JP2706704B2 - 組換ヒト肝実質細胞増殖因子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は肝実質細胞増殖活性を有するポリペプチド、
さらに詳しくは、生体外（in vitro）で肝実質細胞の維
持、増殖を可能にする生理活性を有する新規なポリペプ
チドおよび該ペプチドをコードするDNAである。

本発明のポリペプチドは肝実質細胞培養試薬、肝再生
促進剤、肝機能の基礎的研究、肝実質細胞に対する各種
ホルモンの薬剤の作用の研究、肝癌の発癌研究用、さら
に該ポリペプチドに対する抗体を用いる臨床診断試薬、
肝疾患治療薬などへの利用が期待出来る。

〔従来の技術〕

従来、細胞増殖活性を有するポリペプチドとして、上
皮細胞増殖因子（EGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、
神経細胞増殖因子（NGF）、血小板由来増殖因子（PDG
F）、血管内皮細胞増殖因子（ECGF）などが知られてい
る。これらの細胞増殖因子の他に、生体外において肝実
質細胞増殖活性を有するポリペプチドが1984年に中村ら
によって再生肝ラット血清より部分精製され、肝実質細
胞増殖因子（以下HGFと略す）と命名された。

このHGFの発見まで肝実質細胞は、各種の株化細胞が
活性に増殖する哺乳動物血清の存在下でも該細胞の増殖
が全く認められず、通常約１週間で培養容器の壁からの
脱落が起こり、生体外での長期培養は不可能であった。
ところが、このHGFの存在下において肝細胞は極めて良
好に増殖し、該細胞の培養が可能となった（Biochem.Bi
ophys.Res.Commun.,122,1450,1984）。他の研究者によ
っても、このHGF活性は、肝部分切除手術後の血中、劇
症肝炎患者の血中にも存在することが確認された。その
後、多くの研究者によって精製法、化学的性質、生物学
的性質が明らかにされたが、このHGFあるいはHGFと同様
の肝細胞増殖活性を有するポリペプチドのアミノ酸構造
を同定するまでには至らかなった。

このような状況の下で、本発明者らは、先にラット血
小板などの組織からHGFを分離精製して研究を重ね、こ
の血小板由来のHGFは、２種のサブユニットからなり、
このHGFは生体外において肝実質細胞を極めて良好に増
殖させることを見出すとともにHGFに含有される一部の
アミノ酸配列27残基を同定することに成功した（特願昭
63−311866号）。

〔発明が解決しようとする課題〕

生体内HGFは、肝臓、脳、肺臓、骨髄、ひ臓、胎盤、
腎臓などの臓器あるいは血小板や白血球などの血液細胞
などから極微量分秘されるポリペプチドであるため、原
材料組織の入手、HGFの収量、安定供給など問題点が多
い。このHGFを肝実質細胞の培養や肝細胞の研究用とし
て利用するためには、その構造を明らかにしHGFあるい
はHGFと同様な活性を有するポリペプチドを遺伝子組換
技術を応用して大量に供給することが望まれている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ね
た結果、ラット肝臓mRNAより調製したcDNAライブラリー
より、ラット血小板由来のHGFのアミノ酸配列に基づい
て合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、
ラットHGFβ鎖ポリペプチドをコードする塩基配列を含
有するcDNAが得られることを見出した。さらに、ラット
由来の該cDNAの全部あるいはその一部をプローブとし
て、ヒト肝臓mRNAより調製されたcDNAライブラリーより
ヒトHGFポリペプチドをコードする塩基配列を含有するc
DNAが得られることを見出した。また、ヒトの肝臓以外
の臓器や血液細胞のcDNAライブラリーよりヒトHGFcDNA
が得られることも見出した。さらに、該cDNAを含有する
組換発現ベクターによって形質転換された形質転換体、
該形質転換体を培養してヒトHGF遺伝子が発現すること
を見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は組換ヒト肝実質細胞増殖因子およ
びヒト肝実質細胞増殖因子をコードする塩基配列を含有
するDNAである。

本発明のヒト肝実質細胞増殖因子をコードするDNA、
組換発現ベクター、および形質転換体は、例えば次のよ
うにして調製される。

すなわち、（１）ラット肝細胞やラット巨核球などの
動物細胞よりmRNAまたは染色体DNAを単離し、常法に従
ってcDNAライブラリーまたは染色体DNAライブラリーを
作製し、（２）合成オリゴヌクレオチドプローブ、ある
いは抗体を用いて動物、例えばラットのHGFのcDNAまた
は染色体DNAを単離するため、上記動物、例えばラット
由来のcDNAライブラリーまたは染色体ライブラリーのス
クリーニングを行い、単離されたクローンより目的とす
るcDNAまたは染色体DNAを抽出し、この動物、例えばラ
ット由来のHGFのcDNAまたは染色体DNAをプローブとし
て、ヒトの臓器あるいは血液細胞などのmRNAより調製し
たcDNAライブラリーのスクリーニングを行い、単離され
たクローンより目的とするヒト由来HGFのcDNAを抽出す
る。また、本発明によって明らかにされたDNA配列ある
いはヒトや動物のHGFのアミノ酸配列に基づいて合成さ
れたオリゴヌクレオチドや本発明により得られたヒトHG
FcDNAやヒトHGF染色体DNAなどをプローブに用い、また
ヒトまたは動物のHGFに対する抗体を用い、直接ヒトの
臓器あるいは血液細胞などから抽出したmRNAより調製し
たcDNAライブラリーのスクリーニングを行い、単離され
たクローンより目的とするヒト由来のHGFのcDNAを抽出
することもできる。（３）このヒト由来HGFのcDNAより
ヒトHGFをコードするcDNA断片を制限酵素を用いて切り
出し発現用ベクターに組み込み、（４）得られた組換発
現ベクターにより宿主細胞を形質転換して形質転換体を
得、（５）この形質転換細胞を培養して、その培養上清
から本発明のヒトHGFを採取・製造することが出来る。
さらに形質転換細胞中の組換発現ベクターから制限酵素
処理によって本発明のヒトHGFをコードする塩基配列を
含有するDNAを得ることが出来る。

以下、本発明の各工程について詳細に説明する。

（１）mRNAの単離とcDNAライブラリーの調製： 動物、例えばラットまたはヒトのHGFをコードするmRN
Aはラットなどの動物またはヒトの肝臓、腎臓、ひ臓、
肺臓、脳、骨髄、胎盤などの臓器あるいは白血球、巨核
球やリンパ球などの血液細胞などから各々得ることが出
来る。例えば、Biochemistry,18,5294（1979）に記載さ
れているJ.M.Chirgvinらの方法によって、ラットなどの
動物またはヒトの臓器あるいは血液細胞のグアニジンチ
オシアン酸溶液から得たRNAをさらにオリゴ（dT）セル
ロースカラムを用いる液体クロマトグラフィに付すこと
によって該mRNAを調製することが可能である。

また、ヒト肝、脳、胎盤、白血球などのmRNAのような
動物細胞や動物組織などの各種mRNAは、市販品としてク
ロンテック社などから購入して利用することも出来る。

これらのmRNAを鋳型として逆転写酵素やポリメラーゼ
・チェーン・リアクション法（PCR）を用いて、例えば
H.Okayamaらの方法（Mol.Cell.Biol.,２,161,1982、お
よびMol.Cell.Biol.,3,280,1983）あるいはU.Gublerら
の方法（Gene,25,263,1893）あるいはM.A.Frohmanらの
方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,8998,1988）に従っ
てcDNAを合成し、このcDNAをプラスミドやファージなど
に組み込むことによりcDNAライブラリーを調製すること
が出来る。cDNAを組み込むプラスミドベクターとして
は、大腸菌由来のpBR322（東洋紡績）、pUC18およびpUC
19（東洋紡績）、枯草菌由来のpUB110（シグマ社）など
がある。またcDNAを組み込むファージベクターとして
は、λgt10およびλgt111（東洋紡績）などがある。こ
れらのベクターは、宿主細胞内に保持されて複製、増幅
されるものであれば、ここに例示したものに限定される
ものではない。

mRNAを鋳型として合成されたcDNAをプラスミドまたは
ファージに組み込んでcDNAライブラリーを調製する方法
として、T.Maniatisの方法（Molecular Cloning,Cold S
pring Harbor Laboratory,1982,p.239）またはT.V.Hyun
hらの方法（DNA Cloning:A Practical Approach,1,49,1
985）を各々例示することが出来る。また、mRNAと同様
に各種のcDNAライブラリーを市販品としてクロンテック
社などから購入することが出来るのでそれらを利用する
ことも出来る。

（２）cDNAライブラリーのクローニング： cDNAライブラリーとして得られたプラスミドやファー
ジなどの組換発現ベクターは、大腸菌のような適切な宿
主細胞に保持される。宿主となり得る大腸菌としては、
例えばEscherichia coli NM514,C600（ストラタジーン
社）、NM522,JM101（ファルマシア社）などを例示する
ことが出来る。cDNAのベクターがプラスミドの場合、塩
化カルシウム法、塩化カルシウム・塩化ルビジウム法な
どを用いて、またcDNAのベクターがファージの場合、イ
ンビトロパッケージング法などを用いてあらかじめ増殖
させた宿主細胞に保持させることが出来る（Molecular
Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,1982,p.24
9）。

このようにして得られた形質転換体から、ラットなど
の動物またはヒトの肝実質細胞増殖因子の部分のアミノ
酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを合成し、この
オリゴヌクレオチドを³²P標識して、プローブとして用
いてコロニーハイブリダイゼーション法（Gene,10,63,1
980）、プラークハイブリダイゼーション法（Sciene,19
6,180,1977）などによってcDNAクローンを釣り上げるこ
とが出来る。また、目的とするポリペプチドに対する抗
体を用いて、標識抗体法（DNA Cloning:A Practical Ap
proach,1,49,1985）によって、cDNAクローンをクローニ
ングすることも可能である。このようにしてクローン化
された形質転換体は、ラットなどの動物またはヒト由来
のHGFの全アミノ酸配列あるいはその部分のアミノ酸配
列をコードする塩基配列を有するcDNAを含有している。

次に該形質転換体から常法（Molecular Cloning,Cold
Spring Harbor Laboratory,New York,1982）に従って
プラスミドやファージなどの組換DNAを単離し、そのま
ま、あるいは制限酵素で消化してからcDNA塩基配列が決
定される。最初に得られた該ラットなどの動物またはヒ
ト由来のcDNAをプローブとして、同様の方法によってヒ
トの臓器または血液細胞由来のmRNAから調製されたcDNA
ライブラリーのクローニングを行うことが出来る。ここ
で用いられるハイブリダイゼーションの方法及び条件
は、例えば、Molecular Cloning,A Laboratory,Cold Sp
ring Harbor Laboratory,1st ed.（1982）等に記載の方
法及び条件を参照することが出来る。得られたラットな
どの動物あるいはヒト由来のHGFのcDNAの塩基配列は、
マクサムとギルバートの化学法（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,74,560,1977）やサンガーのジデオキシ法（Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA.,74,5463,1977）などによって決定され
る。さらに、必要があれば、記述のmRNAと塩基配列の決
定されたcDNAの１部あるいはそのcDNAの１部の配列を合
成したDNAをプライマーにしてプライマーエクステンシ
ョン法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76,731,1979）によっ
て新たにcDNAを合成し、上記と同様にしてcDNAライブラ
リーから、すでに得られた第１のcDNAに連結しうる第２
のcDNAを含有するプラスミドやファージなどの組換DNA
をクローニングすることが可能である。このプライマー
エクステンションとクローニングの工程は、必要により
複数回繰り返される。

（３）ヒトHGF組換発現ベクターの構築： クローン化されたヒトHGFのアミノ酸配列の全部ある
いはその１部をコードするcDNAを含有する数種のプラス
ミドやファージなどの組換ベクターから制限酵素によっ
てcDNAを切り出し、ヒトHGFの発現に適したベクターの
プロモーターの下流に制限酵素とDNAリガーゼを用いて
再結合して組換発現ベクターを作製することが出来る。

より詳しくは、本発明のヒトHGFを効率良く発現させ
るために組換発現ベクターは転写の下流方向に順番に必
要により（１）プロモータ、（２）リボソーム結合部
位、（３）開始コドン、（４）本発明のヒトHGFをコー
ドする塩基配列を含有するDNA、（５）終止コドン、
（６）ターミネーターを含むように構築される。

本発明で用いることが出来るDNAのベクターとして、
大腸菌由来のプラスミドpBR322,pUC18（東洋紡績）、枯
草菌由来のプラスミドpUB110（シグマ社）、酵母由来の
プラスミドpRB15（ATCC37062）、バクテリオファージλ
gt10、λgt11（ストラタジーン社）、ウイルスSV40（BR
L社）、BPV（ATCC VR−703）、レトロウイルスの遺伝子
由来のベクターなどが列挙出来るが宿主内で複製・増幅
可能なベクターであれば特に限定はない。特に、本発明
のヒトHGFを簡便に発現させるには、SV40のようなウイ
ルスの遺伝子由来のベクターを用いるのが好ましい。

例えば、前述のクローン化されたヒトHGFをコードす
るDNAをSV40ベクターの後期領域に結合した組換発現ベ
クターは、COS細胞（Cell,23,175,1981）と呼ばれるサ
ル細胞株に導入して発現させることが可能である。

プロモーターおよびターミネーターに関しても、目的
とするヒトHGFをコードする塩基配列の発現に用いられ
る宿主に対応したものであれば特に限定はない。例え
ば、プロモーターとして、宿主が大腸菌である場合、tr
pプロモーター、lacプロモーターなどを、宿主が枯草菌
である場合、SP01プロモーター、SP02プロモーターなど
を、宿主が酵母である場合、GAPプロモーター、PGKプロ
モーターなどを、宿主がマウス線維芽細胞やチャイニー
ズハムスター卵巣細胞のような動物細胞の場合、ウイル
ス由来のSV40プロモーターやHSV1 TKプロモーターある
いはメタロチオネインプロモーターやヒートショックプ
ロモーターなどを例示することが出来る。またターミネ
ーターとしては、宿主が大腸菌の場合、trpターミネー
ター、1ppターミネータなどを、宿主が枯草菌の場合、a
myFターミネーターなどを、宿主が酵母の場合、CYC1タ
ーミネーターなどを、宿主が動物細胞の場合、SV40ター
ミネーター、HSV1TKターミネーターなどを例示すること
が出来る。これらのプロモーターとターミネーターは用
いる宿主に応じて適切に組み合わされる。

本発明のヒトHGFをコードする塩基配列を含有するDNA
は、そのDNAが発現されるポリペプチドが、肝実質細胞
増殖活性を有するならば特に制限はなく、例えば後述す
る第４図に示した塩基配列が例示され、さらには上記塩
基配列の一部が置換、欠損、挿入、あるいはこれらが組
み合わされた塩基配列を有するDNAであってもよい。

同様に第４図に示したアミノ酸配列に関しても、当該
アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置
換、欠失及び／又は付加されていてもよい。上記のアミ
ノ酸配列の置換、欠失及び／又は付加は、本願優先日前
に周知の技術である部位特異的突然変異誘発法等により
実施することができ、例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,81,4662−5666,1984;Nucleic Acid Res.10,6487−650
0,1982;WO85/00817;Nature 316,601−605,1985などに記
載の方法に準じて行うことができる。なお、１若しくは
複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加とは、部位
特異的突然変異誘発法等の周知の方法により置換、欠失
及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失
及び／又は付加されることを意味する。

このような置換、欠失及び／又は付加により得られる
ものは、例えば、後述の活性測定方法によって容易に評
価できる。本発明のヒトHGFをコードする塩基配列を含
有する該DNAの翻訳開始コドンとしてATG、翻訳終止コド
ンとしてTAA、TGA、あるいはTAGを有してもよい。また
必要に応じて開始コドン、あるいは終止コドンを１つ以
上組み合わせたり、他のコドンと組み合わせて配列して
もよく、これらに特に限定はない。さらに、この組換発
現ベクターで形質転換した宿主の選択マーカーとなり得
るアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、
DHFR遺伝子など１種または２種以上が該ベクターの適切
な位置に含有されていることが好ましい。

（４）宿主細胞の形質転換とその培養： このようにして構築されたヒトHGF組換発現ベクター
は、コンピテント細胞法（J.Mol.Biol.,53,154,197
0）、プロトプラスト法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1
929,1978）リン酸カルシウム法（Science,221,551,198
3）DEAEデキストラン法（Science,215,166,1982）、電
気パルス法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,7161,198
4）、インビトロパッケージング法（Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,72,581,1975）、ウイルスベクター法（Cell,37,1
053,1984）、またはマイクロインジェクション法（Exp.
Cell.Res.,153,347,1984）などによって宿主に導入さ
れ、形質転換体が作製される。このとき、宿主として既
述の大腸菌の他に、枯草菌、酵母、動物細胞などが用い
られる。特にマウス線維芽細胞C127（J.Virol.,26,291,
1978）やチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO（Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA,77,4216,1980）などの哺乳動物由来の
宿主細胞を用いるのが好適である。

得られた形質転換体は、目的とする組換ヒトHGFを産
生させるためにその宿主に応じた適切な培地中で培養さ
れる。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、
窒素源、無機物、ビタミン、血清および薬剤などが含有
される。培地の１例としては、形質転換体の宿主が大腸
菌の場合、LB培地（日水製薬）、M9培地（J.Exp.Mol.Ge
net.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1972,
p.431）などを、宿主が酵母の場合、YEPD培地（Genetic
Engineering,vol.1,Plenum Press,New York,1979,p.11
7）などを、宿主が動物細胞の場合、20％以下のウシ胎
児血清を含有するMEM培地、DMEM培地、RPMI1640培地
（日水製薬）などを挙げることが出来る。形質転換体の
培養は、通常20℃〜45℃、pHは５〜８の範囲で行われ、
必要に応じて通気、撹拌が行われる。また、宿主が接着
性の動物細胞などの場合は、ガラスビーズ、コラーゲン
ビーズ、あるいはアセチルセルロースフォローファイバ
ーなどの担体が用いられる。これら以外の培地組成ある
いは培養条件下でも形質転換体が生育すれば実施でき、
これらに限定されるものではない。

（５）ヒトHGFの精製： このようにして形質転換体の培養上清中または形質転
換体中に生成した組換ヒトHGFは、公知の塩析法、溶媒
沈澱法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、あるい
はゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラ
フィ、逆相クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグ
ラフィなどを組み合わせて分離精製することが出来る。
特に、硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファロー
スイオンクロマトグラフィ、ヘパリンセファロースアフ
ィニティクロマトグラフィ、およびフェニルセファロー
ス逆相クロマトグラフィの組み合わせ、あるいは硫酸ア
ンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファロースイオンクロ
マトグラフィ、および抗HGF抗体セファロースアフィニ
ティクロマトグラフィの組み合わせなどが好ましく有効
な精製法である。

以上述べた方法によって得られた新規な組換ヒトHGF
は、ラット肝およびラット血小板由来HGFと同様にラッ
ト肝実質細胞の増殖を顕著に促進する活性を示した。

（HGF活性の測定） HGF活性は、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80,7229（198
3）に記載の方法に準じて次のように測定した。ウイス
ター系ラットからコラーゲナーゼ還流法によって肝実質
細胞を分離精製した。得られたラット肝実質細胞を５％
ウシ血清、２×10^-9Mインスリンおよび２×1^-9Mデキサ
メサゾンを添加したウイリアムスＥ培地（フローラボラ
トリー社）に懸濁し、24ウエルマルチプレートに1.25×
10⁵個／ウエルの濃度で播いた。５％CO₂および30％O₂お
よび65％N₂の存在下、37℃で20時間培養後、0.1μg/ml
のアプロチニンを添加したウイルアムスＥ培地に交換す
ると同時に所定量の被験試料を添加した。15時間後、15
μCi/mlの¹²⁵Iデオキシウリジン10μ／ウエルを添加
した。コントロール群には、¹²⁵Iデオキシウリジン添加
の15分前に５μg/mlのアファディコリンを添加した。さ
らに６時間培養して¹²⁵Iでラベルした。細胞をpH7.4のP
BSで２回洗浄後、冷10％トリクロロ酢酸水溶液（TCA）
で固定した。細胞を１ウエル当たり0.5mlの1N水酸化ナ
トリウム水溶液で可溶化し、その放射能をガンマカウン
ターにより測定した。また放射能測定後の試料の１部を
とってローリー法（J.Biol.Chem.,193,265,1951）に従
い蛋白量を測定した。被験試料を添加したとき肝実質細
胞に取り込まれた¹²⁵Iの量をコントロールとのカウント
の差として求め、これをラット肝実質細胞蛋白質1mg当
たりに換算して、DNA合成活性（dpm/mg蛋白質）とし
た。被験試料のHGF活性は、同一試験において上皮細胞
成長因子（EGF）10ng/mlを用いた時の肝実質細胞のDNA
合成活性の50％に相当する活性を１単位と定義して表示
した。

〔発明の効果〕

本発明によれば、肝実質細胞の生体外での増殖を可能
とする新規な生理活性ペプチドが提供される。本発明の
組換ヒトHGFは、臨床診断試薬や肝疾患治療薬として有
用である。さらに本発明の組換ヒトHGFの作用により増
殖維持される肝実質細胞は、例えば肝機能の基礎的研究
用、肝実質細胞に対する各種ホルモンや薬剤の作用の研
究用肝癌の発癌研究用、あるいは肝炎ウイルスの生体外
培養のための宿主細胞として極めて有用である 以下、本発明を実施例により、さらに詳しく説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

〔実施例〕

実施例１ （１）ラット肝臓mRNAの単離： ラット肝臓mRNAは、グアニジンチオシアン酸法（Bioc
hemistry,18,5294,1979）によって抽出し、オリゴdTセ
ルロースカラムクロマトグラフィ法（Proc,Natl.Acad.S
ci,USA,69,1408,1972）によって精製して調製した。市
販食用植物油で希釈した20％四塩化炭素をSDラット100g
当たり1mlを腹腔内投与した。四塩化炭素投与の10時間
後、肝臓を抽出した。得られたラット肝臓0.90gに5.5M
グアニジウム溶液（5.5Mグアニジンチオシアン酸、25mM
クエン酸、0.5％ラウリルザルコシンナトリウムからな
るpH7.0の溶液）16mlを加えてホモジナイズした。0.1M
EDTAを含むセシウムトリフロロ酢酸溶液（1g/ml）17m
lに上記のラット肝分散液16mlを重層し、ベックマン超
遠心機、L8−55型によって85000g、20時間、20℃の条件
下で遠心分離した。DNA層を除去した後、沈降したRNAB
層を1mlの滅菌した蒸留水に溶解した。このRNA水溶液か
ら冷エタノール沈澱によって6.24mgのRNAを得た。得ら
れたRNAを1mM EDTAを含む10mM トリス塩酸緩衝液（pH
7.5）（以後、TE緩衝液と略する）0.5mlに溶解し、65
℃、５分加熱処理した後、1M NaCl溶液0.5mlを加え
た。0.1N NaOHで活性化した後、0.5M NaClおよび1mM
EDTAを含む10mMトリス塩酸緩衝液（STE緩衝液と略
す）で平衡化したオリゴdTセルロースカラムにRNA溶液
0.5mlを注入した。約5mlのSTE緩衝液で洗浄後、TE緩衝
液で吸着したポリ（Ａ）RNAを溶出した。このポリ
（Ａ）RNA溶液500μから冷エタノール沈澱で得られた
ポリ（Ａ）RNAは、再びTE緩衝液に溶解し、１μg/μ
の濃度に調製した。

（２）ラット肝由来のcDNAライブラリーの作製 上記（１）で得られたポリ（Ａ）RNA、５μを鋳型
としてcDNA合成システム・プラス（アマシャム社）を用
いてGublerらの方法（Gene.,25,263,1983）に準じてcDN
Aを合成した。１本鎖cDNAの収量は、1018ng、２本鎖cDN
Aの収量は、1729ngであった。この２本鎖cDNAは、フェ
ノール／クロロホルム（1:1,v/v）抽出とエタノール沈
澱によって精製した後、STE緩衝液に溶解し、約0.7μg/
20μの濃度に調製してから使用するまで−20℃で保存
した。このcDNAは、cDNAクローニングシステムλgt10
（アマシャム社）を用いてHuynhらの方法（DNA Cloning
I,a practical−approach,1,49,1982）に準じ、次のよ
うにλgt10のEcoR I部位にクローニングした。EcoR Iメ
チラーゼを用いて上記のcDNA溶液の20μをメチル化し
た後、T4DNAリガーゼを用いてcDNAの両末端にEcoR Iリ
ンカーを付加した。過剰のリンカーをEcoR I消化し、約
100μの反応液を得た。STE緩衝液で平衡化したcDNA精
製用ゲル濾過カラムに上記反応液100μを注入した。S
TE緩衝液で溶出してcDNA画分500μを集めた。常法に
よってエタノール沈澱を２回繰り返した後、減圧乾燥し
てリンカー付加cDNAを得た。再び、STE緩衝液に溶解し
て50ng/μのリンカー付加cDNA26μを調製した。あ
らかじめ準備されたλgt10アーム１μｇにリンカー付加
cDNA0.1μｇをT4DNAリガーゼを用いて挿入した。この反
応液は冷エタノール処理した後、軽く乾燥し、得られた
組織DNAの全量を５μのTE緩衝液に溶解した。この組
換DNAをインビトロパッケージ反応に供し、λgt10組換
ファージを得た。ファージプレーティング用大腸菌を用
いたタイトレーションにより測定したcDNA1μｇから得
られた組換ファージ数は、5.0×10⁶個であった。このよ
うにして作製したcDNAライブラリーは、使用するまで少
量のクロロホルムを加えたSE緩衝液（100mM NaCl,10mM
MgSO₄,および0.01％ゼラチンを含む20mMトリス塩酸緩
衝液、pH7.5）中、４℃で保存した。

（３）DNAプローブの合成： 本発明者が見出した下記ラットHGFβ鎖Ｎ末端アミノ
酸配列15個 （式中、Ｖはバリン、Ｎはアスパラギン、Ｇはグリシ
ン、Ｉはイソロイシン、Ｐはプロリン、Ｔはトレオニ
ン、Ｑはグルタミン、Ｗはトリプトファン、Ｍはメチオ
ニンを示す） をコードする塩基配列を推定し、オリゴヌクレオチド をDNAシンセサイザー381A（アプライドバイオシステム
ズ社）により合成した。得られたオリゴヌクレオチドを
T4ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績）を用いて〔γ
³²P〕ATP（アマシャル社）により標識してDNAプローブ
を作製した。

（４）ラットHGF遺伝子DNAの部分単離とその塩基配列の
決定 上記（２）で得られた約５×10⁵個の組換ファージを3
7℃で15分間約８×10⁸個の大腸菌NM514（ストラタジー
ン社）に感染させた後、約50℃に加温した0.7％の寒天
を含むLB培地270mlに添加し、23cm×23cmのLB寒天培地
プレート６枚に均一に流延した。空気中、37℃で12時間
培養後、プラークの生じたプレート上にニトロセルロー
スフィルターを約30秒間密着させた。このニトロセルロ
ースフィルターを1.5M NaClおよび0.1N NaOHからなる
アルカリ溶液に５分間浸漬し、さらに0.2M トリス塩酸
緩衝液（pH7.5）、25mMリン酸緩衝液（pH7.5）、2mM E
DTAおよび２×SSC緩衝液からなる中性溶液に15分間浸漬
した。風乾後、80℃、２時間熱処理してニトロセルロー
スフィルターに各プラークのDNAを固定化した。得られ
たニトロセルロースフィルターは、６×SSC緩衝液、５
×デンハート溶液、50mM PIPES、および100mMリン酸緩
衝液、pH7.0、からなるハイブリダイゼーション溶液に
浸漬し、65℃で５時間前処理した。100℃で５分間熱処
理した上記（３）の³²P標識合成オリゴヌクレオチド
（約３×10⁸cpm）プローブとサケ精巣DNA（0.1mg/ml）
の混合溶液を添加し、45℃で16時間ハイブリダイゼーシ
ョン反応を行った。反応後、ニトロセルロースフィルタ
ーは50℃で0.1％SDSを含む６×SSC緩衝液によって３回
洗浄してから風乾した。このニトロセルロースフィルタ
ーを増感スクリーン、ライトニングプラス（デユポン
社）とＸ線フイルム、RX（富士写真フイルム）に密着さ
せ、−80℃で30時間露光した。得られた３個の陽性プラ
ークを採取し、上記と同じ方法によって２枚クリーニン
グを行い、得られた１個の陽性クローンをRBC1と命名し
た。このRBC1ファージを常法により増殖させ、RBC1cDNA
を単離精製した。得られたcDNAの塩基配列は、シーケネ
ース（ユナイテッド ステート バイオケミカル社）を
用いてジデオキシ法によって決定した。第１図にRBC1cD
NAの全塩基配列を示す。RBC1cDNAは、ラットHGFβ鎖を
コードする塩基配列（１番目から699番目）を含有す
る。

（５）ヒトHGF遺伝子DNAの単離と塩基配列の決定： ヒト正常肝臓mRNA（クロンテック社）５μｇを鋳型に
して上記（２）と同様にしてヒト肝由来のcDNAを合成し
た。１本鎖cDNAの収量は、1100ngであった。得られたcD
NAの200ngをアガロース電気泳動に供し、分画した４〜7
kbのcDNAをジーンクリーン（バイオ 101社）で抽出し
た後、上記（２）と同様にしてcDNAライブラリー（Ｉ）
を調製した。cDNA1μｇから２×10⁵個の組換ファージを
得た。マルチプライムDNA標識システム（アマシャム
社）を用いて〔α³²P〕dCTPで標識したRBC1cDNAをプロ
ーブとして、バイブリダイゼーション反応温度および洗
浄温度を60℃、洗浄液は0.1％SDSを含む２×SSC緩衝液
とした以外は（４）と同様に、ヒト肝由来cDNAライブラ
リー（Ｉ）の１次スクリーニングおよび２次スクリーニ
ングを行い、陽性クローンHBC25を得た。HBC25ファージ
から常法により単離、精製したHBC25cDNAを塩基配列解
析および制限酵素切断解析に供した。第２図（ａ）はHB
C25cDNAの制限酵素地図、第３図（ａ）にHBC25cDNAの塩
基配列の一部を示す。次にHBC25cDNAに含有する_５′TCA
TAATCTTTCAAGTCT_３′の塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドをDNAシンセサイザー381A（アプライドバイオシ
ステムズ社）により合成した。この合成DNA0.75μｇを
プライマーとし、ヒト肝mRNA20μｇを鋳型としてcDNA
0.4μｇを合成し、同様にしてcDNAライブラリー（II）
を調製した。このcDNAライブラリー（II）から〔α
³²P〕dCTPで標識したHBC25cDNAの0.7kbEcoR I断片をプ
ローブにして陽性クローンHAC19を得た。第２図（ｂ）
にHAC19cDNAの制限酵素地図、第３図（ｂ）にHAC19cDNA
の塩基配列の一部を示す。このようにして得られたHBC2
5cDNAおよびHAC19cDNAの塩基配列を組み合わせたヒトHG
Fコード領域の全塩基配列およびその塩基配列から演繹
されるアミノ酸配列を第４図に示す。ヒトHGFの全cDNA
塩基配列から、ヒトHGFの翻訳開始コドンは１番目のATG
であり、終止コドンは2185番目のTAGと推定される。こ
れらの開始および終止コドンの間のヒトHGFのcDNA塩基
配列は728アミノ酸残基からなるポリペプチドをコード
し、１番目のMetに続くアミノ酸配列はLeuに富み、31番
目のGlyまでがHGF分秘のためのシグナル配列であった。
同様にヒトHGFβ鎖のＮ末端は、495番目のVa1と推定さ
れる。また、ヒトHGFの糖鎖の結合部位は、Asn−ｘ−Se
r/Thrのアミノ酸配列を有する294番目、402番目、566番
目、および653番目のAsnの推定される。

第４図に示すヒトHGFのアミノ酸配列をコンピュータ
ーによりホモロジー検索を行った結果、ヒトHGFはプラ
スミノーゲン、プラスミン、カリキュレインや凝固因子
XIIなどのセリンプロテアーゼとホモロジーをもつこと
が見出された。即ち、ヒトHGFはそのα−鎖にクリング
ル構造と推定される配列を４箇所持っており、またその
β−鎖は上記セリンプロテアーゼのプロテアーゼ領域に
類似している。しかし、セリンプロテアーゼの活性中心
と推定されているSerとHisがヒトHGFのβ−鎖ではTyr
（673番目）とGln（534番目）にそれぞれ置換されてい
る。

（６）サルCOS細胞用ヒトHGF発現ベクターの構築： サルCOS細胞用ヒトHGF発現ベクターpEUK〔hHGFI〕の
構築図を、第５図に示す。上記（５）で得られたHAC19
ファージDNAを制限酵素BamH IとSca Iで消化し、アガロ
ース電気泳動により0.9kbのDNA断片を分離・精製した。
同様にHBC25ファージDNAを制限酵素Sca IとSma Iで消化
し、2.1kbのDNA断片を分離・精製した。これらのDNA断
片をあらかじめ制限酵素BamH IとSma Iで消化したブル
ースクリプトKSM13＋（ストラタジーン社）と混合し、T
4DNAリガーゼで結合してプラスミドpBS〔hHGFI〕を得
た。得られたpBS〔hHGFI〕を制限酵素Xba IとSma Iで消
化した。制限酵素Xba IとSma Iであらかじめ消化したCO
S細胞用発現ベクターpEUK−Cl（クロンテック社）と3.0
kbDNA断片を混合し、T4DNAリガーゼで結合してヒトHGF
発現ベクターpEUK〔hHGFI〕を得た。

（７）サルCOS細胞の形質転換とヒトHGF遺伝子の発現： 得られたpEUK〔hHGFI〕プラスミドをエタノール沈澱
した後、10mMPBS緩衝液に溶解し、20μg/mlに調製し
た。次に、10％ウシ胎児血清（ギブコ社）を含むDMEM培
地（日水製薬）中で増殖させた対数増殖期のCOS−１細
胞（ATCC CRL−1650）を10mMPBS緩衝液で２回洗浄した
後トリプシン処理した。同緩衝液で３回洗浄後、細胞濃
度２×10⁷個/mlになるように再び同緩衝液に浮遊化し
た。先に調製したプラスミド溶液250μと細胞浮遊液2
50μを混合し、氷冷下で10分間放置した。この氷冷し
たプラスミド・細胞混液に高電圧パルス遺伝子導入装置
ZA−1200（PDS社）を用いて、印加電圧4kV/cm、パルス
時間20ミリ秒の条件下で高電圧パルスをかけた。得られ
た細胞を上記の培地で希釈し、37℃、５％CO₂存在下に
て３日間培養した。培養３日目の培養上清中のHGF活性
を前述のラット肝実質細胞を用いて測定したところ、50
単位/mlであった。

一方、HGFcDNAを挿入していない発現ベクター,pEUK−
C1を同じ方法によりCOS−１細胞に導入して培養した
が、その培養上清中には、HGF活性を認めなかった。

実施例２ （１）マウスC127細胞用ヒトHGF発現ベクターの構築 マウスC127細胞用ヒトHGF発現ベクターpBPMT〔hHGF I
I〕の構築図は、第６図に示す。実施例１で得られたHAC
19ファージDNAを制限酵素BamH IとSca Iで消化し、アガ
ロース電気泳動により0.9kbのDNA断片を分離・精製し
た。同様にHBC25ファージDNAを制限酵素Sca IとPst Iで
消化し、2.1kbのDNA断片を分離・精製した。これらのDN
A断片をあらかじめ制限酵素Bam IとPst Iで消化したブ
ルースクリプトKS II＋（ストラタジーン社）と混合
し、T4DNAリガーゼで結合してプラスミドpBS〔hHGF I
I〕（微工研菌寄第11050号）を得た。プラスミドpBPMT
を制限酵素EcoR Vで消化後、細菌性アルカリフォスファ
ターゼ（BAP）でリン酸基を除去した部位に、プラスミ
ドpBS〔hHGF II〕（微工研菌寄第11050号）を制限酵素X
ba IとSal IとNae Iで消化しT4DNAポリメラーゼで平滑
末端とした後、アガロース電気泳動により分離・精製し
た3.0kbのDNA断片をT4DNAリガーゼにより挿入した。得
られたヒトHGF発現ベクターpBPMT〔hHGF II〕は、MT−
１プロモーターとSV40初期遺伝子のポリ（Ａ）付加シグ
ナルの間にヒトHGF遺伝子を有し、この発現ベクターに
よるマウスC127細胞の形質転換は、ウシパピロマウイル
ス（BPV）遺伝子により行われる。また形質転換された
細胞の選択は、トランスポゾンTn5のneo遺伝子（Gene,1
9,327,1982）にヘルペスシンプレックスウイルスタイプ
１のチミジンキナーゼ（HSV−１ TK）遺伝子由来のプ
ロモーターとポリ（Ａ）付加シグナルを連結したneoキ
メラ遺伝子によっても可能となる。

（２）マウスC127細胞の形質転換とヒトHGF遺伝子の発
現： ヒトHGF発現ベクターpBPMT〔hHGF II〕は、Wiglerら
の方法（Cell,11,223,1977）によりマウスC127細胞へ導
入した。

上記（１）で得られた20μｇのpBPMT〔hHGF II〕プラ
スミドを0.5M 塩化カルシウム240μに溶解し、20mM
HEPES、280mM NaClおよび1.5mMリン酸ナトリウムか
らなる２×HEPES緩衝液（pH7.1）,240μを撹拌しなが
ら加えた。室温で30分撹拌を続けプラスミドとリン酸カ
ルシウムの共沈澱を形成させた。あらかじめ、10％ウシ
胎児血清（ギブコ社）および10mMグルタミンを添加した
DMEM培地（日水製薬）を用いて５×10⁵個のC127細胞を
５％CO₂の存在下で37℃、24時間培養した。培地交換し
た後、プラスミドとリン酸カルシウム共沈澱を加え、室
温で20分放置した。さらに37℃で４時間インキュベート
した後、培地を除去し、15％グリセリンを添加した１×
HEPES緩衝液を加え室温で５分間放置した。培地で細胞
を洗浄した後、培地交換し、さらに37℃で２日間インキ
ュベートした。細胞を10倍に希釈して1mg/mlのG418（シ
グマ社）を含む同倍地を用いて５％CO₂の存在下で37
℃、７日間培養して形質転換細胞を得た。得られた細胞
株から培養上清中のHGF活性の高い細胞を限界希釈法で
スクリーニングしヒトHGF高産生株BPH89を得た。この細
胞の培養上清中のHGF産生能は、2.3万単位／／日であ
った。

実施例３ （１）チャイニーズハムスターCHO細胞用ヒトHGF発現ベ
クターの構築 チャイニーズハムスターCHO細胞用ヒトHGF発現ベクタ
ーpEVSVE〔hHGF II〕の構築図は、第７図に示す。プラ
スミドpEVSVEを制限酵素EcoR Vで消化後、細菌性アルカ
リフォスファターゼ（BAP）でリン酸基を除去した部位
に、実施例２で得られたプラスミドpBS〔hHGF II〕（微
工研菌寄第11050号）を制限酵素Xba IとSal IとNae Iで
消化し、T4DNAポリメラーゼで平滑末端とした後、アガ
ロース電気泳動により分離・精製した3.0kbのDNA断片を
T4DNAリガーゼにより挿入した。得られたヒトHGF発現ベ
クターpEVSVE〔hHGF II〕は、SV40初期プロモーターとS
V40の初期遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナルの間にヒトH
GF遺伝子を有する。また、形質転換された細胞の選択
は、マウスDHFR遺伝子にSV40初期プロモーターとポリ
（Ａ）付加シグナルを連結したDHFRキメラ遺伝子により
可能となる。

（２）チャイニーズハムスターCHO細胞の形質転換とヒ
トHGF遺伝子の発現： ヒトHGF発現ベクターpEVSVE〔hHGF II〕は、実施例２
と同様にしてチャイニーズハムスターCHO細胞のジヒド
ロ葉酸還元酵素（DHFR）欠損CHO DUKX細胞に導入し
た。得られた細胞株は、リボヌクレオシドとデオキシヌ
クレオシドを含まず、透析した10％ウシ胎児血清（ギブ
コ社）と１％グルタミンと50nMメソトレキセートを含む
α−MEM培地（フローラボラトリー社）を用いて培養し
た。発生したコロニーは、安定なヒトHGF高産生株を得
るために、同培地において18世代まで増殖させた。得ら
れた細胞株は、安定したヒトHGFを産生し、CHO−１と名
付けた。この細胞のヒトHGF産生能は、3.1万単位／／
日であった。

実施例４ 実施例２で得られたヒトHGF産生マウスC127組換細胞
株BHP89の培養上清液より組換ヒトHGFを精製した。

（１）陽イオン交換クロマトグラフィー BPH89株の培養液400mlに、終濃度0.01％となるように
Tween80を添加し、ステリベクスHVフィルター（日本ミ
リポア・リミテッド）により濾過した。この濾液に1/20
容に1MTris・HCl（pH8.5）緩衝液を加え、緩衝液Ａ（50
mM Tris・HCl、10mM Hepes、20mM CaCl₂、150mM Na
Cl、0.01％Tween80、pH8.5）で平衡化したＳ−セファロ
ースFF（ファルマシア社製、カラムサイズ内径1.6cm、
高さ5cm）に添加した。緩衝液Ａで未吸着物質を洗浄
後、0.15Mから1.0MのNaClによる直線濃度勾配（全量100
ml）で、吸着物を溶出した。クロマトパターンを第８図
に示す。HGF活性をもつ画分を集め、Ｓ−セファロース
溶出液とした。

（２）アフィニティクロマトグラフィー Ｓ−セファロース溶出液を1N酢酸でpH7.5に調整後、
２倍容の0.01％Tween80を含む蒸留水で希釈し、緩衝液
Ｂ（10mM Tris・HCl、0.3M NaCl、0.01％Tween80、pH
7.5）で平衡化したヘパリン・セファロースCL−6B（フ
ァルマシア社製、カラムサイズ内径1cm、高さ3cm）に添
加した。緩衝液Ｂでカラムを洗浄後、0.3Mから2.0MのNa
Clによる直線勾配（全量30ml）により溶出した。そのク
ロマトパターンを第９図に示す。HGF活性をもつ画分を
集め、ヘパリン溶出液とした。

（３）逆相HPLC 0.1％TFA（トリフルオロ酢酸、v/v％）を含む蒸留水
で平衡化したC4 RP−304カラム（バイオラッド社製、
内径4.6mm、高さ250mm）にヘペリン溶出液を添加し、0.
1％TFAを含む０％から90％へのアセトニトリルの濃度勾
配により溶出を行った。組換ヒトHGFは約40％のアセト
ニトリル濃度にて溶出させた。そのクロマトグラムを第
10図に示す。精製された組換ヒトHGFの収量は約25μｇ
であり、培養上清液からの活性回収率は約25％であっ
た。

（４）SDSポリアクリルアミド電気泳動 前記３段のクロマトグラフィーで精製された組換ヒト
HGFを２−メルカプトエタノール還元下及び非還元下SDS
−ポリアクリルアミド電気泳動にかけた。結果を第11図
に示す。精製組換HGFは、非還元条件（２−ME（−））
では分子量７万〜９万の単一バンドを示し、還元条件下
（２−ME（＋））では、分子量６万〜7.5万のα鎖と分
子量３万〜４万のβ鎖に分かれた。即ち、組換HGFはα
鎖とβ鎖からなるヘテロダイマーであることが示され
た。またβ鎖が２本のバンドに分離し、β鎖に付加され
る糖類の本数に差のあることを示した。

（５）α鎖およびβ鎖のＮ末端アミノ酸配列 精製組換HGFのα鎖とβ鎖を分離し、それぞれのＮ末
端アミノ酸配列を調べた。精製標品を4Mグアニジン存在
下にて60℃、30分間処理し、２−メルカプトエタノール
にて還元した。次いでモノヨード酢酸ナトリウムを添加
して、SH基をアルキル化し、反応液をマイクロボンダス
フェアーC4カラム（ウォーターズ社）による逆相HPLCに
かけ、α鎖とβ鎖を分離した。溶出は0.1％TFAを含む水
とアセトニトリルによった。このようにして得られたα
鎖とβ鎖をプロティンシークエンサーにかけた結果、下
記に示すアミノ酸配列が得られた。

これらの配列は第４図のHGFコード領域の全塩基配列
より推定されたアミノ酸配列の32〜51番目および495〜5
01番目に一致した。

（６）アミノ酸組成および糖組成 精製組換HGFを0.2％フェノールを含む6NHClにて110
℃、24時間処理して加水分解し、アミノ酸分析機にか
け、アミノ酸組成を調べた。その結果は下表に示したよ
うに、DNA塩基配列より推定したアミノ酸組成値と精製
組換標品による実測値は非常によく一致した。

さらに精製組換HGFを2.5N TFA中で、110℃、６時間
加熱処理し、陰イオン交換樹脂を用いたHPLCにて糖分析
を行った。その結果、アスパラギン配糖体特有のマンノ
ース、ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチルガラクト
サミンが検出され、組換HGFは糖蛋白質であることが確
認された。

（７）組換ヒトHGFの肝細胞増殖活性 ラット初代培養肝実質細胞は、現在知られているin v
itroの系の中では最もin vivoに近い肝機能を持つ系で
ある。「HGF活性の測定法」に記述した方法に従って得
たラット肝実質細胞に対し、精製した組換ヒトHGFを添
加したところ、1ng/mlの濃度で強い細胞増殖を誘起し、
10ng/mlでその効果は最大に達した。この培養系に増殖
活性を示す因子は他にもインスリンやEGFがあるが、組
換ヒトHGFは単独で両者よりも強い活性を有し、かつこ
れら３者の共存下では相加的な作用を示した。従って、
組換ヒトHGFは現在知られている因子のなかでは、生体
外肝細胞に対し最も強力な増殖活性をもつ物質というこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、RBC1cDNAの塩基配列を示す。第２図は、HBC2
5cDNAの制限酵素地図（ａ）およびHAC19cDNAの制限酵素
地図（ｂ）を示す。第３図は、HBC25cDNAの塩基配列の
一部（ａ）及びHAC19cDNAの塩基配列の一部（ｂ）を示
す。第４図は、ヒトHGFコード領域の全塩基配列とアミ
ノ酸配列を示す。第５図は、サルCOS細胞用ヒトHGF発現
ベクターの構築図を示す。第６図は、マウスC127細胞用
ヒトHGF発現ベクターの構築図を示す。第７図は、チャ
イニーズハムスターCHO細胞用ヒトHGF発現ベクターの構
築図を示す。第８図は、Ｓ−セファロース検出液のフラ
クションと溶出成分の吸光度およびそれらのDNA合成活
性との関係を示す線図である。第９図は、ヘパリン溶出
液のフラクションと溶出成分の吸光度およびそれらのDN
A合成活性との関係を示す線図である。第10図は、逆相H
PLCにおいて、通液したアセトニトリル濃度と、溶出し
た成分の吸光度との関係を示す線図である。第11図は、
精製組換ヒトHGFの還元下および非還元下でのSDS−ポリ
アクリルアミド電気泳動パターンを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 下西 学 滋賀県大津市桜野町１丁目20番36号 グ リーンベル西大津Ａ―203 (72)発明者 清水 伸 京都府京都市左京区高野東開町１―23 27棟303号 (56)参考文献 特開 昭60−45534（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−22526（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−288899（ＪＰ，Ａ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコ
   ードする遺伝子。 （ａ）下記のアミノ酸配列からなるタンパク質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは複数のア
   ミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列
   からなり、かつ肝実質細胞増殖活性を有するタンパク質
2. 【請求項２】以下のオリゴヌクレオチド（ａ）又は
   （ｂ）のいずれかをプローブとして、60℃、６×SSC緩
   衝液、５×デンハート溶液、50mM PIPES、100mMリン酸
   緩衝液（pH7.0）及びサケ精巣DNA（0.1mg/ml）の条件下
   でハイブリダイズし、かつ肝実質細胞増殖活性を有する
   タンパク質をコードする哺乳動物由来のDNA。 （ａ）下記の塩基配列からなるオルゴヌクレオチド （ｂ）下記の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（第
   ３図（ａ）の塩基配列のEcoR I断片、即ち、塩基番号96
   9〜1646の塩基配列）
3. 【請求項３】以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のDNAか
   らなる遺伝子。 （ａ）下記の塩基配列からなるDNA （ｂ）（ａ）の塩基配列からなるDNAと60℃、６×SSC緩
   衝液、５×デンハート溶液、50mM PIPES、100mMリン酸
   緩衝液（pH7.0）及びサケ精巣DNA（0.1mg/ml）の条件下
   でハイブリダイズし、かつ肝実質細胞増殖活性を有する
   タンパク質をコードするDNA （ｃ）遺伝子コドンの縮重のため、（ａ）及び（ｂ）に
   示されるDNAとハイブリッド形成しないが、（ａ）又は
   （ｂ）に示されるDNAによりコードされるタンパク質と
   同じアミノ酸配列を持つタンパク質をコードするDNA