JP3673261B2 - 高い比活性を有するエリスロポエチン - Google Patents

Description

【０００１】
説明
本発明は、その炭水化物構造においてＮ−アセチルラクトサミン単位及び／又は４アンテナ分枝の高含量によって特徴づけられる高い比活性を有する新規ＥＰＯ組成物に関する。本発明はまた、その様なＥＰＯ製品の単離法に関する。
【０００２】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は赤血球細胞の産生を刺激するヒト糖タンパク質である。ＥＰＯは健康な人の血液血漿において、非常に低濃度だけ発生するので、この様により多くの量を提供する事は可能ではない。ＥＰ−Ｂ１−０ １４８６０５及びＥＰ−Ｂ１−０ ２０５ ５６４はＣＨＯ細胞における組換えヒトＥＰＯの製造を記載する。ＥＰ−Ｂ１−０ １４８ ６０５において記載されたＥＰＯは尿ＥＰＯ及び非Ｏグリコシル化のものより高い分子量を有する。ＣＨＯ細胞由来のＢＰ−Ｂ１−０ ２０５ ５６４において記載されたＥＰＯは大量において及び純粋形態において現在入手可能である。
【０００３】
更に無形成貧血を有する患者の尿からのヒトＥＰＯの単離が知られている（Miyake et al., J. Biol. Chem. 252 (1977), 5558〜5564）。
組換え及び尿のＥＰＯはそれらのシアル化の値において異なることが知られている様々なイソ型の混合物として単離される。これらのＥＰＯのイソ型は異なる等電点を有し、そして等電点電気泳動又はキャピラリー電気泳動（Tsao et al., Biotech. Bioeng. 40 (1992), 1190-1196 ; Nieto et al., Anal. Commun. 33 (1996), 425-427 ; Tran et al., J. Chromatogr. 542 (1991), 459-471 ; Bietot et al., J. Chromatogr. 759 (1997), 177-184 ; Watson et al., Anal. Biochem. 210 (1993), 389-393 参照）によって分離されうる。最も大きな数のシアル酸を有するイソ型は最も高い比活性を有し、一方最も少ない数を有するそれらは最も低い活性を有する（例えばImai et al., Eur. J. Biochem. 194 (1990), 457-462 ; EP-A-0 428 267参照）。
【０００４】
Takeuchiらは（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 7819-7822)、前記生物学的活性とシアル酸含量と２アンテナ及び４アンテナの炭水化物構造の比率との関係を記述している。Takeuchiらは、更にＥＰＯの炭水化物構造におけるＮ−アセチルラクトサミン単位の存在が前記生物学的活性と相互に関係していない事を結論づけている。
【０００５】
Fukudaらは（Blood 73 (1989),84〜89）、前記生物学的活性に重要な貢献をする血液循環由来のＥＰＯの排出速度を扱い、そして比較的多量のＮ−アセチルラクトサミン単位を有するＥＰＯが、ラクトサミン単位を有していないＥＰＯよりも前記循環からより素速く除去される事を結論づけている。Morimotoらは（Glycoconjugate J. 13 (1996),1093〜1120）、ｍｏｎｏ−ＱクロマトグラフィーによるＥＰＯのイソ型の分離、そしてその個々の画分が２、３のイソ型のみから成っている事を記述している。これらの画分で行われた前記研究は、全ての画分における全ての構造の平衡を示している。相互関係が２アンテナ若しくは４アンテナの構造の含量又はＮ−アセチルラクトサミン単位の含量と前記比活性の間に見出されなかった。
【０００６】
この様に前記従来技術はシアル酸の含量に関して、特に前記糖構造と前記生物学的活性の一般的な相互関係がある事を示している。しかしながら、４アンテナ構造の含量及び／又はＮ−アセチルラクトサミンの含量が直接前記生物学的活性と相互関係している事は全く記載が無い。
ＥＰＯ調製品を精製するとき、驚くことに炭水化物構造における４アンテナ炭水化物構造及び／又はＮ−アセチルラクトサミン単位の増大が前記特異的な生物学的活性の有意な改良を引き起こす事が明らかにされた。これは、ＥＰＯが欧州適用９７ １１２ ６４０．４に従うヒト細胞系において製造される場合に特に適用可能である。
【０００７】
個々のＥＰＯ調製品又はＮ−アセチルラクトサミン単位（ＬＥ単位）の含量において本質的にわずかに異なる炭水化物構造のＥＰＯイソ型の比較活性の研究は、前記調製品又は同一のシアル酸含量及びほぼ同一のアンテナ度の値のＮ−アセチルラクトサミン単位の高含量を有するイソ型の更に有意に高い活性を示している。この関連において、アンテナ度は、前記ＥＰＯ調製品の２アンテナ、３アンテナ及び４アンテナのＮ結合炭水化物鎖の、又はＮ結合炭水化物鎖の総数に関する前記単離ＥＰＯのイソ型の、相対的平均含量（ｉｎ％）として理解される。更に、４−アンテナ構造の含量が高められたものを有する調製品又はイソ型において特に、ラクトサミン単位の全含量がｉｎ ｖｉｖｏ活性において非常に重要である事を明らかにした。Ｎ−アセチルラクトサミン単位の全含量における増加、例えばＬＥ単位を有するその核構造の付加的な伸長の形態（いわゆる繰り返し）における増加は前記生物学的活性を相当増大することができる。更に４アンテナ構造の含量における増大が前記生物学的活性を改善しうる事が明らかにされた。
【０００８】
故に、最大限可能な高い比活性を有し及び高収率のＥＰの製造を試みるならば、それに続く精製段階、製造細胞及び／又はその培養は４アンテナ炭水化物構造の最大限可能な高い含量及び／又はＮ−アセチルラクトサミン単位の最大限可能な高い含量を達成するために選択及び最適化されなければならない。
本発明の第一の観点は炭水化物鎖の総数、すなわち２アンテナ、３アンテナ及び４アンテナ構造の合計に関して少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも８５％及び最も好ましくは少なくとも９０％の４アンテナ構造の比率を含むグリコシル化されたＥＰＯ分子から本質的に成るＥＰＯ組成物に関する。
【０００９】
本発明の更なる観点は、ＥＰＯ分子のＮ結合炭水化物鎖当たりの前記平均組成物に関して少なくとも３．７、好ましくは少なくとも４．０、特に好ましくは少なくとも４．３及び最も好ましくは少なくとも４．５のＮ−アセチルラクトサミン単位の平均数又はＥＰＯ分子の全ての３Ｎ結合炭水化物構造（全Ｎグリコシル化）に関して少なくとも１１．１、好ましくは少なくとも１２．０、特に好ましくは少なくとも１３．０及び最も好ましくは少なくとも１３．５のＮ−アセチルラクトサミン単位数を含むグリコシル化されたＥＰＯ分子から本質的に成るＥＰＯ組成物に関する。
【００１０】
本発明の更なる観点は、ＥＰＯ分子当たりのＮ−アセチルラクトサミン単位の平均総数にＥＰＯの分子当たりの平均シアル酸含量を掛けた積が少なくとも１３０、好ましくは少なくとも１３５、特に好ましくは少なくとも１４０及び最も好ましくは少なくとも１６０の値を有するグリコシル化されたＥＰＯ分子から本質的に成る、ＥＰＯ組成物に関する。
【００１１】
この文脈において“本質的に”の語は前記所望のＥＰＯ分子がその組成物におけるＥＰＯ分子の総数に関して好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％及び最も好ましくは少なくとも９５％の比率において存在する事を意味する。
本発明のより更なる観点は炭水化物鎖の総数に関して少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％及び特に好ましくは少なくとも８５％の平均比率の４アンテナ構造を有するグリコシル化されたＥＰＯ分子から成るＥＰＯ組成物に関する。
【００１２】
更に本発明はＥＰＯ分子のＮ結合炭水化物鎖当たりの組成物の平均に関して少なくとも３．７、好ましくは少なくとも４．０並びに特に好ましくは少なくとも４．３及び最も好ましくは少なくとも４．５の平均数のＮ−アセチルラクトサミン単位を有し、又はＥＰＯ分子の全ての３Ｎ結合炭水化物構造に関して少なくとも１１．０、好ましくは少なくとも１２．０、特に好ましくは少なくとも１３．０及び最も好ましくは少なくとも１３．５の数のＮ−アセチルラクトサミン単位を含むグリコシル化されたＥＰＯ分子から成るＥＰＯ組成物に関する。
【００１３】
４アンテナ構造の最大比率は、各々の４アンテナ構造がＮ結合糖の核構造において４個のＮ−アセチルラクトサミン単位を含む場合、全炭水化物鎖の１００％に達することができる。いわゆる繰り返しの様に核構造の伸長を生じる付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位は炭水化物構造当たりのＮ−アセチルラクトサミン数並びにグリコシル化の総数を増大することができる。グリコシル化部位当たりの（すなわちＮ結合炭水化物構造当たりの）Ｎ−アセチルラクトサミン単位の数は６（繰り返しの形態における４アンテナ構造及び２つの付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位）まで達することができ、又は（２つの付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位以上有する場合において）それより多くなりうる。Ｎ−アセチルラクトサミン単位の数はグリコシル化の総数（３Ｎ結合炭水化物構造）に関して１８又はそれ以上になりうる。
【００１４】
本発明のより更なる観点は、ＥＰＯ分子のＮ−アセチルラクトサミン単位の平均総数にＥＰＯの分子当たりの平均シアル酸含量を掛けた積が少なくとも１３０、好ましくは少なくとも１３５、特に好ましくは少なくとも１４０及び最も好ましくは少なくとも１６０の平均値を有するグリコシル化された分子から成るＥＰＯ組成物に関する。
【００１５】
本発明の更なる主題は前記の観点の少なくとも２又はそれ以上の形態を有するＥＰＯ組成物である。
本発明に従う組成物は１又は複数のイソ型すなわち等電点電気泳動において異なる等電点を有するＥＰＯ分子から成りうる。本発明に従う組成物は少なくとも２つの、例えば２〜５つのイソ型の混合物、特に３又は４つのイソ型の混合物を好ましくは含んで成る。
【００１６】
本発明に従う組成物の比活性はｉｎ ｖｉｖｏ（正血球状態のマウス）で好ましくは少なくとも１７５，０００IU／mg、特に２００，０００IU／mgである。前期比活性は特に好ましくは約２００，０００〜４００，０００IU／mg又は４５０，０００IU／mgタンパク質の範囲内、最も好ましくは２５０，０００〜４００，０００IU／mg又は４５０，０００IU／mgタンパク質の範囲内である。
【００１７】
本発明に従う前記組成物において、平均シアル酸含量又はＥＰＯの分子当たりのシアル酸残基の平均数は好ましくは１１〜１４、特に好ましくは少なくとも１１．５及び最も好ましくは少なくとも１２．５である。
本発明に従う前記ＥＰＯ組成物は、一方で、哺乳類の細胞、例えば齧歯類の細胞、例えば、ＥＰ−Ｂ−０ ２０５ ５６４に記載のＣＨＯ又はＢＨＫにおける外来ＤＮＡの発現の産物であるＥＰＯ分子から得ることができる。あるいは、前記組成物は、ヒト細胞、例えばNamalwa (Nadkarni et al., Cancer 23 (1969), 64-79), HT1080 (Rasheed et al., Cancer 33 (1973), 1027-1033)又はHeLa S3 (Puck et al., J. Exp. Meth. 103 (1956), 273-284)の様な不死化された細胞における遺伝子活性の後の、内因性ＤＮＡの発現の産物であるＥＰＯ分子からも成りうる。この様な方法は欧州特許適用９７ １１２ ６４０．４に記述され、その開示は本発明の適用の部分を成す。
【００１８】
ＥＰＯの生物学的活性のための更に重要なパラメーターは、Ｎ結合炭水化物鎖の総数に関する繰り返し、すなわち付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位を有する炭水化物鎖の比率、及びこの繰り返しの比率と炭水化物鎖の総数に関する４アンテナ炭水化物鎖の比率との積の値である。ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯの場合において、繰り返しの比率は好ましくは少なくとも３０％、特に好ましくは少なくとも３５％及び最も好ましくは少なくとも４０％である。ヒト細胞、例えばＨｅＬａ細胞由来のＥＰＯの場合には、繰り返しの比率は好ましくは少なくとも１０％、特に好ましくは少なくとも１２％及び最も好ましくは少なくとも１４％である。故に、ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯの場合には、炭水化物鎖の総数に関するＮ−アセチルラクトサミン繰り返しを持つ炭水化物鎖の比率と炭水化物鎖の総数に関する４アンテナ構造の比率との積の値は好ましくは少なくとも２４００、特に好ましくは少なくとも２８００及び最も好ましくは少なくとも３４００である。ヒト細胞由来のＥＰＯの場合には、前記値は好ましくは少なくとも８００、特に好ましくは少なくとも９６０及び最も好ましくは少なくとも１１００である。
【００１９】
ＥＰＯ組成物は、低含量の血清、例えば最大１％（Ｖ／Ｖ）を含む培養培地において又は特別に無血清培地において（このＷＯ９６／３５７１８を参照）ＥＰＯ製造細胞を培養することにより製造されてきたものが好ましくは使用される。適当な培養培地の例はＲＰＭＩ１６４０又はＤＭＥＭである。
本発明に従うＥＰＯ組成物は一般の医薬希釈剤、補助物質及び担体と任意に一緒の医薬調製品として調製されうる。医薬調製品を製造するために使用されうる本発明に従うＥＰＯ組成物は、逆層ＨＰＬＣ（例えばＶｙｄａｃ Ｃ４カラム使用）及び／又はサイズ排除クロマトグラフィー（例えばＴＳＫ２０００ＳＷ Ｕｌｔｒａｐａｃカラム使用）によって決定された好ましくは少なくとも９９％及び特に好ましくは少なくとも９９．９％の純度を有する。
【００２０】
更に、本発明に従う組成物は、１０，０００IUタンパク質当たりのＤＮＡが好ましくは１０pg以下、特に好ましくは５pg以下及び最も好ましくは１pg以下のＤＮＡ含量を有する。更に本発明に従う組成物は、好ましくは微生物の夾雑物（１CFU ／ml以下）及びエンドトキシン（１EU／１０，０００IUタンパク質）を本質的に含まない。
【００２１】
前記ＤＮＡ含量は放射活性又は蛍光で標識されたＤＮＡを用いてハイブリダイゼーション試験によって決定されうる。商業的に入手可能な精製されたヒトＤＮＡがそのプローブＤＮＡの例として使用される。前記ヒトＤＮＡは更に前記試験のスタンダードとして使用されうる。その様なハイブリダイゼーション試験の検出の下限は約０．３pg／１０，０００IU ＥＰＯである。前記ＥＰＯ調製品の微生物及びエンドトキシンの含量は医薬の欧州又はＵＳ特許に記載の標準化された方法によって決定されうる。
【００２２】
本発明によって所望される前記形態を好ましくは有するＥＰＯ組成物は以下の方法：
（ａ）４アンテナ構造及び／又はＮ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有する炭水化物鎖の製造が可能である適当な製造細胞の選択、
（ｂ）４アンテナ構造及び／又はＮ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有する炭水化物鎖を製造するための前記細胞培養のための適当な培養条件の選択及び
（ｃ）４アンテナ構造及び／又はＮ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有する炭水化物鎖を含むＥＰＯ分子の強化（ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ）の間、ＥＰＯ分子の知られた組成物からの不所望成分の分離；
の少なくとも１つによって得られる。
【００２３】
方法（ａ）は適当な産生細胞の選択を含んで成る。この場合、ある者は、一方で、前記所望の炭水化物鎖構造を高収率で産生する傾向を有する事が知られている細胞を使用しうる。その様な細胞系の例はハムスター由来の細胞、例えばＣＨＯ若しくはＢＨＫ及びヒト細胞系由来の、例えばＨｅＬａ，Ｎａｍａｌｗａ，ＨＴ１０８０又はそれら由来の細胞系である。ＨｅＬａ Ｓ３細胞又は改良ＣＨＯ細胞が特に好まれる。
【００２４】
一方、細胞内であるグリコシル化酵素を過剰発現させることによって、例えば組換え体発現によって及び／又は内因性遺伝子の活性によって適当な製造細胞を特に製造することも可能である。その様なグリコシル化酵素の例はシアリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼである。
【００２５】
方法（ｂ）は前記細胞培養における適当な培養条件を含んで成る。本発明の第一の態様において、方法（ｂ）は少なくとも２つ及び好ましくは少なくとも３つの炭水化物の混合物を培養培地に加える事も含んで成る。前記炭水化物は単糖類及び二糖類、例えばグルコース、グルコサミン、リボース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、スクロース、ラクトース、マンノース−１−リン酸、マンノース−１−硫酸及びマンノース−６−硫酸から好ましくは選択される。栄養培地は例えばグルコース及び／又はマンノース及び／又はガラクトースを含むものが適当である。各々の炭水化物がＤ（＋）型で特に好ましく使用される場合、例えば１：（０．５−３）：（１−５）及び特に１：（０．７−２．４）：（１．８−４．０）の質量比の、グルコース、ガラクトース及びマンノースの混合物を含む栄養培地を用いて特に良い結果が得られる。発酵の間の全ての糖類の合計濃度は、前記培養培地において好ましくは０．１〜１０ｇ／ｌ、特に好ましくは２〜６ｇ／ｌである。炭水化物混合物は以下で更に詳細に解明される前記細胞のそれぞれの要求性に依存して好ましくは加えられる。
【００２６】
更に好ましい態様に従い、方法（ｂ）は前記の培養された細胞系のための少なくとも１つの必須アミノ酸及び／又は各々の細胞要求性に依存の少なくとも１つの炭水化物を含んで成る、栄養素の調節された、好ましくは要求性に従う添加を含んで成る。この方法において、多くの改良されたグリコシル化が、高細胞密度発酵（採収時の細胞密度が１０×１０⁵ 細胞／ml以上及び好ましくは２０×１０⁵ 細胞／ml以上）にもかかわらず大発酵槽（容積１ｌ以上、例えば５０〜１０，０００ｌ）において得られる。この目的のために、前記細胞の栄養要求性に関連するパラメーターの濃度は、連続的に又は適当な時間間隔で、例えば少なくとも日に１回決定され、そしてそれらの消費速度が算出される。この事は前記細胞の栄養要求性が定量的に及び／又は定性的に決定される事を可能にする。この様なパラメーターは前記細胞の栄養素又は代謝産物、例えばグルタミン、アンモニウム、グルコース及び／又は乳酸の濃度そして特にグルタミン濃度でありうる。
【００２７】
本発明のこの観点に従って添加された前記栄養素は、必須アミノ酸、例えばグルタミン及び／又はトリプトファン及び／又は炭水化物類並びに好ましくは更に非必須アミノ酸、ビタミン類、微量元素、塩類及び／又は増殖因子、例えばインスリンから成る。前記栄養素は特に好ましくは少なくとも１つの必須アミノ酸及び少なくとも１つの炭水化物を含む。これらの栄養素は溶解状態において培養培地に好ましくは計量しながら加えられる。前記栄養素溶液はグルタミン及び炭水化物類、特に上述した様な少なくとも２つの炭水化物類の混合物を好ましくは含む。グルコース、ガラクトース及びマンノースの混合物が特に好ましく使用される。更に栄養素が前記細胞の全体の増殖期の後の必要性に従い、すなわち培養培地において測定された前記の選択されたパラメーターの濃度に依存して加えられる事が好まれる。
【００２８】
前記栄養素溶液における炭水化物類に対するグルタミンの量比は、発酵槽における消費率に本質的に一致する様、好ましくは選択される。この事は発酵槽において個々の基質の一定の濃度が維持される事を実質上可能にする。グルタミンの濃度は前記培養培地において１５０mg／ｌ以下の値で好ましくは維持され、そして前記培養培地において２−３mmol／ｌ以上のアンモニウム濃度の発生を防ぐ。発酵の間、糖類の全濃度は既に説明した様に培養培地で好ましくは０．１〜１０ｇ／ｌの範囲内、特に好ましくは２〜６ｇ／ｌの範囲内である。
【００２９】
使用される栄養素溶液は全ての糖に関して好ましくは１：３〜２０の範囲内及び特に好ましくは１：５〜１５の範囲内である糖に対するグルタミンの質量比を含む。使用される栄養素溶液がグルタミン、並びに三つの糖、グルコース、ガラクトース及びマンノースを含む場合、前記糖類に対するグルタミンの質量比は、好ましくは１：（１〜３）：（１〜５）：（２〜８）及び特に好ましくは１：（１．５〜２．２）：（１．５〜３．６）：（４〜６）である。
【００３０】
前記培養は好ましくは繰り返しのバッチ工程として行われ、増殖期の後に培養液の一部が採収され、そして前記培養液の残査が、続いて作業体積に新鮮培地で再び満たされる発酵槽において維持される。本発明に従う前記工程はグルコシル化されたＥＰＯが高収率で採収される事を可能にする。故に採収時の前記濃度は例えば培養培地のＬ当たりのＥＰＯが少なくとも３０mg及び特に少なくとも４０mgである。
【００３１】
本発明のより更なる観点は真核細胞からのＥＰＯの単離方法であり、ここで前記真核細胞は適当な培地において培養され、そして前記ＥＰＯは培養上清から単離され、その培養において特徴づけられる前記方法は３６℃以下、好ましくは３０と３５．５℃の間及び特に好ましくは３３と３５．０℃の間の温度で行われる。培養の間の温度を低める事によって所望のグリコシル化を有するＥＰＯの比率が大いに増大されうる事は驚きを持って見出された。
【００３２】
方法（ｃ）は本適用の特徴を満たさない、炭水化物構造の知られたＥＰＯ組成物からの不所望の成分の分離を含んで成る。例えば、この事は前記ＥＰＯ調製品のクロマトグラフィー精製によって、例えばトリアジン色素ゲル、好ましくはシバルコンブルー色素ゲルでの親和性クロマトグラフィーによって行われうる。不所望の成分もまた、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び逆層ＨＰＬＣを用いる事によって更に分離されうる。このために適当なリガンドはブチル、ペンチル、オクチル、オクタデシル及びフェニル残基である。前記逆層ＨＰＬＣ段階は、６．０〜８．５の範囲内及び特に好ましくは７．０〜８．０の範囲内のpHの値で好ましくは行われる。適当な溶出液は、例えばアセトニトリル、エタノール又はイソプロパノール、好ましくはアセトニトリルである。
【００３３】
適当な画分が決定され、プールされそして最終的にキャピラリー ゾーン電気泳動解析（ＣＺＥ）を用いて、更に処理されうる。更に高含量のＮ−アセチルラクトサミン単位を有するＥＰＯ分子はトマト又はジャガイモ由来のレクチン類を用いて直接強化されうる（MerKle, Cummings, J. Biol. Chem. 262 (1987),8179〜8189）。その様なレクチン類は例えば固定化型において好ましくは使用される。
【００３４】
本発明の更なる主題はＥＰＯ組成物の比活性を増大させるための方法であり、ここでＥＰＯ分子は；
（ａ）高い比率の４アンテナ構造、
（ｂ）多数のＮ−アセチルラクトサミン単位、
（ｃ）高い値の、Ｎ−アセチルラクトサミン単位数とシアル酸含量との積、
（ｄ）高い比率のＮ−アセチルラクトサミン繰り返し及び／又は
（ｅ）高い値の、Ｎ−アセチルラクトサミン繰り返しと４アンテナ炭水化物構造との積：
を有する組成物に強化される。
【００３５】
この強化は、上述した方法（ａ），（ｂ）及び（ｃ）の１又は複数によって達成されうる。
例１ 細胞系の培養上清からのＥＰＯの精製
前記クロマトグラフィー段階の数及び原理において異なる本質的に２つの方法が、ヒト細胞又はＣＨＯ細胞由来の細胞培養上清からＥＰＯを精製するために使用され、培地の組成及びＥＰＯ濃度に依存して使用された：
方法１：第１段階：ブルーセファロースカラム
第２段階：ブチルセファロースカラム
第３段階：ハイドロキシアパタイトカラム
第４段階：濃縮
方法２：第１段階：ブルーセファロースカラム
第２段階：ハイドロキシアパタイトカラム
第３段階：濃縮
（択一的第３段階：ＲＰ−ＨＰＬＣ）
方法１による２％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＨｅＬａ細胞培養上清の精製例：
１．ブルーセファロースカラム：
５ml Ｈｉ−Ｔｒａｐブルーカラム(Pharmaciaの既製のブルーセファロースカラム）を少なくとも５カラム体積（CV）の緩衝液Ａ（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０；５mM ＣａＣｌ₂ ；１００mM ＮａＣｌ）で平衡化した。続いて７０mlのＨｅＬａ細胞上清（約２４５μｇのＥＰＯ及び７０〜１００mgの全タンパク質を含む）を循環方法において０．５ml／分の流速で一晩吸収させた。
【００３６】
前記カラムを少なくとも５CVの緩衝液Ｂ（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０；５mM ＣａＣｌ₂ ；２５０mM ＮａＣｌ）及び少なくとも５CVの緩衝液Ｃ（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０；０．２mM ＣａＣｌ₂ ；２５０mM ＮａＣｌ）を用いて０．５ml／分で洗浄した。洗浄の成功をＯＤ２８０でタンパク質含量を測定することによって監視した。
【００３７】
ＥＰＯを緩衝液Ｄ（１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０；０．２mM ＣａＣｌ₂ ；２Ｍ ＮａＣｌ）を用いて０．５ml／分の流速で溶出した。溶出溶液を１〜２mlの画分に集めた。
前記画分、洗浄溶液及び溶出溶液のＥＰＯ含有量を、アリコートをＰＯＲＯＳＲ２／Ｈカラム（Boehringer Manheim）にかけることにより逆層（ＲＰ）−ＨＰＬＣによって決定した。択一的に、免疫ドット−ブロットをＥＰＯを含む画分の定性的な同定のために使用した。
【００３８】
ＥＰＯを含む溶出画分（８〜１２ml）をプールし、ブチルセファロースカラムにかけた。
ブルーセファロースカラム後の収量は約１７５μｇ ＥＰＯであった（約７０％に相当）。たいていブルーセファロース後の収率は５０と７５％の間であった。
【００３９】
２．ブチルセファロースカラム（疎水性相互作用クロマトグラフィー）
自分で作った２〜３mlのブチルセファロースカラム（材料：Toyopearl butyl S650）を少なくとも５CVの緩衝液Ｄ（１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０；０．２mM ＣａＣｌ₂ ；２Ｍ ＮａＣｌ）を用いて平衡化し、そしてそれに続きＥＰＯを含む方法１からのブチルセファロースプール（約１５０μｇＥＰＯ）を０．５ml／分の流速で吸収させた。
【００４０】
前記カラムを少なくとも５CVの緩衝液Ｅ（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０；２Ｍ ＮａＣｌ及び１０％イソプロパノール）を用いて０．５ml／分で洗浄した。洗浄の成功をＯＤ２８０でタンパク質含量を測定することによって監視した。
ＥＰＯを緩衝液Ｆ（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０；２Ｍ ＮａＣｌ及び２０％イソプロパノール）を用いて室温で及び０．５ml／分の流速で溶出した。溶出溶液を１〜２mlの画分において回収した。
【００４１】
前記画分、洗浄溶液及び溶出溶液のＥＰＯ含有量を、アリコートをＰＯＲＯＳＲ２／ＨカラムにかけることによりＲＰ−ＨＰＬＣによって決定した。択一的に、免疫ドット−ブロットをＥＰＯを含む画分の定性的な同定のために使用した。
ＥＰＯを含む溶出画分（１０〜１５ml）をプールし、ハイドロキシアパタイトカラムにかけた。
【００４２】
ブチルセファロースカラムの収量は約１３０μｇ ＥＰＯであった（約８５％に相当）。たいていブチルセファロースの収率はブルーセファロースにかけたプールの６０と８５％の間であった。
３．ハイドロキシアパタイトカラム
５mlのハイドロキシアパタイトカラム(Bio RADの既製のＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ ＣＨＴII）を少なくとも５CVの緩衝液Ｆ（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０；２Ｍ ＮａＣｌ；２０％イソプロパノール）を用いて平衡化し、そしてそれに続きＥＰＯを含む方法２からのブチルセファロースプール（約１２５μｇ ＥＰＯ）を０．５ml／分の流速で吸収させた。
【００４３】
前記カラムを少なくとも５CVの緩衝液Ｇ（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０；２Ｍ ＮａＣｌ）を用いて０．５ml／分で洗浄した。洗浄の成功をＯＤ２８０でタンパク質含量を測定することによって監視した。
ＥＰＯを緩衝液Ｈ（１０mM リン酸ナトリウム、pH７．０；８０mM ＮａＣｌ）を用いて０．５ml／分の流速で溶出した。溶出溶液を１〜２mlの画分において回収した。
【００４４】
前記画分、洗浄溶液、及び溶出溶液のＥＰＯ含有量を、アリコートをＰＯＲＯＳ Ｒ２／ＨカラムにかけることによってＲＰ−ＨＰＬＣによって決定した。
ＥＰＯを含む溶出画分（３〜６ml）をプールした。ハイドロキシアパタイトカラムの収量は約８０μｇ ＥＰＯであった（約６０％に相当）。たいてい、ハイドロキシアパタイトカラムの収率はブチルセファロースにかけたプールの５０と６５％の間であった。
【００４５】
４．濃縮
ハイドロキシアパタイト段階からの、プールされたＥＰＯ画分を１０KDの排除サイズを有する遠心装置（例えばFiltron のＭｉｃｒｏｓｅｐ）において０．１〜０．５mg／mlの濃度まで濃縮した。０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を加え、そしてこれを−２０℃でアリコートにおいて保存した。
【００４６】
【表１】

【００４７】
単離されたＥＰＯの純度は約９０％以上、通常９５％以上でさえあった。
ブチルセファロース段階が削除された方法２は、ＥＰＯ収率を増大させるためにも使用される。この方法は、１％（Ｖ／Ｖ）ＦＣＳ補足の添加が無し又は有りの細胞培養培地に特に適用することができ、そして単離されたＥＰＯの収率はほぼ同一の純度（９０〜９５％）である。ハイドロキシアパタイトカラムのための平衡化緩衝液（緩衝液Ｆ）における５mM ＣａＣｌ₂ の存在は、この方法において結合の改良、そしてこのようにハイドロキシアパタイト段階におけるＥＰＯの再現可能な溶出性質の改良を導いた。その結果、方法２は原理において同一な、方法１の様な方法を使用する以下の緩衝液を用いて行われた：

【００４８】
【表２】

【００４９】
方法１における緩衝液Ｃ〜Ｇへの５mM ＣａＣｌ₂ の添加はまた、結合の改良及びハイドロキシアパタイトカラムからの溶出のさらなる定義づけへと導く。
択一的又は付加的に以下の段階もＥＰＯを精製するために使用される：
− ＲＰ−ＨＰＬＣ、例えばＶｙｄａｃ Ｃ４材料を使用
− ＤＥＡＥセファロースｆｆクロマトグラフィー
− ダイアフィルトレーション
例２：イソ型１〜８（対比）の保持と同時の、培養上清からのＥＰＯの精製
１．出発材料
哺乳類細胞、例えばＣＨＯ又はヒト細胞由来のＥＰＯを繰り返しのバッチ工程によって発酵した。１０００Ｌの発酵槽を前培養したもので接種し、そして前記発酵槽の中身を約３〜５日後に採収した。採収の後、前記細胞を遠心によって発酵液から取り除いた。前記無細胞培養上清を１mol ／ｌの酢酸を用いてpH５．０〜５．２に調節し、そして１〜９℃で濾過する。
【００５０】
２．ブルーセファロースクロマトグラフィー
クロマトグラフィーカラム（Ａｍｉｃｏｎ Ｐ４４０×５００、Ａｍｉｃｏｎ，ＧＢ）を６０〜８０Ｌのブルーセファロースで満たし、そして０．５Ｎ ＮａＯＨを用いて再生させた。次に前記カラムを約３カラム体積（CV）の酢酸緩衝液を用いて平衡化した。
【００５１】
pH５に調節された無細胞培養上清を１０±５℃の温度及び８００〜１４００ml／分の流速でカラムに吸収させた。前記カラムを約１CVの洗浄緩衝液１を用いて前記と同一の流速及び５±４℃で再洗浄した。これに約２CVの洗浄緩衝液２を続けた。次に前記カラムを約３CVの溶出緩衝液を用いて溶出した。全てのタンパク質のピークを回収し（約３０〜６０Ｌ）、ＨＣｌを用いてpH６．９に調節し、そして次の工程まで５±４℃で保存した。前記の製品溶液をこのクロマトグラフィー段階において濃縮し、そして約４０〜５０％の純度を達成した。
【００５２】

３．ブチルトーヨーパールクロマトグラフィー（疎水性クロマトグラフィー）クロマトグラフィーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢＰＧ ３００／５００）を３０〜４０Ｌのブチルトーヨーパールで満たし、そして４ＭグアニジンＨＣｌ及び０．５Ｎ ＮａＯＨを用いて再生した。次にカラムを少なくとも３CVの平衡化緩衝液を用いて平衡化した。
【００５３】
前記ブルーセファロースカラムからの溶出液を１０％イソプロパノールに調節し、そして２７±２℃の温度及び８００〜１２００ml／分の流速で吸収させた。カラムを約１CVの平衡化緩衝液及びそれに続く約２CVの洗浄緩衝液を用いて前記と同一の温度及び流速で再洗浄した。次にそれを約３CVの溶出緩衝液を用いて溶出した。全てのタンパク質のピークを回収し（約１０〜１８Ｌ）、すぐに希釈緩衝液を用いて３倍に希釈し、そして次の工程まで１５℃で保存した。約９０％の純度をこのクロマトグラフィーにおいて達成した。
【００５４】

４．ハイドロキシアパタイトウルトロゲルクロマトグラフィー
クロマトグラフィーカラム（Ａｍｉｃｏｎ Ｐ４４０×５００又は等価のもの）を３０〜４０Ｌのハイドロキシアパタイトウルトロゲルで詰め、０．５Ｎ ＮａＯＨで再生した。次にカラムを少なくとも４CVの平衡化緩衝液で平衡化した。
【００５５】
前記ブチルトーヨーパールカラムからの溶出溶液を、約１５℃の温度及び５００〜１２００ml／分の流速でカラムに吸収させた。カラムを約１CVの平衡化緩衝液及びそれに続く約２CVの洗浄緩衝液を用いて前記と同一の温度及び流速で再洗浄した。次にそれを約３CVの溶出緩衝液を用いて溶出した。全てのタンパク質ピークを回収し（約１０〜１８Ｌ）、そして次の工程まで１５℃で保存した。９５％以上の純度をこのクロマトグラフィーにおいて達成した。
【００５６】

５．逆層ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
予備的なＨＰＬＣをＭｅｒｃｋ Ｐｒｅｐｂａｒ １００分離装置（又は同等のもの）を用いて２２±４℃の温度で行った。分離カラム（１００mm×４００mm、３．２１）をＶｙｄａｃ Ｃ４材料で詰めた。使用の前に、カラムを緩衝液Ａから１００％溶媒までの勾配に繰り返しかけ再生し、そして次に緩衝液Ａを用いて平衡化した。
【００５７】
前記ハイドロキシアパタイトカラムからの溶出溶液をトリフルオロ酢酸を用いて約pH２．５に酸性化し、そして無菌濾過した。次にそれをカラムに２２±４℃の温度及び２５０〜３１０ml／分の流速でかけた。カラムを緩衝液Ａから緩衝液Ｂへの直線勾配を用いて前記と同一の温度及び流速で溶出した。溶出ピークを画分に回収した。溶出溶液を最初に加えた４体積分のＨＰＬＣ希釈緩衝液によってすぐに中和した。
【００５８】
分析的なＨＰＬＣにおいて少なくとも９９％の純度を有する画分をプールした（プール体積約４〜６Ｌ）。微量不純物をこのクロマトグラフィーにおいて分離し、そして９９％以上の純度を達成した。
緩衝液Ａ：０．１％ トリフルオロ酢酸／水
緩衝液Ｂ：８０％ アセトニトリル、０．１％ トリフルオロ酢酸／水
ＨＰＬＣ希釈緩衝液：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、pH７．５±０．２
６．ＤＥＡＥ−セファロースｆｆクロマトグラフィー
クロマトグラフィーカラム（Ａｍｉｃｏｎ Ｐ９０×２５０又は等価のもの）を、かけるＥＰＯのｇ当たり１００〜２００mlのゲルで満たし、そして０．５ＮＮａＯＨを用いて再生した。次にカラムを最初に１００mM リン酸ナトリウム／カリウム緩衝液、pH７．５、そして少なくとも１２CVの平衡化緩衝液を用いて平衡化した。
【００５９】
前記ＨＰＬＣカラムからの溶出溶液を５±４℃の温度及び約１５０ml／分の流速でカラムに吸収させた。カラムを少なくとも５CVの平衡化緩衝液及びそれに続いて約１０CVの洗浄緩衝液を用いて前記と同一の温度及び流速で再洗浄した。次にそれを約１０CVの平衡化緩衝液を用いて再び洗浄し、そしてそれに続いて約７CVの溶出緩衝液を用いて溶出した。全てのタンパク質ピークを回収し（約２〜５Ｌ）、無菌濾過し、そして分配した。
【００６０】
このクロマトグラフィーにおいて前記ＨＰＬＣ段階からの溶媒を分離し、そして微量不純物を除去した。純度は９９％以上である。
平衡化緩衝液：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、pH７．５±０．２
洗浄緩衝液：３０mM 酢酸ナトリウム、pH４．５±０．１
溶出緩衝液：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、８０mM ＮａＣｌ，pH７．５±０．２
例３：イソ型１〜４（発明）の保持と同時の培養上清からのＥＰＯの精製
１．出発材料
哺乳類細胞、例えばＣＨＯ又はヒト細胞由来のＥＰＯを繰り返しのバッチ工程によって発酵した。１０Ｌの発酵槽を前培養したもので接種し、そして前記発酵槽の中身を約３〜５日後に採収した。採収の後、前記細胞を遠心によって発酵液から取り除いた。前記無細胞培養上清を１mol ／ｌの酢酸を用いてpH５．０〜５．２に調節し、そして１〜９℃で濾過する。
【００６１】
２．ブルーセファロースクロマトグラフィー
適当なクロマトグラフィーカラムを１５０〜２５０mlのブルーセファロースで満たし、そして０．５Ｎ ＮａＯＨを用いて再生させた。次に前記カラムを約３カラム体積（CV）の酢酸緩衝液を用いて平衡化した。
pH５に調節された無細胞培養上清を１０±５℃の温度及び１〜２CV／時の流速でカラムに吸収させた。前記カラムを約１CVの洗浄緩衝液１を用いて前記と同一の流速及び５±４℃で再洗浄した。これに約２CVの洗浄緩衝液２を続けた。次に前記カラムを約３〜６CVの溶出緩衝液を用いて溶出した。タンパク質のピークを画分に回収した。ＣＥ解析の後、適当な画分をプールし、ＨＣｌを用いてpH６．９に調節し、そして次の工程まで５±４℃で保存した。前記の製品溶液をこのクロマトグラフィー段階において濃縮し、不純物及び塩基性のイソ型を分離した。
【００６２】

３．ブチルトーヨーパールクロマトグラフィー（疎水性クロマトグラフィー）適当なクロマトグラフィーカラムを２００〜３００mlのブチルトーヨーパールで満たし、そして４ＭグアニジンＨＣｌ及び０．５Ｎ ＮａＯＨを用いて再生した。次にカラムを少なくとも３CVの平衡化緩衝液を用いて平衡化した。
【００６３】
前記ブルーセファロースカラムからの溶出液を１０％イソプロパノールに調節し、そして２７±２℃の温度及び１〜２CV／時の流速で吸収させた。カラムを約１CVの平衡化緩衝液及びそれに続く約２CVの洗浄緩衝液を用いて前記と同一の温度及び流速で再洗浄した。次にそれを約５〜１０CVの溶出緩衝液を用いて溶出した。画分をタンパク質ピークから回収し、すぐに希釈緩衝液を用いて３倍に希釈した。ＣＥ解析の後、適当な画分をプールし、次の工程まで１５℃で保存した。このクロマトグラフィーにおいて、更に基本的なイソ型を除去し、そして約８０％以上の純度を達成した。
【００６４】
平衡化緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ ，０．２Ｍ ＮａＣｌ，１０％ イソプロパノール、pH６．９±０．２
洗浄緩衝液 ：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ ，０．２Ｍ ＮａＣｌ，１７％ イソプロパノール、pH６．９±０．２
溶出緩衝液 ：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ ，０．２Ｍ ＮａＣｌ，２３％ イソプロパノール、pH６．９±０．２
希釈緩衝液 ：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ ，pH６．９±０．２
４．ハイドロキシアパタイトウルトロゲルクロマトグラフィー
適当なクロマトグラフィーカラムを１５０〜２００mlのハイドロキシアパタイトウルトロゲルで詰め、０．５Ｎ ＮａＯＨで再生した。次にカラムを少なくとも４CVの平衡化緩衝液で平衡化した。
【００６５】
前記ブチルトーヨーパールカラムからの溶出溶液を、約１５℃の温度及び１〜２CV／時の流速でカラムに吸収させた。カラムを約１CVの平衡化緩衝液及びそれに続く約２CVの洗浄緩衝液を用いて前記と同一の温度及び流速で再洗浄した。次にそれを約３CVの溶出緩衝液を用いて溶出した。全てのタンパク質ピークを回収し、そして次の工程まで１５℃で保存した。９５％以上の純度をこのクロマトグラフィーにおいて達成した。
【００６６】
平衡化緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ ，０．０６Ｍ ＮａＣｌ，７．５％ イソプロパノール、pH６．９±０．２
洗浄緩衝液 ：１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５mM ＣａＣｌ₂ ，pH６．８±０．２
溶出緩衝液 ：１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM リン酸カリウム、０．５mM ＣａＣｌ₂ ，pH６．８±０．２
５．逆層ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
半調製用ＨＰＬＣをＶｙｄａｃ Ｃ４カラム（２０mm×２５０mm、約８０ml）を用いて２２±４℃の温度で行った。使用の前に、カラムを緩衝液Ａから１００％溶媒までの勾配に繰り返しかけ再生し、そして次に緩衝液Ａを用いて平衡化した。
【００６７】
前記ハイドロキシアパタイトカラムからの溶出溶液を２２±４℃の温度及び８〜１５ml／分の流速でカラムにかけた。カラムを次のＨＰＬＣ実験計画に従って緩衝液Ａから緩衝液Ｂへの直線勾配を用いて前記と同一の温度及び流速で溶出した。溶出ピークを画分に回収した。溶出溶液を最初に加えた４体積分のＨＰＬＣ希釈緩衝液においてすぐに中和した。
【００６８】
【表３】

【００６９】
分析用ＨＰＬＣにおいて少なくとも９９％の純度を有し、そしてＣＥ解析に従う適当な画分をプールした。微量不純物及び塩基性イソ型の残査をこのクロマトグラフィーにおいて除去し、そして９９％以上の純度を達成した。
緩衝液Ａ：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、pH７．０±０．２
緩衝液Ｂ：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、８０％ アセトニトリル、pH７．０
ＨＰＬＣ希釈緩衝液：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、１００mM ＮａＣｌ，pH７．５±０．２
６．ダイアフィルトレーション
適当な大きさのダイアフィルトレーション装置を１０KDのカセットで合わせ、１Ｎ ＮａＯＨで再生した。次にこの装置をバルク緩衝液を用いてアルカリが無くなるまですすいだ。
【００７０】
前記ＨＰＬＣカラムの溶出溶液を５±４℃の温度で濃縮し、そして１０体積のバルク緩衝液に対してダイアフィルトレーションした。最終的な濃度は１〜３mg／mlの間であるべきである。
この段階は前記ＨＰＬＣ段階から溶媒残査を除去すること、要求されたバルク緩衝液条件及びバルク活性物質の製品濃度を調節することを提供する。
【００７１】
バルク緩衝液：１０mM リン酸ナトリウム／カリウム、１００mM ＮａＣｌ，pH７．５±０．２
例４：ｉｎ ｖｉｖｏでのＥＰＯの比活性の決定（正血球状態マウスでのバイオアッセイ）
赤血球前駆体細胞の増殖及び分化におけるＥＰＯの投与量依存的活性は、ＥＰＯ投与の後、マウスにおける血液中の網状赤血球の増大によってｉｎ ｖｉｖｏで決定された。
【００７２】
このため、解析されうるＥＰＯ試料及びＥＰＯ標準（ＥＰＯ ＷＨＯ標準で標準化された）の様々な投与量を８匹のマウスに非経口に各々投与した。前記マウスを一定の定めた条件下で引き続き保った。血液を、ＥＰＯ投与の後、４日目のマウスから回収し、そして網状赤血球をアクリジンオレンジで染色した。３０，０００赤血球当たりの網状赤血球数を赤色蛍光ヒストグラムの解析によるフローサイトメーターにおける微蛍光定量法によって決定した。
【００７３】
生物学的活性を前記試料及びLinderによって記述された、平行直線を用いる濃度のペアワイズ（ｐａｉｒ ｗｉｓｅ）決定法（Linder“Planen und Auswerten von Versuchen”, 3rd. edition, 1969, Birkenhaeuser Verlag, Basel)に従う、異なる投与量における標準の網状赤血球数の値から算出された。
ＥＰＯ調製品ＣＨＯ１，ＣＨＯ２及びＣＨＯ３を、それぞれ２４８，０００（ＣＨＯ１）、２２５，０００（ＣＨＯ２）及び１８６，０００IU／mg（ＣＨＯ３）の生物学的活性を有する、無血清培地において培養されたＣＨＯ細胞の培養上清からＥＰＯを精製することによって得た。ヒト細胞の培養上清から精製されたＥＰＯの４つの調製品において、２２０，０００（ＨｅＬａ１）、１９８，０００（ＨｅＬａ２）、２０４，０００（ＨｅＬａ３）、１７６，０００（ＨｅＬａ４）及び１００，０００IU／mg（ＨｅＬａ５）の比活性を有する製品が得られた。糖構造のためのパラメーターを有する生物学的活性の値の関係を例１１において与える。
例５：シアル酸残基含量の決定
アルスロバクター・ウレアファシエンス（A. ureaf., Boehringer Mannheim）由来のノイラミニダーゼを用いたシアル酸の酵素的開裂の後、Dionex system のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（パルス電流計検出を用いる高pH陰イオン交換クロマトグラフィー）によってシアル酸含量を決定した。
【００７４】
ＣＨＯ及びヒト細胞系（例えばＨｅＬａ Ｓ３）の様々な調製品由来のＥＰＯを２２μｇそれぞれ含む調製品を、５mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH７．２中で０．２mg／mlのＥＰＯ濃度に調節した。それぞれの調製品の半分を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって前記ＥＰＯの量を正確に決定するために使用した。A. ureaf. 由来の５mMノイラミニダーゼを前記調製品の残りの半分のものに加え、３７℃で一晩（約１８時間）インキュベートした。次に消化混合物を２等分し、Ｈ₂ Ｏを用いて５００μｌに２０倍希釈し、その５０μｌ（約２７pmol ＥＰＯに相当）を前記Dionex system にかけた。次のクロマトグラフィーパラメーターを、このために使用した。
【００７５】

適用した試料におけるシアル酸の量を、同様に解析されたシアル酸標準の値（Boehringer Mannheim)から得られた検量線の補助を用いて決定した。シアル酸含量（モル シアル酸／モルＥＰＯ）をシアル酸決定の結果（Dionex system)及びＲＰ−ＨＰＬＣによって使用されたＥＰＯの量の決定から算出した。
【００７６】
ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯはモルＥＰＯ当たり１２．９モル（ＣＨＯ１）、１１．８（ＣＨＯ２）及び１１．７モル（ＣＨＯ３）シアル酸の平均含量を有していた。ヒト細胞に由来するＥＰＯ調製品はモルＥＰＯ当たり１３．１モル（ＨｅＬａ１）、１３．２モル（ＨｅＬａ２）、１３．３モル（ＨｅＬａ３）、１１．６モル（ＨｅＬａ４）及び１０．８モル（ＨｅＬａ５）のシアル酸量を有していた（例１１も参照）。
例６：２アンテナ、３アンテナ及び４アンテナ炭水化物構造の比率の決定
Ｎ結合炭水化物構造をDionex system のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤクロマトグラフィー的に解析した。ＣＨＯ及びヒト細胞系（ＨｅＬａ Ｓ３）由来のＥＰＯ調製品のアシアロオリゴ糖類をＮ−グリコシダーゼＦ（Boehringer Mannheim)及びA. ureaf由来のノイラミニダーゼ（Boehringer Mannheim)を用いた酵素的開裂によって単離した。
【００７７】
混合物当たり１０又は３０μｇのＥＰＯを、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ超遠心装置（Ａｍｉｃｏｎ、排所サイズ１０KD）によって脱塩し、１０mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH７．２を用い０．２又は０．３mg／mlの濃度に調節した。次に１ＵのＮ−グリコシダーゼＦ及び１０mU ノイラミニダーゼを各混合物に加え、３７℃で一晩（約１８時間）インキュベートした。開裂したオリゴ糖類からＥＰＯポリペプチド部分を単離するために、混合物をインキュベーションの後、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ遠心装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、排所サイズ１０KD）を通して遠心し、前記Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ装置を２０mlのＨ₂ Ｏで再び２回洗浄した。濾液中に含まれたオリゴ糖類をＨ₂ Ｏで１５０mlに合わせ、その１００μｌをDionex system で解析した。このために、以下のクロマトグラフィーのパラメーターを使用した。
【００７８】

ピークを標準的なオリゴ糖類による複合型のＮ糖のクロマトグラムにおいて同定し、エンド−β−ガラクトシダーゼ又はフコシダーゼの酵素を用いてＥＰＯのオリゴ糖類の酵素的消化によって変化させ、そしてDionex system での次の解析にかけた。２アンテナ、３アンテナ及び４アンテナ構造のパーセンテージを全ピーク領域（２アンテナ、３アンテナ及び４アンテナ構造のピーク領域の総計）に関するＮ糖構造に一致して表されるピークの領域によって算出した。
【００７９】
ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯは４．２％ ２アンテナ炭水化物構造、２２．３％ ３アンテナ炭水化物構造及び７３．５％の４アンテナ炭水化物構造（ＣＨＯ３）の含量、ＣＨＯ１調製品において８６．７％の４アンテナ炭水化物構造並びにＣＨＯ２において７８．６％の含量を有していた。ヒト細胞系由来のＥＰＯの調製品における２アンテナ／３アンテナ／４アンテナ構造の含量は、ＨｅＬａ１で５．８／８．８／８５．４％、ＨｅＬａ２で５．１／１２．７／８２．２％、ＨｅＬａ３で４．１／１７．７／７８．２％、ＨｅＬａ４で１０．１／１９．２／７０．６％、ＨｅＬａ５で１２．６／２５．４／６２％であった（例１１も参照）。
例７：Ｎ−アセチルラクトサミン単位の平均含量及び付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位（繰り返し）の平均含量の決定
ＥＰＯのＮ結合炭水化物構造中のＮ−アセチルラクトサミン単位（すなわち核中の炭水化物構造＋繰り返し）の総数を、例６の実験のクロマトグラムのピーク領域から算出した。
【００８０】
炭水化物鎖当たりのＮ−アセチルラクトサミン単位の平均含量の数（ｎ）を以下の様に算出した：
ｎ＝Σ％（２アンテナ）×２＋％（３アンテナ）×３＋％（４アンテナ）×４＋％（３アンテナ＋１ｒ）×４＋％（４アンテナ＋１ｒ）×５＋％（３アンテナ＋２ｒ）×５＋％（４アンテナ＋２ｒ）×６
（ここで％（２アンテナ）＝Ｎ結合炭水化物の総計（１００％）に関する２アンテナ構造のパーセンテージ；
％（３アンテナ）＝付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位無しの３アンテナ構造のパーセンテージ
％（４アンテナ）＝付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位無しの４アンテナ構造のパーセンテージ；
％（３アンテナ＋１ｒ）＝１つの付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位を有する３アンテナ構造のパーセンテージ；
％（４アンテナ＋１ｒ）＝１つの付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位を有する４アンテナ構造のパーセンテージ；
％（３アンテナ＋２ｒ）＝２つの付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位を有する３アンテナ構造のパーセンテージ；
％（４アンテナ＋２ｒ）＝２つの付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位を有する４アンテナ構造のパーセンテージ；
である）。
【００８１】
ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯの場合、炭水化物鎖当たり４．３（ＣＨＯ１）、４．４（ＣＨＯ２）及び４．２（ＣＨＯ３）のＮ−アセチルラクトサミン単位の平均数が明らかになった。ヒト細胞由来のＥＰＯ調製品において、４．０（ＨｅＬａ１）、４．０（ＨｅＬａ２）、３．９（ＨｅＬａ３）、３．７５（ＨｅＬａ４）及び３．６（ＨｅＬａ５）のＮ−アセチルラクトサミン単位数が明らかになった（例１１も参照）。
【００８２】
ＥＰＯが３Ｎ結合糖構造を含む事実のため、Ｎ−アセチルラクトサミン単位の総数は更に３倍高い。ＥＰＯのグルコシル化総数に関して、ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯにおけるＮ−アセチルラクトサミン単位数は、故に１２．９（ＣＨＯ１）、１３．２（ＣＨＯ２）及び１２．６（ＣＨＯ３）である。ヒト細胞のＥＰＯ調製品において、一致する値は１２．０（ＨｅＬａ１）、１１．９（ＨｅＬａ２）、１１．７（ＨｅＬａ３）、１１．２５（ＨｅＬａ４）及び１０．８（ＨｅＬａ５）であった。
【００８３】
それぞれのシアル酸含量を掛けた炭水化物構造当たりのＮ−アセチルラクトサミン単位数の積は、ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯにおいて５５．５（ＣＨＯ１）、５２（ＣＨＯ２）及び４９．３（ＣＨＯ３）の値を生じた。ヒト細胞由来のＥＰＯ調製品の場合において、一致する値は５２．４（ＨｅＬａ１）、５２．５（ＨｅＬａ２）、５１．３（ＨｅＬａ３）、４３．５（ＨｅＬａ４）及び３８．９（ＨｅＬａ５）であった。
【００８４】
ＥＰＯのグリコシル化総数（３Ｎ結合炭水化物構造）に関して、それぞれのシアル酸含量を掛けたＮ−アセチルラクトサミン単位数の積は、ＣＨＯ細胞由来のＥＰＯにおいてそれぞれ１６６．５（ＣＨＯ１）、１５６（ＣＨＯ２）及び１４７．９（ＣＨＯ３）である。ヒト細胞由来のＥＰＯ調製品において、一致する値は１５７．２（ＨｅＬａ１）、１５７．５（ＨｅＬａ２）、１５３．９（ＨｅＬａ３）、１３０．５（ＨｅＬａ４）及び１１６．７（ＨｅＬａ５）であった（例１１も参照）。
【００８５】
更に重要なパラメーターは、繰り返しと称される、炭水化物構造の核に結合しうるＮ−アセチルラクトサミン単位の量である（Ｆｉｇ．７参照）。繰り返しの含量は、全てのＮ結合炭水化物構造の総計（２アンテナ＋３アンテナ＋４アンテナ＝１００％）に関する炭水化物構造を含む繰り返しのパーセンテージとして記載されている。
【００８６】
この繰り返しの比率は、ＣＨＯ細胞由来及びヒト細胞由来のＥＰＯ調製品において異なりうる。この様に、３９．６％（ＣＨＯ１）、５１％（ＣＨＯ２）及び３６．８％（ＣＨＯ３）の繰り返し比率がＣＨＯ細胞由来の調製品のものとして決定された。１８％（ＨｅＬａ１）、１６．５％（ＨｅＬａ２）、１４．０％（ＨｅＬａ３）、１２．２％（ＨｅＬａ４）及び９．８％（ＨｅＬａ５）がヒト細胞由来の調製品のものとして決定された（例１１参照）。
例８：要求に従う調節及び供給によるＥＰＯの生物学的活性への影響
培養を３６．５℃の温度で要求に従う供給を用いる繰り返しのバッチ工程（繰り返しのフェドバッチ）として行った。このために、無血清の、タンパク質に乏しい培養培地を滅菌発酵槽（総作業容量：１０ｌ）に居え、そして接種培養物を用いて１回接種した。接種後の細胞密度は３±１×１０⁵ 生細胞／mlであった。
【００８７】
１４４±２４時間の増殖期の後、培養液の一部を採収した。培養液の残りは発酵槽内に残され、そして次の増殖期のための接種の代わりとなった；この目的のため発酵槽は再び作業容積まで新鮮培地で満たされた。
ＥＰＯを含む培養上清を発酵培養物を遠心する事によって得た。
栄養素溶液を、増殖期の間、連続的に培養物に加えた。この目的のために、栄養素溶液を含む保存容器は発酵槽と組合わされた。栄養素溶液はアミノ酸類、ビタミン類、インスリン、微量元素、塩類、グルタミン及び炭水化物類を含んだ。２つの発酵を以下の様に行った：
発酵Ａにおいて栄養素溶液は糖としてＤ−（＋）−グルコースを含み、そして発酵Ｂにおいて糖類はＤ−（＋）−グルコース、Ｄ−（＋）−ガラクトース及びＤ−（＋）−マンノースであった。糖類に対するグルタミンの質量比は発酵Ｂにおいて１：２、２：３、６：６であった。栄養素溶液における個々の糖類の濃度は７．２〜１８ｇ／ｌの間であった。
【００８８】
培養物におけるグルタミンの濃度は発酵Ｂにおいて周期的に解析され、そしてその消費が算出された。栄養素溶液の瞬間体積流は細胞の栄養素要求に釣り合っていた。発酵Ａにおいてグルタミン濃度は調節変化が可能なものとして使用されなかった。発酵Ｂにおける栄養素溶液は、２：３：５の質量比のＤ−（＋）−グルコース、Ｄ−（＋）−ガラクトース及びＤ−（＋）−マンノースの糖類の混合物を含んだ。発酵槽における全糖類の濃度は、一致した供給によって培養の間、２〜６ｇ／ｌの範囲内に保たれた。
【００８９】
細胞密度は、増殖の間、採収時までに２０×１０⁵ 細胞／ml以上、典型的に３０±１０×１０⁵ 細胞／mlに変化した。採収時、ＥＰＯの濃度は典型的に４０±１０mg／ｌであった。
ヒトエリスロポエチンの濃度は、採収した培養液において、例えばＥＬＩＳＡによって決定された。生じたこのタンパク質のイソ型のパーセンテージ分布は、例えばキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を用いた分離によって決定された。
【００９０】
表４は、グルコースを含む栄養素溶液が供給される発酵Ａとグルコース、マンノース及びガラクトースを含む栄養素溶液が供給される発酵Ｂとの間のＥＰＯイソ型の分布の比較を示す。発酵ＢにおけるＥＰＯイソ型の含量は、発酵Ａのイソ型に対応するパーセンテージとして算出された。後者は各々１００％に標準化された。本データは、所望の高度にグリコシル化されたＥＰＯイソ型２〜４が、発酵Ａと比較して、発酵の間、より高い比率で本質的に存在している事を示す。
【００９１】
【表４】

【００９２】
供給を用いて得られたイソ型のパターンは、栄養素溶液の調節され及び要求に従う供給を用いた発酵から４つの連続的な採収において再現可能であった。
例９：培養温度の変化によるＥＰＯの生物学的活性への影響
本工程は、発酵槽温度が３６．５℃の代わりに３５．０℃である事を除く、調節され及び要求に応じる供給を用いるフェド−スプリットバッチ（ｆｅｄ−ｓｐｌｉｔｂａｔｃｈ）工程における例８において記述したものと同じであり（発酵Ｂ）、本発酵は１０００Ｌ規模で行われた。
【００９３】
表５は、各々が栄養素溶液の調節された供給を用いる、３６．５℃での発酵Ｃと３５．０℃での発酵ＤのＥＰＯのイソ型分布の比較を示す。発酵ＤにおけるＥＰＯのイソ型の含量は、発酵Ｃの対応しているイソ型のパーセンテージとして算出された。後者は、それぞれが１００％に標準化された。本データは酸性ＥＰＯイソ型の２〜４が、温度の低下によってかなり増大しうる事を示す。
【００９４】
【表５】

【００９５】
例１０：培地中の炭水化物組成の変化によるＥＰＯの生物学的活性への影響
以下に表す方法は、供給培地における炭水化物供給の変化によりヒトエリスロポエチンの質を変える事が可能である事を示す。
上述した本方法の２つの変異体は（以下発酵Ｅ及び発酵Ｆと称する）、使用した培地の組成が異なる事を示している。
【００９６】
両調製品において、培養培地の処方は改変ｅＲＤＦ培地を基にしている。無血清を使用し、しかし幾分の組換えインスリン（唯一のタンパク質添加物）及び更なる追加物（例えばセレナイト、プトレッシン、ヒドロコルチゾン、硫化鉄）が無血清又は無タンパク質培地において通常使用される。
供給栄養素溶液はまた、改変ｅＲＤＦ培地が基となっているが、塩類ＫＣｌ，Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ 及びＮａＣｌは含まない。
【００９７】
発酵ＥとＦとの間の主な違いは、供給培地への様々な単糖類の添加である。
発酵Ｅ：
通常の糖、Ｄ−（＋）−グルコースが発酵Ｅのために使用される。最初の濃度は３ｇ／ｌであった。グルコース含有栄養素溶液を適当に供給する事によって、培養液におけるグルコース濃度を、全体の培養の間、３±０．５ｇ／ｌに保った。
【００９８】
培養周期は典型的に１００±２０時間であった。ＥＰＯの濃度は採収時において典型的に４０±１０mg／ｌであった。
発酵Ｆ：
Ｄ−（＋）−グルコースに加えて、Ｄ−（＋）−ガラクトース及びＤ−（＋）−マンノースの糖類が、発酵Ｆのために、供給培地に約１：２：３の質量比で加えられた。培養の間、全糖類の濃度を、適当な供給によって０．２５ｇ／ｌと３．５ｇ／ｌの間の範囲内に保った。
【００９９】
この増殖のための培養周期は典型的に１００±２０時間であった。採収時のＥＰＯの濃度は典型的に４０±１０mg／ｌであった。
エリスロポエチンを前記培養上清から精製した。精製方法は、本糖タンパク質の関連したイソ型の分布が影響されないよう設計された（例２を参照）。
精製されたエリスロポエチンのイソ型分布を上述した様に決定した。
【０１００】
ヒトエリスロポエチンのイソ型の炭水化物構造及び採収した培養上清中のそれらの分布は発酵Ｅ及びＦにおいて異なった。発酵Ｅは、発酵Ｆと比較して、イソ型２，３及び４をかなりの高い比率で有していた。これらの違いは単糖類マンノース及びガラクトースの供給によって生じた（例２参照）。
正常マウス試験（例４）によって決定された生物学的活性（例４）は前記ＥＰＯのイソ型の分布及び炭水化物構造に関連する（Ｆｉｇ．３）。前記培養上清Ｅ及びＦから得たＥＰＯ調製品の炭水化物構造を、ＣＺＥ及びＨＰＡＥＣ解析で試験した。
【０１０１】
アンテナ度（２つの構造、３つの構造及び４つの構造を含む）、Ｎ−アセチルラクトサミン単位の含量（ＬＥ）、シアル酸含量（ＳＡ）及び２つのＥＰＯ調製品のＬＥとＳＡの積を表６に示す。
【０１０２】
【表６】

【０１０３】
例１１：特異的活性と炭水化物構造との関係
この例において、炭水化物構造への個々のＥＰＯのイソ型の生物学的活性の依存に対する研究を要約する。このために、様々なＥＰＯ供給源由来のイソ型（ＣＨＯ細胞及びヒト細胞由来のＥＰＯの異なる一群）を単離及び比較した。
１１．１ 等電点電気泳動（ＩＥＦ）及びウェスタンブロットによる個々のイソ型の単離
Ａ） ＩＥＦゲル電気泳動及びニトロセルロースへのエレクトロブロッティングのための方法
純粋な状態において個々のイソ型を単離するために、複数のイソ型の混合物から成るＥＰＯ溶液をｕｌｔｒａｆｒｅｅ遠心装置において脱塩し、そして濃縮（５〜１０mg／ml）した。この溶液の３５０〜１０００μｇをＳｅｒｖａのＩＥＦポリアクリルアミド既製ゲル（Ｓｅｒｖａｌｙｔ Ｐｒｅｃｏｔｅｓ、pH３〜５、３００μｍ、１２５×１２５mm）にかけた（レーン当たり７０〜１００μｇのＥＰＯを含む５〜１０レーン内）。本ＩＥＦを５℃で３．５時間２５００Ｖで行い；次にそのゲルをニトロセルロースにブロットした（２００mAでの３時間のメタノールを含むがＳＤＳは含まないＴｒｉｓ／グリシン緩衝液中でのウェットブロット）。ブロッティング工程の後、ゲルを除き、ニトロセルロース膜をポンソー染色液で染色した。染色されたイソ型を切り取り、そして再びＨ₂ Ｏ又はＴＢＳ緩衝液（１００mM Ｔｒｉｓ、pH７．４；１５０mM ＮａＣｌ）で完全に脱色した。
【０１０４】
Ｂ） 膜からのイソ型の抽出
各々のイソ型を含む脱色されたニトロセルロースの小片を２mlのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ容器に据え（前記ＩＥＦゲルの３〜４レーンに一致）、１．５mlのアセトンを加え、そしてそのニトロセルロースをボルテックスによって溶解した。それはＥＰＯを最適に沈澱させるために２０℃で一晩インキュベートされた。次にＥＰＯを含むその沈澱を１０分間のベンチ遠心、１４，０００rpm で単離した。沈澱物を１mlのアセトンを用いて２〜３回洗浄し、そして次に窒素気流下、室温又は３７℃で乾燥させた。ＥＰＯ沈澱物を次に、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH７．２に溶解し、そして次の解析まで−２０℃で保存した。
【０１０５】
Ｃ） 沈澱ＥＰＯ溶液からのイソ型の単離
個々のイソ型を、たった３〜４個のイソ型の代わりとして７〜８個を含む初期のＥＰＯ溶液の性質を用いてＡ）及びＢ）に記述した様に単離した。出発物質はＤＥクロマトグラフィー（陰イオン交換体）によって単離されたＥＰＯ画分であった。これらの画分は３〜４個のイソ型のみ（例えばイソ型６〜８又はイソ型１〜４）を含んだ。
【０１０６】
イソ型群を単離するために、適当なクロマトグラフィーカラムを使用するＥＰＯ １０mg当たり１〜２mlのＤＥＡＥ−セファロースｆｆで満たし、０．５Ｎ ＮａＯＨで再生した。次にカラムを最初に２CVの中和緩衝液及び次に少なくとも５CVの平衡化緩衝液を用いて平衡化した。
８個のイソ型を含んで成る精製されたＥＰＯ調製品を５±４℃の温度及び最大１５CV／時の流速で吸収させた。そのカラムを次に２〜３CVの平衡化緩衝液を用いて洗浄し、そしてそれに続きpH値が５．０まで洗浄緩衝液（約５CV）ですすいだ。
【０１０７】
様々なイソ型群を、溶出緩衝液において１０mMの段階から開始して２０mM ＮａＣｌまで、ＮａＣｌ濃度を増加することによって溶出した。塩基性イソ型はイオン交換体に弱く結合し、そして低イオン強度に相当して溶出され、酸性イソ型は最大７０mMのＮａＣｌのより高いＮａＣｌ濃度で溶出される。あるＮａＣｌ濃度において溶出されるイソ型の量は出発物質及び溶出体積に強く依存する。規定通り、溶出をＯＤ２８０がこのＮａＣｌ濃度において最大値の約５０％まで減少するまで個々の段階において続けた。この事は１５〜４０CVの間に相当する。ＮａＣｌ濃度範囲内での溶出されたイソ型群の更なる分画は、前記イソ型の更なる分離を生じる。カラムの進行速度は最大１５CV／時であった。
【０１０８】

個々の純粋イソ型を、Ａ）及びＢ）に記述した精製に従って得られたイソ型群から単離した。
【０１０９】
Ａ〜Ｃから得られた純粋なイソ型（ＩＦ）を酸性から塩基性までのそれらの等電点（ｐＩ）に従い番号をつけた。イソ型２（ＩＦ２）は、最も低いｐＩを有する、最も強く酸性の単離されたイソ型である。イソ型８は最も高いｐＩを有する、最も強く塩基性である。イソ型２は、出発混合物から十分な量において単離されうる、最も低いｐＩを有するイソ型であった。出発混合物において、イソ型１の１〜２％のみが存在するため、完全な解析のために十分な量を得ることが出来ない。
【０１１０】
純粋なイソ型を特徴づけるために以下の解析：
− ＰＰ−ＨＰＬＣによる量及び収率の決定
− キャピラリー電気泳動及び等電点電気泳動による純度及び同一性の決定；を行った。
個々のイソ型の収率は、一般に出発混合物において使用されるイソ型の２０％〜３０％の間であった。
【０１１１】
イソ型の純度は通常９０％以上、多くは９４％以上でさえあった。
１１．２ 結果
精製されたイソ型（ＩＦ）のために以下のデータ：
− Ｎ結合炭水化物構造の相対分布（グリコシル化総数に関する２アンテナ、３アンテナ及び４アンテナ構造の比率）及び繰り返しの含量
− 正常マウス試験における生物学的活性
− シアル酸含量；
を得た。
【０１１２】
これらの決定を前述した方法によって本質的に行った。
それぞれ個々のイソ型調製品のための単離されたイソ型のシアル酸含量は、単独に決定されなかったが、ＣＨＯ細胞由来ＥＰＯのイソ型２〜８又はヒト細胞由来ＥＰＯのイソ型２〜６のそれぞれの例として１〜３個の調製品において行われた。
【０１１３】
各イソ型の、おおよその、全ての番号のシアル酸の値をＮ−アセチルラクトサミン単位の含量（ＬＥ値）とシアル酸含量（ＳＡ）の積を算出するために使用した。
これらおおよそのＳＡ値は、ＣＨＯ細胞及びヒト細胞由来のＥＰＯにおいて以下の様に：１４（ＩＦ２）、１３（ＩＦ３）、１２（ＩＦ４）、１１（ＩＦ５）、１０（ＩＦ６）、９（ＩＦ７）及び８（ＩＦ８）；であった。
【０１１４】
表７はＣＨＯ細胞（ＣＨＯ１，ＣＨＯ２及びＣＨＯ３）並びにヒト細胞（ＨｅＬａ１〜５）由来の様々なＥＰＯの特異的活性と炭水化物構造の間の関係のデータを含む。この表は生物学的活性とＥＰＯ分子におけるＮ−アセチルラクトサミン単位の平均総数（ＬＥ）、平均シアル酸含量（ＳＡ）並びにＬＥ×ＳＡの積との間の関係を示す。
【０１１５】
表８はＣＨＯ細胞由来の予備分画されていないＥＰＯ群の単離されたイソ型の、生物学的活性とＥＰＯ分子におけるＮ−アセチルラクトサミン単位の平均総数（ＬＥ）、平均シアル酸含量（ＳＡ）並びにＬＥ×ＳＡの積との間の関係のデータを含む。
表９はＣＨＯ細胞由来の予備分画されたＥＰＯ群の様々な画分から単離されたイソ型（ＩＦ２又はＩＦ５）の様々な調製品（Ａ又はＢ）の比較を含み、すなわちイソ型２及び５の２つの調製品（Ａ及びＢ）がそれぞれの場合において解析された。予備分画を例１１．１Ｃに記述されたＤＥ陰イオン交換体によって行った。イソ型ＩＦ２及びＩＦ５の２つの調製品Ａ及びＢを、ＤＥカラムの異なる画分から単離した（画分５及び６からＩＦ２、画分２及び３からＩＦ５）。ＩＦ２／Ａ又はＩＦ５／Ａがそれぞれ単離された画分５又は２は、ＩＦ２／Ｂ又はＩＦ５／Ｂがそれぞれ単離された画分６又は３より、ＤＥセファロースカラムから容易に溶出された（より低い塩濃度において）。しかしながら、イソ型２又は５の調製品Ａ及びＢはそれぞれ、次の等電点電気泳動において又はキャピラリー電気泳動においてそれらの特性に違いはなく、すなわちＩＦ２又はＩＦ５の両調製品は同一のシアル酸含量を有している。しかしながら、調製品Ａからのイソ型が、それらのより高いＬＥ値及びより高い繰り返し構造の含量のため、調製品Ｂの相当するイソ型よりも有意に高い生物学的活性を有する事が驚くことに明らかとなった。同一のシアル酸含量においてＥＰＯ分子内に含まれるＮ−アセチルラクトサミン単位の総数に対するイソ型の生物学的活性の表９に記載の依存性はイソ型２及び５だけでなく他のイソ型においても観察されなかった。
【０１１６】
表１０は様々なＥＰＯ供給源（ＣＨＯ細胞又はヒトＨｅＬａ Ｓ３細胞）由来の相当するイソ型を比較する。また、この場合において相関関係が生物学的活性とＬＥ×ＳＡの値との間で明らかになった。
故に、全ての表において、相関関係がＮ−アセチルラクトサミン単位数（ＬＥ）とシアル酸含量（ＳＡ）の積と生物学的活性との間で見られうる。ＬＥ×ＳＡの積の高い値は高い生物学的活性と常に関連する。
【０１１７】
【表７】

【０１１８】
【表８】

【０１１９】
【表９】

【０１２０】
【表１０】

【０１２１】
付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位（繰り返し）を有するＮ結合炭水化物構造の比率に対する生物学的活性の依存を、例として個々のイソ型を用いてＦｉｇ．４に示す。イソ型を、繰り返し含有炭水化物構造の異なる比率を含むＥＰＯ調製品から単離した（繰り返し含有構造を約５０％有するＥＰＯ１、約４０％有するＥＰＯ２及び約１５％を有するＥＰＯ３）。対応するイソ型（同一のシアル酸含量及びほぼ同一のアンテナ度）の生物学的活性は、繰り返し含有炭水化物構造がそのイソ型において減少する様に減少する。この特性は、イソ型２から少なくともイソ型７においてまで見られうる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は付加的なＮ−アセチルラクトサミン単位（繰り返し）及びシアル酸を有する４アンテナ構造の図を示す。
【図２】図２は培養培地に加えられた炭水化物類に対する個々のＥＰＯイソ型の相対的な比率の依存性を示す。
【図３】図３は培養培地に加えられた炭水化物類に対するＥＰＯ調製品の生物学的活性の依存性を示す。
【図４】図４はＮ−アセチルラクトサミン繰り返し単位に対するＥＰＯのイソ型の生物学的活性の依存性を示す。

Claims (5)

1. ＥＰＯ組成物の比活性を増大させる方法であって、ヒト細胞由来ＥＰＯ分子が、当該ＥＰＯ組成物において、炭水化物鎖の総数に対して少なくとも１０％のＮ−アセチルラクトサミンの繰り返しの平均比率を有するように強化される、方法。
2. ＥＰＯ分子のＮ結合炭水化物鎖に関して少なくとも４．３のＮ−アセチルラクトサミン単位又はＥＰＯ分子のＮグリコシル化総数に関して少なくとも平均１３．０のＮ−アセチルラクトサミン単位の平均数に強化される、請求項１に記載の方法。
3. ＥＰＯ分子のＮ結合炭水化物鎖に関するＮ−アセチルラクトサミン単位の平均数に平均シアル酸含量を掛けた積が少なくとも４３．３、又はＥＰＯ分子のＮグリコシル化総数に関して少なくとも１３０の値に強化される、請求項１に記載の方法。
4. 炭水化物鎖の総数に対するＮ−アセチルラクトサミン繰り返しの平均比率に４アンテナ炭水化物構造の平均比率を掛けた積が、少なくとも８００の値に強化される、請求項１に記載の方法。
5. 前記強化が、以下の方法：
   （ａ）Ｎ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有する炭水化物鎖の製造が可能である適当な産生細胞の選択、
   （ｂ）Ｎ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有する炭水化物鎖を製造するための前記細胞培養のための適当な培養条件の選択及び
   （ｃ）Ｎ−アセチルラクトサミン単位を高い比率で有する炭水化物鎖を含むＥＰＯ分子の強化の間の、ＥＰＯ分子の既知の組成物からの不所望成分の分離：
   のうちの１又は複数によって達成される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。

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