JPH0372883A - 肝実質細胞増殖因子及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents
肝実質細胞増殖因子及びそれをコードする遺伝子Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
殖因子及びそれをコードする遺伝子に関する。
ある。これは主に各種栄養素(糖質、タンパク質、脂質
、ビタミン、ホルモン等)の処理(代TM)、貯蔵、解
毒、分解、排せつ等の重要な多種の機能を兼ね備えてお
り、なかでも生体内中間代謝の中心的な役割を果たすこ
とが知られている。これらの機能を担っている肝実質細
胞は生体内において各種のホルモンによる側御下に置か
れ、ある場合にはきわめて旺盛な増殖を示す。例えば、
ラットの肝臓のほぼ2/3を切除しても、約10日後に
は元の大きさに戻ることが知られており、ヒトでも肝癌
患者等において、部分肝切除とその後の再生による治癲
法が行われている。肝実質細胞の増殖による肝再生の機
構については従来より数多くの研究が行われ、肝実質細
胞増殖因子の存在が報告されてきた。とりわけ、本発明
者らの一部は、ヒト劇症肝炎患者血漿中には、肝実質細
胞増殖活性が極めて高いことを見いだしく Biome
d、 Res、。
es、 166、 139(1986))、その活性を
有する因子を世界で初めて単一のタンパク質として精製
することに成功した(特開昭63−22526号公報及
びJ、Cl1n、Invest、、81.414(19
88))。
非還元条件下の5DS−PAGEによる推定分子量が約
76000−92000であり、還元条件下の5DS−
PAGEでは分子量56000−65000及び320
00−35000の2つのバンドに分かれた。中村らは
、ラット血小板由来の同様な活性を有する因子を報告し
ており(B 1ochei、 B 1ophys、 R
eS、 Conmun、122.1450(1984)
)、 5DS−PAGE&こ よ リ、その推定分子
量は約27000であるとしていたが(Proc、 N
atl、^cad、 Sc t、 USA、 83.6
489 (1986) )、その後、単一のタンパク質
として精製し、分子量69000と34000との2つ
のポリペプチドからなる分子量82000のタンパク質
であると報告された(FEBS Letters、2
24,311(19B?))。これらhHGF及びラッ
トHGF以外には単一のタンパク質として精製された肝
細胞増殖因子は今までに報告されていないし、hHGF
及びラットHGFに関しても、その−次構造及び該当す
るc DNAの塩基配列については、なんの報告もなさ
れていない。
おける肝再生に対する効果等を生体外で調べるには、多
量のhHGPを必要とするが、劇症肝炎患者血漿から多
量のhE(OFを精製することは人的、時間的、経費的
に必ずしも容易ではなく、また感染源の存在する血漿中
からhHOPのみを安定に取り出すことは困難を極める
。かかる理由からhHGFの劇症肝炎患者血漿からの安
定かつ大量の精製は行われていなかった。
より大量に取得するべく種々検討した結果、かかる目的
に有用なhHGFをコードする遺伝子を初めてクローニ
ングすることに成功し、本発明を完成するに至った。す
なわち、本発明の要旨は、第1図に示すアミノ酸配列で
表される、シグナル配列を含むh HG F、 第1
図に示すアミノ酸配列のうち30番目のグルタミン酸残
基(G 1 u)から最後のセリン残基(Ser)まで
の配列で表されるh HG F、 第1図に示すアミ
ノ酸配列のうち32番目のグルタミンCGin)から最
後のセリン残基(Ser)までの配列で表されるh H
G F、 該アミノ酸配列で表される各hHGFをコ
ードする遺伝子、第2図に示す塩基配列で表される、シ
グナル配列を含むhHGFをコードする遺伝子、第2図
に示す塩基配列のうち88番目のGからi f&のGま
での配列で表される遺伝子及び第2図に示す塩基配列の
うち94番目のCから最後のGまでの配列で表される遺
伝子に存する。
する遺伝子(cDNA)は例えば第2図に示すような塩
基配列を有する。なお、塩基配列は他の相補的な塩基配
列を省略し1本鎖のみを記載した。この遺伝子より組換
えDNA技術により例えば第1図に示すアミノ酸配列を
宥するhHGFを発現させることができる。この時、h
HGFをコードするm RN Aから翻訳される蛋白は
シグナル配列を含んでいるが、細胞から分泌される場合
にはシグナル配列が切断され、30番目のグルタミン酸
残基(Glu)または32番目のグルタミン残基(Gi
n)以後のアミノ酸配列を有するhHGFが産生される
。
る事もできる。また、宿主細胞内にシグナル配列のない
成熟hHGFを発現させる場合は、hHGFをコードす
る遺伝子として第2図に示す塩基配列のうち88番目の
Gまたは94番目のCから以後の塩基配列を有する遺伝
子を、ベクターのATGコドンにつなげて使用すればよ
い。さらに、本発明においては、肝実質細胞増殖促進活
性を損なわない範囲内で、一部のアミノ酸または核酸を
除去、変更あるいは追加する等の改変を行ったものも本
発明に含まれる。
えば次の様な方法によって得られる。
est。
製されたhHGFは、還元条件下では、ジスルフィド結
合が切断されて2本のポリペプチドに分かれる。分子量
56000−65000のポリペプチドをH1111、
分子量32000−35000のポリペプチドをL鎖と
する。
ル基をカルボキシメチル化したのち、逆相高速液体クロ
マトグラフィーでH鎖とL鎖を分離するか、あるいはh
HGFを還元条件下で電気泳動し、そのゲルからH鎖、
L#14のそれぞれを抽出したのち、例えばアプライド
・バイオシステムズ社製気相プロティンシーケンサ−で
分析することにより、画調のアミノ末端アミノ酸配列を
調べることがてきる。さらに、hHOF自体を、または
H鎖、L鎖分離後に、適切な蛋白分解酵素例えばアクロ
モバクタープロテアーゼエ(リジルエンドペプチダーゼ
)で分解し、生成するペプチド断片を例えば逆相高速液
体クロマトグラフィーで分離したのち、各ペプチドを上
記と同様にしてアミノ酸配列分析すればポリペプチド内
部のアミノ酸配列を知ることができる。これらのアミノ
酸配列からDNA塩基配列を推定しオリゴヌクレオチド
を作成しやすい配列を選定して、そのオリゴヌクレオチ
ド、例えば、後述の実施例に示すようなオリゴヌクレオ
チドを合成してプローブとして使用する。
DNAライブラリーとしては、人由来の肝臓c DNA
ライブラリー 肺臓cDNAライ 。
。これらのライブラリーはクローンチック社より販売さ
れている。特に胎盤c DNAライブラリーが望ましい
。その他hHGFを発現している細胞株、及び組織材料
から常法に従ってcDNAライブラリーを作成してもよ
い。
iatisらの方法(「モレキュラークローニング」、
コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−56頁−73
頁(1982))により大腸菌に感染させ培養する。形
成されたプラークをhHGFの一部のアミノ酸配列から
推定される塩基配列から作成したオリゴヌクレオチドを
プローブとしてプラークハイブリダイゼーション法(「
モレキュラークローニング」、コールドスプリングハー
バ−ラボラトリ−320頁−328頁(1982))に
従って選択することにより、容易に目的とするhHGF
の7案ノ酸配列の一部と同じアミノ酸配列を有しなおか
つhHGFのアミノ酸配列のプローブ以外の領域に相当
する塩基配列をも有する、異なるλフアージクローンを
いくつか得ることができる。
atisらの方法(「モレキュラークローニング」、コ
ールドスプリングハーバ−ラボラトリ76頁−79頁(
1982))によりファージを増殖させ、そのものから
グリセロールグラヂエント法にしたがってDNAt/I
u製し適切な制限酵素例えばEc oRI等で切断後、
pUCL8.pU019等のプラス且ドベクターあるい
はM13mp18.M13mp19などの一重鎖ファー
ジベクターにc DNAをサブクロニングし、Sang
erらのジデオキシ法(プロシーデインゲス・オブ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニー・ニス
・ニー(Proc、Natl、Acad、Sci、υ、
S、A、) l 5 4 (33(1977))に従
って目的cDNAセグメントの塩基配列を決定すること
ができる。得られたクローンの塩基配列を解析しそれら
を統合することにより(第3図)hHGPの一部をコー
ドするcDNAクローン群によって、第1図に示すhH
OFの全アミノ酸配列の全てに対応する遺伝子を得るこ
とができる。かくして得られるc DNAの発現は、例
えば、該DNA群をその塩基配列の順番がhHGFのア
ミノ酸配列に従う形でつないでそれらhHGFの全領域
を含むDNA断片としこれをpCDL−3Rα296等
のプラスミドのプロモーターの下流に翻訳開始コドンA
TOとフェーズを合わせて接続して蛋白質発現用プラス
ミドを形威し、該プラスミドで形質転換された動物細胞
の宿主内等で行うことができる。次いで、常法に従い発
現された蛋白質を回収することにより本発明のHGPを
得ることができる。
、安定した宿主−ベクター系を構築することが望ましい
。例えば、特願平1−115831号に記載されている
ようなものが挙げられる。
きは、プロモーター リボゾーム結合配列、hHGF遺
伝子、転写終結因子、及びプロモーターを制御する遺伝
子より成ることが好ましい。プロモーターとしては、例
えばトリプトファン合成酵素オペロン(trp)、
ラクトースオペロン(、l a c ) 、 リボプ
ロティンのプロモーター(lpp)等が挙げられ、また
、tac (trp: 1ac)、trc (trp
: 1ac)、pac(ファージ二大腸菌)等のハイ
ブリッドプロモーターでもよい。hHGF遺伝子として
はシグナル配列に相当する部分を除去したものが好まし
いが、シグナル配列に相当する部分を含むものでも産生
されるプレ体からシグナル配列を除くことによってhH
GPを得ることが出来る。使用するプラスミドとしては
、大腸菌や枯草菌で多コピー数になるプラスミド、例え
ばpBR322系プラスくド、pUB110系プラス【
ド等が望ましい。通常の方法により形質転換された大腸
菌、枯草菌などは、通常の培地を用いて15−42℃で
培養すればよい。
えばピルビン酸キナーゼ(pYK)。
hHGF遺伝子を接続し、酵母内に導入して30℃前後
で培養すればよい。
慮すると、宿主としては動物細胞が望ましい。また、動
物細胞を宿主とする場合はシグナル、配列に相当する部
分を含むhHGP遺伝子を導入することにより、シグナ
ル配列が除かれたhHGPが分泌生産されるという利点
が期待される。シグナル配列としてはhHGFの本来の
シグナル配列以外にもヒト血清アルブミン、インターフ
ェロン、ヒト・アミラーゼ等のシグナル配列を利用して
もよく、その場合は本来のシグナル配列をコードするD
NA断片にかえて、それらのシグナル配列に相当する塩
基配列のDNA断片を5°側に置換すればよい。動物細
胞を宿主とする場合、プロモーターとしては、SV 4
0 f&期プロモーター アポリボプロティンE遺伝子
のプロモーター アポリボプロティンA1遺伝子のプロ
モーター 熱ショック蛋白遺伝子のプロモーター メタ
ロチオネイン遺伝子のプロモーター H8VTKプロモ
ーター アデノウィルスのプロモーター レトロウィル
スのLTR等が挙げられるが、SV40プロモーター及
びメタロチオネイン遺伝子のプロモーターが好ましい。
ニル化部位が含まれる。
NA、 β−グロビン遺伝子またはメタロチオネイン
遺伝子に由来するものが挙げられる。
V40 DNAのポリアデニル化部位が連結したもの
であってもよい。発現ベクターは、形質転換体の選択マ
ーカーを有していてもよい。発現ベクター中に選択マー
カーがなくても、二重形質転換により、形質転換された
動物細胞を選択できる。このような選択マーカーとして
は、メトトレキセート耐性を与えるDHPR遺伝子、H
AT培地中での形質転換tk−株の選択を可能とするヘ
ルペス・シンプレックスウィルス(H3V)(7)tk
遺伝子、3°−デオキシストレブタミン抗生物質G41
8に対する耐性を付与する大腸菌のトランスボゾンTn
5からのア夫ノグリコシド3′−ホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子、重層増殖によるウシバビローマウウイルス
遺伝子、aprt遺伝子等が挙げられる。また、二重形
質転換法により、発現ベクターで形質転換した動物細胞
を選択するには、上記した選択マーカーとなる遺伝子を
含有するプラスくドその他のDNAを発現ベクターと一
緒に形質転換し、選択マーカーの発現による上記した表
現形質により、形質転換細胞を選択出来る。発現ベクタ
ーは、大腸菌等の細菌由来の複製開始点を有するプラス
シト断片を有すると、細菌中でのクローニングも可能と
なり有利である。このようなプラスミド断片としてはp
BR322、pBR327、pML等のプラスくド断片
が挙げられる。発現ベクターに使用されるプラスミドベ
クターの具体例としては、SV40初期プロモーター
ウサギのβ−グロビン遺伝子に由来するスプライス配列
D N A、 ウサギのβ−グロビン遺伝子からのポ
リアデニル化部位、SV40初期領域からのポリアデニ
ル化部位並びにpBR322からの複製開始点及びアン
ピシリン耐性遺伝子を含有するpKCR,pKCRのp
BR322部分なpBR327で置換し、ウサギβ−グ
ロビン遺伝子のエクソン3中に存在するEco R1
部位をHi n d’n1部位に変えたpKCR)(2
、BPV遺伝子及びメタロチオネイン遺伝子を含有する
pBPVMTI等が挙げられる。発現ベクターで形質転
換される動物細胞としては、CHO細胞、C08m胞、
マウスL細胞、マウスC127細胞、マウスFM3A細
胞等が挙げられる。発現ベクターの動物細胞への移入は
トランスフェクション法、マイクロインジェクション法
としては、リン酸カルシウム法が最も一般的である。移
入により形質転換された動物細胞の培養は、常法により
浮遊培養または付着培養で行うことができる。培地とし
ては、MEM、RPM1164Oなどが一般的である。
らの精製と同様に、ヘパリン・セファローズやハイドロ
キシアパタイト等を用いたカラムクロマトグラフィーに
より行うことが出来る。
り発現ベクターに導入することによって、これを鋳型と
する発現によりhHGFまたはhHGF様物質あるいは
これを含む融合蛋白を得ることができる。得られる組換
えh HG F。
生促進剤、肝機能改善剤、肝炎治療剤あるいは肝硬変抑
制剤等肝疾患の治療薬となる可能性がある。
、その要旨を越えない限り、以下の実施例に限定される
ものではない。
の作製 劇症肝炎患者血漿より、J、Cl1n、Invest、
、81,414 (1988)に記載された方法に従っ
てhHGPを精製した。これを5DS−PAGEにかけ
たところ、非還元条件下では、分子1k 76000−
920000)位置にややブロードな単一バンドが現れ
、還元条件下では、分子量56000−65000のや
やブロードなバンドと分子量32000−35000の
バンドの2つのバンドが現れた。この精製hHGF50
μgを5モル濃度の尿素を含有するpH9の50ミリモ
ル濃度のトリス塩酸緩衝液100μlに溶解し、これに
、hHGPに対しモル比で1/200に相当するアクロ
モバクタ−プロテアーゼIを加えて37℃で6時間反応
させた。生成したペプチド混合物は常法により還元カル
ボキシメチル化したのち、J、 T、 Baker社製
Bakerbond W P 0ctyl Co
lumnを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーによ
り分離して、各ペプチドを分取した。
Applied Biosystems社 Mode
1470A)を用いてアミノ酸配列番号を行ったとこ
ろ、表1に示すような配列が見いだされた。
roAspLys2、 GIuPheGly)Iis
GluPheAspLeuTyrGluAsnLys3
、 AspTyrGIu^IaTrpLeuGIyl
leHisAspValHis −G IyArgG
1yAspXXXLys4、 AsnMetGluA
spLeu旧\sArgHisllePheTrpGI
u −ProAspA 1aserLys XXXは未決定のアミノ酸 [2] hHGFの一部をコードするcDNAのスクリ
ーニング (L)プラークハイブリダイゼーションスクリーニング
を行うλファージc DNAライブラリーとして34週
齢のヒト胎盤由来のcDNA(クローンチック社)のス
クリーニングを説明書に従って行った。 100
万クローンのファージを大腸菌Y−1090株に感染さ
せ24.5c m x 24.5c mのシャーレ中の
NZY軟寒天培地[NZY培地:1%N Z−7i ン
、 0.5%イーストイクストラクト、0.5%塩化
ナトリウム、pH7・5に謂整し 0.25%塩化マグ
ネシュウムを加えたもの、NZY軟寒天培地;NzY培
地に0.7%になるように寒天法を加えオートフレイブ
したもの]中で1枚あたり20万クローンの割合で5枚
分を42℃で一晩培養した。次に培地中のλフアージク
ローンを市販のナイロン膜であるシーンスクリーニング
プラス(デュポン社)上に移し取り、以下に説明するブ
ラークハイプリダイゼーシ3ンを行った。即ち、1枚の
シャーレあたりナイロン膜2枚の割合でファージ粒子を
移し取り、その様にしてできたナイロン膜を0.1M水
酸化ナトリウム−1,5M塩化ナトリュウムが染み込ん
だろ紙上に2分間静置し別に用意した屹いたろ紙上で水
分を除いた後、次に、同様に2 x 5SCP (2倍
の濃度の5SCP溶液のこと、以下同様の表記方法をと
る。10x S S CP : 1.2M塩化ナトリュ
ウム、150mMクエン酸ナトリュウム、130m M
燐酸二水素力すュウム、1mMEDTA pH7,2
)−0,2Mトリス−塩酸(pH7,4)を染み込ませ
たろ紙上でこのナイロン膜を静置し乾いたろ紙上で風乾
した後、同じ操作を再び繰り返した。こうして処理した
ナイロン膜は、3 x S S C(20倍)濃度のS
SC溶液;3M塩化ナトリウム、0.3Mクエン酸ナト
リウム)−0,1% SDSで80’015分間2回洗
浄し、次にナイロン膜1枚当り5mlのプレハイブリダ
イゼーションmE3XssC,0,1%SDS、 1
0 x Denha 1 t (50倍の濃度のD e
n h a J、 を溶液;1%BSA C牛血清ア
ルブくン)1%ポリビニルピロリドン、及び1%フィ:
y−ル400)、20u g /a+1鮭精子DNAコ
に65℃3時間浸した。次に、表1のペプチド4、すな
わち Asn−Met−Glu−Asp−Leu−旧s
−Arg−H4s−11e−Phe−Trp−Glu−
Pro−Asp−Ala−3er−LysのうちのAs
n−Met−Glu−Asp−Leu−H4sおよび旧
5−11e−Phe−↑rp−G Iu−Proを基に
合或オリゴヌクレオチドを作成した。即ち、前述のアミ
ノ酸配列の順に17塩基64種類(7)T’H23(5
’T−G−T/C/A/G−A−A/G −A/G−T
−C−T/C−T−C−C−A−T−A/G−T−T−
3’ )、17塩基24種類のTM01 (5′−a−
a−T/C−T −C−C−C−A −A/G−A −
A −A/G/T−A−T−^/G−T−G−3’)を
作成した。
の5′末端を反応液[50mM)リス−塩酸pH7,F
3. 10mM塩化マグネシュウム、10m Mメルカ
プトエタノール、100μM [r ” PIA T
P、基質DNAコ中で32p標識した後、常法に従いD
EAEセルロースカラムをかけて余分なモノヌクレオチ
ドを除いた。こうしてできあがった”Ptl識合或合成
ゴヌクレオチドプローブを含むハイブリダイゼーション
液[3XSSC,10x Denha 1 t、 5
0pg/ml鮭精子D N A 1M塩化ナトリウム、
1%SDS、250μg/l鮭請子D N A、
合成プローブ1種頬当り10万c、p、m、/ m 1
32P $1識プローブDNA コ中で前述のフィル
ターをプローブに応じAまたはTを2℃に、GまたはC
を4℃に置き換えて全ての塩基を合計した温度、実際は
プローブにより42℃(TM01)4C3℃(TM01
)で36時間保温した。その後、ナイロン膜を取り出し
、4xSSC溶液中で室温で30分間2回洗い、4 X
SSC溶液でハイブリダイゼーションの時と同じ温度
で30分間2回洗った後2xSSC溶液で室温で15分
間2回洗い、オートラジオグラフィーをとった。
グナルが一致したものは6個あった。
、これらシグナルと一致する軟寒天培地上のプラークを
ガラス管で打ち抜き50μlのクロロフォルム存在下1
mfのT M G 緩衝液[50mM)リス−塩酸pH
7・5.100mM塩化ナトリュウム、10mM塩化マ
グネシュウム及び0・01%ゼラチンコ中でファージ粒
子を一晩抽出し再び大腸菌Y−1090株に感染させ9
cmシャーレ中で適当量培養し前述の方法でプラークハ
イブリダイゼーションを行った。この一連の操作を繰り
返すことによりシグナルに相当するクローンを各々単離
することができた。その結果独立した6個のクローンを
得た。そのうち2個のクローン、すなわちλhl(GF
21と λhllGF502について、含まれるcDN
Aの塩基配列を解析した。
決定 これらのλフアージクローンから以下のようにDNAを
抽出しプラスミドベクターpucts、pUC19及び
−木調ファージベクターM13mp18.M13mp1
9にサブクローニングをおこなった。即ち、500m
l三角フラスコ中の200m lのNZY培地中におい
て、200μmのTMG溶液に懸濁しであるλフアージ
クローン2x 10”p、f、u、 (p、f、u、;
プラーク形成単位)と40μmの大腸菌Y−1090株
2 x 10”を37℃15分置くことにより感染させ
た。15分後さらに1mlのIM塩化力ルシュウムを加
え一晩、概ね14時間はど培養した。次に、2m lの
クロロフォルムを加え10分はど置き、15.8gの塩
化ナトリュウムを加え溶かし、それらを4℃において日
立冷却遠心機5CR208Bで、ローターRPR9−2
を用いて6000回転20分間遠心した上清に20gの
ポリエチレングリコールeoooを加えて十分に溶解し
た後に水中で1時間静置した。これを日立冷却遠心機5
CR208Bで、ローターRPR9−2において600
0回転20分間遠心し沈澱を6m lのA緩衝液[0,
5%NP40.36mM6mM塩化カルシュラムmMh
リスー塩リス−塩酸pH750mM塩化マグネシュウム
、125m M塩化力すュウム、0.5mMEDTA、
0.25%デオキシコール酸、0.6mMメルカブ
トエタノールコに懸濁しここに100μlの10m g
/ m LのデオキシリボヌクレアーゼIと10p
1の10mg/mlのりボヌクレアーゼAを加え30℃
で30分間保温することにより大腸菌由来の核酸を分解
した。その後上記反応液に等量のクロロフォルムを加え
良く攪はんしたのちにトく一遠心機LC−OE3、ロー
ターTS−7で3000回転10分間遠心し上清を得た
。
40%グリセロール溶液[0゜5%NP40.30mM
)リス−塩酸pH7・5 125mM塩化カリウム、
0.5m M E D T A、 0.6m Mメル
カプトエタノール、10%グリセロール]を1ml入れ
ておきその上に3m lの10%グリセロール溶液[0
,5% NP40. 30mM) リ ス
− 塩 酸 pH7−5125m M塩化カリウム、
0.5mMEDTA。
]を重層して準備しておいた上に先はどのヌクレアーゼ
処理をしたファージ懸濁液を重層し、日立超遠心機70
P72、ローターRPS40Tで35000回転1時間
遠心する。遠心後沈澱として落ちてきたファージ粒子を
0.4mlの40mM) リ ス − 塩 西1pH
7・ 5 、 10m M E D T
A、2%SDSに懸濁し4μlの10mg/mlのプロ
テナーゼKを加えて55℃1時間保温を行った。
ノール/クロロフォルムにてファージDNAを抽出しエ
タノール沈澱を行うことにより目的とするファージDN
Aを 200μg得ることが出来た。このファージDN
Aを制限酵素Ec oRIで常法に従い切断しアガロー
ス電気泳動法にて解析した。その結果クローンλhHG
F21から0.2kbと0.85kbと0.72Kbの
3本のEcoRI断片を得た。一方アガロスゲルから該
インサートcDNA断片を常法に従い回収することによ
り目的とするcDNA断片を得ることが出来た。これら
cDNA断片1100nを予め常法に従い制限酵素Ec
oRIによって切断しておいたプラスくドベクターpU
C18、pUc19及び−木調ファージベクタM13m
p18.M13mp19 200ngと10μmの反応
液[66mMトリス−塩酸pH7,13,6,6mMj
jl化マグネシュウム、10m Mジチオスレイトール
、66μMATP、 基質DNAコ中でユニットのT
4DNAリガーゼにより結合しそれぞれのベクターに見
合った宿主の大腸菌を常法に従い形質転換することによ
りEcoRI挿入部位にHGF蛋白質の部分配列を持つ
サブクローンを得た。
angerらのジデオキシ法によって行った。
ものを使用した。その結果、最も長いcDNAを持つク
ローンλh)IGF21の塩基配列をアミノ酸に翻訳す
ると第3図に示すようにすでに明らかにされているアミ
ノ酸配列のうちプローブの設計に使用したアミノ酸配列
とは異なる領域のアミノ酸配列のうちのいくつかを含ん
でいることが判明し、このクローンがhHGFの少なく
とも一部分の領域を含むc DNAであることが判明し
た。また、λhHGF21にはないcDNA断片を含む
クローンλhHGF502のc DNAの塩基配列をS
anger法に従い解析した結果、クローンλh)lG
F502はクローンλh)IGF21と同じ塩基配列を
第2図で示す制限酵素切断部位NcoIの近傍から5°
上流から数えて三番目のEcoR工切断部位の近傍まで
の0.8kbの長さで共有し3′側にλhHGF21に
はない0.7kbの塩基配列をもつことがわかった。λ
hHGF502の塩基配列のうちλh)IGF21の有
しない塩基配列のなかには既に解析されているアミノ酸
配列に相当する塩基配列があることが判明した。これら
2つのクローンの塩基配列を一部が重複する形でつなぎ
あわせるとhHGFのアミノ酸配列の全てをカバーする
ことが判明した。
ドする遺伝子を含むcDNAの塩基配列を表す。図中に
主な、制限酵素の認識部位を併記した。また下線はすで
に明かにされていたアミノ酸配列に対応する部分を示し
そのうち二重下線は最初のクローンを得る際に使用した
プローブに対応するアミノ酸配列を表す。 癌二図 (その2) TGC AAT ACT ATT CAG CGT CAG ACC 40 CGCTGG CAA ACA ACT GAA TGCATC
CAACCT CAA AAT TTG AAGG
AA TCA CCCTGG TGTCCA
AACTGT GAT ATGGGCAACTTA
TCCCAA AAC,LLにJ−」に1f CCA AAT CCA GAT GA丁7GG
GAT TAT TGCCCTGACCAT
CCCGTA ATAACA CGA ACA
AACATAGG^ TCA TTG ATA
AAGGC ATT TCA ACA ^^G ACC AAT ACA AAT ATT CGT CGA CAG CGT CGT TGT TGC ACT GGT CAA GGA CAG ACT CGA CGT GTA AAT CAA ACA AAT ACT ACC ATC TGC ACA ACT AAA ATT ATT TCT CAG TAT CCTCGA GA
A AAT TACTGCCC^ AACATCC
GA (:TTGAT TGT TAT CG
T GGGCTA ACA TGT TCA
ATGCCCTGG TGCTACACG GAA GGT GAT ACCACAACG
AAA CAA TTG CGA^GT T
TG AGA TACAG^TT CAG CCA CCC AAT TGC TG ACA CGT ATT AAT CAG AAT CAG CCC CAG AAT AAT ACA GTA AAA AAT CCA CCC AAA AAC CAG CCA ATA AAT AAT 020 GAG ATG ACT 080 GAT GGG TGT 140 TCCCAA ATT 200 AAT TAT ATG 260 L直=1工り一−4 320 AAT TACTGC 380 GTCATT CGT 440 GTCAAT TTA 500 GGG ATT CCA 560 ATCTGCGGA
Claims (9)
- (1)第1図のアミノ酸配列で表されることを特徴とす
る肝実質細胞増殖因子。 - (2)第1図のアミノ酸配列のうち30番目のグルタミ
ン酸から728番目のセリンまでの配列で表されること
を特徴とする肝実質細胞増殖因子。 - (3)第1図のアミノ酸配列のうち32番目のグルタミ
ンから728番目のセリンまでの配列で表されることを
特徴とする肝実質細胞増殖因子。 - (4)第1図のアミノ酸配列で表される肝実質細胞増殖
因子をコードすることを特徴とする遺伝子。 - (5)第1図のアミノ酸配列のうち30番目のグルタミ
ン酸から728番目のセリンまでの配列で表される肝実
質細胞増殖因子をコードすることを特徴とする遺伝子。 - (6)第1図のアミノ酸配列のうち32番目のグルタミ
ンから728番目のセリンまでの配列で表される肝実質
細胞増殖因子をコードすることを特徴とする遺伝子。 - (7)第2図の塩基配列で表される肝実質細胞増殖因子
をコードすることを特徴とする遺伝子。 - (8)第2図の塩基配列のうち88番目のグアニンから
2187番目のグアニンまでの配列で表される肝実質細
胞増殖因子をコードすることを特徴とする遺伝子。 - (9)第2図の塩基配列のうち94番目のシトシンから
2187番目のグアニンまでの配列で表される肝実質細
胞増殖因子をコードすることを特徴とする遺伝子。
Priority Applications (9)
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---|---|---|---|
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DE199090115397T DE412557T1 (de) | 1989-08-11 | 1990-08-10 | Wachstumsfaktor aus parenchymalen lebenszellen, dafuer kodierendes gen, verfahren zur herstellung dieses faktors und transformanten. |
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Cited By (3)
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WO1993008821A1 (en) * | 1991-11-07 | 1993-05-13 | Toshikazu Nakamura | Side effect inhibitor for cancer therapy |
EP1293511A4 (en) * | 2000-06-22 | 2005-11-30 | Nippon Zenyaku Kogyo Ltd | GROWTH FACTOR FOR CANINE HEPATIC CELLS |
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6322526A (ja) * | 1986-07-14 | 1988-01-30 | Shuji Hashimoto | 肝細胞増殖因子 |
JPH03130091A (ja) * | 1989-06-05 | 1991-06-03 | Toyobo Co Ltd | 組換ヒト肝実質細胞増殖因子 |
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1989
- 1989-08-11 JP JP1209449A patent/JP2577091B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6322526A (ja) * | 1986-07-14 | 1988-01-30 | Shuji Hashimoto | 肝細胞増殖因子 |
JPH03130091A (ja) * | 1989-06-05 | 1991-06-03 | Toyobo Co Ltd | 組換ヒト肝実質細胞増殖因子 |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993008821A1 (en) * | 1991-11-07 | 1993-05-13 | Toshikazu Nakamura | Side effect inhibitor for cancer therapy |
EP1293511A4 (en) * | 2000-06-22 | 2005-11-30 | Nippon Zenyaku Kogyo Ltd | GROWTH FACTOR FOR CANINE HEPATIC CELLS |
US7129064B2 (en) | 2000-06-22 | 2006-10-31 | Nippon Zenyaku Kogyo Ltd. | Canine hepatocyte growth factor |
US7763591B2 (en) | 2001-11-28 | 2010-07-27 | Anges Mg, Inc. | Hepatocyte growth factor gene therapy for parkinson's disease |
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