JPH0430000A - 組換ヒト肝実質細胞増殖因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は肝実質細胞増殖活性を有するポリペプチド、さ
らに詳しくは、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で肝実質細
胞の維持、増殖を可能にする生理活性を有する新規なポ
リペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、組換
発現ベクター、形質転換体および該ポリペプチドの製造
法に関するものである。

本発明のポリペプチドは肝実質細胞培養試薬、肝再生促
進剤、肝機能の基礎的研究、肝実質細胞に対する各種ホ
ルモンや薬剤の作用の研究、肝癌の発癌研究用、さらに
該ポリペプチドに対する抗体を用いる臨床診断試薬、肝
疾患治療薬などへの利用か期待出来る。

〔従来の技術〕

従来、細胞増殖活性を有するポリペプチドとして、上皮
細胞増殖因子（ＥＧＦ）　、線維芽細胞増殖因子（ＦＧ
Ｆ）　、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖
因子（ＰＤＧＦ）　、血管内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ
）なとか知られている。これらの細胞増殖因子の他に、
生体外において肝実質細胞増殖活性を有するポリペプチ
ドか１９８４年に中村らによって再生肝ラット血清より
部分精製され、肝実質細胞増殖因子（以下ＨＧＦと略す
）と命名された。

このＨＧＦの発見まで肝実質細胞は、各種の株化細胞か
活発に増殖する咄乳動物血清の存在下ても該細胞・の増
殖が全く認められず、通常約１週間で培養容器の壁から
の脱落か起こり、生体外での長期培養は不可能であった
。ところか、このＨＧＦの存在下において肝細胞は極め
て良好に増殖し、該細胞の培養か可能となった（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　ＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、
、　１２２．１４５０．１９８４）。他の研究者によっ
ても、このＨＧＦ活性は、肝部分切除手術後の血中、劇
症肝炎患者の血中にも存在することか確認された。その
後、多くの研究者によって精製法、化学的性質、生物学
的性質が明らかにされたが、このＨＧＦあるいはＨＧＦ
と同様の肝細胞増殖活性を有するポリペプチドのアミノ
酸構造を同定するまてには至らなかった。

このような状況の下で、本発明者らは、先にラット血小
板などの組織からＨＧＦを分離精製して研究を重ね、こ
の血小板由来のＨＧＦは、２種のサブユニットからなり
、このＨＧＦは生体外において肝実質細胞を極めて良好
に増殖させることを見出すとともにＨＧＦに含有される
一部のアミノ酸配列２７残基を同定することに成功した
（特願昭６３−３１１８６６号）。

〔発明か解決しようとする課題〕

生体内ＨＧＦは、肝臓、脳、肺臓、骨髄、ひ臓、胎盤、
腎臓なとの臓器あるいは血小板や白血球などの血液細胞
などから極微量分泌されるポリペプチドであるため、原
材料組織の入手、ＨＧＦの収量、安定供給なと問題点か
多い。このＨＧＦを肝実質細胞の培養や肝細胞の研究用
として利用するためには、その構造を明らかにしＨＧＦ
あるいはＨＧＦと同様な活性を有するポリペプチドを遺
伝子組換技術を応用して大量に供給することか望まれて
いる。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記課題を解決すへく鋭意研究を重ねた
結果、ラット肝臓ｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡライブ
ラリーより、ラット血小板由来のＨＧＦのアミノ酸配列
に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとし
て用い、ラットＨＧＦβ鎖ポリペプチドをコードする塩
基配列を含有するｃＤＮＡが得られることを見出した。

さらに、ラット由来の該ｃＤＮＡの全部あるいはその一
部をプローブとして、ヒト肝臓ｍＲＮＡより調製された
ｃＤＮＡライブラリーよりヒトＨＧＦポリペプチドをコ
ードする塩基配列を含有するｃＤＮＡが得られることを
見出した。また、ヒトの肝臓以外の臓器や血液細胞のｃ
ＤＮＡライブラリーよりヒトＨＧＦｃＤＮＡが得られる
ことも見出した。

さらに、該ｃＤＮＡを含有する組換発現ベクターによっ
て形質転換された形質転換体、該形質転換体を培養して
ヒトＨＧＦ遺伝子が発現することを見出し、本発明を完
成させるに至った。

すなわち、本発明は組換ヒト肝実質細胞増殖因子、ヒト
肝実質細胞増殖因子をコードする塩基配列を含有するＤ
ＮＡ、該ＤＮＡを発現し得る組換発現ベクター、該組換
発現ベクターで形質転換された形質転換体および該形質
転換体を培養し、該培養物から組換ヒト肝実質細胞増殖
因子を採取・製造する方法である。

本発明のヒト肝実質細胞増殖因子をコードするＤＮＡ、
組換発現ベクター、および形質転換体は、例えば次のよ
うにして調製される。

すなわち、（１）ラット肝細胞やラット巨核球なとの動
物組織よりｍＲＮＡまたは染色体ＤＮＡを単離し、常法
に従ってｃＤＮＡライブラリーまたは染色体ＤＮＡライ
ブラリーを作製し、（２）合成オリゴヌクレオチドプロ
ーブ、あるいは抗体を用いて動物、例えばラットのＨＧ
ＦのｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡを単離するため、上記
動物、例えばラット由来のｃＤＮＡライブラリーまたは
染色体ライブラリーのスクリーニングを行い、単離され
たクローンより目的とするｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡ
を抽出し、この動物、例えばラット由来のＨＧＦのｃＤ
ＮＡまたは染色体ＤＮＡをプローブとして、ヒトの臓器
あるいは血液細胞なとのｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡ
ライブラリーのスクリーニングを行い、単離されたクロ
ーンより目的とするヒト由来ＨＧＦのｃＤＮＡを抽出す
る。また、本発明によって明らかにされたＤＮＡ配列あ
るいはヒトや動物のＨＧＦのアミノ酸配列に基づいて合
成されたオリゴヌクレオチドや本発明により得られたヒ
トＨＧＦｃＤＮＡやヒトＨＧＦ染色体ＤＮＡなとをプロ
ーブに用い、またヒトまたは動物のＨＧＦに対する抗体
を用い、直接ヒトの臓器あるいは血液細胞などから抽出
したｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡライブラリーのスク
リーニングを行い、単離されたクローンより目的とする
ヒト由来のＨＧＦのｃＤＮＡを抽出することもてきる。

（３）このヒト由来ＨＧＦのｃＤＮＡよりヒトＨＧＦを
コードするｃＤＮＡ断片を制限酵素を用いて切り出し発
現用ベクターに組み込み、（４）得られた組換発現ベク
ターにより宿主細胞を形質転換して形質転換体を得、（
５）この形質転換細胞を培養して、その培養上清から本
発明のヒトＨＧＦを採取・製造することか出来る。さら
に形質転換細胞中の組換発現ベクターから制限酵素処理
によって本発明のヒｌ−ＨＧ　Ｆをコードする塩基配列
を含有するＤＮＡを得ることが出来る。

以下、本発明の各工程について詳細に説明する。

（Ｘ１ｍ　ＲＮ　Ａの単離とｃＤＮＡライブラリーの調
製動物、例えばラットまたはヒトのＨＧＦをコードする
ｍＲＮＡはラットなとの動物またはヒトの肝臓、腎臓、
ひ臓、肺臓、脳、骨髄、胎盤などの臓器あるいは白血球
、巨核球やリンパ球なとの血液細胞なとから各々得るこ
とが出来る。例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１
８．５２９４　（１９７９）に記載されているＪ、　＋
１＋、　Ｃｈｉｒｇｖｉｎらの方法によって、ラットな
との動物またはヒトの臓器あるいは血液細胞のグアニジ
ンチオシアン酸溶液から得たＲＮＡをさらにオリゴ（ｄ
Ｔ）セルロースカラムを用いる液体クロマトグラフィに
付すことによって該ｍＲＮＡを調製することか可能であ
る。

また、ヒト肝、脳、胎盤、白血球なとのｍＲＮＡのよう
な動物細胞や動物組織などの各種ｍＲＮＡは、市販品と
してクロンチック社などから購入して利用することも出
来る。

これらのｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素やポリメラー
ゼ・チェーン・リアクシコン法（ＰＣＲ）を用いて、例
えばＨ，Ｏｋａｙａｍａらの方法（Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ
。

Ｂｉｏｌ、、２．１６１．１９８２、およびＭｏ１．　
Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ３、２８０．１９８３）あるいは
Ｕ、　Ｇｕｂｌｅｒらの方法（Ｇｅｎｅ２５、２６３．
１９８３）あるいはＭ、　Ａ、　Ｆｒｏｈｍａｎらの方
法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　
ＵＳＡ、８５．８９９８．１９８８）に従ってｃＤＮＡ
を合成し、このｃＤＮＡをプラスミドやファージなどに
組み込むことによりｃＤＮＡライブラリーを調製するこ
とが出来る。ｃＤＮＡを組み込むプラスミドベクターと
しては、大腸菌由来のｐＢＲ３２２（東洋紡績）、ｐＵ
ｃ１８およびｐＵｃ１９（東洋紡績）、枯草菌由来のｐ
ＵＢｌｌｏ（シグマ社）などがある。またｃＤＮＡを組
み込むファージベクターとしては、λｇｔｌＯおよびλ
ｇｔｌｌ（東洋紡績）などがある。

これらのベクターは、宿主細胞内に保持されて複製、増
幅されるものであれば、ここに例示したものに限定され
るものではない。

ｍＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡをプラスミド
またはファージに組み込んでｃＤＮＡライブラリーを調
製する方法として、Ｔ、　ＭａｎｉａｔｉＳの方法（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９
８２．　ｐ、　２３９）またはＴ、　Ｖ、　Ｈｙｕｎｈ
らの方法（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｐｒａｃｔ
ｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈｌ、　４９．１９８５）を
各々例示することか出来る。また、ｍＲＮＡと同様に各
種のｃＤＮＡライブラリーを市販品としてクロンチック
社などから購入することか出来るのでそれらを利用する
ことも出来る。

（２）　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーのクローニングｃ
ＤＮＡライブラリーとして得られたプラスミドやファー
ジなどの組換発現ベクターは、大腸菌のような適切な宿
主細胞に保持される。宿主となり得る大腸菌としては、
例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＮＭ５１４．
Ｃ６００（ストラタジーン社）、ＮＭ５２２．ＪＭＩ　
０１　　（ファルマシア社）なとを例示することが出来
る。ｃＤＮＡのベクターかプラスミドの場合、塩化カル
シウム法、塩化カルシウム・塩化ルビジウム法などを用
いて、またｃＤＮＡのベクターかファージの場合、イン
ビトロパッケージング法なとを用いてあらかしめ増殖さ
せた宿主細胞に保持させることが出来る（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　１９８２ｐ、
　２４９）。

このようにして得られた形質転換体から、ラットなどの
動物またはヒトの肝実質細胞増殖因子の部分のアミノ酸
配列をコードするオリゴヌクレオチドを合成し、このオ
リゴヌクレオチドを３２ｐ標識して、プローブとして用
いてコロニーハイブリダイゼーション法（Ｇｅｎｅ、　
１０．６３．１９８０）　、プラークハイブリダイゼー
ション法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　　１９６１８０、１９７
７）などによってｃＤＮＡクローンを釣り上げることが
出来る。また、目的とするポリペプチドに対する抗体を
用いて、標識抗体法（ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｐ
ｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、１．４９．　１
９８５）によって、ｃＤＮＡクローンをクローニングす
ることも可能である。このようにしてクローン化された
形質転換体は、ラットなどの動物またはヒト由来のＨＧ
Ｆの全アミノ酸配列あるいはその部分のアミノ酸配列を
コードする塩基配列を有するｃＤＮＡを含有している。

次に該形質転換体から常法Ｑｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇＣｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ
　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ、
　　＋９８２）に従ってプラスミドやファージなどの組
換ＤＮＡを単離し、そのまま、あるいは制限酵素で消化
してからｃＤＮＡ塩基配列が決定される。最初に得られ
た該ラットなどの動物またはヒト由来のｃＤＮＡをプロ
ーブとして、同様の方法によってヒトの臓器あるいは血
液細胞由来のｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡライブラ
リーのクローニングを行うことか出来る。得られたラッ
トなどの動物あるいはヒト由来のＨＧＦのｃＤＮＡの塩
基配列は、マクサムとギルバートの化学法（Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７４，５６０．１９
７７）やサンガーのジデオキシ法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ、、　７４゜５
４６３、１９７７）なとによって決定される。さらに、
必要があれば、記述のｍＲＮＡと塩基配列の決定された
ｃＤＮＡの１部あるいはそのｃＤＮＡの１部の配列を合
成したＤＮＡをプライマーにしてプライマーエクステン
ション法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　ＡｃａｄＳｃｉ、
　ＵＳＡ、　７６、７３１．１９７９）によって新たに
ｃＤＮＡを合成し、上記と同様にしてｃＤＮＡライブラ
リーから、すでに得られた第１のｃＤＮＡに連結しつる
第２のｃＤＮＡを含有するプラスミドやファージなどの
組換ＤＮＡをクローニングすることが可能である。この
プライマーエクステンションとクローニングの工程は、
必要により複数回繰り返される。

（３）ヒトＨＧＦ組換発現ベクターの構築クローン化さ
れたヒｌ−ＨＧ　Ｆのアミノ酸配列の全部あるいはその
１部をコードするｃＤＮＡを含有する数種のプラスミド
やファージなどの組換ベクターから制限酵素によってｃ
ＤＮＡを切り出し、ヒトＨＧＦの発現に適したベクター
のプロモーターの下流に制限酵素とＤＮＡリガーゼを用
いて再結合して組換発現ベクターを作製することが出来
る。

より詳しくは、本発明のヒｌ−ＨＧ　Ｆを効率良く発現
させるために組換発現ベクターは転写の下流方向に順番
に必要により（１）プロモーター、（２）リポソーム結
合部位、（３）開始コドン、（４）本発明のしトＨＧＦ
をコードする塩基配列を含有するＤＮＡ、（５）終止コ
ドン、（６）ターミネータ−を含むように構築される。

本発明で用いることか出来るＤＮＡのベクターとして、
大腸菌由来のプラスミドｐＢＲ３２２゜ｐＵｃ１８（東
洋紡績）、枯草菌由来のプラスミドｐＵＢ１１０（シグ
マ社）、酵母由来のプラスミドｐＲＢ１５　（ＡＴＣＣ
３７０６２）、バクテリオファージλｇｔｌｏ、λｇｔ
ｌｌ（ストラタジーン社）、ウィルスＳＶ４０　（ＢＲ
Ｌ社）、ＢＰｖ（ＡＴＣＣｖＲ−７０３）、レトロウィ
ルスの遺伝子由来のベクターなどが列挙出来るが宿主内
で複製・増幅可能なベクターであれば特に限定はない。

特に、本発明のヒトＨＧＦを簡便に発現させるには、Ｓ
Ｖ４０のようなウィルスの遺伝子由来のベクターを用い
るのか好ましい。

例えば、前述のクローン化されたヒトＨＧＦをコードす
るＤＮＡをＳＶ４０ベクターの後期領域に結合した組換
発現ベクターは、ＣＯ８細胞（Ｃｅ　Ｉ　１２３、１７
５．１９８１）と呼ばれるサル細胞株に導入して発現さ
せることか可能である。

プロモーターおよびターミネータ−に関しても、目的と
するヒトＨＧＦをコードする塩基配列の発現に用いられ
る宿主に対応したものであれば特に限定はない。例えば
、プロモーターとして、宿主が大腸菌である場合、ｔｒ
ｐプロモーター、ｌａＣプロモーターなどを、宿主か枯
草菌である場合、５ＰＯＩプロモーター、５ＰＯ２プロ
モーターなどを、宿主か酵母である場合、ＧＡＰプロモ
ータ、ＰＧＫプロモーターなどを、宿主かマウス線維芽
細胞やチャイニーズハムスター卵巣細胞のような動物細
胞の場合、ウィルス由来のＳＶ４０プロモーターやＨ３
ＶＩ　　ＴＫプロモーターあるいはメタロチオネインプ
ロモーターやヒートショックプロモーターなどを例示す
ることが出来る。またターミネータ−としては、宿主が
大腸菌の場合、ｔｒｐターミネータ−１ｌｐｐターミネ
ータ−などを、宿主が枯草菌の場合、ａｍｙＦターミネ
ータ−などを、宿主が酵母の場合、ＣＹＣｌターミネー
タ−などを、宿主か動物細胞の場合、ＳＶ４０ターミネ
ータ−１Ｈ３ＶＩＴＫターミネータ−などを例示するこ
とが出来る。これらのプロモーターとターミネータ−は
用いる宿主に応じて適切に組み合わされる。

本発明のヒトＨＧＦをコードする塩基配列を含有するＤ
ＮＡは、そのＤＮＡが発現されるポリペプチドか、肝実
質細胞増殖活性を有するならば特に制限はなく、例えば
後述する第４図に示した塩基配列か例示され、さらには
上記塩基配列の一部か置換、欠損、挿入、あるいはこれ
らが組み合わされた塩基配列を有するＤＮＡであっても
よい。

本発明のヒトＨＧＦをコードする塩基配列を含有する該
ＤＮＡの翻訳開始コドンとしてＡＴＧ、翻訳終止コドン
としてＴＡＡ、、ＴＧＡｌあるいはＴＡＧを有してもよ
い。また必要に応じて開始コドン、あるいは終止コドン
を１つ以上組み合わせたり、他のコドンと組み合わせて
配列してもよく、これらに特に限定はない。さらに、こ
の組換発現ベクターで形質転換した宿主の選択マーカー
となり得るアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性
遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子など１種または２種以上が該ベ
クターの適切な位置に含有されていることが好ましい。

（４）宿主細胞の形質転換とその培養：このようにして
構築されたヒトＨＧＦ組換発現ベクターは、コンピテン
ト細胞法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

５３、　１５４．１９７０）、プロトプラスト法（Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　７５．１９２９．１
９７８）リン酸カルシウム法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２２
１．５５１．１９８３）　ＤＥＡＥデキストラン法（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ、　２１５．１６６、１９８２）　、電気
パルス法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　ＵＳＡ　　８１７１６１、１９８４）、インビト
ロパッケージング法（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７２．
５８１．１９７５）、ウィルスベクター法（Ｃｅ１１．
３７．１０５３．１９８４）　、またはマイクロインジ
ェクション法（Ｅｘｐ、　Ｃｅ１１．　Ｒｅｓ、。

１５３、３４７．１９８４）などによって宿主に導入さ
れ、形質転換体が作製される。このとき、宿主として既
述の大腸菌の他に、枯草菌、酵母、動物細胞などが用い
られる。特にマウス線維芽細胞ＣＩ　２７Ｕ、　Ｖｉｒ
ｏｌ、、　２６．２９１．１９７８）やチャイニーズハ
ムスター卵巣細胞ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　５ｃｉＵＳＡ、　７７、４２１６．１９８０
）などの哺乳動物由来の宿主細胞を用いるのが好適であ
る。

得られた形質転換体は、目的とする組換ヒトＨＧＦを産
生させるためにその宿主に応じた適切な培地中て培養さ
れる。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、
窒素源、無機物、ビタミン、血清および薬剤などが含有
される。培地の１例としては、形質転換体の宿主が大腸
菌の場合、ＬＢ培地（日水製薬）、Ｍ９培地（Ｊ、　Ｅ
ｘｐ、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎｅｔ、。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７２９、４３１
）などを、宿主が酵母の場合、ＹＥＰＤ培地（Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　ｖｏｌ、　１．　
Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７９．　ｐ、１１７）などを
、宿主が動物細胞の場合、２０％以下のウシ胎児血清を
含有するＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭ１１６４０
培地（日水製薬）などを挙げることが出来る。形質転換
体の培養は、通常２０°Ｃ〜４５°Ｃ，ｐｔ＋は５〜８
の範囲で行われ、必要に応じて通気、攪拌が行われる。

また、宿主が接着性の動物細胞なとの場合は、ガラスピ
ーズ、コラーゲンビーズ、あるいはアセチルセルロース
フォローファイバーなとの担体が用いられる。これら以
外の培地組成あるいは培養条件下でも形質転換体か生育
すれば実施でき、これらに限定されるものではない。

（５）ヒトＨＧＦの精製 このようにして形質転換体の培養上清中または形質転換
体中に生成した組換ヒＩ−ＨＧ　Ｆは、公知の塩析法、
溶媒沈澱法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、あ
るいはゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマト
グラフィ、逆相クロマトグラフィ、アフィニティクロマ
トグラフィなどを組み合わせて分離精製することが出来
る。特に、硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファ
ロースイオンクロマトグラフィ、ヘパリンセファロース
アフィニティクロマトグラフィ、およびフェニルセファ
ロース逆相クロマトグラフィの組み合わせ、あるいは硫
酸アンモニウムによる塩析法、Ｓセファロースイオンク
ロマトグラフィ、および抗ＨＧＦ抗体セファロースアフ
ィニティクロマトグラフィの組み合わせなどが好ましく
有効な精製法である。

以上述へた方法によって得られた新規な組換ヒｈＨＧＦ
は、ラット肝およびラット血小板由来ＨＧＦと同様にラ
ット肝実質細胞の増殖を顕著に促進する活性を示した。

（ＨＧＦ活性の測定） ＨＧＦ活性は、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８０、７２２９　（１９８３）に記載
の方法に準じて次のように測定した。ウィスター系ラッ
トからコラーゲナーゼ還流法によって肝実質細胞を分離
精製した。

得られたラット肝実質細胞を５％ウシ血清、２×１０−
’Ｍインスリンおよび２ＸＩＯ−９Ｍデキサメザゾンを
添加したウィリアムスＥ培地（フローラボラトリー社）
に懸濁し、２４ウエルマルチプレートに１．２５　Ｘ　
１０５個／ウェルの濃度て播いた。

５％ＣＯ２および３０％０２および６５％Ｎ２の存在下
、３７°Ｃて２０時間培養後、Ｏｏ−１ｕ／ｍｅのアプ
ロチニンを添加したウィリアムスＥ培地に交換すると同
時に所定量の被験試料を添加した。

１５時間後、１５μｃｉ／ｍｌ’の１２５Ｉデオキシウ
リジン１０μＩ！／ウエルを添加した。コントロール群
には、　１５Ｉデオキシウリジン添加の１５分前に５μ
ｇ　／　ｍｌのアフィディコリンを添加した。

さらに６時間培養して１２５Ｉでラベルした。細胞をｐ
Ｈ７，４のＰＢＳで２回洗浄後、冷１０％トリクロロ酢
酸水溶液（ＴＣＡ）で固定した。細胞を１ウエル当たり
０．５　ｍｌのＩＮ水酸化ナトリウム水溶液で可溶化し
、その放射能をガンマカウンターにより測定した。また
放射能測定後の試料の１部をとってローリ−法（Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　１９３．２６５゜１９５１
）に従い蛋白量を測定した。被験試料を添加したとき肝
実質細胞に取り込まれた１２５Ｉの量をコントロールと
のカウントの差として求め、これをラット肝実質細胞蛋
白質１■当たりに換算して、ＤＮＡ合成活性（ｄｐｍ／
ｍｇ蛋白質）とした。

被験試料のＨＧＦ活性は、同一試験において上皮細胞成
長因子（Ｅ　Ｇ　Ｆ）　１０　ｎ　ｇ／ｒｎｌを用いた
時の肝実質細胞のＤＮＡ合成活性の５０％に相当する活
性を１単位と定義して表示した。

〔発明の効果〕

本発明によれば、肝実質細胞の生体外での増殖を可能と
する新規な生理活性ペプチドか提供される。本発明の組
換ヒトＨＧＦは、臨床診断試薬や肝疾患治療薬として有
用である。さらに本発明の組換ヒトＨＧＦの作用により
増殖維持される肝実質細胞は、例えば肝機能の基礎的研
究用、肝実質細胞に対する各種ホルモンや薬剤の作用の
研究用肝癌の発癌研究用、あるいは肝炎ウィルスの生体
外培養のだめの宿主細胞として極めて有用である以下、
本発明を実施例により、さらに詳しく説明するか、本発
明はこれらの実施例に限定されるものではない。

〔実施例〕

実施例１ （１）ラット肝臓ｍＲＮＡの単離 ラット肝臓ｍＲＮＡは、グアニジンチオシアン酸法（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１８．５２９４．１９７９
）によって抽出し、オリゴｄＴセルロースカラムクロマ
トグラフィ法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　６９゜１４０８、１９７２）によ
って精製して調製した。市販食用植物油で希釈した２０
％四塩化炭素をＳＤラッ）１００ｇ当たり１ｍｌを腹腔
内投与した。四塩化炭素投与の１０時間後、肝臓を摘出
した。得られたラット肝臓０．９０　ｇに５．５Ｍグア
ニジウム溶液（５，５Ｍグアニジンチオシアン酸、２５
ｍＭクエン酸、０．５％ラウリルザルコシンナトリウム
からなるｐＨ７，０の溶液）１６ｍｌ’を加えてホモジ
ナイズした。０．１Ｍ　　ＥＤＴＡを含むセシウム）〜
リフロロ酢酸溶液（１ｇ　／ｍｌ＞　　１７　ｍｌに上
記のラット肝分散液１６艷を重層し、ベックマン超遠心
機、Ｌ８−５５型によって８５０００ｇ、２０時間、２
０°Ｃの条件下で遠心分離した。ＤＮＡ層を除去した後
、沈降したＲＮＡ層を１−の滅菌した蒸留水に溶解した
。このＲＮＡ水溶液から冷エタノール沈澱によって６．
２４■のＲＮＡを得た。得られたＲＮＡを１ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡを含むＩＯｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐ）１７．５
）　　（以後、ＴＥ緩衝液と略する）０．５ｉｌに溶解
し、６５°Ｃ，５分加熱処理した後、ＩＭ　　ＮａＣｌ
溶液０．５　ｍｌを加えた。Ｏ，ＩＮＮａＯＨで活性化
した後、０．５Ｍ　　ＮａＣ１およびＩｍＭ　　ＥＤＴ
Ａを含む１０ｍＭ１−リス塩酸緩衝液（ＳＴＥ緩衝液と
略す）で平衡化したオリコ゛ｄＴセルロースカラムにＲ
ＮＡ溶液０．５　ｍｌを注入した。約５ｍｌのＳＴＥ緩
衝液て洗浄後、ＴＥ緩衝液で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡ
を溶出した。このポリ（Δ）ＲＮＡ溶液５００μｌから
冷エタノール沈澱て得られたポリ（Ａ）ＲＮＡは、再び
ＴＥ緩衝液に溶解し、１Ｍｇ／μｍの濃度に調製した。

（２）ラット肝由来のｃＤＮＡライブラリーの作製上記
（１）で得られたポリ（Ａ）ＲＮＡ、５μｌを鋳型とし
てｃＤＮＡ合成システム・プラス（アマジャム社）を用
いてＧｕｂｌｅｒらの方法（Ｇｅｎｅ。

２５　２６３、１９８３）に準じてｃＤＮＡを合成した
。１本鎖ＣＤＮＡの収量は、１１０１８ｎ、２本鎖ＣＤ
ＮＡの収量は、＋７２９ｎｇであった。この２本鎖ＣＤ
ＮＡは、フェノール／クロロホルム（１：１、ｖ／ｖ）
抽出とエタノール沈澱によって精製した後、ＳＴＥ緩衝
液に溶解し、約０．７μｇ／２０μｌの濃度に調製して
から使用するまで一２０°Ｃて保存した。このｃＤＮＡ
は、ｃＤＮＡクローニングシステムλｇｔｌｏ（アマジ
ャム社）を用いてＨｕｙｎｈらの方法（ＤＮＡ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ　［、ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃ
ｈ、　１．４９．１９８２）に準じ、次のようにλｇｔ
ｌＯのＥｃｏＲ１部位にクローニングした。ＥｃｏＲＩ
メチラーゼを用いて上記のｃＤＮＡ溶液の２０μβをメ
チル化した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてｃＤＮＡの
両末端にＥｃｏＲＩリンカ−を付加した。過剰のリンカ
−をＥｃｏＲ’ｌ消化し、約１００μｌの反応液を得た
。ＳＴＥ緩衝液で平衡化したｃＤＮＡ精製用ゲル濾過カ
ラムに上記反応液１００μｌを注入した。ＳＴＥ緩衝液
で溶出してｃＤＮＡ画分５００μβを集めた。常法によ
ってエタノール沈澱を２回繰り返した後、減圧乾燥して
リンカ−付加ｃＤＮＡを得た。再び、ＳＴＥ緩衝液に溶
解してｓｏｎｇ／μｌのリンカ−付加ｃＤＮＡ２６μｌ
を調製した。あらかじめ準備されたλｇｔｌｏアーム１
μｇにリンカ−（］加ｃＤＮＡ０．１μｇをＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて挿入した。この反応液は冷エタノール
処理した後、軽く乾燥し、得られた組換ＤＮＡの全量を
５μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。この組換ＤＮＡをイン
ビトロパッケージング反応に供し、λｇｔｌ。

組換ファージを得た。ファージブレーティング用大腸菌
を用いたタイトレージョンにより測定したｃＤＮＡ１μ
ｇから得られた組換ファージ数は、５．０ＸＩＧ’個で
あった。このようにして作製したｃＤＮＡライブラリー
は、使用するまで少量のクロロホルムを加えたＳＥ緩衝
液（ｌｏｏｍＭ　　ＮａＣ１１０ｍＭ　　Ｍｇ５Ｏ＋、
および０．０１％ゼラチンを含む２０ｍＭトリス塩酸緩
衝液、ｐＨ７，５）中、４°Ｃて保存した。

（３）ＤＮＡプローブの合成 本発明者が見出した下記ラットＨＧＦβ鎖Ｎ末端アミノ
酸配列１５個 Ｖ−Ｖ−Ｎ−Ｇ−１−Ｐ−Ｔ−０−Ｔ−Ｔ−Ｖ（式中、
■はバリン、Ｎはアスパラギン、Ｇはグリシン、■はイ
ソロイシン、Ｐはプロリン、Ｔはトレオニン、Ｑはグル
タミン、Ｗはトリプトファン、Ｍはメチオニンを示す） をコードする塩基配列を推定し、オリゴヌクレオチド ５゛ＡＣＣＡＴＣＣＡ　Ｔ　ＣＣＩ　ＡＣＩ　ＧＴ　Ｉ
　ＧＴ　ＩＴＧＩＧＴＩＧＣ；ＩＡＴＩＣＣＩＴＴＩＡ
ＣＴＡＣ”（Ｉはイノシンを表わす） をＤＮＡシンセサイザー３８１Ａ（アプライドバイオシ
ステムズ社）により合成した。得られたオリゴヌクレオ
チドをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績）を用
いて〔γ”Ｐ）ＡＴＰ　（アマジャム社）により標識し
てＤＮＡプローブを作製した。

（４）ラットＨＧＦ遺伝子ＤＮＡの部分単離とその塩基
配列の決定 上記（２）で得られた約５Ｘ１０５個の組換ファージを
３７℃で１５分間約８Ｘ１０’個の大腸菌ＮＭ５１４（
ストラタジーン社）に感染させた後、約５０°Ｃに加温
した０、７％の寒天を含むＬＢ培地２７０ｍ１に添加し
、２３ｃｍＸ２３ｃｍのＬＢ寒天培地プレート６枚に均
一に流延した。空気中、３７°Ｃで１２時間培養後、プ
ラークの生じたプレート上にニトロセルロースフィルタ
ーを約３０秒間密着させた。このニトロセルロースフィ
ルターを１．５Ｍ　　ＮａＣ１および０．ＩＮ　　Ｎａ
ＯＨからなるアルカリ溶液に５分間浸漬し、さらに０．
２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　、２５ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７，５）　、２ｍＭ　　ＥＤＴＡおよび
２ＸＳＳＣ緩衝液からなる中性溶液に１５分間浸漬した
。

風乾後、８０°Ｃ，２時間熱処理してニトロセルロース
フィルターに各プラークのＤＮＡを固定化した。得られ
たニトロセルロースフィルターは、６ｘｓｓｃ緩衝液、
５×デンハート溶液、５０ｍＭＰＩＰＥＳ、および１０
０ｍＭリン酸緩衝液、ｐ１７．０、からなるハイブリダ
イゼーション溶液に浸漬し、６５°Ｃで５時間前処理し
た。１００’Ｃて５分間熱処理した上記（３）の″′Ｐ
標識合成オリゴヌクレオチド（約３ｘ１０８ｃｐｍ）プ
ローブとサケ精巣ＤＮＡ　（０，１ｍｇ／＋ｎｌ）の混
合溶液を添加し、４５°Ｃて１６時間ハイブリダイゼー
ション反応を行った。反応後、ニトロセルロースフィル
ターは５０°Ｃて０．１％ＳＤＳを含む６ＸＳＳＣ緩衝
液によって３回洗浄してから風乾した。このニトロセル
ロースフィルターを増感スクリーン、ライトニングプラ
ス（デュポン社）とＸ線フィルム、ＲＸ（富士写真フィ
ルム）に密着させ、−８０°Ｃで３０時間露光した。得
られた３個の陽性プラークを採取し、上記と同じ方法に
よって２次スクリーニングを行い、得られた１個の陽性
クローンをＲＢＣｌと命名した。このＲＢＣ１フアージ
を常法により増殖させ、ＲＢＣｌｃＤＮＡを単離精製し
た。

得られたｃＤＮＡの塩基配列は、シーケネース（ユナイ
テッド　ステート　バイオケミカル社）を用いてジデオ
キシ法によって決定した。第１図にＲＢＣｌｃＤＮＡの
全塩基配列を示す。ＲＢＣｌｃＤＮＡは、ラットＨＧＦ
β鎖をコードする塩基配列（１番目から６９９番目）を
含有する。

（５）ヒトＨＧＦ遺伝子ＤＮＡの単離と塩基配列の決定
： ヒト正常肝臓ｍＲＮＡ　（クロンチック社）５μｇを鋳
型にして上記（２）と同様にしてヒト肝由来のＣＤＮＡ
を合成した。１重鎖ｃＤＮＡの収量は、１ｌ１００ｎで
あった。得られたｃＤＮＡの２００ｎｇをアガロース電
気泳動に供し、分画した４〜７ｋｂのｃＤＮＡをシーン
クリーン（バイ第１０１社）で抽出した後、上記（２）
と同様にしてＣＤＮＡライブラリー（Ｉ）を調製した。

ｃ　ＤＮＡ１μｇから２Ｘ１０５個の組換ファージを得
た。

マルチプライムＤＮＡ標識システム（アマジャム社）を
用いて〔α”Ｐ）ｄＣＴＰて標識したＲＢＣｌｃＤＮＡ
をプローブとして、ハイブリダイゼーション反応温度お
よび洗浄温度を６０°Ｃ１洗浄液は０．１％ＳＤＳを含
む２ＸＳＳＣ緩衝液とした以外は（４）と同様に、ヒト
肝由来ｃＤＮＡライブラリー（Ｉ）の１次スクリーニン
グおよび２次スクリーニングを行い、陽性クローンＷＢ
Ｃ２５を得た。ＨＢＣ２５ファージから常法により単離
、精製したＨＢＣ２５ｃＤＮＡを塩基配列解析および制
限酵素切断解析に供した。第２図（ａ）にＨＢＣ２５ｃ
ＤＮＡの制限酵素地図、第３図（ａ）にＨＢＣ２５ｃＤ
ＮＡの塩基配列の一部を示す。次にＨＢＣ２５ｃＤＮＡ
に含有する”ＴＣＡＴＡＡＴＣＴＴＴＣＡＡＧＴＣＴ″
の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡシンセ
サイザー３８１Ａ（アプライドバイオシステムズ社）に
より合成した。この合成りＮＡｏ、７５μｇをプライマ
ーとし、ヒト肝ｍＲＮＡ２０μｇを鋳型としてｃＤＮＡ
Ｏ１４μｇを合成し、同様にしてｃＤＮＡライブラリー
（Ｉ［）を調製した。このｃＤＮＡライブラリー（■）
から〔α３２Ｐ）ｄＣＴＰて標識したＨＢＣ２５ｃＤＮ
Ａの０．７　ｋ　ｂ　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ断片をプローブ
にして陽性クローンＨＡＣ１９を得た。第２図（ｂ）に
ＨＡＣ１９ｃＤＮＡの制限酵素地図、第３図（ｂ）にＨ
ＡＣｌ　９　ｃＤＮＡの塩基配列の一部を示す。このよ
うにして得られたＨＢＯ２５ｃＤＮＡおよびＨＡＣＩ　
９　ｃＤＮＡの塩基配列を組み合わせたヒトＨＧＦコー
ド領域の全塩基配列およびその塩基配列から演澤される
アミノ酸配列を第４図に示す。ヒトＨＧＦの全ｃＤＮＡ
塩基配列から、ヒトＨＧＦの翻訳開始コドンは１番目の
ＡＴＣであり、終止コドンは２１８５１８５番目Ｇと推
定される。これらの開始および終止コドンの間のヒ１−
　ＨＧ　ＦのｃＤＮＡ塩基配列は７２８アミノ酸残基か
らなるポリペプチドをコードし、１番目のＭｅｔに続く
アミノ酸配列はＬｅｕに富み、３１番目のＧｌｙまてか
ＨＧＦ分泌のためのシグナル配列であった。同様にヒト
ＨＧＦβ鎖のＮ末端は、４９５番目のＶａｌと推定され
る。また、ヒトＨＧＦの糖鎖の結合部位は、Ａｓｎ−ｘ
−３ｅｔ／Ｔｈｒのアミノ酸配列を有する２９４番目、
４０２番目、５６６番目、および６５３番目のＡｓｎと
推定される。

第４図に示すヒトＨＧＦのアミノ酸配列をコンピュータ
ーによりホモロジー検索を行った結果、ヒトＨＧＦはプ
ラスミノーゲン、プラスミン、カリキュレインや凝固因
子Ｘ■なとのセリンプロテアーゼとホモロシーをもつこ
とか見出された。即ち、ヒトＨＧＦはそのα−鎖にクリ
ングル構造と推定される配列を４箇所持っており、また
そのβ鎖は上記セリンプロテアーゼのプロテアーゼ領域
に類似している。しかし、セリンプロテアーゼの活性中
心と推定されているＳｅｒとＨｉｓかヒトＨＧＦのβ−
鎖てはＴｙｒ（６７３番目）とＧＩｎ（５３４番目）に
それぞれ置換されている。

（６）ザルＣＯ８細胞用ヒｌ−ＨＧ　Ｆ発現ベクターの
構築。

サルＣＯ８細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターｐＥＵＫ　（
ｈＨＧＦ　Ｉ）の構築図を、第５図に示す。

上記（５）で得られたＨＡＣ１９フアージＤＮＡを制限
酵素ＢａｍＨＩとＳｃａ　Ｉて消化し、アガロース電気
泳動により０．９　ｋ　ｂのＤＮＡ断片を分離・精製し
た。同様にＨＢＣ２５ファージＤＮＡを制限酵素Ｓｃａ
　ＴとＳｍａＩて消化し、２．１　ｋ　ｂの−ＤＮＡ断
片を分離・精製した。これらのＤＮＡ断片をあらかじめ
制限酵素ＢａｍＨＩとＳｍａ　Ｉて消化したブルースク
リプトＫＳＭＩ　３＋（ストラタジーン社）と混合し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合してプラスミドｐＢＳ　（ｈ
ＨＧＰＩ）を得た。

得られたｐＢＳ　（ｈＨＧＦＩ：ｌを制限酵素ＸｂａＩ
とＳｍａｌて消化した。制限酵素ＸｂａｌとＳｍａｌて
あらかじめ消化したｃｏｓ細胞用発現ベクターｐＥＵＫ
−ＣＩ　　（クロンチック社）と３．０ｋｂＤＮＡ断片
を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合してヒトＨＧＦ発
現ベクターｐＥＵＫ　［ｈＨＧＦＩ）を得た。

（７）サルＣＯ８細胞の形質転換とヒトＨＧＦ遺伝子の
発現 得られたｐＥＵＫ　（ｈＨＧＦ　Ｉ）プラスミドをエタ
ノール沈澱した後、１０ｍＭＰＢＳ緩衝液に溶解し、２
０Ｐｇ　／　ｍｌに調製した。次に、１０％ウシ胎児血
清（ギブコ社）を含むＤＭＥＭ培地（日永製薬）中で増
殖させた対数増殖期のＣ０８ｌ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−
１６５０）を１０ｍＭＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した後ト
リプシン処理した。同緩衝液で３回洗浄後、細胞濃度２
×１０７個／　ｍｌになるように再び同緩衝液に浮遊化
した。

先に調製したプラスミド溶液２５０μβと細胞浮遊液２
５０μｌを混合し、水冷下で１０分間放置した。この氷
冷したプラスミド・細胞混液に高電圧パルス遺伝子導入
装置ＺＡ−１２００（ＰＤＳ社）を用いて、印加電圧４
　ｋ　Ｖ　／　ｃｍ、パルス時間２０ミリ秒の条件下で
高電圧パルスをかけた。得られた細胞を上記の培地で希
釈し、３７°Ｃ１５％ＣＯ２存在下にて３日間培養した
。培養３日目の培養上清中のＨＧＦ活性を前述のラット
肝実質細胞を用いて測定したところ、５０単位／ｄてあ
った。

一方、ＨＧＦｃＤＮＡを挿入していない発現ベクター、
ｐＥＵＫ−ＣＩを同じ方法によりＣ０８１細胞に導入し
て培養したが、その培養上清中には、ＨＧＦ活性を認め
なかった。

実施例２ （１）マウスＣ１２７細胞用ヒｌ−ＨＧ　Ｆ発現ベクタ
の構築 マウスＣ１２７細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターｐＢＰＭ
Ｔ　（ｈＨＧＦＩ［］の構築図は、第６図に示す。実施
例１で得られたＨＡＣ＋９ファージＤＮＡを制限酵素Ｂ
ａｍＨＩと３−ｃａＩて消化し、アガロース電気泳動に
より０．９　ｋ　ｂのＤＮＡ断片を分離・精製した。同
様にＨＢＣ２５ファージＤＮＡを制限酵素Ｓｃａ　Ｉと
ＰｓｔＩて消化し、２．１ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精
製した。これらのＤＮＡ断片をあらかじめ制限酵素Ｂａ
ｍ１とＰｓｔＩて消化したブルースクリプトＫＳＩＩ＋
（ストラタジーン社）と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーセて
結合してプラスミドｐＢＳ　（ｈＨＧＦＩ［）（微工研
菌寄第１１０５０号）を得た。プラスミドｐＢＰＭＴを
制限酵素ＥｃｏＲＶて消化後、細菌性アルカリフォスフ
ァターセ（ＢＡＰ）でリン酸基を除去した部位に、プラ
スミドｐＢＳ　［ｈＨＧＦＩＩ〕（微工研菌寄第１１０
５０号）を制限酵素Ｘｂａ■と５ａｌｒとＮａｅＩてｔ
白化しＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした後、ア
ガロース電気泳動により分離・精製した３、　０　ｋ　
ｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより挿入した。

得られたヒ１−　ＨＧ　Ｆ発現ベクターｐＢＰＭＴ　ｌ
：ｈＨＧＦＩＩ）は、ＭＴ−１プロモーターとＳＶ４０
初期遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナルの間にヒトＨＧＦ
遺伝子を有し、この発現ベクターによるマウスＣｌ２７
細胞の形質転換は、ウシパピロマウイルス（ＢＰＶ）遺
伝子により行われる。また形質転換された細胞の選択は
、トランスポゾンＴｎ５のｎｅ。

遺伝子（Ｇｅｎｅ、１９．３２７．１９８２）にヘルペ
スシンプレックスウィルスタイプ１のチミジンキナーゼ
（Ｈ８Ｖ−Ｉ　　ＴＫ）遺伝子由来のプロモーターとポ
リ（Ａ）付加シグナルを連結したｎｅｏキメラ遺伝子に
よっても可能となる。

（２）マウスＣＩ　２７細胞の形質転換とヒトＨＧＦ遺
伝子の発現： ヒトＨＧＦ発現ベクターｐＢＰＭＴ　（ｈＨＧＦ■〕は
、Ｗｉｇｌｅｒらの方法（Ｃｅ１１．１１．２２３．１
９７７）によりマウスＣｌ２７細胞へ導入した。

上記（１）で得られた２０μｇのｐＢＰＭＴ　（ｈＨＧ
ＦＩＩ〕プラスミドを０．５Ｍ　　塩化カルシウム２４
０μｊ？に溶解し、２０ｍＭ　　ＨＥＰＥＳ、２８０ｍ
Ｍ　　ＮａｅＩおよび１．５ｍＭリン酸ナトリウムから
なる２ｘＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，１）　、　　２４
０μｌを攪拌しながら加えた。室温で３０分攪拌を続は
プラスミドとリン酸カルシウムの共沈殿を形成させた。

あらかじめ、１０％ウシ胎児血清（ギブコ社）およびｌ
０ｍＭグルタミンを添加したＤＭＥＭ培地（日永製薬）
を用いて５ＸＩ０５個のＣ１２７細胞を５％ＣＯ２の存
在下で３７°Ｃ１２４時間培養した。培地交換した後、
プラスミドとリン酸カルシウム共沈澱を加え、室温で２
０分放置した。さらに３７°Ｃて４時間インキュベート
した後、培地を除去し、１５％グリセリンを添加したｔ
ｘＨＥＰＥＳ緩衝液を加え室温で５分放置した。

培地て細胞を洗浄した後、培地交換し、さらに３７°Ｃ
て２Ｂ間インキュベートした。細胞を１０倍に希釈して
１■／艷の０４１８（シグマ社）を含む同培地を用いて
５％Ｃ０２の存在下で３７°Ｃ１７日間培養して形質転
換細胞を得た。得られた細胞株から培養上清中のＨＧＦ
活性の高い細胞を限界希釈法てスクリーニングしヒトＨ
ＧＦ高産生株ＢＰＨ８９を得た。この細胞の培養上清中
のＨＧＦ産生能は、２，３万単位／１／日であった。

実施例３ （１）チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞用ヒトＨＧＦ
発現ベクターの構築 チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞用ヒトＨＧＦ発現べ
’）ターｐＥＶＳＶＥ　（ｈＨＧＦＩ［）ｃＤ構築図は
、第７図に示す。プラスミドｐＥＶＳＶＥを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＶて消化後、細菌性アルカリフォスファターセ（
ＢＡＰ）でリン酸基を除去した部位に、実施例２て得ら
れたプラスミドｐＢＳ（ｈＨＧＦＩ［）（微工研菌寄第
１１０５０号）を制限酵素ＸｂａＴと５ａｌｌとＮａｅ
ｌで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした
後、アガロース電気泳動により分離・精製した３、　０
　ｋ　ｌ）のＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより挿
入した。得られたヒトＨＧＦ発現ベクターｐＥｖｓＶＥ
　（ｈＨＧＦＩ［］　は、ＳＶ４０初期プＯモーターと
ＳＶ４０の初期遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナルの間に
ヒトＨＧＦ遺伝子を存する。また、形質転換された細胞
の選択は、マウスＤＨＦＲ遺伝子にＳＶ４０初期プロモ
ーターとポリ（Ａ）付加シグナルを連結したＤＨＦＲキ
メラ遺伝子により可能となる。

（２）チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞の形質転換と
ヒトＨＧＦ遺伝子の発現。

ヒｌ−ＨＧ　Ｆ発現ベクターｐＥＶＳＶＥ　Ｉ：ｈＨＧ
ＦＩＩ）は、実施例２と同様にしてチャイニーズハムス
ターＣＨ○細胞のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＰＲ）欠
損ＣＨＯＤ　Ｕ　Ｋ　Ｘ細胞に導入した。

得られた細胞株は、リボヌクレオシドとデオキシヌクレ
オシドを含まず、透析したｌＯ％ウシ胎児血清（ギブコ
社）と１％グルタミンと５０％Ｍメソトレキセートを含
むα−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）を用いて培
養した。発生したコロニーは、安定なヒトＨＧＦ高産生
株を得るために、同培地において１８世代まで増殖させ
た。得られた細胞株は、安定にヒｌ−ＨＧ　Ｆを産生し
、ＣＨＯｌと名付けた。この細胞のヒトＨＧＦ産生能は
、３、１万里位／ＩＩ１日であった。

実施例４ 実施例２て得られたヒトＨＧＦ産生マウス０１２７組換
細胞株ＢＨＰ８９の培養上清液より組換ヒトＨＧＦを精
製した。

（１）陽イオン交換クロマトグラフィ ＢＰＨ８９株の培養液４００ｍ１’に、終濃度０．０１
％となるようにＴｗｅｅ口８０口添０し、ステリベクス
ＨＶフイルター（日本ミリポア・リミテッド）により濾
過した。この濾液に１／２０容のＩＭＴｒ　ｉｓ　−Ｈ
Ｃｌ　　（ｐＨ８，５）緩衝液を加え、緩衝液Ａ（５０
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、２ｍ
Ｍ　　ＣａＣｌ２、＋５０ｍＭＮａｃ１．０．Ｏ１％Ｔ
ｗｅｅｎ　８０、ｐＨ８，５）で平衡化したＳ−セファ
ロースＦＦ（ファルマシア社製、カラムサイズ内径１．
６ｃｍ、高さ５ｃｍ）に添加した。

緩衝液Ａで未吸着物質を洗浄後、０．１５Ｍがら１゜Ｏ
ＭのＮａＣ１による直線濃度勾配（全量１００ｍ１）で
、吸着物を溶出した。クロマトパターンを第８図に示す
。ＨＧＦ活性をもつ両分を集め、Ｓセファロース溶出液
とした。

（２）アフィニティクロマトグラフィーＳ−セファロー
ス溶出液をＩＮ酢酸でｐＨ７，５に調整後、２倍容の０
．０１％Ｔｗｅｅｎ　８０を含む蒸留水で希釈し、緩衝
液Ｂ（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３Ｍ　　Ｎ
ａｅｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ　８０゜ｐＨ７，５）で
平衡化したヘパリン・セファロースＣＬ−６Ｂ（ファル
マシア社製、カラムサイズ内径１ｃｍ、高さ３ｃｍ）に
添加した。緩衝液Ｂてカラムを洗浄後、０．３Ｍから２
．０ＭのＮａＣ１による直線勾配（全量３０ｍ１）によ
り溶出した。そのクロマトパターンを第９図に示す。Ｈ
ＧＦ活性をもっ画・分を集め、ヘパリン溶出液とした。

（３）逆相ＨＰＬＣ Ｏ，１％ＴＦＡ（＋−リフルオロ酢酸、ｖ　／　ｖ％）
を含む蒸留水で平衡化したＣ４　　ＲＰ−３０４カラム
（バイオラッド社製、内径４．６　ｍｍ、高さ２５０ｍ
ｍ）にヘパリン溶出液を添加し、０．１％ＴＦＡを含む
０％から９０％へのアセトニトリルの濃度勾配により溶
出を行った。組換ヒトＨＧＦは約４０％のアセトニトリ
ル濃度にて溶出させた。そのクロマトグラムを第１０図
に示す。精製された組換ヒトＨＧＦの収量は約２５μｇ
であり、培養上清液からの活性回収率は約２５％であっ
た。

（４）　Ｓ　Ｄ　Ｓポリアクリルアミド電気泳動前記３
段のクロマトグラフィーで精製された組換ヒｌ−ＨＧ　
Ｆを２−メルカプトエタノール還元下及び非還元下５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけた。結果を第１
１図に示す。精製組換ＨＧＦは、非還元条件（２−ＭＥ
　（−））では分子量７万〜９万の単一バンドを示し、
還元条件下（２−ＭＥ　（＋））では、分子量６万〜７
．５万のα鎖と分子量３万〜４万のβ鎖に分かれた。即
ち、組換ＨＧＦはα鎖とβ鎖からなるヘテロダイマーで
あることが示された。またβ鎖か２本のバンドに分離し
、β鎖に付加される糖類の本数に差のあることを示した
。

（５）　　α鎖およびβ鎖のＮ末端アミノ酸配列精製組
換ＨＧＦのα鎖とβ鎖を分離し、それぞれのＮ末端アミ
ノ酸配列を調べた。精製標品を４Ｍグアニジン存在下に
て６０°Ｃ１３０分間処理し、２−メルカプトエタノー
ルにて還元した。次いでモノヨード酢酸ナトリウムを添
加して、ＳＲ基をアルキル化し、反応液をマイクロボン
ダスフェア−Ｃ４カラム（ウォーターズ社）による逆相
ＨＰＬＣにかけ、α鎖とβ鎖を分離した。溶出は０．１
％ＴＦＡを含む水とアセトニトリルによった。倶のよう
にして得られたα鎖とβ鎖をプロテインシ一りエンサー
にかけた結果、 下記に示すアミノ酸 配列が得られた。

α鎖　　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａ
ｓｎ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕｌｌ　　１２　
１３　１４　　＋５　１６　１７　１８　　＋９　２０
Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔ
ｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ｌ１ｅβ鎖　　Ｖａｌ　Ｖａｌ
　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒこれらの配
列は第４図のＨＧＦコード領域の全塩基配列より推定さ
れたアミノ酸配列の３２〜５１番目および４９５〜５０
１番目に一致した。

（６）アミノ酸組成および糖組成 精製組換ＨＧＦを０．２％フェノールを含む６ＮＨＣＩ
にて１１０°０１２４時間処理して加水分解し、アミノ
酸分析機にかけ、アミノ酸組成を調へた。その結果は下
表に示したように、ＤＮＡ塩基配列より推定したアミノ
酸組成値と精製組換標品による実測値は非常によく一致
した。

〔以下余白〕

アミノ酸 蛋白質１ｍｏ１当たりの各アミノ酸敗 ＤＮＡ配列からの計算値　　　実測値 ｒｐ （実測値の（）はこの分析方法では測定できないことを
意味する。） さらに精製組換ＨＧＦを２．５Ｎ　　ＴＦＡ中で、１１
０°Ｃ１６時間加熱処理し、陰イオン交換樹脂を用いた
ＨＰＬＣにて糖分析を行った。その結果、アスパラギン
配糖体特有のマンノース、ガラクト−ス、フコース、Ｎ
−アセチルガラクトサミンが検出され、組換ＨＧＦは糖
蛋白質であることか確認された。

（７）組換ヒ）ＨＧＦの肝細胞増殖活性ラット初代培養
肝実質細胞は、現在知られているｉｎ　ＶｉｔｒＯの系
の中では最もｉｎ　ｖｉｖｏに近い肝機能を持つ系であ
る。ｒＨＧＦ活性の測定法」に記述した方法に従って得
たラット肝実質細胞に対し、精製した組換ヒトＨＧＦを
添加したところ、Ｉｎｇ　／　ｍ（！の濃度で強い細胞
増殖を誘起し、１０ｎｇ／艷でその効果は最大に達した
。この培養系に増殖活性を示す因子は他にもインスリン
やＥＧＦがあるか、組換ヒトＨＧＦは単独で両者よりも
強い活性を有し、かつこれら３者の共存下では相加的な
作用を示した。従って、組換ヒトＨＧＦは現在知られて
いる因子のなかでは、生体外肝細胞に対し最も強力な増
殖活性をもつ物質ということかできる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＲＢＣｌｃＤＮＡの塩基配列を示す。 第２図は、ＨＢＣ２５ｃＤＮＡの制限酵素地図（ａ）お
よびＨＡＣ１９ｃＤＮＡの制限酵素地図（ｂｌを示す。 第３図は、ＨＢＣ２５ｃＤＮＡの塩基配列の一部（ａ）
及びＨＡＣ１９ｃＤＮＡの塩基配列の一部（ｂ）を示す
。第４図は、ヒトＨＧＦコード領域の全塩基配列とアミ
ノ酸配列を示す。第５図は、サルＣＯ８細胞用ヒトＨＧ
Ｆ発現ベクターの構築図を示す。第６図は、マウスＣ１
２７細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターの構築図を示す。第
７図は、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞用ヒトＨＧ
Ｆ発現ベクターの構築図を示す。第８図は、Ｓ−セファ
ロース溶出液のフラクションと溶出成分の吸光度および
それらのＤＮＡ合成活性との関係を示す線図である。第
９図は、ヘパリン溶出液のフラクションと溶出成分の吸
光度およびそれらのＤＮＡ合成活性との関係を示す線図
である。第１０図は、逆相ＨＰＬＣにおいて、通液した
アセトニトリル濃度と、溶出した成分の吸光度との関係
を示す線図である。第１１図は、精製組換ヒトＨＧＦの
還元下および非還元下での５ＤＳ−ポリアクリルアミド
電気泳動パターンを示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）組換ヒト肝実質細胞増殖因子。
2. （２）ヒト肝実質細胞増殖因子をコードする塩基配列を
   含有するＤＮＡ。
3. （３）ヒト肝実質細胞増殖因子をコードする塩基配列を
   発現し得る組換発現ベクター。
4. （４）ヒト肝実質細胞増殖因子をコードする塩基配列を
   発現し得る組換発現ベクターにより形質転換された形質
   転換体。
5. （５）ヒト肝実質細胞増殖因子をコードする塩基配列を
   発現し得る組換発現ベクターにより形質転換された形質
   転換体を培養し、該培養液から組換ヒト肝実質細胞増殖
   因子を採取することを特徴とする組換ヒト肝実質細胞増
   殖因子の製造法。