PT1000154E

PT1000154E - Identificação de linhas celulares humanas para a produção de proteínas humanas por activação endógena de genes

Info

Publication number: PT1000154E
Application number: PT98942592T
Authority: PT
Inventors: Reinhard Franze; Michael Brandt; Ulrich Pessara
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1997-07-23
Filing date: 1998-07-22
Publication date: 2007-03-30
Also published as: US7214514B2; US6846673B2; JP5896960B2; US20020164792A1; JP2013240335A; JP2014193187A; JP6047524B2; KR100622203B1; US20050090007A1; CO4790179A1; AR016774A1; KR20010022126A

Description

DESCRIÇÃO "IDENTIFICAÇÃO DE LINHAS CELULARES HUMANAS PARA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS HUMANAS POR ACTIVAÇÃO ENDÓGENA DE GENES" A invenção refere-se a um processo para a escolha de células humanas para a preparação de proteínas humanas por activação endógena de genes, para produzir proteínas humanas com rendimentos económicos e numa forma que seja adequada para a preparação de uma composição farmacêutica. A invenção refere-se ainda a um processo para a preparação de proteínas humanas numa linha celular identificada deste modo. A preparação de proteínas humanas por activação endógena de genes numa linha celular humana é conhecida. Assim, descrevem por exemplo os documentos WO93/09222, WO94/12650 e WO95/31560 a produção de eritropoietina humana e de outras proteínas humanas em linhas celulares humanas por activação endógena de genes.

Nos documentos referidos não se encontra contudo qualquer indicação de que na escolha das linhas celulares utilizadas para a preparação de proteínas humanas se tem de atender a determinados critérios. Não pode por isso assegurar-se que a proteína humana desejada, na linha celular escolhida para a sua produção, se possa obter com o rendimento e na forma desejados, bem como livre de contaminações. Por isso, nos documentos acima referidos, obtêm-se em geral apenas baixos rendimentos em proteínas humanas. 1 0 objectivo da presente invenção era ultrapassar as desvantagens do estado da técnica e, em especial, disponibilizar critérios para a escolha de linhas celulares humanas de partida que sejam adequadas para uma activação endógena de um gene alvo pré-determinado.

Atinge-se este objectivo através de um processo para a escolha de linhas celulares humanas para a preparação de proteínas humanas por activação de um gene alvo endogenamente existente de forma endógena na linha celular, caracterizado por (a) se testar uma linha celular humana em relação a existência das seguintes características: (i) um gene alvo com a sequência de ácidos nucleicos desej ada, (ii) pelo menos 5 duplicações de população no espaço de 14 dias numa cultura de suspensão, e (iii) pelo menos 5 duplicações de população no espaço de 14 dias num meio de cultura isento de soro, e (b) se utilizar uma linha celular que preencha as características (i) , (ii) e (iii) como linha celular de partida para a activação endógena do gene alvo.

Quando se tem como objectivo activar um gene alvo humano numa linha celular humana por "targeting" de genes e obter uma célula que tenha a capacidade de produzir a proteína alvo com rendimento satisfatório e na forma desejada, testam-se de acordo com a invenção várias linhas celulares em relação à existência de algumas características que esta linha celular deve preencher para ser um candidato adequado para a produção posterior em grande escala técnica da proteína alvo. De um modo preferido, testam-se neste caso como linhas celulares linhas celulares imortalizadas, em especial linhas celulares tumorais, uma vez 2 que estas apresentam vantagens significativas no que respeita à capacidade de cultura comparadas com células não imortalizadas.

De acordo com a caracteristica (i) investiga-se a linha celular humana para ver se o gene alvo, isto é o gene a activar por activação endógena de genes, possui de facto a sequência de ácidos nucleicos desejada, em geral a sequência de ácidos nucleicos do gene alvo natural. As linhas celulares tumorais e outras linhas celulares em cultura permanente apresentam, na verdade, muitas vezes uma série de mutações no seu genoma. É por isso um aspecto importante na escolha de uma linha celular adequada saber se as células possuem um gene correcto para o produto desejado. A determinação da sequência pode efectuar-se por cultivo das células do modo habitual e sequenciação do gene alvo. Conforme o caso, pode efectuar-se antes da sequenciação uma amplificação do gene alvo por PCR ou por outros métodos de amplificação.

Uma outra caracteristica importante para a escolha de uma linha celular é a capacidade de cultura em suspensão. As células em suspensão são mais fáceis de fermentar e a fermentação pode adaptar-se mais facilmente a maiores dimensões, por exemplo num fermentador de grandes dimensões com um volume de, por exemplo, 10 L a 50.000 L. Por isso, as células escolhidas devem ser células em suspensão ou serem facilmente adaptáveis a uma cultura em suspensão. Para tal, cultivam-se as células durante 14 dias sob agitação constante. No caso de as células apresentarem neste espaço de tempo pelo menos cinco duplicações de população são consideradas adequadas para uma cultura em suspensão. A determinação da quantidade de duplicações de população pode efectuar-se por determinação periódica do número 3 de células, por exemplo por contagem de células, ou por medição da densidade óptica da suspensão de células.

Uma outra característica importante para a escolha de células humanas é a capacidade de cultura em meio isento de soro. Uma vez que a purificação de proteínas a partir de culturas celulares isentas de soro é claramente mais fácil e numa cultura isenta de soro não existe o perigo da contaminação com patogenes animais, por exemplo vírus, as células escolhidas devem poder ser cultivadas numa cultura isenta de soro. Para tal cultivam-se as células durante 14 dias numa densidade de 1 a 10 x 105 células por mL em recipientes de cultura com meio isento de soro (por exemplo RPMI 1640 com ITS da Boehringer Mannheim) . Quando as células durante esta cultura apresentam pelo menos 5 duplicações de população, que se pode determinar por contagem de células, consideram-se adequadas para cultura em meio isento de soro.

Uma outra característica importante e preferida de acordo com a invenção é o tempo de geração (iv). Assim, as células escolhidas devem apresentar, em meio como por exemplo DMEM 10% de soro de bovino fetal ou RPMI 1640 com 10% de soro de bovino fetal, uma elevada proliferação, isto é, devem apresentar no intervalo de uma semana em cultura 16 a 256 duplicações de população, de um modo preferido 64 a 128 duplicações de população. Para tal semeiam-se as células numa concentração de 0,1 a 10 x 105 células por mL, de um modo preferido 0,5 a 2 x 105 células por mL, em caixas de cultura e determina-se o número de células de dois em dois ou de três em três dias por meio de uma câmara de células após ou sem tripsinização. As células que apresentam um tempo de geração suficientemente curto são 4 especialmente adequadas para a produção em grande escala técnica de proteínas humanas por activação endógena de genes.

Uma outra característica preferida é a inexistência de uma expressão endógena detectável, isto é transcrição e tradução, do gene alvo (v). De um modo preferido, escolhem-se para a activação endógena de genes as linhas celulares que não apresentam essencialmente qualquer expressão endógena do gene alvo. Para tal podem semear-se as células durante 24 horas numa densidade celular de 0,01 a 2 x 106 células/mL, de um modo preferido 0,5 a 1 x 106 células/mL de meio de cultura. Após um período de tempo pré-determinado, por exemplo 24 horas, remove-se o sobrenadante celular, rejeitam-se as células e determina-se o teor da proteína alvo no sobrenadante celular por meio de processos de teste conhecidos, por exemplo por exemplo ELISA. No caso de EPO o limite de detecção situa-se por exemplo a 10 pg/EPO/mL. As células que, com uma sementeira de 106 células/mL, sintetizam menos de 10 pg de proteína são consideradas como não produtoras e são particularmente adequadas.

Ainda uma outra característica importante e preferida é a polissomia do gene alvo na célula a escolher (vi). A existência de mais do que duas cópias cromossomais do gene alvo na célula aumenta significativamente os rendimentos na recombinação homóloga. Para a produção de EPO, cujo gene se encontra no cromossoma 7, revelaram-se particularmente adequadas, por exemplo, as células Namalwa (Nadkarni et al., Câncer 23 (1969), 64-79) ou HeLa S3 (Puck et al., J. Exp. Med. 103 (1956), 273— 284), que possuem o cromossoma 7 três vezes. Outros exemplos de linhas celulares que contêm o cromossoma 7 em elevado número de cópias são a linha celular de adenocarcinoma do cólon SW-480 (ATCC CCL-228; Leibovitz et al., Câncer Res. 36 (1976), 4562- 5 4567), a linha celular de melanoma maligno SK-MEL-3 (ATCC HTB 69; Fogh e Tremp, em: Human Tumor Cells in vitro, pp 115-159, J., Fogh (ed.), Plenum Press, New York 1975), a célula de adenocarcinoma do cólon Colo-320 (ATCC CCL-220; Quinn et al., Câncer Res. 39 (1979), 4914-4924), a linha celular de melanoma MEL-HO (DSM ACC 62; Holzmann et al., Int. J. Câncer 41 (1988), 542-547) e a linha celular de carcinoma do rim A-498 (DSM ACC 55; Giard et al., J. Natl. Câncer Inst. 51 (1973), 1417-1423). A verificação do número de cromossomas no genoma de uma linha celular pode efectuar-se utilizando sondas de ADN, que são especificas para o respectivo cromossoma e/ou para o locus do gene alvo.

Ainda uma outra caracteristica preferida de uma linha

celular de partida utilizada para uma activação endógena de genes é uma correcta glicosilação da proteina alvo desejada (vii). Utiliza-se de um modo preferido uma linha celular humana que sintetiza a proteina alvo com um padrão de glicosilação comparável ao da proteina alvo de origem natural, em especial no que respeita ao número de resíduos de ácido sialínico. 0 teste sobre a existência de uma glicosilação correcta efectua-se de um modo preferido transfeccionando de forma transiente a célula a testar com um vector extracromossomal, que contém o gene alvo desejado, sob controlo de um promotor activo na célula. Após expressão transiente do gene alvo analisa-se o sobrenadante celular e/ou o extracto celular por focagem isoeléctrica. No exemplo da EPO é muito clara a existência de uma glicosilação correcta. Assim, a EPO não glicosilada, por exemplo EPO recombinante de células de E. coli, possui em experiências in vitro uma actividade comparável à da EPO glicosilada. Em experiências in vivo a EPO não glicosilada é contudo muito menos 6 eficaz. Para determinar se uma linha celular de partida está em condições de produzir EPO com uma glicosilação correcta pode efectuar-se uma comparação com EPO urinária, mas também com EPO recombinante de células CHO, que é conhecido por apresentar uma forma de glicosilação activa no ser humano e cuja glicosilação é consideravelmente idêntica à da EPO urinária. A comparação da glicosilação efectua-se de um modo preferido por focagem isoeléctrica.

Ainda uma outra caracteristica preferida para a escolha de uma linha celular humana é a ausência, na linha celular investigada, de contaminações infecciosas (vii), por exemplo de partículas virais infecciosas ou de micoplasmas. A investigação sobre a presença de contaminações virais pode efectuar-se por meio de cultura celular, análises in vivo e/ou detecção de proteínas virais específicas. A invenção refere-se além disso a um processo para a preparação de proteínas humanas por activação endógena de genes numa linha celular humana, caracterizado por se utilizar uma linha celular que preenche as características acima referidas (i) , (ii) e (iii) , bem como ainda de um modo preferido pelo menos uma das características (iv), (v), (vi) e (vii) como acima referido. 0 processo de acordo com a invenção utiliza-se em especial para a preparação de factores humanos, por exemplo EPO, trombopoietina (TPO), factores estimulantes de colónias como G-CSF ou GM-CSF, proteínas que influenciam a coagulação do sangue como tPA, interferões como IFN-a, INF-β ou INF-γ, interleuquinas como IL-1 a IL-18, quemoquinas como MIP, factores neutróficos como NGF ou BDNF, proteínas que influenciam o crescimento dos 7 ossos como IFG-BPs, proteínas de Hedgehog (Igel), factores de crescimento tumoral como TFG-β, hormonas de crescimento como HGH, ACTH, encefalinas, endorfinas, receptores como, por exemplo, receptores de interleuquina ou de insulina na forma solúvel e/ou resistente à membrana e outras proteínas de ligação a proteínas. Emprega-se de um modo particularmente preferido o processo para a preparação de EPO. A própria activação endógena de genes pode efectuar-se de acordo com métodos conhecidos e compreende de um modo preferido os passos: (a) Disponibilização de linhas celulares humanas de partida, que contêm pelo menos uma cópia de um gene alvo endógeno com a sequência de ácidos nucleicos desejada, e que foram identificadas por verificação dos critérios de escolha de acordo com a invenção como adequadas para a expressão do gene alvo,

(b) transfecção das células com uma construção de ADN compreendendo: (i) duas sequências de ADN flanqueantes, homólogas a regiões do locus do alvo gene, para permitir uma recombinação homóloga, (ii) um gene marcador de selecção positivo, (iii) conforme o caso, um gene marcador de selecção negativo, (iv) conforme o caso, um gene de amplificação e (v) uma sequência de controlo de expressão heteróloga, activa na célula humana, (c) cultura das células transfeccionadas sob condições em que ocorra uma selecção em relação à presença do gene marcador 8 de selecção positivo e, conforme o caso, em relação à ausência do gene marcador de selecção negativo, (d) análise das células seleccionáveis de acordo com o passo anterior, (e) identificação das células que produzem a proteína alvo desejada e (f) conforme o caso, amplificação do gene alvo nas células seleccionadas. A construção de ADN utilizada para a preparação da célula que produz a proteína humana desejada contém duas sequências de ADN flanqueantes homólogas a regiões do locus do gene alvo. A escolha de sequências flanqueantes adequadas efectua-se por exemplo de acordo com os métodos descritos nos documentos WO90/11354 e WO91/09955. De um modo preferido, cada uma das sequências flanqueantes tem um comprimento de pelo menos 150 pb.

De um modo particularmente preferido escolhem-se as sequências de ADN homólogas a partir da região 5' do gene alvo, por exemplo sequências 5' não traduzidas, exões codificantes de sequências de sinal e intrões localizados nesta região, por exemplo exão 1 e intrão 1. O gene marcador de selecção positivo pode ser qualquer gene marcador de selecção adequado para células eucarióticas, que conduza por expressão a um fenótipo seleccionável, por exemplo resistência a antibióticos, auxotrofia, etc. Um gene marcador de selecção positivo particularmente preferido é o gene de neomicina fosfatotransferase.

Conforme o caso, pode também estar presente um gene marcador de selecção negativo como, por exemplo, o gene de HSV- 9 timidinoquinase, através de cuja expressão as células são destruídas na presença de um meio de selecção. 0 gene marcador de selecção negativo está colocado no exterior das duas regiões sequenciais homólogas flanqueantes.

Quando se pretende uma amplificação do gene alvo endógeno activado na célula humana, a construção de ADN contém um gene de amplificação. Exemplos de genes de amplificação adequados são o gene de di-hidrofola reductase, o gene de adenosina desaminase, o gene de ornitina descarboxilase, etc. Um gene de amplificação particularmente preferido é o gene de di-hidrofolato reductase, em especial um gene codificante para um mutante de di-hidrofolato reductase-arginina, que possui uma maior sensibilidade para o agente selectivo (metotrexato) do que o gene do tipo selvagem (Simonsen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 (1983), 2495). A construção de ADN utilizada para activação endógena de genes contém ainda uma sequência de controlo de expressão heteróloga, que é activa numa célula humana. A sequência de controlo de expressão compreende um promotor e, de um modo preferido, outras sequências que melhoram a expressão, por exemplo um activador. O promotor pode ser um promotor regulável ou constitutivo. De um modo preferido o promotor é um promotor virai forte, por exemplo um promotor SV40 ou CMV. Particularmente preferido é o promotor/activador CMV. A invenção refere-se ainda à utilização das linhas celulares humanas identificadas pelo processo acima descrito, após activação de um gene alvo endogenamente existente (de forma endógena) na célula, para a obtenção do polipéptido codificado pelo gene alvo activado, de um modo preferido para a obtenção do 10 polipéptido num processo em grande escala técnica, por exemplo utilizando um fermentador de grandes dimensões.

Um outro objectivo da invenção é ainda uma célula humana que contém uma cópia de um gene endógeno em ligação operativa com uma sequência de controlo de expressão heteróloga activa na célula humana e que tem capacidade, sem amplificação de gene prévia, de produzir pelo menos 200 ng do polipéptido codificado pelo gene endógeno / 106 células / 24 h. De um modo preferido, a célula humana de acordo com a invenção tem capacidade de produzir 200 a 3000 ng de polipéptido / 106 células / 24 h e, de um modo muito preferido, produzir 1000 a 3000 ng de polipéptido / 106 células / 24 h.

Finalmente, um outro objectivo da presente invenção é ainda uma célula humana que se pode obter por amplificação de gene a partir da célula acima referida e que contém várias cópias de um gene endógeno respectivamente em ligação operativa com uma sequência de controlo de expressão heteróloga activa na célula humana e que tem capacidade de produzir de pelo menos 1000 ng do polipéptido codificado pelo gene endógeno / 106 células / 24 h. É particularmente preferida a linha celular humana que se pode obter por amplificação de gene e que tem capacidade de produzir 1000 a 25000 ng de polipéptido / 106 células / 24 h e, de um modo muito preferido, de produzir 5000 a 25000 ng de polipéptido / 106 células / 24 h.

Um exemplo de uma célula de acordo com a invenção é o clone produtor de EPO "Aladin", que foi depositado em 15.07.1997, de acordo com as prescrições da conferência de Budapeste, na Deutschers Sammlung von Mikroorganismen und Zellreulter (DSMZ), 11

Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, com a designação DSM ACC 2320. A invenção é ainda ilustrada pelos exemplos e figuras e Protocolos de Sequência seguintes.

Mostram: Figura 1: uma representação esquemática da amplificação de regiões de homologia do gene de EPO a partir da região das sequências 5' não traduzidas, exão 1 e intrão 1; Figura 2: uma representação esquemática de um plasmideo, que contém regiões de homologia EPO da região das sequências 5' não traduzidas, exão 1 e intrão 1; Figura 3: uma representação esquemática de uma sequência de activação de gene que contém o promotor de Rous-Sarcomavirus (RSV), o gene de neomicina fosfatotransferase (NEO), a região inicial de poliadenilação de SV40 (SVIpA), o promotor inicial SV40 (SVI), o gene de di-hidrofolato reductase (DHFR) e o promotor precoce imediato e activador do virus citomegalo (MCMV); Figura 4a: a preparação do vector de alvejamento do gene de EPO pl76; Figura 4b: a preparação dos vectores de alvejamento do gene de EPO pl79 e pl87; Figura 4c: a preparação do vector de alvejamento do gene de EPO pl89; Figura 4d: a preparação do vector de alvejamento do gene de EPO pl90; 12

Figura 4e: a preparação do vector de alvejamento do gene de EPO pl92; SEQ ID N° 1 e N° 2 Sequências de nucleótidos dos iniciadores utilizados para a preparação do produto 1 de PCR (Fig. 1); SEQ ID N° 3 e N° 4 Sequências dos iniciadores utilizados para a preparação do produto 2 de PCR (Fig. 1).

Exemplos

Exemplo 1 Métodos de selecção 1.1 Determinação do tempo de geração

As linhas celulares testadas foram semeadas numa concentração de 0,1 - 5 x 105 por mL, de um modo preferido de 0,5 - 2 x 105 células por mL em caixas de cultura com DMEM e 10% de FKS ou RMPI 1640 e 10% de FKS e determinou-se o número de células por cultura num meio aconselhado por exemplo por ATCC para as células em causa e em condições adequadas, de dois em dois ou de três em três dias, como uma câmara de contagem, por exemplo Neubauer, sem ou com tripsinização. As células que, no intervalo de uma semana de cultura, apresentaram 16 a 256 duplicações de população, de um modo preferido 64 a 128 duplicações de população, foram consideradas positivas (+, ++ ou +++) . 13 1.2 Capacidade de cultura em suspensão

Para a determinação da capacidade de cultura em suspensão cultivaram-se as células durante 14 dias, sob agitação constante, no meio (ver 1.1 com e sem adição de soro, por exemplo soro de vitela fetal) num Bellco-Spinner com 0 respectivo acessório, a 37 °C e 7% de C02. As células que apresentaram durante esta fase pelo menos 5 duplicações de população foram consideradas adequadas para uma cultura em suspensão (+). 1.3 Capacidade de cultura em meio isento de soro

Para determinar a capacidade de cultura de células em meio isento de soro cultivaram-se as células durante 14 dias numa densidade de 1 - 10 x 105 células / mL, em recipientes de cultura no meio básico aconselhado por exemplo por ATCC para as células em questão (isto é, sem adição de soro) com ITS (Boehringer Mannheim, N° de Cat. 1074547), em condições de acordo com 1.1. As células que apresentaram durante este tempo pelo menos 5 duplicações de população (determinado por contagem de células), foram consideradas adequadas para a cultura isenta de soro (+). 1.4 Determinação da expressão endógena do gene alvo

Para determinar se a proteina alvo na linha celular escolhida é produzida de forma endógena, semearam-se as células durante 24 horas numa densidade de células de 0,01 a 2 x 106 células / mL, de um modo preferido 0,5 a 1 x 106 células / mL de meio de cultura. 24 horas mais tarde removeu-se o sobrenadante 14 celular, rejeitaram-se as células e determinou-se o teor da proteína alvo no sobrenadante celular de acordo com métodos conhecidos, por exemplo através de um ensaio imunológico específico para a proteína em causa.

No caso de EPO determinou-se o teor por meio de ELISA. Para tal cobriram-se placas de microtitulação revestidas com estreptavidina com anticorpos anti-EPO biotinilados (Boehringer Mannheim) e, para bloquear as ligações não específicas, incubaram-se com uma solução contendo proteína (1% p/v) . Adicionaram-se então 0,1 mL de sobrenadante de cultura e incubou-se durante a noite. Após lavagem adicionaram-se anticorpos anti-EPO monoclonais conjugados com peroxidase (Boehringer Mannheim) durante duas horas. Efectuou-se a reacção de peroxidase utilizando ABTS® como substrato num fotómetro Perkin Elmer a 405 nm. O limite de detecção de EPO neste teste situava-se a 10 pg de EPO/mL de células. As células que, numa sementeira de 106 células/mL produziram menos do que 10 pg de EPO/mL foram consideradas não produtoras e adequadas (+). 1.5 Determinação do número de cópias do gene alvo

Para verificar o número de cópias do gene alvo na linha celular, isolou-se ADN genómico humano a partir de cerca de 108 células e quantificou-se (Sambrook et al.r Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Após cisão do ADN com enzimas de restrição, por exemplo Agel e Asei ou BamHI, HindIII e Sall, separaram-se os fragmentos de ADN por electroforese em gel de agarose segundo o seu tamanho e 15 finalmente transferiram-se e imobilizaram-se sobre uma membrana de nylon. 0 ADN imobilizado hibridizou-se com uma sonda de ADN marcada com digoxigenina que era especifica para o locus do gene alvo ou para o cromossoma sobre o qual se encontra o gene alvo, e lavou-se em condições estritas. Os sinais de hibridização específicos detectaram-se por meio de um processo de quimiluminescência empregando películas sensíveis à radiação. 1.6 Determinação da sequência de ácidos nucleicos do gene alvo A partir de cerca de 107 células isolou-se o ADN genómico utilizando um kit de isolamento de ADN (por exemplo QIAGEN Blood & Cell Culture ADN Kit).

Utilizou-se um par de iniciadores PCR para a amplificação do gene alvo. As sequências dos iniciadores eram neste caso complementares a sequências que flanqueiam a região codificante do gene alvo. Pôde assim amplificar-se a região codificante total do gene alvo. 0 produto de PCR submeteu-se directamente à análise sequencial ou clonou-se num vector e sequenciou-se em seguida. Para tal utilizaram-se iniciadores de sequenciação cujas sequências são complementares a sequências das regiões do intrão do gene alvo, de modo a poderem manter-se completamente as sequências das regiões do exão do gene alvo. A sequenciação efectuou-se num aparelho automático de sequenciação PE/ABI utilizando por exemplo o kit "Prism ™ Ready Reaction Dye 16

Terminator Cycle Sequenzing" (PE/ABI, Forster City, USA), de acordo com os dados do fabricante. 1.7 Determinação do padrão de glicosilagão

Para a determinação do padrão de glicosilagão de EPO transfeccionaram-se as linhas celulares a testar com o plasmideo pEPO 227, que contém um fragmento HindIII/EcoRI de 4 kb da sequência genética de EPO humana, sob controlo do promotor SV40 (Jacobs et al., Nature 313 (1985), 806; Lee-Huang et ai., Gene 128 (1993) , 272) . Transfeccionaram-se para tal as células na presença de lipofectamina utilizando um kit reagente obtenível comercialmente, de acordo com os dados do fabricante. Determinou-se o teor de EPO por meio de ELISA no sobrenadante celular obtido 2 a 5 dias mais tarde.

Concentrou-se o sobrenadante celular e comparou-se com produtos de EPO conhecidos por meio de focagem isoeléctrica (Righetti P.G., em: Work T.S., Burdon R.H. (ed.), Isoelectric focusing: Theory, methodology and applications, Elsevier Biomedical Press, Amsterdam (1983)). As células humanas que apresentavam um padrão de glicosilagão comparável ao de produtos de EPO conhecidos, por exemplo EPO urinária, foram consideradas adequadas (+). 17 1.8 Determinação de contaminações virais 1.8.1 Análises por meio de cultura celular

Para a determinação de possíveis contaminações virais infecciosas da linha celular humana a testar incubou-se um lisado das células com uma linha celular detectora para poder detectar efeitos citopáticos. Além disso efectuaram-se análises de hemoadsorpção.

Para a preparação do lisado lisou-se uma suspensão de 106 células em 1 mL de tampão através de um processo rápido de congelação-descongelação. 0 resíduo celular separou-se por centrifugação e adicionou-se o sobrenadante às linhas celulares detectoras. Como linhas celulares detectoras utilizaram-se células HepG2 (ATCC HB-8065; Nature 282 (1979), 615-616, MRC-5 (ATCC-1587) e Vero (ATCC CCL-171; Jacobs, Nature 227 (1970), 168-170) . Como controlo positivo empregaram-se vírus do tipo Polio SV e Influenza. Como controlos negativos utilizaram-se linhas celulares detectoras que foram cultivadas sem lisado. Para a determinação de efeitos citopáticos investigaram-se regularmente as linhas celulares detectoras num período de tempo de pelo menos 14 dias.

Para a análise de hemoadsorpção misturaram-se células Vero, que tinham sido incubadas com os lisados celulares ou com os controlos, após 7 dias com eritrócitos de galinha, porco ou ser humano. Uma aderência dos eritrócitos à monocamada das células cultivadas indica uma contaminação virai das culturas. 18 1.8.2

Análise in vivo

Prepararam-se lisados das linhas celulares a testar, como indicado em 1.8.1, e injectaram-se em murganhos recém nascidos por via intraperitoneal ou intracerebral, numa quantidade de 0,1 mL. Durante um período de 14 dias observaram-se os murganhos em relação à morbidez e à mortalidade. 1.8.3 Detecção específica de proteínas virais A presença de proteínas virais específicas, por exemplo proteínas de vírus Epstein-Barr (proteína nuclear ou antigénio do capsídeo), testou-se adicionando, às células imobilizadas da linha celular humana a testar soro humano de bandas positivas de EBV. A detecção dos antigenes de vírus efectuou-se então por adição do complemento e do respectivo conjugado de fluoresceína do complemento anti-humano C3 (para a detecção do antigene nuclear) ou através de globulinafluoresceína anti-humana (para a detecção do antigénio do capsídeo).

Exemplo 2 Resultados de selecção

Testaram-se as linhas celulares humanas HepG2, HT1080, Namalwa, Hela e HelaS3, de acordo com os métodos indicados no ponto 1. Os resultados apresentam-se na Tabela 1 seguinte. 19

Tabela 1

HepG2 HT1080 Namalwa Hela Hela S3 Comportamento de crescimento Tempo de duplicação + ++ ++ +++ +++ Cultura em suspensão - + + +/- + Isenção de soro possível +/- + + + + Produção de EPO Endógena + - - - - Transiente / mL 53 ng 65 ng 70 ng 100 ng 480 ng Glicosilação de EPO (transiente) + + + + Teste de contaminações infecciosas virais não testado livre livre não testado livre A partir da tabela 1 é evidente que as linhas celulares HT1080, Namalwa e Hela S3 parecem adequadas para a activação endógena de genes de EPO. Particularmente adequadas são Namalwa e Hela S3.

Exemplo 3 Clonagem de regiões homólogas de EPO

Amplificaram-se regiões homólogas do gene de EPO por PCR utilizando um ADN genómico de placenta (Boehringer Mannheim). Prepararam-se para tal dois produtos de PCR a partir de uma região homóloga com o comprimento de 6,3 kb da região das sequências não traduzidas 5' do gene de EPO, exão 1 e intrão 1 (ver Fig. 1) . Os iniciadores utilizados para a preparação do produto de PCR 1 tinham as seguintes sequências: 5'-CGC GGC GGA TCC CAG GGA GCT GGG TTG ACC GG-3' (SEQ ID N° 1) e 5'-GGC CGC GAA TTC TCC GCG CCT GGC CGG GGT CCC TCA GC-3' (SEQ ID N° 2) . Os 20 iniciadores utilizados para a preparação do produto de PCR 2 tinham as seguintes sequências: 5'-CGC GGC GGA TCC TCT CCT CCC TCC CAA GCT GCA ATC-3' (SEQ ID N° 3) e 5'-GGC CGC GAA TTC TAG AAC AGA TAG CCA GGC TGA GAG-3' (SEQ ID N° 4). A partir dos produtos de PCR 1 e 2 recortaram-se os segmentos desejados por clivagem por restrição (produto de PCR 1: HindIII, produto de PCR 2: HindIII e Eco RV) e clonaram-se no vector pCRII (gene in vitro) , que tinha sido clivado com HindIII e Eco RV. 0 vector recombinante deste modo obtido designou-se como 5epopcrl000 (ver Fig. 2).

Exemplo 4 Construção de vectores de alvejamento do

gene de EPO 4.1 Inseriu-se uma sequência de activação de gene, que contém o gene ΝΕΟ, o gene DHFR e um promotor/activador CMV (ver Fig. 3) na posição Agel do plasmideo 5epocrl000 que contém as regiões homólogas de EPO, obtendo-se o plasmideo pl76 (ver

Fig. 4a) . Para trazer o promotor CMV tão próximo quanto possível da posição de início de translacção do gene de EPO, eliminou-se um segmento com o comprimento de 963 pb entre as posições de restrição Asei e Agel (cisão parcial), obtendo-se o plasmideo pl79 (Fig. 4b). 4.2 Para se obter uma optimização da expressão substituíram-se nucleótidos no exão 1, que codificam para o início da sequência leader de EPO Met-Gly-Val-His, pela sequência sintética Met-Ser-Ala-His. Esta sequência obteve-se, como matriz com iniciadores correspondentes, por amplificação de uma sequência de ADN de EPO genómica, por exemplo do 21 plasmídeo pEP0148, que contém um fragmento BstEII/EcoRI de 3,5 kb (incluindo os exões 1-5) da sequência genética de EPO humana sob controlo do promotor SV40 (Jacobs et al., Nature 313 (1985), 806 e Lee-Huang et al., Gene 128 (1993), 227). Obteve-se neste caso o plasmídeo pl87 (Fig. 4b). 4.3 Preparou-se o plasmídeo pl89 a partir do plasmídeo pl87 por inserção do gene de timidinaquinase do vírus de Herpes Simplex (HSV-TK), proveniente de Psvtk-1 (fragmento PvuII/Narl) (Fig. 4c). O gene de HSV-TK encontra-se, sob controlo do promotor SV40, no extremo 3' do intrão 1 (Eco RV/Clal) em orientação contrária em relação ao promotor CMV e deveria servir para a selecção negativa de uma recombinação homóloga. 4.4 Para a construção do plasmídeo pl90 subclonou-se um fragmento Sfil/BglII de pHEAVY, um plasmídeo que contém o ADNc de um mutante de arginina de DHFR, descrito por

Simonsen et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 (1983), 2495), no plasmídeo pGenak-1 cortado com Sfil e BglII, que contém o gene NEO sob controlo do promotor RSV e da posição de poliadenilação tardia SV40 como terminador, o gene DHFR murino sob controlo do promotor SV40 inicial e da posição de poliadenilação inicial SV40 como terminador (Kaufmann et al., Mol. Cell. Biol. 2 (1982), 1304; Okayama et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 280 e Schimke, J. Biol. Chem. 263 (1998), 5989) e o promotor CMV (Boshart et al., Cell 41 (1995) , 521) . Em seguida ligou-se um fragmento Hpal, que continha o cADN codificante para o mutante de arginina de DHFR, no plasmídeo pl89 cortado com Hpal, obtendo-se o plasmídeo pl90 (Fig. 4d) . 22 4.5 Para se obter um vector de transfecção sem o gene HSV-TK, ligou-se um fragmento Ascl/Nhel do plasmídeo pl90, que continha a sequência de activação de gene, num fragmento Ascl/Nhel do plasmideo pl87 contendo o exão 1. 0 plasmideo resultante designou-se por pl92 (Fig. 4e).

Exemplo 5 Transfecção de células

Seleccionaram-se várias linhas celulares para a produção de EPO e transfeccionaram-se com vectores de alvejamento. 5.1 Células Namalwa

Cultivaram-se as células em recipientes de cultura de tecidos T150 e transfeccionaram-se por electroporação (1 x 107 células / 800 μΕ de tampão de electroporação, 20 mM Hepes, 138 mM NaCl, 5 mM KC1, 0,7 mM Na2HP04, 6 mM mono-hidrato de D-glucose, pH 7,0, 10 μρ ADN linearizado, 960 μΕ, 260 V BioRad Gene Pulser). Após a electroporação alimentaram-se as células em RPMI 1640, 10% (v/v) de soro de vitela fetal (FCS), 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio, em quarenta placas de 96 orifícios. Após dois dias cultivaram-se as células durante 10 a 20 dias em meio contendo 1 mg/mL de G-418. Testou-se o sobrenadante num teste ELISA de fase sólida em relação à produção de EPO (ver Exemplo 1.4). Os clonos produtores de EPO expandiram-se em placas de 24 orifícios e recipientes de cultura de tecidos T25. Congelaram-se alíquotas e subclonaram-se as células por meio de FACS (Ventage, Becton Dickinson). Testaram-se novamente os subclonos em relação à produção de EPO. 23 5.2 Células HT 1080

As condições foram as mesmas das descritas para células Namalwa, excepto que se cultivaram as células HT1080 em DMEM, 10% (v/v) de FCS, 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio. Para a transfecção por electroporação separaram-se as células das paredes dos recipientes de cultura por tripsinização. Após a electroporação cultivaram-se 1 x 107 células em DMEM, 10% (v/v) de FCS, 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio, em 5 placas de 96 orifícios. 5.3 Células HeLa S3

As condições foram as mesmas das descritas para células Namalwa, excepto que se cultivaram as células HeLaS3 em RPMI 1640, 10% (v/v) de FCs, 2 mM L-glutamina, 1% (v/v) de aminoácidos não essenciais NEM (Sigma), 1 mM piruvato de sódio. Para a transfecção por electroporação separaram-se as células das paredes dos recipientes de cultura por tripsinização. As condições de electroporação foram 960 μΓ/250 V. Após a electroporação cultivaram-se as células em RPMI 1640, 10% (v/v) de FCS, 2 mM L-glutamina, 1% (v/v) de NEM, 1 mM piruvato de sódio, em recipientes de cultura de tecidos T75. 24 horas após a electroporação tripsinizaram-se as células e cultivaram-se durante 10 a 15 dias num meio contendo 600 μρ/πΛ de G-418, em 10 placas de 96 orifícios. 24

Exemplo 6 Amplificação de genes de EPO

Para aumentar a expressão de EPO cultivaram-se os clones produtores de EPO na presença de concentrações crescentes (100 pM - 1000 nM) de metotrexato (MTX) . Para cada concentração de MTX testaram-se os clones por meio de um teste ELISA (ver Exemplo 1.4) em relação à produção de EPO. Os produtores fortes subclonaram-se através de diluição limitada.

Exemplo 7 Caracterização das linhas celulares produtoras de

EPO

Escolheram-se três linhas celulares diferentes (Namalwa, HeLa S3 e HT 1080) para a activação de genes de EPO. Os clones produtores de EPO obtiveram-se por transfecção com os plasmideos pl79, pl87, pl89, pl90 ou pl92 (ver Exemplos 2 e 3) .

Testaram-se cerca de 160.000 clones resistentes a NEO em relação à produção de EPO, dos quais 12 a 15 segregavam EPO com rendimento significativo de modo reprodutível no sobrenadante celular.

De entre estes puderam identificar-se surpreendentemente, sem amplificação de genes por meio de MTX, um total de 7 clones de EPO que produziam EPO em quantidades suficientes para uma produção em grande escala técnica. A produção de EPO destes clones situava-se na gama de 200 ng/mL a mais do que 1000 ng / mL / 106 células / 24 h.

Após amplificação de genes com 500 nM de MTX pôde aumentar-se a produção de EPO dos clones de EPO identificados até mais do 25 que 3000 ng / mL / 106 células / 24 h. Um novo aumento da concentração de MTX para 1000 nM levou a uma produção superior a 7000 ng / mL / 10β células / 24 h.

Os clonos obtidos mostravam também uma produção de EPO sob condições de cultura isentas de soro e na ausência de MTX.

PROTOCOLO DE SEQUÊNCIA

(1) DADOS GERAIS (i) REQUERENTE:

(A) NOME: Boehringer Mannheim GmbH (B) RUA: Sandhofer Str. 112-132 (C) LOCALIDADE: Mannheim (E) PAÍS: Alemanha (F) CÓDIGO POSTAL: 68305 (ii) DESIGNAÇÃO DA INVENÇÃO: Identificação de linhas celulares humanas para a produção de proteínas humanas por activação endógena de genes (iii) NÚMERO DAS SEQUÊNCIAS: 4 (iv) VERSÃO LEGÍVEL PELO COMPUTADOR: (A) SUPORTE DE DADOS: disquete (B) COMPUTADOR: PC IBM compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS / MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, versão #1.30 (EPA) (2) DADOS PARA A SEQ ID N° 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: Nucleótido (C) FORMA DA CADEIA: cadeia simples 26

(D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESIGNAÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 1 CGCGGCGGAT CCCAGGGAGC TGGGTTGACC GG (2) DADOS PARA A SEQ ID N° 2:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: Nucleótido (C) FORMA DA CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESIGNAÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 2

GGCCGCGAAT TCTCCGCGCC TGGCCGGGGT CCCTCAGC (2) DADOS PARA A SEQ ID N° 3:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: Nucleótido (C) FORMA DA CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESIGNAÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 3

CGCGGCGGAT CCTCTCCTCC CTCCCAAGCT GCAATC (2) DADOS PARA A SEQ ID N° 4:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: Nucleótido (C) FORMA DA CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESIGNAÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 4

GGCCGCGAAT TCTAGAACAG ATAGCCAGGC TGAGAG

Lisboa, 26 de Fevereiro 2007 27

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a escolha de linhas celulares humanas para a preparação de proteínas humanas por activação endógena de um gene alvo endogenamente existente de forma endógena na célula, caracterizado por (a) se testar uma linha celular humana em relação à existência das seguintes características: (i) um gene alvo com a sequência de ácidos nucleicos desejada, (ii) pelo menos 5 duplicações de população no espaço de 14 dias numa cultura de suspensão, e (iii) pelo menos 5 duplicações de população no espaço de 14 dias num meio de cultura isento de soro, e (b) se utilizar uma linha celular que preencha as características (i), (ii) e (iii) como linha celular de partida para a activação endógena do gene alvo.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar uma linha celular humana que (iv) apresente um tempo de geração de 16 a 256 duplicações de população no intervalo de uma semana num meio de cultura.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se utilizar uma linha celular humana que apresente 64 a 128 duplicações de população no intervalo de uma semana num meio de cultura. 1
4. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores caracterizado por se utilizar uma linha celular humana que (v) não apresente essencialmente qualquer expressão endógena do gene alvo.
5. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se utilizar uma linha celular humana que (vi) contenha mais do que 2 cópias cromossomais do gene alvo.
6. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se utilizar uma linha celular humana que (vii) sintetize a proteína alvo com um padrão de glicosilação comparável ao da proteína alvo de origem natural.
7. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se utilizar uma linha celular humana que (viii) esteja isenta de contaminações infecciosas detectáveis.
8. Processo para a preparação de proteínas humanas por activação endógena de genes numa célula humana, caracterizado por através de um processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, se escolher uma linha celular que preenche as características (i), (ii) e (iii) como definidas na reivindicação 1, e se utilizar a linha celular assim escolhida. 2
9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por se utilizar uma linha celular que preenche ainda pelo menos uma das características (iv), (v), (vi), (vii) e (viii) como definidas numa das reivindicações 2, 4, 5, 6 e 7.
10. Processo de acordo com a reivindicação 8 ou 9, para a preparação de um factor humano, escolhido de entre EPO, TPO, factores estimulantes de colónias, proteínas que influenciam a coaqulação do sanque, interferões, interleuquinas, quemoquinas, factores neutróficos, proteínas que influenciam o crescimento dos ossos, proteínas de Hedgehog, factores de crescimento tumoral, hormonas de crescimento, ACTH, encefalinas, endorfinas, receptores e outras proteínas de ligação a proteínas.
11. Processo de acordo com a reivindicação 10, para a preparação de EPO.
12. Processo para a obtenção de um polipéptido, caracterizado por se identificar uma linha celular humana através de um processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, na qual existe endogenamente um gene alvo que codifica para o polipéptido desejado, se efectuar uma activação do gene alvo e se obter depois o polipéptido codificado pelo gene alvo.
13. Processo de acordo com a reivindicação 12, em que se efectua a obtenção do polipéptido num fermentador de grandes dimensões. Lisboa, 26 de Fevereiro de 2007 3