SA97170803B1 - إنتاج الإريثروبويتينات erythopoietins بطريقة الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin - Google Patents
إنتاج الإريثروبويتينات erythopoietins بطريقة الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin Download PDFInfo
- Publication number
- SA97170803B1 SA97170803B1 SA97170803A SA97170803A SA97170803B1 SA 97170803 B1 SA97170803 B1 SA 97170803B1 SA 97170803 A SA97170803 A SA 97170803A SA 97170803 A SA97170803 A SA 97170803A SA 97170803 B1 SA97170803 B1 SA 97170803B1
- Authority
- SA
- Saudi Arabia
- Prior art keywords
- heparin
- erythropoietin
- erythropoietins
- cells
- buffer
- Prior art date
Links
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 title claims description 149
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 title claims description 149
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 147
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 title abstract description 35
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 7
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims abstract description 101
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 98
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims abstract description 93
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 87
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 58
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 50
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 49
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 47
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 24
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 18
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 8
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 8
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims description 6
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 4
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 claims 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 claims 1
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 152
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 88
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 77
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 75
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 56
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 48
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 48
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 description 36
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 description 36
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 32
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 19
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 18
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 15
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 13
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 13
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 13
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 10
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 9
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 8
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 7
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 7
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 7
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 description 5
- 101000707286 Xenopus laevis Protein Shroom1 Proteins 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 241000189662 Calla Species 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 4
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 3
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- JQYMGXZJTCOARG-UHFFFAOYSA-N Reactive blue 2 Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC(S(O)(=O)=O)=C1 JQYMGXZJTCOARG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 3
- 125000004202 aminomethyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N benzyl N-[2-hydroxy-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]carbamate Chemical compound OC1=C(NC(=O)OCC2=CC=CC=C2)C=CC(=C1)N1CCOCC1=O FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 3
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 3
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 3
- -1 serine oligosaccharide oligosaccharide Chemical class 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 2
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 150000004056 anthraquinones Chemical class 0.000 description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000007805 chemical reaction reactant Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N cibacron blue Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 210000002445 nipple Anatomy 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011137 process chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical class OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- CWUAAQVTCQLNTH-UHFFFAOYSA-N 1-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(C)N1CCN(CCO)CC1 CWUAAQVTCQLNTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-UHFFFAOYSA-N 2-(hydroxymethyl)-6-[4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane-3,4,5-triol Chemical compound OCC1OC(OC2C(O)C(O)C(O)OC2CO)C(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STUKIEZGAXBRHI-UHFFFAOYSA-N Cl.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O Chemical compound Cl.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O STUKIEZGAXBRHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 1
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 1
- 241001397104 Dima Species 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102100022119 Lipoprotein lipase Human genes 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 208000008601 Polycythemia Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000007324 Protease Nexins Human genes 0.000 description 1
- 108010007544 Protease Nexins Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 206010062237 Renal impairment Diseases 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 description 1
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 description 1
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003926 acrylamides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- DQPBABKTKYNPMH-UHFFFAOYSA-M amino sulfate Chemical group NOS([O-])(=O)=O DQPBABKTKYNPMH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000001307 androgen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010080146 androgen receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 1
- IZXGZAJMDLJLMF-UHFFFAOYSA-N methylaminomethanol Chemical compound CNCO IZXGZAJMDLJLMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004987 nonapoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 231100000857 poor renal function Toxicity 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004116 schwann cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000003460 sulfonic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Abstract
الملخص : يتعلق الاختراع الحالي بعملية بسيطة وفعالة لاستخلاص الإريثروبويتينات erythropoietin من سوائل احيائية واستنباتية باستخدام عملية الفصل الكروماتوجرافي chromatography من الإريثروبويتينات erythropoietins لأغراض البحث والتجارة .،
Description
إنتاج الإريثروبويتينات erythropoietins بطريقة الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin الوصف الكامل يتعلق الاختراع الحالي بعملية بسيطة وفعالة لاستخلاص الإريثروبويتينات erythropoietin من سوائل احيائية واستنباتية باستخدام عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين «heparin ويمكن استخدام الاختراع الحالي للحصول على كميات من الإريثروبويثينات erythropoietins لاغراض البحث والتجارة .
oo والهيبارين heparin عبارة عن جليكوز أمينو جليكان glycosaminoglycan عدادي مخاطي mucopolysaccharide بدرجة عالية ؛ والهيبارين heparin بصفة dala عبارة عن سكر عدادي مخاطي يتكون من مركب مزدوج الصيغة الجزيئية متكرر ل من .1 - حمض St بيرانيورونيك = كبريتات L-dipyranuronic acid 2-sulfate و -١ ديوكسي Y= كبريتات أمينو - D -جلوكوبيراتوز “7-كبريتات 2-deoxy-2-sulfamino-D-glucopyranose 6-sulfate
٠ يتراوح وزنه الجزيئي من One الى 0000© يتم بصفة عامة اتمام عملية التنقية بإستغلال alls الهيبارين heparin للبروتينات المختلفة ؛ وذلك بوضع الهيبارين heparin في ترابط مشترك مع مادة ترابط مدعمة مثل sale سيكاروز هيبارين HeparinSepharoseo CL- CL - 6B
8 التي تتكون من هيبارين heparin متحد مع مادة الترابط Sepharose CL-6B بطريقة بروميد السيانوجين cyanogen bromide .
٠ تعتمد عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin على طريقتين رئيسيتين للتفاعل التداخلي مع البروتينات : )١( كمادة alls و (7) كمبادل كاتيون ae exchange cation المحتوي العالي من مجموعات الكبريتات الانبونية canionic sulfate وعلى ذلك فان طبيعة Jeli) التداخلي الصحيحة مع الهيبارين heparin للبروتينات الفردية تكون We عن طريق تأليف من التفاعلات
ay.
دسم - التداخلية للتألف وتبادل الايون don ولا يمكن اكتشاف الطبيعة الصحيحة Jia هذه التفاعلات التداخلية بطريقة صحيحة . يتم تطبيق عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin في عملية تنقية كميات كبيرة متنوعة من البروتينات (الفصل الكروماتوجرافي للتآلف ؛ دراسة بعنوان مبادئ وطرق ؛ منشورة ٠ .من قبل شركة )٠١77١74 = VA pharmacia : يشتمل ذلك على إنزيمات (بروتياز الخلايا البدنية mast cell proteases « ليباز البروتين الشحمي lipoprotein lipase « انزيمات التجلط coagulation enzymes ؛ ديسميوتاز فوق الاكسيد (superoxide dismutase وكوابح بروتياز السرين serine protease inhibitors (مائع التخثر رقم 7 ]11 cantithrombin نكسينات البروتياز (protease nexins وعوامل النمو growth factors (عامل نمو i alld al (fibroblast growth factor ٠ عامل نمو خلية شوان Schwann cell growth factor ؛ عامل الخلية البطانية (endothelial cell growth factor وبروتينات النسيج matrix proteins الموجود خارج الخلايا (فيبرونكتين «fibronectin فيترونكتين laminin (pie ¢ vitronectin ؛ ترومبوسبندين thrombospondin ¢ كولاجين (collagens والبروتينات المرتبطة بحمض النيوكلييك Jaf ge) nucleic acid البدء؛ النيوكلياز الداخلي pa all endonucleases ليجاز DNA ¢ ١٠ بوليمراز DNA و RNA ( ومستقبلات الهرمون hormone (مستقبلات الاستروجين estrogen « والاندروجين (androgen والبروتينات الشحمية lipoproteins . يتعلق الاختراع الحالي في احد جوانبه بخطوة مناسبة للفصل الكروماتوجرافي في استراتيجية تنقية اجمالية للإريثروبويتينات erythropoietins ؛ ويمكن استخدام عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin وحدها كخطوة اولى أو كخطوة تالية في اجراء متعدد الخطوات . تتعلق Yo عملية الفصل الكرماتوجرافي للهيبارين heparin بخطوة تنقية مناسبة للنزع الانتقائي للمواد ay.
- الملوثة التي لم يتم مضاعفتها بواسطة عمليات تنقية اخرى يتم وصفها في المجال ؛ وبذلك تعرض هذه العملية خطوة تنقية بديلة هامة في تحضير الإريثروبويتينات erythropoietins المتجانسة . يمكن الحصول على الإريثروبويتين erythropoietin من عدة مصادر ومنها الكائن الحي (مثل الإريثروبويتين (dsl erythropoietin البشري) أو من سائل زراعة الخلية الذي يلي ٠ ادخال جين إيثروبويتين سليم في خلايا الحلمات الثدييه ؛ أو من سائل زراعة الخلية الذي يلي تنشيط جين الإريثروبويتين Jalal erythropoietin gene في الخلايا البشرية. وتصلح بصفة خاصة عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin المذكورة في الاختراع الحالي بأن تكون جزءاً من خطة تنقية اجمالية يتم استخدامها للحصول على مستحضرات متجانسة من الإريثروبويتين erythropoietin ؛ وبصفة عامة وحتى تكون فعالة تجارياً ؛ فان Jia ٠ هذه العملية تتكون من خطوات متعاقبة يمكن بسهولة ان يتم توازنها مع المنتجات القادرة على مواجهة متطلبات الانتاج الصيدلاني ؛ ويمكن ان يتم دمج خطوة Jia dll الكروماتوجرافي للهيبارين heparin الموصوفة في هذا البحث ؛ في خطة تنقية واسعة المقياس مع عملية استخلاص كبيرة لتنقية الإريثروبويتينات 1000016005 ؛ وأحد سمات الاختراع Jal هو ان عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin يمكن ان يتم ادماجها إما كخطوة أولى مناسبة للفصل الكروماتوجرافي في استراتيجية التنقية الاجمالية للإريثروبويتينات erythropoietins « أو كخطوة تابعة للاستخدام في اي موضع في العملية متعددة الخطوات . ولا يصلح عدد من خطوات الفصل الكروماتوجرافي للاستخدام كخطوة اولى لعملية الفصل الكروماتوجرافي لان الخطوة الاولى للفصل الكرماتوجرافي يجب ان تكون قادرة على تتاول الكمية الاجمالية للمواد الغذائية والبروتينات الموجودة مبدئياً في سائل احيائي او سائل استنباتي ؛ ve توفر الخطوة الاولى المناسبة للفصل الكروماتوجرافي درجة كافية من التنقية للبروتين مع درجة av.
Ce عاليه من استخلاص البروتين المطلوب ؛ وبذلك يكون لها قدرة كافية للتفاعل التداخلي مع حمل البروتين الكلي وبدائل الاوساط ؛ على سبيل المثال تعد عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين للتتقيه كافيه ومناسبة ومستقلة عن حالات الاستنبات ؛ على سبيل المثال ؛ Jd خطوة heparin النمو داخل المخمرات او قارورات الرج ؛ كما تعتبر خلايا معتمدة على التثبيت أو خلايا غير معتمدة على التثبيت ببروتينات مصل أو بدون بروتينات مصل ؛ وقد وجد ان الخطوة التالية oo هذه المعايير كخطوة اولى مناسبة في JME heparin الحالية للفصل الكروماتوجرافي للهيبارين . erythropoietins تنقية الإريثروبويتين للادماج كخطوة تابعة لمزيد من heparin وتصلح عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين بعد التجزئه المبدئية بواسطة عدد من خطوات التنقية erythropoietins التنقية للإريثروبويتينات ion الحصر على الفصل الكروماتوجرافي بتبادل أيون pads وتشتمل على سبيل المثال ٠ تفاعل داخلي غير محب للماء ؛ أو استثناء الحجم أو التآلف وعن طريق التجزئه 5) exchange بترسيب محل أو كحول او بعملية استشراد (هجرة الجزيئات المعلقة في مجال كهربائي) تحضيرية لهلام أو عملية تجميع تحضيرية متساوية الجهد الكهربائي . يمكن ايضاً بإدماج عملية في خطة التنقية الاجمالية ان يتم زيادة كفاءة heparin الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين الملوثة التي لم يتم بصفة خاصة فصلها جيداً of gall خطوات التنقية الاخيرة بالنزع الانتقائي ١ . بواسطة خطوات التنقية الاخيرة خطوة تنقية مفيدة للحصول على heparin تقدم عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين نشطه احيائياً من سوائل احيائية أو سوائل استنباتية بدرجة عاليه erythropoietins إيثروبويتينات من الاستخلاص ؛ بالاضافة الى ذلك يمكن ان يتم تنفيذ عملية الفصل الكروماتوجرافي بواسطة _مذيبات مائية فقط ويمثل ذلك ميزة اخرى تحظى بتقدير ذوي الخبرة في المجال ؛ ويعتبر ٠ av
0 -
إستعمال المذيبات المائية فقط ميزة لانه يمكن بذلك ان يتم تصميم خطوة التنقية بحيث لا يتم
تعرض البروتين لمواد محولة للصفات الطبيعية أو مذيبات عضوية أو أحماض ؛ والتي يمكن ان
تكون مضرة للبروتين المستخلص والسليم تركيبياً والنشط احيائياً ؛ وبالاضافة الى ذلك als يمكن
اجراء عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin ظروف بسيطة جداً ؛ على سبيل ٠ المثال تحت رقم هيدروجين و/أو تحث تركيزات ملح منخفضة ؛ وتعتبر هذه الخاصية مفيدة
بصفة خاصة حيث ان الإريثروبويتينات erythropoieting تكون حساسة للتجمع أى desialation
برقم هيدروجيني pH منخفض أو Jo وحالات ملح عالية (.7 Endo, وآخرون ؛ جريدة
الكيمياء الحيوية Biochem العدد ١١١ من صفحة 7٠١0 الى صصفحة ((Y49Y) Vo . وبناءاً
على ذلك يقدم هذا الاسلوب ظروف مائية بسيطة جداً تساعد على منع فقد النشاط الاحيائي olf ٠ الفصل الكروماتوجرافي لجزيئات الإريثروبويتين erythropoietin .
يتعلق الاختراع الحالي بخطوة فصل كروماتوجرافي لتنقية الإريثروبويتينات erythropoietins
والتي تشتمل على :
{ توصيل سائل أحيائي يحتوي على إيثروبويتين erythropoietin بمساعد تآلف هيبارين heparin
تحت ظروف معينة بحيث ترتبط جزيئات الإريثروبويتين erythropoietin بمساعد «lls ١ -_ الهيبارين heparin المذكور .
ب) فصل جزيئات الإريثروبويتين erythropoietin بالتصفية بواسطة محلول منظم لعملية
الفصل .
. المذكورة erythropoietin تجميع الإريثروبويتين (z
يمكن استخدام خطوة الفصل الكروماتوجرافي اما كخطوة فصل كروماتوجرافي أولى في تنقية ٠ الإريثروبويتين erythropoietin أو للادخال في اي نقطة في العملية متعددة الخطوات ؛ وتفيد ay.
-
خطوة الفصل الكروماتوجرافي بصفة خاصة في نزع البروتينات الملوثة للإريثروبويتينات
005 د مثل بروتينات المصل بصفة خاصة ؛ ولكنها ليست قاصرة على تلك التي يتم
اختيارها من مجموعة مصل العجل مصل البقر ومصل جنين البقر وزلال المصل و
transferring وفي مجال الاختراع تحتوي عملية تنقية الإريثروبويتين erythropoietin أو
٠ الإريثروبويتينات erythropoietins على طريقة بالفصل الكروماتوجرافي حيث يكون السائل
الاحبائي الملامس عباره عن سائل استنباتي culture fluid .
يتعلق الاختراع الحالي ايضاً بخطوة فصل كروماتوجرافي للهيبارين heparin للادخال في اي
نقطة في العملية متعددة الخطوات في تنقية الإريثروبويتين erythropoietin أو الإريثروبويتينات
erythropoietins مثل؛ ولكن ليس قاصرة على عملية متعددة الخطوات والتي تحتوي بالاضافة ٠ الى ذلك على واحدة أو أكثر من خطوات الفصل الكروماتوجرافي يتم اختيارها من مجموعة
تبادل الايون on أو التفاعل التداخلي الكاره للماء أو استثناء الحجم او الطور العكسي أو الفصل
الكروماتوجرافي للتالف .
يتعلق Lin الاختراع بخطوة فصل كروماتوجرافي في HAD الإريثروبويتين erythropoietin أو
الإريثروبويتينات erythropoietins 5 يتم فيها ايضاً تتقية السائل الاحيائي الملامس مثل تلك ١ _ التي تتم بواسطة الطرد المركزي على سبيل المثال وليس الحصر ؛ ويمكن بصفة مستقلة اجراء
عملية الطرد المركزي على السوائل الاحيائية أو ترشيحها بدقة أو فرزها أو اجراء كل هذه
الاجراءات ؛ وعندما يتم ترشيح السائل الاحيائي بدقة فانه يمكن القيام بذلك على سبيل المثال
وليس الحصر على غشاء فصل 8.00 = ٠00.000 دالتقون أو غشاء فصل ٠١٠... -
en دالتون ؛ وعندما يتم ترشيح سائل احيائي فانه يمكن اختيارياً على سبيل المثال وليس © الحصر الحصول على غشاء £0 ميكرون .
qr.
م - يمكن في الاختراع الحالي ان يتم على سبيل المثال وليس الحصر ربط جزيئات الإريثروبويتين erythropoietin المذكورة في محلول alate للتوازن ؛ وتحتوي مثل هذه المحاليل على سبيل المثال وليس الحصر على محلول منظم من ؛ - Y) - هيدروكسي اثيل) - ١ - بيرازينو إيثان حمض السلفونيك (MES) 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinoethane sulfonic acid ثلاني © (هيدروكسي مثيل) أمينو ميثان (ثلاني) (MES), tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) « أو محلول منظم من الفوسفات phosphate أو أي محلول منظم اخر يصلح لتوفير محلول منظم مناسب لربط الإريثروبويتينات erythropoietins ؛ وبالاضافة الى ذلك يمكن على سبيل المثال Gud الحصر ان يتم ربط جزيثات الإريثروبويتين erythropoietin المذكورة عند رقم هيدروجين يتراوح بين حوالي من 5,1 الى Ae ؛ ويفضل ان يكون عند رقم هيدروجيني PH ٠ حوالي من 0,9 الى Vo ويفضل أكثر ان يكون الرقم الهيدروجيني pH 6,7 أو ١ .
تشتمل بالاضافة الى ذلك خطوات الفصل الكروماتوجرافي للاختراع الحالي على اجراء عملية فصل بالتصفية الإريثروبويتينات erythropoieting المذكورة بتغيير المنظم لعملية الفصل بالتصفية اختيارياً ؛ ويتم ذلك على سبيل المثال وليس الحصر بواسطة زيادة تركيز الملح في المحلول المنظم أو Jue العمود بمحلول لمنظم اضافي أو تغيير الرقم الهيدروجيني pH الفخّال vo للمحلول المنظم لعملية الفصل بالتصفي . ويمكن تعديل تركيز ملح المحلول المنظم لعملية الفصل بالتصفي على سبيل المثال وليس الحصر بواسطة اضافة هاليدات قلوية alkali halides مثل كلوريد الصوديوم sodium chloride (NaCl). NaCl . يشتمل نموذج اخر للاختراع ايضاً على اضافة مادة مضادة للامتزاز الى أي من المحاليل المنظمة على سبيل المثال وليس الحصر ¢
. Tween توين ay,
و - تشتمل ايضاً خطوات الفصل الكروماتوجرافي للاختراع الحالي على تبادل المحلول المنظم الخاص بالوسط المحتوي على إريثروبويتين erythropoietin ؛ ويتم هذا التبادل على سبيل المثال وليس الحصر بسائل احيائي أو عينة يتم جمعها. وتتضمن اجراءات تبادل المحلول المنظم هذه على سبيل المثال وليس الحصر استخدام أنظمة الدفق المماس أو الالياف المجوفة أو المرشحات اللولبية أو أنظمة الخلايا النشطه أو الفرز أو الترشيح الثنائي أو خطوة الترشيح أو بواسطة عملية فصل كروماتوجرافي تقليدية ؛ وعندما يتم اجراء تبادل المحلول المنظم بواسطة غشاء فرز أو غشاء ترشيح ثنائي يمكن اختيارياً يتم على سبيل المثال وليس الحصر استخدام غشاء وزن جزيئي ٠٠٠٠٠١ - 55008٠0 أو ٠8 = ,+ . يمكن ان يتم اجراء عملية تبادل المحول المنظم عند رقم هيدروجيني 11م يتم اختياره وتركيزات ملح المحلول المنظم على 1 سبيل المثال وليس الحصر مثل تلك الارقام الهيدروجينية التي تتراوح بين 6 و 8 2 50,8 V,0 و 1,7 الى ١ وضد المحلول منظم من ملح صفر الى Yoo مليمول أو يفضل أكثر ان يكون ملح صفر الى ٠١ مليمول . يوجد نموذج اخر للاختراع الحالي ؛ يتوقع فيه استخدام عدد من مدعمات تآلف الهيبارين heparin « وهي مدعمات متوفرة تجارياً وهي على سبيل المثال وليس الحصر سيفاروز ١ _ الهيبارين سي ال - جي بي Heparin SepharoseCL-GB و سيفاروز الهيبارين + Hearin Sepharose 6 بتدفق سريع وهيبارين هاي تاب HiTap Heparin وهيبارين أفيجين AffigenHeparin وألجاروز الهيبارين HeparinAgaraose و سيفاروز الههببارين HeprinSepharose وهيبر هيبارين Heparin HyperD وألجاروز الهيببارين .Heparin Agarose6XL ay.
١و
خلفيسة الاختراع يتعلق الاختراع الحالي بإريثروبويتينات Laan Al erythropoietins خلايا الحلمات الثدييه Jala mammalian cells أو خارج الجسم عباره عن جليكوبروتينات glycoproteins ذات حمض أميني amino acid ناضج ذو تسلسل أحماض أمينية ١١١ amino acids ويحتوي على ثلاثة ٠ سلاسل اوليجوسكريد oligosaccharide مرتبطة بالنيتروجين وسلسلة واحدة مرتبطة بالاكسجين ؛ تحدث سلاسل الاوليجوسكريد oligosaccharide المرتبطة بالنيتروجين عند بقايا اسبارجين Y¢ asparagine و YA و AY بينما تحدث سلسلة الاوليجوسكريد oligosaccharide المرتبطة بالاكسجين عند بقايا سرين ١7 serine . لاى Lai وآخرون . جريدة الكيمياء الاحيائية Biol. Chem العدد YT صفحة Broudy « )١94835( 7١١6 واخرون. دورية الكيمياء الحيوية ٠ والفيزياء الحيوية (VAAN) FY CYTO التعرف على منطقة تدوين شفرة الحمض الاميني ١7١١ amino acid والتسلسل المتعاقب اللإريثروبويتين erythropoietin في جزء منها من عزل النسائل الوراثية والنسائل الخاصة بال (DNA) الخلوي جين الإريثروبويتين erythropoietin gene البشري + Jacobs واخرون- الطبيعة Lin, FK. )١ذم( A+ ¢ ¥\Y Nature واخرون. دورية خاصة باجراءات البحث للاكاديمية الوطنية للعلوم بالالولايات المتحدة الامريكية
6 مجلد AY ¢ عدد 7586 )١88( . يتعلق عدد كبير من الاوراق العلمية وبراءات الاختراع وتطبيقات براءات الاختراع بعملية عزل الإريثروبويتين «erythropoietin ويبين ملخص موجز للمراجع المتعلقة بذلك ان يتم تطبيق العديد من خطوات الفصل الكروماتوجرافي على عملية عزل الإريثروبويتينات .erythropoietins توضح المراجع الاتية قائمة بالمصادر والاجراءات التي لم يتم فيها محاولة وصف تفصيلي ar.
١١ - - للعملية الخاصة بكل خطوة فصل كروماتوجرافي ؛ وتحاول ايضاً المراجع الاتية ان توضح فقط حالة المجال بصفة كلية ويجب اللا يتم اعتبارها قائمة شاملة لكل ما هو معروف في المجال . تم في دراسة علمية وصف استخدام الفصل الكروماتوجرافي التبادل للانيون anion و الكاتيون 8 في تنقية الإريثروبويتينات (MonoQ@) Broudy, V.C. )١( : erythropoietins (VAAN) ٠ دورية. في الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية العدد 716 صفحة TY - حو (DEAESephacel@) Ghanem, A. B. (Y) وأخرون (V99¢) ؛ دورية الكيمياء الحيوية التحضيرية العدد 74 ؛ صفحة Quelle, FW. « VEY - ١77 وآخرون (YAA4) ¢ علوم الدم العدد VE صصفحة 57 - لاعت )¥( (DEAE Agaroseo) Miyake, T. وأخرون (1977) ؛ جريدة الكيمياء الاحيائية العدد 000A dai a YOY - تحدم « )£( -8) 1٠١ - ١7١ صفحة VY علوم الدم العدد )١991( وآخرون Sepharoseo) Fibi, MR. 1»
PNAS (1 4V\)(SulfoethylSephadex@) Goldwasser, E. and Kung, C.K.H. (°) وأخرون (SulfopropylSephadexo) Miyake, T. (1) ¢ 19A - 14Y dad 1a TA العدد . 5864 — 000A صفحة YO جريدة الكيمياء الاحيائية العدد « (VAVY) يتم وصف الاستخدام الخاص لراتنجات تبادل الانيون anion exchange resin الضعيفة القاعدة DEAE Jie No كخطوة فصل كروماتوجرافي اولى ؛ وذلك في دراسة براءة الاختراع : )١( للولايات المتحدة الامريكية 479978436 (طلب براءة اختراع ذو أولوية AY ؛ لليابان برقم حا )رو (Y) مت لتحدا - اليابان (طلب براءة اختراع ذو اولوية 749 ؛ اليابان برقم 4 ؟ » .) ؛ يتم استخدام cla تبادل أيون exchange resins «منه أكثر قوة قاعدية لعزل الاشكال المتساوية للإريثروبويتين erythropoietin باستخدام كيو - سيفاروز Q-Sepharoses ؛ © وذلك في دراسة براءة الاختراع الاوروبية : (V) 4787731-أ و براءة الاختراع الدولية ay.
Y —_— \ _ لالاتده لاك أو براءة الاختراع الاوروبية ¢YAYY — (ذو اولوية AQ - وبراءة اختراع الولايات المتحدة الامريكية - 04714664). يتم نشر استخدام راتنجات تبادل أيون jon exchange resin قوية كطريقة عامة لفصل البروتينات المطلوبة من الشوائب وذلك في دراسة براءة الاختراع الاوروبية 17743»-أ و ٠ نحلو -أ و براءة الاختراع الدولية call) TAG YALE براءة اختراع ذو اولوية AY - للولايات المتحدة الامريكية برقم 01117843) . تكشف براءة الاختراع البريطانية رقم 8859717 T= عن طرق لتحضير عامل الإريثروبويتينات 005 باستخدام بوليمر مذاب يحتوي على مجموعة تبادل ايون aion exchange . يتم وصف الفصل الكروماتوجرافي للتآلف باستخدام صبغات سيباكرون زرقاء Cibacron Blue ؛ ٠ وذلك في الدراسة العلمية في تنقية الإريثروبويتينات erythropoietin : CM Affi-GelBlue Krystal, 6. )١( وآخرون )١84( الجريدة البريطانية في علوم الدم Hematology العدد 0A صفحة 1ه - 14 ىر CM Affi-GelBlue Broudy, V. (Y) وآخرون )١44( ؛ دورية_الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية Arch of Biochem and Bioph. » العدد YO صفحة 34 - 5 CM Affi-GelBlue Krystal, G. (Y) Vo وآخرون )١٠9785( « علوم الدم Hematology العدد ١7 صفحة VY - ف ) ¢ ( CM Aff GelBlue Yanagi, H.i وآخرون DNA + ( 14 Ad) العدد A « Blue TrisacrylM) Fibi, MR. (©) 4797 = 414 dada وآخرون )4491( «¢ علوم الدم Hematology العدد VY - صفحة ١٠١١١ - ١٠7ل . ay.
دس - استخدام الانثراكوينونات Jie anthraquinones صبغات سيباكرون الزرقاء Cibacron Blue ؛ معروف ايضاً في دراسة براءة الاختراع : )1( 1240765071 - اليابان (طلب براءة اختراع ذو أولوية AY - اليابان = 1747748؛) ؛ (Y) مجموعات كربوكسي مثيل carboxymethyl المرتبطة و أزرق السيباكرون CM Affi-Gel J—% « Cibacron BlueF3Gas F3GA م Tey ytevay - اليابان (طلب براءة اختراع ذو اولوية AY - لليابان برقم - (FYE يتم وصف استخدام الفصل الكروماتوجرافي باستثاء الحجم في تنقية الإريثروبويتينات erythropoietins في دراسة براءة الاختراع والدراسة العلمية؛ (TSKG3000SW) Yanagi, H. )١( وآخرون DNA )١989( العدد A - صفحة 414 - MR. (Y) ¢ £YV ,1 وأخرون )1441( علوم الدم العدد VV - صفحة (SephadexG-100e) Goto, M. (¥) « ١١٠١ - 7١7 ٠ وآخرون )١848( ؛ التكنولوجيا الحيوية ؛ العدد ١ - صفحة AV حا 58 Yanagawa, وآخرون (VAAL) ؛ جريدة الكيمياء الاحيائية - العدد YOY - صفحة 000A - 5ف 4) براءة الاختراع اليابانية رقم 1161857497 - أ (طلب براءة اختراع ذو اولوية 87 لليابان برقم .).7749٠- يتم وصف استخدام هيدروكسي أباتيت hydroxyapatite لتنقية الإريثروبويتينات erythropoietins vo في الدراسة العلمية ودراسة براءة الاختراع : .© Krystal, وآخرون )١9876( علوم الدم العدد 7 صفحة Yanagi, 11 4 = VY وآخرون DNA (V9A4) العدد ١6 صفحة £14 - (BioRadHPHT) Goto, M ١ 47١ وآخرون (Y4AA) التكنولوجيا الحيوية العدد 7 ¢ صفحة TV PNAS ( ١٠91 ) (calcium phosphate gel) Goldwasser, E. and Kung, CK.H. ¢ V+ — العدد TA ¢ صفحة 47 - (BioRad BioGelHT & Miyake, T. « 149A وآأخرون (Y4VY) ٠ جريدة الكيمياء الاحيائية العدد YOY ؛ صفحة 000A - 00564 ؛ براءة الاختراع اليابانية برقم qv.
١6 - - ١167 (طلب براءة اختراع ذو اولوية AY - براءة الاختراع اليابانية برقم - )37491١ ٠ يتم وصف انفصال شوائب البروتينات المحتوية على مثيونينات methionines بادئه (بروتينات مبدلة) باستخدام هيدروكسي أباتيت hydroxyapatite وبخاصسة من طريقة الفصل الكروماتوجرافي للسائل عالي الاداء 1101.0 ؛ أو في إتحاد من الخطوات ؛ ويتم وصف ذلك في ٠ براءة الاختراع الامريكية رقم EVAAAAT و الدولية رقم ATHY STA وبراءة الاختراع الاوروبية 716744١-أ - وبراءة الاختراع الاوروبية ١77971-آ (طلبات براءة اختراع ذات اولوية AE وبراءة الاختراع اليابانية برقم 4950 ٠٠ وبراءة الاختراع اليابانية رقم 11794 ٠ لسنة AT وبراءة الاختراع اليابانية رقم ١6544٠ لسنة (AY وبراءة الاختراع الامريكية رقم 4 ؟ وبراءة الاختراع الاوروبية رقم 1776794 . ٠ ويتم التعرف على الاستخدام العام للأجسام المضادة الغهير متحركة لعملية الفصل الكروماتوجرافي ذات alll المناعي للإريثروبويتينات erythropoietins ؛ في الدراسة العلمية : Miyazaki, H وآخرون (VAM) جريدة الطرق المناعية ؛ العدد 0117 ؛ صفحة (YY = 16١ M 000. وآخرون (VAAN) التكنولوجيا الحيوية- العدد 3 صفحة NV كنا Yanagawa, s وآخرون )١984( الكيمياء الحيوية التحضيرية العدد ١764 صفحة ١77 - 67 .Ghanem, AB oe وآخرون )١994( الكيمياء الحيوية التحضيرية- العدد YE ؛ صفحة ١١١7 - 7 لط .Wojchowski,, وآخرون (YAY) الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية Arch of Acta.
Biochem and Bioph. العدد 91 ؛ ١760 dasa - لاا . يتم Lad التعرف على الاستخدام العام للاجسام المضادة الغير متحركة لعملية الفصل الكروماتوجرافي للتآلف المناعي ؛ في دراسة براءة الاختراع : ar.
و١ - EP - 107 4477 (طلب براءة اختراع ذو أولوية AT - اليابان - 019147)؛ وبصفة خاصة أكثر للإريثروبويتين erythropoietin في براءة رقم 40080056 - للولايات المتحدة الامريكية وبراءة ©٠١77 للولايات المتحدة الامريكية وبراءة ١١6447 - ب الاوروبية (طلب براءة اختراع ذو اولوية AY - الولايات المتحدة الامريكية - وبراءة رقم 09ت م و ححلاخلده f= - لليابان calla) براءة اختراع ذو الاولوية Av لليابان برقم )٠0115486 ؛ وبراءة 5 4119746- أ وبراءة رقم 0471137499 T= - لليابان وبراءة رقم 4088646 - ب ؟ - لليابان calla) براءة اختراع ذو الاولوية AY - لليابان برقم )٠7719749 وبراءة رقم 0 حب <- لليابان وبراءة رقم 411745868 .أ - لليابان وبراءة رقم 4187174 - للولايات المتحدة الامريكية (طلب براءة اختراع ذو اولوية AY - لليابان برقم 7737494..) ٠ وبراءة رقم 4871118 - للولايات المتحدة الامريكية (طلب براءة اختراع ذو اولوية AY - للولايات المتحدة الامريكية برقم ATV +( وبراءة رقم £OTAEAA - للولايات المتحدة الامريكية (طلب براءة اختراع ذو اولوية AE - للولايات المتحدة الامريكية برقم 5706075.) وبراءة رقم 49508665 - للولايات المتحدة CAS) He ويكون استخدام عملية الفصل الكروماتوجرافي لسائل عالي الضغط منعكس الطور vo (©.1101- 110)_مخطوة في التنقية الاجمالية للإريثروبويتينات erythropoietins ؛ معروف في كل من الدراسات العلمية ودراسة براءة الاختراع : (DEAE-C4 RP-HPLC Con A )١( Agarose) Quelle, F.
W. وآخرون )٠989( ٠ علوم الدم Hematology ؛ العدد VE صفحة NOY eV - ¢ (Blue TrisacrylMs -S-Sepharosee - C8 RP-HPLC Size exclusion) Fibi, M.R )7( Y. وآخرون )144( علوم الدم Hematology ؛ العدد VV ¢ صفحة RP-) )©( 7٠١ = ٠١7١7 ay.
١١ - - HPLC - الفصل الكروماتوجرافي بالتصفية الجزيئية) براءة رقم 707316400 أ - لليابان (طلب براءة اختراع ذو أولوية Ae - لليابان برقم 0197977717) . يتم Lind وصف (RP - HPLC) كخطوة فصل كروماتوجرافي نهائية في الدراسات العلمية ودراسة براءة الاختراع ¢ Jacobs, K وآخرون )١1989( ؛ علوم الطبيعة العدد dai aa IY م AV — AT « (فصل كروماتوجرافي بتبادل الكاتيون (RP - HPLC - exchange cation Broudy, V وآخرون (VAAA) ؛ دورية في الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية؛ العدد 766 ؛ صفحة 379 - 776 6 Krystal, روآخرون )١943( علوم (DEAE-Agaroses ¢ axl Sulphopropyl-Sephadexe (ترشيح هلامي - هيدروكسي أباتيت RP - - hydroxyapatite (HPLC براءة الاختراع الاوروبية رقم 70845974 - ب١ وبراءة 077877 - للولايات ٠ المتحدة الامريكية calla) براءة اختراع ذو اولوية Ao - للولايات المتحدة الامريكية برقم ACY 140+( وبراءة اختراع امريكية برقم 5,177,01576 والاوروبية 1784507 (T= والعالمية 860978496 T= (طلب براءة اختراع ذو أولوية AT - للولايات المتحدة برقم (+AYYYOY . يتم التعرف على عدد من الخطوات الاضافية لتنقية الإريثروبويتينات erythropoietin وذلك في ١ الدراسات العلمية ودراسة براءة الاختراع : )١( (الفصل الكروماتوجرافي بتآلف اللكتين (Lectin Krystal, © وآخرون (Y4AT) علوم الدم ؛ العدد 7١ صفحة ١لا - YA (جرثومية (ail ؛ Quelle, 7 وآخرون )١9489( علوم الدم العدد ١0764 صفحة 107 - «Tov “كد - أوروبا calla) براءة اختراع ذو اولوية ZA - AA برقم )٠ ٠07645 و (7) (التركيز اللوني) Krystal, G وآخرون )١987( علوم الدم ؛ العدد 37 صفحة PBE94 74 - VY ¢ 5 )¥( SDS - PAGE) © - تحضيرية) © Krystal, وآخرون (Y4AT) علوم الدم ؛ العدد TY صفحة VA qv.
١١7 - - PNAS ١١١ (Methylated albumin-Kieseguhr); Goldwasser, E )4( 5 Va - العدد TA ¢ صفحة 6959 - 1458 ؛ )0( (الامتصاص الى دعامة متعدد ستيرين polystyrene المسامي أو شيتوزان chitosan أو التراب الدياتومي (diatomaceous earth 47150 - الولايات المتحدة الذي له طلب براءة اختراع ذو أولوية 4 - لليابان رقم ١٠70559707 ؛ )1( (الفصل ٠ الكروماتوجرافي بالتفاعل التداخلي الكاره للماء (Hydrophobic ل Haung وآخرون (Y4A+) ¢ علوم الدم Hematology ؛ العدد 07 صفحة 370 - 174 « Wojchowski وآخرون (YAY) الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية Arch of Biochem and Bioph. ¢ العدد YY صفحة ١١7١ - 8لا . لا يوجد من بين الاساليب المكثفة المسجلة في الدراسات العملية ودراسات براءة الاختراع لتنقية ٠ الإريثروبويتين erythropoietin ؛ أي من المراجع السالف ذكرها قام باستخدام عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin ؛ وبناءاً على ذلك يقدم الاختراع الحالي خطوة تتقية جديدة ومتميزة في تنقية الإريثروبويتينات .erythropoietins شرح مختصر للرسومات شكل ١ : الفصل الكروماتوجرافي سيفاروز الهيبارين HeprinSepharose ( الخاص ب GA-EPO ٠ المستخلصة من مصل بتركيز ؛ 7 . يمثل شكل ١ رسم بياني كروماتوجرافي يبين تجزئة هيبارين - سيفاروز CL - GB Heparin SepharoseCL-GB للمادة الطافية للمزرعة لخط الخلية الناسخ ل GA - EPO ؛ تتكائر الخلايا على شكل مزرعة تعتمد على التثبيت في مكعب خلوي من شركة Costar في وسط يحتوي على مصل جنين البقر بتركيز ؛ 7 ١ ويتم فصل المادة الطافية للمزرعة وثنائيبة ٠ - الترشيح ومرشحة بدرجة فائقة والتي يتم وصفها في مثال ١ ؛ ويتم هذا الفصل على هيبارين - ar.
- ١8 ويتم 6 L,Y pH عند رقم هيدروجيني Heparin-Sepharoses CL-6B CL - 68 سيفاروز للاجراء بواسطة معايرة المادة الممتزة المناعية المرتبطة بالانزيم GA - EPO تعيين محتوى والخط nm متر nm ويمثل الخط المشار اليه ب الامتصاص عند 780 نانومتر ELISA (~0~) . NaCl المشار اليه ب (---) يمثل مستوى متدرج من كلوريد الصوديوم الخاص ب ( HeprinSepharose شكل ؟ : الفصل الكروماتوجرافي سيفاروز الهيبارين ٠ . 7 المستخلصة من مصل بتركيز ؟ GA - EPO
CL - 6B يمثل شكل ؟ رسم بياني كروماتوجرافي يبين تجزئة هيبارين - سيفاروز المشتق من المادة الطافية للمزرعة لخط GA - EPO الخاص ب Heparin-Sepharoses CL-6B تتكاثر الخلايا على شكل مزرعة تعتمد على التثبيت في مكعب GA - EPO الخلية الناسخ في وسط يحتوي على مصل جنين البقر بتركيز 7 7 ويتم فصل Costar خلوي من شركة ٠ ويتم هذا Ye المادة الطافية للمزرعة والثنائية الترشيح والفائقة الترشيح والتي يتم وصفها في مثال رقم هيدروجيني die Heparin-Sepharoses 01-68 CL - 6B الفصل على هيبارين - سيفاروز
ELISA (~0~) _للاجزاء بواسطة معايرة GA - EPO ؛ وتعيين محتوى 1,7 pH والخط المشار اليه ب nm الخط المشار اليه ( ) الامتصاص عند 780 نانومتر :: متر Gi
NaCl يمثل مستوى متدرج من كلوريد الصوديوم )- - ( 5 الخاص ب ( HeprinSepharose شكل ¥ : الفصل الكروماتوجرافي سيفاروز الهيبارين . المستخلصة من وسط خالي من المصل GA - EPO
CL - 6B شكل ¥ رسم بياني كروماتوجرافي يبين تجزئة هيبارين - سيفاروز Jae ic hall المشتق من المادة الطافية GA - EPO الخاص ب Heparin-Sepharoses 01-8 يتم تكاثر الخلايا في معلق في قنينات في وسط خالي من . GA - BPO لخط الخلية الناسخ ل © ay.
ya - - المصل ؛ ويتم فصل المادة الطافية للمزرعة والثنائية الترشيح والفائقة الترشيح التي يتم وصفها في مثال ؟ ؛ ويتم هذا الفصل على هيبارين سيفاروز 01-68 01-68 Heparin-Sepharoses عند رقم هيدروجيني pH 1,7 ؛ ويتم تعيين محتوى GA - EPO للاجزاء بواسطة معايرة ELISA )-©( . يمثل الخط المشار اليه ب ( ) الامتصاص عند 780 نانومتر صم مقر ود 0 والخط المشار اليه ب (- ==( Jig مستوى متدرج من كلوريد الصوديوم NaCl . شكل ؛ : الفصل الكروماتوجرافي سيفاروز الهيبارين HeprinSepharose ) بتدفق سريع الخاص ب GA - EPO المستخلصة من مصل بتركيز ؛ / . يمثل شكل ؛ رسم بياني كروماتوجرافي يبين تجزئة هيبارين - سيفاروز 6“ Heparin-Sepharoses 6 3833( سريع المشتق من المادة الطافية للمزرعة لخط الخلية الناسخ ل GA - 200 ٠ . يتم تكاثر Wall على شكل مزرعة تعتمد على التثبيت في مكعب خلوي من شركة Costar في وسط يحتوي على مصل جنين البقر بتركيز ؛ 7 ؛ ويتم فصل المادة الطافية للمزرعة والثنائية الترشيح الفائقة الترشيح التي يتم وصفها في مثال 4 ؛ ويتم هذا الفصل على هيبارين - سيفاروز 1 6 Heparin-Sepharoses بتدفق سريع عند رقم هيدروجيني ١ pH ,لأ ؛ ويتم تعيين محتوى GA - EPO 523 61 بواسطة )~0~( ELISA يمثل الخط المشار اليه ( ) ١ الامتصاص عند YA نانومتر nm متر nm والخط المشار اليه (- - -) يمثل مستوى متدرج من كلوريد الصوديوم NaCl . شكل 0 : الفصل الكروماتوجرافي للهاى تراب هيبارين heparin الخاص ب GA - EPO المستخلصة من Jie بتركيز ؟ 7 بعد تنقية مبدئية بواسطة تبادل الايون ion وفصل كروماتوجرافي بالتفاعل التداخلي الكاره للماء . ar.
.ل
يمثل شكل © رسم بياني كروماتوجرافي يبين تجزئة الهاى تراب HiTrap (شركة pharmacia (
الخاص ب GA - EPO المشتق من المادة للمزرعة لخط الخلية الناسخ ل GA-EPO .
يتم تكاثر الخلايا في قارورات دوارة في وسط زراعة يحتوي على مصل dae بتركيز CTY
يتم اجراء تجزئه مبدئية بواسطة الفصل الكروماتوجرافي بتبادل الايون fon باستخدام DEAE
oo الخط الانسيابي الخاص بشركة pharmacia ؛ ويلي ذلك فصل كروماتوجرافي بالتفاعل المتداخل
الكاره للماء على فنيل سيفاروز 00715000 بتدفق سريع (شركة pharmacia ) وفصل
كروماتوجرافي بتبادل الايون on على كيو - سيفاروز Q-Sepharoses بتدفق سريع (شركة
. ) pharmacia
يتم فرز المادة المنقاه La تم فصلها بالتقصفي من راتنج الكيو - سيفاروز uy Q-Sepharosee 18810 ٠ فصلها على هاى تراب HiTrap عند رقم هيدروجيني ,Y pH ¢
ويتم تعيين محتوى GA - EPO للاجزاء بواسطة معايرة )~0~( ELISA .
يمثل الخط المشار اليه ( )الامتصاص عند 180 نانومتر :»8 ؛ والخط المشار اليه (- - -)
يمثل مستوى متدرج من كلوريد الصوديوم NaCl .
شكل “ : الفصل الكروماتوجرافي للهاى تراب هيبارين heparin HiTrap ( الخاص ب - GA EPO 6 المستخلصة من مصل بتركيز 7 7 بعد تنقية مبدئية بواسطة الفصل الكروماتوجرافي
بالتفاعل التداخلي الكاره للماء .
يمثل شكل ١ رسم بياني كروماتوجرافي يبين تجزئة الهاى تراب HiTrap (شركة (pharmacia
الخاص ب GA - BPO المشتق من المادة الطافية للمزرعة لخط الخلية الناسخ ل GA - EPO .
يتم تكاثر الخلايا في قارورات دوارة في وسط زراعة يحتوي على مصل عجل بتركيز 3 7 .
ar,
- vy -
ثم اجراء تجزئة مبدئية بواسطة الفصل الكروماتوجرافي بالتفاعل التداخلي الكاره للماء على di
سيفاروز 7 6 PhenylSepharoset بتدفق سريع (شركة pharmacia ) ويلي ذلك فرز المادة
المنقاه جزئياً التي تم فصلها بالتصفي من هذا الراتنج ويتم فصلها على هارى تراب HiTrap عند
رقم هيدروجيني pH 0,7 ؛ ويتم تعيين محتوى GA - EPO للاجزاء بواسطة معايرة ELISA م (م). يمثل الخط المشار اليه ( ) الامتصاص عند 180 نانومتر ه مر :0 ؛ والخط
المشار اليه )= - -) يمثل متدرج من كلوريد الصوديوم NaCl .
شكل V : الفصل الكروماتوجرافي للهاى تراب هيبارين heparin HiTrap الخاص ب
الإريثروبويتينات erythropoietin المشتقة من WA مبيض الهامستر الصيني (CHO) .
heparin HiTrap رسم بياني كروماتوجرافي يبين تجزئه الهاى تراب هيبارين V شكل Ji المشتق من خلايا مبيض الهامستر erythropoietins للإريثروبويتينات ) pharmacia (شركة ٠
الصيني (CHO) (نظام (RKD والذي يتم تثبيته في وسط غير مكيف ومرشح ترشيح PD
ويحتوي على مصل عجل بتركيز ؟ 7 ؛ ويتم فصل الوسط المثبت والمرشح ترشيحاً ثائياً على
هاى تراب هيبارين heparin HiTrap عند رقم هيدروجيني 1,٠ pH ويتم تعيين محتوى
الإريثروبويتين erythropoietin للاجزاء بواسطة معايرة ball Jy. )- - -( ELISA ١ المتصل المشار اليه (ac ac) الامتصاص عند 780 نانومتر 8« متر nm ؛ والخط المتقطضع
المشار اليه (ac ae) يمتل مستوى متدرج من كلوريد الصوديوم NaCl .
وصف الجدول ١ :
جدول ١ الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin : جدول التنقية
يتم في جدول ١ تصنيف بعض البيانات التي يتم الحصول عليها باستخدام الفصل ٠ الكروماتوجرافي للهيبارين heparin كخطوة فصل كروماتوجرافي أولى أو تالية ؛ وتغطي iv.
الإ -
الامثلة المبينة مجموعة كبيرة من حالات الزراعة Lay فيها الخلايا القائمة على التثبيت والخلايا
الغير قائمة على التثبيت وبواسطة أو بدون مصل جنين البقر أو مصل العجل الخاص بهم عند
تركيزات مختلفة في الوسط ؛ وبالمثل توضح الامثلة مجموعة كبيرة من حالات الفصل
الكروماتوجرافي . ويضع تتابعياً في الجدول مثال # (عمود )١ وحالات النمو (عمود (F
© وحالات التنقية (عمود (V ووحدات /1115/مجم (نشاط نوعي يعبر عنه ب Ewmg « عمود 4؛)
وتنقية الطية (عمود 0( والنسبة المئوية )%( للاستخلاص (عمود )١ .
يقوم الإريثروبويتين erythropoietin بتنظيم النمو والنضوج الطرفي للخلايا المكونه للخلايا
الحمراء وتحويلها الى خلايا دموية حمراء إنتاج الإريثروبويتين erythropoietin في كلية ٠ الانسان البالغ وفي الخلايا شبيهة بالخلايا الحمراء في خلايا كبد الجنين ؛ ففي المرضى الذين
يعانون من خلل وظيفة الكلى يقل انتاج الإريثروبويتين erythropoietin ويؤدي ذلك الى فقر
دم شديد ؛ ويعتبر استخدام الإريثروبويتين erythropoietin الطبيعي المنقى والمركب علاج فعّال
للمرضى الذي يعانون من فقر دم مزمن B ,8:0ة080. )١990( الجريدة الامريكية في أمراض
الكلي ؛ العدد 10 ؛ صفحة ١694 = 175 ؛ © ,48ل:28. وآخرون (1989) ؛ علم العقاقير العدد م م صفحة .Winearles, C.
G « A%4 — AY وآخرون « + )١ دورية بعنوان Lancet
(VIVA = 6
يتكون الإريثروبويتين erythropoietin في الحقيقة من عدد كبير من أنواع متميزة كيميائياً
نتيجة الترتيب المعقد للتحورات الانتقالية التالية وبصفة خاصة الجليكوسيليشن glycosylation ؛
ويكون للإرثيربويتينات erythropoietins التي يتم وصفها في هذا البحث كل من الصفتين ٠ | الاتيتين:
qv.
ا سرب )١( يكون لها تسلسل من حمض أميني amino acid يشبه بدرجة كافية ذلك الحمض الاميني الذي يقوم جين الإريثروبويتين spall erythropoietin gene بتدوين شفرته .
(7) لها خواص أحيائية داخل الجسم تسبب زيادة في انتاج الخلايا الشبكية وخلايا الدم الحمراء . ويكون كل من الإريثروبويتينات Al erythropoietin يتم انتاجها عن طريق الخلايا البولية
٠ البشرية وتلك التي يتم انتاجها عن طريق خلايا الحلمات الثدييه البشرية ؛ عبارة عن جليكوبروتينات glycoproteins ذات سلسلة متعاقبة ناضجة من الاحماض الامينية ٠١١ وتحتوي على ثلاثة سلاسل اوليجوسكريد oligosaccharide مرتبطة بالنيتروجين N-linked وسلسلة واحدة مرتبطة بالاكسجين O-linked . تحدث سلاسل الاوليجوسكريد oligosaccharide المرتبطة بالنيتروجين عند بقايا أسباراجين asparagine ؛7 و TA و 87 بينما تحدث سلسلة
Lai . ١١١ serine المرتبطة بالاكسجين عند بقية سيرين oligosaccharide الاوليجوسكريد ٠ وآخرون ؛ 30007 + (VAAN) FIT صفحة 77١ وآخرون ؛ جريدة الكيمياء الاحيائية العدد دورية الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية العدد 715 صصفحة 79 (19848) . ويكون بوزن جزيئي ظاهر يتغير حسب ظروف الفصل الكروماتوجرافي للهلام (EPO) للإرثيربويتين وآخرون ؛ دورية في الكيمياء الحيوية والفيزياء Brody, 17 (أنظر ؛ على سبيل المثال ؛
“١ وآخرون ؛ علوم الدم Krystal, Go (VAAA) FFU - 379 الحيوية. العدد 7766 ؛ صفحة _ ١ £YV - £19 صفحة (DNA 8)6 وآخرون ؛ -Yanagi, 11 « (AAT) V4 - VY dada )١( يكون الوزن الجزيئي الحقيقي متنوع ويشمل مدى من الاحجام نتيجة الاختلاف في ٠ )١١خك( المتصلة بجزء البروتين في الجزيء ؛ ويعتمد هذا carbohydrate تركيبات الكربوهيدرات . الاختلاف جزئياً على نوع الخلية التي تقوم بانتاج البروتين سواء داخل الجسم أو خارج الجسم
qv.
علا - يمكن ان تكون الإريثروبويتينات Lill erythropoietins للاختراع الحالي أي من الإريثروبويتينات mall erythropoieting 45 التي لها أهمية احيائية و/أو صيدلائية ؛ وكما يتم الاستخدام في هذا البحث فان المصطلح "إريثروبويتين "erythropoietin أو منتج الإريثروبويتين erythropoietin " يقصد به :
)١( oo _الإريثروبويتين erythropoietin الذي يتم عزله من مصدر داخل الجسم ؛ على سبيل المثال البول البشري كما يتم وصفه بواسطة Miyake, T وآخرون )١9917( جريدة الكيمياء الاحيائية العدد (V0) YOY صفحة 000A - 0018 ؛ (7) الإريثروبويتين erythropoietin الذي يتم انتاجه من تنشيط جين الإريثروبويتين erythropoietin gene في الخلايا المشتقة من أصسل بشري ؛ مثل تلك التي تم وصفها في براءة الاختراع الدولية رقم 14/1758٠6 (وايضاً تم بيانها
٠ بالرمز )3( GA-EPO, ) الإريثروبويتين erythropoietin الذي يتم انتاجه من ادخال جين الإريثروبويتين erythropoietin gene 4 خلية عائل بشري ؛ على سبيل المثال ؛ تلك التي تم وصفها بواسطة DNA 8(6) )١٠945( Oso—als.
Yanagi, H صفحة £14 - €YY « )€( الإريثروبويتين erythropoietin الذي يتم انتاجه من ادخال جين الإريثروبويتين erythropoietin gene في خلية عائل غير بشري ؛ مثل تلك التي تم وصفها في براءة الاختراع
. 577008 الامريكية ve يمكن ان تكون "الخلايا المنتجة' خلايا ذات منشاً سوي النويه ؛ ويفضل ان تكون ذات منشاً ثديي ؛ ويفضل اكثر انه تكون ذات منشاً بشري ؛ والخلايا Lie فقاري ؛ ويفضل أكثر ان تكون erythropoietin ؛ على انتاج الإريثروبويتين aD المنتجة لها القدرة ؛ عند زراعتها في وسط المطلوب ؛ بكميات تصلح للاستخلاص ؛ وتشتمل الامثلة البيانية لهذه الخلايا على الخلايا الليفية
fibroblasts ٠٠ والخلايا التقرنية keratinocytes ؛ والخلايا الظهارية epithelial cells (مثل الخلايا
ay.
ده" الظهارية الثديية mammary ؛ الخلايا الظهارية المعوية intestinal ) والخلايا البطانية endothelial والخلايا الدبقية glial العصبية neural والخلايا العصبية والخلايا الموجودة في الدم Ju) الخلايا اللميفاوية lymphocytes وخلايا نخاع العظام bone narrow cells ( والخلايا العضلية muscle cells والخلايا التي Law منها أنواع هذه الخلايا الجسدية LS 5 ¢ somatic cells م سبق ذكره فان هذه الخلايا يفضل ان تكون ذات منشاً ثديي ؛ (مثل الفأر ؛ الجرذ ؛ الأرنب ؛ القط ؛ الكلب ؛ الخنزير ؛ البقرة ؛ الطير ؛ الخروف ؛ الماعز ؛ land القرد ؛ الانسان ؛ ويفضل أكثر ان تكون ذات منشاً ثديي أو بشري . تشتمل الخلايا المنتجة ايضاً على خلايا يتم الحاق اصابه بها ؛ أولية وثانوية وغير ميتة ذات Lane فقاري ؛ وبصفة خاصة ذات Line يي ؛ ويفضل ان تكون ذات منشاً ثديي أو Laie بشري ويتم الحاق اصابة بها عن طريق مادة وراثية ٠ خارجية تحت الخلايا بطريقة مباشرة أو غير مباشرة على انتاج كميات يمكن استخلاصها من الإريثتروبويتين ٠ erythropoietin تتعلق عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin للاختراع الحالي بعزل الإريثروبويتين Cu erythropoietin "السوائل الاحيائية biological fluids " ؛ وكما يرد ذكره في هذا البحث OU "السوائل الاحيائية" يتم ادماجها مع الإريثروبويتينات erythropoieting المعزولة من داخل الخلية ١ _مثل المعزولة من السيتوبلازم cytoplasm أو من أجسام الاندماج أو من الحويصلات ؛ أو التي يتم عزلها من الوسط مثل الحالة التي يتم فيها افراز الإريثروبويتين erythropoietin بواسطة الخلية ؛ ويمكن ان يتم العثور على الجزيئات التي تم افرازها ؛ ثم عزلها من السائل الاحيائي مثل الدم أو اللبن أو السائل الاستسقائي أو البول أو سائل زراعة الخلية . وفي الحالات التي يتم فيها زراعة الخلايا يتم افراز الإريثروبويتين erythropoietin في "سائل © المزرعة' وبصفة خاصة تتعلق عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin باستخلاص ay.
- الإريثروبويتين erythropoietin الموجود في سائل الزراعة الخاص بالخلية التي تقوم بافراز الإريثروبويتين erythropoietin ؛ وكما يرد ذكره في هذا البحث فان المصطلح BL المزرعة" يشير الى اي سائل يستخدم أو يشتق من خلايا مزروعة لها القدرة على انتاج الإريثروبويتين erythropoietin . © يفضل ان يتم فصل السائل الاحيائي أو سائل الزراعة المستخدم في تنقية الإريثروبويتين «erythropoietin الخلايا أو بقايا الخلايا وذلك بالترشيح أو الترشيح الفائق او الطرد المركزي ؛ أو بطرق اخرى معروفة لذوي الخبرة في المجال . يستخدم المصطلح Jil منقى clarified fluid " للدلالة على سائل زراعة أو سائل احيائي يتم فصله من الخلايا أو بقايا الخلايا او مادة دقائقية وذلك بالطرد المركزي أو الترشيح أو الترشيح الفائق أو بطريقة مشابهة معروفة ٠ في المجال ؛ وحيث انه يتم Le 488 جزيئات الإريثروبويتين erythropoietin من "السائل المنقي" فانه من الافضل ان يتم فصل الخلية والبقايا الدقائقية من الوسط سواء كانت سائل احيائي J سائل زراعة ؛ ويمكن اجراء هذه العملية بعدة خطوات ؛ منها الطرد المركزي والترشيح ومنها "الترشيح الفائق" LS (UF) هو معروف جيداً في المجال . يمكن Lad ان يدل المصطلح JIL منقى" على السوائل التي تحتوي على إرثيربويتين والتي يتم تعرضها الى خطوة فصل ١ كروماتوجرافي أو خطوة تنقية سابقة حيث يتم خلال هذه الخطوة نزع الخلية علاوة على المواد الملوثة للخلية وللوسط ؛ من العينة . توجد غالباً رغبة في اجراء 'تتظيم تبادلي buffer exchange " للوسط المحتوي على الإريثروبويتين erythropoietin بواسطة محلول منظم معملي معروف ؛ ويمكن تنفيذ هذه الخطوة بصورة مستقلة كخطوة منفصلة ؛ أو بالاشتراك مع خطوات اخرى . يمكن تنفيذ "التنظيم © التبادلي" بواسطة عدة اجراءات معروفة جيداً لذوي الخبرة في المجال ؛ ومن هذه المجالات على av.
ال - سبيل المثال لا الحصرء أنظمة التدفق المماس أو الالياف المجوفة أو المرشحات المغزلية الملفوفة أو نظام خلية مقلب أو بواسطة عملية فصل كروماتوجرافي كما هو معروف في المجال ؛ توجد عملية أكثر تميزاً وهي كما يتم استخدامها في هذا البحث تتم بالترشيح (DF) At ؛ وفي هذه الحالات يفضل ان يكون الغشاء من متعدد السلفون polysulfone أو غشاء من o السيلولوز cellulose المعاد تكوينه من الانواع المتوفرة تجارياً ؛ على سبيل المثال من شركة Millipore أو أميكون Amicon ؛ ويفضل ايضاً في Alls الاستخدام في خطوة الترشيح ان تكون الاغشية من النوع الذي له قطع حوالي 0060© الى ٠٠0٠٠0 وزن جزيئي ويفضل ان يكون القطع حوالي ٠٠٠٠١ الى 70,0005 وزن جزيئي ؛ ويتم بعد ذلك تعريض المادة المتبقية اختيارياً للفرز و/أو الترشيح الثنائي وفقاً لاجراءات معروفة في المجال ؛ ويفضل ان تكون في نفس المحلول المنظم الذي يكون رقمه الهيدروجيني pH من ١ الى A ؛ ويفضل ان يوجد الملح من صفر الى ٠٠008١6 مليمول من الافضل أكثر ان يكون الملح من صفر الى ٠١ مليمول . ويفضل ان يكون الرقم الهيدروجيني pH من 4,9 الى 8.60 ؛ ويفضل أكثر ان يكون من 2,8 الى ١,6 والافضل ان يكون الرقم الهيدروجيني pH حوالي 1,7 الى 0 . يتم بصفة عامة اشتقاق البروتينات الملوثة الرئيسية في سوائل زراعة خلية الحلمات الثديية من ve مصل او بروتينات مضافة الى الوسط ؛ ويرجع ذلك في احد جوانبه الى اعتماد عديد من أنواع الخلايا على وجود كمية كبيرة من المصل ؛ وتكون الاوساط التجارية للخلية غالباً مكتسبة ل/أو Cilia اليها اما مصل dae ؛ مصل بقري ؛ مصل جنين البقر أو زلال المصل أو بروتينات مصل اخرى elite ؛ أو منقاه جزئياً مثل التراس فرين ؛ أو اتحاد من كل ذلك حيث يتم تنقية البروتين المطلوب منها . وبناءاً على ذلك تكون هناك الرغبة بان تكون الخطوة الاولى لعملية © - التتقية موجهة الى نزع عناصر المصل . qv.
ما - لا تقتصر عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin على الخطوة الاولى لعملية التنقية ؛ وتكون مناسبه للاحتواء في عملية التنقية عند أي نقطة في العملية متعددة الخطوات . أو اجراء فصل كروماتوجرافي ؛ على سبيل المثال لا الحصر ؛ تبادل أيون jon exchange أو تفاعل تداخلي كاره للماء أو استثناء حجم أو طور منعكس أو تآلف ؛ ويمكن ان يتم اجراء ذلك قبل © الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin مباشرة .
يشير المصطلح "دعامة تآلف الهيبارين "heparin affinity support الى أي دعامة فصل كروماتوجرافي معروفة تقوم بحمل جزيئات الهيبارين Cus heparin يكون الهيبارين heparin مربوط بثبات بدعامة الراتنج وتستخدم في الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين «heparin وتكون دعامات lb الهيبارين متوفرة عند عدد من الممولين التجاريين ؛ وتحتوي دعامات تآلف ٠ _الهيبارين heparin المتوفرة تجارياً ؛ على سبيل المثال لا الحصر ؛ على هيبارين سيفاروز HeparinSepharoseo CL-6B CL - 6B « هيبارين سيفاروز 1 6 Hearin Sepharose بتدفق سريع ؛ هاي تراب هيبارين HiTap Heparin ( (شركة pharmacia ) أفيجل هيبارين (بيو راد) Affigel Heparin (BioRad) ؛ هيبارين HeparinAgaraose_y s_\a] » هيبارين سيفاروز ننوع1 Mg sis + نوع 115 go 115 (سيجما) ؛ إيه إف هيبارين ١ تويوبيرل +10 AF-Heparin Toyopearl650 « هيبر دى( ¢ (بيوسيبرا) ؛ هيبارين Heparin HyperDs (Biosepra) هيبارين أجاروز إكس )Heparin Agarose6xLs J (أنواع 1, 11 ) (الكيماويات الدولية الامريكية) ٠ يفضل استخدام المادة الرابطة الصلبة التي تعتمد في تكوينها على الاجاروز 5 + ويفضل ان تكون سيفاروز ) أو مشتقات السيفاروز Sepharose في شكل حبيبي ؛ كما يمكن ايضاً استخدام المواد الرابطة الصلبة الاخرى مثل السيلولوز celluloses
. polyacrylamides و الاكريلاميدات المتعددة ٠ av.
- vq -
يمكن تنفيذ عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin إما على شكل اكواد تشغيلية
مختلفة أو بواسطة الفصل بالتصفي لعمود ؛ ويفضل ان تكون دعامة الهيبارين heparin ؛
موجودة أو بواسطة الفصل بالتصفي لعمود ؛ ويفضل ان تكون دعامة الهيبارين heparin
موجودة في جهاز الفصل الكروماتوجرافي لعمود ؛ وعند استخدامها في اجهزة الفصل
٠ الكروماتوجرافي لعمود فان دعامة تآلف الهيبارين heparin يتم استخدامها بين صفر مئوية و
٠ درجة مئوية ؛ ويفضل ان يكون بين ؛ درجة مئوية و Yo درجة مئوية ويفضل أكثر عند
حوالي ؛ درجة مئوية ويفضل بصفة عامة ان تتم معادلة وتحضير راتنج الهيبارين
Heparin resin والاحتفاظ به وفقاً لمواصفات المصنع (على سبيل المثال ؛ يتم تحضير هيبارين
سيفاروز Heparin Sepharose 01.68 CL 6B كما تم وصفه في كتيب تعليمات شركة pharmacia ٠ ١لا حماخلاح.).
يتم تنفيذ عملية ربط جزيئات الإريثروبويتين erythropoietin بدعامة الهيبارين heparin بتعادل
الدعامة YJ في 'محلول منظم للتعادل" وهذا المحلول عبارة عن الحالة المائية التي توضع فيها
الدعامة لربط جزيئات الإريثروبويتين erythropoietin عندما يتم تلامسها مع السائل الاحيائي او
سائل الزراعة ؛ يتم تتنفيذ عملية ربط الإريثروبويتين erythropoietin بالعمود عند رقم ١ هيدروجين حوالي 5,9 الى Ae ؛ ويفضل ان يكون حوالي 5,4 الى Vie ويفضل اكثر ان يكون
عند رقم هيدروجيني pH حوالي 1,7 أو ٠ ؛ وتصلح عدة محاليل منظمة للاستخدام مع
دعامات الهيبارين «heparin ويفضل المحاليل المنظمة التي تحتوي على :
MES )2- [N-Morpholino] ) موفولينو ] حمض ايثان سلفونيك - 11 1- ¥ ) (MES)
Tris أو ثلاثي (ثلاثي [هيدروكسي مثيل] أمينو ميثان) ethanesulfonic acid) . phosphate أو فوسفات (tris[Hydroxymethyl]aminomethane) | ٠
AY.
الس
ويفضل ان يكون التركيز المختار لتعادل المحلول المنظم حوالي Vo مليمول مع أفضلية في
درجة التوصيل حوالي ؟ سم/ملي ثانية . وقبل ان يتم فصل الإريثروبويتين erythropoietin المربوط بالتصفي من دعامة الهيبارين heparin ؛ يمكن ان يتم فصل of gall الملوثة بالتصفي وذلك بغسل العمود بكمية اضافية من ٠ المحلول المنظم للتعادل ؛ او بواسطة محلول منظم للتعادل يحتوي على أملاح مضافة ؛ محاليل منظمة أو بتتويع الرقم الهيدروجيني 11م الموجود أو بأتحاد من كل هذه العوامل ؛ على سبيل المثال ؛ يمكن ان يتم تتفيذ عملية ربط الإريثروبويتين erythropoietin عند رقم هيدروجيني pH VT ؛ ويمكن فصل بعض المواد الملوثة عند رقم هيدروجيني pH 4,/ا بدون فقد في الإريثروبويتين erythropoietin . يمكن ان يتم تغيير المحلول المنظم بالمعالجة اليدوية لعناصره (Saye استخدام ذلك لتحقيق درجة تنقية مناسبة Sl jad الإريثروبويتين erythropoietin ¢ على سبيل المثال ؛ يمكن اجراء عملية فصل الإريثروبويتين erythropoietin بالقصفي من دعامة الهيبارين heparin وذلك عن Bask زيادة تركيز الملح الموجود في المحلول المنظم لعملية الفصل ؛ ويفضل استخدام أملاح dima مثل الهاليدات القاعدية alkali halides ؛ ويفضل
أكثر استخدام كلوريد الصوديوم NaCl . ve تحتوي اختيارياً المحاليل المنظمة لمعادلة او فصل الإريثروبويتين «erythropoietin على alas للامتزاز anti-adsorbent " و'مضاد الامتزاز antiadsorbent " عبارة عن اي مادة تقلل من امتزاز الإريثروبويتين erythropoietin لاسطح ele sl آو البروتينات الاخرى ؛ أو لنفسها le) سبيل المثال ؛ تراكم) ؛ ومن الامثلة المفضلة لمضادات لامتزاز ؛ مشتقات متعدد اكسي أيثيين سوربيتان polyoxyethylene sorbitan للاحماض الدهنية والتي تعرف بأسم Tween’ "مع Tween20" ٠ " (متعدد أكسي Bid سور بيتان احادي لورات polyoxyethylene sorbitan ay
١س (monolaurate العامل الخافض للتوتر السطحي 1 المفضل دائماً » وفي حالة وجود العامل الخافض للتوتر السطحي ؛ يفضل ان يتم استخدامه بتركيز حوالي 00,١ 7 الى ono ويفضل أكثر ان يكون التركيز حوالي 00١ 7# (وزن/وزن) ٠ يمكن ان يتم ادماج خطوة تنقية الهيبارين heparin الحالية في خطة تنقية اجمالية للإريثروبويتين erythropoietin © ؛ على سبيل المثال ؛ يمكن استخدام الخطوة الحالية مع خطوات فصل كروماتوجرافي تقليدية مثل تبادل الايون don والفصل الكروماتوجرافي لنفاذية الهلام والطور المنعكس من الفصل الكروماتوجرافي ذو السائل عالي الاداء HPLC . تشتمل خطوات تبادل الايون jon exchange بالاتحاد مع خطوة الهيبارين heparin ؛ على استخدام الفصل الكروماتوجرافي لتبادل الانيون jon exchange أو تبادل الكاتيون exchange cation ٠ (سواء كانت قبل أو بعد الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin ( ¢ وتحمل مدعمات تبادل الايون fon exchange المعروفة بصفة عامة والمتوفرة تجارياً والتي تستخدم في تنقية الإريثروبويتين erythropoietin ؛ تحمل مجموعات وظيفية من رباعي الأمونيوم quaternary ammonium ؛ وتكون المواد الرابطة المفضلة للاستخدام في العملية الحالية عباره عن مواد رابطة تعتمد على الاجاروز agarose او السيلولوز cellulose ؛ Ji ١ السيلولوز دقيق microcrystalline cellulose skill أو الاجاروز agaroses المرتبط عرضياً ‘ ومن المواد الرابطة المفضلة ايضاً بصفة خاصة هي المواد الرابطة التي تحمل مجموعات وظيفية من ثنائي اثيل امينو اثيل diethyl aminoethyl أو ثلاثي اثيل امينو اثيل triethyl aminomethyl أو ثلاثي مثيل أمينو مثيل trimethyl aminomethyl ؛ ومن المواد الرابطة لتبادل الانيون anion exchange المفضلة بصفة خاصة اجاروز ثلاثي مثيل أمينو مثيل المرتبط Y. عرضياً trimethyl aminomethyl cross linked agarose ؛ والذي يكون متوفر تجارياً ؛ مثل كيو ar.
الاسم _ - سيفاروز 0-06 بتدفق سريع (شركة pharmacia ) . تحمل بصفة عامة مدعمات تبادل الكاتيون exchange cation المعروفة والمتوفرة تجارياً والتي يمكن استخدامها في تنقية الإريثروبويتينات erythropoietin ؛ أداء حمضي Lay فيها احماض الكربوكسي carboxy والسلفونيك sulfonic ؛ وتشتمل المواد الرابطة التي تحتوي على أداء الكاتيون cation « على oo أشكال مختلفة من المواد الرابطة التي تعتمد في تكوينها على السيلولوز celluloses والبولي سترين polystyrene ؛ وعلى سبيل المثال لا الحصر ؛ تشتمل مبدلات الكاتيون cation 5 الضعيفة المعروفة في المجال على كربوكسي مثيل سللولوز Carboxymethyl- oS 52 S 5 Cellulose مثيل - سيفادكس Carboxymethyl-Sephadexe و كربوكسي مثيل - سيفاروز Carboxymethyl-Sepharose . تحتوي مبدلات الكاتيون cation exchangers القوية ٠ المعروفة في المجال ؛ على سبيل المثال لا الحصر ؛ على بولي ستيرينات مسلفنة sulfonated AG50We, Bio-Rex70) polystyrenes ( وسليولوزات مسلفئة SP - ( sulfonated celluloses (Sephadex وسيفاروزات مسلفئة (S- Sepharose) sulfonated Sepharoses . يفضل ان يتم توصيل خطوة الفصل الكروماتوجرافي التي تشتمل على هذه المواد الرابطة في صورة خطوة فصل كروماتوجرافي لعمود ؛ والتي يمكن اختيارياً تنفيذها تحت درجة حرارة بين ve 40 الى You درجة مئوية ؛ ويضاف ملح بصفة عامة الى محلول منظم للغسيل أو محلول منظم للفصل بالتصفي وذلك ليزيد من القوة الايون don ية للمحلول المنظم للاستعمال او للتعادل ؛ ويمكن استخدام اي من الاملاح الملائمة لهذا الغرض كما يمكن ان يتم تحديد ذلك بواسطة أحد ذوي الخبرة في المجال ؛ بواسطة كلوريد الصوديوم NaCl لكونه أحد الاملاح المناسبة التي يتم استخدامها بصفة مستمرة . ay.
اسه _ يمكن ايضاً استخدام خطوة ترشيح هلام مناسبة في الاتحاد مع خطوة عملية الهيبارين heparin ؛ ومن الامثلة لهذه المواد الرابطة ؛ البولي دكسترانات polydextrans المرتبطة عرضياً مع الاكريلاميدات 5 ؛ Jie المواد الهلامية المركبة AY) للماء التي يتم تحضيرها بالترابط العرضي التساهمي للأليل دكستران allyl dextran مع 'N, N - مثيلين SD © مكريلاميد bisacrylamide عه الإطاع-11,21 والمواد الهلامية للسليولوز المرتبط عرضياً crosslinked cellulose gels ؛ وتكون الدكستران أكريلاميدات dextranacrylamides المرتبطة عرضياً والمتوفرة تجارياً معروفة تحت الاسم التجاري Sephacryl ) وهي متوفرة من شركة pharmacia ؛ وهلام السيفاكريل Sephacrylo gel المفضل هو Sephacryl - 5 200HR ( ؛ ومن امثلة المواد الهلامية للسليولوز cellulose gels المرتبط عرضياً هي المواد الهلامية المسامية ٠ للسيلولوز cellulose المرتبطة عرضياً والمتّوفرة تجارياً Jie 0103000 أو 610,000 والتي تكون متوفرة من شركة أميكون Amicon . أمثلة تعتبر الامثلة الاتية أمثلة توضيحية فقط ولا يمكن اعتبارها محدده لمجال الاختراع الحالي . يمكن اشتقاق مواد بدء التفاعل لتنقية الإريثروبويتينات erythropoietins ؛ من سوائل احيائية أو ١ من خلايا تعتمد أو لا تعتمد على التثبيت ؛ يتم زراعتها في اي وسط زراعة مناسب باضافة آو بدون اضافة كميات مختلفة من مصل البقر أو مصل اخر ؛ أو عناصر غير مشتقة من المصل ؛ ويمكن ان يتم انتاج مادة بدء التفاعل في عديد من أنواع الخلايا البشرية أو الغير بشرية . تحتوي خطوط الخلية البشرية الغير ميته ؛ على سبيل المثال لا الحصر ؛ على خلايا هيلا HeLa cells ومشتقات خلايا هيلا (ATCC CCL 2, 2.1 and 2.2) Hela cells و 1107-7 خلايا ٠ سرطان الثذي K - 5625 (ATCC HTB22) breast cancer cells خلايا سرطان الدم (اللوكيميا ar.
دوس - (ATCC CCL 243) (leukemia cells و KB خلايا السرطان carcinoma cells (ATCC CCL 17) و ADYVA. خلايا سرطان المبيض ovarian carcinoma cells Van der Blick, AM) واخرون) و سرطان ريس ¢A ¢ Cancer Res : 4797 - 5477 (V4AA) وخلايا راجي (ATCC CCL 86) Raji cells وخلايا جوركات ATCC ( Jurkat cells (TIB 152 ٠ وخلايا (ATCC CRL 1432) Namalwa cells | lls وخلايا HL-60 cells (ATCC CCL 240) وخلايا يدر (ATCC CCL 218) WiDr cells وخلايا HT1080 cells (ATCC CCL 121) وخلايا دودى (ATCC CCL 213) Daudi cells وخلايا RPMI 8226 cells (ATCC CCL 155) وخلايا (ATCC CRL 1593) U-937 cells وخلايا ورم باوز الملانى (ATCC CRL 9607) Bowes Melanoma cells وخلايا WI-38VAI3 منحنى ATCC CCL (MOLT - 4 (ATCC CRL 1582 WDA 575.1) 284 ٠ « علاوة على خلايا الورم الهجيني الغير متجانس heterolybridoma cells التي يتم انتاجها عن طريق اتحاد الخلايا البشرية وخلايا من أنواع اخرى يمكن استخدام سلالات من خلايا ليفية بشرية ثانوية مثل 11711-3874813( ATCC (CCL 75 و (5 - ATCC CCL 171) MRC _بالاضافة الى ذلك فانه يمكن استخدام خلايا بشرية ابتدائية لانتاج الإريثروبويتين erythropoietin . يمكن ان يتم انتاج الإريثروبويتين م erythropoietin عن طريق تنشيط جين الإريثروبويتين erythropoietin gene في الخلايا البشرية الابتدائية أو الثانوية أو الخلايا الغير مماته ؛ وذلك كما تم وصفه في براءة الاختراع العالمية. ١775 / 94 أو بواسطة احداث عدوى صناعية بواسطة ادخال جين الإريثروبويتين erythropoietin gene في الخلايا الابتدائية او الثانوية أو الغير مماته immortaized والتي تكون من أصل بشري أو غير بشري . av.
vo - -_ تبين الامثلة التوضيحية الاستعمال المتعدد لعملية الكروماتوجرافي للهيبارين heparin كخطوة تنقية أولى أو تابعة ؛ وتوضح الامثلة الاتية ايضاً ان عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin تعمل بطريقة جيدة مع عدة Clad) هيبارين Heparin resins تجارية ؛ وتوضح ايضاً تعدد الخطوة من الاستخدام التحليلي الى الاستخدام التحضيري . يتم تنفيذ الامثلة ١ - 6 و ١ - Ao باستخدام gl GA - EPO يتم عزله من الخلايا البشرية المنشطة الجين التي يتم انتاجها اساساً كما تم وصفه في البراءة العالمية 44/177380 ؛ يتم تتفيذ مثال 7 بإستخدام إريثروبويتين erythropoietin من مصدر متوفر تجارياً والذي يتم انتاجه بواسطة نسخ جين الإريثروبويتين erythropoietin gene البشري بعد ادخاله في خلايا كربو هيدراتيه .CHO Cells مثال :١ استخدام عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin كخطوة فصل ٠ كروماتوجرافي أولى في عملية التنقية 1. مادة بدء التفاعل يتم الحصول على وسط مكيف يحتوي على مصل جنين بقري بتركيز ؛ 7 من خط خلية بشرية ملتصق ناسخ ل lial GA - EPO في مكعب خلوي من (Costar) ؛ تتم تنقية الوسط بالطرد المركزي ثم الترشيح خلال وحدة ترشيح Nalgene filter 0,5 مكيرون ؛ ويتم اجراء ترشيح ٠ فائق Ultrafiltration /ترشيح ثنائي (DF/UF) diafiltration باستخدام جهاز دفق مماس بليكون (Millipore) Pellicon مثبت مع غشاء قطع ذو وزن جزيئي Vopr es + ويكون المحلول المنظم للتعادل والفرز Yeo مليمول MES ؛ الرقم الهيدروجيني PH 1,7 ويحتوي على 0,5 / توين ٠١ Tween . Iv
دوس 2. الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin
يتم اجراء عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin باستخدام جهاز GradiFrac من شركة pharmacia عند ؛ درجة مئوية . تتم معادلة عمود 786 مل X VE) © ستتيمتر) من سيفاروز الهيبارين 01-8 01-68 HeparinSepharoseo (من شركة pharmacia ) ؛ مع ٠١ م مليمول MES ؛ ورقم هيدروجيني pH 1,7 ويحتوي على 0.١ 7 توين Yo Tween ؛ عند معدل تدفق ٠١ مل في الدقيقة ؛ يتم وضع عينة في العمود بمعدل ٠١ مل في الدقيقة بواسطة مضخة (050)_من شركة 8 ؛ ثم يتم Jud العمود بمنظم للتعادل حتى يتم ثبات الامتصاص عند YA نانومتر nm متر 81« . يتم فصل البروتين الضعيف الترابط بالغسل بواسطة حجم عمود واحد (de YAY) من Vo مليمول MES ؛ رقم هيدروجيني LY pH ¢ ٠ ويحتوي على ١.١ 2 توين Yoo Tween 06 14 كلوريد صوديوم NaCl ؛ وفي نفس الوقت يتم تجميع ١١ مل من تلك الاجزاء ويتبع عملية الغسيل تدرج خطي ذو حجم عمودين )014 مل) من ٠.06 14 الى 5,» 1 كلوريد صوديوم 14801 في ٠١ مليمول MES ؛ رقم هيدروجيني LY يحتوي على 0.١ 7 توين Yo Tween ؛ ثم يتم غسله بواسطة حجم عمود واحد M «TO كلوريد صوديوم ٠١ (NaCl مليمول MES ؛ رقم هيدروجيني pH 7,7 ويحتوي ve على Lay توين 5١ Tween . يتم بعد ذلك زيادة المحلول المنظم لعملية الفصل shally ؛ حتى ٠,١ 14 كلوريد صوديوم 11801 في ٠١ مليمول MES ورقم هيدروجيني LY pH ويحتوي على ١ توين ٠١ Tween على نصف حجم العمود (Je Vr) ثم يتم الابقاء عليه في
هذا المحلول المنظم حتى حجم عمود واحد YAY) مل) . وتتم متابعة البروتين الكلي بالامتصاص عند 786 نانومتر nm متر im إتباع تركيز ll ٠ - بمراقبة توصيلية داخلية (شكل )١ ؛ ويتم تحليل الاجزاء المنسابه والاجزاء المشطوفة للكشف iY.
الس عن محتوى GA - EPO بواسطة معايرة ELISA الاجهزة 0 مع R SDS - PAGE و بقعة ونسترن Western Blot . ثم يجري اعادة تحضير عمود سيفاروز الهيبارين heparinSepharoseo بوضع 0٠0 مل من ٠١ مليمول ثلاثي - كلور Tris-Cl ورقم هيدروجيني pH 9,0 ويحتوي على ME يوريا 1:88 و ٠ 104 1 كلوريد صوديوم NaCl ويتبع ذلك الغسل بمحلول منظم للتعادل حتى تتساوى درجة التوصيل والرقم الهيدروجيني pH لكل من بقايا العمود والمحلول المنظم للتعادل . يتم في تجربة واحدة لتحمل GA - EPO على عمود الهيبارين heparin استخلاص 84 7 في التجمع الناتج من الفصل بالتصفي ؛ وينتج عن استعمال هذا العمود نزع 90 7 من البروتين الملوث (جدول )١ . Ja ٠ ؟ : استخدام عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin كخطوة فصل كروماتوجرافي اولى في عملية تنقية 1.. مادة بدء التفاعل يتم الحصول على وسط مكيف يحتوي على مصل جنين بقري بتركيز ١ 7 من خط خلية بشرية ملتصق ناسخ GA - EPO _المنتشر في مكعب خلوي من (Costar) ؛ يتم تنقية الوسط بالطرد vo المركزي ثم الترشيح خلال وحدة ترشيح filter 5,0141806 ميكرون ؛ ويتم اجراء ترشيح فائق Ultrafiltration /ترشيح ثنائي diafiltration باستخدام جهاز دفق مماسي Pellicon (Millipore) مثبت مع غشاء قطع ذو وزن جزيئي 0500٠0 ؛ ويكون المحلول المنظم للتعادل والفرز ٠١ مليمول MES والرقم الهيدروجبني pH 7,7 ويحتوي على 0,5 7# توين Tween ٠ . ar.
رم - 2. الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin يتم اجراء عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin باستخدام جهاز جراديفراك GradiFrac system من شركة pharmacia عند 4 درجة مئوية . تتم معادلة عمود 78٠8 مل X 1) © سم) من سيفاروز الهيبارين CL-6B heparin (من شركة pharmacia ( ؛ مع ٠١ ٠ _مليمول MES ورقم هيدروجيني TY ويحتوي على ٠١ 7 توين Yo Tween عند معدل تدفق ٠ مل في الدقيقة . يتم وضع عينة في العمود بمعدل ٠١ مل في الدقيقة بواسطة مضخة (P50) من شركة pharmacia « ثم يتم غسل العمود بمنظم للتعادل حتى يتم ثبات الامتصاص عند 1880 نانومتر nm متر nm . يتم فصل البروتين الضعيف الترابط بالغسل بواسطة حجم عمود واحد (do YAY) من ٠١ مليمول MES ورقم هيدروجيني pH 7,7 ويحتوي على 02١ 17 توين ١ 160 0٠ و ٠,١ 11 كلوريد صوديوم NaCl وفي نفس الوقت يتم تجميع VY مل أجزاء يتبع عملية الغسيل تدرج خطي ذو حجم عمودين O10) مل) من 00 11 الى ٠078 14 كلوريد صوديوم NaCl في 10880,07 .14 dys هيدروجيني pH 1,7 ويحتوي على 0.١ 7 توين Ye Tween ثم يتم غسله في © ١,7 14 كلوريد صوديوم 14801 في 10880.05 14 ورقم هيدروجيني TY pH ويحتوي على )+ 7 توين Yo Tween لحجم عمود واحد YAY) مل) . ١ تتم زيادة كلوريد الصوديوم NaCl في المحلول المنظم لعملية الفصل الى ٠.١٠ 14 كلوريد صوديوم NaCl على مدى واحد - نصف حجم عمود (Jo Vir) ثم الابقاء عليه في هذا المحلول المنظم حتى حجم عمود واحد YAY) مل) . تتم متابعة البروتين الكلي بالامتصاص عند 1850 نانومتر nm متر «« ويتم اتباع تركيز المللح بمراقبة توصيلية داخلية (شكل ؟) ويتم تحليل الاجزاء المنسابة والاجزاء المشطوفة للكشف عن ay.
vq — ~ محتوى GA - EPO بواسطة ELISA (الاجهزة D مع (R وبواسطة SDS - PAGE و بقعة وسترن Western Blot . يتم اعادة تحضير عمود الهيبارين heparin بوضع 074 مل من ٠١ مليمول ثلاثي - كلور Tris-Cl ورقم هيدروجيني pH 3,0 ويحتوي على ME يوريا urea 141,4 كلوريد © صوديوم NaCl ؛ ويتبع ذلك وضع محلول منظم للتعادل حتى تتساوى درجة التوصيل والرقم الهيدروجيني 17م لكل من بقايا العمود والمحلول المنظم للتعادل . يتم في تجربة واحدة لتحميل GA - EPO على عمود الهيبارين heparin استخلاص LAY في التجمع الناتج من الفصل بالتصفي ؛ وينتج عن استعمال هذا العمود نزع 87 7# من البروتين الملوث (جدول )١ . Jha. ¥ : استخدام lee الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin كخطوة فصل كروماتوجرافي اولى في عملية تنقية 1. مادة بدء التفاعل يتم تتقية وسط مكيف خالي من المصل يتم الحصول عليه من خط خلية بشرية ناسخ ل GA - EPO في معلق قوارير ؛ وتتم هذه التنقية بالطرد المركزي ثم الترشيح خلال وحدة ١ ترشيح £+,0Nalgene filter _ميكرون . ويتم اجراء ترشيح فائق Ultrafiltration إترشيح ثنائي 0 باستخدام جهاز دفق مماس صغير (Millipore) مثبت مع غشاء قطع ذو وزن جزيئي ٠٠0٠١ ؛ ويكون المحلول المنظم للتعادل والفرز Yo مليمول MES و الرقم الهيدروجيني NY pH ويحتوي على 0,+ ٠١ Tween (ps . ar.
.م
2. الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin
يتم اجراء عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin باستخدام جهاز FPLC من شركة
pharmacia عند YO درجة مئوية . تتم معادلة عمود VY مل TXT) سم) من سيفاروز
الهيبارين 63 - HeparinSepharoses CL-6B CL (من شركة pharmacia ) مع ٠١ مليمسول MES © ورقم هيدروجيني pH 1,7 ويحتوي على )+ 7 توين ٠١ Tween عند ١ مل في
الدقيقة. يتم تحميل العينة المقرر وضعها للعمود بمعدل ١ مل في الدقيقة بواسطة حلقة اضافية ثم
يتم غسل العمود بمحلول منظم للتعادل حتى يتم ثبات الامتصاص عند 780 نانومتر 001 متر
0 . يتم وضع تدرج خطي بحجم خمسة أعمدة (Je Th) من صفر الى 0,4 14 كلوريد
صوديوم NaCl في 10850.07 M ورقم هيدروجيني pH 6,7 ويحتوي على 0.١ 7 توين Yo Tween ٠ ويتبع ذلك تدرج حجم عمود واحد الى 141,8 كلوريد صوديوم 11801 في MES
4 ورقم هيدروجيني LY pH ويحتوي على ٠١ Tween (pg Lay ثم الابقاء عليه في
هذا المحلول المنظم حتى حجم عمود واحد .
تتم متابعة البروتين الكلي بالامتصاص عند YA نانومتر jie nm 0008 ويتم تحليل الأاجزاء
المناسبة والاجزاء المشطوفة للكشف عن محتوى GA - EPO بواسطة ELISA (الاجهزة D Vo مع ) (شكل 7) وبواسطة SAD - PAGE وبقعة وسترن Western Blot +
يتم اعادة تحضير عمود الهيبارين ٠١0 heparin مل من ٠١ مليمول ثلاثي = كلور Tris-Cl ¢
ورقم هيدروجيني pH 9,0 ويحتوي على ME يوريا urea و 141,4 كلوريد صوديوم
NaCl ؛ ويتبع ذلك الغسل بمحلول منظم للتعادل حتى تتساوى درجة التوصيل والرقم
الهيدروجيني pH لكل من بقايا العمود والمحلول المنظم للتعادل .
يتم في تجربة واحدة لتحميل GA - EPO على عمود الهيبارين heparin استخلاص 0 7 في
التجمع الناتج من الفصل بالتصفي ؛ وينتج عن استعمال هذا العمود نزع 9١7 7 من البروتين
الملوث (جدول )١ .
مثال ؛ : استخدام عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin كخطوة فصل
٠ كروماتوجرافي اولى في عملية تنقية
1. مادة بدء التفاعل
يتم الحصول على وسط مكيف يحتوي على مصل جنين بقري بتركيز ؛ 7 من خط خلية بشري
ملتصق ناسخ ل GA - EPO المنتشر في مكعب خلوي من (Costar) ؛ تتم تنقية الوسط
بالطرد المركزي ثم الترشيح خلال وحدة ترشيح Nalgene filter 50.9 _ميكرون . يتم اتمام ٠ عملية تبادل المحلول المنظم عن طريق الفرز طوال الليل (غشاء قطع ذو وزن جزيئي 73000
الى )٠400 مقابل ٠١ مليمول ثلاثي ورقم هيدروجيني Vor pH ويحتوي على ١.١ 7 توين
.٠١ Tween
2.. الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin
يتم اجراء عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin باستخدام جهاز FPLC من شركة pharmacia ٠ عند YO درجة مئوية . تتم معادلة عمود ٠١ مل ( © VIX سم) من سيفاروز
الهيبارين 1 6 HeparinSepharoses بتدفق سريع (شركة pharmacia ) مع ٠١ مليمول ثلاثي
ورقم هيدروجيني Vir pH ويحتوي على 0.١ 7 توين ٠١ Tween عند ؛ مل في الدقيقة . يتم
وضع عينة الى العمود بمعدل ؛ مل في الدقيقة ؛ ثم يتم غسل العمود بمحلول منظم للتعادل حتى
يتم ثبات الامتصاص عند 7850 نانومتر 007 ويلي عملية الغسل تدرج خطي بحجم عمود ٠١ (de Ver) © من صفر الى 8 1 كلوريد صوديوم 11801 في ٠١ مليمول ثلاثي ؛ ورقم
qv.
Y — ¢ _ هيدروجيني 7,٠ pH ويحتوي على Lo) توين Yo Tween . يتم بعد ذلك زيادة المحلول المنظم لعملية الفصل بالتصفي حتى ٠.١ 131 كلوريد صوديوم 14801 في ٠١ مليمول ثلاثي ورقم هيدروجيني 7١٠ pH ويحتوي على ٠,١ / توين Yo Tween فوق © مل ثم الابقاء عليه في هذا المحلول المنظم حتى حجمي عمود (Jo Yo) . تتم متابعة البروتين الكلي بالامتقصاص oo عند YA نانومتر «0 ويتم تحليل الاجزاء المنسابة والاجزاء المشطوفة للكشف عن محتوى GA - EPO بواسطة معايرة ELISA (الاجهزة 0 مع (R (شكل ؛) وبواسطة - SDS PAGE 4285 وسترن Western Blot . يتم في تجربة واحدة لتحميل 68-1200 على عمود هيبارين heparin استخلاص 84 / في التجمع الناتج من الفصل بالتصفي ؛ وينتج عن إستعمال هذا العمود ؛ نزع 97 7 من البروتين ١ الملوث (جدول \ ( ٠ تتم اعادة تحضير عمود سيفاروز الهيبارين HeparinSepharoses 6 ١ بتدفق سريع بواسطة الغسل ب Yo مل من ٠ ١ عياري هيدروكسيد صوديوم NaCl ثم الغسل بمحلول منظم للتعادل حتى تتساوى درجة التوصيل والرقم الهيدروجيني 11م لكل من بقايا العمود والمحلول المنظم للتعادل . ١ مثال 0 : استخدام عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin كخطوة متوسطة في 1.. مادة بدء التفاعل يتم الحصول على )£00 مل) من وسط مكيف يحتوي على مصل جنين dae بتركيز ١ 7 من خط خلية بشري ملتصق ناسخ ل GA - PEO _المنتشر في قارورات دوارة ؛ ويتم تنقية الوسط ٠ بالطرد المركزي ثم الترشيح خلال وحدة ترشيح Nalgene filter 50,0 ._ميكرون . يتم تخفيف ay.
دس المادة ؛ - طيات بالماء ويتم تحميلها على عمود 100 DEAE مل من شركة pharmacia « ومدرج في ٠١ مليمول ثلاثي - كلور Tris-Cl ورقم هيدروجيني 8.٠ pH ؛ وبعد ان يتم الغسل بواسطة ؟ لتر من المحلول المنظم للتعادل يتم فصل GA - EPO بواسطة Yo مليمول ثلاثي - كلور Tris-Cl ؛ برقم هيدروجيني pH 8.0 ويحتوي على MY كلوريد صوديوم NaCl . يتم © تجمع المادة المفصولة وضبطها الى MY كلوريد صوديوم NaCl ووضعها الى عمود سيفاروز الفنيل 7 6 Phenyl Sepharose بتدفق سريع ٠٠١ مل من شركة pharmacia ويتم تعادله في محلول منظم بالفوسفات (Dulbecco) phosphate يحتوي على كمية اضافية من MY كلوريد الصوديوم NaCl ؛ وبعد ان يتم الغسل بمحلول ملح منظم بالفوسفات phosphate يحتوي على كمية اضافية ١,58 14 كلوريد الصوديوم NaCl ؛ يتم فصل 068-1200 مع ٠١ مليمول ٠ هيدروكسيد صوديوم NaCl ؛ ورقم هيدروجيني VY pH ويحتوي على ٠١ 7 بروبيلين جليكول propylene glycol و ME يوريا urea . يتم فرز التجمع عن عملية الفصل بالتصفي مقابل ٠١ مليمول ثلاثي كلور Tris-Cl ؛ رقم هيدروجيني Ae pH ويحتوي على ١,06 توين Tween ٠٠١ ثم يتم وضعه على عمود ٠١ مل من كيو - سيفاروز Q-Sepharoses بتدفق سريع متعادل في نفس المحلول المنظم . يتم فصل GA - EPO العمود باستخدام تدرج حجم عمود ٠١ من صفر الى ٠.١ 14 كلوريد صوديوم NaCl في المحلول المنظم للتعادل . يتم تجمع الاجزاء التي تحتوي على GA - EPO وفرزها مقابل ٠١ مليمول MES ؛ رقم هيدروجيني LY pH ويحتوي على ٠١ Tween (psi 7 ٠.05 . 2.. الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin يتم توصيل عمودان هيبارين هاى تراب («heparin HiTrap شركة pharmacia كل منهما ١ ٠ مل سبق تعبئتهما ويتم التوصيل بحيث يكون واحد خلف الاخر ؛ ويتم التعادل في Yo مليمول ar.
م4 - MES « رقم هيدروجيني 1,١ pH ويحتوي على Lovo توين Yo Tween . يتم تحميل المادة التي تم فرزها من عمود كيو - سيفاروز mlQ-Sepharoses بتدفق سريع ¢ الى أعمدة الهاى تراب هيبارين heparin HiTrap المصطفة خلف بعضها ؛ ثم يتم بعد ذلك غسل الاعمدة بمحلول منظم للتعادل حتى يتم ثبات الامتصاص عند 780 نانومتر nm ؛ يتبع lee الغسل تدرج خطي ٠ (10 مل) بحجم عمود Fo من صفر الى 140.5 كلوريد صوديوم NaCl في 0.02M 1288 رقم هيدروجيني pH 6.7 ويحتوي على 8606© 7 توين ٠١ Tween . تتم متابعة البروتين الكلي بالامتصاص عند 780 نانومتر nm ؛ ويتم تحليل الاجزاء المنسابة والاجزاء المشطوفة للكشف عن محتوى EPO - 08_بواسطة ELISA (الاجهزة 0 مع ) (شكل °( وبواسطة SDS - PAGE و Western Blot . ٠ يتم في تجربة واحدة لتحميل GA - EPO على أعمدة هيبارين sla تراب heparin HiTrap ¢ استخلاص LAN في التجمع الناتج من الفصل بالتصفي » وينتج عن استعمال هذا العمود نزع VA من البروتين الملوث (جدول )١ . مثال ١ : استخدام عملية الفصل الكروماتوجرافي كخطوة متوسطة في عملية تنقية 1 . مادة بدء التفاعل ١ يتم الحصول على ٠0١7( مل)_من وسط مكيف يحتوي على مصل dae بتركيز ZY من خط خلية بشري ملتصق ناسخ ل GA - EPO المنتشر في قارورات دوارة ؛ ويتم تنقية الوسط بالطرد المركزي ثم الترشيح خلال وحدة ترشيح Nalgene filter 40,6 ميكرون . يتم ضبط المادة الى MY كلوريد صوديوم NaCl ثم يتم تحميلها على عمود سيفاروز الفئنيل + 06 بتدفق سريع ٠٠١ مل من شركة pharmacia . يتم تعادله في محلول ملح ٠ منظم بالفوسفات (Dulbecco) | phosphate يحتوي على كمية اضافية من MY كلوريد ar,
مع - الصوديوم NaCl ؛ وبعد ان يتم الغسل بمحلول ملح منظم بالفوسفات (Dulbecco) phosphate يحتوي على كمية اضافية ١,6 14 كلوريد الصوديوم NaCl متبوعاً July ب Yo مليمول ثلاثي ؛ رقم هيدروجيني pH 8.0 ؛ يتم فصل GA -EPO بواسطة ٠١ مليمول هيدروكسيد الصوديوم NaCl ؛ رقم هيدروجيني ١١ pH ويحتوي على 7١ 7 بروبيلين جليكول propylene ME glycol © يوريا urea . يتم تجميع الاجزاء التي تحتوي على GA - EPO وفرزها مقابل ٠ مليمول MES ؛ رقم هيدروجيني pH 5,7 ويحتوي على 6,05 7 توين ٠١ Tween . 2 . الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin يتم توصيل عمودان هيبارين sla تراب HiTrap Heparin من شركة pharmacia كل منهما ١ مل سبق تعبئتهما ؛ ويتم التوصيل بحيث يكون ؛ واحد خلف الاخر ؛ ويتم التعادل في Vo ٠ .- مليمول MES ؛ رقم هيدروجيني pH 0,7 ؛ ويحتوي على ٠,00 / توين Yo Tween . يتم تحميل المادة التي تم فرزها من عمود سيفاروز الفنيل PhenylSepharoseo بتدفق سريع الى أعمدة الهيبارين هاى تراب HiTrap Heparin المصطفة خلف بعضها ؛ ثم يتم بعد ذلك غسل الاعمدة بمحلول منظم للتعادل حتى يتم ثبات الامتصاص عند 780 نانومتر nm . يتبع Alec الغسل تدرج خطي ٠0١( ملي) بحجم عمود 7١ من صفر الى 14١ كلوريد صوديوم NaCl في MES0.02M ١ + رقم هيدروجيني pH 5,7 ويحتوي على 0.06 7 توين ٠١ Tween . تتم متابعة البروتين الكلي بالامتصاص عند 780 نانومتر nm ويتم تحليل الاجزاء المنسابه والاجزاء المشطوفة للكشف عن محتوى GA - EPO بواسطة معايرة ELISA (الاجهزة (1 مع (R (شكل 1( وبواسطة SDS - PAGE وبقعة وسترن Western Blot . ay.
- gq - يتم في تجربة واحدة لتحميل GA - EPO على أعمدة هيبارين هاى تراب HiTrap Heparin ¢ إستخلاص VA 7# في التجمع الناتج من الفصل بالتصفي ؛ وينتج عن إستعمال هذا العمود نزع 7 72 من البروتين الملوث (جدول )١ . مثال : تنقية الإيثروبويتين erythropoietin بنسخ جين الإيثروبويتين erythropoietin gene © البشري في LDA الكربوهيدرات CHO Cells عن طريق استخدام عملية الفصل الكروماتوجرافي للهببارين heparin كخطوة فصل كروماتوجرافي اولى في عملية تنقية . 1. مادة بدء التفاعل تتم اضافة الإريثروبويتين jig erythropoietin تجارياً والذي يتم انتاجه بنسخ جين الإريثروبويتين ddl erythropoietin gene في خلايا الكربوهيدرات ؛ الى وسط زراعة ٠ مرشح ترشيحاً Lt وغير مكيف ويتم تعريضه الى عملية التنقية بواسطة الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin كما يلي : يتم تبادل المحلول المنظم لوسط غير مكيف ٠١( مل) يحتوي على مصل عجل بتركيز LY وذلك مقابل Ye مليمول ثلاثي - كلور Tris-Cl ؛ رقم هيدروجيني Vor pH ويحتوي على ٠,١ توين Yo Tween باستخدام وحدة (Amicon) CentriPrep 30 unit حتى تصل درجة Jima sill ١ _ الى 7,7 ملي أوم mmho متبادل . يتم تخفيف المنتج النهائي (حوالي ٠١ مل) حتى VA مل بالماء لتحقيق درجة توصيل ٠,6 ملي أوم متبادل . يتم احلال قنينة واحدة )+ © وحدة) من إريثروبويتين erythropoietin مشتق من خلية كربوهيدرات CHO cell (الاجهزة D مع درجة زراعة النسيج) ؛ في ٠٠١ ميكرولتر من الماء واضافته الى ٠9 مل من المحلول المنظم الذي تم تبادله والوسط المخفف ؛ ثم يتم ترشيحه خلال مرشح ١,7 Acrodise ميكرومتر (Gelman) ٠ .
AY.
ا - 2. الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin يتم تعادل عمود من الهاى تراب هيبارين ١ heparin HiTrap مل من (شركة pharmacia ( Cad درجة حرارة الغرفة في ٠١ مليمول ثلاثي - كلور Tris-Cl ؛ رقم هيدروجيني 7,١٠ pH ويحتوي على )+ توين ١( ٠١ Tween مل/دقيقة) ؛ ويكون معدل الانسياب ١ مل/دقيقة ويتم 0 تجميع ١ مل أجزاء مراقبة الامتصاص عند 780 نانومتر 000 . يتم وضع العينة المرشحة (لا,؛ مل) الى العمود ثم غسل حجم عمود ٠١ بواسطة المحلول المنظم للتعادل . يتم فصل الإريثروبويتين erythropoietin بالتصفي بواسطة تدرج خطي anal عمود ١5 الى Yo مليمول ثلاثي - كلور Tris-Cl ؛ رقم هيدروجيني ١ pH ويحتوي على ١,4 14 كلوريد صوديوم ٠١ Tween (ps / +١ NaCl . > يتم تركيز الكمية المتجمعة من الإريثروبويتين ٠.١ (erythropoietin مل باستخدام Centricon 10 وحدات (Amicon) ؛ ويتم تعيين تركيز الإريثروبويتين erythropoietin بواسطة معايرة ELISA (الاجهزة 10 مع (R . ويتم تعيين التركيز الاجمالي للإريثروبويتين erythropoietin بواسطة معايرة Pierce) BCA) .يتم اساساً في تجربة واحدة استخلاص جميع الإريثروبويتين erythropoietin الموضوع في عمود الهاى تراب هيبارين (heparin HiTrap ١ في التجمع الذي يحدث نتيجة عملية الفصل بالتصفي . يؤدي استخدام هذا العمود في النزع ف / من البروتين الملوث erythropoietin pool (جدول )١ . مثال م : مزيد من التنقية لل GA - EPO بعد عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin تعتبر الاجراءات الاتية أمثلة لبعض خطوات التنقية المحتملة والتي يمكن استغلالها بعد عملية الفصل ٠ الكروماتوجرافي للهيبارين «heparin ولا تحدد الامثلة الاتية عدد الخطوات التي تم تطبيقها فقط ar,
ام -
ولكن توضح هذه الامثلة ايضاً الاستعمالات المتعددة لعملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين
. بأعتبارها خطوة مفيدة ومناسبة لعديد من الاجراءات الخاصة بالثنقية heparin
1. الفصل الكروماتوجرافي بتبادل الانيون Anion Exchange
يتم تعادل عمود من كيو - سيفاروز Q Sepharose بتدفق سريع YO مل من (شركة (Pharmacia
0 بواسطة محلول منظم لتعادل كيو - سيفاروز ٠١( © Sepharose مليمول ثلاثي - كلور Tris-Cl
.)٠١ Tween توين 7 ٠,١ وتحتوي على V0 pH رقم هيدروجيني »
يتم فرز تجمع GA - EPO الذي تم الحصول عليها بعد عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين
heparin ¢ ويتم الفرز مقابل محلول منظم لتعادل كيو - سيفاروز Sepharose © ؛ ثم يتم تحميله
على عمود كيو - سيفاروز Sepharose © . يتم غسل العمود بالمحلول المنظم لتعادل كيو - ٠ سيفاروز Sepharose © حتى يتم ثبات درجة الامتصاص عند 780 نانومتر nm . يتم فصل
البروتين المربوط بواسطة Yo مليمول ثلاثي - كلور Tris-Cl ؛ رقم هيدروجيني V,0 pH ¢
ويحتوي على Met كلوريد صوديوم 116و ١ / توين ٠١ Tween .
يتم تحليل البروتين القمي لكلوريد الصوديوم NaCl 140,4 والذي تم فصله بالتصفي ؛ للكشف
عن GA -EPO _بواسطة ELISA (أجهزة 0 مع (R ؛ وللكشف عن البروتين الكلي بواسطة vo الامتصاص عند 780 نانومتر ©« ؛ وبنفس الطريقة يتم تحليل الاجزاء المنسابة والاجزاء
المغسولة.
2 . الفصل الكروماتوجرافي بتبادل الكاتيون exchange cation
يتم تعادل عمود احادي اس YO MonoSs column مل (شركة pharmacia ) مع محلول منظم
لتعادل احادي إس Y+) MonoSs column مليمول ثلاثي - اسيتات Tris-Acetate ؛ رقم
ay.
- gq -
هيدروجيني pH 0,£ ويحتوي على ١:١ 7 توين )٠١ Tween . يتم فرز GA - EPO الذي تم
الحصول عليه بعد الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin مقابل محلول منظم لتعادل
احادي إس MonoSs ؛ ثم يتم تحميله على عمود احادي إس MonoSs column ؛ يتم غسل
العمود بمحلول منظم لتعادل (gala) إس MonoSs column حتى يتم ثبات الامتصاص عند 1860 © نانومتر nm ؛ يتم فصل 68-100 .في مستوى متدرج من رقم هيدروجيني pH من محلول
منظم لتعادل احادي إس MonoSs عند رقم هيدرويجين pH 0,£ الى Yo مليمول ثلاثي -
أسيتات Tris-Acetate ¢ رقم هيدروجيني Ay pH ويحتوي على )+ توين ٠١ Tween .
يتم تحليل اجزاء البروتين القمي التي تم فصلها بالتصفي ؛ للكشف عن GA - EPO بواسطة
معايرة ELISA (أجهزة 0 ae ) وللكشف عن البروتين الكلي بواسطة الامتصاص عند 1860 ٠ نانومتر nm وبنفس الطريقة يتم تحليل الاجزاء المنسابة والاجزاء المغسولة .
3. الفصل الكروماتوجرافي بالتفاعل التداخلي الكاره للماء
يتم عمل GA - EPO الذي تم الحصول عليه بعد الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin
ME في كلوريد صوديوم NaCl ويتم تحويله الى رقم هيدروجيني pH *,5 بواسطة اضافة
حمض هيدروكلوريك 1171101 على شكل قطرات . يتم تحميل المادة على عمود سيفاروز فنيل PhenylSepharoseo 61 ٠ بتدفق سريع تعويض منخفض ٠ ٠ مل (شركة (pharmacia وتعادلها
في ٠١ مليمول MES ؛ رقم هيدروجيني pH 0,0 ويحتوي على ME كلوريد صوديوم NaCl
« وبعد الغسل بخمسة أحجام عمود من المحلول المنظم للتعادل لنزع المادة الغير مرتبطة ؛ يتم
فصل GA - EPO مع محلول منظم من ٠١ مليمول ثلادني - أسيتات Tris-Acetate ؛ رقم
هيدروجيني Av pH ويحتوي على ME يوريا urea و Ye 7# بروبيلين جليكول .propylene glycol ٠
ay.
.يج - يتم تحليل أجزاء البروتين القمي التي تم فصلها بالتصفي ؛ للكشف عن GA - EPO بواسطة ELISA (أجهزة 0 مع (R وللكشف عن البروتين الكلي بواسطة الامتصاص عند YAS نانومتر nm ؛ وبنفس الطريقة يتم تحليل الاجزاء المنسابه والاجزاء المغسولة . 4. عملية الاستشراد لهلام تحضيري © يتم تركيز GA - EPO الذي تم الحصول عليه بعد الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin ؛ الى " مل ؛ وعمل 140.1 في ثنائي ثيوتريتول ١ dithiothreitol 7 في DSD ؛ ثم التسخين حتى ٠٠١ درجة مئوية لمدة دقيقة . يتم تحميل العينة على عمود استشراد هلام تحضيري (BioRad) يتم تحضيره كما تم وصفه في الكتيب الفني ل BioRad باستخدام هلام تحليل من الاكريل أميد acrylamide بتركيز ١١ 2 . يتم تحليل اجزاء البروتين القمي التي تم فصلها ٠ بالتصفي ؛ للكشف عن GA - EPO بواسطة بقعة وسترن Western Blot ؛ وللكشف عن البروتين الكلي بالامتصاص عند 7860 نانومتر am 5. الفصل الكروماتوجرافي بالتآلف باستخدام احادي التناسل Immobilized Monoclonal غير متحرك مضاد لمستضدات 5ه الإريثروبويتين erythropoietin البشري Ve يتم فرز EPO - 0/8_بعد الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin ؛ مقابل محلول منظم للتعادل Yo) مليمول ؛ ثلاثي - كلور Tris-Cl ؛ رقم هيدروجيني Ae pH ويحتوي على OY / توين Yo Tween . يتم وضع العينة الى عمود تآلف 8 مل MY) راتنج إمفاس Emphase resin ؛ Pierce ؛ وغسلها في محلول منظم للتعادل) والذي يحتوي على ©» مجم من عامل مضاد لمستضدات الإريتروبويتين erythropoietin البشري (Genzyme) والذي يتم ٠ إيقاف حركته عن طريق تحديدات الصانع ؛ وبعد الغسل بالمحلول المنظم للتعادل ؛ يتم فصل ay.
- ه١
GA - EPO مع حمض أستيك ١7 acetic acid 14 ؛ رقم هيدروجيني Y,0 pH ويحتوي على
5 كلوريد صوديوم NaCl . يتم تجميع المادة المفصولة في أجزاء Yeu لتر صغير في
أنابيب تحتوي على ٠٠00 لتر صغير من 141 ثلاثي ؛ رقم هيدروجيني pH 8.0 و ؟ لتر
صغير من توين Ye Tween يتم تحليل البروتين القمي التي تم فصلها بالتصفي للكشف عن GA - EPO © بواسطة ELISA (الاجهزة 0 مع ) وللكشف عن البروتين الكلي بالامتصاص عند
. nm نانومتر YA
مثال 14 استخدام راتنجات resins الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin من صانعين
(Sa ان يتم اجراء عملية الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin _لتنقية الإريثروبويتين erythropoietin ٠ ؛ وذلك باستخدام راتنجات هيبارين (Heparin resins عديد من الصانعين ؛
ويتم اختيار خمسة راتنجات resins مختلفة ؛ لتقييم سعة ترابط وتحميل GA - EPO المشتق من
وسط زراعة فائق الترشيح ultrafiltered /ثنائي الترشيح diafiltered يحتوي على مصل جنين
I نوع Heparin Agarose6XLs XL% heparin أجاروز هيبارين )١ و١( 7 ١ بقرة بتركيز
ونوع !]11 من الكيميائية الامريكية الدولية (10ه) و( و ؛) سيفاروز هيبارين HeparinSepharoses Cl-6B yo وسيفاروز هيبارين 6 Heparin Sepharose 6 بتدفق سريع مسن
.TosoHaas من AF-Heparin650Ms (©) s pharmacia شركة
وتكون مادة بدء التفاعل وظروف الفصل الكروماتوجرافي المستخدمة ؛ كما تم وصفه في مثال
¥ باستخدام أعمدة من ١ مل الى V مل ؛ ويكون استخلاص GA - EPO لجميع الراتتجات resins
التي تم اختبارها 7٠ 7 على الاقل ؛ ولم يلاحظ وجود إختلاف ذو مغزى في سعة التحميل بين ٠ - الراتنجات resins المختلفة .
ar,
- oY - طرق التحليل
ELISA معايرة يمكن ان يتم قياس كمية الإريثروبويتين erythropoietin باستخدام طريقة معايرة المادة الممتزة المرتبطة بالانزيم (ELISA) ¢ وتوجد مجموعة أدوات ELISA لقياس كمية الإريثروبويتين spall erythropoietin © وتكون متوفرة تجارياً تحت اسم (Quantikine IVD) من شركة الاجهزة 0 مع R ؛ ويوجد مجموعة أدوات ELISA اخرى لقياس كمية الإريثروبويتين . (Predicta Kit وتسمى (مجموعة Genzyme وهذه المجموعة من جنزيم erythropoietin يتم بصفة اساسية إجراء معايرات Ty ELISA لمواصفات الشركة المصنعة ؛ وفي طريقة بديلة ؛ يمكن ان يتم تنمية الاجسام المضادة المناسبة للإريثروبويتين erythropoietin المعروف في ٠ أنظمة ELISA مشابهة لمعايرة كميات الإربثروبويتين erythropoietin الموجود . Protein Assay معايرة البروتين يعتبر قياس عينات البروتين معروف جداً في المجال ؛ وتشتمل مثل هذه الاجراءات على معايرات البروتين ل Lowry و Bradford و BCA توجد مجموعات الادوات اللازمة لتعيين كمية البروتين في عينة ٠ متوفرة تجارياً وذلك مثل طريقة معامل BCA لمعايرة البروتين ؛ التي ١ _يتم إنتاجها بواسطة شركة Pierce Chemical يمكن Lind قياس كمية البروتين بواسطة طريقة الفوتومتر الطيفي spectrophotometry (قياس الشدة النسبية لاجزاء الطيف) عند YA نأنومتر . وذلك كما هو معروف لذوي الخبرة في المجال nm Specific Activity النشاط النوعي يتم حساب النشاط النوعي لعينات بالصيغة الاتية : ar.
اسن - النشاط النوعي = اجمالي وحدات GA - EPO بواسطة معايرة 2115/8/إجمالي المليجرامات للبروتين بواسطة معايرة (BCA ويكون النشاط النوعي للمستحضر النقي من GA - EPO حوالي ٠٠٠٠٠١ من وحدات 21158/مجم بروتين بواسطة معايرة BCA ويكون النشاط النوعي باستخدام معايرة ELISA لقياس عدد وحدات GA - EPO ؛ مرتبط بطريقة غير مباشرة © بالنشاط الاحيائي الحقيقي GA - EPO . يوجد إختبار يتم بصفه عامة إجراؤه لتعيين النشاط النوعي داخل الجسم ؛ وهذا الاختبار هو اختبار تأثير العقار على فأر مصاب بتعدد كرات الدم الحمراء نتيجة نقص الاكسجين كما هو معروف لذوي الخبرة في المجال (يمكن ان تحدد Jie هذه المعايرة النشاط النوعي بالوحدة الدولية/مجم كما هو معروف لأي من ذوي الخبرة في هذا المجال) .
Western Blot وبقعة وسترن SDS-PAGE ٠ وتحليلها على مواد هلامية من الاكريلاميد المتعدد SDS PAGE يتم تحضير عينات ل كما هو معروف في المجال ؛ وعلى سبيل المثال 7 ١١ أو 7 ٠١ بتركيز polyacrylamide gels وتكون طرق استخدامها كما تم وصفه في (BioRad Jie) تكون المواد الهلامية متوفرة تجارياً
Laemmli خلية مزدوجة الجدار (وفقاً لطريقة لاملاى 1 )BioRad MiniProtein تعليمات ٠ دورية الطبيعة Nature مجلد YYV عدد 1860 ( (VAY بالمملكة المتحدة) ¢ يمكن استخدام Coomassie R-250 بتركيز حوالي ١,١ 7 وذلك لاجمالي تلوث البروتين . يمكن اجراء عملية نقل البروتينات الى غشاء (Millipore)immobilonTM-P PVDF بواسطة خلية نقل استشرادية 0 بقعة التحول الصغيرة وفقاً لتعليمات الكتيب باستخدام VY,0 مليمول ثلاشي - كلور Tris-Cl ؛ رقم هيدروجيني AY pH ؛ ويحتوي على 976 مليمول جليسين ٠١ «glycine 7 © ميثانول SDS 7 ٠١و methanol . ثم يجري تقل البروتينات لمدة ساعة واحدة عند ٠٠١ حجم في جهاز بيوراد بقعة التحول الصغيرة . يمكن حصر الغشاء لمدة ساعة واحدة تحت درجة qv.
من - حرارة الغرفة مع الدوران أو طوال الليل تحت درجة حرارة ؛ درجة مئوية بواسطة استخدام حليب غير دهني (كارنيشن (carnation بتركيز © 7 (وزن/وزن) في تي بي إس - توين ٠١( TBS Tween مليمول ثلاثي - كلور Tris-Cl ؛ رقم هيدروجيني pH 4لا 10.169 كلوريد صوديوم NaCl ؛ © ++ توين )٠١ Tween . ه يمكن بعد ذلك Jue الغشاء برفق في TBS-Tween ووضعه في حضانة مع الدوران لمدة ١ ساعة تحت درجة حرارة الغرفة في إريثروبويتين erythropoietin أرنب مضاد للإريثروبويتين erythropoietin البشري (الاجهزة 0 مع (R مخفف بدرجة ٠٠٠١/١ بواسطة حليت غير دهني بتركيز Yoo 7 (وزن/وزن) في TBS-Tween (التركيز النهائي ١ ميكروجرام/مل) . . يتم غسل الغشاء بشدة وتنميته بواسطة طريقة Jie طريقة انلضيائية الكيمياوية chemiluminescence ٠ باستخدام مجموعة أدوات (Amersham ECLTM) وتعريضها على elie رقيق . يكون الحد الادنى لإكتشاف GA - EPO بهذا الاسلوب حوالي Yo = ٠١ نانومتر nm جرام SDS - PAGE) يليها بقعة وسترن 8106 (Western . ولاعادة فحص البقعة بجسم مضاد مختلف ؛ يمكن ان يتم تعرية الغشاء بواسطة 0 مليمول ثلاثي - كلور Tris-Cl ؛ رقم هيدروجيني V,0 pH ويحتوي على SDS 7 7,٠ لمدة ساعتين 5 .تحت درجة حرارة الغرفة مع الدوران . يتم اعادة إنسداد البقعة بواسطة محلول منظم حاصر . يتم بعد ذلك اضافة الجسم المضاد الابتدائي الجديد كما سبق وصفه ؛ على سبيل المثال يمكن اكتشاف transferrin باستخدام جسم مضاد من transferrin المستختلصة من transferrin-HRP مزدوج المضاد لل transferrin البشري (التصميم الحيوي) ؛ ولإكتشاف الزلال البقري يمكن استخدام مضاد المركب المزدوج HPR _بزلال بقري (مختبرات (Bethyl Labs يتم غسل البقع ٠ وتنميتها كما تم وصفه فيما سبق . iY.
Claims (1)
- عناصر_الحماية ١ ١ - عملية لتنقية مركبات إريثروبوليتين erythropoietins والتي تشتمل على Y خطوات: 1 أ ( ملامسة مائع بيولوجي biological fluid يحتوي على مركبات الإريثروبوليتين ¢ 5 مع مدعم هيبارين كروماتوجرافي heparin chromatographic ° بحيث ترتبط مركبات الإريثروبوليتين erythropoietins المذكورة بمدعم هيبارين 1 كروماتوجرافي heparin chromatographic المذكور؛ و 7 ب ) التصفية التتابعية SUS yal eluting الإريثروبوليتين erythropoietins المذكورة A بمحلول تصفية تتابعية منظم ؛و 9 ج ( تجميع مركبات الإريثروبوليتين erythropoietins المذكورة. ١ " - عملية وفقاً لعنصر الحماية ١ ؛ حيث تضمينها في أية نقطة في عملية متعددة Y الخطوات في تنقية مركبات الإريثروبوليتين erythropoieting . ١ ¥ - عملية وفقاً لعنصر الحماية ¥ ؛ والتي تكون هي Jf خطوة تحليل ¥ كروماتوجرافي في تنقية مركبات الإريثروبولبتين erythropoietins . ١ ؛ - عملية وفقاً لأي من عناصر الحماية من ١ إلى لإزالة البروتينات الملوثة Y لمركبات الإريثروبوليتين erythropoietins .ay.هن -١ © -عملية وفقاً لأي من عناصر الحماية من 7 إلى ؛ حيث بها تحتوي العملية Y متعددة الخطوات المذكورة على واحدة أو أكثر من خطوات التحليل الكروماتوجرافي chromatographic Y المختارة من مجموعة التبادل الايوني 108 ؛ أو التفاعل البيني غير الألف للماء hydrophobic الاستبعاد الحجمي sized exclusion ¢ أو الطور ° العكسي reverse phase « أو التحليسل الكروماتوجرافي للألفة affinity chromatography 1 .ّ > = عملية وفقاً لأي من عناصر الحماية من )١( إلى )0( حيث بها يتم ترشيح, أو Y عدم ترشيح؛ أو الطرد المركزي؛ أو الديلزة 40 للمائع البيولوجي biological 01 0 المذكور قبل ملامسة المائع البيولوجي biological fluid المذكور مع مدعم ¢ ألفة الهيبارين heparin المذكور.١ — عملية وفقاً لأي من عناصر الحماية من )١( إلى )0( والتي تشتمل كذلك على Y أن هذا المائع البيولوجي biological fluid يتم ترويقه clarified قبل ملامسته لمدعم v ألفة الهيبارين heparin المذكور.A ١ - عملية وفقاً لأي من عناصر الحماية من )١( إلى (7) والتي تشتمل كذلك على Y أن ارتباط جزيئات الإريثروبوليتين erythropoietins المذكورة يحدث في محلول ¥ منظم للاتزان aquilibration buffer .av— 0 7 _ ١ 4 - عملية iy لأي من عناصر الحماية من )١( إلى (A) وبها يحدث ارتباط Y جزيئات الإريثروبوليتين erythropoietins المذكورة عند حوالي pH يتراوح من 1 4 إلى 8. ٠ ١ - عملية وفقاً لأي من عناصر الحماية من )١( إلى )3( والتي تشتمل كذلك Y على التصفية التتابعية eluting لمركبات الإريثروبوليتين erythropoietins المذكورة ¥ بتغيير المحلول المنظم للتصفية التتابعية elution buffer . ١١ ١ - عملية وفقاً لأي من عناصر الحماية من (A) إلى )14( حيث بها يحتوي Y المحلول المنظم المذكور بشكل إضافي على مضاد للامتزاز .antiadsorbent ١" ١ - عملية وفقاً لعنصر الحماية )٠١( والتي تشتمل كذلك على أن التصفية Y التتابعية eluting لمركبات الإريثروبوليتين erythropoieting المذكورة تحدث بزيادة ¥ تركيز الملح للهاليد القلوي .alkali halide VY ١ - عملية وفقاً لأي من عناصر الحماية من )١( إلى (VY) حيث بها يكون المائع Y البيولوجي biological fluid المذكور هو مائع استزراع culture fluid . ١ 4 - عملية وفقاً لعنصر الحماية (VY) حيث بها يتم ترويق مائع الاستزراع culture 40 Y المذكور.ay._ 0 A —_٠ ١ - عملية وفقاً لأي من عناصر الحماية من )١( إلى )18( حيث بها يكون المائع Y البيول وجي biological fluid أو المائع المتجمع المحتوي على مركبات ¥ الإريثروبوليتين erythropoietins متبادل مع المحلول المنظم buffer exchange .١ 1 - عملية وفقاً لعنصر الحماية )10( حيث بها يتم إجراء تبادل المحلول المنظم buffer exchanger Y المذكور فيما بين 11م تتراوح من ١ إلى 8.VV ١ - عملية وفقاً لعنصر الحماية )10( حيث بها يتم إجراء تبادل المحلول المنظم buffer exchanger Y المذكور على محلول منظم لملح من صفر إلى Yoo ملي مولار. ٠ ١ - عملية وفقاً لأي من عناصر الحماية من )١( إلى (VV) حيث بهايتم Y الحصول على مدعم ألفة الهيبارين heparin heparin المذكور من مصدر متوافر ¥ تجارياً.Ys
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US55523995A | 1995-11-08 | 1995-11-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SA97170803B1 true SA97170803B1 (ar) | 2006-06-20 |
Family
ID=24216519
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SA97170803A SA97170803B1 (ar) | 1995-11-08 | 1997-04-09 | إنتاج الإريثروبويتينات erythopoietins بطريقة الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0862581B1 (ar) |
| JP (1) | JP3407261B2 (ar) |
| KR (1) | KR19990067374A (ar) |
| CN (1) | CN1200948C (ar) |
| AR (1) | AR004543A1 (ar) |
| AT (1) | ATE242266T1 (ar) |
| AU (1) | AU704509B2 (ar) |
| CA (1) | CA2236206C (ar) |
| DE (2) | DE862581T1 (ar) |
| DK (1) | DK0862581T3 (ar) |
| ES (1) | ES2122951T3 (ar) |
| HK (1) | HK1016615A1 (ar) |
| HU (1) | HU225972B1 (ar) |
| IL (2) | IL124317A0 (ar) |
| MA (1) | MA24128A1 (ar) |
| MX (1) | MX9803697A (ar) |
| NO (1) | NO324401B1 (ar) |
| NZ (1) | NZ321272A (ar) |
| PT (1) | PT862581E (ar) |
| SA (1) | SA97170803B1 (ar) |
| SI (1) | SI0862581T1 (ar) |
| SK (1) | SK284315B6 (ar) |
| TW (1) | TW450976B (ar) |
| WO (1) | WO1997017366A1 (ar) |
| ZA (1) | ZA969254B (ar) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100900033B1 (ko) * | 2007-11-21 | 2009-06-01 | 한국생명공학연구원 | 인간 에리스로포이에틴의 정제방법 |
| CN117420224B (zh) * | 2023-09-08 | 2024-05-07 | 华北制药金坦生物技术股份有限公司 | 一种反相高效液相色谱法检测人促红素注射液中人血白蛋白含量的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL239896A (ar) * | 1958-06-12 |
-
1996
- 1996-10-17 CA CA002236206A patent/CA2236206C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-10-17 CN CNB961981938A patent/CN1200948C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-10-17 DE DE0862581T patent/DE862581T1/de active Pending
- 1996-10-17 IL IL12431797A patent/IL124317A0/xx unknown
- 1996-10-17 DK DK96936680T patent/DK0862581T3/da active
- 1996-10-17 WO PCT/US1996/016711 patent/WO1997017366A1/en active IP Right Grant
- 1996-10-17 AT AT96936680T patent/ATE242266T1/de active
- 1996-10-17 KR KR1019980703384A patent/KR19990067374A/ko active Search and Examination
- 1996-10-17 ES ES96936680T patent/ES2122951T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-17 JP JP51818997A patent/JP3407261B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-17 SI SI9630622T patent/SI0862581T1/xx unknown
- 1996-10-17 EP EP96936680A patent/EP0862581B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-17 HU HU9901876A patent/HU225972B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-10-17 DE DE69628581T patent/DE69628581T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-17 IL IL12431796A patent/IL124317A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-10-17 PT PT96936680T patent/PT862581E/pt unknown
- 1996-10-17 AU AU74543/96A patent/AU704509B2/en not_active Ceased
- 1996-10-17 NZ NZ321272A patent/NZ321272A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-11-04 ZA ZA969254A patent/ZA969254B/xx unknown
- 1996-11-05 TW TW085113499A patent/TW450976B/zh not_active IP Right Cessation
- 1996-11-05 MA MA24387A patent/MA24128A1/fr unknown
- 1996-11-06 AR ARP960105067A patent/AR004543A1/es active IP Right Grant
- 1996-11-07 SK SK1447-96A patent/SK284315B6/sk not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-04-09 SA SA97170803A patent/SA97170803B1/ar unknown
-
1998
- 1998-05-07 NO NO19982085A patent/NO324401B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-05-08 MX MX9803697A patent/MX9803697A/es unknown
-
1999
- 1999-04-21 HK HK99101717A patent/HK1016615A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nicolson et al. | ANIONIC SITES OF HUMAN ERYTHROCYTE MEMBRANES: II. Antispectrin-Induced Transmembrane Aggregation of the Binding Sites for Positively Charged Colloidal Particles | |
| Wakefield et al. | Latent transforming growth factor-beta from human platelets. A high molecular weight complex containing precursor sequences. | |
| US11667671B2 (en) | Separation method | |
| CN102164954B (zh) | 促红细胞生成素的纯化 | |
| US20080319163A1 (en) | Method for Isolating and Purifying Immuno-Modulating Polypeptide from Cow Placenta | |
| JPH026750A (ja) | 生物試料分離用のカラム充填材若しくはクロマトグラフィー部材として用いるアガロースコーティングガラス繊維 | |
| CA2313349A1 (en) | Novel tgf-beta protein purification methods | |
| Vijayalakshmi | Biochromatography: theory and practice | |
| SA97170803B1 (ar) | إنتاج الإريثروبويتينات erythopoietins بطريقة الفصل الكروماتوجرافي للهيبارين heparin | |
| CN101120017A (zh) | 用于纯化抗体的亲和力加离子交换层析 | |
| Kittur et al. | Two-step purification procedure for recombinant human asialoerythropoietin expressed in transgenic plants | |
| KR101847169B1 (ko) | 지속형 에리트로포이에틴 함유 조성물 | |
| Ingham et al. | Methods of removing polyethylene glycol from plasma fractions | |
| Schmidt | The purification of large amounts of monoclonal antibodies | |
| DE10360844A1 (de) | Verfahren zum Nachweis und zur Entfernung von Endotoxin | |
| Kagimoto et al. | Differential glycosylation of Bence Jones protein and kidney impairment in patients with plasma cell dyscrasia | |
| Lopes et al. | Lipopolysaccharides: Methods of Quantification and Removal from Biotechnological Products | |
| Turner et al. | Suboptimal C3b/C3bi deposition and defective yeast opsonization. II. Partial purification and preliminary characterization of an opsonic co-factor able to correct sera with the defect. | |
| Lee et al. | Purification and characterization of recombinant human erythropoietin from milk of transgenic pigs | |
| Fuhrer | Rapid analysis of membrane glycopeptides by gel permeation high-performance liquid chromatography | |
| Lopes et al. | 14 LipopolysaccharidesMethodsof | |
| KR0162517B1 (ko) | 재조합 인간 에리스로포이에틴의 정제방법 | |
| Kabir et al. | A novel urinary sialoglycoprotein as the inhibitor of interleukin-1. | |
| Lambert et al. | The basic proteins of bovine allantoic fluid | |
| Randell | STUDIES ON THE SOLUBLE PROTEIN FRACTION OF THE MILK-FAT-GLOBULE MEMBRANE. |