JP2003238593A - 高い比活性を有するエリスロポエチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、ＥＰＯ組成物を、炭水化物構造内
のＮ−アセチルラクトサミン単位及び／又は４アンテナ
分枝を高い比率のものに強化することを特徴とする、Ｅ
ＰＯ組成物の比活性を増大する方法を提供することを課
題とする。 【解決手段】 本発明は、ＥＰＯ分子を、（ａ）Ｎ−ア
セチルラクトサミンの繰り返しを高い比率で有し、そし
て任意に（ｂ）多数のＮ−アセチルラクトサミン単位を
有し、（ｃ）Ｎ−アセチルラクトサミン単位の数とシア
ル酸含量との積について高い値を有し、そして／あるい
は（ｄ）Ｎ−アセチルラクトサミンの繰り返しと４アン
テナ炭水化物構造との積について高い値を有する、組成
物に強化することによって、ＥＰＯ組成物の比活性を増
大する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】説明 本発明は、その炭水化物構造においてＮ−アセチルラク
トサミン単位及び／又は４アンテナ分枝の高含量によっ
て特徴づけられる高い比活性を有する新規ＥＰＯ組成物
に関する。本発明はまた、その様なＥＰＯ製品の単離法
に関する。

【０００２】エリスロポエチン（ＥＰＯ）は赤血球細胞
の産生を刺激するヒト糖タンパク質である。ＥＰＯは健
康な人の血液血漿において、非常に低濃度だけ発生する
ので、この様により多くの量を提供する事は可能ではな
い。ＥＰ−Ｂ１−０ １４８６０５及びＥＰ−Ｂ１−０
２０５ ５６４はＣＨＯ細胞における組換えヒトＥＰ
Ｏの製造を記載する。ＥＰ−Ｂ１−０ １４８ ６０５
において記載されたＥＰＯは尿ＥＰＯ及び非Ｏグリコシ
ル化のものより高い分子量を有する。ＣＨＯ細胞由来の
ＢＰ−Ｂ１−０ ２０５ ５６４において記載されたＥ
ＰＯは大量において及び純粋形態において現在入手可能
である。

【０００３】更に無形成貧血を有する患者の尿からのヒ
トＥＰＯの単離が知られている（Miyake et al., J. Bi
ol. Chem. 252 (1977), 5558〜5564）。組換え及び尿の
ＥＰＯはそれらのシアル化の値において異なることが知
られている様々なイソ型の混合物として単離される。こ
れらのＥＰＯのイソ型は異なる等電点を有し、そして等
電点電気泳動又はキャピラリー電気泳動（Tsao et al.,
Biotech. Bioeng. 40 (1992), 1190-1196 ; Nieto et a
l., Anal. Commun. 33(1996), 425-427 ; Tran et al.,
J. Chromatogr. 542 (1991), 459-471 ; Bietot et a
l., J. Chromatogr. 759 (1997), 177-184 ; Watson et
al., Anal. Biochem. 210 (1993), 389-393 参照）に
よって分離されうる。最も大きな数のシアル酸を有する
イソ型は最も高い比活性を有し、一方最も少ない数を有
するそれらは最も低い活性を有する（例えばImai et a
l., Eur. J. Biochem. 194 (1990),457-462 ; EP-A-0 4
28 267参照）。

【０００４】Takeuchiらは（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 86 (1989), 7819-7822)、前記生物学的活性とシアル
酸含量と２アンテナ及び４アンテナの炭水化物構造の比
率との関係を記述している。Takeuchiらは、更にＥＰＯ
の炭水化物構造におけるＮ−アセチルラクトサミン単位
の存在が前記生物学的活性と相互に関係していない事を
結論づけている。

【０００５】Fukudaらは（Blood 73 (1989),84〜89）、
前記生物学的活性に重要な貢献をする血液循環由来のＥ
ＰＯの排出速度を扱い、そして比較的多量のＮ−アセチ
ルラクトサミン単位を有するＥＰＯが、ラクトサミン単
位を有していないＥＰＯよりも前記循環からより素速く
除去される事を結論づけている。Morimotoらは（Glycoc
onjugate J. 13 (1996),1093〜1120）、ｍｏｎｏ−Ｑク
ロマトグラフィーによるＥＰＯのイソ型の分離、そして
その個々の画分が２、３のイソ型のみから成っている事
を記述している。これらの画分で行われた前記研究は、
全ての画分における全ての構造の平衡を示している。相
互関係が２アンテナ若しくは４アンテナの構造の含量又
はＮ−アセチルラクトサミン単位の含量と前記比活性の
間に見出されなかった。

【０００６】この様に前記従来技術はシアル酸の含量に
関して、特に前記糖構造と前記生物学的活性の一般的な
相互関係がある事を示している。しかしながら、４アン
テナ構造の含量及び／又はＮ−アセチルラクトサミンの
含量が直接前記生物学的活性と相互関係している事は全
く記載が無い。ＥＰＯ調製品を精製するとき、驚くこと
に炭水化物構造における４アンテナ炭水化物構造及び／
又はＮ−アセチルラクトサミン単位の増大が前記特異的
な生物学的活性の有意な改良を引き起こす事が明らかに
された。これは、ＥＰＯが欧州適用９７ １１２ ６４
０．４に従うヒト細胞系において製造される場合に特に
適用可能である。

【０００７】個々のＥＰＯ調製品又はＮ−アセチルラク
トサミン単位（ＬＥ単位）の含量において本質的にわず
かに異なる炭水化物構造のＥＰＯイソ型の比較活性の研
究は、前記調製品又は同一のシアル酸含量及びほぼ同一
のアンテナ度の値のＮ−アセチルラクトサミン単位の高
含量を有するイソ型の更に有意に高い活性を示してい
る。この関連において、アンテナ度は、前記ＥＰＯ調製
品の２アンテナ、３アンテナ及び４アンテナのＮ結合炭
水化物鎖の、又はＮ結合炭水化物鎖の総数に関する前記
単離ＥＰＯのイソ型の、相対的平均含量（ｉｎ％）とし
て理解される。更に、４−アンテナ構造の含量が高めら
れたものを有する調製品又はイソ型において特に、ラク
トサミン単位の全含量がｉｎ ｖｉｖｏ活性において非
常に重要である事を明らかにした。Ｎ−アセチルラクト
サミン単位の全含量における増加、例えばＬＥ単位を有
するその核構造の付加的な伸長の形態（いわゆる繰り返
し）における増加は前記生物学的活性を相当増大するこ
とができる。更に４アンテナ構造の含量における増大が
前記生物学的活性を改善しうる事が明らかにされた。

【０００８】故に、最大限可能な高い比活性を有し及び
高収率のＥＰの製造を試みるならば、それに続く精製段
階、製造細胞及び／又はその培養は４アンテナ炭水化物
構造の最大限可能な高い含量及び／又はＮ−アセチルラ
クトサミン単位の最大限可能な高い含量を達成するため
に選択及び最適化されなければならない。本発明の第一
の観点は炭水化物鎖の総数、すなわち２アンテナ、３ア
ンテナ及び４アンテナ構造の合計に関して少なくとも７
５％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少
なくとも８５％及び最も好ましくは少なくとも９０％の
４アンテナ構造の比率を含むグリコシル化されたＥＰＯ
分子から本質的に成るＥＰＯ組成物に関する。

【０００９】本発明の更なる観点は、ＥＰＯ分子のＮ結
合炭水化物鎖当たりの前記平均組成物に関して少なくと
も３．７、好ましくは少なくとも４．０、特に好ましく
は少なくとも４．３及び最も好ましくは少なくとも４．
５のＮ−アセチルラクトサミン単位の平均数又はＥＰＯ
分子の全ての３Ｎ結合炭水化物構造（全Ｎグリコシル
化）に関して少なくとも１１．１、好ましくは少なくと
も１２．０、特に好ましくは少なくとも１３．０及び最
も好ましくは少なくとも１３．５のＮ−アセチルラクト
サミン単位数を含むグリコシル化されたＥＰＯ分子から
本質的に成るＥＰＯ組成物に関する。

【００１０】本発明の更なる観点は、ＥＰＯ分子当たり
のＮ−アセチルラクトサミン単位の平均総数にＥＰＯの
分子当たりの平均シアル酸含量を掛けた積が少なくとも
１３０、好ましくは少なくとも１３５、特に好ましくは
少なくとも１４０及び最も好ましくは少なくとも１６０
の値を有するグリコシル化されたＥＰＯ分子から本質的
に成る、ＥＰＯ組成物に関する。

【００１１】この文脈において“本質的に”の語は前記
所望のＥＰＯ分子がその組成物におけるＥＰＯ分子の総
数に関して好ましくは少なくとも８０％、特に好ましく
は少なくとも９０％及び最も好ましくは少なくとも９５
％の比率において存在する事を意味する。本発明のより
更なる観点は炭水化物鎖の総数に関して少なくとも７５
％、好ましくは少なくとも８０％及び特に好ましくは少
なくとも８５％の平均比率の４アンテナ構造を有するグ
リコシル化されたＥＰＯ分子から成るＥＰＯ組成物に関
する。

【００１２】更に本発明はＥＰＯ分子のＮ結合炭水化物
鎖当たりの組成物の平均に関して少なくとも３．７、好
ましくは少なくとも４．０並びに特に好ましくは少なく
とも４．３及び最も好ましくは少なくとも４．５の平均
数のＮ−アセチルラクトサミン単位を有し、又はＥＰＯ
分子の全ての３Ｎ結合炭水化物構造に関して少なくとも
１１．０、好ましくは少なくとも１２．０、特に好まし
くは少なくとも１３．０及び最も好ましくは少なくとも
１３．５の数のＮ−アセチルラクトサミン単位を含むグ
リコシル化されたＥＰＯ分子から成るＥＰＯ組成物に関
する。

【００１３】４アンテナ構造の最大比率は、各々の４ア
ンテナ構造がＮ結合糖の核構造において４個のＮ−アセ
チルラクトサミン単位を含む場合、全炭水化物鎖の１０
０％に達することができる。いわゆる繰り返しの様に核
構造の伸長を生じる付加的なＮ−アセチルラクトサミン
単位は炭水化物構造当たりのＮ−アセチルラクトサミン
数並びにグリコシル化の総数を増大することができる。
グリコシル化部位当たりの（すなわちＮ結合炭水化物構
造当たりの）Ｎ−アセチルラクトサミン単位の数は６
（繰り返しの形態における４アンテナ構造及び２つの付
加的なＮ−アセチルラクトサミン単位）まで達すること
ができ、又は（２つの付加的なＮ−アセチルラクトサミ
ン単位以上有する場合において）それより多くなりう
る。Ｎ−アセチルラクトサミン単位の数はグリコシル化
の総数（３Ｎ結合炭水化物構造）に関して１８又はそれ
以上になりうる。

【００１４】本発明のより更なる観点は、ＥＰＯ分子の
Ｎ−アセチルラクトサミン単位の平均総数にＥＰＯの分
子当たりの平均シアル酸含量を掛けた積が少なくとも１
３０、好ましくは少なくとも１３５、特に好ましくは少
なくとも１４０及び最も好ましくは少なくとも１６０の
平均値を有するグリコシル化された分子から成るＥＰＯ
組成物に関する。

【００１５】本発明の更なる主題は前記の観点の少なく
とも２又はそれ以上の形態を有するＥＰＯ組成物であ
る。本発明に従う組成物は１又は複数のイソ型すなわち
等電点電気泳動において異なる等電点を有するＥＰＯ分
子から成りうる。本発明に従う組成物は少なくとも２つ
の、例えば２〜５つのイソ型の混合物、特に３又は４つ
のイソ型の混合物を好ましくは含んで成る。

【００１６】本発明に従う組成物の比活性はｉｎ ｖｉ
ｖｏ（正血球状態のマウス）で好ましくは少なくとも１
７５，０００IU／mg、特に２００，０００IU／mgであ
る。前期比活性は特に好ましくは約２００，０００〜４
００，０００IU／mg又は４５０，０００IU／mgタンパク
質の範囲内、最も好ましくは２５０，０００〜４００，
０００IU／mg又は４５０，０００IU／mgタンパク質の範
囲内である。

【００１７】本発明に従う前記組成物において、平均シ
アル酸含量又はＥＰＯの分子当たりのシアル酸残基の平
均数は好ましくは１１〜１４、特に好ましくは少なくと
も１１．５及び最も好ましくは少なくとも１２．５であ
る。本発明に従う前記ＥＰＯ組成物は、一方で、哺乳類
の細胞、例えば齧歯類の細胞、例えば、ＥＰ−Ｂ−０
２０５ ５６４に記載のＣＨＯ又はＢＨＫにおける外来
ＤＮＡの発現の産物であるＥＰＯ分子から得ることがで
きる。あるいは、前記組成物は、ヒト細胞、例えばNama
lwa (Nadkarni et al., Cancer 23 (1969),64-79), HT1
080 (Rasheed et al., Cancer 33 (1973), 1027-1033)
又はHeLa S3(Puck et al., J. Exp. Meth. 103 (1956),
273-284)の様な不死化された細胞における遺伝子活性
の後の、内因性ＤＮＡの発現の産物であるＥＰＯ分子か
らも成りうる。この様な方法は欧州特許適用９７ １１
２ ６４０．４に記述され、その開示は本発明の適用の
部分を成す。

【００１８】ＥＰＯの生物学的活性のための更に重要な
パラメーターは、Ｎ結合炭水化物鎖の総数に関する繰り
返し、すなわち付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位
を有する炭水化物鎖の比率、及びこの繰り返しの比率と
炭水化物鎖の総数に関する４アンテナ炭水化物鎖の比率
との積の値である。ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯの場合にお
いて、繰り返しの比率は好ましくは少なくとも３０％、
特に好ましくは少なくとも３５％及び最も好ましくは少
なくとも４０％である。ヒト細胞、例えばＨｅＬａ細胞
由来のＥＰＯの場合には、繰り返しの比率は好ましくは
少なくとも１０％、特に好ましくは少なくとも１２％及
び最も好ましくは少なくとも１４％である。故に、ＣＨ
Ｏ細胞由来のＥＰＯの場合には、炭水化物鎖の総数に関
するＮ−アセチルラクトサミン繰り返しを持つ炭水化物
鎖の比率と炭水化物鎖の総数に関する４アンテナ構造の
比率との積の値は好ましくは少なくとも２４００、特に
好ましくは少なくとも２８００及び最も好ましくは少な
くとも３４００である。ヒト細胞由来のＥＰＯの場合に
は、前記値は好ましくは少なくとも８００、特に好まし
くは少なくとも９６０及び最も好ましくは少なくとも１
１００である。

【００１９】ＥＰＯ組成物は、低含量の血清、例えば最
大１％（Ｖ／Ｖ）を含む培養培地において又は特別に無
血清培地において（このＷＯ９６／３５７１８を参照）
ＥＰＯ製造細胞を培養することにより製造されてきたも
のが好ましくは使用される。適当な培養培地の例はＲＰ
ＭＩ１６４０又はＤＭＥＭである。本発明に従うＥＰＯ
組成物は一般の医薬希釈剤、補助物質及び担体と任意に
一緒の医薬調製品として調製されうる。医薬調製品を製
造するために使用されうる本発明に従うＥＰＯ組成物
は、逆層ＨＰＬＣ（例えばＶｙｄａｃ Ｃ４カラム使
用）及び／又はサイズ排除クロマトグラフィー（例えば
ＴＳＫ２０００ＳＷ Ｕｌｔｒａｐａｃカラム使用）に
よって決定された好ましくは少なくとも９９％及び特に
好ましくは少なくとも９９．９％の純度を有する。

【００２０】更に、本発明に従う組成物は、１０，００
０IUタンパク質当たりのＤＮＡが好ましくは１０pg以
下、特に好ましくは５pg以下及び最も好ましくは１pg以
下のＤＮＡ含量を有する。更に本発明に従う組成物は、
好ましくは微生物の夾雑物（１CFU ／ml以下）及びエン
ドトキシン（１EU／１０，０００IUタンパク質）を本質
的に含まない。

【００２１】前記ＤＮＡ含量は放射活性又は蛍光で標識
されたＤＮＡを用いてハイブリダイゼーション試験によ
って決定されうる。商業的に入手可能な精製されたヒト
ＤＮＡがそのプローブＤＮＡの例として使用される。前
記ヒトＤＮＡは更に前記試験のスタンダードとして使用
されうる。その様なハイブリダイゼーション試験の検出
の下限は約０．３pg／１０，０００IU ＥＰＯである。
前記ＥＰＯ調製品の微生物及びエンドトキシンの含量は
医薬の欧州又はＵＳ特許に記載の標準化された方法によ
って決定されうる。

【００２２】本発明によって所望される前記形態を好ま
しくは有するＥＰＯ組成物は以下の方法： （ａ）４アンテナ構造及び／又はＮ−アセチルラクトサ
ミン単位を高い比率で有する炭水化物鎖の製造が可能で
ある適当な製造細胞の選択、（ｂ）４アンテナ構造及び
／又はＮ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有す
る炭水化物鎖を製造するための前記細胞培養のための適
当な培養条件の選択及び（ｃ）４アンテナ構造及び／又
はＮ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有する炭
水化物鎖を含むＥＰＯ分子の強化（ｅｎｒｉｃｈｉｎ
ｇ）の間、ＥＰＯ分子の知られた組成物からの不所望成
分の分離；の少なくとも１つによって得られる。

【００２３】方法（ａ）は適当な産生細胞の選択を含ん
で成る。この場合、ある者は、一方で、前記所望の炭水
化物鎖構造を高収率で産生する傾向を有する事が知られ
ている細胞を使用しうる。その様な細胞系の例はハムス
ター由来の細胞、例えばＣＨＯ若しくはＢＨＫ及びヒト
細胞系由来の、例えばＨｅＬａ，Ｎａｍａｌｗａ，ＨＴ
１０８０又はそれら由来の細胞系である。ＨｅＬａ Ｓ
３細胞又は改良ＣＨＯ細胞が特に好まれる。

【００２４】一方、細胞内であるグリコシル化酵素を過
剰発現させることによって、例えば組換え体発現によっ
て及び／又は内因性遺伝子の活性によって適当な製造細
胞を特に製造することも可能である。その様なグリコシ
ル化酵素の例はシアリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセ
チルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びガラクトシ
ルトランスフェラーゼである。

【００２５】方法（ｂ）は前記細胞培養における適当な
培養条件を含んで成る。本発明の第一の態様において、
方法（ｂ）は少なくとも２つ及び好ましくは少なくとも
３つの炭水化物の混合物を培養培地に加える事も含んで
成る。前記炭水化物は単糖類及び二糖類、例えばグルコ
ース、グルコサミン、リボース、フルクトース、ガラク
トース、マンノース、スクロース、ラクトース、マンノ
ース−１−リン酸、マンノース−１−硫酸及びマンノー
ス−６−硫酸から好ましくは選択される。栄養培地は例
えばグルコース及び／又はマンノース及び／又はガラク
トースを含むものが適当である。各々の炭水化物がＤ
（＋）型で特に好ましく使用される場合、例えば１：
（０．５−３）：（１−５）及び特に１：（０．７−
２．４）：（１．８−４．０）の質量比の、グルコー
ス、ガラクトース及びマンノースの混合物を含む栄養培
地を用いて特に良い結果が得られる。発酵の間の全ての
糖類の合計濃度は、前記培養培地において好ましくは
０．１〜１０ｇ／ｌ、特に好ましくは２〜６ｇ／ｌであ
る。炭水化物混合物は以下で更に詳細に解明される前記
細胞のそれぞれの要求性に依存して好ましくは加えられ
る。

【００２６】更に好ましい態様に従い、方法（ｂ）は前
記の培養された細胞系のための少なくとも１つの必須ア
ミノ酸及び／又は各々の細胞要求性に依存の少なくとも
１つの炭水化物を含んで成る、栄養素の調節された、好
ましくは要求性に従う添加を含んで成る。この方法にお
いて、多くの改良されたグリコシル化が、高細胞密度発
酵（採収時の細胞密度が１０×１０⁵ 細胞／ml以上及び
好ましくは２０×１０ ⁵ 細胞／ml以上）にもかかわらず
大発酵槽（容積１ｌ以上、例えば５０〜１０，０００
ｌ）において得られる。この目的のために、前記細胞の
栄養要求性に関連するパラメーターの濃度は、連続的に
又は適当な時間間隔で、例えば少なくとも日に１回決定
され、そしてそれらの消費速度が算出される。この事は
前記細胞の栄養要求性が定量的に及び／又は定性的に決
定される事を可能にする。この様なパラメーターは前記
細胞の栄養素又は代謝産物、例えばグルタミン、アンモ
ニウム、グルコース及び／又は乳酸の濃度そして特にグ
ルタミン濃度でありうる。

【００２７】本発明のこの観点に従って添加された前記
栄養素は、必須アミノ酸、例えばグルタミン及び／又は
トリプトファン及び／又は炭水化物類並びに好ましくは
更に非必須アミノ酸、ビタミン類、微量元素、塩類及び
／又は増殖因子、例えばインスリンから成る。前記栄養
素は特に好ましくは少なくとも１つの必須アミノ酸及び
少なくとも１つの炭水化物を含む。これらの栄養素は溶
解状態において培養培地に好ましくは計量しながら加え
られる。前記栄養素溶液はグルタミン及び炭水化物類、
特に上述した様な少なくとも２つの炭水化物類の混合物
を好ましくは含む。グルコース、ガラクトース及びマン
ノースの混合物が特に好ましく使用される。更に栄養素
が前記細胞の全体の増殖期の後の必要性に従い、すなわ
ち培養培地において測定された前記の選択されたパラメ
ーターの濃度に依存して加えられる事が好まれる。

【００２８】前記栄養素溶液における炭水化物類に対す
るグルタミンの量比は、発酵槽における消費率に本質的
に一致する様、好ましくは選択される。この事は発酵槽
において個々の基質の一定の濃度が維持される事を実質
上可能にする。グルタミンの濃度は前記培養培地におい
て１５０mg／ｌ以下の値で好ましくは維持され、そして
前記培養培地において２−３mmol／ｌ以上のアンモニウ
ム濃度の発生を防ぐ。発酵の間、糖類の全濃度は既に説
明した様に培養培地で好ましくは０．１〜１０ｇ／ｌの
範囲内、特に好ましくは２〜６ｇ／ｌの範囲内である。

【００２９】使用される栄養素溶液は全ての糖に関して
好ましくは１：３〜２０の範囲内及び特に好ましくは
１：５〜１５の範囲内である糖に対するグルタミンの質
量比を含む。使用される栄養素溶液がグルタミン、並び
に三つの糖、グルコース、ガラクトース及びマンノース
を含む場合、前記糖類に対するグルタミンの質量比は、
好ましくは１：（１〜３）：（１〜５）：（２〜８）及
び特に好ましくは１：（１．５〜２．２）：（１．５〜
３．６）：（４〜６）である。

【００３０】前記培養は好ましくは繰り返しのバッチ工
程として行われ、増殖期の後に培養液の一部が採収さ
れ、そして前記培養液の残査が、続いて作業体積に新鮮
培地で再び満たされる発酵槽において維持される。本発
明に従う前記工程はグルコシル化されたＥＰＯが高収率
で採収される事を可能にする。故に採収時の前記濃度は
例えば培養培地のＬ当たりのＥＰＯが少なくとも３０mg
及び特に少なくとも４０mgである。

【００３１】本発明のより更なる観点は真核細胞からの
ＥＰＯの単離方法であり、ここで前記真核細胞は適当な
培地において培養され、そして前記ＥＰＯは培養上清か
ら単離され、その培養において特徴づけられる前記方法
は３６℃以下、好ましくは３０と３５．５℃の間及び特
に好ましくは３３と３５．０℃の間の温度で行われる。
培養の間の温度を低める事によって所望のグリコシル化
を有するＥＰＯの比率が大いに増大されうる事は驚きを
持って見出された。

【００３２】方法（ｃ）は本適用の特徴を満たさない、
炭水化物構造の知られたＥＰＯ組成物からの不所望の成
分の分離を含んで成る。例えば、この事は前記ＥＰＯ調
製品のクロマトグラフィー精製によって、例えばトリア
ジン色素ゲル、好ましくはシバルコンブルー色素ゲルで
の親和性クロマトグラフィーによって行われうる。不所
望の成分もまた、疎水性相互作用クロマトグラフィー及
び逆層ＨＰＬＣを用いる事によって更に分離されうる。
このために適当なリガンドはブチル、ペンチル、オクチ
ル、オクタデシル及びフェニル残基である。前記逆層Ｈ
ＰＬＣ段階は、６．０〜８．５の範囲内及び特に好まし
くは７．０〜８．０の範囲内のpHの値で好ましくは行わ
れる。適当な溶出液は、例えばアセトニトリル、エタノ
ール又はイソプロパノール、好ましくはアセトニトリル
である。

【００３３】適当な画分が決定され、プールされそして
最終的にキャピラリー ゾーン電気泳動解析（ＣＺＥ）
を用いて、更に処理されうる。更に高含量のＮ−アセチ
ルラクトサミン単位を有するＥＰＯ分子はトマト又はジ
ャガイモ由来のレクチン類を用いて直接強化されうる
（MerKle, Cummings, J. Biol. Chem. 262 (1987),8179
〜8189）。その様なレクチン類は例えば固定化型におい
て好ましくは使用される。

【００３４】本発明の更なる主題はＥＰＯ組成物の比活
性を増大させるための方法であり、ここでＥＰＯ分子
は； （ａ）高い比率の４アンテナ構造、（ｂ）多数のＮ−ア
セチルラクトサミン単位、（ｃ）高い値の、Ｎ−アセチ
ルラクトサミン単位数とシアル酸含量との積、（ｄ）高
い比率のＮ−アセチルラクトサミン繰り返し及び／又は
（ｅ）高い値の、Ｎ−アセチルラクトサミン繰り返しと
４アンテナ炭水化物構造との積：を有する組成物に強化
される。

【００３５】この強化は、上述した方法（ａ），（ｂ）
及び（ｃ）の１又は複数によって達成されうる。 例１ 細胞系の培養上清からのＥＰＯの精製 前記クロマトグラフィー段階の数及び原理において異な
る本質的に２つの方法が、ヒト細胞又はＣＨＯ細胞由来
の細胞培養上清からＥＰＯを精製するために使用され、
培地の組成及びＥＰＯ濃度に依存して使用された： 方法１による２％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を
含むＨｅＬａ細胞培養上清の精製例：１．ブルーセファロースカラム： ５ml Ｈｉ−Ｔｒａｐブルーカラム(Pharmaciaの既製の
ブルーセファロースカラム）を少なくとも５カラム体積
（CV）の緩衝液Ａ（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．
０；５mM ＣａＣｌ₂ ；１００mM ＮａＣｌ）で平衡化
した。続いて７０mlのＨｅＬａ細胞上清（約２４５μｇ
のＥＰＯ及び７０〜１００mgの全タンパク質を含む）を
循環方法において０．５ml／分の流速で一晩吸収させ
た。

【００３６】前記カラムを少なくとも５CVの緩衝液Ｂ
（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０；５mM ＣａＣ
ｌ₂ ；２５０mM ＮａＣｌ）及び少なくとも５CVの緩衝
液Ｃ（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０；０．２mM
ＣａＣｌ₂ ；２５０mM ＮａＣｌ）を用いて０．５ml
／分で洗浄した。洗浄の成功をＯＤ２８０でタンパク質
含量を測定することによって監視した。

【００３７】ＥＰＯを緩衝液Ｄ（１００mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ、pH７．０；０．２mM ＣａＣｌ₂ ；２Ｍ Ｎａ
Ｃｌ）を用いて０．５ml／分の流速で溶出した。溶出溶
液を１〜２mlの画分に集めた。前記画分、洗浄溶液及び
溶出溶液のＥＰＯ含有量を、アリコートをＰＯＲＯＳＲ
２／Ｈカラム（Boehringer Manheim）にかけることによ
り逆層（ＲＰ）−ＨＰＬＣによって決定した。択一的
に、免疫ドット−ブロットをＥＰＯを含む画分の定性的
な同定のために使用した。

【００３８】ＥＰＯを含む溶出画分（８〜１２ml）をプ
ールし、ブチルセファロースカラムにかけた。ブルーセ
ファロースカラム後の収量は約１７５μｇ ＥＰＯであ
った（約７０％に相当）。たいていブルーセファロース
後の収率は５０と７５％の間であった。

【００３９】２．ブチルセファロースカラム（疎水性相
互作用クロマトグラフィー） 自分で作った２〜３mlのブチルセファロースカラム（材
料：Toyopearl butylS650）を少なくとも５CVの緩衝液
Ｄ（１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０；０．２mM
ＣａＣｌ₂ ；２Ｍ ＮａＣｌ）を用いて平衡化し、そ
してそれに続きＥＰＯを含む方法１からのブチルセファ
ロースプール（約１５０μｇＥＰＯ）を０．５ml／分の
流速で吸収させた。

【００４０】前記カラムを少なくとも５CVの緩衝液Ｅ
（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０；２Ｍ ＮａＣ
ｌ及び１０％イソプロパノール）を用いて０．５ml／分
で洗浄した。洗浄の成功をＯＤ２８０でタンパク質含量
を測定することによって監視した。ＥＰＯを緩衝液Ｆ
（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０；２Ｍ ＮａＣ
ｌ及び２０％イソプロパノール）を用いて室温で及び
０．５ml／分の流速で溶出した。溶出溶液を１〜２mlの
画分において回収した。

【００４１】前記画分、洗浄溶液及び溶出溶液のＥＰＯ
含有量を、アリコートをＰＯＲＯＳＲ２／Ｈカラムにか
けることによりＲＰ−ＨＰＬＣによって決定した。択一
的に、免疫ドット−ブロットをＥＰＯを含む画分の定性
的な同定のために使用した。ＥＰＯを含む溶出画分（１
０〜１５ml）をプールし、ハイドロキシアパタイトカラ
ムにかけた。

【００４２】ブチルセファロースカラムの収量は約１３
０μｇ ＥＰＯであった（約８５％に相当）。たいてい
ブチルセファロースの収率はブルーセファロースにかけ
たプールの６０と８５％の間であった。３．ハイドロキシアパタイトカラム ５mlのハイドロキシアパタイトカラム(Bio RADの既製の
Ｅｃｏｎｏ−ＰａｃＣＨＴII）を少なくとも５CVの緩衝
液Ｆ（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０；２Ｍ Ｎ
ａＣｌ；２０％イソプロパノール）を用いて平衡化し、
そしてそれに続きＥＰＯを含む方法２からのブチルセフ
ァロースプール（約１２５μｇ ＥＰＯ）を０．５ml／
分の流速で吸収させた。

【００４３】前記カラムを少なくとも５CVの緩衝液Ｇ
（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０；２Ｍ ＮａＣ
ｌ）を用いて０．５ml／分で洗浄した。洗浄の成功をＯ
Ｄ２８０でタンパク質含量を測定することによって監視
した。ＥＰＯを緩衝液Ｈ（１０mM リン酸ナトリウム、
pH７．０；８０mM ＮａＣｌ）を用いて０．５ml／分の
流速で溶出した。溶出溶液を１〜２mlの画分において回
収した。

【００４４】前記画分、洗浄溶液、及び溶出溶液のＥＰ
Ｏ含有量を、アリコートをＰＯＲＯＳ Ｒ２／Ｈカラム
にかけることによってＲＰ−ＨＰＬＣによって決定し
た。ＥＰＯを含む溶出画分（３〜６ml）をプールした。
ハイドロキシアパタイトカラムの収量は約８０μｇ Ｅ
ＰＯであった（約６０％に相当）。たいてい、ハイドロ
キシアパタイトカラムの収率はブチルセファロースにか
けたプールの５０と６５％の間であった。

【００４５】４．濃縮 ハイドロキシアパタイト段階からの、プールされたＥＰ
Ｏ画分を１０KDの排除サイズを有する遠心装置（例えば
Filtron のＭｉｃｒｏｓｅｐ）において０．１〜０．５
mg／mlの濃度まで濃縮した。０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０
を加え、そしてこれを−２０℃でアリコートにおいて保
存した。

【００４６】

【表１】

【００４７】単離されたＥＰＯの純度は約９０％以上、
通常９５％以上でさえあった。ブチルセファロース段階
が削除された方法２は、ＥＰＯ収率を増大させるために
も使用される。この方法は、１％（Ｖ／Ｖ）ＦＣＳ補足
の添加が無し又は有りの細胞培養培地に特に適用するこ
とができ、そして単離されたＥＰＯの収率はほぼ同一の
純度（９０〜９５％）である。ハイドロキシアパタイト
カラムのための平衡化緩衝液（緩衝液Ｆ）における５mM
ＣａＣｌ₂ の存在は、この方法において結合の改良、
そしてこのようにハイドロキシアパタイト段階における
ＥＰＯの再現可能な溶出性質の改良を導いた。その結
果、方法２は原理において同一な、方法１の様な方法を
使用する以下の緩衝液を用いて行われた： １．ブルーセファロースカラム： 平衡化緩衝液（緩衝液Ａ）：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．０； ５mM ＣａＣｌ₂ ；１００mM ＮａＣｌ 洗浄緩衝液１（緩衝液Ｂ）：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．０； ５mM ＣａＣｌ₂ ；２５０mM ＮａＣｌ 洗浄緩衝液２（緩衝液Ｃ）：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．０ ５mM ＣａＣｌ₂ ，２５０mM ＮａＣｌ 溶出緩衝液（緩衝液Ｄ）：１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．０ ５mM ＣａＣｌ₂ ；２Ｍ ＮａＣｌ ２．ハイドロキシアパタイトカラム 平衡化緩衝液（緩衝液Ｆ）：５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．０； ５mM ＣａＣｌ₂ ；１Ｍ ＮａＣｌ 洗浄緩衝液（緩衝液Ｇ） ：１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．０； ５mM ＣａＣｌ₂ ；８０mM ＮａＣｌ 溶出緩衝液（緩衝液Ｈ） ：１０mM リン酸ナトリウム、pH７．０； ０．５mM ＣａＣｌ₂ ；８０mM ＮａＣｌ

【００４８】

【表２】

【００４９】方法１における緩衝液Ｃ〜Ｇへの５mM Ｃ
ａＣｌ₂ の添加はまた、結合の改良及びハイドロキシア
パタイトカラムからの溶出のさらなる定義づけへと導
く。択一的又は付加的に以下の段階もＥＰＯを精製する
ために使用される： − ＲＰ−ＨＰＬＣ、例えばＶｙｄａｃ Ｃ４材料を使
用 − ＤＥＡＥセファロースｆｆクロマトグラフィー − ダイアフィルトレーション 例２：イソ型１〜８（対比）の保持と同時の、培養上清
からのＥＰＯの精製 １．出発材料 哺乳類細胞、例えばＣＨＯ又はヒト細胞由来のＥＰＯを
繰り返しのバッチ工程によって発酵した。１０００Ｌの
発酵槽を前培養したもので接種し、そして前記発酵槽の
中身を約３〜５日後に採収した。採収の後、前記細胞を
遠心によって発酵液から取り除いた。前記無細胞培養上
清を１mol ／ｌの酢酸を用いてpH５．０〜５．２に調節
し、そして１〜９℃で濾過する。

【００５０】２．ブルーセファロースクロマトグラフィ
ー クロマトグラフィーカラム（Ａｍｉｃｏｎ Ｐ４４０×
５００、Ａｍｉｃｏｎ，ＧＢ）を６０〜８０Ｌのブルー
セファロースで満たし、そして０．５Ｎ ＮａＯＨを用
いて再生させた。次に前記カラムを約３カラム体積（C
V）の酢酸緩衝液を用いて平衡化した。

【００５１】pH５に調節された無細胞培養上清を１０±
５℃の温度及び８００〜１４００ml／分の流速でカラム
に吸収させた。前記カラムを約１CVの洗浄緩衝液１を用
いて前記と同一の流速及び５±４℃で再洗浄した。これ
に約２CVの洗浄緩衝液２を続けた。次に前記カラムを約
３CVの溶出緩衝液を用いて溶出した。全てのタンパク質
のピークを回収し（約３０〜６０Ｌ）、ＨＣｌを用いて
pH６．９に調節し、そして次の工程まで５±４℃で保存
した。前記の製品溶液をこのクロマトグラフィー段階に
おいて濃縮し、そして約４０〜５０％の純度を達成し
た。

【００５２】 平衡化緩衝液：２０mM 酢酸ナトリウム、５mM ＣａＣｌ₂ 、 ０．１Ｍ ＮａＣｌ，pH５．０±０．２ 洗浄緩衝液１：２０mM 酢酸ナトリウム、５mM ＣａＣｌ₂ 、 ０．２５Ｍ ＮａＣｌ，pH５．０±０．２ 洗浄緩衝液２：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ 、 pH６．５±０．３ 溶出緩衝液：１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ 、 １Ｍ ＮａＣｌ，pH９．０±０．２ ３．ブチルトーヨーパールクロマトグラフィー（疎水性
クロマトグラフィー） クロマトグラフィーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢＰ
Ｇ ３００／５００）を３０〜４０Ｌのブチルトーヨー
パールで満たし、そして４ＭグアニジンＨＣｌ及び０．
５Ｎ ＮａＯＨを用いて再生した。次にカラムを少なく
とも３CVの平衡化緩衝液を用いて平衡化した。

【００５３】前記ブルーセファロースカラムからの溶出
液を１０％イソプロパノールに調節し、そして２７±２
℃の温度及び８００〜１２００ml／分の流速で吸収させ
た。カラムを約１CVの平衡化緩衝液及びそれに続く約２
CVの洗浄緩衝液を用いて前記と同一の温度及び流速で再
洗浄した。次にそれを約３CVの溶出緩衝液を用いて溶出
した。全てのタンパク質のピークを回収し（約１０〜１
８Ｌ）、すぐに希釈緩衝液を用いて３倍に希釈し、そし
て次の工程まで１５℃で保存した。約９０％の純度をこ
のクロマトグラフィーにおいて達成した。

【００５４】 平衡化緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ ，０．７５Ｍ ＮａＣｌ，１０％ イソプロパノール、pH６．９±０．２ 洗浄緩衝液 ：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ ，０．７５Ｍ ＮａＣｌ，１９％ イソプロパノール、pH６．９±０．２ 溶出緩衝液 ：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ ，０．７５Ｍ ＮａＣｌ，２７％ イソプロパノール、pH６．９±０．２ 希釈緩衝液 ：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ ，pH６．９±０ ．２ ４．ハイドロキシアパタイトウルトロゲルクロマトグラ
フィー クロマトグラフィーカラム（Ａｍｉｃｏｎ Ｐ４４０×
５００又は等価のもの）を３０〜４０Ｌのハイドロキシ
アパタイトウルトロゲルで詰め、０．５Ｎ ＮａＯＨで
再生した。次にカラムを少なくとも４CVの平衡化緩衝液
で平衡化した。

【００５５】前記ブチルトーヨーパールカラムからの溶
出溶液を、約１５℃の温度及び５００〜１２００ml／分
の流速でカラムに吸収させた。カラムを約１CVの平衡化
緩衝液及びそれに続く約２CVの洗浄緩衝液を用いて前記
と同一の温度及び流速で再洗浄した。次にそれを約３CV
の溶出緩衝液を用いて溶出した。全てのタンパク質ピー
クを回収し（約１０〜１８Ｌ）、そして次の工程まで１
５℃で保存した。９５％以上の純度をこのクロマトグラ
フィーにおいて達成した。

【００５６】 平衡化緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ ，０．２５Ｍ ＮａＣｌ，９％ イソプロパノール、pH６．９±０．２ 洗浄緩衝液 ：１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ ，pH６．８±０ ．２ 溶出緩衝液 ：１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM リン酸カリウム、 ０．５Ｍ ＣａＣｌ₂ ，pH６．８±０．２ ５．逆層ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ） 予備的なＨＰＬＣをＭｅｒｃｋ Ｐｒｅｐｂａｒ １０
０分離装置（又は同等のもの）を用いて２２±４℃の温
度で行った。分離カラム（１００mm×４００mm、３．２
１）をＶｙｄａｃ Ｃ４材料で詰めた。使用の前に、カ
ラムを緩衝液Ａから１００％溶媒までの勾配に繰り返し
かけ再生し、そして次に緩衝液Ａを用いて平衡化した。

【００５７】前記ハイドロキシアパタイトカラムからの
溶出溶液をトリフルオロ酢酸を用いて約pH２．５に酸性
化し、そして無菌濾過した。次にそれをカラムに２２±
４℃の温度及び２５０〜３１０ml／分の流速でかけた。
カラムを緩衝液Ａから緩衝液Ｂへの直線勾配を用いて前
記と同一の温度及び流速で溶出した。溶出ピークを画分
に回収した。溶出溶液を最初に加えた４体積分のＨＰＬ
Ｃ希釈緩衝液によってすぐに中和した。

【００５８】分析的なＨＰＬＣにおいて少なくとも９９
％の純度を有する画分をプールした（プール体積約４〜
６Ｌ）。微量不純物をこのクロマトグラフィーにおいて
分離し、そして９９％以上の純度を達成した。 緩衝液Ａ：０．１％ トリフルオロ酢酸／水 緩衝液Ｂ：８０％ アセトニトリル、０．１％ トリフ
ルオロ酢酸／水 ＨＰＬＣ希釈緩衝液：１０mM リン酸ナトリウム／カリ
ウム、pH７．５±０．２ ６．ＤＥＡＥ−セファロースｆｆクロマトグラフィー クロマトグラフィーカラム（Ａｍｉｃｏｎ Ｐ９０×２
５０又は等価のもの）を、かけるＥＰＯのｇ当たり１０
０〜２００mlのゲルで満たし、そして０．５ＮＮａＯＨ
を用いて再生した。次にカラムを最初に１００mM リン
酸ナトリウム／カリウム緩衝液、pH７．５、そして少な
くとも１２CVの平衡化緩衝液を用いて平衡化した。

【００５９】前記ＨＰＬＣカラムからの溶出溶液を５±
４℃の温度及び約１５０ml／分の流速でカラムに吸収さ
せた。カラムを少なくとも５CVの平衡化緩衝液及びそれ
に続いて約１０CVの洗浄緩衝液を用いて前記と同一の温
度及び流速で再洗浄した。次にそれを約１０CVの平衡化
緩衝液を用いて再び洗浄し、そしてそれに続いて約７CV
の溶出緩衝液を用いて溶出した。全てのタンパク質ピー
クを回収し（約２〜５Ｌ）、無菌濾過し、そして分配し
た。

【００６０】このクロマトグラフィーにおいて前記ＨＰ
ＬＣ段階からの溶媒を分離し、そして微量不純物を除去
した。純度は９９％以上である。 平衡化緩衝液：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、pH７．５±０．２ 洗浄緩衝液：３０mM 酢酸ナトリウム、pH４．５±０．１ 溶出緩衝液：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、８０mM ＮａＣｌ，pH７ ．５±０．２ 例３：イソ型１〜４（発明）の保持と同時の培養上清か
らのＥＰＯの精製 １．出発材料 哺乳類細胞、例えばＣＨＯ又はヒト細胞由来のＥＰＯを
繰り返しのバッチ工程によって発酵した。１０Ｌの発酵
槽を前培養したもので接種し、そして前記発酵槽の中身
を約３〜５日後に採収した。採収の後、前記細胞を遠心
によって発酵液から取り除いた。前記無細胞培養上清を
１mol ／ｌの酢酸を用いてpH５．０〜５．２に調節し、
そして１〜９℃で濾過する。

【００６１】２．ブルーセファロースクロマトグラフィ
ー 適当なクロマトグラフィーカラムを１５０〜２５０mlの
ブルーセファロースで満たし、そして０．５Ｎ ＮａＯ
Ｈを用いて再生させた。次に前記カラムを約３カラム体
積（CV）の酢酸緩衝液を用いて平衡化した。pH５に調節
された無細胞培養上清を１０±５℃の温度及び１〜２CV
／時の流速でカラムに吸収させた。前記カラムを約１CV
の洗浄緩衝液１を用いて前記と同一の流速及び５±４℃
で再洗浄した。これに約２CVの洗浄緩衝液２を続けた。
次に前記カラムを約３〜６CVの溶出緩衝液を用いて溶出
した。タンパク質のピークを画分に回収した。ＣＥ解析
の後、適当な画分をプールし、ＨＣｌを用いてpH６．９
に調節し、そして次の工程まで５±４℃で保存した。前
記の製品溶液をこのクロマトグラフィー段階において濃
縮し、不純物及び塩基性のイソ型を分離した。

【００６２】 平衡化緩衝液：２０mM 酢酸ナトリウム、５mM ＣａＣｌ₂ 、 ０．１Ｍ ＮａＣｌ，pH５．０±０．２ 洗浄緩衝液１：２０mM 酢酸ナトリウム、５mM ＣａＣｌ₂ 、 ０．２５Ｍ ＮａＣｌ，pH５．０±０．２ 洗浄緩衝液２：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ 、 pH６．５±０．３ 溶出緩衝液：１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ 、 ０．２５Ｍ ＮａＣｌ，pH８．０±０．２ ３．ブチルトーヨーパールクロマトグラフィー（疎水性
クロマトグラフィー） 適当なクロマトグラフィーカラムを２００〜３００mlの
ブチルトーヨーパールで満たし、そして４Ｍグアニジン
ＨＣｌ及び０．５Ｎ ＮａＯＨを用いて再生した。次に
カラムを少なくとも３CVの平衡化緩衝液を用いて平衡化
した。

【００６３】前記ブルーセファロースカラムからの溶出
液を１０％イソプロパノールに調節し、そして２７±２
℃の温度及び１〜２CV／時の流速で吸収させた。カラム
を約１CVの平衡化緩衝液及びそれに続く約２CVの洗浄緩
衝液を用いて前記と同一の温度及び流速で再洗浄した。
次にそれを約５〜１０CVの溶出緩衝液を用いて溶出し
た。画分をタンパク質ピークから回収し、すぐに希釈緩
衝液を用いて３倍に希釈した。ＣＥ解析の後、適当な画
分をプールし、次の工程まで１５℃で保存した。このク
ロマトグラフィーにおいて、更に基本的なイソ型を除去
し、そして約８０％以上の純度を達成した。

【００６４】 平衡化緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ ，０．２Ｍ Ｎ ａＣｌ，１０％ イソプロパノール、pH６．９±０．２ 洗浄緩衝液 ：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ ，０．２Ｍ Ｎ ａＣｌ，１７％ イソプロパノール、pH６．９±０．２ 溶出緩衝液 ：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ ，０．２Ｍ Ｎ ａＣｌ，２３％ イソプロパノール、pH６．９±０．２ 希釈緩衝液 ：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ ，pH６．９±０ ．２ ４．ハイドロキシアパタイトウルトロゲルクロマトグラ
フィー 適当なクロマトグラフィーカラムを１５０〜２００mlの
ハイドロキシアパタイトウルトロゲルで詰め、０．５Ｎ
ＮａＯＨで再生した。次にカラムを少なくとも４CVの
平衡化緩衝液で平衡化した。

【００６５】前記ブチルトーヨーパールカラムからの溶
出溶液を、約１５℃の温度及び１〜２CV／時の流速でカ
ラムに吸収させた。カラムを約１CVの平衡化緩衝液及び
それに続く約２CVの洗浄緩衝液を用いて前記と同一の温
度及び流速で再洗浄した。次にそれを約３CVの溶出緩衝
液を用いて溶出した。全てのタンパク質ピークを回収
し、そして次の工程まで１５℃で保存した。９５％以上
の純度をこのクロマトグラフィーにおいて達成した。

【００６６】 平衡化緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ ，０．０６Ｍ ＮａＣｌ，７．５％ イソプロパノール、pH６．９±０．２ 洗浄緩衝液 ：１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ ，pH６．８±０ ．２ 溶出緩衝液 ：１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM リン酸カリウム、 ０．５mM ＣａＣｌ₂ ，pH６．８±０．２ ５．逆層ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ） 半調製用ＨＰＬＣをＶｙｄａｃ Ｃ４カラム（２０mm×
２５０mm、約８０ml）を用いて２２±４℃の温度で行っ
た。使用の前に、カラムを緩衝液Ａから１００％溶媒ま
での勾配に繰り返しかけ再生し、そして次に緩衝液Ａを
用いて平衡化した。

【００６７】前記ハイドロキシアパタイトカラムからの
溶出溶液を２２±４℃の温度及び８〜１５ml／分の流速
でカラムにかけた。カラムを次のＨＰＬＣ実験計画に従
って緩衝液Ａから緩衝液Ｂへの直線勾配を用いて前記と
同一の温度及び流速で溶出した。溶出ピークを画分に回
収した。溶出溶液を最初に加えた４体積分のＨＰＬＣ希
釈緩衝液においてすぐに中和した。

【００６８】

【表３】

【００６９】分析用ＨＰＬＣにおいて少なくとも９９％
の純度を有し、そしてＣＥ解析に従う適当な画分をプー
ルした。微量不純物及び塩基性イソ型の残査をこのクロ
マトグラフィーにおいて除去し、そして９９％以上の純
度を達成した。 緩衝液Ａ：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、pH７．０±０．２ 緩衝液Ｂ：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、８０％ アセトニトリル、 pH７．０ ＨＰＬＣ希釈緩衝液：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、１００mM Ｎａ Ｃｌ，pH７．５±０．２ ６．ダイアフィルトレーション 適当な大きさのダイアフィルトレーション装置を１０KD
のカセットで合わせ、１Ｎ ＮａＯＨで再生した。次に
この装置をバルク緩衝液を用いてアルカリが無くなるま
ですすいだ。

【００７０】前記ＨＰＬＣカラムの溶出溶液を５±４℃
の温度で濃縮し、そして１０体積のバルク緩衝液に対し
てダイアフィルトレーションした。最終的な濃度は１〜
３mg／mlの間であるべきである。この段階は前記ＨＰＬ
Ｃ段階から溶媒残査を除去すること、要求されたバルク
緩衝液条件及びバルク活性物質の製品濃度を調節するこ
とを提供する。

【００７１】バルク緩衝液：１０mM リン酸ナトリウム
／カリウム、１００mM ＮａＣｌ，pH７．５±０．２ 例４：ｉｎ ｖｉｖｏでのＥＰＯの比活性の決定（正血
球状態マウスでのバイオアッセイ） 赤血球前駆体細胞の増殖及び分化におけるＥＰＯの投与
量依存的活性は、ＥＰＯ投与の後、マウスにおける血液
中の網状赤血球の増大によってｉｎ ｖｉｖｏで決定さ
れた。

【００７２】このため、解析されうるＥＰＯ試料及びＥ
ＰＯ標準（ＥＰＯ ＷＨＯ標準で標準化された）の様々
な投与量を８匹のマウスに非経口に各々投与した。前記
マウスを一定の定めた条件下で引き続き保った。血液
を、ＥＰＯ投与の後、４日目のマウスから回収し、そし
て網状赤血球をアクリジンオレンジで染色した。３０，
０００赤血球当たりの網状赤血球数を赤色蛍光ヒストグ
ラムの解析によるフローサイトメーターにおける微蛍光
定量法によって決定した。

【００７３】生物学的活性を前記試料及びLinderによっ
て記述された、平行直線を用いる濃度のペアワイズ（ｐ
ａｉｒ ｗｉｓｅ）決定法（Linder“Planen und Auswe
rtenvon Versuchen”, 3rd. edition, 1969, Birkenhae
user Verlag, Basel)に従う、異なる投与量における標
準の網状赤血球数の値から算出された。ＥＰＯ調製品Ｃ
ＨＯ１，ＣＨＯ２及びＣＨＯ３を、それぞれ２４８，０
００（ＣＨＯ１）、２２５，０００（ＣＨＯ２）及び１
８６，０００IU／mg（ＣＨＯ３）の生物学的活性を有す
る、無血清培地において培養されたＣＨＯ細胞の培養上
清からＥＰＯを精製することによって得た。ヒト細胞の
培養上清から精製されたＥＰＯの４つの調製品におい
て、２２０，０００（ＨｅＬａ１）、１９８，０００
（ＨｅＬａ２）、２０４，０００（ＨｅＬａ３）、１７
６，０００（ＨｅＬａ４）及び１００，０００IU／mg
（ＨｅＬａ５）の比活性を有する製品が得られた。糖構
造のためのパラメーターを有する生物学的活性の値の関
係を例１１において与える。 例５：シアル酸残基含量の決定 アルスロバクター・ウレアファシエンス（A. ureaf., B
oehringer Mannheim）由来のノイラミニダーゼを用いた
シアル酸の酵素的開裂の後、Dionex system のＨＰＡＥ
Ｃ−ＰＡＤ（パルス電流計検出を用いる高pH陰イオン交
換クロマトグラフィー）によってシアル酸含量を決定し
た。

【００７４】ＣＨＯ及びヒト細胞系（例えばＨｅＬａ
Ｓ３）の様々な調製品由来のＥＰＯを２２μｇそれぞれ
含む調製品を、５mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH７．
２中で０．２mg／mlのＥＰＯ濃度に調節した。それぞれ
の調製品の半分を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって前記ＥＰＯ
の量を正確に決定するために使用した。A. ureaf. 由来
の５mMノイラミニダーゼを前記調製品の残りの半分のも
のに加え、３７℃で一晩（約１８時間）インキュベート
した。次に消化混合物を２等分し、Ｈ₂ Ｏを用いて５０
０μｌに２０倍希釈し、その５０μｌ（約２７pmol Ｅ
ＰＯに相当）を前記Dionex system にかけた。次のクロ
マトグラフィーパラメーターを、このために使用した。

【００７５】 カラム：ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ １００ 流速：１．０ml／分 検出感度：３００nA 勾配： ｔ（分） ％緩衝液Ｂ ０ １７ ７ １７ ９ １００ １２ １００ １３ ０ ２０ ０ 緩衝液Ａ：０．１Ｍ ＮａＯＨ 緩衝液Ｂ：０．１Ｍ ＮａＯＨ；０．５Ｍ 酢酸ナトリウム 適用した試料におけるシアル酸の量を、同様に解析され
たシアル酸標準の値（Boehringer Mannheim)から得られ
た検量線の補助を用いて決定した。シアル酸含量（モル
シアル酸／モルＥＰＯ）をシアル酸決定の結果（Dion
ex system)及びＲＰ−ＨＰＬＣによって使用されたＥＰ
Ｏの量の決定から算出した。

【００７６】ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯはモルＥＰＯ当た
り１２．９モル（ＣＨＯ１）、１１．８（ＣＨＯ２）及
び１１．７モル（ＣＨＯ３）シアル酸の平均含量を有し
ていた。ヒト細胞に由来するＥＰＯ調製品はモルＥＰＯ
当たり１３．１モル（ＨｅＬａ１）、１３．２モル（Ｈ
ｅＬａ２）、１３．３モル（ＨｅＬａ３）、１１．６モ
ル（ＨｅＬａ４）及び１０．８モル（ＨｅＬａ５）のシ
アル酸量を有していた（例１１も参照）。 例６：２アンテナ、３アンテナ及び４アンテナ炭水化物
構造の比率の決定 Ｎ結合炭水化物構造をDionex system のＨＰＡＥＣ−Ｐ
ＡＤクロマトグラフィー的に解析した。ＣＨＯ及びヒト
細胞系（ＨｅＬａ Ｓ３）由来のＥＰＯ調製品のアシア
ロオリゴ糖類をＮ−グリコシダーゼＦ（Boehringer Man
nheim)及びA. ureaf由来のノイラミニダーゼ（Boehring
er Mannheim)を用いた酵素的開裂によって単離した。

【００７７】混合物当たり１０又は３０μｇのＥＰＯ
を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ超遠心装置（Ａｍｉｃｏｎ、排所
サイズ１０KD）によって脱塩し、１０mM リン酸ナトリ
ウム緩衝液、pH７．２を用い０．２又は０．３mg／mlの
濃度に調節した。次に１ＵのＮ−グリコシダーゼＦ及び
１０mU ノイラミニダーゼを各混合物に加え、３７℃で
一晩（約１８時間）インキュベートした。開裂したオリ
ゴ糖類からＥＰＯポリペプチド部分を単離するために、
混合物をインキュベーションの後、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ
遠心装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、排所サイズ１０KD）を
通して遠心し、前記Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ装置を２０mlの
Ｈ₂ Ｏで再び２回洗浄した。濾液中に含まれたオリゴ糖
類をＨ₂ Ｏで１５０mlに合わせ、その１００μｌをDion
ex systemで解析した。このために、以下のクロマトグ
ラフィーのパラメーターを使用した。

【００７８】 カラム：ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ １００ 流速：１．０ml／分 検出感度：３００nA 勾配： ｔ（分） ％緩衝液Ｂ ０ ０ ２ ０ ６０ １０ ６２ １００ ６７ １００ ｔ（分） ％緩衝液Ｂ ６９ ０ ８０ ０ 緩衝液Ａ：０．１Ｍ ＮａＯＨ 緩衝液Ｂ：０．１Ｍ ＮａＯＨ；０．５Ｍ 酢酸ナトリウム ピークを標準的なオリゴ糖類による複合型のＮ糖のクロ
マトグラムにおいて同定し、エンド−β−ガラクトシダ
ーゼ又はフコシダーゼの酵素を用いてＥＰＯのオリゴ糖
類の酵素的消化によって変化させ、そしてDionex syste
m での次の解析にかけた。２アンテナ、３アンテナ及び
４アンテナ構造のパーセンテージを全ピーク領域（２ア
ンテナ、３アンテナ及び４アンテナ構造のピーク領域の
総計）に関するＮ糖構造に一致して表されるピークの領
域によって算出した。

【００７９】ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯは４．２％ ２ア
ンテナ炭水化物構造、２２．３％３アンテナ炭水化物構
造及び７３．５％の４アンテナ炭水化物構造（ＣＨＯ
３）の含量、ＣＨＯ１調製品において８６．７％の４ア
ンテナ炭水化物構造並びにＣＨＯ２において７８．６％
の含量を有していた。ヒト細胞系由来のＥＰＯの調製品
における２アンテナ／３アンテナ／４アンテナ構造の含
量は、ＨｅＬａ１で５．８／８．８／８５．４％、Ｈｅ
Ｌａ２で５．１／１２．７／８２．２％、ＨｅＬａ３で
４．１／１７．７／７８．２％、ＨｅＬａ４で１０．１
／１９．２／７０．６％、ＨｅＬａ５で１２．６／２
５．４／６２％であった（例１１も参照）。 例７：Ｎ−アセチルラクトサミン単位の平均含量及び付
加的なＮ−アセチルラクトサミン単位（繰り返し）の平
均含量の決定 ＥＰＯのＮ結合炭水化物構造中のＮ−アセチルラクトサ
ミン単位（すなわち核中の炭水化物構造＋繰り返し）の
総数を、例６の実験のクロマトグラムのピーク領域から
算出した。

【００８０】炭水化物鎖当たりのＮ−アセチルラクトサ
ミン単位の平均含量の数（ｎ）を以下の様に算出した： ｎ＝Σ％（２アンテナ）×２＋％（３アンテナ）×３＋
％（４アンテナ）×４＋％（３アンテナ＋１ｒ）×４＋
％（４アンテナ＋１ｒ）×５＋％（３アンテナ＋２ｒ）
×５＋％（４アンテナ＋２ｒ）×６ （ここで％（２アンテナ）＝Ｎ結合炭水化物の総計（１
００％）に関する２アンテナ構造のパーセンテージ； ％（３アンテナ）＝付加的なＮ−アセチルラクトサミン
単位無しの３アンテナ構造のパーセンテージ ％（４アンテナ）＝付加的なＮ−アセチルラクトサミン
単位無しの４アンテナ構造のパーセンテージ； ％（３アンテナ＋１ｒ）＝１つの付加的なＮ−アセチル
ラクトサミン単位を有する３アンテナ構造のパーセンテ
ージ； ％（４アンテナ＋１ｒ）＝１つの付加的なＮ−アセチル
ラクトサミン単位を有する４アンテナ構造のパーセンテ
ージ； ％（３アンテナ＋２ｒ）＝２つの付加的なＮ−アセチル
ラクトサミン単位を有する３アンテナ構造のパーセンテ
ージ； ％（４アンテナ＋２ｒ）＝２つの付加的なＮ−アセチル
ラクトサミン単位を有する４アンテナ構造のパーセンテ
ージ；である）。

【００８１】ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯの場合、炭水化物
鎖当たり４．３（ＣＨＯ１）、４．４（ＣＨＯ２）及び
４．２（ＣＨＯ３）のＮ−アセチルラクトサミン単位の
平均数が明らかになった。ヒト細胞由来のＥＰＯ調製品
において、４．０（ＨｅＬａ１）、４．０（ＨｅＬａ
２）、３．９（ＨｅＬａ３）、３．７５（ＨｅＬａ４）
及び３．６（ＨｅＬａ５）のＮ−アセチルラクトサミン
単位数が明らかになった（例１１も参照）。

【００８２】ＥＰＯが３Ｎ結合糖構造を含む事実のた
め、Ｎ−アセチルラクトサミン単位の総数は更に３倍高
い。ＥＰＯのグルコシル化総数に関して、ＣＨＯ細胞由
来のＥＰＯにおけるＮ−アセチルラクトサミン単位数
は、故に１２．９（ＣＨＯ１）、１３．２（ＣＨＯ２）
及び１２．６（ＣＨＯ３）である。ヒト細胞のＥＰＯ調
製品において、一致する値は１２．０（ＨｅＬａ１）、
１１．９（ＨｅＬａ２）、１１．７（ＨｅＬａ３）、１
１．２５（ＨｅＬａ４）及び１０．８（ＨｅＬａ５）で
あった。

【００８３】それぞれのシアル酸含量を掛けた炭水化物
構造当たりのＮ−アセチルラクトサミン単位数の積は、
ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯにおいて５５．５（ＣＨＯ
１）、５２（ＣＨＯ２）及び４９．３（ＣＨＯ３）の値
を生じた。ヒト細胞由来のＥＰＯ調製品の場合におい
て、一致する値は５２．４（ＨｅＬａ１）、５２．５
（ＨｅＬａ２）、５１．３（ＨｅＬａ３）、４３．５
（ＨｅＬａ４）及び３８．９（ＨｅＬａ５）であった。

【００８４】ＥＰＯのグリコシル化総数（３Ｎ結合炭水
化物構造）に関して、それぞれのシアル酸含量を掛けた
Ｎ−アセチルラクトサミン単位数の積は、ＣＨＯ細胞由
来のＥＰＯにおいてそれぞれ１６６．５（ＣＨＯ１）、
１５６（ＣＨＯ２）及び１４７．９（ＣＨＯ３）であ
る。ヒト細胞由来のＥＰＯ調製品において、一致する値
は１５７．２（ＨｅＬａ１）、１５７．５（ＨｅＬａ
２）、１５３．９（ＨｅＬａ３）、１３０．５（ＨｅＬ
ａ４）及び１１６．７（ＨｅＬａ５）であった（例１１
も参照）。

【００８５】更に重要なパラメーターは、繰り返しと称
される、炭水化物構造の核に結合しうるＮ−アセチルラ
クトサミン単位の量である（Ｆｉｇ．７参照）。繰り返
しの含量は、全てのＮ結合炭水化物構造の総計（２アン
テナ＋３アンテナ＋４アンテナ＝１００％）に関する炭
水化物構造を含む繰り返しのパーセンテージとして記載
されている。

【００８６】この繰り返しの比率は、ＣＨＯ細胞由来及
びヒト細胞由来のＥＰＯ調製品において異なりうる。こ
の様に、３９．６％（ＣＨＯ１）、５１％（ＣＨＯ２）
及び３６．８％（ＣＨＯ３）の繰り返し比率がＣＨＯ細
胞由来の調製品のものとして決定された。１８％（Ｈｅ
Ｌａ１）、１６．５％（ＨｅＬａ２）、１４．０％（Ｈ
ｅＬａ３）、１２．２％（ＨｅＬａ４）及び９．８％
（ＨｅＬａ５）がヒト細胞由来の調製品のものとして決
定された（例１１参照）。 例８：要求に従う調節及び供給によるＥＰＯの生物学的
活性への影響 培養を３６．５℃の温度で要求に従う供給を用いる繰り
返しのバッチ工程（繰り返しのフェドバッチ）として行
った。このために、無血清の、タンパク質に乏しい培養
培地を滅菌発酵槽（総作業容量：１０ｌ）に居え、そし
て接種培養物を用いて１回接種した。接種後の細胞密度
は３±１×１０⁵ 生細胞／mlであった。

【００８７】１４４±２４時間の増殖期の後、培養液の
一部を採収した。培養液の残りは発酵槽内に残され、そ
して次の増殖期のための接種の代わりとなった；この目
的のため発酵槽は再び作業容積まで新鮮培地で満たされ
た。ＥＰＯを含む培養上清を発酵培養物を遠心する事に
よって得た。栄養素溶液を、増殖期の間、連続的に培養
物に加えた。この目的のために、栄養素溶液を含む保存
容器は発酵槽と組合わされた。栄養素溶液はアミノ酸
類、ビタミン類、インスリン、微量元素、塩類、グルタ
ミン及び炭水化物類を含んだ。２つの発酵を以下の様に
行った：発酵Ａにおいて栄養素溶液は糖としてＤ−
（＋）−グルコースを含み、そして発酵Ｂにおいて糖類
はＤ−（＋）−グルコース、Ｄ−（＋）−ガラクトース
及びＤ−（＋）−マンノースであった。糖類に対するグ
ルタミンの質量比は発酵Ｂにおいて１：２、２：３、
６：６であった。栄養素溶液における個々の糖類の濃度
は７．２〜１８ｇ／ｌの間であった。

【００８８】培養物におけるグルタミンの濃度は発酵Ｂ
において周期的に解析され、そしてその消費が算出され
た。栄養素溶液の瞬間体積流は細胞の栄養素要求に釣り
合っていた。発酵Ａにおいてグルタミン濃度は調節変化
が可能なものとして使用されなかった。発酵Ｂにおける
栄養素溶液は、２：３：５の質量比のＤ−（＋）−グル
コース、Ｄ−（＋）−ガラクトース及びＤ−（＋）−マ
ンノースの糖類の混合物を含んだ。発酵槽における全糖
類の濃度は、一致した供給によって培養の間、２〜６ｇ
／ｌの範囲内に保たれた。

【００８９】細胞密度は、増殖の間、採収時までに２０
×１０⁵ 細胞／ml以上、典型的に３０±１０×１０⁵ 細
胞／mlに変化した。採収時、ＥＰＯの濃度は典型的に４
０±１０mg／ｌであった。ヒトエリスロポエチンの濃度
は、採収した培養液において、例えばＥＬＩＳＡによっ
て決定された。生じたこのタンパク質のイソ型のパーセ
ンテージ分布は、例えばキャピラリーゾーン電気泳動
（ＣＺＥ）を用いた分離によって決定された。

【００９０】表４は、グルコースを含む栄養素溶液が供
給される発酵Ａとグルコース、マンノース及びガラクト
ースを含む栄養素溶液が供給される発酵Ｂとの間のＥＰ
Ｏイソ型の分布の比較を示す。発酵ＢにおけるＥＰＯイ
ソ型の含量は、発酵Ａのイソ型に対応するパーセンテー
ジとして算出された。後者は各々１００％に標準化され
た。本データは、所望の高度にグリコシル化されたＥＰ
Ｏイソ型２〜４が、発酵Ａと比較して、発酵の間、より
高い比率で本質的に存在している事を示す。

【００９１】

【表４】

【００９２】供給を用いて得られたイソ型のパターン
は、栄養素溶液の調節され及び要求に従う供給を用いた
発酵から４つの連続的な採収において再現可能であっ
た。 例９：培養温度の変化によるＥＰＯの生物学的活性への
影響 本工程は、発酵槽温度が３６．５℃の代わりに３５．０
℃である事を除く、調節され及び要求に応じる供給を用
いるフェド−スプリットバッチ（ｆｅｄ−ｓｐｌｉｔｂ
ａｔｃｈ）工程における例８において記述したものと同
じであり（発酵Ｂ）、本発酵は１０００Ｌ規模で行われ
た。

【００９３】表５は、各々が栄養素溶液の調節された供
給を用いる、３６．５℃での発酵Ｃと３５．０℃での発
酵ＤのＥＰＯのイソ型分布の比較を示す。発酵Ｄにおけ
るＥＰＯのイソ型の含量は、発酵Ｃの対応しているイソ
型のパーセンテージとして算出された。後者は、それぞ
れが１００％に標準化された。本データは酸性ＥＰＯイ
ソ型の２〜４が、温度の低下によってかなり増大しうる
事を示す。

【００９４】

【表５】

【００９５】例１０：培地中の炭水化物組成の変化によ
るＥＰＯの生物学的活性への影響以下に表す方法は、供
給培地における炭水化物供給の変化によりヒトエリスロ
ポエチンの質を変える事が可能である事を示す。上述し
た本方法の２つの変異体は（以下発酵Ｅ及び発酵Ｆと称
する）、使用した培地の組成が異なる事を示している。

【００９６】両調製品において、培養培地の処方は改変
ｅＲＤＦ培地を基にしている。無血清を使用し、しかし
幾分の組換えインスリン（唯一のタンパク質添加物）及
び更なる追加物（例えばセレナイト、プトレッシン、ヒ
ドロコルチゾン、硫化鉄）が無血清又は無タンパク質培
地において通常使用される。供給栄養素溶液はまた、改
変ｅＲＤＦ培地が基となっているが、塩類ＫＣｌ，Ｎａ
₂ ＨＰＯ₄ 及びＮａＣｌは含まない。

【００９７】発酵ＥとＦとの間の主な違いは、供給培地
への様々な単糖類の添加である。発酵Ｅ： 通常の糖、Ｄ−（＋）−グルコースが発酵Ｅの
ために使用される。最初の濃度は３ｇ／ｌであった。グ
ルコース含有栄養素溶液を適当に供給する事によって、
培養液におけるグルコース濃度を、全体の培養の間、３
±０．５ｇ／ｌに保った。

【００９８】培養周期は典型的に１００±２０時間であ
った。ＥＰＯの濃度は採収時において典型的に４０±１
０mg／ｌであった。発酵Ｆ： Ｄ−（＋）−グルコースに加えて、Ｄ−（＋）
−ガラクトース及びＤ−（＋）−マンノースの糖類が、
発酵Ｆのために、供給培地に約１：２：３の質量比で加
えられた。培養の間、全糖類の濃度を、適当な供給によ
って０．２５ｇ／ｌと３．５ｇ／ｌの間の範囲内に保っ
た。

【００９９】この増殖のための培養周期は典型的に１０
０±２０時間であった。採収時のＥＰＯの濃度は典型的
に４０±１０mg／ｌであった。エリスロポエチンを前記
培養上清から精製した。精製方法は、本糖タンパク質の
関連したイソ型の分布が影響されないよう設計された
（例２を参照）。精製されたエリスロポエチンのイソ型
分布を上述した様に決定した。

【０１００】ヒトエリスロポエチンのイソ型の炭水化物
構造及び採収した培養上清中のそれらの分布は発酵Ｅ及
びＦにおいて異なった。発酵Ｅは、発酵Ｆと比較して、
イソ型２，３及び４をかなりの高い比率で有していた。
これらの違いは単糖類マンノース及びガラクトースの供
給によって生じた（例２参照）。正常マウス試験（例
４）によって決定された生物学的活性（例４）は前記Ｅ
ＰＯのイソ型の分布及び炭水化物構造に関連する（Ｆｉ
ｇ．３）。前記培養上清Ｅ及びＦから得たＥＰＯ調製品
の炭水化物構造を、ＣＺＥ及びＨＰＡＥＣ解析で試験し
た。

【０１０１】アンテナ度（２つの構造、３つの構造及び
４つの構造を含む）、Ｎ−アセチルラクトサミン単位の
含量（ＬＥ）、シアル酸含量（ＳＡ）及び２つのＥＰＯ
調製品のＬＥとＳＡの積を表６に示す。

【０１０２】

【表６】

【０１０３】例１１：特異的活性と炭水化物構造との関
係 この例において、炭水化物構造への個々のＥＰＯのイソ
型の生物学的活性の依存に対する研究を要約する。この
ために、様々なＥＰＯ供給源由来のイソ型（ＣＨＯ細胞
及びヒト細胞由来のＥＰＯの異なる一群）を単離及び比
較した。 １１．１ 等電点電気泳動（ＩＥＦ）及びウェスタンブ
ロットによる個々のイソ型の単離Ａ） ＩＥＦゲル電気泳動及びニトロセルロースへのエ
レクトロブロッティングのための方法 純粋な状態において個々のイソ型を単離するために、複
数のイソ型の混合物から成るＥＰＯ溶液をｕｌｔｒａｆ
ｒｅｅ遠心装置において脱塩し、そして濃縮（５〜１０
mg／ml）した。この溶液の３５０〜１０００μｇをＳｅ
ｒｖａのＩＥＦポリアクリルアミド既製ゲル（Ｓｅｒｖ
ａｌｙｔ Ｐｒｅｃｏｔｅｓ、pH３〜５、３００μｍ、
１２５×１２５mm）にかけた（レーン当たり７０〜１０
０μｇのＥＰＯを含む５〜１０レーン内）。本ＩＥＦを
５℃で３．５時間２５００Ｖで行い；次にそのゲルをニ
トロセルロースにブロットした（２００mAでの３時間の
メタノールを含むがＳＤＳは含まないＴｒｉｓ／グリシ
ン緩衝液中でのウェットブロット）。ブロッティング工
程の後、ゲルを除き、ニトロセルロース膜をポンソー染
色液で染色した。染色されたイソ型を切り取り、そして
再びＨ₂ Ｏ又はＴＢＳ緩衝液（１００mM Ｔｒｉｓ、pH
７．４；１５０mM ＮａＣｌ）で完全に脱色した。

【０１０４】Ｂ） 膜からのイソ型の抽出 各々のイソ型を含む脱色されたニトロセルロースの小片
を２mlのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ容器に据え（前記ＩＥＦゲ
ルの３〜４レーンに一致）、１．５mlのアセトンを加
え、そしてそのニトロセルロースをボルテックスによっ
て溶解した。それはＥＰＯを最適に沈澱させるために２
０℃で一晩インキュベートされた。次にＥＰＯを含むそ
の沈澱を１０分間のベンチ遠心、１４，０００rpm で単
離した。沈澱物を１mlのアセトンを用いて２〜３回洗浄
し、そして次に窒素気流下、室温又は３７℃で乾燥させ
た。ＥＰＯ沈澱物を次に、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を
含む２０mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH７．２に溶解
し、そして次の解析まで−２０℃で保存した。

【０１０５】Ｃ） 沈澱ＥＰＯ溶液からのイソ型の単離 個々のイソ型を、たった３〜４個のイソ型の代わりとし
て７〜８個を含む初期のＥＰＯ溶液の性質を用いてＡ）
及びＢ）に記述した様に単離した。出発物質はＤＥクロ
マトグラフィー（陰イオン交換体）によって単離された
ＥＰＯ画分であった。これらの画分は３〜４個のイソ型
のみ（例えばイソ型６〜８又はイソ型１〜４）を含ん
だ。

【０１０６】イソ型群を単離するために、適当なクロマ
トグラフィーカラムを使用するＥＰＯ １０mg当たり１
〜２mlのＤＥＡＥ−セファロースｆｆで満たし、０．５
ＮＮａＯＨで再生した。次にカラムを最初に２CVの中和
緩衝液及び次に少なくとも５CVの平衡化緩衝液を用いて
平衡化した。８個のイソ型を含んで成る精製されたＥＰ
Ｏ調製品を５±４℃の温度及び最大１５CV／時の流速で
吸収させた。そのカラムを次に２〜３CVの平衡化緩衝液
を用いて洗浄し、そしてそれに続きpH値が５．０まで洗
浄緩衝液（約５CV）ですすいだ。

【０１０７】様々なイソ型群を、溶出緩衝液において１
０mMの段階から開始して２０mM ＮａＣｌまで、ＮａＣ
ｌ濃度を増加することによって溶出した。塩基性イソ型
はイオン交換体に弱く結合し、そして低イオン強度に相
当して溶出され、酸性イソ型は最大７０mMのＮａＣｌの
より高いＮａＣｌ濃度で溶出される。あるＮａＣｌ濃度
において溶出されるイソ型の量は出発物質及び溶出体積
に強く依存する。規定通り、溶出をＯＤ２８０がこのＮ
ａＣｌ濃度において最大値の約５０％まで減少するまで
個々の段階において続けた。この事は１５〜４０CVの間
に相当する。ＮａＣｌ濃度範囲内での溶出されたイソ型
群の更なる分画は、前記イソ型の更なる分離を生じる。
カラムの進行速度は最大１５CV／時であった。

【０１０８】 中和緩衝液：１００mM リン酸ナトリウム／カリウム、 pH７．５±０．２ 平衡化緩衝液：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、 pH７．５±０．２ 洗浄緩衝液：３０mM 酢酸ナトリウム／酢酸、pH５．０±０．２ 溶出緩衝液：１０mM 酢酸ナトリウム／酢酸、pH５．０±０．２、 ２０mM ＮａＣｌ、 又は１０mM〜７０mM ＮａＣｌまでの濃度増加 個々の純粋イソ型を、Ａ）及びＢ）に記述した精製に従
って得られたイソ型群から単離した。

【０１０９】Ａ〜Ｃから得られた純粋なイソ型（ＩＦ）
を酸性から塩基性までのそれらの等電点（ｐＩ）に従い
番号をつけた。イソ型２（ＩＦ２）は、最も低いｐＩを
有する、最も強く酸性の単離されたイソ型である。イソ
型８は最も高いｐＩを有する、最も強く塩基性である。
イソ型２は、出発混合物から十分な量において単離され
うる、最も低いｐＩを有するイソ型であった。出発混合
物において、イソ型１の１〜２％のみが存在するため、
完全な解析のために十分な量を得ることが出来ない。

【０１１０】純粋なイソ型を特徴づけるために以下の解
析： − ＰＰ−ＨＰＬＣによる量及び収率の決定 − キャピラリー電気泳動及び等電点電気泳動による純
度及び同一性の決定；を行った。個々のイソ型の収率
は、一般に出発混合物において使用されるイソ型の２０
％〜３０％の間であった。

【０１１１】イソ型の純度は通常９０％以上、多くは９
４％以上でさえあった。 １１．２ 結果 精製されたイソ型（ＩＦ）のために以下のデータ： − Ｎ結合炭水化物構造の相対分布（グリコシル化総数
に関する２アンテナ、３アンテナ及び４アンテナ構造の
比率）及び繰り返しの含量 − 正常マウス試験における生物学的活性 − シアル酸含量； を得た。

【０１１２】これらの決定を前述した方法によって本質
的に行った。それぞれ個々のイソ型調製品のための単離
されたイソ型のシアル酸含量は、単独に決定されなかっ
たが、ＣＨＯ細胞由来ＥＰＯのイソ型２〜８又はヒト細
胞由来ＥＰＯのイソ型２〜６のそれぞれの例として１〜
３個の調製品において行われた。

【０１１３】各イソ型の、おおよその、全ての番号のシ
アル酸の値をＮ−アセチルラクトサミン単位の含量（Ｌ
Ｅ値）とシアル酸含量（ＳＡ）の積を算出するために使
用した。これらおおよそのＳＡ値は、ＣＨＯ細胞及びヒ
ト細胞由来のＥＰＯにおいて以下の様に：１４（ＩＦ
２）、１３（ＩＦ３）、１２（ＩＦ４）、１１（ＩＦ
５）、１０（ＩＦ６）、９（ＩＦ７）及び８（ＩＦ
８）；であった。

【０１１４】表７はＣＨＯ細胞（ＣＨＯ１，ＣＨＯ２及
びＣＨＯ３）並びにヒト細胞（ＨｅＬａ１〜５）由来の
様々なＥＰＯの特異的活性と炭水化物構造の間の関係の
データを含む。この表は生物学的活性とＥＰＯ分子にお
けるＮ−アセチルラクトサミン単位の平均総数（Ｌ
Ｅ）、平均シアル酸含量（ＳＡ）並びにＬＥ×ＳＡの積
との間の関係を示す。

【０１１５】表８はＣＨＯ細胞由来の予備分画されてい
ないＥＰＯ群の単離されたイソ型の、生物学的活性とＥ
ＰＯ分子におけるＮ−アセチルラクトサミン単位の平均
総数（ＬＥ）、平均シアル酸含量（ＳＡ）並びにＬＥ×
ＳＡの積との間の関係のデータを含む。表９はＣＨＯ細
胞由来の予備分画されたＥＰＯ群の様々な画分から単離
されたイソ型（ＩＦ２又はＩＦ５）の様々な調製品（Ａ
又はＢ）の比較を含み、すなわちイソ型２及び５の２つ
の調製品（Ａ及びＢ）がそれぞれの場合において解析さ
れた。予備分画を例１１．１Ｃに記述されたＤＥ陰イオ
ン交換体によって行った。イソ型ＩＦ２及びＩＦ５の２
つの調製品Ａ及びＢを、ＤＥカラムの異なる画分から単
離した（画分５及び６からＩＦ２、画分２及び３からＩ
Ｆ５）。ＩＦ２／Ａ又はＩＦ５／Ａがそれぞれ単離され
た画分５又は２は、ＩＦ２／Ｂ又はＩＦ５／Ｂがそれぞ
れ単離された画分６又は３より、ＤＥセファロースカラ
ムから容易に溶出された（より低い塩濃度において）。
しかしながら、イソ型２又は５の調製品Ａ及びＢはそれ
ぞれ、次の等電点電気泳動において又はキャピラリー電
気泳動においてそれらの特性に違いはなく、すなわちＩ
Ｆ２又はＩＦ５の両調製品は同一のシアル酸含量を有し
ている。しかしながら、調製品Ａからのイソ型が、それ
らのより高いＬＥ値及びより高い繰り返し構造の含量の
ため、調製品Ｂの相当するイソ型よりも有意に高い生物
学的活性を有する事が驚くことに明らかとなった。同一
のシアル酸含量においてＥＰＯ分子内に含まれるＮ−ア
セチルラクトサミン単位の総数に対するイソ型の生物学
的活性の表９に記載の依存性はイソ型２及び５だけでな
く他のイソ型においても観察されなかった。

【０１１６】表１０は様々なＥＰＯ供給源（ＣＨＯ細胞
又はヒトＨｅＬａ Ｓ３細胞）由来の相当するイソ型を
比較する。また、この場合において相関関係が生物学的
活性とＬＥ×ＳＡの値との間で明らかになった。故に、
全ての表において、相関関係がＮ−アセチルラクトサミ
ン単位数（ＬＥ）とシアル酸含量（ＳＡ）の積と生物学
的活性との間で見られうる。ＬＥ×ＳＡの積の高い値は
高い生物学的活性と常に関連する。

【０１１７】

【表７】

【０１１８】

【表８】

【０１１９】

【表９】

【０１２０】

【表１０】

【０１２１】付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位
（繰り返し）を有するＮ結合炭水化物構造の比率に対す
る生物学的活性の依存を、例として個々のイソ型を用い
てＦｉｇ．４に示す。イソ型を、繰り返し含有炭水化物
構造の異なる比率を含むＥＰＯ調製品から単離した（繰
り返し含有構造を約５０％有するＥＰＯ１、約４０％有
するＥＰＯ２及び約１５％を有するＥＰＯ３）。対応す
るイソ型（同一のシアル酸含量及びほぼ同一のアンテナ
度）の生物学的活性は、繰り返し含有炭水化物構造がそ
のイソ型において減少する様に減少する。この特性は、
イソ型２から少なくともイソ型７においてまで見られう
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位
（繰り返し）及びシアル酸を有する４アンテナ構造の図
を示す。

【図２】図２は培養培地に加えられた炭水化物類に対す
る個々のＥＰＯイソ型の相対的な比率の依存性を示す。

【図３】図３は培養培地に加えられた炭水化物類に対す
るＥＰＯ調製品の生物学的活性の依存性を示す。

【図４】図４はＮ−アセチルラクトサミン繰り返し単位
に対するＥＰＯのイソ型の生物学的活性の依存性を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ゼリンガー，カール−ハインツ ドイツ連邦共和国，デー−82362 バイル ハイム，トリフトフシュトラーセ 15 (72)発明者 ハーゼルベック，アントン ドイツ連邦共和国，デー−82362 バイル ハイム，ベレンミュールベク 50 (72)発明者 コル，ハンス ドイツ連邦共和国，デー−82362 バイル ハイム，アドレルベク ２ Ｆターム(参考） 4B064 AG18 CA10 CC03 CD09 DA01 4C084 AA06 BA01 BA08 BA22 BA23 BA34 CA17 CA18 CA25 DB56 NA05 NA14 ZA512 4H045 AA20 CA42 DA13 EA24 FA72 GA25 GA26

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＥＰＯ組成物の比活性を増大する方法で
   あって、ＥＰＯ分子が（ａ）Ｎ−アセチルラクトサミン
   の繰り返しを高い比率で有し、そして任意に（ｂ）多数
   のＮ−アセチルラクトサミン単位を有し、（ｃ）Ｎ−ア
   セチルラクトサミン単位の数とシアル酸含量との積につ
   いて高い値を有し、そして／あるいは（ｄ）Ｎ−アセチ
   ルラクトサミンの繰り返しと４アンテナ炭水化物構造と
   の積について高い値を有する、当該組成物において強化
   される、方法。
2. 【請求項２】 ＥＰＯ分子のＮ結合炭水化物鎖に関して
   少なくとも４．３のＮ−アセチルラクトサミン単位又は
   ＥＰＯ分子のＮグリコシル化総数に関して少なくとも平
   均１３．０のＮ−アセチルラクトサミン単位の平均数に
   強化される、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 ＥＰＯ分子のＮ結合炭水化物鎖に関する
   Ｎ−アセチルラクトサミン単位の平均数に平均シアル酸
   含量を掛けた積が少なくとも４３．３、又はＥＰＯ分子
   のＮグリコシル化総数に関して少なくとも１３０の値に
   強化される、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 （ａ）ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯの場合に
   おいて炭化水素鎖の総数に関して少なくとも３０％Ｎ−
   アセチルラクトサミン繰り返しの平均比率又は（ｂ）ヒ
   ト細胞由来のＥＰＯの場合において炭水化物鎖の総数に
   関して少なくとも１０％のＮ−アセチルラクトサミンの
   繰り返しの平均比率：に強化される、請求項１に記載の
   方法。
5. 【請求項５】 （ａ）ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯの場合に
   おいて、炭水化物鎖の総数に関するＮ−アセチルラクト
   サミンの繰り返しの平均比率に４アンテナ炭水化物構造
   の平均比率を掛けた積が少なくとも２４００の値、又は
   （ｂ）ヒト細胞由来のＥＰＯにおいて、炭水化物鎖の総
   数に関するＮ−アセチルラクトサミン繰り返しの平均比
   率に４アンテナ炭水化物構造の平均比率を掛けた積が、
   少なくとも８００の値、に強化される、請求項４に記載
   の方法。
6. 【請求項６】 前記強化が、以下の方法： （ａ）Ｎ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有す
   る炭水化物鎖の製造が可能である適当な産生細胞の選
   択、（ｂ）Ｎ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で
   有する炭水化物鎖を製造するための前記細胞培養のため
   の適当な培養条件の選択及び（ｃ）Ｎ−アセチルラクト
   サミン単位を高い比率で有する炭水化物鎖を含むＥＰＯ
   分子の強化の間の、ＥＰＯ分子の既知の組成物からの不
   所望成分の分離：のうちの１又は複数によって達成され
   る、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。