JPH03130091A - 組換ヒト肝実質細胞増殖因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は肝実質細胞増殖活性を有するポリペプチド、さ
らに詳しくは、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で肝実質細
胞の維持、増殖を可能にする生理活性を有する新規なポ
リペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、組換
発現ベクター、形質転換体、および該ポリペプチドの製
造法に関するものである。

本発明のポリペプチドは肝実質細胞培養試薬、肝再生促
進剤、肝機能の基礎的研究、肝実質細胞に対する各種ホ
ルモンや薬剤の作用の研究、肝癌の発癌研究用、さらに
該ポリペプチドに対する抗体を用いる臨床診断試薬、肝
疾世、治療薬などへの利用が期待出来る。

〔従来の技術〕

従来、細胞増殖活性を有するポリペプチドとして、上皮
細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ
）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子
（ＰＤＧＦ）　、血管内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）な
どが知られている。これらの細胞増殖因子の他に、生体
外において肝実質細胞増殖活性を有するポリペプチドが
１９８４年に中村らによって再生肝ラット血清より部分
精製され、肝実質細胞増殖因子（以下ＨＧＦと略す）と
命名された。

このＨＧＦの発見まで肝実質細胞は、各種の株化細胞が
活発に増殖する哺乳動物血清の存在下でも該細胞の増殖
が全く認められず、通常約１週間で培養容器の壁からの
脱落が起こり、生体外での長期培養は不可能であった。

ところが、このＨＧＦの存在下において肝細胞は極めて
良好に増殖し、該細胞の培養が可能となった（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、　Ｂｔｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、ｃｏｍｍｕｎ、、　坐ｈ１４５０．１９８４）
。他の研究者によっても、このＨＧＦ活性は、肝部分切
除手術後の血中、劇症肝炎患者の血中にも存在すること
が確認された。その後、多くの研究者によって精製法、
化学的性質、生物学的性質が明らかにされたが、このＨ
ＧＦあるいはＨＧＦと同様の肝細胞増殖活性を有するポ
リペプチドのアミノ酸構造を同定するまでには至らなか
った。

このような状況の下で、本発明者らは、先にラット血小
板からＨＧＦを分離精製して研究を重ね、この血小板由
来のＨＧＦは、２種のサブユニットからなり、このＨＧ
Ｆは生体外において肝実質細胞を極めて良好に増殖させ
ることを見出すとともにＨＧＦに含有される一部のアミ
ノ酸配列２７残基を同定することに成功した（特願昭６
３−３１１８６６号公報）。

〔発明が解決しようとする課題〕

生体内ＨＧＦは、肝組織あるいは血小板などから極＠量
分泌されるポリペプチドであるため、原材料組織の入手
、１（ＯＦの収量、安定供給など問題点が多い。このＨ
ＧＦを肝実質細胞の培養や肝細胞の研究用として利用す
るためには、その構造を明らかにしＨＧＦあるいはＨＧ
　Ｆと同様な活性を有するポリペプチドを遺伝子組換技
術を応用して大量に供給することが望まれている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた
結果、ラット肝１１ｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡライ
ブラリーより、ラット血小板由来のＨＧＦのアごノ酸配
列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブと
して用い、ラットＨＧＦβ鎖ポリペプチドをコードする
塩基配列を含有するｃＤＮＡが得られることを見出した
。さらに、ラット由来の該ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの全部あるい
はその一部をプローブとして、ヒト肝臓ｍＲＮＡより調
製されたｃＤＮＡライブラリーよりヒトＨＧＦポリペプ
チドをコードする塩基配列を含有するｃＤＮＡが得られ
ることを見出した。さらに、該ＣＤ　Ｎ　Ａを含有する
＆ｌｌ換発現ベクターによって形質転換された形質転換
体、該形質転換体を培養してヒトＨＯＦ遺伝子が発現す
ることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は組換ヒト肝実質細胞増殖因子、ヒト
肝実質細胞増殖因子をコードする塩基配列を含有するＤ
ＮＡ、該ＤＮＡを発現し得る組換発現ベクター、および
該組換発現ベクターで形質転換された形質転換体、およ
び該形質転換体を培養し、該培養物から組換ヒト肝実質
細胞増殖因子を採取・製造する方法である。

本発明のヒト肝実質細胞増殖因子をコードするＤＮＡ、
組換発現ベクター、および形質転換体は、例えば次のよ
うにして調製される。

すなわち、（１）ラット肝細胞やラット巨核球などの動
物組織よりｍＲＮＡを単離し、常法に従ってｃＤＮＡラ
イブラリーを作製し、（２）合成オリゴヌクレオチドプ
ローブ、あるいは抗体を用いてラットＨＧＦのｃＤＮＡ
を単離するため、上記ラット由来ｃＤＮＡライブラリー
のスクリーニングを行い、単離されたクローンより目的
とするｃ　ＤＮＡを抽出し、このラット由来ＨＧＦのｃ
ＤＮＡをプローブとして、ヒト肝ｍＲＮＡより調製した
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、単離さ
れたクローンより目的とするヒト由来ＨＧＦのｃＤＮＡ
を抽出する。（３）このヒト由来ＨＧＦのＣＤＮＡより
ヒトＨＧＦをコードするｃＤＮＡ断片を制限酵素を用い
て切り出し発現用ベクターに組み込み、（４）得られた
組換発現ベクターにより宿主細胞を形質転換して形質転
換体を得、（５）この形質転換細胞を培養して、その培
養上清から本発明のヒトＨＧＦを採取・製造することが
出来る。さらに形質転換細胞中の組換発現ベクターから
制限酵素処理によって本発明のヒトＨＧＦをコードする
塩基配列を含有するＤＮＡを得ることが出来る。

以下、本発明の各工程について詳細に説明する。

（１）ｍＲＮＡの単離とｃＤＮＡライブラリーの調製：
ラットまたはヒトのＨＧＦをコードするｍＲＮＡはラッ
ト巨核球細胞、ラットまたはヒト肝ＩＪ１＃ｓなどから
各々得ることが出来る。例えば、８ｉｏｃｈｅｍ−４ｓ
ｔｒｙ、　、ｌＪｌ、　５２９４　（１９７９）に記載
されているＪ、　）Ｉ。

Ｃｈｉｒｇｖｉｎらの方法によって、ラット巨核球細胞
、またはラントもしくはヒト肝Ｍｉ織のグアニジンチオ
シアン酸ン容液から得たＲＮＡをさらにオリゴ（ｄＴ）
セルロースカラムを用いる液体クロマトグラフィに付す
ことによってＮｌ　ｍ　ＲＮ　Ａを調製することが可能
である。

また、ヒト肝ｍＲＮＡのようなりＪ物細胞や動物＆１１
織などの各種ｍＲＮＡは、市販品としてクロンテ・ンク
社などから購入して利用することも出来る。

これらのｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いて、例
えばＨ，Ｏｋａｙａｍａらの方法（Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ
。

Ｂｊｏｌ、、２　１６１．１９ｇ２、およびＭｏ１．　
Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ−＋３、２８０．１９８３）ある
いはＵ、　Ｇｕｂｌｅｒらの方法（Ｇｅｎｅ。

２５、２６３．１９８３）に従ってｃＤＮＡを合成し、
このｃＤＮＡをプラスごドやファージなどに組み込むこ
とによりｃＤＮＡライブラリーを調製することが出来る
。ｃＤＮＡを組み込むプラスミドベクターとしては、大
腸菌由来のｐＢＲ３２２（東洋紡績Ｌ　ｐＵｃｌＢおよ
びｐＵｃ１９（東洋紡績）、枯草菌由来のｐＵＢｌｌｏ
（シグマ社）などがある。またｃＤＮＡを組み込むファ
ージベクターとしては、λｇｔｌｏおよびλｇｕｌｌ（
東洋紡績）などがある。これらのベクターは、宿主細胞
内に保持されて複製、増幅されるものであれば、ここに
例示したものに限定されるものではない。

ｍＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡをプラスミド
またはファージに組み込んでｃ　ＤＮＡライブラリーそ
ＵＮ製する方法として、Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓの方法
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　
１．９８２．９．２３９）またはＴ、　Ｖ、　Ｈｙｕｎ
ｈらの方法（ＯＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ［４９，１９８５）を各
々例示することが出来る。また、ｍＲＮＡと同様に各種
のｃＤＮＡライブラリーを市販品としてクロンチック社
などから購入することが出来るのでそれらを利用するこ
とも出来る。

（２）　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーのクローニング：
ｃＤＮＡライブラリーとして得られたプラスミドやファ
ージなどの組換発現ベクターは、大腸菌のような適切な
宿主細胞に保持される。宿主となり得る大腸菌としては
、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＮＭ５１４
．Ｃ６００（ストラフジーン社）、ＮＭ５２２．ＪＭＩ
ＯＩ　（ファルマシア社）などを例示することが出来る
。ｃＤＮＡのヘクターがプラス旦ドの場合、塩化カルシ
ウム法、塩化カルシウム・塩化ルビジウム法などを用い
て、またｃＤＮＡのベクターがファージの場合、インビ
トロパッケージング法などを用いてあらかじめ増殖させ
た宿主細胞に保持させることが出来る（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２ｐ、　２
４９）。

このようにして得られた形質転換体から、ラット肝実質
細胞増殖因子の部分のアミノ酸配列をコードするオリゴ
ヌクレオチドを合成し、このオリゴヌクレオチドを３ｔ
ｐ標識したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼー
ション法（Ｇｅｎｅ＋　ＩＣＬ６３、１９８０）　、プ
ラークハイブリダイゼーション法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　
１９６　１８０．１９７７）などによってｃＤＮＡクロ
ーンを釣り上げることが出来る。また、目的とするポリ
ペプチドに対する抗体を用いて、標識抗体法（ＤＮＡ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒ
ｏａｃｈｌ　　４９、１９８５）によって、ｃＤＮＡク
ローンをクローニングすることも可能である。このよう
にしてクローン化された形質転換体は、ラント由来ＨＧ
Ｆの全アミノ酸配列あるいはその部分のアミノ酸配列を
コードする塩基配列を有するｃＤＮＡを含有している。

次に該形質転換体から常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８２
）に従ってプラスミドやファージなどのＭｉ換ＤＮＡを
単離し、そのまま、あるいは制限酵素で消化してからｃ
ＤＮＡ塩基配列が決定される。最初に得られた該ラット
由来ｃＤＮＡをプローブとして、ラットとヒトの間のｃ
ＤＮＡ塩基配列のホモロジーを利用して、同様の方法に
よってヒト肝由来ｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡライ
ブラリーのクローニングを行うことが出来る。得られた
ラットあるいはヒト由来ＨＧＦのｃＤＮＡの塩基配列は
、マクサムとギルバートの化学法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７４．５６０．１９
７７）やサンガーのジデオキシ法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、＋　７４５４６
３、１９７７）などによって決定される。さらに、必要
があれば、記述のｍＲＮＡと塩基配列の決定されたｃＤ
ＮＡの１部あるいはｃＤＮＡの１部の合成ＤＮＡをブラ
イマーにしてプライマーエクステンンゴン法（Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ＋　７
６＋７３Ｌ　１９７９）によって新たにｃＤＮＡを合成
し、上記と同様にしてｃＤＮＡライブラリーから第１の
ｃＤＮＡに連結した第２のｃＤＮＡを含有するプラスミ
ドやファージなどの組換ＤＮＡをクローニングすること
が可能である。このプライマーエクステンシゴンとクロ
ーニングの工程は、必要により複数回繰り返される。

（３）ヒＩ−ＨＧＦ組換発現ベクターの構築：クローン
化されたヒトＨＧＦのアミノ酸配列の全部あるいはその
１部をコードするｃＤＮＡを含有する数種のプラスミド
やファージなどの組換ヘクターから制限酵素によってｃ
ＤＮＡを切り出し、ヒトＨＧＦの発現に適したベクター
のプロモーターの下流に制限酵素とＤＮＡリガーゼを用
いて再結合して組換発現ベクターを作製することが出来
る。

より詳しくは、本発明のヒ）ＨＧＦを効率良く発現させ
るためにＩ換発現ベクターは転写の下流方向に順番に必
要により（１）プロモーター、（２）リポソーム結合部
位、（３）開始コドン、（４）本発明のヒトＨＧＦをコ
ードする塩基配列を含有するＤＮＡ、（５）終止コドン
、（６）ター業ネーターを含むように構築される。

本発明で用いることが出来るＤＮＡのベクターとして、
大腸菌由来のプラスミドｐＢＲ３２２ｐＵｃ１８（東洋
紡績）、枯草菌由来のプラスミドｐＵＢ＋１０（シグマ
社）、酵母由来のプラスミドｐＲＢ１５　（ＡＴＣＣ３
７０６２）、バクテリオファージλｇｌＯ１λｇＬ１１
　（ストラタジーン社）、ウィルスＳＶ４０　（ＢＲＬ
社）、ＢＰＶ（ＡＴＣＣＶＲ−７０３）、レトロウィル
スの遺伝子由来のベクターなどが列挙出来るが宿主内で
複製・増幅可能なベクターであれば特に限定はない。特
に、本発明のし）ＨＧＦを簡便に発現させるには、ＳＶ
４０のようなウィルスの遺伝子由来のヘククーを用いる
のが好ましい。

例えば、前述のクローン化されたヒトＨＧＦをコードす
るＤＮＡをＳＶ４０ベクターの後期領域に結合した組換
発現ベクターは、ＣＯ３細胞（Ｃｅｌｌ。

２３、１７５．１９８１）と呼ばれるサル細胞株に導入
して発現させることが可能である。

プロモーターおよびターミネータ−に関しても、目的と
するヒトＨＧＦをコードする塩基配列の発現に用いられ
る宿主に対応したものであれば特に限定はない。例えば
、プロモーターとして、宿主が大腸菌である場合、ｔｒ
ｐプロモーター、１ａＣプロモーターなどを、宿主が枯
草菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、５ＰＯ２プロ
モーターなどを、宿主が酵母である場合、ＧＡＰプロモ
ータ、ＰＧＫプロモーターなどを、宿主がマウス線維非
細胞やチャイニーズハムスター卵巣細胞のような動物細
胞の場合、ウィルス由来のＳＶ４０プロモーター、Ｈ３
ＶＩ　　ＴＫプロモーターなどを例示することが出来る
。またターくネーターとしては、宿主が大腸菌の場合、
ｔｒｐターミネータ、Ｉｐｐターミネータ−などを、宿
主が枯草菌の場合、ａｍｙＦターくネーターなどを、宿
主が酵母の場合、ＣＹＣ１ターごネーターなどを、宿主
が動物細胞の場合、ＳＶ４０ター旦不−ターＨ３ＶＩ　
　ＴＫターミネークーなどを例示することが出来る。こ
れらのプロモーターとターミネータ−は用いる宿主に応
じて適切に組み合わされる。

本発明のヒ）ＨＧＦをコードする塩基配列を含有するＤ
ＮＡは、そのＤＮＡが発現されるポリペプチドが、肝実
質細胞増殖活性を有するならば枠に制限はなく、例えば
後述する第４図に示した塩基配列が例示され、さらには
上記塩基配列の一部が置換、欠損、挿入、あるいはこれ
らが組み合わされた塩基配列を有するＤＮＡであっても
よい。

本発明のヒトＨＧＦをコードする塩基配列を含有する２
ｇ　Ｄ　Ｎ　Ａの翻訳開始コドンとしてＡＴＧ、翻訳終
止コドンとしてＴＡＡ、ＴＧＡ、あるいはＴＡＧを有し
てもよい、また必要に応じて開始コドン、あるいは終止
コドンを１つ以上組み合わせたり、他のコドンと組み合
わせて配列してもよく、これらに特に限定はない。さら
に、この組換発現ベクターで形質転換した宿主の選択マ
ーカーとなり得るアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシ
ン耐性遺伝子、Ｄ　ＨＦ　Ｒ遺伝子など１種または２種
以上が該ヘクターの適切な位置に含有されていることが
好ましい。

（４）宿主細胞の形質転換とその培養：このようにして
構築されたヒトＨＧＦ組換発現ベクターは、コンピテン
ト細胞法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、。

ｄ、　１５４．１９７０）、プロトプラスト法（Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａ１ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７５．１９２９．１
９７８）　　リン酸カルシウム法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　
２２１　５５１．１９８３）　　Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅデキス
トラン法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　旦Ｌ１６６．１９８２）
　、電気パルス法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ＋　８１７１６１、１９８４）、
インビ）・ロバンケージング法（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７２，５８１．
１９７５）、つ、イルスベクター法（Ｃｅ１１．３７．
１０５３．１９８４）　、またはマイクロインジェクシ
ゴン法（Ｅｘｐ、　Ｃｅ１１．　Ｒｅｓ。

１５３工３４７．１９８４）などによって宿主に導入さ
れ、形質転換体が作製される。このとき、宿主として既
述の大腸菌の他に、枯草菌、酵母、動物細胞などが用い
られる。特にマウス線維芽細胞Ｃ１２７（Ｊ、　Ｖｉｒ
ｏ！、＋　２６．２９１．１９７８）やチャイニーズノ
＼ムスター卵巣細胞ＣＨ○（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　、丑、　４２１６．１９８０）などの哺乳動物
由来の宿主細胞を用いるのが好適である。

得られた形質転換体は、目的とする組換ヒ）ＨＧＦを産
生させるためにその宿主に応した適切な培地中で培養さ
れる。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、
窒素源、無機物、ビタミン、血清および薬剤などが含有
される。培地の１例としては、形質転換体の宿主が大腸
菌の場合、ＬＢ培地（日水製薬）Ｍ９培地（Ｊ、　Ｅｘ
ｐ、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎｅｔ、。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７２＋ｐ、４３
１）などを、宿主が酵母の場合、ＹＥＰＤ培地（Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　ｖｏｌ、　１．
　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７９．　ｐ、１１７）などを
、宿主が動物細胞の場合、２０％以下のウシ胎児血清を
含有するＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭ１１６４０
培地（日水製薬）などを挙げることが出来る。形質転換
体の培養は、通常２０°Ｃ〜４５℃、ｐＨは５〜８の範
囲で行われ、必要に応して通気、撹拌が行われる。また
、宿主が接着性の動物細胞などの場合は、ガラスピーズ
、コラーゲンピーズ、あるいはアセチルセルロースフォ
ローファイバーなどの担体が用いられる。これら以外の
培地組成あるいは培養条件下でも形質転換体が生育すれ
ば実施でき、これらに限定されるものではない。

（５）ヒトＨＧ　Ｆの精製： このようにして形質転換体の培養上清中または形質転換
体中に生成した組換ヒ）Ｈ（１，Ｆは、公知の塩析法、
溶媒沈澱法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、あ
るいはゲル１Ｉｔａクロマトグラフイ、イオン交換クロ
マトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、アフィニティク
ロマトグラフィなどを組み合わせて分離精製することが
出来る。特に、硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−セ
ファロースイオンクロマトグラフィ、ヘパリンセファロ
ースアフィニティクロマトグラフィ、およびフェニルセ
ファロース逆相クロマトグラフィの組み合わせ、あるい
は硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓセファロースイオ
ンクロマトグラフィ、および抗ＨＧＦ抗体セファロース
アフィニティクロマトグラフィの組み合わせなどが好ま
しく有効な精製法である。

以上述べた方法によって得られた新規な組換ヒトＨＧＦ
は、ラット肝およびラント血小板由来ＨＯＦと同様にラ
ット肝実質細胞の増殖を顕著に促進する活性を示した。

（ＨＧＦ活性の測定） ＨＧＦ活性は、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

８０、７２２９　（１９８３）に記載の方法に準して次
のように測定した。ウィスター系ラットからコラーゲン
還流法によって肝実質細胞を分離精製した。得られたラ
ット肝実質細胞を５％ウシ血清、２ＸｌＯ−９Ｍインス
リンおよび２Ｘ１０−９Ｍデキサメサゾンを添加したウ
ィリアムスＥ培地（フローラボラトリー社）に懸濁し、
２４ウエルマルチプレートに１、２５　Ｘ　１０　’個
／ウェルの濃度で播いた。５％ＣＯ２および３０％０２
および６５％Ｎ２の存在下、３７°Ｃで２０時間培養後
、Ｏ，ｌ　ｕ　ｇ／ｍｌのアプロチニンを添加したウィ
リアムスＥ培地に交換すると同時に所定量の被験試料を
添加した。１５時間後、１５μＣ１／ｍｌの１！５］デ
オキシウリジン１０μｌ／ウエルを添加した。コントロ
ール群には、　Ｉｔｓ　ｌデオキシウリジン添加の１５
分前に５μｓ／ｄのアフィディコリンを添加した。さら
に６時間培養してｌｆｆ１Ｓｌでラヘルした。細胞をｐ
ｌ＋７．４のＰＢＳで２回洗浄後、冷１０％トリクロロ
酢酸水溶液（ＴＣＡ）で固定した。細胞をｌウェル当た
り０．５　ｄのＩＮ水酸化ナトリウム水溶液で可溶化し
、その放射能をガンマカウンターにより測定した。また
放射能測定後の試料の１部をとってローリ−法（Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　月υ工２６５．１９５１）
に従い蛋白量を測定した。被験試料を添加したとき肝実
質細胞に取り込まれた＋２５１の量をコントロールとの
カウントの差として求め、これをラット肝実質細胞蛋白
質１ｍｇ当たりに換算して、ＤＮＡ合威合成（ｄｐｍ／
ｍｇ蛋白質）とした。被験試料のＨＧＦ活性は、同一試
験において上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）　１０　ｎ　ｇ
／１ｒｄｌを用いた時の肝実質細胞のＤＮＡ合戊活性の
５０％に相当する活性を１単位と定義して表示した。

〔発明の効果〕

本発明によれば、肝実質細胞の生体外での増殖を可能と
する新規な生理活性ペプチドが提供される。本発明の組
換ヒ）ＨＧＦは、臨床診断試薬や肝疾患治療薬として有
用である。さらに本発明のＭｉ換とトＨＧＦの作用によ
り増殖維持される肝実質細胞は、例えば肝機能の基礎的
研究用、肝実質細胞に対する各種ホルモンや薬剤の作用
の研究用、肝癌の発癌研究用、あるいは肝炎ウィルスの
生体外培養のための宿主細胞として極めて有用である。

以下、本発明を実施例により、さらに詳しく説明するが
、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

〔実施例〕

実施例Ｉ （１）う・ント肝臓ｍＲＮＡの単離 ラット肝ｍ　ｍ　ＲＮ　Ａは、グアニジンチオシアン酸
法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１８．５２９４．１
９７９）によって抽出し、オリゴｄＴセルロースカラム
クロマトグラフィ法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　６９１４０８、１９７２）
によって精製して調製した。市販食用植物油で希釈した
２０％四塩化炭素をＳＤラット１００ｇ当たりｌｌＲ１
を腹腔内投与した。四塩化炭素投与の１０時間後、肝臓
を摘出した。得られたラット肝！０．９０ｇに５．５Ｍ
グアニジウム溶液（５，５Ｍグアニジンチオシアン酸、
２５ｍＭクエン酸、０．５％ラウリルザルコシンナトリ
ウムからなるｐｌ＋７．０の１容液）１６ｄｆ加えてホ
モシナイス゛シタ。０．５Ｍ　　ＥＤＴＡを含むセシウ
ムトリフロロ酢酸溶液（１３４ｇ／Ｊ）　］、　１１ｍ
１に上記のラット肝分散液１６ｄを重層し、ベックマン
超遠心機、Ｌ８−５５型によ一、７８５０００Ｇ、２２
時間、２２°Ｃの条件下で遠心分離した。ＤＮＡ層を除
去した後、沈降したＲＮＡ層を１ｒＲ１の滅菌した草留
水に熔解した。このＲＮＡ水溶液から冷エタノール沈澱
によって６．２４■のＲＮＡを得た。得られたＲＮＡを
水溶液中で６５゛ｃ、５分、加熱処理した後、１．ｍＭ
　　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ１−リス塩酸緩衝液、ｐＨ
７，５（以後Ｔ　Ｅ　１１衝液と略す）、０．５成に溶
解した。０．ｌＮＮａ○Ｈで活性化した後、０．５Ｍ　
　ＮａＣ１および１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む１０　ｍ　
Ｍ　トリス塩酸緩衝液（ＳＴＥ緩衝液と略す）で平衡化
したオリゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液０．５成
を注入した。約５　ｍｌのＳＴＥ緩衝液で洗浄後、ＴＥ
緩衝液で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡをン容出した。この
ポリ　（Ａ）ＲＮＡ？容ン夜５００ｕｌから冷エタノー
ル沈澱で得られたポリ　（Ａ）ＲＮＡは、再びＴＥ緩衝
液に溶解し、１μｇ／μＥの濃度に調製した。

（２）ラット肝由来のｃＤＮＡライブラリーの作製上記
（１）で得られたポリ（Ａ）ＲＮＡ、５μｌを鋳型とし
てｃＤＮＡ合或システム・プラス（アマジャム社）を用
いてＧｕｂｌｅｒらの方法（Ｇｅｎｅ、　。

益、　２６３．１９８３）に準してｃＤＮＡを合成した
。１末鎖ｃＤＮＡの収量は、ｌｏ１８ｎｇ、２本１１４
　ｃＤＮＡの収量は、１７２９ｎｇであった。この２本
積ｃＤＮＡは、フェノール／クロロホルム（１：　１．
ｖ／ｖ）抽出とエタノール沈澱によって精製した後、Ｓ
ＴＥ緩衝液に溶解し、約０．７μｇ／２０μｌの濃度に
調製してから使用するまで一２０°Ｃで保存した。この
ｃＤＮＡは、ｃ　ＤＮＡクローニングシステムλｇｔｌ
Ｏ（アマジャム社）を用いてＨｕｙｎｈらの方法（ＤＮ
Ａ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｉ、　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌａ
ｐｐｒｏａｃｈ、　　１．４９．１９８２）に準し、次
のようにλｇｔ　ｉｏのＥｃ　ｏＲＩ部位にクローニン
グした。

ＥｃｏＲＩメチラーゼを用いて上記のｃＤＮＡｉ液の２
０μｌをメチル化した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
ｃＤＮＡの両末端にＥｃｏＲＩリンカ−を付加した。過
剰のリンカ−をＥｃｏＲｒ消化し、約１００μｌの反応
液を得た。５ＴＥｌ！街液で平衡化したｃＤＮＡｔＩ製
用ゲル濾過用ゲル濾過カラム液１００μｌを注入した。

ＳＴＢ緩衝波で溶出してｃＤＮＡ画分５００μｌを集め
た。常法によってエタノール沈澱を２回繰り返した後、
減圧乾燥してリンカ−付加ｃＤＮＡを得た。再び、ＳＴ
Ｂ緩衝液にン容解して５０　ｎ　ｇ／μｌのリンカ−付
加ｃＤＮＡ２６μ２を調製した。あらかじめ準備された
λｇｔｌｏアーム１μｇにリンカ−付加ｃＤＮＡ０．１
μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入した。この反応
液は冷エタノール処理した後、軽く乾燥し、得られた組
換Ｄ　Ｎ　Ａの全量を５μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。

この組換ＤＮＡをインビトロパッケージング反応に供し
、λｇｔｌ。

Ｍｉ換ファージを得た。ファージブレーティング用大腸
菌を用いたタイトレージョンにより測定したｃ　ＤＮＡ
　１μｇから得られた＆ｌｌ換ファージ数は、５．０Ｘ
ＩＯｂ個であった。このようにして作製したｃＤＮＡラ
イブラリーは、使用するまで少量のクロロホルムを加え
たＳ　Ｅｍ衝ｅ　（ｌ　ＯＯｍＭＮａＣｌ、ｌｏｍＭ　
　ＭｇＳＯ３，および０．０１％ゼラチンを含む２０ｍ
Ｍ１リス塩酸緩衝液、ｐＨ７，５）中、４°Ｃで保存し
た。

（３）　Ｄ　Ｎ　Ａプローブの合ｒｌｉ：特願昭６３−
３１１８６６号公報に記載のラットＨＧ　Ｆβ鎖Ｎ末端
アミノ酸配列１５個をコードする塩基配列を推定し、オ
リゴヌクレオチド’　ＡＣＣＡＴＣＣＡｒＣＣＩＡＣＩ
ＧＴＩＧＴＩＴＧ　ＩＧＴ　ＩＧＧ　ＩＡＴ　Ｉ　ＣＣ
ＩＴＴ　ＩＡＣＩＡＣ３“（■はイノシンを表わす） をＤＮＡシンセサイザー３８１Ａ（アブライドバイオシ
ステムズ社）により合成した。得られたオリゴヌクレオ
チドをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績）を用
いて［ｒ”Ｐ）ＡＴＰ　（アマジャム社）により標識し
てＤＮＡプローブを作製した。

（４）うｙ　トＨＧＦ遺伝子Ｄ　Ｎ　Ａの部分単離とそ
の塩基配列の決定 上記（２）で得られたｖ１５Ｘ１０’個のＵ換ファージ
を３７°Ｃで１５分間約８Ｘ１０”個の大腸菌ＮＭ５１
４（ストラタジーン社）に感染させた後、約５０゛Ｃに
加塩した０、７％の寒天を含むＬＢ培地２７０　ｍｌに
添加し、２３ｃｍＸ２３ｃｍのＬＢ寒天培地プレート６
枚に均一に流延した。空気中、３７°Ｃで１２時間培養
後、プラークの生したプレート上にニトロセルロースフ
ィルターを約３０秒間密着させた。このニトロセルロー
スフィルターを１．５Ｍ　　ＮａＣｌおよび０．ｌＮ　
　Ｎａ’ＯＨからなるアルカリ溶液に５分間浸漬し、さ
らに０．２　Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ）１７．５）　、
２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　、２ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡおよび２ＸＳＳＣ緩衝液からなる中性溶液に１５
分間浸漬した。

風乾後、８０°Ｃ１２時間熱処理してニトロセルロース
フィルターに各プラークのＤＮＡを固定化した。得られ
たニトロセルロースフィルターは、６ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ１
，ｌ？Ｊｉ液、５×デンハートｌ容／夜、５０ｍＭＰＩ
ＦＥＳ、および１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７，０、
からなるハイフ゛リダイゼーション）客演にンｉ漬し、
６５“Ｃで５時間前処理した。１００°Ｃで５分間熱処
理した上記（３）の”ｐ［２合成オリゴヌクレオチド（
約３Ｘ１０’　ｃｐｍ）プローブとサケ精巣Ｄ　Ｎ　Ａ
　（０，１■／ｍｌ）のｌ昆合溶液を添加し、４５°Ｃ
で１６時間ハイブリダイゼーシゴン反応を行った。反応
後、ニトロセルロースフィルターは５０°Ｃで０．１％
ＳＤＳを含む５ｘＳＳＣ緩衝液によって３回洗浄してか
ら風乾した。このニトロセルロースフィルターを増感ス
クリーン、ライトニングプラス（デュポン社）とＸ線フ
ィルム、ＲＸ（富士写真フィルム）に密着させ、−８０
’Ｃで３０時間露光した。得られた３個の陽性プラーク
を採取し、上記と同し方法によって２次スクリーニング
を行い、得られた１個の陽性クローンをＲＢＣｌと命名
した。このＲＢＣＩファージを常法により増殖させ、Ｒ
ＢＣｌｃＤＮＡを単離精製した。

得られたｃＤＮＡの塩基配列は、シーケネース（ユナイ
テッド　ステート　バイオケミカル社）を用いてジデオ
キシ法によって決定した。第１図にＲＢＣｌｃＤＮＡの
全塩基配列を示す。ＲＢＣＩｃＤＮＡは、ラットＨＧＦ
β鎖をコードする塩基配列（１番目から６９９番目）を
含有する。

（５）ヒ１−ＨＧＦ遺伝子ＤＮＡの単離と塩基配列の決
定： ヒト正常肝臓ｍＲＮＡ（クロンチック社）５μｇを鋳型
にして上記（２）と同様にしてヒト肝由来のＣＤＮＡを
合成した。１本ｔＪｃＤＮＡの収量は、１１１００ｎで
あった。得られたｃＤＮＡの２００ｎｇをアガロース電
気泳動に供し、分画した４〜７ｋｂのｃＤＮＡをシーン
クリーン（バイ第１０１社）で抽出した後、上記（２）
と同様にしてＣＤＮＡライブラリー（１）を調製した。

ｃＤＮＡ１μｇから２Ｘ１０’個の組換ファージを得た
。

マルチプライムＤＮＡ標識システム（アマジャム社）を
用いて〔α”Ｐ）ｄＣＴＰで標識したＲＢＣ１ｃ　ＤＮ
Ａをプローブとして、ハイブリダイゼーション反応温度
および洗浄温度を６０″Ｃ１洗浄液は１＋０．１％ＳＤ
Ｓを含む２ＸＳＳＣ緩衝液とした以外は（４）と同様に
、ヒト肝由来ｃＤＮＡライブラリー（１）の１次スクリ
ーニングおよび２次スクリーニングを行い、陽性クロー
ンＷＢＣ２５を得た。ＨＢＣ２５フアージから常法によ
り単離、精製したＨＢｃ２５ｃＤＮＡを塩基配列解析お
よび制限酵素切断解析に供した。第２図（ａ）にＨＢＣ
２５ｃＤＮＡの制限酵素地図、第３図（ａ）にＨＢＣ２
５ｃＤＮＡの塩基配列の一部を示す。次にＨＢＣ２５ｃ
ＤＮＡに含有する５°ＴＣＡＴＡＡＴＣＴＴＴＣＡＡＧ
ＴＣＴ”の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮ
Ａシンセサイザー３８１Ａ（アプライドバイオシステム
ズ社）により合成した。この合或ＤＮＡ０．７５μｇを
プライマーとし、ヒト肝ｍＲＮＡ２０μｇを鋳型として
ｃ　ＤＮＡ００４μｇを合或し、同様にしてＣＤＮＡラ
イブラリー（ＩＩ）を調製した。このＣＤＮＡライブラ
リー（■）から［α”Ｐ］ｄＣＴＰで標識したＨＢＣ２
５ｃＤＮＡの０．７　ｋ　ｂ　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ断片を
プローブにして陽性クローンＨＡＣ１９を得た。第２図
Ｏ）にＨＡＣ１９ｃＤＮＡの制限酵素地図、第３図（＋
））にＨＡＣ１９ｃ　ＤＮＡの塩基配列の一部を示す。

このようにして得られたＨＢＣ２５ｃＤＮＡおよびＨＡ
Ｃ１９ｃＤＮＡの塩基配列を組み合わせたヒトＨＧＦコ
ード領域の全塩基配列およびその塩基配列から演鐸され
るアミノ酸配列を第４図に示す。ヒ）ＨＣＦの全ｃＤＮ
Ａ塩基配列から、ヒトＨＧＦの翻訳開始コドンは１番目
のＡＴＧであり、終止コドンは２１８５１８５番目Ｇと
推定される。これらの開始および終止コドンの間のヒト
ＨＧＦのｃＤＮＡ塩基配列は７２８アミノ酸残基からな
るボリペフ゛チドをコードし、１番目のＭｅｔに続くア
ミノ酸配列はＬｅｕに富み、２９番目のＡｌａまでがＨ
ＧＦ分泌のためのシグナル配列と推定される。ヒトＨＧ
Ｆα鎖のＮ末端は、ラットＨＧＦα鎖のアミノ酸配列と
の類似性から５５番目のＰｒｏと推定される。同様にヒ
トＨＧＦβ鎖のＮ末端は、４９５番目のＶａｌと准定さ
れる。

また、ヒトＨＣＦの糖鎖の結合部位は、Ａｓｎｘ−３ｅ
ｒ／Ｔｈｒのアミノ酸配列を有する２９４番目、４０２
番目、５６６番目、および６５３番目のＡｓｎと准定さ
れる。

（６）サルＣＯ３細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターの構築
： サルＣＯ３細胞用ヒ）ＨＧＦ発現ベクターｐＥＵＫ　（
ｈＨＧＦ　Ｔ）の構築図を、第５図に示す。

上記（５）で得られたＨＡＣ１９ファージＤＮＡを制限
酵素ＢａｍＨＩと５ｃａｌで消化し、アガロース電気泳
動により０．９　ｋ　ｂのＤＮＡ断片を分離・精製した
。同様にＭＢＣ２５フアージＤＮＡを制限酵素Ｓｅａ　
ＩとＳｍａ　Ｉで消化し、２．１　ｋ　ｂのＤＮＡ断片
を分離・精製した。これらのＤＮＡ断片をあらかじめ制
限酵素ＢａｍＨＩとＳｍａ　Ｉで消化したブルースクリ
プトＫＳＭ１３＋（ストラタジーン社）と混合し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼで結合してプラスミドｐＢＳ　ＣｈＨＧ
Ｆ　ｌ）を得た。

得られたＰｉ３ｓ　（ｈＨＧＦ　Ｉ）を制限酵素Ｘｂａ
■とＳｍａｌで消化した。制限酵素Ｘｂａ　ＴとＳｍａ
ｌであらかしめ消化したＣＯ３細胞用発現ベクターｐＥ
ＵＫ−Ｃ１（クロンチック社）と３．０ｋｂＤＮＡ断片
を虐合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合してヒトＨＧＦ発
現ベクターｐＥＵＫ　（ｈＨＧＦＩＩを得た。

（７）サルＣＯ３細胞の形質転換とヒトＨＧＦ遺伝子の
発現： 得られたｐＥＵＫ　（ｈＨＧＦ　＋）プラスミドをエタ
ノール沈澱した後、１０ｍＭＰＢＳ緩衝液に溶解し、２
μｇ　／　ｍｌに調製した。次に、１０％ウシ胎児血清
（ギブコ社）を含むＤＭＥＭ培地（白水製薬）中で飽和
細胞密度まで増殖させたＣＯ３１細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ
−１６５０）を１０ｍ　Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　緩衝液で２回
洗浄した後トリプシン処理した。同緩衝液で３回洗浄後
、細胞濃度２Ｘ１０’個／　ｍｌになるように再び同緩
衝液に浮遊化した。

先に調製したプラスミド熔ｔｊ、２５０μ２と細胞浮遊
液２５０μｌを混合し、水冷下で１０分間放置した。こ
の氷冷したプラスミド・細胞ｌ昆液に高電圧パルス遺伝
子導入装置ＺＡ−１２００（ＰＤＳ社）を用いて、印加
電圧４ｋＶ／ｃｍ、パルス時間２０ミリ秒の条件下で高
電圧パルスをかけた。得られた細胞を上記の培地で希釈
し、３７°Ｃ１５％ＣＯ２存在下にて３日間培養した。

培養３日目の培養上清中のＨＧＦ活性を前述のラット肝
実質細胞を用いて測定したところ、５０単位／　ｍ（ｌ
であっ一方、ＨＧＦｃＤＮＡを挿入していない発現ベク
ター、ｐＥＵＫ−ＣＬを同し方法によりＣＯ３−１細胞
に導入して培養したが、その培養上清中には、ＨＧＦ活
性を詔めなかった。

実施例２ （１）マウスＣｌ２７細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターの
構築 マウスＣ１２７細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターｐＢＰＭ
Ｔ　ＣｈＨＧＦ［［）の構築図は、第６図に示す。実施
例１で得られたＨＡＣ１９フアージＤＮＡを制限酵素Ｂ
ａｍＨ［と５ｃａｌで消化し、アガロース電気泳動によ
り０．９　ｋ　ｂのＤＮＡ断片を分離・精製した。同様
にＭＢＣ２りファージＤＮＡを制限酵素Ｓｃａ　ＩとＰ
ｓｔｌで消化し、２．１ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精製
した。これらのＤＮＡ断片をあらかしめ制限酵素Ｂａｍ
１とＰｓｔＩで消化したブルースクリプトＫＳＩＩ＋（
ストラタンーン社）と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結
合してプラスミドｐＢＳ　（ｈＨＧＦＩＩ）を得た。

プラスミドρＢＰＭＴを制限酵素ＥｃｏＲＶで消化後、
細菌性アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）でリン酸基
を除去した部位に、プラスミドｐＢＳ（ｈＨＣ；Ｆｉｌ
）を制限酵素Ｘｂａ　ＩとＳａ　Ｉ　ＩとＮａｅｌで消
化しＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした後、アガ
ロース電気泳動により９萬１【・精製した３、　０　ｋ
　ｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより挿入した
。得られたヒ）ＨＧＦ発現ヘクターｐＢＰＭＴ　ＣｈＨ
ＧＦＩＩ）は、ＭＴ−１プロモーターとＳＶ４０初期遺
伝子のポリ（Ａ）付加シグナルの間にヒトＨＧ　Ｆ遺伝
子を有し、この発現ベクターによるマウスＣ１２７細胞
の形質転換は、ウシバピロマウイルス（ＢＰＶ）により
行われる。また形質転換された細胞の選択は、トランス
ボゾンＴｎ５のｎｅｏ遺伝子（Ｇｅｎｅ、　１９．３２
７１９８２）にヘルペスシンプレックスウィルスタイプ
１のチミジンキナーゼ（Ｈ３Ｖ−Ｉ　　ＴＫ）ｉｆｆｆ
ｆ白子由来ロモーターとポリ　（Ａ）付加シグナルを連
結したｎｅｏキメラ遺伝子によって可能となる− （２）マウスＣ１２７細胞の形質転換とヒトＨＧＦ遺伝
子の発現： ヒトＨＣＦ発現ベクターｐＢＰＭＴ　ＣｈＨＧＦ■〕は
、Ｗｉｇｌｅｒらの方法（Ｃｅｌｌ、　１１．２２３．
１９７７）によりマウスＣ１２７細胞へ導入した。

上記（１）で得られた２０μｇのｐＢＰＭＴ（ｈＨＣ，
Ｆｌｌ）プラスミド１を２４０μｌの０．５Ｍ　塩化カ
ルシウム２４０ｕｌに１容解し、２０ｍＭ　　ＨＥＰＥ
Ｓ、２′８０ｍＭ　　ＮａＣｌおよび１．５　ｍ　Ｍリ
ン酸ナトリウムからなる２ＸＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７
，１）、　　２４０ＩＪｆｆｉを攪拌しながら加えた。

室温で３０分攪拌を続はプラスミドとリン酸カルシウム
の共沈殿を形成させた。あらかしめ、１０％ウシ胎児血
清（ギプコ社）および１０ｍＭグルタミンを添加したＤ
ＭＥＭ培地（日永製薬）を用いて５Ｘ１０５個のＣ１２
７細胞を５％ＣＯ□の存在下で３７°Ｃ１２４時間培養
した。培地交換した後、プラスミドとリン酸カルシウム
共沈澱を加え、室温で２０分放置した。さらに３７°Ｃ
で４時間インキユヘートした後、培地を除去し、１５％
グリセリンを添加したＩ　Ｘ　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　緩衝
液を加え室温で５分放置した。培地で細胞を洗浄した後
、培地交換し、さらに３７°Ｃで２日間インキュベート
した。細胞を１０倍に希釈して１■／−〇Ｇ４１８（シ
グマ社）を含む同培地を用いて５％ＣＯｚの存在下で３
７°Ｃ１７日間培養して形質転換細胞を得た。得られた
細胞株から培養上清中のＨＧ　Ｆ活性の高い細胞を限界
希釈法でスクリーニングしヒＩ−ＨＧＦ高産生株ＢＰＨ
８９を得た。この細胞の培養上清中のＨＧＦ産生能は、
２３０万単位／ｌ／日であった。

実施例３ （］）チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞用ヒ）　ＨＧ
Ｆ発現ベクターの構築 チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞用ヒトＨＧＦ発現ベ
クターｐＥＶＭＴ　［ｈＨＧＦＩＩ）の構築図は、第７
図に示す。プラスミドｐＥＶＭＴを制限酵素ＥｃｏＲＶ
で消化後、細菌性アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）
でリン酸基を除去した部位に、実施例２で得られたプラ
スミドｐＢＳ　［ｈＨＧＦｎ）を制限酵素Ｘｂａ　Ｉと
５ａｌｌとＮａｅｌで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
で平滑末端とした後、アガロース電気泳動により分離・
精製した３、ＯｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ
により挿入した。得られたヒトＨＧＦ発現ヘクタ−ｐＥ
ＶＭＴ　（ｈＨＧＦ［Ｉ）は、ＭＴ−１プロモーターと
ＳＶ４０の初期遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナルの間に
ヒトＨＧＦ遺伝子を有する。また、形質転換された細胞
の選択は、マウスＤＨＦＲｉｊｉ伝子にＳＶ４０初期プ
ロモーターとポリ（Ａ）付加シグナルを連結したＤＨＦ
Ｒキメラ遺伝子により可能となる。

（２）チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞の形質転換と
ヒトＨＧＦ遺伝子の発現： ヒトＨＧ　Ｆ発現ベク９−ｐ　Ｅ　ＶＭＴ　（ｈ　ＨＧ
　Ｆ■〕は、実施例２と同様にしてチャイニーズハムス
ターＣＨＯ細胞のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠
ｔＭ　ＣＨＯＤ　Ｕ　Ｋ　Ｘ細胞に導入した。得られた
細胞株は、リポヌクレオシドとデオキシヌクレオシドを
含まず、透析した１０％ウシ胎児血清（ギブコ社）と１
％グルタミンと５０ｎＭメソトレキセートを含むα−Ｍ
ＢＭ培地（フローラボラトリー社）を用いて、培養上清
中のＨＧＦ活性の高い細胞を限界希釈法でスクリーニン
グした。

発生したコロニーは、安定なヒトＨＧＦ高産生株を得る
ために、同培地において７世代まで増殖させた。この細
胞株は、１１００ｎ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、７５０
ｎＭ、および１１０００ｎとメソトレキセートの濃度を
順次増加させながら同培地で生育させ、さらに安定なヒ
トＨＧＦ高産生株ＥＶＨ１９を得た。この細胞のヒトＨ
ＧＦ産生能は、３１０万単位／１．７日であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＲＢＣｌｃＤＮＡの塩基配列を示す。 第２図は、ＨＢＣ２５ｃＤＮＡの制限酵素地図（ａ）お
よびＨＡＣ１９ｃＤＮＡの制限酵素地図（ｂ）を示す。 第３図は、ＨＢＣ２５ｃＤＮＡの塩基配列の一部（ａｌ
及びＨＡＣ１９ｃＤＮＡの塩基配列の一部（ｔ）ｌを示
す。第４図は、ヒ）ＨＧＦコード領域の全塩基配列とア
くノ酸配列を示す。第５図は、サルＣＯ３細胞用ヒトＨ
ＧＦ発現ベクターの構築図を示す。第６図は、マウスＣ
１２７細胞用ヒ１−ＨＧＦ発現ベクターの構築図を示す
。第７図は、チャイニーズハムスターＣＨ○細胞用ヒ）
ＨＧＦ発現ベクターの構築図を示す。 ＧＡＡＴＴ　ＣＣＧＴＧＴＣＡＧＣＧＴＴＧＧＧＡＴＴ
ＣＧＣＡＧＴＡＣＣＣＣＣＡＣＡＡＧＣＡＴＧ　　ＡＣ
ＡＴＣＡＣＴＣＣＣＧＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＡＴＧＣＡ
ＡＧＧ　　ＡＣＣＴＴＡＧＡＧＡ　　ＡＡＡＴＴＡＴＴ
ＧＣＣＧＣＡＡＴＣＣＧＧ　　Ａ丁ＧＧＧＧＣＴＧＡ　
　ＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧ　　ＴＧＴＴＴＴＡＣＣＡ　　
ＣＴＧＡＴＣＣＡＡＡ　　ＣＡＴＣＣＧＡＧＴＴＧＧＴ
ＴＡＣＴＧＣＴ　ＣＴＣＡＡＡＴＴＣＣＣＡＡＡＴＧＴ
ＧＡＣＧＴＧＴＣＡＡＧＴＧ　ＧＡＣＡＡＧＡＴＴＧ　
ＴＴＡＴＣＧＴＧＧＣＡＡＴＧＧＧＡＡＡＡ　　ＡＣＴ
ＡＣＡＴＧＧＧ　　ＣＡＡＣＴＴＡＴＣＣＡＡＡＡＣＡ
ＡＧＧＴ　　Ｃ丁ＧＧＡＣＴＣＡＣＡＴＧＴＴＣＣＡＴ
ＧＴＧＧＧＡＣＡＡＧＡ　ＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡ　ＴＴ
ＴＡＣＡＣＣＧＴ　ＣＡＴＡＴＣＴＴＣＴ　ＧＧＧＡＧ
ＣＣＡＧＡ　ＣＧＣＴＡＧＣＡＡＧＴＴＧＡＣＴＡＡＧ
Ａ　ＡＴＴＡＣＴＧＣＣＧ　ＧＡＡＣＣＣＣＧＡＴ　Ｇ
ＡＣＧＡＣＧＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＧ　ＧＴＧＣＴ
ＡＣＡＣＡＧＧＧＡＡＴＣＣ丁ＣＴＣＧＴＴＣＣＴＴＧ
　　ＧＧＡＴＴＡＴＴＧＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＴＴ
ＧＴＧＡＡＧＧ　　ＡＧＡＴＡＣＴＡＣ＾ＣＣＴＡＣＡ
ＡＴＴＧ　ＴＣＡＡＴＴＴＧＧＡ　ＣＣＡＴＣＣＴＧＴ
Ａ　ＡＴＡＴＣＣＴＧＴＧ　ＣＣＡＡＡＡＣＡＡＡ　Ａ
ＣＡＡＣＴＧＣＧ＾ＧＴＴＧＴＡＡＡＴＧ　ＧＣＡＴＴ
ＣＣＡＡＣＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡ　ＧＴＡＧＧＧＴＧＧ
Ａ　ＴＧＧＴＴＡＧＴＴＴ　ＧＡＡＡＴＡＣＡＧＧＡＡ
ＴＡＡＡＣＡＣＡ　　ＴＣ７ＧＴＧＧＧＧＧ　　ＡＴＣ
ＡＴＴＧＡ丁Ａ　　ＡＡＧＧＡＡＡＧＴＴ　　ＧＧＧＴ
ＴＣＴＴＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＡＡＴＧＴＴＴＴＣＣＡ
Ｇ　ＣＴＡＧＡＡＡＣＡＡ　ＡＧＡＣＴＴＧＡＡＡ　Ｇ
ＡＣＴＡＴＧＡＡＧ　ＣＴＴＧＧＣＴＴＧＧ　ＡＡＴＣ
ＣＡＴＧＡＴＧＴＣＣＡＴＧＡＧＡ　　ＧＡＧＧＣＧＡ
ＧＧＡ　　ＧＡＡＡＣＧＣＡＡＡ　　ＣＡＧＡＴＣＴＴ
ＡＡ　　ＡＣＡＴＴＴＣＣＣＡ　　ＧＣＴＡＧＴＣＴＡ
丁ＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧ　　ＧＣＴＣＡＧＡＴＴＴ　　
ＧＧＴＴＴＴＡＣＴＧ　　ＡＡＧＣＴＴＧＣ丁ＣＧＣＣ
ＣＴＧＣＡＡ丁　ＣＣＴＧＧＡＴＡＡＣＴＴＴＧＴＣＡ
ＧＴＡ　　ＣＡＡＴＴＧＡＴＴＴ　　ＡＣＣＴＡＧＴＴ
ＡＴ　　ＧＧＣＴＧＴＡＣＡＡ　　ＴＣＣＣＴＧＡＡＡ
Ａ　　ＧＡＣＴＡＣＴＴＧＣＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧ　Ｇ
ＣＴＧＧＧＧＣＴＡ　ＣＡＣＴＧＧＡＴＴＧ　ＡＴＣＡ
ＡＣＧＣＡＧ　ＡＴＧＧＴＴＴＡＴＴ　ＡＣＧＡＧＴＡ
ＧＣＴＣＡＴＣＴＧＴＡＴＡ　　ＴＴＡＴＧＧＧＧＡＡ
　　ＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＴＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣ
ＡＡＧＧＣＡＡ　　ＧＧＴＧＡＣＴＴＴＧ＾＾ＴＧＡＧ
ＴＣＴＧ　　ＡＡＴＴＡＴＧＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡ
Ａ　　ＡＡＧＡＴＴＧＧＡＴ　　ＣＡＧＧＡＣＣＴＴＧ
　　ＴＧＡＧＧＧＡＧＡＴＴＡＴＧＧＴＧＧＣＣＣＡＣ
ＴＣＡＴＴＴＧ　ＴＧＡＡＣＡＡＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡ
ＧＡＡ　ＴＧＧＴＴＣＴＴＧＧ　ＴＧＴＣＡＴＴＧＴＴ
ＣＣ丁ＧＧＴＣＧＴＧ　　ＧＡＴＧＴＧＣＣＡＴ　　Ｃ
ＣＣＡＡＡＴＣＧＴ　　ＣＣＴＧＧＴＡＴＴＴ　　ＴＴ
ＧＴＴＣＧＡＧＴ　　ＡＧＣＡＴＡＴＴＡＴＧＣＡＡＡ
ＡＴＧＧＡ　ＴＡＣＡＣＡＡＡＧＴ　ＡＡＴＴＴＴＧＡ
ＣＡ　ＴＡＣＡＡＧＴＴＧＴ　ＡＡＴＡＧＣＣＡＴＡ　
ＧＡＡＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＴＡＴＴＴＧＡ　　ＡＧＣ
ＡＴＣＣＡＴＧ　　ＧＡＴＡＣＡＧＧＡＡ　　ＧＡＴＴ
ＴＣＣＡＡＧ　　ＡＣ丁ＴＣＡＧＧＡ丁　ＴＡＡＡＡＴ
ＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＡＣＡＡ　　丁ＣＣＴＡＡＡＡＣ
Ａ　　ＡＣＴＡＣ丁ＴＧＡＧ　　ＴＧＴＴＧＴＧＡＧＴ
　　ＧＴＴＣＡＧＡＴＡＣ丁ＧＡＴＴＡＡＴＡＴＡＴＧ
ＴＧＧＣＧＴＴ　　ＴＴＣＴＧＴ丁ＧＡＡ　　ＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡ　　ＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡ　　ＴＴＣ第１
図 第２図 σ ■ 第３図（ａｌ ＧＧＡＴＣＣＧ　ＣＣＡＧＣＣＣＧＴＣＣＡＧＣＡＧＣ
ＡＣＣＡＴＧＴＧＧＧＴＧＡＣＣＡＡＡＣＴＣＣ丁ＧＣ
ＣＡＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＣＴ
ＣＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣ丁ＣＣＣＣＡ　　
ＴＣＧＣＣＡ丁ＣＣＣＣＴＡＴＧＣＡＧＡＧ　　ＧＧＡ
ＣＡＴＡＡＧＡ　　ＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡ　　ＴＡＣＡ
ＡＴＴＣＡＣＧＡＡＴτＣＡＡＡＡ　　ＡＡＴＣＡＧＣ
ＡＡＡ　　ＧＡＣＴＡＣＣＣＴＡ　　ＡＴＣＡＡＡＡＴ
ＡＧ　　ＡＴＣＣＡＧＣＡＣ丁　ＧＡＡＧＡＴＡＡＡＡ
ＡＣＣＡＡＡＡＡＡＧ　　ＴＧＡＡ丁ＡＣＴＧＣＡＧＡ
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　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ第４図（５）へ続く

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）組換ヒト肝実質細胞増殖因子。
2. （２）ヒト肝実質細胞増殖因子をコードする塩基配列を
   含有するＤＮＡ。
3. （３）ヒト肝実質細胞増殖因子をコードする塩基配列を
   発現し得る組換発現ベクター。
4. （４）ヒト肝実質細胞増殖因子をコードする塩基配列を
   発現し得る組換発現ベクターにより形質転換された形質
   転換体。
5. （５）ヒト肝実質細胞増殖因子をコードする塩基配列を
   発現し得る組換発現ベクターにより形質転換された形質
   転換体を培養し、該培養液から組換ヒト肝実質細胞増殖
   因子を採取することを特徴とする組換ヒト肝実質細胞増
   殖因子の製造法。