CN102164954B - 促红细胞生成素的纯化 - Google Patents

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Abstract

在本发明中，记述了用于纯化促红细胞生成素的方法，其包括至少一个应用含有羟磷灰石的固定相的层析步骤。该方法包括下列步骤：i)即在促红细胞生成素与含有羟磷灰石的固定相结合的条件下，将含有钙离子的溶液中的促红细胞生成素与用含有钙离子的溶液平衡的含有羟磷灰石的固定相接触，ii)将含有比前述溶液较少钙离子的溶液通过来自i)的含有羟磷灰石的固定相，促红细胞生成素未从含有羟磷灰石的固定相中分离，和iii)将含有低于0.5mM钙离子的另一溶液通过来自ii)的含有羟磷灰石的固定相，由此将促红细胞生成素从含有羟磷灰石的固定相中分离。

Description

促红细胞生成素的纯化
本文记述了使用羟磷灰石层析(hydroxyapatite chromatography)纯化促红细胞生成素(EPO)的方法。另外描述了用于去除宿主细胞蛋白质的方法和用于改变EPO组合物的同工型分布的方法。
发明背景
促红细胞生成素(EPO)是一种刺激红细胞产生的人糖蛋白。其作用和治疗应用例如在EP 0 148 605、EP 0 205 564、EP 0 209 539和EP 0 411 678，以及在Huang，S.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)2708-2712，Lai，P.H.等人，J.Biol.Chem.261(1986)3116-3121和Sasaki，H.等人，J.Biol.Chem.262(1987)12059-12076中详细描述。
EPO仅以非常低的浓度存在于健康人血浆中。从患有再生障碍性贫血患者的尿中分离人EPO是已知的(Miyake，T.等人，J.Biol.Chem.252(1977)5558-5564)。描述了一种七步法，其包括离子交换层析、乙醇沉淀、凝胶过滤和吸附层析。EP 0 148 605和EP 0 205564记述了在CHO细胞中生产重组人EPO。Nobuo，I.等人，J.Biochem.107(1990)352-359描述了用于纯化重组生产的EPO的方法。
用于生产和纯化促红细胞生成素的另外方法是已知的，尤其在下列文献中描述：EP 0 148 605、EP 0 205 564、EP 0 255 231、EP 0 830 376、EP0 267 678、EP 0 228 452、EP 1 127 063、EP 0 209 539、EP 0 358 463、EP1 010 758、EP 0 820 468、EP 0 984 062、EP 0 640 619、EP 0 428 267、EP1 037 921和Lai，P.H.等人，J.Biol.Chem.261(1986)3116-3121；Broudy，V.C.等人，Arch.Biochem.Biophys.265(1988)329-336；Zou，Z.等人，Journal of Chrom.16(1998)263-264；Inoue，N.等人，Biol.Pharm.Bull.17(1994)180-184；Qian，R.L.等人，Blood 68(1)(1986)258-262、Krystal，G.等人，Blood 67(1)(1986)71-79；Lange，R.D.等人，Blood Cells10(2-3)(1984)305-314；Sasaki，R.等人，MethodsEnzymol.147(1987)328-340；Ben Ghanem，A.等人，Prep.Biochem.24(1994)127-142；Cifuentes，A.等人，J.Chrom.A 830(1999)453-463；和Gokana，A.等人，J.Chromat.A 791(1997)109-118。
EP 1 394 179记述了用于生产不含动物蛋白的促红细胞生成素的方法。EP 0 986644的主题是通过用病毒启动子进行内源基因活化而生产促红细胞生成素。EP 1 428 878中记述了用于生产重组糖蛋白、特别是促红细胞生成素的方法。EP 1 492 878中记述了用于生产所需特性的促红细胞生成素糖原同工型的方法。
发明概述
重组促红细胞生成素的生成和纯化需要若干步骤，特别是层析步骤。
本发明的第一方面是生产促红细胞生成素的方法，包括至少一个应用含有羟磷灰石的固定相的层析步骤，且包括下列步骤：
i)将含有0.5mM至20mM钙离子浓度的含促红细胞生成素溶液与含有羟磷灰石的固定相接触，所述固定相已用含有0.5mM至20mM相同钙离子浓度的溶液平衡，
ii)将含有低于0.5mM钙离子浓度的溶液通过含有羟磷灰石的固定相，和
iii)将含有低于0.5mM钙离子浓度的溶液通过含有羟磷灰石的固定相，由此生产促红细胞生成素。
在一个实施方案中，与i)中含促红细胞生成素的溶液相比，所生产的促红细胞生成素不含脱氧-EPO类和脱氮-EPO类。在进一步的实施方案中，除了应用含有羟磷灰石的固定相的层析步骤之外，该方法还包括至少一个另外的层析步骤。在进一步的实施方案中，所有层析步骤均以不同的层析原理为基础，其中各层析原理在该方法中仅使用一次。在进一步的实施方案中，该一个或多个层析原理选自亲和层析、疏水相互作用层析、反相层析、凝胶渗透层析、阳离子交换层析和/或阴离子交换层析。在进一步的实施方案中，层析步骤的顺序为亲和层析、疏水相互作用层析、在含有羟磷灰石的固定相上的层析、任选的反相层析和阴离子交换层析。在一个实施方案中，除层析步骤之外，根据本发明的方法还包括任选的中间步骤，例如盐沉淀、浓缩、渗滤、超滤、透析和/或乙醇沉淀。
本发明的一方面是已用根据本发明的方法获得的促红细胞生成素组合物。
本发明的又一方面是用于从促红细胞生成素制品中去除中国仓鼠卵巢(CHO)细胞蛋白质的方法，包括根据本发明的应用含有羟磷灰石的固定相的层析步骤，其中含有促红细胞生成素的馏分的收集受280nm处的光吸收控制，以15mAU至75mAU的吸收开始，并在峰最大值通过200mAU至40mAU的吸收后终止。
在一个实施方案中，含有羟磷灰石的固定相是纯的结晶羟磷灰石。在另一个实施方案中，步骤ii)和/或iii)中用于层析的溶液含有约5mM磷酸盐离子浓度，在另一个实施方案中，为5mM磷酸钠或磷酸钾。
本发明的另一方面是用于制备促红细胞生成素组合物的方法，所述组合物是促红细胞生成素同工型的混合物，所述促红细胞生成素同工型中每个促红细胞生成素分子的唾液酸残基数大于6且小于17，并且四触角糖基形式∶三触角糖基形式∶双触角糖基形式的比率范围为83∶14∶2至74∶21∶6。在一个实施方案中，该比率在该范围内是线性的。
因此，本发明的另一方面是促红细胞生成素组合物，其是促红细胞生成素同工型的混合物，所述促红细胞生成素同工型中每个促红细胞生成素分子的唾液酸残基数大于6且小于17，并且四触角糖基形式∶三触角糖基形式∶双触角糖基形式的比率范围为83∶14∶2至74∶21∶6。在一个实施方案中，所述比率在该范围内是线性的。
在一个实施方案中，该促红细胞生成素组合物的四触角糖基形式∶具有一个重复单元的四触角糖基形式∶具有两个重复单元的四触角糖基形式∶三触角糖基形式∶具有一个重复单元的三触角糖基形式∶双触角糖基形式的比率范围为43∶28∶12∶8∶6∶2至45∶21∶7∶14∶7∶6。在一个实施方案中，所述比率在该范围内是线性的。
因此，本发明的又一方面是促红细胞生成素组合物，其四触角糖基形式∶具有一个重复单元的四触角糖基形式∶具有两个重复单元的四触角糖基形式∶三触角糖基形式∶具有一个重复单元的三触角糖基形式∶双触角糖基形式的比率范围为43∶28∶12∶8∶6∶2至45∶21∶7∶14∶7∶6。在一个实施方案中，所述比率在该范围内是线性的。
本发明的又一方面是促红细胞生成素组合物，其是促红细胞生成素同工型的混合物，所述促红细胞生成素同工型中每个促红细胞生成素分子的唾液酸残基数大于6且小于17，所述组合物已用根据本发明的方法获得。
本发明的再一方面是用于生产重组促红细胞生成素的方法，其包括在适宜条件下、在适宜培养基中培养包含编码促红细胞生成素的核酸的宿主细胞以生产促红细胞生成素，并从培养基或细胞中分离促红细胞生成素。在一个实施方案中，在悬浮液中培养该细胞。在进一步的实施方案中，在发酵罐中、特别是在体积为10升至50,000升的发酵罐中培养该细胞。
从培养基中分离促红细胞生成素包括下列步骤：
(a)将细胞培养上清液施加到亲和层析材料上，并回收/收集含有促红细胞生成素的馏分，
(b)任选地将(a)的馏分施加到疏水相互作用层析材料上，并回收/收集含有促红细胞生成素的馏分，
(c)用根据本发明的方法，将(a)或(b)的馏分施加到含有羟磷灰石的固定相上，并回收/收集含有促红细胞生成素的馏分，和
(d)将(c)的馏分浓缩或/和将其通过反相HPLC材料。
纯化方法的步骤(a)包括将细胞上清液通过亲和层析材料，所述细胞上清液可任选进行预处理。在一个实施方案中，该亲和层析材料是已与蓝色染料偶联的亲和层析材料。实例是蓝色琼脂糖凝胶(Blue Sepharose)。在一个实施方案中，如果血清含量≥2％(v/v)的培养基用于发酵/其生产，那么在从亲和层析材料中洗脱后，将含有促红细胞生成素的洗脱液通过疏水相互作用层析材料。在一个实施方案中，该疏水相互作用层析材料是丁基琼脂糖凝胶。在步骤(c)中，将来自步骤(a)或步骤(b)(如使用)的洗脱液通过含有羟磷灰石的固定相，并分离含有促红细胞生成素的洗脱液。在一个实施方案中，浓缩用排阻层析、例如膜过滤进行。在这种情况下，使用例如排阻大小为10kDa的膜已被证明是有利的。可用根据本发明的方法获得的促红细胞生成素可含有α-2，3-连接的或/和α-2，6-连接的唾液酸残基。
本发明的另一方面是用于生产聚乙二醇缀合的促红细胞生成素的方法，其包括下列步骤：
a)使用活化聚乙二醇试剂共价连接即聚乙二醇化促红细胞生成素，
b)通过两个连续的阳离子交换层析步骤纯化聚乙二醇缀合的促红细胞生成素，由此产生聚乙二醇缀合的促红细胞生成素，
其中步骤a)中所用的促红细胞生成素用根据本发明的方法获得。
本发明的另一方面是药物组合物，其包含已用根据本发明的方法获得的促红细胞生成素。根据本发明的组合物可任选与常规药用稀释剂、赋形剂、辅助剂和载体一起配制成药物制剂。当用反相HPLC(例如在Vydac C4柱上)或/和体积排阻层析(例如在TSK 2000SWUltrapac柱上)测定时，可用于产生药物制剂的根据本发明的组合物具有至少99％的纯度，或在另一个实施方案中，具有至少99.9％的纯度。本发明的又一方面是用于治疗贫血的药物组合物，其包含促红细胞生成素，所述促红细胞生成素已用根据本发明的方法获得。
发明详述
不同物质能否用层析法彼此分离，首先取决于进行层析的条件，此外取决于良好的柱填充和层析材料(固定相)的选择。除缓冲系统的选择之外，这包括洗脱杂质和产物的方式。
本发明记述了用于纯化促红细胞生成素的方法，包括至少一个应用含有羟磷灰石的固定相的层析步骤，并包括下列步骤：
i)将待纯化的含有第一钙离子浓度的促红细胞生成素溶液与含有羟磷灰石的固定相接触，一定体积的含有第二钙离子浓度的溶液已通过所述固定相，
ii)将一定体积的含有比来自i)的溶液更低的钙离子浓度即第三钙离子浓度的溶液通过含有羟磷灰石的固定相，其中在该过程中促红细胞生成素保持与含有羟磷灰石的固定相结合或未从其分离，和
iii)将一定体积的含有低于0.5mM钙离子浓度即第四钙离子浓度的溶液通过来自ii)的含有羟磷灰石的固定相，其中促红细胞生成素从含有羟磷灰石的固定相中分离和洗脱。
在一个实施方案中，第一和第二浓度和/或第三和第四浓度是不同的。在另一个实施方案中，第三和第四钙离子浓度为第一和第二钙离子浓度的10％或更少。
促红细胞生成素，其在下文中也被称为EPO，被理解成具有刺激类红前体细胞中的分化和分裂过程并由此提供红细胞的生物能力的蛋白质。该蛋白质优选是人促红细胞生成素，由分子量为约34-38kDa的165个或166个氨基酸(SEQ ID NO：1和2)组成。糖残基占约40％的分子量。EPO的衍生物和片段例如聚乙二醇化EPO，即聚乙二醇缀合的促红细胞生成素，具有类似的生物学性质并包含通过培养产生EPO的宿主细胞所得的促红细胞生成素，也可用根据本发明的方法制备。人EPO的DNA序列和蛋白质序列尤其在EP 0 205 564和EP 0209 539中描述。
EPO的结构包括两个二硫桥和数条糖链。糖链在下文也被称为糖残基，其与蛋白质主链结合。有些链通过天冬酰胺残基与蛋白质以N-糖苷键结合，而某条链通过丝氨酸残基与蛋白质以O-糖苷键结合。
唾液酸(N-乙酰神经氨糖酸)通常掺合到(支链或直链)糖残基的末端。此后糖残基再也不能延伸。唾液酸仅可与Gal(β1-4)GlcNAc的α2-3键连接(Nimtz，M.等人，Eur.J.Biochem.213(1993)39-56)。
术语“触角”(antennarity)或“糖残基的触角”是指糖残基的支化度。如果糖残基例如具有两个臂，那么糖残基是双触角的，即其是双触角糖残基。糖残基可具有重复性部分，即所谓的重复单元。这些是其中序列GlcNAc和半乳糖(N-乙酰乳糖胺)是重复性的区域。糖残基的链长、由此还有蛋白质的分子量随不同的重复单元数目而变化(Nimtz，M.等人，Eur.J.Biochem.213(1993)39-56)。在EPO的情况下，三触角糖残基可包含最大一个重复单元，而四触角糖残基可具有至多两个的重复单元。双触角糖残基不具有重复单元。
促红细胞生成素是多重糖基化蛋白。由于糖残基的变化和不同的唾液酸化(sialidation)度，不同糖基化形式和同工型存在于自然界和生物技术生产中。高比例的重复单元也对体内活性具有积极影响(参见例如EP 0 409113)。
促红细胞生成素由十种主要同工型组成。术语“同工型”是指一组具有同一氨基酸序列和相同数量的结合唾液酸残基的EPO分子。同工型具有相同的等电点，但在程度、复杂性和与氨基酸序列结合的糖残基的触角方面不同。例如，术语“EPO的同工型2”包括一组具有14个唾液酸残基的EPO分子。同工型3具有13个唾液酸，以此类推。此外，具有不在末端的另外的唾液酸的EPO形式很少。因此，同工型1具有15个与糖残基结合的唾液酸，同工型1′具有16个与糖残基结合的唾液酸。
本发明的一方面是用于制备具有促红细胞生成素同工型分布的、高纯度的促红细胞生成素的方法，其中所述方法包括不同层析步骤的组合，组合的方式使得初始的促红细胞生成素同工型分布改变。该方法的不同层析步骤包括应用含有羟磷灰石的固定相的层析步骤和至少一个选自下列的层析步骤：i)染料亲和层析、ii)疏水相互作用层析、iii)阴离子交换层析、iv)反相层析和/或v)凝胶渗透层析。在该方面的一个实施方案中，具有减少的唾液酸残基数的促红细胞生成素同工型被去除或完全分离。在本申请中，术语“完全”意指相应的化合物再也不能用给定的分析方法检测，因为浓度/量低于方法的检测限。在一个实施方案中，每个促红细胞生成素分子多达3个或4个或5个(包括5个)唾液酸残基的促红细胞生成素同工型被去除或完全分离。在一个实施方案中，获得促红细胞生成素，其中该同工型混合物包括具有6至15个唾液酸基团或具有7至15个唾液酸基团的同工型。
除各种糖残基和同工型之外，存在更多的EPO形式。在脱氮-EPO和脱氧-EPO形式的情况下，存在还未完全翻译后糖基化并在丝氨酸残基126(脱氧-EPO)或天冬酰胺残基24(脱氮-EPO)上未糖基化的种类。
羟磷灰石是基于磷酸钙的无机化合物，其具有经验式Ca5(PO4)3OH。作为层析固定相，其适于分离蛋白质、酶、免疫球蛋白和核酸。它实际上主要存在于骨和牙釉质中。高pH值有助于羟磷灰石的形成。羟磷灰石在酸性pH值下溶解。羟磷灰石的各种结合机理用于层析分离中，其中它主要用作吸附剂但也具有离子交换材料的性质。有可能在蛋白质的带正电荷的氨基(例如赖氨酸)和固定相的带负电荷的磷酸基之间形成离子键。此外，蛋白质的羧基(例如天冬酰胺)可与羟磷灰石的钙离子结合。该材料的特征是复合结合可在固定相的磷酸基与溶液中的钙或镁离子和蛋白质的羧基之间发生(M.Kratzel，“PharmazeutischeBioanalytik”第5章，University ofVienna)。
各种羟磷灰石材料是已知的。促红细胞生成素与该基质结合，在一个实施方案中，在低磷酸盐浓度下被洗脱。
在根据本发明方法的一个实施方案中，含有羟磷灰石的固定相由掺合到琼脂糖主链中的羟磷灰石组成。适宜的柱材料例如是羟磷灰石Ultrogel(BioSepra，德国)或HABiogel HT(Biorad，德国)。有利的是，在约中性的pH进行层析。与纯的羟磷灰石(例如以HAUltrogel形式可得)相比，嵌入琼脂糖基质中的羟磷灰石具有较高的耐压性。该材料具有非均匀的50μm至160μm的粒径分布，其中主要部分为70μm至90μm。表面非常粗糙，颗粒仅在一定程度上呈球形。
在不同的实施方案中，用于根据本发明方法的含有羟磷灰石的固定相由在高温和高压下烧结的纯羟磷灰石(例如以来自BioRad的CHT-陶瓷羟磷灰石的形式可得)组成。这是耐压性材料，且由颗粒组成，所述颗粒是相对对称和均匀球形的，且具有相对光滑的表面。对CHT-1型而言，颗粒具有约40μm的大小，比表面积为约40m2/g。平均粒径为20μm-30μm。CHT材料2型专门针对较大的分子例如免疫球蛋白开发。CHT-2型的比表面积为19m2/g，因此约为CHT-1型的一半。该颗粒具有与CHT-1型相似的形态。该颗粒也具有40μm的大小。因此，在根据本发明方法的一个实施方案中，含有羟磷灰石的固定相是在高温和高压下烧结的羟磷灰石，比表面积为约40m2/g。
在进一步的实施方案中，用于根据本发明方法的含有羟磷灰石的固定相由纯结晶羟磷灰石(例如以来自Calbiochem的羟磷灰石Fast Flow形式可得)。颗粒是菱形的，并且具有50μm-100μm的大小。
图1显示了促红细胞生成素在含有羟磷灰石的固定相(HA-Ultrogel)上层析的层析图示例。框内区域是分馏的产物峰，其被细分成馏分1-16。馏分17是峰肩，其以单独馏分形式收集。越过峰后各个馏分的纯度几乎线性地下降(参见图2)。
采用与实施例4中所述相同的用于纯化促红细胞生成素的层析方法，对所述不同的含有羟磷灰石的固定相进行比较。
表1：来自EPO层析的数据的概述
在一个实施方案中，如果CHO蛋白的浓度低于15ng/ml，那么样品被视为不含CHO蛋白。已发现，当装载有不同量的促红细胞生成素时，陶瓷和结晶羟磷灰石材料是可比较的，而在5mg EPO/ml柱材料的装载下，用基于琼脂糖的材料时，收率和产物质量大大下降。因此，在用HA Ultrogel羟磷灰石材料的分离中，分离过程中损失几乎10％的促红细胞生成素。
用分析型反相HPLC(RP-HPLC)对含有促红细胞生成素的馏分的分析显示，在几乎所有的馏分中，在促红细胞生成素峰的下降侧上产物峰具有一个肩部(图3)，其被鉴定为脱氧-EPO。通过在RP-HPLC层析谱中画垂直线半定量地测定脱氧-EPO的比例，该比例与EPO量一同示于图4中。形成这个肩部的原因是，尤其在羟磷灰石层析中去除了含有EPO形式的双触角糖残基和三触角糖残基。在分析型RP-HPLC中，这些形式又在脱氧-EPO之前直接洗脱。作为这种选择去除的结果，凸显出脱氧-EPO肩部。
蛋白质样杂质在整个洗脱峰上分布，但是前馏分比后馏分包含更低比例的CHO宿主细胞蛋白(参见图5)。
由于含有EPO的后馏分中的疏水性EPO糖基形式较多，所以促红细胞生成素的疏水性增大。在含有羟磷灰石的固定相上的层析法特异性去除碱性同工型，即含有较少唾液酸的同工型。如图6中所示，唾液酸残基数随含有促红细胞生成素的馏分而均匀地下降。碱性从同工型1至同工型9增加。含有促红细胞生成素的前几个馏分(馏分1至馏分5)中富集酸性同工型，而在含有促红细胞生成素的后几个馏分(馏分12至馏分16)中看到向碱性同工型大幅度转移(图7)。对糖基形式的分析显示，前几个馏分中洗脱出亲水性EPO形式，其具有较高含量的四触角结构和较多的重复单元。之后洗脱出更多具有较少重复单元或较高三触角结构比例的疏水性EPO形式，此过程与四触角糖基形式是相反的(图8)。双触角糖基形式的比例平稳地增加(图9)，而该增加并不均匀，而是逐步的。
图10也示例了糖基形式在产物峰上的分布。尽管含有EPO的前几个馏分(例如F1，馏分1)中存在具有高重复单元含量的四触角糖基形式，含有EPO的后几个馏分(例如F16，馏分16)中有高比例的三触角糖基形式和双触角糖基形式。因此，已发现，用根据本发明的方法，在含有羟磷灰石的固定相上层析的后期，较少糖基化的EPO形式被去除，并被洗脱。
在含有EPO的后几个馏分中，CHO宿主细胞蛋白质的含量也增加。因此，可用层析方法实现良好分离并由此去除CHO宿主细胞蛋白质，从而EPO与CHO宿主细胞蛋白质之间具有良好分离，即具有一个更突出的含有CHO宿主细胞蛋白的肩部(参见图11)。因此，在用根据本发明方法的一个实施方案中，本发明的一方面是用含有羟磷灰石的固定相上的层析除去含有促红细胞生成素馏分中的CHO宿主细胞蛋白的方法，所述方法特征在于含有促红细胞生成素的馏分的收集由280nm波长处的光吸收控制，收集在15mAU至75mAU的吸收时开始，并在峰最大值越过200mAU至40mAU的吸收后终止。
在一个实施方案中，含有羟磷灰石的固定相是结晶羟磷灰石。由于产物峰通常非常平坦并具有突出的肩部，所以该固定相是适合的。在进一步的实施方案中，用于层析的洗涤和洗脱步骤中的溶液包含5mM磷酸盐离子浓度。已发现，该磷酸盐离子浓度对用含有陶瓷羟磷灰石的固定相纯化促红细胞生成素是有利的，因为通过采用此磷酸盐浓度，可将含EPO馏分中的CHO宿主细胞蛋白的量减少/去除至低于对应分析方法的定量限或检测限的值。
用各种含有羟磷灰石的固定相获得的促红细胞生成素的同工型分布示于图12中。已发现，不管是含有羟磷灰石的固定相的类型还是装载，都未对同工型分布产生重要影响。陶瓷和结晶羟磷灰石相的特征是它们去除碱性同工型比基于琼脂糖的羟磷灰石相略多。在一个实施方案中，用RP-HPLC测定，用根据本发明方法获得的促红细胞生成素的纯度超过99.3％。在一个实施方案中，任选在5mg/ml的装载下，经RP-HPLC测定，所得EPO的纯度为99.3％至99.9％(％＝基于RP-HPLC层析图的面积百分比)。也在CHO宿主细胞蛋白去除/分离中看到固定相之间的差异。基于琼脂糖的羟磷灰石相和结晶羟磷灰石相的有效性比陶瓷羟磷灰石相差。因此，在根据本发明方法的一个实施方案中，含有羟磷灰石的固定相是陶瓷羟磷灰石相。
已发现，用于在含有羟磷灰石的固定相上的层析的溶液中所含的钙离子浓度对纯化、由此也对以此获得的促红细胞生成素的纯度具有显著影响。当溶液中钙离子浓度下降时，结果是大多数促红细胞生成素可用分步洗脱(即通过溶液三至溶液四的步骤)可由含有羟磷灰石的固定相得到(参见实施例4和8，和图13)。当在洗脱促红细胞生成素(换至第五溶液)之后钙离子浓度增加时，CHO宿主细胞蛋白和DNA从含有羟磷灰石的固定相中洗脱。用含有减少的钙离子浓度的溶液获得的促红细胞生成素馏分比此后洗脱的促红细胞生成素馏分更具酸性(参见图14)。用增加的钙离子浓度获得的峰的下降侧非常平坦，即其含有许多CHO宿主细胞蛋白。相反，用减少的钙离子浓度获得的峰非常对称。
本发明包括用于纯化促红细胞生成素的方法，其包括至少一个应用含有羟磷灰石的固定相的层析步骤，且包括：
i)a)提供含有促红细胞生成素和第一钙离子浓度的第一溶液，
b)提供含有羟磷灰石的固定相，一定量的含有第二钙离子浓度的第二溶液已通过所述固定相(平衡步骤)，
c)将a)溶液施加至b)中获得的固定相，
ii)将含有低于第一和第二溶液浓度的第三钙离子浓度的第三溶液通过步骤i)中所得的含有羟磷灰石的固定相(洗涤步骤)，和
iii)将一定量含有0.5mM钙离子浓度或更少的第四溶液通过来自ii)的含有羟磷灰石的固定相，由此从含有羟磷灰石的固定相中分离并回收促红细胞生成素，随即获得纯化的促红细胞生成素(洗脱步骤)。
在一个实施方案中，第一钙离子浓度与第二钙离子浓度相同。在进一步的实施方案中，第二溶液和第三溶液包含2-丙醇。在进一步的实施方案中，第一钙离子浓度和/或第二钙离子浓度为4mM至20mM。在进一步的实施方案中，第一钙离子浓度和/或第二钙离子浓度为5mM。在进一步的实施方案中，溶液的pH值为pH 6.9±0.2。在进一步的实施方案中，2-丙醇含量为7至12％(v/v)，在一个实施方案中，为9％(v/v)。在进一步的实施方案中，第三钙离子浓度等于或小于0.5mM，在一个实施方案中，为0.000001mM至0.5mM。在进一步的实施方案中，第三钙离子浓度等于或小于0.1mM，在一个实施方案中，为0.000001mM至0.1mM。在另一个实施方案中，第四溶液包含0.1mM或更少的钙离子，在一个实施方案中，为0.000001mM至0.1mM。在进一步的实施方案中，将4至7倍柱体积的第二溶液施加于柱子。在进一步的实施方案中，施加于柱子上的第三溶液的体积为0.5至2.5倍柱体积。在进一步的实施方案中，仅有少量的促红细胞生成素从步骤ii)的固定相中洗脱/分离。在进一步的实施方案中，所述量小于10％，在另一个实施方案中，所述量小于5％，且在最终的实施方案中，小于1％的促红细胞生成素结合在固定相。在进一步的实施方案中，钙离子以CaCl2形式引入到溶液中。在根据本发明方法的一个实施方案中，第二溶液含有20mM TRIS-HCl、5mMCaCl2、0.25M NaCl、9％(v/v)2-丙醇，pH为6.9±0.2。在进一步的实施方案中，第三溶液含有20mMTRIS-HCl、0.25M NaCl、9％(v/v)2-丙醇，pH为6.9±0.2。在进一步的实施方案中，第四溶液含有10mM TRIS-HCl、pH 6.9±0.2。例如9％(v/v)的值表示，该溶液通过提供9％ 2-丙醇并加入所制备的溶液直至获得最终体积而制得。
与用第五溶液获得的馏分相比较，用第四溶液获得的馏分中的四触角糖基形式的量增加。但是，用第五溶液获得的馏分具有较高比例的双触角糖基形式和三触角糖基形式。也已发现，在第五溶液的情况下，与用不加修饰的CaCl2的CHT-2型试验相比较，馏分中存在较高比例的脱氧-EPO和脱氮-EPO种类。
本发明的又一方面是用于生产促红细胞生成素的方法，包括在适宜的培养基中、在适宜的条件下培养含有编码EPO的核酸的细胞，并从培养基或细胞中分离促红细胞生成素。在一个实施方案中，在悬液中培养该细胞。在进一步的实施方案中，在发酵罐中、特别是在体积为10升-50,000升的发酵罐中进行培养。从细胞的培养基中分离促红细胞生成素包括下列步骤：
a)将细胞培养上清液或分解细胞悬液的上清液施加到亲和层析材料上，并回收/收集含有促红细胞生成素的馏分，
b)任选地将步骤a)中所得的含有促红细胞生成素的馏分施加到疏水相互作用层析材料上，并回收/收集含有EPO的馏分，
c)使用根据本发明的方法，将a)或b)的含有EPO的馏分施加到含有羟磷灰石的固定相上，并回收/收集含有促红细胞生成素的馏分，和
d)浓缩或/和将c)的含有EPO的馏分施加到反相HPLC材料上。
纯化方法的步骤a)包括将细胞培养上清液施加到亲和层析材料上，所述细胞培养上清液可任选进行预处理。在一个实施方案中，该亲和层析材料是已与蓝色染料共价偶联的亲和层析材料。其一个实例是蓝色琼脂糖凝胶(Blue Sepharose)。在一个实施方案中，如果使用血清含量等于或大于2％(≥2％)(v/v)的培养基，那么在从亲和层析材料中洗脱后，将含有促红细胞生成素的洗脱液施加到疏水相互作用层析材料上。在一个实施方案中，该疏水相互作用层析材料是丁基琼脂糖凝胶。在方法的步骤(c)中，将来自步骤(a)或步骤(b)(如果使用)的洗脱液施加到含有羟磷灰石的固定相上，然后根据本发明的方法回收含有促红细胞生成素的洗脱液。在一个实施方案中，用排阻层析、例如通过膜过滤浓缩洗脱液，在这种情况下使用培养基例如排阻大小为10kDa的膜被证明是有利的。可用根据本发明方法获得的促红细胞生成素可包含α-2，3-连接的或/和α-2，6-连接的唾液酸残基。
为了生产重组促红细胞生成素，将不含细胞的培养上清液分离，使其进行根据本发明的方法。如有需要，可在纯化工艺之前另外地进行分离浊度的过滤和/或浓缩。
在第一步骤中，染料层析除去由蛋白酶产生的污染。在一个实施方案中，蓝色三嗪染料例如 Blue用作染料。其它三嗪染料也是适合的。用于染料层析的支撑物材料不是关键的，但是优选使用基于多糖的支撑物材料，例如Sepharose，优选Sepharose 6Fast Flow。柱子用pH值为4.5至5.5的缓冲液平衡，在一个实施方案中，用pH 4.8-5.2的缓冲液，在进一步的实施方案中，用乙酸盐缓冲液或乙酸。在一个实施方案中，层析在1℃至10℃的温度进行，在另一个实施方案中，温度为约5℃。在一个实施方案中，洗脱/回收是通过在酸性或中性pH(在一个实施方案中，pH5至7)增加盐浓度而进行。在碱性pH下，在一个实施方案中为pH 8.5至9.5，在另一个实施方案中为pH 8.8至9.2，也可能在盐浓度未有明显变化的情况下洗脱促红细胞生成素。
在第二步骤中，进行在疏水化支撑物上的层析。用于疏水层析的适宜的吸附剂材料例如在“蛋白纯化方法，一种实用方法”，编者Harris，E.L.V.和Angal，S.，IRL Press，Oxford，英国(1989)，第224页；和“蛋白质纯化”，Janson，J.C.、Ryden，L.(编者)，VCHPublisher，Weinheim，德国(1989)，第207-226页中描述。支撑物材料自身不是关键的，可以是例如Sepharose，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物，或硅胶。重要的是，疏水基团、在一个实施方案中是丁基与支撑物共价连接。适宜的支撑物市售可得(例如Butyl Toyopearl购自Tosoh Haas，德国或Butyl Sepharose购自Pharmacia，德国)。在一个实施方案中，使用丁基化支撑物。其它烷基化或芳基化支撑物在某些情况下不可逆地结合促红细胞生成素，或导致较差的分离。通过降低盐浓度(例如梯度为4mol/l至0mol/l)、通过加入离液剂例如碘化物、高氯酸盐或硫氰酸盐或通过加入醇例如甘油、乙二醇或2-丙醇，进行疏水层析中的洗脱。在一个实施方案中，在中性pH、在盐存在、在一个实施方案中为约0.75mol/l NaCl下进行疏水层析。也可能在低分子量醇存在下、在一个实施方案中在异丙醇(＝2-丙醇)存在下进行疏水层析。洗脱缓冲液中低分子量醇的浓度为平衡缓冲液中浓度的约2-3倍高。在洗涤缓冲液中低分子量醇的浓度为平衡缓冲液中浓度的约2倍高。加入约10-15％、在一个实施方案中约10％的2-丙醇以用于平衡(装载层析材料)；加入约25％至35％、在一个实施方案中约27％的2-丙醇以用于洗脱，将19％ 2-丙醇加入洗涤缓冲液(特定浓度也适用于其它醇，以体积％(v/v)所示)。可在10℃至40℃的较宽温度范围进行疏水层析。但是，在27±2℃的受控温度操作是有利的。
然后，可根据本发明的方法在含有羟磷灰石的固定相上进行分离。
羟磷灰石步骤后可在疏水化支撑物上进行反相层析，作为纯化的任选步骤。但是，当根据本发明使用羟磷灰石层析时，则该步骤通常没有必要进行，因此可被忽略。除节省时间之外，该步骤还降低了成本，并避免使用随后必须被分离的有机溶剂。例如，下述材料作为层析材料适用于反相层析：Phenyl Sepharose和Octyl Sepharose(Pharmacia，瑞典)、ButylToyopearl(Tosoh Haas，德国)或Propyl-TSK(Merck，德国)。但是，在该方法步骤中，使用含有较长烷基(例如C8或C18)的支撑物也是有利的。在一个实施方案中，在2至7的pH范围平衡柱子，在另一个实施方案中，pH为2.5，且在另一个实施方案中，使用含水的三氟乙酸。从平衡缓冲液到极性有机溶剂如乙腈的水溶液的梯度用于洗脱。层析后，优选对洗脱液进行中和。
作为根据本发明纯化方法的下一步，接着进行阴离子交换层析。在该步骤中，在一个实施方案中，DEAE Sepharose Fast Flow层析材料用作柱材料。在pH 6至pH 9的pH值进行平衡，在另一个实施方案中pH为7.5。在一个实施方案中，任选地用酸性溶液(pH值约为4.5)洗涤后，在中性或略碱性的范围(pH 6-9，在一个实施方案中，pH为7.5，同时增强离子强度，在一个实施方案中用NaCl)进行洗脱。在一个实施方案中，磷酸盐缓冲液用作缓冲液。
在一个实施方案中，该蛋白制品以0.1g至10g的批量生产。结果表明，如果疏水层析作为在染料上的亲和层析之后的第二步骤进行，那么在培养基中培养之后、在一个实施方案中培养基不含天然哺乳动物蛋白质，EPO可被充分纯化用于治疗应用(EP 1 394 179)。在层析纯化之前，没有必要加入蛋白酶抑制剂(例如CuSO4)，如Nobuo，I.等人，J.Biochem.107(1990)352-359或WO 86/07494中所述。在一个实施方案中，在烷基化(C4-C18)或芳基化(在一个实施方案中为苯基化或苄基化)支撑物上进行疏水层析。在另一个实施方案中，特别使用丁基化支撑物。
“完全不含天然哺乳动物蛋白质”在本文表示该制品不含可检测量的此类蛋白。该制品完全不含有意加入的哺乳动物蛋白质，所述哺乳动物蛋白质并非源自宿主细胞且通常另外被加入培养基中以维持并改善细胞生长和优化收率。天然哺乳动物蛋白质被理解为来自天然来源例如来自人或动物的哺乳动物蛋白质，而不是例如已在原核生物例如大肠杆菌中产生的重组哺乳动物蛋白质。
本发明的又一方面是用于生产与一个聚乙二醇聚合物共价连接的促红细胞生成素(单-聚乙二醇化促红细胞生成素)的方法，包括下列步骤：
a)通过使用分子量为20kDa至40kDa的活化PEG试剂将促红细胞生成素与聚乙二醇缀合(促红细胞生成素的聚二乙醇化)，
b)用两个各自采用相同的固定相但采用不同洗脱方法的连续阳离子交换层析步骤纯化在步骤a)中所得的聚乙二醇化促红细胞生成素，
c)将与PEG(聚乙二醇)缀合的促红细胞生成素从第二固定相中分离。
该方法特别适用于纯化聚乙二醇化EPO，该EPO已重组产生并且随后被化学方法聚乙二醇化。在该方法的第一步骤中，促红细胞生成素被聚乙二醇化。用于该反应的聚乙二醇聚合物(PEG)具有约20kDa至40kDa的分子量(在这方面，术语“分子量”是指聚乙二醇的平均分子量，因为PEG是没有确定的分子量而是具有分子量分布的聚合化合物)。术语“约”意指一些PEG分子将具有较高分子量，而一些PEG分子将具有较低分子量，即术语“约”意指分子量分布，其中95％的PEG分子具有±10％所示分子量的分子量。
术语“聚乙二醇化”是指聚乙二醇分子与多肽的N端或赖氨酸侧链之间的共价连接。蛋白质的聚乙二醇化尤其在Veronese，F.M.，Biomaterials22(2001)405-417中描述。聚乙二醇可通过各种功能团且以各种分子量与蛋白质连接(Francis，G.E.等人，Int.J.Hematol.68(1998)1-18；Delgado，C.等人，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Systems9(1992)249-304)。聚乙二醇与促红细胞生成素的共价连接可在例如WO 00/44785中记述的水溶液中进行，在一个实施方案中，使用分子量为5kDa至40kDa的NHS活化的直链或支链聚乙二醇(PEG)分子。聚乙二醇化反应也可以以固相反应的形式进行(Lu，Y.等人，ReactivePolymers 22(1994)221-229)。选择性N端聚乙二醇化蛋白质可根据WO 94/01451或Felix，A.M.等人，ACS Symp.Ser.680(聚乙二醇)(1997)218-238获得。
提供下面实施例、序列表和附图来帮助理解本发明，而本发明的真实范围在所附的权利要求中阐明。应理解，可在不背离本发明的精神下对所阐述的方法进行变更。
序列表概述
SEQ ID NO：1
具有165残基的氨基酸序列的人促红细胞生成素
SEQ ID NO：2
具有166残基的氨基酸序列的人促红细胞生成素
附图概述
图1 用含有羟磷灰石的固定相(HA-Ultrogel)对促红细胞生成素进行层析的示例性层析图
图2 各个含有促红细胞生成素的馏分的纯度的图表
图3 用分析型反相HPLC对含有促红细胞生成素的馏分的分析型层析
图4 含有促红细胞生成素的馏分中脱氧-EPO和EPO的百分比的图表
图5 含有促红细胞生成素的馏分中蛋白样杂质的分布
图6 含有促红细胞生成素的馏分中的唾液酸数的图表
图7 含有促红细胞生成素的馏分中酸性和碱性同工型的分布
图8 含有促红细胞生成素的馏分中三触角糖基形式的分布
图9 含有促红细胞生成素的馏分中双触角糖基形式的分布
图10 对含有促红细胞生成素的馏分中糖基形式的分布的概述
图11 含有促红细胞生成素的峰中肩部的比较实施例
图12 用不同的含有羟磷灰石的固定相获得的促红细胞生成素的同工型分布
图13 使用根据本发明的方法获得的层析图
图14 不同层析方法中同工型分布的比较
材料和方法
用于层析的缓冲液：
所有溶液由储备溶液制备。如果未另有说明，那么用1M NaOH或1MHCl调节所有缓冲液的pH。始终使用II型超纯水(MilliQ-水)。
储备溶液(水溶液)：
1mol/l磷酸钾缓冲液，pH 6.9±0.2，
1mol/l三(羟基氨基甲烷)缓冲液(TRIS-HCl)，pH 6.9±0.2，
5mol/l氯化钠，
1mol/l氯化钙，
10mol/l氢氧化钠。
标准层析缓冲液：
标准洗涤缓冲液：20mM TRIS-HCl，5mM CaCl2，pH 6.9±0.2
填装缓冲液
HA Ultrogel/Fast Flow：20mM TRIS-HCl，5mM CaCl2，pH 6.9±0.2
填装缓冲液CHT：200mM磷酸钾，pH 9-10
再生缓冲液1 HA Ultrogel：200mM磷酸钾，0.1mM CaCl2，pH 6.9±0.2
再生缓冲液1 CHT，Fast Flow：200mM磷酸钾，pH 6.9±0.2
碱再生：0.5M NaOH
平衡缓冲液：20mM TRIS-HCl，5mM CaCl2，0.25M NaCl，9％(v/v)2-丙醇，pH 6.9±0.2
洗涤缓冲液：10mM TRIS-HCl，5mM CaCl2，pH 6.9±0.2
洗脱缓冲液：10mM TRIS-HCl，0.5mM CaCl2，10mM磷酸钾，pH 6.9±0.2
用于分析测定的缓冲液
分析型RP-HPLC：
洗脱液A：0.1％ TFA(三氟乙酸)，水
洗脱液B：0.1％ TFA，70％乙腈，水
蛋白质测定A280：
10mM磷酸钠/磷酸钾，0.1mol/l NaCl，pH 7.5±0.2
蛋白质测定
使用光程长度为1cm的石英比色杯。稀释样品，以使测定的吸收度为0.2至1.0AU。如果需要稀释，那么彼此独立地稀释样品，测量以一式三份进行。未稀释的样品进行单次测量。促红细胞生成素最终产物缓冲液用于样品稀释和空白测定。
在280nm处进行测量。在开始时测量促红细胞生成素参考标准样品作为系统对照。在分析之前调节实际样品使平均蛋白质浓度为1.86mg/ml至2.05mg/ml。根据下式计算蛋白质浓度：
1)0.1％溶液的消光系数：ε＝1.25ml·(mg·cm)-1
2)样品的稀释因子
蛋白质的量由下式给出：
m[g]＝c[mg/ml]·V[L]
分析型RP-HPLC
在RP-HPLC(反相-高效液相层析)中，用洗脱液A将所有样品稀释至0.12mg/ml的最大浓度。用280nm的光度测量测定蛋白质浓度。在分析样品之前注射100％洗脱液A的4个样品。这确保柱子完全达到平衡。在样品序列的开始和结束时对促红细胞生成素参考标准进行分析。为了避免偏差，用标准化积分法分析层析图。通过绘制与基底垂直的线将各个峰彼此分离。
CHO蛋白含量/宿主细胞蛋白含量的测定
用ELISA试验(酶联免疫吸附测定)测定CHO细胞蛋白质。本文中使用基于链霉亲和素/生物素技术的夹心式分析法。涂布有链霉亲和素的微量滴定板用于测定。用生物素将抗CHO细胞蛋白的抗体与板结合。通过移液管以15-150ng/ml的CHO蛋白质浓度加入待分析的样品溶液。如果浓度低于15ng/ml，那么该样品被认为不含CHO蛋白。如果浓度高于150ng/ml，在较高的稀释度下重复试验。
结果以CHO蛋白[ppm]形式显示。
同工型分布的测定
用毛细管电泳测定同工型分布。为了分析将样品渗滤到水中。随后用电解质溶液漂洗毛细管，接着将所稀释的样品点样到毛细管中。采用25,000V的高压进行分离。流动缓冲液含有过量的正离子，它们产生电渗流。使用石英毛细管能对毛细管中的蛋白质进行光度检测，并通过峰面积进行定量测定。
糖分析
为了糖分析，使用酶促试验操作。在该操作中，用N-糖苷酶将促红细胞生成素的N-糖苷连接的寡糖裂解。此外，借助于神经醇胺酶(neuramidase)将唾液酸从寡糖除去。使用阴离子交换剂将所得N-寡糖分离并对其分析。在系列试验期间，测量用完全与样品相同的方法处理的促红细胞生成素参考标准。检测出下述糖结构：双触角、三触角、三触角1个重复单元、四触角、四触角1个重复单元、四触角2个重复单元。
排阻层析(SE-HPLC)
为了SE-HPLC，在分离开始前，将层析柱用3-5倍柱体积(CV)缓冲液平衡，以得到不含附加峰的均匀基线。将样品稀释至0.2mg/ml的浓度，注射到SE-HPLC中。根据标准方法对各峰积分。通过绘制垂直线将各峰彼此分离。
DNA测定
将生物素与微量滴定板结合。加入链霉亲和素、单链DNA和生物素化单链DNA结合蛋白的反应混合物。结合蛋白能结合DNA并被生物素化。以这种方式，可能从样品混合物中特异性除去DNA。链霉亲和素结合微量滴定板上的生物素以及与单链DNA结合蛋白偶联的生物素。将与脲酶偶联的DNA特异性抗体加至该总复合物中。脲的加入导致脲的水解，这使pH发生局部变化。这种变化可被检测为改变的表面电势。表面电势的变化与结合DNA的量成比例。单链DNA通过蛋白酶K消化和用SDS变性而得。
肽图
不完全糖基化的促红细胞生成素种类例如脱氧-EPO和脱氮-EPO可通过肽图谱定量测定。为此，用内蛋白酶Lys-C将促红细胞生成素分子裂解成肽，通过HPLC分离这些肽。将所得肽谱与参考标准比较。将所得结果与标准就峰大小、峰外观和保留时间进行比较。
实施例1
在CHO细胞中重组生产促红细胞生成素
用分批法在CHO细胞中生产EPO。用预培养物接种发酵罐，约5天后收集发酵罐内容物。通过离心将完整的CHO细胞和细胞片段从发酵上清液除去。用乙酸(1mol/l)将不含细胞的培养上清液的pH调节至5.0-5.2，随后在1-9℃过滤经pH调节的溶液。无血清培养基用作培养基，其组成为基础培养基DME(HG)HAM的F-12改性(R5)(GRH Biosciences/HazletonBiologics，Denver，USA，订单号57-736)、碳酸氢钠、L-(+)谷氨酰胺、D-(+)葡萄糖、重组胰岛素、亚硒酸钠、二氨基丁烷、氢化可的松、硫酸铁(II)、天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸和聚乙烯醇。
实施例2
蓝色琼脂糖凝胶(Blue Sepharose)层析
Blue Sepharose(Pharmacia)由共价结合染料蓝的琼脂糖珠组成。在低离子强度和中性至酸性pH值下，促红细胞生成素与该支撑物结合。通过增加离子强度和pH值对促红细胞生成素进行洗脱。
用60-80升Blue Sepharose填装层析柱(Amicon P440×500，Amicon，GB)，然后用0.5N NaOH再生。随后，将柱子用约3倍柱体积(CV)乙酸缓冲液平衡。在10±5℃的温度和800-1400ml/min的流速下，将pH被调节至5的不含细胞的培养上清液吸附到柱子上。在相同的流速和5±4℃，用约1CV洗涤缓冲液1对柱子进行再洗涤，随后用约2CV洗涤缓冲液2再洗涤。然后，用约3CV洗脱缓冲液洗脱柱子。收集完整的蛋白峰(约30-60升)，用HCl将pH调节至6.9，贮存于5±4℃直至进一步加工。在该层析步骤中浓缩产物溶液，达到约40-50％的纯度。
平衡缓冲液：20mM乙酸钠，5mM CaCl2，0.1M NaCl，pH 5.0±0.2
洗涤缓冲液1：20mM乙酸钠，5mM CaCl2，0.25M NaCl，pH 5.0±0.2
洗涤缓冲液2：20mM TRIS-HCl，5mM CaCl2，pH 6.5±0.3
洗脱缓冲液：100mM TRIS-HCl，5mM CaCl2，1M NaCl，pH 9.0±0.2
实施例3
Butyl Toyopearl层析(疏水层析)
Butyl Toyopearl(Tosoh Haas)是在其上丁基残基与表面共价结合的支撑物。促红细胞生成素与该基质结合，用含有2-丙醇的缓冲液洗脱。
将该蛋白质在含有10％ 2-丙醇的平衡缓冲液中与丁基基质结合后，用由含水缓冲溶液和50％ 2-丙醇组成的梯度洗脱促红细胞生成素。洗脱从约20％ 2-丙醇开始。
用30-40升Butyl Toyopearl填装层析柱(Pharmacia BPG 300/500)，然后用4M盐酸胍和0.5N NaOH再生。随后，用至少3CV平衡缓冲液平衡柱子。将Blue Sepharose柱的洗脱液调节至10％ 2-丙醇，在27±2℃的温度和800-1200ml/min的流速下吸附到柱子上。将柱子在相同的温度和流速下用约1CV平衡缓冲液再洗涤，然后用约2CV洗涤缓冲液再洗涤。随后，用约3CV洗脱缓冲液洗脱促红细胞生成素。收集完整的蛋白峰(约10-18升)，立即用稀释缓冲液稀释3倍，贮存于15℃。在该层析中达到约90％的纯度。
平衡缓冲液：20mM TRIS-HCl，5mM CaCl2，0.75M NaCl，
10％2-丙醇，pH 6.9±0.2
洗涤缓冲液：20mM TRIS-HCl，5mM CaCl2，0.75M NaCl，
19％ 2-丙醇，pH 6.9±0.2
洗脱缓冲液：20mM TRIS-HCl，5mM CaCl2，0.75M NaCl，
27％ 2-丙醇，pH 6.9±0.2
稀释缓冲液：20mM TRIS-HCl，5mM CaCl2，pH 6.9±0.2
第一溶液：20mM TRIS-HCl，5mM CaCl2，0.25M NaCl，
9％(v/v)2-丙醇，pH 6.9±0.2
实施例4
在含有羟磷灰石的固定相上层析
根据本发明的方法条件，使用相同的基本方法步骤在每种含有羟磷灰石的固定相上进行分离，以便达到良好的可比性。顺序为：再生-平衡-分离-再生。
该缓冲液根据生产商的说明书调整以用于再生。
表2：再生-平衡
表3：分离
分离的层析参数示于下表4中。相同的参数用于所有材料。
表4：层析参数.
根据UV吸收信号收集各峰。收集开始于15mAU，并在各自峰最大值经过40mAU后停止。在分离后进行再生。收集洗脱和再生步骤的峰，并贮存于-20℃。再生的切割限(cutlimit)为上升侧的15mAU至下降侧的15mAU。在各个步骤中，洗脱流速在0.35cm/分钟至1.7cm/分钟间变化。
标准溶液：
标准洗涤缓冲液：20mM TRIS-HCl，5mM CaCl2，pH 6.9±0.2
填装缓冲液HA Ultrogel/Fast Flow：20mM TRIS-HCl，5mM CaCl2，
pH 6.9±0.2
填装缓冲液CHT：200mM磷酸钾，pH 9-10
再生缓冲液1 HA Ultrogel：200mM磷酸钾，0.1mM CaCl2，pH 6.9±0.2
再生缓冲液1 CHT，Fast Flow：200mM磷酸钾，pH 6.9±0.2
碱性再生：0.5M NaOH
平衡缓冲液：20mM TRIS-HCl，5mM CaCl2，0.25M NaCl，
9％(v/v)2-丙醇，pH 6.9±0.2
洗涤缓冲液：10mM TRIS-HCl，5mM CaCl2，pH 6.9±0.2
洗脱缓冲液：10mM TRIS-HCl，0.5mM CaCl2，10mM磷酸钾，pH 6.9±0.2
实施例5
羟磷灰石Ultrogel层析
羟磷灰石Ultrogel(BioSepra)由被掺合到琼脂糖主链中以改善其机械和流体力学性质的羟磷灰石组成。促红细胞生成素与该基质结合，并在低于大多数蛋白质杂质浓度的磷酸盐浓度下洗脱。
用30-40升羟磷灰石Ultrogel填装层析柱(Amicon P440×500或等同物)，然后用0.5N NaOH再生。随后，用至少4CV平衡缓冲液平衡柱子。在约15℃的温度和500-1200ml/min的流速下，将待纯化的促红细胞生成素溶液吸附到柱子上。在相同的温度和流速下，用约1CV平衡缓冲液、然后用约2 CV洗涤缓冲液对柱子进行再洗涤。随后，用约3 CV洗脱缓冲液洗脱柱子。收集完整的蛋白峰(约10-18升)，贮存于15℃直至进一步加工。在该层析中获得95％以上的纯度。
平衡缓冲液：20mM乙酸钠，5mM CaCl2，0.1M NaCl，pH 5.0±0.2
洗涤缓冲液1：20mM乙酸钠，5mM CaCl2，0.25M NaCl，pH 5.0±0.2
洗涤缓冲液2：20mM TRIS-HCl，5mM CaCl2，pH 6.5±0.3
洗脱缓冲液：100mM TRIS-HCl，5mM CaCl2，1M NaCl，pH 9.0±0.2
实施例6
羟磷灰石Fast Flow层析
该材料由生产商以固体的形式供应。称重适宜量的材料，将其悬浮于标准洗涤缓冲液中。将粉末在缓冲液中温育数小时以便润湿颗粒的整个表面。稀凝胶浆料(约20％(v/v))用于填充。通过将凝胶材料沉淀两天，在没有压力下填充柱子。凝胶已完全沉淀后，以0.5ml/min(0.64cm/min)的流速用5CV漂洗柱子。随后，将柱子进行再生。
按实施例4中所述进行层析。
实施例7
羟磷灰石CHT层析
陶瓷材料(CHT 1型和2型)由生产商以固体形式供应。将待填充的量称重，将其悬浮于填装缓冲液CHT 1型、2型中。将CHT在缓冲液中温育数小时以便润湿材料的所有面积。稀凝胶浆料(约20％(v/v))用于填充，将整个浆料填充到柱子中，以1ml/min(1.3cm/小时)的流速填装。凝胶已完全沉淀后，将柱子再生。
按实施例4中所述进行层析。
实施例8
在没有CaCl2的情况下根据本发明的羟磷灰石CHT层析
按实施例7中所述填装柱子，并按实施例4中所述进行层析。
与实施例4相比，使用下述溶液：
第二溶液：20mM TRIS-HCl，5mM CaCl2，0.25M NaCl，9％(v/v)2-丙醇，
pH 6.9±0.2
第三溶液：20mM TRIS-HCl，0.25M NaCl，9％(v/v)2-丙醇，pH 6.9±0.2
第四溶液：10mM TRIS-HCl，pH 6.9±0.2
第五溶液：10mM TRIS-HCl，5mM CaCl2，10mM磷酸钾，pH 6.9±0.2
实施例9
反相HPLC(RP-HPLC)
RP-HPLC材料例如Vydac C4(Vydac，USA)由表面携带C4烷基链的硅胶颗粒组成。由于疏水相互作用促红细胞生成素与该基质结合，用在稀三氟乙酸中的乙腈梯度选择性地洗脱。
在22±4℃的温度，用Merck Prepbar 100分离系统(或等同物)进行制备型HPLC。用Vydac C4材料填装分离柱(100mM×400mM，3.2升)。在使用之前，应用缓冲液A至100％溶剂的梯度数次将柱子再生，随后用缓冲液A平衡。用三氟乙酸将羟磷灰石柱的洗脱液酸化至pH约2.5，过滤灭菌。之后，在22±4℃的温度和250-310ml/min的流速下将促红细胞生成素吸附到柱子上。在相同的温度和流速下，用缓冲液A至缓冲液B的线性梯度洗脱柱子。收集各馏分的洗脱峰。通过加入4体积HPLC稀释缓冲液将洗脱液立即中和。
将分析型HPLC中纯度为至少99％的馏分汇合(汇合体积约4-6升)。
在该层析中分离痕量杂质，达到99％以上的纯度。
缓冲液A：在水中0.1％三氟乙酸
缓冲液B：在水中80％乙腈、0.1％三氟乙酸
HPLC稀释缓冲液：10mM磷酸钠/磷酸钾，pH 7.5±0.2
实施例10
DEAE Sepharose FF层析
DEAE Sepharose Fast Flow(Pharmacia)由与琼脂糖珠的表面共价结合的DEAE基团组成。由于离子相互作用促红细胞生成素与该基质结合，并通过增加离子强度而被洗脱。
用每克在适用样品中的促红细胞生成素100-200ml凝胶填充层析柱(Amicon P90×250或等同物)，然后用0.5M NaOH再生。随后用100mMNa/K缓冲液(pH 7.5)平衡柱子，接着用至少12 CV平衡缓冲液平衡。在5±4℃的温度和约150ml/min的流速下，将HPLC柱的洗脱液吸附到柱子上。在相同的温度和流速下，用至少5CV平衡缓冲液、然后用约10CV洗涤缓冲液洗涤柱子。随后，用约10CV平衡缓冲液再洗涤柱子，用约7CV洗脱缓冲液洗脱促红细胞生成素。收集完整的蛋白峰(约2-5升)，过滤灭菌，然后分配。
在此层析中，分离来自HPLC步骤的溶剂并除去痕量杂质。纯度为99％以上。
平衡缓冲液：10mM磷酸钠/磷酸钾，pH 7.5±0.2
洗涤缓冲液：30mM乙酸钠，pH 4.5±0.1
洗脱缓冲液：10mM磷酸钠/磷酸钾，80mM NaCl，pH 7.5±0.2。

Claims (4)

1.用于纯化促红细胞生成素的方法，其包括：
a)提供含有i)促红细胞生成素和ii)钙离子的第一溶液：20mM TRIS-HCl、5mM CaCl2，pH6.9±0.2，
b)提供包含含有陶瓷羟磷灰石的固定相的层析柱，
c)将第二溶液：20mM TRIS-HCl、5mM CaCl2、0.25M NaCl、9％(v/v)2-丙醇，pH 6.9±0.2，施加到b)的柱子上，
d)将a)的溶液施加到c)中所得的柱子上，
e)将第三溶液：20mM TRIS-HCl、0.25M NaCl、9％(v/v)2-丙醇，pH 6.9±0.2，施加到d)中所得的柱子上，和
f)通过将第四溶液：10mM TRIS-HCl，pH 6.9±0.2，施加到e)中所得的柱子上而回收纯化的促红细胞生成素。
2.使用如下顺序的层析步骤生产促红细胞生成素的方法：
i)亲和层析、
ii)疏水相互作用层析、
iii)在含有陶瓷羟磷灰石的固定相上层析，其包括：
a)提供含有(1)促红细胞生成素和(2)钙离子的第一溶液：20mM TRIS-HCl、5mM CaCl2，pH 6.9±0.2，
b)提供包含含有陶瓷羟磷灰石的固定相的层析柱，
c)将第二溶液：20mM TRIS-HCl、5mM CaCl2、0.25M NaCl、9％(v/v)2-丙醇，pH 6.9±0.2，施加到b)的柱子上，
d)将a)的溶液施加到c)中所得的柱子上，
e)将第三溶液：20mM TRIS-HCl、0.25M NaCl、9％(v/v)2-丙醇，pH 6.9±0.2，施加到d)中所得的柱子上，和
f)通过将第四溶液：10mM TRIS-HCl，pH 6.9±0.2，施加到e)中所得的柱子上而回收纯化的促红细胞生成素。
3.生产促红细胞生成素的方法，其包括培养含有编码EPO的核酸的细胞并从细胞或培养基中分离促红细胞生成素，其特征在于促红细胞生成素的分离包括下列步骤：
i)将细胞上清液施加到亲和层析材料上，并回收/收集含有促红细胞生成素的馏分，
ii)任选地将来自i)的含有促红细胞生成素的馏分施加到疏水相互作用层析材料上，并回收/收集含有促红细胞生成素的馏分，
iii)将来自i)或ii)的含有促红细胞生成素的馏分施加到含有陶瓷羟磷灰石的固定相上进行层析，其包括：
a)提供含有(1)促红细胞生成素和(2)钙离子的第一溶液：20mM TRIS-HCl、5mM CaCl2，pH 6.9±0.2，
b)提供包含含有陶瓷羟磷灰石的固定相的层析柱，
c)将第二溶液：20mM TRIS-HCl、5mM CaCl2、0.25M NaCl、9％(v/v)2-丙醇，pH 6.9±0.2，施加到b)的柱子上，
d)将a)的溶液施加到c)中所得的柱子上，
e)将第三溶液：20mM TRIS-HCl、0.25M NaCl、9％(v/v)2-丙醇，pH 6.9±0.2，施加到d)中所得的柱子上，和
f)通过将第四溶液：10mM TRIS-HCl，pH 6.9±0.2，施加到e)中所得的柱子上而回收纯化的促红细胞生成素。
4.生产单-聚乙二醇化促红细胞生成素的方法，其包括下列步骤：
i)使用根据权利要求1至2之一的方法纯化促红细胞生成素；
ii)使用分子量为20kDa至40kDa的活化PEG将促红细胞生成素聚乙二醇化，
iii)用采用相同固定相的两个连续的阳离子交换层析步骤，纯化步骤ii)中所得的聚乙二醇化促红细胞生成素，
iv)回收并由此从第二固定相中生产单-聚乙二醇化促红细胞生成素。
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