CN1200948C - 红细胞生成素的肝素层析 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用肝素层析法由生物液体和培养液体回收红细胞生成素的简单而有效的方法。本发明可以用来获得研究和商业用量的红细胞生成素。

Description

红细胞生成素的肝素层析

本发明涉及使用肝素层析法由生物液体和培养液体回收红细胞生成素的简单而有效的方法。本发明可以用来获得研究和商业用数的红细胞生成素。

肝素是高度硫酸化的糖胺聚糖。具体地说，肝素是由L-二吡喃糖醛酸2-硫酸盐和2-脱氧-2-硫氨-D-吡喃葡萄糖6-硫酸盐重复二聚体组成的粘多糖，分子量范围为5,000-30,000。一般通过肝素与支持基质(如HeparinSepharoseCL-6B是由与肝素通过溴化氰方法连接的琼脂糖CL-6B组成)的共价结合使肝素亲和力用于纯化各种蛋白质。

肝素层析以与蛋白质相互作用的两种主要方式为基础：(1)作为亲和性配体和(2)作为具有高含量的阴离子硫酸盐基团的阳离子交换剂。然而，对于单个的和肝素具有相互作用的蛋白质的确切性质经常是亲和性和离子交换相互作用的组合，也不能精确地预测这种相互作用的确切性质。

肝素层析已经用于各种蛋白质的纯化(亲和性层析、原则和方法；Pharmacia出版物18-1022029)：这些蛋白质包括酶(肥大细胞蛋白酶、脂蛋白脂肪酶、凝聚酶、超氧化物岐化酶)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(抗凝血酶III、蛋白酶连接蛋白)、生长因子(成纤维细胞生长因子、施旺细胞生长因子、内皮细胞生长因子)、胞外基质蛋白质(纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、血小板反应蛋白、胶原)、结合核酸的蛋白质(起始因子、限制核酸内切酶、DNA连接酶、DNA和RNA聚合酶)、激素受体(雌激素和雄激素受体)和脂蛋白。

本发明的一个目的是提供红细胞生成素的总纯化方法中的合适的层析步骤。所说的肝素层析可以作为在多步方法中的第一个步骤或后面的步骤。肝素层析提供了一种不同于本领域描述的其它纯化过程的能够选择性地除去杂质的合适纯化步骤，因此本发明提供了一种在均相红细胞生成素制剂中的重要选择性纯化步骤。红细胞生成素的来源可以是多方面的，其包括有机体(例如人泌尿红细胞生成素)；将完整的红细胞生成素基因引入哺乳动物细胞后得到的细胞培养液；或者激活人体细胞中的内源性红细胞生成素基因后得到的细胞培养液。

本发明的肝素层析特别是适合于并入到一个总纯化方案来指导获得红细胞生成素的均相制剂。一般地，作为在市场上流行的方法是由一系列很容易与产量相对应的步骤组成，其能满足药物生产的需求。本文所描述的肝素层析步骤能够并入到高回收率的纯化红细胞生成素的大规膜纯化方案中。本发明的特点是肝素层析能够并入红细胞生成素的总纯化方案或者作为合适的第一层析步骤，或者作为以后的步骤在多步过程的任何位置使用。

许多层析步骤不能很好地适合于作为层析步骤的第一步使用。第一步层析步骤必须能够处理大量的本来存在于生物或培养液中的营养成分和蛋白质。合适的第一步层析步骤提供了具有高回收率的所需蛋白质的合理的蛋白质纯化方法，并且具有一定的与大量蛋白质和培养基取代物的样品相互作用的能力。例如，肝素层析用作方便和合适的不依赖于培养条件(例如在发酵罐或摇瓶中的生长、作为依赖锚基或不依赖锚基的细胞、有或没有血清蛋白质)的第一纯化步骤。已经发现本发明的肝素层析步骤在红细胞生成素纯化中可作为满足这些标准的合适的第一步。

在经许多初始的分级分离纯化步骤(包括但不限于离子交换、疏水作用、大小排阻、亲和性、通过分级分离、盐或醇沉淀、制备性凝胶电泳、或通过制备等电聚焦)之后，肝素层析很适合作为红细胞生成素的进一步纯化的随后步骤。将肝素层析并入到一个总纯化方案中，通过选择性的除去以后纯化步骤不易分离的杂质，这样也可以增加以后纯化步骤的效率。

肝素层析提供了一种有用的纯化步骤以便从生物或培养液中以很高的回收率得到在生物学上具有活性的红细胞生成素。此外，可以只使用本领域的技术人员认为有优势的水溶剂来进行肝素层析。因为可以设计这样一种纯化步骤，即蛋白质不易受到变性剂、有机溶剂或酸影响(这些试剂对回收结构完整和具有生物学活性的蛋白质是有害的)，所以只使用水溶剂是有利的。而且，肝素层析可以在非常温和的条件(如中性pH和/或低的盐浓度)下进行。因为在低或高pH和高盐条件下红细胞生成素对聚集作用或desialation敏感时，所以肝素层析的这一性质是特别有价值的(Endo，Y.等，生物化学杂志112，700-706(1992))。因此，这种技术在红细胞生成素分子的层析期间提供了防止生物活性丧失的较温和的水溶剂条件。

本发明的目的涉及纯化红细胞生成素的层析步骤，包括：a)将包含红细胞生成素的生物液体与肝素亲和性支持物在使所说的红细胞生成素分子结合到肝素亲和性支持物的条件下相接触；b)用洗脱缓冲液洗脱所说的红细胞生成素分子；和c)收集所说的红细胞生成素。上述的层析步骤可以作为纯化红细胞生成素的第一层析步骤，或者包含在多步过程的任何位置。层析步骤对除去红细胞生成素的杂质蛋白质(例如血清蛋白，特别是(但不限于)那些选自小牛血清、牛血清、胎牛血清、血清白蛋白和运铁蛋白组成的组)特别有用。在本发明的纯化红细胞生成素的范围内包含一种层析方法，在这种层析方法中相关的生物液体培养液。

本发明也涉及肝素层析步骤，其可以包含在纯化红细胞生成素的多步过程的任何位置，例如(但不限于)还包括选自由离子交换、疏水作用、大小排阻、反相或亲和性层析组成的组中的一个或多个层析步骤。

本发明还涉及纯化红细胞生成素中的层析步骤，此层析步骤还包括，例如(但不限于)通过离心澄清相关的生物液体。另外，对所说的生物液体可以进行离心、过滤、超滤、渗析或这些方法的组合。当对生物液体进行超滤时，可以使用(但不限于)5,000-100,000D的截断膜或10,000-30,000D的截断膜。当对所说的生物液体过滤时，可以使用也可以不使用(但不限于)45微米的膜。

在本发明中，所说的红细胞生成素分子的结合可以发生在(但不限于)平衡缓冲液中。这样的缓冲液包括(但不限于)4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸缓冲液(MES)、三(羟甲基)甲胺(Tris)或磷酸缓冲液或任何其它的使红细胞生成素结合的合适缓冲液。此外，所说的红细胞生成素分子的结合可以发生在(但不限于)大约pH 4.9-8.0，优选的大约为pH 5.9-7.5，更优选的为pH 6.2或7。

此外，本发明的层析步骤包括通过变化洗脱缓冲液洗脱所说的红细胞生成素，可以选择地(但不限于)通过增加缓冲液中盐浓度、用另外的缓冲液洗涤柱或者改变洗脱缓冲液的操作pH洗脱所说的红细胞生成素。可以通过(但不限于)加入碱卤化物(如氯化钠(NaCl))调整洗脱缓冲液的盐浓度。本发明的另外的实施方案包括将或不将抗吸附剂(例如(但不限于)Tween)加入任何的缓冲液。

本发明的层析步骤还包括交换含有红细胞生成素的培养基的缓冲液，例如(但不限于)生物液体或收集的样品。这样的缓冲液交换方法包括(但不限于)切向流系统、中空纤维、螺旋滤器(spiral wound filter)、搅拌器系统、透析、渗滤、过滤步骤或者常规层析。当通过透析或渗滤进行缓冲液交换时，可以使用也可以不使用(但不限于)5,000-10,000或者10,000-30,000分子量的膜。可以在选择的pH和缓冲液盐浓度下进行缓冲液的交换，例如在(但不限于)pH 6-8、pH 5.9-7.5和pH 6.2-7.0以及0-200mM盐浓度的缓冲液(更优选的是0-10mM盐浓度的缓冲液)。

本发明的另一个实施方案将使用大量的肝素亲和性支持物，这些支持物在市场上能够买到，例如(但不限于)Heparin Sepharose CL-6B、Heparin Sepharose 6 Fast Flow、HiTap Heparin、AffigenHeparin、Heparin Agaraose、Heparin Sepharose、Heparin HyperD和Heparin Agarose 6XL。

                        发明背景

由哺乳动物细胞体外或体内产生的红细胞生成素是具有165个氨基酸的成熟氨基酸序列并且包含三个连接N和一个连接氧的寡糖链的糖蛋白。连接氮的寡糖链发生在24、38、和83位的天冬酰胺残基上，而连接氧的寡糖链发生在126位的丝氨酸残基上，参见Lai等生物化学杂志261，3116(1986)；Broudy等生物化学生物物理学学报，265，329(1988)。通过人类红细胞生成素的基因组和cDNA克隆的分离已经大概知道红细胞生成素的165个氨基酸编码区和加工过的前导序列。参见Jacobs等自然，313，806；Lin，F.K.等美国国家科学院年报82，7580(1985)。

大量的科学论文、专利和专利申请针对红细胞生成素的分离。相关的参考文献的简要概述表明在红细胞生成素的分离方面使用了很多层析步骤。下列的参考文献显示的是来源和方法的目录，并没有试图详尽地描述每一个层析步骤的操作。此外，下列的参考文献只是为了表明本领域技术的大体状况，并没有作为本领域已知技术的全部罗列。

下列科学文献中已经描述了使用阴离子和阳离子交换层析来纯化红细胞生成素：(1)(Mono Q)Broudy，V.C.(1988)生物化学和生物物理学学报，265，329-3366；(2)(DEAE Sephacel)Ghanem，A.B.等(1994)制备生物化学24，127-142；Quelle，F.W.等(1989)血液，74，652-657；(3)(DEAE Agarose)Miyake，T.等(1977)生物化学杂志252，5558-5564；(4)(S-Sepharose)Fibi，M.R.等(1991)血液77，1203-1210；(5)(Sulfopropyl Sephadex)Goldwasser，E.和Kung，C.K.H.(1971)PNAS68，697-698；和(6)(磺酸基丙基葡聚糖凝胶)Miyake，T.等(1977)生物化学杂志252，5558-5564。

在下列专利文献中描述了弱碱阴离子交换树脂(例如DEAE)的特殊用途，即将其作为第一步层析步骤：(1)US 4397840(优先权申请815P-0034727)；和(2)JP 56016496A(优先权申请79JP-0092999)。在下列专利文献中描述了通过Q-Sepharose更强的碱性阴离子交换树脂在分离同工型红细胞生成素上的用途：(1)EP 4282267A2、WO91058677和EP 428267A(优先权89US-0421444)。在下列的专利文献中公开了强离子交换树脂作为一般方法来从不纯的蛋白质中分离所需的蛋白质的用途：EP 313343A、EP391934A和WO8903840A(优先权申请87US-0111886)。

在下列的科学文献中描述了在纯化红细胞生成素过程中使用Cibacron蓝色染料的亲和性层析：(1)(CM Affi-Gek Blue)Krystal，G.等(1984)英国血液学杂志58，533-64；和(2)(CM Affi-Gek Blue)Broudy，V.等(1988)，生物化学和生物物理学学报，265，329-336；(3)(CM Affi-GekBlue)Krystal，G.等(1986)，血液，67，71-79；(4)(CM Affi-GekBlue)Yanagi，H.等(1989)，DNA，8，419-427；(5)(BlueTrisacrylM)Fibi，M.R.等(1991)血液，77，1203-1210。

和Cibacron蓝色染料一样，在下列的专利文献中使用了蒽醌：(1)JP59065021A(优先权申请825P-0174678)；(2)(作为CM Affi-Gek Blue的结合的羧甲基基团和Cibacron Blue F3GA)JP01165393A(优先权申请87JP-0324910)。

在下列科学和专利文献中描述使用大小排阻层析来纯化红细胞生成素：(1)(TSK G3000SW)Yanagi，H.等(1989)DNA，419-427；(2)Fibi，M.R.等(1991)血液77，1203-1210；(3)(Sephadex G-100)Goto，M.等(1988)生物技术6，67-70；Yanagawa，S.等(1984)生物化学杂志259，2707-2701；Miyake T.等(1977)生物化学杂志252，5558-5564；(4)JP01165393A(优先权申请875P-0324910)。

在下列科学和专利文献中描述使用羟基磷灰石来纯化红细胞生成素：Krystal，G.等(1986)血液67，71-79；Yanagi，H.(1989)等DNA 8，419-427；(BioRad HPHT)Goto，M.等(1988)6生物技术，67-70；(磷酸钙凝胶)Goldwasser，E.和Kung，C.K.H.(1971)PNAS 68，697-698；(BioRadBioGel HT)Miyake，T.等(1977)生物化学杂志252，5558-5564；JP01165393A(优先权申请87JP-0324910。在US4398886、WO8602068A、EP176299A、EP 239311A(优先权申请84WO-JP00460、86JP-0066399和87JP-0066940)、US5256769和EP 176299B中给出了使用羟基磷灰石(特别是HPLC方式)(或者是组合步骤)分离含有起始甲硫氨酸(Met-蛋白质)的蛋白质杂质的方法。

在下列科学文献中公开了一般使用固定化抗体进行红细胞生成素的免疫亲和层析：Miyazaki，H.等(1988)免疫学方法杂志，113，261-267；Goto，M.等(1988)生物技术6，67-70；Yanagawa，S.等(1984)制备生物化学24，127-142；Ghanem，A.B.等(1994)制备生物化学24，127-142；Wojchowski，D.M.等(1987)生物化学生物物理学学报913，170-177。

在下列专利文献也公开了一般使用固定化抗体进行免疫亲和层析：EP249932A(优先权申请865P-0139142)和更针对红细胞生成素的US4558006、US 5106760和EP 116446B1(优先权申请83US-0463724)；JP56108798A(优先权申请80JP-0011685)；JP 4117400A、JP 59116297A和JP 94089040B2(优先权申请82JP-0231539)；JP 940866480B2、JP04117400A、US 4465624(优先权申请83JP-0026399)、US 4831118(优先权申请87US-0083670)、US 4568488(优先权申请84US-0570075)和US4558005。

在下列的科学文献和专利文献中都公开了使用反相高压液相色谱(RP-HPLC)作为红细胞生成素的总纯化中的一步：(1)(DEAE-C4 RP-HPLC-Con A琼脂糖Quelle，F.W.等(1989)血液，74，652-657；(2)(Blue TrisacrylM-S-Sepharose-C8 RP-HPLC-大小排阻)Fibi，M.R.等(1991)血液，77，1203-1210；(3)(RP-HPLC-分子筛层析)JP 62036400A(优先权申请855P-0177337)。

在下列的科学文献和专利文献中将RP-HPLC描述为最后层析步骤：Jacobs，K.等(1989)，自然313，806-810；(阳离子交换层析-RP-HPLC)Broudy，V.等(1988)，生物化学和生物物理学报，265，329-336；Krystal，G.等(1986)，血液，(DEAE-Agarose-Sulphopropyl-Sephaedx凝胶过滤-羟基磷灰石-RP-HPLC)EP 209539B1和US 5322837(优先权申请85US-0690853)；美国专利4,677,016、EP228452A、WO 8607594A(优先权申请86US-0872152)。

在下列的科学文献和专利文献中都公开了纯化红细胞生成素的一些附加步骤：(1)(凝集素亲和性层析)Krystal，G.等(1986)血液67，71-79(麦胚)；Quelle，F.W.等(1989)血液，652-657；EP 358463A(优先权申请88A-0006645)(2)(层析聚焦)Krystal，G.等(1986)血液，67，71-79，PBE94；(3)(制备SDS-PAGE)Krystal，G.等(1986)血液，67，71-79；和(4)(甲基化的白蛋白硅藻土)；Goldwasser，E.和Kung，C.K.H.(1971)PNAS 68，697-698；(5)(对多孔聚苯乙烯、脱乙酰壳多糖或硅藻土的支持物的吸收)作为优先权申请的79JP-01306677的US 4303650；(6)(疏水作用层析)Lee Haung等(1980)，血液，56，620-624；Wojchowski等(1987)生物化学和生物物理学913，170-178。

在科学和专利文献中报道的纯化红细胞生成素的广泛技术中，上述的参考文献没有一篇使用肝素层析。因此，本发明提供了纯化红细胞生成素的新的并且有利的纯化步骤。

                   附图的描述

图1. 4％血清的GA-EPO的Heparin-Sepharoe层析

图1是一个层析谱，其显示了表达GA-EPO的细胞系的培养物上清液的Heparin-SepharoseCL-6B分级分离。在Cell Cube(Costar)中，在含有4％胎牛血清的培养基中将细胞繁殖为依赖锚基的培养物。在pH 6.2时，在Heparin-SepharoseCL-6B上分离出实施例1所述的经超滤、膜渗滤的培养物上清液，并且通过ELISA(_O_)测定组分中的GA-EPO含量。__代表在280nm的吸收率。---代表NaCl梯度。

图2.2％血清的GA-EPO的Heparin-Sepharoe层析

图2是一个层析谱，其显示了衍生于表达GA-EPO细胞系培养物上清液的Heparin-SepharoseCL-6B分级分离。在试管(Costar)中，在含有2％胎牛血清的培养基中将细胞繁殖为依赖锚基的培养物。在pH 6.2时，在Heparin-SepharoseCL-6B上分离出实施例2的经超滤、膜渗滤的培养物上清液，并且通过ELISA(_O_)测定组分的GA-EPO含量。(__)代表在280nm的吸收率。(---)代表NaCl梯度。

图3不含血清的培养基中的GA-EPO的Heparin-Sepharose层析

图3是一个层析谱，其显示了从表达GA-EPO细胞系培养物上清液中回收的GA-EPO的Heparin-SepharoseCL-6B分级分离。在旋转摇瓶培养基(不含血清)的悬浮液中繁殖细胞。在pH 6.2时，在Heparin-SepharoseCL-6B上分离出实施例3的经超滤、膜渗滤的培养物上清液，并且通过ELISA(_O_)测定组分的GA-EPO含量。(__)代表在280nm的吸收率。(---)代表NaCl梯度。

图4.4％血清的GA-EPO的Heparin-Sepharoe6 Fast Flow层析

图4是一个层析谱，其显示了从表达GA-EPO细胞系培养物上清液中回收的GA-EPO的Heparin-Sepharose6 Fast Flow分级分离。在试管(Costar)中，在含有4％胎牛血清的培养基中将细胞繁殖为依赖锚基(anchorage)的培养物。在pH 7时，在Heparin-Sepharose6 Fast Flow上分离出实施例4的经超滤、膜渗滤的培养物上清液，并且通过ELISA(_O_)测定组分的GA-EPO含量。(__)代表在280nm的吸收率。(---)代表NaCl梯度。

图5在经离子交换和疏水作用层析初步纯化后的2％血清中的GA-EPOHiTrap Heparin层析

图5是一个层析谱，其显示了从表达GA-EPO细胞系培养物上清液中回收的GA-EPO的HiTrap Heparin(Pharmacia)分级分离。在含有2％的小牛血清的培养基的滚动瓶中繁殖细胞。使用Pharmacia Streamline通过离子交换层析初步分级分离后，在Phenyl SepharoseFast Flow(Pharmacia)上进行疏水作用层析和在Q-SepharoseFast Flow(Pharmacia)上进行离子交换层析。对从Q-Sepharose树脂中洗脱出来的部分纯化的物质进行渗析，并且在pH 6.2时在HiTrap Heparin上分离，并且通过ELISA(_O_)测定组分中的GA-EPO含量。(__)代表在280nm的吸收率。(---)代表NaCl梯度。

图6疏水作用层析初步纯化后的2％血清中的GA-EPO的HiTrap Beparin层析

图6是一个层析谱，其显示了从表达GA-EPO细胞系培养物上清液中回收的GA-EPO的HiTrap Heparin(Pharmacia)分级分离。在含有2％的小牛血清的培养基的滚动瓶中繁殖细胞。在Phenyl SepharoseFastFlow(Pharmacia)上通过疏水作用层析进行初步分级分离。将从树脂中洗脱出来的部分纯化的物质进行渗析，并且在pH 5.2时在HiTrap Heparin上分离，并且通过ELISA(_O_)测定组分的GA-EPO含量。(__)代表在280nm的吸收率。(---)代表NaCl梯度。

图7.衍生于CHO细胞d红细胞生成素的HiTrap肝素层析

图7是一个层析谱，其显示了中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的掺加到含有2％小牛血清的膜渗滤的无条件培养基中的红细胞生成素(R&D系统)的HiTrap Heparin(Pharmacia)分级分离。在pH 7.0在HiTrap Heparin上分离掺加的(spiked)膜渗析的培养基，通过ELISA(_O_)测定组分的GA-EPO含量。(__)代表在280nm的吸收率。(---)代表NaCl梯度。

                    表的描述

表1肝素层析：纯化表

表1编辑了使用肝素层析作为第一步或以后步骤而得到的一些数据。所示的实施例涉及很多的培养条件，其中包括依赖锚基和不依赖锚基的细胞以及在培养基中含有或不含有各种浓度的胎牛血清或小牛血清。同样，实施例显示了很多层析条件。在表中给出的次序是实施例#(柱1)、生长条件(柱2)、纯化条件(柱3)、ELISA单位/mg(具体的活性表述为EU/mg，柱4)、多次纯化(柱5)和回收百分比(柱6)。

                   发明的详细描述

红细胞生成素调节红细胞样祖细胞的生长和最终成熟，从而成为成熟的血红细胞。红细胞生成素是由成年人的肾、成红细胞和胎儿的肝细胞产生的。肾功能减弱的患者产生的红细胞生成素减少，从而导致严重的贫血。已经有效地使用了纯化了的天然和重组体的红细胞生成素治疗慢性贫血患者(Canaud，B.(1990)，美国肾脏疾病杂志，169-175；Faulds，D.等(1989)，药物38，863-899；Winearles，C.G.等(1986)Lancet 1175-1178)。

由于各种复杂的翻译后修饰(特别是糖基化作用)，红细胞生成素实际上包括很多种化学物。本文所描述的红细胞生成素一般有以下两个特性：(1)它们具有与人红细胞生成素基因编码的蛋白质十分相似的氨基酸序列；和(2)在体内具有增加网状细胞和红细胞产生的生物特性。

如上所述，人类泌尿系统和哺乳动物细胞产生的重组红细胞生成素是具有165个氨基酸的成熟氨基酸序列并且包含三个连接N和一个连接氧的寡糖链的糖蛋白。连接氮的寡糖链发生在24、38、和83位的天冬酰胺残基上，而连接氧的寡糖链发生在126位的丝氨酸残基上，参见Lai等生物化学杂志261，3116(1986)；Broudy等生物化学生物物理学学报，265，329(1988)。红细胞生成素(EPO)具有表观分子量，其分子量变化取决于凝胶电泳条件(例如参见Brody，V.等，生物化学生物物理学学报265，329-336(1998)；Krystal，G.等，血液67(1)，71-79(1986)；Yanagi，H.等，DNA 8(6)，419-427(1989)。由于与红细胞生成素分子蛋白质部分相连的碳水化合物的结构多样性，实际分子量是变化的，因此分子量有一个变化范围。这种多样性部分取决于体内或体外的产生蛋白质的细胞类型。

本发明的纯化红细胞生成素可以是任何一种已知的具有生物学和/或药学兴趣的红细胞生成素。本文所使用的术语″红细胞生成素″或″红细胞生成素产品″旨在包括(1)从体内(如Miyake，T.等(1977)生物化学杂志252(15)5558-5564描述的人尿)分离的红细胞生成素，(2)由来源于人类细胞的活化的红细胞生成素基因而产生的红细胞生成素，如在WO 94/12650中描述的(也表述为GA-EPO)，(3)将红细胞生成素基因引入到人宿主细胞而产生的红细胞生成素，例如由Yanagi，H.等(1989)DNA 8(6)，419-427所描述的，和(4)将红细胞生成素基因引入非人类宿主细胞而产生的红细胞生成素，例如在美国专利4,703,008中描述的。

″产生红细胞生成素的细胞″可以是真核起源的细胞，优选的是脊椎动物起源的细胞，更优选的是哺乳动物起源的细胞，最优选的是人类起源的细胞。在合适的培养基中培养产生红细胞生成素的细胞，能够产生所需的达到回收量的红细胞生成素，这些细胞代表性的例子包括成纤维细胞、角质形成细胞、上皮细胞(例如乳房上皮细胞、肠上皮细胞)、内皮细胞、神经胶质细胞、神经细胞、学液中发现的细胞(例如淋巴细胞、骨髓细胞)、肌肉细胞和这些体细胞类型的前体。如上所述，这些细胞更优选的是哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、牛、鸟、绵羊、山羊、马、猴子和人类)起源的，最优选的是灵长类或人类起源的。产生红细胞生成素细胞也可以是转染的脊椎动物起源的初级、次级和无限增值的细胞，特别是用能直接或间接引起细胞产生可回收量的红细胞生成素的外源基因物质转染的哺乳动物起源和灵长类或人类起源(最优选的)的细胞。

本发明的肝素层析方法涉及从″生物液体″分离红细胞生成素。本文所使用的″生物液体″包括从细胞内分离出来的红细胞生成素(例如从胞质或包涵体或液泡分离得到的)，或从培养基中分离的红细胞生成素(当所说的细胞分泌红细胞生成素时)。可以发现分泌分子，然后将其从生物液体(例如血液、牛奶、腹水、尿或细胞培养液)中分离出来。

例如，当培养细胞时，细胞把红细胞生成素分泌到″培养液″中。用于分离红细胞生成素的肝素层析方法特别适宜于从产生红细胞生成素细胞的培养液中回收红细胞生成素。本文所使用的术语培养液优选地指任何使用的或来源于能够产生红细胞生成素的培养细胞的液体。

优选地，使用过滤、超滤、离心或本领域技术人员已知的其它技术从细胞和细胞碎片中分离用于纯化红细胞生成素的生物液体或培养液，此外，术语“澄清的液体”用于通过离心、过滤、超滤或者本领域熟知的类似技术从细胞、细胞碎片或颗粒物质中分离出来的生物液体或培养液。因为红细胞生成素分子经常是从“澄清的液体”中纯化出来的，所以从培养基(无论是生物液体还是培养液)中分离细胞和颗粒碎片是有利的。可以通过很多步骤来完成这一过程，其中包括离心和过滤，也包括本领域熟知的超滤(Uf)。术语“澄清的液体”也可以包括含有已经进行了预先层析或纯化步骤(在此步骤中从样品中除去细胞和细胞碎片以及其它的细胞和培养基杂质)的红细胞生成素液体。

经常需要用含有红细胞生成素的培养基与实验室熟知的缓冲液进行″缓冲液交换″。可以独立地进行这一步骤或与其它步骤结合进行。可以通过本领域技术人员熟知的许多方法进行″缓冲液交换″，其中包括(但不限于)切向流系统、中空纤维、螺旋创伤(wound)滤器、搅拌器系统或者本领域熟知的常规层析。本文所使用的更优选的方法是渗滤(Df)。此时，优选的膜是聚砜膜或者从市场(例如Millipore或Amicon公司)上可以买到的再生纤维素膜。此外，用于过滤步骤的膜优选的是那些具有大约5,000-100,000分子量的截断膜，更优选的是大约10,000-30,000分子量的截断膜。然后可选择地将渗余物按照本领域熟知的方法进行透析和/或渗滤，优选地是在pH 6-8的同一缓冲液中进行。盐浓度优选的是0-200mM，并且更优选的盐浓度为0-10mM。优选的pH从4.9至8.0，更优选的从5.9-7.5，最优选的pH大约6.2至7.0。

一般地，在哺乳动物细胞培养液中的主要杂质蛋白质来源于血清或加入到培养基中的蛋白质。这在一定程度上是因为许多细胞类型对存在的足量血清的依赖性。从市场上得到的细胞培养基常常含有(或已经加入)小牛血清、牛血清、胎牛血清、血清白蛋白或其它纯化或部分纯化的血清蛋白(例如运铁蛋白或它们的组合物)，从这些培养基中可以纯化所需的蛋白质。因此通常纯化过程的第一步是需要直接除去血清组分。

肝素层析方法并不只限于纯化过程的第一步。在多步过程的纯化方法中的任何位置使用肝素层析都是合适的。在肝素层析前可以通过任何一种部分分级分离方法或层析方法(包括但不限于离子交换、疏水作用、大小排阻、反相或亲和性)制备部分纯化的红细胞生成素。

″肝素亲和性支持物″是指用于肝素层析的任何已知的接受肝素分子的层析支持物，其中肝素稳定结合到树脂支持物上。可以从很多供应商得到肝素亲和性支持物。市售的肝素亲和性支持物包括但不限于HeparinSepharose CL-6B、Hearin Sepharose 6 Fast Flow、HiTapHeparin(Pharmacia)、Affigen Heparin(BioRad)；HeparinAgaraose、Heparin Sepharose类型I和类型II、类型IIS、类型IIS(Sigma)、AF-Heprin Toyopearl 650、Heparin-650M(TosoHaas)；Cellufine Heparin(Amicon)；Heprin Hyper D；Heprin Agarose 6xL(类型I、II和III)(美国国际化学公司)。优选的固体基质是以琼脂糖为基础的，最优选的是颗粒形式的琼脂糖或琼脂糖的衍生物。也可以使用其它的固体基质，例如纤维素或聚丙烯酰胺。

可以通过分批的或柱洗脱进行肝素层析。优选的肝素支持物是在一个柱层析系统中。当使用柱层析系统时，优选的是在0℃至30℃时使用肝素亲和性支持物，更优选的是在4℃和25℃之间，最优选的是在大约4℃。优选地一般是按照厂商的说明书来平衡、制备和保存肝素树脂(例如Heparin SepharoseCL6B是按照Pharmacia说明手册71-7078-00来制备的)。

通过在″平衡缓冲液″第一次平衡所说的支持物来完成红细胞生成素分子和肝素支持物的结合。″平衡缓冲液″处于含水状态，在其中放置结合红细胞生成素分子的支持物，当与生物液体或培养液接触时支持物和红细胞生成素分子结合。在大约pH 4.9-8.0时进行红细胞生成素和柱的结合，更优选的pH为大约5.9-7.5，最优选的pH大约6.2或7.0。

有许多缓冲液适合于和肝素支持物一起使用。优选的缓冲液包括MES(2-[N-吗啉]乙磺酸)、Tris(三[羟甲基]甲胺)或磷酸。用于平衡缓冲液的优选浓度为大约20mM，其具有大约2mS/cm的理想传导率。

在从肝素支持物上洗脱结合的红细胞生成素之前，可以通过使用另外的平衡缓冲液或使用含有附加盐、缓冲液的平衡缓冲液、或通过改变操作pH或使用上述各种方法的组合来洗涤柱从而洗脱杂质。例如，可以在pH 6.2时进行红细胞生成素结合，可以在pH 7.4洗脱一些杂质而不损失红细胞生成素。通过改变成分可以改变缓冲液系统，由此，可以使用此缓冲液来完成红细胞生成素分子的合适的纯化。例如可以通过增加洗脱缓冲液的盐浓度来从肝素支持物中洗脱红细胞生成素。优选的盐是碱性卤化物，最优选的是使用NaCl。

用于平衡或洗脱红细胞生成素的缓冲液可以含有也可以不含有″抗吸附剂″。″抗吸附剂″是任何能够减少红细胞生成素吸附到容器表面、其它蛋白质或其本身(如聚集)的物质。优选的抗吸附剂的例子是脂肪酸的聚氧化乙烯山梨聚糖衍生物，即Tween，″Tween 20″(聚氧化乙烯山梨聚糖单月桂酸酯)是目前优选的表面活性剂。如果使用表面活性剂，优选的使用浓度大约为0.01-0.5％，更优选的浓度大约为0.1％(w/w)。

本发明的肝素纯化步骤可以并入到红细胞生成素纯化的总方案中。例如，此步骤可以和传统的层析步骤(例如离子交换、凝胶渗透层析和反相HPLC)一起使用。

离子交换步骤(在肝素层析前或者在肝素层析后)与肝素层析步骤结合使用包括使用阴离子交换或阳离子交换层析。一般地，用于纯化红细胞生成素的已知的可买到的阴离子交换支持物含有季铵功能基团。用于本方法的优选的基质是琼脂糖或纤维素基质，例如微晶纤维素或交联琼脂糖。更为优选的是那些提供二乙氨乙基、三乙氨甲基或三甲氨甲基官能团的基质。一种特别优选的阴离子交换基质是可以买到的(例如Q-Sepharose FastFlow(Pharmacia))连接琼脂糖的三甲氨甲基。一般地，用于纯化红细胞生成素的已知市售的阳离子交换支持物含有酸性官能团(包括羧基和磺酸)。含有阳离子官能团的基质包括各种形式的纤维素和聚苯乙烯基质。例如，本领域熟知的弱阳离子交换剂包括(但不限于)羧甲基-纤维素、羧甲基-交联葡聚糖糖和羧甲基-琼脂糖糖。本领域熟知的强阳离子交换剂包括(但不限于)磺化聚苯乙烯(AG 50W、Bio-Rex 70)、磺化纤维素(SP-Sephadex)和磺化琼脂糖(S-Sepharose)。

与这些基质有关的层析步骤最优选的是以柱层析进行，这种层析步骤可以在4-25℃的任意温度下进行。通常，向洗涤或洗脱缓冲液加入盐以增加应用或平衡缓冲液的离子强度。任何常规使用的盐都可以用于此目的，这一点本领域技术人员可以很容易地确定。NaCl是比较方便且经常使用的盐之一。

也可以将常规的凝胶过滤步骤与肝素步骤结合起来使用。这些基质代表性的例子是与丙烯酰胺交联的聚右旋糖苷，例如通过将N，N-亚甲基二丙烯酰胺与丙基葡聚糖共价交联而制备的复合的亲水凝胶以及共价交联的纤维素凝胶。公知的市售交联葡聚糖-丙烯酰胺的商标为Sephacryl，可以从Pharmacia公司买到。优选的Sephacryl是Sephacryl S-200 HR。交联纤维素凝胶的例子是那些市售的交联多孔纤维素凝胶，例如可从Amicon公司买到的GLC 300或GLC 1,000。

                     实施例

下列的实施例只是说明性的，并无意限制本发明的范围。纯化红细胞生成素的起始材料可以是来源生物液体或来源于培养在任何合适的培养基(此培养基中含有或者不含有各种量的牛血清或其它血清或者非血清衍生的成分)中的依赖锚基或不依赖锚基细胞。起始材料可以在各种人类或非人类细胞类型中产生。用于产生红细胞生成素的无限增殖化人类细胞系的例子包括(但不限于)：HeLa细胞和HeLa细胞的衍生物(ATCC CCL 2，2.1和2.2)，MCF-7胸癌细胞(ATCC HTB 22)、K-562白血病细胞(ATCC CCL 243)、KB癌细胞(ATCC CCL 17)、2780AD卵巢癌细胞(Van der Blick，A.M.等，癌症研究，48：5927-5932(1988)，Raji细胞(ATCC CCL 86)、Jurkat细胞(ATCC TIB 152)、Namalwa细胞(ATCC CRL 1432)、HL-60细胞(ATCC CCL240)、WiDr细胞(ATCC CCL218)、HT1080细胞(ATCC CCL 121)、Daudi细胞(ATCC CCL213)、RPMI 8226细胞(ATCC CCL 155)、U-937细胞[ATCC CRL1593)、Bowes黑素瘤细胞(ATCC CRL 9607)、WI-38VA13亚系2R4细胞(ATCC CCL 75.1)、MOLT-4细胞(ATCC CRL 1582)以及人类细胞和其它物种的细胞融合产生的异源杂交瘤细胞。可以使用次级的人成纤维细胞菌株，如WI-38(ATCC CCL 75)和MRC-5(ATCC CCL 171)。此外，初级人细胞可以用于产生红细胞生成素。可以通过激活初级、次级或无限增值的人细胞(实质上如WO 94/12650中的描述)，或者通过用红细胞生成素基因转染人或非人器官的初级、次级或无限增殖的细胞来产生红细胞生成素。

说明性的实施例表明以肝素层析作为第一步或以后的纯化步骤显示出肝素层析的多功能性。另外，下列的实施例也表明肝素层析可以使用各种市售的肝素树脂，并且从分析到制备的各种用途中也显示出此步骤可以用于定量。使用从基因激活的人类细胞中分离的GA-EPO(实质上按照WO94/12650中的描述产生)完成实施例1-6和8-9。使用市售的红细胞生成素(在转染CHO细胞后通过表达人红细胞生成素基因而产生的)完成实施例7。

                    实施例1

      肝素层析在纯化过程中作为第一步层析步骤的用途

I.1.起始材料

从在Cell Cube(Costar)繁殖的表达GA-EPO的附着人细胞系获得含有4％胎牛血清的条件培养基。通过离心和0.45微米Nalgene滤膜单位过滤澄清培养基。使用由30,000分子量截断膜装备的Pellicon切向流系统(Millipore)进行超滤/膜渗滤(Uf/Df)。平衡和透析缓冲液为20mM MES，pH 6.2，含有0.5％Tween 20。

I.2.肝素层析

40℃下使用Pharmacia的GradiFrac系统进行肝素层析。用含有0.1％Tween 20的20mM MES(pH 6.2)，以10ml/分钟的流速平衡280ml HeparinSepharoseCL-6B(Pharmacia)柱(14×5cm)。用Pharmacia P50泵以10ml/分钟的流速将样品加入柱中。然后用平衡缓冲液洗涤此柱，直到280nm的吸收率达到稳定。通过用1体积(280ml)含有0.1％Tween 20和0.05M NaCl的20mM MES(pH 6.2)洗涤结合不紧密的蛋白，收集12ml的组分。然后用2倍体积(560ml)的溶解在20mM MES(pH 6.2)中的含有0.1％Tween 20的线型梯度NaCl(0.05M-0.35M)洗涤，然后用1体积的溶解在20mM MES(pH 6.2)中的含有0.1％Tween 20的0.35M NaCl洗涤。然后增加洗脱缓冲液的梯度，为溶解在20mM MES(pH 6.2)中的含有0.1％Tween 20的1.0M NaCl，体积为柱体积的一半(140ml)，然后将此柱保存在1倍体积的此种缓冲液(280ml)。

通过在280nm吸收率检测总蛋白质，接下来通过在线性(in line)传导率监测器中监测盐浓度(图1)。通过ELISA(R&D系统)、SDS-PAGE和Western印迹分析流出物和洗脱组分的GA-EPO含量。

通过使用含有4M尿素和1.4M NaCl的560ml 20mM Tris-Cl(pH 9.0)溶液再生Heparin Sepharose柱，接下来用平衡缓冲液洗涤此柱，直到传导率和柱流出物的pH与平衡缓冲液的传导率和pH相等。

在一个实验中，在洗脱池中回收了89％的加入到肝素柱上的GA-EPO。结果使用此柱除去了90％的杂质蛋白质(表1)。

                  实施例2

         肝素层析在纯化过程中作为第一步层析步骤的用途

II.1.起始材料

从Cell Cube(Costar)繁殖的表达GA-EPO的附着人细胞获得含有4％胎牛血清的条件培养基。通过离心和0.45微米Nalgene滤膜单位过滤澄清培养基。使用由30,000分子量截断膜装备的Pellicon切向流系统(Millipore)进行超滤/膜渗滤。平衡和透析缓冲液为20mM MES，pH 6.2，含有0.5％Tween 20。

II.2.肝素层析

40℃下使用Pharmacia的GradiFrac系统进行肝素层析。用含有0.1％Tween 20的20mM MES(pH 6.2)，以10ml/分钟的流速平衡280ml HeparinSepharoseCL-6B(Pharmacia)柱(14×5cm)。用Pharmacia P50泵以10ml/分钟的流速将样品加入柱中。然后用平衡缓冲液洗涤此柱，直到280nm的吸收率达到稳定。通过用1体积(280ml)含有0.1％Tween 20和0.05M NaCl的20mM MES(pH 6.2)洗涤结合不紧密的蛋白，收集12ml的组分。然后用2倍体积(560ml)的溶解在0.02M MES(pH 6.2)中的含有0.1％Tween 20的线型梯度NaCl(0.05M-0.35M)洗涤，然后用1体积的溶解在0.02M MES(pH 6.2)中的含有0.1％Tween 20的0.35M NaCl洗涤。增加洗脱缓冲液的NaCl的浓度至1.0M，体积为柱体积的一半(140ml)，然后将此柱保存在1倍体积的此种缓冲液(280ml)中。

通过在280nm吸收率检测总蛋白质，接下来通过在线性传导率监测器中监测盐浓度(图2)。通过ELISA(R&D系统)、SDS-PAGE和Western印迹分析流出物和洗脱组分的GA-EPO含量。

通过使用含有4M尿素和1.4M NaCl的560ml 20mM Tris-Cl(pH 9.0)溶液再生Heparin Sepharose柱，接下来用平衡缓冲液洗涤此柱，直到传导率和柱流出物的pH与平衡缓冲液的传导率和pH相等。

在一个实验中，在洗脱池中回收了81％的加入到肝素柱上的GA-EPO。结果使用此柱除去了86％的杂质蛋白质(表1)。

                    实施例3

        肝素层析在纯化过程中作为第一步层析步骤的用途

III.1.起始材料

通过离心和0.45微米Nalgene滤膜单位过滤将由表达GA-EPO的人细胞系(在旋转摇瓶的悬浮液中繁殖的)获得的不含血清的条件培养基澄清。使用由10,000分子量截断膜装备的Miniton切向流系统(Millipore)进行超滤/膜渗滤。平衡和透析缓冲液为20mM MES，pH 6.2，含有0.5％Tween20。

III.2.肝素层析

25℃下使用Pharmacia的FPLC系统进行肝素层析。用含有0.1％Tween20的20mM MES(pH 6.2)，以10ml/分钟的流速平衡280ml HeparinSepharoseCL-6B(Pharmacia)柱(6×1.6cm)。用Superloop以1ml/分钟的流速将样品加入柱中。然后用平衡缓冲液洗涤此柱，直到280nm的吸收率达到稳定.接下来用5倍体积(60ml)含有0.1％Tween 20的溶解在0.02MMES(pH 6.2)的0-0.4M NaCl线型梯度液洗涤，然后用1体积的溶解在0.02MMES(pH 6.2)中的含有0.1％Tween 20的1.0M NaCl梯度液洗涤，然后将此柱保存在1倍体积的此种缓冲液中。

通过在280nm吸收率检测总蛋白质。通过ELISA(R&D系统)(图3)、SDS-PAGE和Western印迹分析流出物和洗脱组分的GA-EPO含量。

通过使用含有4M尿素和1.4M NaCl的60ml 20mM Tris-Cl(pH 9.0)溶液再生Heparin Sepharose柱，接下来用平衡缓冲液洗涤此柱，直到传导率和柱流出物的pH与平衡缓冲液的传导率和pH相等。

在一个实验中，在洗脱池中回收了90％的加入到肝素柱上的GA-EPO。结果使用此柱除去了97％的杂质蛋白质(表1)。

                       实施例4

       肝素层析在纯化过程中作为第一步层析步骤的用途

IV.1.起始材料

从试管(Costar)繁殖的表达GA-EPO的附着人细胞获得含有4％胎牛血清的条件培养基。通过离心和0.45微米Nalgene滤膜单位过滤澄清培养基。通过20mM Tris，pH 7.0，含有0.1％Tween 20的过夜透析(12,000-14,000分子量的截断膜)进行缓冲液交换。

IV.2.肝素层析

25℃下使用Pharmacia的FPLC系统进行肝素层析。用含有0.1％Tween20的20mM Tris(pH 6.2)，以4ml/分钟的流速平衡10ml Heparin Sepharose6 Fast Flow(Pharmacia)柱(5×1.6cm)。用4ml/分钟的流速将样品加入柱中。然后用平衡缓冲液洗涤此柱，直到280nm的吸收率达到稳定。接下来用10倍体积(100ml)含有0.1％Tween 20的溶解在0.02M Tris(pH 6.2)的0-0.35M NaCl线型梯度液洗涤，然后增加洗脱缓冲液的浓度，为溶解在含有0.1％Tween 20的20mM Tris(pH 7.0)的1.0M NaCl，体积为5ml，然后将此柱保存在2倍柱体积(20ml)的此种缓冲液中。

通过在280nm吸收率检测总蛋白质。通过ELISA(R&D系统)(图4)、SDS-PAGE和Western印迹分析流出物和洗脱组分的GA-EPO含量。

在一个实验中，在洗脱池中回收了89％的加入到肝素柱上的GA-EPO。结果使用此柱除去了93％的杂质蛋白质(表1)。

通过用20ml的0.1N的NaOH洗涤再生Heparin Sepharose6 Fast Flow柱，然后用平衡缓冲液洗涤，直到传导率和柱流出物的pH与平衡缓冲液的传导率和pH相等。

                            实施例5

          肝素层析在纯化过程中作为中间步骤的用途

V.1.起始材料

从摇瓶中繁殖的表达GA-EPO的附着人细胞系获得含有4％胎牛血清的条件培养基(400ml)，并且通过离心和0.45微米Nalgene滤膜单位过滤澄清培养基。用4倍的水稀释所说的材料并且加入到用20mM Tris-Cl(pH 8.0)平衡的100ml Pharmacia StreamlineDEAE柱上。在用2升的平衡缓冲液洗涤之后，用含有1M NaCl的20mM Tris-Cl(pH 8.0)逐步洗脱GA-EPO。将洗脱的物质合并，将NaCl的浓度调整为3M，并所说的物质加入到含有另外3M NaCl的磷酸缓冲的盐水(Dulbecco)平衡的100ml Pharmacia PhenylSepharose凝胶6 Fast Flow柱中。在用含有另外0.5M NaCl的磷酸缓冲盐水洗涤后，用含有20％丙烯乙二醇和4M尿素的10mM NaOH(pH 12)洗脱GA-EPO。将洗脱合并物用含有0.05％Tween 20的20mM Tris-Cl(pH 8.0)渗析，然后将其加入到用同一缓冲液平衡的20ml Q-琼脂糖Fast Flow柱中，使用10倍于柱体积的梯度(0-1.0M溶解在平衡缓冲液的NaCl)从此柱中洗脱GA-EPO。将含有GA-EPO的组分合并，并用含有0.05％Tween 20的20mM MES(pH 6.2)渗析。

V.2.肝素层析

将两个1ml预填充的Pharmacia HiTrap Heparin柱串联，并且在含有0.05％Tween 20的20mM MES(pH 6.2)中平衡，将经Q-Sepharose6 FastFlow柱渗析的物质加入到HiTrap Heparine串联柱中。然后用平衡缓冲液洗涤此柱，直到280nm的吸收率达到稳定。接下来用30倍体积(60ml)含有0.05％Tween 20的溶解在0.02M MES(pH 6.2)的0-0.6M NaCl线型梯度洗涤。

通过在280nm吸收率检测总蛋白质。通过ELISA(R&D系统)(图5)、SDS-PAGE和Western印迹分析流出物和洗脱组分的GA-EPO含量。

在一个实验中，在洗脱池中回收了88％的加入到HiTrap柱上的GA-EPO。结果使用此柱除去了78％的杂质蛋白质(表1)。

                        实施例6

          肝素层析在纯化过程中作为中间步骤的用途

VI.1.起始材料

从摇瓶中繁殖的表达GA-EPO的附着人细胞系获得含有2％胎牛血清的条件培养基(602ml)，并且通过离心和0.45微米Nalgene滤膜单位过滤澄清培养基。将所说的物质调整到3M NaCl，然后将其加入到含有另外3M NaCl的磷酸缓冲的盐水(Dulbecco)平衡的100ml Pharmacia Phenyl Sepharose凝胶6 Fast Flow柱中。在用含有另外0.5M NaCl的磷酸缓冲盐水洗涤后，用20mM Tris(pH 8.0)洗涤，用含有20％丙烯乙二醇和4M尿素的10mMNaOH(pH 12)洗脱GA-EPO。将洗脱合并物用含有0.05％Tween 20的20mMTris-Cl(pH 8.0)渗析，然后将含有GA-EPO的组分合并，并用含有0.05％Tween 20的20mM MES(pH 5.2)渗析。

VI.2.肝素层析

将两个1ml预填充的Pharmacia HiTrap Heparin柱串联，并且在含有0.05％Tween 20的20mM MES(pH 5.2)中平衡，将经Q-Sepharose6 FastFlow柱渗析的物质加入到HiTrap Heparin串联柱中。然后用平衡缓冲液洗涤此柱，直到280nm的吸收率达到稳定。接下来用30倍体积(60ml)含有0.05％Tween 20的溶解在0.02M MES(pH 5.2)的0-1M NaCl线型梯度液洗涤。

通过在280nm吸收率检测总蛋白质。通过ELISA(R&D系统)(图6)、SDS-PAGE和Western印迹分析流出物和洗脱组分的GA-EPO含量。

在一个实验中，在洗脱池中回收了79％的加入到HiTrap柱上的GA-EPO。结果使用此柱除去了82％的杂质蛋白质(表1)。

                      实施例7

通过在CHO细胞中表达人红细胞生成素基因而产生的红细胞生成素基因的

纯化：肝素层析在纯化过程中作为第一步层析步骤的用途

VII.1起始材料

将市售的通过在CHO细胞中表达人红细胞生成素基因而产生的红细胞生成素加入到膜渗滤的非培养基中，并通过如下的肝素层析进行纯化：

使用CentriPrep 30装置(Amicon)将含有2％牛血清的无条件培养基(10ml)与含有0.1％Tween 20的20mM Tris-Cl(pH 7.0)进行缓冲液交换，直到传导率为2.2mmho。用水将渗余物稀释到18ml使之传导率为1.6mmho。将一小瓶(500U)CHO细胞产生的红细胞生成素(R&D系统组织培养等级)溶解在100μl水中，并将其加入到0.9ml缓冲液交换的稀释培养基中，然后通过Acrodisc 0.2μm滤膜(Gelman)过滤。

VII.2肝素层析

室温下在含有0.1％Tween 20的20mM Tris-Cl(pH 7.0)中平衡(1ml/分钟)1ml HiTrap Heparin(Pharmacia)柱。流速为1ml/分钟，收集1ml组分，并在280nm下监测吸收率。将过滤的样品(0.7ml)加入的此柱中，然后用平衡缓冲液以10倍柱体积洗涤。用15倍柱体积的线性梯度缓冲液(最高浓度为含有0.4M NaCl和0.1％Tween 20的20mM Tris-Cl(pH 7.0))洗脱红细胞生成素。使用Centricon-10装置(Amicon)将红细胞生成素合并物浓缩到1.0ml。通过ELISA(R&D系统)监测红细胞生成素浓度，通过BCA分析(Pierce)测定红细胞生成素合并物的总蛋白质浓度。

在一个实验中，在洗脱池中回收了实质上加入到此Heparin HiTrap柱上的全部红细胞生成素。结果使用此柱除去了91％的杂质蛋白质(表1)。

                             实施例8

                 肝素层析后GA-EPO的进一步纯化

下列过程作为可以在肝素层析之后使用的一些可能的纯化步骤的实施例。下列实施例不是用来限制可使用的步骤的数目，而是用来具体说明肝素层析的多功能性，其是一个有用的步骤，并且此步骤与各种纯化方法是兼容的。

VIII.1阴离子交换层析

用Q琼脂糖凝胶平衡缓冲液(含有0.1％Tween 20的20mM Tris-Cl(pH7.5))平衡25ml Q SepharoseFast Flow(Pharmacia)柱。将肝素层析后获得的GA-EPO合并物用Q琼脂糖凝胶平衡缓冲液渗析，然后加入到QSepharose柱上。用Q琼脂糖凝胶平衡缓冲液洗涤此柱，直到280nm下的吸收率稳定。用含有0.4M NaCl和0.1％Tween 20的20mM Tris-Cl(pH 7.5)洗涤结合的蛋白质。

通过ELISA(R&D系统)分析0.4M NaCl洗脱的蛋白质峰中的GA-EPO，通过280nm吸收率分析总蛋白质。将流出物和洗涤组分进行相似的分析。

VIII.2阳离子交换层析

用Mono S平衡缓冲液(含有0.1％Tween 20的20mM Tris-醋酸盐(pH4.5))平衡25ml Mono S(Pharmacia)柱。将肝素层析后获得的GA-EPO集合物用Mono S平衡缓冲液渗析，然后加入到Mono S柱上。用Mono S平衡缓冲液洗涤此柱，直到280nm下的吸收率稳定。在pH梯度缓冲液(从pH 4.5的Mono S平衡缓冲液到含有0.1％Tween 20的20mM Tris-醋酸盐(pH8.0))缓冲液洗脱GA-EPO。

通过ELISA(R&D系统)分析0.4M NaCl洗脱的蛋白质峰中的GA-EPO，通过280nm吸收率分析总蛋白质。将流出物和洗涤组分进行相似的分析。

VIII.3.疏水作用层析

将从肝素层析获得的GA-EPO溶解在4M NaCl中，通过逐滴加入1N HCl使pH达到5.5。将此物质加入到在含有4M NaCl的20mM MES中平衡的50mlPhenyl Sepharose凝胶6 Fast Flow取代柱(Pharmacia)上。用5倍体积的平衡缓冲液洗涤以便除去未结合的物质，之后用含有4M尿素和20％丙烯乙二醇的20mM Tris-醋酸盐缓冲液(pH 8.0)洗脱GA-EPO。

通过ELISA(R&D系统)分析0.4M NaCl洗脱的蛋白质峰中的GA-EPO，通过280nm吸收率分析总蛋白质。将流出物和洗涤组分进行相似的分析。

VIII.4.制备性凝胶电泳

把在肝素层析后获得的GA-EPO浓缩到2ml，溶解在二硫苏糖醇和1％SDS中，使之终浓度为0.1M，然后加热到100℃并保持1分钟。将样品加入到如BioRad技术手册所描述的方法使用12％丙烯酰胺鉴定凝胶制备的凝胶电泳柱(BioRad)中。通过Western印迹分析洗脱的蛋白质峰中的GA-EPO，并通过280nm吸收率分析总蛋白质。

VIII.5.使用固定的单克隆抗人EPO抗体的亲和性层析

把在肝素层析后获得的GA-EPO用平衡缓冲液(含有0.2％Tween 20的20mM Tris-Cl(pH 8.0))渗析。将样品加入到0.25ml的亲和性柱(3M Emphase树脂(Pierce)，在平衡缓冲液中洗涤)，此柱含有按照厂商的说明固定的0.5mg抗人EPO抗体(Genzyme)的。在用平衡缓冲液洗涤后，用含有0.15MNaCl的0.2M乙酸(pH 3.5)洗脱GA-EPO。将洗脱的物质以200μl组分收集到含有20μl的1M Tris(pH 8.0)和2μl的Tween 20的试管中。通过ELISA(R&D系统)分析洗脱的蛋白质峰中的GA-EPO，并通过280nm吸收率分析总蛋白质。

                        实施例9

            来自各种厂商的肝素层析树脂的使用

可以使用来自各种厂商的肝素树脂进行纯化红细胞生成素的肝素层析。选择了5种不同的树脂来评价对来源于超滤/膜渗滤的含有2％胎牛血清培养基的GA-EPO结合和装载能力：(1和2)美国国际化学公司(AIC)的Heparin Agarose6XLI型和III型；(3和4)Pharmacia公司的HeparinSepharoseCl-6B和Heparin Sepharose6 Fast Flow；和(5)TosoHaas的Toyopearl AF-Heparin-650M。

使用的起始材料和层析条件如在实施例2中所述，使用1ml至7ml的柱。对于所有检验的树脂，GA-EPO的回收率至少是70％。在装载能力上，在不同的树脂中没有观察到显著性差异。

                        分析方法

ELISA：

可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行红细胞生成素量的常规测量。用于定量人红细胞生成素的一种市售ELISA试剂盒是一种可以从R&D系统公司买到的试剂盒(Quantikine IVD)。另一种定量人红细胞生成素的市售ELISA试剂盒来自Genzyme公司(Predicta试剂盒)。实质上，按照厂商的说明书进行ELISA测定。另外，在测定红细胞生成素量的类似ELISA系统中，也可以使用用来识别红细胞生成素的抗体。

蛋白质测定：

蛋白质样品的量化是本领域公知的。这样的方法包括Lowry、Bradford和BCA蛋白质分析方法。可以从市场上买到用于测定样品中蛋白质量的试剂盒，例如由Pierce化学公司研制的BCA蛋白质测定试剂方法。可以通过本领域技术人员熟知的280nm的分光光度法来测定蛋白质的数量。

比活：

由下列公式计算样品的比活：比活＝通过ELISA测定的GA-EPO总单位/通过BCA测定的总蛋白质(mg)。纯化的GA-EPO制剂具有大约200,000 ELISA单位/BCA测定的蛋白质(mg)的比活。使用ELISA来定量GA-EPO单位的比活是只是间接地和GA-EPO的实际生物活性相联系。测定体内比活的普通检验方法是本领域技术人员熟知的外氧过少红细胞增多(exhypoxicpolycythemic)小鼠生物测定法(例如本领域技术人员熟知的可以测定比活(IU/mg)的分析方法)。

SDS PAGE和Western印迹：

制备用于SDS-PAGE的样品和用于10％或12％聚丙烯酰胺凝胶分析的样品是本领域熟知的。例如，凝胶是市售的(例如BioRad)，使用的方式是按照BioRad Mini-ProteanII Dual Slab Cell说明书(按照Laemmli，U.K.的方法，自然227，680(1970))所描述的。浓度大约为0.1％的CoomassieR-250可以用于总蛋白质染色。可以使用BioRad Mini-Trans-Blot电泳转移部件按照说明手册并使用含有96mM甘氨酸、10％甲醇和0.01％SDS的12.5mM Tris-Cl(PH8.3)将蛋白质转移到ImmobilonTM-P PVDF膜(Millipore)上。100V下在BioRad Mini-Trans-Blot仪器将蛋白质转移1小时。可以在室温下将膜旋转封阻1小时，或者在40℃时用溶解在TBS-Tween(20mMTris-Cl(pH 7.4)，0.15M NaCl，0.05％Tween 20)中的5％(w/v)脱脂牛奶(Carnation)封阻过夜。然后在TBS-Tween中简单洗涤此膜，室温下在2.5％(w/v)脱脂牛奶的TBS-Tween溶液以1/1000稀释的兔抗人红细胞生成素(R&D系统)(终浓度为1ug/ml)中旋转温育1小时。再次洗涤此膜，并例如使用Amersham ECLTM试剂盒使之发生化学荧光，并在胶片上曝光。通过这种技术检测的GA-EPO的最小量为大约10-20ng(SDS-PAGE，之后是Western印迹)。

如果用不同的抗体检测印迹，可以用含有2.0％SDS的60mM Tris-Cl(pH7.5)在室温下旋转汽提(Stripp)2小时。用封阻缓冲液重新封阻印迹。然后按照上述的方法加入新的一级抗体。例如可以使用绵羊抗人运铁蛋白-HRP缀合物抗体(Biodesign)检测运铁蛋白。可以使用绵羊抗牛白蛋白-HRP缀合物(Bethyl Lsbs)检测牛白蛋白。如上所述洗涤并展开印迹。

Claims (46)

1.一种用于纯化红细胞生成素的方法，所说的方法包括：

a)将包含红细胞生成素的生物液体与肝素层析支持物相接触，使所说的红细胞生成素结合到所说的肝素层析支持物上；

b)用洗脱缓冲液洗脱所说的红细胞生成素；

c)收集所说的红细胞生成素。

2.权利要求1中的方法用于包括在纯化红细胞生成素的多步骤方法中的任何时候的单一步骤的用途。

3.权利要求2的用途，其中所述的权利要求1中的方法为红细胞生成素纯化过程中的第一层析步骤。

4.权利要求1的方法用于除去红细胞生成素的杂质蛋白质的用途。

5.权利要求4的用途，所说的蛋白质是血清蛋白质。

6.权利要求4或5的用途，其中所说的杂质蛋白质选自由小牛血清、牛血清、胎牛血清、血清白蛋白以及运铁蛋白组成的组。

7、如权利要求2的用途，所说的多步骤方法包括一种或多种选自下组的方法：离子交换、疏水作用、大小排阻、反相或者亲和性层析。

8.如权利要求1之方法，其中所说的生物液体在与所说的肝素层析支持物相接触之前，进行了过滤。

9.如权利要求1之方法，其中所说的生物液体在与所说的肝素层析支持物相接触之前，进行了超滤。

10.如权利要求1之方法，其中所说的生物液体在与所说的肝素层析支持物相接触之前，进行了离心。

11.如权利要求1之方法，其中所说的生物液体在与所说的肝素层析支持物相接触之前，进行了透析。

12.如权利要求9的方法，其中所说的生物液体在5,000-100,000D截断膜上进行了超滤。

13.如权利要求9的方法，其中所说的生物液体在10,000-30,000D截断膜上进行了超滤。

14.如权利要求8的方法，其中所说的生物液体在0.45微米膜上进行了过滤。

15.如权利要求1之方法，其中在pH5-8时进行所说的红细胞生成素分子的结合。

16.如权利要求15的方法，其中在pH6.2时进行所说的红细胞生成素分子的结合。

17.如权利要求1之方法，其还包括在将所说的生物液体与所说的肝素层析支持物相接触之前，澄清所说的生物液体。

18.如权利要求17的方法，其中通过离心澄清所说的生物液体。

19.如权利要求1之方法，其中在平衡缓冲液中进行所说的红细胞生成素分子的结合。

20.如权利要求1之方法，其中在三(羟甲基)-甲胺缓冲液之中进行所说的红细胞生成素分子的结合。

21.如权利要求1之方法，其中在2-(N-吗啉)-乙烷磺酸缓冲液之中进行所说的红细胞生成素分子的结合。

22.如权利要求1之方法，其中在磷酸缓冲液之中进行所说的红细胞生成素分子的结合。

23.如权利要求1之方法，其中在pH4.9-8.0时进行所说的红细胞生成素分子的结合。

24.如权利要求23的方法，其中在pH5.9-7.5时进行所说的红细胞生成素分子的结合。

25.如权利要求24的方法，其中在pH6.2时进行所说的红细胞生成素分子的结合。

26.如权利要求24的方法，其中在pH7.0时进行所说的红细胞生成素分子的结合。

27.如权利要求1之方法，其中通过改变洗脱缓冲液来洗脱所说的红细胞生成素。

28.如权利要求27的方法，其中通过增加缓冲液的盐浓度来洗脱所说的红细胞生成素。

29.如权利要求27的方法，其中用其它盐和/或缓冲液洗涤柱来洗脱所说的红细胞生成素。

30.如权利要求27的方法，其中通过改变洗脱缓冲液的操作pH来洗脱所说的红细胞生成素。

31.如权利要求19的方法，其中所说的缓冲液还包含抗吸附剂。

32.如权利要求31的方法，其中所说的缓冲液还含有Tween。

33.如权利要求27的方法，其中通过增加碱性卤化物的盐浓度来洗脱所说的红细胞生成素。

34.如权利要求33的方法，其中所说的碱性卤化物是氯化钠。

35.如权利要求1之方法，其中所说的生物液体是培养液体。

36.如权利要求35的方法，其中所说的培养液体是澄清的。

37.如权利要求1之方法，其中所说的含有红细胞生成素的生物液体或最后一步中收集的液体是缓冲液交换的。

38.如权利要求37的方法，其中所说的缓冲液交换方法选自：切向流系统、中空纤维、螺旋滤器、搅拌器系统、透析、渗滤、过滤步骤或者常规层析。

39.如权利要求38的方法，当通过渗析或透析完成所说的缓冲液交换时，选择5,000-10,000或10,000-30,000分子量的膜。

40.如权利要求37的方法，其中所说的缓冲液交换是在pH6-8下完成的。

41.如权利要求40的方法，其中所说的缓冲液交换是在pH5.9-7.5下完成的。

42.如权利要求41的方法，其中所说的缓冲液交换是在pH6.2-7.0下完成的。

43.如权利要求37的方法，其中所说的缓冲液交换是针对0-200mM盐的缓冲液完成的。

44.如权利要求43的方法，其中所说的缓冲液交换是针对0-10mM盐的缓冲液完成的。

45.如权利要求43的方法，其中所说的肝素层析支持物选自由Heparin Sepharose CL-6B、Heparin Sepharose 6 Fast Flow、HiTapHeparin、Affigen Heparin、Heparin Agaraose、HeparinSepharose、Heparin Hyper D和Heparin Agarose 6XL组成的组。

46.权利要求27的方法，其中所述的缓冲液还包含抗吸附剂。

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