JPH05503945A - サイトカイン型の活性を有するタンパク質、およびその生産のための組換えｄｎａ、発現ベクターおよび宿主 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２２、ＣＨＯ細胞である、請求ｒＪｉ２０または請求項２１記載の動物細胞。

２３、ＣＯＳ細胞である、請求項２０または請求項２１記載の動物細胞。

２４、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡおよびその発現に 必要な手段を含む酵母。

２５、請求項２１または請求項２２記載の動物細胞の培養の工程、ついで組換え タンパク質の分離および精製を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のタ ンパク質の製造方法。

２６　請求項２４記載の酵母の培養工程、ついて組換えタンパク質の分離および 精製を含む、請求項１−１３のいずれが１項に記載のタンパク質の製造方法。

２７　請求項１〜ユ３のいずれか１項に記載のタンパク質を含む医薬。

明　細　書 サイトカイン型の活性を有するタンパク質、およびその生産のための組換えＤＮ Ａ、発現ベクターおよび宿主この発明はサイトカイン型の活性を有する新規タン パク質、その生産のための遺伝子工学的手段、即ち、組換えＤＮＡ、この組換え ＤＮＡを保有している発現ベクター、この組換えＤＮＡを含んでいる原核微生物 および真核細胞、およびこのタンパク質が有効生薬として存在する特に抗ガン剤 または免疫調節剤として有用な薬物に関する。

免疫系は、細胞性因子およびこの因子によって分泌されるサイトカインと呼ばれ る可溶性物質からなっていることはよく知られている。サイトカイン類は、生物 体の免疫系、または別の生物学的系の何れかに属するエミッター細胞と標的細胞 間の伝達をっがさどるタンパク質である。一般にサイトカイン類はいわゆる多面 的生物活性を有し、即ち標的細胞に対して、増殖、分化、細胞溶解、活性化、走 化性など多面的な活性を有している。これらの分子のうちの幾つかは、すでに治 療上の応用が見いだされている。例えばインターロイキン−２またはインターフ ェロンαは免疫療法により、ある種の腫瘍の処置に使用され、ＧＣ３Ｆ　（顆粒 球コロニー刺激因子）または０ＭＣ８Ｆ　（顆粒球・単球コロニー刺激因子）の ような造血因子は、血球の増殖および分化を刺激することによって、化学療法の 結果、血球が減弱した血液を強化することができる。

最初に発見されたサイトカインの１つはインターロイキン−１であるが、炎症に おけるその中心的な活性（好中球の走化性）は、最初、生体内で注射後、この種 の活性を示した実験に基づいている［Ｊ、オノベンハイムら（１９８６年）、イ ミュノロジー・トウデー、７巻、４５〜５６頁〕。現在インターロイキン−１は 、生体内で好中球に対して走化性である別のサイトカイン、即ち、インターロイ キン−８［本来、好中球走化性因子（Ｎ　ＣＦ　）と呼ばれた］の発現を刺激す ることが分かっている。このサイトカインのアミノ酸配列は１９８７年に単離精 製され、その相補的なりＮＡをクローン化し、その配列を決定することにより決 定された［Ｋ、マツシマら（１９８８年）、ジャーナル・オブ・エクスペリメン タル・メジシン、１８８３〜１８９３頁］が、その発見当時、すでに既知であっ た他のサイトカイン類、即ち、ＰＦ４　（血小板因子４）およびＰＢＰ（血小板 塩基性プロティン）のような血小板のα顆粒によって産生されるサイトカイン類 と相同であった。普通、ＳＩＳ　（スモール・インデニースト・シフリーチラド ・プロテインズの意味）ファミリーと呼ばれるインターロイキン−８と相同な既 知のタンパク質ファミリーは、１９８７年来かなり増加した［Ｊ、オッペンハイ ムら（１９９１年）、アニュアル・レビューズ・オブ・イミュノロジー、９巻、 ６１７頁］。現在これに含まれるものは、特に下記のサイトカイン類、即ち、ｇ 　ｒ　ｏ　（ＭＧＳＡ　：黒色腫増殖刺激活性とも呼ばれる）〔Ａ、アニソウィ ッチら（１９８７年）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ −・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８４巻、７１８８〜７１９２頁、 およびＡ、リッチモンドら（１９８８年）　、ＥＭＢ○・ジャーナル、７巻、２ ０２５〜２０３３頁］　、ＲＡＮＴＥＳ　（正常Ｔ細胞の活性化により調節され て発現し、究極的に分泌される）［Ｔ、シャルら（１９８８年）、ジャーナル・ オブ・イミュノロジー、１４１巻、１０１８〜１０２５頁］、ＭＩＰ−１（マク ロファージ・インフラメートリー・プロティン１）　［Ｓ、Ｄ、ウオルブら（１ ９８８年）、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン、１６７巻、５ ７０〜５８１頁］　、ＭＩＰ−２（マクロファージ・インフラメートリー・プロ ティン２）［Ｓ、Ｄ、ウオルブら（１９８９年）、ブロンーディングズ・オブ・ ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８６巻 、６１２〜６１６頁］、ＭＣＰ−１［単球化学誘引性プロティン１、ＭＣＡＦ　 （単球走化性活性化因子）とも呼ばれるコ　［ヨノムラら（１９８９年）、プロ シーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オ ブ・ザ・ＵＳＡ、８４巻、９２３３〜９２３７頁、およびＫ　マツシマら（１９ ８９１Ｅ）、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン、１６９巻、１ ４８５〜１４８９頁］などである。

Ｔ、ヨシムラら（前掲）によって神経膠層系から、またに、マツシマら（前掲） によって単球系から単離されたサイトカインＭＣＰ−１には、１３ｋＤａおよび １５ｋＤａの見掛けの分子量を有するＭＣＰ−１αおよびＭＣＰ−１βと呼ばれ る２つの形が存在し、これらは翻訳後修飾に対応するものと思われる［Ｙ　ジア ングら（１９９０年）、ジャーナル・オブ・バイオケミカル・ケミストリー、２ ６５巻、１３１８〜１３２１頁］。サイトカインＭＣＰ−１は単球および好塩基 球に対する走化活性を有するが、好中球に対しては走化性を有せず［Ｅ、Ｊ、レ オナルト（１９９０年）、イミュノロジー・トウデー、１１巻（３）、９７〜１ ０１頁］、ある種の腫瘍系に対する単球の静細胞活性を刺激する効果を有する［ Ｋ　マツシマら（１９８９年）、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジ シン、１６９巻、１４８５〜１４９０頁］。

核磁気共鳴分光法またはＸ線回折法によるインターロイキン−８およびＰＦ４に 関する３次元構造の研究から、これら２つのサイトカインは、αヘリックスの形 で１２〜１５アミノ酸からなるカルボキン末端ペプチドをもった同一のコンホメ ーションを有することが判明した［Ｒ，Ｓ　ｔ　チャールズら（１９８８年）、 ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６４巻（４）、２０９２ 〜２０９９頁、およびＧＭ、クロア（１９９０年）、バイオケミストリー、２９ 巻、１６８９〜１６９６頁１゜Ｇ、Ｍ、クロアによれば、ＳＩＳファミリーに属 するサイトカイン類の大多数が、そのようなαヘリックスの形でカルボキシ末端 部分を有するが、このヘリックスの役割はいまだ解明されるに至っていない［Ｃ ）１−パートら（１９９１年）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト リー、２６６巻、１８９８９〜１８９９４頁］。

最近、１３アミノ酸からなるカルボキシ末端ペプチドが、サイトカインＰＦ４の 抗血管形成活性（血管壁の増殖阻止）を有し得ることが判明したＣＴ、　メイヨ ンら（１９９０年）、サイエンス、２４７巻、７７〜７９頁〕。Ｄ、　Ｇ、オス ターマン［１９８２年、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ ・コミュニケーンヨンズ、１０７巻、１３０〜１３５頁］によれば、このペプチ ドはＰＦ４よりも３０倍強い単球に対する走化活性を有する。

この発明は、下記の配列（ａｌ） と、配列（ａｌ）のすぐ上流にある下記の配列（ａ２）Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ 　ｒｌｃ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｃｕ　Ｇｌｕ　Ｓｃｒ　Ｔｙｒ 　Ａｒｇ　ＡｒｇＴｈｒ　Ｔｈｒの一部、またはこの配列（ａ２）と１またはそ れ以上のアミノ酸が異なり、これと同一の活性をタンパク質に付与する配列を含 んでおり、または配列（ａ２） Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｓｃｒ　Ｔｈｒ　 Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　ｒｌｅｌ　５　１０　１５ Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｏｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｃｕ　 Ｇｌｕ　Ｓｃｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　ＴｈｒＳｃｒ　Ｓｃｒ　Ｈ ｉｓ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　ＡＩＸＩＶａｌ　Ｉｌｃ　Ｐｈｃ　Ｌ ｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ３５　４０　’　４５ Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｉｌｃ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　 Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｐｈｅと、（ａ２）のすぐ下流に、 配列（ａｌ）Ｍｅ＋　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｃｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈ ｒ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕｌ　５　１０ または配列（ａｌ）と１またはそれ以上のアミノ酸が異なり、これと同一の活性 をタンパク質に付与する配列を含んでいることからなるサイトカイン型の活性を 有する新規タフバク質に関するものである。

配列（ａｌ）のすぐ上流にある配列（ａ２）の一部は、下記の配列 ＧＬｎ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　およびＧｌｎ　Ａ ｓｐ　Ｐｈｅから選ぶことができる。

好ましくは配列（ａｌ）のすぐ上流にある配列（ａ２）は、配列（ａ２）、およ び下記の配列（ａ３） および配列（ａ４） （ａ４）　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ 　Ｓｃｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　ＴｈｒＴｈｒ　Ｓｅｒ@５ｅｒ Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｉｌｃ　Ｐｈｅ　 ＬｙｓＴｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　ＧｌｕＴｌｃ　Ｃｙｓ　Ａｌ ａ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ａｓ ｐ　Ｐｈｃまたは配列（ａ２）、（ａ３）または（ａ４）と１またはそれ以上の アミノ酸が異なり、これと同一の活性をタンパク質に付与する配列から選ばれる 。

配列（ａ２）は特に有用であり、この場合、タンパク質は恐らくアミノ末端封鎖 を有すると思われる。このタンパク質の配列およびアミン末端封鎖は、サイトカ インの発現を刺激する条件下に、末梢血で単核細胞から分泌されるタンパク質の 場合と恐らく対応するであろう。それらのアミノ酸配列に関する限り、このタン パク質はサイトカインＭＣＰ−１とある一定の相似性を保有し、これと同様のサ イトカイン型活性を有している。このタンパク質はＳＩＳファミリーの新しい一 員を構成する。

このタンパク質は、好ましくはＳＤＳの存在で行うポリアクリルアミドゲル電気 泳動による測定で、９±２．１１＝２、または１６±２　ｋＤａの見掛けの分子 量を有する形である。このタンパク質は、１６±２　ｋＤＡの見掛けの分子量を 有する形であるとき、特に都合よくＮ−グリコジル化されている。このタンパク 質は、１１±２　ｋＤＡの見掛けの分子量を有する形であるとき、特に都合よく ○−グリコジル化されている。

このタンパク質は、ＳＤＳの存在でポリアクリルアミドゲル電気泳動じ、硝酸銀 で現像することによる測定で、好ましくは９０％以上の純度、特に９５％以上の 純度を有する。

さらにこの発明は、上記のタンパク質を暗号化し、または都合よく上記のタンパ ク質の前駆物質を暗号化し、ついでこのタン／くり質を細胞溶解物から得ること ができる組換えＤＮＡに関する。。上記の前駆物質は好ましくはシグナル配列を 含んでいる。

このシグナル配列の官能性は宿三細胞にしたがって選ばれるが、この場合、細胞 質からの組換えタンパク質の分泌を可能とし、それによって組換えタンパク質が 天然タンパク質のコンホメーションと類似のコンホメーションを取り、その精製 をかなり容易にできるようにする。このシグナル配列は、成熟タンパク質によっ て放出されるシグナルペプチダーゼによる１段階で、あるいはさらにこのシグナ ル配列がシグナルペプチダーゼによって除去される配列（シグナルペプチドまた はプレ配列と呼ばれる）に追加して、１段階またはそれ以上のタンパク質分解処 理段階の後段で除去される配列（プロ配列と呼ばれる）を含んでいる場合は、数 段階でこれを切断することができる。

例えばエンエリキア・コリのような原核微生物で発現するには、原核微生物によ って分泌されるタンパク質の天然前駆物質に由来する配列（例えばシグナルペプ チド○ＭＰａ［グレイニブら、１９８４年、ＥＭＢＯ・ジャーナル、３巻、２４ ３７〜２４４２頁］）、またはアルカリ性ホスファターゼの配列［ミカエリスら 、ジャーナル・オブ・バクテリオロシー、１９８３年、１５４巻、３６６〜３７ ４頁コ、または真核性前駆物質に由来する非内分泌性配列（例えばヒト成長ホル モンの天然前駆物質の１つのシグナルペプチド）、または合成シグナルペプチド （例えばフランス特許出願第２６３６６４３号に報告された Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　 Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕｌ　５　１０　１５ Ｃｙｓ　Ｌｃｕ　Ｐｒｏ　Ｓｃｒ　Ｔｒｐ　Ａｓｎにａ　Ｇｌｙにａ）。

で示される配列）の何れかであり得る。

子嚢菌類のような真核細胞、例えば酵母サツカロミセス・セレビシアエ、または 糸状菌クリフオネクトリア・バランチカで発現するには、このシグナル配列は、 好ましくはこれらの細胞によって分泌されたタンパク質の天然前駆物質、例えば 酵母であればインベルターゼの天然前駆物質（ヨーロッパ特許出願第０１２３２ ８９号）、またはフェロモンαのプレプロ配列の前駆物質（オランダ特許出願系 ２４８４／８４号）、またはクリフオネクトリア・ノ々ラシチ力であればエンド チアペプシンのプレプロ配列の前駆物質に由来する配列 Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｅ！Ｊ Ｖａｌ　Ｔｈｒんａ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙｌ　５　１０　１５ Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　 Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　ｒｌｅ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　ＡｓｎＡＩａＳｃｒ　Ｐｒ ｏ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｐｈ ｃ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　ＡｒｇＡｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ 　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｔ：ｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙ ｓ　Ｔｈｒ　Ｔｙ■ Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　 Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇ１ｎＡｓｎ　Ｓｃｒ　Ｔ ｈｒ　Ｓｃｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｒｇで示される配列である 。

動物細胞で発現するためには、使用するシグナル配列は、分泌されることが知ら れている動物細胞タンパク質のシグナル配列、例えばインターロイキン−２の分 泌を起こすことがすでに知られてし＼るヒト成長ホルモンの天然前駆物質の１つ のシグナルペプチド（フランス特許出願第２６１９７１１号参照）か、または下 記の配列（Ｎｂｌ）、（Ｎｂ２） ＯＣＴＴＧＣＴ および（Ｎｂ３） ＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧ　ＧＧＧＣＴＴＧＣＴによって都合よく暗号化されている 下記の３種のシグナル配列（ｂｌ）、（ｂ２） （ｂｌ）　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｓｃｒ　Ａｌａ　Ａｈａ　Ｌｃｕ　Ｌｅｕ 　Ｃｙｓ　Ｌｃｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＴｈｒんａんａＡ］ａＰｈｅ　Ｓｅｒ　Ｐ ｒｏ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｌｃｕ　Ａｌａ（ｂ２）　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐ ｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａんａ　Ｌｅｕ 　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　kｅｕ ｌ　５　１０　１５ Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｓｃｒ　Ｐｒｏ　 Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌａおよび（ｂ３） （ｂ３）　Ｍｅｔ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ 　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌ≠■■ ｌ　５　１０　１．５ Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｌ：ｌんａんａ 　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕｈａ のうちの１つの何れかのシグナル配列である。

成熟タンパク質を暗号化しているヌクレオチド配列は、例えば下記の配列（Ｎａ ２） である。

この発明はさらに、その発現に必要な手段とともに上記の組換えＤＮＡを保有し ている発現ベクターに関する。

原核微生物、特にエシェリキア・コリで発現するには、組換えＤＮＡを、特に効 果的なプロモーターを含んでいる発現ベクターへ挿入し、さらに発現される遺伝 子のりホソーム結合部位上流、および発現される遺伝子の効果的な転写終結配列 下流を挿入しなければならない。このベクターはまた複製開始点および選択マー カーを含んでいなければならない。これらの配列は、すべて宿主細胞にしたがっ て選択されなければならない。

真核細胞で発現するためには、この発明の発現ベクターは、その発現に必要な手 段、および好適であれば真核細胞でその複製に必要な手段、および／または形質 転換した細胞の選別に必要な手段とともに上記の組換えＤＮＡを保有する。好ま しくはこのベクターは、例えば受容体真核細胞の変異を相補するように選ばれ、 それによってそれらのゲノムか、または多重コピーベクターの何れかへ、組換え ＤＮＡを多数のコピーとして組込むことができる細胞を選び得る選択マーカーを 保有する。

酵母のような真核細胞、例えばサツカロミセス・セレビンアエで発現するために は、一方は効果的なプロモーター、他方は転写ターミネータ−と認められる配列 の間に組換えＤＮＡを挿入する必要がある。発現カセットと呼ばれるプロモータ ー／コード配列／ターミネータ−組立て物は、酵母のための単一コピーまたは多 重コピープラスミドベクターでクローン化するか、あるいは多重コピーとして酵 母のゲノムへ組込まれる。

この発明はさらに、その発現に必要な手段とともに上記の組換えＤＮＡを含んで いる酵母に関する。

この発明はさらに、この酵母の培養段階、ついて組換えタンパク質の単離および 精製段階を含む上記のタンパク質の生産方法に関する。

子嚢菌類に属する糸状菌、例えばアスペルギルス属、ニューロスポラ属、ポドス ボラ属、トリコデルマ属、またはクリフオネクトリア属のよ支な真菌類の真核細 胞で発現するには、この発明の発現へフタ−は、その発現に必要な手段、および 好適であれば選択マーカーおよび／またはテロメア配列とともに、上記の組換え ＤＮＡを保有する。つまり対象となるＤＮＡとして同一のベクター上、または別 のベクター上の何れかに位置した選択マーカーの助けを借りて、対象となるＤＮ Ａを組込んだ形質転換体を選び出すことができ、ここでこれら２つのベクターは 同時形質転換によって導入される。この発明の組換えＤＮＡは、糸状菌のゲノム へ挿入するが、あるいはこのＤＮＡを複製し、これを分配できる配列によって染 色体外の形で保存することができる。

動物細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現するには、組 換えＤＮＡを、好ましくはこの発明の組換えＤＮＡを挿入した単一の発現単位、 および好適であれば効果的なプロモーターの前に選択マーカーを含んでいるプラ スミド（例えばｐＢＲ３２２から誘導した）へ挿入するか、または２つの発現単 位へ挿入する。第１の発現単位は効果的なプロモーター（例えばＳＶ４０早期プ ロモーター）によって先行される上記の組換えＤＮＡを含む。開始ＡＴＧを取り 巻く配列は、好ましくはコザックが報告した共通配列［Ｍ、コザノク（１９７８ 年）、セル、１５巻、１１０９〜１１２３頁Ｊにしたがって選ぶ。イントロン配 列、例えばマウスα−グロビンのイントロン配列を組換えＤＮＡの上流へ挿入で き、ポリアデニル化部位を含む配列、例えばＳＶ４０ポリアデニル化配列を組換 え遺伝子の下流へ挿入することができる。第２の発現単位は、選択マーカー、例 えばンヒドロ葉酸レダクターゼ（以下、ＤＨＦＲと略称される酵素）を暗号化し ているＤＮＡ配列を含んでいる。このプラスミドを動物細胞、例えばＣＨＯｄｈ ｆｒ−細胞（ＤＨＦＲを発現できない）へ移入する。メトトレキセート耐性につ いて細胞系を選別する。選び出された系は組換えＤＮＡの多数のコピーをゲノム へ組込まれており、このＤＮＡを十分量発現する。

この発明はさらに、その発現に必要な手段とともにこの組換えＤＮＡを含んでい る動物細胞に関する。このＤＮＡを、例えば上記の発現ベクターのトランスフェ クションにより、またはこのＤＮＡを保有しているウィルスまたはレトロウィル スによる感染により、あるいはマイクロインジェクションによって細胞へ導入し 得る。好ましい動物細胞は、ＣＨ○細胞、特にＣＨＯｄｈｆｒ−細胞であり、こ れによってこの発明のタンパク質について高度に生産的である系を得ることがで きる。またＣＯ８細胞は、このタンパク質を得るのに好都合な宿主を構成する。

この発明はさらに、上記の動物細胞の培養段階、ついで組換えタンパク質の単離 および精製段階を含む上記のタンパク質の生産方法に関する。

この発明はさらに、これらの動物細胞の培養段階、ついで組換えタンパク質の単 離および精製段階を含む方法によって入手し得る組換えタンパク質に関する。

この発明のタンパク質は、単球、即ち腫瘍増殖を阻止することができ［Ｂｊ、ロ リングら（１９９１年）、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロン−１１ １巻、６．３１２５〜３１３１頁コ、またリーンユマニア・メイシャーのような ある種の原虫を駆除することができる細胞［Ｓ、ステンガーら（１９９１年）、 ヨーロビアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー、２１巻、３２７〜３３３頁 ］に対する走化活性を有するサイトカインである。

したがってこの発明はさらに、癌腫学、および例えばある種の原虫の存在のため に免疫防御が弱まっているある種の感染疾患（例えばリーシュマニア症、ライ、 またはシャガス病）の処置に特に有用な薬物に関するものであり、ここでこの薬 物は、上記のタンパク質またはペプチドを製薬上許容し得る賦形薬中に有効主薬 として含有する。上記の有効主薬は、それらを単独、または他の有効薬物、例え ば１またはそれ以上の他のサイトカイン類と併用して使用することができる。

この発明についてさらに理解を深めるため、以下に実験結果、およびその考察を 含め、それぞれ節を分けて説明する。これらの節の幾つかは、発明を成功させる 目的のために実施した実験に関するものてあり、他はこの発明の実際の実施例に 関するものである。当然のことながらこれらの説明は、単に発明を説明する目的 のためのものである。

下記の技術は当業者周知のものであり、すべてサンプルツクらの論文に極めて詳 細に説明されている［サンプルツクら、「モレキュラー・クローニング、ア・ラ ボラトリ−・マニュアルＪ　（１９８９年）、コールド・スプリング・ハーバ− ・プレス社刊、ニューヨーク（第２版）］。

以下、第１ａ、ｌｂ、２〜５．６ａ、６ｂ、および６ｃ図によってこの発明をさ らに詳細に説明する。

第１ａ図は、エンエリキア・コリでクローン化し、動物細胞で発現するためのプ ラスミドであるプラスミドｐｓＥ１の組立て地図である。図中、ライゲーション によって消失した部位をカッコ内に示す。この図で使用した記号はこのプラスミ ドに関する説明のところ（セクション２）で説明する。

第１ｂ図はプラスミドｐｓＥ１の組立てに使用した合成ｒＨｉｎｄ　０丁へ結合 する部位」〜ＨｉｎｄＩＩＩ断片の配列を示す。

第２図はＮＣ２８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列であり、下段は翻訳されたアミノ 酸配列を示す。翻訳を開始できる３個のＭｅｔを実線で、シグナルペプチドの切 断部位と思われる部分を矢印で、Ｎ−グリコジル化部分の可能性が高い部分を破 線で示す。

第３図および第４図は、それぞれニードルマンおよびブンンニの方法［１９７０ 年、ジャーナル・オブ・モレキユラー・）＼イτロンー１４８巻、４４３〜４５ ３頁］によるＮＣ２８ｃＤＮＡから翻訳したアミノ酸配列（上段）、およびサイ トカインＭＣＰ−１のＣＤＮＡから翻訳したアミノ酸配列（下段）、およびこの 方法によるＮＣ２８ｃＤＮＡ、（上段）、およびサイトカインＭＣＰ−１のＣＤ ＮＡ　（下段）の配列の最大相同配列を示す。

第５図は、酵母で発現するためのベクター、プラスミドｐ　ＥＭＲ６１７の組立 てで使用した断片Ｂの配列を示す。

第６ａ、６ｂ、６ａ図は走化活性を証明する実験に関するものである。

第６ａ図は、酵母から誘導した精製タンパク質ＮＣ２８、ＣＯ８細胞から誘導し た精製タンパク質ＮＣ２８、およびペプチドＣ１３、Ｃ１６、Ｃ２０、ｆ　ＭＬ 　Ｐについて、１顕微鏡視野当たりの細胞数を濃度（ｎＭ）の関数として示した 図である。

第６ｂ図は、酵母から誘導した精製タンパク質ＮＣ２８、およびＣＯ８細胞から 誘導した精製サイトカインＭＣＰ−１について、１顕微鏡視野当たりの細胞数を 濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数として示した図である。

第６ｃ図は、酵母から誘導した精製タンパク質ＮＣ２８、サイトカインＩＬ−８ 、およびペプチドｆＭＬＰについて、１顕微鏡視野当たりの細胞数をａ度（ｎｇ ／ｍｌ）の関数として示した図である。

セクション１　末梢血単核細胞の培養およびＰＭＡおよびＰＨＡ−Ｐによる刺激 ：相補的なりＮＡライブラリー作成に使用したメツセンジャーＲＮＡの調製 （１）末梢血単核細胞の培養および刺激末梢血バッグ（輸血センターの３人の健 常ボランティア−から採取）から、まずサイトアフエレ／スおよびフィコール密 度勾配遠心［ゴーシャットら（１９８９年）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ ・イミュノロジー、１９巻、１０７９頁］を行って末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ ）を豊富に含んだ概略下記の構成［リンパ球７０％、単球２５％、顆粒球５％（ コウルター型Ｓブラスエｖセルカウンターを使用して計数した細胞数）］からな る細胞画分を得る。

細胞を２５０ｍ１のフラスコに採取し、ついで３７℃で１０分間遠心する。上清 を除き、細胞残留物をグルコース、無機塩、アミノ酸、ビタミンからなるＲＰＭ Ｉ培地と呼ばれる培地（ＲＰＭ１１６４０培地、ギブコＢＲＬ社）５０ｍＭです すぎ、ついで前記と同一条件下で再度遠心する。

ついて細胞残留物を１０％０％ラン血清（ギブコＢＲＬ社、製品番号：０１３− ０６２９０Ｈ）を補給したＲＰＭＩ培地５００ｍ１へ取り、これに培地１の１当 たりペニシリン１０単位およびストレプトマイシン１０ｇｇ（ペニシリン／スト レプトマイシン溶液、キブコ社、製品番号　０４３−０５１４０Ｄ）を添加し、 さらにＬ−グルタミン（ギブコＢＲＬ社、製品番号：　０４３−０５０３０Ｄ） を最終濃度２ｍＭとなるまで添加した。

粘着細胞苓よび非粘着細胞を分離するため、細胞浮遊液の１部を大きな四角い４ 枚の培養皿（２４５Ｘ２４５Ｘ２０ｍｍ、ヌンク社、製品番号：１６６５０８） に１皿当たり約１００ｍ１の割合で分け、これを３７℃で１時間インキュベート する。実際、単球の大部分は培養皿へ粘着するが、リンパ球の大部分は浮遊液に 残ることが知られている。

非粘着細胞をピペットで吸い取り、表面積１７５ｃｍ２のファルコン型培養フラ スコで、上記のように補給したＲＰＭＩ培地の存在で、さらにホルボール−２− ミリステート−３−アセテート（ＰＭＡ）（シグマ社、製品番号・Ｐ８１３９） およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ−Ｐ）（シグマ社、製品番号：Ｌ８７５４ ）を添加し、５％Ｃ○２の存在で３７８Ｃで２４時間これを培養する。

上記のように補給し、さらにＰＭＡ　１０ｎｇ／ｍｌおよびＰ）（Ａ−Ｐ　５部 ｇ／ｍｌを添加したＲＰＭＩ培地１００ｍ１を粘着細胞へ加える。細胞を５％（ ｖ／ｖ）Ｃｏ２の存在で３７℃で５時間インキュベートする。

細胞浮遊液の残り（以下、全細胞と呼ぶ）を、大きな四角い４枚の培養皿に分け 、上記のように補給し、さらにＰＭＡ　ＩＱｎｇ／ｍｌおよびＰＨＡ−Ｐ　５ｇ ｇ／ｍｌを添加したＲＰＭＩ培地の存在で、５％（ｖ／ｖ）Ｃｏ２の存在で３７ ℃で、最初の２枚の皿の場合は５時間、他の２枚の皿の場合は２４時間インキュ ベートする。

インキュベーション終了の約２時間前に、シクロへキシミド（シグマ社、製品番 号：Ｃ６２５５）１０μｇ／ｍｌ　（サイトカイン類のＲＮＡの安定性を増大さ せる翻訳阻害剤）［Ｔ、リントスチンら（１９８９年）、ザイエンス、２４４巻 、３３９〜３４４頁参照コをこれらのさまざまな細胞の培養培地へ添加し、さら に２時間、３７°Ｃでインキュベーションを続ける。

（２）メツセンシャーＲＮＡの調製 （ａ）メツセンツヤ−ＲＮＡの抽出 下記の態様で細胞を回収する。

粘着細胞をＰＢＳ　（リン酸緩衝化食塩水、ギブ＝ＢＲＬ社、製品番号　０４１ ０４０４０）て２回洗浄し、ついでゴム製かき取り器でかき取り、遠心する。こ れによって残留物Ａと呼ばれる細胞残留物を得る。

非粘着細胞については、細胞浮遊液を含有するフラスコを振とうしたのち、細胞 浮遊液を除いて遠心する。これによって細胞残留物ＮＡと呼ばれる細胞残留物を 得る。

全細胞については、粘着画分を上記のようにＰＢＳで２回洗浄してかき取り、つ いでこれを遠心する。非粘着画分を遠心する。得られた２種類の細胞残留物をつ いでプールする。このプールで、全細胞を５時間インキュベートした場合は、細 胞残留物Ｔ（５ｈ）と呼び、全細胞を２４時間インキュベートした場合は、Ｔ（ ２４ｈ）と呼ぶ。

細胞残留物、Ａ、ＮＡ、Ｔ　（５ｈ）およびＴ（２４ｈ）を凍結し、−８０℃で 保存する。

凍結した各細胞残留物を、下記の組成［ＯＭグアニジンチオシアナート、５部ｍ Ｍｈリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ７，５）および１０ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ］からなる細胞溶解緩衝液にそれぞれ浮遊させる。浮遊液をウルトラ・ツ ラックスＮｏ、２３１２５６音波処理機（ジャンプ・アンド・クンケル社）を使 用して最大出力で２０秒ずつ４サイクル音波処理する。β−メルカプトエタノー ルを０．２Ｍ添加して、さらに３０秒音波処理サイクルを実施する。

塩化リチウムを３Ｍ添加する。上清を４℃に冷却し、この温度で４８時間静置す る。ついで６０分間遠心によってＲＮＡを単離する。

ＲＮＡ残留物を３Ｍ塩化リチウム溶液で１回洗浄し、再度遠心し、ツイテ下記の 組成［１％ＳＤＳ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５ ）］にタンパク分解酵素Ｋ（ベーリンガー・マンハイム社）１ｍｇ／＋ｓｌを添 加した緩衝液に加える。４０℃で１時間インキュベーションの後、ＲＮＡ溶液を フェノール／クロロホルム混合物で抽出する。水層に含まれているＲＮＡを、最 終濃度０．３Ｍの酢酸アンモニウム溶液およびエタノール２５容量の溶液で＝２ ０℃で沈殿させる。混合物を１５０００ｇで３０分間遠心し、残留物を保存する 。

（ｂ）ＲＮＡのポリＡ゛画分の精製 残留物を下記の組成［１１０Ｉｎトリス−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）および１ｍＭ ＥＤＴＡ］の緩衝液（ＴＥ緩衝液）１ｍ１に取り、撹拌装置によって浮遊させる 。３型オリゴｄＴ−セルロース（コラボレイティブ・リサーチ社、バイオメジカ ロ・プロダクト・ディビジョン）を製造会社の指示にしたがい調製する。オリゴ ｄＴ−セルロース上にＲＮＡを付着させてゆるやかに振とうし、ボード上に浮遊 させ、ついで６５℃で１分間加温する。

浮遊液をＮａＣｌで０．５Ｍに調節し、ついでゆるやかに１０分分間上うする。

ついで浮遊液を１０００ｇで１分間遠心し、上清を除き、残留物を０．５ＭＮａ Ｃｌを含有するＴＥ緩衝液１ｍｌで２回洗浄する。上清を除く。ビーズをＴＥ緩 衝液１ｍｌに浮遊させることによって、ＲＮＡのポリアデニル化画分（メツセン ジャーＲＮＡを含む）を溶出し、ついでこの浮遊液を６０℃で１分間加温し、さ らに傾斜板上で１０分分間上うする。ついて浮遊液を１０００ｇで１分間遠心し 、溶液中に遊離メツセンジャーＲＮＡを含有する上清の回収ができるようにする 。上記の一連の操作（溶出から）を２回反復する。このようにして得られた上清 をプールし、残留ビーズを遠心によって除去し、上清をエタノール３容量および 最終濃度０．３ＭのＮａＣｌ溶液で沈殿させる。

細胞残留物ＡＳＮＡ、Ｔ　（５ｈ）およびＴ（２４ｈ）から出発して、この処理 により、４種類のＲＮＡポリＡ゛の試料を得る。以下これらの試料を、それぞれ ＲＮＡポリＡ”−Ａ、ＲＮＡポリＡ−−ＮＡ、ＲＮＡポリＡ′″−Ｔ　（５ｈ） 　、ＲＮＡポリＡ”−Ｔ　（２４ｈ）という。

セクション２　末梢血単核細胞に特異的な配列を豊富に含んでいる相補的ＤＮＡ ライブラリーの作成 （１）クローニングベクターｐｓＥ１の組立て採用方針として、一般に誰にでも 入手できる既存のプラスミドから得られる断片および現在一般に利用できる技術 によって合成される断片を使用する。　採用したクローニング技術は、Ｔ　マニ アティス、Ｅ、Ｆ　フリッチ、およびＪ　サンプルツクが、「モレキュラー・ク ローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル」　（コールド・スプリング・ハー バ−・ラボラトリ−１１９８４年）で報告した方法である。オリゴヌクレオチド はバイオサーチ・８７００　ＤＮＡ・シンセサイザーを使用して合成する。

以下の説明は、第１ａ図を参照することによって一層明らかに理解し得る。

プラスミドは、下記の要素を逐次ライゲーションすることによって組立てた。

（ａ）ＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片 第１ａ図で÷＋＋　＋　＋＋の記号で表したこの２５２．５ｂｐの断片は、プラ スミドｐＴＺ１８Ｒ（ファーマシア社）を制限酵素ＰｖｕＴＩて完全消化するこ とにより得た。この断片はファーンｆ１の複製開始、！！５．（第１図、ＯＲＩ 　Ｆｌで示す）、アンピシリン耐性を保有する遺伝子（第１図１．Ａｍｐ’）お よびこのプラスミドの複製をエシェリキア・コリで可能にする複製開始点（第１ 図、ＯＲＩ　ｐＢＲ３２２で示す）を含んでいる。第１のＰｖｕ工Ｉ平滑部位は 、（ｇ）で説明する断片のＥｃｏＲＶ平滑部位とのライゲーションによって消失 する（このＥｃｏＲＶ平滑部位も消失する）。

（ｂ）　Ｐ　ｖ　ｕＩＩ−Ｈｐ　ａ　Ｉ断片第１ａ図で■■■■の記号で表した １１２９９位（ＰｖｕＩＩ制限酵素部位）と１０２３９位（Ｈｐａｌ制限酵素部 位）［デツカ−およびパン・オーモント、ジーン、２７巻、１９８４年、１１５ 〜１２０頁］との間にあるこの１０６０ｂｐの５型アデノウイルスＤＮＡの断片 は、ＲＮＡ　ＶＡ−ＩおよびＶＡ（Ｉに関する情報を含んでいる。Ｈｐａｌ平滑 部位は、（Ｃ）で説明する断片のＰｖｕＩＩ平滑部位とのライゲーションによっ て消失する（このＰｖｕＩＩ平滑部位も消失する）。１１２１８位にあるＡｐａ Ｉ部位は酵素ＡｐａＩで切断し、ファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼでエクソヌ クレアーゼ的に処理し、再ライゲーションにより除かれた。

（ｃ）　Ｐｖ　ｕＩＩ−Ｈｉ　ｎ　ｃｔＩＩＩ断片第１ａ図で刀刃ππの記号で 表したこの３４４ｂｐの断片は、制限酵素ＰｖｕＩＩおよびＨｉ　ｎ　ｄＩＩＩ による完全消化によって得られたＳＶ４０　ＤＮＡから誘導された。この断片は ＳＶ４０　ＤＮＡの複製開始１点および早期プロモーターを含んでいる［Ｂ、　 Ｊ　バイネら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ（１９８３年）、８０巻、７２１〜７２５頁 参照］。

ＨｉｎｄｌＩＩ部位は、（ｄ）で説明する断片のＨｉ　ｎ　ｃＨＩＩへ結合する 部位とのライゲーションによって消失する。

（ｄ）合成ｒＨｉ　ｎ　ｄＩＩＩへ結合する部位Ｊ　〜Ｈｉ　ｎ　ｄＩＩＩ断片 第１ａ図で□の記号で表されたこの４１９ｂｐ断片（第１ｂ図にその配列を示す ）は、ＨＴＬＶＩの翻訳されない５′配列［Ｒワイスら、「モレキュラー・バイ オロジー・オブ・ツモール・ウイルンズ」、第２部（第２版）、１９８５年、コ ールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１１０５７頁］と類似の配列、お よびマウスα−グロビン遺伝子の遠位イントロン［Ｙ、ニンオカら（１９７９年 ）、セル、１８巻、８７５〜８８２頁］を含んでいる。

（ｅ）合成Ｈｉｎｄ工ＩＩ　〜ｒＢａｍＨＩへ結合する部位」断片第１ａ図でｘ ｘｘｘｘｘの記号で表したこの断片は、ファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼのプ ロモーター、および特にＡｐａＩおよを含んでいる。

（ｆ）ＢａｍＨＩ−Ｂｃ　ｌ　Ｉ断片 第１ａ図でムムムムムムの記号で表したこの２４０ｂｐ断片は、ＳＶ４０　ＤＮ Ａの酵素ＢｃｌＩおよびＢａｍＨＩによる完全消化によって得られた小断片であ って、Ｓ〜’４０後期ポリアデニル化部位［Ｍ、フィッジェラルドら（１９８１ 年）、セル、２４巻、２５１〜２６０頁］を含んでいる。ＢａｍＨＩおよびＢｅ ］Ｉ部位は、それぞれ（ｅ）で説明した断片のｒＢａｍＨＩへ結合する部位」お よび（ｇ）で説明した断片のＢａｍＨＩ部位とのライゲーションによって消失す る（このＢａｍＨＩ部位も消失する）。

（ｇ）ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片 第１ａ図で○ｏｃｏｏｏの記号で表したこの１９０ｂｐ断片は、プラスミドｐＢ Ｒ３２２から、酵素ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩによるその完全消化後に誘導さ れた小断片である。

したがってプラスミドｐｓＥ１はエシェリキア・コリでクローニングベクターと して使用されるのに必要な要素（エシェリキア・コリにおける複製開始点および プラスミドｐＴＺ１８Ｒに由来するアンピンリン耐性遺伝子）、および動物細胞 における発現ベクター（ＳＶ４０のプロモーター、ポリアデニル化部位、複製開 始点）、および配列決定するための１本鎖コピー（ファージｆ１の複製開始点） を含んでいる。

（２）末梢血単核細胞に特異的な配列を豊富に含んでいる相補的ＤＮＡライブラ リーの構成 使用したクローン化技術はカプトらが報告した方法である［プライマー・アダプ ター手法、カプトら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ− ・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ　（１９８６年）、８３巻、１６７０ 〜１６７４頁コ。

この方法は、一方でベクターｐｓＥ１をＡｐａＩで消化し、ポリ６０尾部を、突 出した３°末端へ付加し、ついで得られたプラスミドをエンドヌクレアーゼＢａ ｍＨＩで消化することからなる。ベクターに対応する断片をセファロースＣＬ４ Ｂカラム（ファーマンア社）で精製する。したがってこの断片は一方の末端でポ リｄｃ尾部を含み、他の末端はＢａｍＨＩ型の粘着末端である。

他方、第１節の最後に得られたＲＮＡ−ポリＡ゛に、下記の配列５°ＧＡＴＣＣ ＧＧＧＣＣ３゜ を有するプライマーから出発する逆転写を行う。即ち、ｃＤＮＡはその５゛末端 でＢａｍＨＩ粘着末端に相補的な配列ＧＡＴＣＣを有する。

逆転写の作用によって得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドをアルカリ加水分解 することにより、ＲＮＡを除去することができる。

ついで１末鎖ｃＤＮＡを末端トランスフェラーゼて処理して、３゛末端で、ポリ ｄＧを付加できるようにし、セファロースＣＬ４Ｂカラムで２回精製を繰り返す 。

これらのＣＤＮＡをＣＯ３３細胞系（第１．２節で説明したように調製した５Ｖ ４０Ｔ抗原を発現するサル腎臓細胞系［Ｙ　グルラマン（１９８１年）、セル、 ２３巻、１７５〜１８２頁参照］）に由来するＲＮＡ−ポリＡ“とハイブリッド 形成する。

ハイブリッド形成しないｃＤＮＡを単離する（末梢血単核細胞に特異的なメツセ ンジャーＲＮＡと相補的なりＮＡを豊富に含んでいる画分）。

これらのｃＤＮＡを１本鎖の形でベクターｐｓＥ１へ挿入する。

プライマーに相補的な第２のオリゴヌクレオチド（アダプター）はｃＤＮＡの５ ゛末端てＢａｍＨ１部位を生じるのに必要である。ベクター、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａお よびアダプターのハイブリッド形成ののち、組換え体分子をファージＴ４のリガ ーゼの作用によってアニーリングする。ついで１本鎖領域をファージＴ４のＤＮ Ａポリメラーゼによって修復する。得られたプラスミドのプールをエシェリキア ・コリＭＣ１０６１株［カサバダンおよびＳ　コーエン、ジャーナル・オブ・バ クテリオロジー（１９８０年Ｌ１４３巻、９７１〜９８０頁コのエレクトロポレ ーションによる形質転換に使用する。

相補的ＤＮＡライブラリー作成のためのプロトコール（ａ）相補的ＤＮＡの調製 セクション１の末尾で得られた末梢血単核細胞のＲＮＡ−ポリＡ′″［下記の構 成：ＲＮＡ−ポリＡ”−Ａ　０．５μｍｇ、　ＲＮＡ−ポリＡ“−ＮＡ２；ｇ、 ＲＮＡ−ポリＡ−−Ｔ（５ｈ）２μｇ、ＲＮＡ−ポリＡ”−Ｔ　（２４ｈ）　０ ．５μｇからなるコ５μｇから出発して、下記の配列（ＢａｍＨＩ部位を含む） ５’　ＧＡＴＣＣＧＧＧＣＣ３’ からなる合成プライマー（容量１００μｍ）で、”Ｐ−ｄＣＴＰで標識した１本 鎖の相補的ＤＮＡを調製する（得られた相補的ＤＮＡは３０００　ｄｐｍ／　ｎ ｇの比活性を有する）。逆転写酵素（ジニノフィット社、Ｅ１０２２）１００単 位と４６℃で３０分間インキュベートしたのち、Ｏ，，１５Ｍ　ＥＤＴＡ　４ａ ｌを添加する。第１の抽出をフェノール（ＴＥ緩衝液で飽和）で実施し、ついで 第２の抽出をクロロホルムで実施する。ウシ肝臓転移ＲＮＡ１０μｇ１酢酸アン モニウム１０Ｍ溶液１／１０容量、およびエタノール２．５容量を加えて相補的 Ｉ）ＮＡを沈殿させる。混合物を遠心し、残留物をＴＥ緩衝液３０μｍに溶解し 、ポリアクリルアミドＰＩＯカラム（バイオジェルＰ１０−２００〜４００メツ ／ユ、製品番号：１５０１０５０、バイオラド社）を使用する排除クロマトグラ フィーにより、塩類、フェノール、クロロホルムのような小分子を除去する。

（ｂ）ＲＮＡ鋳型のアルカリ加水分解 Ｎ　ａ、　ＯＨの２Ｎ溶液４．６μｍを加え、６８℃でインキュベーションを３ ０分間実施する。ついで２Ｎ酢酸４．６μｍを加え、得られた溶液をポリアクリ ルアミドＰＩＯカラムに通導する。

（ｃ）ｄＧのホモポリマー付加 末端トランスフェラーゼ酵素（ファーマンア、２７０７３００１）６６単位を使 用して、３′末端をｄＧｒ尾部」により伸長する。

３７℃で３０分間インキュベーションを実施し、っＬ：でＱ、５ＭＥＤＴＡ　４ μｍを添加する。

（ｄ）セファロースＣＬ４Ｂカラムによる精製合成プライマーを除去するため、 相補的ＤＮＡを３０ｍＭＮａＯＨ／２ｍＭＥＤＴＡ溶液で平衡化した２つの連続 したセファロースＣＬ４Ｂ　（ファーマシア社）１鵬１のカラムで精製する。

最初の３つの放射性画分（それぞれ約８０μｍ）をプールし、１０Ｍ酢酸アンモ ニウム溶液１／１０容量およびエタノール２．５容量で沈殿させる。相補的ＤＮ Ａの量は１μｇである。

（ｅ）ハイブリッド形成 相補的ＤＮＡの残留物をＴＥ緩衝液２５μｍに浮遊し、ＣＯ８細胞系から抽出し たＲ、ＮＡ−ポリＡ″１５μｇを加え、さらに３Ｍ　ＮａＣ１溶液１／１０容量 およびエタノール２．５容量をこれに添加して、混合物を放置して一２０℃で沈 殿させる。

これを遠心し、残留物を７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、これを下記の組成 ［０，１Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）　、０．３ＭＮａＣｌ、および１ｍ Ｍ　ＥＤＴＡ］からなる緩衝液５μｍに溶解し、得られた溶液を毛細管に加えて 、溶封し、ついて６５°Ｃで４０時間インキュベートする。

毛細管の内容物をＴＥ緩衝液１００＝１で希釈し、これに５ＱｍＭリン酸ナトリ ウム緩衝液（ｐＨ６，８）３００μｍを加える。得られた溶液をこのリン酸緩衝 液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（バイオラド社、製品番号：１３０ ０５２０）へ６０℃で通導する。

リン酸緩衝液の濃度勾配（０，１Ｍ→０．２Ｍ）を通導したヒドロキシアパタイ トカラムにより、１本鎖物質（ハイブリッド形成しない相補的Ｄ　Ｎ　Ａ　）お よび２本鎖物質（相補的ＤＮＡとハイブリッド形成したＣＯＳメッセンンヤーＲ ＮＡ）を分離する。１本鎖の相補的ＤＮＡに対応する両分をプールしく溶出した ｃＤＮＡの２５重量％であって、末梢血単核細胞に特異的な配列を約４倍富化し た画分に対応）、これに転移ＲＮＡ２０μｇを添加し、全容量を１０Ｍ酢酸アン モニウム溶液１／１０容量およびエタノール２，５容量で沈殿させる。この混合 物を遠心し、残留物をＴＥ　２００μｍに溶解し、残りのリン酸塩をポリアクリ ルアミドＰＩＯで除去し、溶液を再度１０Ｍ酢酸アンモニウム溶液１／１０容量 およびエタノール２．５容量で沈殿させる。

残留物を３０ｍＭ　ＮａＯＨ，２ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液３０Ｉ！１に溶解する。

残っている合成プライマーを除去するため、相補的Ｄ　Ｎ　、Ａを、３０ｍＭ　 ＮａＯＨ，２ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液で平衡化した容量１１１１のセファロースＣ Ｌ４Ｂカラム（ファーマンア社）へ負荷する。放射性を有する最初の３画分（そ れぞれ約３０μｍ）をプールする。これらの画分に含まれているｃＤＮＡを１０ Ｍ酢酸アンモニウム溶液１／１０容量およびエタノール２．５容量で沈殿させる 。この方法で回収した相補的ＤＮＡの量は２０ｎｇである。

（ｆ）クローニングベクターｐｓＥ１および相補的ＤＮＡのアダプターの存在で の対合 混合物を遠心し、残留物をＴＥ緩衝液３３１！１に溶解し、クローニングベクタ ーｐｓＥ１　５ｇｌ　（１２５ｎｇ）　、下記の配列（Ａｐａｒ部位を含む） ５’　ＧＧＧＣＣＣＧ　３゜ からなるアダプター１＝１　（１２０ｎｇ）　、および２００ｍＭＮａＣ］溶液 １０〃１を温溶液、６５℃でインキュベーションを５分間実施し、ついて反応混 合物を室温に放冷する。

（ｇ）ライゲーション クローニングベクターおよび１末鎖ｃＤＮＡを、ファージＴ４のＤＮＡリガーゼ 酵素（ファーマシア社、製品番号：　２７０８７００２）３２．５単位（容量１ ００　、！１）中、１５℃で１夜ライゲーシヨンする。

（ｈ）ｃＤＮＡの第２鎖の合成 フェノール抽出、ついでクロロホルム抽出によってタンパク質を除去し、ついで １０Ｍ酢酸アンモニウム溶液１／１０容量およびエタノール２．５容量を添加す る。混合物を遠心し、残留物を下記の組成［３３ｍＭｈリスー酢酸（ｐＨ７，９ ）　、６２．５ｍＭ酢酸カリウム、１ｍＭ酢酸酢酸マグネニウムｍＭジチオトレ イトール（ＤＴＴ）］からなる緩衝液に溶解する。ファージＴ４のＤＮＡポリメ ラーゼ酵素（ファーマシア社、製品番号　２７−０７１８）３０単位、および４ 種のデオキシヌクレオチド三リン酸、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄ ＴＴＰの混合物、およびファージＴ４の３２遺伝子タンパク質（ファー７７７社 、製品番号：２７０２１３）２単位からなる混合物（容量３０＝１）を３７℃で １時間インキュベートして相補的ＤＮＡの第２鎖を合成する。フェノールで抽出 を実施し、ポリアクリルアミドＰＩＯカラム（バイオジェルＰＩＯ−２００−４ ００メツシュ、製品番号：１５０１１０５０−バイオラド社）を使用して痕跡の フェノールを除去する。

（１）エレクトロポレーションによる形質転換バイオラド・ジーン・パルサー装 置（バイオラド社）を使用し、製造会社の指示する条件下で２，５ｋＶで操作す るエレクトロポレーションにより、前記により得られた組換えＤＮＡでエシェリ キア・コリＭＣ１０６１細胞（クローンチック社）を形質転換し、ついで菌を、 下記の組成［バクトド９プ８２１０物６ｇ／リットル、ＮａＣ１１０ｇ／リット ル］からなる所謂ＬＢ培地（サンプルツク、前掲）へアンピンリン１　０　０　 ＝ｇ／ｍｌを添加した培地で６時間３０分増殖する。

増幅前に、寒天１　５に（Ｗ／　Ｖ　）およびアンピノリン１００μｇ／ｍｌを 添加したＬＢ培地（以下、ＬＢゲローズ培地と呼ぶ）の皿に形質転換の１／１０ ００希釈を接種することにより、独立したクローン数を測定する。独立したクロ ーン数は５０００００である。

セクション３　差し引いた相補的ＤＮＡライブラリーのスクリーニングおよびク ローンＮＣ２８の選別 （１）ナイロンフィルター上におけるｃＤＮＡライブラリーの細菌コロニーレプ リカの作成 ｃＤＮＡライブラリーの組換え体細菌約４００００個を、ＬＢゲロース培地を含 むベトリ皿（２４５Ｘ２４５ｍｍ）上に分配する（皿１枚当たり約２０００コロ ニー）。

これらの皿からそれぞれ出発して、皿の表面にナイロン膜（ハイボンドＮ１アマ −ジャム社）を被せ、膜を針で突き抜くことによって照合点を作ることにより、 コロニーをナイロン膜上べ移す。ついで膜を除き、これをＬＢゲロース培地を含 む新しいペトリ皿の表面へ被せる。コロニーを再増殖させるため、この膜を３７ ℃で数時間放置する。この最初の膜から出発して、新しい膜（ＬＢゲロース培地 に被せることによって予め加湿する）を逐次最初の膜と接触させることにより、 ２枚のレプリカを新しい膜上に作成する。膜上に得られたレプリカを最後にＬＢ ゲロース培地の皿に被せ、３０℃で１夜インキユベートする。

膜上のレプリカを、下記の組成［０．５Ｍ　ＮａＯＨおよび１５ＭＮａＣｌ］の 溶液で飽和したワットマン３ＭＭシート上にコロニー表面を上に向けて５分間被 せることにより、細菌を溶解し、ＤＮＡを固定することが可能となる。ついで膜 上のレプリカを、今度は下記の組成［１．　５Ｍ　ＮａＣ１および０．５Ｍ１− リス−ＨＣＩ（ｐＨ８．０）］の中和溶液で飽和した第２のワットマン３１１Ｍ ノート上に！（。膜上のレプリカを２ＸＳＳＣ溶液（ＳＳＣ溶液の組成：０１５ ＭＮａＣ１および０．　０　１　５Ｍクエン酸ナトリウム）ですすぎ、洗浄用脱 脂綿でゆるやかにこすることにより、細菌破片を部分的に除去する。

膜上のレプリカを、ついで下記の組成［１０ｍ１ｎリス−ＨＣＩ（ｐＨ８）　、 １０ａＭ　ＥＤＴＡ，５０ｍＭ　ＮａＣ１、０．１％５ＤＳＩ溶液中、タンパク 分解酵素ｋ（ベーリンガー・マンハイム社）（１０　０　ｇｇ／ｍｌ濃度）で膜 １枚当たり２０ｍ１の割合で処理する。混合物を振とうしながら３７℃で３０分 間インキュベートする。細菌破片のすべての痕跡を完全に除去するため、膜上の レプリカを再度２×ＳＳＣですすぐ。最後にレプリカを濾紙上で数分間、ついで 真空下に÷８０℃で３０分間乾燥する。以上の処理によって、各皿毎に２枚ずつ の膜上レプリカが得られる（以下、これらをレプリカ１およびレプリカ２と呼ぶ ）。

（２）ｃＤＮＡプローブを作成するために使用するＲＮＡの調製（ａ）単一細胞 系Ｕ９３７の培養および刺激単一細胞系Ｕ９３７　（ＡＴＣＣ１５９３）を１０ ％０％ラン血清（ギブコＢＲＬ社、製品番号：０１３−０６２９０Ｈ）を補給し 、培地１０１当たりペニシリン１０単位およびストレプトマイノン１０２ｇを添 加し、さらにＬ−グルタミンを最終濃度２ｍＭとなるまで添加したＲＰＭＩ培地 で培養する。これらの細胞を活性化するため、ペニシリン、ストレプトマイシン 、Ｌ−グルタミン、およびポルホール−２−ミリステート−３−アセテート（Ｐ ＭＡ）（シグマ社、製品番号　Ｐ　８１　９　３）　２　０ｎｇ／ｍｌを添加し たＲＰＭＩ培地で細胞を２４時間培養する。この方法で活性化された細胞をかき 取り、遠心する。得られた細胞残留物を細胞残留物Ｕ９３７Ｐと呼ぶ。

細胞の半分を、培養の最後の２時間、シクロへキンミド（１０μｇ／ｍ１）で追 加的に誘導する。このタンパク質合成の阻害剤は不安定なメツセンジャーＲＮＡ 　（サイトカイン類を含む）を一層安定化することができる［Ｔ　リントスチン ら（１９８９年）、サイエンス、２４４巻、３３９〜３４３頁］。この方法で活 性化した細胞をかき取り、遠心する。得られた細胞残留物を細胞残留物Ｕ９３７ ＰＣと呼ぶ。

（ｂ）ＲＮＡ−ポリＡ゛の調製 細胞残留物Ｕ９３７ｐおよびＵ９３７ＰＣから出発して、ＲＮＡを抽出し、ポリ Ａ−画分を第１〜２節（ａ）および（ｂ）で説明したように精製する。これによ ってそれぞれポリ、へ−１画分およびポリＡ”２画分と呼ばれる２つのＲＮＡ− ポリＡ゛画分を得る。

（Ｃ）放射能標識したｃＤＮＡプローブの調製上記でｔＡ製した２種類のＲＮＡ −ポリＡ゛画分から、下記に説明する態様でそれぞれプローブ１およびプローブ ２と呼ばれる放射能標識したｃＤＮＡプローブを合成する。

下記の組成［５０１１１Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）および１ｍＭＥＤＴ Ａ］からなる緩衝液２〜ａｊｌ中で、ＲＮＡ−ポリＡ−１μｇをオリゴｄＴｎ− ＋ｇ（ファーマシア社）２００ｎｇと６５℃で２分間インキュベートし、室温に 冷却することにより、ハイブリッドを形成する。下記の組成［５０ｍＭ）リス− ＨＣｌ　（ｐＨ８，３）　、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭジチオトレイトール ］の緩衝液（１０ｇｌ）に、各５０μＭ　ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およ び１０ｇＭｄＣＴＰおよび１５０μＣ１ｄＣＴＰ　α３２’　（３０００Ｃｉ／ ミリモル、アマージャム社）、およびＲＮａｓ　ｉ　ｎ　（ＲＮＡ分解酵素阻害 剤、アマージャム社）４０単位を含有する反応容量中で、放射能標識したｃ　Ｄ ＮＡを合成する。反応は、逆転写酵素（ジニノフィット社）１０ｍ２０単位の存 在で４６℃で３０分間実施する。この合成に引き続き、最終容量２０ｇ１までの Ｑ、３ＭＮａＯＨ溶液中でＲ’ＮＡを６５℃で３０分間アルカリ加水分解する。

３Ｍ酢酸の添加により混合物を中和する。容量をＴＥ培地で５０ｇ１に調節する 。これと同量のフェノールで抽出を実施し、さらにこれと同量のクロロホルム／ イソアミルアルコール混合物（それぞれの割合は２４／１）で第２の抽出を行う 。ｃＤＮＡ鎖の合成中に挿入されなかったｄＣＴＰα３２Ｆはポリアクリルアミ ドＰ１０カラム（パイオシニル−２００−４００メツシユ、バイオラド社）によ る排除クロマトグラフィーにより除去する。

ｃＤＮＡの量は６０〜１１００ｎで、１　ｘ　１０　’ｄｐｍ／ｊｇの比活性を 有する。

（４）細菌コロニーのレプリカとｃＤＮＡプローブとのバイブ１ノツト形成 膜上のレプリカを、下記の組成［５０％ホルムアミド、６ＸＳＳＣ，５Ｘデンハ ート溶液、０１％ＳＤＳ、および音波処理し、１０分間、１００℃で変性したの ち添加したサケ精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍ１］からなる緩衝液中で４２℃で２時 間プレハイブリッド化する。膜上のレプリカは、レプリカ１の場合はプローブ１ と、レプリカ２の場合はプローブ２とそれぞれ２日間ハイブリッド形成する。こ れらのプローブを上記の緩衝液中で４ｎｇ／ｍｌの濃度で使用する。５×デンハ ート溶液［サンプルツク（前掲）参照コは下記の組成［フィコール（タイプ４０ ０１フアーマシア社）１ｇ／リットル、ポリビニルピロリド２エ １ｇ／リットルコを有する。

プレハイブリッド化およびハイブリッド形成は、膜１枚当たり、それぞれ緩衝液 ２５ＩＩｌｌおよび１０ｍ１を使用して、ハイブリッド化オーブン（ハイベイト ）中で試験管内で実施する。

ついで膜上のレプリカを、順次、下記の組成［２　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃおよび０、１ ％５ＤＳＩの緩衝液で、２０℃で１５分間ずつ数回、ついで下記の組成［０．ｌ Ｘ５ＳＣおよび０．１％ＳＤＳコの溶液で５５℃で２回洗浄し、ワットマン３　 ＭＭｉＩ紙上で乾燥し、コダックｒＡｉ？５フィルムでオートラジオダラムに掛 ける。

５）既知サイド力インの大多数に対応するオリゴヌクレオチドの混合物とのハイ ブリダイゼーション。

既知サイド力インのメツセンジャーＲＮＡに相補的なりＮＡを含むクローンを同 定するため、上記要領で製造された膜上の別の一連のレプリカを、次のサイトカ イン：インターロイキン−１α（フルタニＹ等、１９８５、「ヌクレイツク・ア シッズ・リサーチ」、１３．５８６９−５８８２）、インターロイキン−１β（ アラロンＰ等、１９８４、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカ デミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・ア メリカ」、８１．７９０７−７９１１）、インターロイキン−２（デグレープＷ 等、１９８３、ｒＥＭＢｏンヤーナル」、２．３２４９−３２５３）、インター ロイキン−３（ヤングＹ、　Ｃ，等、１９８６．４７．３−１０）、インターロ イキン−４（ヨコトＴ等、１９８６、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショ ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ」、８３．５８９４−５８９８）、イ ンターロイキン−５（ヒラメ　Ｔ等、１９８６、「ネイチャー」、３２４．７３ −７５）、インターロイキン−６（メイト等、１９８６、「プロシーディンゲス ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナ イテッド・ステーブ・オブ・アメリカ」、８３．８９５７−８９６１）、インタ ーロイキン−７（ナーメンＡ等、１９８８、「ネイチャー」、３３３．５７１− ５７３）、インターロイキン−８（マツンマに等、１９８８、「ジャーナル・オ ブ・エクスベリメンタル・メディシン」、１６７．１８８３−１８９３）、イン ターロイキン−９（ヤングＹ、Ｃ等、１９８９、「ブラッド」、７４．１８８０ −１８８４）、ＴＮＦα（ペニカＤ等、１９８４、「ネイチャー」、３１２．７ ２４−７２９）、ＴＮＦβ（グレイＰ等、１９８４、「ネイチャー」、３１２． ７２１−７２４）、Ｇ−ＣＳＦ（ナガタ　Ｓ等、１９８６．３１９．４１５−４ １８）、Ｍ−Ｃ３Ｆ（カワサキＥ等、１９８５、「サイエンス」、２３０，２９ １−２９６）、ＧＭ−ＣＳＦ（ウォングＧ等、１９８５、「サイエンス」、２２ ８．８１０−８１５）、ＬＩＦ（グラフＮ等、１９８８、［プロシーディンゲス ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナ イテッド・ステーブ・オブ・アメリカ」、８５．２６２３−２６２７）、インタ ーフェロンα（ゲーデルＤ等、１９８１、「ネイチャー」、２９０．２Ｏ−２６ ）、インターフェロンβ１（タニグチＴ等、１９８０、「ジーンｊ１１０．１ｌ −１５）、インターフェロンγ（グレイ　Ｐ等、１９８２、「ネイチャー」、２ ９５．５０３−５０８）、ＴＧＦα（プリンクＲ等、１９８４、「セル」、３８ ．２８７−２９７）、ＴＧＦβ１（プリンク　Ｒ等、１９８５、「ネイチャー」 、３１６．７０１−７０５）、ｂＦＧＦ（ブラッツＨ等、１９８９、ｒプロシー ディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ」、８６．１８３６−１８４０ ）、エリスロポイエチン（シャコブスに等、１９８５、「ネイチャー」、３１３ ．８０６−８１０）、ＢＣＧＦ（シャルマＳ等、１９８７、「サイエンス」、２ ３５．１４８９−１４９２）、ＭＩＦ（ワイザーＷ等、１９８９、［プロシーデ ィンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンノーズ・オブ・ ザ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ」、８６．７５２２−７５２６） 、ＭＣＰ−１（ヨシムラ　Ｔ等、「ＦＥＢＳレターズ」、２４４．４８７−４９ ３）、オンコスタチン−Ｍ（マリクＮ等、１９８９、Ｍｏ１．　Ｃｅｌｌ、Ｂ　 ｉｏｌ、、９．２８４７−２８５３）およびＥＤＦ（ムラタＭ等、１９８８、「 プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシー ズ・オブ・ザ・ユナイテンド・ステーブ・オブ・アメリカ」、８５．２４３４− ２４３８）に相補的なりＮＡに対応する、各々２０ヌクレオチドを含む２８オリ ゴヌクレオチドから成る混合物−混合物Ｃと称す−とハイブリダイゼーションす る。

バイオサーチ８７００ＤＮＡシンセサイザーを用いて製造されたこれらのオリゴ ヌクレオチドを、下記プロトコールに従い西洋わさびペルオキシダーゼＥＣ１， １１，１７（ベーリンガー・マンハイムー参照番号８１４−４０７）と結合させ る。

ワソチャー等、１９８６、「ヌクレイツク・アンソズ・リサーチ」、１４．７９ ８５−７９９４の方法に従い、オリゴヌクレオチドを、合成カラムにおいて力ル ポニルンイミダゾール（アルドリック−１１．５５３−３）および１．６−ジア ミツヘキサン（アルドリック−Ｈｌ、１６９−６）と反応させる。

塩基の脱保護およびアンモニア処理による支持体の開裂後、イオン交換樹脂（キ アゲンーダイアゲン５０００５１）においてオリゴヌクレオチドを精製する。こ の場合アンモニウム対イオンはリチウム７オンに変換される。

Ｍ、ウルデア等、「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ」、１９８８．１６．４ ９３７−４９５６の方法に従い、５゛−アミノオリゴヌクレオチドを西洋わさび ペルオキシダーゼ（ベーリンガー・マンハイム−８１４４０７）と結合させる。

オリゴヌクレオチド混合物は、ライブラリーにおけるクローンの約１０％とハイ ブリダイズする。

プローブ１よりもプローブ２による場合に強いオートラジオグラフィー・シグナ ルを与え、混合物Ｃとはハイブリダイズしないクローンが、下記セク／ヨン４に 記載されている通り部分的に配列決定された。フランス国特許出願９０１４９６ １でクローンＡと呼ばれ、本特許出願でクローンＮＣ２８と命名されているこれ らのクローンのうちの一つが保持された。

セクション４ クローンＮＣ２８のｃＤＮＡ配列の配列決定および分析１）クローンＮＣ２８の ｃＤＮＡの配列決定ａ）１本鎖ＤＮＡの製造 クローンＮＣ２８は、ＡｐａＩおよびＢａｍＨ１部位間にｃＤＮＡ（以後、ＮＣ ２８ｃＤＮＡと呼ぶ）をもつベクターｐｓＥ１を含む。

ファージｆ１の複製開始点を含むベクターｐｓＥ１を用いると、下記方法でバク テリオファージＭ１３ＫＯ７（ファーマシアー参照番号２７−１５２４）の存在 下クローンＮＣ２８の培養による１本鎖ＤＮＡの製造が可能となる。

１５ｍ１管において、クローンＮＣ２８を、０００１％のチアミンおよび１００ μｇ／ｍｌのアンピシリンを補い、バクトドリブトン１６ｇ／ｌ、酵母抽出物Ｌ ｏｇ／ｌおよびＮａＣ１５ｇ／ｌという組成を有する２ＸＹＴ培地（サムプルツ ク等（前出）に記載）２ｍｌ中３７℃で振り混ぜながら、６６０％ｍで約０．６ ０の光学密度になるまで培養する。

ｍ；の培養物１００μｌを、１５国１管中１０程度の感染倍率でバクテリオファ ージＭ１３ＫＯ７（ファーマシアー参照番号２７−１５２４）により感染させる 。培養物を３７°Ｃで振り混ぜる。

−１時間後、培地２ｍｌを加える。次いで、培養物を約１６時間３７℃で振り混 ぜながらインキュベーションする。

−培養物１．５＋ａｌを、マイクロチューブ中２分間１５０００ｇの遠心分離に かける。

一上清１ｍｌをマイクロチューブに移し、２．５モルのＮ　ａ　Ｃ１を含むポリ エチレングリコール（分子量６０００）の２０％溶液２５０μｍを加える。混合 物を５分間４℃でインキュベーションすることにより、ファージの沈澱を容易に し、次いで１５０００ｇで５分間遠心分離する。上清を除去し、ファージの残留 物を、トリス−ＨＣｌ、１０ミリモル、ｐＨ８およびＥＤＴＡ、１ミリモルとう 組成を有する緩衝液５００μｍに再懸濁する。

−懸濁液を、トリス−ＨＣｌ１００ミリモルｐＨ８で飽和させたフェノールによ り１回、次いでクロロホルムにより２回抽出する。

−次いで、１／１０容量の３モル酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）溶液および２． ５容量のエタノールを加えることにより、生成物を沈澱させる。最少限２０分間 −２０℃で沈澱させる。ＤＮＡを１５０００ｇで１０分間遠心分離し、残留物を エタノールの７０％溶液により洗浄し、次いでトリス−８６１１０５９モルｐＨ ８およびＥＤＴＡ１ミリモルという組成を有する緩衝液３０μｍに再懸濁する。

ｂ）配列決定 ユナイテッド・ステーク・バイオケミカル・ンークエンシング・キット（参照番 号７０７７０）の助けにより、配列決定反応が行なわれる。この場合、サンガー 等、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ ンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーク・オブ・アメリカＪ、１９７７． １４．５４６３−５４６７の方法が用いられる。使用されるプライマーは１８ヌ クレオチドのオリゴヌクレオチドであり、これらはＮＣ２８ｃＤＮＡの５゛末端 近接領域におけるベクターｐｓＥ１またはＮＣ２８ｃＤＮＡの配列に相補的であ る。

２）ＮＣ２８ｃＤＮＡの配列の分析 下記内容は、図２．３および４を参照することによりさらに明確に理解されるは ずである。

図２では、ＮＣ２８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および下部に翻訳されたアミノ 酸配列が示されており、翻訳を開始し得る３つのＭｅｔには下線が付され、Ｎ− グリコリル化部位には破線による下線が付され、シグナルペプチドの可能な開裂 部位は垂直矢印により示されている。

図３および図４は、各々、ニードルマンおよびウンンユ、１９７０、「ジャーナ ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」、４８．４４３−４５３の方法による 、ＮＣ２８ｃＤＮＡから翻訳されたアミノ酸配列（上線）およびサイトカインＭ ＣＰ−１のｃＤＮＡから翻訳されたアミノ酸配列（下線）の最大相同性配列（ア ラインメント）、並びにこの方法による、ＮＣ２８ｃＤＮＡ（上線）およびサイ トカインＭＣＰ−１のｃＤＮＡ（下線）のアラインメントを示す。

ＮＣ２８ＣＤＮＡ（７）配列の分析 （１）ＮＣ２８ｃＤＮＡは、８０４ヌクレオチドを含み、ポリＡ配列により終結 する。

（２）このヌクレオチド数は、ホルムアルデヒドの存在下１％アガロース・ゲル 電気泳動（サムプルツク、前出）、次いでナイロン膜（ハイボンドＮ＋−アマ− ジャム）への移動および下記プロトコールによるハイブリダイゼーションにより 測定された、対応するメツセンジャーＲＮＡのサイズ（約０．８ｋｂ）と一致す る。

この膜を、”Ｐ−ｄＣＴＰ（アマ−ジャム）により標識したプローブとハイブリ ダイズする。このプローブは、サムプルツク等（前出）による記載に従い、デオ キシリボヌクレアーゼＩによる後者の部分開裂、次いで酵素ＤＮＡポリメラーゼ Ｉの助けによるポリマー化にツク翻訳として知られている技術）によりＮＣ２８ ｃＤＮＡから製造されたものである。ハイブリダイゼーションは、５０％のホル ムアルデヒド、１モルのＮａＣ１，５×デンハルツ溶液および０１％のＳＤＳを 含む水性培地中１６時間４２°Ｃで行なわれる。これらの膜を、室温で数回０． １％のＳＤＳを含む２ＸＳＳＣ溶液により洗浄し、次いで５０℃で１５分間０． １％のＳＤＳを含む０．ｌＸ５ＳＣ溶液により２回洗浄する。５×デンハルツ溶 液は、フィニル（４００タイブーフアーマンア）Ｉｇ／ｌ、ポリビニルピロリド ン１ｇ／ｌおよびＢＳＡ１ｇ／ｌという組成を有する。１ｘＳＳＣ溶液は、０１ ５モルのＮａＣ１および０．０１５モルのくえん酸ナトリウムを含有する。

（３）７８７−７９２位において、Ｍ、バーンステイール等、１９８５、「セル 」、４１．３４９に記載された共通配列ＡＡＴＡＡＡと類似した配列ＣＡＴＡＡ Ａは、恐らくはポリアデニル化シグナルであると思われる。５３４−５５４位に おいて、ＡおよびＴに富む領域−Ｔ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｔ 　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ−は、Ｇ、ンヤウ等、１９８６、「 セル」、４６．６５９−６６７に記載された不安定性共通パターンＡ　Ｔ　Ｔ　 Ｔ　Ａを含む。既知サイトカインの大多数は、上記のようなＡおよびＴに富む領 域を有し、この不安定性共通／＜ターンを含む。

（４）ＤＮＡ配列は、４１−４３位のＡＴＧから翻訳停止コドンに相当する３６ ８−３７０位のＴＧＡまでの蛋白質の翻訳に関する読み取り可能枠を含む。この 読み取り可能枠には、４１−４３．５３−５５および７１−７３位に翻訳を開始 し得る３個のＡＴＧコドンが存在する。これらの中でも、７１−７３位のＡＴＧ のヌクレオチド環境は、真核生物における翻訳の開始に関して、コザックＭ、１ ９７８、「セル」、１５．１１０９−１１２３に記載された共通配列に最も類似 した環境である。

（５）シグナルペプチド検索ソフトウェア（以後、ＰＳソフトウェアと呼ぶ）は 、フォノ・ヘイー不、１９８６、「ヌクレイツク・アンッズ・リサーチ」、１４ ．４８３−４９０により記載された方法および情報に従い本出願人により開発さ れた。このソフトウェアは、この読み取り可能枠において、シグナルペプチドに 類似した疎水性領域および１３９−１４０位（、ＡｌａおよびＧｉｎ間）の可能 な蛋白質開裂部位を予誓する。予想されたシグナルペプチドは、翻訳を開始し得 る３つのＭｅｔのうちの一つおよびこの開裂部位の間にある。従って、成熟蛋白 質（そのシグナルペプチドから開裂された翻訳蛋白質）は、７６個のアミノ酸を 含む（図２参照）。

（６）ＮＣ２８ｃＤＮＡから翻訳された蛋白質のアミノ酸配列およびＮＣ２８ｃ ＤＮＡの配列を、各々、適当なソフトウェア、すなわちユニバージティー・オブ ・ライスコンシンから入手された、デベリ二一等、１９８４、「ヌクレイツク・ アンッズ・リサーチ」、１２．８７１１−８７２１のＵＷＧＣＧソフトウェアを 用いてサイトカインＭＣＰ−１のｃＤＮＡから翻訳された蛋白質の配列およびサ イトカインＭＣＰ−１のｃＤＮＡの配列と比較した（オプションＧ　Ａ　Ｐ、ニ ードルマンおよびウンンユ、１９７０．ｒジャーナル・オブ・モレキュラー・バ イオロジー」、４８．４４３−４５３の方法による最適配列アラインメント）。

この比較は、ＮＣ２８ｃＤＮＡから翻訳された蛋白質のアミノ酸配列およびサイ トカインＭＣＰ−１の配列間における約７４％の同一性（９９アミノ酸のうち７ ３が同一であった）並びに翻訳された蛋白質をコードするＮＣ２８ｃＤＮＡの一 部分およびサイトカインＭＣＰ−１のｃＤＮＡ間における約７９％の同一性（２ ９７ヌクレオチドのうちの２３５が同一であった）を示した。

１３９−１４０位（ＡｌａおよびＧｉｎ間）における、ＰＳソフトウェアにより 予測されたこの開裂部位は、Ｅ、ロビンソン等（１９８９、「プロシーディンゲ ス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユ ナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ」、８６．１８５０−１８５）４により サイトカインＭＣＰ−１に関して実験的に見出された部位と対応する。ＮＣ２８ ｃＤＮＡの７１−７３位にあるＡＴＧは、サイトカインＭＣＰ−１の翻訳開始Ａ ＴＧに対応する。

ＮＣ２８ｃＤＮＡかに翻訳された蛋白質のアミノ酸配列およびサイトカインＭＣ Ｐ−１の配列間の相同性は、ＮＣ２８ＣＤＮＡから翻訳された蛋白質がサイトカ イン型の分泌された蛋白質であることを示している。

セクション５ ＮＣ２８ｃＤＮＡによりコードされた蛋白質のＣＯ８細胞における分泌の分析 ＣＯ８細胞は、ＳＶ４０　Ｔ−抗原を発現するサル腎臓細胞である（グルラマン Ｙ１、「セル」、２３．１９８１．１７５−１８２）。

５Ｖ４０ＤＮ−Ａの複製開始点を含むベクター（ベクターｐｓＥ１の場合）の複 製を可能にするこれらの細胞は、動物細胞における遺伝子発現研究用の好ましい 宿主を構成する。

１）ＣＯ３細胞のトランスフェクションおよびＮＣ２８ｃＤＮＡによりコードさ れる蛋白質の一時的発現直径５ｃｍのペトリ皿（コーニング）中、０．６ｇ／ｌ のグルタミンおよび３．７ｇ／ＩのＮａＨＣＯ２を含み、５％の割合で牛飴児血 清（ギブコ）を補ったダルベツコの修飾培地（ギブコ、参照番号０４１−０１９ ６５０以後、ＤＭＥＭと称す）５０１に５Ｘ１０５ＣＯ３細胞を接種する。５％ の割合で二酸化炭素を含む雰囲気中３７℃で約１６時間培ＩＩ後、培養培地を吸 引ろ過し、細胞を３ｍｌのＰＢＳ（ギブコからの燐酸緩衝食塩水）で洗浄する。

次いで、１０００μｍの（ＤＭＥＭ＋１０％牛脂児血清（ギブコ））、２ｍｇ／ ｒＡ１の濃度で平均分子量５０ｏｏｏｏのジエチルアミノエチルデキストラン（ ファーマシア）１１０μｍ、１００ミリモルのクロロキン（ングマ）１１μｍ、 およびアルカリ性溶解技術、次いで塩化セシウム勾配てのプラスミドＤＮＡの精 製により製造されたクローンＮＣ２８のプラスミドＤＮＡ（サムブロック等、前 出）６μｇから成る混合物を加える。５％の割合で二酸化炭素を含む雰囲気中３ ７℃で５時間インキュベーション後、混合物を細胞から回収する。１０％の割合 でジメチルスルホキシドを含むＰＢＳ（分光分析用、メルク）２ｍｌを加える。

室温で１分間インキュベーション後、混合物を回収し、細胞をＰＢＳで２回洗浄 し、２％の割合で飴児牛血清を含むＤＭＥＭ中でインキュベーションを行う。５ ％の割合で二酸化炭素を含む雰囲気下、３７°Ｃで４０時間インキュベーション を続行する。

また、プラスミドｐｓＥ１のＤＮＡを用いて上記操作を行うことにより、対照Ｃ Ｏ８細胞を製造した。

２）蛋白質の標識 クローンＮＣ２８のプラスミドＤＮＡによりトランスフェクションされたＣＯ８ 細胞および対照ＣＯ８細胞を用いて、下記操作を全て遂行する。

培養培地を吸引ろ過し、細胞を３ｍｌのＰＢＳで２回洗浄する。３ｇ／ｍｌのグ ルコースおよび４ミリモルのグルタミンを補ったメチオニン不含有ＭＥＭ（イー グル最少必須培地）（ギブコー参照番号０４Ｏ４１−０１９００Ｈ）５を加える 。３７°Ｃで２時間インキュベーションを行う。培養培地を除去し、２００μＣ １のメチオニン３５Ｓ（参照番号ＳＪ　１０１５、アマ−ジャム）が加えられた 、さらに２ｍｌの同培地を細胞に加える。インキュベーションを３７℃で６時間 行う。

培養培地を除去し、５分間遠心分離にかけることにより、細胞層および懸濁した 細胞を排除し、上清を保持する。付着細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ゴムスクレー バーでこすり、遠心分離に付す。

３）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるトランスフェクションＣＯ８細胞の 放射性標識蛋白質の分析トランスフェクションされたＣＯ８Ｏ８細胞上清１右ｌ びアセトン９ｍｌを一２０℃で沈澱させる。混合物を遠心分離し、蛋白質残留物 を回収する。それらを緩衝液（組成ニドリス０．１２５モル、ｐＨ６８、ＳＤＳ ４％およびグリセリン２０％）中にとる。２０００００ｃｐｍの放射能に相当す る、生成した懸濁液のアリコートを、Ｕ、にレムリ、「アナリティカル・バイオ ケミストリーＪ、１９７７．７８．４５９に記載された技術に従いＳＤＳの存在 下１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。ゲルを真空乾燥する 。放射性標識蛋白質をオートラジオグラフィーにより展開する。

オートラジオグラフは、対照細胞と比較した、クローンＮＣ２８のプラスミドＤ Ｎ−Ａによりトランスフェクションされた細胞に関する４つのエキストラバンド 二見かけ上の分子量９±２および１６±２ｋＤａに対応する２つの高密度バンド および見がけ上の分子量１に２および１７±２ｋＤａに対応する２つの低密度バ ンドの存在（後のバンドは拡散している）を示している。７６アミノ酸の成熟蛋 白質に関して計算された分子量は８９５６Ｄａであるため、これらのバンドの最 初の方に対応する見かけ上の分子量に近似している。

観察された相異なるバンド、またはそれらのうちの幾つかは、本発明蛋白質の様 々な度合のグリコジル化に対応し得る。事実、後者（図２参照）は、Ｎ−グリコ ジル化され得るアスパラギン残基（図２では破線による下線が付されたもので、 ドナー等、「ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー」、１９８７．１０５．２ ６６５に記載された共通配列に対応する）並びに０−グリコジル化され得る幾つ かのセリンおよびトレオニン残基を有する。

４）１６±２および１７±２ｋＤａの見かけ上の分子量を有する形態の可能なＮ −グリコジル化の立証 上記２）と同じ要領に従うが、ただし蛋白質Ｎ−グリコジル化阻害物質である１ ０μｇ／ｍｌのツニカナイシン（シグマ−参照番号Ｔ７７６５）の存在下で蛋白 質を標識する。

ポリアクリルアミドゲルにおける蛋白質の分析を３）と同じ要領で行う。

オートラジオグラフは、クローンＮＣ２８のプラスミドＤＮＡによりトランスフ ェクションされた細胞に関する２つのエキストラバンド、見かけ上の分子量９± ２ｋＤａに対応する１つの高密度バンドおよび見かけ上の分子量１１±２ｋＤａ に対応する１つの低密度バンドの存在を示す。これらの結果は、１６±２および １７±２ｋＤａの分子量に対応する、３）で観察された組換え蛋白質の２形態が Ｎ−グリコジル化されていることを示す。

セクション６　：ＣＯ８細胞により分泌される組換えタンパク質の精製 １）組換えタンパク質の製造 ４Ｘ１０’ＣＯ３細胞を、通常ローラーと称する表面積８５００ｍ２の円筒の培 養フラスコ内グルタミン０．６　ｇ／　１およびＮａＨＣＯ３３，７ｇ／Ｉを含 むダルベコ修復イーグル培地（以下、ＤＭＥＭという（ギブコ、参照番号０４１ −０１９６．５））１５０ｍｌ中に接種し、５％でラン胎仔血清を補足し、つい で二酸化炭素で緩衝化する。約Ｑ、２ｒｐｍの回転速度で３７℃約１６時間培養 後、培養培地を搾取し、細胞をＰＢＳ　（ギブコ社製リン酸緩衝食塩水）で洗浄 する。次いで下記の混合物を加える・ＤＭＥＭ＋１０％胎仔ウシ血清（ギブコ） ３６ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌの濃度にて平均分子量５００゜０００のジエチルアミノ エチルデキストラン４ｍ１（ファルマシア）、１００ｍＭクロロキノン４０μｍ およびアルカリ融解法によった後、塩化センラム勾配におけるプラスミドの精製 により製造された（サムプルツク等、上掲）クローンＮＣ２８のプラスミドむ雰 囲気下３７℃５時間インキュベート後、混合物を細胞から回収する。次いで７％ ジメチルスルホキシドを含むＰＢＳ３５ｍｌ　（分光度、メルク）を加える。室 温で１分３０秒間回転後、混合物を回収し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、フェノ ールレッドなしのＤＭＥＭ中で回転しながら３７℃５日間インキュベートする。

約３０ｍ１の容積の上溝を回収する。

２）組換えタンパク質の単離および精製以下の工程により、上記で得られた上清 から組換えタンパク質を単離し、精製した。

一前もって５０ｍＭトリス−ＨＣｌ溶液ｐＨ８，０で平衡化されたＤＥＡＥ−セ ファロースカラム（ファルマシア）上でのイオン交換クロマトグラフィー。この 操作条件下、タンパク質はゲルに結合しない。

一前もって５ＱｍＭトリスーＨＣｌ溶液ｐＨ８，０で平衡化されたヘパリン　セ ファロースカラム（ファルマシア）上でのアフにティークロマトグラフィー、溶 出液として５０ｍＭトリス−ＨＣｌ溶液ｐＨ８，０中０〜１ＭＮａＣ１の直線勾 配を使用する。

純度が、ＳＤＳの存在下ポリアクリルアミドゲル上電気泳動法および硝酸銀での 発色により測定され、９０％以上である組換えタンパク質を含むセクション１１ に記載の化学定性試験をしたサンプルのためのＰＢＳ溶液に対してまたは以下の クロマトグラフィーの工程のためのＱ、１ＮＮａＣ１を含み、２０ｍＭＭ０ＰＳ 緩衝液溶液と称する溶液に対する両分の透析。

一前もって溶液１で平衡化されたモノ　Ｓ　ＨＲ５１５カラム（ファルマシア） 上でのこれらの両分のカチオン交換クロマトグラフィー、溶出液として溶液１中 ０１〜０．４ＭＮａＣ１の直線勾配を使用する（６０分間）。２８０ｎｍで検出 する。

組換えタンパク質は、ＳＤＳ存在下電気泳動法において、画分１および画分２と 称する２つのピークに相当する画分中に存在し、各々は、ある場合において見掛 は分子量９±２ｋＤａを有する王バンドおよび見掛は分子量１６　、＝　２　ｋ 　Ｄ　ａを有する副バンド、他の場合において見掛は分子量１６±２ｋＤａを有 する主バンドおよび見掛は分子量１６〜１８±２ｋＤａを有する一連の弱いバン ドを与える。

上記のタンパク質ＮＣ２８の形態以外のバンドを示さなかったので、ＳＤＳの存 在下ポリアクリルアミドゲル電気泳動法および硝酸銀での発色によるそれら２画 分各々の分析は、組換えタンパク質が各々画分で少なくとも純度９５％を有する ことを示している。

３）画分１および２の各アミノ末端配列の解析各々画分１および２において、ア ミノ末端配列をフェニルチオヒダントイン酸のアプライド・バイオシステム・モ デル１２０Ａアナライザーと組み合わせたアプライド・バイオシステム・モデル ４７０Ａシークエンサーを使用して解析した。精製タンパク質（２００ピコモル 、アミノ酸分析により確認された）を、対照タンパク質β−ラクトグロブリン２ ０ピコモル存在下シークエンサー上に着く。

ＮＣ２８ｃＤＮＡによりコード化されたアミノ酸配列に相当するアミノ末端配列 を検出しなかった。これに対して対照タンパク質のアミノ酸末端配列を検出して おり、これはシークエンサーを作動していることを示す。

従って、多分組換えタンパク質の異なる形状の各々のアミン末端保護が存在する のであろう。

４）タンパク質ＮＣ２８の異なる形態の糖鎖形成の検討画分１および２を、３種 の酵素、Ｎ−グルカナーゼ、ニューラミナーゼ、○−グリカナーゼて、この酵素 を付属しているデータシートに記載のプロトコールに従って消化した。

酵素消化生成物を、ラエミリ、ＵＫｌ、１９７７年、アナリテイカル・バイオケ ミストリー、第７８巻、４５９頁に記載の技術によりＳＤＳの存在下電気泳動に より分析した。結果は以下である９±２ｋＤａの見掛は分子量を有する主要バン ドは、Ｎ−グリカナーゼ、ニューラミダーゼまたは○−グリカナーゼの存在下修 飾されない。

１１±２ｋＤａの見掛は分子量を有する副バンドＮ−グリカナーセにより修飾さ れないが、ニューラミナーゼにより修飾され、見掛は分子量１０±２ｋＤａを有 するバンドを得、このバンドはそれ自身Ｏ−グリカナーゼにより修飾され、見掛 は分子量９±２ｋＤａを有する主要バンドに一致するバンドを得る。

見掛は分子量１６±２ｋＤａを有する主要バンドはニューラミナーゼまたは○− グリカナーゼにより修飾されないで、Ｎ−グリカナーゼの反応後、見掛は分子量 ９±２ｋＤａを有する主要バンドに一致する。

見掛は分子量１６〜１８±２ｋＤａを有するバンドは３種の酵素各々作用により 消失する。

これらの実験は見掛は分子量９±２ｋＤａを有する主要形態がタンパク質ＮＣ２ ８の非−糖鎖形成形態であり、見掛は分子量１１±２ｋＤａを有する副次形態が 、１またはそれ以上のシアル酸を含むタンパク質ＮＣ２８の〇−糖鎖形成された 形態であり、見掛は分子量１６±２ｋＤａを有する主要形態がタンパク質ＮＣ２ ８のＮ−糖鎖形成された形態である。

見掛は分子量１６〜１８ｋＤａを有する少数形態は、Ｎ−および〇−糖鎖形成さ れた形態の複合混合物を表す。

タンパク質ＮＣ２８がＮ−糖鎖形成されたヒトＳＩＳサイトカインの系統群の第 一に知られる成典である（Ａ、ミンチイー、１９９１年、メディスン・サイエン ス、第７巻、５７８頁）。サイトカインＭＣＰ−１はＯ−糖鎖形成された形態で 存在し、Ｎ−糖鎖形成された形態では存在しない（ジャン等、１９９０年、ジャ ーナル・オブ・バイオケミストリー、第３０巻、１８３１８頁）。

セクション７：酵母中ＮＣ２８ｃＤＮＡの発現ベクターの構築・プラスミドｐＥ ＭＲ６１７およびこのプラスミドを使用して酵母種の形質転換 １）プラスミドｐＥＭＲの構築 プラスミドｐＥＭＲ５８３（ヨー口・ンノぐ特許出願４３５７７６１：。

記載）を酵素ＨｉｎｄＩＩｌ［およびＢａｍＩＩＩで完全に消化する。２ミクロ ン複製上点およびＳＴＢ遺伝子座、ＬＥＵ２ｄ遺伝子、アンビン１ノン耐性遺伝 子、ｐＢＲ３２２起点およびフェロモンアルファのプレプロ領域の出発点を含む 、大型フラグメント（以下、フラグメントＡと称する。）を精製した。フェロモ ンアルファのプロプレ領域の終点および成熟タンパク質をコードしているｃＤＮ Ａを含み、３゛末端でＢａｍＩＩＩ制限部位により隣接されたＨｉｎｄＩＩＩ　 −ＢａｍＩＩＩフラグメント（以下、フラグメントＢと称する）を、プラスミド ｐｓＥ１−ＮＣ２８から出発してＰＣＲ法を使用して増幅を得た。このフラグメ ントの配列はＦｉｇ、５に詳細に記載する。フラグメントＡおよびＢを結合し、 プラスミドｐＥＭＲ６１７を得る。

ａ）ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法の記述ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法は 、当技術の熟練者に周知の方法であり、プライマーとして２種のオリゴヌクレオ チドを使用してあらかじめ変性したＤＮＡの２ストランドを同時に複写すること を可能にする（特に、ＨＡ、エリツクによる研究：　ｒＰＣＲ法。

ＤＮＡ増幅の原理および適用」、１９８９年、マツクミリアン・パブリッシャー により刊行およびＭ、　Ａ、イニス等：　ｒＰＣＲプロトコール」、１９９０年 、アカデミツク　ブレス　Ｉｎｃ、、サンテイエゴ、カルフォルニア、９２１０ １、アメリカ合衆国により刊行）。

この技術の原理を以下に要約する。

ＰＣＲ法は、１０〜３０サイクル後、通常Ｔａｑポリメラーゼと称されるテルム ス　アクアチフスのＤＮＡポリメラーゼを使用して、もとの鋳型の１００．００ ０コピーを得ることを可能とする３工程の繰返しに基づく。３工程は以下である ：鋳型の変性 二重鎖ＤＮＡを約２分間高温（９２℃〜９６℃）でのインキュベルジョンにより 一重鎖ＤＮＡに変性する。

プライマーのハイブリダイゼーション これらのプライマーは、増幅される領域の末端とハイブリッドする一対の合成オ リゴヌクレオチドである。２種のプライマーは反射鏡とハイブリッド形成する。

プライマー−鋳型複合物の形成を最適にするためにプライマーを過剰に加える。

プライマーの延長 Ｔａｑポリメラーゼが５′末端から３′末端へプライマー−鋳型複合物を延長す る工程を７２°Ｃて行う。

ＰＣＲ法において、目的の生成物が３回目のサイクルで発現し、次いで顕著に増 幅される。サイクルがおこなわれる間に、増幅生成物は、プライマーがハイブリ ッド形成する鋳型に迅速になる。

ｂ）使用されたプライマーの説明 ２種合成オリゴヌクレオチドを製造する。

以下の配列。

ＡＴＣＧＡ　ＡＧＣＴＴＧ　ＧＡＴ　ＡＡＡＡＧＡ　ＣＡＧ　ＣＣＡ　ＧＴＴ　 ＧＧＧ　ＡＴｒ　ＡＡＴ　ＡＣ５ｃｒ　Ｌｃｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌ ｎ　Ｐｒｏ　ＶａＪ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ領域１　領域２ を有する、プライマー１と称する第１のオリゴヌクレオチドは２つの制限部位を 有する・領域１ 第２のオリゴヌクレオチドは、プライマー２と称し、以下の配列領域１　領域２ ２異なる領域をまた含む：領域１は、第５番目のヌクレオチドにＢａｒｘＨＩを 担持し、領域２はＮＣ２８ｃＤＮＡのコード化部分の最終コドンおよび停止コド ンに相当するヌクレオチド配列を有しており、ＨｉｎｄＩＩＩ　（：ｌトンＡＡ Ｇ−ＡＡＡのサイレント突然変異）の排除を意図する突然変異を伴う。この領域 はＮＣ２８ｃＤＮＡを担持するプラスミドｐｓＥ１−ＮＣ２８のその部分のコー ド化ストランドとハイブリッド形成を意図するものである。

Ｃ）フェロモンおよび成熟タンパク質ＮＣ２８のコード化ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのプレ プロ領域の末端を示すＨｉｎｄＩＩＩ　−ＢａｍＨＩ増幅フラグメントの製造 使用された鋳型はプラスミドｐｓＥ１−ＮＣ２８であり、タンパク質ＮＣ２８の コード化ｃＤＮＡを担持する。

プラスミドｐｓＥ１−ＮＣ２８の１１００ｎ、プライマー１の１１００ｎ、プラ イマー２の１１００ｎおよび１０−倍濃縮反応混合物（最終量：６７ｍＭ）リス −ＭＣＩ　ｐＨ８，８，１６，６ｍＭ　（ＮＨ４）　２Ｓｏ、、１ｍ５ｌβ−メ ルカプトエタノール、６．７ｍＭＥＤＴＡ、０１５％トリトンＸ１００．２ｍ〜 ｌＭｇＣｌ２、Ｑ、２ｍＭｄＮＴＰ、ゼラチン２００ｎｇ）を管に入れ、混合物 の体積をついで水を加えて５０ｍ１にする。

Ｔａｑポリメラーゼの０．５μｍすなわち２．５ユニツト（ベーリンガーマンハ イム商品番号１１４６−１７３）を加える。ついで、混合物を、水溶液の蒸発を 防ぐためにパラフィンで覆う。

増幅は１５反応サイクル以上でおこり、以下に１サイクルの工程を示す。

９４６０１分間−変性 ５５℃１分間→ハイブリダイゼーション７２℃１分間→重合化 １５サイクル後、酵素反応を２０ｍＭＥＤＴＡの添加により止める。

この方法で増幅されるＤＮＡフラグメントは、約２５０ｂｐの所望の大きさを有 し、ついで鳳離され、１％アガロースゲル上で精製され、ＰＬＯポリアクリルア ミドゲル（ファルマンア）のカラマ上でクロマトグラフにかけて透析され、つい でＨ１ｎｄＩＩＩおよびＢ　ａｍＨＩ粘着性末端を形成するために当技術の熟練 者に周知の常法（サムプルツク等、上掲）により酵素Ｈ１ｎｄＩＩＩおよびＢ　 ａｍＨＩで全て同時に加水分解される。加水分解後、フラグメントをＰＩＯカラ ム上でｎＩ製する。

得られたフラグメントＢの配列はＦｉｇ、５に示す。タンパク質ＮＣ２８のコー ド化部位において、Ｆｉｇ、５のアスタリスクにより示されるＮＣ２８ｃＤＮ、 Ａに関するサイレント突然変異を含む。

フラグメントＡおよびＢを結合させて、プラスミドｐＥＭＲ６１７を得る。

２）プラスミドｐＥＭＲ６１７による酵母菌株ＥＭＹ７６１の形質転換および形 質転換された菌株によるタンパク質ＮＣ２８の発現ヨーロッパ特許０４０８４６ １記載のＥ！ｖｌＹ７６１株（Ｎｉａｔ　ａｌｐｈａ、１ｅｕ２、ｕｒａ３、ｈ ｉｓ３）は、ｌ−１０２１の番号のもと１９８９年１２月２７日ＣＮＣＭに寄託 された株をプラスミド回復して得られ、プラスミドｐＥＭＲ６１７中存在するＬ ＥＵ２ｄ欠損選択マーカーおよびＵＲＡ３選択マーカーにより相補され得る突然 変異（１ｅｕ２およびｕｒａ３）を含む。その株を、浸透安定剤、即ちＩＭ濃度 のソルビトール存在中酵母を原形質処理することを含む、ペックス等（ペックス 等、１９８７年、ネイチャー、第２７５巻、１０４〜１０９頁）により記載され た様々な形質転換の技術を使用して、ロインン原栄養性選択を有するプラスミド ｐＥＭＲ６１７と形質転換する。

正確な形質転換プロトコールを以下に示す・ａ）液体ＹＰＧ培地２００ｍ１　（ 下記、第１表参照）を、静止相にある約５Ｘ１０’細胞培養物で接種し、この方 法で接種された培養物を３０℃で一夜撹拌する。

ｂ）培養物が約１０７細胞／ｍｌに達するとき、細胞を４０００ｒｐｍで５分間 遠心分離し、残渣を１Ｍソルビトール溶液で洗浄する。

Ｃ）細胞を２５ｍＭＥＤＴＡおよび５０ｍＭジチオスレイトールを含む１Ｍソル ビトール溶液５ｍｌ中に懸濁し、３０℃で１０分間インキュベートする。

ｄ）細胞を１Ｍソルビトール溶液１０ｍ１て１回洗浄し、ソルビトール溶液２０ ｍ１に懸濁する。チモラーゼ−１００Ｔ　（アフィニティーカラム上アルソバク ター・ルテウス培養上清の部分精製により得られ、β−１，３−グルカナーゼラ ミテリペンタヒドラーゼを含む、セイカガク　コウギョウ社製市販品）を最終濃 度２０μｇ／ｍ１になるまて加え、懸濁液を室温で１５分間インキュベートする 。

ｅ）細胞をＹＧＰソルビトール培地（第１表、参照）と称するソルビトール含有 の培地２０ｍ１に再懸濁し、静かに撹拌しつつ３０℃で２０分間インキュベート する。

ｆ）懸濁液を２５００ｒｐｍで３分間遠心分離する。

ｇ）細胞を以下の組成の形質転換緩衝液９ｍｌ中に再懸濁する：ソルビトールＩ Ｍ、トリス−ＨｅｌｐＨ７，５１０ｍＭおよびＣａＣ１２ＣａＣ１２ １Ｑ細胞０．１ｍｌおよびＤＮＡ溶液５μｌ（約５ｍｇ）を加え、得られた懸濁 液を室温で１０〜１５分間放置する。

ｌ）以下の溶液１ｍｌを加える・ ポリエチレングリコールＰＥＧ４０００　２０％、トリス−ＨＣＩｐ）（７，５ １０ｍＭおよびＣａＣｌ２１０ｍＭｊ）１）で得られた懸濁液０．１ｍｌを、前 もって溶解し、約４５°Ｃ液状に保ったロイシン不在の固体再生培地（第１表、 参照）を含む管に注ぐ。懸濁液をロイシン不在の固体再生培地１５ｍ１の固体化 された層を含むベトリ皿に注ぐ。

形質転換物が３日後現れ始める。ＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ６１７株と称する形質転 換物を得た。

酵母菌株ＥＭＹ７６１の形質転換のためのプロトコール中に使用された主要培地 の組成および製造 液体ＹＰＧ培地 酵母抽出物１０ｇ（ディフコ社製抽出のバクトー酵母）ペプトン２０ｇ　（ディ フコ社製バクトーベブトン）グルコース２０ｇ 蒸留水中に成分を混合する。蒸留水で最終容量ｌｌにする。１５分間１２０℃で 高圧滅菌する。

ＹＰＧソルビトール培地 液体ＹＰＧ培地の組成を使用して、高圧滅菌後、ＩＭａ度にソルビトールを加え る。

ロインン不在固体再生培地 アミノ酸を含まない酵母窒素ベース（ギフコ社製）６７ｇＬ−１−リブトファン ２０ｍｇ Ｌ−ヒス力ジン２０ｍｇ Ｌ−フェニルアラニン５０ｍｇ Ｌ−グルタミン酸１００ｍｇ 寒天３０ｇ ソルビトール１８２ｇ 成分を蒸留水中に混合する。蒸留水で最終容量１１にする。１２０℃で１５分間 高圧滅菌する。高圧滅菌後、トレオニン２００ｍｇおよびアスパラギン酸１１０ ０ｒｎを加える。

セクション８ エーレンマイヤーフラスコ中、形質転換株によるタンパク質ＮＣ２８の発現およ びＳＤＳの存在中ポリアクリルアミドゲル上で培養培地中タンパク質の検出 １）ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ６１７の培養ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ６１７株（セ クション７で得られた）のコロニーをウランルー無含有液体培地５０ｍ１中培養 した。この培地は１１当たり以下のものを含む゛ −アミノ酸を含まない酵母窒素ベース６．７ｇ（ディフコ社製）−カゼイン加水 分解物５．０ｇ（ディフコ社製カザミノ酸）グルコースＬｏｇ ３０℃で１夜撹拌後、培養株を１０分間遠心分離し、残渣を無菌水ＩＱｍｌに取 り、再び１０分間遠心分離した。タンパク質ＮＣ２８の発現を以下の組成の培地 ５Ｑｍｌ中に細胞を取って誘発した。

アミノ酸不在の酵母窒素ベース素地６．７ｇ／ｌ（ディフコ社製）カゼイン加水 分解物５．０ｇ／］（ディフコ社製カザミノ酸）グリセリン３０．０ｇ／］ ガラクトース３０．０　ｇ／　１ 工タノール１０ｍ１／１ 培養物を撹拌しつつ３０℃２４時間再インキュベートした。

２）発現タンパク質の解析 ａ）ＳＤＳ存在存在リポリアクリルアミドゲルサンプル製 組成を第２表に示すグルコースを含むウラシル−無含有液体培地と称する培地中 −夜培養された細胞の一部を遠心分離し、非誘発サンプルを得た。エタノール、 グリセリンおよびガラクトースを有するウラシル−無含有液体培地（第２表）と 称する培地中−夜培養した細胞を遠心分離し、誘発されたサンプルを得た。上清 を集めた。

デオキコラート２ｍｇ／ｍｌを含む５０％トリクロロ酢酸５０ｍ１を上清１０ｍ １に加えた。

混合物を３０分間温度４℃で放置し１、ついで３０分間遠心分離した。残渣を冷 アセトン（＋４℃）約１ｍｌに取り、再び３０分間遠心分離した。乾燥後、残渣 を、ラエミリ（止揚）により開示されたプロトコールにより、トリス−ＨＣｌ　 ｐＨ６，８０，１２５Ｍ、ＳＤＳ　４％、ブロモフェノールブルー０．００２％ 、グリセリン２０％およびβ−メルカプトエタノール１０％を含むいわゆる充填 緩衝液に取る。残渣を１５分煮沸して可溶化し、ついでブロモフェノールブルー が責に変わるまで中和する。

サンプルをＳＤＳ存在下ポリアクリルアミドゲル上に置き、電気泳動にかける。

結果 ゲルの解析（クーマノ−ブルーで発色させる）は、見掛は分子量９±２（主形態 ）および１１±２ｋＤａに相当する２種の主要なバンド、非誘発サンプルと比較 して誘発サンプルの数個の付属バンドの存在を示す。観察された他の付属バンド は、１６±２以上の見掛は分子量を有し、糖鎖形成の様々な程度に相当してかな り多数であり、広がっている。見掛は分子量８ｋＤａに対応する、強度の低いバ ンドもまた観察される。酵母によるタンパク質のＮ−糖鎖形成は、小胞体中量− 糖鎖形成（コア糖鎖形成）およびゴルジ装置中Ｎ−高度糖鎖形成（外鎖糖鎖形成 ）を含む（Ｒ，Ａ、ヒラマン等、１９９０年、メソード・イン・エンザイモロノ ー、第１８５巻、アカデミツク・プレス、４２１〜４４０頁）。一般に、コア糖 鎖形成は同種の見掛は分子量（１個のバンド）の糖タンパク質を産生し、外糖鎖 形成は異種の見掛は分子量の糖タンパク質（数個の異なるバンド）を産生する。

ある種のタンパク質は酵母により〇−糖鎖形成され得ることは周知である（Ｊ　 ツェコ等、１９８６年、バイオケミ力・工・バイオロジー・アクタ、第８８４巻 、９３〜１００頁）。

Ｎ−糖鎖形成は種々の方法において開示され得（Ｐ　オーリン等、１９９１年、 メソード・イン・エンザイモロジー、第１９４巻、６８２〜６９７頁）、そのＮ −結合炭水化物鎖を特異的に切断する。

１つにエンドグリコノダーゼＨ（エンド−ｂ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ 　Ｅ、Ｃ，３２，１，９６）で処理したときタンパク質の見掛は分子量減少を観 察することからなり、タンパク質がエンドグリコンダーゼＨに耐性であるときお よびその見掛は分子量がα−マンノンダーゼ（α−Ｄ−アンノンド　マンノヒド ラーゼ・Ｅ。

Ｃ，３，２，１，２４）で処理後増加するとき、〇−糖鎖形成は、ピーマンズ等 、１９９１年、ＤＮＡ・アンド・セル・バイオロジー、第１０巻、１９１〜２０ ０頁に記載のように推定され得る。

ｂ）潜在的なエンドグリコシダーゼＨ処理でのイムノブロッティング（ウェスタ ン　プロット） サンプルの調製 グルコースを有するウランルー無含有液体培地中で一夜培養された細胞（第２表 ）を遠心分離し、非誘発サンプルを得た。エタノール、グリセリンおよびガラク トースを有するウランル不在液体培地中−夜培養された細胞（第２表）を遠心分 離し、誘発サンプルを得た。上清を集めた。デオキシコラート２ｍｇ／ｍｌを含 む５０％トリクロロ酢酸５ｍｌを上清ＩＱｍｌに加えた。

混合物を３０分間温度４℃で放置し、ついで３０分間遠心分離した。残渣を冷ア セトン（＋４℃）約１ｍｌに取り、再び３０分間遠心分離した。残渣を可溶化緩 衝液（組成　トリス−ＨＣｌ　ｐＨ６゜８１０ｍＭ　β−メルカプトエタノール ２％、ＳＤＳ１％）４０μｍ中に取る。残渣を１００℃５分間加熱する。

サンプルをついで４画分に分けるニ ー５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液１０μｍ　ｐＨ５およびエンドグリコンダ ーゼＨ（５ｍｌＵ−ベーリンガー商品番号１０８８７２６）５μｍを第１画分１ ０μｍに加える。サンプルを約−夜３７℃で放置する。充填緩衝液２０μｍをつ いで加える。

−５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５１０μｍおよびα−マンノシダーゼ （シグマ商品番号、Ｍ７２５７）５μｍを第２画分１０μｍに加える。サンプル を約−夜３７℃で放置する。充填緩衝液２０μｍをついで加える。

一５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５１０μｍおよびエンドグリコシダー ゼＨ（ベーリンガー）５μｌを第３画分１０μｌに加える。サンプルを約−夜３ ７℃で放置する。α−マンノシダーゼ（シグマ）２．５μｍをついで加える。充 填緩衝液２０μｌをついで加える。

一充填緩衝液１０μｍを第４画分１０μｌに加える。サンプルを１０分間煮沸し 、ＳＤＳの存在下ポリアクリルアミドゲル上に置き、電気泳動を、ラエミリ、ア ナリティカル・ケミストリー、第７８巻、４５９頁のプロトコールにより行う。

ゲル中得られたタンパク質をついでニトロセルロース膜に移す（Ｈトウービン等 、１９７９年、プロシーディンゲス・ナショナル・アカデミイー・オブ・サイエ ンス、アメリカ合衆国、第７６巻、４３５０〜４３５４頁に記載の技術による） 。パイオーラッド（商品番号１７０〜６４５０）社製免疫−プロット検定キット に記載のプロトコールにより行われる免疫検出は、下記の工程を含む一部うチン ３ｇ／１００ｍ１を含むＴＢＳ　（ｈリス緩衝化食塩水）とともに３０分間のニ トロセルロース膜の飽和ニーＴ、ＴＢＳ　（０，０５％トゥイーン２０を含むＴ ＢＳ）と称する緩衝液で５分間２回膜をすすぐ。

−膜をセクション１０で製造された免疫血清を１時間室温で接触させる。

−Ｔ、ＴＢＳで５分間２回およびＴＢＳで５分間１回、膜をすすぐ。

抗原−抗体複合物を、膜をンエチレンおよび過酸化水素中４−クロロー１−ナフ トールを含む展開緩衝液と接触させて展開する。

膜を水をすすぐ。

結果 イムノブロッティングの解析は、非誘発サンプルと比較するとエンドグルコシダ ーゼＨで未処理の誘発サンプルの数個の付属バンドの存在を示し、２つの主要な 付属バンドは見掛は分子量９±２および１１±２ｋＤａに相当する。それらの２ 個のバンドは免疫血清により認識される。１６±２ｋＤａ以上の見掛は分子量を 有する広いバンドもまた検出された。

誘発サンプルにおいて、１６±２ｋＤａ以上の分子量に相当する広いバンドは、 エンドグリコンダーゼで処理後消失する傾向にあり、フェロモンの前記列を保持 する前駆体に相当し得る見掛は分子量１６±２ｋＤａを有するバンドであること を支持する。

この同じ処理サンプルにおいて、見掛は分子量９±２および１１＝２ｋＤａを有 する２種の主バンドはなおも存在することに注目される。

誘発サンプルにおいて、見掛げ分子量１１±２ｋＤａに相当するハンドがα−マ ンノンダーゼで処理後消失する傾向があるが、一方９±２ｋＤａのバンドは同じ 条件下で強度が増大する。これは見掛は分子量１１±２ｋＤａに相当するタンパ ク質が〇−糖鎖形成されるということを示すと思われる。

第２表 サンプル製造に使用される培地の組成および製造−グルコースを有するウランル ー無含有液体培地−アミノ酸−無含有酵母窒素ベース６．７ｇ（ディフコ）−カ ゼイン加水分解物５．０ｇ（デフフコ社製カサミノ酸）−グルコース１０．０ｇ 全成分を蒸留水中混合し、蒸留水で最終体積１ハこする。１２００Ｃ１０分間高 圧滅菌する。

一エタノール、グリセリンおよびカラクトースを有するウランルー無含有液体培 地 上記のウランルー無含有液体培地の処方を使用するがグルコースは含まない。高 圧滅菌後、１００％ニタノール１００ｍ　ｌ、グリセリン３０ｇおよびカラクト ース３０ｇを加える。

セクション９ 酵母中産生されるプロティンＮＣ２８の精製およびそのアミノ末端配列の同定 １）酵母により産生されるプロティンＮＣ２８の主形態の精製見掛は分子量９± ２ｋＤａを有する組換えタンパク質の主形態（セクション８−２−ａ）参照）を 、下記の連続工程を含むプロトコールを用いて、第８章の１）の終点で得られた 培養培地から単離し、精製した 一５０ｍＭｐＨ８，０トリス−ＨＣｌ溶液で前もって平衡化されたＤＥＡＥ−セ ファロースカラム（ファルマンア）上でのイオン交換−溶出液として５０ｍＭｐ Ｈ８，０トリス−ＨＣｌ溶液中０〜１ＭＮａＣ１の直線勾配を用いて、５０ｍＭ ｐＨ８１−リス−ＨＣｌ溶液で前もって平衡化されたヘパリンセファ０−ス（フ ァルマ／ア）カラム上でのアフィニティークロマトグラフィー−ＰＢＳ溶液に対 する（ＳＤＳ存在下ポリアクリルアミド上電気泳動法により同定された）組換え タンパク質を含む画分の透析２）精製タンパク質の分析 ａ）ＳＤＳ存在下ポリアクリルアミドゲル上電気泳動法ＳＤＳ存在下ポリアクリ ルアミドゲル上電気泳動による解析および硝酸銀での発色は、見掛は分子量９± ２ｋＤａに相当する１個の強いバンドおよび見掛は分子量８土２および１１±２ ｋＤａに相当する非常に低い強度の２個のバンドの存在を示す。これらの３種に 相当する組換えタンパク質の純度は９０％以上である。

ｂ）アミン末端配列の同定 アミノ末端配列を、エツトマン・デグラデーション・プリンシブル（キアーキ　 ハン等、１９７７年、パイオキミー、第３９巻、５５７頁）より決定する。第１ ７ミノ末端アミノ酸はフェニルイソチオンアネート（ＰＩＴＣ）と結合し、つい で切断する。得られた誘導体を２６９ｎｍで吸収する安定なフェニルイソチオヒ ダントイン／アミノ酸に変換する。各々サイクルの生成物をＨＰＬＣにより解析 する。

下記の３種のアミノ末端配列を各々７０％、２０％および１０％率で検出する。

配列１　、Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ工１ｅ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ配列２Ｖａ ＩＧ１ｙ工ｌｅ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ配列３．Ｌｙｓ工ｌｅ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌ ｎ配列１は、所望するアミノ末端配列、即ちセクション７に記載のベクターｐＥ ＭＲへ導入されるコード化配列であるセクション４ｇ１２戴の７６個のアミノ酸 （Ｆｉｇ、２、参照）の成熟タンパク質の配列である。

配列１および配列２は、２および１８アミノ酸各々のアミノ酸末端部位において 切断される７６個のアミノ酸の成熟タンパク質のアミン末端配列である。

セクション１０：ペプチドの合成および免疫血清の製造ｌ）ペプチドの合成 種々のペプチドは、ホウンテン、１９８５年、プロン−ディング・オブ・ナショ ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、アメリカ合衆国、第８２巻、５１３１頁 記載のいわゆるティーバッグ法により手動でまたはミリーゲン合成機により合成 される。最初の方法において、合成支持体サポートは耐溶媒浸透性エンベロープ 中に抱接される；すなわち常用合成工程（活性化、洗浄等）は、大多数のペプチ ドにおいて同時に行われ得る。第２の方法は、完全な自動合成を行うことを可能 にする。両者において、合成化学は、通常固体層ペプチド合成のために用いられ るものである（メリーランド等、１９６３年、ジャーナル・オブ・アメリカン・ ケミストリー・ンサエティ、第８５巻、２１４９〜２１５４頁） この方法において、合成されたペプチドのカルボキシ末端残基は不溶性重合体に 付着させ、ついで種々のアミノ酸を加える。ポリペプチド鎖の大きさはアミノ末 端方向に増大する。合成後、ペプチドをフッ化水素酸で支持体から分離し、溶液 中に回収する。

第１の方法は、翻訳されたタンパク質ＮＣ２８のアミノ酸９０−１０９．９４− １０９および９７−１０９の相当するペプチドを合成するのに使用され、ペプチ ドＣ２０、ペプチドＣ１６およびＣ１３と各々称される。ペプチド４８−６９と 称する、ＮＣ２８ｃＤＮＡから翻訳されるタンパク質のアミノ酸４８−６９に相 当するペプチドを自動的に合成した。全ペプチドをＨＰＬＣにより精製し、アミ ノ酸組成の同定およびペプチドの配列を精製物に対して行った。

アミノ酸組成の解析は全く自動化されている。アミノ酸アナライザーは、加水分 解後分離されたアミノ酸を誘導体化する。誘導されたアミノ酸は４２０Ａシステ ムの工程に連結するブラウンリー１３０Ａ　ＨＰＬＣにより分離される。

アミン末端配列は、エツトマン分解原理により決定される。第１のアミン末端ア ミノ酸は、フェニルインチオシア不−１−（ＰＩＴＣ）と結合し、ついで切断さ れる。得られた誘導体は２５４ｎｍで吸収する安定なフェニルチオヒダントイン ／アミノ酸に転換される。各々サイクルの生成物をＨＰＬＣで解析する。

２）免疫血清の製造 免疫血清の製造のために、ペプチド４８−６９を結合剤としてｍ−マレイミドベ ンゾイル−Ｎ−ヒドロキシザクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を使用してそのカ ルボキシ末端ンステイン残基によりフィスレラ（ＫＬＨ）のヘモシアニンを担持 するタンパク質を結合する。

ウサギにューノランド、雄、約２ｋｇ）を、ハイツ力イティス、１９８１年、メ ソード・イン・エンザイモロシー、第７３巻、４６頁記載のプロトコールにより ２週間毎に複合ペプチド４８−６９／ＫＬＨ（ペプチド８００μｇに相当する量 ）（ウサギｎ、４３）またはタンパク質ＮＣ２８５０μｇで免疫化する。第１の 注射において、抗層溶液の１容をフロイント完全アジュバント（シグマ−参照番 号４２５８）１容と乳化する。追加免疫用量（ウサギｎｏ、４３の３およびウサ ギｎｏ、４４の６）をフロインド不完全アジュバントで投与する（ングマー商品 番号５５０６）。

得られた免疫血清は、ＳＤＳ存在下ポリアクリルアミドゲル上電気泳動後免疫検 索により酵母およびＣＯ８細胞で製造されたタンパク質ＮＣ２８が認められる。

セクション１１： １）使用された方法 ａ）好中球の単離 ０．６％デキストランＴ５００　（ファルマンア、参照番号１７−０３２０−０ １）および００９％ＮａＣ１を含む溶液中３０分間３７６Ｃで沈降により大部分 の赤血球を除去する。細胞をフィコルーバク（ファルマシア）の層の頂点に連続 して付着させ、３０分間４００ｇで遠心分離する。抹消血単核細胞（ＰＢＭＮＣ ）は、フィコールと上清の界面に存在するが、残余赤血球および多核細胞（主に 好中球）は、細胞残渣に存在する。残渣をＮＨ，Ｃ１０，８％、Ｈｅ１）ｅｓｌ ＯｍＭの溶液中に再懸濁し、赤血球をバーストさせるために３７６Ｃ７分間イン キュベートした。残余細胞（主に好中球）を遠心分離し、ＨＢＳＳ　（ハンクス 平衡塩類溶液、以下ＨＢＳＳをいう）緩衝液（ギブコＢＲＬ−商品番号０４１− ０４０２０Ｈ）で洗浄する。

ｂ）毘核球の息離 単核球の単離原理は、Ａ、ボユム、１９８３年、スカンジナビアン・ジャーナル ・オブ・イムノロジー、第１７巻、４２９〜４３６頁に開示されている。下記に 要約される。方法は、ヨウ素含有勾配培地ニコデンツ（Ｎ、Ｎ“−ビス（２，３ −ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ　−（２，３−ジヒドロキンプロピル）ア セタミド］−２゜４、　６−）リョードイソフタラミド）を使用して血液から単 核球を分離することからなる。単核球およびリンパ球間の密度の相違を強調する ために、リンパ球は水を排除し、より密度が高くなるように、溶液の容量モル濃 度を増加させる。単核球の分離のために最適濃度でニコデンツ、塩化ナトリウム およびトリノン／ＮａＯＨを含む「ニコブレップ１．０６８Ｊ培地を使用するこ とは可能であるにコムド・ファルマ・ＡＳ１ノルウェー、商品番号２２３５１０ ）。

下記のプロトコールを使用する 赤血球の大部分を０６％デキストランおよび０，０９％ＮａＣ１を含む溶液中３ ０分間３７℃で沈降して抹山血から除去する。単核球、リンパ球および好中球を 含む血漿の上層を除去する。他の細胞力１ら単核球を分離するために、下記のよ うにして管を製造する。血漿６ｍｌを！径１３〜１４ｍｍの管中ニコブレップ１ ．０６８にコムド・ファルマ・ＡＳ−商品番号、２２３５１０）の３ｍ１層上に 付着させる。６００ｇで１５分間遠心分離後、清澄化血漿を界面上３〜４ｍｍま で除去し、残余プラズマおよび全二コブレップ溶液を残余細胞上約１ｃｍまで集 め、それによって、リンパ球を除去させない。集めた単核球懸濁液を、下記の組 成の溶液で６〜７ｍｌの容量にする。０９％ＮａＣ１，０，１３％ＥＤＴＡ、１ ％ＥＢＳ、ついで６００ｇ７分間遠心分離する。

単核球を血小板でコンタミネートする。後者を遠心分離して除去し、ついで上溝 を除去し、同じ溶液で再懸濁し、これらの操作を３回繰り返す。

細胞を０５％ウノ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＲＰＭＩＩ６４０培地（ギブ コ）中に再懸濁する。

Ｃ）走化性を実証するだめのプロトコール使用された試験は、Ｗ、フォーク等、 １９８０年、ンヤーナル・オブ・イムノロジカル・メソード、第３３巻、２３９ 〜２４７頁に記載された試験である。使用された正確なプロトコールを下記に説 明する： ニューロブローブ社製（商品番号　ＡＰ４８）定性測定のために修正されたボイ デン室を使用する。試験サンプルは好中球を試験するためにＨＢＳＳ中に希釈、 単核球の試験のために０５％ＢＳＡを含むＲＰ　Ｍ　Ｉ中に希釈し、下部プレー ト中のウェル中に置く。ポリカーボナートフィルター（孔径：５ｍｍ：ニューフ レポアー商品番号１５５８４５）を光沢のある面を下にして上記のプレート上に 置く。上部のプレートをフィルター上に置く。細胞（緩衝液５０μｍ当たり５０ ０００）を上部プレート中のウェル中に置く。室を湿潤な天火中または湿った綿 を含む的中、好中球の試験の場合１時間、単核球の試験の場合３時間、３７°Ｃ でインキ二ヘートする。フィルターを回収し、光沢のない面（移動しなかった細 胞）上にある細胞をフィルターを拭き、ゴム製スクレーバでそれを削り、これら の後の２操作を１回繰り返す。移動しなかった細胞を染色し、「ディツークイッ ク」キット（デーデー商品番号１３０８３２）を使用して定着する。フィルター の光沢のある面の細胞数を顕微鏡下で数える。

ｄ）サンプルの製造 ａ）組換えタンパク質のサンプル −ＣＯＳ細胞由来のセクション６に記載と同様にして精製されたタンパク質ＮＣ ２８ 一酵母由来のセクション９に記載と同様に精製されたタンパク質Ｃ２８ 下記のように得られたサイトカインＭＣＰ−１：ヨンムラ等、１９８９年、フエ ブス・レターズ、第２４４巻、４８７〜４９３頁に記載されたサイトカインのｃ ＤＮＡの部分に相当するオリゴヌクレオチドを使用しセクション２において製造 されたライブラリーをスクリーニングしてサイトカインＭＣＰ−１のｃＤＮＡを 担持するプラスミドｐｓＥ１の単離後、タンパク質！’、’Ｃ２８の記載と同様 にＣＯ８細胞を形質転換し、形質転換されたＣＯ８細胞を培養し、サイトキノン ＭＣＰ−１を精製する。

−プロティンＩＬ−８（エンドゲンー商品番号ＣＹ−０９０２５’）ｂ）ペプチ ドのサンプル ペプチド　Ｃ１３、セクション１０記載と同様に製造ペプチド　Ｃ１６、セクシ ョン１０記載と同様に製造ペプチド　Ｃ２０、セクション１０記戴を同様に製造 ペプチド　ホルミル−Ｍｅ　ｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、−船名ｆＭＬＰ（シグマ−商 品番号Ｆ３５０６） ２）結果 ａ）単核球上、ＣＯ８細胞由来の精製タンパク質ＮＣ２８の走化性および酵母由 来の精製タンパク質の走化性得られた結果を、Ｆｉｇ、６ａに示す。これは酵母 由来の精製タンパク質、ＣＯ８細胞由来の精製タンパク質ＮＣ２８およびペプチ ドＣ１３、Ｃ１６、Ｃ２０、ｆＭＬＰのｌｎＭ中に発現される濃度の関数として 顕微鏡視野当たり細胞数を示し、Ｆ　ｉｇ、　６　ｂでは、酵母由来の精製タン パク質ＮＣ２８およびＣＯ８細胞由来の精製サイトキノンＭＣＰ−１のｌｎｇ／ ｍｌ中に発現される濃度の関数として顕微鏡視野当たり細胞数を示す。

Ｆ　ｉｇ、　５　ａは、３時間インキュベート後、酵母由来の精製タンパク質Ｎ Ｃ２８およびＣＯ８細胞由来の精製タンパク質ＮＣ２８が、単核球上で走化活性 を所有することが周知である（シッフマン　Ｅ。

等、第１１４巻、１８３１頁）ペプチドであるｆＭＬＰの走化活性より著しく高 い単核球上走化活性を有することを示す。タンパク質ＮＣ２８のカルボキン末端 ペプチドもまたこの活性を有する。

Ｆ　ｉｇ、　５　ｂは、単核球上タンパク質Ｎ　Ｃ２８の走化活性が、走化活性 で周知のタンパク質ＭＣＰ−１の走化活性とマグニチュードが同等であること（ ローリンズ　Ｂ、Ｊ　等、１９９１年、ブランド、第７８巻、１１１２頁）およ びこの活性が濃度０１〜１０ｎ、ｇ／ｍｌで測定されることを示す。

ｂ）好中球上、酵母由来精製タンパク質ＮＣ２８の走化性得られた結果をＦｉｇ 、５ｃで具体的に説明する。Ｆ　ｉｇ、　６　ｃは、酵母、サイトカインＩＬ− ８およびペプチドｆＭＬＰ由来の精製タンバク質の１ｎｇ／ｍｌ中発現される濃 度の関数として顕微鏡視野当たり細胞数を示す。

タンパク質ＮＣ２８は、走化活性を有することがともに周知であるサイトカイン ＩＬ−８およびペプチドｆＭＬＰ　（ヨシムラ　Ｔ等、１９８７年、プロン−デ ィンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・サイエンスアメリカ合衆国、第８４ 巻、９２３３．１およびンッフマン　Ｅｌ等、１９７５年、ジャーナル・オブ・ イムノロン−１第１１４巻、１８３１頁）と比較して、好中球（１００ｎｇ／ｍ １以上の高濃度で）上に弱い走化活性のみを有する。

タンパク質ＮＣ２８は、したがって単核球の強いおよび特異的ｃｈｅｍｏａｔｔ ｒａｃｔａｎｔである。

プラスミド　ｐ５ｉ！１ ■ ＯＱ’ｌ　Ｏ，（Ｔｈ　Ｏ＜７１　ロ　（Ｔｈ　ｏ　ａｎ　ロ　φ０　０　０　 ｅＴｈ　ｕ″ＩＷ　ロ　ｏ′１　リ　で　。　の　リ　マ　ＯＷい　罰　−Φ　 −−へ　−Ｎ　Ｎ　ｒｖ′１　へ　！”）Ｆｌ　寸　ｎｇ λＣ：フλτ？τフＣＱＧフＣロＣフＣλ入Ｃ；；フλ入：τλτＣλλＧ：フ αλ：ＧａλＣ；λＣユλτＣフＣτλ入λτλＧτフλ：τＣττ：フλ０ズ 詰２τＣりτＣ：ロ；；λＣ；τＣフＣ；υ℃フＣττ（ｒＧＧ）ＧＧフＱ’Ｌ ＴＣＧＧ　：ＣλＣλＧＧＧＧＣｃｃ？：Ｃ；ｕコごフ入ａλＭ７−℃＝α７− ＝℃１ＣＣ：：Ｇ？τ（Ｃ）Ｃ：λＧλＣλＣＦＩＧ、６ａ ０　ＮＣ２Ｅ　酵ｅ’度（ｎｇ／ｍｌ）麿　培地 。く３酵母　濃度（ｎｇ／ｍｌ） φ　１ｕ −ｌ”、Ｂ５５ ０　へ化Ｐ 要約書 本発明は下記の配列（ａｌ）： Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　）（ｉｓ　Ｌｃｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ 　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｃｕおよび、配列（ａｌ）の直ぐ上流に、下記の 配列（Ｂ２）Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｓｃ ｒ　Ｔｈｒ　Ｔｎｒ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｃ　ＩｌｅＡｓｎ 　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｉｅ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｔｎ　Ａｒｇ　Ｌｃｕ　Ｇｉｕ 　Ｓｃｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　ＴｈｒＴｈｒＳｃｒ　Ｓｃｒ　Ｈｉｓ　Ｃ ｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｉｌｃ　Ｐｈｃ　Ｌｙｓ　Ｔ ｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　ＡｓｐＬｙｓ　Ｇｌｕ　ｌｉｅ　Ｃｙｓ　ＡｊａＡｓｐ 　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ の部分、または１個またはそれ以上のアミノ酸が配列（Ｂ２）と異なり、タンパ ク質に同じ活性を与える配列の部分を含む、サイトカイン型活性を有するタンパ ク質に関する。

適用・抗癌剤または免疫調節剤として特に有効な医薬。

図なし 国際調査報告

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．下記の配列（ａ１）： 【配列があります】 および、配列（ａ１）の直ぐ上流に、下記の配列（ａ２）：【配列があります】 の部分、または１個またはそれ以上のアミノ酸が配列（ａ２）と異なり、タンパ ク質に同じ活性を与える配列の部分を含む、サイトカイン型活性を有するタンパ ク質。
2. ２．配列（ａ２）： 【配列があります】 および、上記の配列（ａ２）の直ぐ下流に、配列（ａ１）：【配列があります】 または個１またはそれ以上のアミノ酸が上記の配列（ａ１）と異なり、タンパク 質に同じ活性を与える配列を含む、サイトカイン型活性を有するタンパク質。
3. ３．配列（ａ１）の配列の直ぐ上流の配列（ａ２）の部分が、下記の配列： 【配列があります】および【配列があります】から選ばれる、請求項１記載のタ ンパク質。
4. ４．配列（ａ１）の直ぐ上流の、配列（ａ２）の部分、または１個またはそれ以 上のアミノ酸が配列（ａ２）と異なり、タンパク質に同じ活性を与える配列の部 分が、配列（ａ２）および下記の配列（ａ３）および（ａ４）： （ａ３）【配列があります】 （ａ４）【配列があります】 または１個またはそれ以上のアミノ酸が配列（ａ３）、（ａ４）または（ａ２） と異なり、タンパク質に同じ活性を与える配列から選ばれる、請求項１記載のタ ンパク質。
5. ５．配列（ａ１）の直ぐ上流の配列（ａ２）の部分が配列（ａ２）である、請求 項４記載のタンパク質。
6. ６．アミノ末端ブロッキングを有する、請求項５記載のタンパク質。
7. ７．見掛け分子量９±２ｋＤａを有する、請求項５または請求項６記載のタンパ ク質。
8. ８．見掛け分子量１１±２ｋＤａを有する、請求項５または請求項６記載のタン パク質。
9. ９．見掛け分子量１６±２ｋＤａを有する、請求項５または請求項６記載のタン パク質。
10. １０．Ｏ−糖鎖形成される、請求項５記載のタンパク質。
11. １１．Ｎ−糖鎖形成される、請求項５記載のタンパク質。
12. １２．９０％以上の純度を有する、請求項４または請求項５記載のタンパク質。
13. １３．９５％以上の純度を有する、請求項５記載のタンパク質。
14. １４．請求項４または請求項５記載のタンパク質または請求項４または請求項５ 記載のタンパク質の前駆体をコード化する組換えＤＮＡ。
15. １５．シグナル配列を含む、請求項４または請求項５記載のタンパク質の前駆体 をコード化する組換えＤＮＡ。
16. １６．シグナル配列が下記の配列（ｂ１）、（ｂ２）および（ｂ３）： （ｂ１）【配列があります】 （ｂ２）【配列があります】 （ｂ３）【配列があります】 から選ばれる配列である、請求項１５記載の組換えＤＮＡ。
17. １７．成熟タンパク質をコード化するヌクレオチド配列が下記の配列（Ｎａ２） ： 配列があります】 である、請求項１６記載の組換えＤＮＡ。
18. １８．アミノ酸配列（ｂ１）、（ｂ２）および（ｂ３）をコード化するヌクレオ チド配列が下記の配列（Ｎｂ１）、（Ｎｂ２）および（Ｎｂ３）： （Ｎｂ１）【配列があります】 （Ｎｂ２）【配列があります】 （Ｎｂ３）【配列があります】 から選ばれる、請求項１６記載の組換えＤＮＡ。
19. １９．請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡおよびその発現に 必要な手段を含む発現ベクター。
20. ２０．請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡおよびその発現に 必要な手段を含む動物細胞。
21. ２１．請求項１９記載の発現ベクターを含む、請求項２０記載の動物細胞。
22. ２２．ＣＨＯ細胞である、請求項２０または請求項２１記載の動物細胞。
23. ２３．ＣＯＳ細胞である、請求項２０または請求項２１記載の動物細胞。
24. ２４．請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡおよびその発現に 必要な手段を含む酵母。
25. ２５．請求項２１または請求項２２記載の動物細胞の培養の工程、ついで組換え タンパク質の分離および精製を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のタ ンパク質の製造方法。
26. ２６．請求項２４記載の酵母の培養工程、ついで組換えタンパク質の分離および 精製を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質の製造方法。
27. ２７．請求項１〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質を含む医薬。