KR101898302B1

KR101898302B1 - 당사슬의 비환원 말단이 만노오스 잔기인 당 단백질의 제조 방법

Info

Publication number: KR101898302B1
Application number: KR1020137012110A
Authority: KR
Inventors: 겐이치 다카하시
Original assignee: 제이씨알 파마 가부시키가이샤
Priority date: 2010-10-15
Filing date: 2011-10-13
Publication date: 2018-09-13
Also published as: US11649474B2; JPWO2012050175A1; KR20130119932A; US20190256883A1; US20130224797A1; WO2012050175A1; CN103154243A; EP2628797A1; EP2628797A4; JP5918697B2; EP2628797B1

Abstract

포유 동물 세포를 사용한, N-글리코사이드 결합 당사슬의 비환원 말단의 전부 또는 일부가 만노오스 잔기인 당 단백질의 제조 방법이 개시되어 있다. 당해 제조 방법은 β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자를 도입하여 발현시킨 형질 전환 포유 동물 세포, 및 그 세포를 사용한 당 단백질의 제조 방법이다.

Description

당사슬의 비환원 말단이 만노오스 잔기인 당 단백질의 제조 방법 {METHOD FOR PRODUCING GLYCOPROTEIN HAVING MANNOSE RESIDUE AS NON-REDUCING END OF SUGAR CHAIN}

본 발명은 포유 동물 세포를 사용한 당사슬의 비환원 말단이 만노오스 잔기인 당 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

포유 동물 세포 중에서, 당 단백질의 N-글리코사이드 결합 당사슬은, 단백질이 RNA 로부터 번역되어 소포체 내강을 거쳐 골지체로 수송되는 과정에서, 각종 효소가 관여하는 복잡한 경로를 거쳐 단백질의 아스파라긴 잔기에 부가된다. N-글리코사이드 결합 당사슬의 주된 것은 복합형 당사슬과 고 (高) 만노오스형 당사슬이다. 고만노오스형 당사슬은 주로 하기 구조식 1 로 나타내는 구조를 갖는다. 또, 복합형 당사슬은 여러 가지 타입의 것이 있지만, 비환원 말단이 시알산 잔기인 것을 특징으로 한다. 그 일례를 하기 구조식 2 로 나타낸다. 또 복합형 당사슬과 고만노오스형 당사슬에 공통의 하기 구조식 3 으로 나타내는 영역은 코어 영역이라고 한다.

[화학식 1]

고만노오스형 당사슬이나 복합형 당사슬은 이하에 서술하는 바와 같이 하여 생합성된다. 즉, 먼저, 2 개의 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc), 9 개의 만노오스 (Man) 및 3 개의 글루코오스 (Glc) 잔기를 포함하는 돌리콜-P-P-GlcNAc₂Man₉Glc₃ 중간체가, 올리고사카릴트랜스페라아제 복합체에 의해, 소포체 내강에서 번역 중인 단백질의 아스파라긴 잔기로 전이되어, 하기 구조식 4 의 당사슬이 부가된 상태가 된다.

[화학식 2]

이어서, 소포체 내강에서, 그 구조식 4 의 당사슬로부터, 글루코시다아제에 의해, 3 개의 Glc, 이어서 ER 만노시다아제에 의해 1 개의 Man 가 그 비환원 말단에서 제거되어, 하기 구조식 5 의 당사슬 구조가 된다.

[화학식 3]

이어서, 그 당 단백질은 골지체에 수송되고, 그 구조식 5 의 당사슬로부터, 골지 만노시다아제 I 에 의해 3 개의 Man 가 제거되고, 코어 영역에 2 개의 Man 가 결합된 상기 구조식 1 의 고만노오스형 당사슬이 생긴다.

복합형 당사슬은 고만노오스형 당사슬이 골지체에서 더욱 수식을 받아 생긴다. 즉, 상기 구조식 2 의 복합형 당사슬의 합성 경로는 이하와 같다. 먼저, 고만노오스형 당사슬 (구조식 1) 에 N-아세틸글루코사민트랜스페라아제 I 에 의해 GlcNAc 가 1 개 결합되어, 하기 구조식 6 의 당사슬 구조가 된다. 이어서, 골지 만노시다아제 Ⅱ 에 의해 Man 가 2 개 제거되어, 코어 영역에 GlcNAc 가 1 개 결합된 하기 구조 7 의 당사슬 구조가 된다.

[화학식 4]

이어서 GlcNAc 가 2 개, 갈락토오스 (Gal) 가 3 개, 시알산 (Sia) 이 3 개 결합되어 상기 구조식 2 의 복합형 당사슬이 형성된다. 아스파라긴 잔기에 직접 결합되어 있는 GlcNAc 에 푸코오스가 결합되어 있는 복합형 당사슬도 존재한다.

포유 동물 세포, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO 세포) 를 이용하여, 재조합체 당 단백질을 제조했을 경우, 그 단백질의 당사슬 구조의 상당수는 복합형 당사슬이 되므로, 이와 같은 재조합체 당 단백질의 당사슬의 비환원 말단은 시알산 잔기가 된다. 재조합체 당 단백질에, 비환원 말단이 시알산 잔기인 복합형 당사슬이 부가되면, 생체 내에 투여했을 때에 혈중에서의 안정성이 증가되는 것이 알려져 있다 (특허문헌 1 참조). 따라서, 혈액 중에서 순환되어 그 효과를 발휘하는 재조합체 당 단백질을 제조하는 경우, 이들의 혈중 반감기를 장기화시킴으로써 약효 등을 높이는 것을 기대할 수 있으므로, 당사슬의 비환원 말단이 시알산 잔기가 되는 CHO 세포를 사용한 제조법이 활용되고 있다. 에리스로포에틴, 난소 자극 호르몬 (FSH) 이 그 좋은 예이다 (특허문헌 2, 3 참조).

그러나, 재조합체 당 단백질 중에는, 당사슬 구조가 복합형 당사슬이 되는 것이 오히려 결점이 되는 것이 있다. 예를 들어, 글루코세레브로시다아제 등의, 라이소솜병에 대한 효소 보충 요법으로 환자에게 의약으로서 투여되는 일군의 효소이다. 이들 효소는, 생체 내에 투여한 후, 그 기능을 발휘하기 위해서 세포 내로 도입될 필요가 있지만, 세포 내로의 도입은 타겟이 되는 세포의 세포막 상에 발현하는 만노오스 수용체를 통하여 실시된다 (비특허문헌 1 참조). 그리고, 만노오스 수용체를 통하여 당 단백질을 도입하기 위해서는, 당 단백질의 당사슬 구조가 비환원 말단이 만노오스 잔기인 고만노오스형 당사슬일 필요가 있다. 따라서, 이와 같은 효소 보충 요법에 있어서는, 당사슬 구조가 복합형 당사슬인 것은 사용할 수 없다.

또, 짧은 혈중 반감기인 것이 요구되는 의약의 경우에는, 비환원 말단이 복합형 당사슬인 것은 혈중에서의 안정성이 증가되는 점에서 바람직하지 않고, 이와 같은 경우에도, 고만노오스형 당사슬인 것이 요구된다.

그래서, 고만노오스형 당사슬을 갖는 당 단백질의 제조법의 확립이 시도되고 있다. 예를 들어, 포유 동물 세포를 사용하여 일단 복합형 당사슬을 갖는 당 단백질로서 제조하고, 이것을 시알리다아제, β-갈락토시다아제 및 헥소사미니다아제의 3 종의 효소로 처리하여, 비환원 말단으로부터 시알산, 갈락토오스 및 N-아세틸갈락토사민을 제거하고, 환원 말단을 만노오스 잔기로 하는 수법이 있다. 현재, 젠자임사로부터 고셰병 치료제로서 판매되고 있는 글루코세레브로시다아제 제제 (상품명：세레자임 (등록상표) 주 200U, 비특허문헌 2 참조) 는 이 수법에 의해 제조되고 있다. 그러나, 이 방법에서는, 효소 처리라는 추가적인 공정이 필요해지는 점에서, 그것에 기초한 번잡함이나 비용의 문제 등이 있다.

또, 포유 동물 세포에서 당 단백질을 발현시킬 때에, 키프넨신의 존재하에서 세포를 배양하는 방법이 알려져 있다 (특허문헌 4 참조). 키프넨신은 ER 만노시다아제의 저해제이므로, 당사슬의 수식 과정이 ER 만노시다아제의 전단층인 글루코시다아제에 의한 글루코오스의 제거에 의해 멈추고, 그 결과로서 비환원 말단에 3 개의 만노오스 잔기를 갖는 하기 구조식 8 의 당사슬 구조를 갖는 당 단백질이 얻어진다. 그러나, 이 방법에 있어서는, 합성 과정에 있어서 효소 저해제를 첨가해야 하는 점에서, 그것에 기초하는 생성물의 안전성에 대한 우려의 문제 등이 있다.

[화학식 5]

이 외에, N-아세틸글루코사민트랜스페라아제 I 활성을 결손시키는 CHO 세포의 변이주인 LEC-1 세포를 사용하는 방법이 알려져 있다 (비특허문헌 3 참조). N-아세틸글루코사민트랜스페라아제는 고만노오스형 당사슬 (구조식 1) 에, GlcNAc 를 1 개 결합시켜 상기 구조식 6 의 당사슬 구조로 하는, 고만노오스형 당사슬로부터 복합형 당사슬을 합성하는 경로의 초기 반응을 촉매하는 효소이다. 이 효소가 결손됨으로써, LEC-1 세포에서는 고만노오스형 당사슬로부터 복합형 당사슬이 합성되지 않고, 고만노오스형 당사슬의 당사슬 구조를 갖는 당 단백질이 얻어진다. 그러나, 당 단백질을 제조하는 방법으로서, LEC-1 세포를 사용하는 방법은 반드시 생산성이 우수한 것은 아니다 (비특허문헌 4).

또, 비환원 말단에 만노오스 잔기를 갖는 당 단백질의 제조법으로서, 곤충 세포를 사용한 발현계가 알려져 있다 (특허문헌 5 참조). 곤충 세포에서는, 2 개의 GlcNAc 와 3 개의 Man 로 구성되는 상기 구조식 3 으로 나타내는 N-글리코사이드 결합형 당사슬 (파우치 만노오스형 당사슬) 을 갖는 당 단백질이 산생되는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 5 참조). 즉, 곤충 세포에서는, 상기 구조식 7 로부터, β-N-아세틸글루코사미니다아제에 의해 비환원 말단의 GlcNAc 가 제거되어, 파우치 만노오스형 당사슬되는 경로가 우세하게 작용하고, 그 결과로서, 비환원 말단에 만노오스 잔기를 갖는 당 단백질이 얻어진다 (비특허문헌 6 참조).

곤충 세포를 사용한 발현계에서 일반적인 것으로, 밤나방 (Spodoptera frugiperda) 유래의 세포 (Sf-9 등) 를 사용한 것이 있다 (특허문헌 6 참조). 밤나방은 당사슬의 비환원 말단으로부터 GlcNAc 를 제거한 활성을 갖는 효소로서, β-N-아세틸글루코사미니다아제 1, β-N-아세틸글루코사미니다아제 3 (비특허문헌 7, 8 참조) 및 SfFDL 의 3 종류의 β-N-아세틸글루코사미니다아제를 갖는 것이 알려져 있다 (특허문헌 7 참조). 동일한 활성을 갖는 효소 (예를 들어, BmFDL) 가, 누에나방 (Bombyx mori) 으로부터도 단리되어 있다 (비특허문헌 9). 그러나, 곤충 세포와 포유 동물 세포 (특히, 인간 세포) 사이에는, 명확한 종 (種) 차가 존재하기 때문에, 의약 등의 제조에 있어서 곤충 세포를 사용하는 것은, 그 생성물이 곤충 세포 내에서의 생합성 과정에 있어서 받는 여러 가지 영향에 대한 우려 때문에 바람직하지 않은 것으로 생각된다.

이 외에, 포유 동물 세포 이외의 세포를 사용한 비환원 말단에 만노오스 잔기를 갖는 당 단백질의 제조 방법으로서, 식물 유래의 세포를 사용한 발현계가 알려져 있다 (특허문헌 8 참조).

일본 공개특허공보 평8-027181호 일본 공표특허공보 2001-525342호 WO2009/127826 일본 공표특허공보 2004-506438호 일본 공개특허공보 2009-225781호 일본 공개특허공보 평2-291270호 WO2009/079376 일본 공표특허공보 2006-524506호

Sato Y. et al., J Clin Invest. (1993) 91, 1909-17 세레자임 주 200U 첨부 문서 Ripka J. et al., J CellBiochem. (1990) 42, 117-22 Van Patten SM. et al., Glycobiology (2007) 17, 467-78 Watanabe S. et al., J Biol Chem. (2002) 277, 5090-3 Altmann F. et al., J Biol Chem. (1995) 270, 17344-9 Tomiya N. et al., J Biol Chem. (2006) 281, 19545-60 Aumiller JJ. et al., Prot. Expr. Purif. (2006) 47, 571-90 Nomura T. Et al., J Biosci Bioeng. (2010) 110, 386-91

상기 배경하에서, 본 발명의 목적은, 포유 동물 세포, 특히 CHO 세포를 사용하여, N-글리코사이드 결합 당사슬의 비환원 말단에 만노오스 잔기를 갖는 재조합체 당 단백질을 제조하는 새로운 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 위한 연구에 있어서, 본 발명자들은 고만노오스형 당사슬의 합성이 우세하게 작용하고 있는 곤충 세포 내에서의 기구를, 포유 동물 세포에 도입하는 것을 검토하였다. 그 결과, 놀랄만하게도, 포유 동물 세포에 β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자를 도입하여 발현시킨 형질 전환 포유 동물 세포를 사용함으로써, N-글리코사이드 결합 당사슬의 비환원 말단에 만노오스 잔기를 갖는 재조합체 당 단백질이 얻어지는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 이하를 제공하는 것이다.

[1] 외래의 β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자가 도입되고 발현되어 이루어지는 형질 전환 포유 동물 세포.

[2] 그 β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자를 도입함으로써 발현한 β-N-아세틸글루코사미니다아제가 골지체에서 그 활성을 나타내는 것인 상기 [1] 의 형질 전환 포유 동물 세포.

[3] 그 β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자가 곤충 유래의 것인 상기 [1] 또는 [2] 의 형질 전환 포유 동물 세포.

[4] 그 곤충이 인시목 (麟翅目) 에 속하는 곤충인 상기 [3] 의 형질 전환 포유 동물 세포.

[5] 인시목에 속하는 그 곤충이 밤나방 또는 누에나방인 상기 [4] 의 형질 전환 포유 동물 세포.

[6] 그 β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자가 β-N-아세틸글루코사미니다아제 1 유전자, β-N-아세틸글루코사미니다아제 3 유전자, SfFDL 유전자 및 BmFDL 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 것인 상기 [5] 의 형질 전환 포유 동물 세포.

[7] 소정의 당 단백질을 산생하도록, 그 소정의 당 단백질을 코드하는 외래 유전자가 추가로 도입되어 발현되어 이루어지는 상기 [1]∼[6] 의 어느 하나의 형질 전환 포유 동물 세포.

[8] 그 소정의 당 단백질을 코드하는 외래 유전자가 인간 유래의 유전자인 상기 [7] 의 형질 전환 포유 동물 세포.

[9] 인간 유래의 그 유전자가 리소솜 효소를 코드하는 것인 상기 [8] 의 형질 전환 포유 동물 세포.

[10] 그 리소솜 효소가 글루코세레브로시다아제, 산성 스핑고미엘리나아제, 리소솜 산성 리파아제, 산성 α-글루코시다아제, N-아세틸갈락토사민-4-술파타아제, 이두론산2-술파타아제, α-L-이두로니다아제, α-갈락토시다아제 A, 헥소사미니다아제, α-N-아세틸갈락토사미니다아제, 및 α-만노시다아제, 시알리다아제로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 상기 [9] 의 형질 전환 포유 동물 세포.

[11] 그 리소솜 효소가 글루코세레브로시다아제인 상기 [9] 의 형질 전환 포유 동물 세포.

[12] N-글리코사이드 결합 당사슬의 비환원 말단에 위치하는 잔기의 전부 또는 일부가 만노오스 잔기인 당 단백질의 제조 방법으로서,

(a) 상기 [1]∼[6] 중 어느 것의 포유 동물 세포를 배양액 중에서 배양하여, 당 단백질을 발현시키는 단계, 및

(b) 상기 단계 (a) 에서 발현시킨 당 단백질을 정제하는 단계를 포함하여 이루어지는 것인 제조 방법.

[13] 상기 [1]∼[6] 의 어느 것의 포유 동물 세포 대신에, 상기 [7] 의 포유 동물 세포를 사용하는 것인 상기 [12] 의 제조 방법.

[14] 그 당 단백질을 코드하는 외래 유전자가 인간 유래의 유전자인 상기 [13] 의 제조 방법.

[15] 인간 유래의 그 유전자가 리소솜 효소를 코드하는 것인 상기 [14] 의 제조 방법.

[16] 그 리소솜 효소가 글루코세레브로시다아제, 산성 스핑고미엘리나아제, 리소솜 산성 리파아제, 산성 α-글루코시다아제, N-아세틸갈락토사민-4-술파타아제, 이두론산2-술파타아제, α-L-이두로니다아제, α-갈락토시다아제 A, 헥소사미니다아제, α-N-아세틸갈락토사미니다아제, 및 α-만노시다아제, 시알리다아제로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 상기 [15] 의 제조 방법.

[17] 그 리소솜 효소가 글루코세레브로시다아제인 상기 [15] 의 제조 방법.

본 발명에 의해 곤충의 β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자에 의해 형질 전환된 포유류 세포는 그것이 산생하는 당 단백질의 N-글리코사이드 결합 당사슬의 비환원 말단에 위치하는 잔기가 만노오스가 되는 비율이 증대되도록 형질이 변화되어 있다. 따라서, 당해 세포는 원래 갖는 내인성의 당 단백질을, 그 N-글리코사이드 결합 당사슬의 비환원 말단에 위치하는 잔기의 적어도 일부가 또는 전부가 만노오스 잔기가 된 형태로 산생한다. 또, 외래의 당 단백질 유전자를 도입하여 발현시키는 경우에, 천연의 포유류 세포 대신에 이 형질 전환 포유류 세포를 사용하면, 천연의 포유류 세포를 사용한 것에서는 얻어지지 않았던, 당사슬의 비환원 말단에 위치하는 잔기의 일부가 만노오스 잔기인 당 단백질을, 또는 보다 대부분이, 바람직하게는 전부가 만노오스 잔기인 당 단백질을 산생시킬 수 있다.

따라서, 본 발명에 의하면, N-글리코사이드 결합 당사슬의 비환원 말단에 위치하는 잔기의 비율을 증대시킨 당 단백질을, 곤충 세포 등을 사용하지 않고 제조할 수 있다. 종래, 포유 동물 세포를 사용하여 제조한 당 단백질은 N-글리코사이드 결합 당사슬로서 복합형 당사슬을 갖는 것이었기 때문에, 그 비환원 말단에 위치하는 잔기를 만노오스 잔기로 하기 위해서는, 추가로 효소 처리 등을 할 필요가 있던 것에 반해, 본 발명에 의하면, N-글리코사이드 결합 당사슬의 비환원 말단에 위치하는 잔기의 전부 또는 일부가 만노오스 잔기인 당 단백질을 직접 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의하면, 종래와 비교하여 효율적이고 또한 용이하게, 만노오스 잔기를 N-글리코사이드 결합 당사슬의 비환원 말단 잔기로서 갖는 것인 당 단백질을 얻을 수 있다. 또, 본 발명에 의해 얻어지는 당 단백질은, 예를 들어, 표적 세포의 표면에 존재하는 만노오스 수용체를 통하여 세포에 도입되어야 할 의약이나, 혈중 반감기가 짧게 있어야 할 의약 등으로서 유용하다.

도 1a 는 pE-neo 벡터의 구축 방법의 흐름도를 나타낸다.
도 1b 는 pE-neo 벡터의 구축 방법의 흐름도를 나타낸다.
도 2a 는 pE-hygr 벡터의 구축 방법의 흐름도를 나타낸다.
도 2b 는 pE-hygr 벡터의 구축 방법의 흐름도를 나타낸다.
도 2c 는 pE-hygr 벡터의 구축 방법의 흐름도를 나타낸다.
도 3 은 글루코세레브로시다아제 (GBA) 의 전기 영동 패턴을 나타내는 도면. (레인 1 은 GBA 발현 세포의 배양 상청을, 레인 2∼4 는 GBA 발현 세포의 배양 상청을 순차 시알리다아제, β1,4-갈락토시다아제, 및 β-N-아세틸글루코사미니다아제로 처리한 것을, 레인 5 는 GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포의 배양 상청을 각각 첨가한 것이다)
도 4 는 GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포로부터 얻어진 글루코세레브로시다아제 (GBA) 의 매크로파지 세포 내 도입량의 측정 결과를 나타내는 도면이다. 그래프 1 은 GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포로부터 얻어진 GBA, 그래프 2 는 GBA 발현 세포로부터 얻어진 GBA, 그래프 3 은 GBA 발현 세포로부터 얻어지고 또한 효소에 의해 당사슬을 트리밍한 GBA 의, 세포 내 도입량을 각각 나타낸다. 그래프 4∼6 은, 만난 존재하에서의, GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포로부터 얻어진 GBA, GBA 발현 세포로부터 얻어진 GBA, 및 GBA 발현 세포로부터 얻어지고 또한 효소에 의해 당사슬을 트리밍한 GBA 의, 세포 내 도입량을 각각 나타낸다. 세로축은 세포 내로 도입된 GBA 의 양 (대조에 대한 ％) 을, 가로축은 GBA 의 농도 (mU/㎖) 를 각각 나타낸다.
도 5 는 GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포로부터 얻어진 글루코세레브로시다아제 (GBA) 의 전기 영동 패턴을 나타내는 도면. 화살표는 GBA 에서 유래하는 밴드를 나타낸다. (레인 M 은 분자량 마커, 레인 1 은 GBA 발현 세포의 배양 상청을, 레인 2 는 GBA/Sf-FDL 발현 세포의 배양 상청을, 레인 3 은 GBA/Bm-FDL 발현 세포의 배양 상청의 배양 상청을 각각 첨가한 것이다)
도 6 은 GBA/Sf-FDL 발현 세포 및 GBA/Bm-FDL 발현 세포의 배양 상청으로부터 얻어진 글루코세레브로시다아제 (GBA) 의 세포 내 도입량의 측정 결과를 나타내는 도면이다. 그래프 1 은 GBA/Sf-FDL 발현 세포로부터 얻어진 GBA, 그래프 2 는 GBA/Bm-FDL 발현 세포로부터 얻어진 GBA, 그래프 3 은 GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포로부터 얻어진 GBA 의 세포 도입량을 각각 나타낸다. 그래프 4∼6 은, 만난 존재하에서의, GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포로부터 얻어진 GBA, GBA/Sf-FDL 발현 세포로부터 얻어진 GBA, GBA/Bm-FDL 발현 세포로부터 얻어진 GBA 의 세포 내 도입량을 각각 나타낸다. 세로축은 세포 내로 도입된 GBA 의 양 (대조에 대한 ％) 을, 가로축은 GBA 의 농도 (mU/㎖) 를 각각 나타낸다.

본 발명에 있어서, 포유 동물이라고 할 때는 특별히 한정은 없고, 어떠한 포유 동물도 포함하지만, 바람직하게는 인간, 아프리카 녹색 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트, 차이니즈 햄스터 등 설치류, 토끼, 개이다. 또, 포유 동물 세포라고 할 때는, 포유 동물 유래의 세포이면 특별히 한정은 없고, 생체로부터 취출한 장기, 근조직, 피부 조직, 결합 조직, 신경 조직, 혈액, 골수 등으로부터 채취된 세포의 초대 배양 세포, 계대 배양 세포, 및 계대 배양해도 형질이 안정되도록 주화 (株化) 된 세포 중 어느 것이어도 된다. 또, 세포는 정상 세포, 암화 세포 중 어느 것이어도 된다. 특히 바람직하게 사용할 수 있는 세포는 차이니즈 햄스터의 난소에서 유래하는 CHO 세포, 인간의 섬유 아세포 및 아프리카 녹색 원숭이의 신장 선유 아세포에서 유래하는 COS 세포이다.

본 발명에 있어서, β-N-아세틸글루코사미니다아제라고 할 때는, 당사슬의 비환원 말단에 위치하는 β-글리코사이드 결합된 N-아세틸글루코사민 (예를 들어 상기 구조식 6, 구조식 7 등의 비환원 말단에 위치하는 N-아세틸글루코사민) 을 유리시키는 활성을 갖는 효소를 말한다. 또, β-N-아세틸글루코사미니다아제를 코드하는 유전자는, 코드되는 β-N-아세틸글루코사미니다아제가 상기 효소 활성을 갖는 한, 어떠한 것이어도 된다. 예를 들어, 생물로부터 직접 유래하는 야생형의 유전자, 야생형의 유전자에 염기의 치환, 삽입, 결실 등의 변이를 가한 변이형의 유전자, 인공적으로 설계한 유전자 중 어느 것이어도 사용할 수 있다. 또, 생물의 종류에 대해서도 특별히 제한은 없고, 포유 동물을 포함하여 어떠한 생물 유래의 것도 사용할 수 있지만, 예를 들어, 인시목 (Lepidoptera) 에 속하는 누에나방 (Bombyx mori), 밤나방 (Spodoptera frugiperda), 자벌레 (Geometridae) 등, 쌍시목 (Diptera) 에 속하는 초파리 (Drosophila) 등의 곤충, 바실라스속 등의 원핵 생물, 선충, 효모, 방선균, 사상균, 자낭균, 탄자균 및 식물 유래의 것이 바람직하게 사용된다. 이 중, 곤충, 그 중에서도 인시목에 속하는 곤충, 특히 밤나방 또는 누에나방 유래의 것이 바람직하다.

사용할 수 있는 생물 유래의 β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자의 예로서, 밤나방 유래의 β-N-아세틸글루코사미니다아제 1, β-N-아세틸글루코사미니다아제 3 유전자, SfFDL 유전자, 누에나방 유래의 BmFDL 유전자 등이 있다. 또, 복수의 생물 유래의 β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자 단편을 융합시켜 구축한 β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자를 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 포유 동물 세포에서 발현시키는 β-N-아세틸글루코사미니다아제는, 당해 세포 내에서의 N-글리코사이드 결합 당사슬의 합성 경로에 있어서, 예를 들어 상기 구조식 6, 구조식 7 의 비환원 말단에 위치하는 N-아세틸글루코사민을 유리하는 효소로서 기능하는 것이다. 따라서, 그 효소는 포유 동물 세포 내에서 N-글리코사이드 결합 당사슬의 합성이 실시되는 세포 소기관인 골지체에서 그 활성을 나타내는 것이 바람직하다.

포유 동물 세포 내에서 이들 세포 소기관에 국재화하는 단백질은, 통상, 그 아미노산 배열 중에 국재화 시그널을 갖는 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 있어서 도입하는 β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자로는, 보다 적극적으로 이들 세포 소기관에 국재화시키기 위해서, β-N-아세틸글루코사미니다아제의 효소 활성 부위를 코드하는 유전자 단편과 다른 단백질의 상기 국재화 시그널을 코드하는 유전자 단편을 융합시켜 구축한 키메라형의 β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자인 것을 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자에 의한 포유 동물 세포의 형질 전환은 β-N-아세틸글루코사미니다아제를 포유 동물 세포에서 발현시키는 목적에서 실시하는 것이고, 이 목적이 달성되는 한 어떠한 방법을 이용하여 실시해도 된다. 통상, 그 형질 전환은 β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자를 삽입한 발현 벡터를 포유 동물 세포에 도입하여 실시할 수 있다. 이와 같은 발현 벡터는 포유 동물 세포 내에서 β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자를 발현시킬 수 있는 것이면 특별히 한정은 없다. 일반적으로, 발현 벡터는 고리형의 플라스미드이고, 이것을 고리형인 상태로, 또는 제한 효소로 절단하고 나서 세포에 도입한다. β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자는, 포유 동물 세포 내에서 발현하도록, 유전자의 발현을 제어하는 발현 벡터 내의 프로모터의 하류에 삽입된다. 이 때 프로모터로서 사이토메갈로 바이러스 (CMV) 유래의 프로모터, SV40 초기 프로모터, 신장 인자 1 (EF-1) 프로모터 등을 사용할 수 있다.

혹은, 그 형질 전환은, 예를 들어, 포유 동물 세포를, β-N-아세틸글루코사미니다아제를 발현하는 곤충 세포 등의 세포와 융합시킴으로써 실시해도 된다. 본 명세서에 있어서는, 이와 같이 융합된 포유 동물 세포도 본 발명의 β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자에 의해 형질 전환된 포유 동물 세포에 포함된다. 또 이 때, 1 종류에 한정하지 않고 복수 종류의 β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자에 의해, 포유 동물 세포를 형질 전환시켜도 된다.

본 발명에 있어서, 당 단백질을 코드하는 외래 유전자에 의한 포유 동물 세포의 형질 전환은, 포유 동물 세포에 있어서, 그 당 단백질이 산생되도록 하는 목적에서 실시하는 것이고, 이 목적이 달성되는 한 어떠한 방법을 이용하여 실시해도 된다. 그 형질 전환은 상기 β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자에 의한 포유 동물 세포의 형질 전환과 동일하게 실시할 수 있다.

본 발명에 있어서, 발현 벡터에 삽입되는, 당 단백질을 코드하는 외래 유전자에 대해 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는 생체 내에 투여했을 때에, 만노오스 수용체를 통하여 세포에 도입시킬 필요가 있는 당 단백질을 코드하는 유전자이고, 특히 바람직하게는 글루코세레브로시다아제, 산성 스핑고미엘리나아제 (스핑고미엘린포스포디에스테라아제) 등의 리소솜 효소를 코드하는 유전자이다. 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어진 글루코세레브로시다아제는 고셰병 환자의, 산성 스핑고미엘리나아제는 니만피크병 환자의, 리소솜 산성 리파아제는 월만병 환자의, 산성 α-글루코시다아제 (산성 말타아제) 는 폼페병 환자의, N-아세틸갈락토사민-4-술파타아제는 마로토·라미 증후군 환자의, 이두론산2-술파타아제는 헌터 증후군 환자의, α-L-이두로니다아제는 후를러 증후군 환자의, α-갈락토시다아제 A 는 파브리병 환자의, 효소 보충 요법에 사용할 수 있다. 그 외에, 본 발명의 제조 방법은 헥소사미니다아제, α-N-아세틸갈락토사미니다아제, α-만노시다아제, 시알리다아제 등의 효소의 제조에 사용할 수 있다.

또, 본 발명에 있어서, 포유 동물 세포에 의한 당 단백질의 산생은, 외래 유전자에 상관없이, 목적으로 하는 당 단백질 산생능을 갖는 포유 동물 세포에 있어서, 그 당 단백질을 코드하는 내인성 유전자의 발현량 증대를 유도하여 실시해도 된다. 이 경우 내인성 유전자란, 사용하는 포유 동물 세포의 게놈상에 원래 존재하는 유전자를 말한다. 내인성 유전자의 발현량을 증대시키도록 유도시키는 방법에 대해서는 특별히 한정은 없고, 주지된 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 내인성 유전자의 발현 제어 부위에 사이토메갈로바이러스 (CMV) 유래의 프로모터 등을 상동 재조합에 의해 도입하는 방법 (WO94/12650), 특정한 내인성 유전자의 발현 제어 부위에 작용하여, 그 유전자의 발현량을 증대시키는 호르몬, 성장 인자, 비타민, 사이토카인, 인터류킨 등을 배양액 중에 첨가하는 방법이 있다. 예를 들어 스테로이드 호르몬, 갑상선 호르몬, 레티노인산, 비타민 B 등은, 이들 수용체를 통하여, 발현 제어 부위에 호르몬 응답 배열을 갖는 내인성 유전자를 활성화시켜, 그 발현량을 증대시킬 수 있다.

본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 당 단백질은 N-글리코사이드 결합 당사슬의 비환원 말단에 위치하는 잔기의 적어도 일부 또는 모두가 만노오스 잔기가 되므로, 만노오스 수용체를 통하여 세포 내로 도입될 뿐만 아니라, N-글리코사이드 결합 당사슬이 복합형 당사슬인 경우에 비해, 생체 내에 투여했을 때의 안정성, 혈액 동태가 변화된 것이 된다. 따라서, 본 발명은 당 단백질의 생체 내에 있어서의 안정성, 혈액 동태를 변화시킬 목적에서 사용할 수도 있다. 즉, 복합형 당사슬의 비환원 말단의 시알산은 생체 내에 있어서의 당 단백질의 안정성을 높이는 효과가 있는 것에 반해, 본 발명은, 예를 들어, 생체 내에 투여했을 때에 혈중 반감기가 짧은 당 단백질을 얻는 목적에서 사용할 수 있다. 부작용이 예상되는 의약이 생체 내에서 장기에 걸쳐 존재하는 것은 그 부작용의 발생을 조장할 우려가 있다. 그러한 경우, 본 발명을 사용함으로써, 비교적 반감기가 짧은 당 단백질로 이루어지는 의약을 제조할 수 있다.

이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 의도하지 않는다.

[pE-neo 벡터 및 pE-hygr 벡터의 구축]

pEF/myc/nuc 벡터 (인비트로젠사) 를, KpnI 와 NcoI 로 소화시키고, EF-1 α 프로모터 및 그 제 1 인트론을 포함하는 영역을 잘라내어, 이것을 T4 DNA 폴리머라아제로 평활 말단화 처리하였다. pCI-neo (인비트로젠사) 를, BglⅡ 및 EcoRI 로 소화시켜, CMV 의 인핸서/프로모터 및 인트론을 포함하는 영역을 절제한 후에, T4 DNA 폴리머라아제로 평활 말단화 처리하였다. 이것에, 상기의 EF-1 α 프로모터 및 그 제 1 인트론을 포함하는 영역을 삽입하여, pE-neo 벡터를 구축하였다 (도 1a 및 도 1b).

pE-neo 벡터를 SfiI 및 BstXI 로 소화시키고, 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 약 1 kbp 의 영역을 절제하였다 (도 2a). pcDNA3.1/Hygro(+) (인비트로젠사) 를 주형으로 하여 프라이머 Hyg-Sfi (5'-GAGGCCGCCTCGGCCTCTGA-3'；배열 번호 1) 및 프라이머 Hyg-BstX (5'-AACCATCGTGATGGGTGCTATTCCTTTGC-3'；배열 번호 2) 를 이용하여, PCR 반응에 의해 하이그로마이신 유전자를 증폭시켰다 (도 2b). 증폭된 하이그로마이신 유전자를, SfiI 및 BstXI 로 소화시켜, 상기의 pE-neo 벡터에 삽입하여, pE-hygr 벡터를 구축하였다 (도 2c).

[글루코세레브로시다아제 발현 세포의 구축]

인간 태반 cDNA 라이브러리 A (TAKARA 사) 를 주형으로 하여 프라이머 GBA-Mlu (5'-GCAATACGCGTCCGCCACCATGGAGTTTTCAAGTCCTTCCAGAGAGG -3'；배열 번호 3) 및 프라이머 GBA-Not (5'-GGACGCGGCCGCGAGCTCTCACTGGCGACGCCACAGGTAGG-3'；배열 번호 4) 를 이용하여, PCR 에 의해 글루코세레브로시다아제 유전자 (GBA 유전자) 를 증폭시켰다. 이 증폭시킨 유전자를 제한 효소 (MluI 및 NotI) 로 소화시켜, pCI-neo (Promega 사) 의 MluI 와 NotI 사이에 삽입하고, 이것을 pCI-neo (GBA) 라고 명명하였다. pCI-neo 에 삽입한 GBA 유전자의 염기 배열 중에 변이가 없는 것을, DNA 시퀀서 (ABI 사) 를 이용하여 확인한 후, pCI-neo (GBA) 를 제한 효소 (MluI 및 NotI) 로 소화시켜, GBA 유전자를 잘라내었다. 이어서, 잘라낸 GBA 유전자를, 상기에서 구축한 발현 벡터 pE-neo 의 MluI 와 NotI 사이에 삽입하고, 이것을 GBA 발현 벡터 [pE-neo (GBA)] 로 하였다. CHO-K1 세포를, 리포펙타민 2000 시약 (Invitrogen 사) 을 이용하여, pE-neo (GBA) 로 형질 전환한 후, G418 을 포함하는 CD Opti CHO 배지 (Invitrogen 사) 에서 선택 배양을 실시하여, 글루코세레브로시다아제 발현 세포 (GBA 발현 세포) 를 선택하였다.

[β-N-아세틸글루코사미니다아제 3 발현 플라스미드의 구축]

QuickPrep Total RNA Extraction Kit (Amersham Pharmacia 사) 를 이용하여, 밤나방 유래의 Sf9 세포 (Invitrogen 사) 로부터 토탈 RNA 를 추출 정제하여, SuperScript Choice System for cDNA Synthesis (GIBCO BRL 사) 를 이용하여, oligo dT 를 프라이머로 한 역전사 반응을 실시하였다. 역전사 반응물을 주형으로 하여, 프라이머 N-AGase5'-Sal (5'-CCGGTCGACCATGTTACGGCACGTAATATTGTTATTCG-3'；배열 번호 5) 과 프라이머 N-AGase5'-Mlu (5'-ACCAATCAGTTTATAGGTGAT-3'；배열 번호 6), 및 프라이머 N-AGase3'-Mlu (5'-GAAGTACACCCACAGAGGTC-3'；배열 번호 7) 와 프라이머 N-AGase3'-Not (5'-GCTTGCGGCCGCCTAAAAGTAATTCCCTGTTACGCAAAATCC-3'；배열 번호 8) 의 각 프라이머 세트를 이용하여 PCR 을 실시하고, β-N-아세틸글루코사미니다아제 3 유전자를 5' 측과 3' 측으로 2 분할하여 각각 증폭시켰다. 5' 측 DNA 단편을 제한 효소 (SalI 및 MluI), 3' 측 DNA 단편을 제한 효소 (MluI 및 NotI) 로 소화시켜, 5' 측 DNA 단편을 pCI-neo 의 SalI 와 MluI 사이에 3' 측 DNA 단편을 pCI-neo 의 MluI 와 NotI 사이에 삽입하여, 각각 pCI-neo (N-AGase5'), pCI-neo (N-AGase3') 라고 명명하였다. pCI-neo 에 삽입된 β-N-아세틸글루코사미니다아제 3 유전자의 각 단편에 염기 배열 중에 변이가 없는 것을, DNA 시퀀서 (ABI 사) 를 이용하여 확인한 후, pCI-neo (N-AGase5') 를 SalI 와 MluI, pCI-neo (N-AGase3') 를 MluI 와 NotI 로 각각 절단하여, 5' 측 DNA 단편과 3' 측 DNA 단편을 잘라내었다. 이어서, pBluescript SK (-) (토요 방적사) 의 SalI 와 NotI 사이에, β-N-아세틸글루코사미니다아제 3 유전자의 전체 길이가 구축되도록, 5' 측 DNA 단편과 3' 측 DNA 단편을 조합하였다. 이것을 pBSK (N-AGase) 라고 명명하였다. pBSK (N-AGase) 를 SalI 와 NotI 로 소화시켜, β-N-아세틸글루코사미니다아제 3 유전자를 잘라내고, 이것을, 상기에서 구축한 발현 벡터 pE-hygr 의 SalI 와 NotI 사이에 삽입하여, 이것을 β-N-아세틸글루코사미니다아제 3 발현 플라스미드 [pE-hygr (N-AGase)] 로 하였다.

[GBA 발현 세포에 대한 β-N-아세틸글루코사미니다아제 3 유전자의 도입]

GBA 발현 세포에, pE-hygr (N-AGase) 를 일렉트로포레이션에 의해 도입한 후, 그 세포를, 200 μM 하이그로마이신, 및 500 ㎍/㎖ G418 을 포함하는 CD Opti CHO 배지에서 선택 배양하여, β-N-아세틸글루코사미니다아제 3 유전자에 의해 형질 전환된 GBA 발현 세포를 얻었다.

[강낭콩 렉틴 (PHA-L4 및 PHA-E4) 에 의한 선택 배양]

강낭콩 렉틴에는 L 형과 E 형의 2 종류의 서브 유닛이 존재하고, L 형은 4 개 사슬 복합형 당사슬을, E 형은 바이섹팅 2 개 사슬 복합형 당사슬 구조를 인식한다. PHA-L4 는 L 형만으로 4 량체를 형성하고, PHA-E4 는 E 형만으로 4 량체를 형성하고 있는 이소렉틴이다. 고농도의 이들 렉틴으로 세포를 처리하면, 비환원 말단에 위치하는 것이 시알산 잔기인 복합형 당사슬 구조를 갖는 막 단백질을 개재하여, 렉틴이 세포에 결합되고, 이로써 세포는 사멸한다. 또, 렉틴에 의해 세포가 가교되어 세포가 응집된다. 한편, 막 단백질의 당사슬 구조가 비환원 말단에 만노오스 잔기를 갖는 것으로 변화된 경우, 렉틴은 세포에 결합할 수 없어, 세포는 증식 가능하다. GBA 발현 세포에 pE-hygr (N-AGase) 를 일렉트로포레이션에 의해 도입한 후에 선택 배양하여 얻은 상기 형질 전환 세포를, 12 ㎍/㎖ 의 PHA-L4 (J Oil Mills 사) 와 12 ㎍/㎖ 의 PHA-E4 (J Oil Mills 사) 를 첨가한 배지, CD Opti CHO 배지에서 배양함으로써, 당해 형질 전환 세포 중에서 복합형 당사슬을 발현하고 있는 세포를 사멸시킴과 함께 응집시켜, 비응집 세포를 회수하였다. 회수된 비응집 세포를 GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포로 하였다.

[웨스턴 블로팅에 의한 당사슬 구조의 해석]

GBA 발현 세포 및 GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포의 배양 상청을 각 약 10 ㎕ 씩 SDS-PAGE 전기 영동 (10 ％ 겔) 에 제공하고, 영동 종료 후에 니트로셀룰로오스막에 전사하였다. 1 차 항체에 토끼 항인간 GBA 항체, 2 차 항체에 표지화 항토끼 IgG 항체를 이용하여, 막 상에 전사된 GBA 를 검출하였다. GBA 발현 세포와 GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포 각각의 배양 상청에 포함되는 GBA 의 영동 패턴을 비교하면, 전자에 비해 후자에서는 분자량의 저하에 수반되는 전기 영동 거리의 증가가 확인되었다 (도 3, 레인 1 및 5). GBA 발현 세포의 배양 상청에 포함되는 GBA 의 당사슬 구조는 비환원 말단이 시알산인 복합형 당사슬인 것으로 생각되었으므로, GBA 발현 세포의 배양 상청에 시알리다아제 (New England Biolabs 사), β1,4-갈락토시다아제 (New England Biolabs 사), 및 β-N-아세틸글루코사미니다아제 (New England Biolabs 사) 를 순차 첨가하였다. 그 결과, 배양 상청에 이들 효소를 순차 첨가함에 따라, 분자량의 저하에 수반되는 전기 영동 거리의 증가가 확인되었다 (도 3, 레인 2∼4). 시알리다아제, β1,4-갈락토시다아제, 및 β-N-아세틸글루코사미니다아제는 당사슬의 비환원 말단으로부터 시알산, 갈락토오스 및 N-아세틸갈락토사민을 제거하는 활성을 가지므로, 이 결과는 GBA 발현 세포의 배양 상청에 포함되는 GBA 의 당사슬 구조가 복합형 당사슬인 것을 나타낸다. 또, β-N-아세틸글루코사미니다아제로 처리 후의 GBA 의 밴드 (도 3, 레인 4) 는 당사슬의 비환원 말단이 만노오스가 된 GBA 의 영동 패턴을 나타낸다. 이 β-N-아세틸글루코사미니다아제로 처리 후의 GBA 의 밴드 (도 3, 레인 4) 와 GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포의 배양 상청에 포함되는 GBA 의 밴드 (도 3, 레인 5) 를 비교하면, 양자는 거의 동일한 영동 패턴을 나타낸다. 이 결과는, GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포에서 발현된 GBA 의 당사슬이, 비환원 말단에 시알산을 갖는 복합형 당사슬이 아니라, 비환원 말단에 만노오스를 갖는 것을 시사한다. 즉, 이 결과는 포유 동물 세포에 도입된 곤충 유래인 비포유 동물의 β-N-아세틸글루코사미니다아제 3 이 골지체에서 그 활성을 나타내고, GBA 의 당사슬 수식의 과정에서 비환원 말단에 위치하는 N-아세틸글루코사민을 제거하여, 당사슬의 비환원 말단을 만노오스 잔기로 하는 효소로서 기능하는 것을 나타내는 것이다. 곤충 유래인 비포유 동물의 β-N-아세틸글루코사미니다아제 3 이 이와 같이 포유 동물 세포 내에서도 동일하게 기능하는 것을 나타내는 보고는 지금까지 없다.

[글루코세레브로시다아제의 정제-제 1 공정 (소수성 칼럼 크로마토그래피)]

GBA 발현 세포와 GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포를 각각 배양하여, 배양액 중으로부터, 이하의 순서로, 글루코세레브로시다아제를 정제하였다. 먼저 배양액을 원심하여 배양 상청을 회수하였다. 배양 상청을 멤브레인 필터로 여과한 후, 이것에 에틸렌글리콜, 1 M DTT 및 250 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8) 을, 최종농도가 각각 20 ％ 에틸렌글리콜, 5 mM DTT 및 50 mM 아세트산나트륨이 되도록 첨가하였다. 결합용 완충액 [50 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8), 20 ％ 에틸렌글리콜] 으로 평형화한 HiTrap Phenyl Sepharose FF 5 ㎖ 칼럼 (GE 헬스케어사) 에 배양 상청을 적용한 후, 10 칼럼 용량의 결합용 완충액으로 칼럼을 세정하였다. 이어서, 결합용 완충액과 용출용 완충액 [50 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8), 20 ％ 에틸렌글리콜, 50 ％ 에탄올] 의 혼합비가 100 : 0 에서 0 : 100 이 되도록, 6 칼럼 용량의 직선적인 그래디언트를 가하여 글루코세레브로시다아제를 용출하였다. 분획된 용출액의 활성을 하기 방법으로 측정하여, GBA 활성이 있는 획분을 회수하였다. 또한, 유속은 모두 1.5 ㎖/분으로 하였다.

[글루코세레브로시다아제의 정제-제 2 공정 (양이온 교환 칼럼 크로마토그래피)]

상기 제 1 공정에서 회수한 획분에, 동량의 순수를 첨가하여 희석시키고, 추가로 이것에 에틸렌글리콜, 1 M DTT 및 250 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8) 을, 최종농도가 각각 20 ％ 에틸렌글리콜, 5 mM DTT 및 50 mM 아세트산나트륨이 되도록 첨가하였다. 세정용 완충액 [30 mM 아세트산나트륨 (pH 5.6), 0.01 ％ Tween80] 으로 평형화한 HiTrap CM-Sepharose FF 1 ㎖ 칼럼 (GE 헬스케어사) 에, 상기 획분을 적용한 후, 10 칼럼 용량 (10 ㎖) 의 세정용 완충액으로 칼럼을 세정하였다. 이어서, 완충액 A [50 mM 시트르산, 0.01 ％ Tween80] 와 완충액 B [50 mM 시트르산나트륨, 0.01 ％ Tween80] 의 혼합비가 75 : 25 에서 4 : 96 이 되도록, 8 칼럼 용량의 직선적인 그래디언트를 가하고, 추가로 완충액 A 와 완충액 B 의 혼합비가 4 : 96 인 완충액을, 5 칼럼 용량을 흘려 글루코세레브로시다아제를 용출하였다. 용출액을 1 ㎖ 씩 분획하여 회수하고, 이것에 25 ㎕ 씩 1 M 만니톨을 첨가하여 혼합하였다. 각 획분의 GBA 활성을 하기 방법으로 측정하여, GBA 활성이 있는 획분을 회수하였다. 또한, 유속은 모두 1.5 ㎖/분으로 하였다.

[GBA 활성 측정]

GBA 활성 측정은 Pasmanik-Chor M. et al., Biochem J 317, 81-88 (1996) 에 기재된 방법을 참고로 하여 실시하였다. 인산 4-methylumbelliferyl (4-MUF, Sigma Chemical Co.제조) 을 희석용 완충액 (0.125 ％ Na-Taurocholate, 0.15 ％ Triton X-100, 0.1 ％ 소 혈청 알부민을 함유하는 100 mM 인산 칼륨 완충액 (pH 5.96)) 에 용해시킨 후, 단계 희석시켜, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25 및 3.125 mM 농도의 표준 용액을 제조하였다. 4-methylumbelliferyl-β-D-glucopyranoside (Sigma Chemical Co.제조) 를, 4 mM 의 농도가 되도록 희석용 완충액에 용해시켜, 이것을 기질 용액으로 하였다. 검체는, 필요에 따라, 측정 전에 희석용 완충액을 사용하여 희석시켰다. 플루오로 플레이트 F96 에, 4-MUF 표준 용액 또는 검체를 10 ㎕ 씩 첨가한 후, 기질 용액을 70 ㎕ 첨가하여 혼합하였다. 37 ℃ 에서 1 시간 반응시킨 후, 반응 정지액으로서, 50 mM 글리신-NaOH 완충액 (pH 10.6) 을 200 ㎕ 씩 각 웰에 첨가한 후, 플루오로 플레이트 리더를 사용하여, 여기 파장 355 ㎚, 검출 파장 460 ㎚ 의 조건에서 형광 강도를 측정하였다. 4-MUF 표준 용액의 형광 강도로부터 검량선을 그려, 각 검체의 형광 강도를 검량선에 내삽하여, 활성 (n㏖/h/㎖) 을 산출하였다. 측정은 duplicate 로 실시하고, 평균값을 측정값으로 하였다.

[매크로파지 세포주 NR8383 을 사용한 GBA 의 세포 내 도입량 측정]

매크로파지 세포주 NR8383 을 사용한 GBA 의 세포 내 도입량 측정은 Zhu Y. et al., J Pharmacol Exp Ther. 308, 705-11 (2004) 에 기재된 방법을 참고로 하여 실시하였다. NR8383 세포 (래트 폐포 매크로파지 유래 세포주, ATCC 번호：CRL-2192) 를, 15 ％ 소 태아 혈청 (FBS) 을 포함하는 Kaighn's modification of Ham's F12 (F12K) 배지 (Invitrogen 사) 중에서 배양하였다. NR8383 세포가 서브컨플루언트 상태가 된 시점에서, 배지를, 32 μM Conduritol B Epoxide (CBE) (Calbiochem 사) 를 포함하는 F12K 배지에 교환하여, 하룻밤 배양 (18 시간 이내) 하고, NR8383 세포의 내인성의 GBA 를 실활시켰다. 세포를 원심하여 회수하고, 15 ％ FBS 를 포함하는 F12K 배지에서 3 회 세정한 후, 20 ㎖ 의 측정용 배지 (25 mM HEPES, pH 6.8, 4 ㎎/㎖ 소 혈청 알부민을 함유하는 F12K 배지) 에 현탁시켜, CO₂ 인큐베이터에서 2.5 시간 배양하였다. 세포를 2 개로 나누어 원심하여 회수하여, 일방은 5 ㎖ 의 측정용 배지에 재현탁시키고, 다른 일방은 5 ㎖ 의 50 ㎎/㎖ 만노오스를 함유하는 측정용 배지에 재현탁시켰다. 이 때의 세포 밀도는 모두 1×10⁷ cells/㎖ 가 되도록 조제하였다. 배양 튜브에 각 세포 현탁액을 190 μL 씩 분주하고, 그곳에 GBA 의 최종 농도가 소정의 농도 (mU/㎖) 가 되도록 10 ㎕ 씩 GBA 샘플을 첨가하여 혼합하고, 37 ℃ 에서 2 시간, 진탕 배양을 실시하였다. 이 때, GBA 샘플 대신에 10 ㎕ 의 측정용 배지를 첨가한 것을 컨트롤로서 두었다. 배양 후, 세포를 원심에 의해 회수하고, 1 ㎎/㎖ 만난 (나카라이테스크) 을 함유하는 PBS 로 3 회 세정하였다. 또한 PBS 로 2 회 세정한 후, 150 ㎕ 의 세포 용해액 [50 mM 인산칼륨, pH 6.5, 0.25 ％ Triton X-100, 1×프로테아제 인히비터 칵테일 (로슈사)] 으로 세포를 용해시켰다. 얻어진 세포 용해액 중의 GBA 활성을 상기의 GBA 활성 측정법에 의해 측정하였다. 만노오스를 함유하지 않는 측정용 배지에서 배양한 세포의 GBA 활성 측정값으로부터, 만노오스를 함유하는 측정용 배지에서 배양한 세포의 GBA 활성 측정값을 뺀 값을, 매크로파지 세포 내로 도입된 GBA 의 양으로 한 그 결과, GBA 발현 세포의 배양 상청에 얻어진 GBA 는 NR8383 세포 내에 거의 도입되지 않지만, GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포의 배양 상청에 얻어진 GBA 는 NR8383 세포 내로 도입되는 것을 알 수 있었다.

또, 매크로파지 세포 내로의 GBA 의 도입량을, 컨트롤에 있어서의 GBA 의 활성 측정값을 100 ％ 로 하여, 컨트롤에 대한 비로서 활성을 나타내었다 (대조에 대한 ％). 그 결과, GBA 발현 세포의 배양 상청에 얻어진 GBA 는 매크로파지 세포 내에 거의 도입되지 않았지만 (도 4：그래프 2), GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포의 배양 상청에 얻어진 GBA 는 매크로파지 세포 내로 도입되었다 (도 4：그래프 1). 또, GBA 발현 세포의 배양 상청에 얻어진 GBA 를, 순차로 시알리다아제 (New England Biolabs 사), 1,4-갈락토시다아제 (New England Biolabs 사), 및 β-N-아세틸글루코사미니다아제 (New England Biolabs 사) 로 처리함으로써, 당사슬의 비환원 말단을 만노오스로 한 GBA 도, GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포의 배양 상청에 얻어진 GBA 와 동일하게, 매크로파지 세포 내로 도입되었다 (도 4：그래프 3). 또, 만노오스 존재하에서는, GBA 의 매크로파지로의 도입이 저해되었다 (도 4：그래프 4∼6).

이들 결과는, GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포를 사용하여 발현시킨 GBA 가 그 당사슬의 비환원 말단에 만노오스를 갖는 것이고, 매크로파지 세포막 상에 존재하는 만노오스 수용체를 통하여, 효율적으로 세포 내로 도입되는 것을 나타내는 것이다.

[SfFDL 및 BmFDL 발현 플라스미드의 구축]

CHO 세포용으로 코돈을 최적화한 밤나방의 SfFDL 유전자 및 누에나방 유래의 BmFDL 유전자를 각각 화학 합성하였다.

SfFDL 유전자의 염기 배열을 배열 번호 9 에, 그것이 코드하는 아미노산 배열을 배열 번호 10 에 각각 나타낸다. 배열 번호 9 의 염기 배열에 있어서, 염기 1∼6 은 MluI 부위, 염기 14∼1909 는 SfFDL 코드 배열, 염기 1910∼1917 은 NotI 부위이다. 여기에, 배열 번호 10 의 아미노산 배열은 배열 번호 9 의 염기 배열의 코드 영역에 대응하는 아미노산 배열이며, 천연의 SfFDL 유전자에 의해 코드되는 아미노산 배열과 동일하다.

또, BmFDL 유전자의 염기 배열을 배열 번호 11 에, 그것이 코드하는 아미노산 배열을 배열 번호 12 에 각각 나타낸다. 배열 번호 11 의 염기 배열에 있어서, 염기 1∼6 은 MluI 부위, 염기 14∼1909 는 BmFDL 코드 배열, 염기 1910∼1917 은 NotI 부위이다. 여기에, 배열 번호 12 의 아미노산 배열은 배열 번호 11 의 염기 배열의 코드 영역에 대응하는 아미노산 배열이며, 천연의 BmFDL 유전자에 의해 코드되는 아미노산 배열과 동일하다.

상기의 각 유전자를 MluI 와 NotI 로 소화시켜, 각각 MluI 와 NotI 로 소화된 pUC57 벡터에 삽입하였다. 이어서, SfFDL 유전자와 BmFDL 유전자를 pUC57 벡터로부터 MluI 와 NotI 로 잘라내어, 상기에서 구축한 발현 벡터 pE-hygr 의 MluI 와 NotI 사이에 각각 삽입하였다. SfFDL 유전자를 삽입한 pE-hygr 을, SfFDL 유전자 발현 플라스미드 (pE-hygr (Sf-FDL)), BmFDL 유전자를 삽입한 pE-hygr 을, BmFDL 유전자 발현 플라스미드 (pE-hygr (Bm-FDL)) 로 하였다.

[GBA 발현 세포에 대한 SfFDL 및 BmFDL 유전자의 도입]

GBA 발현 세포에, pE-hygr (Sf-FDL) 또는 pE-hygr (Bm-FDL) 을 각각 일렉트로포레이션에 의해 도입한 후, 그 세포를, 200 μM 하이그로마이신, 및 500 ㎍/㎖ G418 을 포함하는 CD Opti CHO 배지에서 선택 배양하여, SfFDL 유전자 및 BmFDL 유전자에 의해 형질 전환된 GBA 발현 세포를 얻었다.

[강낭콩 렉틴 (PHA-L4 및 PHA-E4) 에 의한 선택 배양]

상기의 선택 배양에 의해 얻어진 형질 전환 세포를, 12 ㎍/㎖ 의 PHA-L4 (J Oil Mills 사) 와 12 ㎍/㎖ 의 PHA-E4 (J Oil Mills 사) 를 첨가한 배지인 CD Opti CHO 배지에서 배양함으로써, 당해 형질 전환 세포 중에서 복합형 당사슬을 발현하고 있는 세포를 사멸시킴과 함께 응집시켜, 비응집 세포를 회수하였다. 회수된 비응집 세포를, SfFDL 유전자에 의해 형질 전환된 세포에 대해서는 GBA/Sf-FDL 발현 세포, BmFDL 유전자에 의해 형질 전환된 세포에 대해서는 GBA/Bm-FDL 발현 세포로 하였다.

[SDS-PAGE 에 의한 당사슬 구조의 해석]

GBA 발현 세포, GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포, GBA/Sf-FDL 발현 세포 및 GBA/Bm-FDL 발현 세포의 배양 상청을 각 약 10 ㎕ 씩 SDS-PAGE (10 ％ 겔) 에 제공하고, 영동 종료 후에 심플리 블루 세이프스테인 (Invitrogen) 에 의해 단백질 염색을 하였다. 또, 강낭콩 렉틴 처리 전의 GBA/AcGlcNAcase-3 유전자에 의한 형질 전환 세포, GBA/Sf-FDL 유전자에 의한 형질 전환 세포 및 GBA/Bm-FDL 유전자에 의한 형질 전환 세포의 배양 상청도 동시에 SDS-PAGE 과 동 조건에서 제공하였다.

GBA 의 영동 패턴을 비교하면, GBA/Sf-FDL 발현 세포와 GBA/Bm-FDL 발현 세포의 배양 상청에 포함되는 GBA 의 영동 패턴은 GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포의 것과 일치하였다 (도 5). 또, 강낭콩 렉틴 처리 전의 GBA/Sf-FDL 유전자에 의한 형질 전환 세포와 GBA/Bm-FDL 유전자에 의한 형질 전환 세포의 배양 상청에 포함되는 GBA 의 영동 패턴도 GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포의 것과 부분적으로 일치하였다 (데이터는 나타내지 않는다). 이들 결과는, GBA/Sf-FDL 발현 세포 및 GBA/Bm-FDL 발현 세포에서 발현된 GBA 가, GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포한 것과 동일하게, 당사슬의 비환원 말단에 만노오스를 갖는 것을 나타낸다. 또, 이들 결과는, 포유 동물 세포에 도입한 밤나방 유래의 SfFDL 및 누에나방 유래의 BmFDL 가, 밤나방 유래의 β-N-아세틸글루코사미니다아제 3 과 동일하게, 골지체에서 그 활성을 나타내고, GBA 의 당사슬 수식의 과정에서 비환원 말단에 위치하는 N-아세틸글루코사민을 제거하여, 당사슬의 비환원 말단을 만노오스 잔기로 하는 효소로서 기능하는 것을 나타내는 것이다. 즉 이 결과는, 포유 동물 세포 내에서 발현한 SfFDL 및 BmFDL 가 포유 동물 세포 내에서도 골지체의 소정의 위치에 국재화되어, 그 효소 활성을 발휘한다는 것을 나타내는 것이다.

[GBA/Sf-FDL 발현 세포 및 GBA/Bm-FDL 발현 세포의 배양 상청으로부터 얻어진 글루코세레브로시다아제의 세포 내 도입량 측정]

GBA/Sf-FDL 발현 세포 및 GBA/Bm-FDL 발현 세포의 배양 상청으로부터, 상기의 제 1 공정 및 제 2 공정으로 이루어지는 정제 방법에 의해, 각각 GBA 를 정제 하였다. 이들 정제된 GBA 에 대해, 상기의 방법으로, 매크로파지 세포주 NR8383 을 사용한 GBA 의 세포 내 도입량 측정을 실시하였다. 도 6 에 나타내는 바와 같이, GBA/Sf-FDL 발현 세포의 배양 상청 (그래프 1) 및 GBA/Bm-FDL 발현 세포의 배양 상청 (그래프 2) 으로부터 얻어진 GBA 는, GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포의 배양 상청 (그래프 3) 으로부터 얻어진 GBA 와 거의 동일한 레벨로, NR8383 세포 내로 도입되는 것을 알 수 있었다. 또, 이들 세포 내 도입 효과는 배지 중에 만난을 첨가함으로써 저해되었다 (그래프 4∼6). 이들 결과는, GBA/Sf-FDL 발현 세포 및 GBA/Bm-FDL 발현 세포를 사용하여 발현시킨 GBA 가, GBA/AcGlcNAcase-3 발현 세포를 사용하여 발현시킨 GBA 와 동일하게, 그 당사슬의 비환원 말단에 만노오스를 갖는 것이고, 매크로파지 세포막 상에 존재하는 만노오스 수용체를 통하여, 효율적으로 세포 내로 도입되는 것을 나타내는 것이다.

산업상 이용가능성

본 발명에 의하면, 포유 동물 세포를 사용하여, N-글리코사이드 결합 당사슬의 비환원 말단에 만노오스 잔기를 갖는 재조합체 당 단백질을 제공할 수 있기 때문에, 예를 들어, 리소솜병의 효소 보충 요법에 사용하는 효소를 효율적으로, 용이하게 제조할 수 있다.

배열표 프리 텍스트

배열 번호 1：프라이머 Hyg-Sfi

배열 번호 2：프라이머 Hyg-BstX

배열 번호 3：프라이머 GBA-Mlu

배열 번호 4：프라이머 GBA-Not

배열 번호 5：프라이머 N-AGase5'-Sal

배열 번호 6：프라이머 N-AGase5'-Mlu

배열 번호 7：프라이머 N-AGase3'-Mlu

배열 번호 8 : 프라이머 N-AGase3'-Not

배열 번호 9：SfFDL 코드 배열을 포함하는 인공 배열. 염기 1-6 : MluI 부위, 염기 14-1909 : SfFDL 코드 배열, 염기 1910-1917 : NotI 부위

배열 번호 10：Synthetic Construct

배열 번호 11：BmFDL 코드 배열을 포함하는 인공 배열. 염기 1-6 : MluI 부위, 염기 14-1909：BmFDL 코드 배열, 염기 1910-1917 : NotI 부위

배열 번호 12：Synthetic Construct

SEQUENCE LISTING <110> JCR Pharmaceuticals. Co. Ltd. <120> Method for Production of Glycoprotein Having Mannose Residue at Its Non-reducing Terminal <130> GP149-PCT <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hyg-Sfi <400> 1 gaggccgcct cggcctctga 20 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hyg-BstX <400> 2 aaccatcgtg atgggtgcta ttcctttgc 29 <210> 3 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GBA-Mlu <400> 3 gcaatacgcg tccgccacca tggagttttc aagtccttcc agagagg 47 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GBA-Not <400> 4 ggacgcggcc gcgagctctc actggcgacg ccacaggtag g 41 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N-AGase5'-Sal <400> 5 ccggtcgacc atgttacggc acgtaatatt gttattcg 38 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N-AGase5'-Mlu <400> 6 accaatcagt ttataggtga t 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N-AGase3'-Mlu <400> 7 gaagtacacc cacagaggtc 20 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N-AGase3'-Not <400> 8 gcttgcggcc gcctaaaagt aattccctgt tacgcaaaat cc 42 <210> 9 <211> 1917 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence containing SfFDL CDS, bases 1-6: MluI site, bases 14-1909: CDS for SfFDL, bases 1910-1917: NotI site <220> <221> CDS <222> (14)..(1909) <223> SfFDL <400> 9 acgcgtcgcc accatgaagt ggtggggcga gggactgggt cgcggcgcca gcgcccagct 60 gagccgcgtg gcccgaatgc ggcgcgctct tctcctgctc gccgctgccg catgcaccgc 120 ggcagctctg ctgtactggc gccagcagag cgacgaccgc gcccaccgcc ctctgcatgc 180 cctctacgag ggcgtggagc cccagtggag ctgggtgtgc cgcaacctgc gctgcgagcg 240 cctcctggca accgagacca ccaccctgca gagcctgccc acctgcaata tgctttgcga 300 cagcacccag ctgtggcccc agcccaccgg cgccgtgagc ctggccaccg ccgtgcagcc 360 cgtgcgcgca gagggattca agctgcagat cgtgaccagc cccagccgcg acgtgagcga 420 ccacctggcc gacgccttcg agctgatgaa ggaggacatg cgcaccctgg agcgcagcgc 480 cggcagcgag cgccgccccg ccgactacgg cctgccccgc aacgtgctgg tgcgcgtggc 540 catcaacggc agcgccgacc cccgcatgcg gctggatacc gacgagagct acaagctgac 600 cctgcgcccc agccgcaaga gcctggtggc cgacatcacc gcccacagct tctgcggcgc 660 ccgccacggc ctggagaccc tgagccagat cgtgtggatg gacccctacg ccggctgcct 720 gctgatcctg gaggccgcca ccgtggtgga cgccccccgc ttcccctacc gcggcctgct 780 gctggacacc gcccgcaact tcttccccac cggcgagatc ctgcgcacca tcgacgccat 840 ggccgccagc aagatgaaca ccttccactg gcacgtgagc gacagccaga gcttccccct 900 gcgactggat agcgcccccc agctggccca gcatggagcc tacggccccg gcgccgtgta 960 caccagcgac gacgtgaaga ccatcgtgcg ccacgccaag ctgcgcggca tccgcgtgct 1020 gctggaggtg gacgcccccg cccacgtggg ccgcgcctgg ggctggggcc ccagcgccgg 1080 cctgggccac ctggcccact gcgtggagct ggagccctgg agcgcctact gcggcgagcc 1140 cccctgcggc cagctgaacc cccgcaaccc ccacgtgtac gacctgctgc agcgcatcta 1200 cgccgagatc ctggccctga ccgaggtgga cgacgtgttc cacctgggcg gcgacgaggt 1260 gagcgagcgc tgctgggccc agcacttcaa cgacaccgac cccatggacc tgtggctgga 1320 gttcacccgc cgcgccctgc atgcactgga gcgcgccaac ggcggcaagc tgcccgagct 1380 ggtgctgctg tggagcagcc gcctgacccg cagcccctac ctggagcgcc tggacagccg 1440 ccacctgggc gtgcaggtgt ggggcagcag ccgctggccc gagagccgcg ccgtgctgga 1500 cgccggcttc cgcagcgtgc tgagccacgt ggacgcctgg tacctggact gcggcttcgg 1560 cagctggcgc gacagcagcg acggccactg cggcccctac cgcagctggc agcaggtgta 1620 cgagcaccgc ccctggaccg aggagggagg tggggcagct gcctggcgcg tggagggcgg 1680 cgccgcctgc cagtggaccg agcagctggc cgccggcggc ctggacgccc gcgtgtggcc 1740 ccgcgcagcg gctctggccg agcgcctgtg gagcgaccgc gccgagggcg ccctgcccga 1800 cgtgtacctg cgcctggaca cccagcgcgc ccgcctgctg gcccgcggcg tgcgcgccgc 1860 ccccctgtgg ccccgctggt gcagccacaa cccccacgcc tgcctgtagg cggccgc 1917 <210> 10 <211> 631 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Met Lys Trp Trp Gly Glu Gly Leu Gly Arg Gly Ala Ser Ala Gln Leu 1 5 10 15 Ser Arg Val Ala Arg Met Arg Arg Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala 20 25 30 Ala Cys Thr Ala Ala Ala Leu Leu Tyr Trp Arg Gln Gln Ser Asp Asp 35 40 45 Arg Ala His Arg Pro Leu His Ala Leu Tyr Glu Gly Val Glu Pro Gln 50 55 60 Trp Ser Trp Val Cys Arg Asn Leu Arg Cys Glu Arg Leu Leu Ala Thr 65 70 75 80 Glu Thr Thr Thr Leu Gln Ser Leu Pro Thr Cys Asn Met Leu Cys Asp 85 90 95 Ser Thr Gln Leu Trp Pro Gln Pro Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Thr 100 105 110 Ala Val Gln Pro Val Arg Ala Glu Gly Phe Lys Leu Gln Ile Val Thr 115 120 125 Ser Pro Ser Arg Asp Val Ser Asp His Leu Ala Asp Ala Phe Glu Leu 130 135 140 Met Lys Glu Asp Met Arg Thr Leu Glu Arg Ser Ala Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Arg Pro Ala Asp Tyr Gly Leu Pro Arg Asn Val Leu Val Arg Val Ala 165 170 175 Ile Asn Gly Ser Ala Asp Pro Arg Met Arg Leu Asp Thr Asp Glu Ser 180 185 190 Tyr Lys Leu Thr Leu Arg Pro Ser Arg Lys Ser Leu Val Ala Asp Ile 195 200 205 Thr Ala His Ser Phe Cys Gly Ala Arg His Gly Leu Glu Thr Leu Ser 210 215 220 Gln Ile Val Trp Met Asp Pro Tyr Ala Gly Cys Leu Leu Ile Leu Glu 225 230 235 240 Ala Ala Thr Val Val Asp Ala Pro Arg Phe Pro Tyr Arg Gly Leu Leu 245 250 255 Leu Asp Thr Ala Arg Asn Phe Phe Pro Thr Gly Glu Ile Leu Arg Thr 260 265 270 Ile Asp Ala Met Ala Ala Ser Lys Met Asn Thr Phe His Trp His Val 275 280 285 Ser Asp Ser Gln Ser Phe Pro Leu Arg Leu Asp Ser Ala Pro Gln Leu 290 295 300 Ala Gln His Gly Ala Tyr Gly Pro Gly Ala Val Tyr Thr Ser Asp Asp 305 310 315 320 Val Lys Thr Ile Val Arg His Ala Lys Leu Arg Gly Ile Arg Val Leu 325 330 335 Leu Glu Val Asp Ala Pro Ala His Val Gly Arg Ala Trp Gly Trp Gly 340 345 350 Pro Ser Ala Gly Leu Gly His Leu Ala His Cys Val Glu Leu Glu Pro 355 360 365 Trp Ser Ala Tyr Cys Gly Glu Pro Pro Cys Gly Gln Leu Asn Pro Arg 370 375 380 Asn Pro His Val Tyr Asp Leu Leu Gln Arg Ile Tyr Ala Glu Ile Leu 385 390 395 400 Ala Leu Thr Glu Val Asp Asp Val Phe His Leu Gly Gly Asp Glu Val 405 410 415 Ser Glu Arg Cys Trp Ala Gln His Phe Asn Asp Thr Asp Pro Met Asp 420 425 430 Leu Trp Leu Glu Phe Thr Arg Arg Ala Leu His Ala Leu Glu Arg Ala 435 440 445 Asn Gly Gly Lys Leu Pro Glu Leu Val Leu Leu Trp Ser Ser Arg Leu 450 455 460 Thr Arg Ser Pro Tyr Leu Glu Arg Leu Asp Ser Arg His Leu Gly Val 465 470 475 480 Gln Val Trp Gly Ser Ser Arg Trp Pro Glu Ser Arg Ala Val Leu Asp 485 490 495 Ala Gly Phe Arg Ser Val Leu Ser His Val Asp Ala Trp Tyr Leu Asp 500 505 510 Cys Gly Phe Gly Ser Trp Arg Asp Ser Ser Asp Gly His Cys Gly Pro 515 520 525 Tyr Arg Ser Trp Gln Gln Val Tyr Glu His Arg Pro Trp Thr Glu Glu 530 535 540 Gly Gly Gly Ala Ala Ala Trp Arg Val Glu Gly Gly Ala Ala Cys Gln 545 550 555 560 Trp Thr Glu Gln Leu Ala Ala Gly Gly Leu Asp Ala Arg Val Trp Pro 565 570 575 Arg Ala Ala Ala Leu Ala Glu Arg Leu Trp Ser Asp Arg Ala Glu Gly 580 585 590 Ala Leu Pro Asp Val Tyr Leu Arg Leu Asp Thr Gln Arg Ala Arg Leu 595 600 605 Leu Ala Arg Gly Val Arg Ala Ala Pro Leu Trp Pro Arg Trp Cys Ser 610 615 620 His Asn Pro His Ala Cys Leu 625 630 <210> 11 <211> 1917 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence containing BmFDL CDS, bases 1-6: MluI site, bases 14-1909 CDS for BmFDL, bases 1910-1917: NotI site <220> <221> CDS <222> (14)..(1909) <223> BmFDL <400> 11 acgcgtcgcc accatgatga gctggggcga cgccctgtgg ctgggcctga ccgcccgctt 60 cgcccgcgtg ggccgcctgc ggcgcgctgt cctgatgctg gcagctgcgg cctgcactgc 120 cgctgccgtt ctgtactgga agcagcagac cgacgacagc gccaaccgcc ccctgcatag 180 tatgtacagc ggcatcgagc cccagtggag ctggctgtgc cagcacgacc gctgcgagcg 240 ctaccaggcc agcgacacca ccaccctgca gagcctgcag acctgcaaca tgctgtgcgc 300 cagcacccag ctgtggcccc agcccaccgg ccccgtgagc ctggccagcg ccgccgtgcc 360 cgtgcgcagc gaccgcttca gcctgaaggt gatcgccagc cccagccgcg acgtgaccaa 420 gcacctgaac gaggccttca tcgtgatgca gaaccacatg cgcaccctgg agcacggcgt 480 ggtgggcgag aaccgccgca gcgacatcgg ccccccccgc gacgtgctgg tgaaggtgag 540 cgtgaacggc agcggcgacc cccgcatgcg actggatacc aacgagagct acaagctggc 600 cctgcgcccc agcggcaaca gcctggtggt ggacatcacc gcccacagct tctgcggcgc 660 ccgccacggc ctggagaccc tgctgcaggt gacctggctg gacccctacg ccggcagcct 720 gctgatcctg gaggccgcca ccgtggtgga cgccccccgc ttcccctacc gcggcctgct 780 gctggacacc gcccgcaact tcttccccgt gagcgagctg ctgcggacaa tcgacgccat 840 ggccgccaac aagctgaaca ccttccactg gcacgtgagc gacagccaga gcttcccctg 900 gaagctggac agcgcccccc agctggccca gcacggcgcc tacggccccg gcgccgtgta 960 caccagcgac gacgtgcgca ccatcgtgaa gtacgcccgc atccgcggca tccgcgtgct 1020 gatggagatc gacacccccg cccacgtggg ccgcgccttc ggctggggcc ccgaggccgg 1080 cctgggacat ctggcccact gcatcgaggc cgagccctgg agcagctact gcggcgagcc 1140 cccctgcggc cagctgaacc cccgcaaccc ccacatctac gacctgctgg agcacgtgta 1200 ccgcgagatc atccagctga ccggcgtgga cgacatcttc cacctgggcg gcgacgaggt 1260 gagcgagcag tgttgggcta agcacttcaa cgacaccgac cccatggacc tgtggatgga 1320 gttcacccgc caggccatgc acgtgctgga gcgcgccaac ggcggcaagg cccccgagct 1380 gaccctgctg tggagcagcc gcctgacccg cagcccctac ctggagcgcc tggaccccaa 1440 gcgcttcggc gtgcacgtgt ggggcgccag ccagtggccc gagagccgag ccgtcctgga 1500 cgccggcttc cgcagcgtga tcagccacgt ggacgcctgg tacctggact gcggcttcgg 1560 cagctggcgc gacagcagcg acggccactg cggcccctac cgcagctggc agcaggtgta 1620 cgagcaccgc ccctgggcca ccgagacccc cgagagtgcc gcatggcccg tggagggcgg 1680 cgccgcctgc cagtggaccg agcagctggg ccccggcggc ctggacgccc gcgtctggcc 1740 tcgcaccgcc gccctggccg agcgcctgtg ggccgaccgc gccgagggcg ccaccgccga 1800 cgtgtacctg cgcctggaca cccagcgcgc ccgcctggtg gcccgcggcg tgcgcgccgc 1860 ccccctgtgg ccccgctggt gcagccacaa cccccacgcc tgcctgtagg cggccgc 1917 <210> 12 <211> 631 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Met Met Ser Trp Gly Asp Ala Leu Trp Leu Gly Leu Thr Ala Arg Phe 1 5 10 15 Ala Arg Val Gly Arg Leu Arg Arg Ala Val Leu Met Leu Ala Ala Ala 20 25 30 Ala Cys Thr Ala Ala Ala Val Leu Tyr Trp Lys Gln Gln Thr Asp Asp 35 40 45 Ser Ala Asn Arg Pro Leu His Ser Met Tyr Ser Gly Ile Glu Pro Gln 50 55 60 Trp Ser Trp Leu Cys Gln His Asp Arg Cys Glu Arg Tyr Gln Ala Ser 65 70 75 80 Asp Thr Thr Thr Leu Gln Ser Leu Gln Thr Cys Asn Met Leu Cys Ala 85 90 95 Ser Thr Gln Leu Trp Pro Gln Pro Thr Gly Pro Val Ser Leu Ala Ser 100 105 110 Ala Ala Val Pro Val Arg Ser Asp Arg Phe Ser Leu Lys Val Ile Ala 115 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540 Thr Pro Glu Ser Ala Ala Trp Pro Val Glu Gly Gly Ala Ala Cys Gln 545 550 555 560 Trp Thr Glu Gln Leu Gly Pro Gly Gly Leu Asp Ala Arg Val Trp Pro 565 570 575 Arg Thr Ala Ala Leu Ala Glu Arg Leu Trp Ala Asp Arg Ala Glu Gly 580 585 590 Ala Thr Ala Asp Val Tyr Leu Arg Leu Asp Thr Gln Arg Ala Arg Leu 595 600 605 Val Ala Arg Gly Val Arg Ala Ala Pro Leu Trp Pro Arg Trp Cys Ser 610 615 620 His Asn Pro His Ala Cys Leu 625 630

Claims

곤충 유래의 외래의 β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자가 도입되고 발현되어 이루어지고, 또한 소정의 당 단백질을 산생하도록, 그 소정의 당 단백질을 코드하는 외래 유전자가 추가로 도입되어 발현되어 이루어지는, 형질 전환 포유 동물 세포.
제 1 항에 있어서,
그 곤충이 인시목 (麟翅目) 에 속하는 곤충인 형질 전환 포유 동물 세포.
제 2 항에 있어서,
인시목에 속하는 그 곤충이 밤나방 또는 누에나방인 형질 전환 포유 동물 세포.
제 3 항에 있어서,
그 β-N-아세틸글루코사미니다아제 유전자가 β-N-아세틸글루코사미니다아제 1 유전자, β-N-아세틸글루코사미니다아제 3 유전자, SfFDL 유전자 및 BmFDL 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 것인 형질 전환 포유 동물 세포.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
그 소정의 당 단백질을 코드하는 외래 유전자가 인간 유래의 유전자인 형질 전환 포유 동물 세포.
제 5 항에 있어서,
인간 유래의 그 유전자가 리소솜 효소를 코드하는 것인 형질 전환 포유 동물 세포.
제 6 항에 있어서,
그 리소솜 효소가 글루코세레브로시다아제, 산성 스핑고미엘리나아제, 리소솜 산성 리파아제, 산성 α-글루코시다아제, N-아세틸갈락토사민-4-술파타아제, 이두론산2-술파타아제, α-L-이두로니다아제, α-갈락토시다아제 A, 헥소사미니다아제, α-N-아세틸갈락토사미니다아제, α-만노시다아제, 및 시알리다아제로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 형질 전환 포유 동물 세포.
제 6 항에 있어서,
그 리소솜 효소가 글루코세레브로시다아제인 형질 전환 포유 동물 세포.
N-글리코사이드 결합 당사슬의 비환원 말단에 위치하는 잔기의 전부 또는 일부가 만노오스 잔기인 당 단백질의 제조 방법으로서,
(a) 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 포유 동물 세포를 배양액 중에서 배양하여, 당 단백질을 발현시키는 단계, 및
(b) 상기 단계 (a) 에서 발현시킨 당 단백질을 정제하는 단계를 포함하여 이루어지는 것인 제조 방법.
제 9 항에 있어서,
그 당 단백질을 코드하는 외래 유전자가 인간 유래의 유전자인 제조 방법.
제 10 항에 있어서,
인간 유래의 그 유전자가 리소솜 효소를 코드하는 것인 제조 방법.
제 11 항에 있어서,
그 리소솜 효소가 글루코세레브로시다아제, 산성 스핑고미엘리나아제, 리소솜 산성 리파아제, 산성 α-글루코시다아제, N-아세틸갈락토사민-4-술파타아제, 이두론산2-술파타아제, α-L-이두로니다아제, α-갈락토시다아제 A, 헥소사미니다아제, α-N-아세틸갈락토사미니다아제, α-만노시다아제, 및 시알리다아제로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 제조 방법.
제 11 항에 있어서,
그 리소솜 효소가 글루코세레브로시다아제인 제조 방법.
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