JPH11511483A - エリトロポエチンのヘパリンクロマトグラフィー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヘパリンクロマトグラフィーを用いて、生物学的および培養流体からエリトロポエチンを回収するための簡単で効果的な方法に関する。本発明は、エリトロポエチンの研究および商業的な量を得るのに使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 エリトロポエチンのヘパリンクロマトグラフィー 本発明は、ヘパリンクロマトグラフィーを使用して、生物学的および培養流体 から、エリトロポエチンを回収するための、簡単で、有効な方法に関する。本発 明は研究用および商業的な量のエリトロポエチンを得るのに使用することができ る。 ヘパリンは、高度に硫酸化されたグリコサミノグリカンである。特に、ヘパリ ンは、Ｌ−ジピラヌロン酸２−硫酸および２−デオキシ−２−スルファミノ−Ｄ −グルコピラノース６−硫酸の二量体の繰返しからなる、5,000〜30,000の分子 量範囲を有するムコ多糖である。種々のタンパク質に関してヘパリンの親和性を 利用する精製は、一般にヘパリンを支持体マトリックスに共有結合させることに よって実施され、例えばヘパリンセフ たヘパリンからなる。 ヘパリンクロマトグラフィーは、二つの主要な、タンパク質との相互作用の仕 方（１）親和性配位子として、および（２）高含量のアニオン性硫酸基とのカチ オン交換体として：をベースにしている。しかしながら、個々のタンパク質につ いては、ヘパリンとの相互作用の正確な性質は、しばしば親和性とイオン交換体 の相互作用との組み合わせによるもので、このような相互作用の正確な性質を厳 密に予想することはできない。 ヘパリンクロマトグラフィーは、広く種々のタンパク質の精製に利用されてい る(Affinity Chromatography，Principles and Methods；Parmacia Publication 18〜1022029)。これらには、酵素（肥満細胞プロテアーゼ、リポタンパク質リ パーゼ、凝固酵素、スーパーオキシドジスムターゼ）、血清プロテアーゼ阻害剤 (アンチトロンビンIII、プロテアーゼネキシン)、 成長因子（繊維芽細胞成長因子、シュワン細胞成長因子、内皮細胞成長因子）、 細胞外マトリックスタンパク質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン 、トロンボスポンジン、コラーゲン）、核酸結合タンパク質(開始因子、制限エ ンドヌクレアーゼ、DNAリガーゼ、DNAおよびRNAポリメラーゼ)、ホルモンレセプ ター（エストロゲンおよびアンドロゲンレセプター）およびリポタンパク質が含 まれる。 本発明の一つの目的は、エリトロポエチンの全体の精製プランの中で、適切な クロマトグラフィー工程を提供することである。このように、ヘパリンクロマト グラフィーは、多段階方法の最初の工程として、または次なる工程として使用す ることができる。ヘパリンクロマトグラフィーは、当分野で記載されている別の 精製プロセスとは重複しないような汚染物質の選択的除去に適切な精製工程を提 供するもので、これによって均質なエリトロポエチンを調製するにあたっての重 要な代替精製工程が提示される。エリトロポエチン源は、生物を含む多数の源（ 例えば、ヒトの尿のエリトロポエチン）から、完全なエリトロポエチン遺伝子を 哺乳動物の細胞中に導入した後の細胞培養流体から、またはヒト細胞中の内生的 エリトロポエチン遺伝子を活性化した後の細胞培養流体からのものであることが できる。 本発明のヘパリンクロマトグラフィーは、特にヘパリンの均質な調製物を得る ための全体的精製プランに組み込むのが適切である。一般に、商業的に実施可能 であるためには、このようなプロセスは、医薬製造必要高をみたすことができる 収量に応じて容易に規模を変えることができる連続した工程からなる。ここに記 載したヘパリンクロマトグラフィー工程は、エリトロポエチン精製のための高い 回収率の大規模精製プランに組み込むことができる。本発明の特徴は、エリトロ ポエチンの全体の精製プラ ンにおいて適切な最初のクロマトグラフィー工程として、または多段階プロセス のいずれかの部分での使用するための後に続く工程としてのいずれかでヘパリン クロマトグラフィーを組み込むことができるということである。 多くのクロマトグラフィー工程は、最初のクロマトグラフィー工程として使用 するのに十分に適切ではない。最初のクロマトグラフィー工程は、生物学的また は培養流体中に最初から存在する多量の栄養素およびタンパク質を取り扱うこと ができなければならない。適切な最初のクロマトグラフィー工程は、所望のタン パク質を高い回収率で、かなりよくタンパク質精製するものであり、さらに負荷 となる多量のタンパク質及び培地の置換分と相互作用する適切な能力を有してい る。例えば、ヘパリンクロマトグラフィーは、例えば成長が発酵槽または震盪フ ラスコ中であるとか、細胞が足場依存性または足場に依存しないとか、血清タン パク質を用いるかまたは用いないといった、培養条件に依存しない便利で適切な 最初の精製工程として役立つ。このヘパリンクロマトグラフィー工程は、エリト ロポエチンの精製における適切な最初の工程としてこれらの基準をみたすことが わかった。 また、ヘパリンクロマトグラフィーは、イオン交換、疎水性相互作用、サイズ 排除またはアフィニティーによるクロマトグラフィー、塩またはアルコールの沈 殿による分別、分離用ゲル電気泳動または分離用等電点焦点化法（preparative isoelectric focusing）を含む多数の精製工程(これらに限定されない)によって 最初に分別した後にエリトロポエチンをさらに精製するための後に続く工程とし て組み込むのにも十分適している。また、全体の精製体系にヘパリンクロマトグ ラフィーを組み込むと、後の精製工程によって特に十分には分離されない汚染物 質が選択的 に除去されることによって、後の精製工程の有効性も高めることができる。 ヘパリンクロマトグラフィーは、生物学的流体または培養流体から、高い回収 率で生物学的に活性なエリトロポエチンを得るための有用な精製工程を提供する 。さらに、ヘパリンクロマトグラフィーは水性溶媒だけで実施することができ、 当業者によって認められるようなさらなる利点を示している。水性溶媒のみを使 用することは、構造的に損なわれていない生物学的に活性なタンパク質を回収す るのに有害でありうる変性剤、有機溶媒または酸に、タンパク質をさらさないよ うに精製工程を設計することができるので有利である。さらに、ヘパリンクロマ トグラフィーは、非常に穏やかな条件、例えば中性のpHおよび／または低い塩濃 度で実施することができる。この性質は、エリトロポエチンが低いpHまたは高い pHおよび高い塩濃度で、凝集または脱シアル化に対して過敏であるので特に貴重 である(Endo，Y.，et al，J．of Biochem．112，700〜706(1992))。従って、こ の技術はクロマトグラフィー中にエリトロポエチン分子の生物学的活性の損失を 防ぐのに役立つ非常に穏やかな水性条件を提示する。 本発明の目的は、（ａ）エリトロポエチン分子がヘパリン親和性支持体に結合 するような条件下で、前記エリトロポエチンを含む生物学的流体を、前記ヘパリ ン親和性支持体と接触させ、（ｂ）前記エリトロポエチン分子を溶離緩衝剤を用 いて溶離し、そして（ｃ）前記エリトロポエチンを集めることからなる、エリト ロポエチンの精製におけるクロマトグラフィー工程に関する。 前記クロマトグラフィー工程は、エリトロポエチンの精製における最初のクロ マトグラフィー工程、または多段階プロセスにおけるいずれかの部 分にいれる、いずれかとして使用することができる。クロマトグラフィー工程は 、エリトロポエチンの汚染タンパク質、例えば血清タンパク質、特に、限定され るわけではないが仔ウシ血清、ウシ血清、ウシ胎児血清、血清アルブミン、およ びトランスフェリンの群から選ばれるものを除去するのに特に有用である。エリ トロポエチンの精製に関する本発明の範囲内には接触させる生物学的流体が培養 流体であるクロマトグラフィー法が含まれる。 また、本発明は、エリトロポエチンの精製における多段階プロセス（例えば限 定されるわけではないが、多段階プロセスには付加的に、イオン交換、疎水性相 互作用、サイズ排除、逆相、またはアフィニティークロマトグラフィーの群から 選ばれる一つまたはそれより多くのクロマトグラフィー工程が含まれる）中のい ずれかの部分に入れるためのヘパリンクロマトグラフィーに関する。 さらに、本発明は、接触させた生物学的流体を、例えば、限定されるわけでは ないが遠心分離を実施することによって浄化することを、さらに含むことができ る、エリトロポエチンの精製におけるクロマトグラフィー工程に関する。独立し て、生物学的流体は遠心分離、ろ過、限外ろ過、透析またはこれらの手法を組み 合わせて行うことができる。生物学的流体を限外ろ過する時は、限定されるわけ ではないが、5,000〜100,000Ｄの分離膜または10,000〜30,000Ｄの分離膜で実施 することができる。生物学的流体をろ過する時は、場合により45ミクロンの膜を 得ることができるが、これに限定されるわけではない。 本発明では、前記エリトロポエチン分子の結合は、平衡化緩衝剤中で行うこと ができるが、これに限定されるわけではない。このような緩衝剤には、限定され るわけではないが、４−（２−シドロキシエチル）−１−ピ ペリジノエタンスルホン酸緩衝剤（MES）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノ メタン（Tris）もしくは燐酸塩緩衝剤、またはエリトロポエチンを結合させるの に適した緩衝剤となる別のいずれかの緩衝剤が含まれる。さらに、前記エリトロ ポエチン分子の結合は、限定されるわけではないが、4.9〜8.0のpH付近、そして 好ましくは5.9〜7.5のpH付近、そしてさらに好ましくは、6.2または７のpHで行 うことができる。 さらに、本発明のクロマトグラフィー工程は、限定されるわけではないが、場 合により緩衝剤中の塩濃度を高める、追加の緩衝剤でカラムを洗浄する、または 溶離緩衝剤のpHを変えることによって、溶離緩衝剤を変化させて前記エリトロポ エチンを溶離することを含む。溶離緩衝剤の塩濃度は、限定されるわけではない が、アルカリハロゲン化物、例えば塩化ナトリウム（NaCl）の添加によって調節 することができる。本発明のさらなる実施態様には、場合により、緩衝剤のいず れかに付着防止剤、例えば限定されるわけではないがツイーンを添加することが 含まれる。 本発明のクロマトグラフィー工程は、さらにエリトロポエチンを含む媒体、例 えば限定されるわけではないが、生物学的流体または集めたサンプル、の緩衝剤 を交換することが含まれる。このような緩衝剤の交換方法には、接線フローシス テム（tangential flowsy stem）、中空繊維、渦巻きフィルター、撹拌セルシス テム、透析、透析ろ過、ろ過工程の、または慣用のクロマトグラフィーによる使 用が含まれるが、これらに限定されるわけではない。緩衝剤の交換を透析または 透析ろ過膜によって実施するときは、場合により5,000〜10,000または10,000〜3 0,000の分子量の膜を使用することができるが、これらに限定されるわけではな い。緩衝剤の交換は、pHおよび緩衝剤の塩濃度を選んで実施することができ、例 えばこれらのpH は６〜８、5.9〜7.5および6.2〜7.0の間のpHであり、そして緩衝剤は０〜200mM の塩またはさらに好ましくは０〜10mMの塩であるが、これらに限定されるわけで はない。 本発明のさらなる実施態様では、商業的に入手可能な支持体である多数 発明の背景 in vitroまたはin vivoで哺乳動物の細胞によって産出されるエリトロポエチ ンは、165個のアミノ酸の成熟アミノ酸配列を有し、３個のＮ−結合および１個 のＯ結合されたオリゴ糖鎖を含む、糖タンパク質である。Ｎ−結合されたオリゴ 糖鎖は、アスパラギン残基24、38、および83に現れ、一方Ｏ−結合されたオリゴ 糖鎖はセリン残基126に現れる。Lai et al．J．Bio．Chem．261，3116(1986)；B roudy et al．Arcl．Biochem．Biophys．265，329(1988)。エリトロポエチンの1 65個のアミノ酸解読領分およびプロセッシングされたリーダー配列は、ヒトエリ トロポエチン遺伝子のゲノム及びcDNAクローンの単離から一部知られている。Ja cobs et al．Nature 313，806(1985)；Lin，F．K.，et al．Proc．Natl．Acad． Sci．U.S.A．82，7580(1985)。 数多くの科学紙、特許および特許明細書はエリトロポエチンの単離を扱ってい る。関連文献の簡単な概要には、エリトロポエチンの単離に利用されてきた種々 のクロマトグラフィー工程が広く記載されている。次に示した以下の文献は出典 および方法のリストであるが、それぞれのクロマトグラフィー工程の操作を詳細 に記載している試みはない。さらに、 以下の文献の試みは、全体として当分野の状態を示しているだけで、当分野で知 られていることすべての網羅的なリストとして扱われるものではない。 エリトロポエチンの精製のためのアニオンおよびカチオン交換クロマトグラフ ィーの両方の使用は、以下の科学文献に記載されている： Preparative Biochemistry 24，127-142；Quelle，F.W．et al.（1989） Goldwasser，E．and Kung，C.K.H.（1971）PNAS 68，697-698；および Chem．252，5558-5564。 最初のクロマトグラフィー工程として、弱塩基性アニオン交換樹脂、例えばDE AEの特別な使用は、特許文献（１）US 4397840(優先権明細書81JP-0034727)；お よび（２）JP 56016496A(優先明細書79JP-0092999)： ンの異形態を単離するためのさらに強い塩基性アニオン交換樹脂は、特許文献（ １）EP 4282267A2、WO 091058677およびEP 428267A(優先権 89US-0421444)：に 記載されている。不純物から所望のタンパク質を分離するための一般的な方法と して強いイオン交換樹脂を使用することは、特許文献：EP 313343A、EP 391934A およびWO8903840A（優先権明細書87US-0111886）に公示されている。 Cibacron Blue染料を使用するアフィニティークロマトグラフィーは、 エリトロポエチン精製の以下の科学文献に記載されている： et．(1988)，Arch of Biochem and Bioph，265，329-336；(3)（CM Affi- 1210。 また、Cibacron Blueのようなアントラキノンの使用は、特許文献：（１）JP 59065021A（優先権明細書82JP-0174678）；（２）（CM Affi- 合させたもの）JP01165393A（優先権明細書87JP-0324910）にも知られている。 エリトロポエチンの精製のためのサイズ排除クロマトグラフィーの使用は、以 下の科学および特許文献に記載されている： (2)Fibi M.R.，et al.（1991）Blood 77，1203-1210；(3)（Sephadex S．et al.（1984）J．Biol．Chem．259，2707-2701；Miyake T．et al.（1977） J．Biol．Chem 252，5558-5564；(4)JP 01165393A(優先権明細書 87JP-0324910) 。 エリトロポエチンを精製するためのヒドロキシアパタイトの使用は、以下の科 学および特許文献に記載されている： Krystal，G．et al（1986）Blood 67，71-79；Yanagi，H．et al. Biotechnology 6，67-70；(リン酸カルシウムゲル)Goldwasser，E．and T．et al.（1977）J．Biol．Chem．252，5558-5564；JP 01165393A(優先権明細 書 87JP-0324910)。 ヒドロキシアパタイトを、特にHPLC方式で、または工程中で組み合わせて使用 し、開始剤メチオニンを含むタンパク質（Met−タンパク質）の不純物を分離す ることは、US 4798886、WO8602068A、EP176299A、およびEP239311A（優先権明細 書84WO-JP00460、86JP-0066399および87JP-0066940;US 5256769およびEP 176299 Bに示されている。 エリトロポエチンのイムノアフィニティークロマトグラフィーのための固定化 された抗体の一般的な使用は以下の科学文献中に知られている： Miyazaki，H．et al.（1988）J．of Immunological Methods，113，261-267； Goto，M．et al.（1988）Biotechnology 6，67-70；Yanagawa，s．et al.,（198 4）Preparative Biochemistry 24，127-142；Ghanem，A.B．et al.（1994）Prep arative Biochemistry 24，127-142；Wojchowski，D.M．et al.（1987）Biochim ．Biophys．Acta 913，170-177。 また、イムノアフィニティークロマトグラフィーのための固定化された抗体の 一般的な使用は、以下の特許文献中に知られている： EP 249932A（優先権明細書 86JP-0139142），およびさらに特別にはUS 455800 6，US 5106760およびEP 116446B1(優先権明細書83US-0463724；JP 56108798A(80 JP 0011685)中のエリトロポエチン；JP 4117400A，JP59116297AおよびJP 940890 40B2(優先権明細書 82JP-0231539)，JP940866480B2，JP 04117400 A，US 446562 4(優先権明細書 83JP-0026399)，US 4831118(優先権明細書 87US-0083670)，US 4568488(優先権明細書84US-0570075)，およびUS 4558005。 エリトロポエチンの全体的な精製の一つの工程として逆相高圧液体クロマトグ ラフィー（RP-HPLC）を使用することは、以下の科学および特許の両文献に知ら れている： (1)（DEAE-C4 RP-HPLC-Con A Agarose）Quelle，F．W．et al.（1989） HPLC-Size exclusion）Fibi，M.R.，et al.（1991）Blood，77，1203-1210；(3) （RP-HPLC-モレキュラーシーブクロマトグラフィー）JP62036400A(優先権明細書 85JP-0177337)。 また、RP-HPLCは、以下の科学および特許文献に最終的なクロマトグラフィー 工程として記載されている： Jacobs，K．et al．(1989)，Nature 313，806-810；(陽イオン交換クロマトグ ラフィー−RP-HPLC)Broudy，V．et al．(1988)，Arch of Biochem and Bioph，2 65，329-336；Krystal，G．et al．(1986)，Blood,（DEAE- −RP-HPLC）EP 209539B1およびUS 5322837(優先権明細書 85US-0690853)；US Pa tent 4,677,016，EP 228452A，WO 8607594A(優先権明細書 86US-0872152)。 エリトロポエチンの精製のための多くの付加的な工程は、以下の科学および特 許文献中に知られている： (1)（Lectin affinity chromatography）Krystal，G．et al.(1986)Blood 67 ，71〜79（Wheat Germ）；Que1le，F．W．et al．(1989)，Blood 74，652〜657 ；EP 358463A(優先権明細書88ZA-0006645)；(2)（クロマトフォーカシング）Kry stal，G et al.（1986）Blood 67，71〜79，PBE94；(3)（分離用のSDS-PAGE）Kr ystal，G et al.（1986）Blood 67,71〜79；および(4)（メチル化アルブミン− 珪藻土）；Goldwasser，EおよびKung， C.K.H（1971 PNAS 68，697〜698）；(5)（多孔質ポリスチレン、キトサンまたは 珪藻土の支持体への吸着）優先権明細書79JP 01306677を有するUS4303650；(6) （疎水性相互作用クロマトグラフィー）Lee Hung et al．(1980)，Blood，56， 620〜624；Wojchowski et al.（1987）Biochem．et Biophys．913，170〜178。 エリトロポエチン精製に関する科学および特許文献中に報告されている広範囲 にわたる技術のなかで、ヘパリンクロマトグラフィーを使用している文献は前述 のなかにはない。従って、本発明はエリトロポエチンの精製における、新規で都 合のよい精製工程を提供するものである。 図面の説明 ィー 図１は、GA-EPOを発現する細胞系の培養上澄みのヘパリン−セファロー 血清含有培地中のCell Cube（Coster）中で足場依存性培養物として増殖させた 。実施例１に記載された、限外ろ過され、透析ろ過された培養上 吸収度を表している、（・・・・・）線はNaClの勾配を表している。 ィー 図２は、GA-EPOを発現する細胞系の培養上澄みから誘導されたGA-EPOの 細胞は、２％ウシ胎児血清含有培地中のCell Cube（Coster）中で足場依存性培 養物として増殖させた。実施例２に記載された、限外ろ過され、透 る。 マトグラフィー 図３は、GA-EPOを発現する細胞系の培養上澄みから誘導されたGA-EPOの 細胞は、血清を含まない培地中のスピナーフラスコ中の懸濁液中で増殖させた。 実施例３の限外ろ過され、透析ろ過された培養上澄みを、pH6.2で ている。（・・・・・）線はNaClの勾配を表している。 フロークロマトグラフィー 図４は、GA-EPOを発現する細胞系の培養上澄みから誘導されたGA-EPOの グラムである。細胞は、４％ウシ胎児血清含有培地中のCell Cube(Coster)中で 足場依存性培養物として増殖させた。実施例４に記載された、限外ろ過され、透 析ろ過された培養上澄みを、pH7.0でヘパリン−セファロー る。（・・・・・）線はNaClの勾配を表している。 図５．イオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィーによって最初に精製 した後の２％血清からのGA-EPOのハイトラップヘパリンクロマトグ ラフィー 図５は、GA-EPOを発現する細胞系の培養上澄みから誘導されたGA-EPOの ある。細胞は２％仔ウシ血清を含む培養培地中で、ローラーボトル中で増 ロー（Pharmacia）での疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびＱ−セ は280nmでの吸光度を表している。（・・・・・）線はNaClの勾配を表している。 図６．疎水性相互作用クロマトグラフィーによって最初に精製した後の２％血清 からのGA-EPOのハイトラップヘパリンクロマトグラフィー 図６は、GA-EPOを発現する細胞系の培養上澄みから誘導されたGA-EPOのある。 細胞は２％仔ウシ血清を含む培養培地中で、ローラーボトル中で増 ー（Pharmacia）の疎水性相互作用クロマトグラフィーによるものである。この 樹脂から溶離した部分的に精製された物質を透析し、pH5.2でハイト NaClの勾配を表している。 図７．CHO細胞から誘導されたエリトロポエチンのハイトラップクロマト グラフィー 図７は、２％仔ウシ血清を含む、透析ろ過された、状態が整えられていない培 地中に内部基準を入れられた、チャイニーズハムスター卵巣（CHO） （Pharmacia）の分画化を示すクロマトグラムである。内部基準を入れ、 は280nmでの吸光度を表している。破線（・・・・・）はNaClの勾配を表している。 表の説明 表１は、最初のまたは後に続くクロマトグラフィー工程としてヘパリンクロマ トグラフィーを使用して得られたデータのいくつかを集めている。示した実施例 は、足場依存性および足場依存性でない細胞を含み、そして培地中に種々の濃度 でウシ胎児血清または仔ウシ血清のいずれかを用いてまたは用いない、広く様々 な培養条件を扱っている。同様に、実施例は広く様々なクロマトグラフィーの条 件を示している。表中に順に示されているのは、実施例＃（欄１）、成長条件（ 欄２）、精製条件(欄３)、ELISAユニット／mg(EU／mgとして表示された比活性； 欄４)、精製倍率(欄５)、およびパーセント（％）回収率（欄６）である。 発明の詳述 エリトロポエチンは、赤血球の前駆細胞の成熟した赤血球への成長および末端 成熟（terminal maturation）を調節する。エリトロポエチンは、ヒト成人の腎 臓、赤血球細胞および胎児の肝細胞中で産生される。腎機能に欠陥のある患者は 、エリトロポエチン産生が低下しており、酷い貧血になる。精製された天然の及 び組換え型エリトロポエチンの使用は、慢性貧血の患者に対する有効な治療であ る(Canaud，B．(1990)，Am．J．Kidney Dis．15，169〜175；Faulds，D．et al ．(1989)，Drugs 38，863〜899；Wineales，C．G．et al.（1986）Lancet 1175 〜1178)。 エリトロポエチンは、実際には翻訳後の改質、特にグルコシル化による複雑な 配列のため、膨大な数の化学的に異なる種類からなる。ここに記載されているエ リトロポエチンは、一般に以下の特徴：（１）これらはヒトエリトロポエチン遺 伝子によって暗号化された十分に似ているアミノ酸配列を有する；および（２） それらは網状赤血球および赤血球の産生を高めるin vivo生物学的性質を有する ：の両方を有している。 前記のように、ヒトの尿のおよび哺乳類の細胞から産生された組換え型エリト ロポエチンの両者は、165のアミノ酸の成熟アミノ酸配列を有し、三個のＮ−結 合されたおよび一個のＯ−結合されたオリゴ糖鎖を含む糖タンパク質である。Ｎ −結合された糖タンパク質鎖は、アスパラギン残基24、38および83のところで現 れ、一方Ｏ結合された糖タンパク質は、セリン残基126のところに現れる。Lai e t al．J．Biol．Chem．261，3116(1986)；Broudy et al．Arch．Biochem．Bioph ys．265，329(1988)。エリトロポエチン(EPO)は見掛けの分子量を有しており、 これはゲル電気泳動条件に依存して変化する(例えば、Brody，V.，et al.，Arch of Biochem Biophys．265，329-336(1998)；Krystal，G.，et al．Blood 67(1) ，71-79(1986)； Yanagi，H.，et al.，DNA 8(6)，419-427(1989))。実際の分子量は変化し、分子 のタンパク質部分に付いている炭水化物の構造の多様性のため広範囲のサイズに わたる。この多様性は、タンパク質を産生するin vivoおよびin vitro細胞のタ イプに依存している。 本発明の精製エリトロポエチンは、生物学的および／または医薬上興味深い知 られているすべてのエリトロポエチンでありうる。ここで使用するように、「エ リトロポエチン」または「エリトロポエチン生成物」の用語は、（１）Miyake， T.，et al(1977)J．of Biol．Chem．252(15)5558〜5564に記載されている、in v ivo源、例えばヒトの尿から単離されたエリトロポエチン、（２）WO 94／12650 に記載されているようなヒト由来細胞のエリトロポエチン遺伝子（GA-EPOとして も示されている）の活性化から産生されたもの、（３）例えば、Yanagi，H.，et al.（1989）DNA 8(6),419-427に記載されているような、ヒト宿主細胞中にエリ トロポエチン遺伝子を移入させて産生したもの、および（４）米国特許第4,703, 008号に記載されているように、ヒトでない宿主細胞中にエリトロポエチン遺伝 子を移入して産生したもの、を含むことが意図される。 「産生可能細胞」とは、真核生物起源の、好ましくは脊椎動物起源の、そして さらに好ましくは哺乳動物起源の、そして最も好ましくはヒト起源の細胞であり うる。産生可能細胞は、適当な培地中での培養により回収可能な量で所望のエリ トロポエチンを産生することが可能である。これらの細胞の代表的な例には、繊 維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞（例えば、哺乳類の上皮細胞、腸管の上皮 細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液中に見られる細胞（例えば、リ ンパ球、骨髄細胞）、筋細胞およびこれらの体細胞タイプの前駆体が含まれる。 記載したように、これらの細胞は、より好ましくは哺乳動物起源のもの(例えば 、マウス、ラット、ウサ ギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、トリ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サル、ヒト)、そし て最も好ましくはそれらは霊長類またはヒト起源のものである。また、産生可能 細胞には、直接的または間接的に細胞に、回収可能な量のエリトロポエチンを産 生させる外来の遺伝物質を用いてトランスフェクションされた、脊椎動物起源の 、特に哺乳動物起源の、そして最も好ましくは霊長類またはヒト起源の、トラン スフェクションされた第一次、第二次および永久化細胞が包含される。 本発明のヘパリンクロマトグラフィープロセスは、「生物学的流体」からエリ トロポエチンを単離することに関する。ここで使用されているように、「生物学 的流体」には、細胞内部から、例えば細胞質から、もしくは封入体もしくは液胞 から単離された、または例えば細胞がエリトロポエチンを分泌した時の培地から 単離されたエリトロポエチンが含まれる。分泌された分子を発見し、次いで、生 物学的流体、例えば血液、乳汁、腹水もしくは尿、または細胞培養流体から単離 することができる。 例えば、細胞を培養したときに、エリトロポエチンは「培養流体」中に分泌さ れる。エリトロポエチンを単離するためのヘパリンクロマトグラフィープロセス は、特にエリトロポエチンを産生する細胞の培養流体中に含まれるエリトロポエ チンの回収に適している。ここで使用しているように、培養流体の用語は、好ま しくはエリトロポエチンを産生することができる、培養された細胞から使用また は誘導されたすべての流体に相当することを意図している。 好ましくは、エリトロポエチンの生成のために使用する生物学的または培養流 体は、ろ過、限外ろ過、遠心分離によって、または当業者によって知られている 別の技術によって、細胞または細胞のくずから分離される。さらに、「清澄化さ れた流体」の用語は、遠心分離、ろ過、限外ろ過また は当分野で知られている類似の技術によって、細胞、細胞のくずまたは粒状物質 から分離された、生物学的または培養流体を示すのに使用される。エリトロポエ チン分子は、「清澄化された流体」から精製されるのがもっとも多いので、それ が生物学的または培養流体であるかどうかにかかわらず、培地から細胞および粒 子状のくずを分離することは都合がよい。このプロセスは、当分野で知られてい るような、限外ろ過を含めて、遠心分離およびろ過を含む多くの工程によって実 施することができる。また、「清澄化された液体」には、細胞および細胞くず並 びに別の細胞および培地汚染物質を試料から除去する、先行のクロマトグラフィ ーまたは精製工程にかけられた、エリトロポエチンを含む流体を含めることがで きる。 エリトロポエチンを含む培地を知られている実験用緩衝剤を用いて、「緩衝剤 交換」するのは、しばしば望ましい。このような工程は、単独の工程として独立 に、または他の工程と組み合わせて実施することができる。「緩衝剤交換」は、 限定されるわけではないが、接線フローシステム、中空繊維、渦巻きフィルター もしくは撹拌セルシステムを含む当業者によく知られている多くの方法によって 、または当分野で知られている慣用のクロマトグラフィーによって実施すること ができる。ここで使用されるさらに好ましい方法は、透析ろ過（Df）によるもの である。このような場合には、好ましくは膜は、ポリスルホン膜であるか、また は例えばMilliporeまたはAmicon社から商業的に入手可能なタイプの再生された セルロース膜である。また、ろ過工程で使用するのに好ましいのは、約5,000〜1 00,000の分子量のカットオフ、そしてさらに好ましくは約10,000〜30,000の分子 量のカットオフを有する膜である。次いで、場合により被保持物を、好ましくは ６と８の間のpHを有する同一の緩衝剤中で、当分野で知られている手法に従って 、透析および／または透析ろ過にかける。塩は、０〜200mM 存在するのが好ましく、そしてより一層好ましくは塩は０〜10mMである。pHは、 好ましくは4.9〜8.0であり、さらに好ましくは5.9〜7.5であり、そして最も好ま しくは約6.2〜7.0のpHである。 一般に、哺乳類の細胞培養流体中の主な汚染タンパク質は、培地に添加された 血清またはタンパク質に由来する。これは一部である、というのは多くの細胞の タイプでは存在する血清の著しい量への依存性があるからである。市販の細胞培 地は、仔ウシ血清、ウシ血清、ウシ胎児血清もしくは血清アルブミンもしくは他 の精製されたもしくは部分的に精製された血清タンパク質、例えばトランスフェ リン、またはそれらの組み合わせを用いて得られるか、または添加され、ここか ら所望のタンパク質を精製しなければならない。従って、精製プロセスの最初の 工程は血清成分の除去に向けられるのが、しばしば望ましい。 ヘパリンクロマトグラフィープロセスは、精製プロセスの最初の工程に限定さ れない。これは多段階プロセスのいずれの部分で精製プロセスに入れるのにも適 している。限定されるわけではないが、イオン交換、疎水性相互作用、サイズ排 除、逆相またはアフィニティーを含む部分的な分画化方法またはクロマトグラフ ィー方法のいずれかによって、部分的に精製されたエリトロポエチンを調製する ことは、ヘパリンクロマトグラフィーの前に実施することができる。 「ヘパリンアフィニティー支持体」とは、ヘパリンが樹脂支持体にしっかりと 結合されており、ヘパリンクロマトグラフィーのために使用されるような、ヘパ リン分子を支えている、知られているクロマトグラフィー支持体のいずれかのこ とである。ヘパリンアフィニティー支持体は、多くの市販供給源から入手可能で ある。市販入手可能なヘパリンアフィニティー タイプＩおよびタイプII、タイプIIＳ（Sigma）；AF−ヘパリンToyopeal Ｉ、IIおよびIII)(American International Chemical)が含まれるが、これらに 限定されない。好ましい固体マトリックスは、アガロースベース、 である。また、他の固体マトリックス、例えばセルロースまたはポリアクリルア ミドも使用することができる。 ヘパリンクロマトグラフィーは、バッチ式またはカラム溶出のいずれかによっ て実施することができる。好ましくは、ヘパリン支持体は、カラムクロマトグラ フィー方式中にある。カラムクロマトグラフィー方式中で使用するときは、ヘパ リンアフィニティー支持体は、好ましくは０℃〜30℃の間、さらに好ましくは４ ℃〜25℃の間、そして最も好ましくは約４℃で使用される。好ましくは、ヘパリ ン樹脂は、一般に製造者の仕様書に従って、平衡に達せられ、調製され、そして 維持されている（例えば、ヘパリ に記載されているようにして調製されている)。 ヘパリン支持体へのエリトロポエチン分子の結合は、「平衡化緩衝剤」中で支 持体を最初に平衡にすることによって実施される。「平衡化緩衝剤」は、含水状 態にあり、支持体は、生物学的または培養流体と接触させた時にエリトロポエチ ン分子を結合するために置かれる。カラムへのエリトロポエチンの結合は、pH4. 9〜8.0付近、さらに好ましくはpH5.9〜7.5付近、そして最も好ましくはpH6.2〜7 .0付近で実施する。多くの緩衝剤が、 ヘパリン支持体と共に使用するのに適している。好ましい緩衝剤には、MES(２− ［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸)、トリス（トリス［ヒドロキシメチル］ アミノメタンまたは燐酸塩が含まれる。緩衝剤を平衡にするのに選ばれるのが好 ましい濃度は、約20mMであり、好ましい導電率は約２mS／cmである。 ヘパリン支持体から、結合したエリトロポエチンを溶離する前に、付加的な平 衡化緩衝剤を用いて、もしくは添加された塩、緩衝剤を含む平衡化緩衝剤を用い て、もしくは操作するpHを変えることによって、またはそれらを組み合わせてカ ラムを洗浄することによって汚染物質を溶離することができる。例えば、エリト ロポエチンの結合は、pH6.2で実施することができ、そしていくつかの汚染物質 はエリトロポエチンを損失することなく、pH7.4で溶離することができる。緩衝 剤系をその成分を操作することによって変えることは、エリトロポエチン分子の 適切な精製を実施するのに使用することができる。例えば、ヘパリン支持体から のエリトロポエチンの溶離は、溶離緩衝剤中に存在する塩濃度を高めることによ って実施することができる。好ましい塩は、アルカリハロゲン化物であり、最も 好ましくはNaClの使用である。 場合により、エリトロポエチンを平衡または溶離するための緩衝剤には、「吸 着防止剤」が含まれる。「吸着防止剤」は、エリトロポエチンの、容器表面への もしくは他のタンパク質へのまたはそれ自体（例えば、凝集）への吸着を低下さ せる任意の物質である。吸着防止剤の好ましい例は、「ツイーン(Tween)」とし て知られているポリオキシエチレンソルビタン ウレート）が現在最も好ましい界面活性剤である。界面活性剤がある場合は、約 0.01〜0.5％、そしてさらに好ましくは約0.1％（w／w）の濃度で使 用するのが好ましい。 本発明のヘパリン精製工程は、エリトロポエチンの全体の精製プラン中に組み 込むことができる。例えば、本工程は慣用のクロマトグラフィー工程、例えばイ オン交換、ゲル浸透クロマトグラフィーおよび逆相HPLCと共に使用することがで きる。 ヘパリン工程と組み合わせるイオン交換工程（ヘパリンクロマトグラフィーの 前、または後のいずれか）には、陰イオン交換または陽イオン交換クロマトグラ フィーの使用が含まれる。一般に知られている、市販入手可能な、エリトロポエ チンの精製に使用される陰イオン交換支持体は、第四級アンモニウム官能基を有 している。本方法に使用するのに好ましいマトリックスは、アガロースまたはセ ルロースをベースとするマトリックス、例えば微結晶セルロースまたは架橋され たアガロースである。また、特に好ましいのは、ジエチルアミノエチル、トリエ チルアミノエチル、またはトリメチルアミノメチル官能基を有するこれらのマト ッリックスである。特に好ましい陰イオン交換マトリックスは、トリメチルアミ ノメチル架橋されたアガロースであり、これは市販入手可能な、例えばＱ−セフ ァロー 用することができる、一般的に知られている市販入手可能な陽イオン交換支持体 は、カルボキシおよびスルホン酸を含む酸性官能性を有している。陽イオン官能 性を含むマトリックスには、種々の形態のセルロースおよびポリスチレンをベー スとするマトリックスが含まれる。例えば、当分野で 限定されない。 これらのマトリックスを含むクロマトグラフィー工程は、場合により摂氏４℃ 〜25℃の間の温度で実施することができるカラムクロマトグラフィー工程として 実施するのが最も好ましい。一般には、洗浄または溶離緩衝剤に塩を添加して、 適用または平衡化緩衝剤のイオン強度を高める。この目的のために、慣用的に使 用されているすべての塩を使用することができ、これは当業者が容易に定めるこ とができ、NaClは最も頻繁にそして都合よく使用される塩のひとつである。 また、慣用のゲルろ過工程もヘパリンプロセス工程と組み合わせて使用するこ とができる。これらのマトリックスの代表的な例は、アクリルアミドで架橋され たポリデキストランであり、これはN,N′−メチレンビスアクリルアミドと共有 結合によって架橋しているアリルデキストランによって製造された疎水性ゲルお よび架橋されたセルロースゲルの複合物である。市販入手可能な架橋されたデキ ストラン−アクリルアミドは、商品名セフ ースゲルの例は、市販入手可能な架橋された多孔性セルロースゲル、例え 実施例 以下の実施例は、説明するだけのものであって、本発明の特許請求の範囲を限 定するものと解釈されることはない。エリトロポエチン精製のための出発物質は 、生物学的流体から、または種々の量の添加されたウシ血清もしくは他の血清ま たは非血清の誘導された成分を用いて、もしくは用い ずに、いずれかの適切な培養培地中で培養された足場依存性もしくは足場依存性 でない細胞から誘導することができる。出発物質は、様々なヒトまたはヒトでな い細胞のタイプ中で製造することができる。エリトロポエチン産生に有用な不死 化ヒト細胞系の例には、Hela細胞およびHela細胞の誘導体（ATCC CCL 2,2.1およ び2.2）、MCF-7胸部ガン細胞（ATCC HTB 22）、K-562白血病細胞（ATCC CCL 243 ）、KB癌腫細胞（ATCC CCL 17）、2780AD卵巣癌腫細胞（Van der Blick，A．M． et al.，Cancer Res，48：5927-5932(1988)、Raji細胞（ATCC CCL 86）、Jurkat 細胞（ATCC TIB 152）Nemalwa細胞（ATCC CRL 1432）、HL-60細胞（ATCC CCL 24 0）、WiDr細胞(ATCC CCL218)、HT1080細胞(ATCC CCL 121)、Daudi細胞（ATCC CC L213）、RPMI 8226細胞（ATCC CCL 155）、U-937細胞（ATCC CRL 1593）、黒色 腫細胞（ATCC CRL 9607）、WI-38VA13 subline 2R4細胞（ATCC CCL 75．1）およ びMOLT-4細胞（ATCC CRL 1582）、並びにヒト細胞と他の種の細胞の融合によっ て産生されたヘテロハイブリドーマ細胞が含まれるが、これらに限定されない。 二次ヒト繊維芽細胞菌株、例えばWI-38（ATCC CCL 75）およびMRC-5（ATCC CCL 171）を使用することができる。加えて、一次ヒト細胞をエリトロポエチン産生 に使用することができる。エリトロポエチンは、本質的にWO 94／12650に記載さ れているように一次、二次，または不死化ヒト細胞中でエリトロポエチン遺伝子 を活性化させることによって、またはヒトもしくはヒト起源の一次、二次もしく は不死化細胞中にエリトロポエチン遺伝子をトランスフェクションすることによ って産生することができる。 説明の実施例は、最初のまたは後に続く精製工程としてのヘパリンクロマトグ ラフィーの多様性を示している。また、以下の実施例は、ヘパリンクロマトグラ フィーが種々の市販のヘパリン樹脂と共に良好に作動し、ま た分析的な使用から実験室での使用まで工程の規模を変えることができることを 示している。実施例１〜６および８〜９は、本質的にWO 94／12650に記載されて いるようにして製造された、遺伝子活性化されたヒト細胞から単離されたGA-EPO を使用して実施した。実施例７は、CHO細胞中にトランスフェクションされた後 、ヒトエリトロポエチン遺伝子の発現によって産生された、市販入手可能な源か らのエリトロポエチンを使用して実施した。 実施例１ 精製プロセス中の最初のクロマトグラフィーとしてのヘパリンクロマトグラフィ ーの使用 Ｉ．１．出発物質 ４％ウシ胎児血清を含むならし培地を、Cell Cube(Costar)中で増殖させた、G A-EPOを発現する付着ヒト細胞系から得た。培地は、遠心分離に続いて0.45ミク ロンNalgeneフィルター装置を通してろ過することによって、清澄化した。限外 ろ過／透析ろ過(Uf／Df)は、分子量30,000の分離膜を備えたPellicon接線フロー システム（Millipore）を使用して実施した。平衡および透析緩衝剤は、0.5％ツ イーン20を含む20mM MES、pH6.2である。 Ｉ．２．ヘパリンクロマトグラフィー ヘパリンクロマトグラフィーは、４℃でPharmacia's Gradi-Frac の280mlカラム(14×５ｃｍ)を、0.1％ツイーン20を含む20mM MES、pH6.2を用い て、10ml／分の流速で平衡にした。Pharmacia P 50ポンプを用いて、10ml／分で 、試料をカラムに入れた。次いで、280nmでの吸収が安定するまで、カラムを平 衡化緩衝剤で洗浄した。粗く結合したタンパク質を、カラムー容積（280ml）分 の、0.1％ツイーン20および0.05Ｍ NaClを含む、 20mM MES、pH6.2を用いて洗浄することによって溶離しながら、12ml分画を集め た。カラム二容積（560ml）分の、0.1％ツイーン20を含む、20mM MES、pH6.2に おいて、NaClを0.05Ｍから0.35Ｍへ直線的に勾配させて洗浄を続け、次いでカラ ムー容積分の、0.1％ツイーン20を含む、20mM MES、pH6.2中の0.35Ｍ NaClを用 いて洗浄した。次いで、溶離緩衝剤を、カラム半容積（140ml）分にわたって、0 .1％ツイーン20を含む、20mM MES、pH6.2中でNaClを1.0Ｍに高め、それから、カ ラムー容積（280ml）分の間、この緩衝剤中で維持した。 総タンパク質を280nmでの吸光度によってモニターし、そして塩濃度はインラ イン導電率モニターによって追った（図１）。通過流量（flow-through）および 溶離剤の分画を、ELISA（R&D System）、SDS-PAGEおよびWestern Blotによって 、GA-EPO含量について分析した。 ４Ｍ尿素および1.4Ｍ NaClを含む、20mM Tris-Cl、pH9.0の560mlを適用し、続 いてカラム溶離剤の導電率およびpHが平衡化緩衝剤のものと等しく カラムを再生した。 一つの実験において、ヘパリンカラム上に装填されたGA-EPOの89％が溶出プー ルに回収された。このカラムを使用した結果、汚染タンパク質の90％が除去され た（表１）。 実施例２ 精製プロセス中の最初のクロマトグラフィーとしてのヘパリンクロマトグラフィ ーの使用 II．１．出発物質 ２％ウシ胎児血清を含むならし培地を、Cell Cube（Costar）中で増殖させた 、GA-EPOを発現する付着ヒト細胞系から得た。培地は、遠心分離に 続いて0.45ミクロンNalgeneフィルター装置を通してろ過することによって、清 澄化した。限外ろ過／透析ろ過は、分子量30,000の分離膜を備えたPellicon接線 フローシステム（Millipore）を使用して実施した。平衡および透析緩衝剤は、0 .5％ツイーン20を含む20mM MES、pH6.2である。 II．２．ヘパリンクロマトグラフィー ヘパリンクロマトグラフィーは、４℃でPharmacia's Gradi-Frac の280mlカラム（14×５ｃｍ）を、0.1％ツイーン20を含む20mM MES、pH6.2を用 いて、10ml／分の流速で平衡にした。Pharmacia P50ポンプを用いて、10ml／分 で、試料をカラムに入れた。次いで、280nmでの吸光度が安定するまで、カラム を平衡緩衝剤で洗浄した。粗く結合したタンパク質を、カラム一容積（280ml） 分の、0.1％ツイーン20および0.05Ｍ NaClを含む、20mM MES、pH6.2を用いて洗 浄することによって溶離しながら、12ml分画を集めた。カラム二容積（560ml） 分の、0.1％ツイーン20を含む、0.02Ｍ MES、pH6.2においてNaClを0.05Ｍから0. 35Ｍへ直線的に勾配させて洗浄を続け、次いでカラム一容積分の、0.1％ツイー ン20を含む、0.02Ｍ MES、pH6.2中の0.35Ｍ NaClで洗浄した。溶離緩衝剤中のNa Clを、カラム半容積(140ml)分にわたって、1.0Ｍに高め、それからカラム一容積 （280ml）分の間、この緩衝剤中で維持した。 総タンパク質を280nmでの吸光度によってモニターし、そして塩濃度はインラ イン導電率モニターによって追った（図２）。通過流量および溶離剤の分画を、 ELISA（R&D System）、SDS-PAGEおよびWestern Blotによって、GA-EPO含量につ いて分析した。 ４Ｍ尿素および1.4Ｍ NaClを含む、20mM Tris-Cl、pH9.0の560mlを適用し、続 いてカラム溶離剤の導電率およびpHが平衡化緩衝剤のものと等しく なるまで、平衡化緩衝剤によってヘパリンカラムを再生した。 一つの実験で、ヘパリンカラム上に装填されたGA-EPOの81％が溶出プールに回 収された。このカラムを使用した結果、汚染タンパク質の86％が除去された（表 １）。 実施例３ 精製プロセス中の最初のクロマトグラフィーとしてのヘパリンクロマトグラフィ ーの使用 III．１．出発物質 スピナーフラスコ中の懸濁液中で増殖させた、GA-EPOを発現するヒト細胞系か ら得た、血清を含まないならし培地を、遠心分離に続いて0.45ミクロンNalgene フィルター装置を通してろ過することによって、清澄化した。限外ろ過／透析ろ 過は、分子量10,000の分離膜を備えたMinitan接線フローシステム（Millipore） を使用して実施した。平衡および透析緩衝剤は、0.5％ツイーン20を含む20mM ME S、pH6.2である。 III．２．ヘパリンクロマトグラフィー ヘパリンクロマトグラフィーは、25℃でPharmacia's FPLC Systemを使 ム（６×1.6cm）を、0.1％ツイーン20を含む20mM MES、pH6.2を用いて、１ml／ 分の流速で平衡にした。Superloopによって、１ml／分で、試料をカラムに装填 した。次いで、280nmでの吸収度が安定するまで、カラムを平衡化緩衝剤で洗浄 した。次に、カラム５容積（60ml）分の、0.1％ツイーン20を含む、0.02Ｍ MES 、pH6.2において、NaClを０から0.4Ｍに直線的に勾配させて適用し、続いて、カ ラム一容積分の、0.1％ツイーン20を含む、0.02Ｍ MES、pH6.2においてNaClを1. 0Ｍに勾配させ、それからカラム一容積分の間、この緩衝剤中で維持した。 総タンパク質を280nmでの吸光度によってモニターした。通過流量および溶離 剤の分画を、ELISA(R&D System)(図３)によって、並びにSDS-PAGEおよびWestern Blotによって、GA-EPO含量について分析した。 ４Ｍ尿素および1.4Ｍ NaClを含む、20mM Tris-Cl、pH9.0を60ml適用し、続い てカラム溶離剤の導電率およびpHが平衡化緩衝剤のものと等しくなる を再生した。 一つの実験で、ヘパリンカラム上に装填されたGA-EPOの90％が溶出プールに回 収された。このカラムを使用した結果、汚染タンパク質の97％が除去された（表 １）。 実施例４ 精製プロセス中の最初のクロマトグラフィーとしてのヘパリンクロマトグラフィ ーの使用 IV．１．出発物質 ４％ウシ胎児血清を含むならし培地を、Cell Cube（Costar）中で増殖させた 、GA-EPOを発現する付着ヒト細胞系から得た。培地は、遠心分離に続いて0.45ミ クロンNalgeneフィルター装置を通してろ過することによって、清澄化した。緩 衝剤の交換を0.1％ツイーン20を含む、20mM Tris、pH7.0に対して一夜透析（分 子量12,000〜14,000の分離膜）して行った。 IV．２．ヘパリンクロマトグラフィー ヘパリンクロマトグラフィーは、25℃でPharmacia's FPLC Systemを使 の10mlカラム（５×1.6cm）を、0.1％ツイーン20を含む20mM Tris、pH7.0を用い て、４ml／分で平衡にした。４ml／分で、試料をカラムに入れた。次いで、280n mでの吸光度が安定するまで、カラムを平衡化緩衝剤で洗浄 した。カラム10容積（100ml）分の、0.1％ツイーン20を含む、20mM Tris、pH7.0 において、NaClを０から0.35Ｍに直線的に勾配させて洗浄を続けた。次いで、溶 離緩衝剤を、５mlにわたって、0.1％ツイーン20を含む、20mM Tris、pH7.0中で1 .0Ｍ NaClに高め、それから、カラム二容積（20ml）分の間、この緩衝剤中で維 持した。 総タンパク質を280nmでの吸光度によってモニターした。通過流量および溶離 剤の分画を、ELISA(R&D System)(図４)、SDS-PAGEおよびWestern Blotによって 、GA-EPO含量について分析した。 一つの実験で、ヘパリンカラム上に装填されたGA-EPOの89％が溶出プールに回 収された。このカラムを使用した結果、汚染タンパク質の93％が除去された（表 １）。 0.1Ｎ NaOH 20mlでの洗浄に続き、カラム溶離剤の導電率およびpHが平衡化緩 衝剤のものと等しくなるまで、平衡化緩衝剤で洗浄することによっ 実施例５ 精製プロセス中の中間工程としてのヘパリンクロマトグラフィーの使用 Ｖ．１．出発物質 ２％ウシ胎児血清を含むならし培地(400ml)を、ローラーボトル中で増殖させ た、GA-EPOを発現する付着ヒト細胞系から得て、そして遠心分離に続いて0.45ミ クロンNalgeneフィルター装置を通してろ過することによって、清澄化した。物 質を水で４倍に希釈し、そして20mM Tris-Cl、pH8.0 リッターの平衡化緩衝剤で洗浄した後、GA-EPOを、１Ｍ NaClを含む、20mMTris- Cl、pH8.0で溶離する工程に進めた。溶離された物質をため、３Ｍ NaClに調節し 、追加の３Ｍ NaClを含む、燐酸塩緩衝化塩水（Dulbecco） ストフローカラムに適用した。追加の0.5Ｍ NaClを含む、燐酸塩緩衝化塩水で洗 浄した後、GA-EPOを、20％プロピレングリコールおよび４Ｍ尿素を含む、10mM N aOH、pH12で溶離した。溶出プールを、0.05％ツイーン20を含む、20mM Tris-Cl 、pH8.0に対して、透析し、次いで同じ緩衝剤中で平 した。平衡化緩衝剤において、NaClを０から1.0Ｍへ勾配させ、カラム10容積を 使用してGA-EPOを溶離した。GA-EPO含有分画をため、0.05％ツイーン20を含む、 20mM MES、pH6.2に対して透析した。 Ｖ．２．ヘパリンクロマトグラフィー ムを縦につないで、0.05％ツイーン20を含む、20mM MES、pH6.2中で平衡 度が安定するまで、カラムを平衡化緩衝剤で洗浄した。0.05％ツイーン20を含む 、0.02Ｍ MES、pH6.2において、NaClを０から0.6Ｍに直線的に勾配させて、カラ ム30容積（60ml）分によって洗浄を続けた。 総タンパク質を280nmでの吸光度によってモニターした。通過流量および溶離 剤の分画を、ELISA(R&D System)(図５)、SDS-PAGEおよびWestern Blotによって 、GA-EPO含量について分析した。 出プールに回収された。このカラムを使用した結果、汚染タンパク質の78％が除 去された（表１）。 実施例６ 精製プロセス中の中間工程としてのヘパリンクロマトグラフィーの使用 VI．１．出発物質 ２％仔ウシ血清を含むならし培地（602ml）を、ローラーボトル中で増殖させ た、GA-EPOを発現する付着ヒト細胞系から得て、そして遠心分離に続いて0.45ミ クロンNalgeneフィルター装置を通してろ過することによって、清澄化した。こ の物質を３Ｍ NaClに調節し、次いで追加の３Ｍ NaClを含む、燐酸塩緩衝化塩水 （Dulbecco）中で平衡に達せられた100ml 追加の0.5Ｍ NaClを含む、燐酸塩緩衝化塩水で洗浄し、続いて20mM Tris、pH8.0 で洗浄した後、GA-EPOを、20％プロピレングリコールおよび４Ｍ尿素を含む、10 mM NaOH、pH12で溶離した。GA-EPO含有分画をため、0.05％ツイーン20を含む、2 0mM MES、pH6.2に対して透析した。 VI．２．ヘパリンクロマトグラフィー 二本を縦につないで、0.05％ツイーン20を含む、20mM MES、pH5.2中で平 の吸光度が安定するまで、カラムを平衡化緩衝剤で洗浄した。0.05％ツイーン20 を含む、0.02Ｍ MES、pH5.2において、NaClを０から１Ｍに直線的に勾配させて 、カラム30容積（60ml）分によって洗浄を続けた。 総タンパク質を280nmでの吸光度によってモニターした。通過流量および溶離 剤の分画を、ELISA(R&D System)(図６)、SDS-PAGEおよびWestern Blotによって 、GA-EPO含量について分析した。 出プールに回収された。このカラムを使用した結果、汚染タンパク質の82％が除 去された（表１）。 実施例７ CHO細胞中でのヒトエリトロポエチン遺伝子の発現によって産生されたエリトロ ポエチンの精製：精製プロセス中の最初のクロマトグラフィーとしてのへパリン クロマトグラフィーの使用 VII．１．出発物質 CHO細胞中でヒトエリトロポエチン遺伝子を発現することによって産生された 、市販入手可能なエリトロポエチンを、透析濾過され、条件づけされていない培 養培地に添加し、以下のようにヘパリンクロマトグラフィーによる精製にかけた 。 ２％仔ウシ血清を含む条件づけされていない培地（10ml）を、導電率が2.2ミ リムオーになるまで、CenteriPrep 30装置（Amicon）を使用して、0.1％ツイー ン20を含む、20mM Tris-Cl、pH7.0に対して緩衝剤交換した。最終的な被保持物 （約10ml）を水で18mlに希釈し、導電率を1.6ミリムオーにした。一瓶(500Ｕ)の CHO細胞由来のエリトロポエチン(R&D System、組織、培養グレード)を、100μl の水に溶解し、0.9mlの、緩衝剤交換された、希釈された培地に添加し、次いでA crodisc 0.2μmフィルター(Gelman)を通してろ過した。 VII．２．ヘパリンクロマトグラフィー を含む、20mM Tris-Cl、pH7.0中、室温で、平衡にした（１ml／分）。流速は１m l／分で、１ml分画を集め、そして280nmでの吸光度をモニターした。ろ過した試 料（0.7ml）をカラムに適用し、続いて平衡化緩衝剤でカラム10容積分洗浄した 。0.4Ｍ NaClおよび0.1％ツイーン20を含む、20mM Tris-Cl、pH7.0に、カラム15 容積分、直線的に勾配させて溶離した。Centricon 10装置(Amicon)を使用して、 エリトロポエチンプールを1.0ml に濃縮した。エリトロポエチン濃度を、ELISA(R&D System)によって測定し、エ リトロポエチンプールの総タンパク質濃度をBCAアッセイ(Pierice)によって測定 した。 すべてのエリトロポエチンが溶出プールに回収された。このカラムを使用した結 果、汚染タンパク質の91％が除去された（表１）。 実施例８ ヘパリンクロマトグラフィー後のGA-EPOのさらなる精製 以下の手法は、ヘパリンクロマトグラフィー後に利用することができる、多く の可能な精製工程のいくつかの例として示す。以下の実施例は、適用できる工程 の数を制限するものとして解釈されるものではないが、有用であり、様々な精製 手法と併用することができる工程としてのヘパリンクロマトグラフィーの多様性 を説明するのに役立つ。 VIII．１．陰イオン交換クロマトグラフィー ァロース平衡化緩衝剤（0.1％ツイーン20を含む、20mM Tris-Cl、pH7.5)で平衡 にした。ヘパリンクロマトグラフィーの後に得られたGA-EPOプールを、Ｑ，セフ ァロース平衡化緩衝剤に対して透析し、次いで、Ｑセファロ ファロース平衡化緩衝剤で洗浄した。結合したタンパク質を、0.4M NaClおよび0 .1％ツイーン20を含む、20mM Tris-Cl、pH7.5で溶離した。 0.4Ｍ NaClで溶離されたタンパク質ピークは、GA-EPOに関してはELISA（R&D S ystem）によって、そして総タンパク質については、280nmでの吸光度によって分 析した。通過流量および洗浄分画を同様に分析した。 VIII．２．陽イオン交換クロマトグラフィー イーン20を含む、20mM Tris-Acetate、pH4.5）を用いて平衡にした。ヘパリンク ロマトグラフィー後に得られたGA-EPOプールをモノＳ平衡化緩衝剤 定するまで、モノＳ平衡化緩衝剤でカラムを洗浄した。pH4.5でのモノＳ平衡化 緩衝剤から、0.1％ツイーン20を含む、20mM Tris-Acatate、pH8.0へpHを勾配さ せて、GA-EPOを溶離した。 溶離されたタンパク質ピーク分画は、GA-EPOに関してはELISA（R&DSystem）に よって、そして総タンパク質については、280nmでの吸光度によって分析した。 通過流量および洗浄分画を同様に分析した。 VIII．３．疎水性相互作用クロマトグラフィー ヘパリンクロマトグラフィー後に得られたGA-EPOを４Ｍ NaClにし、１Ｎ HCl を滴加することによってpH5.5にした。この物質を、４Ｍ NaClを含む、20mM MES 、pH5.5中で平衡に達せられた、50mlフェニルセファロー 容積分の平衡化緩衝剤で洗浄して結合していない物質を除いた後、４Ｍ尿素およ び20％プロピレングリコールを含む、20mM Tris-Acetate緩衝剤、pH8.0を用いて GA-EPOを溶離した。 溶離されたタンパク質ピーク分画は、GA-EPOに関してはELISA（R&DSystem）に よって、そして総タンパク質については、280nmでの吸光度によって分析した。 通過流量および洗浄分画を同様に分析した。 VIII．４．分離用ゲル電気泳動 ヘパリンクロマトグラフィー後に得られたGA-EPOを２mlに濃縮し、ジチオトレ イトール中0.1ＭおよびSDS中１％にし、次いで１分間100℃に加熱した。12％ア クリルアミド分解ゲルを使用して、BioRad技術マニュアルに 記載されているように調製された分離用電気泳動カラム（BioRad）に入れた。溶 離されたタンパク質のピーク分画は、GA-EPOについてはWestern Blotによって、 そして総タンパク質については、280nmでの吸光度で分析した。 VIII．５．固定化モノクロナール抗−ヒトEPO抗体を用いたアフィニティークロ マトグラフィー ヘパリンクロマトグラフィー後のGA-EPOを、平衡化緩衝剤（0.2％ツイーン20 を含む、20mM Tris-Cl、pH8.0）に対して透析した。製造者の仕様書によって固 定化された0.5ｇ抗−ヒトEPO抗体（Genzyme）を含む0.25mlアフィニティーカラ ム（３Ｍ Emphase樹脂、Pierce、平衡化緩衝剤中で洗浄）に試料を適用した。平 衡化緩衝剤で洗浄した後、0.15Ｍ NaClを含む、0.2Ｍ酢酸、pH3.5でGA-EPOを溶 離した。溶離された物質を、20マイクロリッターの１Ｍ Tris、pH8.0および２マ イクロリッターのツイーン20を含む、管中の200マイクロリッター分画に集めた 。溶離されたタンパク質のピークは、GA-EPOについてはELISA（R&D Systems）に よって、そして総タンパク質については、280nmでの吸光度によって分析した。 実施例９ 種々の製造者からのヘパリンクロマトグラフィー樹脂の使用 種々の製造者からのヘパリン樹脂を使用して、エリトロポエチン精製のための ヘパリンクロマトグラフィーを実施した。２％ウシ胎児血清を含む限外ろ過／透 析ろ過され、培養された培地から産生されたGA-EPOの結合および装填能力を評価 するために、５個の異なる樹脂：（１および２） タイプＩおよびII；（３および４）Pharmaciaからのヘパリンセファロー 使用した出発物質およびクロマトグラフィーの条件は、１mlから７mlのカラム を使用して、実施例２に記載した通りである。試験したすべての樹脂について、 GA-EPOの回収率は少なくとも70％であった。異なる樹脂の間では装填能力に顕著 な差異は見られなかった。 分析方法 ELISA： エリトロポエチンの定量は、Enzyme Linked Immunosorbent Assay（ELISA）の 使用によって都合よく測定することができる。ヒトエリトロポエチンを定量する ための、このような市販入手可能なELISAキットのひとつは、R&D Systems Inc. からキット（Quantikine IVD）として入手できる。エリトロポエチンを定量する ための別のELISAキットは、Genzymeからのもの（Predicta Kit）である。本質的 に、ELISAアッセイは製造者の説明書に従って実施する。別法として、存在する エリトロポエチンの量のアッセイのために、認識されているエリトロポエチンに 発現された適切な抗体を、類似のELISA系中に発現させることができる。 タンパク質アッセイ： タンパク質試料の定量は当分野で知られている。このような手法には、Lowry 、BradfordおよびBCAタンパク質アッセイが含まれる。試料中のタンパク質の量 を測定するためのキットは、市販入手可能であり、例えばPierce Chemical Co. 製のBCA Protein Assay Reagent Methodである。また、タンパク質の定量は、当 業者によって知られているように、280nmでの分光測光法によって評価すること ができる。 比活性： 試料の比活性は、以下の式、比活性＝ELISAによるGA-EPOの総単位／BCA アッセイによる総mgタンパク質：によって計算される。GA-EPOの精製された調製 物は、約200,000 ELISA単位／BCAアッセイによるmgタンパク質の比活性を有する 。GA-EPOの単位を定量するためにELISAを使用した比活性は、実際のGA-EPOの生 物学的活性とは、間接的にしか関連がない。in vivo比活性を測定するために一 般に実施する試験は、当業者によって知られている、低酸素性でない赤血球増加 症マウスバイオアッセイ（このようなアッセイは、当業者に知られているように IU／mgとして比活性を測定することができる）である。 SDS PAGEおよびウエスターン法（Western Blot）： 試料をSDS PAGE用に調製し、当分野で知られているような10％または12％ポリ アクリルアミドゲル上で分析した。例えば、ゲルは市販入手可能で II Dual Slab Cell使用説明書（Laemmli，U.K．Nature 227，680(1970)の方法に 従う）に記載されている通りである。約0.1％濃度でのクーマシーR-250は、総タ ンパク質染色に使用することができる。ImmobilonTM-P Electrophretic Transfer Cellを用いて、96mMグリシン、10％メタノール、およ び0.01％SDSを含む、12.5mM Tris-Cl、pH8.3を使用し、使用説明書のマニュアル に従って実施することができる。タンパク質は、BioRad Mini させながら、またはTBS−ツイーン（0.15Ｍ NaCl、0.05％ツイーン20を含む、20 mM Tris-Cl、pH7.4）中の脂肪分を含まない乳汁５％（Carnation）を用いて４℃ で一夜、膜を封鎖することができる。次いで、膜をTBS−ツイーン中で簡単に洗 浄し、室温で１時間、回転させながら、TBS−ツイーン中の2.5％（w／v）脂肪分 を含まない乳汁で１／1000希釈されたウサギ の抗−ヒトエリトロポエチン（R&D Systems）中でインキュベーションすること ができる。膜をよく洗浄し、Amersham ECLTMキットを使用する化学ルミネセンス のような方法によって発現させ、そしてフィルム上に露光させる。この技術によ るGA-EPO検出の低い方の限界は、約10〜20ngである（SDS-PAGEの後でウエスタン 法）。 ブロットを異なる抗体で再調査する場合は、2.0％SDSを含む、60mM Tris-Cl、 pH7.5を用いて、室温で２時間、回転させながら、膜をストリッピングすること ができる。ブロットは、遮断緩衝剤で再遮断される。次いで、新しい一次抗体を 上記のように添加する。例えば、トランスフェリンの検出は、ヒツジ抗−ヒトト ランスフェリン−HRP複合抗体（Biodesign）を用いて実施することができる。ウ シアルブミンを検出するには、ヒツジ抗−ウシアルブミン−HRP抱合体（Bethyl Labs）を使用することができる。ブロットを洗浄し、そして上記のように現像す る。

【手続補正書】 【提出日】１９９９年１月７日 【補正内容】 請求の範囲 １．（ａ）エリトロポエチンがヘパリンクロマトグラフィー支持体に結合するよ うに、前記エリトロポエチンを含む生物学的流体を、前記ヘパリンクロマトグラ フィー支持体と接触させ、 （ｂ）前記エリトロポエチンを溶離緩衝剤を用いて溶離し、そして （ｃ）前記エリトロポエチンを集める： の工程からなるヘパリンクロマトグラフィー工程を含むエリトロポエチンの精 製方法。 ２．（ａ）エリトロポエチン分子がヘパリン親和性支持体に結合するような条件 下で、前記エリトロポエチンを含む生物学的流体を、前記ヘパリン親和性支持体 と接触させ、 （ｂ）前記エリトロポエチン分子を溶離緩衝剤を用いて溶離し、そして （ｃ）前記エリトロポエチンを集める： からなる第一のクロマトグラフィー工程を含むエリトロポエチンの精製方法。 ３．（ａ）エリトロポエチン分子がヘパリン親和性支持体に結合するような条件 下で、前記エリトロポエチンを含む生物学的流体を、前記ヘパリン親和性支持体 と接触させ、 （ｂ）前記エリトロポエチン分子を溶離緩衝剤を用いて溶離し、そして （ｃ）前記エリトロポエチンを集める： からなる、精製の多段階プロセスのいずれかの部分に含められるためのクロマ トグラフィー工程を含むエリトロポエチンの精製方法。 ４．（ａ）エリトロポエチン分子がヘパリン親和性支持体に結合するような条件 下で、前記エリトロポエチンを含む生物学的流体を、前記ヘパリン親和性支持体 と接触させ、 （ｂ）前記エリトロポエチン分子を溶離緩衝剤を用いて溶離し、そして （ｃ）前記エリトロポエチンを集める： からなるクロマトグラフィー工程を含むエリトロポエチンの汚染タンパク質の 除去方法。 ５．汚染タンパク質が血清タンパク質である、請求項４の方法。 ６．前記汚染タンパク質が、仔ウシ血清、ウシ血清、ウシ胎児血清、血清アルブ ミン、およびトランスフェリンの群から選ばれる、請求項４または５のいずれか 一項の方法。 ７．前記多段階プロセスには、イオン交換、疎水性相互作用、サイズ排除、逆相 、またはアフィニティークロマトグラフィーの群から選ばれる一つまたはそれ以 上のクロマトグラフィー工程が含まれる、請求項３の方法。 ８．前記生物学的流体を前記ヘパリン親和性支持体と接触させる前に、前記生物 学的流体を濾過する、請求項１〜４のいずれか一項の方法。 ９．前記生物学的流体を前記ヘパリン親和性支持体と接触させる前に、前記生物 学的流体を限外濾過する、請求項１〜４のいずれか一項の方法。 10．前記生物学的流体を前記ヘパリン親和性支持体と接触させる前に、前記生物 学的流体を遠心分離する、請求項１〜４のいずれか一項の方法。 11．前記生物学的流体を前記ヘパリン親和性支持体と接触させる前に、前記生物 学的流体を透析する、請求項１〜４のいずれか一項の方法。 12．前記物質を5,000〜100,000Ｄの分離膜で限外濾過する、請求項９の方法。 13．前記物質を0.45ミクロンの膜で濾過する、請求項８の方法。 14．さらに、前記エリトロポエチン分子の結合をpH５〜８付近で行うことを含む 、請求項１〜４のいずれか一項の方法。 15．さらに、前記生物学的流体を前記ヘパリン親和性支持体と接触させる前に、 前記生物学的流体を浄化する、請求項１〜４のいずれか一項の方法。 16．さらに、前記生物学的流体を遠心分離によって清澄化することを含む、請求 項15の方法。 17．さらに、前記エリトロポエチン分子の結合を平衡化緩衝剤中で行うことを含 む、請求項１〜４のいずれか一項の方法。 18．さらに、前記エリトロポエチン分子の結合をトリス（ヒドロキシメチル）ア ミノメタン緩衝剤、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝剤または燐酸 塩緩衝剤中で行うことを含む、請求項１〜４または17のいずれか一項の方法。 19．前記エリトロポエチン分子の結合をpH4.9〜8.0付近で行う、請求項１〜４ま たは17〜18のいずれか一項の方法。 20．さらに、溶離緩衝剤を変えることによって、前記エリトロポエチンを溶離す ることを含む、請求項１〜４のいずれか一項の方法。 21．さらに、前記エリトロポエチンの溶離を、緩衝剤の塩濃度を高めることによ って行うことを含む、請求項20の方法。 22．さらに、カラムを追加の塩および／または緩衝剤で洗浄することによって、 前記エリトロポエチンの溶離を行うことを含む、請求項20の方 法。 23．さらに、溶離緩衝剤の操作するpHを変えることによって、前記エリトロポエ チンの溶離を行うことを含む、請求項20の方法。 24．前記緩衝剤には、付加的に吸着防止剤が含まれる、請求項17または20のいず れか一項の方法。 25．前記緩衝剤には、付加的にツィーンが含まれる、請求項24の方法。 26．さらに、アルカリハロゲン化物の塩濃度を高めることによって、前記エリト ロポエチンの溶離を行うことを含む、請求項20の方法。 27．前記生物学的流体が培養流体である、請求項１〜４のいずれか一項の方法。 28．前記培養流体を清澄化する、請求項27の方法。 29．生物学的流体または集めたエリトロポエチンを含む流体を緩衝剤交換する、 請求項１〜４のいずれか一項の方法。 30．前記緩衝剤交換法は、接線フローシステム、中空繊維、渦巻きフィルター、 撹拌セルシステム、透析、透析ろ過、ろ過工程または慣用のクロマトグラフィー から選ばれる、請求項29の方法。 31．前記緩衝剤交換が透析または透析ろ過によるものである場合には、分子量5, 000〜10,000または10,000〜30,000の膜を選択する請求項30の方法。 32．前記緩衝剤交換をpH６〜８で実施する、請求項29の方法。 33．前記緩衝剤交換を、０〜200mMの塩の緩衝剤に対して実施する、請求項29の 方法。 34．前記ヘパリン親和性支持体は、市販入手源からのものである、請求項１〜４ のいずれか一項の方法。 り選ばれる、請求項34の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）エリトロポエチンがヘパリンクロマトグラフィー支持体に結合するよ うに、前記エリトロポエチンを含む生物学的流体を、前記ヘパリンクロマトグラ フィー支持体と接触させ、 （ｂ）前記エリトロポエチンを溶離緩衝剤を用いて溶離し、そして （ｃ）前記エリトロポエチンを集める： の工程からなる、エリトロポエチンを精製するための、ヘパリンクロマトグラ フィー工程。 ２．（ａ）エリトロポエチン分子がヘパリン親和性支持体に結合するような条件 下で、前記エリトロポエチンを含む生物学的流体を、前記ヘパリン親和性支持体 と接触させ、 （ｂ）前記エリトロポエチン分子を溶離緩衝剤を用いて溶離し、そして （ｃ）前記エリトロポエチンを集める： からなる、エリトロポエチンの精製における、第一のクロマトグラフィー工程 。 ３．（ａ）エリトロポエチン分子がヘパリン親和性支持体に結合するような条件 下で、前記エリトロポエチンを含む生物学的流体を、前記ヘパリン親和性支持体 と接触させ、 （ｂ）前記エリトロポエチン分子を溶離緩衝剤を用いて溶離し、そして （ｃ）前記エリトロポエチンを集める： からなる、エリトロポエチンの精製における、多段階プロセスのいずれかの部 分に含められるためのクロマトグラフィー工程。 ４．（ａ）エリトロポエチン分子がヘパリン親和性支持体に結合するよう な条件下で、前記エリトロポエチンを含む生物学的流体を、前記ヘパリン親和性 支持体と接触させ、 （ｂ）前記エリトロポエチン分子を溶離緩衝剤を用いて溶離し、そして （ｃ）前記エリトロポエチンを集める： からなる、エリトロポエチンの汚染タンパク質を除去するためのクロマトグラ フィー工程。 ５．血清タンパク質であるエリトロポエチンの汚染タンパク質を除去するための 、請求項４のクロマトグラフィー工程。 ６．前記汚染タンパク質が、仔ウシ血清、ウシ血清、ウシ胎児血清、血清アルブ ミン、およびトランスフェリンの群から選ばれる、請求項４または５のいずれか 一項のクロマトグラフィー工程。 ７．前記多段階プロセスには、イオン交換、疎水性相互作用、サイズ排除、逆相 、またはアフィニティークロマトグラフィーの群から選ばれる一つまたはそれ以 上のクロマトグラフィー工程が含まれる、請求項３に記載のようなエリトロポエ チンの精製における多段階プロセスのいずれかの部分に含められるためのクロマ トグラフィー工程。 ８．前記生物学的流体を前記ヘパリン親和性支持体と接触させる前に、前記生物 学的流体を濾過する、請求項１〜４のいずれか一項のクロマトグラフィー工程。 ９．前記生物学的流体を前記ヘパリン親和性支持体と接触させる前に、前記生物 学的流体を限外濾過する、請求項１〜４のいずれか一項のクロマトグラフィー工 程。 10．前記生物学的流体を前記ヘパリン親和性支持体と接触させる前に、前記生物 学的流体を遠心分離する、請求項１〜４のいずれか一項のクロマ トグラフィー工程。 11．前記生物学的流体を前記ヘパリン親和性支持体と接触させる前に、前記生物 学的流体を透析する、請求項１〜４のいずれか一項のクロマトグラフィー工程。 12．前記物質を5,000〜100,000Ｄの分離膜で限外濾過する、請求項９のクロマト グラフィー工程。 13．前記清澄化された物質を10,000〜30,000Ｄの分離膜で限外濾過する、請求項 ９のクロマトグラフィー工程。 14．前記物質を0.45ミクロンの膜で濾過する、請求項８のクロマトグラフィー工 程。 15．さらに、前記エリトロポエチン分子の結合をpH５〜８付近で行うことを含む 、請求項１〜４のいずれか一項のクロマトグラフィー工程。 16．さらに、前記エリトロポエチン分子の結合をpH6.2付近で行うことを含む、 請求項15のクロマトグラフィー工程。 17．さらに、前記生物学的流体を前記ヘパリン親和性支持体と接触させる前に、 前記生物学的流体を浄化する、請求項１〜４のいずれか一項のクロマトグラフィ ー工程。 18．さらに、前記生物学的流体を遠心分離によって清澄化することを含む、請求 項17のクロマトグラフィー工程。 19．さらに、前記エリトロポエチン分子の結合を平衡化緩衝剤中で行うことを含 む、請求項１〜４のいずれか一項のクロマトグラフィー工程。 20．さらに、前記エリトロポエチン分子の結合をトリス（ヒドロキシメチル）ア ミノメタン緩衝剤中で行うことを含む、請求項１〜４または19のいずれか一項の クロマトグラフィー工程。 21．さらに、前記エリトロポエチン分子の結合を２−（Ｎ−モルホリノ） エタンスルホン酸緩衝剤中で行うことを含む、請求項１〜４または19のいずれか 一項のクロマトグラフィー工程。 22．さらに、前記エリトロポエチン分子の結合を燐酸塩緩衝剤中で行うことを含 む、請求項１〜４または19のいずれか一項のクロマトグラフィー工程。 23．前記エリトロポエチン分子の結合をpH4.9〜8.0付近で行う、請求項１〜４ま たは19〜22のいずれか一項のクロマトグラフィー工程。 24．前記エリトロポエチン分子の結合をpH5.9〜7.5付近で行う、請求項23のクロ マトグラフィー工程。 25．前記エリトロポエチン分子の結合をpH6.2付近で行う、請求項24のクロマト グラフィー工程。 26．前記エリトロポエチン分子の結合をpH7.0付近で行う、請求項24のクロマト グラフィー工程。 27．さらに、溶離緩衝剤を変えることによって、前記エリトロポエチンを溶離す ることを含む、請求項１〜４のいずれか一項のクロマトグラフィー工程。 28．さらに、前記エリトロポエチンの溶離を、緩衝剤の塩濃度を高めることによ って行うことを含む、請求項27のクロマトグラフィー工程。 29．さらに、カラムを追加の塩および／または緩衝剤で洗浄することによって、 前記エリトロポエチンの溶離を行うことを含む、請求項27のクロマトグラフィー 工程。 30．さらに、溶離緩衝剤の操作するpHを変えることによって、前記エリトロポエ チンの溶離を行うことを含む、請求項27のクロマトグラフィー工程。 31．前記緩衝剤には、付加的に吸着防止剤が含まれる、請求項19または27 のいずれか一項のクロマトグラフィー工程。 32．前記緩衝剤には、付加的にツィーンが含まれる、請求項31のクロマトグラフ ィー工程。 33．さらに、アルカリハロゲン化物の塩濃度を高めることによって、前記エリト ロポエチンの溶離を行うことを含む、請求項27のクロマトグラフィー工程。 34．前記アルカリハロゲン化物が塩化ナトリウム（NaCl）である、請求項33のク ロマトグラフィー工程。 35．前記生物学的流体が培養流体である、請求項１〜４のいずれか一項のクロマ トグラフィー工程。 36．前記培養流体を清澄化する、請求項35のクロマトグラフィー工程。 37．生物学的流体または集めたエリトロポエチンを含む流体を緩衝剤交換する、 請求項１〜４のいずれか一項のクロマトグラフィー工程。 38．前記緩衝剤交換法は、接線フローシステム、中空繊維、渦巻きフィルター、 撹拌セルシステム、透析、透析ろ過、ろ過工程または慣用のクロマトグラフィー から選ばれる、請求項37のクロマトグラフィー工程。 39．前記緩衝剤交換が透析または透析ろ過によるものである場合には、分子量5, 000〜10,000または10,000〜30,000の膜を選択する請求項38のクロマトグラフィ ー工程。 40．前記緩衝剤交換をpH６〜８で実施する、請求項37のクロマトグラフィー工程 。 41．前記緩衝剤交換をpH5.9〜7.5で実施する、請求項40のクロマトグラフィー工 程。 42．前記緩衝剤交換をpH6.2〜7.0で実施する、請求項41のクロマトグラフィー工 程。 43．前記緩衝剤交換を、０〜200mMの塩の緩衝剤に対して実施する、請求項37の クロマトグラフィー工程。 44．前記緩衝剤交換を、０〜10mMの塩の緩衝剤に対して実施する、請求項43のク ロマトグラフィー工程。 45．前記ヘパリン親和性支持体は、市販入手源からのものである、請求項１〜４ のいずれか一項のクロマトグラフィー工程。 り選ばれる、請求項43のクロマトグラフィー工程。