JPH05192177A

JPH05192177A - Ｐａｃａｐ蛋白質の製造法

Info

Publication number: JPH05192177A
Application number: JP3293402A
Authority: JP
Inventors: Haruo Onda; 治夫音田; Chiharu Kimura; 千春木村; Chieko Kitada; 千恵子北田; Akira Arimura; 章有村
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-11-09
Filing date: 1991-11-08
Publication date: 1993-08-03

Abstract

(57)【要約】【目的】ＰＡＣＡＰ蛋白質を容易に且つ大量に得る方法
の提供。【構成】ＰＡＣＡＰ蛋白質をコードするｃＤＮＡを含有
するＤＮＡを保持する形質転換体の培養、培養物中への
ＰＡＣＡＰ蛋白質の生成蓄積、採取を包含するＰＡＣＡ
Ｐ蛋白質の製造法。【効果】大量のＰＡＣＡＰ３８の前駆体蛋白質や、成熟
ＰＡＣＡＰ３８もしくはＰＡＣＡＰ２７を得ることが出
来、これを実験動物で使用することにより、その作用、
特に脳の機能に関する研究、特にホルモン類による脳機
能の理解に応用し、さらに各種神経障害の治療薬として
利用することが出来る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は脳の視床下部、精巣等由
来の、生理活性を有するＰＡＣＡＰ蛋白質の新規な製造
法に関し、更に詳しくは該蛋白質をコードするｃＤＮＡ
を含有するＤＮＡを保持する形質転換体を用いる上記蛋
白質の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】脳の視床下部、下垂体から分泌されるホ
ルモンには種々のものが知られている。甲状腺刺激ホル
モン放出ホルモン（Thyrotropin releasing hormone)や
黄体形成ホルモン放出ホルモン(Leutenizing hormone r
eleasing hormone)、ソマトスタチン(Somatostatin)、
副腎皮質刺激ホルモン（Adrenocorticotropic hormon
e)、成長ホルモン(Growth hormone)、プロラクチン(Pro
lactin)などがその例で、これらの作用についてはよく
研究されている。一方、これ以外の新しい視床下部由来
の生理活性のある物質が、アデニレートサイクラーゼ
アクティヴィティ(adenylate cyclase activity)を指標
にしての探求の結果、それまでには報告されていない、
３８個のアミノ酸残基からなる蛋白質が発見され、その
構造が決定され、このものはＰＡＣＡＰ３８と命名され
た〔バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コ
ミュニケーション(Biochem. Biophys. Res. Commun.) 1
64，567-574,1989〕。本発明者等はヒツジ、ヒトおよび
ラット由来のＰＡＣＡＰ３８の塩基配列を決定して、こ
れらの成熟部分のアミノ酸配列が同一であり、ＰＡＣＡ
Ｐ前駆体においてはアミノ酸の置換があることを見出し
ている〔特願平２−39841号、バイオケミカル・バイオ
フィジカル・リサーチ・コミュニケーション(Biochem.
Biophys. Res. Commun.) 173，1271-1279(1990)〕。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら上記のと
おりＰＡＣＡＰ３８の存在は確認したものの、成熟蛋白
質およびその前駆体を視床下部等から単離、精製するこ
とは非常に複雑な操作を必要として困難である上に、少
量しか目的の蛋白質が得られないという問題がある。し
たがって、該ＰＡＣＡＰ蛋白質を容易に且つ大量に得る
方法の提供が望まれているのである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らはＰＡＣＡＰ
蛋白質の大量生産技術を開発すべく種々研究の結果、こ
のたび、これに基き遺伝子組換え技術を用いることによ
りＰＡＣＡＰ蛋白質を大量に得ることを可能とし、本発
明に到達したものである。即ち、本発明はＰＡＣＡＰ蛋
白質をコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡを保持する
形質転換体の培養、培養物中へのＰＡＣＡＰ蛋白質の生
成蓄積、採取を包含するＰＡＣＡＰ蛋白質の製造法を提
供するものである。本発明により得られるＰＡＣＡＰ蛋
白質としては、〔式１〕（配列番号：１） His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys で表わされる成熟ＰＡＣＡＰ３８、〔式１''〕（配列番号：２） His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu で表わされる成熟ＰＡＣＡＰ２７、およびこれらの前駆
体蛋白質が包含される。

【０００５】ＰＡＣＡＰ前駆体蛋白質としては〔式１〕
（配列番号：１）のアミノ酸配列を包含するものが挙げ
られ、ヒツジ、ヒト、ラットの３種において共通の〔式
１’〕（配列番号：３） Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile のアミノ酸配列を有するものの他、後述の、ヒツジ、ヒ
ト、ラットの３種において一部のアミノ酸配列が異なる
各種の前駆体蛋白質が挙げられる。

【０００６】本発明において、ヒツジＰＡＣＡＰ３８を
コードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡとしては、〔式
２〕、〔式３〕の塩基配列を含有するあるいはその一部
で表わされるＤＮＡが挙げられる。〔式２〕（配列番号：４） 5′ CAC TCG GAC GGC ATC TTC ACT GAC AGC TAC AGC CGC TAC CGG AAG CAA ATG GCT GTT AAG AAA TAC TTG GCG GCT GTC CTA GGG AAA AGG TAT AAA CAA AGG GTT AAG AAC AAA GGA CGG CGA ATA CCG TAC TTG TAG CGA CGA GTT ACC AGC TAT CCT 〔式３〕（配列番号：５） 1 CTGCTAACTGCCCAGATAAATAGGAGCAGAGGGCTGGTCACCTCTGTAATAACCACCGGCAGCAGTAGA AGAAACCGCAGCTTCAGAAGCAGCCAGAGAGACTTCTGAGCAGCGAAGGCGCTGCCTGCTCGAGCTGCCTGG CCGGGCGGCTGCCCCAGACGCCGACTTCGCCGAGGCCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC TCTCTCTCTCTGCTTCTTTCCTTATCACTCCTTTCTTCTCAGTGGACTTCAGGCCACTTTGTCTCCCACCCC CACTCAGCTCGTCGCCTCCTCCGTCTTCCTTCTCCATCTCTCCTCTCGCCCCCCTTCTCTCAGTGTCACGCT CCGTCCTAGTTCCGAGCGTCGTCAAACTTTTGAACAGAATAACAGGACTCAGCAAACAAGTCCTCCAGCTCC TCCCGCGGCTCCGGCTCGTTCCTGCGGCTCCTGCTCAGACACTAACGCCAGACGGCGATGCCTCTTGGGTTG TGACTACAGCGCACAAACTTGGAGAAGCTCTTTGCCCGCCGTCCTACTTGGCAGCAAATCCTCTCCTGGCAG CGA ATG ACC ATG TGT AGC GGA GCG AGG CTGGCC CTG CTC GTT TAC GGG ATA CTG ATG CAC AGC AGC GTC TAC GGC TCA CCT GCC GCC TCC GGA CTC CGG TTC CCG GGG ATC AGG CCG GAG AAC GAG GCG TAC GAC GAG GAC GGA AAC CCG CAG CAG GAC TTC TAC GAC TCG GAG CCG CCA GGC GTG GGG AGC CCC GCC TCC GCG CTG CGC GAT GCC TAC GCG CTC TAC TAC CCG GCG GAG GAA AGA GAT GTC GCC CAC GGG ATC CTT GAT AAG GCC TAC CGC AAA GTG CTG GAC CAG CTG TCC GCC AGG AGA TAC CTG CAG ACG CTC ATG GCC AAG GGC TTG GGT GGG ACC CCG GGC GGC GGC GCG GAC GAC GAC TCG GAG CCG CTC TCC AAG CGC CAC TCG GAC GGC ATC TTC ACT GAC AGC TAC AGC CGC TAC CGG AAG CAA ATG GCT GTT AAG AAA TAC TTG GCG GCT GTC CTA GGG AAA AGG TAT AAA CAA AGG GTT AAG AAC AAA GGA CGG CGA ATA CCG TAC TTG TAG CGACGAGT TACCAGCTATCCTGTGTATACAGCCCTGACACAATGAGAAGTCGTTTTTCCCAACTGACTGAACTGTCATCG CTGCTGTGTTCTGTCCCACATGTATTTATGTATGAAGTCAAGCCATTAAATGAATATTTTGATAATAATATT GTTTTTCTTTTTACGAAGCACTGGAGAATGCACAGATATACTTTGTGGACCAATTATTGATATTGACATATA TATTACGAATATATAAAGAGTATATATATATATATATAAGTATAATAGAGAGCCGTTCATACAGTGTGCACA AGGACTGAAGATTCGCCTGAGCTGTTTGTTTTTATATAAAATAAATAGAAAAATAGACAATCATTGTTTTGA ATATTACTCCTATTTTTGTAAACTGGAATTAAAAGGATAGTATTTTTATCCACAATAGGCCTGAAGATATTA ATCCTGACCATTTGCTACTGTACATAAACAGTGATGCCCTGCTCCAGGGAGACTTTGAGGTAATGATTTGGG AGGATTGCTGAAGGTCTCTCTTTCCCAGGGAGTCTCTGGGGCAGGCTGCTTCAATCCCAGCTGAACTCGACT GAGGCTCTGTCTACCCCTTGCTGGGTGGCAATGCCAATACTTCCGCTTTCTTTGATTCTATTTTTATGTGTA 1763 本発明におけるヒツジＰＡＣＡＰ３８の前駆体として
は、〔式８〕、〔式９〕で表わされるものが挙げられ
る。

【０００７】〔式８〕（配列番号：６） Met Ala Lys Gly Leu Gly Gly Thr Pro Gly Gly Gly Ala Asp Asp Asp Ser Glu Pro Leu Ser Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile Pro Tyr Leu 〔式９〕（配列番号：７） Met Thr Met Cys Ser Gly Ala Arg Leu Ala Leu Leu Val Tyr Gly Ile Leu Met His Ser Ser Val Tyr Gly Ser Pro Ala Ala Ser Gly Leu Arg Phe Pro Gly Ile Arg Pro Glu Asn Glu Ala Tyr Asp Glu Asp Gly Asn Pro Gln Gln Asp Phe Tyr Asp Ser Glu Pro Pro Gly Val Gly Ser Pro Ala Ser Ala Leu Arg Asp Ala Tyr Ala Leu Tyr Tyr Pro Ala Glu Glu Arg Asp Val Ala His Gly Ile Leu Asp Lys Ala Tyr Arg Lys Val Leu Asp Gln Leu Ser Ala Arg Arg Tyr Leu Gln Thr Leu Met Ala Lys Gly Leu Gly Gly Thr Pro Gly Gly Gly Ala Asp Asp Asp Ser Glu Pro Leu Ser Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile Pro Tyr Leu。

【０００８】本発明において、ヒトＰＡＣＡＰ３８をコ
ードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡとしては、〔式
４〕、〔式５〕の塩基配列を含有するあるいはその一部
で表わされるＤＮＡが挙げられる。〔式４〕（配列番号：８） 5′ CAC TCG GAC GGG ATC TTC ACG GAC AGC TAC AGC CGC TAC CGG AAA CAA ATG GCT GTC AAG AAG TAC TTG GCG GCC GTC CTA GGG AAG AGG TAT AAA CAA AGG GTT AAA AAC AAA GGA CGC CGA ATA GCT TAT TTG TAG CGA TGG GTT ACC AGC TAC CCT GTG TAT AC 3′ 〔式５〕（配列番号：９） A ATG ACC ATG TGT AGC GGA GCG AGG CTG GCC CTG CTG GTC TAT GGG ATA ATC ATG CAC AGC AGC GTC TAC AGC TCA CCT GCC GCC GCC GGA CTC CGG TTC CCC GGG ATC AGG CCA GAG GAA GAG GCG TAC GGC GAG GAC GGA AAC CCG CTG CCA GAC TTC GGT GGC TCG GAG CCG CCG GGC GCA GGG AGC CCC GCC TCC GCG CCG CGC GCC GCC GCC GCC TGG TAC CGC CCG GCC GGG AGA AGA GAT GTC GCC CAC GGG ATC CTT AAC GAG GCC TAC CGC AAA GTG CTG GAC CAG CTG TCC GCC GGG AAG CAC CTG CAG TCG CTC GTG GCC CGG GGC GTG GGT GGG AGC CTC GGC GGC GGC GCG GGG GAC GAC GCG GAG CCG CTC TCC AAG CGC CAC TCG GAC GGG ATC TTC ACG GAC AGC TAC AGC CGC TAC CGG AAA CAA ATG GCT GTC AAG AAG TAC TTG GCG GCC GTC CTA GGG AAG AGG TAT AAA CAA AGG GTT AAA AAC AAA GGA CGC CGA ATA GCT TAT TTG TAGCGATGGGTT ACCAGCTACCCTGTGTATACAGCCCTGACGCAATGAAAAGTCGTTTTCCAAACTGAC TCAACAGTCATCGC TCGTGTGTTCTATCCAAACATGTATTTATGTAATGAAGTAAAGCCATTAAATGAATATTTTGATAATAATAT TGTTTTTCTTTCTACAAAGCACTAGAGAATGCACAGATATACTTTGTGGACCAATTATTGATATATATTATA AATATATATAAAGAATATATATATATATATATATATAAAGTATAGAGAGAAGTTCATACAAAGCGTGCACAA GGATTGAAAATTCGCCCGAGCTGTTTATGTTTTTATAAAAATAAATAGAAAAGTAGACAATCATTGTTTTGA ATATTACTCCTATTTTTGTAAACTGGAATTAAAAGGATAGTATTTTTATCCATGACAGGCCTGAAGATATTA CTACTTACCATTTGCTACTGTACATAAACAATGATGCCCTGCTCCAGGGAGATTTTGAGGTAAAGATATGGA GAATTGCTGAAGGGCATTCTTTCCCAGTGAGTCTCTGGGGCAGGCTGCTTCAATCCCAGCCTAACTCAACTG GGCTCTGTCCCCCTGGTTGGGTGGCAATTCCAATATTTCTGCTTTCTTTGATTCTCCTTTTATGTGTAGTTG TCTCTCTTCAGACTCTCAGCCCAGAAGAAAATTCTCCTGATAAAACAACAGCTCGATCCAAATTGTGCTTCT CCCCAGAATTCACGCCTCTCCCTAGGAGAAGAGTTGAGGAACTGTACAGAAAAGGGCGGCTTCGTTAGACCG CTCTCTTTTCTGTACTTCCTGAGTGGCCAGGGAATCTAATATCCCCAAATTAGGGCAATTGGAACAAAGTGA AGGACATAGAGGTATATTGGAAGAGGCAGAGCCTGAGGTGGTAGGAGGAGGACCCTGGAAATGGACTGGTTT GAGATTGCCCCAGGTCTGGGAAGCTGAGGGCAAATCCAGTCCCAGTGGTCCTGACTTTGGGCGCTGGGTATT GGAAATGGATGCAAAGTACAATGTGTTTTTCTCCAGTGCTGTCCATGCTTCTCATCTTGTGAAATGGCCAGG ATCCTCTCCTTTGAAACCTGCTCTGTAGGAGCTACCCTTTTCCTTTGTGGTTTTATGGAGACCTCTCCTTCC TACCCTCCTGCACTGTTTAAGTACTGTTTACCATTTTTCATTCACTTCTCTTAAACTTGTGAATGCTTCTCA CTTTTTTTTTTTGTTTGATGCAGGCACTTATTGTAAATTTTAGAAACCCCTCTGTAGCCACTAGTAAGTAAT TATGCACTAAATATGAACCCTTTGTTTCTTGTTTATTGAGTTTGTAGGTAAAATGTATTTTTCTACATTATT GCTTATTGCTTAGTAAAATTTATTTCATAAAA。

【０００９】本発明におけるヒトＰＡＣＡＰ３８の前駆
体としては、〔式10〕、〔式11〕で表わされるものが挙
げられる。〔式１０〕（配列番号：１０） Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ala Gly Asp Asp Ala Glu Pro Leu Ser Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile Ala Tyr Leu 〔式１１〕（配列番号：１１） Met Thr Met Cys Ser Gly Ala Arg Leu Ala Leu Leu Val Tyr Gly Ile Ile Met His Ser Ser Val Tyr Ser Ser Pro Ala Ala Ala Gly Leu Arg Phe Pro Gly Ile Arg Pro Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Glu Asp Gly Asn Pro Leu Pro Asp Phe Gly Gly Ser Glu Pro Pro Gly Ala Gly Ser Pro Ala Ser Ala Pro Arg Ala Ala Ala Ala Trp Tyr Arg Pro Ala Gly Arg Arg Asp Val Ala His Gly Ile Leu Asn Glu Ala Tyr Arg Lys Val Leu Asp Gln Leu Ser Ala Gly Lys His Leu Gln Ser Leu Val Ala Arg Gly Val Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ala Gly Asp Asp Ala Glu Pro Leu Ser Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile Ala Tyr Leu 。

【００１０】本発明において、ラットＰＡＣＡＰ３８を
コードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡとしては、〔式
６〕、〔式７〕の塩基配列を含有するあるいはその一部
で表わされるものが挙げられる。〔式６〕（配列番号：１２） CAC TCG GAC GGC ATC TTC ACA GAC AGC TAT AGC CGC TAC CGA AAA CAA ATG GCT GTC AAG AAA TAC TTG GCG GCC GTG CTA GGG AAA AGG TAT AAA CAG AGG GTT AAA AAC AAA GGA CGC CGA ATA GCG TAC TTG TAG CGATGAGTTGC CAGCTACCGTGTGTATAAAATGAAAAGTCGTTTTCCAAATTGACTGACCAGTCATCACTCATGTGTTCTTTC CAAACATGTATTTATGTATCAAGTAAAGCCATTAAATGACTATTTTGATAATAATATTGTTTTTCTTTTTAC GAAGCACTGGAGAATGCACAGATATACTTTGTGGACCAATTATTGATATATATTATAAGTATATATTAAGAA TATATATAGGTATAGCAGAGAGCAATTCATAAGCGTGCACAAAGATTGAAAATTCGCCTGAGCTGTTTATGT TTTTATATAAAATGAATAGAGAAAATAGACAACCATTGTTTTGAATATTACTCCTATTTTTGTAAACTGGAA TTAAAGGATAGTATTTTTATCCACAACCGGCTTGAAGATACCAATAATGGCCATTTGTACAAAAAAATGATG CCCTGCTCCAGGAGAATTC 〔式７〕（配列番号：１３） GAATTCAGGACTCTCAAAGCTCCACAATGGCGCCCAGCTCTCTCCTCAGCAACAGACTGAAGGCTTCGGCTA GTTTTGTGCGTCTACAAAGCTTTGAGCGGAATTTTAGCTTCGGCAAACAAGTCCCCCCAGCTCCTCCAGCTA ATTCCCGCGACTTCTCTCCAGACACCAGCTCCAGACAGTGACTGATGCCTCTCTGGTTGTGATTCCAGCGCA GAAACTCGAAGGAGCCCTTTGCCCGCCGTCCTATTTAGTCAACTCTTTCCTAGCCGCGA ATG ACC ATG TGT AGC GGA GCA AGG TTG GCC CTG TTG GTC TAC GGG ATA ATA ATG CAT AAC AGC GTC TCC TGT TCA CCT GCC GCC GGA CTC AGC TTC CCT GGG ATC AGA CCA GAA GAA GAG GCT TAC GAT CAG GAC GGA AAC CCG CTG CAA GAC TTC TAC GAC TGG GAC CCT CCG GGC GCA GGG AGC CCC GCC TCC GCG CTG CGT GAC GCC TAC GCC CTT TAC TAC CCA GCC GAC AGG AGA GAT GTC GCC CAC GAA ATC CTT AAC GAA GCC TAC CGC AAA GTC TTG GAC CAG CTG TCC GCC AGG AAG TAC CTG CAG TCC ATG GTG GCC AGG GGC ATG GGC GAG AAC CTC GCC GCC GCC GCG GTG GAC GAC CGG GCA CCC CTT ACC AAA CGC CAC TCG GAC GGC ATC TTC ACA GAC AGC TAT AGC CGC TAC CGA AAA CAA ATG GCT GTC AAG AAA TAC TTG GCG GCC GTG CTA GGG AAA AGG TAT AAA CAG AGG GTT AAA AAC AAA GGA CGC CGA ATA GCG TAC TTG TAG CGATGAGTTGCCAGCTACCGTGTGTATA AAATGAAAAGTCGTTTTCCAAATTGACTGACCAGTCATCACTCATGTGTTCTTTCCAAACATGTATTTATGT ATCAAGTAAAGCCATTAAATGACTATTTTGATAATAATATTGTTTTTCTTTTTACGAAGCACTGGAGAATGC ACAGATATACTTTGTGGACCAATTATTGATATATATTATAAGTATATATTAAGAATATATATAGGTATAGCA GAGAGCAATTCATAAGCGTGCACAAAGATTGAAAATTCGCCTGAGCTGTTTATGTTTTTATATAAAATGAAT AGAGAAAATAGACAACCATTGTTTTGAATATTACTCCTATTTTTGTAAACTGGAATTAAAGGATAGTATTTT TATCCACAACCGGCTTGAAGATACCAATAATGGCCATTTGTACAAAAAAATGATGCCCTGCTCCAGGAGAAT TC 本発明におけるラットＰＡＣＡＰ３８の前駆体として
は、〔式１２〕、〔式１３〕で表わされるものが挙げら
れる。〔式１２〕（配列番号：１４） Val Ala Arg Gly Met Gly Glu Asn Leu Ala Ala Ala Ala Val Asp Asp Arg Ala Pro Leu Thr Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile Ala Tyr Leu 〔式１３〕（配列番号：１５） Met Thr Met Cys Ser Gly Ala Arg Leu Ala Leu Leu Val Tyr Gly Ile Ile Met His Asn Ser Val Ser Cys Ser Pro Ala Ala Gly Leu Ser Phe Pro Gly Ile Arg Pro Glu Glu Glu Ala Tyr Asp Gln Asp Gly Asn Pro Leu Gln Asp Phe Tyr Asp Trp Asp Pro Pro Gly Ala Gly Ser Pro Ala Ser Ala Leu Arg Asp Ala Tyr Ala Leu Tyr Tyr Pro Ala Asp Arg Arg Asp Val Ala His Glu Ile Leu Asn Glu Ala Tyr Arg Lys Val Leu Asp Gln Leu Ser Ala Arg Lys Tyr Leu Gln Ser Met Val Ala Arg Gly Met Gly Glu Asn Leu Ala Ala Ala Ala Val Asp Asp Arg Ala Pro Leu Thr Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile Ala Tyr Leu 。

【００１１】本発明方法におけるＰＡＣＡＰ３８の前駆
体蛋白質、成熟ＰＡＣＡＰ３８や成熟ＰＡＣＡＰ２７を
コードする塩基配列を有するＤＮＡを含有する発現型ベ
クターは、例えば、（ｉ）ＰＡＣＡＰ蛋白質産生細胞か
らメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、（ii）
該ｍＲＮＡから単鎖の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、次い
で二重鎖ＤＮＡを合成し、（iii）該相補ＤＮＡをファ
ージまたはプラスミドに組み込み、（iv）得られた組み
換えファージまたはプラスミドで宿主を形質転換し、
（ｖ）得られた形質転換体を培養後、形質転換体から適
当な方法、例えばＰＡＣＡＰ蛋白質の一部をコードする
ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションにより、あ
るいは抗ＰＡＣＡＰ抗体を用いたイムノアッセイ法によ
り目的とするＤＮＡを含有するファージあるいはプラス
ミドを単離し、（vi）その組み換えＤＮＡから目的とす
るクローン化ＤＮＡを切り出し、（vii）該クローン化
ＤＮＡまたはその一部を発現ベクター中のプロモーター
の下流に連結する、ことにより製造することができる。
ＰＡＣＡＰ蛋白質をコードするｍＲＮＡは、種々のＰＡ
ＣＡＰ蛋白質産生細胞、例えばヒツジ視床下部、ヒト視
床下部、精巣あるいはラット視床下部、精巣などから得
ることができる。ＰＡＣＡＰ蛋白質産生細胞からＲＮＡ
を調製する方法としては、グアニジンチオシアネート法
〔(ジェー・エム・チルグウィン(J.M.，Chirgwin)ら、バ
イオケミストリー（Biochemistry),18,5294(1979)〕な
どが挙げられる。

【００１２】このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型と
し、逆転写酵素を用いて、例えば岡山(H.Okayama)らの
方法〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジ−
（Molecular and Cellular Biology）2,161(1982)およ
び同誌 3, 280(1983)〕に従いcＤＮＡを合成し、得られ
たcＤＮＡをプラスミドに組み込む。cＤＮＡを組み込む
プラスミドとしては、たとえば大腸菌由来のpＢＲ322
〔ジーン（gene)，2，95(1977)〕，pＢＲ325〔ジーン，
4，121(1978)〕，pＵＣ12〔ジーン，19，259(1982)〕，
pＵＣ13〔ジーン，19，259(1982)〕、枯草菌由来のpＵ
Ｂ110〔バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ
・コミュニケーョン(Biochemical and Biophysical Res
earch Communication)，112，678(1983)〕などが挙げ
られるが、その他のものであっても、宿主内で複製増殖
されるものであれば、いずれをも用いることができる。
またｃＤＮＡを組み込むファージベクターとしては、た
とえばλgt11〔ヤング及びデーヴィス(Young, R., and
Davis, R.,)プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユー・
エス・エー(Proc. Natl. Acad. Sci.,U.S.A.)，80，119
4(1983)〕などが挙げられるが、その他のものであって
も宿主内で増殖できるものであれば用いることができ
る。プラスミドに組み込む方法としては、たとえば、テ
ィー・マニアティス(T.Maniatis)ら，モレキュラー・ク
ローニング(Molecular Cloning) コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Labor
atory)，第239頁(1982)に記載の方法などが挙げられ
る。またファージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法と
しては、たとえばヒューン（Hyunh,T.V.)らの方法〔デ
ィー・エヌ・エークローニングアプラクティカルアプ
ローチ(DNA Cloning, A Practical Approach)１，49(19
85)〕などが挙げられる。

【００１３】このようにして得られたプラスミドは、適
当な宿主たとえばエシェリキア(Escherichia)属菌，バ
チルス(Bacillus)属菌などに導入する。上記エシェリキ
ア属菌の例としては、エシェリキア・コリ(Escherichia
coli)Ｋ12ＤＨ1〔プロシージング・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A.)60,160(1968)〕，Ｍ103〔ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ,(Nucleic Acids Research)，9，30
9(1981)〕,ＪＡ221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)，12
0，517(1978)〕，ＨＢ101〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー，41，459(1969)〕，Ｃ600〔ジェ
ネティックス(Genetics),39,440(1954)〕などが挙げら
れる。上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・
サチリス(Bacillus subtilis)ＭＩ114〔ジーン，24,25
5(1983)〕，207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー(Journal of Biochemistry)95，87(1984)〕など
が挙げられる。プラスミドで宿主を形質転換する方法と
しては、たとえばティー・マニアティス(T．Maniatis)
ら，モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning),
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold
Spring Harbor Laboratory)，第249頁(1982)に記載のカ
ルシウムクロライド法あるいはカルシウムクロライド／
ルビジウムクロライド法などが挙げられる。またファー
ジ・ベクターを用いる場合には、たとえば増殖させた大
腸菌にインビトロパッケージング法を用いて導入するこ
とができる。ヒツジ、ヒトあるいはラットの各ＰＡＣＡ
Ｐ蛋白質のｃＤＮＡを含有するヒツジ、ヒトあるいはラ
ットの各ｃＤＮＡライブラリーは上記の方法などで得る
ことが出来る。

【００１４】各ｃＤＮＡライブラリーからＰＡＣＡＰ蛋
白質のｃＤＮＡをクローニングする方法としては、例え
ばファージベクターλgt11と抗ＰＡＣＡＰ抗体を用いた
Huynhらの方法〔ディーエヌエークローニング、ア
プラクティカルアプローチ(DNA cloning, a practical
approach),p49(1985)〕あるいはＰＡＣＡＰ蛋白質のア
ミノ酸配列に基づいて化学合成したオリゴヌクレオチド
をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーショ
ンまたはプラークハイブリダイゼーション法〔ティー・
マニアティス(T.Maniatis)ら，モレキュラー・クローニ
ング(MolecularCloning) コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborator
y),(1982)〕などが挙げられる。このようにしてクロー
ン化されたＰＡＣＡＰ蛋白質のｃＤＮＡは必要があれば
プラスミド、例えばｐＢＲ322, ｐＵＣ12, ｐＵＣ13,
ｐＵＣ18, ｐＵＣ19, ｐＵＣ118，ｐＵＣ119などにサブ
クローニングしてもよい。このようにして得られたＤＮ
Ａの塩基配列を、たとえばマキサム・ギルバート(Maxam
-Gilbert)法〔Maxam, A. M. and Gilbert, w.,プロシー
ディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス・オブ・ザ・ユー・エス・エー(Proc. Nat
l. Acad. Sci.,U.S.A.),74,560(1977)〕あるいはジデオ
キシ法〔Messing, J. ら、ヌクレイック・アシッズ・リ
サーチ(Nucleic Acids Research)9,309(1981)〕によっ
て決定し、既知のアミノ酸配列との比較からＰＡＣＡＰ
蛋白質のｃＤＮＡの存在を確認する。

【００１５】以上のようにして、例えばヒツジＰＡＣＡ
Ｐ３８の前駆体蛋白質の一部をコードするｃＤＮＡ（式
２）が得られ、更に例えば図１に示すようなヒツジＰＡ
ＣＡＰ３８の前駆体の一部をコードするｃＤＮＡの制限
酵素断片地図を作成することができる。また例えば図２
に示すようにジデオキシ法を用いて該ｃＤＮＡの塩基配
列が決定され、その塩基配列からアミノ酸配列が判明す
る。上記のようにしてクローン化されたＰＡＣＡＰ３８
の前駆体（例えばヒツジＰＡＣＡＰ３８の前駆体）の一
部をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所
望により制限酵素で消化して使用することが出来る。ク
ローン化されたＤＮＡから発現させたい領域を切り出
し、発現に適したビークル（ベクター）中のプロモータ
ーの下流に連結して発現型ベクターを得ることができ
る。該ＤＮＡはその５’末端に翻訳開始コドンとしての
ＡＴＧを有し、また３’末端には翻訳終止コドンとして
のＴＡＡ，ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。こ
れらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成
ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。さら
に該ＤＮＡを発現させるにはその上流にプロモーターを
接続する。ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプラ
スミド（例、pＢＲ322，pＢＲ325，pＵＣ12，pＵＣ1
3)，枯草菌由来プラスミド(例、pＵＢ110，pＴＰ５，p
Ｃ194)，酵母由来プラスミド(例、pＳＨ19，pＳＨ15)，
あるいはλファージなどのバクテリオファージおよびレ
トロウィルス、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルス
などが挙げられる。

【００１６】本発明で用いられるプロモーターとして
は、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモ
ーターであればいかなるものでもよい。形質転換する際
の宿主がエシェリキア属菌である場合は、ｔｒｐプロモ
ーター，ｌａｃプロモーター，ｒｅｃＡプロモーター，
λＰＬプロモーター，ｌｐｐプロモーターなどが、宿主
がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター，
ＳＰＯ２プロモーター，ｐｅｎＰプロモーターなど、宿
主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター，ＰＧＫ
プロモーター，ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨプロモータ
ーなどが好ましい。とりわけ宿主がエシェリキア属菌で
プロモーターがｔｒｐプロモーターまたはλＰＬプロモ
ーターであることが好ましい。宿主が動物細胞である場
合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウィルス
のプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒー
トショックプロモーターなどがそれぞれ利用できる。な
お、発現にエンハンサーの利用も効果的である。

【００１７】このようにして構築されたＰＡＣＡＰ３８
前駆体蛋白質や成熟ＰＡＣＡＰ３８もしくはＰＡＣＡＰ
２７をコードするｃＤＮＡを含有するベクターを用い
て、形質転換体を製造する。宿主としては、たとえばエ
シェリキア属菌、バチルス属菌、酵母、動物細胞などが
挙げられる。上記エシェリキア属菌、バチルス属菌の具
体例としては、前記したものと同様のものが挙げられ
る。上記酵母としては、たとえばサッカロマイセスセ
レビシエ(Saccharomyces cerevisiae) ＡＨ２２, ＡＨ
２２Ｒ~，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄなどが挙げ
られる。動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯＳ−
７,Ｖｅｒｏ,チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，マウ
スＬ細胞，ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。

【００１８】上記エシェリキア属菌を形質転換するに
は、たとえばプロシージング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA),69,2110(1972)やジーン,17,107(1982)などに記載の
方法に従って行なわれる。

【００１９】バチルス属菌を形質転換するには、たとえ
ばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティック
ス(Molecular & General Genetics）,168,111(1979)な
どに記載の方法に従って行なわれる。酵母を形質転換す
るには、たとえばプロシージング・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.S
ci.USA),75,1929(1978)に記載の方法に従って行なわれ
る。動物細胞を形質転換するには、たとえばヴィロロジ
ー(Virology)52,456(1973)に記載の方法に従って行なわ
れる。このようにして、ＰＡＣＡＰ３８の前駆体蛋白質
の一部や成熟ＰＡＣＡＰ３８もしくはＰＡＣＡＰ２７を
コードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換
された形質転換体が得られる。

【００２０】宿主がエシェリキア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナト
リウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵
母、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。
培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェリキア属菌を
培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミ
ノ酸を含むＭ９培地〔ミラー(Miller),ジャーナル・オブ
・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティック
ス(Journal of Experiments in Molecular Genetics),4
31−433,Cold Spring Harbor Laboratory, New York 19
72〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率
よく働かせるために、たとえば３β−インドリルアク
リル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシ
ェリキア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３
〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えること
もできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３
０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や
撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換
体を培養する際、培地としては、たとえばバークホール
ダー(Burkholder)最小培地〔Bostian, K. L. ら、「プロ
シージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77,4505(1980)〕が
挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ま
しい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間
行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細
胞である形質転換体を培養する際、培地としては、たと
えば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイ
エンス（Science)122,501(1952)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴ
ィロロジー(Virology),8,396(1959)〕，ＲＰＭＩ１６４
０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカ
ル・アソシエーション（The Jounal of the American M
edical Association) 199,519(1967)〕,１９９培地〔プ
ロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バ
イオロジカル・メディスン（Proceeding of the Societ
y for the Biological Medicine)73, 1 (1950)〕などが
挙げられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養
は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要
に応じて通気や撹拌を加える。

【００２１】本発明の製造法においては、ＰＡＣＡＰ３
８の前駆体蛋白質や成熟ＰＡＣＡＰ３８もしくはＰＡＣ
ＡＰ２７はＣ端カルボキシル基における酸アミド体とし
て培養液中に生成してくる場合がある。特に宿主として
動物細胞を用いる場合には動物細胞中に含まれる酵素の
働きでグリシンを窒素源としてこのようなアミド化が起
こる場合が多い。またＰＡＣＡＰ３８ｃＤＮＡを用い
て上記の方法でＰＡＣＡＰ３８を製造する場合、宿主の
動物細胞中に含まれる酵素によってＰＡＣＡＰ前駆体蛋
白質から直接またはＰＡＣＡＰ前駆体からＰＡＣＡＰ３
８を経由してＰＡＣＡＰ２７が生成される場合もある。

【００２２】上記培養物からＰＡＣＡＰ３８の前駆体蛋
白質、成熟ＰＡＣＡＰ３８や成熟ＰＡＣＡＰ２７を分離
精製するには、例えば下記の方法により行なうことがで
きる。ＰＡＣＡＰ３８の前駆体蛋白質や成熟ＰＡＣＡＰ
３８もしくはＰＡＣＡＰ２７を培養菌体あるいは細胞か
ら抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体ある
いは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌
体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により
ＰＡＣＡＰ３８の前駆体蛋白質や成熟ＰＡＣＡＰ３８も
しくはＰＡＣＡＰ２７の粗抽出液を得る方法などが適宜
用いられ得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなど
の蛋白変性剤や、トリトンＸ−100などの界面活性剤が
含まれていてもよい。培養液中にＰＡＣＡＰ３８の前駆
体蛋白質や成熟ＰＡＣＡＰ３８もしくはＰＡＣＡＰ２７
が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方
法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集め
る。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液
中に含まれるＰＡＣＡＰ３８の前駆体蛋白質や成熟ＰＡ
ＣＡＰ３８もしくはＰＡＣＡＰ２７は、自体公知の分離
・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。こ
れらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法
などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲ
ルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオ
ン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方
法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親
和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー
などの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法な
どの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。かく
して生成するＰＡＣＡＰ３８の前駆体蛋白質や成熟ＰＡ
ＣＡＰ３８もしくはＰＡＣＡＰ２７は特異抗体を用いた
エンザイムイムノアッセイなどにより測定することがで
きる。また生成物に血圧降下作用がある場合は、該活性
を指標にして測定することもできる。ＰＡＣＡＰ蛋白質
が酸アミド体として生成してくる場合の生成物の分離精
製法や測定法は、上記した分離精製法や測定法をそのま
まあてはめることができる。

【００２３】

【効果】本発明に係る形質転換体の培養により、大量の
ＰＡＣＡＰ３８の前駆体蛋白質や、成熟ＰＡＣＡＰ３８
もしくはＰＡＣＡＰ２７を得ることが出来、これを実験
動物で使用することにより、その作用、特に脳の機能に
関する研究、特にホルモン類による脳機能の理解に応用
し、さらにこれらの知見はヒトの脳機能の解明に役立つ
知見をもたらすものである。そして、この成熟ＰＡＣＡ
Ｐ３８やＰＡＣＡＰ２７はｃＡＭＰの上昇活性があるこ
とから、ヒト、ラット脳神経の成長、維持等に関する情
報を得ることができ、またヒトの各種神経障害の治療薬
として利用することができる。ＰＡＣＡＰ３８前駆体蛋
白質は、これに対する抗血清の作成、あるいはＰＡＣＡ
Ｐの生成過程および生理活性の解明に有効な手段として
使用可能である。なお、後述の実施例１でのＣＨＯ細胞
でのＰＡＣＡＰ蛋白質の発現により、天然の分泌物との
混同を起こさずに該蛋白質の発現を確認できた。また後
述の実施例２ではＰＡＣＡＰ３８前駆体のシグナル配列
を除いた部分の発現を大腸菌で行なったが、疎水性（hy
drophobicity）の強いシグナル配列を除くことにより、
大腸菌内での蛋白質の合成抑制を回避でき効率よく発現
が行なわれた。

【００２４】本発明明細書および図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Commision on Biochemical Nomenclature による略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ−体を示すも
のとする。ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシンＲＮＡ：リボ核酸ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ：アデノシン三リン酸ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウムＢＨＡ：ベンツヒドリルアミンＣｌ−Ｚ：２-クロロ-ベンジルオキシカルボニルＢｒ−Ｚ：２-ブロモ-ベンジルオキシカルボニルＢｚｌ：ベンジルＯＢｚｌ：ベンジルエステルＨＯＢｔ：１−ベンゾトリアゾールＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’ジシクロヘキシルカルボジイミドＧｌｙまたはＧ：グリシンＡｌａまたはＡ：アラニンＶａｌまたはＶ：バリンＬｅｕまたはＬ：ロイシンＩｌｅまたはＩ：イソロイシンＳｅｒまたはＳ：セリンＴｈｒまたはＴ：スレオニンＣｙｓまたはＣ：システインＭｅｔまたはＭ：メチオニンＧｌｕまたはＥ：グルタミン酸ＡｓｐまたはＤ：アスパラギン酸ＬｙｓまたはＫ：リジンＡｒｇまたはＲ：アルギニンＨｉｓまたはＨ：ヒスチジンＰｈｅまたはＦ：フェニールアラニンＴｙｒまたはＹ：チロシンＴｒｐまたはＷ：トリプトファンＰｒｏまたはＰ：プロリンＡｓｎまたはＮ：アスパラギンＧｌｎまたはＱ：グルタミンなお、本発明のＰＡＣＡＰ３８の前駆体蛋白質や成熟Ｐ
ＡＣＡＰ３８もしくはＰＡＣＡＰ２７においては、その
アミノ酸配列の一部が修飾（付加、除去、その他のアミ
ノ酸への置換など）されていてもよい。

【００２５】

【実施例】以下の参考例および実施例により本発明をよ
り具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。後述の参考例２で得られた形質転換体エシ
ェリキア・コリ(Escherichia coli)ＤＨ５α/ｐＯＨ38Ｐ
７は平成１年６月19日に通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所(ＦＲＩ)に受託番号ＦＥＲＭＢＰ-2484と
して寄託され、また該微生物は平成１年６月15日から財
団法人発酵研究所(ＩＦＯ)に受託番号ＩＦＯ 14884とし
て寄託されている。後述の参考例３で得られた形質転換
体エシェリキアコリ（Escherichia coli)ＤＨ５α／
ｐＨＴ３８Ｐ８は平成１年１０月４日に通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥ
ＲＭＢＰ−２６２２として寄託され、また該微生物は
平成１年９月２８日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）
に受託番号ＩＦＯ１４９５３として寄託されている。
後述の参考例４で得られた形質転換体エシェリキアコ
リ（Escherichia coli)ＪＭ109／ｐＲＢ３８Ｐ21は平成
２年２月１９日に通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−２７６２
として寄託されている。後述の実施例１で得られた形質
転換体エシェリヒアコリ（Escherichia coli)ＤＨ５
／ｐＴＳ７０５は平成２年１１月２日に通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥ
ＲＭＢＰ−３１５１として寄託され、また該微生物は
平成２年１１月６日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）
に受託番号ＩＦＯ１５１０５として寄託されている。
後述の実施例２で得られた形質転換体エシェリヒアコ
リ（Escherichia coli)Ｎ４８３０／ｐＴＳ２０１は平
成２年１１月２日に通商産業省工業技術院微生物工業技
術研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−３１５
２として寄託され、また該微生物は平成２年１１月６日
から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ
１５１０６として寄託されている。

【００２６】

【参考例１】ヒツジＰＡＣＡＰ３８の一部をコードす
るＤＮＡプローブの作製ヒツジＰＡＣＡＰ３８の１〜２７残基目のアミノ酸配列 His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu から予想されるメッセンジャーＲＮＡの配列を推定し、
次のような配列を持つ、ＤＮＡプローブを化学合成し
た。５′−ＣＡＣＴＣＴＧＡＴＧＧＡＡＴＣＴＴＣＡＣＡＧ
ＡＴＡＧＣＴＡＣＡＧＣＣＧＣＴＡＴＡＧＡＡＡＧＣＡ
ＡＡＴＧ−３′（配列番号：１６）および３′−ＴＣＧ
ＧＣＧＡＴＡＴＣＴＴＴＣＧＴＴＴＡＣＣＧＡＣＡＣＴ
ＴＣＴＴＴＡＴＧＡＡＣＣＧＧＣＧＧＣＡＡＧＡＴ−
５′（配列番号：１７）このＤＮＡプローブの５′端をＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いて³²Ｐ−りん酸化し、ｃＤＮＡライブラリ
のスクリーニングに用いた。

【００２７】

【参考例２】ヒツジＰＡＣＡＰ３８前駆体ｃＤＮＡの
単離とその塩基配列の決定大腸菌Ｙ1090に前述のヒツジ視床下部ｃＤＮＡライブラ
リー(Clontech Laboratories, Inc. 製)を感染させてプ
レーティングし、ファージプラークを出現せしめた。ベ
ントンとデイビス(Benton, W., Davis, R.)の報告〔サ
イエンス(Science) 196, 180-182(1977)〕に従ってプラ
ークＤＮＡの一部をニトロセルロース膜にうつしとり、
³²Ｐで標識した前項のＤＮＡプローブとプラークハイブ
リダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション
は、ホルムアミド非存在下、60℃で行なった。ハイブリ
ダイゼーション陽性の５個のクローンをそれぞれ単離
し、そのうちのひとつであるλＯＨ３８Ｐ７のｃＤＮＡ
部分をＥcoＲＩで切り出してプラスミドｐＵＣ 118のＥ
coＲＩ部位にリクローニングし、プラスミドp ＯＨ３８
Ｐ７を作製した。このプラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形
質転換し、形質転換体エシェリキア・コリＤＨ５α／p
ＯＨ３８Ｐ７を得た。このプラスミドに含まれるｃＤＮ
Ａ部分は 1.8Ｋbpであり、その簡単な制限酵素地図を図
１に示した。図中の黒く塗りつぶした区域はヒツジＰＡ
ＣＡＰ３８成熟体コード域を示す。このｃＤＮＡ部分の
塩基配列をサンガー（Sanger）の方法〔プロシージング
オブザナショナルアカデミーオブサイエンス（ Pr
oc.Nat.Acad.Sci.USA）74,5463-5467（1977）〕によっ
て決定した。この塩基配列、およびそれより推定される
ヒツジＰＡＣＡＰ３８前駆体のアミノ酸配列の一部を図
２に示した。枠で囲った領域が、ヒツジＰＡＣＡＰ３８
成熟蛋白質に相当する部分である。

【００２８】

【参考例３】ヒトＰＡＣＡＰ３８前駆体ｃＤＮＡの単
離とその塩基配列の決定大腸菌Ｙ1090に前述のヒト精巣ｃＤＮＡライブラリー(C
lontech Laboratories, Inc. 製)を感染させてプレーテ
ィングし、ファージプラークを出現せしめた。ベントン
とデイビス(Benton, W., Davis, R.)の報告〔サイエン
ス(Science) 196, 180-182(1977)〕に従ってプラークＤ
ＮＡの一部をニトロセルロース膜にうつしとり、³²Ｐで
標識した前項のＤＮＡプローブとプラークハイブリダイ
ゼーションを行なった。ハイブリダイゼーションは、ホ
ルムアミド非存在下、50℃で行なった。ハイブリダイゼ
ーション陽性の５個のクローンをそれぞれ単離し、その
うちのひとつであるλＨＴ３８Ｐ８のｃＤＮＡ部分をＥ
coＲＩで切り出してプラスミドｐＵＣ 118のＥcoＲＩ部
位にリクローニングし、プラスミドp ＨＴ３８Ｐ８を作
製した。このプラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換
し、形質転換体エシェリキア・コリＤＨ５α／p ＨＴ３
８Ｐ８を得た。このプラスミドに含まれるｃＤＮＡ部分
は 2.0Ｋbpであり、その簡単な制限酵素地図を図３に示
した。図中の黒く塗りつぶした区域はヒトＰＡＣＡＰ３
８成熟体コード域を示す。このｃＤＮＡ部分の塩基配列
をサンガー（Sanger）の方法〔プロシージングオブザ
ナショナルアカデミーオブサイエンス（ Proc.Nat.A
cad.Sci.USA）74,5463-5467（1977）〕によって決定し
た。この塩基配列、およびそれより推定されるヒトＰＡ
ＣＡＰ３８前駆体のアミノ酸配列の一部を図４に示し
た。枠で囲った領域が、ヒトＰＡＣＡＰ３８成熟蛋白質
に相当する部分である。

【００２９】

【参考例４】ラットＰＡＣＡＰ３８前駆体ｃＤＮＡの
単離とその塩基配列の決定大腸菌Ｙ1090に前述のラット脳ｃＤＮＡライブラリー(C
lontech Laboratories, Inc. 製)を感染させてプレーテ
ィングし、ファージプラークを出現せしめた。ベントン
とデイビス(Benton, W., Davis, R.)の報告〔サイエン
ス(Science) 196, 180-182(1977)〕に従ってプラークＤ
ＮＡの一部をニトロセルロース膜にうつしとり、³²Ｐで
標識した前項のＤＮＡプローブとプラークハイブリダイ
ゼーションを行なった。ハイブリダイゼーションは、ホ
ルムアミド非存在下、60℃で行なった。ハイブリダイゼ
ーション陽性の４個のクローンをそれぞれ単離し、その
うちのひとつであるλＲＢ３８Ｐ６８のｃＤＮＡ部分を
ＥcoＲＩで切り出してプラスミドｐＵＣ 118のＥcoＲＩ
部位にリクローニングし、プラスミドp ＲＢ３８Ｐ２１
を作製した。このプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質
転換し、形質転換体エシェリキア・コリＪＭ１０９／p
ＲＢ３８Ｐ２１を得た。このプラスミドに含まれるｃＤ
ＮＡ部分は 1.2Ｋbpであり、その簡単な制限酵素地図を
図５に示した。図中の黒く塗りつぶした区域はラットＰ
ＡＣＡＰ３８成熟体コード域を示す。このｃＤＮＡ部分
の塩基配列をサンガー（Sanger）の方法〔プロシージン
グオブザナショナルアカデミーオブサイエンス（
Proc.Nat.Acad.Sci.USA）74,5463-5467（1977）〕によ
って決定した。この塩基配列、およびそれより推定され
るラットＰＡＣＡＰ３８前駆体のアミノ酸配列を図６に
示した。枠で囲った領域が、ラットＰＡＣＡＰ３８成熟
蛋白質に相当する部分である。

【００３０】

【実施例１】形質転換動物細胞によるヒト成熟ＰＡＣ
ＡＰの製造ＰＡＣＡＰは視床下部で産生されていることは明白であ
る。脳細胞で分泌発現させることを第一義的に考える
が、脳細胞は他の脳ホルモンを分泌産生している例が多
く、これらとの混乱を避けるために、ＣＨＯ細胞を宿主
細胞に選択して発現を行なった。ｉ）発現プラスミドの構築参考例３で得られたヒトＰＡＣＡＰのｃＤＮＡを保持す
るプラスミドｐＨＴ３８Ｐ８から1.4ｋbのＰＡＣＡＰ前
駆体をコードするＤＮＡ断片を切り出し、第７図に示し
たようにＴ４ポリメラーゼ処理した後、ＢｇｌIIリン
カーｄ(ｐＣＡＧＡＴＣＴＧ）を結合した。このＤＮＡ
断片をＳＶ４０のプロモーターと polyＡ付加シグナル
を持つプラスミドｐＴＢ５５１のＢｇｌII部位に組み込
み、形質転換体エシェリヒア・コリＤＨ５／ｐＴＳ７０
５を得た（図７）。 ii）ＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質転換チャイニーズハムスター卵巣細胞（Chinese Hamster Dv
ary cell,CHO-K1)に精製した、上記ｉ）で得られた形質
転換体から常法により得られたＰＡＣＡＰ発現用プラス
ミドｐＴＳ７０５と、ネオマイシン耐性遺伝子を持つプ
ラスミドｐＳＶ２-neoを１μgをリン酸カルシウム法で
ＣＨＯ細胞にかけ、Dulbecco's mininumessential medi
um(Ｄ−ＭＥＭ）に200μg／ｍlのＧ４１８を含む培地で
培養し、生き残ってくる細胞を培養し選択した。その細
胞株を図８に示した。22株の、Ｇ４１８に耐性のＣＨＯ
細胞を培養し、その培養上清中のＰＡＣＡＰをエンザイ
ムイムノアッセイで測定した結果、クローン番号５、１
４などが免疫反応性のＰＡＣＡＰを産生していることが
明らかにされた。 iii）ＰＡＣＡＰの経時的な産生 0.5×10⁵個／ｍlの、上記のクローン５に相当するＣＨ
Ｏ−ｔｆ７０５．５細胞を５cmのファルコンシャーレで
培養し、経時的に細胞の増殖とその上清中のＰＡＣＡＰ
の量を測定した（図９）。ＰＡＣＡＰ測定用のＥＩＡで
検出される物は、細胞培養開始後３日にプラトーに達
し、後に減少する傾向が認められた。コントロールのＣ
ＨＯ細胞の培養上清中にはＰＡＣＡＰのＥＩＡで検出さ
れる物は存在していない。 iv）ＣＨＯ−ｔｆ７０５．５細胞が分泌するＥＩＡ陽性
の物質の性状ＣＨＯ−ｔｆ７０５．５細胞を培養開始して３日目に血
清を含まない培養液に交換して培養を続け、その培養液
をＥＩＡで測定すると、図１０に示す分泌様式を呈し
た。この無血清培地にしてから１日後の培養液を集め、
濃縮した後、逆相のＨＰＬＣ分析を行った。標品として
化学合成したＰＡＣＡＰ３８ＮＨ₂（ＰＡＣＡＰ３８の
Ｃ端カルボキシル基における酸アミド）とＰＡＣＡＰ２
７ＮＨ₂（ＰＡＣＡＰ２７のＣ端カルボキシル基におけ
る酸アミド）の溶出位置を予め決定しておき、この条件
下に上記濃縮試料を分析すると、培養開始３日目の試
料、図１１ａ）はＰＡＣＡＰ３８ＮＨ₂が大部分であ
り、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ₂はその何分の１か存在する。
無血清の培地を交換して0.5〜１日の試料にはＰＡＣＡ
Ｐ３８ＮＨ₂の他にＰＡＣＡＰ２７ＮＨ₂に相当する位置
にＥＩＡの活性のピークが認められた（分析番号が7、8
がそれぞれＰＡＣＡＰ３８ＮＨ₂、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ₂
の溶出位置を示す）。

【００３１】ｖ）ＣＨＯ−ｔｆ７０５.５細胞のpolyＡ+
ＲＮＡの性状ＣＨＯ−ｔｆ７０５.５細胞から全ＲＮＡをグアニジン
・チオシアネート法で析出し、オリゴｄＴセルロースに
よってpolyＡ+ ＲＮＡを分離した。５〜10μｇのpolyＡ
+ ＲＮＡを１％のアガロースゲル電気泳動にかけ、ニト
ロセルロースフィルターに transfer した後、50％のホ
ルムアミドを含む Hybrdization buffer (Maniatis et
al.) 中で、ヒトＰＡＣＡＰのＤＮＡフラグメントを³²
Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしたプローブとハイブリダイゼー
ションを42℃で行い、0.2×ＳＳＣ 0.1％ＳＤＳ buffer
で洗浄した後、オートラジオグラフを取った。図１２
に示すとおり、ＡのＣＨＯ−ｔｆ７０５.５細胞につい
ては1.5ｋｂの位置にバンドが認められ、ＢのＣＨＯ−
Ｋ１細胞（コントロール）については何らバンドがみと
められなかった。この結果から、ＣＨＯ−ｔｆ７０５.
５細胞には、ノーザンブロット解析により、ヒトＰＣＡ
ＣＰをハイブリダイズするＲＮＡが合成されていること
が証明された。

【００３２】

【実施例２】形質転換大腸菌によるヒトＰＡＣＡＰ前
駆体の製造ヒトＰＣＡＣＰの前駆体の１つが176個のアミノ酸から
なることは証明されている（特願平２−３９８４１
号）。この前駆体は24個のアミノ酸からなるシグナル配
列を有するのでこの部分を除いた152個の前駆体を大腸
菌で発現させ、前駆体の性状研究、あるいはそれに対す
る抗体作成の目的で発現を行った。シグナル配列は疎水
性（Hydrophobicity）が強く、大腸菌内での蛋白の合成
が抑制されることは、他の例で経験済みであるので、こ
の点に着目し、効率よく発現するように検討を加えた。ｉ）発現プラスミドの構築（イ）ｐＨＴ３８Ｐ８のＰＡＣＡＰ前駆体をコードする
領域のストップコドンから６塩基目のＢｓｔＥII部分
をＢｇｌII認識部位に変換したプラスミドから、ＰＡＣ
ＡＰ前駆体をコードするＨｉｎｆＩ断片を切り出し、
これに５’端ＥｃｏＲＩ，ＡＴＧを３’端にＨｉｎｆ
Ｉの認識部位を持った合成アダプター 5'AATTCATGTCACCTGCCGCCGCCGG 3'（配列番号：１８） GTACAGTGGACGGCGGCGGCCTGAG（配列番号：１９）を結合した後ＥｃｏＲＩ，ＢｇｌIIで処理した。このＥ
ｃｏＲＩ，ＢｇｌII ＤＮＡ断片をλＰＬプロモータを
持つプラスミドｐＴＢ２８１のＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ
部分に組み込み、大腸菌Ｎ４８３０を形質転換した。プ
ラスミド名をｐＴＳ２０１とした(図１３)。 (ロ）Ｔ７プロモーターの下流に同じく、ヒトＰＡＣＡ
Ｐの24個のリーダー配列を除く、前駆体部分をコードす
るｃＤＮＡ断片を図１４に従って、プラスミドｐＴＳ４
０１を構築した。 ii）大腸菌でのヒトＰＡＣＡＰ前駆体の発現物の同定ｉ）の（ィ）で構築したプラスミドを持つ形質転換体
28℃下に10ｍｌのｐＴＳ２０１／Ｅ．coli Ｎ４８３０
をＬＢ培地（Ampicillin を50μg／ｍl含む）で培養
し、Klett値が0.25まで菌体が増殖した時、42℃に温度
を上げてさらに90分培養を続けた後、3,000回転15分の
遠心で集菌した。28℃で培養した菌体をコントロールと
して集菌した。菌体に１ｍlの２×の Laemmli のＳＤ
Ｓ、ＭＥ含有 Sample buffer に溶解し、100℃で10分間
沸騰（boil）させた。12,000rpm、５分間の遠心上清を
とり、17％のポリアクリルアミドゲル電気泳動を行っ
た。Western blotting 法により、ニトロセルロースフ
ィルターに蛋白を電気的に移し、抗ＰＡＣＡＰマウスモ
ノクローナル抗体を反応させた後、二次抗体（抗マウス
ＩｇＧ−110−パーオキシダーゼ）を反応させた。コニ
カイムノスティニングキットにより目的とする蛋白バン
ドを発色、固定した。抗ＰＡＣＡＰ抗体を反応するバン
ドは分子量が約16,000ダルトン付近に確認された。この
シグナルペプチドを除いたＰＡＣＡＰ前駆体のＭｅｔ付
きの分子量は16,320ダルトンである。図１４の通り構築
したプラスミドｐＴＳ４０１で形質転換した大腸菌を培
養し、ＩＰＴＧで誘導した後、集菌し、前述の通り Wes
tern blotting を行い、抗ＰＡＣＡＰ抗体と反応するバ
ンドを検出した。分子量は約16,000であり、該プラスミ
ドにより発現される物質は同一であった。

【００３３】iii）大腸菌で発現させたヒトＰＡＣＡ
Ｐ前駆体の精製と性状ヒトＰＡＣＡＰ前駆体のシグナルペプチドを除いて、あ
らたにＮ末端にＭｅｔを付したプロ体をコードするｃＤ
ＮＡ断片（約４７０ｂｐ）を、一部化学合成により調製
した。これをバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼが認識するφ１０プロモーターを持つ発現用プラス
ミドｐＥＴ−３ｃのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入
した。このプラスミド（ｐＴＳ４０１）で形質転換した
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、終濃度０．４ｍＭのＩＰ
ＴＧを添加してから３時間３７℃で培養後集菌した。凍
結保存した菌体２０ｇを５倍容の５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ６．５）（ＥＤＴＡ，ＡＰＭＳＦ，ａｎｔｉ
ｐａｉｎ，ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，ｐｅｐｓｔａｔｉ
ｎを含む）に懸濁し、超音波破砕後１００，０００ｇで
９０分間遠心し、上清の粗抽出液を得た。この上清を、
抗ＰＡＣＡＰマウスモノクローナル抗体ＰＡ−１Ｎを固
定化したカラム（ベッド体積２０ｍｌ）に吸着し、ＰＢ
Ｓ 100ｍｌで洗浄後、６０ｍｌの５０ｍＭグリシン−塩
酸（ｐＨ2.0，0.5ＭＮａＣｌを含む）によって溶出し
た。溶出液に６ｍｌの１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．５）を加え、限外濾過により濃縮後、ＴＳＫ−ｇｅ
ｌＯＤＳ−８０ＴＭカラム（4.6×250ｍｍ）に付し
た。溶出は０から６０％のアセトニトリルを含む0.05％
トリフルオロ酢酸の直線型濃度勾配溶出で行った（流速
１ｍｌ／分）。４０−４３％アセトニトリルで溶出す
る標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１６％ゲル）で分析すると
（Coomassie 染色）、約１９ｋＤの位置に単一のバンド
を与えた。本標品はウェスタンブロッティング法にて
抗ＰＡＣＡＰマウスモノクローナル抗体と反応した。ま
た予想されるヒトＰＡＣＡＰプロ体のＮ末端のアミノ酸
配列（ＭＳＰＡＡＡＧＬＲＦＰＧＩＲ）が確認された
が、一部そのＮ端２残基が欠落した前駆体（ＰＡＡＡＧ
ＬＲＦＰＧＩＲＰＥ）も混在していることが明らかにな
った。

【００３４】

【００３５】

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：38 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys 20 25 30 Gln Arg Val Lys Asn Lys 35。

【００３６】配列番号：2 配列の長さ：27 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu 20 25 。

【００３７】配列番号：３配列の長さ：４４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg 1 5 10 15 Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg 20 25 30 Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile 35 40。

【００３８】配列番号：4 配列の長さ：159 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 CAC TCG GAC GGC ATC TTC ACT GAC AGC TAC AGC CGC TAC CGG AAG CAA 48 ATG GCT GTT AAG AAA TAC TTG GCG GCT GTC CTA GGG AAA AGG TAT AAA 96 CAA AGG GTT AAG AAC AAA GGA CGG CGA ATA CCG TAC TTG TAG CGA CGA 144 GTT ACC AGC TAT CCT 159。

【００３９】配列番号：5 配列の長さ：1763 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 CTGCTAACTG CCCAGATAAA TAGGAGCAGA GGGCTGGTCA CCTCTGTAAT AACCACCGGC 60 AGCAGTAGAA GAAACCGCAG CTTCAGAAGC AGCCAGAGAG ACTTCTGAGC AGCGAAGGCG 120 CTGCCTGCTC GAGCTGCCTG GCCGGGCGGC TGCCCCAGAC GCCGACTTCG CCGAGGCCCT 180 CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTGCTTCT TTCCTTATCA 240 CTCCTTTCTT CTCAGTGGAC TTCAGGCCAC TTTGTCTCCC ACCCCCACTC AGCTCGTCGC 300 CTCCTCCGTC TTCCTTCTCC ATCTCTCCTC TCGCCCCCCT TCTCTCAGTG TCACGCTCCG 360 TCCTAGTTCC GAGCGTCGTC AAACTTTTGA ACAGAATAAC AGGACTCAGC AAACAAGTCC 420 TCCAGCTCCT CCCGCGGCTC CGGCTCGTTC CTGCGGCTCC TGCTCAGACA CTAACGCCAG 480 ACGGCGATGC CTCTTGGGTT GTGACTACAG CGCACAAACT TGGAGAAGCT CTTTGCCCGC 540 CGTCCTACTT GGCAGCAAAT CCTCTCCTGG CAGCGA ATG ACC ATG TGT AGC GGA 594 GCG AGG CTG GCC CTG CTC GTT TAC GGG ATA CTG ATG CAC AGC AGC GTC 642 TAC GGC TCA CCT GCC GCC TCC GGA CTC CGG TTC CCG GGG ATC AGG CCG 690 GAG AAC GAG GCG TAC GAC GAG GAC GGA AAC CCG CAG CAG GAC TTC TAC 738 GAC TCG GAG CCG CCA GGC GTG GGG AGC CCC GCC TCC GCG CTG CGC GAT 786 GCC TAC GCG CTC TAC TAC CCG GCG GAG GAA AGA GAT GTC GCC CAC GGG 834 ATC CTT GAT AAG GCC TAC CGC AAA GTG CTG GAC CAG CTG TCC GCC AGG 882 AGA TAC CTG CAG ACG CTC ATG GCC AAG GGC TTG GGT GGG ACC CCG GGC 930 GGC GGC GCG GAC GAC GAC TCG GAG CCG CTC TCC AAG CGC CAC TCG GAC 978 GGC ATC TTC ACT GAC AGC TAC AGC CGC TAC CGG AAG CAA ATG GCT GTT 1026 AAG AAA TAC TTG GCG GCT GTC CTA GGG AAA AGG TAT AAA CAA AGG GTT 1074 AAG AAC AAA GGA CGG CGA ATA CCG TAC TTG TAG CGACGAGTTA CCAGCTATCC 1127 TGTGTATACA GCCCTGACAC AATGAGAAGT CGTTTTTCCC AACTGACTGA ACTGTCATCG 1187 CTGCTGTGTT CTGTCCCACA TGTATTTATG TATGAAGTCA AGCCATTAAA TGAATATTTT 1247 GATAATAATA TTGTTTTTCT TTTTACGAAG CACTGGAGAA TGCACAGATA TACTTTGTGG 1307 ACCAATTATT GATATTGACA TATATATTAC GAATATATAA AGAGTATATA TATATATATA 1367 TAAGTATAAT AGAGAGCCGT TCATACAGTG TGCACAAGGA CTGAAGATTC GCCTGAGCTG 1427 TTTGTTTTTA TATAAAATAA ATAGAAAAAT AGACAATCAT TGTTTTGAAT ATTACTCCTA 1487 TTTTTGTAAA CTGGAATTAA AAGGATAGTA TTTTTATCCA CAATAGGCCT GAAGATATTA 1547 ATCCTGACCA TTTGCTACTG TACATAAACA GTGATGCCCT GCTCCAGGGA GACTTTGAGG 1607 TAATGATTTG GGAGGATTGC TGAAGGTCTC TCTTTCCCAG GGAGTCTCTG GGGCAGGCTG 1667 CTTCAATCCC AGCTGAACTC GACTGAGGCT CTGTCTACCC CTTGCTGGGT GGCAATGCCA 1727 ATACTTCCGC TTTCTTTGAT TCTATTTTTA TGTGTA 1763。

【００４０】配列番号：6 配列の長さ：68 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Ala Lys Gly Leu Gly Gly Thr Pro Gly Gly Gly Ala Asp Asp Asp 1 5 10 15 Ser Glu Pro Leu Ser Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala 35 40 45 Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg 50 55 60 Ile Pro Tyr Leu 65。

【００４１】配列番号：7 配列の長さ：176 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Thr Met Cys Ser Gly Ala Arg Leu Ala Leu Leu Val Tyr Gly Ile 1 5 10 15 Leu Met His Ser Ser Val Tyr Gly Ser Pro Ala Ala Ser Gly Leu Arg 20 25 30 Phe Pro Gly Ile Arg Pro Glu Asn Glu Ala Tyr Asp Glu Asp Gly Asn 35 40 45 Pro Gln Gln Asp Phe Tyr Asp Ser Glu Pro Pro Gly Val Gly Ser Pro 50 55 60 Ala Ser Ala Leu Arg Asp Ala Tyr Ala Leu Tyr Tyr Pro Ala Glu Glu 65 70 75 80 Arg Asp Val Ala His Gly Ile Leu Asp Lys Ala Tyr Arg Lys Val Leu 85 90 95 Asp Gln Leu Ser Ala Arg Arg Tyr Leu Gln Thr Leu Met Ala Lys Gly 100 105 110 Leu Gly Gly Thr Pro Gly Gly Gly Ala Asp Asp Asp Ser Glu Pro Leu 115 120 125 Ser Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr 130 135 140 Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys 145 150 155 160 Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile Pro Tyr Leu 165 170 175。

【００４２】配列番号：8 配列の長さ：167 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列ＣＡＣＴＣＧＧＡＣＧＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧＧＡＣＡＧＣ
ＴＡＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＧＧＡＡＡＣＡＡ 48 ATG GCT GTC AAG AAG TAC TTG GCG GCC GTC CTA GGG AAG AGG TAT AAA 96 CAA AGG GTT AAA AAC AAA GGA CGC CGA ATA GCT TAT TTG TAG CGA TGG 144 GTT ACC AGC TAC CCT GTG TAT AC 167。

【００４３】配列番号：9 配列の長さ：1940 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA A ATG ACC ATG TGT AGC GGA GCG AGG CTG GCC CTG CTG GTC TAT GGG 46 ATA ATC ATG CAC AGC AGC GTC TAC AGC TCA CCT GCC GCC GCC GGA CTC 94 CGG TTC CCC GGG ATC AGG CCA GAG GAA GAG GCG TAC GGC GAG GAC GGA 142 AAC CCG CTG CCA GAC TTC GGT GGC TCG GAG CCG CCG GGC GCA GGG AGC 190 CCC GCC TCC GCG CCG CGC GCC GCC GCC GCC TGG TAC CGC CCG GCC GGG 238 AGA AGA GAT GTC GCC CAC GGG ATC CTT AAC GAG GCC TAC CGC AAA GTG 286 CTG GAC CAG CTG TCC GCC GGG AAG CAC CTG CAG TCG CTC GTG GCC CGG 334 GGC GTG GGT GGG AGC CTC GGC GGC GGC GCG GGG GAC GAC GCG GAG CCG 382 CTC TCC AAG CGC CAC TCG GAC GGG ATC TTC ACG GAC AGC TAC AGC CGC 430 TAC CGG AAA CAA ATG GCT GTC AAG AAG TAC TTG GCG GCC GTC CTA GGG 478 AAG AGG TAT AAA CAA AGG GTT AAA AAC AAA GGA CGC CGA ATA GCT TAT 526 TTG TAGCGATGGG TTACCAGCTA CCCTGTGTAT ACAGCCCTGA CGCAATGAAA 579 AGTCGTTTTC CAAACTGACT CAACAGTCAT CGCTCGTGTG TTCTATCCAA ACATGTATTT 639 ATGTAATGAA GTAAAGCCAT TAAATGAATA TTTTGATAAT AATATTGTTT TTCTTTCTAC 699 AAAGCACTAG AGAATGCACA GATATACTTT GTGGACCAAT TATTGATATA TATTATAAAT 759 ATATATAAAG AATATATATA TATATATATA TATAAAGTAT AGAGAGAAGT TCATACAAAG 819 CGTGCACAAG GATTGAAAAT TCGCCCGAGC TGTTTATGTT TTTATAAAAA TAAATAGAAA 879 AGTAGACAAT CATTGTTTTG AATATTACTC CTATTTTTGT AAACTGGAAT TAAAAGGATA 939 GTATTTTTAT CCATGACAGG CCTGAAGATA TTACTACTTA CCATTTGCTA CTGTACATAA 999 ACAATGATGC CCTGCTCCAG GGAGATTTTG AGGTAAAGAT ATGGAGAATT GCTGAAGGGC 1059 ATTCTTTCCC AGTGAGTCTC TGGGGCAGGC TGCTTCAATC CCAGCCTAAC TCAACTGGGC 1119 TCTGTCCCCC TGGTTGGGTG GCAATTCCAA TATTTCTGCT TTCTTTGATT CTCCTTTTAT 1179 GTGTAGTTGT CTCTCTTCAG ACTCTCAGCC CAGAAGAAAA TTCTCCTGAT AAAACAACAG 1239 CTCGATCCAA ATTGTGCTTC TCCCCAGAAT TCACGCCTCT CCCTAGGAGA AGAGTTGAGG 1299 AACTGTACAG AAAAGGGCGG CTTCGTTAGA CCGCTCTCTT TTCTGTACTT CCTGAGTGGC 1359 CAGGGAATCT AATATCCCCA AATTAGGGCA ATTGGAACAA AGTGAAGGAC ATAGAGGTAT 1419 ATTGGAAGAG GCAGAGCCTG AGGTGGTAGG AGGAGGACCC TGGAAATGGA CTGGTTTGAG 1479 ATTGCCCCAG GTCTGGGAAG CTGAGGGCAA ATCCAGTCCC AGTGGTCCTG ACTTTGGGCG 1539 CTGGGTATTG GAAATGGATG CAAAGTACAA TGTGTTTTTC TCCAGTGCTG TCCATGCTTC 1599 TCATCTTGTG AAATGGCCAG GATCCTCTCC TTTGAAACCT GCTCTGTAGG AGCTACCCTT 1659 TTCCTTTGTG GTTTTATGGA GACCTCTCCT TCCTACCCTC CTGCACTGTT TAAGTACTGT 1719 TTACCATTTT TCATTCACTT CTCTTAAACT TGTGAATGCT TCTCACTTTT TTTTTTTGTT 1779 TGATGCAGGC ACTTATTGTA AATTTTAGAA ACCCCTCTGT AGCCACTAGT AAGTAATTAT 1839 GCACTAAATA TGAACCCTTT GTTTCTTGTT TATTGAGTTT GTAGGTAAAA TGTATTTTTC 1899 TACATTATTG CTTATTGCTT AGTAAAATTT ATTTCATAAA A 1940。

【００４４】配列番号：10 配列の長さ：63 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ala Gly Asp Asp Ala Glu Pro Leu Ser 1 5 10 15 Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg 20 25 30 Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg 35 40 45 Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile Ala Tyr Leu 50 55 60。

【００４５】配列番号：11 配列の長さ：176 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Thr Met Cys Ser Gly Ala Arg Leu Ala Leu Leu Val Tyr Gly Ile 1 5 10 15 Ile Met His Ser Ser Val Tyr Ser Ser Pro Ala Ala Ala Gly Leu Arg 20 25 30 Phe Pro Gly Ile Arg Pro Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Glu Asp Gly Asn 35 40 45 Pro Leu Pro Asp Phe Gly Gly Ser Glu Pro Pro Gly Ala Gly Ser Pro 50 55 60 Ala Ser Ala Pro Arg Ala Ala Ala Ala Trp Tyr Arg Pro Ala Gly Arg 65 70 75 80 Arg Asp Val Ala His Gly Ile Leu Asn Glu Ala Tyr Arg Lys Val Leu 85 90 95 Asp Gln Leu Ser Ala Gly Lys His Leu Gln Ser Leu Val Ala Arg Gly 100 105 110 Val Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ala Gly Asp Asp Ala Glu Pro Leu 115 120 125 Ser Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr 130 135 140 Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys 145 150 155 160 Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile Ala Tyr Leu 165 170 175。

【００４６】配列番号：12 配列の長さ：600 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 CAC TCG GAC GGC ATC TTC ACA GAC AGC TAT AGC CGC TAC CGA AAA CAA 48 ATG GCT GTC AAG AAA TAC TTG GCG GCC GTG CTA GGG AAA AGG TAT AAA 96 CAG AGG GTT AAA AAC AAA GGA CGC CGA ATA GCG TAC TTG TAG CGATGAGTTG 148 CCAGCTACCG TGTGTATAAA ATGAAAAGTC GTTTTCCAAA TTGACTGACC AGTCATCACT 208 CATGTGTTCT TTCCAAACAT GTATTTATGT ATCAAGTAAA GCCATTAAAT GACTATTTTG 268 ATAATAATAT TGTTTTTCTT TTTACGAAGC ACTGGAGAAT GCACAGATAT ACTTTGTGGA 328 CCAATTATTG ATATATATTA TAAGTATATA TTAAGAATAT ATATAGGTAT AGCAGAGAGC 388 AATTCATAAG CGTGCACAAA GATTGAAAAT TCGCCTGAGC TGTTTATGTT TTTATATAAA 448 ATGAATAGAG AAAATAGACA ACCATTGTTT TGAATATTAC TCCTATTTTT GTAAACTGGA 508 ATTAAAGGAT AGTATTTTTA TCCACAACCG GCTTGAAGAT ACCAATAATG GCCATTTGTA 568 CAAAAAAATG ATGCCCTGCT CCAGGAGAAT TC 600。

【００４７】配列番号：13 配列の長さ：1265 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 GAATTCAGGA CTCTCAAAGC TCCACAATGG CGCCCAGCTC TCTCCTCAGC AACAGACTGA 60 AGGCTTCGGC TAGTTTTGTG CGTCTACAAA GCTTTGAGCG GAATTTTAGC TTCGGCAAAC 120 AAGTCCCCCC AGCTCCTCCA GCTAATTCCC GCGACTTCTC TCCAGACACC AGCTCCAGAC 180 AGTGACTGAT GCCTCTCTGG TTGTGATTCC AGCGCAGAAA CTCGAAGGAG CCCTTTGCCC 240 GCCGTCCTAT TTAGTCAACT CTTTCCTAGC CGCGA ATG ACC ATG TGT AGC GGA 293 GCA AGG TTG GCC CTG TTG GTC TAC GGG ATA ATA ATG CAT AAC AGC GTC 341 TCC TGT TCA CCT GCC GCC GGA CTC AGC TTC CCT GGG ATC AGA CCA GAA 389 GAA GAG GCT TAC GAT CAG GAC GGA AAC CCG CTG CAA GAC TTC TAC GAC 437 TGG GAC CCT CCG GGC GCA GGG AGC CCC GCC TCC GCG CTG CGT GAC GCC 485 TAC GCC CTT TAC TAC CCA GCC GAC AGG AGA GAT GTC GCC CAC GAA ATC 533 CTT AAC GAA GCC TAC CGC AAA GTC TTG GAC CAG CTG TCC GCC AGG AAG 581 TAC CTG CAG TCC ATG GTG GCC AGG GGC ATG GGC GAG AAC CTC GCC GCC 629 GCC GCG GTG GAC GAC CGG GCA CCC CTT ACC AAA CGC CAC TCG GAC GGC 677 ATC TTC ACA GAC AGC TAT AGC CGC TAC CGA AAA CAA ATG GCT GTC AAG 725 AAA TAC TTG GCG GCC GTG CTA GGG AAA AGG TAT AAA CAG AGG GTT AAA 773 AAC AAA GGA CGC CGA ATA GCG TAC TTG TAG CGATGAGTTG CCAGCTACCG 823 TGTGTATAAA ATGAAAAGTC GTTTTCCAAA TTGACTGACC AGTCATCACT CATGTGTTCT 883 TTCCAAACAT GTATTTATGT ATCAAGTAAA GCCATTAAAT GACTATTTTG ATAATAATAT 943 TGTTTTTCTT TTTACGAAGC ACTGGAGAAT GCACAGATAT ACTTTGTGGA CCAATTATTG 1003 ATATATATTA TAAGTATATA TTAAGAATAT ATATAGGTAT AGCAGAGAGC AATTCATAAG 1063 CGTGCACAAA GATTGAAAAT TCGCCTGAGC TGTTTATGTT TTTATATAAA ATGAATAGAG 1123 AAAATAGACA ACCATTGTTT TGAATATTAC TCCTATTTTT GTAAACTGGA ATTAAAGGAT 1183 AGTATTTTTA TCCACAACCG GCTTGAAGAT ACCAATAATG GCCATTTGTA CAAAAAAATG 1243 ATGCCCTGCT CCAGGAGAAT TC 1265。

【００４８】配列番号：14 配列の長さ：６８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＶａｌＡｌａＡｒｇＧｌｙＭｅｔＧｌｙＧｌｕＡｓｎＬｅｕ
ＡｌａＡｌａＡｌａＡｌａＶａｌＡｓｐＡｓｐ１ 5 10 15 Arg Ala Pro Leu Thr Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala 35 40 45 Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg 50 55 60 Ile Ala Tyr Leu 65。

【００４９】配列番号：15 配列の長さ：175 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Thr Met Cys Ser Gly Ala Arg Leu Ala Leu Leu Val Tyr Gly Ile 1 5 10 15 Ile Met His Asn Ser Val Ser Cys Ser Pro Ala Ala Gly Leu Ser Phe 20 25 30 Pro Gly Ile Arg Pro Glu Glu Glu Ala Tyr Asp Gln Asp Gly Asn Pro 35 40 45 Leu Gln Asp Phe Tyr Asp Trp Asp Pro Pro Gly Ala Gly Ser Pro Ala 50 55 60 Ser Ala Leu Arg Asp Ala Tyr Ala Leu Tyr Tyr Pro Ala Asp Arg Arg 65 70 75 80 Asp Val Ala His Glu Ile Leu Asn Glu Ala Tyr Arg Lys Val Leu Asp 85 90 95 Gln Leu Ser Ala Arg Lys Tyr Leu Gln Ser Met Val Ala Arg Gly Met 100 105 110 Gly Glu Asn Leu Ala Ala Ala Ala Val Asp Asp Arg Ala Pro Leu Thr 115 120 125 Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg 130 135 140 Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile Ala Tyr Leu 165 170 175。

【００５０】配列番号：16 配列の長さ：51 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CACTCTGATG GAATCTTCAC AGATAGCTAC AGCCGCTATA GAAAGCAAAT G 51。

【００５１】配列番号：17 配列の長さ：51 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA ANTI-SENSE: Yes 配列 TAGAACGGCG GCCAAGTATT TCTTCACAGC CATTTGCTTT CTATAGCGGC T 51。

【００５２】配列番号：18 配列の長さ：25 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AATTCATGTC ACCTGCCGCC GCCGG 25。

【００５３】配列番号：19 配列の長さ：25 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA ANTI-SENSE: Yes 配列 GAGTCCGGCG GCGGCAGGTG ACATG。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒツジＰＡＣＡＰ３８前駆体や成熟ＰＡＣＡＰ
３８ｃＤＮＡの簡単な制限酵素地図である。

【図２】ヒツジＰＡＣＡＰ３８前駆体や成熟ＰＡＣＡＰ
３８ｃＤＮＡの塩基配列およびそれより推定されるヒツ
ジＰＡＣＡＰ３８前駆体の一部や成熟ＰＡＣＡＰ３８の
アミノ酸配列を示す。

【図３】ヒトＰＡＣＡＰ３８前駆体や成熟ＰＡＣＡＰ３
８ｃＤＮＡの簡単な制限酵素地図である。

【図４】ヒトＰＡＣＡＰ３８前駆体や成熟ＰＡＣＡＰ３
８ｃＤＮＡの塩基配列およびそれより推定されるヒトＰ
ＡＣＡＰ３８前駆体や成熟ＰＡＣＡＰ３８のアミノ酸配
列を示す。

【図５】ラットＰＡＣＡＰ３８前駆体や成熟ＰＡＣＡＰ
３８ｃＤＮＡの簡単な制限酵素地図である。

【図６】ラットＰＡＣＡＰ３８前駆体や成熟ＰＡＣＡＰ
３８ｃＤＮＡの塩基配列およびそれより推定されるラッ
トＰＡＣＡＰ３８前駆体や成熟ＰＡＣＡＰ３８のアミノ
酸配列を示す。

【図７】実施例１における動物細胞用発現プラスミドの
構築図である。

【図８】実施例１で得られたクローンの免疫反応性のＰ
ＡＣＡＰの産生を示すグラフである。

【図９】免疫反応性のＰＡＣＡＰの産生クローンＣＨＯ
−ｔｆ７０５．５細胞の増殖とその上清中のＰＡＣＡＰ
の量を示すグラフである。

【図１０】ＣＨＯ−ｔｆ７０５．５細胞の分泌様式を示
すグラフである。

【図１１】ａ，ｂ，ｃ，ｄはＣＨＯ−ｔｆ７０５．５細
胞の培養物の各種培養日数における生産物の逆相ＨＰＬ
Ｃ分析図である。

【図１２】ＣＨＯ−ｔｆ７０５．５細胞の生産物の電気
泳動図である。

【図１３】実施例２の大腸菌用発現プラスミドの構築図
である。

【図１４】実施例２の大腸菌用発現プラスミドの構築図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 1/21 ＺＮＡ 7236−4Ｂ 5/10 15/16 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ０７Ｋ 99:00 8318−4Ｈ (72)発明者有村章アメリカ合衆国ルイジアナ州70131 ニューオーリンズチェルシードライブ 2630

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＰＡＣＡＰ蛋白質をコードするｃＤＮＡを
含有するＤＮＡを保持する形質転換体を培養し、培養物
中にＰＡＣＡＰ蛋白質を生成蓄積せしめ、これを採取す
ることを特徴とするＰＡＣＡＰ蛋白質の製造法。
【請求項２】ＰＡＣＡＰ蛋白質が〔式１〕 His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys で表わされる成熟ＰＡＣＡＰ３８である請求項１記載の
ＰＡＣＡＰ蛋白質の製造法。
【請求項３】ＰＡＣＡＰ蛋白質が〔式１''〕 His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu で表わされる成熟ＰＡＣＡＰ２７である請求項１記載の
ＰＡＣＡＰ蛋白質の製造法。
【請求項４】ＰＡＣＡＰ蛋白質がＰＡＣＡＰ前駆体であ
る請求項１記載のＰＡＣＡＰ蛋白質の製造法。
【請求項５】ＰＡＣＡＰ前駆体が〔式１〕のアミノ酸配
列を包含するものである請求項４記載のＰＡＣＡＰ蛋白
質の製造法。〔式１〕 His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys
【請求項６】ＰＡＣＡＰ前駆体が〔式１’〕のアミノ酸
配列を包含する請求項４記載のＰＡＣＡＰ蛋白質の製造
法。〔式１’〕 Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile
【請求項７】ＰＡＣＡＰ前駆体が〔式８〕のアミノ酸配
列で表わされるヒツジＰＡＣＡＰ３８前駆体である請求
項４記載のＰＡＣＡＰ蛋白質の製造法。〔式８〕 Met Ala Lys Gly Leu Gly Gly Thr Pro Gly Gly Gly Ala Asp Asp Asp Ser Glu Pro Leu Ser Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile Pro Tyr Leu
【請求項８】ＰＡＣＡＰ前駆体が〔式９〕のアミノ酸配
列で表わされるヒツジＰＡＣＡＰ３８前駆体である請求
項４記載のＰＡＣＡＰ蛋白質の製造法。〔式９〕 Met Thr Met Cys Ser Gly Ala Arg Leu Ala Leu Leu Val Tyr Gly Ile Leu Met His Ser Ser Val Tyr Gly Ser Pro Ala Ala Ser Gly Leu Arg Phe Pro Gly Ile Arg Pro Glu Asn Glu Ala Tyr Asp Glu Asp Gly Asn Pro Gln Gln Asp Phe Tyr Asp Ser Glu Pro Pro Gly Val Gly Ser Pro Ala Ser Ala Leu Arg Asp Ala Tyr Ala Leu Tyr Tyr Pro Ala Glu Glu Arg Asp Val Ala His Gly Ile Leu Asp Lys Ala Tyr Arg Lys Val Leu Asp Gln Leu Ser Ala Arg Arg Tyr Leu Gln Thr Leu Met Ala Lys Gly Leu Gly Gly Thr Pro Gly Gly Gly Ala Asp Asp Asp Ser Glu Pro Leu Ser Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile Pro Tyr Leu
【請求項９】ＰＡＣＡＰ前駆体が〔式１０〕のアミノ酸
配列で表わされるヒトＰＡＣＡＰ３８前駆体である請求
項４記載のＰＡＣＡＰ蛋白質の製造法。〔式１０〕 Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ala Gly Asp Asp Ala Glu Pro Leu Ser Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile Ala Tyr Leu
【請求項１０】ＰＡＣＡＰ前駆体が〔式１１〕のアミノ
酸配列で表わされるヒトＰＡＣＡＰ３８前駆体である請
求項４記載のＰＡＣＡＰ蛋白質の製造法。〔式１１〕 Met Thr Met Cys Ser Gly Ala Arg Leu Ala Leu Leu Val Tyr Gly Ile Ile Met His Ser Ser Val Tyr Ser Ser Pro Ala Ala Ala Gly Leu Arg Phe Pro Gly Ile Arg Pro Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Glu Asp Gly Asn Pro Leu Pro Asp Phe Gly Gly Ser Glu Pro Pro Gly Ala Gly Ser Pro Ala Ser Ala Pro Arg Ala Ala Ala Ala Trp Tyr Arg Pro Ala Gly Arg Arg Asp Val Ala His Gly Ile Leu Asn Glu Ala Tyr Arg Lys Val Leu Asp Gln Leu Ser Ala Gly Lys His Leu Gln Ser Leu Val Ala Arg Gly Val Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ala Gly Asp Asp Ala Glu Pro Leu Ser Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile Ala Tyr Leu
【請求項１１】ＰＡＣＡＰ前駆体が〔式１２〕のアミノ
酸配列で表わされるラットＰＡＣＡＰ３８前駆体である
請求項４記載のＰＡＣＡＰ蛋白質の製造法。〔式１２〕 Val Ala Arg Gly Met Gly Glu Asn Leu Ala Ala Ala Ala Val Asp Asp Arg Ala Pro Leu Thr Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile Ala Tyr Leu
【請求項１２】ＰＡＣＡＰ前駆体が〔式１３〕のアミノ
酸配列で表わされるラットＰＡＣＡＰ３８前駆体である
請求項４記載のＰＡＣＡＰ蛋白質の製造法。〔式１３〕 Met Thr Met Cys Ser Gly Ala Arg Leu Ala Leu Leu Val Tyr Gly Ile Ile Met His Asn Ser Val Ser Cys Ser Pro Ala Ala Gly Leu Ser Phe Pro Gly Ile Arg Pro Glu Glu Glu Ala Tyr Asp Gln Asp Gly Asn Pro Leu Gln Asp Phe Tyr Asp Trp Asp Pro Pro Gly Ala Gly Ser Pro Ala Ser Ala Leu Arg Asp Ala Tyr Ala Leu Tyr Tyr Pro Ala Asp Arg Arg Asp Val Ala His Glu Ile Leu Asn Glu Ala Tyr Arg Lys Val Leu Asp Gln Leu Ser Ala Arg Lys Tyr Leu Gln Ser Met Val Ala Arg Gly Met Gly Glu Asn Leu Ala Ala Ala Ala Val Asp Asp Arg Ala Pro Leu Thr Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile Ala Tyr Leu