JPH03255096A - 組換ラット肝実質細胞増殖因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は肝実質細胞増殖活性を有するポリペブチＩ・、
さらに詳しくは、生体外（ｉｎ　ｖｉｌ、ｒｏ）で肝実
質細胞の維持、増殖を可能にする生理活性を有する新規
なポリペブチ１、該ポリペブチｌ”をコー１するＩＩ）
　Ｎ八、組換発現ヘクター、形質転換体、および該ポリ
ペブチ１の製造法に関するものである。 本発明のポリペプチドは肝実質細胞培養試薬、肝再生促
進剤、肝機能の基礎的研究、成熟肝実質細胞に対する各
種ホルモンや素剤の作用の研究、肝癌の発癌研究用、さ
らに該ポリペブチ［・に対する？ｊ″Ｌ体を用いる臨床
診断試薬などへの利用が期待出来る。 〔従来の技術］ 従来、細胞増殖活性をイｉするポリペプチドとして、上
皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維非細胞増殖因子（ＦＧ
Ｆ）、神経細胞増動因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因
子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖囚了（１５ｃ（１；
Ｆ）などが知られている。これらの細胞増殖因子の他に
、生体外において成熟肝実質細胞増殖活性をイ１するポ
リペプチドが１９８４年に中村らによって再生肝ラット
血清より部分精製され、肝実質細胞増殖因子（以下ＨＧ
　Ｆと略す）と命名された。 このＨＧＦの発見まで肝実質細胞は、各種の株化細胞が
活発に増殖する哺乳動物血清の存在下でも該細胞の増殖
が全く認められず、通常約１週間で培養容器の壁からの
脱落が起こり、生体外での長期培養は不可能であった。 しかし、このＨＧＦの存在下において肝細胞は極めて良
好に増殖し、該細胞の培養が可能となった（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。 Ｒｅｓ、　ｃｏｍｍｕｎ、、　１２２．１４５０．１９
８４）。他の研究者によっても、このＨＧＦ活性は、肝
部分切除手術後の血中、劇症肝炎患者の血中にも存在す
ることが確認された。その後、多くの研究者によって精
製法、化学的性質、生物学的性質が明らかにされたが、
このＨＧＦあるいはＨＧＦと同様の肝細胞増殖活性を有
するポリペプチドのアミノ酸構造を同定するまでには至
らなかった。 このような状況の下で、本発明者らは、ラット血小板な
どの組織からＨＧ　Ｆを分離精製して研究を重ね、この
血小板由来のＩ−Ｉ　ＣＦは、２種のサブユニットから
なり、生体外において肝実質細胞を極めて良好に増殖さ
せることを見出した。そしてこのＨＣ，Ｆに含有される
一部のアミノ酸配列２７残基を同定することに成功した
（特願昭６３−３１、１８６６号公報〉。 〔発明が解決しようとする課題〕 生体内ＨＧ　Ｆは、肝臓、脳、肺臓、骨髄、ひ臓、胎盤
、腎臓などの臓器あるいは血小板や白血球などの血液細
胞などから極微量分泌されるポリペプチドであるため、
原材料組織の入手、収量、安定供給など問題点が多い。 このＨＧ　Ｆを肝実質細胞の培養や肝細胞の研究用とし
て利用するためには、その構造を明らかにしＨＧ　Ｆあ
るいはＨＧ　Ｆと同様な活性を有するポリペプチドを遺
伝子組換技術を応用して大量に供給することが望まれて
いる。 〔課題を解決するための手段〕 本発明者らは、」二記課題を解決すべく鋭意研究を重ね
た結果、ラット肝臓ｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡライ
ブラリーより、ラント血小板由来のＨＧＦのアミノ酸配
列に基づいて合成したオリゴヌクレオヂドをプローブと
して用い、ラノｌ−ＨＣＦポリペブチ１−をコー１する
塩基配列を含ｆ＋、ｉるｃ　ＤＮＡが得られるＪ、！−
を臥出しノこ。さら（，１、詩ｃ　ＤＮＡを含ｆ１゛す
る組換発！ｊ、！、　、＜ククー１．ごま、゛こ形質中
ｐ）Ａされた形ｇ転操体りｉＨｌ、詮肘質Ｃ・ノ、ｌた
１体夕１（“？養しＹラット−ＨＧ　Ｆ遺伝−１′が発
田５ずと−３とを見出し、本発明を完成さ一１七るに〒
っ六：、ずなわら、本発明は９Ｊｊ段う・Ｉ−ｉｔ　Ｇ
　Ｆ　　ご・）１１ｆＧ　−−べ１３）１ 現１　　　　．＋１．．．１ひ ６、Ａ ＪＩｔ、’Ｌ：び該１ｆｌ’：ｔＣ１ｒ：ｍ４＋”ｌ□
”’・、”ｒ５．ｉ：、：（ｉ’（’・、’Ｊ’、ｉ−
’ｊ・ン’ｐＪ：、、１１１ｉＮ２（−゛・　　・１・
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（、パト定明（２）・、　＋１１ｔ′ｉｔ、、−、、、
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’Ｉ　’ｔ’ｒ　□ｉ：、、ｐｌｔｊ　１’、、ｌ、ｊ
、１、（ＩＩ：　、、”’＋、、　Ｉｆ次Ｑ）、ｌ：”
１（二Ｊ　ｉ’調製１＼：、考゛江１・）ｌ、（１）’
：、’２）１．ト１’１．ｌ１１′］、、ｌ）：１．’
４．；：ｉ″番゛５１の動物組凪よｉＨｌ　ｍ　ＲＮ　
Ａまたは染色体ｒｌＮＡを中離し、常法ζ、二従っ−で
ｃ　ＤＮＡ５イブラリ−または染色体Ｉ）　Ｎ　Ａライ
ブラリーを作製し、（２）標識した合成オリ−１′ヌク
レオチドプローブ、あるいは適切な標識し、たｃｌ）Ｎ
Ａプローブを用いて、−１二記ラント山来（：　Ｉ）　
Ｎ　Ａライブラリーまたは染色体ＤＮＡ１：ｌｆブラリ
ーのスクリーニングを行い、単離され六−りローン。（
、り目的とする１秤またる４２種以上の（：　ｌ’、’
）　Ｎ　Ａまた＋４染色体ｆ）　Ｎ　Ａを抽出する。ま
た、本発明に、ｌ、って明らかにされたＤ　Ｎ　Ａ配列
あるいｊ、１ヒトや動物のｌ（Ｇ　Ｆのアミノ酸配列に
基づいて壽・成１＼ｊ・ンたｌリゴヌクレオヂｌや本発
明により得ｑｌｈ１１１１−！ｌ　７１１１ＧＦｃＤＮ
Ａやジノ１ＨＧＦ染色体ｉ、’、Ｉ　Ｎへζパ・１ゴｙ
ブ１．’ｌ−ブζに用い、またヒト又は動斗’！ｌ　ｆ
７））Ｉ　Ｇ　ｌ・！、：女・ｔする扮、体を用（ハ、
泊接シ・、・１０臓：４５　Ｊ　１１イ１Ｊｉ１１．　
？Ｂｔ細龍Ｊなとから抽出した＋ｒ＋　ＲＮ　Ａ　、ｔ
；Ｚ・＋　１ｉｊｉｌ製またｃｌ−ＩＮＡライブラリー
のスクリーニミ・・シ゛イ４−ｊ１い　ｒｐ　ｚｉｉさ
れ）、：り１コーンより目的と４る一′Ｉ、１山’ｆ１
）＋１Ｃ：Ｆのｃ　ｒ−）　Ｎ　、Ａを抽出する、パ、
ともで□・：１．（、、Ｈ）　１．パ）・ノド山＊、Ｈ
ＣＦのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　に　Ｑう、１・ＨＧＦをコート
するｃ　ＤＮＡ断片を制限酵素を用いで切り出し発現用
ヘクターに組み込み、（４）得られた組換発現ベクター
により宿主細胞を形質転換して形質転換体を得、（５）
この形質転換細胞を培養して、その培養上清から本発明
のラッ）　ＨＧＦを製造することが出来る。さらに形質
転換細胞中の組換発現ベクターから制限酵素処理によっ
て本発明のラッｌ−ＨＧ　Ｆをコートする塩基配列を含
有するＤＮＡを得ることが出来る。 以下、本発明の各工程について詳細に説明する。 （１＞ｍＲＮＡの単離とｃＤＮＡライブラリーの調製ニ
ラノドのＨＣＦをコードするｍ　ＲＮ　Ａはラット巨核
球細胞、またはラット肝組織などから得ることが出来る
。例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋　　１８＋　５
２９４（１９７９）に記載されているＪ、　Ｍ、　Ｃｈ
ｉｒｇｖｉｎらの方法によって、ラント巨核球細胞、ま
たはラット肝Ｍｉ織のグアニジンチオシアン酸溶液から
得たＲＮＡをさらにオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを
用いる液体クロマ１−グラフィによって該ｍＲＮＡをａ
ＩｉＩ製することが可能である。 また、ラット肝ｍＲＮＡのような動物細胞や動物組織な
どの各種ｍＲＮＡは市販品としてクロンチック社などか
ら購入して利用することも出来る。 これらのｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素やポリメラー
ゼ・チェーン・リアクシジン法（ＰＣＲ）を用いて、例
えばＩＬ　Ｏｋａｙａｍａらの方法（Ｍｏ１．　Ｃｅ１
ｌ。 Ｂｉｏｌ、、２．１６Ｌ　１９８２、およびＭｏ１．　
Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ３、２８０．１．９８３）あるい
はり、　Ｇｕｂｌｅｒらの方法（Ｇｅｎｅ２５、２６３
．１９８３）あるいは■、八へ　Ｆｒｏｈｍａｎ　らの
方法（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓ
ｃｉ、　　ＵＳＡ、５５．　８９９８．　１９８８）に
従ってｃＤＮＡを合威し、このｃ　ＤＮＡをプラスξ１
・やファージなどに耕み込むことによりｃＤＮＡライブ
ラリーを調製することが出来る。ｃＤＮＡを組み込むプ
ラスミドベクターとしては、大腸菌由来のｐＢＲ３２２
（東洋紡績）、ｐＵｃ１８およびｐＵｃＩ９（東洋紡績
）、枯草菌由来のｐＵＢ］、］、ｏ（シグマ社）などが
ある。またｃＤＮＡを組め込むファージベクターとし°
ζば、スｇｔｌＯおよびλｇｔｌｌ（東洋紡績）などが
ある。 これらのベクターは、宿主細胞内に保持されて複製、増
幅されるものであれば、ここに例示したものに限定され
るものではない。 ｍ　ＲＮ　Ａを鋳型として合成されたｃＤＮＡをプラス
ミドまたはファージに絹み込んでｃＤＮＡライブラリー
を調製する方法として、Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓの方法
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　
ＳｐｒｉｎｇｔｌａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　
＋９８２．　ｐ、　２３９）またはＴ、　Ｖ、　１ｌｙ
ｕｎｈらの方法（ＩＩＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｐ
ｒａｃｔｉｃａｌ　ＡｐｐｒｏａｃｈＪ、−４９，１９
８５）を各々例示することが出来る。しかし場合によっ
ては、ｍ　ＲＮ　Ａと同様に各種のｃＤＮＡライブラリ
ーを市販品としてクロンチック社などから購入すること
が出来るのでそれらを利用することも出来る。 （２）　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーのスクリーニング
：ｃＤＮＡライブラリーとして得られたプラスミドやフ
ァージなどの組換ベクターは、大腸菌のような適切な宿
主細胞に保持される。宿主となり得る大腸菌としては、
例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｎ　Ｍ５１
４、Ｃ６００（ストラタジーン社）、ＮＭ５２２、ＪＭ
ＩＯＩ　　（ファルマシア社）などを例示することが出
来る。ｃＤＮＡのベクターがプラスミドの場合、塩化カ
ルシウム法、あるいは塩化カルシウム・塩化ルビジウム
法、またｃＤＮＡのベクターがファージの場合、インビ
トロパッケージング法などを用いてあらかしめ増殖させ
た宿主細胞に保持させることが出来る（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣ１ｏｎｉｎ８．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　１９Ｂ２ρ、　
２４９＞。 このようにして得られた形質転換体から、ラッ１−　Ｈ
Ｇ　Ｆの部分のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレ
オチドを合威し、このオリゴヌクレオチドを１２ｐ４１
識したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーショ
ン法（Ｇｅｎｅ、　ｊ−０，６３，１９８０）、プラー
クハイブリダイゼーション法（Ｓ（ｉｅｎｃｅ弯□１．
８０．１．９７７）などによってｃＤＮＡクローンを釣
り上げることが出来る。また、目的とするポリペプチド
に対する抗体を用いて、標識抗体法（１１ＮＡ　　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：　　八　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　Ａｐｐｒ
ｏａｃｈ、１．　４９．　１９８５）によって、ｃ　Ｄ
ＮＡクローンをクローニングすることも可能である。こ
のようにしてクローン化された形質転換体は、ラット由
来ＨＧ　Ｆの全アミノ酸配列あるいはその部分のアごノ
酸配列をコードする塩基配列を有するｃＤＮＡを含有し
ている。 次に該形質転換体から常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ］
ｏｎｉｎｇＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　
ｆ、ａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９
８２）に従って１ラスミドやファージなどの組換１）　
Ｎ　Ａを単離し、そのまま、あるいは制限酵素で消化し
てからｃ　Ｉ）　Ｎ　Ａ塩基配列が決定される。得られ
たラット由来ＨＧＦのｃ　ＤＮＡの塩基配列は、マクサ
ムとギルバートの化学法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ。 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　１４．５６０．１９７７）やサン
ガーのジデオキシ法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ、、　７４．５４６３１．９
７７）などによって決定される。さらに、必要があれば
、記述のｍＲＮＡと塩基配列の決定されたｃＤＮＡの１
部あるいはｃＤＮＡの１部の合成ＤＮＡをブライマーに
してブライマーエクステンション法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７６、７３
１１９７９）によって新たにｃＤＮＡを合成し、」二記
と同様にしてｃＤＮＡライブラリーから第１のｃＤＮＡ
に連結した第２のｃＤＮＡを含有するプラス狗ドやファ
ージなどの組換ＤＮＡをクローニングすることが可能で
ある。このブライマーエクステンションとクローニング
の工程は、必要ｔこより複数回繰り返される。 （３）ラットＨＧ　Ｆ組換発現ヘクターの構築：クロー
ン化されたう、トＨＧＦのア≧ノ酸配列の全部あるいは
その１部をコートするｃＤＮＡを含有する数種のプラス
短トやファージなどの組換ヘクターから制限酵素によっ
てｃＤＮＡを切り出し、ラノＩ・ＨＧ　Ｆの発現に適し
たヘクターのプロモーターの下流に制限酵素とｌ）　Ｎ
　Ａリガーゼを用いて再結合して組換発現ヘクターを作
製することが出来る。 より詳しくは、本発明のラノｌ−ＨＧ　Ｆを効率良く発
現させるために糺換発現ヘクターば転写の方向に順番に
（１）プロモーター、（２）リポソーム結合部位、（３
）開始コドン、（４）本発明のラットＨＧ　Ｆをコート
する塩基配列を含有するＤＮＡ、（５）終止コドン、（
６）ターミネータ−を含むように構築される。 木兄１す１で用いることが出来るＤＮＡのヘクターとし
て、大腸菌由来のブラスミＦ’　ｐ　Ｂ　Ｒ３２２ｐｉ
、Ｊｃｌｌｌｌ（東洋紡績）、枯草菌由来のプラスミド
ｐｔＪＢ］、］、０（ングマ社）、酵母由来のプラスミ
ドｐＲＢ］、５　（ＡＴＣＣ３７０６２）あるいはバタ
テリオファージλｇＬ１０．２ｇ１．１１（ストラタシ
ーン社）、あるいはウィルス５Ｖ４０（Ｂ　ＲＬ社）、
ＢＰＶ（ＡＴＣＣＶＲ−７０３）、しｌ−ロウイルスの
遺伝子由来のヘクター、更にジヒドロ葉酸還元酵素の遺
伝子を含むヘクターなどが列挙出来るが宿主内で複製・
増幅可能なヘクターであれば特に限定はない。特に、本
発明のヒトＨＣ；Ｆを節倹に発現させるにば、ＳＶ４０
のようなウィルスの遺伝子由来のヘクターを用いるのが
好ましい。 例えば、前述のクローン化されたラントＨＧ　Ｆをコー
ドするＤＮＡをＳＶ４０ヘクターの後期領域に結合した
組換発現ヘクターは、ＣＯＳ細胞（ＣｅｌＬ２３．１７
５．１９８１）と呼ばれるサル細胞株に導入して発現さ
せることが可能である。 ブ［＋モーターおよびター旦不一ターに関しても、目的
とするラットＨＧ　Ｆをコードする塩基配列の発現に用
いられる宿主に対応したものであれば特に限定はない。 例えば、プロモーターとして、宿主が大腸菌である場合
、１．　ｒ　ｐプロモーター、ａｃジブロモクーなどを
、宿主が枯草菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、５
ＰＯ２プロモーターなどを、宿主が酵母である場合、Ｇ
ＡＰブロモター、ｌ）　Ｇ　Ｋプロモーターなどを、宿
主がマウス線維芽細胞やチャイニーズハムスター卵巣細
胞のような動物細胞の場合、ウィルス由来のＳＶ４０プ
ロモーター、＋１　Ｓ　Ｖ　１　　”「Ｋプ１：Ｉモー
ターなどを例示することが出来る。またター逅不−ター
としては、宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐターミネータ−
１Ｉｐｐター雲不一ターなどを、宿主が枯草菌の場合、
ａｍｙＦターくネーターなどを、宿主が酵母の場合、Ｃ
ＹＣ１ターξ不一ターなどを、宿主が動物細胞の場合、
ＳＶ４０プロモーターや＋（Ｓ　Ｖ　Ｉ　　Ｔ　Ｋプロ
モーターあるいはメタロチオネインプロモーターやヒー
トショックプロモーターなどを例示することが出来る。 これらのブロモターとターξ不一ターは用いる宿主に応
して適切に組み合わされる。 本発明のラノ１〜ＨＧ　Ｆをコードする塩基配列を含有
するＤＮＡは、そのＤＮＡが発現されるポリペプチドが
、肝実質細胞増殖活性を有するならば第３図に示した塩
基配列に限定するものではなく、塩基配列の一部が置換
、欠損、挿入、あるいはこれらが糺み合わされた塩基配
列を有するｉ）　Ｎ　Ａであってもよい。本発明のう、
７１．　＋−Ｉ　ＣＦをコートする塩基配列を含有する
該Ｉ）ＮＡの翻訳開始コドンとしてＡ　Ｔ　Ｇ、翻訳終
止コ］・ンとしてＩ’ＡＡ、ＴＧＡ、あるいばＴＡＧを
有してもよい。また必要に応し−（開始コドン、あるい
は終止コドンを工つ以上組み合わせたり、他のコドンと
組み合わせて配列してもよく、これらに特に限定はない
。さらに、このｔＩｌ換発現ヘクターで形質転換した宿
主の選択マーカーとなり得るアンピシリン耐性遺伝子、
ネオマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子など１種また
は２種以」二が該ベクターの適切な位置に含有されてい
ることが好ましい。 （４）宿主細胞の形質転換とその培養：このようにして
構築されたラットＨＧ　Ｆ　ＩＪｉ換発現ヘクターは、
コンピテント細胞法（Ｊ、　Ｍｏ１Ｂｉｏ１．．５３．
　１５４．　１９７０）、プロトプラスト法（Ｐｒｏｃ
。 Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ｕｓＡ、　
　７５．　１９２９．　１９７８）　　リン酸カルシウ
ム法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２−２１ｈ　５５１．１９８
３）　　Ｄ　ＥＡＥデキストラン法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、
　、２１５．１．６６、１９８２）、電気パルス法（Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔＪｓ
Ａ、　８Ｌ７１６＋、、　１．９８４）、インヒ［・ロ
バノゲーシング法（Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７２．５
８］、　１９７５）、ウイルスヘククー法（Ｃｅ１１．
３７．１０５：（、１９８４）　、またはマイクＩコイ
ンジェクション法（Ｉミｘｐ、　Ｃｅ１１．　Ｒｅｓ！
互、３．３４７．１９８４）などによって宿主に導入さ
れ、形質転換体が作製される。このとき、宿主として既
述の大腸菌の他に、枯草菌、酵母および動物細胞などが
用いられる。特にマウス線維芽細胞ＣＩ２７　（Ｊ、　
Ｖｉｒｏｌ、、　３６．２９１．１９７８）やチャイニ
ズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　　７７、４２］６．１９８０）など
の浦乳動物由来の宿主細胞を用いるのが好適である。 得られた形質転換体は、目的とする組換ラッ］・ＨＧ　
Ｆを産生させるためにその宿主に応した適切な培地中で
培養される。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭
素源、窒素源、無機物、ビタミン、血清および薬剤など
が含有される。培地の〕例としては、形質転換体の宿主
が大腸菌の場合、ＬＢ培地（日水製薬）Ｍ９培地（Ｊ、
　Ｅｘｐ、　Ｍｏｌ。 Ｇｅｎｅｔ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　１
９７２．ｐ、４３１）などを、宿主が酵母の場合、ＹＥ
ＰＤ培地（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、
　ｖｏｗ、　ｌ＋Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｉ
＋　Ｙｏｒｋ＋　１９７９＋　ｐ、１１７）などを、宿
主が動物細胞の場合、２０％以下のウシ胎児血清を含有
するＭ　Ｅ　ＩＶ！培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭ１１６
４０培地（日水製薬）などを挙げることが出来る。形質
転換体の培養は、通常２０°Ｃ〜４５’Ｃ，ｐｌ−１は
５〜８の範囲で行われ、必要に応して通気、攪拌が行わ
れる。また、宿主が接着性の動物細胞などの場合は、ガ
ラスピーズ、コラーゲンビズ、あるいはアセチルセルロ
ースフォローファイバーなどの担体が用いられる。これ
ら以外の培地組成あるいは培養条件下でも形質転換体が
生育すれば実施でき、これらに限定されるものではな（
５）ラットＨＧ　Ｆの精製： このようにして形質転換体の培養上清中または形質転換
体中に生成した組換う、　ｌ−１（Ｇ　Ｆは、公知の塩
析法、溶媒沈澱法、透析性、限外濾過法、ゲル電気泳動
法、あるいはゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換ク
ロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、アフィニティ
クロマトグラフィなどをわ１み合わせて分離精製するこ
とが出来る。特に、硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ
−セファ１コースイオンクＩ」マ］・グラフィ、ヘパリ
ンセファロースアフィニティクロマ（・グラフィ、およ
びフェニルセファロース逆相クロマトグラソイの組み合
わせ、あるいは硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓセフ
ァ

【コースイオンクｌコマトグラソイ、および抗ＨＧ　
Ｆ抗体上ファＩコースアフィニティクロマトグラフィの
輯み合わせなどが好ましく有効な精製法である。 以上述べた方法によって得られた新規な組換う、１．Ｉ
ＩＣＦは、ラット肝およびラット血小板由来ＨＧ　Ｆと
同様にう７）肝実質細胞の増殖を顕著に促進する活性を
示した。 （ＨＧＦ活性の測定） ］−１ＣＦ活性は、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．八ｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　ＩＳＡ別、　７２２９　（１９８３）に記
載の方法に〈１ｅシて次のように測定した。ウィスター
系ラットからコラーゲン環流法によって肝実質細胞を分
離精製した。得られたラット肝実質細胞を５％ウシ血清
、２Ｘ］、０−９Ｍインスリンおよび２Ｘ１０−９Ｍデ
キザメザゾンを添加したウィリアムスＥ培地（フローラ
ボラトリー社）に懸ン蜀し、２４ウエルマルチブレート
１、２５ＸＩ０５個／ウユルの濃度で播いた。５％ＣＯ
□および３０％０□および６５％Ｎ２の存在下、３７°
Ｃで２０時間培養後、Ｏ−　１　ｔｔ　ｇ　／ｍ１のア
プロチニンを添加したウィリアムスＥ培地に交換すると
同時に所定量の被験試料を添加した。１５時間後、ｊ５
μＣ　ｉ　／　ｍｌの１２５　１デオキシウリジン１０
μ尼／ウエルを添加した。コンＩ・ロール群には、１２
５Ｉデオキシウリジン添加の１５分前に５部ｇ　／　ｍ
ｌのアフィディコリンを添加した。さらに６時間培養し
て１２５Ｉでラヘルした。細胞をｐＨ７、４のＰＢＳで
２回洗浄後、冷１０％ｌ・リクロロ酢酸水溶液（ＴＣＡ
）で固定した。細胞をＪウェル当たり０．　５　ｍＱの
ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液で可溶化し、その放射能を
ガンマカウンターにより測定した。また放側能測定後の
試料の１部をとってローリ−法（Ｊ，　Ｂｉｏｌ．　Ｃ
ｈｅｍ．、　１９３，　２６５．　１９５１）に従い蛋
白量を測定した。被験試料を添加したとき旧実質細胞に
取り込まれた＋２５１の量をコントロールとのカランＩ
・の差として求め、これをラット肝実質細胞蛋白質］．
　ｍｇ当たりに換算して、ＤＮＡ合或合成（ｄｐｍ／ｍ
ｇ蛋白質）とした。被験試料のＨ　Ｇ　Ｆ活性は、同−
拭験において一ヒ皮細胞成長因子（ＥＧＦ）１．Ｏｎｇ
／ｍＲを用いた時の肝実質細胞のＤＮＡ合威台底の５０
％に相当する活性を１中位と定義して表示した。 〔発明の効果〕 本発明によれば、肝実質細胞の生体外での増殖をＦｉＪ
能とする新規な生理活性ペプチドが提供される。本発明
の組換ラットＨ　Ｇ　Ｆは、臨床診断試薬として有用で
ある。さらに本発明のｔｉＩＩ換ラットうＧＦの作用に
より増殖維持される肝実質細胞は、例えば肝機能の基礎
的研究用、肝実質細胞に対する各種ホルモンや薬剤の作
用の研究用、肝癌の発癌研究用、あるいは肝炎ウィルス
の生体外培養のための宿主細胞としで極めて有用である
。 以下、本発明を実施例により、さらに詳しく説明するが
、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 〔実施例〕 実施例１ （１）ラント肝臓ｍＲＮＡの単離ニ ラノド肝臓ｍＲＮＡは、グアニジンチオシアン酸法（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　３８．　５２９４．　１９
７９）によって抽出し、オリゴｄＴセルロースカラムク
ロマトグラフィ法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ
．　Ｓｃｉ，　［ＩＳＡ，　６９１４０８、　１９７２
）によって精製して調製した。市販食用植物油で希釈し
た２０％四塩化炭素をＳＤラツ１−　１　０　０　ｇ当
たり１　ｄを腹腔内投与した。四塩化炭素投与の１０時
間後、肝臓を摘出した。得られたラソ）・肝臓０．　９
　０　ｇに５，５Ｍグアニジウム？容液（５．５Ｍグア
ニジンチオシアン酸、２５ｍＭクエン酸、０．　５％ラ
ウリルザルコシンナトリウムからなるｐｌ＋７．０のン
容ン夜）＋６ｍｆｆｉをカロえてホモジナイズした。０
．１Ｍ　　ＥＤＴＡを含むセシウムトリフロロ酢酸７８
液（］、　ｇ／ｄｉ）　　１　７ｍｌに上記のラット肝
分散液１６ｍｌを重層し、ヘノクマン超遠心機、■７８
ー５５型によって８５０００Ｘｇ，２２時間、２０°Ｃ
の条件下で遠心分離した。ｌ）　Ｎ　Ａ層を除去した後
、沈降したＲＮＡ層を１　ｍＲの滅菌した蒸留水に溶解
した。このＲＮＡ水溶液から冷エタノール沈澱によって
６．２４■のＲＮＡを得た。得られたＲＮＡを］ｍＭ　
　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐｌ＋７
．５（以後Ｔ　Ｅ　１１１　ｊ＃ｊ　？ｌと略す）、０
、　５　ｍｌに溶解し、６５°Ｃ、５分間、加熱処理し
た後、］、Ｍ　　ＮａＣ４２０．５−を加えた。０．Ｉ
ＮＮａＯＨで活性化した後、０、５Ｍ　　ＮａＣｌおよ
び１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液
（ＳＴＥ緩衝液と略す）で平衡化したオリゴｄ′Ｆセル
ロースカラムにＲ．　Ｎ　Ａ溶？ａ　０．　５　ｒｍｌ
を注入した。約５　ｍＲのＳＴＥ緩衝液で洗浄後、ＴＥ
緩衝液で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。このポ
リ　（Ａ）ＲＮＡ？容液５００　ｇ　１．から冷エタノ
ール沈澱で得られたポリ　（Ａ）Ｉ？ＮＡは、再びＴＥ
緩衝液に溶解し、］、　ＩＩ　ｇ／　ｔｔ　ｎの濃度に
調製した。 （２）ラント肝由来のｃＤＮＡライブラリーの作製」二
記（Ｉ］で得られたポリ（Ａ）ＲＮＡ、５μＥを鋳型と
してｃＤＮＡ合戊システム・プラス（アマジャム社）を
用いてＧｕｂｌｅｒらの方法（Ｇｅｎｅ。 ２５、２６３．１９８３）に準してｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを台
底した。１本鎖ＣＤＮＡの収量は、］、　＋０］　＋８
ｎ　ｇ、２本鎖ＣＤＮＡの収量は、＋　１２９　ｎ　ｇ
であった。この２本ｔＵｃＤＮＡは、フェノール／クロ
ロホルム（＋１、ｖ／ｖ）抽出とエタノール沈澱によっ
て精製した後、ＳＴＥ緩衝液に溶解し、約０．７μｇ／
２０μｌの濃度に調製してから使用するまで一２０’Ｃ
で保存した。このｃ　ＤＮＡは、ｃＤＮＡクローニング
システムλｇｔｌＯ（アマジャム社）を用いてＨｕｙｎ
ｈ　らの方法（ＤＮＡ　ＣＩｏｎｉＢ　１．　ａ　ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ、　１．４９．１９８
２）に準し、次のようにλｇ１、１０のＩＦ、　ｃ　ｏ
　Ｒｉ部位にクローニングした。ＥｃｏＲ１メヂラーゼ
を用いて上記のｃＤＮＡ溶液の２０μ℃をメチル化した
後、ｌｌＤＮＡリガゼを用いてｃＤＮＡの両末端にＥ　
ｃ　ｏ　Ｒｌリンカを（（加した。過剰のリンカ−をｌ
？、ｃ、　ｏ　Ｒｌ消化し、約１００μｌの反応液を得
た。Ｓ　ＴｒＥ　ｉ、ｌ析液で平衡化したｃＤＮＡ精製
用ゲル濾過カラムに上記反応液１．００μｌを注入した
。Ｓ　ＴＥ緩衝液で溶出してｃＤＮＡ画分５００μ℃を
集めた。常法によってエタノール沈澱を２１＋１繰り返
した後、減圧乾燥してリンカーイ」加ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを
得た。再び、Ｓ　Ｔ　Ｅ緩衝液に溶解して５０１ｇ／μ
℃のリンカ付加ｃＤＮＡ２６ｔｔ１．を調製した。あら
かしめ準備されたλｇ　ｔ　］、　Ｏアーム１μｆｉｌ
こリンカ−付加ｃＤＮＡ０．１μｇをＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて挿入した。この反応液は冷エタノール処理し
た後、軽く乾燥し、得られた組換１）　Ｎ　Ａの全量を
５μにのＴＥ緩衝液に溶解した。この組換ＤＮＡをイン
ビトロパンケージング反応に供し、λｇｔｌ。 組換ファージを得た。ファージブレーティング用大腸菌
を用いたタイトレージョンにより測定したｃ　ＤＮＡ　
１μｇから得られた組換ファージ数は、５．０ＸＩＯ６
個であった。このようにして作製したｃＤＮＡライブラ
リー（１）は、使用するまで少量のクロロホルムを加え
た３Ｍ緩衝液（１００ｍＭ　　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　　
ＭｇＳＯ４，および０，０１％ゼラチンを含む２０ｍＭ
）リス塩酸緩衝液５．１１１７．５）中、４　’Ｃで保
存した。 （３１Ｄ　Ｎ　Ａプローブの合成 特願昭６３−３１１８６６号公報に記載のラットＨｃ　
Ｆβ鎖Ｎ末端アミノ酸配列１５個をコートする塩基配列
を推定し、オリゴヌクレオチド５ＡＣＣＡＴＣＣＡ　Ｉ
　ＣＣＩＡＣＩＧＴ　ＩＧＴ　ＩＴＣＩ；　Ｉ　ＧＴ　
Ｉ　ＧＧＩＡＴ　Ｉ　ＣＣＩＴＴ　ＩＡＣＩＡＣ’（＋
はイノシンを表わす） をＤＮＡシンセサイザー３８］Ａ（アブライトハイオシ
ステムズ社）により台底した。得られたオリゴヌクレオ
チドをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績）を用
いて〔γ３２Ｐ）ＡＴＰ　（アマジャム社）により標識
してＤＮＡプローブを作製した。 （４）ラットＨｃ　Ｆ遺伝子ＤＮＡの単離とその塩基配
列の決定 」二記（２）で得られた約５×１０５個の組換ファージ
を３７°Ｃで１５分間約８　Ｘ　１．、　Ｏ’個の大腸
菌ＮＭ５１４（ストラフジーン社）に感染させた後、約
５０゛Ｃに加温した０、７％の寒天を含むＬＢ培地２１
０ｍｆｔに添加し、２３ｃｍＸ２３ｃｍの１−、　Ｂ寒
天培地プレート６枚に均一に流延した。空気中、３７“
Ｃで１２時間培養後、プラークの生したプレート上にニ
トロセルｌコースフィルターを約３０秒間密着させた。 このニトロセルロースフィルターを１．５ＭＮａＣｌお
よびＯ，］、　Ｎ　　Ｎ　ａ　ＯＨからなるアルカリ溶
液に５分間浸漬し、さらに０．２Ｍ＋・リス塩酸緩衝液
（ｐＨ７、５）　、２５　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，
５）、２ｍＭ　　ＥＤＴＡおよび２ＸＳＳＣ緩衝液から
なる中性溶液に１５分間侵漬した。風乾後、８０゛Ｃ１
２時間熱処理してニトロセルロスフィルターに各プラー
クのＤＮＡを固定化した。 得られたニトロセルロースフィルターは、６ｘＳＳＣ緩
衝液、５×デンハート溶液、５０ｍＭＰＩＦＥＳ、およ
び１．００ｍＭリン酸１１　ｆ＃ｉ液、ｐｌ＋７．０、
からなるハイフ゛リダイゼーション？容１ｖ、に浸漬し
、６５°Ｃで５時間前処理した。１００°Ｃで５分間熱
処理した上記（３）の″２Ｐ標識合成オリゴヌクレＡヂ
１”　（約３Ｘ１０Ｉｌｃｐｍ）プローブと大腸菌ＤＮ
Ａ　（０，］　ｍｇ／ｍ［）の／Ｉ＝ｈ合溶液を添加し
、４５°Ｃで１６時間ハイフリダイゼーション反１＋ｆ
ｆ、を行った。 反応後、ニトロセルロースフィルターは５０°〔：で０
．１％Ｓ　Ｎ）　Ｓを含む５ｘＳＳＣ緩衝液によって３
同洗浄してから風乾した。この二ｌ・Ｉコセルロースフ
ィルターを増感スクリーン、ライトニングプラス（デュ
ポン社）どＸ線フィルム、ＲＸ（富士写真フィルｌ、）
に密着させ、−８０’Ｃで３０時間露光した。得られた
３個の陽性プラークを採取し、」１記と同し方法によっ
て２次スクリーニングを行い、得られたＩ個の陽性クロ
ーンをＲＢＣ］と命名した。このＲＢＣＩファージを常
法により増殖さセ、ＲＢＣｌｃｌ）ＮＡを単離精製、制
限酵素、切断解析および塩基配列解析に供した。得られ
たｃＤＮへの塩基配列は、シーゲネース（ユナイテンＩ
・ステー１・　ハイオケ鎚カル社）を用いてジデオギノ
）ノ、によって決定した。第１図（ａ）にＲＢＣｌｃＤ
ＮＡの制限酵素地図、第２図（ａ）にＲＢＣｌ、ｃＤＮ
Ａの塩基配列を示す。ＲＢＣｌｃＤＮＡは、ラン１−　
ＨＧ　Ｆ　Ｂ鎖を：】−ドする塩基配列（１番目」から
６９９番目）を含有する。つぎにＲＢＣｌｃＤＮＡ乙こ
含有する”ＡＡＡＴＣＣ’ｒＣＣＡＴＡＴＴＣＴＴＧＴ
Ｃ″′“の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをＩ）
　Ｎ　Ａシンセサイザ−３８１，Ａ（アブライドハイオ
システムズ社）により合成し７た。この合成り　Ｎ’　
Ａ　０．７５　ｔｉ　ｇをブライマーどし、（１）で調
製したラット肝ｍＲＮＡ２０／１ｇを鋳型としてｃ、　
ＤＮＡ０．４１１ｇを合成し、同様にしてｃｌ）ＮＡラ
イブラリー（Ｈ）を調製した。ｃ　ＤＮＡ　Ｉμｇから
２Ｘ１．Ｏ’の組換ファージを得た。マルチプライムＤ
ＮＡ標識システム（アマジャム社）を用いて〔α”Ｐ）
ｄＣＴＰで標識した特願平１−１４２６９７号記載のＨ
ＡＣ１９ｃ　ＤＮＡ　（その制限酵素地図は第３図に示
す通りである〕の０．３　ｋ　ｂＥＣＯＲＩ断片をプロ
ーブにして、ｃＤＮＡライブラリー（ＩＩ）の１次スク
リーニングおよび２次スクリーニングを行ない、陽性ク
ローンＲＡＣ３を得た。ＲＡＣ３ファージから常法Ｇこ
より単離・精製したＲＡＣｃＤＮＡを制限酵素切ｌｙｆ
解析および塩基配列解析に供した。第１図（Ｆ））にＲ
ＡＣ３ｃＤＮＡの制限酵素地図、第２図（ｂ）にＲＡＣ
３ｃＤＮＡの塩基配列を示す。このようにして得られた
ＲＢＣｌｃＤＮＡおよびＲＡＣ３ｃＤＮＡの塩基配列を
組み合わせたランＩ・ＨＧ　Ｆコード領域の全塩基配列
およびその塩基配列から演鐸されるアミノ酸配列を第４
図に示す。う・ノドＩＩ　ＣＦの全ｃ　１）ＮＡ塩基配
列から、ランｌ−Ｉｆ　ＣＦの翻訳開始コｌ−ンは１番
目のＡＴＧであり、終止ごＩＦンは２１８５１８５番目
Ａと推定される。これらの開始および終止コドンの間の
ランｌ−ＨＣＦのｃｌ）ＮＡ塩基配列は７２８アミノ酸
残基からなるポリペプチドをコードし、１番目のＭｅｔ
に続くアミノ酸配列Ｌｌ：　Ｉ−ｅ　ｕに冨の、３０番
目のＡｌａまでがｌ−Ｉ　ＣＦ分泌のためのングナル配
列とｔｌＩ定される。ラット１１　Ｇ　Ｆα鎖のＮ末端
は、ランｌ−ＨＧ　Ｆα鎖のアミノ酸配列の解析から５
６番目のＰｒｏと推定される。同様に、ランｌ−ＨＧ　
Ｆβ鎖のＮ−末端は、４９６＠ＥｌのＶａｌである。ま
たラットＨＧ　Ｆの糖鎖の結合部位は、Ａｓ　ｎ−ｘ−
３ｅ　ｒ／Ｔｈ　ｒのアミノ酸配列を有する２９５番目
、４０３番目、５６９番目、および６５６番目のＡｓｎ
と推定される。 第４図に示すラン）　ＨＧ　Ｆのアミノ酸配列をコンビ
ゴーターによりホモ【コシ−検索を行った結果、ラット
ＨＧ　Ｆはプラスミノーゲン、プラスミン、カリキュレ
インや凝固因子ＸＨなどのセリンプロテアーゼとポモロ
ジーを持つことが見出された。 即ち、ランＩ−ＨＧ　Ｆはぞのα−鎮にクリングル構造
と１１（定される配列を４箇所持っており、またそのβ
−鎖は上記セリンプロテアーゼのプロテアーゼ域に類似
している。しかし、セリンプロテアーゼの活性中心と推
定されているＳｅｒとＨｉｓがラットＨＧ　Ｆのβ−鎖
ではＴｙｒ（６７６番目）とＧｉｎ　（５３５番目）に
それぞれ置換されてい（５）ザルＣＯ３細胞用ヒ１−　
Ｈｃ　Ｆ発現ヘクターの構築 サルＣＯ８細胞用ヒトＨＧ　Ｆ発現ヘクターｐ　ＥＵＫ
［：ｒＨＧＦＩ３の構築図を、第５図に示す。 −］二１（４）で得られたＲ　Ａ　Ｃ３フアージＤ　Ｎ
　Ａを制限酵素ＢｇｌｌｌとＸ　ｈ　ｏ　ｌで消化し、
アガロース電気泳動により０．７　ｋ　ｂのＤＮＡ断片
を分離精製した。制限酵素ＢａｍＨ１とＸ　ｈ　ｏ　ｌ
であらかしめ消化したブルースフリブｌ−３Ｋ ４　ＤＮＡリガーゼにより結合してプラスコトρＲ３　
Ｒ　Ｈ　Ｉを得た。また別にＲＡＣ３ファージＤＮＡを
制限酵素ＸｈｏｌとＥｃｏＲＩで消化し、アガロース電
気泳動により０．　４　ｋ　ｂのＤＮＡ断片を分離精製
した。制限酵素Ｘｈｏ　ｌとＥｃｏＲＩであらかしめ消
化したブルースクリプトＳＫＭ１３＋と０．４ｋｂｌ）
ＮＡ断片を混合し、Ｔ４リガーゼにより結合してプラス
ｓ　トＰＢ　Ｓ　Ｒ　Ｈ　２を得た。 このプラスミドｐＢＳＲＨ２をＥ（、ｏ　Ｒ　Ｉで消化
し、細菌性アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）でリン
酸基を除去した部位に、上記（４）で得られたＲＢＣＩ
ファージＤ　Ｎ　Ａを制限酵素ＩＥ　ｃ　ｏ　Ｒ　Ｉで
消化して、得られた］、４ｋｂＤＮＡ断片を］゛４ＤＮ
Ａリガーセによって挿入しプラスミＦ　ｐ　Ｂ　Ｓ　Ｏ
３を得た。次に、プラスミドｐ　Ｂ　Ｓ　Ｒ　Ｈ　２を
制限酵素Ｘｂａ　ｌとＸｈｏｌで消化し、アガロース電
気泳動により０．　７　ｋ　ｂ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を分離
精製した。 向様にプラスミｌｐＢ　Ｓ　Ｒ　１１　３を制限酵素Ｘ
ｈ。 ＩとＢａｍＨＩで消化し、１．８ｋｂｒ）ＮＡＩｉｌ’
ｉ片を分ＭＡＲ製した。制限酵素Ｘｂａｌ、Ｂ　ａ　ｍ
　Ｈ　Ｉてあらかしめ消化したブルースフリブｌ−ＫＳ
Ｍ］３］　（ス［・ラタジーン社）と０．　７　ｋ　ｂ
　Ｉ）　Ｎ　Ａおよび１、８ｋｂＤＮＡ断片を混合し、
Ｔ　４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼにより♀占合してブラスミ
ｌ”　ｐ　Ｂ　Ｓ　（　ｒ　Ｈ　Ｇ　Ｆ　ｌ　）（微王
研菌寄第１　１．　０　５　１号）を得た。得られたｐ
Ｂｓ［ｒＨＧＦＩ）を制限酵素ＸｂａｌとＢａｍＨ）で
消化し、２．５ｋｂＤＮＡ断片を得た。制限酵素Ｘ　ｌ
）　ａ　ＩとＢ　ａ　ｍ　Ｈ　ｌであらかしめ消化した
細胞用発現ヘクターｐ　ＥＵＫ−Ｃ　Ｉ　　（りｌコン
テンク社）と２．５ｋｂＤＮＡ断片を混合し、Ｔ　Ａ．
　ＤＮＡリガーゼで結合してラットＨ　Ｇ　Ｆ発現ヘク
タ−ｐＥＵＫ　（ｒＨＧＦ　Ｉ）を得た。 （６）ザルＣＯ３細胞の形質転換とランｌ−　Ｈ　Ｇ　
Ｆ遺伝子の発現 得られたｐＥＵＫ　［ｒＨＧＦＩ］プラスごドをエタノ
ール沈澱した後、１．０ｍ．ＭＰＢＳ緩ｉ（１液に溶解
し、２０μｇ　／　ｍｌに調製した。次に、１０％ウシ
胎児血清（ギブコ社）を含むＤＭＥＭ培地（白水製薬）
中で増殖させた対数増殖期のＣＯ３１細胞（ＡＴＣＣ　
ＣＲＬ−１６５０）を１．ＯｍＭＰＢＳ緩衝液で２回洗
浄した後トリプシン処理した。同緩衝液で３回洗浄後、
細胞濃度２ＸｌＯ’個／　ｍｌになるように再び同緩衝
液に浮遊化した。 先に調製したプラスミド溶？Ｐｊ．　２　５　０μｌと
細胞浮遊液２５０μ℃を混合し、水冷下で１０分間放置
した。この氷冷したプラスｓ　＋・・細胞混液に高電圧
パルス遺伝子導入装置ＺＡ−１２００　（ＰＤＳ社）を
用いて、印加電圧４ｋＶ／ｃｍ、パルス時間２０ごり秒
の条件下で高電圧パルスをかＩＪた。得られた細胞を」
１記の培地で希釈し、３７°Ｃ１５％ＣＯ２存在ト１こ
て３目間培養した。ｌｉｆ養３日目の培養上清中のＨ　
Ｇ　Ｆ活性を前述のう・７ト肝実質細胞を用いて測定し
たところ、３２単位／　ｍｌであった。一方、１（ＧＦ
ｃＤＮＡをｔＩｐ人していない発現ヘクター，ｐＦＥＵ
Ｋ−Ｃ１を同し方法によりＣＯ３−１細胞に導入して培
養したが、その培養」二清中には、ｌ（Ｇ　Ｆ活性を認
めなかった。 実施例２ （］）マウスＣ１２７細胞用ラノｌ−　Ｈ　Ｇ　Ｆ発現
ヘククーの４１４築 マウスＣｌ２７細胞用ラノ＋−　ｏ　ｃ　Ｆ発現ヘクタ
−ｐＢＰＭＴ　［ｒＨＧＦ　ｌ］の構築図は、第６図に
ホ１。ブラスミＩ’　ｐ　Ｂ　Ｐ　Ｍ　ｉ’を制限酵素
ＦＥ　ｃ　。 ＲＶで消化後、細菌性アルカリフォスファターセ（　Ｂ
　Ａ　Ｐ　）でリン酸梨を除去した部位に、実施例１で
得られたプラスミｌ″ｐＢＳ　［ｒｌ−ＩＧＦ　ｌ）を
制限酵素Ｘｂａ　ＩとＢａｍｔ（Ｉで消化し］’　４　
Ｄ　ＮＡポリメラーゼで平ｄ１末端どした後、アガロー
ス電気泳動により分離・精製した２．　５　ｋ　ｂのＩ
）ＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより挿入した。得ら
れたラットｉ（ＣＦ発現ヘクターｐＢＰＭＴ（ｒＨＧＦ
Ｉ）は、ＭＴ−１プロモーターとＳＶ４０初期遺伝子の
ポリ（Ａ）付加シグナルの間にラットＨＧ　Ｆ遺伝子を
有し、この発現ヘククーによるマウスＣ１，２７細胞の
形質転換は、ウシバピロマウイルス（ＢＰＶ）により可
能となる。また形質転換された細胞の選択は、トランス
ボゾンＴｎ５のｎｅｏ遺伝子（Ｇｅｎｅ、　、１９．３
２７，１．９８２）にヘルペスンンプレソクスウイルス
タイブ１のチミジンキナーゼ（Ｈ３Ｖ−］　　ＴＫ）遺
伝子由来のプロモーターとポリ（Ａ）付加シグナルを連
結したｎｅ。 キメラ遺伝子によって可能となる。 （２）マウスＣ１２７細胞の形質転換とランｌ−１１Ｃ
Ｆ遺伝子の発現： う、ｙ　）　ＨＧ　Ｆ発現ベクターｐＢＰＭＴ（ｒＨｃ
Ｆｌ）は、Ｗｉｇｌｅｒらの方法（Ｃｅ１１．旦、　２
２３．１９７７）によりマウスＣ１２７細胞へ導入した
。 上記（１）で得られた２０ｔｉｇのｐＢＰＭＴ（ｒＨＧ
ＦＴ）プラスミドを２４０μｉの０．５Ｍ　塩化カルシ
ウム２４０ｕｎに７容解し、２０ｍＭＨＥ＋）　Ｅ　Ｓ
、２８０ｍＭ　　ＮａＣ］および１．５ｍＭリン酸すｌ
−リウムからなる２　Ｘ　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ緩衝液（ｐ
Ｈ７，１）、２４０μｅを攪拌しながら加えた。 室温で３０分攪拌を続はプラスク）・とリン酸カルシウ
ムの共沈澱を形成させた。あらかしめ、１０％ウシ胎児
血清（ギブコ社）およびｌ０ｍＭグルタよンを添加した
ＤＭＥＭ培地（日永製薬）を用いて５Ｘ１．０５個のＣ
１２７細胞を５％Ｃ０２の存在−ドで３７°Ｃ２２４時
間培養した。培地交換した後、プラスミドとリン酸力ル
ソウム共沈澱を加え、室温で２０分放置した。さらに３
７゛Ｃで４時間インキユヘートした後、培地を除去し、
１５％グリセリンを添加した１ｘＨＥＰＥＳ緩衝液を加
え室温で５分放置した。培地で細胞を洗浄した後、培地
交換し、さらに３７゛Ｃで２日間インキュベートした。 細胞を１０倍に希釈してｌ　ｍｇ　／　ｍｆｔのＧ４１
８（シグマ社）を含む同培地を用いて５％ＣＯ□の存在
下で３７°Ｃ１７日間培養して形質転換細胞を得た。得
られた細胞株から培養上清中のＨＧ　Ｆ活性の高い細胞
を限界希釈法でスクリーニングしラントＨＧ　Ｆ高産生
株ＢＰＲ７７を得た。この細胞の培養上清中のＨＧＦ産
生能は、１．５力率位／Ｅ／日であった。 実施例３ （１）チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞用ラットＨＧ
Ｆ発現ヘクターの構築 チャイニーズハムスターＣＨ○細胞用うン１〜１４ＣＦ
発現ヘクターｐ　ＥＶＭＴ　Ｃｒ　ＨＣ；Ｆ　Ｉ　）の
構築図は、第７図に示す。プラスミドｐＥＶＭＴを制限
酵素ＥｃｏＲＶで消化後、細菌性アルカリフォスファタ
ーゼ（ＢＡＰ）でリン酸基を除去した部位に、実施例１
で得られたプラスミドｐＢＳ　（ｒＨｃＦｌ）を制限酵
素Ｘｂａ　ｌどＢａｍＨＩで消化し、Ｔ４　ＤＮＡポリ
メラーゼで平滑末端とした後、アガロース電気泳動によ
り分離・精製した２、　５　ｋ　ｂのＤＮＡ断片をＴ４
ＤＮＡリガーゼにより挿入した。得られたランｌ−１１
Ｇ　Ｆ発現ヘクターｐ　ＥＶＭＴ　（ｒ　ＨＧＦ　ｌ　
）は、ＭＴ−］プロモーターとＳＶ４０の初期遺伝子の
ポリ（Ａ）付加シグナルの間にラン）ＨＧＦ遺伝子を有
する。また、形質転換された細胞の選択は、マウスＤＨ
ＦＲ遺伝子にＳＶ４０初期プロモーターとポリ（Ａ）付
加シグナルを連結したジヒドロ葉酸還元酵素キメラ遺伝
子（ＤＨＦＲ）により可能となる。 （２）チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞の形質転換と
ランｌ−ＨＧ　Ｆ遺伝子の発現： う７）ＨＧＦ発現ヘクターｐＥＶＭＴ　（ｒＨＧＦＩ）
は、実施例２と同様にしてチャイニーズハムスターＣＨ
○細胞のＤＨＦＲ欠損ＣＨＯＤＵＫＸ細胞に導入した。 得られた細胞株は、リボヌクレオシドとデオキシヌクレ
オシドを含まず、透析したＩＯ％ウシ胎児血清（ギブコ
社）と１％グルタミンと５０ｎＭメソトレキセートを含
むαＭＥＭ培地（フローラポラトり一社）を用いて、培
養上清中のｌ（ＣＦ活性の高い細胞を限界希釈法でスク
リーニングした。発生したコロニーは、安定なう、）Ｈ
ＧＦ高産生株を得るために、同培地において７世代まで
増殖させた。その結果、安定なラン）　ＨＧ　Ｆ高産生
株ＥＶＲ２６を得た。この細胞のランｌ−ＨＧ　Ｆ産生
能は、２．３力率位／℃／日であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＲＢＣｌｃＤＮＡの制限酵素地図（ａ）およ
びＲＡＣ３ｃＤＮＡの制限酵素地図（ｂ）を示す。 第２図は、ＲＢＣ］、ｃＤＮＡの塩基配列の（ａ）及び
ＲＡＣ３ｃＤＮＡの塩基配列の（ｂ、ｌを示す。第３図
はＨＡＣ１９ｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。第４図は
、ラットＨＧＦコード領域の全塩基配列とアミノ酸配列
を示す。第５図は、ザルＣＯ３細胞用ラッｌ　ＨＧ　Ｆ
発現ヘクターの構築図を示す。第６図は、マウスＣ１２
７細胞用ラッｌ−ＨＧ　Ｆ発現ヘククーの構築図を示す
。第７図は、チャイニズハムスターＣＨＯ細胞用ラント
ＨＧ　Ｆ発現ヘククーの構築図を示す。 ＋　、−１，−１００００００ ４’Ｊ　　　（Ｄ　　　　Ｉ　　　ＣＪ）　　　ＣＱ　
　　Ｃｏ−１０Ｃ０？＋本　　−ｍ　（’−，１（１’
）　（ｖ）−＋　Ｐ−１＋　＋ｌ　１−１　？−１、−
＋−００００００００００００００の　Ｎ　○　Ｏヤ　
ω　Ｎ　■　　　■　＝　競　嵩　８８　窒　牢　嵩　
８　出　答　蓋　王ヤ寸のＯＮ−一 派 （ＪｆＪ　　　←−←−（コ　　Ｌコ　　（コ　　←−
＜　　（コ　　（コ　　（〔（コ　　←−ヒフ　　００
　　　（Ｊ　　　Ｌコ　　（ｔ　　←−←−（コ　　０
７６一 ←−−＜　の　　　　　（づ　あ　　　　０−ｕ〕　　
ぐに　の　　　　　く〔≧＜に）　　（、Ｊ　　　Ｏｕ
＋−＋（１）−＋　　ｃｌニー　　ロ０Ｑｃ）　　　啜
り　　＋：ｅ＞　　（の　　Ｃｊ−ｔｈ　　ｅ！＋−ト
の　　＜＜　　　＜４　　　＜＜　　　Ｃｊ（ｊ＋　　
ＣｊＬ）←→　Φ 　　ｋｂ し−一一一一」 ！デ　　　　　　（’Ｊ　　　　　　　Ｃ）　　　　　
　　ＱりＣ’−１ｔ’−（’−１（Ｑ ■　　　　０　　　　ト　　　　ト ｑ〕　　　　　　　（す　　　　　　　０Ｑｏ０　　　
　　　０つ　　　　　　　ＣＩ”）＜Ｉｍｑ＋−’　　
　　　＜　　輌ｏ　　ト　■０　ω　　　　＋＋　ω　
　　　Ｏぶ２寸　　（へ）、Ｃ１４わ　　　　＜ｒ　　
　　　＜←ｃＪ？ローーの　　　　○ＯＣｊ（：　　　
　　（ｊ　　ン山っＬｌ＞　　　（）ｌｚ　　　ｄ−（
ｊ、−ｍｕ／’）−〇　　　　〇ロー　　　　Ｃ）Ｃｊ
　　　　　Ｌｌ口ｃｑ（り　Ｃ←　＞　　　　（コ　Ｃ
（コ　ψ（１ニーＣ！１１−１　　　＜−＜ジ Ｑ■　　ロＬｊ　　　ＯＣｊ　　　ば−（へ）０哨　Ｃ
叩　　−α　　○α ０！０　　ｃｂｋ　　　＜の　　ばの ○Ｑ−Ｎｄ−！ｌ：　　　１．り（ｅ　　　ｌｊば［−
＋Ｑ）　　　（）１ｍ０　１．ｊＱ、　　　００（へ）
−＜＞（へ）０−　　〇− （−←？％　　ｌ−ｉト　　○ら ○α　　○−０凶の　一 ＜囚　　０Φ　　（ＪＬｅＶ’）　　嬬り０ば　　（ψ
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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）組換ラット肝実質細胞増殖因子。 （２）ラット肝実質細胞増殖因子をコードする塩基配列
   を含有するＤＮＡ。 （３）ラット肝実質細胞増殖因子をコードする塩基配列
   を発現し得る組換発現ベクター。（４）ラット肝実質細
   胞増殖因子をコードする塩基配列を発現し得る組換発現
   ベクターにより形質転換された形質転換体。 （５）ラット肝実質細胞増殖因子をコードする塩基配列
   を発現し得る組換発現ベクターにより形質転換された形
   質転換体を培養し、該培養液から組換ラット肝実質細胞
   増殖因子を採取することを特徴とする組換ラット肝実質
   細胞増殖因子の製造法。