JPH0578398A

JPH0578398A - 蛋白質およびその製造方法

Info

Publication number: JPH0578398A
Application number: JP3316079A
Authority: JP
Inventors: Masaaki Terada; 雅昭寺田; Teruhiko Yoshida; 輝彦吉田; Hiromi Sakamoto; 裕美坂本; Kenichiro Naito; 健一郎内藤
Original assignee: KOKURITSU GAN CENTER SOUCHIYOU; Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: KOKURITSU GAN CENTER SOUCHIYOU; Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-11-30
Filing date: 1991-11-29
Publication date: 1993-03-30
Also published as: EP0488196A3; EP0488196A2; CA2056661A1

Abstract

(57)【要約】【目的】動物細胞の増殖促進作用を有するＨＳＴ２蛋白
質および該蛋白質を遺伝子組み換え技術によって製造す
る方法を提供する。【構成】ＨＳＴ２遺伝子を含有するコスミドベクターＬ
ＹＨ−４により形質転換したマウス細胞のＲＮＡ由来の
ｃＤＮＡライブラリーを作製、このものからＨＳＴ２
ｃＤＮＡを含むプラスミドの単離、塩基配列（配列番号
４〜６）を決定した。上記形質転換細胞の培養物より、
強い細胞増殖促進活性画分が得られる。【効果】ＨＳＴ２蛋白質を高純度で大量に安定して得る
ことができ、このＨＳＴ２蛋白質は創傷治癒、虚血後の
心筋および神経組織の修復に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は動物細胞の増殖促進活性
を有するＨＳＴ２蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮ
Ａ、該ＤＮＡを有するベクター、該ベクターで形質転換
した形質転換体、該形質転換体を用いるＨＳＴ２蛋白質
の製造方法に関する。

【０００２】

【従来技術】ヘパリン結合性成長因子（Heparin-bindin
g growth factor）(HBGF)ファミリーに属する細胞成長
因子群は、相互にアミノ酸配列上で相同性を示すととも
に、強いヘパリン結合性を共通の特徴とする。このファ
ミリーに属する細胞成長因子には酸性および塩基性線維
芽細胞成長因子(aFGFおよびbFGF)、ＨＳＴ１、ＩＮＴ
２、ＦＧＦ５、およびケラチノサイト成長因子（kerati
nocyte growth factor）(KGF)がある。この中でＦＧＦ
はさまざまな細胞に対して活性を有しており、特に中胚
葉系の細胞に対し増殖促進および分化促進活性を有して
いることが報告され［Gospodarowiczら、ジャーナル・
オブ・セルラー・フィジオロジー（J. Cell. Physio
l.）、補遺（ supplt.）, 5,15 (1987)］、創傷治癒
や、虚血後の心筋や神経組織の修復を促進するものとし
て応用研究が進められている。ＨＳＴ１遺伝子はフォー
カス形成法によって同定されたトランスフォーミング遺
伝子であり、その産物はＦＧＦと同様に細胞増殖促進活
性、ならびにin vivoにおける血管新生の誘導活性を有
する［Yoshidaら、submitted］。ＨＳＴ２遺伝子はＤＮ
Ａブロットハイブリダイゼーション法でＨＳＴ１遺伝子
に高い相同性を有する遺伝子として見出された［Sakamo
toら、プロシージングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス（Proc.Natl. Acad. Sci.） USA,
83, 3997 (1986)］。また本発明者等は、ＨＳＴ２遺伝
子を導入した線維芽細胞がヌードマウス上で腫瘤を形成
するため、実際に生物学的活性を有しており、ＨＳＴ２
はＨＳＴファミリーに属する新しい増殖因子であると考
えた［Naitoら、ジャパン・ジャーナル・オブ・キャン
サー・リサーチ・アブストラクト（Jpn. J. CancerRes.
Abstr.）， 500 (1989)］。したがってＨＳＴ２遺伝子
産物も創傷治癒や心虚血後の心筋および脳虚血後の神経
組織の修復を促進するものとして応用できるものと考え
られる。しかしながら、ＨＳＴ２遺伝子のアミノ酸配
列、それをコードする塩基配列はもちろんのこと、他の
化学的、生物学的性質も上記のこと以上は全く判ってい
ないというのが現状である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】そこでＨＳＴ２蛋白質
の研究を進めるためには、該蛋白質を大量にしかも高純
度で得ることが必要であった。しかしながら、これら動
物細胞の増殖促進作用を有する上記蛋白質が局在してい
ると考えられる筋肉、精巣［de Lapeyriere ら、オンコ
ジーン（Oncogene）5，823（1990）］あるいは該ペプチ
ドを産生していると思われる白血病細胞株ＨＥＬ［Mart
in と Papayannoponlou、サイエンス（Science）216，1
223（1982）］ＣＭＫ［Satoら、ブリティッシュジャー
ナルオブヘマトロジー（Britishi Journal of Hematol
ogy）,72，184（1989）］からの該蛋白質の単離、精製
といった方法は複雑で、また目的とする蛋白質も少量し
か得られないという問題がある。そこでＨＳＴ２蛋白質
を大量にしかも高純度で得る方法を提供することが課題
であった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは動物細胞の
増殖促進作用を有するＨＳＴ２蛋白質を遺伝子組み換え
技術によって製造することができれば、今後の研究、治
療に多大な効果を奏することができると考え、研究を重
ねた結果、次のような知見を得、本発明に到達したもの
である。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明はＨＳＴ２蛋白質
をコードする塩基配列を含有する組換えＤＮＡ、該組換
えＤＮＡを含有するベクター、該ベクターで形質転換さ
れた形質転換体、該形質転換体を培養し、培養物中にＨ
ＳＴ２蛋白質を生成蓄積せしめ、これを採取することを
特徴とする該蛋白質の製造法を提供するものである。本
発明の組換えＤＮＡとしては、ＨＳＴ２蛋白質をコード
する塩基配列を含有するものであればいかなるものであ
ってもよいが、たとえば図３の１〜２０８番目（配列番
号：１）、１１〜２０８番目（配列番号：２）もしくは
３４〜２０８番目（配列番号：３）のアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列を含有するもの、中でもたとえば図２
の１〜６２７番目（配列番号：４）、３１〜６２７番目
（配列番号：５）、１００〜６２７番目（配列番号：
６）の塩基配列を含有するＤＮＡが好ましい。本発明の
ＤＮＡおよび形質転換体はＨＳＴ２蛋白質をコードする
ＤＮＡ配列を、また本発明の製造法におけるＨＳＴ２蛋
白質としては、図３のアミノ酸配列で示されるＨＳＴ２
蛋白質をその一部として含む。

【０００６】本発明におけるＨＳＴ２のポリペプチドを
コードする塩基配列を含有する発現ベクターは、たとえ
ば（i）図２の塩基配列のＨＳＴ２配列を含有するＲＮ
Ａを分離し、（ii）該ＲＮＡから単離した相補ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）を、次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、（ii
i）該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み込
み、（iv）得られた組み換えファージまたはプラスミド
で宿主を形質転換し、（v）得られた形質転換体を培養
後、形質転換体から適当な方法、たとえばＨＳＴ２遺伝
子を制限酵素処理して得られるＤＮＡ断片をプローブに
用いたプラーク・ハイブリダイゼーション法により目的
とするＤＮＡを含有するプラスミドを単離し、（vi）そ
のプラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡを切り出
し、（vii）該クローン化ＤＮＡをビークル中のプロモ
ーターの下流に連結する、ことにより製造することがで
きる。ＨＳＴ２蛋白質をコードするＲＮＡは、たとえば
ＨＳＴ２産生細胞やＨＳＴ２遺伝子を含む染色体ＤＮＡ
断片自身またはこれを組み込んだコスミドやファージベ
クターなどによって形質転換したマウスなどの細胞から
得ることができ、ＲＮＡを調製する方法としては、グア
ニジンチオシアネート法［Chirgwin, J. M. ら、バイオ
ケミストリー（Biochemistry）,18, 5294 (1979)］など
が挙げられる。このようにして得られたＲＮＡを鋳型と
し、逆転写酵素を用いて、たとえばOkayama, H. らの方
法［モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Mol. Cel
l. Biol.）, 2, 161 (1982) および同誌、3, 280 (198
3)］やGubler, U. とHoffman, B. J. の方法［ジーン
（Gene）, 25, 263 (1983)］にしたがってｃＤＮＡをプ
ラスミドやファージに組み込む。

【０００７】ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、
たとえば大腸菌由来のpBR322［Gene, 2, 95 (197
7)］、pBR325［Gene, 4, 121(1978)］、pUC12［Gene, 1
9,259 (1982)］、pUC13［Gene, 19, 259 (1982)］、枯
草菌由来のpUB110［バイオケミカルー・バイオフィジカ
ル・リサーチ・コミュニケーション（Biochem. Biophy
s. Res.Commun.）, 112, 678 (1983)］などが挙げられ
るが、その他のものであっても、宿主内で複製保持され
るものであれば、いずれをも用いることができる。ま
た、ｃＤＮＡを組み込むファージベクターとしては、た
とえばλgt10［Young, R.and Davis, R.,Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 80, 1194 (1983)］などが挙げられる
が、その他のものであっても、宿主内で増殖できるもの
であればよい。プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法と
しては、たとえばManiatis, T. らモレキュラー・クロ
ーニング（Molecular Cloning）, Cold Spring Harbor
Laboraotry, p.239 (1985）に記載の方法などがあげら
れる。またファージ・ベクターにｃＤＮＡを組み込む方
法としては、たとえばHyunh, T. V. らの方法［ディー
エヌエー・クローニングア・プラクティカル・アプロ
ーチ（DNA cloning, a practical approach）, 1, 49
(1985)］などが挙げられる。このようにして得られたプ
ラスミドやファージ・ベクターは適当な宿主たとえば大
腸菌などに導入する。

【０００８】上記大腸菌の例としてはEscherichia coli
K12 DH1［Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 60, 160(196
8)］、M103［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nuc
l. Acids Res.）, 9, 309 (1981)］、JA221［ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Bio
l.）, 120, 517 (1978)］、HB101［J. Mol. Biol., 41,
459 (1969)］、C600［ジェネティックス（Genetics）,
39, 440 (1954)］などが挙げられる。上記枯草菌として
は、たとえばBacillus subtilis MI 114［Gene, 24, 25
5 (1983)］、207-21［ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー（J.Biochem.）, 95,87 (1984)］などが挙げられ
る。プラスミドで宿主を形質転換する方法としては、た
とえばManiatis, T. ら［Molecular Cloning, Cold Spr
ing Harbor Laboraotry, p.249 (1985)］に記載のカル
シウムクロライド法あるいはカルシウムクロライド／ル
ビジウムクロライド法などが挙げられる。また、ファー
ジベクターはたとえば、増殖させた大腸菌にインビトロ
パッケージング法を用いて導入することができる。この
ようにして得られた形質転換体中から自体公知の方法、
たとえばコロニーハイブリダイゼーション法［Gene, 1
0, 63 (1980)］、プラーク・ハイブリダイゼーション法
［Science, 196, 180 (1977)］およびＤＮＡ塩基配列決
定法［Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 74, 560 (1977)；N
ucl. Acids Res., 9, 309 (1981)］を用い、求めるクロ
ーンを選出する。このようにして、ＨＳＴ２配列を含有
するＤＮＡを有するベクターを保持するクローン化され
た微生物が得られる。

【０００９】後述の実施例２で得られたEscherichia co
li HB101/cH2-5が保持するプラスミドpcH2-5は、ＨＳＴ
２配列を有する。該ＤＮＡの制限酵素切断位置を図１に
示す。図１に示すように該ＤＮＡは全長約２.７Kbpであ
り、制限酵素EcoRI、BamHI、およびXhoIにより断片に切
断される。次に、該微生物からプラスミドやファージ・
ベクターを単離する。該単離法としては、アルカリ法
［Birmboim, H.C. ら、Nucl. Acids Res., 1,1513 (197
9)］などが挙げられる。上記クローン化されたＨＳＴ２
タンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡを有
するプラスミドまたはファージ・ベクターは目的により
そのまま、または所望により制限酵素で消化して使用す
ることができる。クローン化された遺伝子は、発現に適
したビークル（ベクター）中のプロモーターの下流に連
結して発現型ベクターを得ることができる。

【００１０】ベクターとしては、上記大腸菌由来のプラ
スミド（例；pBR322、pBR325、pUC12、pUC13）、枯草菌
由来プラスミド（例；pUB110, pTB5、pC194）、酵母由
来プラスミド（例；pSH19、pSH15）、あるいはλファー
ジなどのバクテリオファージおよびレトロウイルス、ワ
クシニアウイルスなどの動物ウイルスなどが挙げられ
る。該遺伝子はその５’末端に翻訳開始コドンとしての
ＡＴＧを有し、また３’末端には翻訳終止コドンとして
のＴＡＡ、ＴＧＡ、またはＴＡＧを有していてもよい。
さらに該遺伝子を発現させるにはその上流にプロモータ
ーを接続する。本発明で用いられるプロモーターとして
は、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモ
ーターであればいかなるものでもよい。また、形質転換
する際の宿主が大腸菌である場合は、trpプロモータ
ー、lacプロモーター、recプロモーター、λPＬプロモ
ーター、lppプロモーターなどが、宿主が枯草菌である
場合は、SP 01プロモーター、SP 02プロモーター、penP
プロモーターなど、宿主が酵母である場合は、PHO 5プ
ロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADH
プロモーターなどが好ましい。とりわけ宿主が大腸菌で
プロモーターがtrpプロモーターまたはλPＬプロモータ
ーであることが好ましい。宿主が動物細胞である場合に
は、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプ
ロモーターなどが挙げられ、とりわけＳＶ４０由来のプ
ロモーターが好ましい。このようにして作製されたＤＮ
Ａを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造す
る。

【００１１】宿主としては、大腸菌、枯草菌、放線菌な
どの原核生物や酵母、カビ、動物細胞などの真核生物が
挙げられる。上記大腸菌、枯草菌の具体例としては、前
記したものと同様のものが挙げられる。上記酵母の具体
例としては、たとえばSaccharomyces cerevisiae AH2
2、AH22R~、NA87-11A、DKD-5Dなどが挙げられる。上記
動物細胞の具体例としては、たとえばサル細胞COS-7、V
ero、チャイニーズハムスター細胞CHO、マウス細胞、NI
H 3T3細胞などが挙げられる。宿主が大腸菌、枯草菌、
放線菌、酵母、カビである形質転換体を培養する際、培
養に使用される培地としては液体培地が適当であり、そ
の中には該形質転換体の成育に必要な炭素源、窒素源、
無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、た
とえばグルコース、デキストリン、可溶性殿分、ショ糖
など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝
酸塩類、コーンスティープ・リカー、ペプトン、カゼイ
ン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機ま
たは有機物質、無機物としては塩化カルシウム、リン酸
二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられ
る。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。宿主が大腸菌の
場合、用いる培地は、たとえばグルコース、カザミノ酸
を含むＭ９培地［Millar,ジャーナル・オブ・エクスペ
リメンタル・モレキュラー・ジェネティクス（J. Exp.
Mol. Genet.），p431. Cold Spring Harbor Laborator
y, New York, 1972］が好ましい。培養は通常約１４〜
４３℃で約３〜２４時間行い、必要により通気や撹拌を
加えることもできる。宿主が枯草菌の場合、培養は通常
約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要により通気
や撹はんを加えることもできる。宿主が酵母である形質
転換体を培養する際、培地としては、たとえばBurkhold
er最小培地［Bostian, K. L., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 77,4505(1980)］が挙げられる。培地のｐＨは約
５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３
５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹は
んを加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養す
る際、培地としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血
清を含むＭＥＭ培地［サイエンス（Science）, 122, 50
1 (1952)］、ＤＭＥＭ培地［ヴィロロジー（Virolog
y）, 8, 396 (1959)］、ＲＰＭＩ１６４０培地［ジャー
ナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエーショ
ン（J. Am. Med. Assoc.）, 199, 519 (1967)］、１９
９培地［プロシージングス・オブ・ソサィエティ・オブ
・エクソ・バイオロジカル・メディシン（Proc.Soc. Ex
o. Biol.Med.）, 73, 1(1950)］などが挙げられる。ｐ
Ｈは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜
４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹
拌を加える。

【００１２】本発明のＨＳＴ２タンパク質は細胞内また
は細胞外に生成、蓄積する。細胞内ＨＳＴ２タンパク質
を培養物から抽出するに際しては、培養後公知の方法で
細胞を集め、塩酸グアニジンや尿素などの蛋白変性剤を
含む緩衝液やトライトンＸ−１００などの界面活性剤を
含む緩衝液中に細胞を懸濁させたのち、遠心分離により
ＨＳＴ２タンパク質を含む上澄液を得る方法、あるいは
超音波処理、リゾチームなどの酵素処理や凍結融解法に
よって細胞を破壊したのち、遠心分離によりＨＳＴ２タ
ンパク質を含む上澄液を得る方法などを適宜用い得る。
これらの上澄液や細胞外に生成、蓄積したＨＳＴ２タン
パク質を分離、精製するには自体公知の分離、精製法を
適切に組み合わせて実施すればよい。これらの公知の分
離、精製法としては、塩析や溶媒沈殿法などの溶解度の
差を利用する法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法及び
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主と
して分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグ
ラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティ
ークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方
法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差
を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を
利用する方法などが挙げられる。

【００１３】本発明のＨＳＴ２蛋白質は、血管内皮細胞
などの細胞の増殖促進活性や血管新生促進作用を有する
ので、火傷、創傷、術後組織などの治癒や虚血後の心筋
および神経組織の修復などの医薬として用いることがで
きる。本発明のＨＳＴ２蛋白質は毒性は低い。また、本
発明のＨＳＴ２蛋白質は、細胞培養を促進させるための
試薬として用いることができる。本発明のＨＳＴ２蛋白
質を医薬として用いるには、そのまま粉末として、また
は他の薬理学的に許容されうる担体、賦形剤、希釈剤と
ともに医薬組成物（例、注射剤、錠剤、カプセル剤、液
剤、軟膏）として、温血哺乳動物（例、ヒト、マウス、
ラット、ハムスター、ウサギ、犬、ネコ）に対して非経
口的または経口的に安全に投与することができる。注射
剤の製剤化はたとえば生理食塩水またはブドウ糖やその
他の補助薬を含む水溶液を用い、常法に従って行なわれ
る。錠剤、カプセル剤等の医薬組成物も常法に従って調
製しうる。さらに、医薬組成物としての注射剤、液剤、
錠剤、カプセル剤等を製造する際には、無菌条件下で行
なう。本発明のＨＳＴ２蛋白質を上記した医薬として用
いる場合には、たとえば上記した温血動物に、投与ルー
ト、症状などを考慮して、１日量約１ｎｇないし100μ
ｇ／ｋｇの中から適当量を選んで投与される。また、本
発明のＨＳＴ２蛋白質を細胞培養を促進させるための試
薬として用いる場合、培地１リットルあたり約0.01〜10
μｇ、さらに好ましくは約0.1〜10μｇとなるように培
地に加えることが好ましい。

【００１４】本発明明細書および図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Commision on Biochemical Nomenclature による略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ−体を示すも
のとする。ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシンＲＮＡ：リボ核酸ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ：アデノシン三リン酸ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウムＧｌｙまたはＧ：グリシンＡｌａまたはＡ：アラニンＶａｌまたはＶ：バリンＬｅｕまたはＬ：ロイシンＩｌｅまたはＩ：イソロイシンＳｅｒまたはＳ：セリンＴｈｒまたはＴ：スレオニンＣｙｓまたはＣ：システインＭｅｔまたはＭ：メチオニンＧｌｕまたはＥ：グルタミン酸ＡｓｐまたはＤ：アスパラギン酸ＬｙｓまたはＫ：リジンＡｒｇまたはＲ：アルギニンＨｉｓまたはＨ：ヒスチジンＰｈｅまたはＦ：フェニールアラニンＴｙｒまたはＹ：チロシンＴｒｐまたはＷ：トリプトファンＰｒｏまたはＰ：プロリンＡｓｎまたはＮ：アスパラギンＧｌｎまたはＱ：グルタミン

【００１５】

【実施例】以下の実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１で得られた形質転換マウス細胞株２１ＳＰＬＹ
Ｈ４Ｄ２１２は平成２年１２月１０日から財団法人発酵
研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ５０３０５として
寄託されており、またこのものは平成２年１２月１１日
から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所にＦ
ＥＲＭＢＰ−３１９３として寄託されている。実施例
２で得られた形質転換体 Escherichia coli ＨＢ１０１
／ｃＨ２−５は平成２年１２月１０日から財団法人発酵
研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ１５１１９として
寄託されており、またこのものは平成２年１２月１１日
から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所にＦ
ＥＲＭＢＰ−３１９４として寄託されている。実施例
１ＨＳＴ２遺伝子を含有するコスミドベクターＬＹＨ
−４により形質転換したマウス細胞の作製及び形質転換
細胞のＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーの作製ＬＹＨ−４［Sakamotoら、バイオケミカル・バイオフィ
ジカル・リサーチ・コミュニケーション（Biochem. Bio
phys. Res. Commun.） 151, 965 (1988)］（本文献にし
たがって、ＬＹＨ−４およびＬＹＨ−８と命名されるＨ
ＳＴ２遺伝子を含有する２つのクローンが、ＬＹＨ−３
と共に得られる。）をマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞導入後、
Ｚｈａｎらの方法［オンコジーン（Oncogene) １，３
６９（１９８７）］に従って、無血清培地を用いて形質
転換細胞を選別した。これらの形質転換細胞を更に限界
希釈法によってクローニングし、ＬＹＨ−４によって形
質転換したマウス細胞株２１ＳＦＬＹＨ４Ｄ２１２（Ｉ
ＦＯ５０３０５，ＦＥＲＭＢＰ−３１９３）を作製
した。この細胞よりＲＮＡをグアニジンイソチオシアネ
ート法［Chirgwin, J. M.ら、Biochemistry, 18, 5294
(1979)］を用いて抽出した。このＲＮＡよりポリアデニ
ル化ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラ
フィーにより精製した［AvivとLeder, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 69, 1408 (1972)］。このpoly(A+)RNAを
鋳型としてｃＤＮＡをGubler, U. とHoffman, B. J.の
方法［Gene, 25, 263 (1983)］で精製し、次にHuynh,
T.V. らの方法［DNA CloningI, a practical approach,
1, 49(1985)］にしたがって上記ｃＤＮＡにEcoRIリン
カーを付加したのち、λgt１０のEcoRI部位にクローニ
ングし、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。

【００１６】実施例２ＨＳＴ２ｃＤＮＡを含むプラ
スミドの単離とその塩基配列の決定大腸菌ＮＭ５１４に実施例１で得たλgt１０のｃＤＮＡ
ライブラリーを感染させたのち、Ｌブロスの軟寒天プレ
ートにまいた。プラークが出現を確認後に、プラーク・
ハイブリダイゼーション法［Science, 196, 180 (197
7)］により陽性クローンλcH2-5を選択した。このとき
プローブとしてはＬＹＨ−４由来の０.３５kbpのPvuH/B
amHI DNA断片を用いた。ＨＳＴ２に含まれるｃＤＮＡの
全長は約２.７kbpであり、その簡単な制限酵素地図を図
１に示した。λcH2-5からEcoRIでｃＤＮＡを切り出し、
M13mp18ファージのEcoRI部位に再クローニングし、M13m
p18 cH2-5を作製した。大腸菌ＪＭ１０９をM13mp18 cH2
-5で形質転換させ、得られた組換え体E.coli／M13mp18c
H2-5よりM13mp18 cH2-5をアルカリ法［Birnboim, H. C.
and Doly, J., Nucl. AcidsRes., 11, 1513 (1979)］
によって抽出精製した。このM13mp18 cH2-5のｃＤＮＡ
部分の塩基配列をSanger, F. らの方法［Proc. Natl. A
cad.Sci. USA, 74, 5463 (1977)］により決定した。決
定した配列の翻訳領域の塩基配列を図２に、さらにこの
塩基配列から推測されるアミノ酸配列を図３に示した。
λcH2-5からEcoRIでｃＤＮＡを切り出し、プラスミド
（ｐＧＥＭ１）のEcoRI部位に再クローニングし、プラ
スミドｐｃＨ２−５を作製した。大腸菌HB101をプラス
ミドpcH2-5で形質転換させ、形質転換体 Escherichia c
oli ＨＢ１０１／ｃＨ２−５（ＩＦＯ１５１１９，Ｆ
ＥＲＭＢＰ−３１９４）を作製した。得られた組替え
体Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１／ｃＨ２−５よりｐｃＨ２
−５を上述のアルカリ法によって抽出精製した。このｐ
ｃＨ２−５のｃＤＮＡ部分の塩基配列を上述のSanger，
F.らの方法により決定した。決定した配列の翻訳領域の
塩基配列は図２に示したものであり、更にこの塩基配列
から推測されるアミノ酸配列は図３に示したものであ
る。

【００１７】実施例３ＨＳＴ２タンパク質の精製とそ
の細胞増殖促進活性低血清下（１％）で48時間培養した、実施例１で得られ
たＨＳＴ２遺伝子によって形質転換されたマウス細胞２
１ＳＦＬＹＨ４Ｄ２１２をφ10cmの培養皿15枚から集
め、等量の10mM Tris-HCl（pH7.5）、１M NaCl 0.2％ T
riton Ｘ-100に懸濁した。氷冷下で１分間超音波処理を
行い、遠心上清（15,000rpm、10分間）を得、細胞抽出
液とした細胞抽出液を４倍量の10mM Tris-HCl（pH7.5）
で希釈し、ヘパリンセファロース（ファルマシア）カラ
ム（0.5ml）にかけた。カラムを10mM Tris-HCl(pH7.5),
0.2M NaCl でよく洗浄した後、10mM Tris-HCl (pH7.5)
中、NaCl 濃度を0.5から1.5Mに段階的に上昇させ、カラ
ム吸着画分を溶出した。溶出画分の細胞増殖促進活性
は、以下の方法に従ってマウスBALB/c 3T3 細胞のDNA
合成誘起を［３Ｈ］チミジンの取り込みを指標に測定し
た。［３Ｈ］チミジンの取り込みは、５％仔牛血清を含
むＤＭＥＭ培地にBALB/c 3T3 細胞を２×10⁴個／mlに懸
濁し、懸濁液１mlを24穴培養皿に加え、37℃で24時間培
養後、血清濃度を0.5％に低下させ、更に72時間培養し
た。ヘパリンセファロースカラムの溶出画分を添加、16
時間後に１μＣｉの［３Ｈ］チミジンを加え、４時間後
に放射活性の酸不溶性画分中への取り込みを液体シンチ
レーションカウンターで測定した。0.9−1.5M NaCl溶出
画分中に強い細胞増殖促進活性が認められ、活性のピー
クは1.3M NaCl付近であった。

【００１８】

【発明の効果】本発明のＨＳＴ２蛋白質は創傷治癒や虚
血後の心筋および神経組織の修復などに応用できる。該
蛋白質をコードするＤＮＡは、細胞増殖因子をコードす
るオリゴヌクレオチドとしてＨＳＴ２タンパク質を純度
高く、また大量に生産することができる。

【００１９】

【００２０】

【配列表】配列番号：1 配列の長さ:208 配列の型:アミノ酸トポロジー:直鎖状配列の種類:ペプチド配列 Met Ala Leu Gly Gln Lys Leu Phe Ile Thr Met Ser Arg Gly Ala Gly 1 5 10 15 Arg Leu Gln Gly Thr Leu Trp Ala Leu Val Phe Leu Gly Ile Leu Val 20 25 30 Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Thr Arg Ala Asn Asn Thr Leu 35 40 45 Leu Asp Ser Arg Gly Trp Gly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly 50 55 60 Leu Ala Gly Glu Ile Ala Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr Leu Val 65 70 75 80 Gly Ile Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile Gly Phe 85 90 95 His Leu Gln Val Leu Pro Asp Gly Arg Ile Ser Gly Thr His Glu Glu 100 105 110 Asn Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Ile Ser Thr Val Glu Arg Gly Val Val 115 120 125 Ser Leu Phe Gly Val Arg Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Asn Ser Lys 130 135 140 Gly Arg Leu Tyr Ala Thr Pro Ser Phe Gln Glu Glu Cys Lys Phe Arg 145 150 155 160 Glu Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr 165 170 175 Gln Gly Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys Arg Gly 180 185 190 Ser Lys Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg Ile 195 200 205。

【００２１】配列番号：2 配列の長さ:198 配列の型:アミノ酸トポロジー:直鎖状配列の種類:ペプチド配列 Met Ser Arg Gly Ala Gly Arg Leu Gln Gly Thr Leu Trp Ala Leu Val 1 5 10 15 Phe Leu Gly Ile Leu Val Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Thr 20 25 30 Arg Ala Asn Asn Thr Leu Leu Asp Ser Arg Gly Trp Gly Thr Leu Leu 35 40 45 Ser Arg Ser Arg Ala Gly Leu Ala Gly Glu Ile Ala Gly Val Asn Trp 50 55 60 Glu Ser Gly Tyr Leu Val Gly Ile Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys 65 70 75 80 Asn Val Gly Ile Gly Phe His Leu Gln Val Leu Pro Asp Gly Arg Ile 85 90 95 Ser Gly Thr His Glu Glu Asn Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Ile Ser Thr 100 105 110 Val Glu Arg Gly Val Val Ser Leu Phe Gly Val Arg Ser Ala Leu Phe 115 120 125 Val Ala Met Asn Ser Lys Gly Arg Leu Tyr Ala Thr Pro Ser Phe Gln 130 135 140 Glu Glu Cys Lys Phe Arg Glu Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala 145 150 155 160 Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr Gln Gly Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr 165 170 175 Gly Arg Val Lys Arg Gly Ser Lys Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr 180 185 190 His Phe Leu Pro Arg Ile 195。

【００２２】配列番号：3 配列の長さ:175 配列の型:アミノ酸トポロジー:直鎖状配列の種類:ペプチド配列 Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Thr Arg Ala Asn Asn Thr Leu Leu 1 5 10 15 Asp Ser Arg Gly Trp Gly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg Ala Gly Leu 20 25 30 Ala Gly Glu Ile Ala Gly Val Asn Trp Glu Ser Gly Tyr Leu Val Gly 35 40 45 Ile Lys Arg Gln Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile Gly Phe His 50 55 60 Leu Gln Val Leu Pro Asp Gly Arg Ile Ser Gly Thr His Glu Glu Asn 65 70 75 80 Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Ile Ser Thr Val Glu Arg Gly Val Val Ser 85 90 95 Leu Phe Gly Val Arg Ser Ala Leu Phe Val Ala Met Asn Ser Lys Gly 100 105 110 Arg Leu Tyr Ala Thr Pro Ser Phe Gln Glu Glu Cys Lys Phe Arg Glu 115 120 125 Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr Gln 130 135 140 Gly Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys Arg Gly Ser 145 150 155 160 Lys Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg Ile 165 170 175。

【００２３】配列番号：4 配列の長さ:627 配列の型:核酸鎖の数：二本鎖トポロジー:直鎖状配列の種類:cDNA 起源生物名:ヒト配列 ATGGCCCTGG GACAGAAACT GTTCATCACT ATGTCCCGGG GAGCAGGACG TCTGCAGGGC 60 ACGCTGTGGG CTCTCGTCTT CCTAGGCATC CTAGTGGGCA TGGTGGTGCC CTCGCCTGCA 120 GGCACCCGTG CCAACAACAC GCTGCTGGAC TCGAGGGGCT GGGGCACCCT GCTGTCCAGG 180 TCTCGCGCGG GGCTAGCTGG AGAGATTGCC GGGGTGAACT GGGAAAGTGG CTATTTGGTG 240 GGGATCAAGC GGCAGCGGAG GCTCTACTGC AACGTGGGCA TCGGCTTTCA CCTCCAGGTG 300 CTCCCCGACG GCCGGATCAG CGGGACCCAC GAGGAGAACC CCTACAGCCT GCTGGAAATT 360 TCCACTGTGG AGCGAGGCGT GGTGAGTCTC TTTGGAGTGA GAAGTGCCCT CTTCGTTGCC 420 ATGAACAGTA AAGGAAGATT GTACGCAACG CCCAGCTTCC AAGAAGAATG CAAGTTCAGA 480 GAAACCCTCC TGCCCAACAA TTACAATGCC TACGAGTCAG ACTTGTACCA AGGGACCTAC 540 ATTGCCCTGA GCAAATACGG ACGGGTAAAG CGGGGCAGCA AGGTGTCCCC GATCATGACT 600 GTCACTCATT TCCTTCCCAG GATCTAA 627。

【００２４】配列番号：5 配列の長さ:597 配列の型:核酸鎖の数：二本鎖トポロジー:直鎖状配列の種類:cDNA 起源生物名:ヒト配列 ATGTCCCGGG GAGCAGGACG TCTGCAGGGC ACGCTGTGGG CTCTCGTCTT CCTAGGCATC 60 CTAGTGGGCA TGGTGGTGCC CTCGCCTGCA GGCACCCGTG CCAACAACAC GCTGCTGGAC 120 TCGAGGGGCT GGGGCACCCT GCTGTCCAGG TCTCGCGCGG GGCTAGCTGG AGAGATTGCC 180 GGGGTGAACT GGGAAAGTGG CTATTTGGTG GGGATCAAGC GGCAGCGGAG GCTCTACTGC 240 AACGTGGGCA TCGGCTTTCA CCTCCAGGTG CTCCCCGACG GCCGGATCAG CGGGACCCAC 300 GAGGAGAACC CCTACAGCCT GCTGGAAATT TCCACTGTGG AGCGAGGCGT GGTGAGTCTC 360 TTTGGAGTGA GAAGTGCCCT CTTCGTTGCC ATGAACAGTA AAGGAAGATT GTACGCAACG 420 CCCAGCTTCC AAGAAGAATG CAAGTTCAGA GAAACCCTCC TGCCCAACAA TTACAATGCC 480 TACGAGTCAG ACTTGTACCA AGGGACCTAC ATTGCCCTGA GCAAATACGG ACGGGTAAAG 540 CGGGGCAGCA AGGTGTCCCC GATCATGACT GTCACTCATT TCCTTCCCAG GATCTAA 597。

【００２５】配列番号：6 配列の長さ:528 配列の型:核酸鎖の数：二本鎖トポロジー:直鎖状配列の種類:cDNA 起源生物名:ヒト配列 ATGGTGGTGC CCTCGCCTGC AGGCACCCGT GCCAACAACA CGCTGCTGGA CTCGAGGGGC 60 TGGGGCACCC TGCTGTCCAG GTCTCGCGCG GGGCTAGCTG GAGAGATTGC CGGGGTGAAC 120 TGGGAAAGTG GCTATTTGGT GGGGATCAAG CGGCAGCGGA GGCTCTACTG CAACGTGGGC 180 ATCGGCTTTC ACCTCCAGGT GCTCCCCGAC GGCCGGATCA GCGGGACCCA CGAGGAGAAC 240 CCCTACAGCC TGCTGGAAAT TTCCACTGTG GAGCGAGGCG TGGTGAGTCT CTTTGGAGTG 300 AGAAGTGCCC TCTTCGTTGC CATGAACAGT AAAGGAAGAT TGTACGCAAC GCCCAGCTTC 360 CAAGAAGAAT GCAAGTTCAG AGAAACCCTC CTGCCCAACA ATTACAATGC CTACGAGTCA 420 GACTTGTACC AAGGGACCTA CATTGCCCTG AGCAAATACG GACGGGTAAA GCGGGGCAGC 480 AAGGTGTCCC CGATCATGAC TGTCACTCAT TTCCTTCCCA GGATCTAA 528。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２で得られたcH2-5中にクローニングさ
れたｃＤＮＡの簡単な制限酵素地図である。略号Ｅ、
Ｂ、およびＸはそれぞれEcoRI、BamHI、およびXhoIを示
す。

【図２】実施例２で得られたpcH2-5中にクローニングさ
れたｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列を示す。

【図３】図２の塩基配列から推測されるアミノ酸配列を
示す。

【符号の説明】

図２および図３中の、、およびは３種のポリペプ
チドのそれぞれの翻訳開始点を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＳ 8314−4Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者内藤健一郎大阪府箕面市半町３丁目５番Ａ503号

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】図３における１〜２０８番目（配列番号：
１）、１１〜２０８番目（配列番号：２）もしくは３４
〜２０８番目（配列番号：３）のアミノ酸配列を含有す
るＨＳＴ２蛋白質。
【請求項２】ＨＳＴ２蛋白質をコードする塩基配列を含
有する組換えＤＮＡ。
【請求項３】ＨＳＴ２蛋白質が請求項１記載のものであ
る、請求項２記載の組換えＤＮＡ。
【請求項４】図２の１〜６２７番目（配列番号：４）、
３１〜６２７番目（配列番号：５）もしくは１００〜６
２７番目（配列番号：６）の塩基配列を含有する請求項
２記載の組換えＤＮＡ。
【請求項５】請求項２，３もしくは４記載の組換えＤＮ
Ａを含有するベクター。
【請求項６】請求項５記載のベクターで形質転換された
形質転換体。
【請求項７】請求項６記載の形質転換体を培養し、培養
物中にＨＳＴ２蛋白質を生成蓄積せしめ、これを採取す
ることを特徴とする該蛋白質の製造法。
【請求項８】請求項７記載の方法により製造されたＨＳ
Ｔ２蛋白質。