JP2013240335A - 内因性遺伝子の活性化によるヒト蛋白質の生産のためのヒト細胞株の同定 - Google Patents
内因性遺伝子の活性化によるヒト蛋白質の生産のためのヒト細胞株の同定 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】薬学的組成物の生産に適する形態のヒト蛋白質を経済的な収量で生産するために、内因性遺伝子の活性化によってヒト蛋白質を生産するためのヒト細胞の選択方法の提供。
【解決手段】(a)ヒト細胞株を以下の特徴の存在について試験する：(i)所望の核酸配列を持つ標的遺伝子、(ii)浮遊培養で細胞数が14日以内に少なくとも5回の倍加、および(iii)無血清培地で細胞数が14日以内に少なくとも5回の倍加、ならびに(b)(i)、(ii)および(iii)の特徴を満たす細胞株を、内因性標的遺伝子の活性化の出発細胞株として使用することを特徴とする、細胞中に存在する標的遺伝子を内因性的に活性化することによるヒト蛋白質の調製のための、ヒト細胞株の選択方法。
【選択図】図３
【解決手段】(a)ヒト細胞株を以下の特徴の存在について試験する：(i)所望の核酸配列を持つ標的遺伝子、(ii)浮遊培養で細胞数が14日以内に少なくとも5回の倍加、および(iii)無血清培地で細胞数が14日以内に少なくとも5回の倍加、ならびに(b)(i)、(ii)および(iii)の特徴を満たす細胞株を、内因性標的遺伝子の活性化の出発細胞株として使用することを特徴とする、細胞中に存在する標的遺伝子を内因性的に活性化することによるヒト蛋白質の調製のための、ヒト細胞株の選択方法。
【選択図】図３
Description
本発明は、薬学的組成物の生産に適する形態のヒト蛋白質を経済的な収量で生産するために、内因性遺伝子の活性化によってヒト蛋白質を生産するためのヒト細胞の選択方法に関するものである。本発明は、このようにして同定される細胞株において、ヒト蛋白質を調製する方法にも関する。
ヒト細胞株における内因性遺伝子の活性化によるヒト蛋白質の調製は、既知である。例えば、国際公開公報第93/09222号（特許文献1）、国際公開公報第94/12650号（特許文献2）および国際公開公報第95/31560号（特許文献3）は、内因性遺伝子の活性化によるヒトの細胞株中でのエリスロポエチンおよび他のヒト蛋白質の生産を記述している。
しかし、該文献では、ヒト蛋白質の調製に使用される細胞株の選択に、特定の基準が観察されるという示唆はない。したがって、生産のために選択された細胞株中で、所望のヒト蛋白質が、所望の収量と形態で、汚染なく得られるという保証はない。したがって、上述の文書では、一般にヒト蛋白質の収量が低くなっている。
本発明の問題は、現技術水準の不都合を解消し、特に、あらかじめ決められた標的遺伝子の内因性活性化に適当なヒト出発細胞株の選択の基準を提供することであった。
この問題は、以下のような特徴を持つ、細胞株中に存在する内因性標的遺伝子の活性化によるヒト蛋白質の調製のためのヒト細胞株の選択方法によって、解決できる：
(a) ヒト細胞株の以下の特徴の存在を試験する：
(i) 所望の核酸配列を持つ標的遺伝子、
(ii) 浮遊培養において細胞数が14日以内に少なくとも5回の倍加、および
(iii) 無血清培地において細胞数が14日以内に少なくとも5回の倍加、ならびに
(b) (i)、(ii)および(iii)の特徴を持つ細胞株を、内因性標的遺伝子の活性化の出発細胞株として使用する。
(a) ヒト細胞株の以下の特徴の存在を試験する：
(i) 所望の核酸配列を持つ標的遺伝子、
(ii) 浮遊培養において細胞数が14日以内に少なくとも5回の倍加、および
(iii) 無血清培地において細胞数が14日以内に少なくとも5回の倍加、ならびに
(b) (i)、(ii)および(iii)の特徴を持つ細胞株を、内因性標的遺伝子の活性化の出発細胞株として使用する。
本発明に従い、遺伝子ターゲッティングによりヒト細胞株中のヒト標的遺伝子を活性化し、望ましい形態の標的蛋白質を十分な収量で生産できる細胞を得るという課題に取り組む場合には、後に標的蛋白質を大量生産するために適切な候補となるためにこの細胞株が所有している必要があるいくつかの特徴の存在について、いくつかの細胞株を試験することになる。非不死化細胞と比較して、培養可能性の点で重要な利点があるため、好ましくは不死化した細胞株、特に腫瘍細胞株が試験される。
特徴(i)によると、ヒト細胞株では、実際に標的遺伝子、すなわち内因性遺伝子活性化によって活性化される遺伝子が、通常は天然の標的遺伝子の核酸配列である所望の核酸配列を持つかどうかを試験する。これは、永久培養される腫瘍細胞株や他の細胞株は、しばしばそのゲノムに一連の変異を持つためである。したがって、適当な細胞株の選択の1つの重要な局面は、細胞が所望の産物のために正しい遺伝子を持つかどうかである。配列の決定は、通常の方法で細胞を培養して、標的遺伝子の配列決定をすることによって、実行できる。必要ならば、配列決定の前に、PCRまたは他の増幅方法によって、標的遺伝子の増幅を行なうことができる。
細胞の選択のもう1つの重要な特徴は、浮遊培養の可能性である。懸濁細胞は、発酵槽培養しやすく、発酵槽培養は、例えば10 l から50,000 l の容量の大型発酵槽のような大きなサイズに適合させやすい。したがって、選択された細胞は、懸濁細胞であるか、または懸濁細胞に簡単に適応するものである必要がある。このために、細胞は連続撹拌して14日間培養する。この期間の間に細胞数が少なくとも5回の倍加を示せば、細胞は浮遊培養に適すると考えられる。細胞数の倍加の回数は、例えば、細胞の計数または細胞懸濁液の光学密度の測定によって、細胞数を定期的に決定することによって、決定できる。
ヒト細胞の選択のもう1つの重要な特徴は、無血清培地での培養可能性である。無血清培養からの蛋白質の精製の方がかなり簡単で、無血清培養ではウイルスのような動物の病原体の汚染の危険がないため、選択された細胞は、無血清培地で増殖する必要がある。このために、細胞は無血清培地（例、Boehringer Mannheim社のITS添加RPMI 1650）を用いて培養器中で1 mlあたり1〜10 x 105細胞の密度で14日間培養する。この培養期間に、細胞の計数によって決定される細胞数が少なくとも5回の倍加を示せば、細胞は無血清培養に適すると考えられる。
もう1つの重要な特徴で、本発明によると好ましい特徴は、世代時間(iv)である。選択された細胞は、10%ウシ全血清添加DMEMまたは10%ウシ全血清添加RPMI 1640のような培地中で、高度に増殖する必要がある。すなわち、1週間の培養で、10〜256、好ましくは64〜128の細胞数の倍加が必要である。このために、1 mlあたり0.1〜10 x 105細胞、好ましくは0.5〜2 x 105細胞の濃度で細胞をディッシュに播き、トリプシン処理後または処理なしで、細胞チェンバーによって細胞の計測を行なう。十分に世代時間が短い細胞は、内因性遺伝子の活性化によるヒト蛋白質の大量生産に特に適している。
もう1つの好ましい特徴は、標的遺伝子の検出可能な内因性発現、すなわち転写および翻訳がないことである(v)。好ましくは、内因性遺伝子の活性化には、標的遺伝子の内因性発現が基本的に存在しない細胞株が選択される。このために、0.01〜2 x 106細胞/ml、好ましくは培地 1 mlあたり0.5〜1 x 106細胞の細胞密度で24時間、細胞を播くことができる。例えば24時間のような所定の時間後に、細胞の上清を取り出し、細胞を破棄し、例えばELISAのような既知の試験方法によって細胞上清中の標的蛋白質の含有量を決定する。EPOの場合は、検出限界は例えば10 pg/EPO/mlである。106細胞/mlの播種で蛋白質を10 pg未満しか合成しない細胞は、生産しないと見なされ、特に適している。
もう1つ別の重要で好ましい特徴は、選択される細胞中での標的遺伝子の多染色体性である(vi)。細胞中に標的遺伝子のコピーが2つよりも多ければ、相同組換えにおける収量が大幅に上昇する。7番染色体に遺伝子があるEPOの生産では、7番染色体を3対持つNamalwa (Nadkarniら、Cancer 23 (1969), 64-79)またはHeLa S3 (Puckら、J. Exp. Med. 103 (1956), 173-284)の細胞が、特に適していることが示された。7番染色体のコピー数が増加している他の細胞株の例には、結腸腺癌細胞株SW-480 (ATCC CCL-228; Leibovitzら、Cancer Res. 36 (1976), 4562-4567)、悪性メラノーマ細胞株SK-MEL-3 (ATCC HTB 69; FoghおよびTremp、「インビトロのヒト腫瘍細胞(Human Tumor Cells in vitro)」, pp115-159、J. Fogh編、Plenum Press, New York 1975)、結腸腺癌細胞Colo-320 (ATCC CCL-220; Quinnら、Cancer Res. 39 (1979), 4914-4924)、メラノーマ細胞株MEL-HO (DSM ACC 62; Holzmannら、Int. J. Cancer 41 (1988), 542-547)および腎臓癌細胞A-498 (DSM ACC 55; Giardら、J. Natl. Cancer Inst. 51 (1973), 1417-1423)がある。
細胞株のゲノム中の染色体数の確認は、特定の染色体および/または標的遺伝子の遺伝子座に特異的なDNAプローブを用いて行なうことができる。
内因性遺伝子の活性化に使用する出発細胞株のもう1つの好ましい特徴は、所望の標的蛋白質の正しくグリコシル化されていることである(vii)。好ましくは、特にシアル酸残基の数について、天然に存在する標的蛋白質に匹敵するグリコシル化パターンを持つ標的蛋白質を合成するヒト細胞株が使用される。正しいグリコシル化の存在は、好ましくは、細胞中で活性なプロモーターの制御下に所望の標的遺伝子を持つ染色体外ベクターによって、細胞を一時的にトランスフェクトすることによって、試験できる。標的遺伝子の一時的な発現後に、細胞上清および/または細胞抽出物を、等電点電気泳動によって分析する。EPOの例では、正しいグリコシル化の存在は、非常に明らかである。例えば大腸菌細胞の組換えEPOのような非グリコシル化EPOは、インビトロの実験ではグリコシル化EPOに匹敵する活性を持つ。しかし、インビボの実験では、非グリコシル化EPOは、効率がかなり低い。出発細胞株が正しいグリコシル化を持つEPOを生産できるかどうかを決定するために、尿のEPOと比較できるが、またヒトで活性なグリコシル化の型を持つことが知られており、尿のEPOとほぼ同一のグリコシル化を持つCHO細胞由来の組換えEPOと比較することもできる。グリコシル化の比較は、好ましくは等電点電気泳動によって行なう。
ヒト細胞株の選択のためのもう1つの好ましい特徴は、研究される細胞株に、例えば感染性ウイルス粒子やマイコプラズマの汚染がないことである(vii)。ウイルスの汚染の存在は、細胞培養、インビボ分析、および/または特定のウイルス蛋白質の検出によって、調べられる。
本発明は、ヒト細胞株における内因性遺伝子の活性化によるヒト蛋白質の調製方法にも関するもので、上述の(i)、(ii)および(iii)特徴を満足し、さらに上述の(iv)、(v)、(vi)および(vii)の特徴のうちの少なくとも1つも満足する細胞株を使用するという特徴を持つものである。
本発明の方法は、EPO、トロンボポエチン(TPO)、G-CSFまたはGM-CSFのようなコロニー刺激因子、tPAのような血液凝固に影響を与える蛋白質、IFN-α、IFN-βまたはIFN-γのようなインターフェロン、IL-1からIL-18のようなインターロイキン、MIPのようなケモカイン、NGFまたはBDNFのような神経栄養因子、IFG-BPのような骨成長に影響を与える蛋白質、ヘッジホッグ蛋白質、TGF-βのような腫瘍増殖因子、HGHのような成長ホルモン、ACTH、エンセファリン、エンドルフィン、可溶性および/または膜結合型のインターロイキンまたはインスリン受容体のような受容体、および他の蛋白質結合蛋白質のような、ヒトの因子の調製に特に使用される。特に好ましいのは、EPOの調製プロセスである。
内因性遺伝子の活性化自体は既知の方法によって行なうことができ、好ましくは以下の段階を含む：
(a) 所望の核酸配列を持つ内因性の標的遺伝子を少なくとも1コピー持ち、本発明
の選択基準によって標的遺伝子の発現に適すると同定されたヒト出発細胞株の調製。
(b) 以下を含むDNAコンストラクトによる、細胞のトランスフェクション：
(i) 相同組換えを可能にするために、標的遺伝子座の領域に相同な2つのDNAフランキング配列、
(ii) ポジティブ選択マーカー遺伝子、
(iii) 必要ならばネガティブ選択マーカー遺伝子、
(iv) 必要ならば増幅遺伝子、および
(v) ヒト細胞で活性な、異種発現制御配列。
(c) ポジティブ選択マーカー遺伝子の存在下と、選択的にネガティブマーカー遺伝子の非存在下で選択が起きる条件のもとでの、トランスフェクトされた細胞の培養、
(d) 段階にしたがった選択可能な細胞の分析、
(e) 所望の標的蛋白質を生産する細胞の同定、ならびに
(f) 必要ならば選択された細胞中での標的遺伝子の増幅。
(a) 所望の核酸配列を持つ内因性の標的遺伝子を少なくとも1コピー持ち、本発明
の選択基準によって標的遺伝子の発現に適すると同定されたヒト出発細胞株の調製。
(b) 以下を含むDNAコンストラクトによる、細胞のトランスフェクション：
(i) 相同組換えを可能にするために、標的遺伝子座の領域に相同な2つのDNAフランキング配列、
(ii) ポジティブ選択マーカー遺伝子、
(iii) 必要ならばネガティブ選択マーカー遺伝子、
(iv) 必要ならば増幅遺伝子、および
(v) ヒト細胞で活性な、異種発現制御配列。
(c) ポジティブ選択マーカー遺伝子の存在下と、選択的にネガティブマーカー遺伝子の非存在下で選択が起きる条件のもとでの、トランスフェクトされた細胞の培養、
(d) 段階にしたがった選択可能な細胞の分析、
(e) 所望の標的蛋白質を生産する細胞の同定、ならびに
(f) 必要ならば選択された細胞中での標的遺伝子の増幅。
所望のヒト蛋白質を生産する細胞の調製に使用するDNAコンストラクトは、標的遺伝子座の領域に相同な2つのフランキングDNA配列を含む。適切なフランキング配列は、例えば国際公開公報第90/11354号および国際公開公報第91/09955号に記載される方法によって選択される。好ましくは、フランキング配列は各々少なくとも150 bpの長さを持つ。
特に好ましくは相同DNA配列は、標的遺伝子の5'領域、例、5'非翻訳配列、シグナル配列をコードするエクソン、およびこの領域に存在するイントロンから、選択される。
ポジティブ選択マーカー遺伝子は、発現されると選択可能な表現型、例、抗生物質耐性、栄養要求性等を示す、真核細胞に適した任意の選択マーカー遺伝子であり得る。特に好ましいポジティブ選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。
選択的に、選択薬剤の存在下でそれを発現する細胞が破壊される、例えばHSVチミジンキナーゼ遺伝子のような、ネガティブ選択マーカー遺伝子も存在し得る。ネガティブ選択マーカー遺伝子は、2つのフランキング相同配列領域の外側に位置する。
ヒト細胞中で活性化される内因性標的遺伝子の増幅が望ましい場合、DNAコンストラクトには増幅遺伝子が含まれる。適切な増幅遺伝子の例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、およびオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子等がある。特に好ましい増幅遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子で、特に、野生型遺伝子よりも選択薬剤（メトトレキセート）に対する感受性が高いジヒドロ葉酸レダクターゼ-アルギニン変異（Simonsenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 2495）をコードする遺伝子である。
さらに、内因性遺伝子の活性化に使用されるDNAコンストラクトには、ヒト細胞で活性な、異種発現制御配列が含まれる。発現制御配列には、プロモーターと、好ましくは、例えばエンハンサーのような、別の発現改善配列が含まれる。プロモーターは、コントロール可能または構成性のプロモーターで良い。好ましくは、プロモーターは強力なウイルスプロモーター、例、SV40またはCMVプロモーターである。特に好ましいのは、CMVプロモーター/エンハンサーである。
さらに本発明は、活性化標的遺伝子にコードされるポリペプチドを得るため、好ましくは例えば大型発酵槽を用いた大量プロセスでポリペプチドを得るために、細胞に内在的に存在する標的遺伝子を活性化した後に、上述の方法によって同定されるヒト細胞株の使用することにも関する。
本発明のさらにもう1つの主題は、ヒト細胞中で活性な異種発現制御配列に機能的に連結した内因性遺伝子のコピーを含み、あらかじめ遺伝子増幅をしなくても、その内因性遺伝子にコードされるポリペプチドを106細胞/24時間にて少なくとも200 ng生産する能力がある、ヒト細胞である。好ましくは、本発明のヒト細胞は、106細胞/24時間にて200〜3000 ngのポリペプチドの生産能力があり、最も好ましくは106細胞/24時間にて1000〜3000 ngのポリペプチドの生産能力がある。
最後に、本発明のもう1つの主題は、上述の細胞から遺伝子増幅によって得られるヒト細胞で、各々がヒト細胞中で活性な異種発現制御配列に機能的に連結した内因性遺伝子のコピーをいくつか含み、その内因性遺伝子にコードされるポリペプチドを106細胞/24時間にて少なくとも1000 ng生産する能力のある、ヒト細胞である。特に好ましくは、遺伝子増幅によって得られるヒト細胞株は、106細胞/24時間にて1000〜25000 ngのポリペプチド、および最も好ましくは106細胞/24時間にて5000〜25000のポリペプチドを生産する能力がある。
本発明に記載される細胞の例は、EPO生産クローン「Aladin」であり、これはブダペスト条約の規定に従い、1997年7月15日に、ファイル番号DSM ACC 2320としてDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)（Mascheroder Weg 1b, 38124 Brunswick）に寄託された。
本発明は以下の実施例および図および配列によってさらに説明される。
実施例
実施例1. 選択方法
1.1 世代時間の決定
試験された細胞株は、それぞれ10% FCS添加DMEMまたは10% FSC添加RPMI 1640中に1 mlあたり0.1〜5 x 105細胞、好ましくは1 mlあたり0.5〜2 x 105細胞の濃度で培養ディッシュに播種し、例えばATCCによりその特定の細胞に推奨される培地中で、適切な条件下で培養し、細胞数は、例えばNeubauerのような計数チャンバーを用いて、トリプシン処理ありまたは処理なしで2〜3日ごとに決定した。培養後1週間以内に細胞数が16〜256に倍加した細胞、好ましくは64〜128に倍加した細胞は、陽性（＋、＋＋または＋＋＋）と評価された。
実施例1. 選択方法
1.1 世代時間の決定
試験された細胞株は、それぞれ10% FCS添加DMEMまたは10% FSC添加RPMI 1640中に1 mlあたり0.1〜5 x 105細胞、好ましくは1 mlあたり0.5〜2 x 105細胞の濃度で培養ディッシュに播種し、例えばATCCによりその特定の細胞に推奨される培地中で、適切な条件下で培養し、細胞数は、例えばNeubauerのような計数チャンバーを用いて、トリプシン処理ありまたは処理なしで2〜3日ごとに決定した。培養後1週間以内に細胞数が16〜256に倍加した細胞、好ましくは64〜128に倍加した細胞は、陽性（＋、＋＋または＋＋＋）と評価された。
1.2. 浮遊培養の可能性
浮遊培養の可能性を決定するために、細胞を対応する付属装置を装着したBelico Spinner中で、37℃および7% CO2として、培地（1.1参照、例えばウシ胎仔血清のような血清の添加ありまたはなし）中で、連続的に撹拌しながら14日間培養した。この間に少なくとも5回の倍加をした細胞は、浮遊培養に適する（＋）と評価された。
浮遊培養の可能性を決定するために、細胞を対応する付属装置を装着したBelico Spinner中で、37℃および7% CO2として、培地（1.1参照、例えばウシ胎仔血清のような血清の添加ありまたはなし）中で、連続的に撹拌しながら14日間培養した。この間に少なくとも5回の倍加をした細胞は、浮遊培養に適する（＋）と評価された。
1.3. 無血清培地での培養可能性
無血清培地での細胞の培養可能性を決定するために、細胞を1.1と同じ条件下で、ATCCによってその特定の細胞に推奨される基礎培地（すなわち血清の添加なし）およびITS（Boehringer Mannheim社、カタログ番号1074547）添加で、培養器中で1〜10 x 105細胞/mlの密度で14日間培養した。この間に少なくとも5回の倍加（細胞の計数によって決定）をした細胞は、無血清培養に適すると評価された。
無血清培地での細胞の培養可能性を決定するために、細胞を1.1と同じ条件下で、ATCCによってその特定の細胞に推奨される基礎培地（すなわち血清の添加なし）およびITS（Boehringer Mannheim社、カタログ番号1074547）添加で、培養器中で1〜10 x 105細胞/mlの密度で14日間培養した。この間に少なくとも5回の倍加（細胞の計数によって決定）をした細胞は、無血清培養に適すると評価された。
1.4. 標的遺伝子の内因性発現の決定
標的蛋白質が選択された細胞株中で内在的に生産されるかどうかを決定するために、細胞を0.01〜2 x 106細胞/ml培地、好ましくは0.5〜1 x 106細胞/mlの密度で24時間まいた。24時間後に細胞上清を取り出し、細胞を破棄し、例えば特定の蛋白質に特異的な免疫アッセイのような既知の試験方法によって、細胞上清中の細胞蛋白質の含有量を決定した。
標的蛋白質が選択された細胞株中で内在的に生産されるかどうかを決定するために、細胞を0.01〜2 x 106細胞/ml培地、好ましくは0.5〜1 x 106細胞/mlの密度で24時間まいた。24時間後に細胞上清を取り出し、細胞を破棄し、例えば特定の蛋白質に特異的な免疫アッセイのような既知の試験方法によって、細胞上清中の細胞蛋白質の含有量を決定した。
EPOの場合、含有量はELISAによって決定された。このためにストレプトアビジンでコートしたマイクロタイタープレートをビオチン化抗EPO抗体（Boehringer Mannheim）でコートし、蛋白質を含む溶液（1% w/v）とインキュベートして非特異的結合をブロックした。その後、培養上清0.1 mlを添加し、一晩インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ結合抗EPOモノクローナル抗体（Boehringer Mannheim）を2時間添加した。ペルオキシダーゼ反応は基質としてABTS（登録商標）を用いてPerkin-Elmerフォトメーターで405 nmで測定した。
この試験におけるEPOの検出限界は10 pg EPO/mlだった。106細胞/mlの播種で10 pg EPO/ml未満しか生産しない細胞は、非生産であり、適する（＋）と評価された。
1.5. 標的遺伝子のコピー数の決定
細胞株中の標的遺伝子のコピー数を決定するため、約108細胞からヒトゲノムDNAを単離し、定量した（Sambrookら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press）。それぞれ例えばAgeIおよびAscIまたはBamHI、HindIIIおよびSalIのような制限酵素でDNAを切断した後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片をサイズによって分別し、最後にナイロンメンブレンに移して固定した。
細胞株中の標的遺伝子のコピー数を決定するため、約108細胞からヒトゲノムDNAを単離し、定量した（Sambrookら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press）。それぞれ例えばAgeIおよびAscIまたはBamHI、HindIIIおよびSalIのような制限酵素でDNAを切断した後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片をサイズによって分別し、最後にナイロンメンブレンに移して固定した。
固定したDNAに、標的遺伝子座または標的遺伝子が存在する染色体に特異的なジゴキシゲニン標識DNAプローブをハイブリダイズさせ、厳密な条件下で洗浄した。特異的なハイブリダイゼーションシグナルは、感光性フィルムを用いて化学ルミネセンスを用いて検出した。
1.6. 標的遺伝子の核酸配列の決定
ゲノムDNAは、DNA単離キット（例、QIAGEN血液および細胞培養DNAキット）を用いて約107細胞から単離された。
ゲノムDNAは、DNA単離キット（例、QIAGEN血液および細胞培養DNAキット）を用いて約107細胞から単離された。
標的遺伝子の増幅には、1対のPCRプライマーが使用された。プライマーの配列は、標的遺伝子のコード領域に隣接する配列に相補的だった。したがって、標的遺伝子のコード領域全体を増幅することができた。
PCR産物は、直接に配列分析を行なうか、ベクターにクローニングしてから配列決定をした。標的遺伝子のイントロン領域の配列に相補的な配列を持つシーケンシングプライマーを使用し、標的遺伝子のエクソン領域の配列が完全に得られるようにした。配列決定は、例えば「プリズム・レディ・リアクション・ダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンス（Prism（登録商標） Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing）」キット（PE/ABI、米国フォレストシティ）を用いて、製造元の指示にしたがって、PE/ABI自動シーケンサーで行なった。
1.7. グリコシル化パターンの決定
EPOのグリコシル化パターンを決定するために、試験する細胞株に、ヒトEPO遺伝子配列の4 kbのHindIII/EcoRI断片をSV40プロモーターの制御下に含むプラスミドpEPO227をトランスフェクトした（Jacobsら、Nature 313 (1985), 806; Lee-Huangら、Gene 128 (1993), 272）。細胞は、市販の試薬キットを用いて、製造元の指示に従って、リポフェクタミンの存在下でトランスフェクトした。2〜5日後に得られた細胞上清のEPO含有量をELISAで決定した。
EPOのグリコシル化パターンを決定するために、試験する細胞株に、ヒトEPO遺伝子配列の4 kbのHindIII/EcoRI断片をSV40プロモーターの制御下に含むプラスミドpEPO227をトランスフェクトした（Jacobsら、Nature 313 (1985), 806; Lee-Huangら、Gene 128 (1993), 272）。細胞は、市販の試薬キットを用いて、製造元の指示に従って、リポフェクタミンの存在下でトランスフェクトした。2〜5日後に得られた細胞上清のEPO含有量をELISAで決定した。
細胞上清を濃縮し、等電点電気泳動法によって既知のEPO産物と比較した（Righetti, P.G., 「等電点電気泳動：理論、方法および応用(Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications)」Work, T.S., Burdon, R.H.編、Elsevier Biomedical Press, Amsterdam (1983)）。尿EPOのような既知のEPO産物に匹敵するグリコシル化を示したヒト細胞は、適する（＋）と評価された。
1.8. ウイルス汚染の決定
1.8.1. 細胞培養による分析
試験するヒト細胞株の感染性ウイルス汚染を検出するため、細胞溶解物を、細胞変性効果を検出するために検出細胞株とインキュベートした。さらに、血球吸着分析も行なった。
1.8.1. 細胞培養による分析
試験するヒト細胞株の感染性ウイルス汚染を検出するため、細胞溶解物を、細胞変性効果を検出するために検出細胞株とインキュベートした。さらに、血球吸着分析も行なった。
溶解物を調製するために、1 mlの緩衝液に106細胞を入れた懸濁液を、急速な凍結融解によって溶解させた。細胞残渣を遠心によって分離し、上清を検出細胞株に加えた。使用した検出細胞株はHepG2 (ATCC HB-8065; Nature 282 (1979), 615-616)、MRC-5 (ATCC-1587)およびVero (ATCC CCL-171; Jacobs, Nature 227 (1970), 168-170)だった。ポリオSVおよびインフルエンザタイプのウイルスが、陽性対照として使用された。陰性対照は、溶解物なしで培養した検出細胞株だった。細胞変性効果を検出するために、検出細胞株は少なくとも14日間、定期的に調べた。
血球吸着分析のためには、細胞溶解物および対照とインキュベートされていたVero細胞を、7日後にニワトリ、ブタ、ヒトの赤血球で処理した。培養細胞の単層に赤血球が接着すれば、培養物にウイルス汚染があることを示す。
1.8.2. インビボ分析
試験する細胞株の溶解物を1.8.1.のようにして調製し、0.1 mlを新生マウスの腹腔内または大脳半球間に注射した。14日間にわたり、マウスの罹患率と死亡率を観察した。
試験する細胞株の溶解物を1.8.1.のようにして調製し、0.1 mlを新生マウスの腹腔内または大脳半球間に注射した。14日間にわたり、マウスの罹患率と死亡率を観察した。
1.8.3. ウイルス蛋白質の特異的検出
エプスタイン・バーウイルス蛋白質（核蛋白質またはキャプシド抗原）のような特定のウイルス蛋白質の存在は、EBV陽性バンドのヒト血清を、試験する細胞株の固定化細胞に与えて試験した。その後、補体および対応する抗ヒト補体C3フルオレセイン結合体（核抗原の検出用）および抗ヒトグロブリンフルオレセイン（キャプシド抗原の検出用）を投与して、ウイルス抗原の検出を行なった。
エプスタイン・バーウイルス蛋白質（核蛋白質またはキャプシド抗原）のような特定のウイルス蛋白質の存在は、EBV陽性バンドのヒト血清を、試験する細胞株の固定化細胞に与えて試験した。その後、補体および対応する抗ヒト補体C3フルオレセイン結合体（核抗原の検出用）および抗ヒトグロブリンフルオレセイン（キャプシド抗原の検出用）を投与して、ウイルス抗原の検出を行なった。
実施例2. 選択結果
第1項に述べた方法によって、ヒト細胞株HepG2、HT1080、Namalwa、HeLaおよびHeLaS3が試験された。結果は以下の表1に示されている。
第1項に述べた方法によって、ヒト細胞株HepG2、HT1080、Namalwa、HeLaおよびHeLaS3が試験された。結果は以下の表1に示されている。
表1から、細胞株HT1080、NamalwaおよびHeLaS3は、EPOの内因性遺伝子活性化に適すると考えられることが分かる。NamalwaおよびHeLaS3は特に適している。
実施例3. EPO相同性領域のクローニング
EPO遺伝子の相同性領域は、胎盤のゲノムDNA（Boehringer Mannheim）を用いてPCRによって、増幅された。EPO遺伝子の5'非翻訳配列、エクソン1およびイントロン1の領域からの長さ6.3 kbの相同性領域から、2つのPCR産物が調製された（図1）。PCR産物1の作製に使用されたプライマーは、以下の配列を持っていた：5'-CGC GGC GGA TCC CAG GGA GCT GGG TTG ACC GG-3'（配列番号：1）および5'-GGC CGC GAA TTC TCC GCG CCT GGC CGG GGT CCC TCA GC-3'（配列番号：2）。PCR産物2の調製に使用されたプライマーは、以下の配列を持っていた：5'-CGC GGC GGA TCC TCT CCT CCC TCC CAA GCT GCA ATC-3'（配列番号：3）および5'-GGC CGC GAA TTC TAG AAC AGA TAG CCA GGC TGA GAG-3'（配列番号：4）。
EPO遺伝子の相同性領域は、胎盤のゲノムDNA（Boehringer Mannheim）を用いてPCRによって、増幅された。EPO遺伝子の5'非翻訳配列、エクソン1およびイントロン1の領域からの長さ6.3 kbの相同性領域から、2つのPCR産物が調製された（図1）。PCR産物1の作製に使用されたプライマーは、以下の配列を持っていた：5'-CGC GGC GGA TCC CAG GGA GCT GGG TTG ACC GG-3'（配列番号：1）および5'-GGC CGC GAA TTC TCC GCG CCT GGC CGG GGT CCC TCA GC-3'（配列番号：2）。PCR産物2の調製に使用されたプライマーは、以下の配列を持っていた：5'-CGC GGC GGA TCC TCT CCT CCC TCC CAA GCT GCA ATC-3'（配列番号：3）および5'-GGC CGC GAA TTC TAG AAC AGA TAG CCA GGC TGA GAG-3'（配列番号：4）。
望ましい部分は、制限切断（PCR産物1：HindIII、PCR産物2：HindIIIおよびEcoRV）によってPCR産物1および2から切り出し、HindIIIおよびEcoRVで切断されたベクターpCRII (Invitrogen) にクローニングした。このようにして得られた組換えベクターは、5epopcr1000と呼ばれた（図2参照）。
実施例4. EPO遺伝子ターゲッティングベクターの作製
4.1. NEO遺伝子、DHFR遺伝子およびCMVプロモーター/エンハンサーを含む遺伝子活性化配列（図3参照）が、EPO相同性領域を含むプラスミド5epocr1000のAgeI部位に挿入され、プラスミドp176が得られた（図4a参照）。CMVプロモーターをEPO遺伝子の翻訳出発部位にできるだけ近付けるために、制限部位AscIおよびAgeIの間の長さ963 bpの部分が除去され（部分切断）、プラスミドp179が得られた（図4b）。
4.1. NEO遺伝子、DHFR遺伝子およびCMVプロモーター/エンハンサーを含む遺伝子活性化配列（図3参照）が、EPO相同性領域を含むプラスミド5epocr1000のAgeI部位に挿入され、プラスミドp176が得られた（図4a参照）。CMVプロモーターをEPO遺伝子の翻訳出発部位にできるだけ近付けるために、制限部位AscIおよびAgeIの間の長さ963 bpの部分が除去され（部分切断）、プラスミドp179が得られた（図4b）。
4.2. 発現を最適化するために、EPOリーダー配列の出発Met-Gly-Val-Hisをコードするエクソン1のヌクレオチドが、合成配列Met-Ser-Ala-Hisによって置換された。この配列は、例えばSV40の制御下にヒトEPO遺伝子配列（Jacobsら、Nature 313 (1985), 806、およびLee-Huangら、Gene 128 (1993), 227）の3.5 kbのBstEII/EcoRI断片（エクソン1〜5を含む）を含むプラスミドpEPO148のようなゲノムEPO DNA配列を鋳型として、対応するプライマーを用いて、増幅して得られた。このようにして、プラスミドp187が得られた（図4b）。
4.3. プラスミドp189は、Psvtk-1 (PvuII/NarI断片)から得られた単純ヘルペスウ
イルスチミジンキナーゼ遺伝子（HSV-TK）を、プラスミド-187に挿入して、調製された（図４c）。HSV-TK遺伝子は、CMVプロモーターに対して逆方向で、イントロン１（EcoRV/ClaI）の3'末端にあるSV40プロモーターの制御下にあり、相同組換えのネガティブ選択になるはずである。
イルスチミジンキナーゼ遺伝子（HSV-TK）を、プラスミド-187に挿入して、調製された（図４c）。HSV-TK遺伝子は、CMVプロモーターに対して逆方向で、イントロン１（EcoRV/ClaI）の3'末端にあるSV40プロモーターの制御下にあり、相同組換えのネガティブ選択になるはずである。
4.4. プラスミドp190の作製のために、Simonsenら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 2495）に記述されたDHFRのアルギニン変異のcDNAを含むプラスミドpHEAVYのSfiI/BglII断片が、SfiIおよびBglIIで切断されたプラスミドpGenak-1にサブクローニングされた。pGenak-1は、RSVプロモーターおよびターミネーターとしてSV40後期ポリアデニル化部位の制御下にあるNEO遺伝子、SV40初期プロモーターおよびターミネーターとしてSV40初期ポリアデニル化部位の制御下にあるマウスDHFR遺伝子（Kaufmannら、Mol. Cell. Bio.. 2 (1982), 1304；Okayamaら、Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 280、およびSchimke, J. Biol. Chem. 263 (1988), 5989）、およびCMVプロモーター（Boshartら、Cell 41(1995) 521）を含む。その後、DHFRアルギニン変異をコードするcDNAを含むHpaI断片が、HpaIで切断されたプラスミドp189に連結され、プラスミドp190が得られた（図4d）。
4.5. HSV-TK遺伝子を持たないトランスフェクションベクターを得るために、遺伝子活性化配列を含むプラスミドp190のAscI/NheI断片が、エクソン1を含むプラスミドp187のAscI/NheI断片に連結された。得られたプラスミドはp192と命名された（図4e）。
実施例5. 細胞のトランスフェクション
EPOの生産のために種々の細胞株が選択され、ターゲッティングベクターでトランスフェクトされた。
EPOの生産のために種々の細胞株が選択され、ターゲッティングベクターでトランスフェクトされた。
5.1. Namalwa細胞
細胞はT150組織培養ボトル中で増殖させ、エレクトロポレーション（1 x 107細胞/800μlエレクトロポレーション緩衝液20 mM Hepes、138 mM NaCl、5 mM KCl、0.7 mM Na2HPO4、6 mM D-グルコース1水和物pH 7.0、10μg線状DNA、960μF、260 V BioRad Gene Pulser）によってトランスフェクトした。エレクトロポレーション後、RPMI 1640、10% (v/v)ウシ胎仔血清（FCS）、2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム中で、40枚の96ウェルプレート中で細胞を培養した。2日後に、G-418を含む培地1 mg/ml中で細胞を10〜20日間培養した。上清は、固相ELISAによってEPOの生産を試験した（実施例1.4参照）。EPOを生産するクローンは24ウェルプレートおよびT-25組織培養ボトルで増殖させた。一部を凍結し、細胞はFACSによってサブクローニングされた（Ventage、Becton Dickinson）。サブクローンは、EPO生産について試験を繰り返した。
細胞はT150組織培養ボトル中で増殖させ、エレクトロポレーション（1 x 107細胞/800μlエレクトロポレーション緩衝液20 mM Hepes、138 mM NaCl、5 mM KCl、0.7 mM Na2HPO4、6 mM D-グルコース1水和物pH 7.0、10μg線状DNA、960μF、260 V BioRad Gene Pulser）によってトランスフェクトした。エレクトロポレーション後、RPMI 1640、10% (v/v)ウシ胎仔血清（FCS）、2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム中で、40枚の96ウェルプレート中で細胞を培養した。2日後に、G-418を含む培地1 mg/ml中で細胞を10〜20日間培養した。上清は、固相ELISAによってEPOの生産を試験した（実施例1.4参照）。EPOを生産するクローンは24ウェルプレートおよびT-25組織培養ボトルで増殖させた。一部を凍結し、細胞はFACSによってサブクローニングされた（Ventage、Becton Dickinson）。サブクローンは、EPO生産について試験を繰り返した。
5.2. HT 1080細胞
HT 1080細胞はDMEM、10% (v/v) FCS、2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム中で培養されたという以外は、条件はNamalwa細胞で記述されたとおりである。エレクトロポレーションによるトランスフェクションのために、細胞をトリプシン処理によって培養器の壁からはがした。エレクトロポレーション後、1 x 107細胞は、5枚の96ウェルプレート上で、DMEM、10% (v/v) FCS、2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム中で培養された。
HT 1080細胞はDMEM、10% (v/v) FCS、2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム中で培養されたという以外は、条件はNamalwa細胞で記述されたとおりである。エレクトロポレーションによるトランスフェクションのために、細胞をトリプシン処理によって培養器の壁からはがした。エレクトロポレーション後、1 x 107細胞は、5枚の96ウェルプレート上で、DMEM、10% (v/v) FCS、2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム中で培養された。
5.3. HeLa S3細胞
HeLaS3細胞はRPMI 1640、10% (v/v) FCS、2 mM L-グルタミン、1% (v/v) NEM非必須アミノ酸（Sigma社）、および1 mMピルビン酸ナトリウム中で培養されたという以外は、条件はNamalwa細胞で記述されたとおりである。エレクトロポレーションによるトランスフェクションのために、細胞をトリプシン処理によって培養器の壁からはがした。エレクトロポレーションの条件は960μF/250 Vだった。エレクトロポレーション後、細胞は、RPMI 1640、10% (v/v) FCS、2 mM L-グルタミン、1% (v/v) NEM、および1 mMピルビン酸ナトリウム中で、T75組織培養ボトルで培養された。エレクトロポレーションの24時間後、細胞をトリプシン処理して、10枚の96ウェルプレート上で、600μg/mlのG-418を含む培地中で10〜15日培養した。
HeLaS3細胞はRPMI 1640、10% (v/v) FCS、2 mM L-グルタミン、1% (v/v) NEM非必須アミノ酸（Sigma社）、および1 mMピルビン酸ナトリウム中で培養されたという以外は、条件はNamalwa細胞で記述されたとおりである。エレクトロポレーションによるトランスフェクションのために、細胞をトリプシン処理によって培養器の壁からはがした。エレクトロポレーションの条件は960μF/250 Vだった。エレクトロポレーション後、細胞は、RPMI 1640、10% (v/v) FCS、2 mM L-グルタミン、1% (v/v) NEM、および1 mMピルビン酸ナトリウム中で、T75組織培養ボトルで培養された。エレクトロポレーションの24時間後、細胞をトリプシン処理して、10枚の96ウェルプレート上で、600μg/mlのG-418を含む培地中で10〜15日培養した。
実施例6. EPO遺伝子増幅
EPO発現を増加させるために、EPO生産クローンは、メトトレキセート（MTX）の濃度を上昇させながら（100 pM〜100 nM）、培養した。各MTX濃度で、クローンのEPO生産はELISAによって確認された（実施例1.4参照）。強い生産細胞は、限界希釈によってサブクローニングした。
EPO発現を増加させるために、EPO生産クローンは、メトトレキセート（MTX）の濃度を上昇させながら（100 pM〜100 nM）、培養した。各MTX濃度で、クローンのEPO生産はELISAによって確認された（実施例1.4参照）。強い生産細胞は、限界希釈によってサブクローニングした。
実施例7. EPO生産細胞株の解析
EPO遺伝子の活性化には、3つの細胞株（Namalwa、HeLa S3、およびHT 1080）が選択された。EPO生産クローンは、プラスミドp179、p187、p189、p190またはp192のトランスフェクションによって得られた（実施例2および3参照）。
EPO遺伝子の活性化には、3つの細胞株（Namalwa、HeLa S3、およびHT 1080）が選択された。EPO生産クローンは、プラスミドp179、p187、p189、p190またはp192のトランスフェクションによって得られた（実施例2および3参照）。
約160,000のNEO耐性クローンのEPO生産が試験され、そのうち12から15が細胞上清にかなりの収量でEPOを繰り返し分泌していた。
これらのうち、7つのEPOクローンが、驚くべきことにMTXによる遺伝子増幅なしに同定され、大量の産業用生産に十分な量のEPOを生産していた。これらのクローンのEPO生産は、24時間で106細胞あたり、200 ng/mlから1000 ng/ml以上までの範囲だった。
500 nMのMTXによる遺伝子増幅後、同定されたEPOクローンのEPO生産は、24時間で106細胞あたり3000 ng/ml以上に増加した。MTX濃度を1000 nMまでさらに増加させると、生産は24時間で106細胞あたり7000 ng/ml以上に増加した。
得られたクローンは、無血清培養条件およびMTXの非存在下でも、EPO生産を示した。
[配列番号：1および配列番号：2]
PCR産物1の作製に使用したプライマーのヌクレオチド配列（図1）。
[配列番号：3および配列番号：4]
PCR産物2の作製に使用したプライマーの配列（図1）。
PCR産物1の作製に使用したプライマーのヌクレオチド配列（図1）。
[配列番号：3および配列番号：4]
PCR産物2の作製に使用したプライマーの配列（図1）。
Claims (15)
- (a) ヒト細胞株を以下の特徴の存在について試験する：
(i) 所望の核酸配列を持つ標的遺伝子、
(ii) 浮遊培養で細胞数が14日以内に少なくとも5回の倍加、および
(iii) 無血清培地で細胞数が14日以内に少なくとも5回の倍加、ならびに
(b) (i)、(ii)および(iii)の特徴を満たす細胞株を、内因性標的遺伝子の活性化の出発細胞株として使用する
ことを特徴とする、細胞中に存在する標的遺伝子を内因性的に活性化することによるヒト蛋白質の調製のための、ヒト細胞株の選択方法。 - (iv) 培地中で1週間に16から256の細胞数の倍加をするような世代時間を有するヒト細胞株を用いることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 培地中で1週間に64から128の細胞数の倍加をするヒト細胞株を用いることを特徴とする、請求項2記載の方法。
- (v) 標的遺伝子の内因性発現が実質的にないヒト細胞株を用いることを特徴とする、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- (vi) 標的遺伝子の染色体上のコピー数が2を超えるヒト細胞株を用いることを特徴とする、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- (vii) 天然に存在する標的蛋白質に匹敵するグリコシル化パターンを持つ細胞蛋白質を合成するヒト細胞株を用いることを特徴とする、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- (viii) 検出可能な感染性汚染を持たないヒト細胞株を用いることを特徴とする、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1で定義された特徴(i)、(ii)および(iii)を満たす細胞株を用いることを特徴とする、ヒト細胞株中の内因性遺伝子活性化によるヒト蛋白質の調製方法。
- 請求項2、4、5、6および7のいずれか一項に定義される特徴(iv)、(v)、(vi)、(vii)および(viii)の少なくとも1つをさらに満たす細胞株を用いることを特徴とする、請求項8記載の方法。
- EPO、TPO、コロニー刺激因子、血液凝固に影響を与える蛋白質、インターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、神経栄養因子、骨成長に影響を与える蛋白質、ヘッジホッグ蛋白質、腫瘍増殖因子、成長ホルモン、ACTH、エンセファリン、エンドルフィン、受容体、および他の蛋白質結合蛋白質から選択されるヒトの因子の調製のための、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- EPOの調製のための、請求項10記載の方法。
- 活性化標的遺伝子にコードされるポリペプチドを得るために、細胞中に内因性的に存在する標的遺伝子の活性化の後における、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法によって同定されるヒト細胞株の使用。
- 大型発酵槽中でポリペプチドを得るための、請求項12記載の使用。
- ヒト細胞で活性な異種プロモーターに機能的に連結した内因性遺伝子を1コピー含み、内因性遺伝子にコードされるポリペプチドを、106細胞/24時間にて少なくとも200 ng生産する能力を持つことを特徴とするヒト細胞株。
- ヒト細胞中で活性な異種プロモーターにそれぞれが機能的に連結した内因性遺伝子を数コピー含み、内因性遺伝子にコードされるポリペプチドを、106細胞/24時間にて少なくとも1000 ng生産する能力を持つことを特徴とする、請求項14記載の細胞の遺伝子増幅によって得られるヒト細胞株。
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