf/Df) se realiza utilizando un
sistema de flujo tangencial Pellicon (Millipore), relleno con una
membrana de punto de corte de 30.000 de peso molecular. La solución
de tampón de equilibrio y de diálisis es MES 20 mM, pH 6,2, que
contiene Tween 20 al 0,5%.
La Cromatografía de Heparina se lleva a cabo
utilizando un Sistema Pharmacia's GradiFrac a 4ºC. Una columna de
280 ml (14 x 5 cm) de Heparin Sepharose® CL-6B
(Pharmacia), se equilibra con MES 20 mM, pH 6,2, y que contiene
Tween 20 al 0,1%, a un ritmo de flujo de 10 ml/min. La muestra se
aplica a la columna a 10 ml/min con una bomba Pharmacia P 50. La
columna se eluye después con solución de tampón de equilibrio, hasta
que la absorbancia a 280 nm se estabiliza. La proteína débilmente
unida se eluye mediante lavado con una columna de volumen (280 ml),
de MES 20 mM, pH 6,2, que contiene Tween 20 al 0,1% y NaCl 0,05 M,
mientras se recolectan fracciones de 12 ml. El lavado se sigue de un
gradiente lineal de dos columnas de volumen (560 ml), de NaCl desde
0,05 M hasta 0,35 M, en MES 20 mM, pH 6,2, que contiene Tween 20 al
0,1%, y después de un lavado con una columna de volumen de NaCl 0,35
M en MES 20 mM, pH 6,2, que contiene Tween 20 al 0,1%. La solución
de tampón de elución se aumenta después a NaCl 1,0 M en MES 20 mM,
pH 6,2, que contiene Tween 20 al 0,1%, sobre media columna de
volumen (140 ml), y después se retiene en esta solución de tampón
por una columna de volumen (280 ml).
La proteína total se monitoriza mediante
absorbancia a 280 nm, y la concentración de sal se sigue mediante un
monitor de conductividad en línea (Figura 1). Las fracciones de
flujo a través y eluentes se analizan para el contenido de
GA-EPO mediante ELISA (R & D Systems),
SDS-PAGE y Western Blot.
La columna de Heparin Sepharose® se regenera
mediante la aplicación de 560 ml de Tris-Cl, pH 9,0,
20 mM, que contiene Urea 4 M y NaCl 1,4 M, seguido por un lavado con
solución de tampón de equilibrio hasta que la conductividad y el pH
del efluente de la columna se igualan a los de la solución de tampón
de equilibrio.
En un experimento, se recuperaba el 89% de la
GA-EPO cargada sobre la columna de Heparina, en el
pool de elución. La utilización de esta columna dió como resultado
la eliminación del 90% de la proteína contaminante (Tabla 1).
Se obtuvo medio condicionado, que contenía suero
bovino fetal al 2%, de una línea celular humana adherente que
expresa GA-EPO, propagada en un Cell Cube (Costar).
El medio se clarifica mediante centrifugación, seguida de filtración
a través de una unidad de filtro Nalgene de 0,45 micrones. La
ultrafiltración/diafiltración se realiza utilizando un sistema de
flujo tangencial Pellicon (Millipore), relleno con una membrana de
punto de corte de 30.000 de peso molecular. La solución de tampón de
equilibrio y diálisis es MES, pH 6,2, 20 mM, que contiene Tween 20
al 0,5%.
La Cromatografía de Heparina se llevó a cabo
utilizando un Sistema GradiFrac de Pharmacia a 4ºC. Una columna de
280 ml (14 x 5 cm) de Heparin Sepharose® CL-6B
(Pharmacia), se equilibra con MES, pH 6,2, 20 mM, que contiene Tween
20 al 0,1%, a un ritmo de flujo de 10 ml/min. La muestra se aplica a
la columna a 10 ml/min con una bomba Pharmacia P 50. La columna se
lava después con solución de tampón de equilibrio, hasta que la
absorbancia a 280 nm se estabiliza. La proteína débilmente unida se
eluye mediante lavado con una columna de volumen (280 ml), de MES,
pH 6,2, 20 mM, que contiene Tween 20 al 0,1% y NaCl 0,05 M, mientras
se recolectan fracciones de 12 ml. El lavado se sigue de un
gradiente lineal de dos columnas de volumen (560 ml), de NaCl desde
0,05 M hasta 0,35 M, en MES, pH 6,2, 0,02 M, que contiene Tween 20
al 0,1%, y después se lava con una columna de volumen de NaCl 0,35 M
en MES pH 6,2, 0,02 M, que contiene Tween 20 al 0,1%. La solución de
tampón de elución se aumenta después a NaCl 1,0 M sobre media
columna de volumen (140 ml), y después se retiene en esta solución
de tampón durante una columna de volumen (280 ml).
La proteína total se monitoriza mediante
absorbancia a 280 nm, y la concentración de sal se sigue mediante un
monitor de conductividad en línea (Figura 1). Las fracciones de
flujo a través y eluentes se analizan para el contenido de
GA-EPO mediante ELISA (R & D Systems), mediante
SDS-PAGE y Western Blot.
La columna de Heparina se regenera mediante la
aplicación de 560 ml de Tris-Cl pH 9,0, 20 mM, que
contiene Urea 4 M y NaCl 1,4 M, seguido por un lavado con solución
de tampón de equilibrio, hasta que la conductividad y el pH del
efluente de la columna son iguales a los de la solución de tampón de
equilibrio.
En un experimento, el 81% de la
GA-EPO cargada sobre la columna de Heparina, se
recuperaba en el pool de elución. La utilización de esta columna dió
como resultado la eliminación del 86% de la proteína contaminante
(Tabla 1).
Medio condicionado libre de suero, obtenido de
una línea celular humana que expresa GA-EPO,
propagada en suspensión en frascos de agitación, se clarifica
mediante centrifugación seguida por ultrafiltración a través de una
unidad de filtro Nalgene de 0,45 micrones. La
ultrafiltración/diafiltración se realiza utilizando un sistema de
flujo tangencial Minitan (Millipore), relleno con una membrana de
punto de corte de 10.000 de peso molecular. La solución de tampón de
equilibrio y de diálisis es MES, pH 6,2, 20 mM, que contiene Tween
20 al 0,5%.
La Cromatografía de Heparina se lleva a cabo
utilizando un sistema FPLC de Pharmacia a 25ºC. Se equilibra una
columna de 12 ml (6 x 1,6 cm) de Heparin Sepharose®
CL-6B (Pharmacia), con MES, pH 6,2, 20 mM, que
contiene Tween 20 al 0,1%, a 1 ml/min. La muestra que se va a
aplicar a la columna se carga a 1 ml/min mediante Superloop. La
columna se lava después con solución de tampón de equilibrio, hasta
que la absorbancia a 280 nm se estabiliza. A continuación, en un
volumen de cinco columnas (60 ml), se aplica un gradiente lineal
desde 0 hasta 0,4 M de NaCl en MES, pH 6,2, 0,02 M, que contiene
Tween 20 al 0,1%, seguido por un volumen de una columna de gradiente
de NaCl 1,0 M en MES, pH 6,2, 0,02 M, que contiene Tween 20 al 0,1%,
y después se retiene en esta solución de tampón durante una columna
de volumen.
La proteína total se monitoriza mediante
absorbancia a 280 nm. Las fracciones de flujo a través y eluentes se
analizan para el contenido de GA-EPO mediante ELISA
(R & D Systems) (Figura 3), y mediante SDS-PAGE
y Western Blot.
La columna de Heparin Sepharose® se regenera
mediante la aplicación de 60 ml de Tris-Cl, pH 9,0,
20 mM, que contiene Urea 4 M y NaCl 1,4 M, seguido por un lavado con
solución de tampón de equilibrio hasta que la conductividad y el pH
del efluente de la columna son iguales a los de la solución de
tampón de equilibrio.
En un experimento, el 90% de la
GA-EPO cargada sobre la columna de Heparina, se
recuperaba en el pool de elución. La utilización de esta columna dio
como resultado la eliminación del 97% de la proteína contaminante
(Tabla 1).
Se obtiene medio condicionado, que contiene suero
bovino fetal al 4%, de una línea celular humana adherente que
expresa GA-EPO, propagada en un Cell Cube (Costar).
El medio se clarifica mediante centrifugación seguida de filtración
a través de una unidad de filtro Nalgene de 0,45 micrones. Se
termina el intercambio de la solución de tampón mediante diálisis
durante la noche (membrana con punto de corte de 12.000 a 14.000 de
peso molecular), contra Tris, pH 7,0 20 mM, que contiene Tween 20 al
0,1%.
La Cromatografía de Heparina se lleva a cabo
utilizando un sistema FPLC de Pharmacia a 25ºC. Se equilibra una
columna de 10 ml (5 x 1,6 cm) de Heparin Sepharose® 6 Fast Flow
(Pharmacia), con Tris, pH 7,0, 20 mM, que contiene Tween 20 al 0,1%,
a 4 ml/min. La muestra que se va a aplicar a la columna se carga a 4
ml/min. La columna se lava después con solución de tampón de
equilibrio, hasta que la absorbancia a 280 nm se estabiliza. El
lavado se sigue de un gradiente lineal de 10 columnas de volumen
(100 ml) desde 0 hasta 0,35 M de NaCl en Tris, pH 7,0, 20 mM, que
contiene Tween 20 al 0,1%. La solución de tampón de elución se
aumenta después a NaCl 1,0 M en Tris, pH 7,0, 20 mM, que contiene
Tween 20 al 0,1% sobre 5 ml, y después se retiene en esta solución
de tampón durante dos columnas de volumen (20 ml).
La proteína total se monitoriza mediante
absorbancia a 280 nm. Las fracciones de flujo a través y eluentes se
analizan para el contenido de GA-EPO mediante ELISA
(R & D Systems) (Figura 4), SDS-PAGE y Western
Blot.
En un experimento, el 89% de la
GA-EPO cargada sobre la columna de Heparina, se
recuperaba en el pool de elución. La utilización de esta columna dio
como resultado la eliminación del 93% de la proteína contaminante
(Tabla 1).
La columna de Heparin Sepharose® 6 Fast Flow se
regenera mediante lavado con 20 ml de NaOH 0,1 N, seguido por un
lavado con solución de tampón de equilibrio hasta que la
conductividad y el pH del efluente de la columna son iguales a los
de la solución de tampón de equilibrio.
Se obtiene medio condicionado (400 ml), que
contiene suero de ternera fetal al 2%, de una línea celular humana
adherente que expresa GA-EPO, propagada en botellas
rodantes y se clarifica mediante centrifugación seguida de
filtración a través de una unidad de filtro Nalgene de 0,45
micrones. El material se diluye 4 veces con agua, y se carga sobre
una columna Pharmacia Streamline® DEAE, equilibrada en
Tris-Cl, pH 8,0, 20 mM. Después de lavado con dos
litros de solución de tampón de equilibrio, la
GA-EPO se eluye por etapas con
Tris-Cl pH 8,0 20 mM que contiene NaCl 1M. El
material eluido se recolecta, se ajusta a NaCl 3 M y se aplica a una
columna Pharmacia Phenyl Sepharose® 6 Fast Flow de 100 ml,
equilibrada en solución salina tamponada con fosfato (Dulbecco), que
contiene NaCl 3 M adicional. Después de lavado con solución salina
tamponada con fosfato que contiene NaCl 0,5 M adicional, la
GA-EPO se eluye con NaOH, pH 12, 10 mM, que contiene
propilen-glicol al 20% y urea 4 M. El pool de
elución se dializa contra Tris-Cl, pH 8,0 20 mM,
que contiene Tween 20 al 0,05%, y después se aplica a una columna
Q-Sepharose® Fast Flow de 20 ml, equilibrada en la
misma solución de tampón. La GA-EPO se eluye de la
columna utilizando un gradiente de 10 columnas de volumen de NaCl 0
a 1,0 M en la solución de tampón de equilibrio. Las fracciones que
contienen GA-EPO se recolectan y se dializan contra
MES, pH 6,2, 20 mM, que contiene Tween 20 al 0,05%.
Dos columnas pre-empaquetadas de
Pharmacia HiTrap Heparin® de 1 ml, se conectan en tandem y se
equilibran en MES, pH 6,2, 20 mM, que contiene Tween 20 al 0,05%. El
material dializado de la columna Q-Seapharose® Fast
Flow se carga sobre las columnas HiTrap Heparin® en tandem. Las
columnas se lavan después con solución de tampón de equilibrio hasta
que la absorbancia a 280 nm se estabiliza. El lavado se sigue de un
volumen de 30 columnas (60 ml) de gradiente de NaCl de 0 a 0,6 M en
MES, pH 6,2, 0,02 M, que contiene Tween 20 al 0,05%.
La proteína total se monitoriza mediante
absorbancia a 280 nm. Las fracciones de flujo a través y eluentes se
analizan para el contenido de GA-EPO mediante ELISA
(R & D Systems) (Figura 5), SDS-PAGE y Western
Blot.
En un experimento, el 88% de la
GA-EPO cargada sobre las columnas HiTrap, se
recuperaba en el pool de elución. La utilización de esta columna dio
como resultado la eliminación del 78% de la proteína contaminante
(Tabla 1).
Se obtiene medio condicionado (602 ml), que
contiene suero de ternera al 2%, de una línea celular adherente
humana que expresa GA-EPO, propagada en botellas
rodantes, y se clarifica mediante centrifugación seguida de
filtración a través de una unidad de filtro Nalgene de 0,45
micrones. El material se ajusta a NaCl 3 M y después se carga en una
columna Pharmacia Phenyl Sepharose® 6 Fast Flow de 100 ml,
equilibrada en solución salina tamponada con fosfato (Dulbecco), que
contiene 3 M NaCl adicional. Después de lavado con solución salina
tamponada con fosfato (Dulbecco), que contiene NaCl 0,5 M adicional,
seguido por lavado con Tris, pH 8,0 20 mM, la GA-EPO
se eluye con NaOH, pH 12, 10 mM, que contiene
propilen-glicol al 20% y urea 4 M. Las fracciones
que contienen GA-EPO se recolectan y se dializan
contra MES, pH 5,2, 20 mM, que contiene Tween 20 al 0,05%.
Dos columnas pre-empaquetadas de
HiTrap Heparin® (Pharmacia) de 1 ml, se conectan en tandem y se
equilibran en MES, pH 5,2, 20 mM, que contenía Tween 20 al 0,05%. El
material dializado de la columna de Phenyl Sepharose® Fast Flow se
carga sobre las columnas HiTrap Heparin® en tandem. Las columnas se
lavan después con solución de tampón de equilibrio hasta que la
absorbancia a 280 nm se estabiliza. El lavado se sigue de un volumen
de 30 columnas (60 ml) de gradiente lineal de NaCl de 0 a 1 M en
MES, pH 5,2, 0,02 M, que contiene Tween 20 al 0,05%.
La proteína total se monitoriza mediante
absorbancia a 280 nm. Las fracciones de flujo a través y eluentes se
analizan para el contenido de GA-EPO mediante ELISA
(R & D Systems) (Figura 6), SDS-PAGE y Western
Blot.
En un experimento, el 79% de la
GA-EPO cargada sobre las columnas HiTrap, se
recuperaba en el pool de elución. La utilización de esta columna dio
como resultado la eliminación del 82% de la proteína contaminante
(Tabla 1).
Se añade eritropoyetina producida por al
expresión del gen de la eritropoyetina humana en células CHO,
disponible comercialmente, a medio de cultivo no condicionado,
diafiltrado, y se somete a purificación mediante Cromatografía de
Heparina como sigue:
Medio no condicionado (10 ml), que contiene suero
de ternera al 2%, se intercambia la solución de tampón contra
Tris-Cl pH 7,0, 20 mM, que contiene Tween 20 al
0,1%, utilizando una unidad CentriPrep 30 (Amicon), hasta que la
conductividad es 2,2 mmho. El retenido final (alrededor de 10 ml) se
diluye hasta 18 ml con agua, para conseguir una conductividad de 1,6
mmho. Un vial (500 U) de eritropoyetina derivada de células CHO
(R&D Systems, grado de cultivo celular), se disuelve en 100
\mul de agua y se añade a 0,9 ml de la solución de tampón
intercambiada, medio diluido, y después se filtra a través de un
filtro Acrodisc de 0,2 \mum (Gelman).
Una columna HiTrap Heparin® (Pharmacia) de 1 ml,
se equilibra a temperatura ambiente en Tris-HCl, pH
7,0, 20 mM, que contiene Tween 20 al 0,1% (1 ml/min). El ritmo de
flujo es 1 ml/min, se recolectan fracciones de 1 ml, y se monitoriza
la absorbancia a 280 nm. La muestra filtrada (0,7 ml), se aplica a
la columna, seguida de un volumen de 10 columnas de lavado con
solución de tampón de equilibrio. La eritropoyetina se eluye con un
volumen de 15 columnas de gradiente lineal de
Tris-Cl, pH 7,0, 20 mM, que contiene NaCl 0,4 M y
Tween 20 al 0,1%. El pool de eritropoyetina se concentra a 1,0 ml,
utilizando una unidad Centricon-10 (Amicon). La
concentración de eritropoyetina se determina mediante ELISA (R &
D Systems), y la concentración total de proteína del pool de
eritropoyetina se determina mediante ensayo BCA (Pierce).
En un experimento, esencialmente toda la
eritropoyetina aplicada a la columna Heparin HiTrap® se recuperó en
el pool de elución. La utilización de esta columna dio como
resultado la eliminación del 91% de la proteína contaminante (Tabla
1).
Los siguientes procedimientos sirven como
ejemplos de algunas de las muchas posibles etapas de purificación
que pueden utilizarse después de la Cromatografía de Heparina. Los
siguientes ejemplos no se exponen para limitar el número de etapas
aplicables, pero sirven para ilustrar la versatilidad de la
Cromatografía de Heparina como una etapa que es útil y compatible
con una variedad de procedimientos de purificación.
Una columna Q Sepharose® Fast Flow (Pharmacia) de
25 ml se equilibra con solución de tampón de equilibrio Q Sepharose
(Tris-Cl, pH 7,5, 20 mM, que contiene Tween 20 al
0,1%). El pool de GA-EPO obtenido después de la
Cromatografía de Heparina se dializa contra solución de tampón de
equilibrio Q Sepharose, y después se carga en la columna de Q
Sepharose®. La columna se lava con solución de tampón de equilibrio
Q Sepharose hasta que la absorbancia a 280 nm se estabiliza. La
proteína unida se eluye con Tris-Cl, pH 7,5, 20 mM,
que contiene NaCl 0,4 M y Tween 20 al 0,1%.
El pico de proteína eluida de NaCl 0,4 M se
analiza para GA-EPO mediante ELISA (R & D
Systems), y para proteína total mediante absorbancia a 280 nm. El
flujo a través y las fracciones de lavado se analizaron de forma
similar.
Una columna Mono S® (Pharmacia) de 25 ml, se
equilibra con solución de tampón de equilibrio Mono S
(Tris-Acetato pH 4,5, 20 mM, que contiene Tween 20
al 0,1%). El pool de GA-EPO obtenido después de la
Cromatografía de Heparina se dializa contra solución de tampón de
equilibrio Mono S, y después se carga en una columna Mono S® La
columna se lava con la solución de tampón de equilibrio Mono S hasta
que la absorbancia a 280 nm se estabiliza. La GA-EPO
se eluye en un gradiente de pH a partir de solución de tampón de
equilibrio Mono S a pH 4,5, hasta Tris-Acetato, pH
8,0, 20 mM, que contiene Tween 20 al 0,1%.
Las fracciones de pico de proteína eluido se
analizan para GA-EPO mediante ELISA (R & D
Systems) y la proteína total mediante absorbancia a 280 nm. Las
fracciones de flujo a través y de lavado se analizaron de forma
similar.
La GA-EPO obtenida después de la
Cromatografía de Heparina se hace NaCl 4 M, y se lleva a pH 5,5
mediante la acción gota a gota de HCl 1 N. El material se carga en
una columna Phenyl Sepharose® 6 Fast Flow (Pharmacia) de baja
sustitución, de 50 ml, equilibrada en MES, pH 5,5, 20 mM, que
contiene NaCl 4 M. Después de lavado con cinco volúmenes de columna
de la solución de tampón de equilibrio para eliminar el material no
unido, la GA-EPO se eluye con solución de tampón de
Tris-Acetato, pH 8,0, 20 mM, que contiene urea 4 M y
propilen-glicol al 20%.
Las fracciones de pico de proteína eluido se
analizan para GA-EPO mediante ELISA (R & D
Systems) y la proteína total mediante absorbancia a 280 nm. Las
fracciones de flujo a través y de lavado se analizaron de forma
similar.
La GA-EPO obtenida después de la
Cromatografía de Heparina se concentra hasta 2 ml, en ditiotreitol
0,1 M y SDS al 1%, y después se calienta a 100ºC durante 1 minuto.
La muestra se carga sobre una columna de electroforesis preparativa
en gel (BioRad), preparada como se describe en el manual técnico de
BioRad, utilizando un gel de resolución de acrilamida al 12%. Las
fracciones de pico de proteína se analizan para
GA-EPO mediante Western Blot y para proteína total
mediante absorbancia a 280 nm.
La GA-EPO después de
Cromatografía de Heparina, se dializa contra solución de tampón de
equilibrio (Tris-Cl pH 8,0, 20 mM, que contiene
Tween 20 al 0,2%). La muestra se aplica a una columna de afinidad
(resina Emphase 3M, Pierce, lavada en solución de tampón de
equilibrio) de 0,25 ml, que contiene 0,5 mg de anticuerpos
anti-EPO humana (Genzyme), inmovilizados según las
especificaciones del fabricante. Después de lavado con la solución
de tampón de equilibrio, la GA-EPO se eluye con
ácido acético, pH 3,5, 0,2 M, que contiene NaCl 0,15 M. El material
eluido se recolecta en fracciones de 200 microlitros en tubos que
contienen 20 microlitros de Tris, pH 8,0, 1 M y 2 microlitros de
Tween 20. El pico de proteína eluido se analiza para
GA-EPO mediante ELISA (R & D Systems) y para la
proteína total mediante absorbancia a 280 nm.
La Cromatografía de Heparina para la purificación
de eritropoyetina puede realizarse utilizando resinas de heparina de
una variedad de fabricantes. Se seleccionaron cinco resinas
diferentes para evaluar la capacidad de unión y de carga de
GA-EPO derivada de medio de cultivo
ultrafiltrado/diafiltrado, que contiene suero bovino fetal al 2%: (1
y 2) Heparin Agarose 6XL® Tipo I y Tipo III de American
International Chemical (AIC); (3 y 4) Heparin Sepharose®
Cl-6B y Heparin Sepharose® 6 Fast Flow de Pharmacia;
y (5) Toyopearl AF-Heparin-650M® de
TosoHaas.
El material de inicio y las condiciones
cromatográficas utilizadas fueron como las descritas en el Ejemplo
2, utilizando columnas de 1 ml a 7 ml. Para todas las resinas
ensayadas, la recuperación de GA-EPO fue de al menos
70%. No se observó ninguna diferencia significativa en la capacidad
de carga entre las diferentes resinas.
La cuantificación de eritropoyetina puede
realizarse convenientemente mediante la utilización de un Ensayo
Inmunoabsorbente Ligado a Enzima (ELISA). Uno de dichos kit de ELISA
disponible comercialmente para la cuantificación de eritropoyetina,
está disponible como un kit (Quantikine IVD) de R&D Systems Inc.
Otro kit de ELISA para cuantificar eritropoyetina es de Genzyme
(Predicta kit). Esencialmente, los ensayos de ELISA se realizan
según las especificaciones del fabricante. Alternativamente, pueden
desarrollarse anticuerpos adecuados, desarrollados para reconocer
eritropoyetina, en sistemas de ELISA similares, para ensayo de las
cantidades de eritropoyetina presentes.
La cuantificación de las muestras de proteína es
bien conocida en la técnica. Tales procedimientos incluyen los
Ensayos de Proteína de Lowry, Bradford, y BCA. Existen
comercialmente disponibles kits para determinar la cantidad de
proteína de una muestra, tales como el BCA Protein Assay Reagent
Method, producida por Pierce Chemical Co. La cuantificación de
proteína puede también estimarse mediante espectrofotometría a 280
nm, como es conocido por los expertos en la técnica.
La actividad específica para las muestras se
calcula mediante la siguiente fórmula: Actividad Específica =
Unidades Totales de GA-EPO mediante ELISA/mg totales
de proteína mediante ensayo BCA. Una preparación purificada de
GA-EPO tiene una actividad específica de alrededor
de 200.000 unidades ELISA/mg de proteína mediante ensayo BCA. La
actividad específica utilizando el ELISA para cuantificar unidades
de GA-EPO, está solo indirectamente ligada a la
actividad biológica real de la GA-EPO. Un ensayo
realizado generalmente para determinar la actividad específica in
vivo, es el bioensayo de ratón exhipóxico policitémico, como es
conocido por los expertos en la técnica (dicho ensayo puede
determinar la actividad específica como IU/mg, como es conocido por
los expertos en la técnica).
Las muestras se preparan para
SDS-PAGE y se analizan en geles de poliacrilamida al
10% o al 12%, como es conocido en la técnica. Por ejemplo, los geles
están comercialmente disponibles (por ejemplo, BioRad), y las formas
de utilización son como las descritas en las instrucciones de BioRad
Mini-Protean® II Dual Slab Cell (según el método de
Laemelli, U.K. Nature 227, 680 (1970)). Puede utilizarse Coomassie
R-250, a concentración de alrededor de 0,1%, para
tinción total de proteína. La transferencia de proteínas a una
membrana ImmobilonTM-P PVDF (Millipore), puede
realizarse con un BioRad Mini Trans-Blot®
Electrophoretic Transfer Cell, siguiendo el manual de instrucciones,
utilizando Tris-Cl, pH 8,3, 12,5 mM, que contiene
glicina 96 mM, metanol al 10% y SDS al 0,01%. Las proteínas se
transfieren durante 1 hora a 100 V en un aparato BioRad Mini
Trans-Blot®. La membrana puede bloquearse durante 1
hora a temperatura ambiente con rotación, o durante la noche a 4ºC
con leche desnatada (Carnation) al 5% (peso/volumen), en
TBS-Tween (Tris-Cl, pH 7,4, 20 mM,
NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%). La membrana puede después lavarse
brevemente en TBS-Tween e incubarse con rotación
durante 1 hora a temperatura ambiente en eritropoyetina de conejo
anti-humana (R&D Systems), diluída al 1/1000 con
leche desnatada al 2,5% (peso/volumen) en TBS-Tween
(concentración final 1 \mug/ml). La membrana se lava extensamente
y se revela mediante un método tal como la quimioluminiscencia,
utilizando el Amersham ECLTM Kit y se expone sobre una película. El
límite inferior de detección de GA-EPO mediante esta
técnica está alrededor de 10-20 ng
(SDS-PAGE seguida de Western blot).
Si el blot se va a re-ensayar con
un anticuerpo diferente, la membrana puede limpiarse con
Tris-Cl pH 7,5 60 mM, que contiene SDS al 2,0%
durante 2 horas a temperatura ambiente con rotación. El blot se
rebloquea con solución de tampón bloqueante. El nuevo anticuerpo
primario se añade después como se describió anteriormente. Por
ejemplo, la detección de transferrina puede hacerse utilizando un
anticuerpo conjugado tranferrina-HRP de oveja
anti-humano (Biodesign). Para la detección de
albúmina bovina, puede utilizarse un conjugado
albúmina-HRP de oveja anti-bovino.
Los blots se lavan y se revelan como se describió anteriormente.
Claims (18)
1. Un procedimiento para la purificación de
eritropoyetinas, que comprende las etapas de:
a) poner en contacto un líquido biológico que
contiene eritropoyetinas, con un soporte cromatográfico de heparina,
de tal forma que dichas eritropoyetinas se unan a dicho soporte
cromatográfico de heparina;
b) eluir dichas eritropoyetinas con una solución
de tampón de elución; y
c) recolectar dichas eritropoyetinas
2. Un procedimiento de la reivindicación 1, para
la inclusión en cualquier punto en un procedimiento de etapas
múltiples en la purificación de eritropoyetinas.
3. Un procedimiento de la reivindicación 2, que
es una primera etapa cromatográfica en la purificación de
eritropoyetinas.
4. Un procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, para eliminar proteínas contaminantes de
eritropoyetinas.
5. Un procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, en el que dicho procedimiento de etapas
múltiples incluye una o más etapas cromatográficas seleccionadas de
un grupo de intercambio iónico, interacción hidrófoba, exclusión por
tamaño, fase inversa o cromatografía de afinidad.
6. Un procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho líquido biológico se filtra,
ultrafiltra, centrífuga o dializa, antes de poner en contacto dicho
líquido biológico con dicho soporte de afinidad de heparina.
7. Un procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, que comprende además que dicho líquido
biológico se clarifique antes de poner en contacto dicho líquido
biológico con dicho soporte de afinidad de heparina.
8. Un procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que además comprende que la unión de dichas
moléculas de eritropoyetina ocurre en una solución de tampón de
equilibrio.
9. Un procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la unión de dichas moléculas de
eritropoyetina ocurre a un pH de alrededor de 4,9 a 8,0.
10. Un procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, que comprende además eluir dichas
eritropoyetinas mediante la variación de la solución de tampón de
elución.
11. Un procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha solución de tampón
adicionalmente contiene un anti-adsorbente.
12. Un procedimiento de la reivindicación 10, que
además comprende que la elución de dichas eritropoyetinas ocurre
mediante el incremento de la concentración de sal de un haluro
alcalino.
13. Un procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho líquido biológico es un
líquido de cultivo.
14. Un procedimiento de la reivindicación 13, en
el que dicho líquido biológico está clarificado.
15. Un procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en el que el líquido biológico o el líquido
recolectado que contiene eritropoyetinas, se somete a intercambio de
la solución de tampón.
16. Un procedimiento de la reivindicación 15, en
el que dicho intercambio de la solución de tampón se realiza a un pH
entre 6 y 8.
17. Un procedimiento de la reivindicación 15, en
el que dicho intercambio de la solución de tampón se realiza contra
una solución de tampón de sal entre 0 y 200 mM.
18. Un procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, en el que dicho soporte de afinidad de
heparina es de una fuente disponible comercialmente.
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