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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein einfaches und effizientes Verfahren zur Gewinnung von Erythropoietinen
aus biologischen und Kulturflüssigkeiten
unter Verwendung der Heparinchromatographie. Die vorliegende Erfindung
kann verwendet werden, um Forschungsmengen und kommerzielle Mengen
von Erythropoietinen zu erhalten.
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Heparin ist ein hoch sulfatisiertes
Glycosaminoglycan. Spezifisch ist Heparin ein Mucopolysaccharid,
das aus zwei sich wiederholenden Dimeren von L-Dipyranuronsäure-2-sulfat und 2-Desoxy-2-sulfamino-D-glucopyranose-6-sulfat
besteht, mit einem Molekulargewichtsbereich von 5.000 bis 30.000.
Die Reinigung unter Verwendung der Affinität von Heparin für verschiedene
Proteine wird im allgemeinen durch kovalente Bindung von Heparin
an die Trägermatrix
erreicht, z. B. besteht Heparin Sepharose® CL-6B aus Heparin, das mittels
des Cyanogenbromid-Verfahrens an Sepharose® CL-6B-Matrix gekoppelt ist.
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Die Heparinchromatographie basiert
auf zwei Hauptarten der Wechselwirkung mit Proteinen: (1) als Affinitätsligand
und (2) als Kationenaustauscher mit dem hohen Anteil an anionischen
Sulfatgruppen. Für
einzelne Proteine jedoch ist die exakte Art der Wechselwirkung mit
Heparin oft eine Kombination der Affinitäts- und Ionenaustauscherwechselwirkungen
und die genaue Natur solcher Wechselwirkungen kann nicht genau vorhergesagt
werden.
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Die Heparinchromatographie ist bei
der Reinigung einer großen
Anzahl von Proteinen angewendet worden (Affinity Chromatography,
Principles and Methods; Pharmacia Publication 18-1022029): diese umfassen
Enzyme (Mastzellen-Proteanen, Lipoprotein-Lipase, Koagulationsenzyme,
Superoxid-Dismutase); Serinprotease-Inhibitoren (Antithrombin III, Protease-Nexine);
Wachstumsfaktoren (Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Schwann-Zellen-Wachstumsfaktor,
Endothelzellen-Wachstumsfaktor); extrazelluläre Matrixproteine (Fibronectin,
Vitronectin, Laminin, Thrombospondin, Kollagene); Nucleinsäure-Bindungsproteine
(Initiationsfaktoren, Restriktions-Endonucleasen, DNA-Ligase, DNA-
und RNA-Polymerase); Hormonrezeptoren; (Östrogen- und Androgen-Rezeptoren)
und Lipoproteine.
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Ein Ziel der vorliegenden Erfindung
ist die Bereitstellung eines geeigneten chromatographischen Schritts
bei einer generellen Reinigungsstrategie für Erythropoietine. Die Heparinchromatographie kann
als ein erster Schritt oder als folgender Schritt bei einem mehrstufigen
Verfahren verwendet werden. Die Heparinchromatographie stellt einen
geeigneten Reinigungsschritt für
die selektive Entfernung von Verunreinigungen dar, der nicht von
anderen Reinigungsverfahren, die im Stand der Technik beschrieben
sind, wiederholt wird, und somit bietet sie einen wichtigen alternativen
Reinigungsschritt bei der Herstellung von homogenen Erythropoietinen.
Die Quelle von Erythropoietin kann von einer Reihe von Quellen sein,
einschließlich
eines Organismus (z. B. menschliches Erythropoietin aus dem Urin),
aus Zellkulturflüssigkeit
nach der Einbringung eines intakten Erythropoietin-Gens in Säugerzellen,
oder aus Zellkulturflüssigkeit
nach der Aktivierung des endogenen Erythropoietin-Gens in menschlichen
Zellen.
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Die Heparinchromatographie der vorliegenden
Erfindung ist insbesondere geeignet zum Einbau in ein Gesamtreinigungsschema,
das darauf gerichtet ist, homogene Präparationen von Erythropoietin zu
erhalten. Im allgemeinen besteht ein solches Verfahren, um kommerziell
sinnvoll zu sein, aus einer Abfolge von Schritten, die leicht auf
Ausbeuten erweiterbar sind, die in der Lage sind, die Erfordernisse
einer pharmazeutischen Produktion zu erfüllen. Der Schritt der Heparinchromatographie,
der hier beschrieben wird, kann in ein Reinigungsschema in großem Maßstab mit
einer hohen Ausbeute bei der Reinigung der Erythropoietine eingebaut
werden. Eine Eigenschaft der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit
der Heparinchromatographie, entweder als ein geeigneter erster chromatographischer
Schritt in eine Gesamtreinigungsstrategie von Erythropoietinen eingebaut
zu werden, oder als folgender Schritt zur Verwendung an jeder Stelle
eines vielstufigen Verfahrens.
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Viele chromatographische Schritte
sind für die
Verwendung als erster chromatographischer Schritt nicht gut geeignet.
Ein erster chromatographischer Schritt muß in der Lage sein, mit einer
großen Menge
an Nährstoffen
und Proteinen zurecht zu kommen, die ursprünglich in einer biologischen
Flüssigkeit
oder einer Kulturflüssigkeit
vorhanden sind. Ein geeigneter erster chromatographischer Schritt stellt
eine vernünftige
Reinigung des Proteins mit hoher Ausbeute des gewünschten
Proteins bereit und hat doch eine angemessene Fähigkeit zur Wechselwirkung
der Gesamtproteinmenge und Mediumbestandteilen. Zum Beispiel diente
die Heparinchromatographie als ein bequemer und geeigneter erster Reinigungsschritt
unabhängig
von den Kulturbedingungen, z. B. Wachstum in Fermentern oder Schüttelflaschen,
Verankerungs-abhängige
oder Verankerungs-unabhängige
Zellen, mit oder ohne Serumproteine. Bei dem vorliegenden Heparinchromatographieschritt
ist gefunden worden, daß er
diese Kriterien eines geeigneten ersten Schritts bei der Reinigung
von Erythropoietinen erfüllt.
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Die Heparinchromatographie ist ebenfalls gut
geeignet für
den Einbau als ein Folgeschritt bei der weiteren Reinigung von Erythropoietinen
nach anfänglicher
Fraktionierung durch eine Anzahl an Reinigungsschritten, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf, Chromatographie durch Ionenaustausch, hydrophobe Wechselwirkung,
Größenausschluß oder Affinität, Fraktionierung
durch Salz- oder Alkoholfällung,
durch präparative
Gelelektrophorese oder durch präparative
isoelektrische Fokussierung. Der Einbau der Heparinchromatographie
in ein Gesamtreinigungsschema kann auch die Effektivität späterer Reinigungsschritte
durch die selektive Entfernung von Verunreinigungen erhöhen, die
durch spätere
Reinigungsschritte nicht besonders gut abgetrennt werden.
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Die Heparinchromatographie bietet
einen nützlichen
Reinigungsschritt zur Gewinnung von biologisch aktiven Erythropoietinen
mit hoher Ausbeute aus biologischen Flüssigkeiten oder Kulturflüssigkeiten.
Zusätzlich
kann die Heparinchromatographie nur mit wäßrigen Lösungsmitteln durchgeführt werden, ein
weitere Vorteil, der von einem Durchschnittsfachmann geschätzt wird.
Die Verwendung von nur wäßrigen Lösungsmitteln
ist deshalb von Vorteil, weil der Reinigungsschritt so geplant werden
kann, daß das Protein
keinen Denaturierungsmitteln, organischen Lösungsmitteln oder Säuren ausgesetzt
ist, die für die
Gewinnung von strukturell intaktem und biologisch aktivem Protein
schädlich
sein können.
Darüber
hinaus kann die Heparinchromatogaphie unter sehr milden Bedingungen
durchgeführt
werden, d. h. bei neutralem pH und/oder niedrigen Salzkonzentrationen.
Diese Eigenschaft ist besonders wertvoll, weil Erythropoietin bei
niedrigem oder hohem pH oder bei hohen Salzbedingungen zur Aggregation
oder Desialierung neigt (Endo, Y., et al., J. of Biochem. 112, 700–706 (1992)).
Deshalb bietet dieses Verfahren sehr milde wäßrige Bedingungen, die dazu
dienen, den Verlust der biologischen Aktivität während der Chromatographie der
Erythropoietinmoleküle
zu verhindern.
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Das Ziel der vorliegenden Erfindung
betrifft einen chromatographischen Schritt bei der Reinigung von
Erythropoietin(en), der umfaßt:
a) Inkontaktbringen einer erythropoietinhaltigen biologischen Flüssigkeit
mit einem Heparin-Chromatographieträger, so daß die Erythropoietinmoleküle an den
Heparin-Chromatographieträger
binden; b) Eluieren der Erythropoietinmoleküle mit einem Elutionspuffer;
und c) Gewinnen der Erythropoietine. Der vorstehend erwähnte chromatographische
Schritt kann entweder als erster chromatographischer Schritt bei
der Reinigung von Erythropoietin oder an jedem Punkt eines vielstufigen
Verfahrens verwendet werden. Der chromatogaphische Schritt ist besonders
für die
Entfernung von verunreinigenden Proteinen von Erythropoietinen von
Nutzen, wie Serumproteine, insbesondere, aber nicht beschränkt auf
diejenigen, die ausgewählt
sind aus der Gruppe von Kälberserum,
Rinderserum, fötalem
Kälberserum,
Serumalbumin und Transferrin. Der Umfang der vorliegenden Erfindung für die Reinigung
von Erythropoietin(en) umfaßt
ein chromatographisches Verfahren, wobei die kontaktierte biologische
Flüssigkeit
eine Kulturflüssigkeit
ist.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
einen Schritt der Heparinchromatographie zum Einbau an jedem Punkt
bei einem vielstufigen Verfahren zur Reinigung von Erythropoietin(en),
wie, aber nicht beschränkt
auf, ein vielstufiges Verfahren, das zusätzlich einen oder mehrere chromatogaphische
Schritte umfaßt,
die ausgewählt
sind aus der Gruppe, die besteht aus Ionenaustausch, hydrophober
Wechselwirkung, Größenausschluß, Umkehrphasen-
oder Affinitätschromatogaphie.
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Die Erfindung betrifft weiterhin
einen Schritt der Chromatogaphie bei der Reinigung von Erythropoietin(en),
der weiterhin umfassen kann, daß die kontaktierende
biologische Flüssigkeit
geklärt
ist, wie es mittels Zentrifugation, aber nicht beschränkt darauf, durchgeführt wird.
Die biologischen Flüssigkeiten
können
unabhängig
zentrifugiert, filtriert, ultrafiltriert, dialysiert worden sein
oder einer Kombination dieser Verfahren unterzogen worden sein.
Wenn die biologische Flüssigkeit
ultrafiltriert ist, kann dies mit einer Membran mit einer Ausschlußgrenze
von 5.000–100.000
D oder 10.000–30.000
D durchgeführt
werden, ist aber nicht darauf beschränkt. Wenn eine biologische
Flüssigkeit
filtriert wird, kann sie gegebenenfalls mit einer Membran von 45
Mikron erhalten werden, ist aber nicht beschränkt darauf.
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Bei der vorliegenden Erfindung kann
die Bindung der Erythropoietinmoleküle in einem Äquilibrierungspuffer
erfolgen, ist aber nicht beschränkt
darauf. Solche Puffer umfassen, sind aber nicht beschränkt auf,
4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure-Puffer (MES), Tris(hydroxymethyl)aminomethan
(Tris) oder Phosphatpuffer oder jeder andre Puffer, der einen für die Bindung
von Erythropoietinen geeigneten Puffer bereitstellt. Zusätzlich kann die
Bindung der Erythropoietinmoleküle
etwa bei einem pH von 4,9 bis 8,0 erfolgen, und vorzugsweise bei
einem pH von etwa 5,9 bis 7,5 mehr bevorzugt bei einem pH von 6,2
oder 7.
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Zusätzlich umfassen die chromatographischen
Schritte der vorliegenden Erfindung die Elution der Erythropoietine
durch Variation des Elutionspuffers, gegebenenfalls, aber nicht
beschränkt
auf, durch Erhöhung
der Salzkonzentration in dem Puffer, das Waschen der Säule mit
zusätzlichem
Puffer oder durch Variation des Arbeits-pH des Elutionspuffers. Die
Salzkonzentration des Elutionspuffers kann durch die Zugabe von
Alkalihalogeniden wie Natriumchlorid (NaCl) angepaßt werden,
ist aber nicht beschränkt
darauf. Eine weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfaßt
gegebenenfalls die Zugabe von anti-Absorptionsmitteln wie Tween zu jedem
dieser Puffer, ist aber nicht beschränkt darauf.
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Die chromatographischen Schritte
der vorliegenden Erfindung schließen weiterhin den Austausch
des Puffers bei dem Medium, das Erythropoietin enthält, wie
eine biologische Flüssigkeit
oder eine entnommene Probe ein, sind aber nicht beschränkt darauf.
Solche Pufferaustauschverfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf,
die Verwendung von tangentialen Flußsystemen, Hohlfasern, spiralen
Wundfiltern, gerührten
Zellsystemen, Dialyse, Diafiltration, Filtrationsschritte, oder
mittels herkömmlicher
Chromatographie. Wenn der Pufferaustausch durch eine Dialyse oder
Diafiltration durchgeführt
wird, ist eine Membran, die man gegebenenfalls verwenden kann, eine
Membran mit einem Molekulargewicht von 5.000 bis 10.000 oder 10.000
bis 30.000, aber nicht beschränkt
darauf. Der Pufferaustausch kann bei ausgewähltem pH und ausgewählten Puffersalzkonzentrationen
durchgeführt
werden, wie pH's
zwischen einem pH von 6 bis 8, 5,9 und 7,5 und 6,2 bis 7,0, und
gegen einen Puffer von 0 bis 200 mM Salz, mehr bevorzugt 0 bis 10
mM, sind aber nicht beschränkt
darauf.
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Eine andere Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung sieht die Verwendung einer Anzahl von Heparinaffinitätsträgern vor,
die kommerziell erhältlich
sind, wie, aber nicht beschränkt
auf, Heparin-Sepharose CL-GB®,
Heparin-Sepharose 6 Fast Flow®,
HiTap Heparin®,
Affigen Heparin®,
Heparin Agaraose®,
Heprin Sepharose®,
Heparin Hyper D® und
Heparin Agarose 6XL®.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Erythropoietine, die von Säugerzellen
in vitro oder in vivo produziert werden, sind Glycoproteine, die
eine reife Aminosäuresequenz
von 165 Aminosäuren
haben und drei N-verknüpfte und
eine O-verknüpfte
Oligosaccharidketten enthalten. Die N-verknüpften Oligosaccharidketten
treten bei den Asparaginresten 24, 38 und 83 auf, während die
O-verknüpfte Oligosaccharidkette
am Serinrest 126 auftritt. Lai et al. J. Biol. Chem. 261, 3116 (1986);
Broudy et al. Arch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988). Der codierende
Bereich von 165 Aminosäuren
und die prozessierte Leadersequenz von Erythropoietin sind zum Teil
durch die Isolierung von genomischen und cDNA-Clonen des menschlichen
Erythropoietingens bekannt. Jacobs et al. Nature 313, 806 (1985);
Lin, F. K. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 7580 (1985).
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Eine große Zahl an wissenschaftlichen
Veröffentlichungen,
Patenten und Patentanmeldungen beschäftigen sich mit der Isolierung
von Erythropoietin. Ein kurzer Überblick über die
betreffenden Referenzen zeigt, daß eine große Vielzahl von chromatographischen
Schritten bei der Isolierung von Erythropoietinen angewendet wurden.
Die folgenden, nachstehend aufgeführten Referenzen sind eine
Liste von Quellen und Verfahren, es wurde jedoch kein Versuch unternommen,
um im Detail die Arbeitsweise von jedem chromatographischen Schritt
zu beschreiben. Darüber
hinaus versuchen die folgenden Referenzen nur den Stand der Technik
als Ganzes anzugeben und können
nicht als eine erschöpfende
Liste von allem betrachtet werden, was im Fachgebiet bekannt ist.
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Die Verwendung der Anionen- und Kationenaustauschchromatographie
bei der Reinigung von Erythropoietinen wurde in der wissenschaftlichen
Literatur beschrieben: (1) (Mono Q®) Broudy, V. C. (1988) Arch.
of Biochem. and Biophys. 265, 329–336; (2) (DEAE Sephacel®) Ghanem,
A. B. et al. (1994) Preparative Biochemistry 24, 127–142 ; Quelle,
F. W. et al. (1989) Blood, 74, 652–657; (3) DEAE Agarose®) Miyake,
T. et al. (1977) J. Biol. Chem. 252, 5558–5564; (4) (S-Sepharose®) Fibi, M.
R. et al. (1991) Blood 77, 1203–1210;
(5) (Sulfoethyl Sephadex®)
Goldwasser, E. und Kung, C. K. H. (1971) PNAS 68, 697–698; und
(6) (Sulfopropyl Sephadex®)
Miyake, T. et al. (1977) J. Biol. Chem. 252, 5558–5564.
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Die spezielle Verwendung von schwach
basischen Anionenaustauscherharzen wie DEAE als erstem chromatographischem
Schritt ist in der Patentliteratur gut beschrieben: (1)
US 4397840 (Prioritätsanmeldung
81JP-0034727); und (2) JP 56016496A (Prioritätsanmeldung 79JP-0092999). Die
Verwendung von stärker
basischen Anionenaustauscherharzen für die Isolierung von Erythropoietin-Isoformen
unter Verwendung von Q-Sepharose® ist
in der Patentliteratur beschrieben: (1)
EP 4 282 267A2 , W091/058677
und
EP 428 267A (Priorität 89US-0421444).
Die Verwendung von starken Ionenaustauscherharzen als generelles
Verfahren um die erwünschten
Proteine von Verunreinigungen abzutrennen ist in der Patentliteratur
beschrieben:
EP 313 343A ,
EP 391 934A und
WO89/03840A (Prioritätsanmeldung
87US-0111886). GB-A-886 712 offenbart Verfahren für die Herstellung
von Erythropoietinfaktor-Konzentraten unter Verwendung eines unlöslichen
Polymers, das Ionenaustauschergruppen enthält.
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Die Affinitätschromatographie unter Verwendung
von Cibacron Blau-Farbstoffen wurde in der wissenschaftlichen Literatur
bei der Reinigung von Erythropoietinen beschrieben: (1) (CM Affi-Gel Blue®) Krystal,
G. et. al (1984) Brit. J. of Hematology 58, 533–64; und (2) (CM Affi-Gel Blue®) Broudy,
V. et. (1988) Arch. of Biochem. and Biophys. 265, 329–336; (3)
(CM Affi-Gel Blue®)
Krystal, G. et. al (1986), Blood, 67, 71–79; (4) (CM Affi-Gel Blue®) Yanagi,
H., et. al (1989) DNA, 8, 419–427;
(5) (Blue Trisacryl M®)
Fibi, M. R. et al. (1991) Blood, 77, 1203–1210.
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Die Verwendung von Anthrachinonen
wie den Cibacron Blau-Farbstoffen ist ebenfalls in der Patentliteratur
bekannt: (1) JP 59065021A (Prioritätsanmeldung 82JP-0174678);
(gebundene Carboxymethylgruppen und Cibacron Bue F3GA® als CM Affi-Gel
Blue® JP01165393A
(Prioritätsanmeldung 87JP-0324910).
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Die Verwendung der Größenausschlußchromatographie
für die
Reinigung von Erythropoietinen ist in der wissenschaftlichen Literatur
und der Patentliteratur beschrieben: (1) (TSK G3000SW®) Yanagi, H.,
et. al. (1989) DNA, 8, 419–427;
(2) Fibi, M. R., et al. (1991) Blood 77, 1203–1210; (3) (Sephadex G-100®) Goto, M.
et al. (1988) Biotechnology 6, 67–70; Yanagawa, S. et al. (1984)
J. Biol. Chem. 259, 2707–2701;
Miyake T. et al. (1977) 7. Biol. Chem. 252, 5558–5564; (4) JP 01165393A (Prioritätsanmeldung
87JP-0324910).
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Die Verwendung von Hydroxylapatit
für die Reinigung
von Erythropoietinen ist in der wissenschaftlichen Literatur und
der Patentliteratur beschrieben: Krystal, G. et. al (1986) Blood
67, 71–79; Yanagi,
H., et. al. (1989) DNA 8, 419–427;
(BioRad HPHT®)
Goto, M. et al. (1988) Biotechnology 6, 67–70; (Calciumphosphatgel) Goldwasser,
E. und Kung, C. K. H. (1971) PNAS 68, 697–698; (BioRad BioGel HT®) Miyake,
T. et al. (1977) J. Biol. Chem. 252, 5558–5564; JP 01165393A (Prioritätsanmeldung
87JP-0324910). Die Abtrennung von Verunreinigungen von Proteinen,
die Initiator-Methionine (Met-Proteine) enthalten unter Verwendung
von Hydroxylapatit, insbesondere bei einem HPLC-Verfahren oder bei
einer Kombination von Schritten, ist in der
US 4,798,886 , WO86/02068A,
EP 176 299A und
EP 239 331A (Prioritätsanmeldungen 84WO-JP00460,
86JP-0066399 und 87JP-0066940);
US
5256769 und EP 176299B gegeben.
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Die allgemeine Verwendung von immobilisierten
Antikörpern
für die
Immunaffinitätschromatographie
von Erythropoietinen ist in der wissenschaftlichen Literatur bekannt:
Miyazaki, H. et al. (1988) J of Immunological Methods, 113, 261–267; Goto,
M. et al. (1988) Biotechnology 6, 67–70; Yanagawa, S. et al., (1984)
Preparative Biochemistry 24, 127–142; Ghanem, A. B. et al.
(1994) Preparative Biochemistry 24, 127–142; Wojchowski, D. M. et
al. (1987) Biochim. Biophys. Acta 913, 170–177.
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Die allgemeine Verwendung von immobilisierten
Antikörpern
für die
Immunaffinitätschromatographie
ist auch in der Patentliteratur bekannt:
EP 249932A (Prioritätsanmeldung
86JP-0139142), und spezifischer für Erythropoietin in der
US 4,558,006 ,
US 5,106,760 und
EP 116446B1 (Prioritätsanmeldung
83US-0463724); JP 56108798A (Prioritätsanmeldung 80JP-0011685);
JP 4117400A, JP 59116297A und JP 94089040B2 (Prioritätsanmeldung
82JP-0231539), JP 940866480B2, JP04117400 A,
US 4,465,624 (Prioritätsanmeldung 83JP-0026399),
US 4831118 (Prioritätsanmeldung 87US-0083670),
US 4,568,488 (Prioritätsanmeldung 84US-0570075)
und
US 4,558,005 .
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Die Verwendung der Umkehrphasen-Hochdruckflüssigchromatographie
(RP-HPLC) als ein Schritt bei der Gesamtreinigung von Erythropoietinen ist
in der wissenschaftlichen Literatur und der Patentliteratur bekannt:
(1) (DEAE-C4 RP-HPLC – Con
A Agarose) Quelle, F. W. et al. (1989) Blood, 74, 652–657; (2)
Blue Trisacryl M® – S-Sepharose® – C8 RP-HPLC-Größenausschluß) Fibi,
M. R. et al. (1991) Blood 77, 1203–1210; (3) (RP-HPLC -Molekularsieb-Chromatographie)
JP 62036400A (Prioritätsanmeldung
85JP-0177337).
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RP-HPLC wurde auch als einer letzter
chromatographischer Schritt in der wissenschaftlichen Literatur
und der Patentliteratur beschrieben: Jacobs, K. et al. (1989) Nature
313, 806–810;
(Kationenaustauscherchromatographie – RP-HPLC) Broudy, V. et. al.
(1988), Arch. of Biochem. and Bioph. 265, 329–336; Krystal, G. et. al (1986),
Blood, (DEAE-Agarose® – Sulphopropyl-Sephadex® – Gelfiltration – Hydroxylapatit – RP-HPLC)
EP 209 539B1 und
US 5322837 (Prioritätsanmeldung 85US-0690853);
US-Patent 4,677,016,
EP
228 452A , WO 86/07594A (Prioritätsanmeldung 86US-0872152).
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Eine Zahl von zusätzlichen Schritten für die Reinigung
von Erythropoietinen sind in der wissenschaftlichen Literatur und
der Patentliteratur bekannt: (1) (Lectin-Affinitätschromatographie) Krystal,
G. et. al (1986), Blood 67, 71–79
(Weizenkeim); Quelle, F. W. et al. (1989) Blood 74, 652–657; EP
358463A (Prioritätsanmeldung
88ZA-0006645) (2) (Chromatofokussierung) Krystal, G. et. al (1986)
Blood, 67, 71–79. PBE94;
(3) (Präparative
SDS-PAGE) Krystal, G. et. al (1986) Blood, 67, 71–79; und
(4) (Methyliertes Albumin-Kieselguhr);
Goldwasser, E. und Kung, C. K. H. (1971) PNAS 68, 697–698; (5)
(Absorption an den Träger
aus porösem
Polystyrol, Chitosan oder zweiatomigen Erden)
US 4303650 , die eine Prioritätsanmeldung
79JP-01306677 hat; (6) (Hydrophobe Wechselwirkungschromatographie)
Lee Haung et al. (1980), Blood, 56, 620–624); Wojchowski et al. (1987)
Biochim. et Biophys. 913, 170–178.
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Unter den vielen Techniken, die in
der wissenschaftlichen Literatur und der Patentliteratur für die Reinigung
von Erythropoietin berichtet werden, verwendet keine der vorstehend
erwähnten
Referenzen Heparinchromatographie. Die vorliegende Erfindung offenbart
daher einen neuen und vorteilhaften Reinigungsschritt bei der Reinigung
von Erythropoietinen.
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BESCHREIBUNG
DER ABBILDUNGEN
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1. Heparin-Sepharose®-Chromatographie von GA-EPO
Aus 4% Serum
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1 ist
ein Chromatogramm, das die Heparin-Sepharose® CL-6B-Fraktionierung vom Kulturüberstand
einer Zelllinie zeigt, die GA-EPO exprimiert. Die Zellen werden
als Verankerungs-abhängige
Kultur in einem Cell Cube (Costar) in einem 4% fötales Kälberserum enthaltenden Medium
vermehrt. Der ultragefilterte, diagefilterte Kulturüberstand,
der in Beispiel 1 beschrieben ist, wird bei pH 6,2 auf Heparin-Sepharose® CL-6B aufgetrennt
und der GA-EPO-Gehalt der Fraktionen wird mittels ELISA (_o_) bestimmt.
Die ___ Linie stellt die Absorption bei 280 nm dar. Die --- Linie
stellt den NaCl-Gradienten dar.
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2. Heparin-Sepharose®-Chromatographie von GA-EPO
Aus 2% Serum
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2 ist
ein Chromatogramm, das die Heparin-Sepharose® CL-6B-Fraktionierung von GA-EPO zeigt,
das vom Kulturüberstand
einer Zelllinie abgeleitet ist, die GA-EPO exprimiert. Die Zellen
werden als Verankerungs-abhängige
Kultur in einem CellCube (Costar) in einem 2% fötales Kälberserum enthaltenden Medium
vermehrt. Der ultragefilterte, diagefilterte Kulturüberstand
von Beispiel 2 wird bei pH 6,2 auf Heparin-Sepharose® CL-6B aufgetrennt
und der GA-EPO-Gehalt der Fraktionen wird mittels ELISA (_o_) bestimmt.
Die (___) Linie stellt die Absorption bei 280 nm dar. Die (---)
Linie stellt den NaCl-Gradienten dar.
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3. Heparin-Sepharose®-Chromatographie von GA-EPO
Aus serumfreiem Medium
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3 ist
ein Chromatogramm, das die Heparin-Sepharose® CL-6B-Fraktionierung von GA-EPO zeigt,
das vom Kulturüberstand
einer Zelllinie abgeleitet ist, die GA-EPO exprimiert. Die Zellen
werden in Suspension in Spinner-Flaschen in serumfreiem Medium vermehrt.
Der ultragefilterte, diagefilterte Kulturüberstand von Beispiel 3 wird
bei pH 6,2 auf Heparin-Sepharose® CL-6B
aufgetrennt und der GA-EPO-Gehalt der Fraktionen wird mittels ELISA (_o_)
bestimmt. Die (___) Linie stellt die Absorption bei 280 nm dar.
Die (---) Linie stellt den NaCl-Gradienten dar.
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4. Heparin-Sepharose® 6 Fast Flow-Chromatographie
von GA-EPO Aus 4% Serum
-
4 ist
ein Chromatogramm, das die Heparin-Sepharose® 6 Fast Flow-Fraktionierung von GA-EPO zeigt, das
vom Kulturüberstand
einer Zelllinie abgeleitet ist, die GA-EPO exprimiert. Die Zellen werden
als Verankerungs-abhängige
Kultur in einem Cell Cube (Costar) in einem 4% fötales Kälberserum enthaltenden Medium
vermehrt. Der ultragefilterte, diagefilterte Kulturüberstand
von Beispiel 4 wird bei pH 7,0 auf Heparin-Sepharose® 6 Fast Flow aufgetrennt und
der GA-EPO-Gehalt der Fraktionen wird mittels ELISA (_o_) bestimmt.
Die (___) Linie stellt die Absorption bei 280 nm dar. Die (---)
Linie stellt den NaCl-Gradienten dar.
-
5 HiTrap Heparinchromatographie von GA-EPO aus
2% Serum nach anfänglicher
Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie und hydrophobe Wechselwirkungschromatographie
-
5 ist
ein Chromatogramm, das die HiTrap Heparin® (Pharmacia)-Fraktionierung
von GA-EPO zeigt, das vom Kulturüberstand
einer Zelllinie abgeleitet ist, die GA-EPO exprimiert. Die Zellen werden
in Rollerflaschen in einem 2% Kälberserum enthaltenden
Kulturmedium vermehrt. Der anfänglichen
Fraktionierung durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung
von Pharmacia Streamline® DEAE
folgt eine hydrophober Wechselwirkungschromatographie auf Phenyl
Sepharose® Fast
Flow (Pharmacia) und Ionenaustauschchromatographie auf Q-Sepharose® Fast Flow
(Pharmacia). Das zum Teil gereinigte Material, das von dem Q-Sepharose®-Harz eluiert
wird, wird dialysiert und bei pH 6,2 auf HiTrap Heparin® aufgetrennt
und der GA-EPO-Gehalt der Fraktionen wird mittels ELISA (_o_) bestimmt.
Die (___) Linie stellt die Absorption bei 280 nm dar. Die (---)
Linie stellt den NaCl-Gradienten dar.
-
6 HiTrap Heparin®-Chromatographie von GA-EPO
aus 2% Serum nach anfänglicher
Reinigung durch hydrophobe Wechselwirkungschromatographie
-
6 ist
ein Chromatogramm, das die HiTrap Heparin® (Pharmacia)-Fraktionierung
von GA-EPO zeigt, das vom Kulturüberstand
einer Zelllinie abgeleitet ist, die GA-EPO exprimiert. Die Zellen werden
in Rollerflaschen in einem 2% Kälberserum enthaltenden
Kulturmedium vermehrt. Die anfänglichen
Fraktionierung ist durch hydrophobe Wechselwirkungschromatographie
auf Phenyl Sepharose® 6 Fast
Flow (Pharmacia). Das zum Teil gereinigte Material, das von diesem
Harz eluiert wird, wird dialysiert und bei pH 5,2 auf HiTrap Heparin® aufgetrennt und
der GA-EPO-Gehalt der Fraktionen wird mittels ELISA (_o_) bestimmt.
Die (___) Linie stellt die Absorption bei 280 nm dar. Die (---)
Linie stellt den NaCl-Gradienten dar.
-
7. HiTrap Heparinchromatographie von
Erythropoietin, das von CHO-Zellen abgeleitet ist
-
7 ist
ein Chromatogramm, das die HiTrap Heparin® (Pharmacia)-Fraktionierung
von Erythropoietin zeigt, das von Eierstockzellen vom chinesischen
Hamster (CHO) abgeleitet ist (R&D
Systems), das in diagefiltertes, nicht konditioniertes Medium gegeben
wurde, das 2 % Kälberserum
enthielt. Das versehene diagefilterte Medium wird bei pH 7,0 auf
HiTrap Heparin® aufgetrennt
und der Erythropoietin-Gehalt der Fraktionen wird mittels ELISA
(-_-) bestimmt. Die durchgehende Linie (-) stellt die Absorption
bei 280 nm dar. Die unterbrochene Linie (----) stellt den NaCl-Gradienten
dar.
-
BESCHREIBUNG
DER TABELLE
-
TABELLE 1. Heparinchromatographie:
Reinigungstabelle
-
Tabelle stellt einige der Daten zusammen, die
unter Verwendung der Heparinchromatographie als ein erster oder
folgender chromatographischer Schritt erhalten wurden. Die gezeigten
Beispiele umfassen einen weiten Bereich von Kulturbedingungen, einschließlich Verankerungs-abhängige und
Verankerungs-unabhängige
Zellen, und mit oder ohne fötalem
Kälberserum
oder Kälberserum
zu verschiedenen Konzentrationen in dem Medium. In ähnlicher Weise
zeigen die Beispiele einen weiten Bereich von chromatographischen
Bedingungen. In der Tabelle sind nacheinander die Beispiel # (Spalte
1), die Wachstumsbedingungen (Spalte 2), die Reinigungsbedingungen
(Spalte 3), die ELISA-Einheiten/mg
(die spezifische Aktivität
ist als EU/mg dargestellt; Spalte 4), das Vielfache der Reinigung
(Spalte 5) und Prozent (%) Ausbeute (Spalte 6) angegeben.
-
AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG
-
Erythropoietin reguliert das Wachstum
und die endgültige
Reifung von erythroiden Vorläuferzellen
zu reifen roten Blutzellen. Erythropoietin wird in der Niere von
erwachsenen Menschen, in erythroblastoiden Zellen und in fötalen Leberzellen
produziert. Patienten mit gestörter
Nierenfunktion haben eine verminderte Produktion von Erythropoietin,
was zu einer ernsthaften Anämie
führt.
Die Verwendung von gereinigtem natürlichem und rekombinantem Erythropoietin
ist eine wirksame Behandlung für
Patienten mit chronischer Anämie
(Canaud, B. (1990) Am. J. Kidney Dis. 15, 169–175; Faulds, D. et al. (1989),
Drugs 38, 863–899;
Winearles, C. G. et al. (1986) Lancet 1175–1178).
-
Erythropoietin besteht gegenwärtig wegen einer
komplexen Abfolge von posttranslationalen Modifikationen, insbesondere
Glycosylierung, aus einer großen
Anzahl von chemisch verschiedenen Arten. Die hier beschriebenen
Erythropoietine haben die beiden folgenden Eigenschaften gemeinsam:
(1) sie haben eine Aminosäuresequenz
die der vom menschlichen Erythropoietingen codierten ausreichend
gleicht; und (2) sie besitzen in vivo biologische Eigenschaften,
die ein erhöhte
Produktion von Reticulocyten und roten Blutzellen verursachen.
-
Wie vorstehend erwähnt sind
Erythropoietine aus menschlichem Urin und rekombinant von Säugerzellen
produzierte Glycoproteine, die eine reife Aminosäuresequenz von 165 Aminosäuren haben und
drei N-verknüpfte
und eine O-verknüpfte
Oligosaccharidketten enthalten. Die N-verknüpften Oligosaccharidketten
treten bei den Asparaginresten 24, 38 und 83 auf, während die
O-verknüpfte
Oligosaccharidkette am Serinrest 126 auftritt. Lai et al. J. Biol. Chem.
261, 3116 (1986); Broudy et al. Arch. Biochem. Biophys. 265, 329
(1988). Erythropoietin (EPO) hat ein offensichtliches Molekulargewicht,
das in Abhängigkeit
von den Bedingungen der Gelelektrophorese variiert (vgl. zum Beispiel
Broudy, V., et al., Arch of Biochem. Biophys. 265, 329–336 (1988); Krystal,
G., et al. Blood 67 (1), 71–79
(1986); Yanagi, H., et al., DNA 8 (6), 419–427 (1989). Das tatsächliche
Molekulargewicht variiert und erstreckt sich wegen der unterschiedlichen
Kohlenwasserstoffstrukturen, die an den Proteinteil des Molekülsgebunden sind, über einen
Bereich von Größen. Diese
Diversität
hängt zum
Teil von dem in vivo- oder in vitro-Zelltyp ab, der das Protein
produziert.
-
Die gereinigten Erythropoietine der
vorliegenden Erfindung können
jedes der bekannten Erythropoietine von biologischem und/oder pharmazeutischem
Interesse sein. Wie hier verwendet soll der Ausdruck "Erythropoietin" oder "Erythropoietinprodukt" umfassen (1) Erythropoietin,
das aus einer in vivo-Quelle isoliert wurde, zum Beispiel aus menschlichem
Urin, wie von Miyake, T. et al. (1977) J. Biol. Chem. 252 (15),
5558–5564
beschrieben, (2) das durch Aktivierung des Erythropoietingens in
vom Menschen abgeleitet Zellen produzierte, wie das in der WO 94/12650
beschriebene (auch als GA-EPO bezeichnet), (3) das durch die Einführung eines
Erythropoietingens in eine menschliche Wirtszelle produzierte, wie
von Yanagi, H., et al. (1989) DNA 8 (6), 419–427 beschrieben, und (4) das
durch die Einführung
eines Erythropoietingens in eine nicht-menschliche Wirtszelle produzierte,
wie beschreiben im US-Patent 4,703,008.
-
"Produzierende
Zellen" können Zellen
eukaryontischen Ursprungs sein, vorzugsweise von einem Wirbeltier,
und mehr bevorzugt von einem Säuger
und am meisten bevorzugt von einem Menschen. Produzierende Zellen
sind bei Züchtung
in einem geeigneten Medium in der Lage, die gewünschten Erythropoietine in
einer gewinnbaren Menge zu produzieren. Repräsentative Beispiele dieser
Zellen umfassen Fibroblasten, Keratinocyten, Epithelzellen, (z. B.
Brustepithelzellen, intestinale Epithelzellen), Endothelzellen,
Gliazellen, neurale Zellen, Zellen, die im Blut gefunden werden
(z. B. Lymphocyten, Knochenmarkszellen), Muskelzellen und Vorläufer dieser somatischen
Zellarten. Wie erwähnt
stammen diese Zellen mehr bevorzugt von einem Säuger (z. B. Maus, Ratte, Kaninchen,
Katze, Hund, Schwein, Kuh, Vogel, Schaf, Ziege, Pferd, Affe, Mensch)
und am meisten bevorzugt stammen sie vom Primaten oder Menschen.
Produzierende Zellen umfassen auch transfizierte primäre, sekundäre und immortalisierte
Zellen, die von einem Wirbeltier abstammen, insbesondere von einem
Säuger
und am meisten bevorzugt vom Primaten oder Menschen, transfiziert mit
exogenem genetischen Material, das direkt oder indirekt die Produktion
von gewinnbaren Mengen an Erythropoietin verursacht.
-
Das Verfahren der Heparinchromatographie der
vorliegenden Erfindung ist auf die Isolierung von Erythropoietin
aus "biologischen
Flüssigkeiten" gerichtet. Wie hier
verwendet umfaßt "biologische Flüssigkeiten" Erythropoietine,
die vom Inneren einer Zelle isoliert sind, wie aus dem Cytoplasma
oder aus Einschlußkörpern oder
Vacuolen, oder aus dem Medium isoliert, so wie wenn die Zelle das
Erythropoietin sezerniert. Die sezernierten Moleküle können aufgefunden
und dann aus einer biologischen Flüssigkeiten wie Blut, Milch,
Aszites oder Urin, oder einer Zellkulturflüssigkeit isoliert werden.
-
In den Fällen, in denen Zellen kultiviert
werden, wird das Erythropoietin in eine "Kulturflüssigkeit" sezerniert. Das Verfahren der Heparinchromatographie
für die
Isolierung von Erythropoietin ist insbesondere für die Gewinnung von Erythropoietin
geeignet, das in der Kulturflüssigkeit
einer Erythropoietin produzierenden Zelle enthalten ist. Wie hier
verwendet, ist der Ausdruck Kulturflüssigkeit vorzugsweise so gemeint,
dass er jede Flüssigkeit
bedeutet, die für kultivierte
Zellen verwendet wird oder davon abgeleitet ist, die in der Lage
sind, Erythropoietin zu produzieren.
-
Vorzugsweise wurde die biologische
Flüssigkeit
oder Kulturflüssigkeit,
die für
die Reinigung des Erythropoietins verwendet wird, von Zellen und
Zelltrümmern
mittels Filtration, Ultrafiltration, Zentrifugation oder anderen
Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt
sind, abgetrennt. Darüber
hinaus wird der Ausdruck "geklärte Flüssigkeit" verwendet, um eine
biologische Flüssigkeit
oder Kulturflüssigkeit
anzuzeigen, die von Zellen, Zelltrümmern oder Teilchenmaterie
mittels Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration oder ähnlichen
Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, abgetrennt wurden.
Da die Erythropoietinmoleküle
meistens aus einer geklärten
Flüssigkeit
gereinigt werden, ist es von Vorteil, die Zell- und Teilchentrümmer von dem
Medium abzutrennen, wenn es eine biologische Flüssigkeit oder Kulturflüssigkeit
ist. Das Verfahren kann durch eine Reihe von Schritten durchgeführt werden,
einschließlich
Zentrifugation und Filtration, einschließlich Ultrafiltration (Uf),
wie auf dem Fachgebiet bekannt ist. Der Ausdruck "geklärte Flüssigkeit" kann auch Erythropoietin
enthaltende Flüssigkeiten
umfassen, die vorher einem chromatographischen oder Reinigungsschritt
unterworfen wurden, bei dem die Zellen und Zelltrümmern ebenso
wie andere Zell- und Mediumverunreinigungen aus der Probe entfernt
wurden.
-
Es ist oft erwünscht, bei dem Medium, das Erythropoietin
enthält,
einen "Pufferaustausch" gegen einen normalen
Laborpuffer vorzunehmen. Ein solcher Schritt kann unabhängig als
ein getrennter Schritt oder in Verbindung mit anderen Schritten
vorgenommen werden. Ein "Pufferaustausch" kann mittels einer
Reihe von Verfahren durchgeführt
werden, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt
sind, einschließlich,
aber nicht beschränkt auf,
tangentiale Flußsysteme,
Hohlfasern, spirale Wundfilter oder ein gerührtes Zellsystem, oder mittels herkömmlicher
Chromatographie, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist. Ein mehr bevorzugtes
Verfahren, wie es hier verwendet wird, ist die Diafiltration (Df). Bei
solchen Fällen
ist die Membran vorzugsweise eine Polysulfonmembran oder eine regenerierte
Cellulosemembran der kommerziell erhältlichen Typen, z. B. von Millipore
oder Amicon Inc. Ebenfalls bevorzugt für die Verwendung bei einem
Filtrationsschritt sind diejenigen Membranen, die eine Ausschlußgrenze
von etwa 5.000 bis 100.000 Molekulargewicht haben, und mehr bevorzugt
eine Ausschlußgrenze von
etwa 10.000 bis 30.000 Molekulargewicht haben. Das Zurückgehaltene
wird dann gemäß Verfahren, die
auf dem Fachgebiet bekannt sind, gegebenenfalls einer Dialyse und/oder
Diafiltration unterzogen, vorzugsweise in demselben Puffer, der
einen pH zwischen 6 und 8 hat. Das Salz ist vorzugsweise mit 0 bis
200 mM vorhanden und noch mehr bevorzugt ist das Salz 0 bis 10 mM.
Der pH ist vorzugsweise von 4,9 bis 8,0, und mehr bevorzugt 5,9
bis 7,5 am meisten bevorzugt etwa pH 6,2 bis 7,0.
-
Im allgemeinen sind die hauptsächlich verunreinigenden
Proteine in Säugerzell-Kulturflüssigkeiten
von Serum abgeleitet oder dem Medium zugesetzte Proteine. Dies ist
zum Teil auf die Abhängigkeit vieler
Zellarten von der Anwesenheit einer signifikanten Menge an Serum
zurückzuführen. Kommerzielle Zellmedien
werden oft mit oder unter Zusatz von entweder Kälberserum, Rinderserum, fötalem Kälberserum
oder Serumalbumin oder anderen gereinigten oder teilweise gereinigten
Serumproteinen, wie Transferrin oder Kombinationen davon, erworben, von
denen das gewünschte
Protein gereinigt werden muß.
Deswegen ist es oft wünschenswert,
daß der erste
Schritt des Reinigungsverfahrens auf die Entfernung von Serumkomponenten
gerichtet ist.
-
Das Heparinchromatographieverfahren
ist nicht auf den ersten Schritt eines Reinigungsverfahren beschränkt. Es
ist an jedem Punkt eines mehrstufigen Verfahrens zum Einbau in ein
Reinigungsverfahren geeignet. Die Herstellung von teilweise gereinigten
Erythropoietinen durch jedes teilweise Fraktionierungsverfahren
oder chromatographische Verfahren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf,
Ionenaustausch, hydrophobe Wechselwirkung, Größenausschluß, Umkehrphase oder Affinität, kann
vor der Heparinchromatographie durchgeführt werden.
-
Ein "Heparinaffinitätsträger" betrifft jeden bekannten chromatographischen
Träger,
der Heparinmoleküle
trägt,
wobei das Heparin stabil an den Harzträger gebunden und für die Heparinchromatographie
verwendet wird. Heparinaffinitätsträger sind
bei einer Reihe von kommerziellen Lieferanten erhältlich. Kommerziell
erhältliche
Heparinaffinitätsträger umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf, Heparin-Sepharose® CL-6B,
Heparin-Sepharose® 6
Fast Flow, HiTrap Heparin® (Pharmacia);
Affigel Heparin® (BioRad);
Heparin Agarose®,
Heparin Sepharose® Typ
I und Typ II, Typ IIS, Typ IIS (Sigma); AF-Heparin Toyopearl 650®, Heparin-650M® (TosoHaas),
Cellufine Heparin® (Amicon);
Heparin Hyper D® (Biosepra); Heparin
Agarose 6xL® (Typen
I, II und III) (American International Chemical). Eine bevorzugte
feste Matrix ist auf Agarose-Basis, am meisten bevorzugt Sepharose® oder Sepharose®-Derivate
in der Form von Kügelchen.
Andere feste Matrices wie Cellulosen oder Polyacrylamide können auch
verwendet werden.
-
Die Heparinchromatographie kann entweder seriell
oder mittels Säulenelution
durchgeführt
werden. Vorzugsweise liegt der Heparinträger in einem Säulenchromatographiesystem
vor. Wenn er in einem Säulenchromatographiesystem
verwendet wird, wird der Heparinaffinitätsträger vorzugsweise zwischen 0°C und 30°C verwendet,
mehr bevorzugt zwischen 4°C
und 25°C
und am meisten bevorzugt bei etwa 4°C. Vorzugsweise wird das Heparinharz
im allgemeinen gemäß den Spezifikationen
des Herstellers äquilibriert,
präpariert
und gehalten (z. B. wird Heparin-Sepharose® CL-6B präpariert wie im Pharmacia Intruction
Manual 71-7078-00 beschrieben).
-
Die Bindung von Erythropoietinmolekülen an einen
Heparinträger
wird zuerst durch Äquilibrierung des
Trägers
in einem "Äquilibrierungspuffer" erreicht. Der "Äquilibrierungspuffer" ist der wäßrige Zustand, in
den der Träger
zur Bindung der Erythropoietinmoleküle gebracht wird, wenn er mit
einer biologischen Flüssigkeit
oder einer Kulturflüssigkeit
kontaktiert wird. Die Bindung von Erythropoietin an die Säule wird
etwa bei pH 4,9 bis 8,0 erreicht, und mehr bevorzugt etwa bei pH
5,9 bis 7,5, und am meisten bevorzugt etwa bei pH 6,2 bis 7,0. Eine
Reihe von Puffern sind geeignet für die Verwendung mit Heparinträgern. Bevorzugte
Puffer umfassen MES (2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure), Tris
(tris[Hydroxymethyl]aminomethan) oder Phosphat. Die bevorzugt gewählte Konzentration
für den Äquilibrierungspuffer
ist etwa 20 mM, mit einer bevorzugten Leitfähigkeit von etwa 2 mS/cm.
-
Vor der Elution von gebundenem Erythropoietin
von dem Heparinträger
können
Verunreinigungen durch Waschen der Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer oder mit
dem Äquilibrierungspuffer, der
zugesetzte Salze, Puffer enthält,
oder durch Veränderung
des Arbeits-pH, oder mittels Kombination davon, eluiert werden.
Zum Beispiel kann die Bindung des Erythropoietin bei pH 6,2 erfolgen
und einige Verunreinigungen können
ohne Verlust an Erythropoietin bei pH 7,4 eluiert werden. Eine Veränderung
des Puffersystems durch Manipulation seiner Komponenten kann somit
verwendet werden, um eine geeignete Reinigung der Erythropoietinmoleküle zu erreichen.
Zum Beispiel kann die Elution von Erythropoietin von dem Heparinträger durch
eine Erhöhung
der Salzkonzentration erreicht werden, die in dem Elutionspuffer
vorhanden ist. Bevorzugte Salze sind die Alkalihalogenide, und am
meisten bevorzugt ist die Verwendung von NaCl.
-
Gegebenfalls können die Puffer zur Äquilibrierung
oder zur Elution von Erythropoietin ein "anti-Absorptionsmittel" enthalten. Ein "anti-Absorptionsmittel" ist jede Substanz,
die die Absorption von Erythropoietin an Gefäßoberflächen oder an andere Proteine
oder an sich selbst (d. h. Aggregation) reduziert. Bevorzugte Beispiele
für anti-Absorptionsmittel
sind die Polyoxyethylen-Sorbitol-Derivate von Fettsäuren, die
als "Tween" bekannt sind, wobei "Tween 20®" (Polyoxyethylen-Sorbitol-Monolaurat)
das gegenwärtig
bevorzugte oberflächenaktive
Mittel ist. Das oberflächenaktive
Mittel wird, wenn anwesend, vorzugsweise mit einer Konzentration
von etwa 0,01 bis 0,5 % verwendet und mehr bevorzugt etwa 0,1% (Gew./Gew.)
-
Der vorliegende Heparinreinigungsschritt kann
in eine Gesamtreinigungsstrategie für Erythropoietin integriert
werden. Zum Beispiel kann der vorliegende Schritt mit herkömmlichen
chromatographischen Schritten, wie Ionenaustausch, Gelpermeationschromatographie
und Umkehrphasen-HPLC verwendet werden.
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Ionenaustauschschritte in Kombination
mit dem Heparinschritt (vor oder nach der Heparinchromatographie)
umfaßt
die Verwendung der Anionenaustauscher- oder Kationenaustauscherchromatographie.
Allgemein bekannte kommerziell verfügbare Anionenaustauscherträger, die
bei der Reinigung von Erythropoietin verwendet werden, tragen funktionelle quaternäre Ammoniumgruppen.
Bevorzugte Matrices zur Verwendung bei dem vorliegenden Verfahren sind
Matrices auf der Basis von Agarose oder Cellulose, wie mikrokristalline
Cellulose oder vernetzte Agarosen. Besonders bevorzugte sind auch
diejenigen Matrices, die funktionelle Diethylaminoethyl-, Triethylaminomethyl-
oder Trimethylaminomethylgruppen enthalten. Eine besonders bevorzugte
Anionenaustauschermatrix ist vernetzte Triethylaminomethyl-Agarose,
die kommerziell verfügbar
ist. z. B. Q-Sepharose Fast Flow® (Pharmacia).
Allgemein bekannte kommerziell verfügbare Kationenaustauscherträger, die
bei der Reinigung von Erythropoietin verwendet werden können, tragen
saure Funktionen, einschließlich
Carboxy- und Sulfonsäuren.
Matrices, die Kationenfunktionen enthalten, umfassen verschiedene
Formen von Cellulosen und Matrices auf der Basis von Polystyrol.
Zum Beispiel umfassen schwache Kationenaustauscher, die in dem Fachgebiet
bekannt sind, sind aber nicht beschränkt auf, Carboxymethyl-Cellulose®, Carboxymethyl-Sephadex® und Carboxymethyl-Sepharose®. Starke
Kationenaustauscher, die in dem Fachgebiet bekannt sind, umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf, sulfonierte Polystyrole (AG 50W®, Bio-Rex 70®), sulfonierte Cellulosen (SP-Sephadex®) und sulfonierte Sepharosen
(S-Sepharose®).
-
Der chromatographische Schritt unter
Einschluß diese
Matrices wird vorzugsweise als ein Schritt der Säulenchromatographie durchgeführt und kann
bei einer Temperatur zwischen 4° und
25° Celsius
durchgeführt
werden. Im allgemeinen wird zu einem Wasch- oder Elutionspuffer
ein Salz zugegeben, um die Ionenstärke des angewendeten oder Äquilibrierungspuffers
zu erhöhen.
Jedes der herkömmlich verwendeten
Salze kann zu diesem Zweck verwendet werden, wie vom Durchschnittsfachmann
auf dem Fachgebiet leicht bestimmt werden kann, wobei NaCl eines
der am häufigsten
und einfachsten verwendeten Salze ist.
-
Ein herkömmlicher Gelfitrationsschritt
kann ebenfalls in Kombination mit dem Schritt des Heparinverfahrens
verwendet werden. Repräsentative Beispiele
dieser Matrices sind mit Acrylamiden vernetzte Polydextrane, wie
zusammengesetzte hydrophile Gele, die durch kovalente Vernetzung
von Allyldextran mit N,N'-Methylenbisacrylamid,
und vernetzte Cellulosegele. Kommerziell erhältliche vernetzte Dextran-Acrylamide
sind unter dem Handelsnamen Sephacryl® bekannt und bei Pharmacia erhältlich. Ein
bevorzugtes Sephacryl®-Gel
ist Sephacryl S-200 HR®.
Beispiele für
vernetzte Cellulosegele sind die kommerziell erhältlichen vernetzten porösen Cellulosegele,
z. B. GLC 300® oder
GLC 1.000®,
die bei Amicon Inc. erhältlich
sind.
-
BEISPIELE
-
Die folgenden Beispiele sind nur
illustrativ und nicht gedacht, den Umfang der beanspruchten Erfindung
zu beschränken.
Das Ausgangsmaterial für
die Reinigung von Erythropoietinen kann von biologischen Flüssigkeiten
oder von Verankerungs-abhängigen
oder Verankerungs-unabhängigen
Zellen, die in jedem geeigneten Kulturmedium mit oder ohne Zugabe
verschiedener Mengen an Rinderserum oder einem anderen Serum oder
nicht von Serum abgeleiteten Komponenten gezüchtet worden sind, abgeleitet
sein. Das Ausgangsmaterial kann in einer Vielzahl von menschlichen
oder nicht-menschlichen Zellarten produziert werden. Beispiele für immortalisierte menschliche
Zelllinien, die für
die Produktion von Erythropoietin von Nutzen sind, umfassen, sind
aber nicht beschränkt
auf, HeLa-Zellen und Derivate von HeLa-Zellen (ATCC CCL 2, 2.1 und
2.2), MCF-7 Brustkrebszellen (ATCC HTB 22), K-562 Leukämiezellen
(ATCC CCL 243) KB Karzinomzellen (ATCC CCL 17), 2780AD Eierstockkarzinomzellen
(Van der Blick, A. M. et al., Cancer Res. 48: 5927–5932 (1988),
Raji-Zellen (ATCC CCL 86), Jurkat-Zellen (ATCC TIB 152) Namalwa-Zellen
(ATCC CRL 1432), HL-60-Zellen (ATCC CCL 240), WiDr-Zellen (ATCC CCL218),
HT1080-Zellen (ATCC CCL 121), Daudi-Zellen (ATCC CCL213), RPMI 8226-Zellen
(ATCC CCL 155), U-937-Zellen
(ATCC CRL 1593), Bowes Melanomzellen (ATCC CRL 9607), WI-38VA13
Sublinie 2R4-Zellen (ATCC CCL 75.1) und MOLT-4-Zellen (ATCC CRL
1582), ebenso wie Heterohybridomzellen, die mittels Fusion von menschlichen
Zellen und Zellen einer anderen Art produziert wurden. Sekundäre menschliche
Fibroblastenstämme
wie WI-38 (ATCC CCL 75) und MRC-5 (ATCC CCL 171) können verwendet
werden. Zusätzlich
können
primäre menschliche
Zellen für
die Produktion von Erythropoietin verwendet werden. Erythropoietin
kann durch die Aktivierung des Erythropoietingens in primären, sekundären oder
immortalisierten menschlichen Zellen produziert werden, im wesentlichen
wie in der WO 94/12650 beschrieben, oder durch Transfektion eines
Erythropoietingens in primäre,
sekundäre
oder immortalisierte Zellen menschlichen oder nicht-menschlichen
Ursprungs.
-
Die illustrativen Beispiele zeigen
die Vielseitigkeit der Heparinchromatographie als ein erster oder
ein folgender Reinigungsschritt. Die folgenden Beispiele zeigen
auch, daß die
Heparinchromatographie mit einer Vielzahl von kommerziellen Heparinharzen
gut arbeitet und zeigen auch die Verschiebung des Schritts von der
analytischen zur präparativen
Verwendung. Die Beispiele 1–6
und 8–9
werden unter Verwendung von GA-EPO durchgeführt, das von menschlichen Zellen
mit aktiviertem Gen isoliert und im wesentlichen wie in WO 94/12650
beschrieben, produziert ist. Beispiel 7 wird unter Verwendung von
Erythropoietin von einer kommerziell verfügbaren Quelle durchgeführt, wobei
das Erythropoietin durch Expression des menschlichen Erythropoietingens
nach Transfektion in CHO-Zellen produziert wurde.
-
BEISPIEL 1
-
Verwendung der Heparinchromatogrraphie
als ein erster chromatographischer Schritt bei einem Reinigungsverfahren
-
I.1. Ausgangsmaterial
-
Konditioniertes Medium, das 4% fötales Kälberserum
enthielt, wird von einer adhärenten menschlichen
Zelllinie, die GA-EPO exprimiert und in einem Cell Cube (Costar) vermehrt
wird, erhalten. Das Medium wird durch Zentrifugation geklärt, gefolgt
von Filtration durch eine Nalgene Filtereinheit mit 0,45 Mikron.
Die Ultrafiltration/Diafiltration (Uf/Df) wird unter Verwendung
des tangentialen Flußsystems
Pellicon (Millipore) durchgeführt,
das mit einer Ausschlußmembran
von Molekulargewicht 30.000 ausgestattet war. Der Äquilibrierungs-
und Dialysepuffer ist 20 mM MES, pH 6,2, der 0,5% Tween 20 enthält.
-
I.2. Heparinchromatographie
-
Die Heparinchromatographie wird unter
Verwendung von Pharmacia's
GradiFrac System bei 4°C durchgeführt. Eine
Säule von
280 ml (14 × 5
cm) von Heparin Sepharose® CL-6B
(Pharmacia) wird mit 20 mM MES, pH 6,2, das 0,1% Tween 20 enthält, mit
einer Flußrate
von 10 ml/Min. äquilibriert.
Die Probe wird mit einer P 50 Pumpe von Pharmacia mit 10 ml/Min.
auf die Säule
aufgebracht. Die Säule
wird dann mit Äquilibrierungspuffer
gewaschen, bis sich die Absorption bei 280 nm stabilisiert. Lose
gebundenes Protein wird durch Waschen mit einem Säulenvolumen
(280 ml) von 20 mM MES, pH 6,2, das 0,1% Tween 20 und 0,05 M NaCl
enthält,
eluiert, wobei Fraktionen von 12 ml gesammelt werden. Nach dem Waschen
folgen 2 Säulenvolumen
(580 ml) linearer Gradient von 0,05 M bis 0,35 M NaCl in 20 mM MES, pH
6,2, das 0,1% Tween 20 enthält,
dann wird gewaschen mit einem Säulenvolumen
von 0,35 M NaCl in 20 mM MES, pH 6,2, das 0,1% Tween 20 enthält. Der Elutionspuffer
wird dann für
ein halbes Säulenvolumen
(140 ml) auf 1,0 M NaCl in 20 mM MES, pH 6,2, das 0,1% Tween 20
enthält,
erhöht
und dann für
ein Säulenvolumen
(280 ml) bei diesem Puffer gehalten.
-
Gesamtprotein wird durch die Absorption
bei 280 nm festgestellt und die Salzkonzentration durch ein in-line
Leitfähigkeitsmeßgerät verfolgt
(1). Der Durchfluß und die
eluierten Fraktionen werden mittels ELISA (R & D Systems), SDS-PAGE und Western
Blot auf ihren Gehalt an GA-EPO analysiert.
-
Die Heparin Sepharose®-Säule wird
durch Anwendung von 560 ml 20 mM Tris-HCl, pH 9,0, das 4 M Harnstoff
und 1,4 M NaCl enthält,
regeneriert, gefolgt von Waschen mit Äquilibrierungspuffer, bis die Leitfähigkeit
und der pH des Säulenausflusses
dem des Äquilibrierungspuffers
entsprechen.
-
In einem Experiment wurden 89% des GA-EPO,
das auf die Heparinsäule
geladen wurde, in dem Elutionspool gewonnen. Die Verwendung dieser Säule resultierte
in einer Entfernung von 90% des verunreinigenden Proteins (Tabelle
1).
-
BEISPIEL 2
-
Verwendung der Heparinchromatographie
als ein erster chromatographischer Schritt bei einem Reinigungsverfahren
-
II.1. Ausgangsmaterial
-
Konditioniertes Medium, das 2% fötales Kälberserum
enthielt, wird von einer adhärenten menschlichen
Zelllinie, die GA-EPO exprimiert und in einem Cell Cube (Costar)
vermehrt wird, erhalten. Das Medium wird durch Zentrifugation geklärt, gefolgt
von Filtration durch eine Nalgene Filtereinheit mit 0,45 Mikron.
Die Ultrafiltration/Diafiltration wird unter Verwendung des tangentialen
Flußsystems Pellicon
(Millipore) durchgeführt,
das mit einer Ausschlußmembran
von Molekulargewicht 30.000 ausgestattet war. Der Äquilibrierungs-
und Dialysepuffer ist 20 mM MES, pH 6,2, der 0,5% Tween 20 enthält.
-
II.2. Heparinchromatographie
-
Die Heparinchromatographie wird unter
Verwendung von Pharmacia's
GradiFrac System bei 4°C durchgeführt. Eine
Säule von
280 ml (14 × 5
cm) von Heparin Sepharose® CL-6B
(Pharmacia) wird mit 20 mM MES, pH 6,2, das 0,1% Tween 20 enthält, mit
einer Flußrate
von 10 ml/Min. äquilibriert.
Die Probe wird mit einer P 50 Pumpe von Pharmacia mit 10 ml/Min.
auf die Säule
aufgebracht. Die Säule
wird dann mit Äquilibrierungspuffer
gewaschen, bis sich die Absorption bei 280 nm stabilisiert. Lose
gebundenes Protein wird durch Waschen mit einem Säulenvolumen
(280 ml) von 20 nM MES, pH 6,2, das 0,1% Tween 20 und 0,05 M NaCl
enthält,
eluiert, wobei Fraktionen von 12 ml gesammelt werden. Nach dem Waschen
folgen 2 Säulenvolumen
(580 ml) linearer Gradient von 0,05 M bis 0,35 M NaCl in 0,02 M
MES, pH 6,2, das 0,1% Tween 20 enthält, dann wird gewaschen mit
einem Säulenvolumen
(280 ml) von 0,35 M NaCl in 0,02 M MES, pH 6,2, das 0,1% Tween 20
enthält.
Das NaCl in dem Elutionspuffer wird dann für ein halbes Säulenvolumen
(140 ml) auf 1,0 M erhöht
und dann für
ein Säulenvolumen
(280 ml) bei diesem Puffer gehalten.
-
Gesamtprotein wird durch die Absorption
bei 280 nm festgestellt und die Salzkonzentration durch ein in-line
Leitfähigkeitsmeßgerät verfolgt
(2). Der Durchfluß und die
eluierten Fraktionen werden mittels ELISA (R & D Systems), SDS-PAGE und Western
Blot auf ihren Gehalt an GA-EPO analysiert.
-
Die Heparin-Säule wird durch Anwendung von
560 ml 20 mM Tris-Cl, pH 9,0, das 4 M Harnstoff und 1,4 M NaCl enthält, regeneriert,
gefolgt von Äquilibrierungspuffer,
bis die Leitfähigkeit
und der pH des Säulenausflusses
dem des Äquilibrierungspuffers entsprechen.
-
In einem Experiment wurden 81% des GA-EPO,
das auf die Heparinsäule
geladen wurde, in dem Elutionspool gewonnen. Die Verwendung dieser Säule resultierte
in einer Entfernung von 86% des verunreinigenden Proteins (Tabelle
1).
-
BEISPIEL 3
-
Verwendung der Heparinchromatogrraphie
als ein erster chromatographischer Schritt bei einem Reinigungsverfahren
-
III.1. Ausgangsmaterial
-
Konditioniertes serumfreies Medium,
das von einer menschlichen Zelllinie erhalten wurde, die GA-EPO
exprimierte und in Suspension in Spinner-Flaschen vermehrt wurde,
wird mittels Zentrifugation geklärt,
gefolgt von Filtration durch eine Nalgene Filtereinheit von 0,45
Mikron. Ultrafiltration/Diafiltration wird unter Verwendung des
tangentialen Flußsystems
Minitan (Millipore) durchgeführt,
das mit einer Ausschlußmembran
vom Molekulargewicht 10.000 ausgestattet ist. Der Äquilibrierungs-
und Dialysepuffer ist 20 mM MES, pH 6,2, das 0,5% Tween 20 enthält.
-
III.2. Heparinchromatographie
-
Die Heparinchromatographie wird unter
Verwendung von Pharmacia's
FPLC System bei 25°C durchgeführt. Eine
Säule von
12 ml (6 × 1,6
cm) von Heparin Sepharose® CL-6B
(Pharmacia) wird mit 20 mM MES, pH 6,2, das 0,1% Tween 20 enthält, mit
1 ml/Min. äquilibriert.
Die auf die Säule
aufzubringende Probe wird mit 1 ml/Min. mit Superloop geladen. Die Säule wird
dann mit Äquilibrierungspuffer
gewaschen, bis sich die Absorption bei 280 nm stabilisiert. Als
nächstes
werden fünf
Säulenvolumen
(60 ml) eines linearen Gradienten von 0 bis 0,4 M NaCl in 0,02 M
MES, pH 6,2, das 0,1% Tween 20 enthält, aufgebracht, gefolgt von
einem Säulenvolumen
eines Gradienten bis 1,0 M NaCl in 0,02 M MES, pH 6,2, das 0,1%
Tween 20 enthält
und wird dann für
ein Säulenvolumen
in diesem Puffer gehalten.
-
Gesamtprotein wird durch die Absorption
bei 280 nm festgestellt. Der Durchfluß und die eluierten Fraktionen
werden mittels ELISA (R & D
Systems) (3), SDS-PAGE
und Western Blot auf ihren Gehalt an GA-EPO analysiert.
-
Die Heparin Sepharose®-Säule wird
durch Anwendung von 60 ml 20 mM Tris-HCl, pH 9,0, das 4 M Harnstoff
und 1,4 M NaCl enthält,
regeneriert, gefolgt von Waschen mit Äquilibrierungspuffer, bis die Leitfähigkeit
und der pH des Säulenausflusses
dem des Äquilibrierungspuffers
entsprechen.
-
In einem Experiment wurden 90% des GA-EPO,
das auf die Heparinsäule
geladen wurde, in dem Elutionspool gewonnen. Die Verwendung dieser Säule resultierte
in einer Entfernung von 97% des verunreinigenden Proteins (Tabelle
1).
-
BEISPIEL 4
-
Verwendung der Heparinchromatographie
als ein erster chromatographischer Schritt bei einem Reinigungsverfahren
-
IV.1. Ausgangsmaterial
-
Konditioniertes Medium, das 4% fötales Kälberserum
enthält,
wird von einer adhärenten menschlichen
Zelllinie, die GA-EPO exprimiert und in einem Cell Cube (Costar)
vermehrt wird, erhalten. Das Medium wird durch Zentrifugation geklärt, gefolgt
von Filtration durch eine Nalgene Filtereinheit mit 0,45 Mikron.
Der Pufferaustausch wird durch Dialyse übernacht (Membran mit einem
Molekulargewichtsausschluß von
12.000 bis 14.000) gegen 20 mM Tris, pH 7,0, das 0,1% Tween 20 enthält, durchgeführt.
-
IV.2. Heparinchromatographie
-
Die Heparinchromatographie wird unter
Verwendung von Pharmacia's
FPLC System bei 25°C durchgeführt. Eine
Säule von
10 ml (5 × 1,6
cm) von Heparin Sepharose® 6
Fast Flow (Pharmacia) wird mit 20 mM Tris, pH 7,0, das 0,1% Tween
20 enthält, mit
4 ml/Min. äquilibriert.
Die Probe wird mit 4 ml/Min. auf die Säule aufgebracht. Die Säule wird
dann mit Äquilibrierungspuffer
gewaschen, bis sich die Absorption bei 280 nm stabilisiert. Dem
Waschen folgen 10 Säulenvolumen
(100 ml) eines linearen Gradienten von 0 bis 0,35 M NaCl in 20 mM
Tris, pH 7,0, das 0,1% Tween 20 enthält. Der Elutionspuffer wird
dann für
5 ml erhöht
auf 1,0 M NaCl in 20 mM Tris, pH 7,0, das 0,1% Tween 20 enthält und wird
dann für
zwei Säulenvolumen
(20 ml) in diesem Puffer gehalten.
-
Gesamtprotein wird durch die Absorption
bei 280 nm festgestellt. Der Durchfluß und die eluierten Fraktionen
werden mittels ELISA (R & D
Systems) (4), SDS-PAGE
und Western Blot auf ihren Gehalt an GA-EPO analysiert.
-
In einem Experiment wurden 89% des GA-EPO,
das auf die Heparinsäule
geladen wurde, in dem Elutionspool gewonnen. Die Verwendung dieser Säule resultierte
in einer Entfernung von 93% des verunreinigenden Proteins (Tabelle
1).
-
Die Heparin Sepharose® 6 Fast Flow-Säule wird
durch Waschen mit 20 ml 0,1 N NaOH regeneriert, gefolgt von Waschen
mit Äquilibrierungspuffer, bis
die Leitfähigkeit
und der pH des Säulenausflusses dem
des Äquilibrierungspuffers
entsprechen.
-
BEISPIEL 5
-
Verwendun
der Heparinchromatographie als Zwischenschritt bei einem Reinigungsverfahren
-
V.1. Ausgangsmaterial
-
Konditioniertes Medium (400 ml),
das 2% fötales
Kälberserum
enthält,
wird von einer adhärenten menschlichen
Zelllinie, die GA-EPO exprimiert und in Rollerflaschen vermehrt wird,
erhalten und wird durch Zentrifugation geklärt, gefolgt von Filtration durch
eine Nalgene Filtereinheit mit 0,45 Mikron. Das Material wird mit
Wasser 4-fach verdünnt
und auf eine Streamline® DEAE-Säule von
Pharmacia mit 100 ml geladen, die mit 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, äquilibriert
ist. Nach Waschen mit 2 Litern Äquilibrierungspuffer
wird GA-EPO schrittweise mit 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, eluiert, das
1 M NaCl enthält.
Das eluierte Material wird gesammelt, auf 3 M NaCl eingestellt und
auf eine Phenyl Sepharose® 6
Fast Flow-Säule
von Pharmacia mit 100 ml aufgebracht, die mit phosphatgepufferter
Salzlösung
(Dulbecco) äquilibriert
war, die zusätzlich
3 M NaCl enthielt. Nach Waschen mit phosphatgepufferter Salzlösung, die
zusätzlich
0,5 M NaCl enthielt, wird das GA-EPO mit 10 mM NaOH, pH 12, das
20% Propylenglycol und 4 M Harnstoff enthielt, eluiert. Der Elutionpool wird
gegen 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, das 0,05% Tween 20 enthält, dialysiert
und dann auf eine Q-Sepharose® Fast
Flow-Säule
von 20 ml aufgebracht, die mit demselben Puffer äquilibriert war. Das GA-EPO wird unter Verwendung
von 10 Säulenvolumen
Gradient von 0 bis 1,0 M NaCl in dem Äquilibrierungspuffer eluiert.
Die GA-EPO enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und gegen 20
mM MES, pH 6,2, das 0,05% Tween 20 enthält, dialysiert.
-
V.2. Heparinchromatographie
-
Zwei vorgepackte 1 ml Säulen von
Pharmacia HiTrap Heparin® werden
im Tandem verbunden und mit 20 mM MES, pH 6,2, das 0,05% Tween 20 enthält, äquilibriert.
Das dialysierte Material von der Q-Sepharose® Fast Flow-Säule wird auf die HiTrap Heparin® im Tandem
geladen. Die Säulen
werden dann mit Äquilibrierungspuffer
gewaschen, bis sich die Absorption bei 280 nm stabilisiert. Dem
Waschen folgen 30 Säulenvolumen
(60 ml) eines linearen Gradienten von 0 bis 0,6 M NaCl in 0,02 M
MES, pH 6,2, das 0,05% Tween 20 enthält.
-
Gesamtprotein wird durch die Absorption
bei 280 nm festgestellt. Der Durchfluß und die eluierten Fraktionen
werden mittels ELISA (R & D
Systems) (5), SDS-PAGE
und Western Blot auf ihren Gehalt an GA-EPO analysiert.
-
In einem Experiment wurden 88% des GA-EPO,
das auf die Heparinsäule
geladen wurde, in dem Elutionspool gewonnen. Die Verwendung dieser Säule resultierte
in einer Entfernung von 78% des verunreinigenden Proteins (Tabelle
1).
-
BEISPIEL 6
-
Verwendung der Heparinchromatographie
als Zwischenschritt bei einem Reinigungsverfahren
-
VI.1. Ausgangsmaterial
-
Konditioniertes Medium (602 ml),
das 2% Kälberserum
enthält,
wird von einer adhärenten menschlichen
Zelllinie, die GA-EPO exprimiert und in Rollerflaschen vermehrt
wird, erhalten und wird durch Zentrifugation geklärt, gefolgt
von Filtration durch eine Nalgene Filtereinheit mit 0,45 Mikron.
Das Material wird auf 3 M NaCl eingestellt und auf eine Phenyl Sepharose® 6 Fast Flow-Säule von
Pharmacia mit 100 ml aufgebracht, die mit phosphatgepufferter Salzlösung (Dulbecco) äquilibriert
war, die zusätzlich
3 M NaCl enthielt. Nach Waschen mit phosphatgepufferter Salzlösung (Dulbecco),
die zusätzlich
0,5 M NaCl enthielt, gefolgt von Waschen mit 20 mM Tris, pH 8,0,
wird das GA-EPO mit 10 mM NaOH, pH 12, das 20% Propylenglycol und
4 M Harnstoff enthielt, eluiert. Die GA-EPO enthaltenden Fraktionen
werden gesammelt und gegen 20 mM MES, pH 5,2, das 0,05% Tween 20
enthält,
dialysiert.
-
VI.2. Heparinchromatographie
-
Zwei vorgepackte 1 ml Säulen von
HiTrap Heparin® (Pharmacia)
werden im Tandem verbunden und mit 20 mM MES, pH 5,2, das 0,05%
Tween 20 enthält, äquilibriert.
Das dialysierte Material von der Phenyl Sepharose® Fast Flow-Säule wird
auf die HiTrap Heparin®-Säulen im
Tandem geladen. Die Säulen
werden dann mit Äquilibrierungspuffer
gewaschen, bis sich die Absorption bei 280 nm stabilisiert. Dem
Waschen folgen 30 Säulenvolumen
(60 ml) eines linearen Gradienten von 0 bis 1 M NaCl in 0,02 M MES,
pH 5,2, das 0,05% Tween 20 enthält.
-
Gesamtprotein wird durch die Absorption
bei 280 nm festgestellt. Der Durchfluß und die eluierten Fraktionen
werden mittels ELISA (R & D
Systems) (6), SDS-PAGE
und Western Blot auf ihren Gehalt an GA-EPO analysiert.
-
In einem Experiment wurden 79% des GA-EPO,
das auf die HiTrap®-Säulen geladen
wurde, in dem Elutionspool gewonnen. Die Verwendung dieser Säule resultierte
in einer Entfernung von 82% des verunreinigenden Proteins (Tabelle
1).
-
BEISPIEL 7
-
Reinigung von Erythropoietin,
das durch die Expression des menschlichen Erythropoietingens in CHO-Zellen
produziert wird: Verwendung der Heparinchromatographie als ein erster
chromatographischer Schritt bei einem Reinigungsverfahren
-
VII.1 Ausgangsmaterial
-
Kommerziell verfügbares Erythropoietin, das durch
die Expression des menschlichen Erythropoietingens in CHO-Zellen
produziert wird, wurde zu diafiltriertem, nicht konditioniertem
Kulturmedium zugegeben und wie folgt der Reinigung durch die Heparinchromatographie
unterzogen:
Bei nicht konditioniertem Medium (10 ml), das 2% Kälberserum
enthält,
wird ein Pufferaustausch gegen 20 mM Tris-Cl, pH 7,0, das 0,1% Tween
20 enthält, unter
Verwendung CentriPrep 30-Einheit (Amicon) vorgenommen, bis die Leitfähigkeit
2,2 mmho ist. Das letztliche Retentat (etwa 10 ml) wird mit Wasser auf
18 ml verdünnt,
um eine Leitfähigkeit
von 1,6 mmho zu erreichen. Eine Ampulle (500 in von von CHO-Zellen
abgeleitetem Erythropoietin (R&D
Systems, Gewebekulturgrad) wird in 100 μl Wasser gelöst und zu 0,9 ml verdünntem Medium
nach Pufferaustausch zugegeben, dann durch ein Acrodisc 0,1 μm Filter
(Gelman) gefiltert.
-
VII.2. Heparinchromatographie
-
Eine HiTrap Heparin®-Säule (Pharmacia)-Säule von
1 ml wird bei Raumtemperatur in 20 mM Tris-Cl, pH 7,0, das 0,1%
Tween 20 enthält, äquilibriert
(1 ml/Min.) Die Flußrate
ist 1 ml/Min., Fraktionen von 1 ml werden gesammelt und die Absorption bei
280 nm wird aufgezeichnet. Die filtrierte Probe (0,7 ml) wird auf
die Säule
aufgebracht, gefolgt von Waschen mit 10 Säulenvolumen Äquilibrierungspuffer.
Das Erythropoietin wird mit 15 Säulenvolumen Gradient
zu 20 mM Tris-Cl, pH 7,0 eluiert, der 0,4 M NaCl und 0,1% Tween 20
enthält.
Der Pool an Erythropoietin wird unter Verwendung einer Centricon-10-Einheit
(Amicon) auf 1,0 ml konzentriert. Die Erythropoietinkonzentration
wird mittels ELISA (R & D
Systems) bestimmt und die Konzentration an Gesamtprotein des Pools
an Erythropoietin wird mittels des BCA-Tests (Pierce) bestimmt.
-
In einem Experiment wurde im Wesentlichen das
gesamte Erythropoietin, das auf die Heparin HiTrap®-Säule aufgebracht
wurde, im Elutionspool gewonnen. Die Verwendung dieser Säule resultierte
in einer Entfernung von 91% des verunreinigenden Proteins (Tabelle
1).
-
BEISPIEL 8
-
Weitere Reinigung
von GA-EPO nach der Heparinchromatographie
-
Die folgenden Verfahren dienen als
Beispiele für
einige der vielen möglichen
Reinigungsschritte, die nach der Heparinchromatographie verwendet werden
können.
Die folgenden Beispiele sind nicht gedacht, um die Anzahl an anwendbaren
Schritten zu beschränken,
sondern dienen dazu, die Vielseitigkeit der Heparinchromatographie
als einen Schritt zu illustrieren, der mit einer Reihe von Reinigungsverfahren
von Nutzen und kompatibel ist.
-
VIII.1 Anionenaustauscherchromatographie
-
Eine Q Sepharose® Fast Flow (Pharmacia)-Säule von
25 ml wird mit Q Sepharose-Äquilibrierungspuffer
(20 mM Tris-Cl, pH 7,5, der 0,1% Tween 20 enthält) äquilibriert. Der GA-EPO-Pool,
der nach der Heparinchromatographie erhalten wird, wird gegen Q
Sepharose-Äquilibrierungspuffer
dialysiert und dann auf eine Q Sepharose®-Säule geladen. Die Säule wird
mit Q Sepharose-Äquilibrierungspuffer gewaschen,
bis sich die Absorption bei 280 nm stabilisiert. Das gebundene Protein
wird mit 20 mM Tris-Cl, pH 7,5, das 0,4 M NaCl und 0,1% Tween 20 enthält, eluiert.
-
Der mit 0,4 M NaCl eluierte Proteinpeak
wird mittels ELISA (R & D
Systems) auf GA-EPO und durch die Absorption bei 280 nm auf Gesamtprotein analysiert.
Die Durchfluß- und Waschfraktionen
werden auf ähnliche
Weise analysiert.
-
VIII.2 Kationenaustauscherchromatographie
-
Eine Mono S®-Säule (Pharmacia) von 25 ml wird
mit Mono S-Äquilibrierungspuffer
(20 mM Tris-Acetat, pH 4,5, der 0,1% Tween 20 enthält) äquilibriert.
Der GA-EPO-Pool, der nach der Heparinchromatographie erhalten wird,
wird gegen Mono S-Äquilibrierungspuffer
dialysiert und dann auf eine Mono S®-Säule geladen. Die Säule wird
mit Mono S-Äquilibrierungspuffer
gewaschen, bis sich die Absorption bei 280 nm stabilisiert. GA-EPO
wird mit einem pH-Gradienten von Mono S-Äquilibrierungspuffer bei pH
4,5 bis 20 mM Tris-Acetat,
pH 8,0, der 0,1% Tween 20 enthält,
eluiert.
-
Die eluierten Proteinpeakfraktionen
werden mittels ELISA (R & D
Systems) auf GA-EPO
und durch die Absorption bei 280 nm auf Gesamtprotein analysiert.
Die Durchfluß-
und Waschfraktionen werden auf ähnliche
Weise analysiert.
-
VIII.3. Hydrophobe Wechselwirkungschromatographie
-
Nach der Heparinchromatographie erhaltenes
GA-EPO wird auf 4 M in NaCl und durch die tropfenweise Zugabe von
1 N HCl auf pH 5,5 gebracht. Das Material wird auf eine Phenyl Sepharose® 6 Fast Flow-Substitutionssäule (Pharmacia)
von 50 ml geladen, die in 20 mM MES, pH 5,5, das 4 M NaCl enthält, äquilibriert
war. Nach Waschen mit fünf
Säulenvolumen Äquilibrierungspuffer,
um nicht gebundenes Material zu entfernen, wird das GA-EPO mit 20
mM Tris-Acetat-Puffer, pH 8,0, der 4 M Harnstoff und 20% Propylenglycol
enthält,
eluiert.
-
Die eluierten Proteinpeakfraktionen
werden mittels ELISA (R & D
Systems) auf GA-EPO
und durch die Absorption bei 280 nm auf Gesamtprotein analysiert.
Die Durchfluß-
und Waschfraktionen werden auf ähnliche
Weise analysiert.
-
VIII.4. Präparative
Gelelektrophorese
-
Nach der Heparinchromatographie erhaltenes
GA-EPO wird auf 2 ml konzentriert, wird 0,1 M an Dithiothreitol
und auf 0,1% an SDS gebracht und dann 1 Minute auf 100°C erhitzt.
Die Probe wird auf eine Präparative
Gelelektrophoresesäule
(BioRad) geladen, die unter Verwendung eines 12%-igen Acrylamid-Auflösungsgels,
wie im technischen Handbuch von BioRad beschrieben, hergestellt
wurde. Die eluierten Proteinpeakfraktionen werden mittels Western
Blot auf GA-EPO und durch die Absorption bei 280 nm auf Gesamtprotein
analysiert.
-
VIII.5. Affinitätschromatographie
unter Verwendung von immobilisierten monoclonalen Antikörpern gegen menschliches
EPO.
-
Das nach der Heparinchromatographie
erhaltene GA-EPO wird gegen Äquilibrierungspuffer (20
mM Tris-Cl, pH 8,0, der 0,2% Tween 20 enthält) dialysiert. Die Probe wird
auf eine Affinitätssäule von 0,25
ml (3M Emphase-Harz, Pierce, gewaschen mit Äquilibrierungspuffer) aufgebracht,
die 0,5 mg Antikörper
gegen menschliches EPO (Genzyme) enthält, die gemäß den Vorschriften des Herstellers
immobilisiert waren. Nach Waschen mit dem Äquilibrierungspuffer wird GA-EPO
mit 0,2 M Essigsäure,
pH 3,5, die 0,15 M NaCl enthält,
eluiert. Das eluierte Material wird in Fraktionen von 200 Mikrolitern
in Röhrchen gesammelt,
die 20 Mikroliter 1 M Tris, pH 8,0 und 2 Mikroliter Tween 20 enthalten.
Der eluierte Proteinpeak wird mittels ELISA (R & D Systems) auf GA-EPO und durch
die Absorption bei 280 nm auf Gesamtprotein analysiert.
-
BEISPIEL 9
-
Die Verwendung von Heparinchromatographieharzen
von verschiedenen Herstellern
-
Die Heparinchromatographie für die Reinigung
von Erythropoietin kann unter Verwendung von Heparinharzen von einer
Reihe von Herstellern durchgeführt
werden. Fünf
verschiedene Harze wurden ausgesucht, um die Bindungs- und Beladungskapazität von GA-EPO zu bewerten,
das von ultrafiltriertem/diafiltriertem Kulturmedium abgeleitet
war, das 2% fötales
Kälberserum
enthielt: (1 und 2) Heparin Agarose 6XL® Typ I und II von American International
Chemical (AIC); (3 und 4) Heparin Sepharose® C1-6B und Heparin Sepharose® 6 Fast Flow
von Pharmacia; und (5) Toyopearl AF-Heparin-650M® von TosoHaas.
-
Das Ausgangsmaterial und die verwendeten chromatographischen
Bedingungen waren wie in Beispiel 2 beschrieben, wobei von 1 ml
bis 7 ml Säulen
verwendet wurden. Für
alle getesteten Harze war die Ausbeute an GA-EPO mindestens 70%.
Es wurden keine signifikanten Unterschiede der Beladungskapazität zwischen
den verschiedenen Harzen beobachtet.
-
Analyseverfahren
-
ELISA:
-
Die Quantifizierung von Erythropoietin
kann einfach unter Verwendung eines Enzyme Linked Immunosorbent
Assays (ELISA) gemessen werden. Ein solcher kommerziell verfügbarer ELISA-Kit
für die Quantifizierung
von menschlichem Erythropoietin ist als ein Kit (Quantikine IVD)
von R&D Systems
Inc. verfügbar.
Ein anderer ELISA-Kit für
die Quantifizierung von Erythropoietin ist von Genzyme (Predicta Kit).
Im Wesentlichen werden die ELISA-Tests gemäß den Vorschriften des Herstellers
durchgeführt. In
einer anderen Ausführungsform
können
geeignete Antikörper,
die zur Erkennung von Erythropoietin entwickelt wurden, zu ähnlichen
ELISA-Systemen für Tests
auf vorhandene Mengen an Erythropoietin entwickelt werden.
-
Proteintest:
-
Die Quantifizierung von Proteinproben
ist im Fachgebiet gut bekannt. Solche Verfahren umfassen den Lowry-,
Bradford- und BCA-Proteintest. Kits zu Bestimmung der Menge an Protein
in einer Probe sind kommerziell verfügbar, wie das BCA-Proteintest-Reagensverfahren,
das von Pierce Chemical Co. produziert wird. Die Quantifizierung
von Protein kann auch mittels Spektrophotometrie bei 280 nm geschätzt werden,
wie dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt ist.
-
Spezifische Aktivität:
-
Die spezifische Aktivität von Proben
wird mittels der folgenden Formel berechnet: Spezifische Aktivität = Gesamte
Einheiten an GA-EPO mittels ELISA/mg Gesamtprotein mittels BCA-Test.
Eine gereinigte Präparation
von GA-EPO hat eine spezifische Aktivität von etwa 200.000 ELISA-Einheiten/mg
Gesamtprotein mittels BCA-Test. Die spezifische Aktivität unter
Verwendung des ELISA zur Quantifizierung der Einheiten an GA-EPO
ist nur indirekt mit der tatsächlichen
biologischen Aktivität
von GA-EPO gekoppelt. Ein Test, der im allgemeinen zur Bestimmung
der spezifischen in vivo-Aktivität
durchgeführt wird,
ist der exhypoxische polycythemische Maus-Biotest, wie dem Durchschnittsfachmann
auf dem Fachgebiet bekannt ist (solch ein Test kann die spezifische
Aktivität
als IU/mg bestimmen, wie dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet
bekannt ist).
-
SDS PAGE und
Western Blot
-
Die Proben werden für SDS-PAGE
vorbereitet und auf 10%- oder 12%-igen Polyacrylamidgelen analysiert,
wie auf dem Fachgebiet bekannt ist. Zum Beispiel sind Gele kommerziell
verfügbar
(z. B. BioRad) und Verfahren der Anwendung sind in den BioRad-Instruktionen Mini-Protean® II Dual
Slab Cell (gemäß dem Verfahren
von Laemmli, U. K. Nature 227, 680 (1970)) beschrieben. Coomassie
R-250 mit einer Konzentration von etwa 0,1% kann für die Färbung des
Gesamtproteins verwendet werden. Die Überführung von Proteinen auf eine
ImmobilonTM-P PVDF-Membran (Millipore) kann mit einer BioRad Mini
Trans-Blot® Elektrophorese-Transfer-Zelle
gemäß den Anweisungen
im Handbuch unter Verwendung von 12,5 mM Tris-Cl, pH 8,3, das 96
mM Glycin, 10% Methanol und 0,01% SDS enthält, durchgeführt werden.
Die Proteine werden 1 Stunde bei 100 V in einem BioRad Mini Trans-Blot®-Gerät überführt. Die Membran
kann 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Rotation oder übernacht
bei 4°C
mit 5% (Gew./Vol.) fettfreier Milch (Carnation) in TBS-Tween (20 mM Tris-Cl,
pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20) blockiert werden. Die Membran
kann dann kurz in TBS-Tween gewaschen werden und unter Rotation eine
Stunde bei Raumtemperatur in Kaninchen-anti-menschliches Erythropoietin
(R&D Systems)
inkubiert werden, das 1/1000 mit 2,5% (Gew./Vol.) fettfreier Milch
in TBS-Tween (Endkonzentration 1 μg/ml) verdünnt ist.
Die Membran wird intensiv gewaschen und nach einem Verfahren wie
der Chemilumineszenz unter Verwendung des Amersham ECLTM-Kits entwickelt
und einem Film ausgesetzt werden. Die Untergrenze des Nachweises
von GA-EPO mit dieser Technik ist etwa 10–20 ng (SDS-PAGE gefolgt von
Western Blot).
-
Wenn der Blot mit einem anderen Antikörper noch
einmal hybridisiert werden soll, kann die Membran mit 60 mM Tris-Cl,
pH 7,5, das 2% SDS enthält, 2
Stunden bei Raumtemperatur unter Rotation gesäubert werden. Der Blot wird
erneut mit Blockierungspuffer geblockt. Der neue primäre Antikörper wird
dann wie vorstehend beschrieben zugegeben. Zum Beispiel kann der
Nachweis für
Transferrin unter Verwendung eines Schaf-anti-menschlichen Transferrin-HRP-Konjugat-Antikörpers (Biodesign)
durchgeführt
werden. Für
den Nachweis von Rinderalbumin kann ein Schaf-anti-Rinderalbumin-HRP-Konjugat
(Bethyl Labs) verwendet werden. Die Blots können wie vorstehend beschrieben
gewaschen und entwickelt werden.