JPH0276583A

JPH0276583A - Ｄｎａおよびその用途

Info

Publication number: JPH0276583A
Application number: JP63228839A
Authority: JP
Inventors: Yoji Mitsui; 三井　洋司; Mario Ishida; 直理雄石田; Kaname Saida; 齊田　要; Masahiko Fujino; 藤野　政彦
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology; Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1988-09-14
Filing date: 1988-09-14
Publication date: 1990-03-15
Anticipated expiration: 2013-10-08
Also published as: JP2807471B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明はマウス血管収縮ペプチ１へたるマウス・エンド
セリン（αとβ）をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ
、マウス・エンドセリン（αとβ）の前駆体蛋白質（前
駆体ポリペプチドともいう）および成熟蛋白質（成熟ポ
リペプチドともいう）、および該前駆体蛋白質と成熟蛋
白す′！〔エンドセリン（αとβ）〕の製造方法に関す
る。　　本明細書において、前駆体蛋白質とは、成熟ペ
プチド（エンドセリン（αとβ）のアミノ酸Ｍ己列を持
ち、かつそのＮ末端側もしくはｃ−４端側、またはその
両方にエンドセリン（αとβ）ＤＮＡによってニー−；
３− ドされるアミノ酸配列の一部又は全部を持つような蛋白
質をさす。〔従来の技術〕内皮依存性の血管拡張反応とならんで、種々の刺激に対
する内皮依存性の血管収縮反応が報告されている。血管
の伸張〜）内圧の亢進といった機械的負荷による収縮、
１〜ロンビンによる収縮、血中酸素の減少による収縮、
さらにはニューロペプチドＹ〔プロシーディングズ・オ
フ・ザ・ナシ玉ナル・アカデミ−・オフ・サイエンス・
オフ・ザ・ニー−ニス・ニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、、Ｕ、Ｓ。Ａ、）、及、　５４８５　（］　＋９８２　；同、　８
］、４５７７（１９８４））によるノルアドレナリン収
縮の増強などがその例である。アメリカン・ジャーナル・オフ・フイジオロジ−（Ａｍ
ｅｒ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、１３２，２６３（
＋９８７）には内皮細胞由来の冠血管収縮因子（分子量
はそれぞれ８，５０（１，３，０００）が記載されてい
るか構造は不明である。また、ジャーナル・オフ・ファーマコロジー・アンド・
エクスペリメンタル・セラビューティクス（、Ｉ。Ｐｈａｒｍａｃｙ、　Ｅｘｐ、　Ｔｈｅｒ、）　２３６
．３３９　（１９８５）にも＝４− 内皮細胞由来のペプチド様物質が記載されているが、こ
れも構造は不明である。一方、血管収縮作用を有するペブチ１くとしてバソプレ
ッシン（Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｊ　ｎ　）が知られていて
、そのアミノ酸配列も明確にされているが、バソプレッ
シンが０１１１乳類または鳥類の＋ｆｉｔ管内皮細胞を
オリジンとして得られたという報告はない。また、血管
収縮作用を有するアンジオテンシン（Ａｎｇｊｏｔ；ｅ
ｎｓｊｎ）がウシ大動脈の内皮細胞から得られるという
報告〔サーキュレーション・リサーチ（Ｃｊｒｃｕｌａ
ｔｊｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ）、６０，４２２（１９８７
））があるか、アンジオテンシンは分子量約１，０００
のペプチドである。また本発明者等の一部は同様のＪＩＩｉ管収縮作用を有
するペプチドとして、先にブタ大動脈内皮細胞よりブタ
・エンドセリンを単離することに成功しく特願昭６２−
２５５３８１号）、また本発明者等の一部はヒト・エン
ドセリンの単離、相補ＤＮＡのクローニングにも成功し
ている（特願昭［ｉ２−：３１３］５５号及び同６３−
１４８１５８号）。更に、本出願人は、ラット・エンドセリンの甲離、相補
ＤＮＡのクローニングについても出願を行っている（特
願昭６３−１７４９３５号、および昭和６３年７月２９
ト１出願）。なお、エンドセリンは分子厭２５００±３００で、アミ
ノ酸２１個からなるベブチ１〜であり、そのアミノ酸中
の４個のＣｙｓが２組のＳ−Ｓ結合を形成している構造
を有するものである。〔発明が解決しようとする課題〕」二記のように、各種動物より相同型のエンドセリンが
見出されているか同一動物種からの新規な相同型遺伝子
は見出されていない。そこで更に新規な相同型エン１く
セリンを検索し、それらエンドセリンの構造、及び活性
等の研究を深め、それらの有用性について検討すること
、及び該新規ペプチドを遺伝子組み換え技術によりクロ
ーニングし、大量生産の道を拓くことが現在の課題であ
る。〔課題を解決するための手段〕本発明者らは上記血管収縮作用を有するエンドセリンの
新規相同型遺伝子を、マウスから採取し、しかもそれを
遺伝子組み換え技術によって製造することかできれば、
今後の研究、治療に多大な効果を奏することができると
考え、研究を重ねた結果、次のような知見を得、本発明
に到達したものである。即ち、本発明者らは先に出願したヒト・エンドセリンの
ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡをコードするＤＮＡをプローブとして使
用して、マウス肝由来の１”）　Ｎ　Ａライブラリーか
ら、はじめてマウスのエンドセリンをコードするＤＮＡ
をクローニングすることに成功した。その結果、従来ヒト・ブタで同定された型（α型）と、
これとは違ったアミノ酸配列を持つ新規相同型遺伝子（
β型）の２種が存在する事が明らかとなった（式■及び
ＴＶ）。その結果、これらを遺伝子組み換え技術によっ
て大量に生産する道を拓くことに成功したものである。本発明は（１）マウス・エンドセリンをコードするＩ）
　Ｎ　Ａを含有するＤＮＡ　（２不１り（２）マウス・
エンドセリンのポリペプチド（αとβ）（３）マウス・
エンドセリンをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを保
持する形質転換体、および（４）上記（３）の形質転換
体の培養、培養物中への蛋白質の生産蓄積、採取を包含
する成熟マウス・エンドセリンの製造方法に関するもの
である。本発明の、ブタ由来の成熟エン１（セリン（エンドセリ
ンα）に相当する、２１個のペプチドたるマウス成熟エ
ンドセリンαは〔式ＩＩビ〕で表わされるものであり、〔式ＩＩ
Ｉ’）また同じくマウス成熟エン１〜セリンβは〔式ＩＶ’）
で表わされるものである。〔式ＩＶ’）Ｌａｕ　Ａｓｐ　］ｌｉｅｌｉｅ　Ｔｙｑ　　　　　　
ｎ、ｖ、＝ｚｂｔｑ上記式中のアミノ酸の番号はマウス
成熟エンドセリンのアミノ酸配列に関して第１番のＣｙ
ｓから番号をつけたものであり、マウス前駆体エン１〜
セリンの番号とは異なる。上記式中、アンダーラインを施したアミノ酸がヒト、ブ
タのエンドセリンと異なるものである。上記式中の４個のＣｙｓが形成するＳ−８結合が架かる
位置についてはマウス成熟エンドセリンのＣｙｓの番号
で表わして、１−］５．３−１１の組合せ、３−１５．
１−１１の組合せがあるが、１．−１５゜３−月の組合
せが生ずる割合が大きく、また血管収縮活性もこのもの
が犬である。またＤＮＡ配列については、本発明のマウス・エンドセ
リンをコードするＤＮＡは式（１）もしくは式（ｎ）の
塩基配列を含有する２種のものであるかあるいはその一
部であり、このものはブタ・ヒト・ラットの各エンドセ
リンのものとは大１１１に異なっている。〔式１〕エン１−セリンα 〔式ｎ）エン］くセリンβ 成熟マウス・エンドセリンαおよびβに関する部分（式
■および■のＮｏ、５−２５に当る）についてもブタ・
ヒ１〜・ラットエンＩくセリンのＩ）　Ｎ　Ａとは異な
っており、本発明のＤＮＡは新規なものである。〔式ＩＩＩ）エン１くセリンα 〔式■〕エンドセリンβ 本発明のマウス・エンドセリン成熟ペプチド（エンドセ
リン）をコードするＤＮＡとしては、マウス・エンドセ
リン（αもしくはβ）の成熟ペプチド（エンドセリン）
のアミノ酸配列（弐■もしくは■の５〜２５）をコード
する塩基配列を含有するものであればいかなるものであ
ってもよいが、たとえば式（１）もしくは（１■）の塩
基配列を含有するＤＮＡあるいはその一部のｌ１ｌＮ八
であることが好ましい。式（１）および（ＩＩ　）の塩基配列は本発明で得られ
たマウス・エンドセリンＤＮＡ配列であり、式（■′）
もしくは（■′）のマウス・成熟エンドセリンアミノ酸
をコードする塩基配列の一例としては式（１）もしくは
（１１）のＮｏ、］３−７５で表わされるものが挙げら
れる。本発明方法におけるマウス・エンドセリンの成熟マウス
・エンドセリン（αとβ）をコードする塩基配列を有す
るＤＮＡを含有する発現型ベクターは、例えば、（ｉ）
マウス・エンドセリン産生細胞からメツセンジャーＲＮ
Ａ（ｍＲＮＡ）を分離し、（ｉｉ）該ｍ　ＲＮ　Ａから
単鎖の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、次いで二重鎖ＤＮＡ
を合成し、（ｉｉｉ　）該相補ＤＮＡをファージまたは
プラスミドに組み込み、（ｉｖ　）得られた組み換えフ
ァージまたはプラスミドで宿主を形質転換し、（Ｖ）得
られた形質転換体を培養後、形質転換体から適当な方法
、例えばマウス・エン１くセリン（αとβ）の一部をコ
ー１−するしＮハブローブとのハイブリダイゼーション
により、あるいは抗マウス・エンドセリン（αとβ）抗
体を用いたイ１１ノアッセイ法により目的とするＤＮＡ
を含有するファージあるいはプラスミドを単離し、（ｖ
ｉ）その組み換えＩ）ＮＡから目的とするクローン化Ｄ
ＮＡを切り出し、（ｖｉｉ）該クローン化ＤＮＡまたは
その一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結
する、ことにより製造することができる。マウス・エンドセリンをコードするｍ　ＲＮ　Ａは、種
々のエンドセリン産生細胞、例えばマウス大動脈内皮細
胞などから得ることができる。マウス・エンドセリン産生細胞からＲＮＡを調製する方
法としては、グアニジンチオシアネー１〜法〔（ジェー
・エム・チルブライン（、Ｊ、Ｍ、、Ｃｈｊｒｇすｊｎ
）ら、バイオケミストリー（Ｂｊｏ−ｃｈｃｍｊｓｔｒ
ｙ）、１８．５２９４（１９７９））などが挙げられる
。このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵
素を用いて、例えば岡山（１１，Ｏｋａｙａｍａ）らの
方法〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
（阿ｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ＣｃＬＩｕｌｃｌＩ旧
ｏｌｏｇｙ）　２゜１６１　（１９８２）および同誌３
．２８０（］９８３））　ニ従イＣＦ）ＮＡを合成し、
得られたｃＴ、ＴＩＮＡをプラスミドに組み込む。ｃＤＮＡを絹み込むプラスミドとしては、たとえば太腸
菌山来のｐ　Ｈ１２３２２［ジーン（Ｈｅｎｃ）　、；
、９５（１！１７７））、、１口＜：１２５［ジーン、
４．−１２１（１９７８））、ｐＵｃ＋２（ジーン、　
１．９．　、２５９（ＨＪ８２））　、ρＵＣ］３１：
ジーン２．！月１２５９（１９８２）］、枯枯草由由の
ＰＵＲＩＩＯ（バイオケミカル・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーヨン（Ｂｉｏｃｈｅｍｊｃａｌ　
ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｊｃａ］　ＲｅｓｅａｒｃｈＣ
ｏｍｍｕｎ　１ｃａｔ　１ｏｎ）、　］　］　２．６７
８　（］　９８３）　）などが挙げられるが、その他の
ものであっても、宿主内で複製増殖されるものであれば
、いずれをも用いることができる。またｃＤＮＡを組み
込むファージベクターとしては、たとえばλＢｔｌｌ　
Ｉ：ヤング及びデーヴイス（Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，、ａｎ
ｄ　Ｉ）ａｖｉｓ、　Ｒ，＋）プロシーデイングズ・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・
オブ・ザ・ニー・ニス・ニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、Ｓｃｊ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、）、８０．１１９
４（１９８３）］などが挙げられるが、その他のもので
あっても宿主内で増殖できるものであれば用いることが
できる。プラスミドに組み込む方法としては、たとえば、ティー
・マニアティス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）　ｌ’）　、
モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ＩｎｎｊｎＩＨ）コールド・スプリング・ハーバ−・ラ
ボつｈ　’Ｊ　　（ＣｏｌｄＳｐｒｊｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａ−ｂｏｒａｌ、ｏｒｙ）＋第ｚ；四頁（１９８
２）に記載の方法などが挙げられる。またファージベク
ターにｃＤＮＡを組み込む方法としては、たとえばヒュ
ーン（Ｉｌｙｕｎｈ、Ｔ、Ｖ、）らの方法〔デイ−・エ
ヌ・ニークローニングアプラクティカルアプローチ（Ｄ
ＮＡ　Ｃ１ｏｎｊ、ｎｇ、　Ａ　Ｐｒａｃｔｊｃａｌ　
Ａｐｐｒｏａｃｈ）　３　、４９（１９８５））などが
挙げられる。このようにして得られたプラスミドは、適当な宿主たと
えばエシェリキア（ｌＥｓｃｈｅｒｊｃｈｊａ）属菌。バチルス（Ｂａｃｊ　］　］　ＩＪｓ　）属菌などにｉ
Ｑ人する。上記エシェリキア属菌の例としては、エシェリキア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｊｃｈｊａ　ｃｏ］ｊ）　Ｋ　１２１
）　Ｉ−Ｔ　Ｉ　［：プロシージング・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　
ＮａｔＪ　、　ＡＣ；ｌｄ、　Ｓｃｉ　、　Ｕ、Ｓ。Ａ、）倶扉１５０　（］　９６８））　、　Ｍ　］　０
３　［ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃｊｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、９，３０９
（１９８１）Ｌ　Ｊ　Ａ２２１（ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ、　ｏ土Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｊ、ｏｌｏｇｙ））＋、↓−？□
０．５１７（１９７８））、　ＨＢｌｏｌ［ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー幻ユ４５９（］、
９６９））、　Ｃ６００（ジエネティックス（Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ）、３９，４４０（１９５４））などが挙げら
れる。」二記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチ
リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　Ｍ　
１１１４（ジーン。２４．２５５（１９８３）、］、］２０７−２］ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ、　
ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９５．８７（１９８
４））などが挙げられる。プラスミドで宿主を形質転換する方法としては、たとえ
はティー・マニアティス（７，１（ａｎｉａｔｉｓ）ら
。モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
］ｏｎｉｎｇ）、コール１へ・スプリング・バーバー・
ラボラ１ヘリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、第２４９頁（１９８２
）に記載のカルシウムクロライド法あるいはカルシウム
クロライド／ルビジウムクロライド法などが挙げられる
。またファージ・ベクターを用いる場合には、たとえば増
殖させた大腸菌にインビトロパッケージング法を用いて
導入することができる。マウス・エンドセリン（αとβ）ｃｌ）ＮＡを含有する
マウス・ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーは」二記の方法な
どで得ることが出来るが、市販品として購入することも
可能であり、例えばマウスのｃ　１．）　Ｎ　Ａライブ
ラリーはクローンテックラホラトリース（Ｃ１ｏｎｔｅ
ｃｈ　Ｉ、ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、米国
）から人手することができる。マウス・ＤＮＡライブラリーか１１マウス・エンドセリ
ンＤＮＡをクローニングする方法としては、例えばファ
ージベクターλｃｈａｒｏｎ／ｌ　Ａとヒ１−・エンド
セリンのアミノ酸配列に基づいて化学合成したオリゴヌ
クレオチドをプローブとして用いたプラークハイブリダ
イゼーション７去〔ティー・マニアティス（７ｊ＋１Ｂ
１ｉａｔｊｓ）ら、モレキュラー・クローニング（Ｍｏ
１．ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｊｎｇ）コールド・スプリ
ング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏ　ｌｄ　５ｐｒｊ
　ｎＨＩｌａｒｂｏｒ　Ｌａ−ｂｏｒａｔｏｒｙ）、（
１９８２）３などが挙げられる。このようにしてクローン化されたマウス・エンドセリン
ＤＮＡは必要があればプラスミド、例えばｐＢＲ３２２
，ｐＬＩｃ１２．　ｐＬｌｃ１３．　ｐＬｌｃｌＢ、　
ｐＬＩｃ１９．　ｐＬｌｃ１１８゜ｐＵｃ］］！１など
にサブクローニングしてマウス・エンドセリンＤＮＡを
得ることができる。このようにして得られたＤＮＡの塩基配列を、たとえば
マキサム・ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）
法（Ｍａｘａｍ、　Ａ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｇｊｌｂｅｒ
ｔ、　ｗ、、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・す・ニー・
ニス・ニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、）、７４　、５６０　（１９７７
））あるいはジデオキシ法［Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、ら
、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃｊｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）９，３０９（１９８
］、）］によって決定し、既知のアミノ酸配列との比較
からマウス・エンドセリン（αとβ）ＤＮＡの存在を確
認する。以上のようにして、マウス・エンドセリンをコードする
ＤＮＡ　（マウス・エンドセリンＤＮＡ）（式■もしく
は■）が得られる。後述の実施例１で得られたマウス・エンドセリン（αと
β）をコードするＤＮＡを含むＤＮＡの制限酵素断片地
図を第１図に示す。またジデオキシ法で決定したＤＮＡ
の塩基配列と、その塩基配列から判明したアミノ酸配列
を第２図に示す。上記のようにしてクローン化されたマウス・エンドセリ
ンをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所
望により制限酵素で消化して使用することが出来る。クローン化されたＤＮＡから発現させたい領域を切り出
し、発現に適したビークル（ベクター）中のプロモータ
ーの下流に連結して発現型ベクターを得ることができる
。該Ｄ　Ｎ　Ａはその５′末端しこ翻訳開始コドンとして
のＡＴＧを有し、また３′末端には翻訳終止コドンとし
てのＴＡＡ、、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい
。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な
合成りＮＡアタプターを用いて付加することもできる。さらに該ＤＮＡを発現させるにはその上流にプロモータ
ーを接続する。 −１９＝ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプラスミド（例
、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２、ｐＵｃ１
３）、枯草菌由来プラスミド（例、ｐＵＢ］、１．ｏ、
ｐ’ｒｐ５．ｐｃ１９４）、酵母由来プラスミド（例、
ｐｓＨ］　９．ＰＳＨＩ　５）。あるいはλファージなどのバクテリオファージおよびレ
トロウィルス、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルス
などが挙げられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発
現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば
いかなるものでもよい。形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌である場合は
、ｔｒｐプロモーター、ｆｌａｃプロモーター、ｒｅｃ
Ａプロモーター、λＰＬプロモータ＋　ＱＰＰプロモー
ターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ｓ　ｐ
　ｏ　、ｔプロモーター、５Ｐ０２プロモーター、ｐｅ
ｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、Ｐ　
Ｉ−１０５プロモーター。ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロ
モーターなどが好ましい。とりわけ宿主がエシェリキア
属菌でプロモーターかｔｒｐプロモーターまたはλＰ１
．プロモーターであることが好ましい。宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０山来のプロモ
ーター、レトロウィルスのプロモーター、メタロチオネ
インプロモーター、ビートシミツクプロモーターなどが
それぞれ利用できる。なお、発現にエンハンサ−の利用も効果的である。このようにして構築されたマウス・エンドセリンの成熟
ペプチド（エンドセリン）をコードする１）　Ｎ　Ａを
含有するベクターを用いて、形質転換体を製造する。宿主としては、たとえばエシェリキア属菌、バチルス属
菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。上記エシェリキア属菌、バチルス属菌の具体例としては
、前記したものと同様のものが挙げら才りる。上記酵母としては、たとえばサツカロマイセスセレビシ
ェ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｊｓｉａｅ
）　Ａ　Ｈ２２。ＡＨ２２Ｒ”−、ＮＡ３７−１．］、］Ａ、、ＤＫＤ−
５などが挙げられる。動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯ５−７＋Ｖｅ
ｒｏ＋チヤイニーズハムスター細胞ＣＨＯ。マウスＬ細胞、ヒトＦ　Ｌ細胞などが挙げられる。上記エシェリキア属菌を形質転換するには、たとえばプ
ロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、ＮａｔＱ、Ａｃａｄ。Ｓｃｊ、１ＪＳＡ）　、６９．２１］０（１９７２）や
ジーン、１７，３０７（］９８２）などに記載の方法に
従って行なわれる。バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　＆　ＧｅｎｅｒａＱ　Ｇｅｎｅｔｉ、ｃｓ
）　、１競、］、１１（１９７９）などに記載の方法に
従って行なわれる。酵母を形質転換するには、たとえばプロシージング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｊ、ＵＳＡ）　、
７５．１９２９（１９７８）に記載の方法に従って行な
われる。動物細胞を形質転換するには、たとえばヴイロロジ−（
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２，４５６（１９７３）に記載の
方法に従って行なわれる。このようにして、マウス・エンドセリン成熟ペプチド〔
エンドセリン（αもしくはβ）〕をコードするＤＮＡを
含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得
られる。宿主がエシェリキア属菌、バチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培
地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物その他が含有仕しめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、
可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばア
ンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、
ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽
出液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえ
ば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグ
ネシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン類、生長促江１因子などを添加し
てもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェリキア属菌を培養する際の培地としては、例えば
グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉ
ｎｅｒ）、ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン
・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊ。ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｊｎ　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）。４３１−４３３．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｊｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＮｅｗＹｏｒｋ　１．９
７２）が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効
率よく働かせるために、たとえば３β−インドリルアク
リル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常約１５〜４
３°Ｃで約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌
を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃
で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加え
ることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばパークポールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ
）最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ、　Ｋ、　Ｌ、　ら、「プ
ロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｊ、ＵＳＡ）７７．４５０５（１９８０））が挙げられ
る。培地のｐ　Ｈは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、
必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地と
しては、たとえば約５〜２０％の胎児生血際を含むＭＥ
Ｍ培地〔サイエンス（Ｓｃｊｅｎｃｅ）　１２２゜５０
１　（１９５２））　、　Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地〔ヴイロ
ロジー（Ｖｉｒｏ−１ｏｇｙ）　＋賽、３９６（１９５
９））　、ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地〔ジャーナル・
オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション
（Ｔｈｅ　、１ｌｏｕｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒ
ｊ−ｃａｎＭｅｄｊｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）
　１９９，５３９（Ｈ１６７））、　］９９培地〔プロ
シージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バ
イオロジカル・メディスン（Ｐｒｏ−ｃｅｅｄｉｎｇ　
ｏｆ　ｔｈｅ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｊ
ｏｌｏｇｊｃａ］Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）７３．１　（１９
５０）３などが挙げられる。ｐ　Ｉ−Ｔは約６〜８であ
るのが好ましい。培養は通常約：３０〜４０℃で約１５
〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。上記培養物からマウス・エンドセリン（αもしくはβ）
の成熟ペプチド（エンドセリン）を分離精製するには、
例えば下記の方法により行なうことができる。マウス・エンドセリンの成熟ペプチド（αもしくはβ）
（エンドセリン）を培養菌体あるいは細胞から抽出する
に際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を
集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチー
ムおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細
胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりラット・エン
ドセリンの成熟ペプチドの粗抽出液を得る方法などが適
宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの
たんばく変性剤や、トリトンＸ−１，００などの界面活
性剤が含まれていてもよい。培養液中にマウス・エンドセリン前駆体たんばくや成熟
ペプチド（αもしくはβ）が分泌される場合には、培養
終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清
とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に
含まれるラット・エンドセリン前駆体たんばくや成熟ペ
プチドは、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせ
て行なうことかできる。これらの公知の分離、精製法と
しては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法
、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、および５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子紙
の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーな
どの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマト
グラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高
速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する
方法、等電点電気泳動法などの等重点の差を利用する方
法などが挙げられる。かくして生成するマウス・エンドセリン（αとβ）前駆
体たんばくや成熟ペプチ１〜は特異抗体を用いたエンザ
イムイムノアッセイなどにより測定することができる。また生成物に血管収縮活性がある場合は、該活性を指標
にしてａｌ１１定することもできる。〔作用・効果〕本発明のＤＮＡでＤＮＡ感染または形質転換した菌体や
細胞では、大量のマウス・エンドセリン成熟ペプチド（
αもしくはβ）を産生せしめることができ、マウス・エ
ンドセリン成熟ペプチド生産を有利に導くことができる
。ここに製造されるマウス・エンドセリン成熟ペプチドは
生体、特に人間の血管収縮反応のメカニズムの解析や血
管収縮因子のアンタゴニストの解明の手掛かりを与える
のみならす、低血圧治療剤や局所血管収縮剤としても利
用することができる。以上、マウス・エンドセリン（αとβ）をコードするＤ
ＮＡのクローニング、マウス・エンドセリン成熟ペプチ
ドの発現ベクターの作製と、それらによる形質転換体の
製造、該形質転換体を用いたマウス・エンドセリン（α
とβ）成熟ペプチドの製造及びその有用性等について詳
細に述べた。本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ　Ｂ　Ｃｏｍ
ｍ、１ｓｉｏｎ　ｏｎ　ｎｊｏｃｈｅｍｊｃａ］　Ｎｏ
ｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野にお
ける慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に
明示しなければＬ一体を示すものとする。ＤＮＡ　　：デオキシリボ核酸ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　：相補的デオキシリボ核酸Ａ　　：ア
デニンＴ　　：チミンＧ　　ニゲアニンＣ：シトシンＲＮＡ　　：リボ核酸ｍ　ＲＮ　Ａ　：メツセンジャーリポ核酸ｄＡＴＰ：デ
オキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオキシチミジン
三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄｃＴＰ：デオ
キシシチジン三すン酸ＡＴＰ：アデノシン三リン酸ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ　　ニドデシル硫酸す１−リウムＧｌｙまたはＧ
　：グリシンＡ　］、　ａまたはＡ　：アラニンＶａｌまたは■　：バリンｒ−ｒ　ｅ　ＩＪまたはＬ　：ロイシン１１ｅまたは■
　：イソロイシンＳｅｒまたはＳ　：セリン ’Ｔ”　ｈ　ｒまたはＴ　：スレオニンＣｙ　ｓまたは
ＣニジスティンＭｅｔまたはＭ　：メチオニンＧ　］、　ｕまたはＩＥ：グルタミン酸Ａｓｐまたは

【
）：アスパラギン酸ＬｙｓまたはＫ　：リジンＡ　ｒ　ｇまたはＲ：アルギニンＴ（ｉｓまたはＨ：ヒスチジンＰｈｅまたはＦ　：フエニールアラニンＴｙｒまたはＹ
　：チロシンＴ　ｒ　ｐまたはＷ　ニトリブトファンＰｒｏまたはＰ
　ニブロリンＡ　ｓｎまたはＮ　：アスパラギンＧ　］　ｎまたはＱ　：グルタミンなお、本発明のマウス・エンドセリン成熟ペプチドにお
いては、そのアミノ酸配列の一部が修飾（付加、除去、
その他のアミノ酸への置換など）されていてもよい。夫−施倒以−ドの参考例および実施例により本発明をより具体的
に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。なお、実施例】で得られた形質転換体は１・Ｓ　ｒ、ｈ
　ｅｒｉｃｈｊａ　ｃｏｌｊ　ＩＩｆ３１０１／ｐｍｌ
巴Ｔ５および１４ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｊＩｌｒ
ｌ　１０１／　ｐｍｌｊｉ’Ｈ１は、１１１’ｊ和６；
３年１）月６１１から通商産業省工業技術院微生物工業
技術研究所（ＦＲＩ）に各々、受託番号１？　Ｅ　ＲＭ
　　Ｂ　Ｐ−２０３２およびＦ　Ｅ　ＲＭ　　ＨＰ　−
２０：３　：うとして寄託され保管されている。参−考−倒− （１）血管平滑筋収縮作用のアッセイ法内皮を注射針に
よる擦過にて除去したブタ右冠状動脈スパイラル標本（
０，５Ｘ　２０１ｍｌ　）を炭酸ガスと酸素の混合ガス
（５：９５、Ｖ／Ｖ）で飽和した３７℃のクレブス−リ
ンゲル液（３ｍＱ）中に懸垂する。刺激前張力（ｂａｓ
ａｌ　ｔｅｎｓｉｏｎ）を２ｇに設定したのち、張カド
ランスデューサーで等尺性張力を測定する。実施例１　マウス・エンドセリンＤＮＡの単離とその塩
基配列の決定大腸菌ＬＥ３９２にマウスＤＮＡライブラリー（マウス
肝由来ＤＮＡを５ａｕ３Ａで部分分解してキャロン２８
に結合したもの）を感染させてブレーティングし、ファ
ージプラークを出現せしめた。ベントンとデイビス（ｒ３ｅｎｔｏｎ、　Ｉｉ、、　Ｄ
ａｖｉｓ、　Ｒ，）の報告〔サイエンス（Ｓｃｊｅｎｃ
ｅ）　Ｌ興、　］８Ｏ−１８２（１９７７））に従って
プラークＤＮＡの一部をニトロセルロース膜にうつしと
り、”Ｐで標識した前項のＤＮＡプローブとプラークハ
イブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーシ
ョンは、ホルムアミド非存在下、６５℃で行なった。ハ
イブリダイゼーション陽性の２３個のクローンを単離し
、そのうちのひとつであるｍＥＴ５のＥｃｏＲＩ　　Ｘ
ｂａ　Ｔ　Ｄ　Ｎ　Ａ部分と　ｍＥＴｌｏのＢａｍＨＩ
　　ＤＮＡ部分を切り出してプラスミドｐＵｃＩ８の相
当部位にリクローニングし、プラスミドｐｍＥＴ５とｐ
ｍＥＴｌｏを作製した。このプラスミドで大腸菌ＨＢＩ
ＯＩ　を形質転換し、形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１／ｐｍＥＴ５とＥ　、　ｃ
ｏｌｊＨＢ　１０１／　ｐ　ｍ　Ｅ　Ｔ　１０を得た。このプラスミドに含まれるＤＮＡ部分は１．４Ｋｂρと
］、８ＫｂｐでありこのＤＮＡ断片を含むＩ）　Ｎ　Ａ
の簡単な制限酵素地図を第１図に示した。図中の区域は
以下のものを示す。ｈ矢印で示された部分）：マウス・エンドセリン（αと
β）成熟体コード域このｃＤＮＡ部分の塩基配列をサンガー（Ｓａｎｇａｒ
）の方法（プロシージングオブザナショナルアカデミー
オブサイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｊ
、。ＵＳＡ）　７４．５４６３−５４６７　（Ｈ）７７）　
）によって決定した。この塩基配列、およびそれより推定されるマウス・エン
ドセリン（αとβ）のアミノ酸配列を第２図に示した。ロコで囲った領域が、マウス・エンドセリン（αとβ）
成熟ペプチド部である。実施例２」）マウス・エンドセリンβ合成市販のＢｏｃ−Ｔｒｐ　（Ｃ）１０）　−Ｐ　Ａ　Ｍ樹
脂、（アプライド・バイオシステムズ社製）　０．７ｇ
（０，５ｍ　ｍｏｌｅ）を用い、ペプチド合成機（アプ
ライド・バイオシステムズ礼製・モデル４３　（ｌΔ）
を使用し、通常の方法により合成した。縮合方法は、樹
脂上のＢ。Ｃ基を塩化メチレン中５０％トリフルオロ酢酸で処理し
、末端アミノ基を遊離させ、この遊離のアミノ基にＢｏ
ｃ　−Ｉ　］、］ｅ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）、Ｂ
ｏｃ−Ｌｅｕ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ　　（Ｔｏｓ）、Ｂｏｃ
−Ｃｙｓ　　（Ａｃｍ）、Ｂｏａ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−ｚ）
、Ｂｏｃ−Ｖａｎ、、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ＋Ｂｏｃ−Ｇ］、
ｕ　　（ＯＢｚｌ、）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＱ−Ｚ）、
Ｂｏｃ−Ｔｒｐ　（ＣＨＯ）、Ｂ。ｃ−８ｅｒ（ＢＺｌ）をＣ末端側よりマウスエンドセリ
ンのアミノ酸配列通りに、ＤＣＣの存在下に縮合させる
反応をくり返した。この様にして得られた保護マウスエンドセリン樹脂２．
５３　ｇのうち８９０■をアニソール１ｍＱ、１゜２−
エタンジチオール１ｍＱで膨張させ、０℃でフッ化水素
］ＯｍＱと６０分間処理した後、過剰のフッ化水素を減
圧留去した。残査をジエチルエーテル５ｍΩで洗った後
、１−リフルオロ酢酸に抽出し、樹脂をろ去した。トリ
フルオロ酢酸を減圧留去したのち、５０％−酢酸水に溶
解し、テキス１〜ランゲル（セファデックスＧ−５０）
カラム（２Ｘ９０印）に付し、同溶媒で溶出した主分画
に集め凍結乾燥し、１８０■の白色粉末を得た。これの
３　］ｒＩ１ｇを５０％−酢酸水４ｍＱに溶解し、トリ
フルオロ酢酸第二水銀］、９ｍｇを加え、室温で１６時
間撹拌したのち、ｎ−ブタノールｌ００ｒｎＱ、メタノ
ール５０ｙｎＱ。水５０ｍｆｆを加え希釈し、硫化水素ガスを通した。これに５％−Ｎ　Ｉ（４０Ｈを加えてＴＩ　ｌ−１８に
調節したのち、６時間空気酸化に付し、耐酸を加えｐ　
Ｈ３としたのち、凍結乾燥した。これを５０％−酢酸で
充填したセファデックスＧ−５０のカラム（２Ｘ９０σ
）に付し、主要分画を吐め、さらにＩ（ＰＬＣ（カラム
：　ＹＭＣ，溶媒：０．］　］％−トリフルオロ酢酸と
０．１％−１〜リフル図ロ酢酸含有アセトニトリルの直
線型濃度勾配溶出）で分取しｋｌ約物１，０■を得た。合成マウス・エンドセリンβは、ＨＰＬＣでエンドセリ
ンα２３．３３分に対し、２３．８４分に溶出された。カラム条件Ｙ　Ｍ　Ｃ−ＯＤ　Ｓ　（４，６Ｘ　１５０ｎｎ）溶離
液：Ａ液（０，１％−トリフルオロ酢酸水）Ｂ液（０，
１％−トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル）を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（５０分）流速：１．ＯｍＱ／分アミノ酸分析値：Ａｓｐ　３．３３　（３）、　Ｓｅｒ　２．００　（２
）、　Ｇｌｕ　１．３２　（ＩＬＣｙｓ　３．５２　（
４）、　Ｖａｌ　Ｏ，９２（１）、　Ｉｌｅ　１．７３
　（２）。Ｌｅｕ　２．１９　（２）、　Ｔｙｒ　Ｏ，９３（１）
、　Ｐｈｅ　１，０　　（１）。Ｌｙｓ　１．１３　（１）、　Ｈｉｓ　Ｏ，９９（１）
、　Ｔｒｐ　１．８８　（２）ここでのＳ−８結合位置
はマウス成熟エンドセリンβのＣｙｓの番号で示して、
］　−１５，３−１１の組合せであった。

【図面の簡単な説明】

第１図はマウス・エンドセリン（αとβ）前駆体や成熟
ペプチドＤＮＡを含むＤＮＡの簡単な制限酵素地図であ
る。第２図はマウス・エンドセリン（αとβ）前駆体や成熟
ペプチドＤＮＡの塩基配列およびそれより推定されるマ
ウス・エンドセリン（αとβ）前駆体の一部や成熟ペプ
チドのアミノ酸配列を示す。代理人、復代理人　大多和　明敏代理人、復代理人　大多和　暁子

Claims

【特許請求の範囲】

（１）マウス・エンドセリンをコードするＤＮＡを含有
するＤＮＡ。
（２）マウス・エンドセリンがマウス・エンドセリンα
である請求項１記載のＤＮＡ。
（３）マウス・エンドセリンがマウス・エンドセリンβ
である請求項１記載のＤＮＡ。
（４）マウス・エンドセリンαをコードするＤＮＡが式
（ I ）の塩基配列を含有あるいはその一部で表わされ
る、請求項２記載のＤＮＡ。〔式 I 〕【アミノ酸配列があります】
（５）マウス・エンドセリンβをコードするＤＮＡが式
（II）の塩基配列を含有あるいはその一部で表わされる
、請求項３記載のＤＮＡ。〔式II〕【アミノ酸配列があります】
（６）マウス・エンドセリンの蛋白質。
（７）マウス・エンドセリンがマウス・エンドセリンα
である請求項６の蛋白質。
（８）マウス・エンドセリンがマウス・エンドセリンβ
である請求項６の蛋白質。
（９）マウス・エンドセリンαの前駆体が式（III）の
アミノ酸配列で表される請求項７記載の蛋白質。〔式III〕【アミノ酸配列があります】
（１０）マウス・エンドセリンβの前駆体が式（IV）の
アミノ酸配列で表される請求項８記載の蛋白質。【アミノ酸配列があります】
（１１）マウス・エンドセリンαの成熟蛋白質が請求項
９記載の式（III）の５〜２５番目のアミノ酸配列で表
される、請求項７記載の蛋白質。
（１２）マウス・エンドセリンβの成熟蛋白質が請求項
１０記載の式（IV）の５〜２５番目のアミノ酸配列で表
される、請求項８記載の蛋白質。
（１３）マウス・エンドセリンをコードするＤＮＡを含
有するＤＮＡを保持する形質転換体。
（１４）マウス・エンドセリンがマウス・エンドセリン
αである請求項１３記載の形質転換体。
（１５）マウス・エンドセリンがマウス・エンドセリン
βである請求項１３記載の形質転換体。
（１６）マウス・エンドセリンをコードするＤＮＡを含
有するＤＮＡを保持する形質転換体を培養し、培養物中
に成熟マウス・エンドセリンを生成蓄積せしめ、これを
採取することを特徴とする成熟マウス・エンドセリン蛋
白質の製造方法。
（１７）マウス・エンドセリンがマウス・エンドセリン
αである請求項１６記載の蛋白質の製造方法。
（１８）マウス・エンドセリンがマウス・エンドセリン
βである請求項１６記載の蛋白質の製造方法。