JP6416738B2 - エリスロポエチンの精製 - Google Patents
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Description
i)0.5mM〜20mM濃度でカルシウムイオンを含有するエリスロポエチン含有溶液を、同濃度0.5mM〜20mMでカルシウムイオンを含有する溶液で平衡化したヒドロキシアパタイトを含有する固定相と接触すること、
ii)0.5mMを下回る濃度のカルシウムイオンを含有する溶液を、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相を通過すること、
iii)0.5mMを下回る濃度のカルシウムイオンを含有する溶液を、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相を通過させ、それによりエリスロポエチンを生産すること、
を含む、エリスロポエチンの生産方法である。
(a)細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー材料に適用すること、およびエリスロポエチンを含有する画分を回収/収集すること、
(b)場合により、(a)の画分を疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に適用すること、およびエリスロポエチンを含有する画分を回収/収集すること、
(c)(a)または(b)の画分を、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相に適用すること、および本発明方法を利用してエリスロポエチンを含有する画分を回収/収集すること、
(d)(c)の画分を濃縮しまたは/そして逆相HPLC材料を通過させること
a)活性化ポリ(エチレングリコール)試薬を用いてエリスロポエチンを共有結合させ、即ちPEG化すること、
b)このポリ(エチレングリコール)コンジュゲート化エリスロポエチンを、2つの連続する陽イオン交換クロマトグラフィー工程によって精製すること、およびそれによりポリ(エチレングリコール)コンジュゲート化エリスロポエチンを生産すること、
を含む、ポリ(エチレングリコール)コンジュゲート化エリスロポエチンを生産する方法であって、
工程a)で使用されるエリスロポエチンは、本発明方法により取得する、ポリ(エチレングリコール)コンジュゲート化エリスロポエチンを生産する方法である。
異なった物質がクロマトグラフィーによって相互に分離できるかどうかは、特に、そのクロマトグラフィーが実施される条件、加えて良好なカラム充填およびクロマトグラフィー材料(固定相)の選択に依存する。これには、緩衝系の選択に加えて、不純物および生成物が溶離される様式が包含される。
i)第一濃度のカルシウムイオンを含有する、精製すべきエリスロポエチン溶液を、第二濃度のカルシウムイオンを含有する或る容量の溶液を通過させた、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相と接触させること、
ii)i)由来の溶液より低い濃度、即ち第三濃度のカルシウムイオンを含有する或る容量の溶液を、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相に通すこと(それにより、この通過の間、エリスロポエチンは、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相に結合したままであり/ヒドロキシアパタイトを含有する固定相から分離されない)、および、
iii)0.5mMを下回る、即ち第四濃度のカルシウムイオンを含有する或る容量の溶液を、ii)由来のヒドロキシアパタイトを含有する固定相を通過させること(それにより、エリスロポエチンが、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相から分離され溶出する)、
を含む、ヒドロキシアパタイトを含有する固定相を伴う少なくとも1つのクロマトグラフィー工程を含む、エリスロポエチンの精製方法を報告するものである。
i)a)エリスロポエチンおよび第一濃度でカルシウムイオンを含有する第一溶液を提供すること、
b)第二濃度でカルシウムイオンを含有する、或る容量の第二溶液を通過させた、ヒドロキシアパタイト含有固定相を提供すること(平衡化工程)、
c)a)の溶液をb)で得られた固定相に適用すること、
ii)第一および第二溶液よりも低い第三濃度のカルシウムイオンを含有する第三溶液を、工程i)で得られたヒドロキシアパタイトを含有する固定相を通過させること(洗浄工程)、および、
iii)0.5mMまたはそれ以下のカルシウムイオンを含有する第四溶液の或る容量を、ii)由来のヒドロキシアパタイト含有固定相を通過させること、それにより、ヒドロキシアパタイト含有固定相からエリスロポエチンを分離回収すること、およびこのことによって精製エリスロポエチンを得ること(溶出工程)、
を含む。
a)細胞培養上清または破砕した細胞懸濁液の上清をアフィニティークロマトグラフィー材料に適用すること、およびエリスロポエチンを含有する画分を回収/収集すること、
b)場合により、工程a)で得られたエリスロポエチン含有画分を疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に適用すること、およびEPOを含有する画分を回収/収集すること、
c)a)またはb)のEPOを含有する画分をヒドロキシアパタイトを含有する固定相に適用すること、本発明方法を使用してエリスロポエチン含有画分を回収/収集すること、および、
d)c)のEPOを含有する画分を、濃縮しまたは/そして逆相HPLC材料に適用すること、
を含む。
a)20kDa〜40kDaの分子量を有する活性化PEG試薬を使用することによりエリスロポエチンをポリ(エチレングリコール)にコンジュゲートさせ(エリスロポエチンのPEG化)、
b)工程a)で得られたPEG化エリスロポエチンを、各々同じ固定相で異なる溶離法を用いる2種類の連続的陽イオン交換クロマトグラフィー工程で精製し、
c)第二固定相からPEG(ポリ(エチレングリコール))にコンジュゲートしたエリスロポエチンを単離する、
を含む、1個のポリ(エチレングリコール)ポリマーに共有結合したエリスロポエチン(モノ−PEG化エリスロポエチン)を生産する方法である。
配列番号1 165残基のアミノ酸配列を有するヒトエリスロポエチン。
配列番号2 166残基のアミノ酸配列を有するヒトエリスロポエチン。
クロマトグラフィーのための緩衝液
溶液は全て保存溶液から調製した。別途記載の無い限り、全ての緩衝液のpHを1M NaOHまたは1M HClで調節した。II型超純水(ミリQ水)を常に使用した。
1mol/lリン酸カリウム緩衝液、pH6.9±0.2、
1mol/lトリス(ヒドロキシアミノメタン)緩衝液(TRIS−HCl)、pH6.9±0.2、
5mol/l塩化ナトリウム、
1mol/l塩化カルシウム、
10mol/l水酸化ナトリウム。
標準洗浄緩衝液: 20mMTRIS−HCl、5mMCaCl2、
pH6.9±0.2
充填緩衝液HAウルトロゲル/ファストフロー:
20mMTRIS−HCl、5mMCaCl2、
pH6.9±0.2
充填緩衝液CHT: 200mMリン酸カリウム、
pH9〜10
再生緩衝液1 HAウルトロゲル:
200mMリン酸カリウム、0.1mMCaCl2、
pH6.9±0.2
再生緩衝液1 CHT、ファストフロー:
200mMリン酸カリウム、
pH6.9±0.2
アルカリ性再生: 0.5M NaOH
平衡緩衝液: 20mMTRIS−HCl、5mMCaCl2、
0.25M NaCl、9%(v/v)2−プロパノール、
pH6.9±0.2
洗浄緩衝液: 10mMTRIS−HCl、5mMCaCl2、
pH6.9±0.2
溶離緩衝液: 10mMTRIS−HCl、0.5mMCaCl2、
10mMリン酸カリウム、
pH6.9±0.2
分析用RP−HPLC:
溶離液A:0.1%TFA(トリフルオロ酢酸)、水
溶離液B:0.1%TFA、70%アセトニトリル、水
タンパク質決定A280:
10mMリン酸Na/K、0.1mol/lNaCl、pH7.5±0.2
光路長1cmの水晶キュベットを使用した。試料を、測定される吸光度が0.2〜1.0AUとなるよう希釈した。希釈が必要な場合、試料を相互に独立して希釈し、トリプリケートで測定した。希釈しなかった試料は1回の測定で決定した。エリスロポエチン最終生成物緩衝液を試料の希釈およびブランク測定に使用した。
1)0.1%溶液の吸光係数:ε=1.25ml・(mg・cm)−1
2)試料の希釈係数
m[g]=c[mg/ml]・V[L]
RP−HPLC(逆相高速液体クロマトグラフィー)において、全ての試料は溶離液Aで最大濃度0.12mg/mlに希釈した。タンパク質濃度は280nmの光度測定により決定した。試料の分析に先立ち100%溶離液Aの試料4個を注入した。このことによりカラムが完全に平衡化されていることを確実とした。エリスロポエチンリファレンス標準を、試料の連続分析の開始時および終了時に分析した。偏位を回避するため、クロマトグラムを標準化積分法で解析した。基線に垂直な線を引くことにより各ピークを相互に分離した。
ELISA試験(酵素結合免疫吸着アッセイ)によってCHO細胞タンパク質を測定した。ここではストレプトアビジン/ビオチン技術に基づくサンドイッチ法を利用した。このアッセイにはストレプトアビジン被覆したマイクロタイタープレートを使用した。CHO細胞タンパク質に対する抗体を、ビオチンによってこのプレートに結合させた。分析しようとする試料溶液を、15〜150ng/mlのCHOタンパク質濃度でピペットにより添加した。濃度が15ng/mlを下回った場合、その試料をCHOタンパク質を含まないとみなした。濃度が150ng/mlを超えた場合には、より高希釈で試験を反復した。
キャピラリー電気泳動によってイソ型分布を決定した。この分析のため、試料を水中で透析濾過した。続いてそのキャピラリーを電解質溶液ですすぎ、その後、希釈試料をキャピラリー内に適用した。25000Vの高電圧をかけることにより分離した。移動相緩衝液は過剰の陽イオンを有し、それが電気浸透流をもたらした。水晶のキャピラリーの使用が、キャピラリー中のタンパク質の光度検出およびピーク面積による定量を可能にした。
糖の分析には酵素試験法を利用した。この方法では、エリスロポエチンのN−グリコシド結合したオリゴ糖を酵素N−グリコシダーゼで開裂させた。さらに、酵素ノイラミニダーゼの助けを借りてこのオリゴ糖からシアル酸を除去した。得られたN−オリゴ糖を陰イオン交換体を用いて分離および分析した。試料と全く同じ方法で処理したエリスロポエチンリファレンス標準を、一連の試験の最中に測定した。以下の糖構造が検出された:バイアンテナリー、トリアンテナリー、トリアンテナリー1リピート、テトラアンテナリー、テトラアンテナリー1リピート、テトラアンテナリー2リピート。
SE−HPLCのため、分離を開始する前に、クロマトグラフィーカラムを3〜5カラム容量(CV)の緩衝液で平衡化し、余分なピークの無い均一な基線を得た。試料を0.2mg/ml濃度に希釈し、SE−HPLCに注入した。標準法に従いピークを積分した。垂線を降ろすことによりピークを相互に分離した。
ビオチンをマイクロタイタープレートに結合させた。ストレプトアビジン、一本鎖DNAおよびビオチン化一本鎖DNA結合タンパク質の反応混合物を添加した。この結合タンパク質はDNAに結合でき、ビオチン化された。このようにして試料混合物からDNAを特異的に除去することが可能となった。ストレプトアビジンは、マイクロタイタープレート上のビオチンおよび一本鎖DNA結合タンパク質にカップリングしたビオチンに結合した。この全複合体に、ウレアーゼにカップリングさせたDNA特異抗体を加えた。尿素を添加すると尿素の加水分解が導かれ、それがpHの局所的変化を惹起した。この変化は表面電位の変化として検出され得る。表面電位の変化は結合しているDNAの量に比例した。一本鎖DNAは、プロテイナーゼK消化およびSDSによる変性により得られた。
de−O−EPOおよびde−N−EPOのような不完全にグリコシル化されたエリスロポエチン種はペプチドマッピングによって定量できる。この目的のため、エリスロポエチン分子をエンドプロテイナーゼLys−Cによりペプチドへと開裂し、これらのペプチドをHPLCで分離した。得られたペプチドパターンをリファレンス標準と比較した。得られた結果を、ピークサイズ、ピークの外観および保持時間について標準と比較した。
CHO細胞におけるエリスロポエチンの組換え生産
EPOをバッチ法によってCHO細胞において生産した。発酵槽に前培養を接種し、約5日後、この発酵槽の内容物を収穫する。無傷のCHO細胞および細胞フラグメントを遠心分離により発酵上清から除去した。この無細胞培養上清のpHを酢酸(1mol/l)でpH5.0〜5.2に調節し、その後このpH調節した溶液を1〜9℃で濾過した。基本培地DME(HG)HAMのF−12改変(R5)(GRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, USA, Order No. 57-736)、炭酸水素ナトリウム、L−(+)グルタミン、D−(+)グルコース、組換えインスリン、亜セレン酸ナトリウム、ジアミノブタン、ヒドロコルチゾン、硫酸鉄(II)、アスパラギン、アスパラギン酸、セリンおよびポリビニルアルコールで構成される無血清培地を培養として使用した。
ブルーセファロースクロマトグラフィー
ブルーセファロース(Pharmacia)は、色素Cibachron(登録商標)ブルーを共有結合させたセファロースビーズで構成される。エリスロポエチンは、低イオン強度および中性ないし酸性pH値でこの支持体に結合する。エリスロポエチンはイオン強度およびpH値を上げることにより溶出する。
pH5.0±0.2
洗浄緩衝液1: 20mM 酢酸Na、5mM CaCl2、0.25M NaCl、
pH5.0±0.2
洗浄緩衝液2: 20mMTRIS−HCl、5mM CaCl2、
pH6.5±0.3
溶離緩衝液: 100mMTRIS−HCl、5mM CaCl2、1M NaCl、
pH9.0±0.2
ブチルトヨパールクロマトグラフィー(疎水性クロマトグラフィー)
ブチルトヨパール(Tosoh Haas)は、表面にブチル残基が共有結合している支持体である。エリスロポエチンはこのマトリックスに結合し、2−プロパノールを含有する緩衝液で溶出される。
10% 2−プロパノール、pH6.9±0.2
洗浄緩衝液: 20mMTRIS−HCl、5mM CaCl2、0.75M NaCl、
19% 2−プロパノール、pH6.9±0.2
溶離緩衝液: 20mMTRIS−HCl、5mM CaCl2、0.75M NaCl、
27% 2−プロパノール、pH6.9±0.2
希釈緩衝液: 20mMTRIS−HCl、5mM CaCl2、
pH6.9±0.2
第一溶液: 20mMTRIS−HCl、5mM CaCl2、0.25M NaCl、
9%(v/v)2−プロパノール、pH6.9±0.2
ヒドロキシアパタイトを含有する固定相によるクロマトグラフィー
現行の工程条件に対する適切な比較を可能とするため、ヒドロキシアパタイトを含有する各固定相による分離において、同じ基本法の工程を利用した。その順序は、
再生 − 平衡化 − 分離 − 再生、
であった。
標準洗浄緩衝液: 20mMTRIS−HCl、5mM CaCl2、
pH6.9±0.2
充填緩衝液HAウルトロゲル/ファストフロー:
20mMTRIS−HCl、5mM CaCl2、
pH6.9±0.2
充填緩衝液CHT: 200mMリン酸カリウム、
pH9−10
再生緩衝液1 HAウルトロゲル:
200mMリン酸カリウム、0.1mM CaCl2、
pH6.9±0.2
再生緩衝液1 CHT、ファストフロー:
200mMリン酸カリウム、
pH6.9±0.2
アルカリ性再生: 0.5M NaOH
平衡化緩衝液: 20mMTRIS−HCl、5mM CaCl2、
0.25M NaCl、
9%(v/v)2−プロパノール、
pH6.9±0.2
洗浄緩衝液: 10mMTRIS−HCl、5mM CaCl2、
pH6.9±0.2
溶離緩衝液: 10mMTRIS−HCl、0.5mM CaCl2、
10mMリン酸カリウム、
pH6.9±0.2
ヒドロキシアパタイトウルトロゲルクロマトグラフィー
ヒドロキシアパタイトウルトロゲル(BioSepra)は、その機械的および流体力学的性質を改善するためにアガロース骨格に組み込まれたヒドロキシアパタイトで構成される。エリスロポエチンはこのマトリックスに結合し、殆どのタンパク質性不純物よりも低いリン酸濃度で溶出する。
pH5.0±0.2
洗浄緩衝液1: 20mM酢酸Na、5mM CaCl2、0.25M NaCl、
pH5.0±0.2
洗浄緩衝液2: 20mMTRIS−HCl、5mM CaCl2、
pH6.5±0.3
溶離緩衝液: 100mMTRIS−HCl、5mM CaCl2、1M NaCl、
pH9.0±0.2
ヒドロキシアパタイトファストフロークロマトグラフィー
この材料は製造者から固体で供給された。適当量の材料を秤量し、標準洗浄緩衝液に懸濁した。粒子の表面全体を濡らすため、粉末を緩衝液中で数時間インキュベートした。希薄なゲルスラリー(約20%(v/v))を充填に使用した。このゲル材料を2日間沈殿させることにより、圧力をかけずにカラムに充填した。ゲルが完全に沈殿した後、カラムを流速0.5ml/分(0.64cm/分)で5CVによりすすいだ。その後カラムを再生した。
ヒドロキシアパタイトCHTクロマトグラフィー
このセラミック材料(CHT1型および2型)は製造者から固体で供給された。満たすべき量を秤量し、充填緩衝液CHT1、2型に懸濁した。この材料の全面を濡らすため、CHTを充填緩衝液中で数時間インキュベートした。希薄なゲルスラリー(約20%(v/v))を充填に使用し、スラリー全体をカラムに満たし、流速1ml/分(1.3cm/時)で充填した。ゲルが完全に沈殿した後、カラムを再生した。
CaCl2を使用しない、本発明に係るヒドロキシアパタイトCHTクロマトグラフィー
実施例7に記載のようにカラムを充填し、実施例4に記載のようにクロマトグラフィーを実施した。
第二溶液: 20mMTRIS−HCl、5mM CaCl2、0.25M NaCl、
9%(v/v)2−プロパノール、pH6.9±0.2
第三溶液: 20mMTRIS−HCl、0.25M NaCl、
9%(v/v)2−プロパノール、pH6.9±0.2
第四溶液: 10mM TRIS−HCl、pH6.9±0.2
第五溶液: 10mM TRIS−HCl、5mM CaCl2、
10mMリン酸カリウム、pH6.9±0.2
逆相HPLC(RP−HPLC)
RP−HPLC材料、例えばヴィダックC4(Vydac, USA)は、その表面にC4アルキル鎖を担持するシリカゲル粒子で構成されている。エリスロポエチンは疎水性相互作用の結果このマトリックスに結合し、希トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配で選択的に溶出される。
緩衝液B: 80%アセトニトリル、水中0.1%トリフルオロ酢酸
HPLC希釈緩衝液: 10mM リン酸Na/K、pH7.5±0.2
DEAEセファロースFFクロマトグラフィー
DEAEセファロースファストフロー(Pharmacia)は、セファロースビーズ表面に共有結合させたDEAE基で構成されている。エリスロポエチンはイオン相互作用の結果このマトリックスに結合し、イオン強度を上げることにより溶離する。
洗浄緩衝液: 30mM酢酸Na、pH4.5±0.1
溶離緩衝液: 10mMリン酸Na/K、80mMNaCl、pH7.5±0.2
Claims (4)
- エリスロポエチン1分子あたりそれぞれ8〜15のシアル酸残基を有する8種類のエリスロポエチンを含み、テトラアンテナリー:トリアンテナリー:バイアンテナリーグリコシル型の比が83:14:2〜74:21:6の範囲である、エリスロポエチンイソ型の混合物であることを特徴とする、エリスロポエチン。
- エリスロポエチン1分子あたりそれぞれ8〜15のシアル酸残基を有する8種類のエリスロポエチンを含み、テトラアンテナリーグリコシル型:1リピートを有するテトラアンテナリーグリコシル型:2リピートを有するテトラアンテナリーグリコシル型:トリアンテナリーグリコシル型:1リピートを有するトリアンテナリーグリコシル型:バイアンテナリーグリコシル型の比率が43:28:12:8:6:2〜45:21:7:14:7:6の範囲である、エリスロポエチンイソ型の混合物であることを特徴とする、エリスロポエチン。
- 請求項1または請求項2に記載のエリスロポエチンを含有する医薬組成物。
- 薬学的希釈剤、助剤および/または担剤と共に、請求項1または請求項2に記載のエリスロポエチンを含有する医薬組成物。
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