JP3120856B2

JP3120856B2 - Ｄｎａおよびその用途

Info

Publication number: JP3120856B2
Application number: JP02257492A
Authority: JP
Inventors: 治夫音田; 尚一大久保
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1989-09-30
Filing date: 1990-09-28
Publication date: 2000-12-25
Anticipated expiration: 2015-12-25
Also published as: CA2026468A1; JPH04262782A; EP0421284A1

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はヒト血管収縮ペプチドたるヒト・エンドセリ
ン−３をコードするcDNAを含有するDNA、ヒト・エンド
セリン−３の前駆体蛋白質およびエンドセリン−３の製
造方法に関する。

本明細書において、前駆体蛋白質とは、成熟ペプチド
のアミノ酸配列を持ち、かつそのＮ末端側もしくはＣ末
端側、またはその両方に該ペプチドDNAによってコード
されるアミノ酸配列の一部又は全部を持つような蛋白質
をさす。

〔従来の技術〕内皮依存性の血管拡張反応とならんで、種々の刺激に
対する内皮依存性の血管収縮反応が報告されている。血
管の伸張や内圧の亢進といった機械的負荷による収縮、
トロンビンによる収縮、血中酸素の減少による収縮、さ
らにはニューロペプチドＹ〔プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オ
ブ・ザ・ユー・エス・エー（Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.
A.），79,5485（1982）；同,81,4577（1984）〕による
ノルアドレナリン収縮の増強などがその例である。

アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー（Am
er.J.Physiol）,248,c550（1985）およびジャーナル・
オブ・セル・フィジオロジー（J.Cell Physiol.）132,2
63（1987）には内皮細胞由来の冠血管収縮因子（分子量
はそれぞれ8,500,3,000）が記載されているが構造は不
明である。また、ジャーナル・オブ・ファーマコロジー
・アンド・エクスペリメンタル・セラビューティクス
（J.Pharmacl.Exp.Ther.）236,339（1985）にも内皮細
胞由来のペプチド様物質が記載されているが、これも構
造は不明である。

一方、血管収縮作用を有するペプチドとしてバソプレ
ッシン（Vasopressin）が知られていて、そのアミノ酸
配列も明確にされているが、バソプレッシンが哺乳類ま
たは鳥類の血管内皮細胞をオリジンとして得られたとい
う報告はない。また、血管収縮作用を有するアンジオテ
ンシン（Angiotensin）がウシ大動脈の内皮細胞から得
られるという報告〔サーキュレーション・リサーチ（Ci
rculation Research），60,422（1987）〕があるが、ア
ンジオテンシンは分子量約1,000のペプチドである。

また本発明者等の一部は同様の血管収縮作用を有する
ペプチドとして、先にブタ大動脈内皮細胞よりブタ・エ
ンドセリンを単離することに成功し（特開平１−206997
号）、また本発明者等の一部はヒト・エンドセリンの単
離、ブタ・エンドセリンおよびヒト・エンドセリンの相
補DNAのクローニングにも成功している（特開平２−728
77号）。このブタおよびヒト・エンドセリンの成熟ポリ
ペプチドのアミノ酸配列は同一で、これをエンドセリン
−１と呼ぶ。

更に、本出願人は、ラット・エンドセリンの単離、相
補DNAのクローニングについても出願を行っており（特
開平２−27983号）、これをエンドセリン−３と呼ぶ。

更に本出願人はマウス・エンドセリンの単離、相補DN
Aのクローニングについても出願を行っており（特開平
２−76583号）、これをエンドセリンＢと呼ぶ。

また本出願人はヒドゲノムDNAライブラリーから新規
なアミノ酸配列のエンドセリン−２をコードするDNAを
クローニングすることにも成功し、それを提案している
（特願平１−274990号）。

これらエンドセリン−1,−2,B,−３のアミノ酸配列に
ついては、第３図にそれらを比較して示す。なお、ここ
でエンドセリンは総称して、分子量200±300で、アミノ
酸21個からなるペプチドであり、そのアミノ酸配列のＮ
末端から数えで第１番目、第３番目、第11番目、第15番
目に位置する４個のCysが２組のＳ−Ｓ結合を形成して
いる構造を有するものである。このジスルフィド結合の
組合せとしては、１−15、３−11の組合せ、および１−
11、３−15の組合せがあるが、前者の組合せのものの方
が生成の割合が高く、また活性も高い。

〔発明が解決しようとする課題〕上記のように、各種動物により相同型のエンドセリン
が見出されているが同一動物種からの新規な相同型遺伝
子は見出されていない。そこで更に新規な相同型エンド
セリンを検索し、それらエンドセリンの構造、及び活性
等の研究を深め、それらの有用性について検討するこ
と、及び該新規ペプチドを遺伝子組み換え技術によりク
ローニングし、大量生産の道を拓くことが現在の課題で
ある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは上記血管収縮作用を有するエンドセリン
の新規相同型遺伝子を採取し、しかもそれを遺伝子組み
換え技術によつて製造することができれば、今後の研
究、治療に多大な効果を奏することができると考え、研
究を重ねた結果、次のような知見を得、本発明に到達し
たものである。

即ち、本発明者らは先に出願したヒト・エンドセリン
のゲノミック（genomic）DNAの一部をコードする合成DN
Aおよびエンドセリン−３のゲノミックDNAの約650bpか
らなるDNAをプローブとして使用して、ヒトcDNA（相補D
NA）ライブラリーから、先のエンドセリン−１〔ヒト・
エンドセリン（エンドセリンＡ）〕とは異なるアミノ酸
配列をもつエンドセリンをコードする相補DNAをクロー
ニングすることに成功した。その結果、これらを遺伝子
組み換え技術によって大量に生産する道を拓くことに成
功したものである。本発明者等はこの新規なアミノ酸配
列のヒト・エンドセリンをヒト・エンドセリン−３と命
名した。これは、エンドセリン−３〔ラット・エンドセ
リン（エンドセリンＣ）〕と成熟部分のアミノ酸配列は
同一であるものの、それをコードする塩基配列が異な
り、また前駆体としてはアミノ酸配列が異なるものであ
る。

本発明は（１）ヒト・エンドセリン−３をコードする
cDNA、特に後述の〔式１〕のNo.399−461で表される塩
基配列を含有するDNA、（２）後述の〔式２〕または
〔式２′〕のアミノ酸配列を含有するヒト・エンドセリ
ン−３前駆体、（３）ヒト・エンドセリン−３をコード
するcDNAを含有するDNAを保持する形質転換体、および
（４）上記（３）の形質転換体の培養、培養物中への蛋
白質の生産蓄積、採取を包含する成熟エンドセリン−３
の製造方法に関するものである。

本発明の、ヒト・エンドセリン−３をコードするcDNA
は〔式１〕の塩基配列を含有するものであるか或いはそ
の一部であり、これは公知のものとは異なる新規なもの
である。

また本発明のヒト・エンドセリン−３前駆体は〔式
２〕のアミノ酸配列を含有するものである。

また〔式２〕の97〜138番のアミノ酸配列に相当する
〔式２′〕で表わされるものもヒト・エンドセリン−３前駆体の一
種であり、このものはビッグ・エンドセリン−３と呼
ぶ。

これらヒト・エンドセリン−３前駆体は、今回初めて
見出された新規なものである。

〔式１〕の塩基配列は本発明で得られたヒト・エンド
セリン−3cDNA配列であり、〔式２〕の成熟エンドセリ
ン−３アミノ酸（白ボックスで囲ってある部分のＣＴ
ＣＦＴＹＫＤＫＥＣＶＹＹ
ＣＨＬＤＩＩＷの配列）をコードする塩基
配列の一例としては〔式１〕のNo.399〜461で表わされ
るものが挙げられる。

本発明方法におけるヒト・エンドセリン−３の成熟エ
ンドセリン−３をコードする塩基配列を有するDNAを含
有する発現型ベクターは、例えば、（ｉ）ヒト・エンド
セリン−３産生細胞からメッセンジャーRNA（mRNA）を
分離し、（ii）該mRNAから単鎖の相補DNA（cDNA）を、
次いで二重鎖DNAを合成し、（iii）該相補DNAをファー
ジまたはプラスミドに組み込み、（iv）得られた組み換
えファージまたはプラスミドで宿主を形質転換し、
（ｖ）得られた形質転換体を培養後、形質転換体から適
当な方法、例えばヒト・エンドセリン−３の一部をコー
ドするDNAプローブとのハイブリダイゼーションによ
り、あるいは抗エンドセリン−３抗体を用いたイムノア
ッセイ法により目的とするDNAを含有するファージある
いはプラスミドを単離し、（vi）その組み換えDNAから
目的とするクローン化DNAを切り出し、（vii）該クロー
ン化DNAまたはその一部を発現ベクター中のプロモータ
ーの下流に連結する、ことにより製造することができ
る。

ヒト・エンドセリン−３をコードするmRNAは、種々の
エンドセリン産生細胞、例えばヒト大動脈内皮細胞、ヒ
ト胎盤などから得る事ができる。

ヒト・エンドセリン−３産生細胞からRNAを調製する
方法としては、グアニジンチアシアネート法〔（ジェー
・エム・チルグウィン］（J.M..Chirgwin）ら、バイオ
ケミストリー（Bio−chemistry），18,5294（1979）〕
などが挙げられる。

このようにして得られたmRNAを鋳型とし、逆転写酵素
を用いて、例えば岡山（H.Okayama）らの方法〔モレキ
ュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular
and Cellular Biology）２,161（1982）および同誌３,2
80（1983）〕に従いcDNAを合成し、得られたcDNAをプラ
スミドに組み込む。

cDNAを組み込みプラスミドとしては、たとえば大腸菌
由来のpBR322〔ジーン（gene），２,95（1977）〕,pBR3
25〔ジーン，４,121（1978）〕,pUC12〔ジーン，19,,25
9（1982）〕,pUC13〔ジーン，19,259（1982）〕、枯草
菌由来のpUB110〔バイオケミカル・バイオフィジカル・
リサーチ・コミュニケーション（Biochemical and Biop
hysical Research Communication），112,678（198
3）〕などが挙げられるが、その他のものであっても、
宿主内で複製増殖されるものであれば、いずれをも用い
ることができる。またcDNAを組み込むファージベクター
としては、たとえばλgt11〔ヤング及びデーヴィス（Yo
ung,R.,and Davis,R.,）プロシーディングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・
ザ・ユー・エス・エー（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.），80,1194（1983）〕などが挙げられるが、その他
のものであっても宿主内で増殖できるものであれば用い
ることができる。

プラスミドに組み込む方法としては、たとえば、ティ
ー・マニアティス（T.Maniatis）ら，モレキュラー・ク
ローニング（Molecular Cloning）コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor La
−boratory），第239頁（1982）に記載の方法などが挙
げられる。またファージベクターにcDNAを組み込む方法
としては、たとえばヒューン（Hyunh,T.V.）らの方法
〔ディー・エヌ・エークローニングアプラクティ
カルアプローチ（DNA Cloning,A Practical Approac
h）１,49（1985）〕などが挙げられる。

このようにして得られたプラスミドは、適当な宿主た
とえばエシェリキア（Escherichia）属菌，バチルス（B
acillus）属菌などに導入する。

上記エシェリキア属菌の例としては、エシェリキア・
コリ（Escherichia coli）K12DH1〔プロシージング・オ
ブ・サ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）60,160（1968）〕,M103
〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acid
s Research），９,309（1981）〕,JA221〔ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molec
ular Biology）〕，120,517（1978）〕,HB101〔ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー41,459（196
9）〕,C600〔ジェネティックス（Genetics），39,440
（1954）〕などが挙げられる。

上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチ
リス（Bacillus subtilis）MI114（ジーン，24,255（19
83）〕,207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー（Journal of Biochemistry）95,87（1984）〕などが
挙げられる。

プラスミドで宿主を形質転換する方法としては、たと
えばティー・マニアティス（T.Maniatis）ら，モレキュ
ラー・クローニング（Molecular Cloning），コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring
Harbor Laboratory），第249頁（1982）に記載のカルシ
ウムクロライド法あるいはカルシウムクロライド／ルビ
ジウムクロライド法などが挙げられる。

またファージ・ベクターを用いる場合には、たとえば
増殖させた大腸菌にインビトロパッケージング法を用い
て導入することができる。

ヒト・エンドセリン−３ cDNAを含有するヒト・cDNA
ライブラリーは上記の方法などで得ることが出来るが、
市販品として購入することも可能であり、例えばヒトの
cDNAライブラリーはクローンテックラボラトリーズ（Cl
ontech Laboratories,Inc.,米国）から入手することが
できる。

ヒト・DNAライブラリーからヒト・エンドセリン−３
cDNAをクローニングする方法としては、例えばファー
ジベクターλcharon4Aとヒト・エンドセリン−３のアミ
ノ酸配列に基づいて化学合成したオリゴヌクレオチドを
プローブとして用いたプラークハイブリダイゼーション
法〔ティー・マニアティス（T.Maniatis）ら，モレキュ
ラー・クローニング（Molecular Cloning）コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Ha
rbor La−boratory），（1982）〕などが挙げられる。
このようにしてクローン化されたヒト・エンドセリン−
３ cDNAは必要があればプラスミド、例えばpBR322,pUC
12,pCU13,pCU18,pUC19,pUC118,pUC119などにサブクロー
ニングしてヒト・エンドセリン−３ cDNAを得ることが
できる。

このようにして得られたDNAの塩基配列を、たとえば
マキサム・ギルバート（Maxam−Gilbert）法〔Maxam,A.
M.and Gilbert,w.,プロシーディングス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・
ユー・エス・エー（Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.），7
4,560（1977）〕あるいはジデオキシ法〔Messing,J.
ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acid
s Research）９,309（1981）〕によって決定し、既知の
アミノ酸配列との比較からヒト・エンドセリン−3DNAの
存在を確認する。

以上のようにして、ヒト・エンドセリン−３をコード
するcDNA（ヒト・エンドセリン−3cDNA）〔式１〕が得
られる。

後述の実施例２で得られたヒト・エンドセリン−３を
コードするcDNAの制限酵素断片地図を第１図に示す。ま
たジデオキシ法で決定したDNAの塩基配列、およびその
塩基配列から判明したアミノ酸配列を第２図に示す。

上記のようにしてクローン化されたヒト・エンドセリ
ン−３をコードするcDNAは目的によりそのまま、または
所望により制限酵素で消化して使用することができる。

クローン化されたcDNAから発現させたい領域を切り出
し、発現に適したビークル（ベクター）中のプロモータ
ーの下流に連結して発現型ベクターを得ることが出来
る。

該DNAはその５′末端に翻訳開始コドンとしてのATGを
有し、また３′末端には翻訳終止コドンとしてのTAA,TG
AまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コド
ンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用
いて付加することができる。さらに該DNAを発現させる
にはその上流にプロモーターを接続する。

ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプラスミド
（例、pBR322,pBR325,pUC12,pUC13），枯草菌由来プラ
スミド（例、pUB110,pTP5,pC194），酵母由来プラスミ
ド（例、pSH19,pSH15），あるいはλファージなどのバ
クテリオファージおよびレトロウイルス、ワクシニアウ
ィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられる。

本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の
発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれ
ばいかなるものでもよい。

形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌である場合
は、trpプロモーター,lacプロモーター,recAプロモータ
ー，λPLプロモーター,lppプロモーターなどが、宿主が
バチルス属菌である場合は、SPO1プロモーター,SPO2プ
ロモーター,penPプロモーターなど、宿主が酵母である
場合は、PHO5プロモーター,PGKプロモーター,GAPプロモ
ーター,ADHプロモーターなどが好ましい。とりわけ宿主
がエシェリキア属菌でプロモーターがtrpプロモーター
またはλPLプロモーターであることが好ましい。

宿主が動物細胞である場合には、SV40由来のプロモー
ター、レトロウィルスのプロモーター、メタロチオネイ
ンプロモーター、ヒートショックプロモーターなどがそ
れぞれ利用できる。

なお、発現にエンハンサーの利用も効果的である。

このようにして構築されたヒト・エンドセリン−３の
成熟ペプチドをコードするcDNAを含有するベクターを用
いて、形質転換体を製造する。

宿主としては、たとえばエシェリキア属菌、バチルス
属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌、バチルス属菌の具体例として
は、前記したものと同様のものが挙げられる。

上記酵母としては、たとえばサッカロマイセスセレビ
シエ（Saccaromyces cerevisiae）AH22,AH22R^-,NA87−1
1A,DKD−5Dなどが挙げられる。

動物細胞としては、たとえばサル細胞COS−7,Vero,チ
ャイニーズハムスター細胞CHO,マウスＬ細胞，ヒトFL細
胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌を形質転換するには、たとえば
プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），69,211
0（1972）やジーン，17,107（1982）などに記載の方法
に従って行なわれる。

バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュ
ラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecu
lar ＆ General Genetics），168,111（1979）などに記
載の方法に従って行なわれる。

酵母を形質転換するには、たとえばプロシージング・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA），75,1929（1978）に記載の方
法に従って行なわれる。

動物細胞を形質転換するには、たとえばヴィロロジー
（Virology）52,456（1973）に記載の方法に従って行な
われる。

このようにして、ヒト・エンドセリン−３成熟ペプチ
ドをコードするcDNAを含有する発現ベクターで形質転換
された形質転換体が得られる。

宿主がエシェリキア属菌、バチルス属菌である形質転
換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体
培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必
要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられ
る。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリ
ン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえ
ばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカ
ー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイシ
ョ抽出液などの無機または有機物質、無機物としてはた
とえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化
マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン
類、生長促進因子などを添加してもよい。

培地のpHは約５〜８が望ましい。

エシェリキア属菌を培養する際の培地としては、例え
ばグルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔ミラー（Mill
er），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モ
レキュラー・ジェネティックス（Journal of Experimen
ts in Molecular Genetics）,431−433,Cold Spring Ha
rbor Laboratory,New York 1972〕が好ましい。ここに
必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、た
とえば３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加
えることができる。

宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常約15〜43
℃で約３〜24時間行い、必要により、通気や攪拌を加え
ることもできる。

宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約30〜40℃で
約６〜24時間行ない、必要により通気や攪拌を加えるこ
ともできる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培
地〔Bostian,K.L.ら、「プロシージング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.
Acid.Sci.USA）77,4505（1980）〕が挙げられる。培地
のpHは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約
20℃〜35℃で約24〜72時間行い、必要に応じて通気や攪
拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地
としては、たとえば約５〜20％の胎児牛血清を含むMEM
培地〔サイエンス（Science）122,501（1952）〕,DMEM
培地〔ヴィロロジー（Virology），８,396（1959）〕,R
PMI1640培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メ
ディカル・アソシエーション（The Jounal of the Amer
ican Medical Association）199,519（1967）〕,199培
地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フオー
・ザ・バイオロジカル・メディスン（Pro−ceeding of
the Society for the Biological Medicine）73,1（195
0）〕などが挙げられる。pHは約６〜８であるのが好ま
しい。培養は通常約30〜40℃で約15〜60時間行い、必要
に応じて通気や攪拌を加える。

上記培養物からヒト・エンドセリン−３の成熟ペプチ
ド（エンドセリン−３）を分離精製するには、例えば下
記の方法により行なうことができる。

ヒト・エンドセリン−３の成熟ペプチドを培養菌体あ
るいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方
法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸
濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解など
によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離や
ろ過によりヒト・エンドセリン−３の成熟ペプチドの粗
抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿
素や塩酸グアニジンなどのたんぱく変性剤や、トリトン
Ｘ−100などの界面活性剤が含まれていてもよい。

培養液中にヒト・エンドセリン−３前駆体たんぱくや
成熟ペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ
自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、
上清を集める。このようにして得られた培養上清、ある
いは抽出液中に含まれるヒト・エンドセリン−３前駆体
たんぱくや成熟ペプチドは、自体公知の分離・精製法を
適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知
の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解
度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、
およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの
主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマ
トグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニ
ティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用す
る方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性
の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の
差を利用する方法などが挙げられる。

かくして生成するヒト・エンドセリン−３前駆体たん
ぱくや成熟ペプチドは特異抗体を用いたエンザイムイム
ノアッセイなどにより測定することができる。また生成
物に血管収縮活性がある場合は、該活性を指標にして測
定することもできる。

〔作用・効果〕

本発明のDNAでDNA感染または形質転換した菌体や細胞
では、大量のエンドセリン−３成熟ペプチドを産生せし
めることができ、これらのペプチド生産を有利に導くこ
とができる。

ここに製造されるエンドセリン−３は他のエンドセリ
ン同様、低血圧治療剤や局所血管収縮剤としても利用す
ることができるのみならず、生体の血管収縮反応のメカ
ニズムの解析や血管収縮因子のアンタゴニストの解明の
手掛かりを与えるものである。また同様にこのエンドセ
リンは、血管収縮剤として種々の出血、例えば胃や食道
の出血を防止するような効果を有する。またこのものは
種々のショック症状を回復させる効果をも有する。この
ペプチドは経口的、局所的、静注もしくは非経口的に投
与することができるが、局所もしくは静注投与が好まし
い。投与量は0.001μｇ〜100μg/kg、好ましくは0.01μ
ｇ〜10μg/kgであり、体重に応じた投与量を１〜10mlの
生理的食塩水中に溶解して用いる。

本発明のペプチドは該ペプチドおよび副成分を含む乳
剤、水和剤、錠剤、水溶剤、粉剤、粒剤、カプセル剤、
丸剤などの種々の形態に製剤化したものとして使用でき
る。副成分としては、薬理的に許容され得る賦形剤、崩
壊剤、滑沢剤、結合剤、分散剤、可塑剤、充填剤、担体
などが用いられる。これらの副成分の例としては、賦形
剤としては乳糖、ぶとう糖、白糖などが、崩壊剤として
は澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、カルボキシメ
チルセルローズカルシウムなどが、滑沢剤としてはステ
アリン酸マグネシウム、タルク、流動パラフィンなど
が、結合剤としては単シロップ、ゼラチン溶液、エタノ
ール、ポリビニルアルコールなどが、分散剤としてはメ
チルセルロース、エチルセルロース、セラックなどが可
塑剤としてはグリセリン、澱粉などが挙げられる。

本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸な
どを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Commision on Bi
ochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野に
おける慣用略号に基づくものであり、その例を下記す
る。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、
特に明示しなければＬ−体を示すものとする。

DNA:デオキシリボ核酸 cDNA:相補的デオキシリボ核酸 A:アデニン T:チミン G:グアニン C:シトシン RNA:リボ核酸 mRNA:メッセンジャーリボ核酸 dATP:デオキシアデノシン三リン酸 dTTP:デオキシチミジン三リン酸 dGTP:デオキシグアノシン三リン酸 dCTP:デオキシシチジン三リン酸 ATP:アデノシン三リン酸 EDTA:エチレンジアミン四酢酸 SDS:ドデシル硫酸ナトリウム GlyまたはG:グリシン AlaまたはA:アラニン ValまたはV:バリン LeuまたはL:ロイシン IleまたはI:イソロイシン SerまたはS:セリン ThrまたはT:スレオニン CysまたはC:システイン MetまたはM:メチオニン GluまたはE:グルタミン酸 AspまたはD:アスパラギン酸 LysまたはK:リジン ArgまたはR:アルギニン HisまたはH:ヒスチジン PheまたはF:フェニールアラニン TyrまたはY:チロシン TrpまたはW:トリプトファン ProまたはP:プロリン AsnまたはN:アスパラギン GlnまたはQ:グルタミンなお、本発明のヒト・エンドセリン−３においては、
そのアミノ酸配列の一部が修飾（付加、除去、その他の
アミノ酸への置換など）されていてもよい。

実施例以下の参考例および実施例により本発明をより具体的
に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

なお、実施例２で得られた形質転換体Escherichia co
li DH5α/pHET−３（Ｐ）は、平成１年９月25日から財
団法人発酵研究所（IFO）に受託番号IFO 14949とし
て、また平成１年９月29日から通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究所（FRI）に受託番号FERM BP−2617
として寄託され保管されている。

参考例（１）血管平滑筋収縮作用のアッセイ法内皮を注射針による擦過にて除去したブタ右冠状動脈
スパイラル標本（0.5×20mm）を炭酸ガスと酸素の混合
ガス（5:95、V/V）で飽和した37℃のクレブス−リンゲ
ル液（3ml）中に懸垂する。刺激前張力（basal tensio
n）を2gに設定したのち、張力トランスデューサーで等
尺性張力を測定する。

（２）強心作用のアッセイ法前記（１）のアッセイ法で用いたブタ右冠状動脈スパ
イラル標本のかわりにモルモットの右心房の懸垂標本を
使用し、（１）と同じ操作を行って張力および毎分の心
脈数を測定する。

実施例１ genomicヒト・エンドセリン−３のDNAの一部
をコードするDNAプローブの作製ヒト・エンドセリン−３の５′側の配列５′ GCGCCTGGATCGGTGGTGCTCAGGGGCCCC3′ のDNAプローブを化学合成し、またクローン化したgenom
icヒト・エンドセリン−３の約650塩基から成るDNAの
５′端をT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて³²P−り
ん酸化し、ゲノムDNAライブラリーのスクリーニングに
用いた。

実施例２ヒト・エンドセリン−３前駆体cDNAの単離と
その塩基配列の決定大腸菌Y1090に前述のヒト胎盤由来のcDNAライブラリ
ー（Clontech Laboratories,Jnc.製）を感染させてプレ
ーテイングし、ファージプラークを出現せしめた。ベン
トンとデイビス（Benton,W.,Davis,R.）の報告〔サイエ
ンス（Sciencs）196,180−182（1977）〕に従って、プ
ラークDNAの一部をナイロン膜にうつしとり、³²Pで標識
した実施例１のDNAプローブとプラークハイブリダイゼ
ーションを行なった。ハイブリダイゼーションは20％ホ
ルムアミドの存在下、43℃で行ない該膜は0.2×SSC、0.
1％SDS中で20℃で洗浄した。ハイブリダイゼーション陽
性のクローンを単離し、そのうちのひとつであるλgt10
の成熟体コード域をEcoR Iで切り出してプラスミドpUC1
18にサブクローニングした。このプラスミドで大腸菌DH
5αを形質転換し、形質転換体エシェリキア・コリDH5α
/pHET−３（Ｐ）を得た。このプラスミドに含まれるヒ
トcDNA断片の簡単な制限酵素地図を第１図に示した。図
中の区域は以下のものを示す。

■：ヒト・エンドセリン−３成熟体コード域この成熟体コード域とその周辺の塩基配列をサンガー
（Sanger）の方法〔プロシージングオブザナショ
ナルアカデミーオブサイエンス（Proc.Nat.Acad.
Sci.U.S.A.）74,5463−5467（1977）〕によって決定し
た。この塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配
列の一部を第２図（枠で囲んだ部分のＣからＷまでが成
熟ペプチド部）に示した。得られたcDNA塩基性は2299で
あり、３′末端にpolyAシグナルAATAAAの配列を有して
いる。また第３図にはこのヒト・エンドセリン−３成熟
ペプチドのアミノ酸配列と共に、先に見出しているエン
ドセリン−1,B,−２の成熟ペプチドのアミノ酸配列を比
較の為に示してある。

実施例３ヒト・エンドセリン−３の動物細胞、CHO−K1細胞での
発現ｉ）発現プラスミドの構築ヒト胎盤のcDNAライブラリーからクローン化したヒト
・エンドセリン−３の前駆体をコードするcDNAを有する
精製プラスミド、pHET−３（ｐ）を、制限酵素EcoR Iで
処理した後、１％のアガロースゲル電気泳動で2.3kbのc
DNAを分離した。このcDNA部分を電気的に溶出し、クレ
ノウフラグメントでEcoR I切断部分の一本鎖部分を二本
鎖の状態にした後、制限酵素Xho Iの認識配列を有する
リンカーである５′−pd（CCTCGAGG）−３′を結合し、
Xho Iで処理した。得られたDNAをポリアクリルアミド電
気泳動で精製、これを電気的に溶出した。得られたリン
カーを結合したエンドセリン−３前駆体をコードするcD
NAを発現ベクターpSVLのXho I部分に組み込み、プラス
ミドpTS6009を得た（第４図）。

ii）CHO−K1細胞の形質転換 CHO−K1細胞をファルコンの直径6cmのプラスチックシ
ャーレに10％仔牛血清を含むDulbecco's minimum essen
tial medium（Ｄ−MEM）（ストレプトマイシン、カナマ
イシンを100〜50μg/ml含む）で、５％CO₂、95％Air,37
℃の条件で培養し、細胞が80〜90％の条件で増殖した
時、シャーレ当たり１〜10μｇの発現プラスミドpTS600
9をリン酸カルシウム法（Graham and Vandu HbA,1977,V
irology 52,456−467）で細胞にかけた。約７〜18時間
後、細胞を−（Mg）PBSで洗浄した後、上記の培養液で
培養した。

CHO−K1細胞の場合はプラスミドpTS6009とネオマイシ
ン耐性の遺伝子をもつプラスミドpSV2−neoとを同時感
染させた後、抗生物質G418を含有する培養液で培養し、
G418に耐性の細胞株を選択樹立し、CHO−K1−15−４と
命名した。

CHO−K1−15−４株はエンドセリン−３の持続産生株
であり、その産生状態はエンドセリン−３特異的なEnzy
me immuno assay（EIA）でその培養上清を測定すると、
第５図に示した通り、細胞を植付けてから３日〜８日ま
でエンドセリン−３の分泌産生をすることが示された。

第５図中、左縦軸は累積hET−３（pg/ml）を表し、■
がCHO−K1−15−４（G418^r）を、□がCHO−K1を表す。
また第５図の右縦軸はセル数×10^-6を表し、▲がCHO−K
1−15−４（G418^r）を、△がCHO−K1を表す。

iii）CHO−K1−15−４株が産生する免疫反応陽性（immu
no reactive）なエンドセリン−３の性状 CHO−K1−15−４株細胞の培養上清約70ml Seppak C14
カラムで濃縮した後400μｌを５％CH₃CN、0.05％トリフ
ルオロ酢酸に溶解した後、RP−HPL（reverse phase−hi
gh performance liquid chromatography）で分析した。

分画した試料をET−３に特異的なEIAで測定した結果
を第６図に示した。EIAで陽性の分画定量は合成したET
−３と同じ位置に溶出されていることから、CHO−K1−1
5−４株細胞で分泌される免疫反応陽性のエンドセリン
は、サンドイッチタイプのエンドセリン−３特異的なEI
Aの測定系ということを考慮すれば、エンドセリン−３
と推定される。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒト・エンドセリン−３前駆体や成熟ペプチド
DNAを含むDNAの簡単な制限酵素地図である。第２図はヒト・エンドセリン−３前駆体や成熟ペプチド
DNAの塩基配列、およびこれらから推定されるアミノ酸
配列を併せて示す。枠で囲んだ部分が成熟エンドセリン
−３である。第３図は第２図の塩基配列より推定されるヒト・エンド
セリン−３成熟ペプチドのアミノ酸配列、エンドセリン
−1,B,−２のアミノ酸配列を示す。第４図はヒト・エンドセリン−３発現用のプラスミドpT
S6009の構築図であり、第５図はエンドセリン−３産生
株化細胞CHO−K1−15−４のエンドセリン−３産生の経
時的変化を示すグラフであり、第６図はヒト・エンドセ
リン−３産生株化細胞CHO−K1−15−４の産生する免疫
反応陽性（immuno reactive）なエンドセリンのRP−HPL
Cの分析図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＡ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/00 - 14/825 C12N 5/00 - 5/28 C12P 21/00 - 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（ＧＥＮＥＴＹＸ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】〔式１〕の塩基配列または〔式１〕の第11
1番目から第782番目の塩基配列を含有するDNA。
【請求項２】〔式２′〕のアミノ酸配列を含有する蛋白質。
【請求項３】〔式２〕のアミノ酸配列で表される請求項
２記載の蛋白質。
【請求項４】請求項２記載の蛋白質をコードするDNAを
保持する形質転換体。
【請求項５】請求項４記載の形質転換体を培養し、培養
物中にアミノ酸配列で表されるペプチドを生成蓄積せしめ、これを採取する
ことを特徴とする該ペプチドの製造方法。