JPH04262782A

JPH04262782A - Ｄｎａおよびその用途

Info

Publication number: JPH04262782A
Application number: JP2257492A
Authority: JP
Inventors: Haruo Onda; 音田　治夫; Shoichi Okubo; 尚一大久保
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1989-09-30
Filing date: 1990-09-28
Publication date: 1992-09-18
Anticipated expiration: 2015-12-25
Also published as: CA2026468A1; JP3120856B2; EP0421284A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はヒト血管収縮ペプチドたるヒト・エンドセリン
−３をコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡ、ヒト・エ
ンドセリン−３の前駆体蛋白質およびエンドセリン−３
の製造方法に関する。

本明細書において、前駆体蛋白質とは、成熟ペプチドの
アミノ酸配列を持ち、かつそのＮ末端側もしくはＣ末端
側、またはその両方に該ペプチドＤＮＡによってコード
されるアミノ酸配列の一部又は全部を持つような蛋白質
をさす。

〔従来の技術〕

内皮依存性の血管拡張反応とならんで、種々の刺激に対
する内皮依存性の血管収縮反応が報告されている。血管
の伸張や内圧の亢進といった機械的負荷による収縮、ト
ロンビンによる収縮、血中酸素の減少による収縮、さら
にはニューロペプチドＹ〔プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ
・ザ・ユー．エス．エー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．），７９，５４８５（１９
８２）；同、８１，４５７７（１９８４）〕によるノル
アドレナリン収縮の増強などがその例である。

アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー（Ａｍ
ｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）、２４８、ｃ５５０（１
９８５）およびジャーナル・オブ・セル・フィジオロジ
ー（Ｊ．ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．）１３２、２６３（
１９８７）には内皮細胞由来の冠血管収縮因子（分子量
はそれぞれ８，５００、３，０００）が記載されている
が構造は不明である。また、ジャーナル・オブ・ファー
マコロジー・アンド・エクスペリメンタル．セラビュー
ティクス（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．
）２３６、３３９（１９８５）にも内皮細胞由来のペプ
チド様物質が記載されているが、これも構造は不明であ
る。

一方、血管収縮作用を有するペプチドとしてバソプレッ
シン（Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）が知られていて、その
アミノ酸配列も明確にされているが、バソプレッシンが
哺乳類または鳥類の血管内皮細胞をオリジンとして得ら
れたという報告はない。また、血管収縮作用を有するア
ンジオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）がウシ大動
脈の内皮細胞から得られるという報告〔サーキュレーシ
ョン．リサーチ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ）、６０、４２２（１９８７）〕があるが、アン
ジオテンシンは分子量約１，０００のペプチドである。

また本発明者等の一部は同様の血管収縮作用を有するペ
プチドとして、先にブタ大動脈内皮細胞よりブタ・エン
ドセリンを単離することに成功し（特開平１−２０６９
９７号）、また本発明者等の一部はヒト・エンドセリン
の単離、ブタ・エンドセリンおよびヒト・エンドセリン
の相補ＤＮＡのクローニングにも成功している（特開平
２−７２８７７号）。このブタおよびヒト・エンドセリ
ンの成熟ポリペプチドのアミノ酸配列は同一で、これを
エンドセリン−１と呼ぶ。

更に、本出願人は、ラット・エンドセリンの単離、相補
ＤＮＡのクローニングについても出願を行っており（特
開平２−２７９８３号）、これをエンドセリン−３と呼
ぶ。

更に本出願人はマウス・エンドセリンの単離、相補ＤＮ
Ａのクローニングについても出願を行っており（特開平
２−７６５８３号）、これをエンドセリンＢと呼ぶ。

また本出願人はヒトゲノムＤＮＡライブラリーから新規
なアミノ酸配列のエンドセリン−２をコードするＤＮＡ
をクローニングすることにも成功し、それを提案してい
る（特願平１−２７４９９０号）。

これらエンドセリン−１、−２、Ｂ、−３のアミノ酸配
列については、第３図にそれらを比較して示す。なお、
ここでエンドセリンは総称して、分子量２５００±３０
０で、アミノ酸２１個からなるペプチドであり、そのア
ミノ酸配列のＮ末端から数えで第１番目、第３番目、第
１１番目、第１５番目に位置する４個のＣｙｓが２組の
Ｓ−Ｓ結合を形成している構造を有するものである。こ
のジスルフィド結合の組合せとしては、１−１５、３−
１１の組合せ、および１−１１、３−１５の組合せがあ
るが、前者の組合せのものの方が生成の割合が高く、ま
た活性も高い。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記のように、各種動物より相同型のエンドセリンが見
出されているが同一動物種からの新規な相同型遺伝子は
見出されていない。そこで更に新規な相同型エンドセリ
ンを検索し、それらエンドセリンの構造、及び活性等の
研究を深め、それらの有用性について検討すること、及
び該新規ペプチドを遺伝子組み換え技術によりクローニ
ングし、大量生産の道を拓くことが現在の課題である。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは上記血管収縮作用を有するエンドセリンの
新規相同型遺伝子を採取し、しかもそれを遺伝子組み換
え技術によつて製造することができれば、今後の研究、
治療に多大な効果を奏することができると考え、研究を
重ねた結果、次のような知見を得、本発明に到達したも
のである。

即ち、本発明者らは先に出願したヒト・エンドセリンの
ゲノミック（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡの一部をコードす
る合成ＤＮＡおよびエンドセリン−３のゲノミックＤＮ
Ａの約６５０ｂｐからなるＤＮＡをプローブとして使用
して、ヒトｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）ライブラリーから、
先のエンドセリン−１〔ヒト・エンドセリン（エンドセ
リンＡ）〕とは異なるアミノ酸配列をもつエンドセリン
をコードする相補ＤＮＡをクローニングすることに成功
した。その結果、これらを遺伝子組み換え技術によって
大量に生産する道を拓くことに成功したものである。本
発明者等はこの新規なアミノ酸配列のヒト・エンドセリ
ンをヒト・エンドセリン−３と命名した。これは、エン
ドセリン−３〔ラット・エンドセリン（エンドセリンＣ
）〕　と成熟部分のアミノ酸配列は同一であるものの、
それをコードする塩基配列が異なり、また前駆体として
はアミノ酸配列が異なるものである。

本発明は（１）ヒト・エンドセリン−３をコードするｃ
ＤＮＡを含有するＤＮＡ、（２）ヒト・エンドセリン−
３前駆体、（３）ヒト・エンドセリン−３をコードする
ｃＤＮＡを含有するＤＮＡを保持する形質転換体、およ
び（４）上記（３）の形質転換体の培養、培養物中への
蛋白質の生産蓄積、採取を包含する成熟エンドセリン−
３の製造方法に関するものである。

本発明の、ヒト・エンドセリン−３をコードするｃＤＮ
Ａは〔式１〕の塩基配列を含有するものであるか或いは
その一部であり、これは公知のものとは異なる新規なも
のである。

〔式１〕また本発明のヒト・エンドセリン−３前駆体は〔式２〕
のアミノ酸配列を含有するものである。

〔式２〕また〔式２〕の９７〜１３８番のアミノ酸配列に相当す
る〔式２’〕〔式２’〕で表わされるものもヒト・エンドセリン−３前駆体の一
種であり、このものはピック・エンドセリン−３と呼ぶ
。

これらヒト・エンドセリン−３前駆体は、今回初めて見
出された新規なものである。

〔式１〕の塩基配列は本発明で得られたヒト・エンドセ
リン−３　ｃＤＮＡ配列であり、〔式２〕の成熟エンド
セリン−３アミノ酸（白ボックスで囲ってある部分のＣ
ＴＣＦＴＹＫＤＫＥＣＶＹＹＣＨＬＤＩＩＷの配列）をコードする塩基配列の一例としては〔式１〕のＮｏ．
３９９〜４６１で表わされるものが挙げられる。

本発明方法におけるヒト・エンドセリン−３の成熟エン
ドセリン−３をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含
有する発現型ベクターは、例えば、（１）ヒト・エンド
セリン−３産生細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）を分離し、（■）該ｍＲＮＡから単鎖の相補ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）を、次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、（■）
該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み込み、
（■）得られた組み換えファージまたはプラスミドで宿
主を形質転換し、（■）得られた形質転換体を培養後、
形質転換体から適当な方法、例えばヒト・エンドセリン
−３の一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダ
イゼーションにより、あるいは抗エンドセリン−３抗体
を用いたイムノアッセイ法により目的とするＤＮＡを含
有するファージあるいはプラスミドを単離し、（■）そ
の組み換えＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切
り出し、（■）該クローン化ＤＮＡまたはその一部を発
現ベクター中のプロモーターの下流に連結する、ことに
より製造することができる。

ヒト・エンドセリン−３をコードするｍＲＮＡは、種々
のエンドセリン産生細胞、例えばヒト大動脈内皮細胞、
ヒト胎盤などから得る事ができる。

ヒト・エンドセリン−３産生細胞からＲＮＡを調製する
方法としては、グアニジンチオシアネート法〔（ジェー
．エム．チルグウイン（Ｊ．Ｍ．．Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）
ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）、１８、５２９４（１９７９）〕などが挙げられる。

このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵
素を用いて、例えば岡山（Ｈ．Ｏｋａｙａｍａ）らの方
法〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉ
ｏｌｏｙ）２、１６１（１９８２）および同誌３、２８
０。（１９８３）〕に従いｃＤＮＡを合成し、得られた
ｃＤＮＡをプラスミドに組み込む。

ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸
菌由来のｐＢＲ３２２〔ジーン（ｇｅｎｅ）、２、９５
（１９７７）〕，ｐＢＲ３２５〔ジーン、４、１２１（
１９７８）〕，ｐＵＣ１２〔ジーン、１９、、２５９（
１９８２）〕，ｐＵＣ１３〔ジーン、１９、２５９（１９８２）〕、枯草菌由来のｐＵＢ１１０〔バイオケ
ミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーヨ
ン（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉ
ｏｎ）、１１２、６７８（１９８３）〕などが挙げられ
るが、その他のものであっても、宿主内で複製増殖され
るものであれば、いずれをも用いることができる。また
ｃＤＮＡを組み込むファージベクターとしては、たとえ
ばλｇｔｌｌ〔ヤング及びデーヴィス（Ｙｏｕｎｇ、Ｒ
．、ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、Ｒ．、）プロシーディングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス・オブ・ザ・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），８０，１１９
４（１９８３）〕などが挙げられるが、その他のもので
あっても宿主内で増殖できるものであれば用いることが
できる。

プラスミドに組み込む方法としては、たとえば、ティー
．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュ
ラー．クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ−ｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）、第２３９頁（１９８２）に記載の方法な
どが挙げられる。またファージベクターにｃＤＮＡを組
み込む方法としては、たとえばヒューン（Ｈｙｕｎｈ、
Ｔ．Ｖ．）らの方法〔ディー．エヌ．エー　クローニン
グ　ア　プラクティカル　アプローチ（ＤＮＡ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ
）１、４９（１９８５）〕などが挙げられる。

このようにして得られたプラスミドは、適当な宿主たと
えばエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌、バ
チルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌などに導入する。

上記エシェリキア属菌の例としては、エシェリキア．コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１
〔プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ．サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）６０、１６０（１９６８）〕，
Ｍ１０３〔ヌクレイック．アシッズ．リサーチ，（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９、３
０９（１９８１）〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）〕，１２０、５
１７（１９７８）〕、ＨＢ１０１〔ジャーナル．オブ．
モレキュラー．バイオロジー４１、４５９（１９６９）
〕、Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）
，３９、４４０（１９５４）〕などが挙げられる。

上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４
（ジーン、２４、２５５（１９８３）〕、２０７−２１
〔ジャーナル．オブ．バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９５、８７（
１９８４）〕などが挙げられる。

プラスミドで宿主を形質転換する方法としては、たとえ
ばティー．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、
モレキュラー．クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、第２４９頁（１９８２）に記
載のカルシウムクロライド法あるいはカルシウムクロラ
イド／ルビジウムクロライド法などが挙げられる。

またファージ・ベクターを用いる場合には、たとえば増
殖させた大腸菌にインビトロパッケージング法を用いて
導入することができる。

ヒト・エンドセリン−３　ｃＤＮＡを含有するヒト・ｃ
ＤＮＡライブラリーは上記の方法などで得ることが出来
るが、市販品として購入することも可能であり、例えば
ヒトのｃＤＮＡライブラリーはクローンテックラボラト
リーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
、Ｉｎｃ．、米国）から入手することができる。

ヒト・ＤＮＡライブラリーからヒト・エンドセリン−３
　ｃＤＮＡをクローニングする方法としては、例えばフ
ァージベクターλｃｈａｒｏｎ４Ａとヒト・エンドセリ
ン−３のアミノ酸配列に基づいて化学合成したオリゴヌ
クレオチドをプローブとして用いたプラークハイブリダ
イゼーション法〔ティー．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ）ら、モレキュラー．クローニング（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａ−ｂｏｒａｔｏｒｙ）、（１９８２）〕
などが挙げられる。このようにしてクローン化されたヒ
ト・エンドセリン−３　ｃＤＮＡは必要があればプラス
ミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、
ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９
などにサブクローニングしてヒト・エンドセリン−３　
ｃＤＮＡを得ることができる。

このようにして得られたＤＮＡの塩基配列を、たとえば
マキサム．ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）
法〔Ｍａｘａｍ、Ａ．Ｍ．　ａｎｄ　Ｇｉｌｂｅｒｔ、
ｗ．、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユー・エス・
エー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｌ．，Ｕ．
Ｓ．Ａ．），７４、５６０（１９７７）〕あるいはジデ
オキシ法〔Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ．　ら、ヌクレイック．
アシッズ．リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ）９、３０９（１９８１）〕によって決
定し、既知のアミノ酸配列との比較からヒト・エンドセ
リン−３ＤＮＡの存在を確認する。

以上のようにして、ヒト・エンドセリン−３をコードす
るｃＤＮＡ（ヒト・エンドセリン−３ｃＤＮＡ）〔式１
〕が得られる。

後述の実施例２で得られたヒト・エンドセリン−３をコ
ードするｃＤＮＡの制限酵素断片地図を第１図に示す。

またジデオキシ法で決定したＤＮＡの塩基配列、および
その塩基配列から判明したアミノ酸配列を第２図に示す
。

上記のようにしてクローン化されたヒト・エンドセリン
−３をコードするｃＤＮＡは目的によりそのまま、また
は所望により制限酵素で消化して使用することが出来る
。

クローン化されたｃＤＮＡから発現させたい領域を切り
出し、発現に適したビークル（ベクター）中のプロモー
ターの下流に連結して発現型ベクターを得ることができ
る。

該ＤＮＡはその５’末端に翻訳開始コドンとしてのＡＴ
Ｇを有し、また３’末端には翻訳終止コドンとしてのＴ
ＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これら
の翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮ
Ａアダプターを用いて付加することもできる。さらに該
ＤＮＡを発現させるにはその上流にプロモーターを接続
する。

ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプラスミド（例
、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１
３）、枯草菌由来プラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴ
Ｐ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ
１９、ｐＳＨ１５）、あるいはλファージなどのバクテ
リオファージおよびレトロウィルス、ワクシニアウィル
スなどの動物ウィルスなどが挙げられる。

本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発
現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば
いかなるものでもよい。

形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌である場合は
、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡ
プロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモータ
ーなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１
プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモ
ーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモ
ーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、Ａ
ＤＨプロモーターなどが好ましい。とりわけ宿主がエシ
ェリキア属菌でプロモーターがｔｒｐプロモーターまた
はλＰＬプロモーターであることが好ましい。

宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモ
ーター、レトロウィルスのプロモーター、メタロチオネ
インプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが
それぞれ利用できる。

なお、発現にエンハンサーの利用も効果的である。

このようにして構築されたヒト・エンドセリン−３の成
熟ペプチドをコードするｃＤＮＡを含有するベクターを
用いて、形質転換体を製造する。

宿主としては、たとえばエシェリキア属菌、バチルス属
菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌、バチルス属菌の具体例としては
、前記したものと同様のものが挙げられる。

上記酵母としては、たとえばサッカロマイセスセレビシ
エ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）ＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ−、ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ
−５Ｄなどが挙げられる。

動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅ
ｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、マウスＬ細
胞、ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌を形質転換するには、たとえばプ
ロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー．オ
ブ．サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ），６９、２１１０（１９７２）やジーン、
１７、１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行
なわれる。

バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、１
６８、１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行
なわれる。

酵母を形質転換するには、たとえばプロシージング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７
５、１９２９（１９７８）に記載の方法に従って行なわ
れる。

動物細胞を形質転換するには、たとえばヴィロロジー（
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２、４５６（１９７３）に記載の
方法に従って行なわれる。

このようにして、ヒト・エンドセリン−３成熟ペプチド
をコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転
換された形質転換体が得られる。

宿主がエシェリキア属菌、バチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培
地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。

炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、
可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばア
ンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、
ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽
出液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえ
ば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグ
ネシウムなどが挙げられる。

また、酵母、ビタミン類、生長促進因子などを添加して
もよい。

培地のｐＨは約５〜８が望ましい。

エシェリキア属菌を培養する際の培地としては、例えば
グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉ
ｌｌｅｒ）、ジャーナル．オブ．エクスペリメンツ・イ
ン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３、Ｃｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ　１９７２〕が好ましい。ここに必
要によりプロモーターを効率よく働かせるために、たと
えば３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加える
ことができる。

宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常約１５〜４
３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や攪拌を
加えることもできる。

宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃
で約６〜２４時間行ない、必要により通気や攪拌を加え
ることもできる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばバークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ
）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ、Ｋ．Ｌ．ら、「プロシー
ジング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ）７７、４５０５（１９８０）〕が挙げられる。培
地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通
常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応
じて通気や攪拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地と
しては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥ
Ｍ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１２２、５０１
（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒ
ｏ−ｌｏｇｙ）、８、３９６（１９５９）〕、ＲＰＭＩ
１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メ
ディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｎａｌ　
ｏｆ　ｔｈｅ　ＡｍｅｒｉｃａｎＭｅｄｉｃａｌ　Ａｓ
ｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９、５１９（１９６７）〕、
１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ
・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏ−
ｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏ
ｒ　ｔｈｅ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ）
７３、１（１９５０）〕などが挙げられる。ｐＨは約６
〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で
約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。

上記培養物からヒト・エンドセリン−３の成熟ペプチド
（エンドセリン−３）を分離精製するには、例えば下記
の方法により行なうことができる。

ヒト・エンドセリン−３の成熟ペプチドを培養菌体ある
いは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法
で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁
し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などに
よって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ
過によりヒト・エンドセリン−３の成熟ペプチドの粗抽
出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素
や塩酸グアニジンなどのたんぱく変性剤や、トリトンＸ
−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。

培養液中にヒト・エンドセリン−３前駆体たんぱくや成
熟ペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自
体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上
清を集める。このようにして得られた培養上清、あるい
は抽出液中に含まれるヒト・エンドセリン−３前駆体た
んぱくや成熟ペプチドは、自体公知の分離・精製法を適
切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の
分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度
を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、お
よびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの
主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマ
トグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニ
ティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用す
る方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性
の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の
差を利用する方法などが挙げられる。

かくして生成するヒト・エンドセリン−３前駆体たんぱ
くや成熟ペプチドは特異抗体を用いたエンザイムイムノ
アッセイなどにより測定することができる。また生成物
に血管収縮活性がある場合は、該活性を指標にして測定
することもできる。

〔作用・効果〕

本発明のＤＮＡでＤＮＡ感染または形質転換した菌体や
細胞では、大量のエンドセリン−３成熟ペプチドを産生
せしめることができ、これらのペプチド生産を有利に導
くことができる。

ここに製造されるエンドセリン−３は他のエンドセリン
同様、低血圧治療剤や局所血管収縮剤としても利用する
ことができるのみならず、生体の血管収縮反応のメカニ
ズムの解析や血管収縮因子のアンタゴニストの解明の手
掛かりを与えるものである。また同様にこのエンドセリ
ンは、血管収縮剤として種々の出血、例えば胃や食道の
出血を防止するような効果を有する。またこのものは種
々のショック症状を回復させる効果をも有する。

このペプチドは経口的、局所的、静注もしくは非経口的
に投与することができるが、局所もしくは静注投与が好
ましい。投与量は０．００１μｇ〜１００μｇ／ｋｇ、
好ましくは０．０１μｇ〜１０μｇ／ｋｇであり、体重
に応じた投与量を１〜１０ｍｌの生理的食塩水中に溶解
して用いる。

本発明のペプチドは該ペプチドおよび副成分を含む乳剤
、水和剤、錠剤、水溶剤、粉剤、粒剤、カプセル剤、丸
剤などの種々の形態に製剤化したものとして使用できる
。副成分としては、薬理的に許容され得る賦形剤、崩壊
剤、滑沢剤、結合剤、分散剤、可塑剤、充填剤、担体な
どが用いられる。

これらの副成分の例としては、賦形剤としては乳糖、ぶ
どう糖、白糖などが、崩壊剤としては澱粉、アルギン酸
ナトリウム、寒天末、カルボキシメチルセルローズカル
シウムなどが、滑沢剤としてはステアリン酸マグネシウ
ム、タルク、流動パラフィンなどが、結合剤としては単
シロップ、ゼラチン溶液、エタノール、ポリビニルアル
コールなどが、分散剤としてはメチルセルロース、エチ
ルセルロース、セラックなどが、可塑剤としてはグリセ
リン、澱粉などが挙げられる。

本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍ
ｉｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅ
ｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における
慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。また
アミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示
しなければＬ−体を示すものとする。

ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシンＲＮＡ：リボ核酸ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオ
キシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオ
ロシシチジン三リン酸ＡＴＰ：アデノシン三リン酸ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウムＧｌｙまたはＧ：グリシンＡｌａまたはＡ：アラニンＶａｌまたはＶ：バリンＬｅｕまたはＬ：ロイシンＩｌｅまたはＩ：イソロイシンＳｅｒまたはＳ：セリンＴｈｒまたはＴ：スレオニンＣｙｓまたはＣ：システインＭｅｔまたはＭ：メチオニンＧｌｕまたはＥ：グルタミン酸ＡｓｐまたはＤ：アスパラギン酸ＬｙｓまたはＫ：リジンＡｒｇまたはＲ：アルギニンＨｉＳまたはＨ：ヒスチジンＰｈｅまたはＦ：フェニールアラニンＴｙｒまたはＹ：チロシンＴｒｐまたはＷ：トリプトファンＰｒｏまたはＰ：プロリンＡｓｎまたはＮ：アスパラギンＧｌｎまたはＱ：グルタミンなお、本発明のヒト・エンドセリン−３においては、そ
のアミノ酸配列の一部が修飾（付加、除去、その他のア
ミノ酸への置換など）されていてもよい。

実施例以下の参考例および実施例により本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。

なお、実施例２で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α／ｐＨＥＴ−３（Ｐ）は、
平成１年９月２５日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）
に受託番号ＩＦＯ　１４９４９として、また平成１年９
月２９日から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−２６１７として
寄託され保管されている。

参考例（１）血管平滑筋収縮作用のアッセイ法内皮を注射針に
よる擦過にて除去したブタ右冠状動脈スパイラル標本（
０．５×２０ｍｍ）を炭酸ガスと酸素の混合ガス（５：
９５、Ｖ／Ｖ）で飽和した３７℃のクレブス−リンゲル
液（３ｍｌ）中に懸垂する。刺激前張力（ｂａｓａｌ　
ｔｅｎｓｉｏｎ）を２ｇに設定したのち、張力トランス
デューサーで等尺性張力を測定する。

（２）強心作用のアッセイ法前記（１）のアッセイ法で用いたブタ右冠状動脈スパイ
ラル標本のかわりにモルモットの右心房の懸垂標本を使
用し、（１）と同じ操作を行って張力および毎分の心脈
数を測定する。

実施例１　ｇｅｎｏｍｉｃヒト・エンドセリン−３のＤ
ＮＡの一部をコードするＤＮＡプローブの作製ヒト・エンドセリン−３の５′側の配列５′ ＧＣＧＣＣＴＧＧＡＴＣＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＡＧＧＧ
ＧＣＣＣＣ３′ のＤＮＡプローブを化学合成し、またクローン化したｇ
ｅｎｏｍｉｃヒト・エンドセリン−３の約６５０塩基か
ら成るＤＮＡの５′端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いて３２Ｐ−りん酸化し、ゲノムＤＮＡライブラリ
ーのスクリーニングに用いた。

実施例２　ヒト・エンドセリン−３前駆体ｃＤＮＡの単
離とその塩基配列の決定大腸菌Ｙ１０９０に前述のヒト胎盤由来のｃＤＮＡライ
ブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、Ｉｎｃ．製）を感染させてプレーティングし、ファ
ージプラークを出現せしめた。ベントンとデイビス（Ｂ
ｅｎｔｏｎ、Ｗ．、Ｄａｖｉｓ、Ｒ．）の報告〔サイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｓ）１９６、１８０−１８２（１９
７７）〕に従って、プラークＤＮＡの一部をナイロン膜
にうつしとり、３２Ｐで標識した実施例１のＤＮＡプロ
ーブとプラークハイブリダイゼーションを行なった。ハ
イブリダイゼーションは２０％ホルムアミドの存在下、
４２℃で行ない該膜は０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
中で２０℃で洗浄した。ハイブリダイゼーション陽性の
クローンを単離し、そのうちのひとつであるλｇｔ１０
の成熟体コード域をＥｃｏＲＩで切り出してプラスミド
ｐＵＣ１１８にサブクローニングした。

このプラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、形質転
換体エシェリキア・コリＤＨ５α／ｐＨＥＴ−３（Ｐ）
を得た。このプラスミドに含まれるヒトｃＤＮＡ断片の
簡単な制限酵素地図を第１図に示した。図中の区域は以
下のものを示す。

■：ヒト・エンドセリン−３成熟体コード域この成熟体
コード域とその周辺の塩基配列をサンガー（Ｓａｎｇｅ
ｒ）の方法〔プロシージング　オブザ　ナショナル　ア
カデミー　オブ　サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）７４、５４６３−５４６
７（１９７７）〕によって決定した。この塩基配列およ
びそれから推定されるアミノ酸配列の一部を第２図（枠
で囲んだ部分のＣからＷまでが成熟ペプチド部）に示し
た。得られたｃＤＮＡ塩基数は２２９９であり、３’末
端にｐｏｌｙＡシグナルＡＡＴＡＡＡの配列を有してい
る。また第３図にはこのヒト・エンドセリン−３成熟ペ
プチドのアミノ酸配列と共に、先に見出しているエンド
セリン−１、Ｂ、−２の成熟ペプチドのアミノ酸配列を
比較の為に示してある。

実施例３ヒト・エンドセリン−３の動物細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞
での発現 ■）発現プラスミドの構築ヒト胎盤のｃＤＮＡライブラリーからクローン化したヒ
ト・エンドセリン−３の前駆体をコードするｃＤＮＡを
有する精製プラスミド、ｐＨＥＴ−３（ｐ）を、制限酵
素ＥｃｏＲＩで処理した後、１％のアガロースゲル電気
泳動で２．３ＫｂのｃＤＮＡを分離した。このｃＤＮＡ
部分を電気的に溶出し、クレノウフラグメントでＥｃｏ
ＲＩ切断部分の一本鎖部分を二本鎖の状態にした後、制
限酵素ＸｈｏＩの認識配列を有するリンカーである５’
−ｐｄ（ＣＣＴＣＧＡＧＧ）−３’を結合し、ＸｈｏＩ
で処理した。得られたＤＮＡをポリアクリルアミド電気
泳動で精製、これを電気的に溶出した。

得られたリンカーを結合したエンドセリン−３前駆体を
コードするｃＤＮＡを発現ベクターｐＳＶＬのＸｈｏＩ
部分に組み込み、プラスミドｐＴＳ６００９を得た（第
４図）。

■）ＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質転換ＣＨＯ−Ｋ１細胞をファルコンの直径６ｃｍのプラスチ
ックシャーレに１０％子牛血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ
’ｓ　ｍｉｎｉｍｕｍ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉ
ｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）（ストレプトマイシン、カナマイシ
ンを１００〜５０μｇ／ｍｌ含む）で、５％ＣＯ２、９５％
Ａｉｒ、３７℃の条件で培養し、細胞が８０〜９０％の
条件で増殖した時、シャーレ当たり１〜１０μｇの発現
プラスミドｐＴＳ６００９をリン酸カルシウム法（Ｇｒ
ａｈａｍ　ａｎｄ　Ｖａｎｄｕ　ＨｂＡ、１９７７、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ　５２、４５６−４６７）で細胞にかけ
た。約７〜１８時間後、細胞を−（Ｍｇ）ＰＢＳで洗浄
した後、上記の培養液で培養した。

ＣＨＯ−Ｋ１細胞の場合はプラスミドｐＴＳ６００９と
ネオマイシン耐性の遺伝子をもつプラスミドｐＳＶ２−
ｎｅｏとを同時感染させた後、抗性物質Ｇ４１８を含有
する培養液で培養し、Ｇ４１８に耐性の細胞株を選択樹
立し、ＣＨＯ−Ｋ１−１５−４と命名した。

ＣＨＯ−Ｋ１−１５−４株はエンドセリン−３の持続産
生株であり、その産生状態はエンドセリン−３特異的な
Ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏ　ａｓｓａｙ（ＥＩＡ）で
その培養上清を測定すると、第５図に示した通り、細胞
を植付けてから３日〜８日までエンドセリン−３の分泌
産生をすることが示された。

第５図中、左縦軸は累積ｈＥＴ−３（ｐｇ／ｍｌ）を表
し、■がＣＨＯ−Ｋ１−１５−４（Ｇ４１８Γ）を、□
がＣＨＯ−Ｋ１を表す。また第５図の右縦軸はセル数×
１０−６を表し、ＡがＣＨＯ−Ｋ１−１５−４（Ｇ４１
８Γ）を、△がＣＨＯ−Ｋ１を表す。

■）ＣＨＯ−Ｋ１−１５−４株が産生する免疫反応陽性
（ｉｍｍｕｎｏ　ｒｅａｃｔｉｖｅ）なエンドセリン−
３の性状ＣＨＯ−Ｋ１−１５−４株細胞の培養上清約７０ｍｌ　
Ｓｅｐｐａｋ　Ｃ１４カラムで濃縮した後４００μｌを
５％ＣＨ３ＣＮ、０．０５％トリフルオロ酢酸に溶解し
た後、ＲＰ−ＨＰＬ（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｈａｓｅ−ｈ
ｉｇｈ　ｐｅｒｉｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈ
ｒｏｒｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で分析した。

分画した試料をＥＴ−３に特異的なＥＩＡで測定した結
果を第６図に示した。ＥＩＡで陽性の分画定量は合成し
たＥＴ−３と同じ位置に溶出されていることから、ＣＨ
Ｏ−Ｋ１−１５−４株細胞で分泌される免疫反応陽性の
エンドセリンは、サンドイッチタイプのエンドセリン−
３特異的なＥＩＡの測定系ということを考慮すれば、エ
ンドセリン−３と推定される。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒト・エンドセリン−３前駆体や成熟ペプチド
ＤＮＡを含むＤＮＡの簡単な制限酵素地図である。第２図はヒト・エンドセリン−３前駆体や成熟ペプチド
ＤＮＡの塩基配列、およびこれらから推定されるアミノ
酸配列を併せて示す。枠で囲んだ部分が成熟エンドセリ
ン−３である。第３図は第２図の塩基配列より推定されるヒト・エンド
セリン−３成熟ペプチドのアミノ酸配列、エンドセリン
−１、Ｂ、−２のアミノ酸配列を示す。第４図はヒト・エンドセリン−３発現用のプラスミドｐ
ＴＳ６００９の構築図であり、第５図はエンドセリン−
３産生株化細胞ＣＨＯ−Ｋ１−１５−４のエンドセリン
−３産生の経時的変化を示すグラフであり、第６図はヒ
ト・エンドセリン−３産生株化細胞ＣＨＯ−Ｋ１−１５
−４の産生する免疫反応陽性（ｉｍｍｕｎｏ　ｒｅａｃ
ｔｉｖｅ）なエンドセリンのＲＰ−ＨＰＬＣの分析図で
ある。代理人　大多和　明敏代理人　大多和　曉子

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト．エンドセリン−３をコードするｃＤ
ＮＡを含有するＤＮＡ。
【請求項２】ヒト．エンドセリン−３をコードするｃＤ
ＮＡが〔式１〕の塩基配列を含有あるいはその一部で表
わされる、請求項１記載のＤＮＡ。〔式１〕
【請求項３】ヒト・エンドセリン−３の前駆体蛋白質。
【請求項４】〔式２’〕のアミノ酸配列〔式２’〕を含有する請求項３記載の前駆体蛋白質。
【請求項５】〔式２〕のアミノ酸配列で表される請求項
４記載の前駆体蛋白質。〔式２〕
【請求項６】ヒト．エンドセリン−３をコードするｃＤ
ＮＡを含有するＤＮＡを保持する形質転換体。
【請求項７】請求項６記載の形質転換体を培養し、培養
物中に成熟エンドセリン−３を生成蓄積せしめ、これを
採取することを特徴とする成熟エンドセリン−３蛋白質
の製造方法。