KR20010022126A - 내인성 유전자 활성화에 의해 사람 단백질을 생성시키는사람 세포계를 확인하는 방법 - Google Patents
내인성 유전자 활성화에 의해 사람 단백질을 생성시키는사람 세포계를 확인하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 내인성 유전자 활성화에 의해 사람 단백질을 경제적으로 적합한 양으로 및 약제 조성물을 생성시키기에 적합한 형태로 생성시키는데 이용되는 사람 세포를 선택하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 방식으로 확인된 세포계에서 사람 단백질을 생성시키는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 내인성 유전자 활성화에 의해 사람 단백질을 경제적인 수율로 및 약제 제제를 제조하기에 적합한 형태로 생성시키는 사람 세포를 선택하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이 방식으로 확인된 세포계 내에서 사람 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
사람 세포계 내에서 내인성 유전자 활성화에 의해 사람 단백질을 제조하는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, WO93/09222호, WO94/12650호 및 WO95/31560호에는 내인성 유전자 활성화에 의해 사람 세포계 내에서 사람 에리트로포이에틴 및 그 밖의 사람 단백질을 생성시키는 방법에 기재되어 있다.
그러나, 상기 문헌들에는, 사람 단백질을 제조하는데 사용되는 세포계의 선택에 있어서 특정한 표준이 준수되어야 한다는 것이 제시되어 있지 않다. 따라서, 원하는 사람 단백질이 이의 생성을 위해 선택된 세포계 내에서 바람직한 수율과 형태로, 오염없이 수득될 수 있다고 보장할 수 없다. 따라서, 상기 문헌들에서는, 단백질이 일반적으로 단지 낮은 수율로 얻어진다.
본 발명의 목적은 종래 기술의 단점을 해결하고, 특히, 소정의 표적 유전자의 내인성 활성화에 적합한 사람 출발 세포계를 선택하기 위한 표준을 제공하는 데에 있다.
이러한 목적은 세포계에 내인적으로 존재하는 표적 유전자를 활성화시키면 사람 단백질을 제조하는 사람 세포계를 선택하는 방법으로서,
(a) 사람 세포계를, 하기 특징의 존재에 대해 시험하고:
(i) 원하는 핵산 서열을 갖는 표적 유전자,
(ii) 현탁 배양액에서의 14일 내의 5배 이상의 개체수 배증, 및
(iii) 혈청 비함유 배지에서의 14일 내의 5배 이상의 개체수 배증;
(b) 특징 (i), (ii) 및 (iii)을 갖는 세포계를 표적 유전자의 내인성 활성을 위한 출발 세포계로서 사용하는 것을 포함하는 방법에 의해 달성된다.
본 발명에 따라, 사람 세포계 내의 사람 표적 유전자를 유전자 표적화에 의해 활성화시키고, 표적 단백질을 생성시키기에 적합한 세포를 수득하는 것을 연구하는 경우, 세포계는, 표적 단백질의 차후의 대규모 생산을 위한 적합한 후보가 되기 위해 이 세포계가 지녀야 하는 다수의 특징의 존재에 대해 시험될 것이다. 바람직하게는, 불멸화된 세포계, 특히 종양 세포계가 그러한 것으로서 시험될 것인데, 이는 이들이 불멸화되지 않은 세포 보다 배양성 면에서 중요한 잇점을 갖기 때문이다.
특징 (i)에 따르면, 사람 세포계는, 표적 유전자, 즉, 내인성 유전자 활성화에 의해 활성화시키려는 유전자가 천연 표전 유전자의 통상적인 핵산 서열인 바람직한 핵산 서열을 실제로 갖는 지를 알기 위해 시험된다. 이는 영구 배양액 중의 종양 세포계 및 그 밖의 세포계가 종종 이들 게놈 중에서 일련의 변이를 나타내기 때문이다. 따라서, 적합한 세포계의 선택에 있어서 한 가지 중요한 일면은 세포가 바람직한 생성물에 대한 올바른 유전자를 갖는 지의 여부이다. 서열의 결정은 세포를 통상의 방식으로 배양하고, 표적 유전자를 시퀀싱함으로서 수행될 수 있다. 소망에 따라, 표적 유전자의 증폭이 시퀀싱 전에 PCR 또는 기타 증폭 방법에 의해 수행될 수 있다.
세포계의 선택을 위한 또 다른 중요한 특징은 현탁액 중에서의 배양성이다. 현탁 세포는 발효시키기 용이하며, 발효는 대규모 치수, 예를 들어 용량이 예를 들어 10ℓ 내지 50,000ℓ인 대규모 발효기에 보다 용이하게 적합될 수 있다. 따라서, 선택된 세포는 현탁 세포이거나, 이들은 현탁 배양에 용이하게 적합되어야 한다. 이를 위해, 세포는 일정하게 교반되면서 14일간 배양된다. 이 기간 내에 세포가 5배 이상의 개체수 배증을 나타내면, 이들은 현탁 배양에 적합한 것으로 간주된다. 배증된 개체수는 전체 세포수를 주기적으로 결정함으로써, 예를 들어 세포를 계수하거나 세포 현탁액의 광학 밀도를 측정함으로써 결정될 수 있다.
사람 세포의 선택을 위한 또 다른 중요한 특징은 혈청 비함유 배지에서의 배양성이다. 혈청 비함유 세포 배양액으로부터의 단백질의 정제가 매우 용이하고, 혈청 비함유 배양액에서는 동물 병원체, 예를 들어 바이러스에 의해 오염될 위험이 없기 때문에, 선택된 세포는 혈청 비함유 배양액 중에서 증식할 수 있어야 한다. 이를 위해, 세포는 혈청 비함유 배지(예를 들어, ITS가 함유된 RPMI 1650 (Boehringer Mannheim))를 갖는 배양기 중에서 14일간 1㎖ 당 1 내지 10 x 105개 세포의 밀도로 배양된다. 이러한 배양 도중의 세포가 세포 계수에 의해 결정될 수 있는 5배 이상의 개체수 배증을 나타내면, 이들은 혈청 비함유 배양에 적합한 것으로 간주된다.
또 다른 중요한 특징으로서, 본 발명에 따른 바람직한 특징은 세대 시간(iv) 이다. 10% 전체 우혈청이 함유된 DMEM 또는 10% 전체 우혈청이 함유된 RPMI 1640과 같은 배지 중의 선택된 세포는 높은 증식율을 가져야 하는데, 즉, 배양액 중의 1주일 내에, 이들은 10 내지 256배, 바람직하게는 64 내지 128배의 개체수 배증을 가져야 한다. 이를 위해, 세포는 배양 접시에 1㎖ 당 0.1 내지 10 x 105개 세포, 바람직하게는 0.5 내지 2 x 105개 세포의 농도로 시딩되고, 전체 세포수는 트립신처리 후 또는 트립신처리 없이 세포 챔버에 의해 결정된다. 충분히 짧은 세대 시간을 갖는 세포가 내인성 유전자 활성화에 의한 사람 단백질의 대규모 생성에 특히 적합하다.
또 다른 바람직한 특징은 임의의 검출가능한 내인성 발현, 즉, 표전 유전자의 전사 및 번역 (v)의 부재에 있다. 바람직하게는, 내인성 유전자 활성화를 위해, 표적 유전자의 내인성 발현을 본질적으로 갖지 않는 세포계가 선택된다. 이를 위해, 세포는 0.01 내지 2 x 106개 세포/㎖, 바람직하게는 배지 1㎖ 당 0.5 내지 1 x 106개 세포의 세포 밀도로 24시간 동안 시딩될 수 있다. 소정의 시간, 예를 들어 24시간 후, 세포 상층액을 분리하고, 세포를 버리고, 세포 상층액 중의 표적 단백질의 함량을 공지된 시험 과정, 예를 들어 ELISA에 의해 결정하였다. EPO의 경우, 검출 한계는 예를 들어 10pg/EPO/㎖ 이다. 1㎖ 당 105개 세포를 시딩하는 경우 10pg 미만의 단백질을 합성시키는 세포는 비생산성인 것으로 간주되며, 특히 적합하다.
또 다른 중요하고 바람직한 특징은 선택하려는 세포 중의 표적 유전자의 다염색체성 (vi) 이다. 세포 중의 표적 유전자의 2개가 넘는 염색체 복사체가 존재하면 동종 재조합에서의 수율을 현저하게 증가시킨다. 유전자가 7번 염색체에 있는 EPO의 생성의 경우, 7번 염색체를 삼벌로 갖는 나말와(Namalwa) 세포 [참조: Nadkarni et al., Cancer 23 (1969), 64-79] 또는 HeLa S3 세포 [참조: Puck et al., J. Exp. Med. 103 (1956), 173-284]가 특히 적합한 것으로 입증되었다. 7번 염색체를 증가된 복사체수로 함유하는 세포계의 또 다른 예로는, 결장 선암 세포계 SW-480 (ATCC CCL-228; Leibovitz et al., Cancer Res. 36 (1976), 4562-4567), 악성 흑색종 세포계 SK-MEL-3 (ATCC HTB 69; Fogh and Tremp, in: Human Tumor Cells in vitro, pp 115-159, J. Fogh (ed.), Plenum Press, New York 1975), 결장 선암 세포 Colo-320 (ATCC CCL-220; Quinn et al., Cancer Res. 39 (1979), 4914-4924)), 흑색종 세포계 MEL-HO (DSM ACC 62; Holzmann et al., Int. J. Cancer 41 (1988), 542-547) 및 신장 암종 세포계 A-498 (DSM ACC 55; Giard et al., J. Natl Cancer Inst. 51 (1973), 1417-1423)이 있다.
세포계의 게놈 중의 염색체의 수를 검사하는 것은 표적 유전자의 특정 염색체 및/또는 유전자좌에 대해 특이적인 DNA 프로브를 사용함으로써 수행될 수 있다.
내인성 유전자 활성에 사용되는 출발 세포계의 또 다른 바람직한 특징은 바람직한 표적 단백질의 올바른 글리코실화 (vii) 이다. 특히, 천연 표적 단백질과 같은 시알산 잔기의 개수에 대해 필적하는 글리코실화 패턴을 갖는 표적 단백질을 합성하는 사람 세포계를 사용하는 것이 바람직하다. 올바른 글리코실화의 존재에 대한 시험은, 세포를, 세포 내에서 활성인 프로모터의 조절하에 있는 바람직한 표적 유전자를 함유하는 염색체외 벡터로 일시적으로 트랜스펙팅시킴으로써 수행되는 것이 바람직하다. 표전 유전자의 일시적 발현 후에, 세포 상층액 및/또는 세포 추출물은 등전 집중에 의해 분석된다. 예로서의 EPO의 경우, 올바른 글리코실화의 존재는 매우 명백하다. 따라서, 글리코실화되지 않은 EPO, 예를 들어 대장균 세포로부터의 재조합 EPO는 시험관내 실험에서 글리코실화된 EPO에 필적하는 활성을 갖는다. 그러나, 생체내 실험에서는, 글리코실화되지 않은 EPO는 실질적으로 덜 효과적이다. 출발 세포계가 올바르게 글리코실화된 EPO를 생성시킬 수 있는 지를 결정하기 위해, 뇨 EPO 뿐만 아니라, 사람에서 활성인 글리코실화의 형태를 가지며, 글리코실화에 있어서, 뇨 EPO와 거의 동일한 CHO 세포로부터의 재조합 EPO와 비교할 수 있다. 글리코실화의 비교는 등전 집중에 의해 수행되는 것이 바람직하다.
사람 세포계의 선택을 위한 또 다른 바람직한 특징은 전염성 오염, 예를 들어 전염성 바이러스 입자 또는 미코플라스마로부터의 실험된 세포계의 자유 (vii) 이다. 바이러스 오염의 존재에 대한 검사는 세포 배양, 생체내 분석 및/또는 특정 바이러스 단백질의 검출에 의해 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 사람 단백질을 사람 세포계 내에서 내인성 유전자 활성화에 의해 제조하는 방법으로서, 상기 열거된 특징 i), ii) 및 iii) 뿐만 아니라 상기 주어진 특징 (iv), (v), (vi) 및 (vii) 중의 하나 이상을 추가로 만족하는 세포계를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 사람 인자, 예를 들어 EPO, 트롬보포이에틴(TPO), 콜로니 자극 인자, 예를 들어 G-CSF 또는 GM-CSF, 혈액 응고에 영향을 미치는 단백질, 예를 들어 tPA, 인터페론, 예를 들어 IFN-α, IFN-β 또는 IFN-γ, 인터루킨, 예를 들어 IL-1 내지 IL-18, 케모킨, 예를 들어 MIP, 향신경성 인자, 예를 들어 NGF 또는 BDNF, 뼈 성장을 영향을 미치는 단백질, 예를 들어 IFG-BPs, 헤지호그 단백질, 종양 성장 인자, 예를 들어 TFG-β, 성장 호르몬, 예를 들어 HGH, ACTH, 엔세팔린, 엔돌핀, 수용체, 예를 들어 가용성 및/또는 막 결합된 형태의 인터루킨 또는 인슐린 수용체 및 그 밖의 단백질 결합성 단백질을 제조하기 위해 특히 사용된다. 특히 EPO를 제조하는 방법이 선택된다.
내인성 유전자 활성화 자체는 공지된 방법에 의해 수행될 수 있고, 바람직하게는 하기 단계를 포함한다:
(a) 원하는 핵산 서열을 가지며, 표적 유전자의 발현에 적합한 본 발명의 선택 표준 검사에 의해 확인된, 내인성 표적 유전자의 하나 이상의 복제물을 함유하는 사람 출발 세포계를 준비하는 단계,
(b) 세포를,
(i) 상동 재조합이 일어나도록 하는, 표적 유전자좌의 영역과 상동인 2개의 플랭킹 DNA 서열,
(ii) 포지티브 선택 마커 유전자,
(iii) 소망에 따라, 네거티브 선택 마커 유전자,
(iv) 소망에 따라, 증폭 유전자, 및
(v) 사람 세포에서 활성인 이종성 발현 조절 서열을 포함하는 DNA 구성물로 트랜스펙팅시키는 단계,
(c) 트랜스펙팅된 세포를, 포지티브 선택 마아커 유전자의 존재 및 임의로, 네거티브 마커 유전자의 부재 하에 선택이 일어나도록 하는 조건하에 배양시키는 단계,
(d) 단계(c)에 따라 선택될 수 있는 세포를 분석하는 단계,
(e) 원하는 표적 단백질을 생성시키는 세포를 확인하는 단계, 및
(f) 소망에 따라, 표적 유전자를 선택된 세포에서 증폭시키는 단계.
원하는 사람 단백질을 생성시키는 세포를 제조하는데 사용되는 DNA 구성물은, 표적 유전자좌의 영역과 상동인 2개의 플랭킹 DNA 서열을 함유한다. 적합한 플랭킹 서열의 선택은 예를 들어, WO 90/11354호 및 WO 91/09955호에 기술된 방법에 의해 수행된다. 바람직하게는, 플랭킹 서열은 각각 길이가 150 bp 이상이다.
특히 바람직하게는, 상동 DNA 서열은 표적 유전자의 5' 영역, 예를 들어 5'-비번역 서열, 즉, 이 영역에 위치한 엑손 및 인트론을 코딩하는 신호 서열로부터 선택된다.
포지티브 선택 마커 유전자는, 발현되면 선택성 표현형, 예를 들어 항생물질 내성, 영양요구성 등을 유도하는 진핵 세포에 적합한 임의의 선택 마커 유전자일 수 있다. 특히 바람직한 포지티브 선택 마아커 유전자는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자이다.
임의적으로, HSV 티미딘 키나아제 유전자와 같은 네거티브 선택 마커 유전자가 존재할 수 있으며, 이에 의해 발현 세포는 선택 제제의 존재하에 파괴된다. 네거티브 선택 마커 유전자는 2개의 플랭킹 상동 서열 영역의 외부에 위치한다.
사람 세포에서 내인적으로 활성화된 표적 유전자의 증폭이 바람직한 경우, DNA 구성물은 증폭 유전자를 함유한다. 적합한 증폭 유전자의 예로는, 디히드로폴레이트 환원효소, 아데노신 탈아민효소, 오르니틴 탈카르복실효소 유전자 등이 있다. 특히 바람직한 증폭 유전자는 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자, 특히 선택성 제제(메토트렉세이트)에 대해 야생형 유전자보다 감도가 높은 디히드로폴레이트 환원효소-아르기닌 변이체를 코딩하는 유전자이다 [참조: Simonsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983); 2495].
또한, 내인성 유전자 활성화에 사용되는 DNA 구성물은 사람 세포에서 활성인 이종성 발현 조절 서열을 함유한다. 발현 조절 서열은 프로모터 및 바람직하게는, 추가의 발현 증강용 서열, 예를 들어 인핸서를 포함한다. 프로모터는 조절 또는 구성 프로모터일 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 강력한 바이러스 프로모터, 예를 들어 SV40 또는 CMV 프로모터이다. 특히 바람직한 것은 CMV 프로모터/인핸서이다.
또한, 본 발명은 세포에 내인적으로 존재하는 표적 유전자의 활성화 후에 활성화된 표적 유전자에 의해 코드화된 폴리펩티드를 수득하는데, 바람직하게는 예를 들어 대규모 발효기를 포함하는 대규모 공정에서 폴리펩티드를 수득하는데 사용되는, 상기 기술된 방법에 의해 확인된 사람 세포계의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 주제는, 사람 세포에서 활성인 이종성 발현 조절 서열과 작동적으로 결합된 내인성 유전자의 복제물을 함유하고, 사전 유전자 증폭 없이, 24시간 당 106개 세포 당 내인성 유전자에 의해 코드화된 폴리펩티드 200ng 이상을 생성시킬 수 있는 사람 세포이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 사람 세포는 24시간 당 106개 세포 당 폴리펩티드 200 내지 3000ng, 가장 바람직하게는 1000 내지 3000ng을 생성시킬 수 있다.
최종적으로, 본 발명의 또 다른 주제는 상기 명명된 세포로부터 유전자 증폭에 의해 수득할 수 있고, 사람 세포에서 활성인 이종성 발현 조절 서열과 각각 작동적으로 결합된 내인성 유전자의 다수의 복제물을 함유하며, 24시간 당 106개 세포 당 폴리펩티드 1000ng 이상을 생성시킬 수 있는 사람 세포이다. 특히 바람직하게는, 내인성 유전자 증폭에 의해 수득할 수 있는 사람 세포는 24시간 당 106개 세포 당 폴리펩티드 1000 내지 25000ng, 바람직하게는 5000 내지 25000ng을 생성시킬 수 있다.
본 발명에 따른 세포의 예로는 EPO 생성 클론인 '알라딘(Aladin)"이 있으며, 이것은 부다페스트 조약의 규정에 따라 1997년 7월 15일에 도이치 잠룽 폰 미크로오가니즈멘 운트 첼쿨투렌 (DSMZ, Mascheroder Weg 1b, 38124 Brunswick)에 수탁번호 DSM ACC 2320으로 기탁되었다.
본 발명은 하기 실시예, 도면 및 서열표에 의해 계속 설명될 것이다.
도 1은 5'-비번역 서열인 엑손 1 및 인트론 1의 영역으로부터의 EPO 유전자의 상동 영역의 증폭의 개략도이다.
도 2는 5'-비번역 서열인 엑손 1 및 인트론 1의 영역으로부터의 상동 영역을 함유하는 플라스미드의 개략도이다.
도 3은 로우스(Rous) 육종 바이러스 프로모터(RSV), 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자(NEO), SV40의 초기 폴리아데실화 영역(SVIpA), 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자(DHFR)의 초기 SV40 프로모터(SVI) 및 시토메갈로바이러스 임미디어트(immediate) 초기 프로모터 및 인핸서(MCMV)를 함유하는 유전자 활성화 서열의 개략도이다.
도 4a는 EPO 유전자 표적화 벡터 p176의 구성을 도시한다.
도 4b는 EPO 유전자 표적화 벡터 p176 및 p187의 구성을 도시한다.
도 4c는 EPO 유전자 표적화 벡터 p189의 구성을 도시한다.
도 4d는 EPO 유전자 표적화 벡터 p190의 구성을 도시한다.
도 4e는 EPO 유전자 표적화 벡터 p192의 구성을 도시한다.
서열 번호 1 및 2 : PCR 생성물 1을 제조하는 데에 사용되는 프라이머의 누클레오티드 서열 (도 1).
서열 번호 3 및 4 : PCR 생성물 2를 제조하는 데에 사용되는 프라이머의 서열 (도 1).
실시예
실시예 1 선택 방법
1.1 세대 시간의 결정
시험하려는 세포계를 각각 DMEM과 10% FCS 또는 RPMI 1640가 함유된 배양 접시 및 10% FCS가 함유된 배양 접시에 1㎖ 당 0.1 내지 5 x 105개 세포, 바람직하게는 0.5 내지 2 x 105개 세포의 농도로 시딩하고, 특정 세포에 대해 권고된 배지 (예를 들어 ATCC에 의해)에서 적합한 조건 하에 배양하고, 전체 세포수를, 트립신 처리하거나 하지않고, 계수 챔버, 예를 들어 뉴바우어(Neubauer)로 2일 내지 3일 마다 결정하였다. 1주일 배양 내에 16 내지 256배 개체수 배증, 바람직하게는 64 내지 128배 개체수 배증을 갖는 세포를 포지티브(+, ++ 또는 +++)한 것으로 평가하였다.
1.2. 현탁액 중에서의 배양성
현탁액 중에서의 배양성을 결정하기 위해, 세포를 37℃ 및 7% CO2에서 상응하는 악세사리가 구비된 벨리코 스피너 (Belico Spinner) 안에서 배지(참조 1.1, 혈청, 예를 들어 우태아 혈청을 첨가하거나 첨가하지 않음)에서 일정하게 교반시키면서 14일간 배양시켰다. 이 기간 동안에 5배 이상의 개체수 배증을 나타내는 세포를 현탁 배양에 대해 적합한(+) 것으로 평가하였다.
1.3. 혈청 비함유 배지 중에서의 배양성
혈청 비함유 배지 중에서의 세포의 배양성을 결정하기 위해, 세포를 특정 세포에 대해 ATCC가 권고하고, ITS(Boehringer Mannheim, Cat. No. 1074547)이 함유된 기초 배지(즉, 혈청 비첨가)에서 1.1에 기재된 조건 하에, 배양 용기에서, 1㎖ 당 1 내지 10 x 105개 세포의 농도로 14일간 배양시켰다. 이 기간 동안에 5배 이상의 개체수 배증(세포 계수에 의해 결정하여)을 나타내는 세포를 혈청 비함유 배양에 적합한 것으로 평가하였다.
1.4 표적 유전자의 내인성 발현의 결정
표적 유전자가 선택된 세포계에서 내인적으로 생성되는 지를 결정하기 위해, 세포를 배지 1㎖ 당 0.01 내지 2 x 106개 세포의 농도로 24시간 동안 시딩하였다. 24시간 후, 세포 상층액을 분리하고, 세포를 버리고, 세포 상층액 중의 세포 단백질의 함량을 공지된 방법, 예를 들어 특정 단백질에 대해 특이적인 면역검정법에 의해 결정하였다.
EPO의 경우, 함량을 ELISA에 의해 결정하였다. 이를 위해, 스트렙타비딘 코딩된 마이크로타이터 플레이트를 비오티닐화된 안티-EPO 항체 (Boehringer Mannheim)으로 코팅하고, 비특이적 결합을 차단하는 단백질(1% w/v)을 함유하는 용액과 인큐베이팅시켰다. 그 후, 배양 상층액 0.1㎖를 첨가하고, 밤새 인큐베이팅시켰다. 세척 후, 퍼옥시다아제 컨쥬게이팅된 모노클로날 안티-EPO 항체 (Boehringer Mannheim)를 2시간 동안 첨가시켰다. 퍼옥시다아제 반응을 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) 광도계로 기질로서 ABTS를 사용하여 405nm에서 수행하였다.
본 시험에서의 EPO 검출 한계는 1㎖ 당 EPO 10pg 이었다. 1㎖ 당 106개 세포로 시딩한 경우, 1㎖ 당 EPO 10pg를 생성시키는 세포는 비생산성이고, 적합한(+)것으로 평가되었다.
1.5 표적 유전자의 복제물 개수의 결정
세포계 중의 표적 유전자의 복제물 개수를 결정하기 위해, 사람 게놈 DNA를 약 108개 세포로부터 단리시키고, 정량하였다 [참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press]. DNA를 제한 효소, 예를 들어 AgeI 및 AscI 또는 BamHI, HindIII 및 SaII로 각각 절단시킨 후, DNA 단편들을 이들의 크기에 따라 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리시킨 후, 최종적으로, 나일론 막에 이동시키고, 고정시켰다.
고정된 DNA를 표적 유전자의 유전자좌 및 표적 유전자가 위치하는 염색체에 특이적인 디곡시제닌 마킹된 DNA 프로브로 하이브리드화시키고, 엄격한 조건 하에 세척시켰다. 특정 하이브리드화 신호는 방사선 감수성 필름을 사용하는 화학발광법에 의해 검출하였다.
1.6 표적 유전자의 핵산 서열의 결정
게놈 DNA를 DNA 단리용 키트 (예를 들어, QIAGEN Blood & Cell Culture DNA kit)를 사용하여 약 107개 세포로부터 단리시켰다.
한 쌍의 PCR 프라이머를 표적 유전자의 증폭을 위해 사용하였다. 프라이머의 서열은 표적 유전자의 코딩 영역을 플랭킹하는 서열과 상보적이었다. 따라서, 표적 유전자의 전체 코딩 영역은 증폭될 수 있었다.
PCR 생성물을 직접 서열 분석하거나 클로닝 벡터에 클로닝시킨 후 시퀀싱하였다. 표적 유전자의 엑손 영역의 서열이 온전하게 수득될 수 있도록, 서열이 표적 유전자의 인트론 영역으로부터의 서열과 상보적인 시퀀싱 프라이머를 사용하였다. 시퀀싱을, 제조업자의 지시에 따라, 예를 들어 "프리즘 레디 리액션 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱(등록상표: Prism Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing)" 키트 (PE/ABI, Forest City, U.S.A.)를 사용하여 PE/ABI 시퀀싱 자동장치 상에서 수행하였다.
1.7 글리코실화 패턴의 결정
EPO의 글리코실화 패턴을 결정하기 위해, 시험하려는 세포계를, SV40 프로모터(Jacobs et al., Nature 313 (1985), 8O6; Lee-Huang et al., Gene 128 (1993), 272)의 조절 하에 있는 사람 EPO 유전자 서열의 4kb HindIII/EcoRI 단편을 함유하는 플라스미드 pEPO227로 트랜스펙팅시켰다. 세포를 리포펙타민의 존재하에, 시판되는 시제 키트를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 트랜스펙팅시켰다. 2일 내지 5일 후에 수득한 세포 상층액 중의 EPO 함량을 ELISA에 의해 결정하였다.
세포 상층액을 농축시키고, 등전 집중(Righetti, P.G., in: Work, T.S., Burdon, R.H. (ed.) Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications, Elsevier Biomedical Press, Amsterdam (1983))에 의해 공지된 EPO 생성물과 비교하였다. 공지된 EPO 생성물, 예를 들어 뇨 EPO에 필적하는 글리코실화 패턴을 나타내는 사람 세포를 적합한(+)것으로 평가하였다.
1.8 바이러스 오염의 결정
1.8.1 세포 배양에 의한 분석
시험하려는 사람 세포계의 가능한 전염성 바이러스 오염을 검출하기 위해, 세포병원성 효과를 검출할 수 있도록 세포의 용해물을 검출제 세포와 인큐베이팅시켰다. 또한, 헤모어드솝션(hemoadsorption) 분석을 수행하였다.
용해물을 제조하기 위해, 완충액 1㎖ 중의 106개 세포의 현탁액을 급속 동결 및 해동 공정에 의해 용해시켰다. 세포 잔류물을 원심분리에 의해 분리시키고, 상층액을 검출제 세포계에 적용시켰다. 사용되는 검출제 세포계는 HepG2(ATCC HB-8065; Nature 282 (1979), 615-616), MRC-5(ATCC-1587) 및 Vero(ATCC CCL-171; Jacobs, Nature 227 (1970), 168-170) 이다. 폴리오 SV 및 인플루엔자 타입의 바이러스를 포지티브 대조표준으로서 사용하였다. 네거티브 대조군은 용해물 없이 배양시킨 검출제 세포계였다. 세포병원성 효과를 결정하기 위해, 검출제 세포계를 14일 이상의 기간에 걸쳐 규칙적으로 실험하였다.
헤모어드솝션 분석을 위해, 세포 용해물 및 대조표준과 함께 인큐베이팅시킨 Vero 세포를 암탉, 돼지 및 사람으로부터의 적혈구로 7일 후에 처리하였다. 배양된 세포의 단일층에 적혈구가 부착되면, 배양액이 바이러스 오염되었음을 나타낸다.
1.8.2 생체내 분석
실험하려는 세포계의 용해물을 1.8.1에서와 같이 제조하고, 갓태어난 마우스에 복강내 및 뇌사이에 0.1㎖의 양으로 주입하였다. 14일에 걸쳐, 마우스를 질병률 및 치사율에 대해 관찰하였다
1.8.3 바이러스 단백질의 특이적 검출
특정 바이러스 단백질, 예를 들어 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 단백질 (핵 단백질 또는 캡시드 항원)의 존재를, EBV-포지티브 밴드의 시험 사람 혈청 하에 세포계의 고정된 세포를 제공함으로써 시험하였다. 그 후, 바이러스 항원의 검출을 보체 및 상응하는 안티-사람 보체 C3 플루오레세인 컨쥬게이트(핵 항원 검출용)의 투여하거나, 안티-사람 글로불린 플루오레세인(캡시드 항원 검출용)을 투여함으로써 수행하였다.
실시예 2 선택 결과
사람 세포계 HepG2, HT1080, 나말와, HeLa 및 HeLaS3을 실시예 1에 기재된 방법에 의해 시험하였다. 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1
| HepG2 | HT1080 | 나말와 | HeLa | HeLaS3 | |
| 증식 | |||||
| 배증 시간 | + | ++ | ++ | +++ | +++ |
| 현탁 배양 | - | + | + | +/- | + |
| 가능한 혈청 비함유 | +/- | + | + | + | + |
| EPO 생성 | |||||
| 내인성 | + | - | - | - | - |
| 일시적/㎖ | 53ng | 65ng | 70ng | 100ng | 480ng |
| EPO 글리코실화 (일시적) | - | + | + | + | + |
| 바이러스 전염성 오염에 대한 시험 | 시험되지 않음 | 없음 | 없음 | 시험되지 않음 | 없음 |
표 1로부터, 세포계 HT1080, 나말와 및 HeLaS3가 EPO의 내인성 유전자 활성에 적합한 것으로 간주되는 것으로 알 수 있다. 나말와 및 HeLa S3가 특히 적합하다.
실시예 3 : EPO 상동 영역의 클로닝
EPO 유전자의 상동 영역을 게놈 태반 DNA(뵈링거 만하임)를 사용하여 증폭시켰다. 2개의 PCR 생성물을 EPO 유전자의 5'-비번역 서열, 엑손 1 및 인트론의 영역으로부터 6.3kB 거리의 상동 영역으로부터 제조하였다 (도 1 참조). PCR 생성물 1의 제조에 사용되는 프라이머는 서열 5'-CGC GGC GGA TCC CAG GGA GCT GGG TTG ACC GG-3' (서열 번호 1) 및 5'-GGC CGC GAA TTC TCC GCG CCT GGC CGG GGT CCC TCA GC-3' (서열 번호 2)을 갖는다. PCR 생성물 2의 제조에 사용되는 프라이머는 서열 5'-CGC GGC GGA TCC TCT CCT CCC TCC CAA GCT GCA ATC-3' (서열 번호 3) 및 5'-GGC CGC GAA TTC TAG AAC AGA TAG CCA GGC TGA GAG-3' (서열 번호 4)을 갖는다.
원하는 절편을 제한 절단에 의해 PCR 생성물 1 및 2로부터 절단하고(PCR 생물 1 : HindIII, PCR 생성물 2 : HindIII 및 Eco RV), HindIII 및 Eco RV에 의해 절단한 벡터 pCRII(인비트로겐) 내로 클로닝시켰다. 이러한 방식으로 수득된 재조합 벡터를 5epopcr로 명명하였다 (도 2 참조).
실시예 4 : EPO 유전자 표적화 벡터의 구성
4.1 NEO 유전자, DHFR 유전자 및 CMV 프로모터/인핸서를 함유하는 유전자 활성화 서열(도 3 참조)을 EPO 상동 영역을 함유하는 플라스미드 5epocr 1000의 AgeI 자리 내에 삽입하고, 플라스미드 p176을 수득하였다 (도 4a 참조). CMV 프로모터를 EPO 유전자의 번역 출발 자리에 가능한 한 근접시키도록, 963 bp 길이의 절편을 제한 자리 AscI와 AgeI 사이에서 결실시켰으며(부분 절단), 이 때 플라스미드 p179를 수득하였다 (도 4b).
4.2 발현을 최적화시키기 위해, EPO 리더 서열 Met-Gly-Val-His의 앞부분을 코드화시키는 엑손 1 내의 누클레오티드를 합성 서열 Met-Ser-Ala-His로 치환시켰다 (실시예 6 참조). 상기 서열은 프라이머 EX4(서열 번호 9) 및 EX17(서열 번호 17)을 갖는 템플레이트로서 SV40[Jacobs et al., Nature 313 (1985), 806 and Lee-Huang et al., Gene 128 (1993), 227]의 조절하에 사람 EPO 유전자 서열의 3,5 kB BstEII/EcoRI 단편(엑손 1-5 포함)을 함유하는 게놈 EPO-DNA 서열, 예를 들어 플라스미드 pEPO148의 증폭에 의해 수득하였다 (표 1). 플라스미드 p187이 수득되었다 (도 4b).
4.3 플라스미드 p189를 Psvtk-1(PvuII/NarI 단편)으로부터 기원하는 단순포진 바이러스 티미딘키나아제 유전자(HSV-TK)의 삽입에 의해 플라스미드 p187로부터 제조하였다 (도 4c). HSV-TK 유전자는 CMV 프로모터에 대해 반대 배향으로 있는 인트론 1(EcoRV/ClaI)의 3' 말단에서 SV40 프로모터의 조절하에 있고, 상동성 재조합을 위한 네거티브 선택용으로 작용해야 한다.
4.4 플라스미드 p190의 구성을 위해, 지몬젠(Simonsen) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci, USA 80 (1983), 2495]에 기술된 DHFR의 아르기닌 변이체의 cDNA를 함유하는 플라스미드인 pHEAVY의 SfiI/BglII 단편을, RSV 프로모터 및 종단제로서의 후기 SV40 폴리아데닐화 자리의 조절하에 있는 NEO 유전자, 초기 SV40 프로모터 및 종단제로서의 초기 SV40 폴리아데닐화 자리의 조절하에 있는 쥐과동물 DHFR 유전자[Kaufmann et al., Mol. Cell. Biol. 2 (1982), 1304; Okayama et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 280, and Schimke, J. Biol. Chem. 263 (1988), 5989] 및 CMV 프로모터[Boshart et al., Cell 41 (1995) 521]함유하는, SfiI 및 BglII로 절단시킨 플라스미드 pGenak-1 내로 서브클로닝시켰다. 그 다음, DHFR 아르기닌 변이체를 코드화하는 cDNA를 함유하는 HpaI 단편을 HpaI로 절단시킨 플라스미드 p189 내로 결찰시켰으며, 이 때 플라스미드 p190이 수득되었다 (도 4d).
4.5 HSV-TK 유전자 없이 트랜스펙팅 벡터를 얻기 위해, 유전자 활성화 서열을 함유하는 플라스미드 p190의 AscI/NheI 단편인 HSV-TK 유전자를 엑손 1을 함유하는플라스미드의 AscI/NheI 단편 내로 결찰시켰다. 생성된 플라스미드를 p192로 명명하였다 (도 4e).
실시예 5 : 세포의 트랜스펙팅
바이러스 세포를 EPO의 생성을 위해 선택하고, 표적화 벡터에 의해 트랜스펙팅시켰다.
5.1 나말와 세포
세포를 T150 조직 배양병 내에서 배양시키고, 전기영동에 의해 트랜스펙팅시켰다 (1x107세포/800㎕의 전기영동 완충액 10 mM Hepes, 138 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM Na2HPO4, 6 mM D-글루코오스 1수화물 pH 7.0, 10㎍의 선형화된 DNA, 960 ㎌, 260 V 바이오래드 유전자 펄서). 전기영동 후, 세포를 RPMI 1640, 10%(v/v) 소 태아 혈청(FCS), 2 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨 중에서, 46개의 96-웰 플레이트에서 배양시켰다. 2일 후에, 세포를 10 내지 20일 동안 G-148을 함유하는 배지 1㎎/㎖ 중에서 배양시켰다. 상층액을 EPO의 생성에 대해 고체상 ELISA로 시험하였다 (실시예 4 참조). EPO 생성 클론을 24-웰 플레이트 및 T-25 조직 배양병에서 팽창시켰다. 분취량을 동결시키고, 세포를 FACS에 의해 서브클로닝시켰다 (참조 : Ventage, Becton Dickinson). 서브클론을 EPO 생성에 대해 반복적으로 시험하였다.
5.2 HT 1080 세포
HT1080 세포를 DMEM, 10%(v/v) FCS, 2 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨 중에서 배양시키는 것을 제외하고는, 조건은 나말와 세포에 대해 기술된 바와 같다. 전기영동에 의한 트랜스펙팅을 위해, 세포를 배양 용기의 벽으로부터 트립신처리시킴으로써 방출시켰다. 전기영동 후에, 1x107개의 세포를 DMEM, 10%(v/v) FCS, 2 mM L-글루타민, 1 mM 피부르산 나트륨 중에서 배양시켰다.
5.3 HeLa S3 세포
HeLaS3 세포를 RPM 1640, 10%(v/v) FCS, 2 mM L-글루타민, 1%(v/v) MEM 비필수 아미노산(Sigma) 및 1 mM 피루브산 나트륨 중에서 배양시키는 것을 제외하고는, 조건은 나말와 세포에 대해 기술된 바와 같다. 전기영동에 의한 트랜스펙팅을 위해, 세포를 배양 용기의 벽으로부터 트립신 처리시킴으로써 방출시켰다. 전기영동에 대한 조건은 960㎌/250 V이다. 전기영동 후에, 세포를 RPM 1640, 10%(v/v) FCS, 2 mM L-글루타민, 1%(v/v) MEM 및 1 mM 피루브산 나트륨 중에서, T75 조직 배양병 에서 배양시켰다. 전기영동 24시간 후에, 세포를 트립신처리하고, 10 내지 15일 동안 10개의 96-웰 플레이트 중에서 600㎍/ml의 G-418을 함유하는 배지 중에서 배양시켰다.
실시예 6 : EPO 유전자 증폭
EPO 발현을 증가시키기 위해, EPO 생성 클론을 증가 농도(100 pM - 1000 nM)의 메토트렉세이트(MTX)의 존재하에 배양시켰다. 클론을 EPO 생성에 대해 각각의 MTX 농도에서 ELISA(실시예 1.4 참조)에 의해 시험하였다. 강한 생성자를 제한된 희석에 의해 서브클로닝시켰다.
실시예 7 : EPO 생성 세포계의 특징화
세개의 상이한 세포주(나말와, HeLa S3 및 HT1080)를 EPO 유전자 활성화를 위해 선택하였다. EPO 생성 클론을 플라스미드 p179, p187, p189, p190 또는 p192에 의해 트랜스펙팅시킴으로써 수득하였다 (실시예 2 및 3 참조).
약 160,000개의 NEO 저항성 클론을 EPO 생성에 대해 시험하였으며, 이 중 12개 내지 15개는 상당한 수율로 세포 상층액 내로 반복적으로 EPO를 분비하였다.
이들 중에서 총 7개의 EPO 클론은 놀랍게도, 대량 생성을 위해 충분한 양으로 MTX,EPO에 의해 유전자 증폭 없이 생성되는 것으로 확인되었다. 이들 클론의 EPO 생성율은 200ng/ml/106개 세포/24h 내지 100ng/ml/106개 세포/24h이었다.
500 nM의 MTX에 의한 유전자 증폭 후에, 확인된 EPO 클론의 EPO 생성율은 3000ng/ml/106개 세포/24h보다 높게 증가하였다. 1000 nM까지의 MTX 농도의 추가의 증가는 생성율을 7000ng/ml/106개 세포/24h보다 높게 유도하였다.
수득된 클론은 혈청 비함유 배양 조건 및 MTX의 부재 하에 EPO 생성을 나타내었다.
Claims (15)
- 세포 내에 내인적으로 존재하는 표적 유전자를 활성화시킴으로써 사람 단백질을 제조하는데 사용되는 사람 세포계를 선택하는 방법으로서,(a) 사람 세포를 하기 특징의 존재에 대해 시험하고:(i) 원하는 핵산 서열을 갖는 표적 유전자,(ii) 현탁 배양액 중에서의 14일 내의 5배 이상의 개체수의 배증, 및(iii) 혈청 비함유 배지 중에서의 14일 내의 5배 이상의 개체수의 배증;(b) 특징 (i), (ii) 및 (iii)을 만족시키는 세포계를 표적 유전자의 내인성 활성화를 위한 출발 세포계로서 사용하는 방법.
- 제 1항에 있어서, (iv) 배지 중에서 1주일 내에 16 내지 256배의 개체수 배증의 세대 시간을 갖는, 사람 세포계가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항에 있어서, 배지 중에서 1주일 내에 64 내지 128배의 개체수 배증을 갖는, 사람 세포계가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, (v) 표적 유전자의 내인성 발현을 실질적으로 갖지 않는, 세포계가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, (vi) 2개가 넘는 표적 유전자의 염색체 복제물을 함유하는, 세포계가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, (vii) 천연 표적 단백질에 필적하는 글리코실화 패턴을 갖는 세포 단백질을 합성하는, 사람 세포계가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, (viii) 검출가능한 전염성 오염이 없는, 사람 세포계가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
- 사람 세포계 내에서 내인성 유전자 활성화에 의해 사람 단백질을 제조하는 방법으로서, 제 1항에 규정된 특징 (i), (ii) 및 (iii)을 만족시키는 세포계가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 8항에 있어서, 제 2항, 4항, 5항, 6항 및 7항 중 어느 한 항에 규정된 특징 (iv), (v), (vi), (vii) 및 (viii) 중 어느 하나 이상을 추가로 만족시키는 세포계가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, EPO, TPO, 콜로니 자극 인자, 혈액 응고에 영향을 미치는 단백질, 인터페론, 인터루킨, 케모킨, 향신경성 인자, 뼈 성장에 영향을 미치는 단백질, 헤지호그 단백질, 종양 성장 인자, 성장 호르몬, ACTH, 엔세팔린, 엔돌핀, 수용체 및 그 밖의 단백질 결합성 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 사람 인자를 제조함을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서, EPO를 제조함을 특징으로 하는 방법.
- 세포 내에 내인적으로 존재하는 표적 유전자를 활성화시킨 후에, 활성 표적 유전자에 의해 코드화되는 폴리펩티드를 수득하는데 사용되는, 제 1항 내지 11항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 확인된 사람 세포계의 용도.
- 제 12항에 있어서, 폴리펩티드를 대규모 발효기에서 수득하는데 사용됨을 특징으로 하는 용도.
- 사람 세포에서 활성인 이종성 프로모터와 작동적으로 결합되어 있는 내인성 유전자의 복제물을 함유하며, 내인성 유전자에 의해 코드화되는 폴리펩티드를 24시간 당 106개 세포 당 200ng 이상 생성시킬 수 있는 사람 세포계.
- 제 14항에 따른 세포로부터 유전자 증폭에 의해 수득될 수 있는 사람 세포계로서, 사람 세포에서 활성인 이종성 프로모터와 각각 작동적으로 결합되어 있는 내인성 유전자의 다수의 복제물을 함유하며, 내인성 유전자에 의해 코드화되는 폴리펩티드를 24시간 당 106개 세포 당 1000ng 이상 생성시킬 수 있는 사람 세포계.
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