JP4234647B2 - 高い比活性を有するエリスロポエチン - Google Patents

Description

本発明は、その炭水化物構造においてＮ−アセチルラクトサミン単位及び／又は４アンテナ分枝の高含量によって特徴づけられる高い比活性を有する新規EPO組成物に関する。本発明はまた、その様なEPO製品の単離法に関する。

エリスロポエチン（EPO）は赤血球細胞の産生を刺激するヒト糖タンパク質である。EPOは健康な人の血液血漿において、非常に低濃度だけ発生するので、この様により多くの量を提供する事は可能ではない。EP-B1-0 148 605及びEP-B1-0 205 564はCHO細胞における組換えヒトEPOの製造を記載する。EP-B1-0 148 605において記載されたEPOは尿EPO及び非Oグリコシル化のものより高い分子量を有する。CHO細胞由来のBP-B1-0 205 564において記載されたEPOは大量において及び純粋形態において現在入手可能である。
更に無形成貧血を有する患者の尿からのヒトEPOの単離が知られている（Miyake et al., J. Biol. Chem. 252 (1977), 5558〜5564）。

組換え及び尿のEPOはそれらのシアル化の値において異なることが知られている様々なイソ型の混合物として単離される。これらのEPOのイソ型は異なる等電点を有し、そして等電点電気泳動又はキャピラリー電気泳動（Tsao et al., Biotech. Bioeng. 40 (1992), 1190-1196 ; Nieto et al., Anal. Commun. 33(1996), 425-427 ; Tran et al., J. Chromatogr. 542 (1991), 459-471 ; Bietot et al., J. Chromatogr. 759 (1997), 177-184 ; Watson et al., Anal. Biochem. 210 (1993), 389-393 参照）によって分離されうる。最も大きな数のシアル酸を有するイソ型は最も高い比活性を有し、一方最も少ない数を有するそれらは最も低い活性を有する（例えばImai et al., Eur. J. Biochem. 194 (1990),457-462 ; EP-A-0 428 267参照）。

Takeuchiらは（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 7819-7822)、前記生物学的活性とシアル酸含量と２アンテナ及び４アンテナの炭水化物構造の比率との関係を記述している。Takeuchiらは、更にEPOの炭水化物構造におけるＮ−アセチルラクトサミン単位の存在が前記生物学的活性と相互に関係していない事を結論づけている。

Fukudaらは（Blood 73 (1989),84〜89）、前記生物学的活性に重要な貢献をする血液循環由来のEPOの排出速度を扱い、そして比較的多量のＮ−アセチルラクトサミン単位を有するEPOが、ラクトサミン単位を有していないEPOよりも前記循環からより素速く除去される事を結論づけている。Morimotoらは（Glycoconjugate J. 13 (1996),1093〜1120）、mono-QクロマトグラフィーによるEPOのイソ型の分離、そしてその個々の画分が２、３のイソ型のみから成っている事を記述している。これらの画分で行われた前記研究は、全ての画分における全ての構造の平衡を示している。相互関係が２アンテナ若しくは４アンテナの構造の含量又はＮ−アセチルラクトサミン単位の含量と前記比活性の間に見出されなかった。

この様に前記従来技術はシアル酸の含量に関して、特に前記糖構造と前記生物学的活性の一般的な相互関係がある事を示している。しかしながら、４アンテナ構造の含量及び／又はＮ−アセチルラクトサミンの含量が直接前記生物学的活性と相互関係している事は全く記載が無い。
EPO調製品を精製するとき、驚くことに炭水化物構造における４アンテナ炭水化物構造及び／又はＮ−アセチルラクトサミン単位の増大が前記特異的な生物学的活性の有意な改良を引き起こす事が明らかにされた。これは、EPOが欧州適用97 112 640.4に従うヒト細胞系において製造される場合に特に適用可能である。

個々のEPO調製品又はＮ−アセチルラクトサミン単位（LE単位）の含量において本質的にわずかに異なる炭水化物構造のEPOイソ型の比較活性の研究は、前記調製品又は同一のシアル酸含量及びほぼ同一のアンテナ度の値のＮ−アセチルラクトサミン単位の高含量を有するイソ型の更に有意に高い活性を示している。この関連において、アンテナ度は、前記EPO調製品の２アンテナ、３アンテナ及び４アンテナのＮ結合炭水化物鎖の、又はＮ結合炭水化物鎖の総数に関する前記単離EPOのイソ型の、相対的平均含量（in％）として理解される。

更に、４−アンテナ構造の含量が高められたものを有する調製品又はイソ型において特に、ラクトサミン単位の全含量がin vivo活性において非常に重要である事を明らかにした。Ｎ−アセチルラクトサミン単位の全含量における増加、例えばＬＥ単位を有するその核構造の付加的な伸長の形態（いわゆる繰り返し）における増加は前記生物学的活性を相当増大することができる。更に４アンテナ構造の含量における増大が前記生物学的活性を改善しうる事が明らかにされた。

故に、最大限可能な高い比活性を有し及び高収率のEPの製造を試みるならば、それに続く精製段階、製造細胞及び／又はその培養は４アンテナ炭水化物構造の最大限可能な高い含量及び／又はＮ−アセチルラクトサミン単位の最大限可能な高い含量を達成するために選択及び最適化されなければならない。
本発明の第一の観点は炭水化物鎖の総数、すなわち２アンテナ、３アンテナ及び４アンテナ構造の合計に関して少なくとも75％、好ましくは少なくとも80％、特に好ましくは少なくとも85％及び最も好ましくは少なくとも90％の４アンテナ構造の比率を含むグリコシル化されたEPO分子から本質的に成るEPO組成物に関する。

本発明の更なる観点は、EPO分子のＮ結合炭水化物鎖当たりの前記平均組成物に関して少なくとも3.7、好ましくは少なくとも4.0、特に好ましくは少なくとも4.3及び最も好ましくは少なくとも4.5のＮ−アセチルラクトサミン単位の平均数又はEPO分子の全ての3N結合炭水化物構造（全Ｎグリコシル化）に関して少なくとも11.1、好ましくは少なくとも12.0、特に好ましくは少なくとも13.0及び最も好ましくは少なくとも13.5のＮ−アセチルラクトサミン単位数を含むグリコシル化されたEPO分子から本質的に成るEPO組成物に関する。

本発明の更なる観点は、EPO分子当たりのＮ−アセチルラクトサミン単位の平均総数にEPOの分子当たりの平均シアル酸含量を掛けた積が少なくとも130、好ましくは少なくとも135、特に好ましくは少なくとも140及び最も好ましくは少なくとも160の値を有するグリコシル化されたEPO分子から本質的に成る、EPO組成物に関する。
この文脈において“本質的に”の語は前記所望のEPO分子がその組成物におけるEPO分子の総数に関して好ましくは少なくとも80％、特に好ましくは少なくとも90％及び最も好ましくは少なくとも95％の比率において存在する事を意味する。

本発明のより更なる観点は炭水化物鎖の総数に関して少なくとも75％、好ましくは少なくとも80％及び特に好ましくは少なくとも85％の平均比率の４アンテナ構造を有するグリコシル化されたEPO分子から成るEPO組成物に関する。
更に本発明はEPO分子のＮ結合炭水化物鎖当たりの組成物の平均に関して少なくとも3.7、好ましくは少なくとも4.0並びに特に好ましくは少なくとも4.3及び最も好ましくは少なくとも4.5の平均数のＮ−アセチルラクトサミン単位を有し、又はEPO分子の全ての3N結合炭水化物構造に関して少なくとも11.0、好ましくは少なくとも12.0、特に好ましくは少なくとも13.0及び最も好ましくは少なくとも13.5の数のＮ−アセチルラクトサミン単位を含むグリコシル化されたEPO分子から成るEPO組成物に関する。

４アンテナ構造の最大比率は、各々の４アンテナ構造がＮ結合糖の核構造において４個のＮ−アセチルラクトサミン単位を含む場合、全炭水化物鎖の100％に達することができる。いわゆる繰り返しの様に核構造の伸長を生じる付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位は炭水化物構造当たりのＮ−アセチルラクトサミン数並びにグリコシル化の総数を増大することができる。グリコシル化部位当たりの（すなわちＮ結合炭水化物構造当たりの）Ｎ−アセチルラクトサミン単位の数は６（繰り返しの形態における４アンテナ構造及び２つの付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位）まで達することができ、又は（２つの付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位以上有する場合において）それより多くなりうる。Ｎ−アセチルラクトサミン単位の数はグリコシル化の総数（３Ｎ結合炭水化物構造）に関して18又はそれ以上になりうる。

本発明のより更なる観点は、EPO分子のＮ−アセチルラクトサミン単位の平均総数にEPOの分子当たりの平均シアル酸含量を掛けた積が少なくとも130、好ましくは少なくとも135、特に好ましくは少なくとも140及び最も好ましくは少なくとも160の平均値を有するグリコシル化された分子から成るEPO組成物に関する。
本発明の更なる主題は前記の観点の少なくとも２又はそれ以上の形態を有するEPO組成物である。

本発明に従う組成物は１又は複数のイソ型すなわち等電点電気泳動において異なる等電点を有するEPO分子から成りうる。本発明に従う組成物は少なくとも２つの、例えば２〜５つのイソ型の混合物、特に３又は４つのイソ型の混合物を好ましくは含んで成る。
本発明に従う組成物の比活性はin vivo（正血球状態のマウス）で好ましくは少なくとも175,000 IU/mg、特に200,000 IU/mgである。前期比活性は特に好ましくは約200,000〜400,000 IU/mg又は450,000 IU/mgタンパク質の範囲内、最も好ましくは250,000〜400,000 IU/mg又は450,000 IU/mgタンパク質の範囲内である。

本発明に従う前記組成物において、平均シアル酸含量又はEPOの分子当たりのシアル酸残基の平均数は好ましくは11〜14、特に好ましくは少なくとも11.5及び最も好ましくは少なくとも12.5である。
本発明に従う前記EPO組成物は、一方で、哺乳類の細胞、例えば齧歯類の細胞、例えば、EP-B-0 205 564に記載のCHO又はBHKにおける外来DNAの発現の産物であるEPO分子から得ることができる。あるいは、前記組成物は、ヒト細胞、例えばNamalwa (Nadkarni et al., Cancer 23 (1969),64-79), HT1080 (Rasheed et al., Cancer 33 (1973), 1027-1033)又はHeLa S3(Puck et al., J. Exp. Meth. 103 (1956), 273-284)の様な不死化された細胞における遺伝子活性の後の、内因性DNAの発現の産物であるEPO分子からも成りうる。この様な方法は欧州特許適用97 112 640.4に記述され、その開示は本発明の適用の部分を成す。

EPOの生物学的活性のための更に重要なパラメーターは、Ｎ結合炭水化物鎖の総数に関する繰り返し、すなわち付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位を有する炭水化物鎖の比率、及びこの繰り返しの比率と炭水化物鎖の総数に関する４アンテナ炭水化物鎖の比率との積の値である。CHO細胞由来のEPOの場合において、繰り返しの比率は好ましくは少なくとも30％、特に好ましくは少なくとも35％及び最も好ましくは少なくとも40％である。ヒト細胞、例えばHeLa細胞由来のEPOの場合には、繰り返しの比率は好ましくは少なくとも10％、特に好ましくは少なくとも12％及び最も好ましくは少なくとも14％である。

故に、CHO細胞由来のEPOの場合には、炭水化物鎖の総数に関するＮ−アセチルラクトサミン繰り返しを持つ炭水化物鎖の比率と炭水化物鎖の総数に関する４アンテナ構造の比率との積の値は好ましくは少なくとも2400、特に好ましくは少なくとも2800及び最も好ましくは少なくとも3400である。ヒト細胞由来のEPOの場合には、前記値は好ましくは少なくとも800、特に好ましくは少なくとも960及び最も好ましくは少なくとも1100である。
EPO組成物は、低含量の血清、例えば最大１％（V/V）を含む培養培地において又は特別に無血清培地において（このWO96/35718を参照）EPO製造細胞を培養することにより製造されてきたものが好ましくは使用される。適当な培養培地の例はRPMI1640又はDMEMである。

本発明に従うEPO組成物は一般の医薬希釈剤、補助物質及び担体と任意に一緒の医薬調製品として調製されうる。医薬調製品を製造するために使用されうる本発明に従うEPO組成物は、逆層HPLC（例えばVydac C4カラム使用）及び／又はサイズ排除クロマトグラフィー（例えばTSK2000SW Ultrapacカラム使用）によって決定された好ましくは少なくとも99％及び特に好ましくは少なくとも99.9％の純度を有する。
更に、本発明に従う組成物は、10,000 IUタンパク質当たりのDNAが好ましくは10pg以下、特に好ましくは５pg以下及び最も好ましくは１pg以下のDNA含量を有する。更に本発明に従う組成物は、好ましくは微生物の夾雑物（１CFU ／ml以下）及びエンドトキシン（1EU/10,000 IUタンパク質）を本質的に含まない。

前記DNA含量は放射活性又は蛍光で標識されたDNAを用いてハイブリダイゼーション試験によって決定されうる。商業的に入手可能な精製されたヒトDNAがそのプローブDNAの例として使用される。前記ヒトDNAは更に前記試験のスタンダードとして使用されうる。その様なハイブリダイゼーション試験の検出の下限は約0.3pg/10,000 IU EPOである。前記EPO調製品の微生物及びエンドトキシンの含量は医薬の欧州又はUS特許に記載の標準化された方法によって決定されうる。

本発明によって所望される前記形態を好ましくは有するEPO組成物は以下の方法：
（ａ）４アンテナ構造及び／又はＮ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有する炭水化物鎖の製造が可能である適当な製造細胞の選択、
（ｂ）４アンテナ構造及び／又はＮ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有する炭水化物鎖を製造するための前記細胞培養のための適当な培養条件の選択、及び
（ｃ）４アンテナ構造及び／又はＮ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有する炭水化物鎖を含むEPO分子の強化の間、EPO分子の知られた組成物からの不所望成分の分離；
の少なくとも１つによって得られる。

方法（ａ）は適当な産生細胞の選択を含んで成る。この場合、ある者は、一方で、前記所望の炭水化物鎖構造を高収率で産生する傾向を有する事が知られている細胞を使用しうる。その様な細胞系の例はハムスター由来の細胞、例えばCHO若しくはBHK及びヒト細胞系由来の、例えばHeLa,Namalwa,HT1080又はそれら由来の細胞系である。HeLa S3細胞又は改良CHO細胞が特に好まれる。

一方、細胞内であるグリコシル化酵素を過剰発現させることによって、例えば組換え体発現によって及び／又は内因性遺伝子の活性によって適当な製造細胞を特に製造することも可能である。その様なグリコシル化酵素の例はシアリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼである。
方法（ｂ）は前記細胞培養における適当な培養条件を含んで成る。本発明の第一の態様において、方法（ｂ）は少なくとも２つ及び好ましくは少なくとも３つの炭水化物の混合物を培養培地に加える事も含んで成る。前記炭水化物は単糖類及び二糖類、例えばグルコース、グルコサミン、リボース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、スクロース、ラクトース、マンノース−１−リン酸、マンノース−１−硫酸及びマンノース−６−硫酸から好ましくは選択される。

栄養培地は例えばグルコース及び／又はマンノース及び／又はガラクトースを含むものが適当である。各々の炭水化物がD（＋）型で特に好ましく使用される場合、例えば1:(0.5-3):(1-5）及び特に1:(0.7-2.4):(1.8-4.0）の質量比の、グルコース、ガラクトース及びマンノースの混合物を含む栄養培地を用いて特に良い結果が得られる。発酵の間の全ての糖類の合計濃度は、前記培養培地において好ましくは0.1〜10g/l、特に好ましくは２〜6g/lである。炭水化物混合物は以下で更に詳細に解明される前記細胞のそれぞれの要求性に依存して好ましくは加えられる。

更に好ましい態様に従い、方法（ｂ）は前記の培養された細胞系のための少なくとも１つの必須アミノ酸及び／又は各々の細胞要求性に依存の少なくとも１つの炭水化物を含んで成る、栄養素の調節された、好ましくは要求性に従う添加を含んで成る。この方法において、多くの改良されたグリコシル化が、高細胞密度発酵（採収時の細胞密度が10×10⁵ 細胞/ml以上及び好ましくは20×10⁵ 細胞/ml以上）にもかかわらず大発酵槽（容積１ｌ以上、例えば50〜10,000ｌ）において得られる。

この目的のために、前記細胞の栄養要求性に関連するパラメーターの濃度は、連続的に又は適当な時間間隔で、例えば少なくとも日に１回決定され、そしてそれらの消費速度が算出される。この事は前記細胞の栄養要求性が定量的に及び／又は定性的に決定される事を可能にする。この様なパラメーターは前記細胞の栄養素又は代謝産物、例えばグルタミン、アンモニウム、グルコース及び／又は乳酸の濃度そして特にグルタミン濃度でありうる。

本発明のこの観点に従って添加された前記栄養素は、必須アミノ酸、例えばグルタミン及び／又はトリプトファン及び／又は炭水化物類並びに好ましくは更に非必須アミノ酸、ビタミン類、微量元素、塩類及び／又は増殖因子、例えばインスリンから成る。前記栄養素は特に好ましくは少なくとも１つの必須アミノ酸及び少なくとも１つの炭水化物を含む。これらの栄養素は溶解状態において培養培地に好ましくは計量しながら加えられる。前記栄養素溶液はグルタミン及び炭水化物類、特に上述した様な少なくとも２つの炭水化物類の混合物を好ましくは含む。グルコース、ガラクトース及びマンノースの混合物が特に好ましく使用される。更に栄養素が前記細胞の全体の増殖期の後の必要性に従い、すなわち培養培地において測定された前記の選択されたパラメーターの濃度に依存して加えられる事が好まれる。

前記栄養素溶液における炭水化物類に対するグルタミンの量比は、発酵槽における消費率に本質的に一致する様、好ましくは選択される。この事は発酵槽において個々の基質の一定の濃度が維持される事を実質上可能にする。グルタミンの濃度は前記培養培地において150mg/ｌ以下の値で好ましくは維持され、そして前記培養培地において２〜３mmol/ｌ以上のアンモニウム濃度の発生を防ぐ。発酵の間、糖類の全濃度は既に説明した様に培養培地で好ましくは0.1〜10g/ｌの範囲内、特に好ましくは２〜6g/ｌの範囲内である。

使用される栄養素溶液は全ての糖に関して好ましくは１：３〜20の範囲内及び特に好ましくは1:5〜15の範囲内である糖に対するグルタミンの質量比を含む。使用される栄養素溶液がグルタミン、並びに三つの糖、グルコース、ガラクトース及びマンノースを含む場合、前記糖類に対するグルタミンの質量比は、好ましくは１:（１〜３）:（１〜５）:（２〜８）及び特に好ましくは1：（1.5〜2.2）：（1.5〜3.6):(4〜6)である。

前記培養は好ましくは繰り返しのバッチ工程として行われ、増殖期の後に培養液の一部が採収され、そして前記培養液の残査が、続いて作業体積に新鮮培地で再び満たされる発酵槽において維持される。本発明に従う前記工程はグルコシル化されたＥＰＯが高収率で採収される事を可能にする。故に採収時の前記濃度は例えば培養培地のＬ当たりのEPOが少なくとも30mg及び特に少なくとも40mgである。

本発明のより更なる観点は真核細胞からのEPOの単離方法であり、ここで前記真核細胞は適当な培地において培養され、そして前記EPOは培養上清から単離され、その培養において特徴づけられる前記方法は36℃以下、好ましくは30と35.5℃の間及び特に好ましくは33と35.0℃の間の温度で行われる。培養の間の温度を低める事によって所望のグリコシル化を有するEPOの比率が大いに増大されうる事は驚きを持って見出された。

方法（ｃ）は本適用の特徴を満たさない、炭水化物構造の知られたEPO組成物からの不所望の成分の分離を含んで成る。例えば、この事は前記EPO調製品のクロマトグラフィー精製によって、例えばトリアジン色素ゲル、好ましくはシバルコンブルー色素ゲルでの親和性クロマトグラフィーによって行われうる。不所望の成分もまた、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び逆層HPLCを用いる事によって更に分離されうる。このために適当なリガンドはブチル、ペンチル、オクチル、オクタデシル及びフェニル残基である。前記逆層HPLC段階は、6.0〜8.5の範囲内及び特に好ましくは7.0〜8.0の範囲内のpHの値で好ましくは行われる。適当な溶出液は、例えばアセトニトリル、エタノール又はイソプロパノール、好ましくはアセトニトリルである。

適当な画分が決定され、プールされそして最終的にキャピラリー ゾーン電気泳動解析（CZE）を用いて、更に処理されうる。更に高含量のＮ−アセチルラクトサミン単位を有するEPO分子はトマト又はジャガイモ由来のレクチン類を用いて直接強化されうる（MerKle, Cummings, J. Biol. Chem. 262 (1987),8179〜8189）。その様なレクチン類は例えば固定化型において好ましくは使用される。

本発明の更なる主題はＥＰＯ組成物の比活性を増大させるための方法であり、ここでEPO分子は；
（ａ）４アンテナ構造を高い比率、
（ｂ）Ｎ−アセチルラクトサミン単位を多数、
（ｃ）Ｎ−アセチルラクトサミン単位数とシアル酸含量との積を高い値、
（ｄ）Ｎ−アセチルラクトサミン繰り返しを高い比率及び／又は
（ｅ）Ｎ−アセチルラクトサミン繰り返しと４アンテナ炭水化物構造との積を高い値：
有する組成物に強化される。
この強化は、上述した方法（ａ），（ｂ）及び（ｃ）の１又は複数によって達成されうる。

次に、本件発明を実施例により、具体的に態様
例１. 細胞系の培養上清からのEPOの精製
前記クロマトグラフィー段階の数及び原理において異なる本質的に２つの方法が、ヒト細胞又はＣＨＯ細胞由来の細胞培養上清からＥＰＯを精製するために使用され、培地の組成及びＥＰＯ濃度に依存して使用された：
方法１：第１段階：ブルーセファロースカラム
第２段階：ブチルセファロースカラム
第３段階：ハイドロキシアパタイトカラム
第４段階：濃縮

方法２：第１段階：ブルーセファロースカラム
第２段階：ハイドロキシアパタイトカラム
第３段階：濃縮
（択一的第３段階：RP-HPLC）
方法１による２％（V/V）ウシ胎仔血清（FCS）を含むHeLa細胞培養上清の精製例：

１．ブルーセファロースカラム：
５ml Hi-Trapブルーカラム(Pharmaciaの既製のブルーセファロースカラム）を少なくとも５カラム体積（CV）の緩衝液Ａ（20mM Tris-HCl、pH7.0；5mM CaCl₂ ；100mM NaCl）で平衡化した。続いて70mlのHeLa細胞上清（約245μgのEPO及び70〜100mgの全タンパク質を含む）を循環方法において0.5ml/分の流速で一晩吸収させた。
前記カラムを少なくとも5CVの緩衝液B（20mM Tris-HCl、pH7.0；5mM CaCl₂ ；250mM NaCl）及び少なくとも５CVの緩衝液C（20mM Tris-HCl、pH7.0；0.2mM CaCl₂ ；250mM NaCl）を用いて0.5ml/分で洗浄した。洗浄の成功をOD280でタンパク質含量を測定することによって監視した。

EPOを緩衝液D（100mM Tris-HCl、pH7.0；0.2mM CaCl₂ ；2M NaCl）を用いて0.5ml/分の流速で溶出した。溶出溶液を１〜２mlの画分に集めた。
前記画分、洗浄溶液及び溶出溶液のEPO含有量を、アリコートをPOROS R2/Hカラム（Boehringer Manheim）にかけることにより逆層（RP）−HPLCによって決定した。択一的に、免疫ドット−ブロットをEPOを含む画分の定量的な同定のために使用した。
EPOを含む溶出画分（８〜12ml）をプールし、ブチルセファロースカラムにかけた。
ブルーセファロースカラム後の収率は約175μg EPOであった。（約70％に相当）。たいていブルーセファロース後の収率は50と75％の間であった。

２．ブチルセファロースカラム（疎水性相互作用クロマトグラフィー）
自分で作った２〜３mlのブチルセファロースカラム（材料：Toyopearl butylS650）を少なくとも５CVの緩衝液Ｄ（100mM Tris-HCl、pH7.0;0.2mM CaCl₂ ;2M NaCl）を用いて平衡化し、そしてそれに続きEPOを含む方法１からのブチルセファロースプール（約150μgEPO）を0.5ml/分の流速で吸収させた。
前記カラムを少なくとも５CVの緩衝液Ｅ（20mM Tris-HCl、pH7.0；2M NaCl及び10％イソプロパノール）を用いて0.5ml/分で洗浄した。洗浄の成功をOD280でタンパク質含量を測定することによって監視した。

EPOを緩衝液Ｆ（20mM Tris-HCl、pH7.0；2M NaCl及び20％イソプロパノール）を用いて室温で及び0.5ml/分の流速で溶出した。溶出溶液を１〜２mlの画分において回収した。
前記画分、洗浄溶液及び溶出溶液のEPO含有量を、アリコートをPOROS R2/HカラムにかけることによりRP-HPLCによって決定した。択一的に、免疫ドット−ブロットをEPOを含む画分の定性的な同定のために使用した。
EPOを含む溶出画分（10〜15ml）をプールし、ハイドロキシアパタイトカラムにかけた。ブチルセファロースカラムの収量は約130μg EPOであった（約85％に相当）。たいていブチルセファロースの収率はブルーセファロースにかけたプールの60と85％の間であった。

３．ハイドロキシアパタイトカラム
５mlのハイドロキシアパタイトカラム(Bio RADの既製のEcono-PacCHTII）を少なくとも５CVの緩衝液Ｆ（20mM Tris-HCl、pH7.0；2M NaCl；20％イソプロパノール）を用いて平衡化し、そしてそれに続きEPOを含む方法２からのブチルセファロースプール（約125μg EPO）を0.5ml/分の流速で吸収させた。
前記カラムを少なくとも５CVの緩衝液Ｇ（20mM Tris-HCl、pH7.0；2M NaCl）を用いて0.5ml/分で洗浄した。洗浄の成功をOD280でタンパク質含量を測定することによって監視した。

EPOを緩衝液Ｈ（10mM リン酸ナトリウム、pH7.0；80mM NaCl）を用いて0.5ml/分の流速で溶出した。溶出溶液を１〜２mlの画分において回収した。
前記画分、洗浄溶液、及び溶出溶液のEPO含有量を、アリコートをPOROS R2/HカラムにかけることによってRP-HPLCによって決定した。
EPOを含む溶出画分（３〜６ml）をプールした。ハイドロキシアパタイトカラムの収量は約80μg EPOであった（約60％に相当）。たいてい、ハイドロキシアパタイトカラムの収率はブチルセファロースにかけたプールの50と65％の間であった。

４．濃縮
ハイドロキシアパタイト段階からの、プールされたEPO画分を10KDの排除サイズを有する遠心装置（例えばFiltron のMicrosep）において0.1〜0.5mg/mlの濃度まで濃縮した。0.01%Tween20を加え、そしてこれを−20℃でアリコートにおいて保存した。

単離されたEPOの純度は約90％以上、通常95％以上でさえあった。
ブチルセファロース段階が削除された方法２は、EPO収率を増大させるためにも使用される。この方法は、１％（V/V）FCS補足の添加が無し又は有りの細胞培養培地に特に適用することができ、そして単離されたEPOの収率はほぼ同一の純度（90〜95％）である。ハイドロキシアパタイトカラムのための平衡化緩衝液（緩衝液Ｆ）における5mM CaCl₂ の存在は、この方法において結合の改良、そしてこのようにハイドロキシアパタイト段階におけるEPOの再現可能な溶出性質の改良を導いた。その結果、方法２は原理において同一な、方法１の様な方法を使用する以下の緩衝液を用いて行われた。

１．ブルーセファロースカラム：
平衡化緩衝液（緩衝液Ａ）：20mM Tris-HCl，pH7.0；5mM CaCl₂；100mM NaCl
洗浄緩衝液１（緩衝液Ｂ）：20mM Tris-HCl，pH7.0；5mM CaCl₂；250mM NaCl
洗浄緩衝液２（緩衝液Ｃ）：20mM Tris-HCl，pH7.0；5mM CaCl₂；250mM NaCl
溶出緩衝液（緩衝液Ｄ）： 100mM Tris-HCl，pH7.0；5mM CaCl₂ ;2M NaCl

２．ハイドロキシアパタイトカラム
平衡化緩衝液（緩衝液Ｆ）：50mM Tris-HCl，pH7.0；5mM CaCl₂；1M NaCl
洗浄緩衝液（緩衝液Ｇ） ：10mM Tris-HCl，pH7.0；5mM CaCl₂；80mM NaCl
溶出緩衝液（緩衝液Ｈ） ：10mM リン酸ナトリウム、pH7.0；0.5mM CaCl₂；80mM NaCl

方法１における緩衝液Ｃ〜Ｇへの５mM CaCl₂ の添加はまた、結合の改良及びハイドロキシアパタイトカラムからの溶出のさらなる定義づけへと導く。
択一的又は付加的に以下の段階もEPOを精製するために使用される：
− RP-HPLC、例えばVydac C4材料を使用
− DEAEセファロースffクロマトグラフィー
− ダイアフィルトレーション

例２. イソ型１〜８（対比）の保持と同時の、培養上清からのEPOの精製
１．出発材料
哺乳類細胞、例えばCHO又はヒト細胞由来のEPOを繰り返しのバッチ工程によって発酵した。1000Lの発酵槽を前培養したもので接種し、そして前記発酵槽の中身を約３〜５日後に採収した。採収の後、前記細胞を遠心によって発酵液から取り除いた。前記無細胞培養上清を１mol /lの酢酸を用いてpH5.0〜5.2に調節し、そして１〜９℃で濾過する。

２．ブルーセファロースクロマトグラフィー
クロマトグラフィーカラム（Amicon P440×500、Amicon，GB）を60〜80Lのブルーセファロースで満たし、そして0.5N NaOHを用いて再生させた。次に前記カラムを約３カラム体積（CV）の酢酸緩衝液を用いて平衡化した。

pH５に調節された無細胞培養上清を10±5℃の温度及び800〜1400ml/分の流速でカラムに吸収させた。前記カラムを約１CVの洗浄緩衝液１を用いて前記と同一の流速及び５±４℃で再洗浄した。これに約２CVの洗浄緩衝液２を続けた。次に前記カラムを約３CVの溶出緩衝液を用いて溶出した。全てのタンパク質のピークを回収し（約30〜60L）、HClを用いてpH6.9に調節し、そして次の工程まで５±４℃で保存した。前記の製品溶液をこのクロマトグラフィー段階において濃縮し、そして約40〜50％の純度を達成した。

平衡化緩衝液：20mM 酢酸ナトリウム、5mM CaCl₂；0.1M NaCl，pH5.0±0.2
洗浄緩衝液１：20mM 酢酸ナトリウム、5mM CaCl₂；0.25M NaCl，pH5.0±0.2
洗浄緩衝液２：20mM Tris-HCl，5mM CaCl₂；pH6.5±0.3
溶出緩衝液：100mM Tris-HCl，5mM CaCl₂；1M NaCl，pH9.0±0.2
３．ブチルトーヨーパールクロマトグラフィー（疎水性クロマトグラフィー）
クロマトグラフィーカラム（Pharmacia BPG 300/500）を30〜40Lのブチルトーヨーパールで満たし、そして４ＭグアニジンHCl及び0.5N NaOHを用いて再生した。次にカラムを少なくとも３CVの平衡化緩衝液を用いて平衡化した。

前記ブルーセファロースカラムからの溶出液を10％イソプロパノールに調節し、そして27±2℃の温度及び800〜1200ml/分の流速で吸収させた。カラムを約１CVの平衡化緩衝液及びそれに続く約２CVの洗浄緩衝液を用いて前記と同一の温度及び流速で再洗浄した。次にそれを約３CVの溶出緩衝液を用いて溶出した。全てのタンパク質のピークを回収し（約10〜18L）、すぐに希釈緩衝液を用いて３倍に希釈し、そして次の工程まで15℃で保存した。約90％の純度をこのクロマトグラフィーにおいて達成した。

平衡化緩衝液：20mM Tris-HCl，5mM CaCl₂ ,0.75M，NaCl，10％イソプロパノール、pH6.9±0.2
洗浄緩衝液 ：20mM Tris-HCl，5mM CaCl₂，0.75M，NaCl，19％イソプロパノール、pH6.9±0.2
溶出緩衝液 ：20mM Tris-HCl，5mM CaCl₂，0.75M，NaCl，27％イソプロパノール、pH6.9±0.2
希釈緩衝液 ：20mM Tris-HCl，5mM CaCl₂，pH6.9±0.2

４．ハイドロキシアパタイトウルトロゲルクロマトグラフィー
クロマトグラフィーカラム（Amicon P440×500又は等価のもの)を30〜40Lのハイドロキシアパタイトウルトロゲルで詰め、0.5N NaOHで再生した。次にカラムを少なくとも4CVの平衡化緩衝液で平衡化した。
前記ブチルトーヨーパールカラムからの溶出溶液を、約15℃の温度及び500〜1200ml/分の流速でカラムに吸収させた。カラムを約１CVの平衡化緩衝液及びそれに続く約２CVの洗浄緩衝液を用いて前記と同一の温度及び流速で再洗浄した。次にそれを約３CVの溶出緩衝液を用いて溶出した。全てのタンパク質ピークを回収し（約10〜18L）、そして次の工程まで15℃で保存した。95％以上の純度をこのクロマトグラフィーにおいて達成した。

平衡化緩衝液：20mM Tris-HCl，5mM CaCl₂，0.25MNaCl，９％イソプロパノール、pH6.9±0.2
洗浄緩衝液 ：10mM Tris-HCl，5mM CaCl₂，pH6.8±0.2
溶出緩衝液 ：10mM Tris-HCl，10mM リン酸カリウム，0.5M CaCl₂，pH6.8±0.2

５．逆層HPLC（RP-HPLC）
予備的なHPLCをMerck Prepbar 100分離装置（又は同等のもの）を用いて22±4℃の温度で行った。分離カラム（100mm×400mm、3.21）をVydac C4材料で詰めた。使用の前に、カラムを緩衝液Ａから100％溶媒までの勾配に繰り返しかけ再生し、そして次に緩衝液Ａを用いて平衡化した。

前記ハイドロキシアパタイトカラムからの溶出溶液をトリフルオロ酢酸を用いて約pH2.5に酸性化し、そして無菌濾過した。次にそれをカラムに22±4℃の温度及び250〜310ml/分の流速でかけた。カラムを緩衝液Ａから緩衝液Ｂへの直線勾配を用いて前記と同一の温度及び流速で溶出した。溶出ピークを画分に回収した。溶出溶液を最初に加えた４体積分のHPLC希釈緩衝液によってすぐに中和した。
分析的なHPLCにおいて少なくとも９９％の純度を有する画分をプールした（プール体積約4〜6L）。微量不純物をこのクロマトグラフィーにおいて分離し、そして99％以上の純度を達成した。

緩衝液Ａ：0.1% トリフルオロ酢酸／水
緩衝液Ｂ：80% アセトニトリル、0.1% トリフルオロ酢酸／水
HPLC希釈緩衝液：10mM リン酸ナトリウム／カリウム、pH7.5±0.2

６．DEAE−セファロースｆｆクロマトグラフィー
クロマトグラフィーカラム（Amicon P90×250又は等価のもの）を、かけるEPOのｇ当たり100〜200mlのゲルで満たし、そして0.5N NaOHを用いて再生した。次にカラムを最初に100mM リン酸ナトリウム／カリウム緩衝液、pH7.5、そして少なくとも12CVの平衡化緩衝液を用いて平衡化した。
前記HPLCカラムからの溶出溶液を５±４℃の温度及び約150ml/分の流速でカラムに吸収させた。カラムを少なくとも５CVの平衡化緩衝液及びそれに続いて約10CVの洗浄緩衝液を用いて前記と同一の温度及び流速で再洗浄した。次にそれを約10CVの平衡化緩衝液を用いて再び洗浄し、そしてそれに続いて約７CVの溶出緩衝液を用いて溶出した。全てのタンパク質ピークを回収し（約２〜5L）、無菌濾過し、そして分配した。

このクロマトグラフィーにおいて前記HPLC段階からの溶媒を分離し、そして微量不純物を除去した。純度は99％以上である。
平衡化緩衝液：10mM リン酸ナトリウム／カリウム、pH7.5±0.2
洗浄緩衝液：30mM 酢酸ナトリウム、pH4.5±0.1
溶出緩衝液：10mM リン酸ナトリウム／カリウム、80mM NaCl，pH7.5±0.2

例３. イソ型１〜４（発明）の保持と同時の培養上清からのEPOの精製
１．出発材料
哺乳類細胞、例えばCHO又はヒト細胞由来のEPOを繰り返しのバッチ工程によって発酵した。10Lの発酵槽を前培養したもので接種し、そして前記発酵槽の中身を約３〜５日後に採収した。採収の後、前記細胞を遠心によって発酵液から取り除いた。前記無細胞培養上清を１mol /lの酢酸を用いてpH5.0〜5.2に調節し、そして１〜９℃で濾過する。

２．ブルーセファロースクロマトグラフィー
適当なクロマトグラフィーカラムを150〜250mlのブルーセファロースで満たし、そして0.5N NaOHを用いて再生させた。次に前記カラムを約３カラム体積（CV）の酢酸緩衝液を用いて平衡化した。

pH５に調節された無細胞培養上清を10±5℃の温度及び１〜２CV／時の流速でカラムに吸収させた。前記カラムを約１CVの洗浄緩衝液１を用いて前記と同一の流速及び５±４℃で再洗浄した。これに約２CVの洗浄緩衝液２を続けた。次に前記カラムを約３〜６CVの溶出緩衝液を用いて溶出した。タンパク質のピークを画分に回収した。CE解析の後、適当な画分をプールし、HClを用いてpH6.9に調節し、そして次の工程まで５±４℃で保存した。前記の製品溶液をこのクロマトグラフィー段階において濃縮し、不純物及び塩基性のイソ型を分離した。

平衡化緩衝液：20mM 酢酸ナトリウム、5mM CaCl₂、0.1M NaCl，pH5.0±0.2
洗浄緩衝液１：20mM 酢酸ナトリウム、5mM CaCl₂、0.25M NaCl，pH5.0±0.2
洗浄緩衝液２：20mM Tris-HCl，5mM CaCl₂、pH6.5±0.3
溶出緩衝液：100mM Tris-HCl，5mM CaCl₂、0.25M NaCl，pH8.0±0.2

３．ブチルトーヨーパールクロマトグラフィー（疎水性クロマトグラフィー）
適当なクロマトグラフィーカラムを200〜300mlのブチルトーヨーパールで満たし、そして４MグアニジンHCl及び0.5N NaOHを用いて再生した。次にカラムを少なくとも３CVの平衡化緩衝液を用いて平衡化した。

前記ブルーセファロースカラムからの溶出液を10％イソプロパノールに調節し、そして27±2℃の温度及び１〜２CV／時の流速で吸収させた。カラムを約１CVの平衡化緩衝液及びそれに続く約２CVの洗浄緩衝液を用いて前記と同一の温度及び流速で再洗浄した。次にそれを約５〜10CVの溶出緩衝液を用いて溶出した。画分をタンパク質ピークから回収し、すぐに希釈緩衝液を用いて３倍に希釈した。CE解析の後、適当な画分をプールし、次の工程まで15℃で保存した。このクロマトグラフィーにおいて、更に基本的なイソ型を除去し、そして約80％以上の純度を達成した。

平衡化緩衝液：20mM Tris-HCl，5mM CaCl₂，0.2M NaCl，10％イソプロパノール、pH6.9±0.2
洗浄緩衝液 ：20mM Tris-HCl，5mM CaCl₂，0.2M NaCl，17％イソプロパノール、pH6.9±0.2
溶出緩衝液 ：20mM Tris-HCl，5mM CaCl₂，0.2M NaCl，23％イソプロパノール、pH6.9±0.2
希釈緩衝液 ：20mM Tris-HCl，5mM CaCl₂，pH6.9±0.2

４．ハイドロキシアパタイトウルトロゲルクロマトグラフィー
適当なクロマトグラフィーカラムを150〜200mlのハイドロキシアパタイトウルトロゲルで詰め、0.5N NaOHで再生した。次にカラムを少なくとも４CVの平衡化緩衝液で平衡化した。
前記ブチルトーヨーパールカラムからの溶出溶液を、約15℃の温度及び１〜２CV／時の流速でカラムに吸収させた。カラムを約１CVの平衡化緩衝液及びそれに続く約２CVの洗浄緩衝液を用いて前記と同一の温度及び流速で再洗浄した。次にそれを約３CVの溶出緩衝液を用いて溶出した。全てのタンパク質ピークを回収し、そして次の工程まで15℃で保存した。95％以上の純度をこのクロマトグラフィーにおいて達成した。

平衡化緩衝液：20mM Tris-HCl，5mM CaCl₂，0.06M NaCl，7.5％イソプロパノール、pH6.9±0.2
洗浄緩衝液 ：10mM Tris-HCl，5mM CaCl₂，pH6.8±0.2
溶出緩衝液 ：10mM Tris-HCl，10mM リン酸カリウム、0.5mM CaCl₂，pH6.8±0.2
５．逆層HPLC（RP-HPLC）
半調製用HPLCをVydac C4カラム（20mm×250mm、約80ml）を用いて22±４℃の温度で行った。使用の前に、カラムを緩衝液Ａから100％溶媒までの勾配に繰り返しかけ再生し、そして次に緩衝液Ａを用いて平衡化した。
前記ハイドロキシアパタイトカラムからの溶出溶液を22±4℃の温度及び8〜15ml/分の流速でカラムにかけた。カラムを次のHPLC実験計画に従って緩衝液Ａから緩衝液Ｂへの直線勾配を用いて前記と同一の温度及び流速で溶出した。溶出ピークを画分に回収した。溶出溶液を最初に加えた４体積分のHPLC希釈緩衝液においてすぐに中和した。

分析用HPLCにおいて少なくとも99％の純度を有し、そしてCE解析に従う適当な画分をプールした。微量不純物及び塩基性イソ型の残査をこのクロマトグラフィーにおいて除去し、そして99％以上の純度を達成した。
緩衝液Ａ：10mM リン酸ナトリウム／カリウム、pH7.0±0.2
緩衝液Ｂ：10mM リン酸ナトリウム／カリウム、80% アセトニトリル、pH7.0
HPLC希釈緩衝液：10mM リン酸ナトリウム／カリウム、100mM NaCl，pH7.5±0.2

６．ダイアフィルトレーション
適当な大きさのダイアフィルトレーション装置を10KDのカセットで合わせ、1N NaOHで再生した。次にこの装置をバルク緩衝液を用いてアルカリが無くなるまですすいだ。
前記HPLCカラムの溶出溶液を５±４℃の温度で濃縮し、そして10体積のバルク緩衝液に対してダイアフィルトレーションした。最終的な濃度は１〜３mg／mlの間であるべきである。
この段階は前記ＨＰＬＣ段階から溶媒残査を除去すること、要求されたバルク緩衝液条件及びバルク活性物質の製品濃度を調節することを提供する。
バルク緩衝液：10mM リン酸ナトリウム／カリウム、100mM NaCl，pH7.5±0.2

例４. in vivoでのEPOの比活性の決定（正血球状態マウスでのバイオアッセイ）
赤血球前駆体細胞の増殖及び分化におけるEPOの投与量依存的活性は、EPO投与の後、マウスにおける血液中の網状赤血球の増大によってin vivoで決定された。
このため、解析されうるEPO試料及びEPO標準（EPO WHO標準で標準化された）の様々な投与量を８匹のマウスに非経口に各々投与した。前記マウスを一定の定めた条件下で引き続き保った。血液を、EPO投与の後、４日目のマウスから回収し、そして網状赤血球をアクリジンオレンジで染色した。30,000赤血球当たりの網状赤血球数を赤色蛍光ヒストグラムの解析によるフローサイトメーターにおける微蛍光定量法によって決定した。

生物学的活性を前記試料及びLinderによって記述された、平行直線を用いる濃度のペアワイズ（pair wise）決定法（Linder“Planen und Auswerten von Versuchen”, 3rd. edition, 1969, Birkenhaeuser Verlag, Basel)に従う、異なる投与量における標準の網状赤血球数の値から算出された。
EPO調製品CHO1，CHO2及びCHO3を、それぞれ248,000（CHO1）、225,000（CHO2）及び186,000IU/mg（CHO3）の生物学的活性を有する、無血清培地において培養されたCHO細胞の培養上清からEPOを精製することによって得た。ヒト細胞の培養上清から精製されたEPOの４つの調製品において、220,000（HeLa１）、198,000（HeLa２）、204,000（HeLa３）、176,000（HeLa４）及び100,000IU/mg（HeLa５）の比活性を有する製品が得られた。糖構造のためのパラメーターを有する生物学的活性の値の関係を例11において与える。

例５. シアル酸残基含量の決定
アルスロバクター・ウレアファシエンス（A. ureaf., Boehringer Mannheim）由来のノイラミニダーゼを用いたシアル酸の酵素的開裂の後、Dionex system のHPAEC-PAD（パルス電流計検出を用いる高pH陰イオン交換クロマトグラフィー）によってシアル酸含量を決定した。

CHO及びヒト細胞系（例えばHeLa S3）の様々な調製品由来のEPOを22μgそれぞれ含む調製品を、５mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2中で0.2mg/mlのEPO濃度に調節した。それぞれの調製品の半分を、RP-HPLCによって前記EPOの量を正確に決定するために使用した。A. ureaf. 由来の５mMノイラミニダーゼを前記調製品の残りの半分のものに加え、37℃で一晩（約18時間）インキュベートした。次に消化混合物を２等分し、H₂Oを用いて500μlに20倍希釈し、その50μl（約27pmol EPOに相当）を前記Dionex system にかけた。次のクロマトグラフィーパラメーターを、このために使用した。

カラム：CarboPac PA 100
流速：1.0ml／分
検出感度：300nA
勾配： t(分) %緩衝液B
0 17
7 17
9 100
12 100
13 0
20 0

緩衝液Ａ：0.1M NaOH
緩衝液Ｂ：0.1M NaOH；0.5M 酢酸ナトリウム
適用した試料におけるシアル酸の量を、同様に解析されたシアル酸標準の値（Boehringer Mannheim)から得られた検量線の補助を用いて決定した。シアル酸含量（モル シアル酸／モルEPO）をシアル酸決定の結果（Dionex system)及びRP-HPLCによって使用されたEPOの量の決定から算出した。
CHO細胞由来のEPOはモルEPO当たり12.9モル（CHO1）、11.8（CHO2）及び11.7モル（CHO3）シアル酸の平均含量を有していた。ヒト細胞に由来するEPO調製品はモルEPO当たり13.1モル（HeLa１）、13.2モル（HeLa２）、13.3モル（HeLa３）、11.6モル（HeLa４）及び10.8モル（HeLa５）のシアル酸量を有していた（例11も参照）。

例６. ２アンテナ、３アンテナ及び４アンテナ炭水化物構造の比率の決定
Ｎ結合炭水化物構造をDionex system のHPAEC-PADクロマトグラフィー的に解析した。CHO及びヒト細胞系（HeLa S3）由来のEPO調製品のアシアロオリゴ糖類をＮ−グリコシダーゼＦ（Boehringer Mannheim)及びA. ureaf由来のノイラミニダーゼ（Boehringer Mannheim)を用いた酵素的開裂によって単離した。

混合物当たり10又は30μgのEPOを、Microcon超遠心装置（Amicon、排所サイズ10KD）によって脱塩し、10mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2を用い0.2又は0.3mg／mlの濃度に調節した。次に1UのＮ−グリコシダーゼＦ及び10mU ノイラミニダーゼを各混合物に加え、37℃で一晩（約18時間）インキュベートした。開裂したオリゴ糖類からEPOポリペプチド部分を単離するために、混合物をインキュベーションの後、Ultrafree遠心装置（Millipore、排所サイズ10KD）を通して遠心し、前記Ultrafree装置を20mlのH₂Oで再び２回洗浄した。濾液中に含まれたオリゴ糖類をH₂Oで150mlに合わせ、その100μlをDionex systemで解析した。このために、以下のクロマトグラフィーのパラメーターを使用した。

カラム：CarboPac PA 100
流速：1.0ml／分
検出感度：300nA
勾配： t(分) ％緩衝液Ｂ
0 0
2 0
60 10
62 100
67 100
69 0
80 0

緩衝液Ａ：0.1M NaOH
緩衝液Ｂ：0.1M NaOH；0.5M 酢酸ナトリウム
ピークを標準的なオリゴ糖類による複合型のＮ糖のクロマトグラムにおいて同定し、エンド−β−ガラクトシダーゼ又はフコシダーゼの酵素を用いてEPOのオリゴ糖類の酵素的消化によって変化させ、そしてDionex system での次の解析にかけた。２アンテナ、３アンテナ及び４アンテナ構造のパーセンテージを全ピーク領域（２アンテナ、３アンテナ及び４アンテナ構造のピーク領域の総計）に関するＮ糖構造に一致して表されるピークの領域によって算出した。

CHO細胞由来のEPOは4.2% ２アンテナ炭水化物構造、22.3％ ３アンテナ炭水化物構造及び73.5％の４アンテナ炭水化物構造（CHO3）の含量、CHO1調製品において86.7%の４アンテナ炭水化物構造並びにCHO2において78.6％の含量を有していた。ヒト細胞系由来のEPOの調製品における２アンテナ／３アンテナ／４アンテナ構造の含量は、HeLa1で5.8/8.8/85.4％、HeLa２で5.1/12.7/82.2％、HeLa３で4.1/17.7/78.2％、HeLa４で10.1/19.2/70.6％、HeLa５で12.6/25.4/62％であった（例11も参照）。

例７. Ｎ−アセチルラクトサミン単位の平均含量及び付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位（繰り返し）の平均含量の決定
EPOのＮ結合炭水化物構造中のＮ−アセチルラクトサミン単位（すなわち核中の炭水化物構造＋繰り返し）の総数を、例６の実験のクロマトグラムのピーク領域から算出した。

炭水化物鎖当たりのＮ−アセチルラクトサミン単位の平均含量の数（ｎ）を以下の様に算出した：
ｎ＝Σ％（２アンテナ）×２＋％（３アンテナ）×３＋％（４アンテナ）×４＋％（３アンテナ＋１ｒ）×４＋％（４アンテナ＋１ｒ）×５＋％（３アンテナ＋２ｒ）×５＋％（４アンテナ＋２ｒ）×６（ここで％（２アンテナ）＝Ｎ結合炭水化物の総計（１００％）に関する２アンテナ構造のパーセンテージ；
％（３アンテナ）＝付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位無しの３アンテナ構造のパーセンテージ
％（４アンテナ）＝付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位無しの４アンテナ構造のパーセンテージ；

％（３アンテナ＋１ｒ）＝１つの付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位を有する３アンテナ構造のパーセンテージ；
％（４アンテナ＋１ｒ）＝１つの付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位を有する４アンテナ構造のパーセンテージ；
％（３アンテナ＋２ｒ）＝２つの付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位を有する３アンテナ構造のパーセンテージ；
％（４アンテナ＋２ｒ）＝２つの付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位を有する４アンテナ構造のパーセンテージ；
である）。

CHO細胞由来のEPOの場合、炭水化物鎖当たり4.3（CHO1）、4.4（CHO2）及び4.2（CHO3）のＮ−アセチルラクトサミン単位の平均数が明らかになった。ヒト細胞由来のＥＰＯ調製品において、4.0（HeLa１）、4.0（HeLa２）、3.9（HeLa３）、3.75（HeLa４）及び3.6（HeLa５）のＮ−アセチルラクトサミン単位数が明らかになった（例11も参照）。
EPOが３Ｎ結合糖構造を含む事実のため、Ｎ−アセチルラクトサミン単位の総数は更に３倍高い。EPOのグルコシル化総数に関して、CHO細胞由来のEPOにおけるＮ−アセチルラクトサミン単位数は、故に12.9（CHO1）、13.2（CHO2）及び12.6（CHO3）である。ヒト細胞のEPO調製品において、一致する値は12.0（HeLa１）、11.9（HeLa２）、11.7（HeLa３）、11.25（HeLa４）及び10.8（HeLa５）であった。

それぞれのシアル酸含量を掛けた炭水化物構造当たりのＮ−アセチルラクトサミン単位数の積は、CHO細胞由来のEPOにおいて55.5（CHO1）、52（CHO2）及び49.3（CHO3）の値を生じた。ヒト細胞由来のＥＰＯ調製品の場合において、一致する値は52.4（HeLa１）、52.5（HeLa２）、51.3（HeLa３）、43.5（HeLa４）及び38.9（HeLa５）であった。
EPOのグリコシル化総数（３Ｎ結合炭水化物構造）に関して、それぞれのシアル酸含量を掛けたＮ−アセチルラクトサミン単位数の積は、CHO細胞由来のEPOにおいてそれぞれ166.5（CHO1）、156（CHO2）及び147.9（CHO3）である。ヒト細胞由来のEPO調製品において、一致する値は157.2（HeLa１）、157.5（HeLa２）、153.9（HeLa３）、130.5（HeLa４）及び116.7（HeLa５）であった（例11も参照）。

更に重要なパラメーターは、繰り返しと称される、炭水化物構造の核に結合しうるＮ−アセチルラクトサミン単位の量である（Fig.7参照）。繰り返しの含量は、全てのＮ結合炭水化物構造の総計（２アンテナ＋３アンテナ＋４アンテナ＝100％）に関する炭水化物構造を含む繰り返しのパーセンテージとして記載されている。
この繰り返しの比率は、CHO細胞由来及びヒト細胞由来のEPO調製品において異なりうる。この様に、39.6％（CHO1）、51％（CHO2）及び36.8％（CHO3）の繰り返し比率がCHO細胞由来の調製品のものとして決定された。18％（HeLa１）、16.5％（HeLa２）、14.0％（HeLa３）、12.2％（HeLa４）及び9.8％（HeLa５）がヒト細胞由来の調製品のものとして決定された（例11参照）。

例８. 要求に従う調節及び供給によるEPOの生物学的活性への影響
培養を36.5℃の温度で要求に従う供給を用いる繰り返しのバッチ工程（繰り返しのフェドバッチ）として行った。このために、無血清の、タンパク質に乏しい培養培地を滅菌発酵槽（総作業容量：10ｌ）に居え、そして接種培養物を用いて１回接種した。接種後の細胞密度は3±1×10⁵ 生細胞/mlであった。
144±24時間の増殖期の後、培養液の一部を採収した。培養液の残りは発酵槽内に残され、そして次の増殖期のための接種の代わりとなった；この目的のため発酵槽は再び作業容積まで新鮮培地で満たされた。

EPOを含む培養上清を発酵培養物を遠心する事によって得た。
栄養素溶液を、増殖期の間、連続的に培養物に加えた。この目的のために、栄養素溶液を含む保存容器は発酵槽と組合わされた。栄養素溶液はアミノ酸類、ビタミン類、インスリン、微量元素、塩類、グルタミン及び炭水化物類を含んだ。２つの発酵を以下の様に行った：
発酵Ａにおいて栄養素溶液は糖としてD-(+)-グルコースを含み、そして発酵Ｂにおいて糖類はD-(+)-グルコース、D-(+)-ガラクトース及びD-(+)-マンノースであった。糖類に対するグルタミンの質量比は発酵Ｂにおいて1:2、2:3、6:6であった。栄養素溶液における個々の糖類の濃度は7.2〜18g/ｌの間であった。

培養物におけるグルタミンの濃度は発酵Ｂにおいて周期的に解析され、そしてその消費が算出された。栄養素溶液の瞬間体積流は細胞の栄養素要求に釣り合っていた。発酵Ａにおいてグルタミン濃度は調節変化が可能なものとして使用されなかった。発酵Ｂにおける栄養素溶液は、2:3:5の質量比のD-(+)-グルコース、D-(+)-ガラクトース及びD-(+)-マンノースの糖類の混合物を含んだ。発酵槽における全糖類の濃度は、一致した供給によって培養の間、２〜6g/lの範囲内に保たれた。

細胞密度は、増殖の間、採収時までに20×10⁵ 細胞／ml以上、典型的に30±10×10⁵ 細胞/mlに変化した。採収時、EPOの濃度は典型的に40±10mg/ｌであった。
ヒトエリスロポエチンの濃度は、採収した培養液において、例えばELISAによって決定された。生じたこのタンパク質のイソ型のパーセンテージ分布は、例えばキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を用いた分離によって決定された。

表４は、グルコースを含む栄養素溶液が供給される発酵Ａとグルコース、マンノース及びガラクトースを含む栄養素溶液が供給される発酵Ｂとの間のEPOイソ型の分布の比較を示す。発酵ＢにおけるEPOイソ型の含量は、発酵Ａのイソ型に対応するパーセンテージとして算出された。後者は各々100％に標準化された。本データは、所望の高度にグリコシル化されたEPOイソ型2〜4が、発酵Aと比較して、発酵の間、より高い比率で本質的に存在している事を示す。

供給を用いて得られたイソ型のパターンは、栄養素溶液の調節され及び要求に従う供給を用いた発酵から４つの連続的な採収において再現可能であった。

例９. 培養温度の変化によるEPOの生物学的活性への影響
本工程は、発酵槽温度が36.5℃の代わりに35.0℃である事を除く、調節され及び要求に応じる供給を用いるフェド−スプリットバッチ（fed-splitbatch）工程における例８において記述したものと同じであり（発酵Ｂ）、本発酵は1000L規模で行われた。
表５は、各々が栄養素溶液の調節された供給を用いる、36.5℃での発酵Ｃと35.0℃での発酵ＤのEPOのイソ型分布の比較を示す。発酵ＤにおけるEPOのイソ型の含量は、発酵Ｃの対応しているイソ型のパーセンテージとして算出された。後者は、それぞれが100％に標準化された。本データは酸性EPOイソ型の２〜４が、温度の低下によってかなり増大しうる事を示す。

例10. 培地中の炭水化物組成の変化によるEPOの生物学的活性への影響
以下に表す方法は、供給培地における炭水化物供給の変化によりヒトエリスロポエチンの質を変える事が可能である事を示す。
上述した本方法の２つの変異体は（以下発酵Ｅ及び発酵Ｆと称する）、使用した培地の組成が異なる事を示している。

両調製品において、培養培地の処方は改変eRDF培地を基にしている。無血清を使用し、しかし幾分の組換えインスリン（唯一のタンパク質添加物）及び更なる追加物（例えばセレナイト、プトレッシン、ヒドロコルチゾン、硫化鉄）が無血清又は無タンパク質培地において通常使用される。
供給栄養素溶液はまた、改変ｅＲＤＦ培地が基となっているが、塩類KCl，Na₂HPO₄ 及びNaClは含まない。
発酵ＥとＦとの間の主な違いは、供給培地への様々な単糖類の添加である。

発酵Ｅ：
通常の糖、D-(+)-グルコースが発酵Ｅのために使用される。最初の濃度は3g/ｌであった。グルコース含有栄養素溶液を適当に供給する事によって、培養液におけるグルコース濃度を、全体の培養の間、3±0.5g/ｌに保った。
培養周期は典型的に100±20時間であった。EPOの濃度は採収時において典型的に40±10mg/ｌであった。

発酵Ｆ：
D-(+)-グルコースに加えて、D-(+)-ガラクトース及びD-(+)-マンノースの糖類が、発酵Ｆのために、供給培地に約1:2:3の質量比で加えられた。培養の間、全糖類の濃度を、適当な供給によって0.25g/ｌと3.5g/ｌの間の範囲内に保った。
この増殖のための培養周期は典型的に100±20時間であった。採収時のEPOの濃度は典型的に40±10mg/ｌであった。
エリスロポエチンを前記培養上清から精製した。精製方法は、本糖タンパク質の関連したイソ型の分布が影響されないよう設計された（例２を参照）。

精製されたエリスロポエチンのイソ型分布を上述した様に決定した。
ヒトエリスロポエチンのイソ型の炭水化物構造及び採収した培養上清中のそれらの分布は発酵Ｅ及びＦにおいて異なった。発酵Ｅは、発酵Ｆと比較して、イソ型２，３及び４をかなりの高い比率で有していた。これらの違いは単糖類マンノース及びガラクトースの供給によって生じた（例２参照）。

正常マウス試験（例４）によって決定された生物学的活性（例４）は前記ＥＰＯのイソ型の分布及び炭水化物構造に関連する（Fig.3）。前記培養上清Ｅ及びＦから得たEPO調製品の炭水化物構造を、CZE及びHPAEC解析で試験した。
アンテナ度（２つの構造、３つの構造及び４つの構造を含む）、Ｎ−アセチルラクトサミン単位の含量（LE）、シアル酸含量（SA）及び２つのEPO調製品のLEとSAの積を表６に示す。

例11. 特異的活性と炭水化物構造との関係
この例において、炭水化物構造への個々のEPOのイソ型の生物学的活性の依存に対する研究を要約する。このために、様々なEPO供給源由来のイソ型（CHO細胞及びヒト細胞由来のEPOの異なる一群）を単離及び比較した。
11.1 等電点電気泳動（IEF）及びウェスタンブロットによる個々のイソ型の単離

Ａ） IEFゲル電気泳動及びニトロセルロースへのエレクトロブロッティングのための方法
純粋な状態において個々のイソ型を単離するために、複数のイソ型の混合物から成るEPO溶液をultrafree遠心装置において脱塩し、そして濃縮（5〜10mg/ml）した。この溶液の350〜1000μgをServaのIEFポリアクリルアミド既製ゲル（Servalyt Precotes、pH3〜5、300μm、125×125mm）にかけた（レーン当たり70〜100μgのEPOを含む5〜10レーン内）。本IEFを5℃で3.5時間2500Vで行い；次にそのゲルをニトロセルロースにブロットした（200mAでの３時間のメタノールを含むがSDSは含まないTris/グリシン緩衝液中でのウェットブロット）。ブロッティング工程の後、ゲルを除き、ニトロセルロース膜をポンソー染色液で染色した。染色されたイソ型を切り取り、そして再びH₂O又はTBS緩衝液（100mM Tris、pH7.4；150mM NaCl）で完全に脱色した。

Ｂ） 膜からのイソ型の抽出
各々のイソ型を含む脱色されたニトロセルロースの小片を２mlのEppendorf容器に据え（前記IEFゲルの３〜４レーンに一致）、1.5mlのアセトンを加え、そしてそのニトロセルロースをボルテックスによって溶解した。それはEPOを最適に沈澱させるために20℃で一晩インキュベートされた。次にEPOを含むその沈澱を10分間のベンチ遠心、14,000rpm で単離した。沈澱物を１mlのアセトンを用いて２〜３回洗浄し、そして次に窒素気流下、室温又は37℃で乾燥させた。EPO沈澱物を次に、0.01%Tween20を含む20mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2に溶解し、そして次の解析まで−20℃で保存した。

Ｃ） 沈澱EPO溶液からのイソ型の単離
個々のイソ型を、たった３〜４個のイソ型の代わりとして７〜８個を含む初期のEPO溶液の性質を用いてＡ）及びＢ）に記述した様に単離した。出発物質はＤＥクロマトグラフィー（陰イオン交換体）によって単離されたEPO画分であった。これらの画分は３〜４個のイソ型のみ（例えばイソ型６〜８又はイソ型１〜４）を含んだ。

イソ型群を単離するために、適当なクロマトグラフィーカラムを使用するEPO 10mg当たり１〜２mlのDEAE−セファロースｆｆで満たし、0.5N NaOHで再生した。次にカラムを最初に２CVの中和緩衝液及び次に少なくとも５CVの平衡化緩衝液を用いて平衡化した。
８個のイソ型を含んで成る精製されたEPO調製品を５±４℃の温度及び最大15CV／時の流速で吸収させた。そのカラムを次に２〜３CVの平衡化緩衝液を用いて洗浄し、そしてそれに続きpH値が5.0まで洗浄緩衝液（約５CV）ですすいだ。

様々なイソ型群を、溶出緩衝液において10mMの段階から開始して20mM NaClまで、NaCl濃度を増加することによって溶出した。塩基性イソ型はイオン交換体に弱く結合し、そして低イオン強度に相当して溶出され、酸性イソ型は最大70mMのNaClのより高いNaCl濃度で溶出される。あるNaCl濃度において溶出されるイソ型の量は出発物質及び溶出体積に強く依存する。規定通り、溶出をOD280がこのNaCl濃度において最大値の約50％まで減少するまで個々の段階において続けた。この事は15〜40CVの間に相当する。NaCl濃度範囲内での溶出されたイソ型群の更なる分画は、前記イソ型の更なる分離を生じる。カラムの進行速度は最大15CV／時であった。

中和緩衝液：100mM リン酸ナトリウム／カリウム、pH7.5±0.2
平衡化緩衝液：10mM リン酸ナトリウム／カリウム、pH7.5±0.2
洗浄緩衝液：30mM 酢酸ナトリウム／酢酸、pH5.0±0.2
溶出緩衝液：10mM 酢酸ナトリウム／酢酸、pH5.0±0.2、20mM NaCl、又は10mM〜70mM NaClまでの濃度増加
個々の純粋イソ型を、Ａ）及びＢ）に記述した精製に従って得られたイソ型群から単離した。

Ａ〜Ｃから得られた純粋なイソ型（IF）を酸性から塩基性までのそれらの等電点（pI）に従い番号をつけた。イソ型２（IF2）は、最も低いpIを有する、最も強く酸性の単離されたイソ型である。イソ型８は最も高いpIを有する、最も強く塩基性である。イソ型２は、出発混合物から十分な量において単離されうる、最も低いpIを有するイソ型であった。出発混合物において、イソ型１の１〜２％のみが存在するため、完全な解析のために十分な量を得ることが出来ない。

純粋なイソ型を特徴づけるために以下の解析：
− PP-HPLCによる量及び収率の決定
− キャピラリー電気泳動及び等電点電気泳動による純度及び同一性の決定；
を行った。
個々のイソ型の収率は、一般に出発混合物において使用されるイソ型の20％〜30％の間であった。
イソ型の純度は通常90％以上、多くは94％以上でさえあった。

11.2 結果
精製されたイソ型（IF）のために以下のデータ：
− Ｎ結合炭水化物構造の相対分布（グリコシル化総数に関する２アンテナ、３アンテナ及び４アンテナ構造の比率）及び繰り返しの含量
− 正常マウス試験における生物学的活性
− シアル酸含量；
を得た。

これらの決定を前述した方法によって本質的に行った。
それぞれ個々のイソ型調製品のための単離されたイソ型のシアル酸含量は、単独に決定されなかったが、CHO細胞由来EPOのイソ型２〜８又はヒト細胞由来EPOのイソ型２〜６のそれぞれの例として１〜３個の調製品において行われた。
各イソ型の、おおよその、全ての番号のシアル酸の値をＮ−アセチルラクトサミン単位の含量（LE値）とシアル酸含量（SA）の積を算出するために使用した。
これらおおよそのSA値は、CHO細胞及びヒト細胞由来のEPOにおいて以下の様に：14（IF2）、13（IF3）、12（IF4）、11（IF5）、10（IF6）、9（IF7）及び8（IF8）；であった。

表７はCHO細胞（CHO1，CHO2及びCHO3）並びにヒト細胞（HeLa１〜５）由来の様々なEPOの特異的活性と炭水化物構造の間の関係のデータを含む。この表は生物学的活性とEPO分子におけるＮ−アセチルラクトサミン単位の平均総数（LE）、平均シアル酸含量（SA）並びにLE×SAの積との間の関係を示す。
表８はCHO細胞由来の予備分画されていないEPO群の単離されたイソ型の、生物学的活性とEPO分子におけるＮ−アセチルラクトサミン単位の平均総数（LE）、平均シアル酸含量（SA）並びにLE×SAの積との間の関係のデータを含む。

表９はCHO細胞由来の予備分画されたEPO群の様々な画分から単離されたイソ型（IF2又はIF5）の様々な調製品（Ａ又はＢ）の比較を含み、すなわちイソ型２及び５の２つの調製品（Ａ及びＢ）がそれぞれの場合において解析された。予備分画を例11.1Cに記述されたDE陰イオン交換体によって行った。イソ型IF2及びIF5の２つの調製品Ａ及びＢを、DEカラムの異なる画分から単離した（画分５及び６からIF2、画分２及び３からIF5）。IF2/A又はIF5/Aがそれぞれ単離された画分５又は２は、IF2/B又はIF5/Bがそれぞれ単離された画分６又は３より、ＤＥセファロースカラムから容易に溶出された（より低い塩濃度において）。

しかしながら、イソ型２又は５の調製品Ａ及びＢはそれぞれ、次の等電点電気泳動において又はキャピラリー電気泳動においてそれらの特性に違いはなく、すなわちIF2又はIF5の両調製品は同一のシアル酸含量を有している。しかしながら、調製品Ａからのイソ型が、それらのより高いＬＥ値及びより高い繰り返し構造の含量のため、調製品Ｂの相当するイソ型よりも有意に高い生物学的活性を有する事が驚くことに明らかとなった。同一のシアル酸含量においてEPO分子内に含まれるＮ−アセチルラクトサミン単位の総数に対するイソ型の生物学的活性の表９に記載の依存性はイソ型２及び５だけでなく他のイソ型においても観察されなかった。

表10は様々なEPO供給源（CHO細胞又はヒトHeLa S3細胞）由来の相当するイソ型を比較する。また、この場合において相関関係が生物学的活性とLE×SAの値との間で明らかになった。
故に、全ての表において、相関関係がＮ−アセチルラクトサミン単位数（LE）とシアル酸含量（SA）の積と生物学的活性との間で見られうる。LE×SAの積の高い値は高い生物学的活性と常に関連する。

付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位（繰り返し）を有するＮ結合炭水化物構造の比率に対する生物学的活性の依存を、例として個々のイソ型を用いてFig.4に示す。イソ型を、繰り返し含有炭水化物構造の異なる比率を含むEPO調製品から単離した（繰り返し含有構造を約50％有するEPO1、約40%有するEPO2及び約15%を有するEPO3）。対応するイソ型（同一のシアル酸含量及びほぼ同一のアンテナ度）の生物学的活性は、繰り返し含有炭水化物構造がそのイソ型において減少する様に減少する。この特性は、イソ型２から少なくともイソ型７においてまで見られうる。

図１は付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位（繰り返し）及びシアル酸を有する４アンテナ構造の図を示す。 図２は培養培地に加えられた炭水化物類に対する個々のEPOイソ型の相対的な比率の依存性を示す。 図３は培養培地に加えられた炭水化物類に対するEPO調製品の生物学的活性の依存性を示す。 図４はＮ−アセチルラクトサミン繰り返し単位に対するEPOのイソ型の生物学的活性の依存性を示す。

Claims (24)

1. EPO分子のＮ−グリコシル化総数に関して少なくとも平均13.0のＮ−アセチルラクトサミン単位数を含むグリコシル化されたEPO分子から本質的に成る、少なくとも175,000IU/mgタンパク質のin vivoでの比活性を有するEPO組成物であって、EPO分子がCHO細胞における外来DNAの発現産物であり、且つCHO細胞由来のグリコシル化されたEPO分子から構成され、ここで、Ｎ結合炭水化物鎖の総数に関してＮ−アセチルラクトサミンの繰り返しを持つ炭水化物鎖の比率が少なくとも30％である、EPO組成物の製造方法において、
   （ａ）Ｎ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有する炭水化物鎖の製造が可能である産生細胞を選択し、
   （ｂ）Ｎ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有する炭水化物鎖を製造するための前記細胞培養のための培養条件を選択し、当該培養条件には、30℃と35.5℃の間の温度で培養を行うことを含んで成り、そして
   （ｃ）Ｎ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有する炭水化物鎖を含むEPO分子を富化し、不所望の成分を除去する、
   ことを含んでなる方法。
2. Ｎ−アセチルラクトサミン単位数が少なくとも、Ｎグリコシル化総数に関して平均13.5である、請求項１に記載のEPO組成物の製造方法。
3. EPO分子の合計N-グリコシル化に関するN-アセチルグルコサミン単位の平均数にEPOの分子当たりの平均シアル酸含量を掛けた積が少なくとも130の値を有するグリコシル化されたEPO分子から本質的に成る、請求項１に記載のEPO組成物の製造方法。
4. EPO分子の合計N-グリコシル化に関するN-アセチルグルコサミン単位の平均数にEPOの分子当たりの平均シアル酸含量を掛けた積が少なくとも130の値を有するグリコシル化されたEPO分子から成る、請求項１に記載のEPO組成物の製造方法。
5. 前記の積の値が少なくとも140である、請求項３又は４に記載のEPO組成物の製造方法。
6. イソ型３又は４の混合物を含んで成る、請求項１〜５のいずれか１項に記載のEPO組成物の製造方法。
7. 少なくとも200,000IU/mgタンパク質のin vivoでの比活性を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のEPO組成物の製造方法。
8. １分子当たりの平均シアル酸含量が少なくとも11である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のEPO組成物の製造方法。
9. 炭水化物鎖の総数に関するＮ−アセチルラクトサミン繰り返しを持つ炭水化物鎖の平均比率と炭水化物鎖の総数に関する４アンテナ構造の平均比率との積の値が少なくとも2400である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のEPO組成物の製造方法。
10. 前記細胞が無血清培地で培養される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のEPO組成物の製造方法。
11. 医薬調製物の製造方法において、
    （１）請求項１〜10のいずれか１項に記載の方法によりEPO組成物を製造し、そして
    （２）前記EPO組成物を、一般的な医薬希釈剤、補助物質又は担体と一緒にする、
    ことを含む方法。
12. 工程（ｂ）が少なくとも２つの炭水化物の前記培養液への添加を含んで成る、請求項１〜11のいずれか１項に記載の方法。
13. 工程（ｂ）が少なくとも３つの炭水化物の前記培養液への添加を含んで成る、請求項１〜11のいずれか１項に記載の方法。
14. グルコース及び／又はマンノース及び／又はガラクトースを含む炭水化物混合物が使用される、請求項12に記載の方法。
15. 工程（ｂ）が前記細胞の要求に依存して少なくとも１つの必須アミノ酸及び／又は少なくとも１つの炭水化物を含んで成る栄養素の必要性に従う調節添加を含んで成る、請求項１〜11のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記細胞の栄養素要求が前記培養液において測定されたグルタミンの濃度に依存して決定される、請求項15に記載の方法。
17. 前記栄養素が前記細胞の全体の増殖期を越えて必要性に従い加えられる、請求項15又は16に記載の方法。
18. 前記栄養素が少なくとも２つの炭水化物の混合物を含んで成る、請求項15〜17のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記栄養素が少なくとも３つの炭水化物の混合物を含んで成る、請求項15〜18のいずれか１項に記載の方法。
20. 工程（ｂ）が33℃と35.0℃の間の温度での培養を含んで成る、請求項１〜19のいずれか１項に記載の方法。
21. 工程（ｃ）がpH値６〜８の範囲内における逆層クロマトグラフィー段階を含んで成る、請求項１〜11のいずれか１項に記載の方法。
22. アセトニトリル、エタノール又はイソプロパノールが溶出剤として使用される、請求項21に記載の方法。
23. 工程（ｃ）がトリアジン色素を使用する親和性クロマトグラフィー段階を含んで成る、請求項１〜11のいずれか１項に記載の方法。
24. 工程（ｃ）がレクチンを使用する親和性クロマトグラフィー段階を含んで成る、請求項１〜11のいずれか１項に記載の方法。

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