JP2577091C

JP2577091C -

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Publication number: JP2577091C
Authority: JP
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Publication date: 1999-01-13

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【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、遺伝子組換えによって得られた肝実質細胞増殖因子及びそれをコード
する遺伝子に関する。（従来の技術）肝臓は、生体中で最も高度に分化の進んだ最大の器官である。これは主に各種栄
養素（糖質、タンパク質、脂質、ビタミン、ホルモン等）の処理（代謝）、貯蔵
、解毒、分解、排せつ等の重要な多種の機能を兼ね備えており、なかでも生体内
中間代謝の中心的な役割を果たすことが知られている。これらの機能を担ってい
る肝実質細胞は生体内において各種のホルモンによる制御下に置かれ、ある場合
にはきわめて旺盛な増殖を示す。例えば、ラットの肝臓のほぼ２／３を切除して
も、約１０日後には元の大きさに戻ることが知られており、ヒトでも肝癌患者等
において、部分肝切除とその後の再生による治療法が行われている。肝実質細胞
の増殖による肝再生の機構については従来より数多くの研究が行われ、肝実質細
胞増殖因子の存在が報告されてきた。とりわけ、本発明者らの一部は、ヒト劇症
肝炎患者血漿中には、肝実質細胞増殖活性が極めて高いことを見いだし(Biomed.
Res.,6,231(1985)及びExp.Cell.Res.166，139(1986))、その活性を有する因子を
世界で初めて単一のタンパク質として精製することに成功した(特開昭63-22526
号公報及びJ.Clin.Invest.,81,414(1988))。このヒト肝細胞増殖因子（以下「ｈＨＧＦ」と略す）は非還元条件下のＳＤＳ−
ＰＡＧＥによる推定分子量が約76000-92000 であり、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥでは分子量56000-65000 及び32000-35000 の２つのバンドに分かれた。中村
らは、ラット血小板由来の同様な活性を有する因子を報告しており(Biochem.Bio
phys.Res.Commun.122,1450(1984))、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、その推定分子量
は約２７０００であるとしていたが(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,6489(1986))、
その後、単一のタンパク質として精製し、分子量69000 と34000 との２つのポリ
ペプチドからなる分子量82000 のタンパク質であると報告された（FEBS Letters
,224,311(1987)）。これらｈＨＧＦ及びラットＨＧＦ以外には単一のタンパク質
として精製された肝細胞増殖因子は今までに報告されていないし、ｈＨＧＦ及びラットＨＧＦに関しても、その一次構造及び該当するｃＤＮＡの塩基配列につ
いては、なんの報告もなされていない。（発明の解決すべき問題点）ｈＨＧＦの生体における詳細な機能あるいは肝障害時における肝再生に対する効
果等を生体外で調べるには、多量のｈＨＧＦを必要とするが、劇症肝炎患者血漿
から多量のｈＨＧＦを精製することは人的、時間的、経費的に必ずしも容易では
なく、また感染源の存在する血漿中からｈＨＧＦのみを安定に取り出すことは困
難を極める。かかる理由からｈＨＧＦの劇症肝炎患者血漿からの安定かつ大量の
精製は行われていなかった。（問題点を解決するための手段）そこで、本発明者らは、ｈＨＧＦを組換えＤＮＡ技術により大量に取得するべく
種々検討した結果、かかる目的に有用なｈＨＧＦをコードする遺伝子を初めてク
ローニングすることに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の
要旨は、第１図に示すアミノ酸配列で表される、シグナル配列を含むｈＨＧＦ、
第１図に示すアミノ酸配列のうち３０番目のグルタミン酸残基（Ｇｌｕ）から最
後のセリン残基（Ｓｅｒ）までの配列で表されるｈＨＧＦ、第１図に示すアミノ
酸配列のうち３２番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から最後のセリン残基（Ｓｅｒ）
までの配列で表されるｈＨＧＦ、該アミノ酸配列で表される各ｈＨＧＦをコード
する遺伝子、第２図に示す塩基配列で表される、シグナル配列を含むｈＨＧＦを
コードする遺伝子、第２図に示す塩基配列のうち８８番目のＧから最後のＧまで
の配列で表される遺伝子及び第２図に示す塩基配列のうち９４番目のＣから最後
のＧまでの配列で表される遺伝子に存する。以下に本発明を説明するに、本発明のｈＨＧＦをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）
は例えば第２図に示すような塩基配列を有する。なお、塩基配列は他の相補的な
塩基配列を省略し１本鎖のみを記載した。この遺伝子より組換えＤＮＡ技術によ
り例えば第１図に示すアミノ酸配列を有するｈＨＧＦを発現させることができる
。この時、ｈＨＧＦをコードするｍＲＮＡから翻訳される蛋白はシグナル配列を
含んでいるが、細胞から分泌される場合にはシグナル配列が切断され、３０番目
のグルタミン酸残基（Ｇｌｕ）または３２番目のグルタミン残基（Ｇｌｎ）以後のアミノ酸配列を有するｈＨＧＦが産生される。シグナル配列として、他の蛋白
のシグナル配列を利用する事もできる。また、宿主細胞内にシグナル配列のない
成熟ｈＨＧＦを発現させる場合は、ｈＨＧＦをコードする遺伝子として第２図に
示す塩基配列のうち８８番目のＧまたは９４番目のＣから以後の塩基配列を有す
る遺伝子を、ベクターのＡＴＧコドンにつなげて使用すればよい。さらに、本発
明においては、肝実質細胞増殖促進活性を損なわない範囲内で、一部のアミノ酸
または核酸を除去、変更あるいは追加する等の改変を行ったものも本発明に含ま
れる。本発明のｈＨＧＦをコードする遺伝子のＤＮＡ断片は例えば次の様な方法によっ
て得られる。劇症肝炎患者血漿より、例えばJ.Clin.Invest.81,414(1988)に記載
された方法によって精製されたｈＨＧＦは、還元条件下では、ジスルフィド結合
が切断されて２本のポリペプチドに分かれる。分子量56000-65000 のポリペプチ
ドをＨ鎖、分子量32000-35000 のポリペプチドをＬ鎖とする。ｈＨＧＦを還元処
理し生成したシステイン残基のチオール基をカルボキシメチル化したのち、逆相
高速液体クロマトグラフィーでＨ鎖とＬ鎖を分離するか、あるいはｈＨＧＦを還
元条件下で電気泳動し、そのゲルからＨ鎖、Ｌ鎖のそれぞれを抽出したのち、例
えばアプライド・バイオシステムズ社製気相プロテインシーケンサーで分析する
ことにより、両鎖のアミノ末端アミノ酸配列を調べることができる。さらに、ｈ
ＨＧＦ自体を、またはＨ鎖、Ｌ鎖分離後に、適切な蛋白分解酵素例えばアクロモ
バクタープロテアーゼＩ（リジルエンドペプチダーゼ）で分解し、生成するペプ
チド断片を例えば逆相高速液体クロマトグラフィーで分離したのち、各ペプチド
を上記と同様にしてアミノ酸配列分析すればポリペプチド内部のアミノ酸配列を
知ることができる。これらのアミノ酸配列からＤＮＡ塩基配列を推定しオリゴヌ
クレオチドを作成しやすい配列を選定して、そのオリゴヌクレオチド、例えば、
後述の実施例に示すようなオリゴヌクレオチドを合成してプローブとして使用す
る。ｈＨＧＦをコードする遺伝子をスクリーニングするｃＤＮＡライブラリーと
しては、人由来の肝臓ｃＤＮＡライブラリー、脾臓ｃＤＮＡライブラリー、胎盤
ｃＤＮＡライブラリー、等が利用できる。これらのライブラリーはクローンテッ
ク社より販売されている。特に胎盤ｃＤＮＡライブラリーが望ましい。その他ｈＨＧＦを発現している細胞株、及び組織材料から常法に従ってｃＤＮＡライブラ
リーを作成してもよい。このようなｃＤＮＡが組み込まれたλファージをManiat
isらの方法（「モレキュラークローニング」、コールドスプリングハーバーラボ
ラトリー、５６頁−７３頁（１９８２））により大腸菌に感染させ培養する。形
成されたプラークをｈＨＧＦの一部のアミノ酸配列から推定される塩基配列から
作成したオリゴヌクレオチドをプローブとしてプラークハイブリダイゼーション
法（「モレキュラークローニング」、コールドスプリングハーバーラボラトリー
、３２０頁−３２８頁（１９８２））に従って選択することにより、容易に目的
とするｈＨＧＦのアミノ酸配列の一部と同じアミノ酸配列を有しなおかつｈＨＧ
Ｆのアミノ酸配列のプローブ以外の領域に相当する塩基配列をも有する、異なる
λファージクローンをいくつか得ることができる。さらに上記スクリーニング陽
性のプラークからManiatisらの方法（「モレキュラークローニング」、コールド
スプリングハーバーラボラトリー、７６頁−７９頁（１９８２））によりファー
ジを増殖させ、そのものからグリセロールグラヂエント法にしたがってＤＮＡを
精製し適切な制限酵素例えばＥｃｏＲＩ等で切断後、ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９等
のプラスミドベクターあるいはＭ１３ｍｐ１８，Ｍ１３ｍｐ１９などの一本鎖フ
ァージベクターにｃＤＮＡをサブクローニングし、Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシ
法（プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・
ユー・エス・エー（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．）７４５４６３（１９７７））
に従って目的ｃＤＮＡセグメントの塩基配列を決定することができる。得られた
クローンの塩基配列を解析しそれらを統合することにより（第３図）ｈＨＧＦの
一部をコードするｃＤＮＡクローン群によって、第１図に示すｈＨＧＦの全アミ
ノ酸配列の全てに対応する遺伝子を得ることができる。かくして得られるｃＤＮ
Ａの発現は、例えば、該ＤＮＡ群をその塩基配列の順番がｈＨＧＦのアミノ酸配
列に従う形でつないでそれらｈＨＧＦの全領域を含むＤＮＡ断片としこれをｐＣ
ＤＬ−ＳＲα２９６等のプラスミドのプロモーターの下流に翻訳開始コドンＡＴ
Ｇとフェーズを合わせて接続して蛋白質発現用プラスミドを形成し、該プラスミ
ドで形質転換された動物細胞の宿主内等で行うことができる。次いで、常法に従
い発現された蛋白質を回収することにより本発明のＨＧＦを得ることができる。上記発現用プラスミドとしては、工業的生産のためには、安定した宿主−ベクタ
ー系を構築することが望ましい。例えば、特願平１−115831号に記載されている
ようなものが挙げられる。具体的には、大腸菌、枯草菌等の微生物を宿主とする
ときは、プロモーター、リボゾーム結合配列、ｈＨＧＦ遺伝子、転写終結因子、
及びプロモーターを制御する遺伝子より成ることが好ましい。プロモーターとし
ては、例えばトリプトファン合成酵素オペロン（ｔｒｐ），ラクトースオペロン
（ｌａｃ）、リボプロテインのプロモーター（ｌｐｐ）等が挙げられ、また、ｔ
ａｃ（ｔｒｐ：ｌａｃ），ｔｒｃ（ｔｒｐ：ｌａｃ），ｐａｃ（ファージ：大腸
菌）等のハイブリッドプロモーターでもよい。ｈＨＧＦ遺伝子としてはシグナル
配列に相当する部分を除去したものが好ましいが、シグナル配列に相当する部分
を含むものでも産生されるプレ体からシグナル配列を除くことによってｈＨＧＦ
を得ることが出来る。使用するプラスミドとしては、大腸菌や枯草菌で多コピー
数になるプラスミド、例えばｐＢＲ３２２系プラスミド、ｐＵＢ１１０系プラス
ミド等が望ましい。通常の方法により形質転換された大腸菌、枯草菌などは、通
常の培地を用いて１５−４２℃で培養すればよい。酵母を宿主とする場合は、酵
母由来のプロモーター、例えばピルビン酸キナーゼ（ｐＹＫ），ホスホグリセロ
キナーゼ（ｐＧＫ）等の配列の支配下にｈＨＧＦ遺伝子を接続し、酵母内に導入
して３０℃前後で培養すればよい。しかしながら、天然のｈＨＧＦは糖蛋白であることを考慮すると、宿主としては
動物細胞が望ましい。また、動物細胞を宿主とする場合はシグナル配列に相当す
る部分を含むｈＨＧＦ遺伝子を導入することにより、シグナル配列が除かれたｈ
ＨＧＦが分泌生産されるという利点が期待される。シグナル配列としてはｈＨＧ
Ｆの本来のシグナル配列以外にもヒト血清アルブミン、インターフェロン、ヒト
・アミラーゼ等のシグナル配列を利用してもよく、その場合は本来のシグナル配
列をコードするＤＮＡ断片にかえて、それらのシグナル配列に相当する塩基配列
のＤＮＡ断片を５’側に置換すればよい。動物細胞を宿主とする場合、プロモー
ターとしては、ＳＶ４０後期プロモーター、アポリポプロテインＥ遺伝子のプロ
モーター、アポリポプロテインＡ１遺伝子のプロモーター、熱ショック蛋白遺伝
子のプロモーター、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター、ＨＳＶＴＫプロモーター、アデノウイルスのプロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ等が挙げられ
るが、ＳＶ４０プロモーター及びメタロチオネイン遺伝子のプロモーターが好ま
しい。発現ベクターには、ｈＨＧＦ遺伝子の下流にポリアデニル化部位が含まれ
る。ポリアデニル化部位の具体例としては、ＳＶ４０ＤＮＡ，β−グロビン遺
伝子またはメタロチオネイン遺伝子に由来するものが挙げられる。また、β−グ
ロビン遺伝子のポリアデニル化部位及びＳＶ４０ＤＮＡのポリアデニル化部位
が連結したものであってもよい。発現ベクターは、形質転換体の選択マーカーを
有していてもよい。発現ベクター中に選択マーカーがなくても、二重形質転換に
より、形質転換された動物細胞を選択できる。このような選択マーカーとしては
、メトトレキセート耐性を与えるＤＨＦＲ遺伝子、ＨＡＴ培地中での形質転換ｔ
ｋ^-株の選択を可能とするヘルペス・シンプレックスウイルス（ＨＳＶ）のｔｋ
遺伝子、３’−デオキシストレプタミン抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与す
る大腸菌のトランスポゾンＴｎ５からのアミノグリコシド３’−ホスホトランス
フェラーゼ遺伝子、重層増殖によるウシパピローマウイルス遺伝子、ａｐｒｔ遺
伝子等が挙げられる。また、二重形質転換法により、発現ベクターで形質転換し
た動物細胞を選択するには、上記した選択マーカーとなる遺伝子を含有するプラ
スミドその他のＤＮＡを発現ベクターと一緒に形質転換し、選択マーカーの発現
による上記した表現形質により、形質転換細胞を選択出来る。発現ベクターは、
大腸菌等の細菌由来の複製開始点を有するプラスミド断片を有すると、細菌中で
のクローニングも可能となり有利である。このようなプラスミド断片としてはｐ
ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２７、ｐＭＬ等のプラスミド断片が挙げられる。発現ベク
ターに使用されるプラスミドベクターの具体例としては、ＳＶ４０初期プロモー
ター、ウサギのβ−グロビン遺伝子に由来するスプライス配列ＤＮＡ，ウサギの
β−グロビン遺伝子からのポリアデニル化部位、ＳＶ４０初期領域からのポリア
デニル化部位並びにｐＢＲ３２２からの複製開始点及びアンピシリン耐性遺伝子
を含有するｐＫＣＲ，ｐＫＣＲのｐＢＲ３２２部分をｐＢＲ３２７で置換し、ウ
サギβ−グロビン遺伝子のエクソン３中に存在するＥｃｏＲ１部位をＨｉｎｄ
III 部位に変えたｐＫＣＲＨ２、ＢＰＶ遺伝子及びメタロチオネイン遺伝子を
含有するｐＢＰＶＭＴ１等が挙げられる。発現ベクターで形質転換される動物細胞としては、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、
マウスＦＭ３Ａ細胞等が挙げられる。発現ベクターの動物細胞への移入はトラン
スフェクション法、マイクロインジェクション法等により行われるが、その中で
は、リン酸カルシウム法が最も一般的である。移入により形質転換された動物細
胞の培養は、常法により浮遊培養または付着培養で行うことができる。培地とし
ては、ＭＥＭ，ＲＰＭＩ１６４０などが一般的である。産生されたｈＨＧＦの分離精製は、劇症肝炎患者血漿からの精製と同様に、ヘパ
リン・セファローズやハイドロキシアパタイト等を用いたカラムクロマトグラフ
ィーにより行うことが出来る。（発明の効果）本発明に係わるｈＨＧＦをコードする遺伝子は常法により発現ベクターに導入す
ることによって、これを鋳型とする発現によりｈＨＧＦまたはｈＨＧＦ様物質あ
るいはこれを含む融合蛋白を得ることができる。得られる組換えｈＨＧＦ，ｈＨ
ＧＦ様物質あるいはｈＨＧＦを含む融合蛋白は肝再生促進剤、肝機能改善剤、肝
炎治療剤あるいは肝硬変抑制剤等肝疾患の治療薬となる可能性がある。（実施例）以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、その要旨を越えない限
り、以下の実施例に限定されるものではない。実施例１〔１〕ｈＨＧＦの部分アミノ酸配列決定及びプローブの作製劇症肝炎患者血漿より、J.Clin.Invest.,81,414(1988)に記載された方法に従っ
てｈＨＧＦを精製した。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけたところ、非還元条件下
では、分子量76000-92000 の位置にややブロードな単一バンドが現れ、還元条件
下では、分子量56000-65000 のややブロードなバンドと分子量32000-35000 のバ
ンドの２つのバンドが現れた。この精製ｈＨＧＦ５０μｇを５モル濃度の尿素を
含有するｐＨ９の５０ミリモル濃度のトリス塩酸緩衝液１００μｌに溶解し、こ
れに、ｈＨＧＦに対しモル比で１／200 に相当するアクロモバクタープロテアー
ゼＩを加えて３７℃で６時間反応させた。生成したペプチド混合物は常法により
還元カルボキシメチル化したのち、J.T.Baker 社製Bakerbond ＷＰ Octyl Colum n を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離して、各ペプチドを分取
した。６つのペプチドについて気相プロテインシーケンサー（Applied Biosystems社Mo
del470A）を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、表１に示すような配列が
見いだされた。〔２〕ｈＨＧＦの一部をコードするｃＤＮＡのスクリーニング（１）プラークハイブリダイゼーションスクリーニングを行うλファージｃＤＮＡライブラリーとして３４週齢のヒト胎
盤由来のｃＤＮＡ（クローンテック社）のスクリーニングを説明書に従って行っ
た。１００万クローンのファージを大腸菌Ｙ−１０９０株に感染させ24.5ｃｍｘ
24.5ｃｍのシャーレ中のＮＺＹ軟寒天培地〔ＮＺＹ培地；１％ＮＺ−アミン、
0.5％イーストイクストラクト、0.5％塩化ナトリウム、ｐＨ７・５に調整し0.25
％塩化マグネシウムを加えたもの、ＮＺＹ軟寒天培地；ＮＺＹ培地に 0.7％になるように寒天沫を加えオートクレイブしたもの〕中で１枚あたり２０万クロ
ーンの割合で５枚分を４２℃で一晩培養した。次に培地中のλファージクローン
を市販のナイロン膜であるジーンスクリーニングプラス（デュポン社）上に移し
取り、以下に説明するプラークハイブリダイゼーションを行った。即ち、１枚の
シャーレあたりナイロン膜２枚の割合でファージ粒子を移し取り、その様にして
できたナイロン膜を 0.1Ｍ水酸化ナトリウム− 1.5Ｍ塩化ナトリウムが染み込ん
だろ紙上に２分間静置し別に用意した乾いたろ紙上で水分を除いた後、次に、同
様に２ｘＳＳＣＰ（２倍の濃度のＳＳＣＰ溶液のこと、以下同様の表記方法をと
る。１０ｘＳＳＣＰ； 1.2Ｍ塩化ナトリウム、150ｍＭクエン酸ナトリウム
、130ｍＭ燐酸二水素カリウム、１ｍＭＥＤＴＡｐＨ７．２）− 0.2Ｍトリス
−塩酸（pH7.4）を染み込ませたろ紙上でこのナイロン膜を静置し乾いたろ紙上
で風乾した後、同じ操作を再び繰り返した。こうして処理したナイロン膜は、３
ｘＳＳＣ（２０倍の濃度のＳＳＣ溶液；３Ｍ塩化ナトリウム、0.3Ｍクエン酸ナ
トリウム）− 0.1％ＳＤＳで６０℃１５分間２回洗浄し、次にナイロン膜１枚
当り5 mlのプレハイブリダイゼーション液〔３ｘＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ、10ｘＤ
ｅｎｈａｒｄｔ’ｓ（５０倍の濃度のＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液；１％ＢＳＡ（
牛血清アルブミン）１％ポリビニルピロリドン、及び１％フィコール４００）、
20μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡ〕に６５℃３時間浸した。次に、表１のペプチド４、
すなわち Asn-Met-Glu-Asp-Leu-His-Arg-His-Ile-Phe-Trp-Glu-Pro-Asp-Ala-Se
r-Lys のうちのAsn-Met-Glu-Asp-Leu-His およびHis-Ile-Phe-Trp-Glu-Pro を基
に合成オリゴヌクレオチドを作成した。即ち、前述のアミノ酸配列の順に１７塩
基６４種類のＴＨ２３（５’−Ｔ−Ｇ−T/C/A/G −Ａ−A/G −A/G −Ｔ−Ｃ−T/
C −Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−A/G −Ｔ−Ｔ−３’）、１７塩基２４種類のＴＨ２４
（５’−Ｇ−Ｇ−T/C −Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−A/G −Ａ−Ａ−A/G/T −Ａ−Ｔ−
A/G −Ｔ−Ｇ−３’）を作成した。これらを常法に従いポリヌクレオチドキナー
ゼによりその５’末端を反応液〔50ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．６、10ｍＭ塩化マ
グネシウム、10ｍＭメルカプトエタノール、100μＭ〔γ³²Ｐ〕ＡＴＰ、基質Ｄ
ＮＡ〕中で³²Ｐ標識した後、常法に従いＤＥＡＥセルロースカラムをかけて余分
なモノヌクレオチドを除いた。こうしてできあがった³²Ｐ標識合成オリゴヌクレオチドプローブを含むハイブリダイゼーション液〔３ｘＳＳＣ、10ｘＤｅｎｈａ
ｒｄｔ’ｓ、50μｇ／ml鮭精子ＤＮＡ1M塩化ナトリウム、１％ＳＤＳ、250μｇ
／ml鮭精子ＤＮＡ、合成プローブ１種類当り10万c.p.m.／ｍｌ³²Ｐ標識プローブ
ＤＮＡ〕中で前述のフィルターをプローブに応じＡまたはＴを２℃に、Ｇまたは
Ｃを４℃に置き換えて全ての塩基を合計した温度、実際はプローブにより４２℃
（ＴＨ２３）４６℃（ＴＨ２４）で３６時間保温した。その後、ナイロン膜を取
り出し、４ｘＳＳＣ溶液中で室温で３０分間２回洗い、４ｘＳＳＣ溶液でハイブ
リダイゼーションの時と同じ温度で３０分間２回洗った後２ｘＳＳＣ溶液で室温
で１５分間２回洗い、オートラジオグラフィーをとった。２枚１組のナイロン膜のオートラジオグラフィー上のシグナルが一致したものは
６個あった。得られたシグナルに相当するクローンを単離するために、これらシ
グナルと一致する軟寒天培地上のプラークをガラス管で打ち抜き５０μｌのクロ
ロフォルム存在下１ｍｌのＴＭＧ緩衝液〔５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７・５、１
００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム及び０・０１％ゼラチン〕
中でファージ粒子を一晩抽出し再び大腸菌Ｙ−１０９０株に感染させ９ｃｍシャ
ーレ中で適当量培地し前述の方法でプラークハイブリダイゼーションを行った。
この一連の操作を繰り返すことによりシグナルに相当するクローンを各々単離す
ることができた。その結果独立した６個のクローンを得た。そのうち２個のクロ
ーン、すなわちλhHGF２１とλhHGF５０２について、含まれるｃＤＮＡの塩基配
列を解析した。（２）ｃＤＮＡ断片のサブクローニング及び塩基配列の決定これらのλファージクローンから以下のようにＤＮＡを抽出しプラスミドベクタ
ーｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９及び一本鎖ファージベクターＭ１３ｍｐ１８，Ｍ１３
ｍｐ１９にサブクローニングをおこなった。即ち、500ｍｌ三角フラスコ中の 20
0ｍｌのＮＺＹ培地中において、200μｌのＴＭＧ溶液に懸濁してあるλファージ
クローン２ｘ 10⁷ p.f.u．（p.f.u.；プラーク形成単位）と４０μｌの大腸
菌Ｙ−１０９０株２ｘ 10⁸を３７℃１５分置くことにより感染させた。１５
分後さらに１ｍｌの１Ｍ塩化カルシウムを加え一晩、概ね１４時間ほど培養した
。次に、２ｍｌのクロロフォルムを加え１０分ほど置き、15.8ｇの塩化ナトリウムを加え溶かし、それらを４℃において日立冷却遠心機ＳＣＲ２０ＢＢで、ロー
ターＲＰＲ９−２を用いて６０００回転２０分間遠心した上清に20ｇのポリエチ
レングリコール６０００を加えて十分に溶解した後に氷中で１時間静置した。こ
れを日立冷却遠心機ＳＣＲ２０ＢＢで、ローターＲＰＲ９−２において６０００
回転２０分間遠心し沈澱を６ｍｌのＡ緩衝液〔0.5％ＮＰ４０、36ｍＭ塩化カル
シウム、30ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７・５ 50ｍＭ塩化マグネシウム、125ｍＭ塩
化カリウム、0.5ｍＭＥＤＴＡ、0.25％デオキシコール酸、0.6ｍＭメルカプトエ
タノール〕に懸濁しここに 100μｌの10ｍｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼ
Ｉと10μｌの10ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡを加え３０℃で３０分間保温す
ることにより大腸菌由来の核酸を分解した。その後上記反応液に等量のクロロフ
ォルムを加え良く攪はんしたのちにトミー遠心機ＬＣ−０６、ローターＴＳ−７
で３０００回転１０分間遠心し上清を得た。一方予め日立超遠心機ローターＲＰＳ４０Ｔ用遠心管に40％グリセロール溶液〔
0.5％ＮＰ４０、30ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７・５、125ｍＭ塩化カリウム、0.5ｍ
ＭＥＤＴＡ、0.6ｍＭメルカプトエタノール、10％グリセロール〕を１ｍｌ入れ
ておきその上に３ｍｌの10％グリセロール溶液〔0.5％ＮＰ４０、30ｍＭトリス
−塩酸ｐＨ７・５、125ｍＭ塩化カリウム、0.5ｍＭＥＤＴＡ、0.6ｍＭメルカプ
トエタノール、40％グリセロール〕を重層して準備しておいた上に先ほどのヌク
レアーゼ処理をしたファージ懸濁液を重層し、日立超遠心機７０Ｐ７２、ロータ
ーＲＰＳ４０Ｔで３５０００回転１時間遠心する。遠心後沈澱として落ちてきた
ファージ粒子を 0.4ｍｌの４０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７・５、10ｍＭＥＤＴＡ、
２％ＳＤＳに懸濁し４μｌの10ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼＫを加えて５５℃１時
間保温を行った。その後溶液をエッペンドルフチューブに移し等量のフェノール
／クロロフォルムにてファージＤＮＡを抽出しエタノール沈澱を行うことにより
目的とするファージＤＮＡを 200μｇ得ることが出来た。このファージＤＮＡを
制限酵素ＥｃｏＲＩで常法で従い切断しアガロース電気泳動法にて解析した。そ
の結果クローンλhHGF２１から０．２ｋｂと０．８５ｋｂと０．７２Ｋｂの３本
のＥｃｏＲＩ断片を得た。一方アガロースゲルから該インサートｃＤＮＡ断片を
常法に従い回収することにより目的とするｃＤＮＡ断片を得ることが出来た。これらｃＤＮＡ断片 100ｎｇを予め常法に従い制限酵素ＥｃｏＲＩによって切
断しておいたプラスミドベクターｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９及び一本鎖ファージベ
クターＭ１３ｍｐ１８，Ｍ１３ｍｐ１９ 200ｎｇと10μｌの反応液〔66ｍＭト
リス−塩酸ｐＨ７．６、6.6ｍＭ塩化マグネシウム、10ｍＭジチオスレイトール
、66μＭＡＴＰ、基質ＤＮＡ〕中でユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合し
それぞれのベクターに見合った宿主の大腸菌を常法に従い形質転換することによ
りＥｃｏＲＩ挿入部位にＨＧＦ蛋白質の部分配列を持つサブクローンを得た。得
られたｃＤＮＡサブクローンの塩基配列の決定は、Sangerらのジデオキシ法によ
って行った。プライマーは市販のＭ１３ファージベクターに対応するものを使用
した。その結果、最も長いｃＤＮＡを持つクローンλhHGF２１の塩基配列をアミ
ノ酸に翻訳すると第１図に示すようにすでに明らかにされているアミノ酸配列の
うちプローブの設計に使用したアミノ酸配列とは異なる領域のアミノ酸配列のう
ちのいくつかを含んでいることが判明し、このクローンがｈＨＧＦの少なくとも
一部分の領域を含むｃＤＮＡであることが判明した。また、λhHGF２１にはない
ｃＤＮＡ断片を含むクローンλhHGF５０２のｃＤＮＡの塩基配列をSanger法に従
い解析した結果、クローンλhHGF５０２はクローンλhHGF２１と同じ塩基配列を
第２図で示す制限酵素切断部位ＮｃｏＩの近傍から５’上流から数えて三番目の
ＥｃｏＲＩ切断部位の近傍までの０．８ｋｂの長さで共有し３’側にλhHGF２１
にはない０．７ｋｂの塩基配列をもつことがわかった。λhHGF５０２の塩基配列
のうちλhHGF２１の有しない塩基配列のなかには既に解析されているアミノ酸配
列に相当する塩基配列があることが判明した。これら２つのクローンの塩基配列
を一部が重複する形でつなぎあわせるとｈＨＧＦのアミノ酸配列の全てをカバー
することが判明した。

【図面の簡単な説明】第１図は、本発明のｈＨＧＦのアミノ酸配列を表す。図中、下線はすでに明らか
にされていたアミノ酸配列を示す。第２図は、実施例１で得られた本発明のｈＨＧＦをコードする遺伝子を含むｃＤ
ＮＡの塩基配列を表す。図中に主な制限酵素の認識部位を併記した。また下線は
すでに明かにされていたアミノ酸配列に対応する部分を示しそのうち二重下線は最初のクローンを得る際に使用したプローブに対応するアミノ酸配列を表す。

Claims

【特許請求の範囲】（１）下記のアミノ酸配列で表されるシグナル配列を含む肝実質細胞増殖因子の
全アミノ酸配列をコードすることを特徴とする遺伝子。（２）下記の塩基配列で表される、シグナル配列を含む肝実質細胞増殖因子の全
アミノ酸配列をコードすることを特徴とする遺伝子。