SK284315B6 - Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetínov - Google Patents

Abstract

Predložený vynález je zameraný na jednoduchý a účinný proces na získavanie erytropoetínov z biologických a kultivačných tekutín pomocou heparínovej chromatografie. Predložený vynález možno použiť na získanie výskumných a komerčných množstiev erytropoetínu.ŕ

Description

Predložený vynález sa týka jednoduchého a účinného procesu získavania erytropoetínov z biologických a kultivačných kvapalín pomocou heparínovej chromatografie. Predložený vynález možno použiť na získanie výskumných a komerčných množstiev erytropoetínov.

Doterajší stav techniky

Heparín je vysoko sulfatovaný glykozaminoglykán. Špecificky je heparín mukopolysacharidom pozostávajúcim z opakujúceho sa diméru 2-sulfátu kyseliny L-dipyranurónovej a 6 sulfátu 2-deoxy-2-sulfamino-D-glukopyranózy s rozmedzím molekulovej hmotnosti 5 000 až 30 000. Čistenie s využitím afinity heparinu k rôznym bielkovinám sa dosahuje kovalentným naviazaním heparinu na nosnú matricu, napr. Heparín Sepharose* CL-6B brómkyánovou metódou.

Heparínová chromatografia je založená na dvoch hlavných režimoch interakcie s bielkovinami: (1) ako afinitný ligand a (2) ako katex s vysokým obsahom aniónových síranových skupín. Pre jednotlivé bielkoviny však spočíva presná povaha interakcie s heparínom často v kombinácii afinitných a iónovýmenných interakcií a presnú povahu takých interakcií nemožno presne predpovedať.

Heparínová chromatografia sa používala na čistenie širokého spektra bielkovín (Affmity Chromatography, Principles and Methods; Pharmacia Publication 18-1022029): Sem patria enzýmy (bukvicové bunkové proteázy, lipoproteín lipáza, koagulačné enzýmy, superoxid dismutáza); inhibítory serínovej proteázy (antritrombín III, proteázové nexíny); rastové faktory (fíbroblastový rastový faktor, rastový faktor Schwannových buniek, rastový faktor endotelových buniek); mimobunkové matricové proteíny (fibronektín, vitronektín, laminín, trombospondín, kolagény); proteíny viažuce nukleové kyseliny (iniciačné faktory, reštrikčné endonukleázy, DNA ligáza, DNA a RNA polymeráza); hormonálne receptory (estrogénové a androgénové receptory) a lipoproteíny.

Erytropoetiny produkované bunkami cicavcov in vitro alebo in vivo sú glykoproteíny so zrelou sekvenciou 165 aminokyselín a obsahujúce tri oligosacharidové reťazce viazané cez dusík a jeden oligosacharidový reťazec viazaný cez kyslík. Oligosacharidové reťazce viazané cez dusík sa objavujú na asparagínových zvyškoch 24, 38 a 83, zatiaľ čo oligosacharidový reťazec viazaný cez kyslík sa vyskytuje na scrínovom zvyšku 126. Lai et al. J. Biol. Chem. 261, 3116 (1986); Broudy et al. Árch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988). 165-amiokyselinová kódovacia oblasť a spracovaná úvodná sekvencia erytropoetínu je známa čiastočne z izolácie genómových a cDNA klonov ľudského erytropoetínového génu. Jacobs et al. Náture 313, 806 (1985); Lin, F.K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 7580 (1985).

Izoláciou erytropoetínu sa zaoberá veľký počet vedeckých prác, patentov a patentových prihlášok. Stručné zhrnutie súvisiacich odkazov naznačuje, že na izoláciu erytropoetinu sa použilo široké spektrum chromatografických krokov. Nasledujúce uvedené odkazy sú výpisom zdrojov a postupov, ale nepokúšame sa podrobne opísať každý chromatografický stupeň. Okrem toho sú nasledujúce odkazy len pokusom o naznačenie stavu technológie ako celku a nemajú sa brať ako vyčerpávajúci zoznam všetkého, čo je v tejto oblasti známe.

Použitie aniónovej i katiónovej iónovýmennej chromatografie na čistenie erytropoetínov bolo opísané vo ve deckej literatúre: (1) (Mono Q’) Broudy, V.C. (1988) Árch, of Biochem. and Biophys. 265, 329-3366; (2) (DEAE Sephacel®) Ghanem, A. B. et al. (1994) Preparative Biochemistry 24, 127-142; Quelle, F W. et al. (1989) Blood, 74, 652-657; (3) (DEAE Agarose*) Miyake, T. et al. (1977) J. Biol. Chem 252, 5558-5564; (4) (S-Sepharose®) Fibi, M.R., et al (1991) Blood 77, 1203-1210; (5) (Sulfoethyl Sephadex®) Goldwasser, E. a Kung, C.K.H. (1971) PNAS 68, 697-698; a (6) (Sulfopropyl Sephadex®) Miyake, T. et al. (1977) J. Biol. Chem. 252, 5558-5564.

Osobitné použitie slabo bázických anexových živíc, ako napríklad DEAE, ako prvého chromatografického stupňa je dobre opísané v patentovej literatúre: (1) US 4397840 (Prioritná prihláška 81 JP-0034727); a (2) JP 56016496A (Prioritná prihláška 79JP-0092999). Použitie bázickejších anexových živíc na izoláciu erytropoetínových izoforiem pomocou Q-Sepharosc* je opísané v patentovej literatúre: (1) EP 4282267A2, W091058677 a EP 428267A (Priorita 89US-0421444). Použitie silných anexových živíc ako všeobecnej metódy na oddelenie žiadaných proteínov od nečistôt je publikované v patentovej literatúre: EP 313343A, EP 391934A a W08903840A (Prioritná prihláška 87US-0111886).

Afinitná chromatografia pomocou farbív Cibacron Blue bola opísaná vo vedeckej literatúre v čistení erytropoetínov: (1) (CM Affi-Gél Blue®) Kryštál, G. et al. (1984) Brit. J. of Hematology 58, 533-64; a (2) (CM Affi-Gél Blue*) Broudy, V. et al (1988), Árch of Biochem and Bioph, 265, 329336; (3) (CM Affi-Gél Blue®) Kryštál, G. et al. (1986), Blood, 67, 71-79; (4) (CM Affi- Gél Blue®) Yanagi, H., et al (1989), DNA, 8, 419-427); (5) (Blue Trisacryl M*) Fibi, M.R. et al (1991) Blood, 77, 1203-1210.

Použitie antrachinónov, ako napríklad farbív Cibacron Blue, je tiež známe v patentovej literatúre: (I) JP 59065021A (Prioritná prihláška 82JP-0174678); (2) (viazané karboxymetylové skupiny a Cibacron Blue F3GA® ako CM Affi-Gél Blue®) JPO1165393A (Prioritná prihláška 87JP-0324910).

Použitie chromatografie vylučovania veľkostných frakcií na čistenie erytropoetínov bolo opísané vo vedeckej a patentovej literatúre: (1) (TSK G3000SW®) Yanagi, H. et al. (1989) DNA 8, 419-427; (2) Fibi, M.R., et al. (1991) Blood 77, 1203-1210; (3) (Sephadex G-100*) Goto, M. et al. (1988) Biotechnology 6, 67-70; Yanagawa, S. et al. (1984) J. Biol. Chem. 259, 2707-2701; Miyake T. et al. (1977) J. Biol. Chem 252, 5558-5564; (4) JP 01165393A (Prioritná prihláška 87JP-0324910).

Použitie hydroxyapatitu na čistenie erytropoetínov bolo opísané vo vedeckej a patentovej literatúre: Kryštál, G. et al (1986) Blood 67, 71-79; Yanagi, H. et al. (1989) DNA 8, 419-427; (BioRad HPHT®) Goto, M. et al. (1988) Biotechnology 6, 67-70; (gél fosforečnanu vápenatého) Goldwasser, E. a Kung, C.K.H. (1971) PNAS 68, 697-698; (BioRad BioGcl HT®) Miyake, T. et al. (1977) J. Biol. Chem. 252, 5558-5564; JP 01165393A (Prioritná prihláška 87JP-0324910. Oddelenie nečistôt proteínov obsahujúcich iniciačné metioniny (Met-proteíny) pomocou hydroxyapatitu, obzvlášť v režime HPLC, alebo v kombinácii krokov, je udané v US 4798886, W08602068A, EP176299A a EP 239311A (Prioritná prihláška 84WO-JP00460, 86JP-0066399 a 87JP-0066940); US 5256769 a EP 176299B.

Všeobecné použitie imobilizovaných protilátok na imunoafinitnú chromatografiu erytropoetínov je známe vo vedeckej literatúre: Miyazaki, II. et al. (1988) J. of Immunological Methods, 113, 261 267; Goto, M. et al. (1988) Biotechnology 6, 67-70; Yanagawa, S. et al., (1984) Preparative Biochemistry 24, 127-142; Ghanem, A.B. et al.

SK 284315 Β6 (1994) Preparative Biochemistry 24, 127-142; Wojchowski, D.M. et al. (1987) Biochim. Biophys. Acta 913, 170-177.

Všeobecné použitie imobilizovaných protilátok na imunoafinitnú chromatografiu erytropoetínov je známe v patentovej literatúre: EP 249932A (Prioritná prihláška 86JP-0139142), a špecifickejšie pre erytropoetíny v US 4558006, US 5106760 a EP 116446B1 (Prioritná prihláška 83US-0463724; JP 56108798A (Prioritná prihláška 80JP-001 1685); JP 4117400A, JP 59116297A a JP 94089040B2 (Prioritná prihláška 82JP-0231539), JP 940866480B2, JP 04117400 A, US 4465624 (Prioritná prihláška 83JP-0026399), US 4831118 (Prioritná prihláška 87US-0083670), US 4568488 (Prioritná prihláška 84US-0570075) a US 4558005.

Použitie vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie s reverznou fázou (RP-HPLC) ako stupňa v celkovej purifikácii erytropoetínov je známe vo vedeckej i patentovej literatúre: (1) (DEAE-C4 RP-HPLC - Con A Agarose) Quelle, F. W. et al. (1989) Blood, 74, 652- 657; (2) (Blue Trisacryl M* - S-Sepharose® - C8 RP-HPLC - vylučovanie veľkostnej frakcie) Fibi, M.R., et al. (1991) Blood, 77, 1203-1210; (3) (RP-HPLC - chromatografia na molekulových sitách) JP 62036400A (Prioritná prihláška 85JP-0177337).

RP-HPLC bola opísaná aj ako konečný chromatografický stupeň vo vedeckej a patentovej literatúre: Jacobs, K. et al. (1989), Náture 313, 806-810; (katiónová výmenná chromatografia - RP-HPLC) Broudy, V. et al. (1988), Árch of Biochem and Bioph, 265, 329-336; Kryštál, G. et al. (1986), Blood, (DEAE-Agarose® - Sulphopropyl-Sephadex* - gélová filtrácia - hydroxyapatit - RP-HPLC) EP 209539B1 a US 5322837 (Prioritná prihláška 85US-0690853); US Patent 4,677,016, EP 228452A, WO 8607594A (Prioritná prihláška 86US-0872152).

Niekoľko dodatočných krokov na čistenie erytropoetínov je známych vo vedeckej a patentovej literatúre: (1) (Lektínová afmitná chromatografia) Kryštál, G. et al. (1986) Blood 67, 71-79 (Wheat Germ); Quelle, F.W. et al. (1989 Blood 74, 652-657; EP 358463A (Prioritná prihláška 88ZA-0006645) (2) (Chromatofokusing) Kryštál, G. et al. (1986) Blood, 67, 71-79. PBE94; (3) (Preparatívna SDSPAGE) Kryštál, G. et al (1986) Blood, 67, 71-79; a (4) (Metylovaný albumín - Kieselguhr); Goldwasser, E. a Kung, C.K.H. (1971 PNAS 68, 697-698; (5) (absorpcia na nosič porézneho polystyrénu, chitozan alebo kremelinu) US 4303650 s prioritnou prihláškou 79JP-01306677; (6) (Chromatografia hydrofóbnej interakcie) Lee Haung et al. (1980), Blood, 56, 620-624; Wojchowski et al. (1987) Biochim. et Biophys. 913,170-178.

Spomedzi rozsiahlych techník udávaných vo vedeckej a patentovej literatúre na čistenie erytropoetínu žiaden z uvedených odkazov nevyužíva heparínovú chromatografiu. Predložený vynález teda ponúka nový a výhodný purifikačný krok v čistení erytropoetínov.

Podstata vynálezu

Jedným z cieľov predloženého vynálezu je poskytnúť vhodný chromatografický krok v celkovej stratégii čistenia erytropoetínov. Sám osebe krok možno použiť heparínovú chromatografiu ako prvý alebo následný krok vo viacstupňovom postupe. Heparínová chromatografia poskytuje vhodný čistiaci krok na selektívne odstránenie znečistení, ktorý nie je reprodukovaný inými čistiacimi postupmi opísanými v najnovších technikách, a ponúka tým dôležitý alternatívny čistiaci krok pri príprave homogénnych erytro poetínov. Pôvod erytropoetínu môže byť z viacerých zdrojov vrátane organizmu (napr. ľudský urinámy erytropoetín), z kvapaliny bunkovej kultúry po zavedení neporušeného erytropoetínového génu do buniek cicavcov, alebo z kvapaliny bunkovej kultúry po aktivácii endogénneho erytropoetínového génu v ľudských bunkách.

Heparínová chromatografia podľa predloženého vynálezu je obzvlášť vhodná na zahrnutie do celkovej schémy čistenia s cieľom získať homogénne erytropoetínovc prípravky. Aby bol taký proces vo všeobecnosti komerčne praktický, musí pozostávať z postupnosti krokov, ktoré možno jednoducho aplikovať na väčšie množstvá s výťažkami, ktoré vyhovujú požiadavkám farmaceutickej výroby. Krok heparínovej chromatografie tu opísaný sa môže zakomponovať do schémy čistenia vo veľkom meradle s vysokou mierou získania erytropoetínov. Vlastnosťou predloženého vynálezu je možnosť zakomponovania heparínovej chromatografie buď ako prvého chromatografického stupňa v celkovej stratégii čistenia erytropoetínov, alebo ako následný krok na použitie v ktorejkoľvek polohe viacstupňového procesu.

Mnoho chromatografických postupov nie jc vhodných na použitie ako prvý chromatografický stupeň. Prvý chromatografický stupeň musí poskytnúť možnosť vyrovnať sa s veľkým množstvom živín a proteínov, ktoré sú spočiatku prítomné v biologickej alebo kultivačnej tekutine. Vhodný prvý chromatografický stupeň poskytuje primerané čistenie proteínu s vysokou mierou získania žiadaného proteínu a substituentov prostredia. Heparínová chromatografia napríklad slúžila ako vhodný prvý purifikačný krok nezávisle od kultivačných podmienok, ako sú napr. rast vo fermentačných reaktoroch alebo v bankách na trepačke, ako bunky závislé alebo nezávislé od ukotvenia, so sérovými proteínmi alebo bez nich. Zistilo sa, že tento stupeň heparínovej chromatografie vyhovuje týmto kritériám ako vhodný prvý stupeň v čistení erytropoetínov.

Heparínová chromatografia je tiež vhodná na zakomponovanie ako následný krok na ďalšie čistenie erytropoetínov po počiatočnej frakcionalizácii niekoľkými purifikačnými krokmi okrem iného iónovýmennou chromatografiou, hydrofóbnou interakciou, vylučovaním veľkostnej frakcie alebo afinitnou chromatografiou, frakcionáciou vyzrážaním soľou alebo alkoholom, preparatívnou gélovou elektroforézou alebo preparatívnym izoelektrickým fokusovaním. Zakomponovanie heparínovej chromatografie do celkovej purifikačnej schémy môže tiež zlepšiť efektívnosť nasledujúcich krokov čistenia selektívnym odstránením znečistení, ktoré sa nie celkom dobre odstraňujú nasledujúcimi purifikačnými krokmi.

Heparínová chromatografia ponúka užitočný purifikačný krok na získanie biologicky aktívnych erytropoetínov z biologických alebo kultivačných tekutín s vysokým výťažkom. Okrem toho možno heparínovú chromatografiu vykonávať aj výlučne s vodnými rozpúšťadlami, čo predstavuje ďalšiu výhodu, ktorú ocenia odborníci v tejto oblasti. Použitie len vodných rozpúšťadiel má výhodu v tom, že purifikačný stupeň možno navrhnúť tak, že proteín nie je vystavený denaturačným činidlám, organickým rozpúšťadlám alebo kyselinám, ktoré môžu mať nepriaznivý vplyv na získanie štrukturálne neporušeného a biologicky aktívneho proteínu. Okrem toho možno heparínovú chromatografiu vykonávať vo veľmi jemných podmienkach, napr. pri neutrálnom pH a/alebo pri nízkych koncentráciách soli. Táto vlastnosť je obzvlášť hodnotná v tom, že erytropoetín je citlivý na agregáciu alebo desialáciu pri nízkom alebo vysokom pH alebo pri vysokom alebo nízkom obsahu soli (Endo, Y., et al., J. of Biochem. 112,700-706(1992)). Táto technika teda poskytuje veľmi jemné vodné podmienky, ktoré zabraňujú strate biologickej aktivity počas chromatografie erytropoetínových molekúl.

Cieľ predloženého vynálezu sa týka chromatografického stupňa v čistení erytropoetínov, ktorý obsahuje: a) kontaktovanie biologickej tekutiny obsahujúcej erytropoetín s nosičom s heparínovou afinitou v podmienkach, kedy sa uvedené molekuly erytropoetinu viažu na uvedený nosič s heparínovou afinitou; b) elúcia uvedených erytropoetinových molekúl elučným tlmivým roztokom; a c) zachytávanie uvedeného erytropoetinu. Tento chromatografický stupeň možno použiť buď ako prvý chromatografický stupeň v čistení erytropoetinu, alebo ho zahrnúť do čistenia erytropoetínu vo viacstupňovom procese. Tento chromatografický stupeň je obzvlášť užitočný na odstránenie kontaminujúcich proteínov erytropoetínov, ako napríklad sérových proteínov, obzvlášť okrem iných sérových proteínov zo skupiny teľacieho séra, hovädzieho séra, fetálneho hovädzieho séra, sérového albumínu a transferínu. Rozsah predloženého vynálezu na čistenie erytropoetinu zahŕňa chromatografickú metódu, pri ktorej kontaktovanou biologickou tekutinou je kultivačná tekutina.

Predložený vynález sa týka aj heparinového chromatografického stupňa, ktorý možno zakomponovať v ktoromkoľvek bode do viacstupňového procesu v čistení erytropoetínov, ako napríklad okrem iného viacstupňového procesu, ktorý okrem toho obsahuje jeden alebo viac chromatografických stupňov zo skupiny iónovej výmeny, hydrofóbnej interakcie, vylučovania veľkostnej frakcie, chromatografie s reverznou fázou alebo afinitnej chromatografie.

Vynález sa ďalej týka chromatografického stupňa v čistení erytropoetínov, ktorý môže ďalej obsahovať vyčírenie kontaktovanej biologickej tekutiny napríklad okrem iného centrifugovaním. Biologické kvapaliny sa môžu nezávisle centrifugovať, filtrovať, ultrafiltrovať, dialyzovať alebo podrobiť kombinácii týchto postupov. Ultrafiltrácia biologickej tekutiny sa môže okrem iných uskutočniť na separačnej membráne pre frakciu molekulových hmotností 5 000 - 100 000. Filtrácia biologickej tekutiny sa môže uskutočniť okrem iných na 45 mikrónovej membráne.

Podľa predloženého vynálezu sa viazanie uvedených erytropoetínových molekúl môže uskutočniť okrem iného vo vyrovnávacom tlmivom roztoku. K takým tlmivým roztokom patria okrem iných tlmivý roztok 4-(2-hydroxyetyl)-l-pipcrazinoctán sulfónovej kyseliny, tris(hydroxymetyl)aminometán (Tris), alebo fosfátový tlmivý roztok alebo akýkoľvek iný tlmivý roztok, ktorý poskytuje vhodné tlmivé prostredie na viazanie erytropoetínov. Okrem toho viazanie uvedených erytropoetínových molekúl sa môže uskutočniť okrem iných pri hodnotách pH 4,9 až 8,0 výhodne pri pH 5,9 až 7,5 a výhodnejšie pri pH 6,2 alebo 7.

Okrem toho chromatografické kroky predloženého vynálezu zahŕňajú elúciu uvedených erytropoetínov menením elučného tlmivého roztoku, napríklad okrem iného zvyšovaním koncentrácie soli v tlmivom roztoku, vymývaním stĺpca ďalším tlmivým roztokom alebo zmenou pracovného pH elučného tlmivého roztoku. Koncentráciu soli elučného tlmivého roztoku možno nastaviť okrem iného prídavkom alkalických halogenidov ako napríklad chloridu sodného (NaCl). Ďalšia forma realizácie predloženého vynálezu zahŕňa pridanie antiadsorbentu do ktoréhokoľvek z tlmivých roztokov, ako je napríklad okrem iného Tween.

Chromatografické kroky predloženého vynálezu zahŕňajú ďalej výmenu tlmivého roztoku prostredia obsahujúceho erytropoetín, ako je napríklad okrem iného biologická tekutina alebo zozbieraná vzorka. Medzi také postupy výmeny tlmivého roztoku patrí okrem iného použitie tangen ciálnych prietokových systémov, duté vlákna, špirálové vinuté filtre, miešané bunkové systémy, dialýza, diafiltrácia, filtrácia alebo konvenčná chromatografia. Keď sa výmena tlmivého roztoku vykonáva dialýzou alebo diafiltráciou cez membránu, možno použiť napríklad okrem iného membránu pre molekulové hmotnosti 5 000 až 10 000 alebo 10 000 až 30 000. Výmenu tlmivého roztoku možno uskutočniť pri zvolenom pH a koncentráciách soli v tlmivom roztoku, ako sú napríklad okrem iných pH medzi 6 až 8, 5,9 až 7,5 a 6,2 až 7,0, a oproti tlmivému roztoku s 0 až 200 mM soli výhodne pre 0 až 10 mM soli.

Ďalšia forma realizácie predloženého vynálezu predpokladá použitie niekoľkých nosičov s heparínovou afinitou, ktoré sú komerčne dostupné, ako napríklad okrem iných Heparin Sepharose CL-GB®, Heparin Sepharose 6 Fast Flow*, HiTap Heparin*, Affigen Heparin®, Heparin Agaraosc’, Heparin Sepahrose®, Heparin Hyper D® a Heparin Agarose 6.XL®,

Opis vynálezu

Erytropoetín reguluje rast a konečné zretie erytroidných progenitomých buniek na zrelé červené krvinky. Erytropoetín sa produkuje v obličkách dospelých, erytroblastoidných bunkách a vo fetálnych pečeňových bunkách. Pacienti s narušenou renálnou funkciou majú zníženú produkciu erytropoetínu, čo vedie k ťažkej anémii. Použitie čisteného prírodného a rekombinantného erytropoetinu je účinnou liečbou pre pacientov s chronickou anémiou (Canaud, B. (1990), Am. J. Kidney Dis. 15, 169-175; Faulds, D. et al. (1989), Drugs 38, 863-899; Winearles, C. G. et al. (1986) Lancet 1175-1178).

Erytropoetín v skutočnosti pozostáva z obrovského množstva chemicky odlišných látok vzhľadom na zložité spektrum posttranslačných modifikácií, obzvlášť glykozylácie. Tu opísané erytropoetíny majú obe nasledujúce vlastností: (1) majú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá dostatočne pripomína sekvenciu kódovanú ľudským erytropoetínovým génom; a (2) majú biologické vlastnosti in vivo, ktoré spôsobujú nárast produkcie retikulocytov a červených krviniek.

Ako už bolo uvedené, rekombinantné erytropoetíny získavané z ľudského moču a buniek cicavcov sú glykoproteínmi so zrelou aminokyselinovou sekvenciou 165 aminokyselín a obsahujúce tri oligosacharidové reťazce viazané cez dusík a jeden oligosacharidový reťazec viazaný cez kyslík. Oligosacharidové reťazce viazané cez dusík sa objavujú na asparagínových zvyškoch 24, 38 a 83, zatiaľ čo oligosacharidový reťazec sa vyskytuje na serínovom zvyšku 126. Lai et al, J. Biol. Chem. 261, 3116 (1986); Broudy et al. Árch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988). Erytropoetín má zdanlivú molekulovú hmotnosť, ktorá sa mení v závislosti od elektroforetických podmienok (pozrite napríklad Brody, V., et al. Árch of Biochem Biophys. 265, 329336 (1998); Kryštál, G., et al. Blood 67(1), 71-79 (1986); Yanagi, H., et al., DNA 8(6), 419-427 (1989). Skutočná molekulová hmotnosť je variabilná a pokrýva spektrum veľkostí vďaka radu uhľohydrátových štruktúr pripojených na proteínovú časť molekuly. Táto rôznorodosť je čiastočne závislá od bunkového typu in vivo alebo in vitro produkujúcom proteín.

Čistené erytropoetíny podľa predloženého vynálezu môžu byť ktorékoľvek zo známych erytropoetínov zaujímavých z biologického a/alebo farmaceutického hľadiska. Pojem erytropoetín tak, ako sa používa tu, zahŕňa (1) erytropoetín izolovaný zo zdroja in vivo, napríklad z ľudského

SK 284315 Β6 moču, ako to opisuje Miyake, T. et al. (1977) J. Biol. Chem. 252, 5558-5564, (2) erytropoetín produkovaný aktiváciou erytropoetínového génu v bunkách získaných z človeka, ako je napríklad opísané vo WO 94/12650 (tiež označovaný ako GA-EPO), (3) erytropoetín produkovaný zavedením erytropoetínového génu do ľudskej hostiteľskej bunky, ako to opisuje napríklad Yanagi, H., et al (1989), DNA, 8(6), 419-427 a (4) erytropoetín produkovaný zavedením erytropoetínového génu do nehumánnej hostiteľskej bunky, ako to opisuje napríklad US patent 4,703,008.

“Produkčné bunky” môžu byť bunkami eukaryotického pôvodu s preferenciou pre stavovce, s vyššou preferenciou pre cicavce a vôbec najlepšie ľudského pôvodu. Produkčné bunky sú schopné pri kultivácii vo vhodnom médiu produkovať žiadaný erytropoetín v získavateľných množstvách. Medzi reprezentatívne príklady týchto buniek patria fíbroblasty, keratinocyty, epitelové bunky (napr. prsné epitelové bunky, intestínálne epitelové bunky), endotelové bunky, gliálne bunky, neurálne bunky, bunky nachádzajúce sa v krvi (napr. lymfocyty, bunky kostnej drene), svalové bunky, a prekurzory týchto somatických bunkových typov. Ako bolo uvedené, uprednostňujú sa bunky cicavcov (napr. myš, potkan, králik, mačka, pes, sviňa, krava, vták, ovca, kôň, opica, človek) a najviac sa uprednostňuje pôvod u primátov alebo ľudský pôvod. Medzi produkčné bunky patria aj imortalizované bunky stavovcov, obzvlášť cicavcov a najviac bunky primátov alebo ľudské bunky transfikované s exogénnym genetickým materiálom, ktorý priamo alebo nepriamo spôsobuje, že bunky produkujú získavateľné množstvá erytropoetínu.

Heparínový chromatografický postup podľa predloženého vynálezu je zameraný na izoláciu erytropoetínu z “biologických tekutín”. “Biologické tekutiny” tak, ako sa tu používajú, obsahujú erytropoetíny izolované zvnútra bunky, ako napríklad z cytoplazmy alebo z inklúzií, alebo vakuol, alebo izolované z média, ako napríklad keď bunka vylučuje erytropoetín. Vylúčené molekuly možno nájsť a potom izolovať z biologickej tekutiny ako napríklad krv, mlieko, ascites alebo moč, alebo kvapalina bunkovej kultúryKeď sa bunky kultivujú, erytropoetín sa vylučuje do “kultivačnej kvapaliny”. Postup heparinovej chromatografie na izoláciu erytropoetínu je obzvlášť vhodný na získavanie erytropoetínu z kultivačnej tekutiny buniek produkujúcich erytropoetín. Pojem kultivačná tekutina tak, ako sa používa tu, sa týka akejkoľvek tekutiny používanej alebo získanej z kultivovaných buniek schopných produkovať erytropoetin.

Biologická alebo kultivačná kvapalina používaná na čistenie erytropoetínu sa oddelí od buniek a ich zvyškov filtráciou, ultrafiltráciou, centrifugovaním alebo inými technikami známymi pre odborníkov v tejto oblasti. Termín „vyčirená kvapalina“ sa používa na označenie biologickej alebo kultivačnej kvapaliny, ktorá bola oddelená od buniek, zvyškov buniek alebo časticových materiálov centrifugovaním, filtráciou, ultrafiltráciou alebo podobnou technikou známou v danej oblasti. Keďže molekuly erytropoetínu sa najčastejšie získavajú z „vyčírenej kvapaliny“, je vhodné oddeliť bunky a časticový materiál z média bez ohľadu na to, či ide o biologickú alebo kultivačnú tekutinu. Tento proces možno uskutočniť niekoľkými krokmi vrátane centrifugovania a filtrácie vrátane ultrafiltrácie (Uf) známymi v danej oblasti. Pojem „vyčirená kvapalina“ môže zahŕňať aj kvapaliny obsahujúce erytropoetín, ktoré boli podrobené predchádzajúcemu chromatografickému alebo purifikačnému stupňu, v ktorom sa zo vzorky odstránili bunky, ich zvyšky ako aj iné kontaminanty buniek a prostredia.

Je často žiaduce uskutočniť „výmenu tlmivého roztoku“ média obsahujúceho erytropoetín známym laboratórnym tlmivým roztokom. Taký krok možno uskutočniť nezávisle ako osobitný krok alebo v spojení s inými krokmi. „Výmena tlmivého roztoku“ sa môže uskutočniť niekoľkými postupmi známymi pre odborníkov z tejto oblasti vrátane okrem iného tangenciálnymi prúdovými systémami, dutými vláknami, špirálovo vinutými filtrami alebo miešanými bunkovými systémami, alebo konvenčnou chromatografiou tak, ako je známa v tejto oblasti. Uprednostňuje sa proces, ktorý sa tu používa a ktorým je diafiltrácia (Df). V takých prípadoch je membránou najvhodnejšie polysulfónová membrána alebo regenerovaná celulózová membrána komerčne dostupného typu, napríklad od Millipore alebo Amicon Inc. Na použitie vo filtračnom stupni sa preferujú aj membrány pre frakciu molekulových hmotností 5 000 až 100 000 s preferenciou pre interval molekulových hmotností asi 10 000 až 30 000. Retentát sa potom môže podrobiť dialýze alebo diafiltrácii podľa postupov známych v tejto oblasti, najlepšie vo vyrovnávacom tlmivom roztoku s pH medzi 6 a 8. Uprednostňuje sa koncentrácia soli 0 až 200 mM výhodne pre 0 až 10 mM. Najvhodnejšie rozmedzie pH je 4,9 až 8,0 výhodne 5,9 až 7,5, najlepšie 6,2 až 7,0.

Vo všeobecnosti najdôležitejšie kontaminujúce proteíny v kultivačných kvapalinách buniek cicavcov pochádzajú zo séra alebo z proteínov pridaných do média. To je čiastočne spôsobené závislosťou mnohých bunkových typov od značného množstva séra. Komerčné bunkové médiá sa často získavajú s buď teľacím sérom, hovädzím sérom, fetálnym hovädzím sérom alebo sérovým albumínom, alebo inými purifikovanými alebo čiastočne purifikovanými sérovými proteínmi ako napríklad transferín alebo ich kombináciami, alebo sa tieto do nich pridávajú, pričom sa žiadaný proteín potom musí od nich oddeliť. Je preto často žiaduce, aby bol prvý stupeň purifikačného procesu zameraný na odstránenie sérových zložiek.

Proces heparinovej chromatografie nie je obmedzený na prvý stupeň purifikačného procesu. Je vhodný na zakomponovanie do procesu čistenia v akomkoľvek bode viacstupňového postupu. Príprava čiastočne purifikovaných erytropoetínov akoukoľvek čiastočnou frakcionačnou procedúrou alebo chromatografickou procedúrou vrátane okrem iného iónovej výmeny, hydrofóbnej interakcie, vylučovania veľkostnej frakcie, reverznej fázy alebo afinity sa môže vykonať pred heparínovou chromatografiou.

„Nosič s heparínovou afinitou“ sa týka akéhokoľvek známeho chromatografického nosiča viažuceho molekuly heparínu, kde je heparín stabilne naviazaný na živicový nosič a používa sa na heparínovú chromatografiu. Nosiče s heparínovou afinitou sú k dispozícii od niekoľkých komerčných dodávateľov. Medzi komerčne dostupné nosiče s heparínovou afinitou patria okrem iného Heparín Sepharose CL-6B, Heparin Sepharose® 6 Fast Flow, HiTrap Heparin* (Pharmacia); Affigél Heparin’ (BioRad); Heparin Agarose®, Heparin Sepharose® typ I a typ II, typ IIS, typ IIS (Sigma); AF-Heparin Toyopearl 650*, Heparin-650M* (TosoHaas); Cellufme Heparin '* (Amicon); Heparin Hyper D* (Biosepra); Heparin Agarose 6x1/' (typy I, II a III) (American Intemational Chemical). Uprednostňovanou pevnou matricou je matrica na báze agarózy, najvhodnejšie Sepharose® alebo deriváty Sepharose® vo forme guľôčok. Možno použiť aj iné pevné matrice ako napríklad celulózy alebo polyakrylamidy.

Heparínovú chromatografiu možno uskutočniť v dávkach alebo elúciou kolóny. Preferuje sa heparínový nosič v stĺpcovom chromatografickom systéme. Pri použití v sys

SK 284315 Β6 témoch stĺpcovej chromatografie sa heparínový afinitný nosič používa najvhodnejšie medzi 0 °C a 30 °C s preferenciou pre 4 °C a 25 °C a najlepšie okolo 4 °C. Uprednostňuje sa heparínová živica všeobecne vyrovnaná, pripravená a udržiavaná podľa špecifikácií výrobcu (napr. Heparin Sepharose® CL6B sa pripravuje podľa opisu v Pharmacia Instruction Manual 71-7078-00).

Viazanie molekúl erytropoetínu na heparínový nosič sa uskutočňuje vyrovnaním nosiča vo “vyrovnávacom tímovom roztoku”. “Vyrovnávací tlmivý roztok” je vodné prostredie, do ktorého sa umiestni nosič na naviazanie molekúl erytropoetínu, keď sa kontaktuje s biologickou alebo kultivačnou tekutinou. Viazanie erytropoetínu na stĺpec sa uskutočňuje pri pH 4,9 až 8,0 výhodne pri pH 5,9 až 7,5, najlepšie okolo pH 6,2 alebo 7,0. Na použitie s heparínovými nosičmi je vhodných niekoľko tlmivých roztokov. Medzi preferované tlmivé roztoky patria MES (2-[N-morfolínojetánsulfónová kyselina), Tris (tris[hydroxymetyljaminometán) alebo fosfát. Najvhodnejšie vybraná koncentrácia na vyrovnávanie je okolo 20 mM s uprednostňovanou vodivosťou asi 2 mS/cm.

Pred elúciou naviazaného erytropoetínu z heparínového nosiča možno eluovať kontaminanty premytím ďalším množstvom vyrovnávacieho tlmivého roztoku alebo vyrovnávacím tlmivým roztokom obsahujúcim prídavok soli, tlmivých vyrovnávacích roztokov alebo zmenou pracovného pH alebo kombináciou týchto zmien. Viazanie erytropoetínu sa napríklad môže uskutočniť pri pH 6,2 a niektoré kontaminanty možno eluovať pri pH 7,4 bez straty erytropoetínu. Zmenou systému tlmivého roztoku úpravou jeho zloženia možno takto dosiahnuť vhodnú purifikáciu molekúl erytropoetínu. Elúciu erytropoetínu z heparínového nosiča možno napríklad uskutočniť zvýšením koncentrácie soli v elučnom tlmivom roztoku. Medzi uprednostňované soli patria alkalické halogenidy a najviac sa preferuje použitie NaCl.

Tlmivé roztoky na vyrovnávanie alebo elúciu erytropoetínu môžu obsahovať „anti-adsorbent“. „Anti-adsorbent“ je akákoľvek látka, ktorá znižuje adsorpciu erytropoetínu na povrchu nosiča alebo na iné proteíny alebo na seba samého (napr. agregácia). Medzi preferované príklady antiadsorbentov patria polyoxyetylénová sorbitanové deriváty mastných kyselín známe ako „Tween“, pričom „Tween 20*“ (polyoxyetylén sorbitan monolaurát) je aktuálne preferovaným povrchovo aktívnym činidlom. Ak sa použije povrchovo aktívne činidlo, jeho najvhodnejšia koncentrácia je asi 0,01 až 0,5 % s preferenciou pre asi 0,1 % (hmotn.).

Tento stupeň čistenia heparínu možno zakomponovať do celkovej purifikačnej stratégie pre erytropoetín. Tento stupeň možno napríklad využiť s tradičnými chromatografickými stupňami, ako je napríklad iónovýmenná chromatografia, gélová chromatografia a HPLC s reverznou fázou.

Medzi iónovýmenné stupne v kombinácii s heparínovým stupňom (buď pred heparínovou chromatografiou, alebo po nej) patrí použitie aniónovej výmennej chromatografie alebo katiónovej výmennej chromatografie. Všeobecne známe komerčne dostupné anexové nosiče používané v čistení erytropoetínu majú kvartéme amóniové funkčné skupiny. Preferovanými matricami na použitie v tomto procese sú matrice na báze agarózy alebo celulózy ako napríklad mikrokryštalická celulóza alebo kroslinkované agarózy. Obzvlášť preferovanými matricami sú tiež matrice s dietylaminoetyl, trietylaminoetyl alebo trimetylaminometylové funkčné skupiny. Obzvlášť preferovanou anexovou matricou je trimetylaminometylová kroslinkovaná agaróza, ktorá je komerčne dostupná, napr. Q-Sepharose Fast Flow' (Pharmacia). Všeobecne známe komerčne dostupné katexové nosiče, ktoré možno použiť pri čistení erytropoetínov, majú kyselinové funkčné skupiny vrátane karboxylových a sulfónových skupín. Medzi matrice obsahujúce katiónové funkčné skupiny patria matrice na báze rôznych foriem celulóz a polystyrénu. Medzi slabé katexy známe v tejto oblasti patria napríklad okrem iných Carboxymethyl-Cellulose®, Carboxymethyl-Sephadex® a Carboxymethyl-Sepharose®. Medzi silné katexy známe v tejto oblasti patria okrem iných sulfónované polystyrény (AG 50W®, BioRex ®), sulfónované celulózy (SP-Sephadex®) a sulfónované sefarózy (S-Sepharose®).

Chromatografický krok s použitím týchto matríc sa najvhodnejšie uskutočňuje ako stĺpcová chromatografia, ktorú možno vykonávať pri teplotách medzi 4 “C až 25 °C. Vo všeobecnosti sa do vymývacieho alebo elučného tlmivého roztoku pridáva soľ, aby sa zvýšila iónová sila aplikačného alebo vyrovnávacieho tlmivého roztoku. Na tento účel možno použiť ktorúkoľvek z bežne používaných solí, čo môžu ľahko zistiť odborníci z tejto oblasti, pričom NaCl je jednou z najčastejšie a najvýhodnejšie používaných solí.

Konvenčný stupeň gélovej filtrácie možno tiež použiť v kombinácii s heparínovým procesom. Reprezentatívnymi príkladmi na tieto matrice sú polydextrány kroslinkované s akrylamidmi ako napríklad zložené hydrofilné gély pripravené kovalentným kroslinkovaním alyldextránu s N,N’-metylén bisakrylamidom a kroslinkované celulózové gély. Komerčne dostupné kroslinkované dextránakrylamidy sú známe pod obchodným názvom Sephacryľ® a sú dostupné od Pharmacia. Preferovaným gélom Septiacryl’ je Sephacryl S-200 HR®. Príkladmi na kroslinkované celulózové gély sú komerčne dostupné kroslinkované porézne celulózové gély, napr. GLC 300® alebo GLC 1 000®, ktoré sú dostupné od Amicon Inc.

Opis obrázkov na výkresoch

Obr. 1. Heparin-Sepharose® chromatografia GA-EPO zo 4 % séra

Obrázok 1 je chromatogram zobrazujúci Heparin-Sepharose® CL-6B frakcionáciu kultivačného supematantu bunkovej línie vylučujúcej GA-EPO. Bunky sa propagujú ako kultúra závislá od ukotvenia v Celí Cube (Costar) v 4 % médiu obsahujúcom fetálne hovädzie sérum. Ultrafiltrovaný, diafiltrovaný kultivačný supematant opísaný v príklade 1 sa oddeľuje na Heparin-Sepharose® CL-6B pri pH 6,2 a obsah GA-EPO vo frakciách sa určuje pomocou ELISA (-o-). Čiara (___) predstavuje absorbanciu pri 280 nm. Čiara (—) predstavuje gradient NaCl.

Obr. 2. Heparin-Sepharose® chromatografia GA-EPO z 2 % séra

Obrázok 2 je chromatogram zobrazujúci Heparin-Sepharose® CL-6B frakcionáciu kultivačného supematantu bunkovej línie vylučujúcej GA-EPO. Bunky sa propagujú ako kultúra závislá od ukotvenia v Celí Cube (Costar) v 2 % médiu obsahujúcom fetálne hovädzie sérum. Ultrafiltrovaný, diafiltrovaný kultivačný supematant z príkladu 2 sa oddeľuje na Heparin-Sepharose® CL-6B pri pH 6,2 a obsah GA-EPO vo frakciách sa určuje pomocou ELISA (-o-). Čiara (___) predstavuje absorbanciu pri 280 nm. Čiara (—) predstavuje gradient NaCl.

Obr. 3. Heparin-Sepharose® chromatografia GA-EPO z bezsérového média

Obrázok 3 je chromatogram zobrazujúci Heparin-Sepharose® CL-6B frakcionáciu GA-EPO pochádzajúceho z

SK 284315 Β6 kultivačného supematantu bunkovej línie vylučujúcej GA-EPO. Bunky sa propagujú v suspenzii v bankách na otáčavej miešačke v médiu bez séra. Ultrafiltrovaný, diafiltrovaný kultivačný supcmatant z príkladu 3 sa oddeľuje na Heparin-Sepharose® CL-6B pri pH 6,2 a obsah GA-EPO vo frakciách sa určuje pomocou ELISA (-o-). Čiara (___) predstavuje absorbanciu pri 280 nm. Čiara (—) predstavuje gradient NaCl.

Obr. 4. Heparin-Sepharose® rýchloprietoková chromatografia GA-EPO zo 4 % séra

Obrázok 4 je chromatogram zobrazujúci Heparin-Sepharose® CL-6B rýchloprietokovú frakcionáciu GA-EPO pochádzajúceho z kultivačného supematantu bunkovej línie vylučujúcej GA-EPO. Bunky sa propagujú ako kultúra závislá od ukotvenia v Celí Cube (Costar) v 4 % médiu obsahujúcom fetálne hovädzie sérum. Ultrafiltrovaný, diafiltrovaný kultivačný supernatant z príkladu 4 sa oddeľuje na Heparin-Sepharose® 6 Fast Flow pri pH 7,0 a obsah GA-EPO vo frakciách sa určuje pomocou ELISA (-o-). Čiara (___) predstavuje absorbanciu pri 280 nm. Čiara (—) predstavuje gradient NaCl.

Obr. 5. HiTrap heparínová chromatografia GA-EPO z 2 % séra po počiatočnom čistení iónovýmennou chromatografiou a chromatografíou s hydrofóbnou interakciou

Obrázok 5 je chromatogram zobrazujúci HiTrap Heparin® (Pharmacia) frakcionáciu GA-EPO pochádzajúceho z kultivačného supematantu bunkovej línie vylučujúcej GA-EPO. Bunky sa propagujú vo valcových fľašiach v 2 % médiu obsahujúcom teľacie sérum. Po počiatočnej frakcionácii iónovýmennou chromatografíou pomocou Pharmacia Streamline® DEAE nasleduje chromatografia s hydrofóbnou interakciou na Phenyl Sepharose® Fast Flow (Pharmacia) a iónovýmenná chromatografia na Q-Sepharose® Fast Flow (Pharmacia). Čiastočne vyčistený materiál eluovaný zo živice Q-Sepharose® sa dialyzuje a oddelí na HiTrap Heparin® pri pH 6,2 a obsah GA-EPO vo frakciách sa určuje pomocou ELISA (-o-). Čiara (___) predstavuje absorbanciu pri 280 nm. Čiara (—) predstavuje gradient NaCl.

Obr. 6. HiTrap Heparin® chromatografia GA-EPO z 2 % séra po počiatočnom čistení chromatografíou s hydrofóbnou interakciou

Obrázok 6 je chromatogram zobrazujúci HiTrap Heparin* (Pharmacia) frakcionáciu GA-EPO pochádzajúceho z kultivačného supematantu bunkovej línie vylučujúcej GA-EPO. Bunky sa propagujú vo valcových fľašiach v 2 % kultivačnom médiu obsahujúcom teľacie sérum. Počiatočná frakcionácia sa uskutočnila chromatografíou s hydrofóbnou interakciou na Phenyl Sepharose® 6 Fast Flow (Pharmacia). Čiastočne vyčistený materiál eluovaný z tejto živice sa dialyzuje a oddelí na HiTrap Heparin® pri pH 5,2 a obsah GA-EPO vo frakciách sa určuje pomocou ELISA (-o-). Čiara (___) predstavuje absorbanciu pri 280 nm. Čiara (—) predstavuje gradient NaCl.

Obr. 7. HiTrap Heparin® chromatografia erytropoetínu pochádzajúceho z buniek CHO

Obrázok 7 je chromatogram zobrazujúci HiTrap Heparin® (Pharmacia) frakcionáciu erytropoetínu pochádzajúceho z buniek CHO (Chinese Hamstcr Ovary - vaječníky čínskeho škrečka) (R & D Systems) napichnutých do diafiltrovaného, neupravovaného média obsahujúceho 2 % teľacie sérum. Napichnuté diafiltrované médium sa oddeľuje na HiTrap Heparin® pri pH 7,0 a obsah erytropoetínu vo frakciách sa určuje pomocou ELISA (-o-). Súvislá čiara (___) predstavuje absorbanciu pri 280 nm. Prerušovaná čiara (—) predstavuje gradient NaCl.

Tabuľka L Heparínová chromatografia: purifíkačná tabuľka

Tabuľka 1 sumarizuje niektoré údaje získané pomocou heparínovej chromatografie ako prvého alebo následného chromatografického stupňa. Uvedené príklady pokrývajú široké spektrum kultivačných podmienok vrátane buniek závislých a nezávislých od ukotvenia a to buď s fetálnym hovädzím sérom alebo teľacím sérom pri rôznych koncentráciách, alebo bez nich, v médiu. Príklady podobne demonštrujú široké spektrum chromatografických podmienok. V tabuľke sú postupne uvedené: číslo príkladu (stĺpec 1), podmienky rastu (stĺpec 2), podmienky čistenia (stĺpec 3), počet jednotiek ELISA na miligram (špecifická aktivita vyjadrená ako EU/mg; stĺpec 4), počet čistiacich cyklov (stĺpec 5) a percento výťažku (stĺpec 6).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady sú len ilustratívne a nemajú sa vysvetľovať ako obmedzenie rozsahu nárokovaného vynálezu. Východiskový materiál na čistenie erytropoetínov možno získať z biologických tekutín alebo buniek závislých alebo nezávislých od ukotvenia kultivovaných v akomkoľvek vhodnom kultivačnom médiu s rôznymi množstvami pridaného hovädzieho séra alebo iných sér, alebo zložiek nezískaných zo séra, alebo bez ich prídavku. Východiskový materiál možno produkovať v rôznych bunkových typoch ľudského alebo iného pôvodu. Medzi príklady na imortalizované ľudské bunkové línie užitočné na produkciu erytropoetínu patria medzi inými: bunky HeLa a deriváty buniek HeLa (ATCC CCL 2, 2.1 a 2.2), bunky rakoviny prsníka MCF-7 (ATCC HTB 22), leukémiové bunky K-562 (ATCC CCL 243), bunky karcinómu KB (ATCC CCL 17), bunky rakoviny vaječníka 2780AD (Van der Blick, A.M. et al., Cancer Res, 48:5927-5932 (1988), bunky Raji (ATCC CCL 86), bunky Jurkat (ATCC TIB 152), bunky Namalwa (ATCC CRL 1432), bunky HL-60 (ATCC CCL 240), bunky WiDr (ATCC CCL218), bunky HT1080 (ATCC CCL 121), bunky Daudi (ATCC CCL213), bunky RPM1 8226 (ATCC CCL 155), bunky U-937 (ATCC CRL 1593), bunky Bowesovho melanómu (ATCC CRL 9607), bunky W1-38VA13 podlíme 2R4 (ATCC CCL 75.1) a bunky MOLT-4 (ATCC CRL 1582), ako aj heterohybridómové bunky produkované fúziou ľudských buniek a buniek iných druhov. Sekundárne ľudské fibroblastové kmene, ako napríklad WI-38 (ATCC CCL 75) a MRC-5 (ATCC CCL 171) možno tiež použiť. Okrem toho možno na produkciu erytropoetínu použiť primáme ľudské bunky. Erytropoetin možno pripravovať aktiváciou erytropoetínového génu v primárnych, sekundárnych alebo imortalizovaných ľudských bunkách, v zásade tak, ako je opísané vo WO 94/12650, alebo transfekciou erytropoetínového génu do primárnych, sekundárnych alebo imortalizovaných buniek ľudského alebo iného pôvodu.

Ilustratívne príklady ukazujú verzatilitu heparínovej chromatografie ako prvého alebo následného purifikačného stupňa. Nasledujúce príklady tiež demonštrujú, že heparinová chromatografia dobre funguje s radom komerčných heparínových živíc a tiež demonštrujú škálovateľnosť stupňa od analytického po preparatívne použitie. Príklady 1 - 6 a 8 - 9 sa vykonávajú s použitím GA-EPO izolovaného z génovo aktivovaných ľudských buniek pripravených v zá

SK 284315 Β6 sade tak, ako to opisuje WO 94/12650. Príklad 7 sa uskutočňuje pomocou erytropoetínu z komerčne dostupného zdroja, ktorý bol pripravený vylučovaním ľudského erytropoetinového génu po transfekcii do buniek CHO.

Príklad I

Použitie heparínovej chromatografie ako prvého chromatografíckého stupňa v purifikačnom procese

1.1 Východiskový materiál

Pripravené médium obsahujúce 4 % fetálneho hovädzieho séra sa získa z adherentnej ľudskej bunkovej línie vylučujúcej GA-EPO propagovanej v Celí Cube (Costar). Médium sa vyčíri centrifugovaním, po ktorom nasleduje filtrácia cez 0,45 mikrónovú filtrovú jednotku Nalgene. Ultrafiltrácia/diafiltrácia (Uf/Df) sa uskutoční pomocou tangenciálneho prúdového systému Pellicon (Millipore) vybaveného membránou na frakciu molekulových veľkostí 30 000. Vyrovnávací a dialyzačný tlmivý roztok je 20 mM MES, pH 6,2, obsahujúci 0,5 % Tween 20.

1.2. Heparínová chromatografia

Heparínová chromatografia sa uskutočňuje pomocou GradiFrac Systém od Pharmacia pri 4 °C. 280 ml stĺpec (14x5 cm) obsahujúci Heparín Sepharose^R CL-6B (Pharmacia) sa vyrovná pomocou 20 mM MES, pH 6,2 a obsahujúcim 0,1 % Tween 20 pri rýchlosti prietoku 10 ml/min. Vzorka sa aplikuje na kolónu pri prietoku 10 ml/min. s pumpou Pharmacia P 50. Stĺpec sa potom premýva vyrovnávacím tlmivým roztokom, kým sa nestabilizuje absorbancia pri 280 nm. Slabo naviazaný protein sa eluuje premytím jedným objemom kolóny (280 ml) 20 mM MES, pH

6.2, obsahujúcim 0,1 % Tween 20 a 0,05 M NaCl, pričom sa odoberajú 12 ml frakcie. Po premytí nasledujú dva objemy stĺpca (560 ml) lineárneho gradientu od 0,05 M po 0,35 M NaCl v 20 mM MES, pH 6,2, obsahujúceho 0,1 % Tween 20, potom sa premyje jedným objemom stĺpca 0,35 M NaCl v 20 mM MES, pH 6,2, obsahujúcim 0,1 % Tween 20. Elučný tlmivý roztok sa potom zvýši na 1,0 M NaCl v 20 mM MES, pH 6,2, obsahujúci 0,1 % Tween 20 v priebehu polovice objemu stĺpca (140 ml) a potom sa udržiava v tomto tlmivom roztoku v priebehu jedného objemu stĺpca (280 ml).

Celkový protein sa monitoruje podľa absorbancie pri 280 nm a koncentrácia soli sa sleduje monitorom vodivosti zapojeným sériovo (obr. 1). Prietok a frakcie eluentu sa analyzujú na obsah GA-EPO pomocou ELISA (R & D Systems), SDS-PAGE a Westem Blot.

Stĺpec obsahujúci Heparín Sepharose sa regeneruje aplikovaním 560 ml 20 mM Tris-Cl, pH 9,0, obsahujúceho 4 M močoviny a 1,4 M NaCl, po ktorom nasleduje premytie vyrovnávacím buffrom, kým sa vodivosť a pH eluentu stĺpca nerovná vodivosti a pH vyrovnávajúceho tlmivého roztoku.

V jednom experimente sa z GA-EPO zavedeného do heparinového stĺpca získalo 89 % v kombinovanom eluente. Použitím tohto stĺpca sa odstránilo 90 % kontaminujúceho proteínu (tabuľka 1).

Príklad 2

Použitie heparínovej chromatografie ako prvého chromatografického stupňa v purifikačnom procese

Π.1 Východiskový materiál

Pripravené médium obsahujúce 2 % fetálneho hovädzieho séra sa získa z adherentnej ľudskej bunkovej línie vylučujúcej GA-EPO propagovanej v Celí Cube (Costar). Médium sa vyčíri centrifugovaním, po ktorom nasleduje filtrácia cez 0,45 mikrónovú filtrovú jednotku Nalgene.

Ultrafiltrácia/diafiltrácia (Uf/Dŕ) sa uskutoční pomocou tangenciálneho prúdového systému Pellicon (Millipore) vybaveného membránou na frakciu molekulových veľkostí 30 000. Vyrovnávací a dialyzačný tlmivý roztok je 20 mM MES, pH 6,2, obsahujúci 0,5 % Tween 20.

11.2. Heparínová chromatografia

Heparínová chromatografia sa uskutočňuje pomocou GradiFrac Systém od Pharmacia pri 4 °C. 280 ml stĺpec (14 x 5 cm) obsahujúci Heparín Sepharose* CL-6B (Pharmacia) sa vyrovná pomocou 20 mM MES, pH 6,2 a obsahujúcim 0,1 % Tween 20 pri rýchlosti prietoku 10 ml/min. Vzorka sa aplikuje na kolónu pri prietoku 10 ml/min. s pumpou Pharmacia P 50. Stĺpec sa potom premýva vyrovnávacím tlmivým roztokom, kým sa nestabilizuje absorbancia pri 280 nm. Slabo naviazaný protein sa eluuje premytím jedným objemom kolóny (280 ml) 20 mM MES, pH

6.2. obsahujúcim 0,1 % Tween 20 a 0,05 M NaCl, pričom sa odoberajú 12 ml frakcie. Po premytí nasledujú dva objemy stĺpca (560 ml) lineárneho gradientu od 0,05 M po 0,35 M NaCl v 0,02 M MES, pH 6,2, obsahujúceho 0,1 % Tween 20, potom sa premyje jedným objemom stĺpca 0,35 M NaCl v 0,02 M MES, pH 6,2, obsahujúcim 0,1 % Tween 20 počas jedného objemu stĺpca (280 ml). Obsah NaCl v elučnom tlmivom roztoku sa zvýši na 1,0 M NaCl v priebehu polovice objemu stĺpca (140 ml) a potom sa udržiava v tomto tlmivom roztoku v priebehu jedného objemu stĺpca (280 ml).

Celkový protein sa monitoruje podľa absorbancie pri 280 nm a koncentrácia soli sa sleduje monitorom vodivosti zapojeným sériovo (obr. 2). Prietok a frakcie eluentu sa analyzujú na obsah GA-EPO pomocou ELISA (R & D Systems), SDS-PAGE a Westem Blot.

Heparinový stĺpec sa regeneruje aplikovaním 560 ml 20 mM Tris-Cl, pH 9,0, obsahujúceho 4 M močoviny a 1,4 M NaCl, po ktorom nasleduje vyrovnávací tlmivý roztok, kým sa vodivosť a pH eluentu stĺpca nerovná vodivosti a pH vyrovnávajúceho tlmivého roztoku.

V jednom experimente sa z GA-EPO zavedeného do heparinového stĺpca získalo 81 % v kombinovanom eluente. Použitím tohto stĺpca sa odstránilo 86 % kontaminujúceho proteínu (tabuľka 1).

Príklad 3

Použitie heparínovej chromatografie ako prvého chromatografického stupňa v purifikačnom procese

111.1 Východiskový materiál

Pripravené médium bez séra získané z ľudskej bunkovej línie vylučujúcej GA-EPO propagovanej v bankách na otočnej miešačke sa vyčíri centrifugovaním, po ktorom nasleduje filtrácia cez 0,45 mikrónovú filtrovú jednotku Nalgene. Ultrafiltrácia/diafiltrácia sa uskutoční pomocou tangenciálneho prúdového systému Pellicon (Millipore) vybaveného membránou na frakciu molekulových veľkosti 10 000. Vyrovnávací a dialyzačný tlmivý roztok je 20 mM MES, pH 6,2, obsahujúci 0,5 % Tween 20.

111.2. Heparínová chromatografia

Heparínová chromatografia sa uskutočňuje pomocou FPLC Systém od Pharmacia pri 25 °C. 12 ml stĺpec (6 x x 1,6 cm) obsahujúci Heparin Sepharose* CL-6B (Pharmacia) sa vyrovná pomocou 20 mM MES, pH 6,2 a obsahujúcim 0,1 % Tween 20 pri rýchlosti prietoku 1 ml/min. Vzorka, ktorá sa má aplikovať na kolónu, sa zavádza rýchlosťou 1 ml/min. pomocou Superloop. Stĺpec sa potom premýva vyrovnávacím tlmivým roztokom, kým sa nestabilizuje absorbancia pri 280 nm. Potom nasleduje päť objemov stĺpca

SK 284315 Β6 (60 ml) lineárneho gradientu od 0 po 0,4 M NaCl v 0,02 M MES, pH 6,2, obsahujúceho 0,1 % Tween 20, a premytie jedným objemom stĺpca s gradientom po 1,0 M NaCl v 0,02 M MES, pH 6,2, obsahujúcim 0,1 % Tween 20. Potom sa udržiava v tomto tlmivom roztoku v priebehu jedného objemu stĺpca.

Celkový proteín sa monitoruje podľa absorbancie pri 280 nm. Prietok a frakcie eluentu sa analyzujú na obsah GA-EPO pomocou ELISA (R & D Systems) (obrázok 3), a pomocou SDS-PAGE a Westem Blot.

Stĺpec obsahujúci Heparín Sepharose® sa regeneruje aplikovaním 60 ml 20 mM Tris-Cl, pH 9,0, obsahujúceho 4 M močoviny a 1,4 M NaCl, po ktorom nasleduje premytie vyrovnávacím tlmivým roztokom, kým sa vodivosť a pH eluentu stĺpca nerovná vodivosti a pH vyrovnávajúceho tlmivého roztoku.

V jednom experimente sa z GA-EPO zavedeného do heparínového stĺpca získalo 90 % v kombinovanom eluente. Použitím tohto stĺpca sa odstránilo 97 % kontaminujúceho proteínu (tabuľka 1).

Príklad 4

Použitie heparínovej chromatografie ako prvého chromatografického stupňa v purifikačnom procese

IV. 1 Východiskový materiál

Pripravené médium obsahujúce 4 % fetálneho hovädzieho séra sa získa z adherentnej ľudskej bunkovej línie vylučujúcej GA-EPO propagovanej v Celí Cube (Costar). Médium sa vyčíri centrifugovaním, po ktorom nasleduje filtrácia cez 0,45 mikrónovú filtrovú jednotku Nalgene. Výmena tlmivého roztoku sa uskutoční dialýzou cez noc (membrána na frakciu molekulových veľkostí 12 000 až 14 000) oproti 20 mM MES, pH 7,0, obsahujúci 0,1 % Tween 20.

IV.2. Heparínová chromatografia

Heparinová chromatografia sa uskutočňuje pomocou FPLC Systém od Pharmacia pri 25 °C. 10 ml stĺpec (5 x x 1,6 cm) obsahujúci Heparin Sepharose® 6 Fast Flow (Pharmacia) sa vyrovná pomocou 20 mM MES, pH 7,0 a obsahujúcim 0,1 % Tween 20 pri rýchlosti prietoku 4 ml/min. Vzorka sa potom aplikuje na kolónu pri rýchlosti 4 ml/min. Stĺpec sa potom premýva vyrovnávacím tlmivým roztokom, kým sa nestabilizuje absorbancia pri 280 nm. Potom nasleduje 10 objemov stĺpca (100 ml) lineárneho gradientu od 0 po 0,35 M NaCl v 20 mM Tris, pH 7,0, obsahujúceho 0,1 % Tween 20. Elučný tlmivý roztok sa potom zvýši na 1,0 M NaCl v 20 mM Tris, pH 7,0, obsahujúcim 0,1 % Tween 20 v priebehu 5 ml. Potom sa udržiava v tomto tlmivom roztoku v priebehu dvoch objemov stĺpca (20 ml).

Celkový proteín sa monitoruje podľa absorbancie pri 280 nm. Prietok a frakcie eluentu sa analyzujú na obsah GA-EPO pomocou ELISA (R & D Systems) (obrázok 4), a pomocou SDS-PAGE a Westem Blot.

V jednom experimente sa z GA-EPO zavedeného do heparínového stĺpca získalo 89 % v kombinovanom eluente. Použitím tohto stĺpca sa odstránilo 93 % kontaminujúceho proteínu (tabuľka 1).

Stĺpec obsahujúci Heparin Sepharose® 6 Fast Flow sa regeneruje premytím 20 ml 0,1 N NaOH, po čom nasleduje premytie vyrovnávacím tlmivým roztokom, kým sa vodivosť a pH eluentu stĺpca nerovná vodivosti a pH vyrovnávajúceho tlmivého roztoku.

Príklad 5

Použitie heparínovej chromatografie ako intermediátneho chromatografického stupňa v purifikačnom procese

V.l Východiskový materiál

Pripravené médium (400 ml) obsahujúce 2 % fetálneho teľacieho séra sa získa z adherentnej ľudskej bunkovej línie vylučujúcej GA-EPO propagovanej vo valcových fľašiach. Médium sa vyčíri centrifugovaním, po ktorom nasleduje filtrácia cez 0,45 mikrónovú filtrovú jednotku Nalgene. Materiál sa zriedi vodou 4-krát a zavedie sa na 100 ml stĺpec Pharmacia Streamline® DEAE vyrovnanú v 20 mM Tris-Cl, pH 8,0. Po premytí 2 litrami vyrovnávacieho tlmivého roztoku sa GA-EPO postupne eluuje pomocou 20 mM tris-Cl, pH 8,0, obsahujúcim 1 M NaCl. Eluovaný materiál sa kombinuje, upraví sa na 3 M NaCl a aplikuje sa na 100 ml kolónu obsahujúcu Pharmacia Phenyl Sepharose* p Fast Flow vyrovnanú vo fosfátom tlmenom fyziologickom roztoku (Dulbecco) obsahujúcim ďalšie 3 M NaCl. Po premytí fosfátom tlmeným fyziologickým roztokom obsahujúcim ďalších 0,5 M NaCl sa GA-EPO eluuje pomocou 10 mM NaOH, pH 12, obsahujúcim 20 % propylénglykolu a 4 M močoviny. Kombinovaný eluent sa dialyzuje oproti 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, obsahujúcemu 0,05 % Tween 20, a potom sa aplikuje na 20 ml stĺpec obsahujúci Q-Sepharose® Fast Flow vyrovnaný v tom istom buffri. GA-EPO sa eluuje zo stĺpca pomocou objemu 10 stĺpcov s gradientom od 0 po 1,0 M NaCl vo vyrovnávacom buffri. Frakcie obsahujúce GA-EPO sa kombinujú a dialyzujú oproti 20 mM MES, pH

6,2, obsahujúcemu 0,05 % Tween 20.

V. 2. Heparínová chromatografia

Dva 1 ml hotové stĺpce obsahujúce Pharmacia HiTrap Heparin® sa zapoja do tandemu a vyrovnajú sa pomocou 20 mM MES, pH 6,2 obsahujúcim 0,05 % Tween 20. Dialyzovaný materiál zo stĺpca s Q-Sepharose® Fast Flow sa zavedie na tandem stĺpcov HiTrap Heparin®. Stĺpce sa potom premývajú vyrovnávacím tlmivým roztokom, kým sa nestabilizuje absorbancia pri 280 nm. Potom nasleduje 30 objemov stĺpca (60 ml) lineárneho gradientu od 0 po 0,6 M NaCl v 0,02 M MES, pH 6,2, obsahujúceho 0,05 % Tween 20.

Celkový proteín sa monitoruje podľa absorbancie pri 280 nm. Prietok a frakcie eluentu sa analyzujú na obsah GA-EPO pomocou ELISA (R & D Systems) (obrázok 5), a pomocou SDS-PAGE a Westem Blot.

V jednom experimente sa z GA-EPO zavedeného do stĺpcov HiTrap® získalo 88 % v kombinovanom eluente. Použitím tohto stĺpca sa odstránilo 78 % kontaminujúceho proteínu (tabuľka 1).

Príklad 6

Použitie heparínovej chromatografie ako intermediátneho chromatografického stupňa v purifikačnom procese

VI. 1 Východiskový materiál

Pripravené médium (602 ml) obsahujúce 2 % fetálneho teľacieho séra sa získa z adherentnej ľudskej bunkovej línie vylučujúcej GA-EPO propagovanej vo valcových fľašiach. Médium sa vyčíri centrifugovaním, po ktorom nasleduje filtrácia cez 0,45 mikrónovú filtrovú jednotku Nalgene. Materiál sa upraví na 3 M NaCl a potom sa zavedie na 100 ml stĺpec Pharmacia Phenyl Sepharose® 6 Fast Flow vyrovnanú vo fosfátom tlmenom fyziologickom roztoku (Dulbecco) obsahujúcim ďalšie 3 M NaCl. Po premytí fosfátom tlmeným fyziologickým roztokom (Dulbecco) obsahujúcim ďalších 0,5 M NaCl a premytí 20 mM Tris, pH 8,0 sa GA-EPO eluuje pomocou 10 mM NaOH, pH 12, obsahujúcim 20 % propylénglykolu a 4 M močoviny. Frakcie obsahujúce GA-EPO sa kombinujú a dialyzujú oproti 20 mM MES, pH 5,2, obsahujúcemu 0,05 % Tween 20.

VI. 2. Heparínová chromatografia

Dva 1 ml hotové stĺpce obsahujúce Pharmacia HiTrap Heparín® (Pharmacia) sa zapoja do tandemu a vyrovnajú sa pomocou 20 mM MES, pH 5,2 obsahujúcim 0,05 % Tween 20. Dialyzovaný materiál zo stĺpca s Phenyl Sepharose® Fast Flow sa zavedie na tandem stĺpcov HiTrap Heparin®. Stĺpce sa potom premývajú vyrovnávacím tlmivým roztokom, kým sa nestabilizuje absorbancia pri 280 nm. Potom nasleduje 30 objemov stĺpca (60 ml) lineárneho gradientu od 0 po 1 M NaCl v 0,02 M MES, pH 5,2, obsahujúceho 0,05 % Tween 20.

Celkový proteín sa monitoruje podľa absorbancie pri 280 nm. Prietok a frakcie eluentu sa analyzujú na obsah GA-EPO pomocou ELISA (R & D Systems) (obrázok 6), a pomocou SDS-PAGE a Westem Blot.

V jednom experimente sa z GA-EPO zavedeného do stĺpcov HiTrap* získalo 79 % v kombinovanom eluente. Použitím tohto stĺpca sa odstránilo 82 % kontaminujúceho proteínu (tabuľka 1).

Príklad 7

Čistenie erytropoetínu pripraveného vylučovaním ľudského erytropoetínového génu v bunkách CHO: Použitie heparínovej chromatografie ako prvého chromatografického stupňa v purifikačnom procese

VII. 1. Východiskový materiál

Komerčne dostupný erytropoetín vyrábaný vylučovaním ľudského erytropoetínového génu v bunkách CHO sa pridal do ultrafiltrovaného neupraveného kultivačného média a podrobil sa čisteniu heparínovou chromatografiou nasledovne:

V neupravenom médiu (10 ml) obsahujúcom 2 % teľacie sérum sa vymení tlmivý roztok oproti 20 mM Tris-Cl, pH 7,0, obsahujúcemu 0,1 % Tween 20 pomocou jednotky CentriPrep 30 (Amicon), kým nie je vodivosť 2,2 mmho. Konečný retentát (asi 10 ml) sa zriedi na 18 ml vodou, aby sa dosiahla vodivosť 1,6 mmho. Jedna ampulka (500 U) erytropoetínu získaného z buniek CHO (R & D Systems, trieda tkanivovej kultúry) sa rozpustí v 100 μΐ vody a pridá sa do 0,9 ml zriedeného média s vymeneným tlmivým roztokom, potom sa prefiltruje cez 0,2 pm filter Acrodisc (Gélman).

VII.2. Heparínová chromatografia

I ml stĺpec obsahujúci HiTrap Heparin® (Pharmacia) sa vyrovná pri teplote miestnosti v 20 mM Tris-Cl, pH 7,0, obsahujúcom 0,1 % Tween 20 (1 ml/min.). Rýchlosť prietoku je 1 ml/min., zbierajú sa 1 ml frakcie a monitoruje sa absorbancia pri 280 nm. Filtrovaná vzorka (0,7 ml) sa aplikuje na stĺpec, po čom nasleduje premytie 10 objemami kolóny vyrovnávacím tlmivým roztokom. Erytropoetín sa eluuje 15 objemami kolóny s lineárnym gradientom na 20 mM Tris-Cl, pH 7,0, obsahujúcim 0,4 M NaCl a 0,1 % Tween 20. Kombinované frakcie erytropoetínu sa nakoncentrujú na 1,0 ml pomocou jednotky Centricon-10 (Amicon). Koncentrácia erytropoetínu sa určí pomocou ELISA (R & D Systems) a celková koncentrácia proteínu v kombinovaných frakciách erytropoetínu sa určí skúškou BCA (Pierce).

V jednom experimente sa v kombinovaných frakciách eluentu získal prakticky všetok erytropoetín aplikovaný na stĺpec obsahujúci Heparin HiTrap®. Použitím tohto stĺpca sa odstránilo 91 % kontaminujúceho proteínu (tabuľka 1).

Príklad 8

Ďalšie čistenie GA-EPO po heparínovej chromatografii

Nasledujúce postupy slúžia ako príklady niektorých z mnohých možných purifikačných krokov, ktoré možno použiť po heparínovej chromatografii. Nasledujúce príklady sa nemajú vysvetľovať ako obmedzenie počtu aplikovateľných krokov, ale slúžia ako ilustrácia verzatility heparínovej chromatografie ako stupňa, ktorý je užitočný a kompatibilný s radom purifikačných postupov.

VIII. 1. Aniónová iónovýmenná chromatografia ml stĺpec obsahujúci Q Sepharose® Fast Flow (Pharmacia) sa vyrovná vyrovnávacím tlmivým roztokom pre Q Sepharose (20 mM Tris-Cl, pH 7,5, obsahujúcim 0,1 % Tween 20). Kombinované frakcie GA-EPO získané po heparínovej chromatografii sa dialyzujú oproti vyrovnávaciemu tlmivému roztoku pre Q Sepharose a potom sa zavedú na stĺpec obsahujúci Q Sepharose®. Stĺpec sa premýva vyrovnávacím tlmivým roztokom pre Q Sepharose, kým sa nestabilizuje absorbancia pri 280 nm. Naviazaný proteín sa eluuje 20 mM Tris-Cl, pH 7,5 obsahujúcim 0,4 M NaCl a 0,1 % Tween 20.

Eluovaný proteínový pík s 0,4 M NaCl sa analyzuje na obsah GA-EPO pomocou ELISA (R & D Systems) a na celkový proteín absorbanciou pri 280 nm. Prietok a premývacie frakcie sa analyzujú podobne.

VIII.2. Katiónová iónovýmenná chromatografia ml stĺpec obsahujúci Mono S® sa vyrovná vyrovnávacím tlmivým roztokom pre Mono S (20 mM Tris-Acetate, pH 4,5, obsahujúci 0,1 % Tween 20). Kombinované frakcie GA-EPO získané po heparínovej chromatografii sa dialyzujú oproti vyrovnávaciemu tlmivému roztoku pre Mono S a potom sa zavedú na stĺpec Mono S*. Stĺpec sa premýva vyrovnávacím tlmivým roztokom pre Mono S, kými sa absorbancia pri 280 nm nestabilizuje. GA-EPO sa eluuje v pH gradiente od vyrovnávacieho tlmivého roztoku pre Mono S pri pH 4,5 až po 20 mM Tris-Acetate, pH 8,0, obsahujúci 0,1 % Tween 20.

Eluované frakcie proteínového piku sa analyzujú na obsah GA-EPO pomocou ELISA (R & D Systems) a celkový proteín absorbanciou pri 280 nm. Prietok a premývacie frakcie sa analyzujú podobne.

VIII.3. Chromatografia s hydrofóbnou interakciou

GA-EPO získaný po heparínovej chromatografii sa upraví na 4 M NaCl a pH sa upraví na 5,5 pridávaním 1 N HC1 po kvapkách. Materiál sa zavedie na 50 ml stĺpec obsahujúci nizkosubstituovaný Phenyl Sepharose® 6 Fast Flow (Pharmacia) vyrovnaný v 20 mM MES, pH 5,5, obsahujúci 4 M NaCl. Po premytí piatimi objemami stĺpca vyrovnávacieho tlmivého roztoku na odstránenie neviazaného materiálu sa eluuje GA-EPO pomocou tlmivého roztoku 20 mM Tris-Acetate, pH 8,0, obsahujúceho 4 M močoviny a 20 % propylénglykolu.

Eluované frakcie proteínového piku sa analyzujú na obsah GA-EPO pomocou ELISA (R & D Systems) a celkový proteín absorbanciou pri 280 nm. Prietok a premývacie frakcie sa analyzujú podobne.

VIII.4. Preparatívna gélová elektroforéza

GA-EPO získaný po heparínovej chromatografii sa nakoncentruje na 2 ml, upraví sa na 0,1 M v ditiotreitole a 1 % v SDS a potom sa zahrieva na 100 °C počas 1 minúty. Vzorka sa zavedie na stĺpec pre preparatívnu gélovú elektroforézu (BioRad) pripravený podľa opisu v technickom manuáli BioRad s použitím 12 % akrylamidového riediace ho gélu. Eluované frakcie proteínového piku sa analyzujú na obsah GA-EPO pomocou Westem Blot a na celkový proteín absorbanciou pri 280 nm.

VIII.5. Afmitná chromatografia pomocou imobilizovaných monoklonálnych antihumánnych protilátok EPO

GA-EPO po heparínovej chromatografíi sa dialyzuje oproti vyrovnávaciemu tlmivému roztoku (20 mM Tris-Cl, pH 8,0, obsahujúcemu 0,2 % Tween 20). Vzorka sa aplikuje na 0,25 ml afinitný stĺpec (živica 3M Emphase, Pierce, premytá vyrovnávacím tlmivým roztokom), ktorý obsahuje 0,5 mg antihumánnych protilátok EPO (Genzyme) imobilizovaných podľa špecifikácií výrobcu. Po premytí vyrovnávacím tlmivým roztokom sa GA-EPO vymyje pomocou 0,2 M kyseliny octovej, pH 3,5, obsahujúcej 0,15 M NaCl. Eluovaný materiál sa zbiera do 200 mikrolitrových frakcií v ampulkách obsahujúcich 20 mikrolitrov 1 M Tris, pH 8,0 a 2 mikrolitre Tween 20. Eluované frakcie proteínového piku sa analyzujú na obsah GA-EPO pomocou ELISA (R & D Systems) a na celkový proteín absorbanciou pri 280 nm.

Príklad 9

Použitie živíc na heparínovú chromatografiu od rôznych výrobcov

Heparínovú chromatografiu na čistenie erytropoetínu možno uskutočniť pomocou heparinových živíc od radu výrobcov. Päť rôznych živíc bolo vybraných na vyhodnotenie väzobnej a pracovnej kapacity GA-EPO získaného z ultrafiltrovaného/diafiltrovaného kultivačného média obsahujúceho 2 % fetálne hovädzie sérum: (1 a 2) Heparin Agarose 6XĽ typ I a typ III od Američan Intemational Chemical (AIC); (3 a 4) Heparin Sepharose* C1-6B a Heparin Sepharose* 6 Fast Flow od Pharmacia; a (5) Toyopearl AFHeparin-650M® od TosoHaas.

Použitý východiskový materiál a chromatografické podmienky boli podľa opisu v príklade 2 s použitím 1 až 7 ml stĺpcov. Pre všetky testované živice bol výťažok GA-EPO najmenej 70 %. V pracovnej kapacite sa medzi jednotlivými živicami nezaznamenali žiadne signifikantné rozdiely.

Analytické metódy

ELISA:

Kvantifikáciu erytropoetínu možno jednoducho merať pomocou Enzýme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Jedna z takých komerčne dostupných súprav ELISA na kvantifikáciu ľudského erytropoetínu je dostupná ako súprava (Quantikine IVD) od R & D Systems Inc. Ďalšia súprava ELISA na kvantifikáciu erytropoetínu je od Genzyme (Predicta Kit). Skúšky ELISA sa v zásade uskutočňujú podľa špecifikácií výrobcu. Alternatívne možno vyvinúť vhodné protilátky vyvinuté na rozoznaný erytropoetin do podobných systémov ELISA pre skúšky prítomných množstiev erytropoetínu.

Kvantitatívna analýza proteínov:

Kvantifikácia proteínových vzoriek je v tejto oblasti dobre známa. Medzi také postupy patria Lowryho, Bradfordova a BCA proteínové skúšky. Súpravy na určovanie množstva proteínov vo vzorke sú komerčne dostupné, ako napríklad BCA Proteín Assay Reagent Method, ktorú vyrába Pierce Chemical Co. Množstvo proteínu možno aj odhadnúť spektrofotometriou pri 280 nm, ako je známe odborníkom z tejto oblasti.

Špecifická aktivita:

Špecifická aktivita pre vzorky sa vypočítava podľa nasledujúceho vzorca: špecifická aktivita = celkový počet jednotiek GA-EPO podľa ELISA/celkový počet mg proteinu podľa skúšky BCA. Purifikovaný prípravok GA-EPO má špecifickú aktivitu asi 200 000 jednotiek ELISA/mg proteínu podľa skúšky BCA. Špecifická aktivita s použitím ELISA na kvantifikáciu jednotiek GA-EPO má len nepriamy vzťah k skutočnej biologickej aktivite GA-EPO. Test, ktorý sa všeobecne vykonáva na určenie špecifickej aktivity in vivo je exhypoxická polycytemická myšacia skúška, čo je známe odborníkom v tejto oblasti (taká skúška môže vyhodnotiť špecifickú aktivitu ako IU/mg, ako je známe odborníkom v tejto oblasti).

SDS PAGE a Westem Blot:

Vzorky sa pripravia pre SDS-PAGE a analyzujú sa na 10 % alebo 12 % polyakrylamidových géloch, ako je v tejto oblasti známe. Napríklad gély sú komerčne dostupné (napr. BioRad) a režimy použitia sú podľa opisu v pokynoch BioRad Mini-Protean® II Dual Slab Celí (podľa metódy Laemli, U.K. Náture 227, 680 (1970)). Coomassie R-250 pri asi 0,1 % koncentrácii možno použiť na celkové sfarbenie proteínu. Prenos proteínov na membránu ImmobilonTM-P PVDF (Millipore) možno uskutočniť pomocou BioRad Mini Trans-Blot® Electrophoretic Transfer Celí podľa manuálu s použitím 12,5 mM tris-Cl, pH 8,3, obsahujúceho 96 mM glycínu, 10 % metanolu a 0,01 % SDS. Proteíny sa prenesú na 1 hodinu pri 100 V do aparátu BioRad Mini Trans-Blot®. Membránu možno zablokovať na 1 hodinu pri laboratórnej teplote rotáciou alebo cez noc pri 4 °C 5 % (hmotnosť/objem) odtučneného mlieka (Camation) v TBS-Tween (20 mM Tris-Cl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,05 % Tween 20). Membránu možno potom krátko premyť v TBS-Tween a inkubovať s rotáciou na jednu hodinu pri laboratórnej teplote v králičom antihumánnom erytropoetíne (R & D Systems) zriedeným 1/1000 s 2,5 % (hmotnosť/objem) odtučneného mlieka v TBS-Tween (konečná koncentrácia 1 ug/ml). Membrána sa dôkladne premyje a vyvinie metódou ako napríklad chemiluminiscenciou s použitím Amersham ECLTM Kit a exponuje sa na film. Dolný limit detekcie GA-EPO touto technikou je asi 10 - 20 ng (SDS-PAGE nasledovaný Westem Blot).

Ak sa má Blot preskúšať inou protilátkou, membránu možno uvoľniť pomocou 60 mM Tris-Cl, pH 7,5, obsahujúcim 2,0 % SDS počas 2 hodín pri laboratórnej teplote s rotáciou. Škvrna sa znova zablokuje blokovacím tlmivým roztokom. Potom sa pridá nová primárna protilátka, ako je opísané skôr. Detekciu transferínu možno napríklad uskutočniť pomocou protilátky ovčieho antihumánneho trasferín-HRP konjugátu (Biodesign). Na detekciu hovädzieho albumínu možno použiť ovčí anti-hovädzi albumín-HRP konjugát. Škvrny sa vymývajú a vyvíjajú podľa uvedeného postupu.

Claims (46)

1. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetínov, vyznačujúci sa tým, že obsahuje tieto stupne: a) kontaktovanie biologickej tekutiny obsahujúcej erytropoetíny s heparínovým nosičom tak, že uvedené erytropoetíny sa viažu na uvedený heparínový chromatografický nosič; b) elúcia uvedených erytropoetínov elučným tlmivým roztokom; a c) zber uvedených erytropoetínov.

2. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetínov podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m, že ide o prvý stupeň viacstupňového postupu čistenia erytropoetínov.

3. Chromatograficky stupeň na čistenie erytropoetinov podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že ide o akýkoľvek stupeň viacstupňového postupu čistenia erytropoetínov.

4. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že tento stupeň slúži na odstránenie proteínov kontaminujúcich erytropoetíny.

5. Chromatograficky stupeň na čistenie erytropoetinov podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že uvedenými proteínmi sú sérové proteíny.

6. Chromatograficky stupeň na čistenie erytropoetinov podľa jedného z nárokov 4 alebo 5, vyznačujúci sa tým, že kontaminujúce proteíny sú vybrané zo skupiny teľacieho séra, hovädzieho séra, fetálneho hovädzieho séra, sérového albumínu a transferínu.

7. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že uvedený viacstupňový proces obsahuje jeden alebo viac chromatografických krokov vybraných zo skupiny chromatografie iónovej výmeny, hydrofóbnej interakcie, vylučovania veľkostnej frakcie, reverznej fázy alebo afinitnej chromatografie.

8. Chromatograficky stupeň na čistenie erytropoetinov podľa ktoréhokoľvek z nárokoví až 4, vyznačujúci sa t ý m , že uvedená biologická tekutina sa filtruje skôr, ako sa kontaktuje s uvedeným nosičom s heparínovou afinitou.

9. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujú c i sa t ý m , že uvedená biologická tekutina sa ultrafiltruje skôr, ako sa kontaktuje s uvedeným nosičom s heparínovou afinitou.

10. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že uvedená biologická tekutina sa centrifuguje skôr, ako sa kontaktuje s uvedeným nosičom s heparínovou afinitou.

11. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujú c i sa t ý m , že uvedená biologická tekutina sa dialyzuje skôr, ako sa kontaktuje s uvedeným nosičom s heparínovou afinitou.

12. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sa uvedený materiál ultrafiltruje na membráne pre frakciu molekulových hmotnosti 5 000 - 100 000.

13. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sa uvedený vyčírený materiál ultrafiltruje na membráne pre frakciu molekulových hmotností 10 000 - 30 000.

14. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sa uvedený materiál filtruje na 0,45 mikrónovej membráne.

15. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že viazanie uvedených erytropoetínových molekúl prebieha pri pH 5 až 8.

16. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že viazanie uvedených erytropoetínových molekúl prebieha pri pH 6,2.

17. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že uvedená biologická kvapalina sa vyčiri skôr, ako sa kontaktuje s uvedeným nosičom s heparínovou afinitou.

18. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že uvedená biologická kvapalina sa vyčiri centrifugovaním.

19. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa t ý m , že viazanie uvedených molekúl erytropoetínu prebieha vo vyrovnávacom tlmivom roztoku.

20. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4 alebo 19, vyznačujúci sa tým, že viazanie uvedených molekúl erytropoetínu prebieha v tris(hydroxymetyl)aminometánovom tlmivom roztoku.

21. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4 alebo 19, vyznačujúci sa tým, že viazanie uvedených molekúl erytropoetínu prebieha v tlmivom roztoku kyseliny 2-(N-rnorfolin)-etánsulfónovej.

22. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4 alebo 19, vyznačujúci sa t ý m, že viazanie uvedených molekúl erytropoetínu prebieha vo fosfátovom tlmivom roztoku.

23. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4 alebo 19 až 22, vyznačujúci sa tým, že viazanie molekúl erytropoetínu prebieha pri pH 4,9 až 8,0.

24. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že viazanie molekúl erytropoetínu prebieha pri pH 5,9 až 7,5.

25. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že viazanie molekúl erytropoetínu prebieha pri pH 6,2.

26. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že viazanie molekúl erytropoetínu prebieha pri pH 7,0.

27. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujú c i sa eluovaním uvedených erytropoetinov zmenou elučného tlmivého roztoku.

28. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že eluovanie uvedených erytropoetinov sa uskutočňuje zvyšovaním koncentrácie soli v tlmivom roztoku.

29. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že eluovanie uvedených erytropoetinov sa uskutočňuje premývaním kolóny ďalšími soľami a/alebo tlmivými roztokmi.

30. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že eluovanie uvedených erytropoetinov sa uskutočňuje zmenou pracovného pH elučného tlmivého roztoku.

31. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov ako v jednom z nárokov 19 alebo 27, vyznačujúci sa t ý m , že uvedený tlmivý roztok ďalej obsahuje antiadsorbent.

32. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa nároku 31, vyznačujúci sa tým, že uvedený tlmivý roztok ďalej obsahuje polysorbátový prípravok.

33. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetinov podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že eluovanie uvedených erytropoetinov sa uskutočňuje zvyšovaním koncentrácie soli - alkalického halogenidu.

SK 284315 Β6

34. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetínov podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že uvedeným alkalickým halogenidom je chlorid sodný (NaCI).

35. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetínov podľa jedného z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa t ý m , že uvedená biologická tekutina je kultivačnou tekutinou.

36. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetínov podľa nároku 35, vyznačujúci sa t ý m , že uvedená kultivačná tekutina je vyčírená.

37. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetínov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že biologická tekutina alebo nazbieraná kvapalina obsahujúca erytropoetíny je po výmene tlmivého roztoku.

38. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetínov podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že metóda uvedenej výmeny tlmivého roztoku je vybraná z tangenciálnych prúdových systémov, dutých vláken, špirálovo vinutých filtrov, miešaných bunkových systémov, dialýzy, diafiltrácie, filtrácie alebo konvenčnej chromatografie.

39. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetínov podľa nároku 38, vyznačujúci sa tým, že sa uvedená výmena tlmivého roztoku uskutoční dialýzou alebo diafiltračnou membránou s výberom frakcií molekulovej hmotnosti 5 000 až 10 000 alebo 10 000 až 30 000.

40. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetínov podľa nároku 37, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že sa uvedená výmena tlmivého roztoku uskutočňuje medzi pH 6 a 8.

41. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetínov podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že sa uvedená výmena tlmivého roztoku uskutočňuje medzi pH 5,9 a 7,5.

42. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetínov podľa nároku 41,vyznačujúci sa tým, že sa uvedená výmena tlmivého roztoku uskutočňuje medzi pH 6,2 až 7,0.

43. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetínov podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že sa uvedená výmena tlmivého roztoku uskutočňuje oproti tlmivému roztoku s obsahom soli až 200 mM.

44. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetínov podľa nároku 43, vyznačujúci sa tým, že sa uvedená výmena tlmivého roztoku uskutočňuje oproti tlmivému roztoku s obsahom soli až 10 mM.

45. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetínov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujú c i sa t ý m , že uvedený nosič s heparínovou afinitou je z komerčne dostupného zdroja.

46. Chromatografický stupeň na čistenie erytropoetínov podľa nároku 43, vyznačujúci sa tým, že uvedený nosič s heparínovou afinitou je z komerčne dostupného zdroja.