JPH0372883A - 肝実質細胞増殖因子及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、遺伝子組換えによって得られた肝実質細胞増
殖因子及びそれをコードする遺伝子に関する。

（従来の技術） 肝臓は、生体中で最も高度に分化の進んだ最大の器官で
ある。これは主に各種栄養素（糖質、タンパク質、脂質
、ビタミン、ホルモン等）の処理（代ＴＭ）、貯蔵、解
毒、分解、排せつ等の重要な多種の機能を兼ね備えてお
り、なかでも生体内中間代謝の中心的な役割を果たすこ
とが知られている。これらの機能を担っている肝実質細
胞は生体内において各種のホルモンによる側御下に置か
れ、ある場合にはきわめて旺盛な増殖を示す。例えば、
ラットの肝臓のほぼ２／３を切除しても、約１０日後に
は元の大きさに戻ることが知られており、ヒトでも肝癌
患者等において、部分肝切除とその後の再生による治癲
法が行われている。肝実質細胞の増殖による肝再生の機
構については従来より数多くの研究が行われ、肝実質細
胞増殖因子の存在が報告されてきた。とりわけ、本発明
者らの一部は、ヒト劇症肝炎患者血漿中には、肝実質細
胞増殖活性が極めて高いことを見いだしく　Ｂｉｏｍｅ
ｄ、　Ｒｅｓ、。

６、２３１　（１９８５）及びεｘｐ、ｃｅ１１．［！
ｅｓ、　１６６、　１３９（１９８６））、その活性を
有する因子を世界で初めて単一のタンパク質として精製
することに成功した（特開昭６３−２２５２６号公報及
びＪ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、８１．４１４（１９
８８））。

このヒト肝細胞増殖因子（以下ｒｈＨＧＦＪと略す）は
非還元条件下の５ＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量が約
７６０００−９２０００であり、還元条件下の５ＤＳ−
ＰＡＧＥでは分子量５６０００−６５０００及び３２０
００−３５０００の２つのバンドに分かれた。中村らは
、ラット血小板由来の同様な活性を有する因子を報告し
ており（Ｂ　１ｏｃｈｅｉ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ｒ
ｅＳ、　Ｃｏｎｍｕｎ、１２２．１４５０（１９８４）
）、　　５ＤＳ−ＰＡＧＥ＆こ　よ　リ、その推定分子
量は約２７０００であるとしていたが（Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃ　ｔ、　ＵＳＡ、　８３．６
４８９　（１９８６）　）、その後、単一のタンパク質
として精製し、分子量６９０００と３４０００との２つ
のポリペプチドからなる分子量８２０００のタンパク質
であると報告された（ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２
２４，３１１（１９Ｂ？））。これらｈＨＧＦ及びラッ
トＨＧＦ以外には単一のタンパク質として精製された肝
細胞増殖因子は今までに報告されていないし、ｈＨＧＦ
及びラットＨＧＦに関しても、その−次構造及び該当す
るｃ　ＤＮＡの塩基配列については、なんの報告もなさ
れていない。

（発明の解決すべき問題点） ｈＨＧＦの生体における詳細な機能あるいは肝障害時に
おける肝再生に対する効果等を生体外で調べるには、多
量のｈＨＧＰを必要とするが、劇症肝炎患者血漿から多
量のｈＥ（ＯＦを精製することは人的、時間的、経費的
に必ずしも容易ではなく、また感染源の存在する血漿中
からｈＨＯＰのみを安定に取り出すことは困難を極める
。かかる理由からｈＨＧＦの劇症肝炎患者血漿からの安
定かつ大量の精製は行われていなかった。

（問題点を解決するための手段） そこで、本発明者らは、ｈＨＧＦを組換えＤＮＡ技術に
より大量に取得するべく種々検討した結果、かかる目的
に有用なｈＨＧＦをコードする遺伝子を初めてクローニ
ングすることに成功し、本発明を完成するに至った。す
なわち、本発明の要旨は、第１図に示すアミノ酸配列で
表される、シグナル配列を含むｈ　ＨＧ　Ｆ、　　第１
図に示すアミノ酸配列のうち３０番目のグルタミン酸残
基（Ｇ　１　ｕ）から最後のセリン残基（Ｓｅｒ）まで
の配列で表されるｈ　ＨＧ　Ｆ、　　第１図に示すアミ
ノ酸配列のうち３２番目のグルタミンＣＧｉｎ）から最
後のセリン残基（Ｓｅｒ）までの配列で表されるｈ　Ｈ
Ｇ　Ｆ、　　該アミノ酸配列で表される各ｈＨＧＦをコ
ードする遺伝子、第２図に示す塩基配列で表される、シ
グナル配列を含むｈＨＧＦをコードする遺伝子、第２図
に示す塩基配列のうち８８番目のＧからｉ　ｆ＆のＧま
での配列で表される遺伝子及び第２図に示す塩基配列の
うち９４番目のＣから最後のＧまでの配列で表される遺
伝子に存する。

以下に本発明を説明するに、本発明のｈＨＧＦをコード
する遺伝子（ｃＤＮＡ）は例えば第２図に示すような塩
基配列を有する。なお、塩基配列は他の相補的な塩基配
列を省略し１本鎖のみを記載した。この遺伝子より組換
えＤＮＡ技術により例えば第１図に示すアミノ酸配列を
宥するｈＨＧＦを発現させることができる。この時、ｈ
ＨＧＦをコードするｍ　ＲＮ　Ａから翻訳される蛋白は
シグナル配列を含んでいるが、細胞から分泌される場合
にはシグナル配列が切断され、３０番目のグルタミン酸
残基（Ｇｌｕ）または３２番目のグルタミン残基（Ｇｉ
ｎ）以後のアミノ酸配列を有するｈＨＧＦが産生される
。

シグナル配列として、他の蛋白のシグナル配列を利用す
る事もできる。また、宿主細胞内にシグナル配列のない
成熟ｈＨＧＦを発現させる場合は、ｈＨＧＦをコードす
る遺伝子として第２図に示す塩基配列のうち８８番目の
Ｇまたは９４番目のＣから以後の塩基配列を有する遺伝
子を、ベクターのＡＴＧコドンにつなげて使用すればよ
い。さらに、本発明においては、肝実質細胞増殖促進活
性を損なわない範囲内で、一部のアミノ酸または核酸を
除去、変更あるいは追加する等の改変を行ったものも本
発明に含まれる。

本発明のｈＨＧＦをコードする遺伝子のＤＮＡ断片は例
えば次の様な方法によって得られる。

劇症肝炎患者血漿より、例えばＪ、Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖ
ｅｓｔ。

８１．４１４（１９８８）に記載された方法によって精
製されたｈＨＧＦは、還元条件下では、ジスルフィド結
合が切断されて２本のポリペプチドに分かれる。分子量
５６０００−６５０００のポリペプチドをＨ１１１１、
分子量３２０００−３５０００のポリペプチドをＬ鎖と
する。

ｈＨＧＦを還元処理し生成したシスティン残基のチオー
ル基をカルボキシメチル化したのち、逆相高速液体クロ
マトグラフィーでＨ鎖とＬ鎖を分離するか、あるいはｈ
ＨＧＦを還元条件下で電気泳動し、そのゲルからＨ鎖、
Ｌ＃１４のそれぞれを抽出したのち、例えばアプライド
・バイオシステムズ社製気相プロティンシーケンサ−で
分析することにより、画調のアミノ末端アミノ酸配列を
調べることがてきる。さらに、ｈＨＯＦ自体を、または
Ｈ鎖、Ｌ鎖分離後に、適切な蛋白分解酵素例えばアクロ
モバクタープロテアーゼエ（リジルエンドペプチダーゼ
）で分解し、生成するペプチド断片を例えば逆相高速液
体クロマトグラフィーで分離したのち、各ペプチドを上
記と同様にしてアミノ酸配列分析すればポリペプチド内
部のアミノ酸配列を知ることができる。これらのアミノ
酸配列からＤＮＡ塩基配列を推定しオリゴヌクレオチド
を作成しやすい配列を選定して、そのオリゴヌクレオチ
ド、例えば、後述の実施例に示すようなオリゴヌクレオ
チドを合成してプローブとして使用する。

ｈＨＧＦをコードする遺伝子をスクリーニングするｃ　
ＤＮＡライブラリーとしては、人由来の肝臓ｃ　ＤＮＡ
ライブラリー　肺臓ｃＤＮＡライ　。

ブラリー　胎盤ｃＤＮＡライブラリー　等が利用できる
。これらのライブラリーはクローンチック社より販売さ
れている。特に胎盤ｃ　ＤＮＡライブラリーが望ましい
。その他ｈＨＧＦを発現している細胞株、及び組織材料
から常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを作成してもよ
い。

このようなｃＤＮＡが組み込まれたλファージをＭａｎ
ｉａｔｉｓらの方法（「モレキュラークローニング」、
コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−５６頁−７３
頁（１９８２））により大腸菌に感染させ培養する。形
成されたプラークをｈＨＧＦの一部のアミノ酸配列から
推定される塩基配列から作成したオリゴヌクレオチドを
プローブとしてプラークハイブリダイゼーション法（「
モレキュラークローニング」、コールドスプリングハー
バ−ラボラトリ−３２０頁−３２８頁（１９８２））に
従って選択することにより、容易に目的とするｈＨＧＦ
の７案ノ酸配列の一部と同じアミノ酸配列を有しなおか
つｈＨＧＦのアミノ酸配列のプローブ以外の領域に相当
する塩基配列をも有する、異なるλフアージクローンを
いくつか得ることができる。

さらに上記スクリーニング陽性のプラークからＭａｎｉ
ａｔｉｓらの方法（「モレキュラークローニング」、コ
ールドスプリングハーバ−ラボラトリ７６頁−７９頁（
１９８２））によりファージを増殖させ、そのものから
グリセロールグラヂエント法にしたがってＤＮＡｔ／Ｉ
ｕ製し適切な制限酵素例えばＥｃ　ｏＲＩ等で切断後、
ｐＵＣＬ８．ｐＵ０１９等のプラス且ドベクターあるい
はＭ１３ｍｐ１８．Ｍ１３ｍｐ１９などの一重鎖ファー
ジベクターにｃ　ＤＮＡをサブクロニングし、Ｓａｎｇ
ｅｒらのジデオキシ法（プロシーデインゲス・オブ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニー・ニス
・ニー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υ、
Ｓ、Ａ、）　　ｌ　５　４　（３３（１９７７））に従
って目的ｃＤＮＡセグメントの塩基配列を決定すること
ができる。得られたクローンの塩基配列を解析しそれら
を統合することにより（第３図）ｈＨＧＰの一部をコー
ドするｃＤＮＡクローン群によって、第１図に示すｈＨ
ＯＦの全アミノ酸配列の全てに対応する遺伝子を得るこ
とができる。かくして得られるｃ　ＤＮＡの発現は、例
えば、該ＤＮＡ群をその塩基配列の順番がｈＨＧＦのア
ミノ酸配列に従う形でつないでそれらｈＨＧＦの全領域
を含むＤＮＡ断片としこれをｐＣＤＬ−３Ｒα２９６等
のプラスミドのプロモーターの下流に翻訳開始コドンＡ
ＴＯとフェーズを合わせて接続して蛋白質発現用プラス
ミドを形威し、該プラスミドで形質転換された動物細胞
の宿主内等で行うことができる。次いで、常法に従い発
現された蛋白質を回収することにより本発明のＨＧＰを
得ることができる。

上記発現用プラスくドとしては、工業的生産のためには
、安定した宿主−ベクター系を構築することが望ましい
。例えば、特願平１−１１５８３１号に記載されている
ようなものが挙げられる。

具体的には、大腸菌、枯草菌等の微生物を宿主とすると
きは、プロモーター　リボゾーム結合配列、ｈＨＧＦ遺
伝子、転写終結因子、及びプロモーターを制御する遺伝
子より成ることが好ましい。プロモーターとしては、例
えばトリプトファン合成酵素オペロン（ｔｒｐ）、　　
ラクトースオペロン（、ｌ　ａ　ｃ　）　、　　リボプ
ロティンのプロモーター（ｌｐｐ）等が挙げられ、また
、ｔａｃ　（ｔｒｐ：　　１ａｃ）、ｔｒｃ　（ｔｒｐ
：　　１ａｃ）、ｐａｃ（ファージ二大腸菌）等のハイ
ブリッドプロモーターでもよい。ｈＨＧＦ遺伝子として
はシグナル配列に相当する部分を除去したものが好まし
いが、シグナル配列に相当する部分を含むものでも産生
されるプレ体からシグナル配列を除くことによってｈＨ
ＧＰを得ることが出来る。使用するプラスミドとしては
、大腸菌や枯草菌で多コピー数になるプラスミド、例え
ばｐＢＲ３２２系プラスくド、ｐＵＢ１１０系プラス【
ド等が望ましい。通常の方法により形質転換された大腸
菌、枯草菌などは、通常の培地を用いて１５−４２℃で
培養すればよい。

酵母を宿主とする場合は、酵母由来のプロモーター　例
えばピルビン酸キナーゼ（ｐＹＫ）。

ホスホグリセロキナーゼ（ｐＧＫ）等の配列の支配下に
ｈＨＧＦ遺伝子を接続し、酵母内に導入して３０℃前後
で培養すればよい。

しかしながら、天然のｈＨＧＦは糖蛋白であることを考
慮すると、宿主としては動物細胞が望ましい。また、動
物細胞を宿主とする場合はシグナル、配列に相当する部
分を含むｈＨＧＰ遺伝子を導入することにより、シグナ
ル配列が除かれたｈＨＧＰが分泌生産されるという利点
が期待される。シグナル配列としてはｈＨＧＦの本来の
シグナル配列以外にもヒト血清アルブミン、インターフ
ェロン、ヒト・アミラーゼ等のシグナル配列を利用して
もよく、その場合は本来のシグナル配列をコードするＤ
ＮＡ断片にかえて、それらのシグナル配列に相当する塩
基配列のＤＮＡ断片を５°側に置換すればよい。動物細
胞を宿主とする場合、プロモーターとしては、ＳＶ　４
０　ｆ＆期プロモーター　アポリボプロティンＥ遺伝子
のプロモーター　アポリボプロティンＡ１遺伝子のプロ
モーター　熱ショック蛋白遺伝子のプロモーター　メタ
ロチオネイン遺伝子のプロモーター　Ｈ８ＶＴＫプロモ
ーター　アデノウィルスのプロモーター　レトロウィル
スのＬＴＲ等が挙げられるが、ＳＶ４０プロモーター及
びメタロチオネイン遺伝子のプロモーターが好ましい。

発現ベクターには、ｈ）（ＯＦ遺伝子の下流にポリアデ
ニル化部位が含まれる。

ポリアデニル化部位の具体例としては、ＳＶ４０　　Ｄ
ＮＡ、　　β−グロビン遺伝子またはメタロチオネイン
遺伝子に由来するものが挙げられる。

また、β−グロビン遺伝子のポリアデニル化部位及びＳ
Ｖ４０　　ＤＮＡのポリアデニル化部位が連結したもの
であってもよい。発現ベクターは、形質転換体の選択マ
ーカーを有していてもよい。発現ベクター中に選択マー
カーがなくても、二重形質転換により、形質転換された
動物細胞を選択できる。このような選択マーカーとして
は、メトトレキセート耐性を与えるＤＨＰＲ遺伝子、Ｈ
ＡＴ培地中での形質転換ｔｋ−株の選択を可能とするヘ
ルペス・シンプレックスウィルス（Ｈ３Ｖ）（７）ｔｋ
遺伝子、３°−デオキシストレブタミン抗生物質Ｇ４１
８に対する耐性を付与する大腸菌のトランスボゾンＴｎ
５からのア夫ノグリコシド３′−ホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子、重層増殖によるウシバビローマウウイルス
遺伝子、ａｐｒｔ遺伝子等が挙げられる。また、二重形
質転換法により、発現ベクターで形質転換した動物細胞
を選択するには、上記した選択マーカーとなる遺伝子を
含有するプラスくドその他のＤＮＡを発現ベクターと一
緒に形質転換し、選択マーカーの発現による上記した表
現形質により、形質転換細胞を選択出来る。発現ベクタ
ーは、大腸菌等の細菌由来の複製開始点を有するプラス
シト断片を有すると、細菌中でのクローニングも可能と
なり有利である。このようなプラスミド断片としてはｐ
ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２７、ｐＭＬ等のプラスくド断片
が挙げられる。発現ベクターに使用されるプラスミドベ
クターの具体例としては、ＳＶ４０初期プロモーター　
ウサギのβ−グロビン遺伝子に由来するスプライス配列
Ｄ　Ｎ　Ａ、　　ウサギのβ−グロビン遺伝子からのポ
リアデニル化部位、ＳＶ４０初期領域からのポリアデニ
ル化部位並びにｐＢＲ３２２からの複製開始点及びアン
ピシリン耐性遺伝子を含有するｐＫＣＲ，ｐＫＣＲのｐ
ＢＲ３２２部分なｐＢＲ３２７で置換し、ウサギβ−グ
ロビン遺伝子のエクソン３中に存在するＥｃｏ　　Ｒ１
部位をＨｉ　ｎ　ｄ’ｎ１部位に変えたｐＫＣＲ）（２
、ＢＰＶ遺伝子及びメタロチオネイン遺伝子を含有する
ｐＢＰＶＭＴＩ等が挙げられる。発現ベクターで形質転
換される動物細胞としては、ＣＨＯ細胞、Ｃ０８ｍ胞、
マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、マウスＦＭ３Ａ細
胞等が挙げられる。発現ベクターの動物細胞への移入は
トランスフェクション法、マイクロインジェクション法
としては、リン酸カルシウム法が最も一般的である。移
入により形質転換された動物細胞の培養は、常法により
浮遊培養または付着培養で行うことができる。培地とし
ては、ＭＥＭ、ＲＰＭ１１６４Ｏなどが一般的である。

産生されたｈＨＧＰの分離精製は、劇症肝炎患者血漿か
らの精製と同様に、ヘパリン・セファローズやハイドロ
キシアパタイト等を用いたカラムクロマトグラフィーに
より行うことが出来る。

（発明の効果） 本発明に係わるｈＨＧＦをコードする遺伝子は常法によ
り発現ベクターに導入することによって、これを鋳型と
する発現によりｈＨＧＦまたはｈＨＧＦ様物質あるいは
これを含む融合蛋白を得ることができる。得られる組換
えｈ　ＨＧ　Ｆ。

ｈＨＧＦ様物質あるいはｈＨＧＦを含む融合蛋白は肝再
生促進剤、肝機能改善剤、肝炎治療剤あるいは肝硬変抑
制剤等肝疾患の治療薬となる可能性がある。

（実施例） 以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが
、その要旨を越えない限り、以下の実施例に限定される
ものではない。

実施例１ ［１］　ｈＨＧＦの部分アミノ酸配列決定及びプローブ
の作製 劇症肝炎患者血漿より、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、
、８１，４１４　（１９８８）に記載された方法に従っ
てｈＨＧＰを精製した。これを５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ
たところ、非還元条件下では、分子１ｋ　７６０００−
９２００００）位置にややブロードな単一バンドが現れ
、還元条件下では、分子量５６０００−６５０００のや
やブロードなバンドと分子量３２０００−３５０００の
バンドの２つのバンドが現れた。この精製ｈＨＧＦ５０
μｇを５モル濃度の尿素を含有するｐＨ９の５０ミリモ
ル濃度のトリス塩酸緩衝液１００μｌに溶解し、これに
、ｈＨＧＰに対しモル比で１／２００に相当するアクロ
モバクタ−プロテアーゼＩを加えて３７℃で６時間反応
させた。生成したペプチド混合物は常法により還元カル
ボキシメチル化したのち、Ｊ、　Ｔ、　Ｂａｋｅｒ社製
Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ　　Ｗ　Ｐ　　０ｃｔｙｌ　　Ｃｏ
ｌｕｍｎを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーによ
り分離して、各ペプチドを分取した。

４つのペプチドについて気相プロテインシークンサー（
Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社　Ｍｏｄｅ
　１４７０Ａ）を用いてアミノ酸配列番号を行ったとこ
ろ、表１に示すような配列が見いだされた。

表１　　　ペプチドのアミノ酸配列 番号　　　　　　　　配列 １　　＋　　ＰｈｅＬｅｕＰｒｏＧｌｕＡｒｇＴｙｒＰ
ｒｏＡｓｐＬｙｓ２、　　ＧＩｕＰｈｅＧｌｙ）Ｉｉｓ
ＧｌｕＰｈｅＡｓｐＬｅｕＴｙｒＧｌｕＡｓｎＬｙｓ３
、　　ＡｓｐＴｙｒＧＩｕ＾ＩａＴｒｐＬｅｕＧＩｙｌ
ｌｅＨｉｓＡｓｐＶａｌＨｉｓ　−Ｇ　ＩｙＡｒｇＧ　
１ｙＡｓｐＸＸＸＬｙｓ４、　　ＡｓｎＭｅｔＧｌｕＡ
ｓｐＬｅｕ旧＼ｓＡｒｇＨｉｓｌｌｅＰｈｅＴｒｐＧＩ
ｕ　−ＰｒｏＡｓｐＡ　１ａｓｅｒＬｙｓ ＸＸＸは未決定のアミノ酸 ［２］　ｈＨＧＦの一部をコードするｃＤＮＡのスクリ
ーニング （Ｌ）プラークハイブリダイゼーションスクリーニング
を行うλファージｃ　ＤＮＡライブラリーとして３４週
齢のヒト胎盤由来のｃＤＮＡ（クローンチック社）のス
クリーニングを説明書に従って行った。　　１００　　
万クローンのファージを大腸菌Ｙ−１０９０株に感染さ
せ２４．５ｃ　ｍ　ｘ　２４．５ｃ　ｍのシャーレ中の
ＮＺＹ軟寒天培地［ＮＺＹ培地：１％Ｎ　Ｚ−７ｉ　ン
、　　０．５％イーストイクストラクト、０．５％塩化
ナトリウム、ｐＨ７・５に謂整し　０．２５％塩化マグ
ネシュウムを加えたもの、ＮＺＹ軟寒天培地；ＮｚＹ培
地に０．７％になるように寒天法を加えオートフレイブ
したもの］中で１枚あたり２０万クローンの割合で５枚
分を４２℃で一晩培養した。次に培地中のλフアージク
ローンを市販のナイロン膜であるシーンスクリーニング
プラス（デュポン社）上に移し取り、以下に説明するブ
ラークハイプリダイゼーシ３ンを行った。即ち、１枚の
シャーレあたりナイロン膜２枚の割合でファージ粒子を
移し取り、その様にしてできたナイロン膜を０．１Ｍ水
酸化ナトリウム−１，５Ｍ塩化ナトリュウムが染み込ん
だろ紙上に２分間静置し別に用意した屹いたろ紙上で水
分を除いた後、次に、同様に２　ｘ　５ＳＣＰ　（２倍
の濃度の５ＳＣＰ溶液のこと、以下同様の表記方法をと
る。１０ｘ　Ｓ　Ｓ　ＣＰ　：　１．２Ｍ塩化ナトリュ
ウム、１５０ｍＭクエン酸ナトリュウム、１３０ｍ　Ｍ
燐酸二水素力すュウム、１ｍＭＥＤＴＡ　　ｐＨ７，２
）−０，２Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７，４）を染み込ませ
たろ紙上でこのナイロン膜を静置し乾いたろ紙上で風乾
した後、同じ操作を再び繰り返した。こうして処理した
ナイロン膜は、３　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（２０倍）濃度のＳ
ＳＣ溶液；３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナト
リウム）−０，１％　ＳＤＳで８０’０１５分間２回洗
浄し、次にナイロン膜１枚当り５ｍｌのプレハイブリダ
イゼーションｍＥ３ＸｓｓＣ，０，１％ＳＤＳ、　　１
０　ｘ　Ｄｅｎｈａ　１　ｔ　（５０倍の濃度のＤ　ｅ
　ｎ　ｈ　ａ　Ｊ、　を溶液；１％ＢＳＡ　Ｃ牛血清ア
ルブくン）１％ポリビニルピロリドン、及び１％フィ：
ｙ−ル４００）、２０ｕ　ｇ　／ａ＋１鮭精子ＤＮＡコ
に６５℃３時間浸した。次に、表１のペプチド４、すな
わち　Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−旧ｓ
−Ａｒｇ−Ｈ４ｓ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−
Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｌａ−３ｅｒ−ＬｙｓのうちのＡｓ
ｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｈ４ｓおよび旧
５−１１ｅ−Ｐｈｅ−↑ｒｐ−Ｇ　Ｉｕ−Ｐｒｏを基に
合或オリゴヌクレオチドを作成した。即ち、前述のアミ
ノ酸配列の順に１７塩基６４種類（７）Ｔ’Ｈ２３（５
’Ｔ−Ｇ−Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ−Ａ−Ａ／Ｇ　−Ａ／Ｇ−Ｔ
−Ｃ−Ｔ／Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｔ−
３’　）、１７塩基２４種類のＴＭ０１　（５′−ａ−
ａ−Ｔ／Ｃ−Ｔ　−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ　−Ａ／Ｇ−Ａ　−
Ａ　−Ａ／Ｇ／Ｔ−Ａ−Ｔ−＾／Ｇ−Ｔ−Ｇ−３’）を
作成した。

これらを常法に従いポリヌクレオチドキナーゼによりそ
の５′末端を反応液［５０ｍＭ）リス−塩酸ｐＨ７，Ｆ
３．　１０ｍＭ塩化マグネシュウム、１０ｍ　Ｍメルカ
プトエタノール、１００μＭ　［ｒ　”　ＰＩＡ　Ｔ　
Ｐ、基質ＤＮＡコ中で３２ｐ標識した後、常法に従いＤ
ＥＡＥセルロースカラムをかけて余分なモノヌクレオチ
ドを除いた。こうしてできあがった”Ｐｔｌ識合或合成
ゴヌクレオチドプローブを含むハイブリダイゼーション
液［３ＸＳＳＣ，１０ｘ　Ｄｅｎｈａ　１　ｔ、　　５
０ｐｇ／ｍｌ鮭精子Ｄ　Ｎ　Ａ　１Ｍ塩化ナトリウム、
　１％ＳＤＳ、２５０μｇ／ｌ鮭請子Ｄ　Ｎ　Ａ、　　
合成プローブ１種頬当り１０万ｃ、ｐ、ｍ、／　ｍ　１
３２Ｐ　＄１識プローブＤＮＡ　　コ中で前述のフィル
ターをプローブに応じＡまたはＴを２℃に、ＧまたはＣ
を４℃に置き換えて全ての塩基を合計した温度、実際は
プローブにより４２℃（ＴＭ０１）４Ｃ３℃（ＴＭ０１
）で３６時間保温した。その後、ナイロン膜を取り出し
、４ｘＳＳＣ溶液中で室温で３０分間２回洗い、４　Ｘ
　ＳＳＣ溶液でハイブリダイゼーションの時と同じ温度
で３０分間２回洗った後２ｘＳＳＣ溶液で室温で１５分
間２回洗い、オートラジオグラフィーをとった。

２枚１組のナイロン膜のオートラジオグラフィー上のシ
グナルが一致したものは６個あった。

得られたシグナルに相当するクローンを単離するために
、これらシグナルと一致する軟寒天培地上のプラークを
ガラス管で打ち抜き５０μｌのクロロフォルム存在下１
ｍｆのＴ　Ｍ　Ｇ　緩衝液［５０ｍＭ）リス−塩酸ｐＨ
７・５．１００ｍＭ塩化ナトリュウム、１０ｍＭ塩化マ
グネシュウム及び０・０１％ゼラチンコ中でファージ粒
子を一晩抽出し再び大腸菌Ｙ−１０９０株に感染させ９
ｃｍシャーレ中で適当量培養し前述の方法でプラークハ
イブリダイゼーションを行った。この一連の操作を繰り
返すことによりシグナルに相当するクローンを各々単離
することができた。その結果独立した６個のクローンを
得た。そのうち２個のクローン、すなわちλｈｌ（ＧＦ
２１と　λｈｌｌＧＦ５０２について、含まれるｃＤＮ
Ａの塩基配列を解析した。

（２）ｃＤＮＡ断片のサブクローニング及び塩基配列の
決定 これらのλフアージクローンから以下のようにＤＮＡを
抽出しプラスミドベクターｐｕｃｔｓ、ｐＵＣ１９及び
−木調ファージベクターＭ１３ｍｐ１８．Ｍ１３ｍｐ１
９にサブクローニングをおこなった。即ち、５００ｍ　
ｌ三角フラスコ中の２００ｍ　ｌのＮＺＹ培地中におい
て、２００μｍのＴＭＧ溶液に懸濁しであるλフアージ
クローン２ｘ　１０”ｐ、ｆ、ｕ、　（ｐ、ｆ、ｕ、；
プラーク形成単位）と４０μｍの大腸菌Ｙ−１０９０株
２　ｘ　１０”を３７℃１５分置くことにより感染させ
た。１５分後さらに１ｍｌのＩＭ塩化力ルシュウムを加
え一晩、概ね１４時間はど培養した。次に、２ｍ　ｌの
クロロフォルムを加え１０分はど置き、１５．８ｇの塩
化ナトリュウムを加え溶かし、それらを４℃において日
立冷却遠心機５ＣＲ２０８Ｂで、ローターＲＰＲ９−２
を用いて６０００回転２０分間遠心した上清に２０ｇの
ポリエチレングリコールｅｏｏｏを加えて十分に溶解し
た後に水中で１時間静置した。これを日立冷却遠心機５
ＣＲ２０８Ｂで、ローターＲＰＲ９−２において６００
０回転２０分間遠心し沈澱を６ｍ　ｌのＡ緩衝液［０，
５％ＮＰ４０．３６ｍＭ６ｍＭ塩化カルシュラムｍＭｈ
リスー塩リス−塩酸ｐＨ７５０ｍＭ塩化マグネシュウム
、１２５ｍ　Ｍ塩化力すュウム、０．５ｍＭＥＤＴＡ、
　　０．２５％デオキシコール酸、０．６ｍＭメルカブ
トエタノールコに懸濁しここに１００μｌの１０ｍ　ｇ
　／　ｍ　ＬのデオキシリボヌクレアーゼＩと１０ｐ　
１の１０ｍｇ／ｍｌのりボヌクレアーゼＡを加え３０℃
で３０分間保温することにより大腸菌由来の核酸を分解
した。その後上記反応液に等量のクロロフォルムを加え
良く攪はんしたのちにトく一遠心機ＬＣ−ＯＥ３、ロー
ターＴＳ−７で３０００回転１０分間遠心し上清を得た
。

一方予め日立超遠心機ローターＲＰＳ４０Ｔ用遠心管に
４０％グリセロール溶液［０゜５％ＮＰ４０．３０ｍＭ
）リス−塩酸ｐＨ７・５　　１２５ｍＭ塩化カリウム、
０．５ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、　　０．６ｍ　Ｍメル
カプトエタノール、１０％グリセロール］を１ｍｌ入れ
ておきその上に３ｍ　ｌの１０％グリセロール溶液［０
，５％　ＮＰ４０．　　　３０ｍＭ）　　　リ　　ス　
　−　塩　酸　ｐＨ７−５１２５ｍ　Ｍ塩化カリウム、
０．５ｍＭＥＤＴＡ。

０．６ｍＭメルカプトエタノール、４０％グリセロール
］を重層して準備しておいた上に先はどのヌクレアーゼ
処理をしたファージ懸濁液を重層し、日立超遠心機７０
Ｐ７２、ローターＲＰＳ４０Ｔで３５０００回転１時間
遠心する。遠心後沈澱として落ちてきたファージ粒子を
０．４ｍｌの４０ｍＭ）　　リ　ス　−　塩　西１ｐＨ
７・　　５　、　１０ｍ　　Ｍ　　Ｅ　　Ｄ　　Ｔ　　
Ａ、２％ＳＤＳに懸濁し４μｌの１０ｍｇ／ｍｌのプロ
テナーゼＫを加えて５５℃１時間保温を行った。

その後溶液をエッペンドルフチューブに移し等量のフェ
ノール／クロロフォルムにてファージＤＮＡを抽出しエ
タノール沈澱を行うことにより目的とするファージＤＮ
Ａを　２００μｇ得ることが出来た。このファージＤＮ
Ａを制限酵素Ｅｃ　ｏＲＩで常法に従い切断しアガロー
ス電気泳動法にて解析した。その結果クローンλｈＨＧ
Ｆ２１から０．２ｋｂと０．８５ｋｂと０．７２Ｋｂの
３本のＥｃｏＲＩ断片を得た。一方アガロスゲルから該
インサートｃＤＮＡ断片を常法に従い回収することによ
り目的とするｃＤＮＡ断片を得ることが出来た。これら
ｃＤＮＡ断片１１００ｎを予め常法に従い制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩによって切断しておいたプラスくドベクターｐＵ
Ｃ１８、ｐＵｃ１９及び−木調ファージベクタＭ１３ｍ
ｐ１８．Ｍ１３ｍｐ１９　２００ｎｇと１０μｍの反応
液［６６ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７，１３，６，６ｍＭｊ
ｊｌ化マグネシュウム、１０ｍ　Ｍジチオスレイトール
、６６μＭＡＴＰ、　　基質ＤＮＡコ中でユニットのＴ
４ＤＮＡリガーゼにより結合しそれぞれのベクターに見
合った宿主の大腸菌を常法に従い形質転換することによ
りＥｃｏＲＩ挿入部位にＨＧＦ蛋白質の部分配列を持つ
サブクローンを得た。

得られたｃＤＮＡサブクローンの塩基配列の決定は、Ｓ
ａｎｇｅｒらのジデオキシ法によって行った。

プライマーは市販のＭ１３ファージベクターに対応する
ものを使用した。その結果、最も長いｃＤＮＡを持つク
ローンλｈ）ＩＧＦ２１の塩基配列をアミノ酸に翻訳す
ると第３図に示すようにすでに明らかにされているアミ
ノ酸配列のうちプローブの設計に使用したアミノ酸配列
とは異なる領域のアミノ酸配列のうちのいくつかを含ん
でいることが判明し、このクローンがｈＨＧＦの少なく
とも一部分の領域を含むｃ　ＤＮＡであることが判明し
た。また、λｈＨＧＦ２１にはないｃＤＮＡ断片を含む
クローンλｈＨＧＦ５０２のｃ　ＤＮＡの塩基配列をＳ
ａｎｇｅｒ法に従い解析した結果、クローンλｈ）ｌＧ
Ｆ５０２はクローンλｈ）ＩＧＦ２１と同じ塩基配列を
第２図で示す制限酵素切断部位ＮｃｏＩの近傍から５°
上流から数えて三番目のＥｃｏＲ工切断部位の近傍まで
の０．８ｋｂの長さで共有し３′側にλｈＨＧＦ２１に
はない０．７ｋｂの塩基配列をもつことがわかった。λ
ｈＨＧＦ５０２の塩基配列のうちλｈ）ＩＧＦ２１の有
しない塩基配列のなかには既に解析されているアミノ酸
配列に相当する塩基配列があることが判明した。これら
２つのクローンの塩基配列を一部が重複する形でつなぎ
あわせるとｈＨＧＦのアミノ酸配列の全てをカバーする
ことが判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のｈＨＧＦのアミノ酸配列を表す。 □２図は、実施例１で得られた本発明のｈＨＧＦをコー
ドする遺伝子を含むｃＤＮＡの塩基配列を表す。図中に
主な、制限酵素の認識部位を併記した。また下線はすで
に明かにされていたアミノ酸配列に対応する部分を示し
そのうち二重下線は最初のクローンを得る際に使用した
プローブに対応するアミノ酸配列を表す。 癌二図 （その２） ＴＧＣ ＡＡＴ ＡＣＴ ＡＴＴ ＣＡＧ ＣＧＴ ＣＡＧ ＡＣＣ ４０ ＣＧＣＴＧＧ ＣＡＡ　ＡＣＡ　　ＡＣＴ　　ＧＡＡ　　ＴＧＣＡＴＣ
ＣＡＡＣＣＴ　　ＣＡＡ　ＡＡＴ　ＴＴＧ　　ＡＡＧＧ
ＡＡ　　ＴＣＡ　　ＣＣＣＴＧＧ　　ＴＧＴＣＣＡ　　
ＡＡＣＴＧＴ　　ＧＡＴ　　ＡＴＧＧＧＣＡＡＣＴＴＡ
　　ＴＣＣＣＡＡ ＡＡＣ，ＬＬにＪ−」に１ｆ ＣＣＡ　ＡＡＴ　　ＣＣＡ　　ＧＡＴ　　ＧＡ丁７ＧＧ
　　ＧＡＴ　　ＴＡＴ　　ＴＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴ　
　ＣＣＣＧＴＡ　　ＡＴＡＡＣＡ　　ＣＧＡ　　ＡＣＡ
　ＡＡＣＡＴＡＧＧ＾　ＴＣＡ　　ＴＴＧ　　ＡＴＡ　
　ＡＡＧＧＣ ＡＴＴ ＴＣＡ ＡＣＡ ＾＾Ｇ ＡＣＣ ＡＡＴ ＡＣＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＡＧ ＣＧＴ ＣＧＴ ＴＧＴ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＧＴ　　ＣＡＡ　　ＧＧＡ ＣＡＧ ＡＣＴ ＣＧＡ ＣＧＴ ＧＴＡ ＡＡＴ ＣＡＡ ＡＣＡ ＡＡＴ ＡＣＴ ＡＣＣ ＡＴＣ ＴＧＣ ＡＣＡ ＡＣＴ ＡＡＡ ＡＴＴ ＡＴＴ ＴＣＴ　　ＣＡＧ　　ＴＡＴ　　ＣＣＴＣＧＡ　　ＧＡ
Ａ　　ＡＡＴ　　ＴＡＣＴＧＣＣＣ＾　ＡＡＣＡＴＣＣ
ＧＡ　　（：ＴＴＧＡＴ　　ＴＧＴ　　ＴＡＴ　　ＣＧ
Ｔ　　ＧＧＧＣＴＡ　　ＡＣＡ　　ＴＧＴ　　ＴＣＡ　
　ＡＴＧＣＣＣＴＧＧ　　ＴＧＣＴＡＣＡＣＧ ＧＡＡ　　ＧＧＴ　　ＧＡＴ　　ＡＣＣＡＣＡＡＣＧ　
　ＡＡＡ　　ＣＡＡ　　ＴＴＧ　　ＣＧＡ＾ＧＴ　　Ｔ
ＴＧ　　ＡＧＡ　　ＴＡＣＡＧ＾ＴＴ ＣＡＧ ＣＣＡ ＣＣＣ ＡＡＴ ＴＧＣ ＴＧ ＡＣＡ ＣＧＴ ＡＴＴ ＡＡＴ ＣＡＧ ＡＡＴ ＣＡＧ ＣＣＣ ＣＡＧ ＡＡＴ ＡＡＴ ＡＣＡ ＧＴＡ ＡＡＡ ＡＡＴ ＣＣＡ ＣＣＣ ＡＡＡ ＡＡＣ ＣＡＧ ＣＣＡ ＡＴＡ ＡＡＴ ＡＡＴ ０２０ ＧＡＧ　　ＡＴＧ　　ＡＣＴ ０８０ ＧＡＴ　　ＧＧＧ　　ＴＧＴ １４０ ＴＣＣＣＡＡ　　ＡＴＴ 　２００ ＡＡＴ　　ＴＡＴ　　ＡＴＧ ２６０ Ｌ直＝１工り一−４ ３２０ ＡＡＴ　ＴＡＣＴＧＣ ３８０ ＧＴＣＡＴＴ　　ＣＧＴ ４４０ ＧＴＣＡＡＴ　　ＴＴＡ ５００ ＧＧＧ　　ＡＴＴ　　ＣＣＡ ５６０ ＡＴＣＴＧＣＧＧＡ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）第１図のアミノ酸配列で表されることを特徴とす
   る肝実質細胞増殖因子。
2. （２）第１図のアミノ酸配列のうち３０番目のグルタミ
   ン酸から７２８番目のセリンまでの配列で表されること
   を特徴とする肝実質細胞増殖因子。
3. （３）第１図のアミノ酸配列のうち３２番目のグルタミ
   ンから７２８番目のセリンまでの配列で表されることを
   特徴とする肝実質細胞増殖因子。
4. （４）第１図のアミノ酸配列で表される肝実質細胞増殖
   因子をコードすることを特徴とする遺伝子。
5. （５）第１図のアミノ酸配列のうち３０番目のグルタミ
   ン酸から７２８番目のセリンまでの配列で表される肝実
   質細胞増殖因子をコードすることを特徴とする遺伝子。
6. （６）第１図のアミノ酸配列のうち３２番目のグルタミ
   ンから７２８番目のセリンまでの配列で表される肝実質
   細胞増殖因子をコードすることを特徴とする遺伝子。
7. （７）第２図の塩基配列で表される肝実質細胞増殖因子
   をコードすることを特徴とする遺伝子。
8. （８）第２図の塩基配列のうち８８番目のグアニンから
   ２１８７番目のグアニンまでの配列で表される肝実質細
   胞増殖因子をコードすることを特徴とする遺伝子。
9. （９）第２図の塩基配列のうち９４番目のシトシンから
   ２１８７番目のグアニンまでの配列で表される肝実質細
   胞増殖因子をコードすることを特徴とする遺伝子。