JPH0687894A

JPH0687894A - 平滑筋細胞増殖因子およびそれをコードする単離されたｄｎａ

Info

Publication number: JPH0687894A
Application number: JP5022590A
Authority: JP
Inventors: Jouda Falkman Moses; ジューダフォークマンモーゼス; Yuen Shing; シンユエン; Koichi Igarashi; 貢一五十嵐
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd; Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd; Childrens Medical Center Corp
Priority date: 1992-02-10
Filing date: 1993-02-10
Publication date: 1994-03-29
Anticipated expiration: 2020-02-16
Also published as: EP0555785B1; CA2089111A1; ATE145939T1; DE69306273D1; DE69306273T2; DK0555785T3; EP0555785A1; ES2099304T3; CA2089111C; JP3621431B2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【構成】下記の部分アミノ酸配列を有する非グリコシ
ル化組み換え哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦ蛋白質、該蛋白質を
コードする単離ＤＮＡ、該単離ＤＮＡをもつ組み換えベ
クター、該ベクターを含有する形質転換細胞、および該
形質転換細胞を培地中で培養することからなる上記蛋白
質の製造方法。（１）Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ
−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ，（２）Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａ
ｌ−Ｖａｌ，（３）Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙ
ｓ、および（４）Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒ
ｇ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ【効果】非グリコシル化組み換え哺乳動物ＢＴＣ−Ｇ
Ｆ蛋白質は、平滑筋増殖因子の関与する病気の治療に、
また創傷／潰瘍治癒に有用な医薬として利用可能であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、平滑筋細胞の成長を刺
激する非グリコシル化組換え型哺乳動物ＢＴＣ−成長因
子蛋白質及びその用途に関するものである。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】平滑筋
細胞の増殖については広く研究されているが（例えば、
Schwartz 等、サーキュレーション・リサーチ（Circula
tion Research）、第５８巻、第４号、第４２７頁参
照。ここの開示は、本文献をここに記載することによ
り、本明細書に引用する。）、平滑筋細胞の増殖を制御
するシグナルについては、大部分が未知のままである。
平滑筋細胞増殖は、動脈硬化症（アテローム性動脈硬化
症及び高血圧症）のような病気において中心的な役割を
演じていることが知られており、幼児における平滑筋増
殖の欠如は、血管奇形においても何らかの役割を演じて
いる。このように、平滑筋細胞複製ができない場合は、
血管の損傷を治療できなくなり、死に至ることも多い。
アテローム性動脈硬化の損傷が形成されている間に、平
滑筋細胞の複製が起こることは、現在一般に知られてい
るが、プラークの履歴全体におけるその増殖応答の役割
は、全てが明らかになっているわけではない。２、３の
研究者は、動脈の発育中に起こる複製が、脂質蓄積及び
内皮損傷に先だって、アテローム性動脈硬化の損傷にお
いて起こる最初のことであると示唆している。血管壁に
おける平滑筋複製を説明する主要な仮説は、損傷応答仮
説である。簡単に言うと、この仮説は、血管壁の平滑筋
細胞が、通常、静止状態で存在すると言うことである。
内皮が損傷を受けると、血小板は、動脈内膜への平滑筋
細胞の移動及びその中での複製を刺激する因子を放出す
る［Ross, アルテリオスクレローシス（Arterioscleros
is） 1, 293-311 (1981)］というものである。Ross
は、培養平滑筋細胞の増殖には、血小板由来成長因子
（ＰＤＧＦ）が必要であることも示した［Ross 及び Gl
omset、ニューイングランドジャーナルオブメディス
ン（N. Eng. J. Med.） 295, 369-377, 420-425 (197
6)］。Ross の観察は、それに続くＰＤＧＦの精製、そ
の受容体の同定、更に最近では、２つのＰＤＧＦペプチ
ド鎖のうちの１つの遺伝子としてのオンコジーンｃ−ｓ
ｉｓの同定をもたらした。

【０００３】細胞周期進行のための第２の公知の要件
は、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１）としても知
られるソマトメジンＣの利用である。ＩＧＦ−１それ自
身は、平滑筋細胞により合成することができ，ＩＧＦ−
１に対する抗体は、細胞周期の進行を抑制する。これら
のデータは、ＰＤＧＦが、それ自体の進行因子の産生を
刺激することが可能であることを示唆している。この観
察は、血管壁に固有な因子により平滑筋複製を制御でき
るかも知れないと言う興味ある可能性に対し、かなり重
要な示唆をするものである。ＰＤＧＦとは別に、平滑筋
細胞の分裂を促進する他の物質も研究されている。更
に、血小板も、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）に類似する
蛋白質［Oka 及び Orth、ジャーナル・オブ・クリニカ
ル・インヴェスティゲーション（J. Clin. Invest.） 7
2、249-259 (1983)並びにAssoian 等、(1994)］及びβ
腫瘍成長因子と呼ばれる、懸濁状態の細胞の成長を助け
ることのできる因子［Tucker 等、サイエンス（Scienc
e） 226、705-777 (1984)］を含んでいる。しかしなが
ら、増殖の刺激に対するこれらのそれぞれの相対的な寄
与については、大部分が知られていない。高血圧症にお
ける平滑筋複製を制御する刺激についても、大部分が未
知のままである。悪性高血圧症での微小血管の変化にお
いてＰＤＧＦは重要な役割を演じているかも知れない
が、大きい血管又はより穏やかな形若しくはより慢性的
な形の高血圧により影響を受ける血管には、ＰＤＧＦは
含まれていないようである。種々の病状における平滑筋
の役割については、多くの研究があり、ＰＤＧＦのよう
な成長因子のいくつかの機構及び役割が探求されている
が、平滑筋細胞の増殖を刺激する分裂促進因子（マイト
ージェン）についての新しい情報はその解明に当然必要
である。このような分裂促進因子を同定することによっ
て、平滑筋分裂促進因子に対する抗体又はこのような分
裂促進因子の受容体に結合する競合蛋白質を用いる競合
的結合戦略のような、種々の治療戦略を工夫することが
可能となるのである。平滑筋分裂促進因子は、血管奇形
のような状態の治療に、あるいは創傷／潰瘍治癒におけ
る成長因子として、用いることもできる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】先に本発明者等は、実質
的に各ベータ細胞がオンコジーンＳＶ４０ラージＴを発
現している、遺伝子導入マウス（ＲＩＰ１−Ｔａｇ２）
から当初誘導された膵臓腫瘍細胞の馴化培地から得るこ
とのできる新規な成長因子（以下、“ＢＴＣ−ＧＦ”と
言う）を提供する出願を行なった（特願平３−２７９６
７６号）。ＢＴＣ−ＧＦが元来それから同定され、単離
され、精製された膵臓腫瘍細胞（以下、“ＢＴＣ−３細
胞”と言う）のサンプルは、ブダペスト条約により、ア
メリカン・タイプカルチャー・コレクション（The Amer
ican Type Culture Collection）にＡＴＣＣ寄託番号Ｃ
ＲＬ１０５８５として１９９０年１０月２６日に寄託
されている。ＢＴＣ−ＧＦは、サブラインの膵臓腫瘍細
胞（以下、ＢＴＣ−ＪＣ１０細胞と言う）から精製して
もよく、その細胞のサンプルは、ブダペスト条約によ
り、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１０８７５として１９９１年
９月２４日に寄託されている。本発明のＢＴＣ−ＧＦ
は、平滑筋細胞、３Ｔ３線維芽細胞及び網膜色素上皮細
胞のための分裂促進因子であり、内皮細胞のためのもの
ではない。ＢＴＣ−ＧＦは、煮沸、１０ｍＭジチオスレ
イトル及び１Ｍ酢酸にさらすことによっても失活しな
い。ＢＴＣ−ＧＦの生物活性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにお
いて、約３２，０００の分子量を有する蛋白質の単一バ
ンドとして存在する。ＢＴＣ−３及びＢＴＣーＪＣ１０
の両方から精製されたＢＴＣ−ＧＦのＮ−末端アミノ酸
配列を比較することにより決定した、ＢＴＣ−ＧＦの部
分Ｎ−末端アミノ酸配列（配列番号：１）は、次の通り
である。 Asp-Gly-Asn-Thr-Thr-Arg-Thr-Pro-Glu-Thr-Asn-Gly-Se
r-Leu-Cys-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Asn-Cys-Thr-Gly （図
７および９参照）翻訳されたＧＥＮＢＡＮＫ及びＮＢＲＦ蛋白質データベ
ースによるコンピューター調査では、同様の蛋白質は見
つからなかった。

【０００５】本発明のＢＴＣ−ＧＦは、創傷／潰瘍等の
治療と共に、血管奇形の治療に用いられることができ
る。ＢＴＣ−ＧＦは、抗体や偽ペプチド（false peptid
es）のような競合剤を産生するのに使われてもよい。Ｂ
ＴＣ−ＧＦは、小島（ランゲルハンス氏島）のインシュ
リン産生細胞に由来するために、このような競合剤を、
高血圧症と共に、糖尿病において認められるアテローム
性動脈硬化症及び糖尿病性網膜症のような平滑筋細胞増
殖に起因する病気の治療に用いることもできる。また、
この因子は診断テストにも用いられる。例えば、この成
長因子に対する抗体が、小島での死にかかっている又は
再生しつつあるベータ細胞がこの因子を放出している糖
尿病患者の血液中に、この因子を検出することができ
る。本発明は新規な非グリコシル化組み換え哺乳動物Ｂ
ＴＣ−ＧＦ、哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦをコードする単離さ
れたＤＮＡを提供するが、このＤＮＡはヒトＢＴＣ−Ｇ
Ｆをコードする単離されたＤＮＡを含み、またこのＤＮ
Ａから発現される生成物も包含するものである。本発明
によって、平滑筋細胞の増殖を促進する新規な非グリコ
シル化組み換え哺乳動物の成長因子ＢＴＣ−ＧＦ、およ
びその製造方法を提供するものである。天然のＢＴＣ−
ＧＦは、各ベータ細胞が実質的にオンコジーンＳＶ４０
Ｔを発現している、遺伝子導入マウス（ＲＩＰＩ−Ｔ
ａｇ２）から当初誘導されたＢＴＣ−３膵臓腫瘍細胞
（ＡＴＣＣＮｏ.ＣＲＬ１０５８５）の馴化培地から同
定、単離された。ＢＴＣ−ＧＦは、ＢＴＣ−ＪＣ１０
（ＡＴＣＣＮｏ.ＣＲＬ１０８７５）からも精製されて
いる。作られた天然のＢＴＣ-ＧＦは、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ
において、約32,000の分子量を有しており、煮沸して
も、熱に安定である。ＢＴＣ-ＧＦは、10ｍＭジチオス
レイトルの存在及び濃度１Ｍの酢酸にさらした場合も、
安定である。ＢＴＣ−ＧＦを精製するには、多くの方法
を用いることができるが、好ましい方法の概要を次に述
べ、実施例で更に詳細に説明する。

【０００６】まず、ベータ腫瘍細胞を、ローラびん内
で、５％子牛血清を含むＤＭＥＭにて４日間培養する。
その後、培地を無血清培地と交換し、採取まで４８〜７
２時間培養する。次いで、無血清ベータ腫瘍細胞馴化培
地を濃縮し、バイオレックス（Biorex）７０カラム、フ
ェニルセファロース（Sepharose）カラム、ＦＰＬＣヘ
パリンアフィニティーカラム、ＨＰＬＣ逆相カラムなど
の多数のカラムに通す。ＢＴＣ−３及びＢＴＣーＪＣ１
０細胞からのＢＴＣ−ＧＦを比較することにより得たＢ
ＴＣ−ＧＦのＮ−末端アミノ酸配列は、ＡＢＩ４７０
Ａ蛋白シーケンサー（protein sequencer）で決定した
場合、次の通りである。 Asp-Gly-Asn-Thr-Thr-Arg-Thr-Pro-Glu-Thr-Asn-Gly-Se
r-Leu-Cys-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Asn-Cys-Thr-Gly（配
列番号：１）ＢＴＣ−ＧＦの中間部のアミノ酸配列（図９参照、アミ
ノ酸４４−６６）は次の通りである。 His-Tyr-Cys-Ile-His-Gly-Arg-Cys-Arg-Phe-Val-Val-As
p-Glu-Gln-Thr-Pro-Ser-Cys-Ile-Cys-Glu-Lys-（配列番
号：３の１２−３４に相当）本発明者はマウスＢＴＣ−ＧＦ遺伝子を含有する組み換
えＤＮＡを構成しているマウス細胞からマウスＢＴＣ−
ＧＦ遺伝子をクローニングすることによってマウスＢＴ
Ｃ−ＧＦが製造でき、該ＤＮＡとの形質転換から生じた
形質転換細胞を培養できることを見出した。

【０００７】一般論としてヒトに近接している動物のタ
ンパク質は対応するヒトのタンパク質とアミノ酸配列順
序において極めて高度な相同を示す。事実、異なるアミ
ノ酸の部分はコドンの一点の突然変異によってしばしば
生ずる。それ故上記のマウスＢＴＣ−ＧＦ遺伝子のＤＮ
Ａ配列順序がヒトのＢＴＣ−ＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列順
序と類似する事を予想するのはもっともなことである。
本発明者はＤＮＡプローブとしてマウスＢＴＣ−ＧＦ遺
伝子の一部を使いヒト細胞からヒトＢＴＣ−ＧＦ遺伝子
をクローニングし、該ヒトＢＴＣ−ＧＦ遺伝子を含有す
る組み換えＤＮＡを構成し及び該ＤＮＡとの形質転換か
ら生じた形質転換細胞を培養することによってヒトＢＴ
Ｃ−ＧＦが製造できることを見出した。本発明者はさら
に研究を行い、以下の（１）〜（５）に関する本発明を
完成するに至った。（１）非グリコシル化組み換え哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦ、
（２）哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦをコードする単離ＤＮＡ、
（３）（２）の単離ＤＮＡをもつ組み換えベクター、
（４）（３）のベクターを含有する形質転換細胞、およ
び（５）（４）の形質転換細胞を培地中で培養すること
からなる（１）のＢＴＣ−ＧＦタンパク質の製造方法。組み換え非グリコシル化哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦとして、
実施例ではヒトＢＴＣ−ＧＦおよびマウスＢＴＣ−ＧＦ
から構成されるタンパク質を取り扱っている。組み換え
非グリコシル化ヒトＢＴＣ−ＧＦとして、図１０のアミ
ノ酸の１番から８０番又は１番から１４７番から構成さ
れるアミノ酸配列を有するタンパク質が例示されてい
る。組み換え非グルコシル化マウスＢＴＣ−ＧＦとし
て、図９のアミノ酸１番から１４６番で構成されるアミ
ノ酸配列を有するタンパク質が例示される。

【０００８】また、本発明の別の実施態様では、遺伝子
工学技術によるＢＴＣ−ＧＦの製造方法、ＢＴＣ−ＧＦ
をコードする単離ＤＮＡが提供されている。より詳しく
いうと、例えば以下のようにして製造される哺乳動物Ｂ
ＴＣ−ＧＦのポリペプチドをコードする塩基配列を有す
るＤＮＡを含有する発現ベクターがある。（ａ）哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦをコードするＲＮＡの単
離、（ｂ）該ＲＮＡに基づいた一本鎖相補ＤＮＡ（ｃＤ
ＮＡ）の合成及び対応する二本鎖ＤＮＡの合成、及び必
要な場合は突然変異誘発の実施、（ｃ）プラスミドある
いはファージベクターへの該ｃＤＮＡの挿入、（ｄ）生
じた組み換えプラスミドによる宿主の形質転換、（ｅ）
得られた形質転換細胞の培養、あるいはファージプラー
クの形成及びＤＮＡプローブを用いた例えばコロニーハ
イブリッド形成法又はプラークハイブリッド形成法のよ
うな適当な方法による、形質転換細胞あるいはファージ
からの目的とするＤＮＡを含有するプラスミドまたはフ
ァージＤＮＡの単離、（ｆ）該プラスミド又はファージ
からのクローニングされた目的とするＤＮＡの切除、
（ｇ）該クローニングされたＤＮＡをベクターのプロモ
ーターの下流部位への挿入。

【０００９】哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦをコードするＲＮＡ
は、前記のように多種のＢＴＣ−ＧＦ生成細胞又は膵臓
腫瘍細胞から得られる。哺乳動物のＢＴＣ−ＧＦ生成細
胞からのＲＮＡ調製方法の一つは、グアニジンチオシア
ネート法（J.M.Chirgwinら：バイオケミストリー(Bioch
em.)，１８，５２９４（１９７９））である。かくして
逆転写酵素といっしょに鋳型として得られたＲＮＡを用
いて例えばH.Okayama．らの方法（モレキュラ・アンド
・セルラー・バイオロジー(Mol. Cell.Bio.)，２，１６
１（１９８２））により、ｃＤＮＡが合成できる。得ら
れたｃＤＮＡはプラスミド又はファージベクター中へ挿
入する。上述の技術の他に、部位特異的突然変異誘発を
利用することができる。部位特異的突然変異誘発は周知
であり、「遺伝子工学」(Genetic Engeneering),Lather
R.F., F.Lecoq著、アカデミックプレス・３１〜５０ペ
ージ（１９８３年）に記載されている。オリゴヌクレオ
チドに対する突然変異誘発は、「遺伝子工学」原理と方
法、Smith M., Gillam S.,プラナムプレス、第３巻、１
〜３２ページ（１９８１年）に記載されている。

【００１０】本哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦをコードする構造
遺伝子の生産は、例えば以下のようにして行なうことが
できる。（ａ）突然変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマー
と、一本鎖の構造遺伝子から成る一本鎖ＤＮＡを交雑す
る。（ｂ）変異ヘテロ２本鎖を形成するために、ＤＮＡポリ
メラーゼを用いてプライマーを伸長する。（ｃ）この変異ヘテロ２本鎖を複製する。オリゴヌクレオチドプライマーの大きさは、突然変異が
行われる遺伝子領域へのプライマーの着実な交雑に不可
欠な条件及びオリゴヌクレオチド合成の現在の有効な方
法における制限によって変ってくる。オリゴヌクレオチ
ドにより指示される突然変異誘発の使用を意図したオリ
ゴヌクレオチドのデザインにおいて考慮されるべき要因
は（例えば、ヌクレオチドの全体サイズ、及び突然変異
部位での不適合部のサイズ等）、前記文献中に、スミス
Ｍ．及びギラムＳ、によって記載されている。一般的に
オリゴヌクレオチドの全体長は、突然変異部位での安定
かつ特有な交雑が最大限活かされるように、かつ、突然
変異部位と５’及び３’末端との間がＤＮＡポリメラー
ゼのエキソヌクレアーゼ活性による突然変異の修復を阻
止するに十分拡張されるような長さに調整される。突然
変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチドは通常１２〜
２４個の塩基、好ましくは１４〜２０個、更に好ましく
は１４〜１８個の塩基を含有する。これらは通常少なく
とも約３塩基からなる、変化を受けるコドンの３’末端
を含有している。例えば付加アミノ酸を有する哺乳動物
ＢＴＣ−ＧＦを得る目的のため、変異性哺乳動物ＢＴＣ
−ＧＦ遺伝子は、直接又は制限酵素での消化による断片
化後付加されるべきアミノ酸配列をコードする遺伝子を
合成し、そしてそれをＤＮＡリガーゼを用いて哺乳動物
ＢＴＣ−ＧＦ遺伝子中の適当な部位へ挿入又は付加する
ことによって製造される。

【００１１】適当な制限酵素認識部位が、哺乳動物ＢＴ
Ｃ−ＧＦ遺伝子中に存在しない場合は、前記の部位特異
性突然変異誘発によって制限酵素認識部位がつくられ
る。例えば構成アミノ酸を欠く哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦ遺
伝子を得る目的のため、変異性哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦ遺
伝子が、例えばカルボキシル末端が欠失された形でつく
られる。カルボキシル末端側でのアミノ酸配列の欠失の
場合において、欠失されるアミノ酸の配列をコードする
遺伝子のコドンが部位特異性突然変異誘発によって終止
コドンへ変えられる。該ｃＤＮＡが挿入されるプラスミ
ドには、例えばｐＢＲ３２２（ジーン(Gene)、２、９５
（１９７７））、ｐＢＲ３２５（ジーン、４、１２１
（１９７８））、ｐＵＣ１２（ジーン、１９、２５９
（１９８２））又はｐＵＣ１３（ジーン、１９、２５９
（１９８２））のような大腸菌由来のプラスミド又は、
ｐＵＢ１１０（バイオケミカル・アンド・バイオフィジ
カル・リサーチ・コミュニケーション(Biochem. Biophy
s. Res. Commun. １２、６７８（１９８３））のような
枯草菌由来のものがある。使用する宿主で複製でき維持
できるものであれば、どのようなプラスミドも同様に使
用することができる。該ｃＤＮＡが挿入されるべきファ
ージベクターには、例えばλｇｔ１０又はλｇｔ１１が
ある。プラスミドへの挿入の好ましい一方法は、T.Mani
atisら著の分子クローニング(Molecular Cloning),コー
ルド・スプリング・ハーバー研究室、２３９ページ（１
９８２）において記載された方法である。この手法で得
られたプラスミドは、適当な宿主、例えばエシェリキア
属又はバチルス属に属する菌に導入される。エシェリキ
ア属の菌の例としては、大腸菌Ｋ１２ＤＨ１株（プロシ
ージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンスＵＳＡ、６０、１６０（１９６８））、
Ｍ１０３株（ヌクイレック・アシッズ・リサーチ(Nucle
ic Acids Research)、９、３０９（１９８１））、ＪＡ
２２１株（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー(Journal of Molecular Biology)、１２０、５１７
（１９７８））、ＨＢ１０１株（ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー、４１、４５９（１９６
９））、Ｃ６００株（ジェネティックス(Genetic)、３
９、４４０、１９５４））、及びＭＭ２９４株(プロシ
ージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンスＵＳＡ、７３、４１７４（１９７６））
がある。バルチス属の菌の例としては、枯草菌ＭＩ１１
４株（ジーン、２４、２５５（１９８３））及び２０７
−２１株（ジャーナル・オブ・バイオケミストリ(Journ
al of Biochemistry），９５、８７（１９８４））があ
る。

【００１２】形質転換を達成するための好ましい方法と
して、T.Maniatisら著による分子クローニング（コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）、２４９
（１９８２）に記載の塩化カルシウム又は塩化カルシウ
ム／塩化ルビジウム法が挙げられる。かくして得られた
形質転換細胞の中から、目的とするクローンが例えばＤ
ＮＡ塩基配列決定法（プロシージングス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、７
４、５６０（１９７７）；ヌクレイック・アシッズ・リ
サーチ、９、３０９（１９８１））を併用したコロニー
ハイブリッド形成法（ジーン、１０、６３（１９８
０））によって選択される。この方法でＢＴＣ−ＧＦを
コードするクローニングされたＤＮＡを有するベクター
又はＢＴＣ−ＧＦをコードするクローニングされたＤＮ
Ａを有するファージを運ぶ微生物が得られる。該微生物
からプラスミドが単離される。このようなプラスミドの
単離のために、例えばアルカリ抽出法（H.C.Birnboim
ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、１、１５１３
（１９７９））が使用できる。ＢＴＣ−ＧＦをコードす
るクローニングされたＤＮＡを有する前記プラスミド又
はファージベクターは、そのままで、又は該ＤＮＡの切
除のため、制限酵素処理を行って使用できる。発現ベク
ターはプロモータの下流部位で該ｃＤＮＡの発現に適し
たベクターへクローニングされたｃＤＮＡを挿入するこ
とによって得ることが出来る。該ベクターには、酵母由
来プラスミド（例えばｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λフ
ァージのようなバクテリオファージ、及びレトロウィル
ス、牛痘ウィルスのような動物ウィルスと同様に、前記
の大腸菌由来プラスミド（例えばｐＢＲ３２２，ｐＢＲ
３２５，ｐＵＣ１３）、及び枯草菌由来のプラスミド
（例えばｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５）が含まれる。該ｃＤ
ＮＡはその５’末端に翻訳開始コドンとしてＡＴＧをも
つ。それはまた３’末端に翻訳終止コドンとしてＴＡ
Ａ，ＴＧＡ又はＴＡＧをもつ。該ｃＤＮＡを発現させる
ため、プロモーターを該ｃＤＮＡの上流部位に接続す
る。本発明の実施に用いられるプロモーターは該ｃＤＮ
Ａの発現に利用される宿主に適当か、適合するものであ
ればどんなものでもよい。

【００１３】形質転換される宿主がエシュリキア属に属
する菌である場合は、特にＴ７ファージプロモータ、ｔ
ｒｐプロモータ、ｌａｃプロモータ、ｒｅｃＡプロモー
タ、λｐｌプロモータ及びｌｐｐプロモータが好まし
い。宿主がバチルス属菌である場合は、例えばＳＰ０１
プロモータ、ＳＰ０２プロモータ、及びｐｅｎＰプロモ
ータが好ましい。宿主が酵母である場合は、特に、ＰＨ
０５プロモータ、ＰＧＫプロモータ、ＧＡＰプロモータ
及びＡＤＨプロモータが好ましい。特に、宿主はエシェ
リキア属菌で、プロモータはｔｒｐプロモータ又はλｐ
Ｌプロモータであることが好ましい。宿主が動物細胞で
ある場合は、ＳＶ−４０由来プロモータ及びレトロウィ
ルスプロモータが使用可能である。特にＳＶ４０由来プ
ロモータが好ましい。かくして得たベクターを宿主細胞
へ導入することによって形質転換細胞が増殖できる。宿
主の例として、エシェリキア属菌、バチルス属菌、酵母
及び動物細胞がある。エシェリキア及びバチルス属菌の
代表例は、本明細書中前記したものである。酵母として
は、サッカロマイセス・セレビシエ・ＡＨ２２Ｒ~，Ｎ
Ａ８７−１１Ａ及びＤＫＤ−５Ｄが使用できる。動物細
胞としては、多数のものが用いられるが、そのうち、好
ましい細胞系として、サルＣＯＳ７株（Gluzman, Y,セ
ル２３、１５７（１９８１））及びベロ細胞株、チャイ
ニーズ・ハムスターＣＨＯ細胞株、マウスＬ細胞株、及
びヒトＦＬ細胞株が掲げられる。エシェリキア属菌の形
質転換は、例えばプロシージングス・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、６９、
２１１０（１９７２）；又はジーン、１７、１０７（１
９８２））に記載の方法によって実施できる。バチルス
属菌の形質転換は、例えばモレキュラー・アンド・ゼネ
ラル・ジェネティックス(Molecular and General Genet
ics)、１６８、１１１（１９７９））に記載の方法によ
って実施される。酵母の形質転換は、例えばプロシージ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンスＵＳＡ、７５、１９２９（１９７８）に記載
の方法で実施される。動物細胞の形質転換は、他にもあ
るが例えば、ウィロロジー、５２、４５６（１９７３）
に記載の方法により実施される。この手法により、哺乳
動物ＢＴＣ−ＧＦをコードするＤＮＡを含有するベクタ
ーと形質転換された形質転換細胞が得られる。

【００１４】該形質転換細胞を培地中で培養し哺乳動物
ＢＴＣ−ＧＦを生産させる。宿主としてエシェリキア又
はバチルス属菌を用いて得た形質転換細胞の培養に用い
られる培地は一般的に液状で、例えば炭素、窒素源及び
無機要素等の該形質転換細胞の成長に必要な物質を含ん
でいる。炭素源としては、例えばグルコース、デキスト
リン、可溶性デンプン及び庶糖が用いられる。窒素源と
しては、例えばアンモニウム塩、硝酸塩、コーン浸出
液、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆ケーキ及びポ
テトエキスが用いられる。無機物質としては、特に塩化
カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウ
ムが掲げられる。酵母エキス、ビタミン、成長促進剤等
をさらに加えることができる。培地のｐＨは、約６から
８であることが好ましい。グルコースとカザミノ酸を含
有するＭ９培地（Miller、ジャーナル・オブ・エクスペ
リメンツ・イン・モレキュラ・ジェネティックス(Journ
al of Experiments in Molecular Genetics)、４３１−
４３３、コールドスフリングハーバーラボラトリー、
ニューヨーク、１９７２年）は、エシェリキア属菌の培
養に好ましい培地である。プロモータ機能を効率的に発
揮させるため、ｔｒｐプロモータの場合なら３−β−イ
ンドリルアクリル酸のような促進剤を必要に応じて添加
することができる。宿主がエシェリキア属菌である場合
は、培養は通常、約１５〜４３℃で約３〜２４時間行わ
れる。必要に応じて通気及び／又は撹拌を行う。宿主が
バチルス属菌の場合は培養は通常、約３０〜４０℃で約
６〜２４時間行われる。必要に応じて通気及び／又は撹
拌を行う。宿主が酵母である形質転換細胞の場合は、例
えばブルクホルダーの最小限培地（Bostian, K.L.ら、
プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンスＵＳＡ、７７、４５０５（１９８
０））が使用できる。培地のｐＨは約５〜８に調整され
ることが望ましい。培養は一般に約２０〜３５℃で約２
４〜７２時間行われ必要に応じて通気及び／又は撹拌を
行う。動物細胞の形質転換細胞を培養するために好まし
い培地には、ＭＥＭ培地（サイエンス(Science)、１２
２、５０１（１９５２））、ＤＭＥＭ培地（ウィロロジ
ー、８、３９６（１９５９））、ＲＰＭＩ１６４０培地
（ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシ
ェーション(Journal of Medical Association)、１９
９、５１９（１９６７））、又は１９９培地（プロシー
ディング・オブ・ザ・ソサエティー・フォー・バイオロ
ジカル・メディシン(Proceeding of the society for B
iological Medicine)、７３、１（１９５０））があ
り、さらに約５〜２０％牛胎児血清が添加される。この
培地は約６〜８のｐＨとするのが望ましい。培養は一般
に約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行われ、必要に応
じて通気及び／又は撹拌を行う。

【００１５】組み換えＢＴＣ−ＧＦは上記培養生成物よ
り例えば以下の方法によって純粋な形で単離することが
できる。培養細胞からＢＴＣ−ＧＦを抽出する際には、
培養後の該細胞を集め塩酸グアニジンのようなタンパク
質変性剤を含有する緩衝液中に細胞を懸濁しそれによっ
て目的のタンパク質の細胞外溶解を起こす方法、又はフ
レンチプレス、音波処理、リゾチーム処理及び／又は凍
結融解により細胞を破壊し、続いて遠心分離によってＢ
ＴＣ−ＧＦタンパク質を回収する方法等の適当な方法に
よって処理を行う。フレンチプレスあるいはリゾチーム
処理と音波処理の併用は特に好ましい。上記方法によっ
て得られた上清からのＢＴＣ−ＧＦの精製には公知の単
離精製法を適当に組み合わせたものが用いられる。好ま
しい単離精製法として特に挙げられるのは、塩析法及び
溶媒沈澱法のような溶解度の相違を利用する方法、透析
法、限外ろ過法、ゲルろ過法及びＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法のような主に分子量の差を利用する
方法、イオン交換クロマトグラフィー法のような荷電の
差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー
法のような特別な親和性を利用する方法、逆相液体クロ
マトグラフィーのような疎水性の差を利用した方法、等
電点電気泳動のような等電点の差を利用した方法などが
ある。

【００１６】更に詳しく説明すると、核酸及び酸性タン
パク質は該上清をＤＥＡＥセルロースを用いたイオン交
換クロマトグラフィーを行うことにより前記上清から取
り除くことができる。例えば殆ど中性の緩衝液（例、ト
リス緩衝液）で平衡にされたＤＥＡＥセルロースカラム
へ上清を加え流出物画分を集めることが効率的である。
該流出物画分をＣＭセルロース等を用いたイオン交換ク
ロマトグラフィーに通した場合、塩基性タンパク質であ
るＢＴＣ−ＧＦは担体上に吸収され、続いて塩溶液で流
出される。ＣＭセルロース等の酸性樹脂カラムクロマト
グラフィーは直接細菌抽出物に使用してＢＴＣ−ＧＦを
精製することができる。例えば若干酸性の緩衝液（リン
酸緩衝液等）で平衡にしたＣＭセルロースカラムへ上清
を加えるのも効率的である。同じ緩衝液でカラムを洗浄
した後、ＢＴＣ−ＧＦは追加の塩（ＮａＣｌ等）を含ん
だ緩衝液をカラムに流出することにより回収することが
できる。流出液は透析後凍結乾燥できる。

【００１７】ヘパリン・セファロースを用いたアフィニ
ティークロマトグラフィーは、大腸菌抽出物中のＢＴＣ
−ＧＦの精製に応用できる。例えば殆ど中性の緩衝液
（例、トリス又はリン酸緩衝液）で平衡にしたヘパリン
・セファロースカラムへ上記流出液を加え、カラムを十
分に洗浄しＮａＣｌ等で作った直線勾配による流出を行
うことによりＢＴＣ−ＧＦタンパク質を精製できる。高
速液体クロマトグラフィー用に開発されたヘパリンカラ
ム（例、ショーデックスＡＦ−パックＨＲ−８９４、昭
和電工株式会社、日本）は特に効率的である。この場合
ＢＴＣ−ＧＦは前記のヘパリン−セファロースカラムの
場合と同じ方法、即ちサンプルをほぼ中性の緩衝液とと
もにヘパリンカラムへ加え、カラムを十分に洗浄しＮａ
Ｃｌで作った直線勾配上で流出させることにより均一な
生成物として回収できる。このようにして得た生成物は
透析と凍結乾燥により乾燥粉末形状にすることができ
る。添加された担体（例、血清アルブミン）とともに製
品を保持することによって製品が容器の壁に付着するの
を防止することができるので望ましい。さらに生成物の
酸化を防止するため、精製又は保存の過程において少量
の還元剤を加えるのが好ましい。使用できる還元剤には
β−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、グル
タチオン等がある。この方法により実質的に純粋なＢＴ
Ｃ−ＧＦが得られる。本発明による実質的に純粋なＢＴ
Ｃ−ＧＦとは、ＢＴＣ−ＧＦ含量が約９５％（重量比）
を下回らない製品をいい、より好ましくはＢＴＣ−ＧＦ
含量が約９８％（重量比）を下回らないものをいう。

【００１８】医薬用に使用するため、本発明によるＢＴ
Ｃ−ＧＦは粉末状のものをそのままの形で、あるいは薬
理学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤と混
合した医薬製剤の形（注射製剤、錠剤、カプセル、溶
液、塗布剤）で、非経口又は経口により温血動物（例、
ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネ
コ）に対し安全に投与できる。注射用製剤は、例えば生
理的食塩水又はグルコース及び／又は他のアジュバント
を含有する水溶液を用いる従来の方法によって製造でき
る。錠剤、カプセル及び他の薬剤組成物も同様に従来の
方法によって製剤できる。本組み換え非グリコシル化哺
乳動物ＢＴＣ−ＧＦは、本来のＢＴＣ−ＧＦと同じ生物
的活性を有する。本発明によって精製されたＢＴＣ−Ｇ
Ｆは、血管内注入による血管奇形のような病理状態の治
療、又は競合的阻害剤の投与によるアテローム動脈硬化
の治療に使用できる。精製されたＢＴＣ−ＧＦはまた、
創傷や潰瘍の治療にも使用できる。本発明のＢＴＣ−Ｇ
Ｆが傷や潰瘍の治療におけると同様に血管奇形の治療に
も用いられる場合は、温血動物へ投与されるべきＢＴＣ
−ＧＦの量は少量で、適量は投与ルート及び症状によっ
て異なるが、１日当たり１ｎｇから１ｍｇ／１ｋｇの範
囲、より好ましくは１０ｎｇから１００μｇ／１ｋｇの
範囲である。本発明の精製ＢＴＣ−ＧＦは、高血圧症と
共に、アテローム性動脈硬化症及び糖尿病性網膜症の治
療に使用できる各種競合剤を作るのにも、用いることが
できる。ＢＴＣ−ＧＦと競合し、及び／又はＢＴＣ−Ｇ
Ｆが平滑筋細胞の増殖を刺激するのを妨げる、抗体や偽
ペプチドのような競合剤を作ることができる。ＢＴＣ−
ＧＦは、それ自身に対する抗体を生成するのに用いられ
ることもできる。生成される抗体は、その適用形態に応
じて、ポリクローナルでもモノクローナルでもよい。こ
のような抗体は、当業者によく知られている技術によっ
て調製されることができる。例えば、蛋白質又はその抗
原蛋白質を複合させてキーホールリンペットヘモシア
ニン（ＫＬＨ）とし、兎等の動物の抗体を高めるのに用
いることができる。代表的には、ペプチドーＫＬＨ複合
体を、約２カ月の期間にわたって数回注射して、抗体を
生成する。その後、標準技術により、血清から抗体を集
める。一方、ハイブリドーマ細胞を形成する標準融合技
術を用いて、その蛋白質に対する抗体を作る細胞内に、
モノクローナル抗体を作ることができる［ここに参照の
ために記載されている G. Kohler 等ネイチャー（Natu
re） 256、495 (1975)］。この技術の代表的なものとし
ては、抗体産生細胞を骨髄腫細胞のような不死化（immo
rtal）細胞株と融合させて、ハイブリッド細胞を作るこ
とが挙げられる。一方、ここに参照のために記載されて
いる Huse 等、サイエンス（Science） 246、1275 (198
9) の方法により、細胞からモノクローナル抗体を作る
ことができる。

【００１９】通常グリコシル化されたタンパク質は各分
子のグリコシル化という不均質性ゆえに不均質な性状で
製造される。対照的に非グリコシル化タンパク質は均質
的に製造され、そのため非グリコシル化タンパク質はグ
リコシル化された分子に比べて、精製が容易である。さ
らに非グリコシル化タンパク質の殆どは原核発現系によ
って製造される。このため非グリコシル化タンパク質は
グリコシル化タンパク質に比べて、その生産性が高いの
である。本明細書、特許請求の範囲及び図面において塩
基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−
ＩＵＢ Commision on Biochemical Nomenclature によ
る略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくもの
であり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異
性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ−体を示
すものとする。ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補デオキシリボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシンＩ：イノシンＲＮＡ：リボ核酸ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ：アデノシン三リン酸Ｔｄｒ：チミジンＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウムＧｌｙ：グリシンＡｌａ：アラニンＶａｌ：バリンＬｅｕ：ロイシンＩｌｅ：イソロイシンＳｅｒ：セリンＴｈｒ：スレオニンＣｙｓ：システインＭｅｔ：メチオニンＧｌｕ：グルタミン酸Ａｓｐ：アスパラギン酸Ｌｙｓ：リジンＡｒｇ：アルギニンＨｉｓ：ヒスチジンＰｈｅ：フェニルアラニンＴｙｒ：チロシンＴｒｐ：トリプトファンＰｒｏ：プロリンＡｓｎ：アスパラギンＧｌｎ：グルタミン本発明を以下の参考例および実施例によって更に詳しく
説明するが、これは本発明の理解を深めるためのもので
あって、本発明を限定するものではない。

【００２０】なお実施例及び表１において検討されてい
る成長因子活性は、前述のように静止状態のマウスＢａ
ｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞のＤＮＡへの（メチル−³Ｈ）チ
ミジンの取り込みの測定することによって測定した（Sh
ing Y., Davidson S.,Klagsbrun M.；メソッズ・イン
・エンザイモロジー（Methods in Enzymology)、１４６
Ｂ，４２−４８（１９８７））。ここの開示は、本文献
をここに記載することにより、本明細書に引用する。

【００２１】参考例１１０％子牛血清を含むダルベッコ(Dulbecco)改変イーグ
ル培地（ＤＭＥＭ）で、ＢＴＣ−３膵臓ベータ腫瘍細胞
（ＡＴＣＣ寄託番号Ｎｏ.ＣＲＬ１０５８５）の一次培
養液を調製した。これらの培養液を、１６２ｃｍ²の細
胞フラスコ（Costar Cat #3150）中に入れ、３７℃の調
湿ＣＯ₂インキュベーター内でインキュベートした。こ
れらの細胞を、１２５ｍｌのインキュベーターを含有す
る９００ｃｍ²のグロースエリアのローラびん（Coster
Cat #3901）への播種源として使用した。４日後、各び
ん内の培地を、無血清培地と交換した。培地を採取し、
４８〜７２時間インキュベートした後、新しい培地と交
換した。馴化培地６リットルを、成長因子の精製のため
の出発材料として、毎週採取した。

【００２２】参考例２ＢＴＣ−３細胞からのＢＴＣ−ＧＦの精製方法工程１.濃縮無血清ベータ腫瘍細胞馴化培地１０リットルを、分子量
１０，０００カットオフフィルターを用いたアミコン
（Amicon）中空繊維濃縮器により、４℃で５００ｍｌに
濃縮した。続いて、濃縮された培地を、連続透析によ
り、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７に
平衡させた。工程２.バイオレックス(Biorex) ７０クロマトグラフィ
ー濃縮された培地を、４℃で１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７
により平衡させたバイオレックスカラム（床容積２００
ｍｌ）にかけた。このカラムを４００ｍｌの同一緩衝液
で洗浄し、次いで生物活性を、６０ｍｌ／時間の流速
で、０Ｍの４００ｍｌから０.６Ｍの４００ｍｌまでの
ＮａＣｌ勾配により溶出した（図１）。工程３.フェニルーセファロースクロマトグラフィーバイオレックスカラムからの活性画分を集めて、５分間
煮沸し、遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分）により
透明にした。透明上澄み液を１.５Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄と
し、４℃で１.５Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄に入れ、１０ｍＭ燐
酸カリウム、ｐＨ７により平衡させたフェニールセファ
ロースカラム（床容積２５ｍｌ）にかけた。このカラム
を１００ｍｌの平衡緩衝液で洗浄し、続いて、生物活性
を、３０ｍｌ／時間の流速で、ｐＨ７にて、１０ｍＭ燐
酸緩衝液中で１.５Ｍの１７０ｍｌから０Ｍの１７０ｍ
ｌまでの(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄勾配により溶出した（図２）。工程４.ＦＰＬＣヘパリンアフィニティークロマトグラ
フィーフェニールセファロースカラムからの活性画分を集め
て、透析し、室温で、１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７により
平衡させたＴＳＫ−ＧＥＬヘパリン５ＰＷガラスカラ
ム（７.５ｃｍ×８ｍｍ内径）にかけた。このカラムを
１０ｍｌの同一緩衝液で洗浄し、生物活性を、１ｍｌ／
分／画分の流速で、０から０.３ＭまでのＮａＣｌ勾配
により、その後、０.３から０.６Ｍまでの他のＮａＣｌ
勾配により溶出した（図３）。工程５.ＨＰＬＣＣ４逆相クロマトグラフィーヘパリンカラムからの活性画分を集め、室温で、１０％
アセトニトリルの０.１％ＴＦＡ溶液により平衡させた
ＨＰＬＣ逆相Ｃ４カラムに直接注入した。このカラムを
２０ｍｌの同一溶液で洗浄し、生物活性を、２ｍｌ／分
の流速で、１０％から３５％までのアセトニトリル勾配
により溶出して、１.５ｍｌの画分を集めた（図４）。
ＳＤＳＰＡＧＥにおいて銀染色された単一バンドを得
るために、この工程をもう一度繰り返した（図５）。

【００２３】精製結果の大略を表１に示す。

【００２４】

【表１】

【００２５】数値は、馴化培地１０リットルの処理に基
づくものであった。生物活性は、マウス３Ｔ３細胞にお
けるＤＮＡ合成により測定した。成長因子活性１単位は
［メチル−³Ｈ］チミジンのＤＮＡへの最大取り込み値
の半分（half-maximal incorporation）までを刺激する
のに必要な成長因子の量として定義された。蛋白質質量
は１ｍｇ／ｍｌ溶液について、Ａ₂₈₀＝１.０を用いて算
出された。＊蛋白質質量は標準蛋白質の強度と比較した銀染色の
強度及びアミノ酸分析により算出された。

【００２６】参考例３平滑筋細胞に対するＢＴＣ−ＧＦの細胞分裂促進活性実施例２の精製ＢＴＣ−ＧＦは、牛大動脈平滑筋細胞
（ＳＭＣ）の増殖を刺激した（図６）。１％子牛血清を
含むＤＭＥＭ中で培養されたＳＭＣで、ＢＴＣ−ＧＦの
分裂促進活性をテストした。このテストサンプルを培養
液に加えた後４日目に、細胞をトリプシン処理し、２４
ウエルプレートの各ウエル内の細胞数をコウルター（Co
ulter）カウンターで数えた。上に例示した精製法によ
り調製された蛋白質は、下記の特性を有している。ＢＴ
Ｃ−ＧＦは、Ｎ−末端アミノ酸配列 Asp-Gly-Xaa-Thr-Xaa-Arg-Thr-Pro-Glu-Xaa-Asn-Gly-Se
r-Leu-Xaa-Xaa-Ala-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa（配
列番号：２）を有するポリペプチドである。ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により測定した場合、分子量は３２,０
００である。高温（１００℃、５分）、スルフヒドリル
還元剤（１０ｍＭジチオスレイトル）又は酸性状態（ｐ
Ｈ２.２）にさらすことによっても、その分裂促進活性
は失活しない。

【００２７】参考例４ＢＴＣーＪＣ１０を、１０％子牛血清を加えたダルベッ
コ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に保持した。馴化培
地を生成するために、８リットルの撹拌フラスコ［ベル
コグラス（Belco glass）］内にて、２ｍＭグルタミ
ン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌス
トレプトマイシンを加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２（１:１）
培地、０.５％インシュリン、トランスフェリン及びセ
レン［ＩＴＳ、シグマ（Sigma）］並びに０.１％ポリエ
チレングリコール４００中で、１０⁴個／ｍｌのＢＴＣ
−ＪＣ１０細胞を懸濁液中でふやした。細胞濃度が２×
１０⁵個／ｍｌになった時に、馴化培地を集めた。ＢＴ
Ｃ−３細胞からＢＴＣ−ＧＦを精製したのと同様な方法
により、ＢＴＣ−ＪＣ１０馴化培地からＢＴＣ−ＧＦを
精製した。ＢＴＣ−ＪＣ１０細胞から精製されたＢＴＣ
−ＧＦの部分Ｎ−末端アミノ酸配列は、配列番号：６で
示される。Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（配列番
号：６）図７から分かるように、ＢＴＣ−３細胞及びＢＴＣ−Ｊ
Ｃ１０細胞からのＢＴＣ−ＧＦのＮ−末端アミノ酸配列
は、同じであると思われ、このことは両タイプの細胞か
ら得られた２種の蛋白質が同じであることを示してい
る。

【００２８】実施例１（マウスＢＴＣ−ＧＦｃＤＮＡ
のクローニング）マウスＢＴＣ−ＧＦは、そのアミノ酸配列の中間部にア
ミノ酸配列：−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｈｉ
ｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ
−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−
Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−
（配列番号：３の１２−３４に相当）を有するポリペプ
チドである。参考例３及び４（図７及び８）において決
定されたマウスＢＴＣ−ＧＦの部分的アミノ酸列に基づ
いて、Ｎ末端アミノ酸の７番から１２番（Ｔｈｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ）、１７番から２
３番（Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒ
ｇ−Ｔｈｒ）、及び図８の中間部のアミノ酸１番から６
番（Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌ
ｙ）、図８の１２番から１７番（Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）の、４つのアミノ酸配列
に相応する４つのオリゴヌクレオチドが化学的に合成さ
れた。以下のプライマーにおいて、Ｉ（イノシン）は、
いずれの塩基にも対応可能な塩基としてコドンの三つ目
の位置に使われた。合成されたオリゴヌクレオチドの塩
基配列は以下の通りである。プライマー１：5' ACI CCI GA A/G ACN AA T/C GG 3' プライマー２：5' GCI CCI GGI GA A/G GA A/G C/A GN
AC 3'，プライマー３：5' CC A/G TG T/G AT A/G CA A/GTA A/G
TG 3'及び（アンチセンス）プライマー４：５’ＧＧＮＧＴＴ／ＣＴＧＴ／
ＣＴＣＡ／ＧＴＣＮＡＣ３’（アンチセン
ス）（ＮはＡ，Ｔ，Ｇ又はＣを示す）。ポリ（Ａ）ＲＮＡ
は、ＲＮＡ抽出キット（ファルマシア）及びメッセンジ
ャーＲＮＡ精製キット（ファルマシア）を用いてＢＴＣ
−ＪＣ１０細胞から調製した。ｃＤＮＡはポリ（Ａ）Ｒ
ＮＡとランダムなヘキサヌクレオチド（ｃＤＮＡシンセ
シス・システム・プラス、アマシャム）から、鋳型とし
てこれらのｃＤＮＡ、プライマーとして二つのオリゴヌ
クレオチド（プライマー１と４）を用いて合成された。
最初のＰＣＲ（複製連鎖反応）が行われた（９４℃で１
分間、４５℃で２分間、及び７２℃で２分間を３０
回）。２回目のＰＣＲを最初のＰＣＲ生成物及びプライ
マー２及び３を用いて行った（９４℃で１分間、４８℃
で２分間及び７２℃で２分間を３０回）。

【００２９】生成物（第２ＰＣＲによって増幅されたＤ
ＮＡ）は、１．５％アガロースゲル電気泳動によって分
画され、約０．１Ｋｂの大きさを持つＤＮＡがゲルから
溶出された。このＤＮＡは、^３２Ｐでランダムプライミ
ング法で標識した。前記ＢＴＣ−ＪＣ１０ｃＤＮＡ
は、ＥｃｏＲＩで消化され、脱リン酸化されたλｇｔ１
０ベクター（ストラタージン）と連結し、これらファー
ジベクターをパッケージとしてジガパック II ゴール
ド、ストラタジーンｃＤＮＡライブラリーをつくった。
このｃＤＮＡライブラリー（約５×１０⁶クローン）
は、大腸菌ＮＭ５１４（ＹＫ~ＭＫ~）とともにプレート
にまき、現れたプラーク（プレート当たり３×１０⁵ プ
ラーク）は６枚のフィルター（ハイボンドＮ，アマーシ
ャム）上に移し、０．５Ｎ-ＮａＯＨで分解し、露出し
変質したファージＤＮＡをフィルター上に固定した。標
識したＤＮＡはプローブとしてフィルターとハイブリダ
イズさせた。ハイブリダイズ反応は、５×ＳＳＰＥ（１
８０ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄，１ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４））及び０.１％ＳＤＳを含む５
×デンハーツ(Denhardt's)中に１０μＣｉのプローブを
含む変成サケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌの割合で含
む１０ｍｌの溶液中で、６５℃で１６時間かけて実施し
た。反応後、フィルターを、０．１％ＳＤＳを含有する
０．２×ＳＳＤ溶液で、２回にわたって、各６５℃で３
０分洗浄した。洗浄したフィルターのラジオオートグラ
ムが取られ、プレート上のプラークとラジオオートグラ
ムを重ね合わせることによって陽性プラークを探し出し
た。この方法によって、２×１０⁶ プラークから７個の
陽性ファージクローンが得られた。次に、これらの陽性
クローンからのＤＮＡ及びプライマ２及び３を用いてＰ
ＣＲを実施し、目的とする大きさのＤＮＡ（０．１Ｋ
ｂ）がわずか２個のクローンで増幅された。そのうちの
一つ（λｇｔ１０ＢＴＣ−３）は、ＥｃｏＲＩ部位に
１．２ＫｂのｃＤＮＡをもつことが示された。このｃＤ
ＮＡをプラスミドｐＵＣ１１９（プラスミドｐＴＢ１４
８９）のＥｃｏＲＩ部位へ挿入した。このプラスミドｐ
ＴＢ１４８９を、大腸菌ＤＨＴαＦ’（ベテスダ・リサ
ーチ・ラボラトリー(Bethesda Research Laboratory)、
ＵＳＡ）へ導入し、形質転換細胞たる大腸菌ＤＨ５α
Ｆ’／ｐＴＢ１４８９（ＩＦＯ１５２５６）を得た。
この形質転換細胞は、ＡＴＣＣ受託番号６８９１１とし
て１９９２年２月１０日にアメリカン・タイプ・カルチ
ュア・コレクションとして寄託されており、またこのも
のは受託番号ＩＦＯ１５２５６として、日本の大阪の
発酵研究所に寄託されている。このｃＤＮＡの塩基配
列、即ち１．２ＫｂのＥｃｏＲＩＤＮＡ断片の塩基配
列はジデオキシリボヌクレオチド合成連鎖停止反応（J.
Messingら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、９、
３０９（１９８１））によって決定された。この配列解
析結果に基づいて、マウスＢＴＣ−ＧＦの全アミノ酸配
列が決定できた。このｃＤＮＡの塩基配列及び該塩基配
列から予想されるアミノ酸配列が図９に示されている
（配列番号：４）。図９において、略語”Ｅｎｄ”は終
止コドンを表し、マウスＢＴＣ−ＧＦのＮ末端残基（ア
ミノ酸番号１番、Ａｓｐ）は図７のものから推定された
ものである。該Ｎ末端アミノ酸残基から上流の３０のア
ミノ酸残基は、おそらくシグナルペプチドを構成する。
矢印は、シグナルルペプチドと成熟マウスＢＴＣ−ＧＦ
間の切断部位を示す。

【００３０】実施例２（哺乳動物細胞用のマウスＢＴＣ
−ＧＦｃＤＮＡ発現プラスミドの構築）ＢＴＣ−ＧＦｃＤＮＡを含有する１．２ＫｂＥｃｏＲ
Ｉ断片を実施例１において得たプラスミドｐＴＢ１４８
９から単離した。発現プラスミドｐＴＢ７０１（ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６３、
６９２７（１９８５年））はＥｃｏＲＩで切断され、子
牛腸ホスファターゼで処理される。得られたプラスミド
は、ＢＴＣ−ＧＦｃＲＮＡを含む上記の１．２ＫｂＥ
ｃｏＲＩ断片に連結された。この連結混合物を用いて、
大腸菌ＤＨ１（分子クローニング；実験室指針、コール
ドスプリングハーバーラボラトリー、５０５ページ、１
９８２年）の形質転換を行なった。生成したアンピシリ
ン耐性形質転換体からプラスミドが単離され、このもの
はｐＴＢ１４９１と命名された。

【００３１】実施例３（哺乳動物細胞中でのＢＴＣ−Ｇ
ＦｃＤＮＡの発現）サルＣＯＳ７細胞をプレート上にまき（３×１０⁵ 細胞
／プレート）、１０％牛胎児血清を含むダルベッコ改変
イーグル培地（ＤＭＥＭ，フロー・ラボラトリズ）中で
培養した。１０μｇの発現プラスミドｐＴＢ１４９１
（実施例２）及びｐＴＢ１４９５（逆方向のＢＴＣ−Ｇ
ＦｃＤＮＡであること以外はｐＴＢ１４９１と同じ構
造を有する）を、リン酸カルシウム法（Grahamら、ウィ
ロロジー、５２、４５６（１９７３））を用いてＣＯＳ
７細胞へ各々、導入した。翌日、培地を０．５％牛胎児
血清を含有するＤＭＥＭに交換し、２日間培養した。該
馴化培地を集め、静止中のＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３Ａ３１
−７１４クローン４（インタナショナル・ジャーナル・
オブ・キャンサー(International Journal of Cance
r)、１２、４６３（１９７３））への³ Ｈ−チミジンの
取り込みによってＤＮＡ合成誘起活性を測定した：これ
については、モレキュラ・セル・バイオロジー、第８
号、５８８ページ、１９８８年に記載されたようにして
行なった。結果は以下の表２に示す。実施例４（ヒトＢＴＣ−ＧＦｃＤＮＡのクローニン
グ）ポリ（Ａ）ＲＮＡ抽出キット（ファルマシア）及びメッ
センジャーＲＮＡ精製キット（ファーマシア）を用いて
ヒト乳腺ガン細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣＨＴＢ２２，
ＡＴＣＣの細胞とハイブリドーマのカタログ、第６版、
１９８８年）からポリ（Ａ）ＲＮＡを調製した。ｃＤ
ＮＡを、ポリ（Ａ）ＲＮＡとランダムヘキサヌクレオチ
ドプライマー（ｃＤＮＡシンセシス・システム・プラ
ス、アマシャム）から合成した。これらのｃＤＮＡは
ｃＤＮＡライブラリを作成するため、ＢｓｔＸＩアダプ
ターと形質転換した大腸菌ＤＨ５αＦ’を用いてプラス
ミドｐＭＥ１８Ｓ（メディカル・イムノロジー(Medical
Immunology)、２０、２７（１９９０））のＢｓｔＸＩ
部位に組み込まれた。このｃＤＮＡライブラリは、フ
ィルター当たり約５×１０⁴ クローンの割合で１０枚の
ニトロセルロースフィルター（ミリポア製ＨＡＴＦフィ
ルタ）上にまかれた。これらのフィルターをマスターフ
ィルタとして使って、該マスターフィルタに対応するレ
プリカフィルターを作成した。これらレプリカフィルタ
ー上の大腸菌細胞を０．５ＮＮａＯＨで分解し、露
出、変性したプラスミドＤＮＡをフィルター上に固定し
た（Grunstein M.，Hogness,D.S. プロシーディングス
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
スＵＳＡ、７２、３９６１（１９７５））。実施例１
で得たプラスミドｐＴＢ１４８９を、ＥｃｏＲＩおよび
ＮｈａＩで消化し、マウスＢＴＣ−ＧＦをコードする
０．７３ＫｂのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片
をニックトランスレーション法（Rigby, P.W.J.ら、ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、１１
３、２３７（１９７７））によって ³²Ｐで標識した。こ
のように標識したＤＮＡはプローブとして、レプリカフ
ィルターとハイブリダイズされた。ハイブリダイズ反応
は５×ＳＳＰＥ（１８０ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＮａ
Ｈ₂ ＰＯ₄ ，１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．４））と０．
１％ＳＤＳの添加された５×デンハーツ中に１０μＣｉ
のプローブを含んだ１００μｌ／ｍｌの変性サケ精液Ｄ
ＮＡ溶液１０ｍｌ中で、６０℃で１６時間にわたって行
われた。反応後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含有す
る２×ＳＳＣ（０．１５ＭＮａＣｌ，０．０１５Ｍコ
ハク酸ナトリウム）溶液で２回室温で３０分、そしてさ
らに６０℃で３０分間で２回洗浄した（T. Maniatis
ら、”分子クローニング”、コールドスプリングハーバ
ーラボラトリー、３０９ページ、１９８２年）。洗浄
したフィルタについてラジオオートグラムを行った。レ
プリカフィルターのラジオオートグラムの重なり合いに
よって細菌コロニーを探索した。この方法でプローブと
反応できる大腸菌Ｋ１２ＤＨ１／ｐＴＢ１４９９株が５
×１０⁵ コロニーの中から得られた。プラスミドＤＮＡ
ｐＴＢ１４９９を先に得た株からアルカリ抽出法（Bi
rnboim, H.C.，Doly,J.,ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ、１、１５１３（１９７９））によって抽出し精製
した。プラスミドＤＮＡのｃＤＮＡ部分を制限酵素Ｂ
ｓｔＸＩ（タカラ酒造）を用いて切断し、アガロールゲ
ル電気泳動によって分画した。続いて、この前記ｃＤ
ＮＡ部分の塩基配列をジデオキシリヌクレオチド合成連
鎖停止法（J. Messingら、ヌクレイック・アシッズ・リ
サーチ、９、３０９（１９８１））によって決定した。
このＤＮＡ配列から、ヒトＢＴＣ−ＧＦの全アミノ酸配
列を決定することができた。該ｃＤＮＡの塩基配列及び
該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を図１０に示
す。矢印は、シグナルペプチドと成熟ヒトＢＴＣ−ＧＦ
との間の切断部位を示す。プラスミドｐＴＢ１４９９を
大腸菌ＤＨ５α（ベテスタ・リサーチ・ラボラトリ、Ｕ
ＳＡ）へ導入し、形質転換細胞たる大腸菌ＤＨ５α／ｐ
ＴＢ１４９９を得た。この形質転換細胞はＡＴＣＣ受託
番号６８９１０で１９９２年２月１０日付でアメリカ・
タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、またこ
のものは１９９２年１月１４日、受託番号ＩＦＯ１５
２５７としてＩＦＯに寄託された。

【００３２】実施例５（哺乳動物細胞用ヒトＢＴＣ−Ｇ
ＦｃＤＮＡ発現プラスミドの構築）ヒトＢＴＣ−ＧＦｃＤＮＡを含有する０．７ＫｂのＳ
ｍａＩ−ＤｒａＩ断片をプラスミドｐＴＢ１４９９（実
施例４）から単離した。Ｂｇ１IIリンカーをＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いてこの断片の平滑末端へ連結した。Ｂｇ
１IIで消化した後、ヒトＢＴＣ−ＧＦｃＤＮＡを含む
０．７Ｋｂ断片を、ＩＬ−２ｃＤＮＡ領域（図１１）
をとり除いて、ｐＴＢ３９９（セル・ストラクチュア・
ファンクション(Cell Structure Function)、１２、２
０５ページ（１９８７））から調製した発現プラスミド
ｐＴＢ１３０８のＢｇ１II部位へＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いた連結によって挿入した。生成したプラスミドｐ
ＴＢ１５１５はＳａ１Ｉ及びＨｉｎｄIIIで切断した。
ＭｕＬＶＬＴＲ及びヒトＢＴＣ−ＧＦｃＤＮＡを含
む２．４Ｋｂ断片を単離し、ＳＶ４０初期領域プロモー
タ及びハムスターＤＨＦＲｃＤＮＡを有するｐＴＢ３
４８（セル・ストラクチュア・ファンクション、１２，
２０５（１９８７））のＳａ１Ｉ−ＨｉｎｄIII部位の
間に導入した。生成したプラスミドはｐＴＢ１５０７
（図１２）と命名した。

【００３３】実施例６（大腸菌のヒトＢＴＣ−ＧＦｃ
ＤＮＡ発現プラスミドの構築）成熟ヒトＢＴＣ−ＧＦ（１−１４７アミノ酸残基）をコ
ードする０．６ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、
プラスミドｐＴＢ１５１５（実施例５）から単離した。
ＡＴＧ翻訳開始コドン（ａ：５’ＴＡＴＧＧＡＴＧＧＧ
３’ｂ；５’ＡＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡ３’）を有す
る合成アダプターを上記０．６Ｋｂ断片のＥｃｏＲＩ部
位に連結した後、生成した０．６ＫｂＮｄｅＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片をＴ７プロモータ（ジーン、５６、１２５
（１９８７））を含有するプラスミドｐＥＴ−３ｃ中へ
挿入し、プラスミドｐＴＢ１５０５を構築した。ヒトＢ
ＴＣ−ＧＦの８０のアミノ酸残基（図１０の１（Ａｓ
ｐ）から８０（Ｔｙｒ）まで）をコードするＤＮＡ断片
を得るため、鋳型としてプラスミドｐＴＢ１５０５、プ
ライマとして２個のオリゴヌクレオチド（１：５’ＡＴ
ＡＣＡＴＡＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡ３’，
２：５’ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＡＡＡＡＣＡＡＧＴ
ＣＡＡＣＴＣＴ３’）を用いてＰＣＲを行った。生成
物をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、２．０％アガロ
ースゲル電気泳動で分画し、目的とする０．２５Ｋｂ
ＤＮＡ断片を単離した。この０．２５ＫｂＮｄｅＩ−
ＢａｍＨＩ断片を、ｐＥＴ−３ｃのＴ７プロモータの下
流にＴ４ＤＮＡリガーゼで連結挿入しプラスミドｐＴＢ
１５１６（図１３）を得た。

【００３４】実施例７（哺乳動物細胞中でのヒトＢＴＣ
−ＧＦｃＤＮＡの発現）サルＣＯＳ７細胞をプレート当たり３×１０⁵ 細胞の割
合でプレート上にまき、１０％牛胎児血清を含むダルベ
ッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，フロー・ラボラト
リ）中で培養した。１０μｇの発現プラスミドｐＴＢ１
４９９（実施例４）及びｐＴＢ１５０７（実施例５）を
リン酸カルシウム法（ウィロロジー、５２、４５６（１
９７３））を用いてＣＯＳ７細胞へそれぞれ導入した。
翌日、培地を０．５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭに交換
し、さらに２日間培養を行った。馴化培地を集め、モレ
キュラ・セル・バイオロジー、８、５８８（１９８８）
に記載のごとく、静止状態のＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３Ａ３
１−７１４クローン４（インタナショナル・ジャーナル
・オブ・キャンサー、１２、４６３（１９７３））中へ
の³ Ｈ−チミジンの取り込みによってＤＮＡ合成誘起活
性を測定した。結果を表３に示す。表３形質導入されたサンプル希釈 ³ Ｈ−チミジン取り込みＤＮＡ／（対照）（ｃｐｍ）ｐＴＢ１４９９１／１２５１５，００２１／６２５５，１２０ｐＴＢ１５０７１／６２５１９，８９８１／３１２５１６，３４４対照１／１２５１，００８実施例８（大腸菌中でのヒトＢＴＣ−ＧＦの発現）大腸菌ＭＭ２９４を、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラー
ゼ遺伝子で組み換えられているラムダファージ（スチュ
ディエ、スプラ）で溶原化した。その後、このプラスミ
ドｐＬｙｓＳを大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）へ導入し、
大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを得た。この
菌株にプラスミドｐＴＢ１５１６を導入し、これによ
り、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＴＢ
１５１６を得た。この形質転換細胞を、１００μｇ／ｍ
ｌのアンピシリン及び１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニ
コールを含む２０ｍｌのＬ−ブロス中で３７℃で培養し
た。クレット値が約１８０である場合は、イソプロピル
β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度で
０．４ｍＭになるよう培地に添加し、４時間培養を続け
た。この菌体を遠心分離で集め、２０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４），１０ｍＭＥＤＴＡ，０．５ＭＮ
ａＣｌ，１０％庶糖及び０．２５ｍＭＰＭＳＦを含有
する緩衝液０．５ｍｌ中に懸濁し、続いてこの懸濁液
へ、卵白リゾチームを０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に加え
た。これを１時間氷溶中に置いた後、混合液を３７℃で
５分間培養し、遠心分離（ソルバール、１５００ｒｐｍ
で３０分、４℃）を行って上清を得た。この細菌抽出液
を、実施例７に記載した静止状態のＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３
細胞への³ Ｈ−チミジンの取り込みによってＤＮＡ合成
誘起活性について測定した。結果は表４に示す。表４形質導入されたサンプル希釈 ³ Ｈ−チミジン取り込みＤＮＡ又は対照（ｃｐｍ）大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）１／７８１２５２０．２３２／ｐＬｙｓＳ，ｐＴＢ１５１６１／３９０６２５１３．１６９大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＥＴ：３ｃ１／３１２５８０５５９２この形質転換細胞大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＢ
１５１６は、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−３８３６で１９
９２年４月２１日付で通産省工業技術院微生物工業研究
所に寄託され、またこのものは１９９２年４月１６日付
けで受託番号ＩＦＯ１５２８２としてＩＦＯに寄託さ
れた。

【００３５】実施例９（ｈＢＴＣを生成するＣＨＯ細胞
株の樹立）発現プラスミドｐＴＢ１５０７（実施例５）をリン酸カ
ルシウム法によりＣＨＯｄｈｆｒ~ 細胞（ウルラウブ
ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、７７、４２１６
（１９８０））中へ導入した。２日後、培地を選択培地
（１０％透析牛胎児血清および３５μｇ／ｍｌプロリン
を含んだＤＭＥＭ）に交換し、ＤＨＦＲ＋の細胞を得る
ため培養を続けた。これらのＣＨＯＤＨＦＲ＋細胞を
限界希釈法によってクローン化し、６０クローンが作ら
れた。各クローンの細胞を２４ウェルプレート中で８０
％飽和となるまで増殖させ、培地を０．５％牛胎児血清
及び０．１μｇ／ｍｌのインシュリンを含有するＤＭＥ
Ｍ／Ｈａｍ’ｓＦ１２（１：１）０．５ｍｌに変えた。
２日間培養後、馴化培地を集め、実施例３において記載
したようにｎＢＴＣのＤＮＡ合成誘起活性を測定した。
６０クローン中の３１クローンの馴化培地がマウス３Ｔ
３細胞に対してＤＮＡ合成誘起活性を示した。分裂誘発
活性は、最大刺激の５０％を与えるのに必要な因子の希
釈度を決定することにより活性を算出し、標準のマウス
ＥＧＦの重量として表わすと、０．１から５．０ｎｇ／
ｍｌであった。

【００３６】実施例１０（ｈＢＴＣを生成するＡ９細胞
株の樹立）マウスＡ９細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１．４）に、ｈＢ
ＴＣｃＤＮＡを含有するｐＴＢ１５１５（実施例５）
とヒトＨＰＲＴ遺伝子を含む発現プラスミドｐ４ａＡ８
（Jolly, D.J.ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、８
０、４７７（１９８３））を用いて同時にリン酸カルシ
ウム法によって形質導入した。この細胞は１０％牛胎児
血清を添加したＤＭＥＭ中で２日間増殖させ、続いて選
択のためＨＡＴ培地（Littlefield, J.W.，サイエンス
(Science)、１４５、７０９（１９６４））で培養し
た。ＨＰＲＴ＋細胞はＨＡＴ培地中で増殖し、限界希釈
法によってクローンを単離した。各クローンの細胞（２
４ウェルプレート中のウェル当たり１０⁵細胞）をプレ
ート上にまき、成育培地中で２日間培養し、続いて２日
間０．５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ０．５ｍｌ中で
培養した。１０⁶細胞が培地中へ分泌したｈＢＴＣレベ
ルを実施例３に記載のマウス３Ｔ３細胞に対するＤＮＡ
合成誘起作用によって調べた。数個のクローンの結果を
以下の表５に示す。表５クローン活性（ｎｇ／ｍｌマウスＥＧＦ換算量）Ａ９／１５１５−４４３Ａ９／１５１５−１４５６６Ａ９／１５１５−１７２０８Ａ９／１５１５−３４２５８Ａ９／１５１５−６３９４クローンＡ９／１５１５−１４は１９９３年１月１日
に、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−４１５９として微生物工業
研究所に寄託され、またこのものは受託番号ＩＦＯ５
０３８９として１９９２年１２月２８日付でＩＦＯに寄
託されている。

【００３７】実施例１１ＣＯＳ７細胞より産生されたＢＴＣの精製プラスミドｐＴＢ１５０７を導入したＣＯＳ７細胞の培
養上清１リットルに、1Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．
０），０．５ＭＥＤＴＡ，５％ＣＨＡＰＳ，０．２５
ＭＰＭＳＦを各々１００ｍｌ，２ｍｌ，１０ｍｌ，２
ｍｌずつ加え、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（径
１．６×１０ｃｍ，ファルマシア社）に流速２ｍｌ／ｍ
ｉｎでかけた。カラムを１００ｍｌの緩衝液（０．１Ｍ
リン酸カリウム（ｐＨ６．０），１ｍＭＥＤＴＡ，
０．０５％ＣＨＡＰＳ，０．５ｍＭＰＭＳＦ）で洗浄
後、０Ｍから０．２１Ｍの濃度勾配のＮａＣｌを０分か
ら１０分まで、次いで０．２１ＭのＮａＣｌを１０分か
ら４０分までカラムに流し、４０分以後は、０．７Ｍ
ＮａＣｌを含む緩衝液を流して蛋白を溶出した。次に、
２ｍｌ（１分）毎に集めた各溶出画分について、ＢＡＬ
Ｂ／ｃ３Ｔ３細胞に対するＤＮＡ合成誘起活性を調べ、
分画番号５１−６９をプールした（図１４）。Ｓ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅカラムのプール分画を限外ロ過（ｃｅｎ
ｔｒｉｐｒｅｐ−１０；アミコン）により濃縮し、２０
ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）−１ｍＭＥＤＴＡ−
０．０５％ＣＨＡＰＳを含む緩衝液にて平衡化したゲル
ロ過カラム（径１．６×６０ｃｍ；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ
７５ｐｇ，ファルマシア）に流速１．２ｍｌ／ｍｉｎで
かけた。開始後、１５分より１．２ｍｌ（１分）毎に集
めた各分画について生物活性を調べ、高い活性を示した
分画番号４０−５０をプールして集めた（図１５）。ゲ
ルロ過カラムのプール分画を、ヘパリンＨＰＬＣカラム
（径０．８５×５ｃｍ；ＳｈｏｄｅｘＨＲ−８９４，
昭和電工）にかけ、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）
−１ｍＭＥＤＴＡ−０．０５％ＣＨＡＰＳにてカラム
を洗浄の後、０Ｍから１ＭのＮａＣｌの濃度勾配を流速
１ｍｌ／ｍｉｎで６０分間にわたってかけ、１分毎に溶
出液を分画した。生物活性の認められた分画番号２４か
ら２８の画分をプールした（図１６）。ヘパリンＨＰＬ
Ｃカラムのプール画分にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を
最終濃度０．１％になるように添加し、Ｃ１８逆相ＨＰ
ＬＣカラム（径０．４６×１５ｃｍ；Ａｓａｈｉｐａｋ
ＯＤＰ−５０，Ａｓａｈｉｃｈｅｍｉｃａｌ）に流
速０．５ｍｌ／ｍｉｎでかけた。カラムを０．１％ＴＦ
Ａにて洗浄後、０％から６３％（ｖ／ｖ）までのアセト
ニトリル濃度勾配を流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで７０分間
にわたってかけ、１分毎に溶出液を分画した（図１
７）。生物活性は黒ぬりのピークに一致して認められ
た。逆相ＨＰＬＣの活性画分２０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅおよび銀染色で調べたところ、分子量２６−３０ＫＤ
に相当する位置のバンドのみが検出された（図１８）。
以上の操作により４３μｇのＣＯＳ７産生の精製ＢＴＣ
が得られた。

【００３８】実施例１２Ａ９細胞産生ＢＴＣの精製Ａ９／１５１５−１４細胞の培養上清３．５リットルに
１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０），０．５ＭＥＤ
ＴＡ，５％ＣＨＡＰＳ，０．２５ＭＰＭＳＦを各々１
８０ｍｌ，７ｍｌ，３６ｍｌ，７ｍｌずつ添加し、Ｓ−
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（径２．６×４０ｃｍ，ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ社）にかけた。カラムを３００ｍｌの
緩衝液（０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０），１
ｍＭＥＤＴＡ，０．０５％ＣＨＡＰＳ，０．５ｍＭ
ＰＭＳＦ）で洗浄後、０．７ＭＮａＣｌを含む上記緩衝
液を流速１ｍｌ／ｍｉｎで流し、蛋白を溶出した。５ｍ
ｌ毎に集めた各画分についてＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞の
ＤＮＡ合成誘起活性（生物活性）を調べ、分画番号２３
−３２および４０−４９を各々ＢＴＣ−ＩおよびＢＴＣ
−IIとしてプールした（図１９）。Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅカラムよりの、ＢＴＣ−Ｉプール画分を２５％お
よび８０％流安で分画した後、限外ろ過（Ｃｅｎｔｒｉ
ｐｒｅｐ−１０；アミコン）により濃縮し、２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４），１ｍＭＥＤＴＡ，０．０５
％ＣＨＡＰＳで平衡化したゲルろ過カラム（径１．６×
６０ｃｍ；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇ，ファルマシ
ア）に流速１．２ｍｌ／ｍｉｎでかけ、開始後、１５分
より１．２ｍｌ毎に画分を集めた。高い生物活性を示し
た画分（分画番号３５−４１）をプールした（図２０
Ａ）。Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムより得られたＢ
ＴＣ−IIプール画分を限外ろ過（ＹＭ２，アミコン）で
濃縮し、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４），１ｍＭＥ
ＤＴＡ，０．０５％ＣＨＡＰＳで平衡化したゲルろ過カ
ラム（径１．６×６０ｃｍ；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐ
ｇ，ファルマシア）に流速１．２ｍｌ／ｍｉｎでかけ、
開始後、１５分より１．２ｍｌ毎に分画した。高い生物
活性を示した分画番号６６−７４をプールした（図２０
Ｂ）。ゲルろ過カラムから集めたＢＴＣ−Ｉプール画分
をヘパリンＨＰＬＣカラム（径０．８×５ｃｍ；ＡＦｐ
ａｋＨＲ−８９４，昭和電工）にかけた。カラムを２
０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭＥＤ
ＴＡ−０．０５％ＣＨＡＰＳで洗浄後、０−０．９Ｍ
ＮａＣｌの濃度勾配を流速１ｍｌ／ｍｉｎで３０分間に
かけ、溶出液を１ｍｌ毎に分画した。生物活性の認めら
れた分画番号９から１３の画分をプールした（図２１
Ａ）。ゲルろ過カラムから集めたＢＴＣ−IIプール画分
をヘパリンＨＰＬＣカラム（径０．８×５ｃｍ；ＡＦｐ
ａｋＨＲ−８９４，昭和電工）にかけた。カラムを２
０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭＥＤ
ＴＡ−０．０５％ＣＨＡＰＳで洗浄後、０−０．９Ｍ
ＮａＣｌの濃度勾配を流速１ｍｌ／ｍｉｎで３０分間に
かけ、溶出液を１ｍｌ毎に分画した。生物活性の認めら
れた分画番号１６−１９の画分をプールした（図２１
Ｂ）。ヘパリンカラムから集めたＢＴＣ−Ｉプール画分
にＴＦＡを最終濃度０．１％になるように加え、Ｃ１８
逆相ＨＰＬＣカラム（径０．４６×１５ｃｍ；Ａｓａｈ
ｉｐａｋＯＤＰ−５０，Ａｓａｈｉｃｈｅｍｉｃａ
ｌ）にかけた。０．１％ＴＦＡ存在下にアセトニトリル
濃度勾配（０−６３％）を７０分間かけ、０．５ｍｌ
（１ｍｉｎ）毎に溶出液を集めた（図２２Ａ）。生物活
性は蛋白の溶出ピークと一致して認められた。この部分
の蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥ／銀染色で調べると、分子量
２６−３０Ｋの位置にのみバンドが検出された（図２３
Ａ）。以上の操作により１５０μｇのＢＴＣ−Ｉが得ら
れた。ヘパリンカラムから集めたＢＴＣ−IIプール画分
にＴＦＡを最終濃度０．１％になるように加え、Ｃ１８
逆相ＨＰＬＣカラム（径０．４６×１５ｃｍ；Ａｓａｈ
ｉｐａｋＯＤＰ−５０，Ａｓａｈｉｃｈｅｍｉｃａ
ｌ）にかけた。０．１％ＴＦＡ存在下にアセトニトリル
濃度勾配（０−６３％）を７０分間かけ、０．５ｍｌ
（１ｍｉｎ）毎に溶出液を集めた（図２２Ｂ）。生物活
性は蛋白の溶出ピークと一致して認められた。この部分
の蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥ／銀染色で調べると、分子量
１４Ｋの位置にのみバンドが検出された（図２３Ｂ）。
以上の操作により７５μｇのＢＴＣ−IIが得られた。

【００３９】実施例１３組換え型大腸菌より産生されたＢＴＣの精製Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐｌｙｓＳ，ｐ
ＴＢ１５１６を一晩培養した後、培養菌液を、２０倍希
釈になるようにＬＢ培地に植菌した。３７℃で２時間培
養後、ＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭになるように添加
し、さらに３時間培養した。遠心により菌体を集め使用
時まで−２０℃に保存した。５リットル培養相当の菌体
ストックを解凍し、氷冷した５０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４），１０ｍＭＥＤＴＡ−０．２ＭＮａ
Ｃｌ，１０％ｓｕｃｒｏｓｅ，１ｍＭＡＰＭＳＦを含
むバッファー３００ｍｌに懸濁した。これに卵白リゾチ
ーム４０ｍｇを溶解し、４℃で２時間インキュベートし
た後、超音波処理を行い、２０，０００×ｇで１時間遠
心して上清を取得した。この上清を２００ｍｌのＱ−セ
ファロースベットを通過させた後、ＴＣＡを最終濃度４
％になるように加え、４０℃で１０分間静置した。２
０，０００×ｇで２０分遠心して集めた沈殿を、１００
ｍｌの２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４），１ｍＭＥＤ
ＴＡ−０．１５ＭＮａＣｌ，１ｍＭＡＰＭＳＦを含む
バッファーに懸濁し、乳鉢中でホモゲナイズしながら、
５ＭＮａＯＨを加え、ｐＨ６に調整した。このホモゲ
ネートを１００，０００×ｇで１時間遠心して得られた
上清をＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（径１．６×１０
ｃｍ，ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけた。カラムを０．１
Ｍｐｏｔａｓｓｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ
６．０），１ｍＭＥＤＴＡ，０．５ｍＭＰＭＳＦを含
むバッファーで洗浄した後、０Ｍから１ＭのＮａＣｌ濃
度勾配を４００ｍｌ，２００分にわたってかけ、溶出液
を５ｍｌ毎に集めた。高い生物活性の認められた分画番
号２０から２７をＥ．ｃｏｌｉＢＴＣＩ，分画番号４
０から４５をＥ．ｃｏｌｉＢＴＣ II分画として、それ
ぞれプールした（図２４）。Ｅ．ｃｏｌｉＢＴＣＩの
プール分画にＴＦＡを最終濃度０．１％になるように添
加し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（径１．０×２５ｃ
ｍ；ＡｓａｈｉｐａｋＯＤＰ−５０，Ａｓａｈｉｃｈ
ｅｍｉｃａｌ）にかけた。カラムを０．１％ＴＦＡで洗
浄後、０％から６３％のアセトニトリル濃度勾配を、３
４０ｍｌ，１７０分間にわたってかけ、溶出液を４ｍｌ
毎に集めた。生物活性は矢印のピークに一致して認めら
れた（図２５）。このピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染
色で調べると、１８Ｋ付近に一本のバンドが認められた
（図２６レーンＩ）。ＢＴＣＩが精製された。この方法
により６３０μｇのＥ．ｃｏｌｉＢＴＣＩが得られ
た。Ｅ．ｃｏｌｉＢＴＣ IIのＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅカラムプール分画を０．１％ＴＦＡ存在下にＣ１８逆
相ＨＰＬＣカラム（径４．６×１５ｃｍ；Ａｓａｈｉｐ
ａｋＯＤＰ−５０，Ａｓａｈｉｃｈｅｍｉｃａｌ）
にかけた。カラムを洗浄後、０％から６３％のアセトニ
トリル濃度勾配を、３５ｍｌ，７０分間にわたってか
け、溶出液を０．５ｍｌ毎に集めた。生物活性は矢印の
ピークに一致して認められた（図２７）。このピークを
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色で調べると、１４．３Ｋ
（リゾチーム）より分子量の小さい位置に一本のバンド
が認められ（図２６レーンII）、ＢＴＣIIが精製され
た。この方法により９９０μｇのＥ．ｃｏｌｉＢＴＣII
が得られた。Ｅ．ｃｏｌｉＢＴＣＩおよびIIのＮ末端
アミノ酸配列を２０アミノ酸残基まで決定した。ＢＴＣ
Ｉは翻訳開始メチオニンから始まる予想通りのＮ末端
を有し、ＢＴＣ IIはＮ末端の３１残基を欠失した分子
であることがわかった（図２８）。

【００４０】

【００４１】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：24 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asp Gly Asn Thr Thr Arg Thr Pro Glu Thr Asn Gly Ser Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Pro Gly Glu Asn Cys Thr Gly 20。

【００４２】配列番号：2 配列の長さ：24 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asp Gly Xaa Thr Xaa Arg Thr Pro Glu Xaa Asn Gly Ser Leu Xaa Xaa 1 5 10 15 Ala Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20。

【００４３】配列番号：3 配列の長さ：48 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Thr His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile His 1 5 10 15 Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Asp Glu Gln Thr Pro Ser Cys Ile Cys 20 25 30 Glu Lys Gly Tyr Phe Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr 35 40 45。

【００４４】配列番号：4 配列の長さ：1179 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：マウス株名：BTC-JC10 細胞の種類：β Tumor Cell 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：113..643 配列の特徴特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：206..643 配列 GAATTCGCGG CCGCGTTTTC AAGCACCCTC TCGGTGCCAG GGCCCAGGAA GGGCATAGAG 60 AAGGAACCTG AGGACTCATC CAGGGGCTGC CCTGCCCCTC ACAGCACAGT TG ATG GAC 118 Met Asp -30 CCA ACA GCC CCG GGT AGC AGT GTC AGC TCC CTG CCG CTG CTC CTG GTC 166 Pro Thr Ala Pro Gly Ser Ser Val Ser Ser Leu Pro Leu Leu Leu Val -25 -20 -15 CTT GCC CTG GGT CTT GCA ATT CTC CAC TGT GTG GTA GCA GAT GGG AAC 214 Leu Ala Leu Gly Leu Ala Ile Leu His Cys Val Val Ala Asp Gly Asn -10 -5 +1 ACA ACC AGA ACA CCA GAA ACC AAT GGC TCT CTT TGT GGA GCT CCT GGG 262 Thr Thr Arg Thr Pro Glu Thr Asn Gly Ser Leu Cys Gly Ala Pro Gly 5 10 15 GAA AAC TGC ACA GGT ACC ACC CCT AGA CAG AAA GTG AAA ACC CAC TTC 310 Glu Asn Cys Thr Gly Thr Thr Pro Arg Gln Lys Val Lys Thr His Phe 20 25 30 35 TCT CGG TGC CCC AAG CAG TAC AAG CAT TAC TGC ATC CAT GGG AGA TGC 358 Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile His Gly Arg Cys 40 45 50 CGC TTC GTG GTG GAC GAG CAA ACT CCC TCC TGC ATC TGT GAG AAA GGC 406 Arg Phe Val Val Asp Glu Gln Thr Pro Ser Cys Ile Cys Glu Lys Gly 55 60 65 TAC TTT GGG GCT CGG TGT GAG CGA GTG GAC CTG TTT TAC CTC CAG CAG 454 Tyr Phe Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr Leu Gln Gln 70 75 80 GAC CGG GGG CAG ATC CTG GTG GTC TGC TTG ATA GTG GTC ATG GTG GTG 502 Asp Arg Gly Gln Ile Leu Val Val Cys Leu Ile Val Val Met Val Val 85 90 95 TTC ATC ATT TTA GTC ATC GGC GTC TGC ACC TGC TGT CAT CCT CTT CGG 550 Phe Ile Ile Leu Val Ile Gly Val Cys Thr Cys Cys His Pro Leu Arg 100 105 110 115 AAA CAT CGT AAA AAA AAG AAG GAA GAG AAA ATG GAG ACT TTG GAT AAA 598 Lys His Arg Lys Lys Lys Lys Glu Glu Lys Met Glu Thr Leu Asp Lys 120 125 130 GAT AAA ACT CCC ATA AGT GAA GAT ATT CAA GAG ACC AAT ATT GCT 643 Asp Lys Thr Pro Ile Ser Glu Asp Ile Gln Glu Thr Asn Ile Ala 135 140 145 TAACGGTTAT AAAGTTATCA CAAGCTGGTG GCAAGCTACA AAAGACCTGA CTCATTCCCA 703 GATGGACAGG ACATGTCTCA GGAAAACAGC TAGCAGAAAT GAATGTTTAA ATATTGTATT 763 TACTTTTTTT ATTTGTAACT GTGTGTTGCT TGTTATTGTT TTTAATAACG ATATATTTTT 823 TTTGTTACAG CCTAGTAGTT GAGAAAAAAT AACCTGGTTA GGTGATGACA AAAATAAGGG 883 ACATTTGAAT ATAAACTTTG TTGCCAGGAT TATTAAATAA ATAAAAGAAA AGTGGAAAAG 943 AAGTTAGATT TTTAAGAACT AATTCACCAC CACGCAATGG TAGTACATGC CTTTAATCCC 1003 AGGACTTGGG AGGCAGAGGC AGGCAAATCT CTGTGAGTTC AAGGCCAGCC TGGTCTACAA 1063 AGAAAGTTCC AAAATAGCCA AGACTACAAC AGAGGAACAC TGTCTCAAAA AACCTAACCA 1123 ACCAACCAAC CAAACAAGCA AGCAAAACCC TGTCAATAAT AGGCGGCCGC GAATTC 1179。

【００４５】配列番号：5 配列の長さ：1271 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：ヒト株名：MCF7 細胞の種類：Breast Adenocarcinoma Cell 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：295..828 配列の特徴特徴を表す記号：ｍａｔｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：３８８．．８２８配列 CAGCGTGGAG GCTCCAAGGA CCAAGTCCTG CGCCTCTTTG GCGGGGTGTG TGCAGGAGGA 60 GGGGGGATAA ATAGGAGGCT CCCTCCTCCC GGCGACATTC ACGGAGCCGG CCGGCCTCCC 120 GCCCTGGGTG TTTCCCTGCC TTGTAGCCAG GGTGCCAGCC TGGGAAGTAG TTTCGTTTCC 180 TTCTGCCTCC GGGATTAGTT TCCAGGCACC CTCTCAGGCG CCCGAGGCCC GGGAAGGGGG 240 CGAAGAAGGA GGGAGACTTG TCTAGGGGCT GCCCGGCCCG GCAGAGCGGG GTTG ATG 297 Met GAC CGG GCC GCC CGG TGC AGC GGC GCC AGC TCC CTG CCA CTG CTC CTG 345 Asp Arg Ala Ala Arg Cys Ser Gly Ala Ser Ser Leu Pro Leu Leu Leu -30 -25 -20 -15 GCC CTT GCC CTG GGT CTA GTG ATC CTT CAC TGT GTG GTG GCA GAT GGG 393 Ala Leu Ala Leu Gly Leu Val Ile Leu His Cys Val Val Ala Asp Gly -10 -5 +1 AAT TCC ACC AGA AGT CCT GAA ACT AAT GGC CTC CTC TGT GGA GAC CCT 441 Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro 5 10 15 GAG GAA AAC TGT GCA GCT ACC ACC ACA CAA TCA AAG CGG AAA GGC CAC 489 Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His 20 25 30 TTC TCT AGG TGC CCC AAG CAA TAC AAG CAT TAC TGC ATC AAA GGG AGA 537 Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg 35 40 45 50 TGC CGC TTC GTG GTG GCC GAG CAG ACG CCC TCC TGT GTC TGT GAT GAA 585 Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu 55 60 65 GGC TAC ATT GGA GCA AGG TGT GAG AGA GTT GAC TTG TTT TAC CTA AGA 633 Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr Leu Arg 70 75 80 GGA GAC AGA GGA CAG ATT CTG GTG ATT TGT TTG ATA GCA GTT ATG GTA 681 Gly Asp Arg Gly Gln Ile Leu Val Ile Cys Leu Ile Ala Val Met Val 85 90 95 GTT TTT ATT ATT TTG GTC ATC GGT GTC TGC ACA TGC TGT CAC CCT CTT 729 Val Phe Ile Ile Leu Val Ile Gly Val Cys Thr Cys Cys His Pro Leu 100 105 110 CGG AAA CGT CGT AAA AGA AAG AAG AAA GAA GAA GAA ATG GAA ACT CTG 777 Arg Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Lys Glu Glu Glu Met Glu Thr Leu 115 120 125 130 GGT AAA GAT ATA ACT CCT ATC AAT GAA GAT ATT GAA GAG ACA AAT ATT 825 Gly Lys Asp Ile Thr Pro Ile Asn Glu Asp Ile Glu Glu Thr Asn Ile 135 140 145 GCT TAAAAGGCTA TGAAGTTACC TCCAGGTTGG TGGCAAGCTG CAAAGTGCCT 878 Ala TGCTCATTTG AAAATGGACA GAATGTGTCT CAGGAAAAAC AGCTAGTAGA CATGAATTTT 938 AAATAATGTA TTTACTTTTT ATTTGCAACT TTAGTTTGTG TTATTATTTT TTAATAAGAA 998 CATTAATTAT ATGTATATTG TCTAGTAATT GGGAAAAAAG CAACTGGTTA GGTAGCAACA 1058 ACAGAAGGGA AATTTCAATA ACCTTTCACT TAAGTATTGT CACCAGGATT ACTAGTCAAA 1118 CAAAAAAGAA AAGTAGAAAG GAGGTTAGGT CTTAGGAATT GAATTAATAA TAAAGCTACC 1178 ATTTATCAAG CATTTACCAT GTGCTAATAA GTTTGAAATA TATTATTTCC TTTATTCCTT 1238 TCAGCAATCC ATGAGATAGC TATTATAATC CTC 1271。

【００４６】配列番号：6 配列の長さ：24 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asp Gly Xaa Thr Xaa Arg Thr Pro Glu Thr Asn Gly Ser Leu Xaa Gly 1 5 10 15 Ala Pro Gly Glu Glu Arg Thr Arg 20。

【図面の簡単な説明】

【図１】濃縮無血清ベータ腫瘍細胞馴化培地をバイオ
レックス７０カチオン交換カラムに通した後のＢＴＣ−
ＧＦの３Ｔ３細胞成長因子活性を示す。

【図２】フェニールセファロースカラムに通した場合
の、図１から集められた活性画分の３Ｔ３細胞成長因子
活性を示す。

【図３】ＦＰＬＣヘパリンアフィニティーカラムに通し
た場合の、フェニールセファロースカラムから集められ
た活性画分の３Ｔ３細胞成長因子活性を示す。

【図４】ＨＰＬＣＣ４逆相カラムに通した場合の、ヘ
パリンアフィニティーカラムから集められた活性画分の
３Ｔ３細胞成長因子活性を示す。

【図５】ＨＰＬＣＣ４逆相カラム精製を繰り返すこと
により得られた、プールされた活性画分のゲルにおける
ＢＴＣ−ＧＦの銀染色図である。

【図６】牛平滑筋細胞に対するＢＴＣ−ＧＦの分裂促進
活性を示す。

【図７】ＢＴＣ−３及びＢＴＣ−ＪＣ１０から、それぞ
れ精製されたＢＴＣ−ＧＦのＮ−末端アミノ酸配列を示
す。

【図８】マウスＢＴＣ−ＧＦ（成長因子）の中間部のア
ミノ酸配列の３３番から８０番のアミノ酸を示している
（配列番号３）。

【図９−１】マウスＢＴＣ−ＧＦｃＤＮＡの塩基配列
及びそれから推定されるマウスＢＴＣ−ＧＦのアミノ酸
配列を示す（配列番号４）。

【図９−２】マウスＢＴＣ−ＧＦｃＤＮＡの塩基配列
及びそれから推定されるマウスＢＴＣ−ＧＦのアミノ酸
配列を示す（配列番号４）。

【図１０−１】実施例１で得られたヒトＢＴＣ−ＧＦの
ｃＤＮＡの塩基配列及びそれから推定されるアミノ酸
配列を示す。

【図１０−２】実施例１で得られたヒトＢＴＣ−ＧＦの
ｃＤＮＡの塩基配列及びそれから推定されるアミノ酸
配列を示す。

【図１１】プラスミドｐＴＢ１５１５の構築図である。

【図１２】プラスミドｐＴＢ１５０７の構築図である。

【図１３】プラスミドｐＴＢ１５１６の構築図である。

【図１４】実施例１１で得られたＳ−セファロースカラ
ムクロマトグラフィーの結果を示す。

【図１５】実施例１１で得られたゲルろ過の結果を示
す。

【図１６】実施例１１において得られたヘパリン高速液
体クロマトグラフィーの結果を示す。

【図１７】実施例１１において得られた逆相高速液クロ
マトグラフィーを示す。

【図１８】実施例１１において得られたＳＤＡ−ＰＡＧ
Ｅ銀染色の結果を示す。

【図１９】実施例１２において得られたＳ−セファロー
スカラムクロマトグラフィー及びＤＮＡ合成誘導活性の
結果を示す。

【図２０】実施例１２において得られたゲルろ過の結果
を示す。

【図２１】実施例１２において得られたヘパリン高速液
体クロマトグラフィーカラムクロマトグラフィーの結果
を示す。

【図２２】実施例１２において得られた逆相高速液体ク
ロマトグラフィーの結果を示す。

【図２３】実施例１２において得られたＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ銀染色の結果を示す。

【図２４】実施例１３において得られたＳ−セファロー
スカラムクロマトグラフィーの結果を示す。

【図２５】実施例１３において得られた逆相高速液体ク
ロマトグラフィーカラムクロマトグラフィーの結果を示
す。

【図２６】実施例１３において得られたＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ銀染色の結果を示す。

【図２７】実施例１３において得られた逆相高速液体ク
ロマトグラフィーカラムクロマトグラフィーの結果を示
す。

【図２８】実施例１３において得られた結果によるアミ
ノ酸配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 8214−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 35/12 ＡＤＴ 7431−4Ｃ 37/02 8314−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号０７／８７２７９２ (32)優先日 1992年４月23日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０７／９９４７７６ (32)優先日 1992年12月22日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号００７１２６ (32)優先日 1993年１月21日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (72)発明者モーゼスジューダフォークマンアメリカ合衆国マサチューセッツ州 02146 ブルックリンチャタムサークル 18 (72)発明者ユエンシンアメリカ合衆国マサチューセッツ州 02368 ランドルフティファニードライブ 16 (72)発明者五十嵐貢一京都府京都市左京区下鴨宮崎町66番地の３

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】非グリコシル化組換え型哺乳動物ＢＴＣ
−ＧＦ蛋白質。
【請求項２】蛋白質が、次の部分アミノ酸配列（１）Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ
−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ，（２）Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａ
ｌ−Ｖａｌ，（３）Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙ
ｓ，および（４）Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒ
ｇ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒを有する請求項１記載の蛋白質。
【請求項３】蛋白質がヒトＢＴＣ−ＧＦを含有する請
求項２記載の蛋白質。
【請求項４】蛋白質がマウスＢＴＣ−ＧＦを含有する
請求項２記載の蛋白質。
【請求項５】蛋白質が、配列番号：５（図１０）のア
ミノ酸番号１番から１４７番、又は配列番号：５（図１
０）のアミノ酸番号１番から８０番のアミノ酸を含有す
るアミノ酸配列を有するものである請求項３記載の蛋白
質。
【請求項６】蛋白質が、配列番号：４（図９）のアミ
ノ酸番号１番から１４６番を含有するアミノ酸配列を有
するものである請求項４記載の蛋白質。
【請求項７】哺乳動物のＢＴＣ−ＧＦをコードする単
離されたＤＮＡ。
【請求項８】ＤＮＡがヒトＢＴＣ−ＧＦをコードする
ものである請求項７記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項９】ＤＮＡがマウスＢＴＣ−ＧＦをコードす
るものである請求項７記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項１０】ＤＮＡが、配列番号：５（図１０）の
アミノ酸番号１番から１４７番のアミノ酸を含有するア
ミノ酸配列をコードするものである請求項８記載のＤＮ
Ａ。
【請求項１１】ＤＮＡが、配列番号：５（図１０）の
アミノ酸番号１番から８０番のアミノ酸を含有するアミ
ノ酸配列をコードするものである請求項８記載のＤＮ
Ａ。
【請求項１２】単離されたＤＮＡが、配列番号：５
（図１０）のＤＮＡ番号３８８番から８２８番のＤＮＡ
配列を含有する、請求項１０記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項１３】単離されたＤＮＡが、配列番号：５
（図１０）のＤＮＡ番号３８８番から６２７番のＤＮＡ
配列を含有する、請求項１０記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項１４】ＤＮＡが、配列番号：４（図９）のア
ミノ酸番号１番から１４６番を含有するアミノ酸配列を
有する蛋白質をコードする、請求項９記載の単離された
ＤＮＡ。
【請求項１５】単離されたＤＮＡが、配列番号：４
（図９）のＤＮＡ番号２０６番から７０３番のＤＮＡ配
列を含有する、請求項１４記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項１６】請求項７記載の単離されたＤＮＡを保
持する組換えベクター。
【請求項１７】請求項８記載の単離されたＤＮＡを保
持する組換えベクター。
【請求項１８】請求項９記載の単離されたＤＮＡを保
持する組換えベクター。
【請求項１９】請求項１６記載のベクターを保持する
形質転換体。
【請求項２０】請求項１７記載のベクターを保持する
形質転換体。
【請求項２１】請求項１８記載のベクターを保持する
形質転換体。
【請求項２２】請求項１９記載の形質転換体を培地中
で培養することを包含する請求項１記載の蛋白質の製造
方法。
【請求項２３】請求項２０記載の形質転換体を培地中
で培養することを包含する請求項３記載の蛋白質の製造
方法。
【請求項２４】請求項２１記載の形質転換体を培地中
で培養することを包含する請求項４記載の蛋白質の製造
方法。