EA006207B1 - ИММУНОГЕННЫЕ ХИМЕРНЫЕ ЧАСТИЦЫ НВс, ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ - Google Patents

ИММУНОГЕННЫЕ ХИМЕРНЫЕ ЧАСТИЦЫ НВс, ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ Download PDF

Info

Publication number
EA006207B1
EA006207B1 EA200300270A EA200300270A EA006207B1 EA 006207 B1 EA006207 B1 EA 006207B1 EA 200300270 A EA200300270 A EA 200300270A EA 200300270 A EA200300270 A EA 200300270A EA 006207 B1 EA006207 B1 EA 006207B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
hbc
sequence
residues
amino acid
chimeric
Prior art date
Application number
EA200300270A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200300270A1 (ru
Inventor
Эшли Дж. Биркетт
Original Assignee
Эповиа, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Эповиа, Инк. filed Critical Эповиа, Инк.
Publication of EA200300270A1 publication Critical patent/EA200300270A1/ru
Publication of EA006207B1 publication Critical patent/EA006207B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/445—Plasmodium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
    • C12N2770/32122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Описан усеченный по карбоксиконцу химерный нуклеокапсидный белок НВс вируса гепатита В, который сконструирован в целях повышения стабильности самособирающихся частиц и который представляет иммуногенный эпитоп. Такое представление иммуногенного эпитопа присходит в иммуногенной петле НВс, в то время как усиление стабильности самособирающихся частиц достигается благодаря присутствию по крайней мере одного гетерологичного цистеинового остатка возле карбоксиконца указанной химерной молекулы. Также описаны способы получения и использования указанных химер.

Description

Нуклеокапсид или сердцевина (кор) вируса гепатита В млекопитающего (НВУ или гепаднавирус) содержит последовательность из 183 или 185 аминокислотных остатков, в зависимости от подтипа вируса, а капсид вируса утки содержит 262 аминокислотных остатка. Мономеры корового белка нескольких вирусов гепатита В, принадлежащих к гепаднавирусам, подвергаются самосборке в инфицированных клетках и образуют стабильные агрегаты, известные как частицы корового белка вируса гепатита В (частицы НВс). Сообщалось, что частицы НВс имеют две трехмерные структуры. Первая структура представляет небольшую популяцию, содержащую 90 копий субъединицы белка НВс в виде димеров или 180 отдельных мономеров белка, а вторая представляет главную популяцию, содержащую 120 копий субъединицы белка НВс в виде димеров или 240 отдельных мономеров белка. Эти частицы обозначаются как частицы Т=4 или Т=3 соответственно, где Т представляет триангуляционное число. Эти частицы НВс вируса, инфицирующего человека (человеческого вируса), имеют диаметр приблизительно 30 или 34 нм соответственно. Ришреик е! а1., (1995) 1п!егу1го1оду, 38:63-74; и Мекдег е! а1., (1998) Юеп.Ую1. 79:587590.
В работе Соптеау е! а1., (1997) №11иге. 386:91-94, описана структура частиц НВс человека при разрешении в 9 А, которая была определена по криоэлектронным микрофотографиям. В работе Во!!сйег е! а1., (1997) Иа!иге, 386:88-91, описана полипептидная укладка для мономеров человеческого НВс и представлена приблизительная схема нумерации аминокислотных остатков в альфа-спиральных областях и в областях связанной с ними петли. В работе 2йепд е! а1., (1992), 1. Вю1. Сйет., 267(13):9422-9429, сообщалось, что образование коровой частицы не зависит от богатого аргинином С-концевого домена, от связывания с нуклеиновыми кислотами или от образования дисульфидных связей, как было подтверждено на основании исследований мутантных белков, не содержащих одного или нескольких цистеинов, и на основании других экспериментов с усеченными по С-концу белками (ВйпЬаиш е! а1., (1990) 1. У1го1. 64, 3319-3330).
Нуклеокапсид или коровый белок вируса гепатита В (НВс) был описан как иммуногенная молекула-носитель, которая стимулирует Т-клеточный ответ у иммунизованного животного-хозяина. См., например, патенты США №№ 4818527, 4882145 и 5143726. Особенно ценным свойством этого носителя является его способность представлять чужеродные или гетерологичные В-клеточные эпитопы в сайте иммунодоминантной петли, которая присутствует в положениях остатков примерно 70-90, а обычно, в положениях примерно 75-85 от аминоконца (Ν-конца) данного белка. С1агке е! а1. (1991) Р. Вго\уп е! а1., еб5. Уассшек 91, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1б 8рпп§ НагЬог, Νο\ν Уогк, рр.313-318.
В процессе репликации вируса, нуклеокапсиды НВУ ассоциируются с пре-геномом вирусной РНК, с вирусной обратной транскриптазой (Ро1) и с концевым белком (происходящим от Ро1), в результате чего образуются компетентные по репликации коровые частицы. Ассоциация между этим нуклеокапсидом и пре-геномом вирусной РНК опосредуется аргинин-богатым доменом у карбоксильного конца (Сконца). При экспрессии в гетерологичных экспрессионных системах, таких как Е.еой, где пре-геном вирусной РНК отсутствует, протамин-подобный С-конец, т.е. остатки в положениях 150-183, может связываться с РНК Е.еой. 2йапд е! а1., (1992) 1ВС, 267(13), 9422-29.
При применении в качестве молекулы-носителя предпочтительно, чтобы эти нуклеокапсиды НВУ не связывались с нуклеиновой кислотой данного хозяина. ВйпЬаиш е! а1., (1990) кУйок, 64:3319-3330 обнаружили, что протамин-подобный С-концевой домен нуклеокапсидов НВУ может быть делетирован, и это не влияет на способность данного белка к сборке вирусоподобных частиц. Так, например, сообщалось, что белки, усеченные примерно до положения 144, т.е. содержащие последовательность НВс в положении примерно 1-144, способны подвергаться самосборке, тогда как делеции, находящиеся за остатком 139, препятствуют сборке капсида [Р. ВипЬаиш & М. N35531 (1990) 1. УЫ 64, 3319-30].
21о1шск е! а1., (1997) Ргос. №!1. Асаб. 8ск, И8А, 94:9556-9561, изучали сборку полноразмерных и усеченных белков НВс в частицы. Помимо обсуждения полноразмерных молекул, этими авторами было описано получение усеченного белка, который содержит последовательность НВс от положения 1 до положения 149, где цистеины в положениях 48, 61 и 107 были заменены аланинами и где у С-конца был добавлен цистеиновый остаток (положение 150). Для мечения в целях проведения электронной микроскопии был использован С-концевой меркаптан для связывания с кластером, содержащим атом золота.
- 1 006207
Совсем недавно Ме1хдег е! а1., (1998) 1. Сеп. νίοΐ., 79:587-590, сообщали, что пролин в положении 138 (Рго-138 или Р138) последовательности человеческого вируса необходим для образования частицы. Эти авторы также сообщали, что способность к сборке частиц, усеченных у карбоксиконца до длины 142 и 140 остатков, была нарушена, а при усечениях до длины 139 и 137 остатков, способность к сборке была полностью утрачена.
Несколько групп показали, что усеченные частицы обладали пониженной стабильностью по сравнению со стандартными коровыми частицами вируса гепатита В [Са1епа е! а1., (1989) 1. νίτοί., 63:46454652; 1пайа е! а1., (1989) Щгик. Век., 14:27-48], на что указывала вариабельность размеров частиц и присутствие фрагментов частиц в очищенных препаратах [Маакеп е! а1., (1994) А гей. νίτοί., 135:131-142]. Таким образом, еще до сообщения Ме1хдег е! а1. (см.выше), Ритрепк е! а1., (1995), 1п!егупо1оду, 38:63-74, представили краткий обзор сообщений, где указывалось, что карбоксиконцевая граница для последовательностей НВс, необходимая для их самосборки, локализована между аминокислотными остатками 139 и 144, и что первые два или три аминокислотных остатка могут быть заменены другими последовательностями, однако удаление четырех или одиннадцати аминоконцевых остатков приводит к полному исчезновению химерного белка в трансформированных клетках Е.еой. №1гупск е! а1., (Ое!ойег 1999) Ыа!ше Мей., 5(10):1157-1163, сообщали, что образование частицы происходит в результате экспрессии в Е.сой НВс-химеры, содержащей Ν-концевую часть из 24 остатков белка М2 вируса гриппа, присоединенную к НВс у остатка 5.
Рекомбинантно продуцируемые гибридные частицы НВс, несущие внутренние вставки (называемые в литературе химерными НВс-частицами или НВс-химерами), содержащие различные встроенные полипептидные последовательности, были получены путем гетерологичной экспрессии в организмах широкого ряда, включая Е.сой, В.кийййк, Vасс^и^а, 8а1топе11а 1урЫтцгшт, 8ассйаготусек сегегыае. См. например работу Ритрепк е! а1. (1995) 1п!егупо1оду, 38:63-74 и указанные в ней ссылки, относящиеся к работам, проведенным несколькими группами исследователей.
Как описано выше, Ритрепк и др. представили список химер, образующих частицы, в которых встроенная полипептидная последовательность расположена у Ν-конца, у С-конца и между этими концами. В этой статье сообщалось, что длины вставок составляют 24-50 остатков у Ν-конца, 7-43 внутренних остатков и 11-741 остатков у С-конца.
Кга1х е! а1., (1999) Ргос. №!1. Асай. 8ск, И8А, 96:1915-1920, недавно описали экспрессию в Е.сой химерных частиц НВс, состоящих из усеченной последовательности НВс, внутренне слитой с белком, состоящим из 238 остатков и флуоресцирующим в зеленом диапазоне спектра (СРР). Эта химера содержала встроенную последовательность СРР, фланкированную парой богатых глицином гибких линкерных плечей, заменяющих аминокислотные остатки 79 и 80 в НВс. Указывается, что эти частицы эффективно индуцируют выработку антител против нативного СРР у кроликов, используемых в качестве животных-хозяев.
В патенте США № 5990085 описаны два гибридных белка, образованных из антигенного бычьего пептида ингибина, слитого (ί) с иммуногенной петлей между остатками 78 и 79 и (ιί) с карбоксиконцевой усеченной НВс после остатка 144. Указывается, что экспрессированные гибридные белки, при их введении животному-хозяину, индуцируют выработку антител против ингибина. Сообщалось, что через тридцать дней после иммунизации титры у пациентов являются относительно низкими, например 1:3000-15000 для гибридного белка со вставкой в петлю и 1:100-125 для вставки после остатка 144.
Очевидно, что химерные коровые частицы гепатита В, несущие внутренние вставки, часто имеют менее упорядоченную структуру по сравнению с частицами, у которых отсутствуют гетерологичные эпитопы, на что указывал анализ, проведенный с помощью электронной микроскопии [8сйойе1 е! а1., (1994) 1. Ехр. Мей., 180:1037-1046]. В некоторых случаях, инсерция гетерологичных эпитопов в усеченные по С-концу частицы НВс оказывает такое сильное дестабилизирующее действие, что гибридные частицы не могут быть выделены после гетерологичной экспрессии. [8сйойе1 е! а1., (1994) 1иРес!. 1ттипо1., 62:1669-1676]. Таким образом, многие химерные частицы НВс являются настолько нестабильными, что в процессе очистки они разлагаются до такой степени, что становятся невыделяемыми, либо отличаются очень плохой стабильностью, что делает проблематичным их использование для разработки вакцин.
Сохранение структурной особенности, а значит и стабильности полноразмерных частиц НВс, при утрате способности к связыванию этих полноразмерных частиц НВс с нуклеиновой кислотой могло бы быть в высокой степени благоприятным фактором при разработке вакцины, где в качестве системы доставки используется гепаднавирусный нуклеокапсид. Действительно, Игйсй и др. в своем недавно опубликованном обзоре по использованию НВс-химер в качестве носителей для чужеродных эпитопов [Айу. Щгик Век., уо1. 50 (1998) Асайетю Ргекк радек 141-182] указывают на три потенциальных проблемы, которые должны быть решены при использовании этих химер в человеческих вакцинах. Первая потенциальная проблема связана с неумышленным переносом нуклеиновых кислот, присутствующих в химерной вакцине, иммунизованному хозяину. Вторая потенциальная проблема связана с определенными препятствиями, возникающими из-за уже присутствующего иммунитета к НВс. Третья потенциальная проблема связана с требованиями воспроизводимости в получении интактных химерных частиц, которые можно было бы также хранить в течение длительного периода времени.
- 2 006207
Как будет описано ниже, настоящее изобретение дает одно решение этих проблем, обеспечивая стабильность НВс-химеры, а также, в основном, отсутствие способности полученной конструкции связываться с нуклеиновой кислотой, при этом данная конструкция представляет собой в высокой степени иммуногенный материал.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к рекомбинантному белку нуклеокапсида гепаднавируса, то есть к химерному белку кора вируса гепатита В (НВс) [или к молекуле корового белка вируса гепатита В или к химерной молекуле НВс или просто химере], который, после его экспрессии в клетке-хозяине, подвергается самосборке с образованием частицы. Этот химерный белок (ί) представляет один или несколько иммуногенных эпитопов на Ν-конце, в иммунногенной петле НВс или на С-конце, либо (ίί) он имеет гетерологичный линкерный остаток для конъюгированного эпитопа в иммуногенной петле и содержит цистеиновый остаток в С-конце или вблизи С-конца, который сообщает повышенную стабильность этим частицам. Указанный химерный белок имеет достаточно мало аргининовых остатков, так что эти самособирающиеся частицы не связываются с нуклеиновой кислотой.
Настоящее изобретение также относится к иммуногенной частице, состоящей из молекул рекомбинантного химерного белка кора вируса гепатита В (НВс). Этот химерный белок (ί) представляет один или несколько иммуногенных эпитопов на Ν-конце, в иммунногенной петле НВс или на С-конце, либо (ίί) он имеет гетерологический линкерный остаток для конъюгированного эпитопа в иммуногенной петле. Этот рекомбинантный белок содержит цистеиновый остаток в С-конце или вблизи С-конца. Указанные частицы, в основном, не связываются с нуклеиновой кислотой и обладают повышенной стабильностью по сравнению с частицами, состоящими из каких-либо других идентичных белков, не содержащих цистеиновый остаток.
В одном из вариантов своего осуществления настоящее изобретение относится к молекуле рекомбинантного корового белка вируса гепатита В (НВс), имеющей длину примерно вплоть до 515 аминокислотных остатков, где указанная молекула (a) содержит (ί) последовательность из, по крайней мере, примерно 130 остатков Ν-концевых 150 аминокислотных остатков молекулы НВс, включая гетерологичный эпитоп, ковалентно связанный пептидной связью, или гетерологичный линкерный остаток для конъюгированного эпитопа, присутствующий в иммунодоминантной петле НВс, или (ίί) последовательность, по крайней мере, примерно из 135 остатков Ν-концевых 150 аминокислотных остатков НВс;
(b) содержит от одного до десяти, а более предпочтительно от одного до трех цистеиновых остатков, расположенных в направлении к С-концу данной молекулы от С-концевого остатка присутствующей последовательности НВс и в пределах примерно 30 остатков от С-конца химерной молекулы [Сконцевой(ые) цистеиновый(ые) остаток(ки)], и (c) содержит последовательность по крайней мере из пяти аминокислотных остатков от положения 135 последовательности НВс до С-конца НВс.
Рассматриваемые химерные молекулы (ί) содержат не более чем 20 % замененных аминокислотных остатков в последовательности НВс и (ίί) подвергаются самосборке после экспрессии в клетке-хозяине с образованием частиц, которые, в основном, не связываются с нуклеиновыми кислотами. Эти частицы, в основном, не связываются с нуклеиновыми кислотами и являются более стабильными, чем частицы, образованные из какой-либо другой идентичной НВс-химеры, которая не содержит вышеуказанного Сконцевого цистеинового остатка(ов), или в которой С-концевой цистеиновый остаток присутствует в данной химере и заменен в этой молекуле другим остатком, таким как аланиновый остаток.
В одном из аспектов настоящего изобретения, рассматриваемая НВс-химера имеет последовательность из примерно от 135 до 515 аминокислотных остатков и содержит четыре последовательно расположенных и связанных пептидной связью доменов, которые обозначены доменами I, II, III и IV. Начиная с Ν-конца, домен I содержит примерно от 71 до 100 аминокислотных остатков, последовательность которого включает, по крайней мере, последовательность остатков примерно от положения 5 до положения 75 НВс, и необязательно включает гетерологичный эпитоп, содержащий примерно до 30 аминокислотных остатков, связанных пептидной связью с одним из остатков 1-4 НВс. Домен II содержит от 5 до примерно 250 аминокислотных остатков, связанных пептидной связью с остатком 75 НВс домена I, в котором (ί) от нуля до всех остатков, а предпочтительно по крайней мере 4 остатка в положениях 76-85 последовательности НВс связаны пептидной связью примерно с 1-245 аминокислотными остатками, которые являются гетерологичными (чужеродными) по отношению к НВс и составляют гетерологичный эпитоп, такой как В-клеточный эпитоп или гетерологичный линкерный остаток для эпитопа, такого как Вклеточный эпитоп, или (ίί) последовательность НВс в положениях 76-85 не имеет гетерологичных остатков. Домен III представляет собой последовательность НВс от положения 86 до положения 135, связанную пептидной связью с остатком 85 домена II. Домен IV содержит (ί) от нуля до четырнадцати остатков аминокислотной последовательности НВс от положения 136 до положения 149, связанных пептидной связью с остатком в положении 135 домена III, (ίί) от одного до десяти, а более предпочтительно, от одного до трех цистеиновых остатков, связанных пептидной связью у С-конца с последовательностью НВс [С-концевой(ые) цистеиновый(ые) остаток(ки)], и (ίίί) от нуля до примерно 100, более предпочтительно
- 3 006207 от нуля до примерно 50, а наиболее предпочтительно примерно 25 аминокислотных остатков в последовательности, гетерологичной по отношению к НВс, от положения 150 до С-конца, при условии, что указанный домен IV содержит по крайней мере 6 аминокислотных остатков, включая вышеуказанные от одного до десяти цистеиновых остатков (ίί).
Рассматриваемый рекомбинантный химерный белок образует частицы, которые, в основном, не связываются с нуклеиновыми кислотами и являются более стабильными, чем частицы, образованные из НВс-химеры, содержащей те же самые связанные пептидной связью последовательности доменов I, II и III и последовательность домена IV, которая по существу, является той же самой, но в которых отсутствуют какие-либо цистеиновые остатки, или в которой цистеиновый остаток заменен другим остатком, таким как аланиновый остаток. При сборке химерных молекул в частицы, эти частицы имеют отношение оптической плотности при 280-260 нм (отношение оптической плотности 280/260), равное примерно 1,21,7. Образованные частицы, вероятно, имеют структуру Т=4, содержащую 240 мономерных НВс-химер или 120 димерных НВс-химер.
В более широком смысле, рассматриваемая химерная частица содержит С-концевой усеченный белок НВс (по крайней мере, до остатка 149), который содержит гетерологичный эпитоп или гетерологичный линкерный остаток для эпитопа в иммунодоминантной петле, или непрерываемую иммунодоминантную петлю, и независимо от последовательности аминокислотных остатков иммунодоминантной петли, от одного до трех С-концевых цистеиновых остатков, гетерологичных по отношению к последовательности НВс. Такая частица имеет отношение оптической плотности при 280/260, равное примерно 1,2-1,7 и является более стабильной, чем частица, образованная из какой-либо другой идентичной НВсхимеры, в которой отсутствует вышеуказанный С-концевой цистеиновый остаток (остатки), или в которой единственный С-концевой цистеиновый остаток присутствует в данной химере и заменен другим остатком.
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к инокуляту или вакцине, которые содержат вышеуказанную химерную НВс-частицу или конъюгат гаптена с вышеуказанной НВс-химерной частицей, растворенные или диспергируемые в фармацевтически приемлемом составе разбавителей, который обычно также содержит воду. При введении иммуногенно эффективного количества инокулята животному, такому как млекопитающее или птица, этот инокулят (ί) индуцирует образование антител, которые вступают в специфическую иммунную реакцию с химерной частицей или с конъюгированным с ней гаптеном (связанным через боковую группу) или (ίί) активирует Т-клетки, или (ίίί) и то и другое. Эти индуцированные таким образом антитела также предпочтительно вступают в специфическую иммунную реакцию (связываются) с антигеном, содержащим гаптен, таким как белок, где указанный гаптен является пептидом, или сахарид, где гаптен является олигосахаридом.
Настоящее изобретение имеет несколько благоприятных эффектов и преимуществ.
Один из таких благоприятных эффектов настоящего изобретения заключается в том, что образованные химерные частицы НВс являются более стабильными при хранении в водных композициях, чем частицы с похожей последовательностью, в которой отсутствуют какие-либо С-концевые цистеиновые остатки.
Преимуществом настоящего изобретения является то, что полученные химерные молекулы обладают такой же способностью к самосборке, как и нативные частицы НВс, но при этом они не связываются с нуклеиновой кислотой как нативные частицы.
Другой благоприятный эффект настоящего изобретения заключается в том, что образованные химерные молекулы обладают превосходной В-клеточной и Т-клеточной иммуногенностью.
Другим преимуществом настоящего изобретения является то, что химерные частицы настоящего изобретения обычно получают с более высоким выходом, чем аналогичные частицы, не содержащие Сконцевого цистеинового остатка.
Другой благоприятный эффект настоящего изобретения заключается в том, что образованные химерные частицы в большинстве случаев являются значительно более иммуногенными, чем аналогичные конъюгаты, не содержащие С-концевого цистеинового остатка.
Другим преимуществом настоящего изобретения является то, что иммуногенности частиц, собранных из химерных молекул, содержащих по крайней мере один С-концевой цистеиновый остаток, являются более высокими, чем иммуногенность аналогичных частиц, собранных из химерных молекул, не содержащих по крайней мере одного С-концевого цистеинового остатка.
Другие благоприятные эффекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны каждому специалисту из нижеследующего описания изобретения.
Краткое описание графического материала
Графический материал составляет часть описания настоящего изобретения.
На фиг. 1 показаны модификации, внесенные в коммерчески доступный плазмидный вектор рКК223-3 при получении плазмидного вектора ρΚΚ223-3Ν, используемого в настоящем изобретении для получения некоторых рекомбинантных НВс-химер. Модифицированная последовательность (8ЕО ГО
N0:285) показана ниже последовательности коммерчески доступного вектора (8ЕО ГО N0:286). Основания добавленного №о!-сайта показаны строчными буквами, где все добавленные основания подчеркну- 4 006207 ты двойными линиями, а делегированные основания показаны пунктиром. Показаны два рестрикционных сайта, присутствующие в этом сегменте последовательности (ΝεοΙ и Н1пбШ).
На фиг. 2 на трех панелях фиг. 2А, 2В и 2С схематически проиллюстрирована предпочтительная стратегия клонирования, в которой В-клеточный эпитоп вируса малярии, такой как (ΝΑΝΡ)4 (ЗЕф ГО N0:1), клонируют в ЕсоК1- и ЗасЕсайты сконструированного гена НВс (фиг. 2 А) между положениями остатков 78 и 79, что приводит к разрушению ЕсоК1-сайта, но к сохранению Заб-сайта. На фиг. 2В показана ДНК, которая кодирует Т-клеточный эпитоп, такой как эпитоп, обозначенный РГ/СЗ-ИТС, и стопкодон (ЗЕО ГО N0:120), клонированный в ЕсоР!- и ΗίηάΙΙΙ-сайты у С-конца сконструированного усеченного гена НВс, содержащего первые 149 остатков НВс (НВс149). ПЦР-амплификация конструкции фиг. 2В с использованием праймера, имеющего 5'-концевой рестрикционный Зас1-сайт, смежный с НВскодирующей последовательностью, начинающейся в положении остатка 79; расщепление амплифицированной последовательности и конструкции фиг. 2А ферментом ЗасЕ и последующее лигирование соответствующих частей, как показано на фиг. 2С, приводят к образованию единственной генной конструкции, называемой далее У12, которая кодирует В-клеточные и Т-клеточные эпитопы иммуногена, используемого для вакцины против Р. ГаЮрагиш.
На фиг. 3 представлена фотография ДСН-ПААГ-анализа в восстанавливающих условиях для иллюстрации стабилизирующего действия на экспрессированные частицы кодона для единственного цистеинового остатка, встроенного с сохранением рамки считывания между С-концевым кодоном (У149) и стоп-кодоном НВс в химере, которая также содержит (ΝΑΝΡ)4, встроенный между аминокислотами в положениях 78 и 79 (У2.РГ1+С), и по сравнению с аналогичной конструкцией, С-конец которой представляет остаток У149 (У2.РГ1) на день 0 и через 15 дней при 37°С. [дорожка 1, У2.РГ1 - день 0; дорожка 2, У2.РГ1 - день 15 при 37°С; дорожка 3, У2.РГ1+С, день 0; дорожка 4, У2.РГ1+С - день 15 при 37°С].
На фиг. 4 представлена фотография ДСН-ПААГ-анализа в восстанавливающих условиях для иллюстрации стабилизирующих действий на химерные частицы НВс149, содержащие (NΑNΡ)4, встроенный между аминокислотами положений 78 и 79 и цистеин-содержащим Т-клеточным эпитопом, слитым с Сконцом (У2.РГ1+РГ/СЗ-ИТС, обозначаемым также У12.РГ1), по сравнению со схожей частицей, в которой С-концевой Сук заменен остатком А1а [У2.РГ1+РГ/СЗ-ИТС(С17А), обозначаемый также У12.РГ1(С17А) на день 0 и через 28 дней при 37°С. [дорожка 1, У2.РГ1+РГ/СЗ-ИТС -день 0; дорожка 2, У2.РГ1+РГ/СЗиТС - день 28 при 37°С; дорожка 3, У2.РГ1+РГ/СЗ-ИТС(С17А)] - день 0; дорожка 4, У2.РГ1+РГ/СЗИТС(С17А) - день 28 при 37°С].
На фиг. 5 представлен график, иллюстрирующий результаты непрямого иммунофлуоресцентного анализа (ИФА), осуществляемого с использованием фиксированных глутаральдегидом спорозоитов Р. ГаЮрагиш и ФИТЦ-меченных антимышиных Ι§Ο (специфичных к гамма-цепи) для детекции титров связанного антитела (1од 1/разведение; ордината) в зависимости от времени (недели) (абцисса) для трех химерных иммуногенов после иммунизации мышей. Данные для известного химерного иммуногена, СЗ2, показаны квадратами; данные для рекомбинантной НВс-химеры У12.РГ1 показаны ромбами, а данные для рекомбинантной НВс-химеры У12.РГ3.1 показаны треугольниками.
На фиг. 6 проиллюстрирована реакционная схема (схема 1), на которой показаны две последовательности реакций: (Ι) реакцию образования активированного носителя для связывания гаптена через боковую цепь с частицей вируса гепатита В, содержащей химерный коровый белок (кт-НВс), где эту реакцию проводят с использованием 1-карбоксилата сульфосукцинимидил-4-Щ-малеимидометил)циклогексана (сульфо-ЗМСС), а затем (ΙΙ) реакцию связывания сульфгидрил-терминированного (цистеинтерминированного) гаптена с активированным носителем с образованием частицы конъюгата. Частица кт-НВс обозначена рамкой, имеющей единственную боковую аминогруппу (для более ясной иллюстрации этой схемы), а сульфгидрил-терминированный гаптен обозначен линией, оканчивающейся группой ЗН.
На фиг. 7 на двух панелях фиг. 7А и 7В проиллюстрировано сопоставление шести опубликованных последовательностей аминокислотных остатков для белков НВс от шести вирусов млекопитающих. Первая последовательность (ЗЕО ГО Ν0: 247) представляет собой последовательность человеческого вируса, подтипа ауте, и опубликована в работе СаНЬсП е! а1. (1983) №11игс. 281:646-650; вторая последовательность (ЗЕО ГО Ν0:248) представляет собой последовательность человеческого вируса подтипа абте и опубликована в работе Опо е! а1., (1983) ШсЮс Ас1бк Рек., 11(6):1747-1757; третья последовательность (ЗЕО ГО Ν0:249) представляет собой последовательность человеческого вируса подтипа абте2 и опубликована в работе Уа1епхие1а е! а1., Ашта1 Уиик Оепебск, Е1е1б е! а1., ебк., Асабетк Ргекк, №те Уогк (1980) радек 57-70; четвертая последовательность (ЗЕО ГО Ν0:250) представляет собой последовательность человеческого вируса, подтипа абуте и опубликована в работе Ракек е! а1., (1979) №!иге, 282:575-579; пятая последовательность (ЗЕО ГО Ν0:251) представляет собой последовательность вируса лесного сурка и опубликована в работе ОаНЬей е! а1. (1982) 1.Уйо1. 41:51-65; а шестая последовательность млекопитающего (ЗЕО ГО Ν0:246) и представляет собой последовательность вируса суслика и опубликована в работе Зеедег е! а1. (1984) ЕУ1го1., 51:367-375.
На фиг. 8 представлена фотография ДСН-ПААГ-анализа, проведенного в восстанавливающих условиях после инкубирования при 37°С в дни 0, 1 и 2, где проиллюстрировано стабилизирующее действие
- 5 006207 на (1) на химерные частицы НВс149, содержащие иммуногенную последовательность (ΝΑΝΡ)4 Р. Γαϊοίραгит, встроенную между аминокислотными остатками 78 и 79 НВс, которая также содержит карбоксиконцевой универсальный Т-клеточный эпитоп Р. Га1с1ратит, связанный пептидной связью с положением 149 НВс [иТС; V12.РΓ1=V2.РΓ1 + ΡΓ/СЗ-иТС], и (2) на сходные частицы, в которых цистеин в положении 17 иТС был заменен аланиновым остатком, и был добавлен цистеиновый остаток в положении 150 между остатком НВс в положении 149 и началом иТС [У12.РГ1(С17А)+С150].
На фиг. 9 представлена фотография ДСН-ПААГ-анализа, который был проведен в восстанавливающих условиях после получения частицы, и который показал, что мономерная конструкция 1СС-1438 является нестабильной (дорожка 2) по сравнению с конструкцией 1СС-1492 (дорожка 3), при этом, НВс149 (дорожка 1), 1СС-1475 (дорожка 4) и 1СС-1473 (дорожка 5) служат в качестве дополнительного контроля молекулярной массы.
Определения
Цифры, используемые вместе с НВс-химерами, указывают на положения в последовательности аминокислотных остатков ауте НВс 8ЕЦ ГО N0: 247, где к этой последовательности добавлены один или несколько остатков, независимо от того, имеются ли в этой последовательности аминокислотных остатков добавления или делеции. Таким образом, НВс149 означает, что химера заканчивается в положении 149, а НВс149+С150 означает, что та же самая химера содержит цистеиновый остаток в положении 150 НВс. С другой стороны, универсальный Т-клеточный эпитоп малярийного белка С8 (иТС) имеет длину в 20 остатков, а эпитоп, где цистеин в положении 17 этой последовательности был заменен аланином, обозначен С8-ЦТС(С17А).
Термин антитело означает молекулу, которая является членом семейства гликозилированных белков, называемых иммуноглобулинами, и которая может специфически связываться с антигеном.
Термин антиген исторически используется для обозначения молекулы, которая связывается с антителом или рецептором, а также для обозначения молекулы, индуцирующей продуцирование антитела. В последнее время, термин антиген имеет ограниченный смысл и относится к молекуле, связывающейся с антителом или рецептором, тогда как термин иммуноген означает молекулу, которая индуцирует продуцирование антитела или связывается с рецептором. Если обсуждаемая здесь молекула является как иммуногенной, так и антигенной, то она называется либо иммуногеном, либо антигеном в зависимости от целей ее использования.
Антигенная детерминанта означает фактическую структурную часть антигена, которая иммунологически связывается со связывающим сайтом антитела или Т-клеточным рецептором. Этот термин имеет то же значение, что и эпитоп. Термины антигенная детерминанта и эпитоп, используемые здесь в несколько более широком смысле, включают дополнительные остатки, которые являются гетерологичными по отношению к последовательности НВс, но которые, фактически, не могут связываться с антителом. Так, например, предполагается, что каждая из повторяющихся последовательностей малярийного белка С8 (ΝΑΝΡ)4 и ΝΑΝΡΝνθΡ(ΝΑΝΡ)3ΝνϋΡ 8ЕЦ ΙΌ N0:1 и 21 содержит более чем один истинный эпитоп, но в соответствии с настоящим изобретением считается, что они содержат лишь один эпитоп. При этом использование обеих указанных последовательностей в одной химерной молекуле НВс рассматривают как использование множества эпитопов.
Используемый здесь термин конъюгат означает гаптен, функционально присоединенный к белкуносителю через боковую цепь аминокислотных остатков белка-носителя, таких как лизин, аспарагиновая или глутаминовая кислота, тирозин или цистеин.
Используемый здесь термин консервативная замена означает, что один аминокислотный остаток заменен другим биологически сходным остатком. Примерами консервативных замен является замена одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, другим остатком, или замена одного полярного остатка другим остатком, например замена аргинина лизином и наоборот, замена глутаминовой кислоты аспарагиновой кислотой и наоборот или глутамина аспарагином и наоборот, и т. п.
Термин соответствует в его различных грамматических формах используется по отношению к пептидным последовательностям и относится к описанной пептидной последовательности, у которой делетированы или к которой добавлены 1-3 аминокислотных остатка либо у одного, либо у обоих аминои карбоксиконцов, и которая содержит лишь консервативные замены в конкретных аминокислотных остатках на протяжении всей полипептидной последовательности.
Используемый здесь термин домен означает часть рекомбинантной химерной молекулы НВс, которая идентифицирована (1) по положению остатка, имеющего номер, соответствующий номерам положений НВсАд подтипа ауте, как описано СаКЬеП е! а1. (1979) №11игс. 281:646-650 (8ЕЦ ГО N0:246). Полипептидные части, по крайней мере, химерных доменов Ι, ΙΙ и ΙΙΙ, очевидно, существуют в третичной форме, сходной с соответствующими последовательностями природного НВсАд.
Используемый здесь термин гибридный белок означает полипептид, содержащий по крайней мере две последовательности аминокислотных остатков, которые обычно не связаны друг с другом в природном окружении и которые своими концами (голова к хвосту) функционально соединены друг с другом пептидными связями между их соответствующими карбокси- и аминоконцевыми аминокислотными
- 6 006207 остатками. Гибридные белки настоящего изобретения представляют собой НВс-химеры, которые индуцируют продуцирование антител, вступающих в иммунную реакцию с полипептидом или ассоциированным с патогеном иммуногеном, и аминокислотная последовательность которых соответствует последовательности полипептида или ассоциированной с патогеном части гибридного белка.
Термин вирус гепатита В, используемый здесь в его наиболее широком смысле, относится к любому члену семейства гепаднавирусов, обсуждаемых выше.
Термин остаток используется здесь как синоним термина аминокислотный остаток и означает реакционноспособную аминокислоту, присутствующую в пептиде или в белке.
Используемый здесь термин экспрессирующий вектор означает ДНК-последовательность, имеющую регуляторные элементы, которые контролируют экспрессию структурного кодирующего белок гена так, чтобы в результате этой экспрессии образовывался белок.
Используемый здесь термин функционально присоединенный, относящийся к нуклеиновой кислоте, означает, что данный ген ковалентно присоединен в правильной рамке считывания к другому ДНК-сегменту (или РНК-сегменту, если это необходимо), такому как экспрессирующий вектор, так, чтобы этот структурный ген находился под контролем указанного экспрессирующего вектора. Термин функционально присоединенный, относящийся к белку, полипептиду или к химере, означает, что указанные элементы ковалентно связаны друг с другом.
Используемый здесь термин промотор означает сайт распознавания на ДНК-последовательности или на группе ДНК-последовательностей, который представляет собой элемент, регулирующий экспрессию гена и с которым специфически связывается РНК-полимераза, инициирующая синтез РНК (транскрипцию) этого гена.
Используемый здесь термин рекомбинантная молекула ДНК означает гибридную ДНКпоследовательность, содержащую по крайней мере две нуклеотидных последовательности, которые в природных условиях вместе не встречаются.
Используемый здесь термин вектор означает молекулу ДНК, которая способна реплицироваться в клетке и/или к которой может быть функционально присоединен другой ДНК-сегмент, что приводит к репликации этого присоединенного сегмента. Примером такого вектора является плазмида.
Все идентифицированные здесь аминокислотные остатки имеют природную I,-конфигурацию. Для сохранения стандартной номенклатуры полипептида, 1.Вю1.Сйет., 243:3557-59 (1969), для аминокислотных остатков были использованы общепринятые аббревиатуры, которые представлены в нижеследующей таблице соответствий.
Таблица соответствий
Символ
Однобуквенное обозначение Трехбуквенное обозначение Аминокислота
Υ Туг Ь-тирозин
С С1у Глицин
Г РНе Ь-фенилаланин
М Меб Ь-метионин
А А1а Ь-аланин
3 Зег Ь-серин
I Не Ь-изолейцин
ь Ьеи Ь-лейцин
т ТНг Ь-треонин
V Уа1 Ь-валин
Р Рго Ь-пролин
к Ьуз Ь-лизин
н ΗΪ3 Ь-гистидин
0 С1п Ь-глутамин
Е 01и Ь-глутаминовая кислота
И Тгр Ь-триптофан
В Агд Ь-аргинин
ц Азр Ь-аспарагиновая кислота
N Азп Ь-аспарагин
С Суз Ь-цистеин
- 7 006207
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к химерному нуклеокапсидному белку гепаднавируса; т.е. к рекомбинантному коровому белку вируса гепатита В (НВс), который сконструирован так, что (а) он представляет иммуногенный эпитоп В-клеток или Т-клеток, линкер для связывания с иммуногенным эпитопом В-клеток или Т-клеток или усеченный белок НВс, (Ъ) обладает повышенной стабильностью, если он присутствует в самособранной частице, а также (с) в основном, не обладает способностью связываться с нуклеиновой кислотой как самособирающаяся частица. Рассматриваемая НВс-химера является усеченной по С-концу молекулой по сравнению с нативной молекулой НВс.
Таким образом, указанный химерный белок представляет один или несколько иммуногенных эпитопов в Ν-конце в иммуногенной петле или в С-конце НВс, или линкер для такого эпитопа в иммуногенной петле. Указанный химерный белок содержит цистеиновый остаток у С-конца или вблизи С-конца, который сообщает повышенную стабильность самособирающимся частицам. Этот химерный белок, в основном, не содержит аргининовых остатков правее (по направлению к карбокси-концу) остатка НВс в положении 149, а поэтому эти самособирающиеся частицы, в основном, не связываются с нуклеиновой кислотой.
Для простоты обсуждения, рассматриваемые химерные последовательности и номера положений в этих последовательностях основаны на последовательности и нумерации положений корового человеческого белка вируса гепатита В подтипа ау\т [байЪей с1 а1. (1979) №-1Шгс. 281:646-650]. Однако если принять во внимание большое сходство между последовательностями капсидных белков гепаднавирусов млекопитающих и образование этими белками аналогичных частиц, как это хорошо известно специалистам, то обсуждение, относящееся к подтипу ау\т НВс человека, также применимо к подтипу ай\\\ а также к белкам лесного сурка и земляной белки. Принимая во внимание близкое сходство последовательностей НВс, то в настоящем описании они обычно обозначаются последовательностями НВс, если это не оговорено особо.
В одном из вариантов своего осуществления, рассматриваемая НВс-химера длиной примерно до 515 аминокислотных остатков (a) содержит (ί) последовательность, имеющую, по крайней мере, примерно 130 из 150 Ν-концевых аминокислотных остатков молекулы НВс, включая ковалентно связанный гетерологичный эпитоп или гетерологичный линкерный остаток для конъюгированного эпитопа, присутствующий в связанной пептидной связью иммунодоминантной петле НВс или (ίί) последовательность, имеющую, по крайней мере, примерно 135 остатков из 150 Ν-концевых НВс аминокислотных остатков, (b) содержит от одного до десяти, а более предпочтительно от одного до трех цистеиновых остатков, расположенных в направлении к С-концу данной молекулы от С-концевого остатка присутствующей последовательности НВс и в пределах примерно 30 остатков от С-конца химерной молекулы [Сконцевого цистеинового остатка(ков)], и (c) содержит последовательность по крайней мере из пяти аминокислотных остатков от положения 135 последовательности НВС до С-конца НВс. Предпочтительно пять из этих шести остатков из положений 136-140 последовательности НВс, а шестым остатком является требуемый цистеин.
При экспрессии химерных молекул белка в клетке-хозяине рассматриваемая химера способна к самосборке в частицы, которые, в основном, не связываются с нуклеиновыми кислотами и являются более стабильными, чем (1) частицы, образованные из какой-либо другой идентичной НВс-химеры, которая не содержит вышеуказанных 1-10 цистеиновых остатков [С-концевого цистеинового остатка(ов], или (2) частицы, в которых С-концевой цистеиновый остаток присутствует в данной химере и заменен в этой молекуле другим остатком, таким как аланиновый остаток.
В одном из аспектов настоящего изобретения предпочтительная НВс-химера имеет последовательность из примерно от 135 до 515 Ь-а-аминокислотных остатков и содержит четыре последовательно расположенных связанных пептидной связью доменов, которые обозначены доменами I, II, III и IV. Эти четыре домена связаны вместе так же, как и нативные белки, в отличие от полипептидов, которые содержат остатки, не являющиеся остатками α-аминокислот, а поэтому они не могут образовывать пептидные связи тех полипептидов, которые содержат Ό-аминокислотные остатки, или олигопептидных конъюгатов, в которых два или несколько полипептидов функционально связаны через боковую цепь аминокислотных остатков. Следовательно, рассматриваемый химерный белок НВс может быть получен путем экспрессии с использованием стандартной рекомбинантной технологии.
Начиная с аминоконца, домен I содержит примерно от 71 до 100 аминокислотных остатков, последовательность которых включает, по крайней мере, последовательность остатков примерно от положения 5 до положения 75 НВс. Предпочтительно, чтобы последовательность остатков 1-75 последовательности НВс присутствовала как часть домена I. Наиболее предпочтительно, чтобы домен I состоял только из последовательности НВс в положениях 1-75.
Домен II содержит от 5 до примерно 250 аминокислотных остатков, связанных пептидной связью с остатком 75 НВс домена I, в котором (ί) от нуля до всех остатков, а предпочтительно по крайней мере 4 остатка, а более предпочтительно по крайней мере 8 остатков в положениях 76-85 последовательности
- 8 006207
НВс связаны пептидной связью примерно с 1-245 аминокислотными остатками, которые являются гетерологичными (чужеродными) по отношению к НВс и составляют гетерологичный линкерный остаток для эпитопа, такого как В-клеточный эпитоп, или гетерологичный эпитоп, такой как сам В-клеточный эпитоп, или (ίί) последовательность НВс в положениях 76-85 не имеет гетерологичных остатков.
Особенно предпочтительно, чтобы присутствовала последовательность из 10 остатков в положениях 76-85 (последовательность 76-85), но чтобы она прерывалась примерно 1-245 остатками гетерологичного линкера или гетерологичного эпитопа. В других случаях особенно предпочтительно, чтобы присутствовала только последовательность из 10 остатков и чтобы она не прерывалась каким-либо гетерологичным остатком.
Химера, содержащая только остатки НВс в этом домене, вместе с обсуждаемыми ниже признаками, может быть использована для индуцирования В- и/или Т-клеточного ответа на сам НВс. Предпочтительная НВс-химерная молекула с непрерываемой последовательностью 76-85 содержит непрерываемую аминокислотную последовательность НВс от положения 1 до положения по крайней мере 140, а более предпочтительно непрерываемую аминокислотную последовательность НВс от положения 1 до положения 149, плюс один цистеиновый остаток у карбоксиконца, как обсуждается ниже.
Домен III представляет собой последовательность НВс от положения 86 до положения 135, связанную пептидной связью с остатком 85.
Домен IV содержит (ί) от нуля до четырнадцати остатков аминокислотной последовательности НВс от положения 136 до положения 149, связанной пептидной связью с остатком в положении 135 домена III, (ίί) от одного до десяти цистеиновых остатков [С-концевого цистеинового остатка(ов)] и (ίίί) от нуля до примерно 100 аминокислотных остатков в последовательности, гетерологичной по отношению к НВс, от положения 150 до С-конца, которая обычно состоит из одного Т-клеточного эпитопа или множества Т-клеточных эпитопов, при условии, что указанный домен IV содержит по крайней мере 6 аминокислотных остатков, от остатка в положении 135 до С-конца указанной химеры, включая вышеуказанные 1-10 цистеиновых остатков (ίί). Предпочтительно, чтобы домен IV содержал последовательность от 0 до примерно 50 аминокислотных остатков в последовательности, гетерологичной по отношению к НВс, а более предпочтительно, чтобы эта последовательность содержала от нуля до примерно 25 остатков.
Таким образом, в одном из аспектов настоящего изобретения, рассматриваемая химерная молекула может не содержать эпитопов или остатков, гетерологичных по отношению к НВс, за исключением Сконцевого цистеина. В другом аспекте настоящего изобретения, рассматриваемая химерная молекула содержит гетерологичный эпитоп у Ν-конца, связанный пептидной связью с одним из остатков 1-5 НВс. В другом аспекте настоящего изобретения, рассматриваемая химерная молекула содержит гетерологичный эпитоп или гетерологичный линкерный остаток для эпитопа, присоединенный пептидной связью почти в середине молекулы, локализованной между остатками НВс 76 и 85 в иммунодоминантной петле. В еще одном аспекте изобретения, гетерологичный эпитоп локализован в С-концевой части химерной молекулы, связанной пептидной связью с одним из остатков 136-149 НВс. В других аспектах изобретения, два или три гетерологичных эпитопа присутствуют в вышеуказанной локализации либо один или два гетерологичных эпитопа присутствуют вместе с гетерологичным линкерным остатком для эпитопа. Каждая из этих химерных молекул также содержит С-концевой цистеиновый остаток(и), как обсуждается ниже. Конкретные примеры нескольких таких химерных молекул и их самособирающихся частиц обсуждаются ниже.
Как уже было отмечено, рассматриваемая химерная молекула НВс может содержать примерно от 135 до 515 аминокислотных остатков. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, остатки 1-5 НВс расположены так, что домен I начинается у остатка 1 НВс и простирается до остатка 75 включительно, т.е. этот остаток НВс находится в положении 75. Гетерологичный эпитоп, присутствующий в домене II в иммунодоминантной петле, предпочтительно содержит примерно от 15 до 50 остатков, хотя короткий эпитоп из примерно 6 аминокислотных остатков может индуцировать антитела и Тклеточные рецепторы и распознаваться ими. Домен III содержит остатки 86-135 НВс, связанные пептидной связью с остатком 85. Домен IV содержит последовательность по крайней мере из шести остатков, которые включают (ί) ноль, один или последовательность остатков НВс от положения 136 до 149 НВс, связанную пептидной связью с остатком 135 (ίί) по крайней мере один цистеиновый остаток и (ίίί) может, но необязательно, содержать гетерологичную последовательность эпитопа примерно до 100 остатков, особенно в том случае, когда последовательность НВс заканчивается у остатка 135, хотя более предпочтительной является более короткая последовательность примерно до 25 остатков.
В одном из вариантов осуществления изобретения, наиболее предпочтительной является химера, содержащая два гетерологичных эпитопа. Эти два гетерологичных эпитопа присутствуют в доменах I и
II, или II и IV, или I и IV. В некоторых вариантах осуществления изобретения одним из двух гетерологичных эпитопов предпочтительно является В-клеточный эпитоп. В других вариантах осуществления изобретения, одним из двух гетерологичных эпитопов является Т-клеточный эпитоп. Более предпочтительно одним из двух гетерологичных эпитопов является В-клеточный эпитоп, а другим является Тклеточный эпитоп. Кроме того, в месте локализации В-клеточного эпитопа может присутствовать мно- 9 006207 жество В-клеточных эпитопов, а в месте локализации Т-клеточного эпитопа может присутствовать множество Т-клеточных эпитопов.
В тех вариантах осуществления изобретения, в которых химерная молекула содержит гетерологичный эпитоп в домене II, предпочтительно, чтобы этот эпитоп представлял собой один или несколько Вклеточных эпитопов, а также, чтобы между аминокислотными остатками 76 и 85 присутствовала последовательность НВс, но, чтобы она прерывалась указанным гетерологичным эпитопом(ами) и чтобы данная химера, кроме того, включала один или несколько Т-клеточных эпитопов в домене IV, связанном пептидной связью с одним из остатков 140-149 НВс.
Те же самые предпочтительные особенности относятся к тем химерным молекулам, в которых гетерологичный линкерный остаток для конъюгированного эпитопа присутствует в домене II, обеспечивая тем самым, присутствие одного или нескольких гетерологичных эпитопов в домене II, в остатках 76 и 85, но при этом прерываемых этим гетерологичным линкерным остатком, причем Т-клеточный эпитоп связан пептидной связью с одним из остатков 140-149 НВс. Частицы, образованные из таких химерных молекул, обычно содержат конъюгированный эпитоп - С-концевой пептид, связанный пептидной связью с Т-клеточным эпитопом в отношении примерно 1:4 - 1:1, а обычно это отношение составляет 1:2.
В проиллюстрированной структуре вышеописанной химерной молекулы, гетерологичный линкерный остаток для конъюгированного эпитопа присутствует в домене II, а Т-клеточный эпитоп присутствует в домене IV, при этом в домене II отсутствует какой-либо дополнительный В-клеточный эпитоп. Такая химера обладает иммуногенностью Т-клеточного эпитопа и обладает минимальной, если вообще обладает, НВс-антигенностью, как было измерено путем связывания с моноклональными антителами против петли в анализе ЕЫ8А, обсуждаемом ниже.
Предпочтительная рассматриваемая химерная молекула НВс содержит последовательность примерно от 140 до 515 остатков. Предпочтительная химерная молекула НВс, содержащая два гетерологичных эпитопа, каждый из которых имеет длину, предпочтительно от примерно 15 до примерно 50 остатков, и предпочтительную НВс-часть, имеющую длину примерно от 140 до 149 остатков, имеет последовательность длиной примерно от 175 до 240 аминокислотных остатков. Особенно предпочтительные химерные молекулы, содержащие два гетерологичных эпитопа, имеют длину примерно от 190 до 210 остатков. Следует отметить, что рассматриваемый широкий диапазон длин химерных молекул обусловлен различными длинами Ν- и С-концевых НВс-частей и различными длинами нескольких рассматриваемых эпитопов, которые могут быть встроены в иммуногенную петлю.
Рассматриваемый рекомбинантный белок после его экспрессии в клетке-хозяине, способен к самосборке в частицы, которые, в основном, не связываются с нуклеиновыми кислотами. Эти рассматриваемые НВс-химерные частицы обычно имеют сферическую форму и обычно являются гомогенными по размеру для данного препарата. Таким образом, эти химерные частицы сходны с нативными частицами НВс, которые имеют аналогичную форму и размер, и могут быть выделены у инфицированных индивидуумов.
Рассматриваемая химерная частица включает обсуждаемые ранее химерные молекулы. В более широком смысле такая химерная частица включает усеченный по С-концу химерный белок НВс, который имеет последовательность, содержащую по крайней мере примерно 130 из 150 Ν-концевых остатков, и содержит (ί) гетерологичный эпитоп или гетерологичный линкерный остаток для эпитопа в иммунодоминантной петле или по крайней мере примерно 130 из 150 Ν-концевых остатков и непрерываемую иммунодоминантную петлю, и (ίί) от одного до трех С-концевых цистеиновых остатков, описанных ранее, и, по крайней мере, последовательность НВс из 5 остатков, начиная с положения 135. Такая частица, в основном, не содержит аргининовых остатков, благодаря чему указанные самособирающиеся частицы, в основном, не связываются с нуклеиновой кислотой и имеют отношение оптической плотности при 280/260, составляющее примерно от 1,2 до 1,7, как обсуждается ниже. Таким образом, рассматриваемый химерный белок может не содержать последовательность НВс в положениях от 150 до 183. Рассматриваемая частица является более стабильной, чем частица, образованная из другого идентичного химерного белка НВс, в котором отсутствует вышеуказанный С-концевой цистеиновый остаток(ки). Аналогичным образом, частица, химерная молекула которой содержит единственный С-концевой цистеиновый остаток, является более стабильной, чем частица, в которой цистеин заменен другим остатком, таким как аланиновый остаток. В некоторых случаях частицы не образуются, если не присутствует С-концевой цистеин. Примеры последовательностей обоих типов с повышенной стабильностью проиллюстрированы в представленных ниже примерах, а более конкретно в примерах, относящихся к фиг. 3, 4 и 8.
В основном, отсутствие связывания с нуклеиновой кислотой может быть легко определено путем сравнения оптической плотности частиц в водном растворе, измеренной при 280 и 260 нм, т.е. отношения оптической плотности 280/260. Рассматриваемые частицы, в основном, не связываются с нуклеиновыми кислотами, которые представляют собой олигомерные и/или полимерные ДНК- и РНК-молекулы. присутствующие в природных клетках организма, используемого для экспрессии белка. Такие нуклеиновые кислоты имеют определенную оптическую плотность при 260 нм и относительно меньшую оптическую плотность при 280 нм, тогда как белок, такой как рассматриваемая химера, имеет относительно низкую оптическую плотность при 260 нм и более высокую оптическую плотность при 280 нм.
- 10 006207
Таким образом, рекомбинантно экспрессируемые частицы НВс или химерные частицы НВс, которые содержат богатую аргинином последовательность в положениях остатков 150-183 (или 150-185), иногда называемую в литературе протаминовой областью, имеют отношение оптической плотности при 280 нм к оптической плотности при 260 нм (отношение оптических плотностей 280/260), составляющее примерно 0,8, тогда как частицы, в основном, не содержащие аргининовых остатков, благодаря чему эти самособирающиеся частицы, в основном, не связываются с нуклеиновой кислотой, например, частицы, которые не содержат богатой аргинином области связывания природной НВс с нуклеиновой кислотой, такие как частицы, которые содержат менее чем три смежных аргининовых или лизиновых остатков или их смесей, или частицы, содержащие нативную или химерную последовательность, которая заканчивается примерно в положениях 140-149 остатков НВс, имеют отношение оптических плотностей при 280/260, составляющее примерно от 1,2 до 1,6.
Химерные частицы НВс настоящего изобретения, в основном, не связываются с нуклеиновой кислотой и имеют отношение оптических плотностей при 280/260, составляющее примерно от 1,2 до 1,6 а обычно, примерно от 1,4 до 1,6. Этот диапазон в значительной степени обусловлен числом ароматических аминокислотных остатков, присутствующих в доменах II и IV данной химерной частицы НВс. Этот диапазон также, частично, обусловлен присутствием Сук в домене IV рассматриваемой химеры, что может снижать наблюдаемое отношение примерно на 0,1 по пока не выясненным причинам.
Рассматриваемые химерные частицы НВс являются более стабильными в водным буфере при 37°С в течение периода времени примерно от двух недель до одного месяца, чем частицы, образованные из НВс-химеры, содержащей те же самые связанные пептидной связью последовательности доменов I, II и III и другую аналогичную последовательность домена IV, в которой отсутствует от одного до десяти цистеиновых остатков [С-концевых цистеиновых остатков], либо присутствующий единственный Сконцевой остаток заменен другим остатком, таким как аланиновый остаток. Стабильность различных химерных частиц определяют, как обсуждается ниже.
Так, например, частицы, содержащие гетерологичный малярийный эпитоп в домене II [например, (ΝΑΝΡ)4] и один цистеиновый остаток, расположенный со стороны С-конца по отношению к валиновому остатку 149, являются более стабильными, чем какие-либо другие идентичные частицы, собранные из химерных молекул, у которых С-концевым остатком является валин в положении 149. Аналогичным образом, частицы, содержащие вышеуказанный малярийный В-клеточный эпитоп в домене II и универсальный малярийный Т-клеточный эпитоп, который содержит один цистеин возле С-конца, являются более стабильными, чем какие-либо другие идентичные частицы, в которых цистеин заменен аланиновым остатком. См. фиг. 3, 4 и 8 и обсуждение, приведенное выше.
Рассматриваемую частицу, содержащую С-концевой цистеиновый остаток, также получают, в основном, с более высоким выходом, чем частицу, собранную из химерной молекулы, в которой отсутствует С-концевой цистеин. Такое увеличение выхода можно видеть, исходя из массы полученных частиц или исходя из анализа, осуществляемого методом гель-фильтрации с использованием 8ирегоке® 6 НЯ, как обсуждается ниже и в табл. 17.
Домен I рассматриваемого химерного НВс-белка состоит из последовательности аминокислотных остатков НВс, начинающихся с аминокислотного остатка, по крайней мере, в положении 5, и заканчивающихся в положении 75, а домен III состоит из последовательности НВс, простирающейся от положения 86 до положения 137. Для любого из доменов I и III могут быть использованы последовательности любого гепаднавируса млекопитающего, и в одной химере могут быть использованы последовательности двух или более вирусов. Предпочтительно и для облегчения конструкции, во всех химерах используется человеческая последовательность ауте.
Сообщалось, что при экспрессии в клетках Е.сой НВс химер, имеющих домен I, который содержит большую делецию, чем делеция первых трех амино-концевых (Ν-концевых) остатков, наблюдается полное исчезновение химерного белка НВс, Ритреик е1 а1., (1995) [п1ег^'1го1оду. 38:63-74. С другой стороны, в недавних исследованиях, в которых иммуногенный 23-мерный полипептид белка вируса гриппа М2 был слит с Ν-концевой последовательностью НВс, сообщалось, что полученный гибридный белок образовывал частицы в случае замены остатков 1-4 нативной последовательности НВс, №иупск е1 а1. (Ос1оЬег 1999) №1Шге Меб., 5(10):1157-1163. Таким образом, из вышесказанного следует, что частицы могут образовываться в том случае, когда добавленная аминокислотная последовательность связана пептидной связью с одним из остатков 1-4 НВс, но эти частицы не образуются, когда отсутствует дополнительная последовательность и более чем 1-3 остатка делетированы у Ν-конца НВс.
Ν-концевая последовательность, связанная пептидной связью с одним из первых пяти Ν-концевых остатков НВс, может содержать последовательность примерно до 25 остатков, которые являются гетерологичными по отношению к НВс. Примерами таких последовательностей являются В-клеточный или Тклеточный эпитопы, которые обсуждаются ниже, 23-мерный полипептид белка вируса гриппа М2 №пупск е1 а1., см. выше, последовательность другого (гетерологичного) белка, такого как βгалактозидаза, которые могут присутствовать в гибридных белках в результате использования соответствующей экспрессионной системы, или другая последовательность, родственная последовательности ви- 11 006207 руса гепатита В, такая как последовательность, происходящая от областей Рге-81 или Рге-82, или главная иммуногенная последовательность НВзЛд.
Домен II содержит от 5 до примерно 250 аминокислотных остатков. Из этих остатков ноль остатков (отсутствие остатков), предпочтительно по крайней мере 4 остатка, более предпочтительно по крайней мере 8 остатков, составляют части последовательности НВс в положениях 76-85, а последовательность от 1 до примерно 245 остатков, а предпочтительно от 1 до примерно 50 остатков являются гетерологичными (чужеродными) по отношению к НВс. Эти гетерологичные остатки составляют (1) гетерологичный линкерный остаток для эпитопа, такого как В-клеточный или Т-клеточный эпитоп, или (и) гетерологичный В- или Т-клеточный эпитопы, которые, предпочтительно, содержат от 6 до примерно 50, более предпочтительно примерно от 15 до 50, а наиболее предпочтительно примерно от 20 до 30 аминокислотных остатков, и которые расположены так, что они связаны пептидной связью между 0, или более предпочтительно по крайней мере 4 остатка или примерно со всеми остатками от положения 76 до положения 85 последовательности НВс. Гетерологичные В-клеточные эпитопы предпочтительно связаны в этом положении линкерным остатком или связаны пептидной связью с последовательностью НВс, и пример такого использования В-клеточного эпитопа обсуждается ниже.
Все эти предпочтительные, по крайней мере, 4 остатка НВс могут находиться в одной последовательности, в положениях остатков 82-85, либо они могут разделены и находиться на обеих сторонах (фланкировать) гетерологичного(ый) остатка(ок), например, как остатки, присутствующие в положениях 76-77 и 84-85, или остатки, присутствующие в положениях 76 и 83-85. Более предпочтительно, если домен II содержит по крайней мере 8 остатков последовательности НВс от остатка 76 до остатка 85. Более предпочтительно, чтобы в данной химере присутствовала последовательность из всех 10 остатков в положениях 76-85.
Последовательность от одного до примерно 245 остатков, добавленных к последовательности петли НВс, является гетерологичной по отношению к последовательности НВс. Одним из таких добавленных гетерологичных остатков является гетерологичный линкерный остаток для В-клеточного эпитопа, обсуждаемый выше. Более длинные последовательности, обычно по крайней мере от 6 аминокислотных остатков и примерно до 50 аминокислотных остатков, а более предпочтительно, примерно от 15 и примерно до 50 остатков, как указывалось выше, находятся в последовательности, которая включает гетерологичный иммуноген, такой как В-клеточный эпитоп, за исключением гетерологичных остатков, кодируемых рестрикционными сайтами.
Примеры пептидных иммуногенов, используемых как для связывания с линкерным остатком после экспрессии рассматриваемой химеры, так и для экспрессии внутри НВс-химеры, представлены ниже в таблице А, при этом рядом с общепризнанным названием гена приводится последовательность, которая получена из этого гена, в этой таблице также приводится ссылка на литературу или патенты, где указаны известные эпитопы и ВЕС) II) N0.
Таблица А В-клеточные эпитопы
Микроорганизм Ген Последовательность Ссылка* ВЕСОМО
ЗегерСососсиз рпеитопзае РзрА ΚΙιΕΕΙ,δΟΚΙΟΕΙιΟΑΕ ΟΚΚΪϋΕΟΟΚΚΤΕΕКААЬЕКААЗЕЕМ- 1 3
ПКАУААУООА 1 4
С гурсозрогаάί шп
рагушп Р23 ΟΟΚΡΑϋΑΡΑΑΕΑΡΑАЕРАА0<2ЭКРАОА 2 5
ВИЧ СР120 ΚΚΕΙΗΙΟΡΟΡΑΡΥΙΤΚΝ 3 6
Вирус ящура νρι ΥΝΟΕΟΚΥΝΚΝΑУРИЬРСЮЬОУЬАОКТАКТЬР 4 7
Вирус гриппа А8/РК8 НА УЙЫЬЬНЬТЕК 8 8
А8/РР8/34 М2 5ЬЬТЕУЕТР1КЫЕИаСКСЫ(355О ЗЫ/ГЕУЕТР1К- 29 9
ИЕиаскс1Л)ззо 29 10
ЗЬЬТЕУЕТР1КЫЕМСАЯАЫЛЗЗО 312
ΕΟΟΞΑνΟΑΠΟΒНГУ31ЕЬЕ 35 313
- 12 006207
Уегздпла
ρββϋϊβ V Ад В1БКУ1ТОЗГ ΝΗΗ(ЗОАЯЗКЬЙЕЕБАЕБТАЕЬК1УЗУЮАΕΙΝΚΗΙι8530ΤΙΝΙΗΟΕΒΙΝΙΜΙΚΝΙ,Υ0ΥΤ0ΕΕΙΕΚΑ3ΑΕΥΚΙΙιΕΚΜΡΟΤΤΙ0νθΟ3ΕΚΚΐν3ΙΚОРБЗЗЕЫКЙТСАЬαΝΜΟί5Υ3ΥΝΚΟΝЫЕБЗНГАТТСЗО 9 11
НаеторкНиз 1п£1иепга рВОМР СЗЗЗШГОААαΝ<3ΑΑ<2ΕΌ<3Υ 10 12
ΝΚΕΟΤνδΥΟΕΕ 13
ΝΟΕΆΑΥ3ΚΝККАУБАУ 14
МогахеИа саеаггйаНз сорВ ББ1ЕКВККК- ЮТЕ0Б0АЕΙίΟϋΚΥΑΟΚαΥ 11 15
ΕΒΙΕΚΝΚΚΚКТЕАЕБОАЕбеюкуасксу 16
ΐϋΐΕκκακιКТЕАЕББАЕШКОУРЗСХЗУ 17
РогрЬуготоп а з дхпдзлгаИз НА ονερκναωντνЕаЗЫЕЕАРУОЫЬТ 12 18
ΚΙΟΒΤΗΒΟΚΤνОБРАСТКУУ 19
Тгурапозота сгиз! ΚΑΑΙΑΡΑΚΑΑΑАРАКААТАРА 14 20
Р1азтосИит £а!с£рагит СЗ (ΝΑΝΡ)4 24 1
ΝΑΝΡΝνϋΡ- (ΝΑΝΡ)3ΝνϋΡ 21
ΝΑΝΡΝνϋΡ(ΝΑΝΡ)3 22
(ΝΑΝΡ) 3ΝνϋΡΝΑΝΡ 23
ΝΑΝΡΝνοΡ- (ΝΑΝΡ) 3ΝνϋΡΝΑΝΡ 24
ΝΡΝνθΡ(ΝΑΝΡ)3Νν 25
ΝΡΝνΟΡ- (ΝΑΝΡ)3Ννϋ₽ 26
- 13 006207
ΝΡΝνϋΡ(ΝΑΝΡ)3ΝνϋΡΝΑ ΝνθΡ(ΝΑΝΡ)3ЫУ ΝνϋΡ (ΝΑΝΡ)3ΝνθΡ Ννθ₽(ΝΑΝΡ)3_ ΝνϋΡΝΑ ϋΡ(ΝΑΝΡ)3Νν ϋΡ (ΝΑΝΡ) 3№ЛЭР ϋΡ(ΝΑΝΡ)3ЫТОРИА 27 28 29 30 31 32 33
СЗ αϋΡΑοααΡΑαϋΚΑΟΟΟΡΑΟ 20 34
РАГЮНААООРАСОО0РАС ΑΝΟΑ3Ν0ΡΟ- 35
ΑΝΟΑΟΡΟΡΟ ΑΝΟΑϋΝΟΡΘ- 36
' ΑΝΟΑϋΙΚ2Ρ(3 ΑΝΟΑΟΝΟΡΟ- 27 37
ΑΝΟΑΟΝΟΡΟ ΑΝΟΑΟΝΟΡΟ- 38
ΑΝαΑΟϋΟΡΟ ΑΡΟΑΝΟΕΟαΑΑ- 39
ΑΡΟΑΝ<3Ε(3ΟΑΑ ΑΝ<3Α(3Ν<2Ρ(3ΑΝСАСООРОАЫСАΕΝΟΡΟΑΝΟΑΟϋ- 28 40
ΟΡΟ 199
ЬегдЫ С8 ϋΡΡΡΡΝΡΝϋΡΡΡΡΝΡΝ 2 41
уое1И СЗ (ООРСАР)4
ЗЫерЬососсиз зоЬтхпиз Ад1/И
ΚΡΕΡΙΥΕΑ-
ΚΙΑ0Ν0Κ ΑΚΑΟΥΕΑΚΙΛΟΥΕΙΟΛ 16 43 44
ЗЫде11а
ИехпегЗ Инвазин
ЮЖТЫЕ0К 18 45
Респираторно-синцитиальный
вирус (Ρ5ν) С ΟΒΙΟδΝΝΡΤСНА1СК 19 46
ЕпСатоеЬа ЫзСо1уС1са Лектин УЕСАЗТУСОМОЫ-
ЗсЫ з еозота 5СР11АХ>УЕКС^ 21 47
- 14 006207 уаропасшп рага
ЗсЫзСозота тапзоп!
ОЬ03Е13ЬЗЬЕЦСЕЫЙЕАКЗАЕЗГАЗЕЬОКВУЛ рага пьозе18ьзьеИЗЕЫККАКААЕЗЪАЗОЬОКНУО
Бычий ингибин ас-субъединица
ЕТРРЪРНРИЗРААЫИЛОНРРЕЕРАА
Вирус Эбола „ мембрано-ассоциированный гликопротеин
ЕзсЬегхсЫа соИ
5Т
252
Болезнь Альцгеймера β-амилоид
АТОУЕОННЕК-
ТОМЭЗТА ΗΝΤΡνΥΚΏϋ- 31 253
ХЗЕАТОУЕ СШЗЫТЫТ1- 31 254
АСУАУЫ 31 255
ССЕЪССУРАСАССЦ МТГУССЕЬСС- 33 288
УРАСАССЫ ЗЗЫУССЕЪСС- 33 289
УРАСАССЦ 33 290
ОАЕРННОЗаУЕУННОКЬУРРАЕονοΒΝκαΑίιαΐΜνοαννίΑ 34 293
ЦАЕРКНЛЗбУЕУННОКЬ 188
ЕОУОЗЖСАИ 294
ОАЕРКНЦЗОУЕ- УННОКЬУГРАЕ- 0ν(35ΝΚ(3ΑϊΙ0 295
* Ссылки на известные эпитопы приведены ниже в Таблице В.
Остальные остатки домена II, которые присутствуют с любой стороны от гетерологичного остатка или последовательности, представляют собой остатки НВс в положении 76-85. Таким образом, в типичном примере, когда остатки 78-82 были заменены, то химерная последовательность в домене II представляет собой последовательность остатков 76-77, за которым следуют остатки, кодируемые рестрикционным сайтом, гетерологичная иммуногенная последовательность (эпитопа), затем остатки, кодируемые рестрикционным сайтом, а затем последовательность НВс 84-85.
Типичным примером последовательности химеры, полученной с помощью стратегии инсерции между остатками 78 и 79, является последовательность НВс остатков 1-78, за которой следуют остатки, кодируемые рестрикционным сайтом, гетерологичная иммуногенная последовательность, затем остатки, кодируемые рестрикционным сайтом, а затем последовательность НВс 79-85. Последовательности других рассматриваемых химер в доменах I и II должны быть очевидными из этих приведенных примеров, и из примеров, представленных ниже, и не нуждаются в перечислении.
Как уже указывалось выше, гетерологичный линкер для конъюгированного эпитопа связан пептидной связью в положении последовательности НВс между аминокислотными остатками 76 и 85. Как и в случае гетерологичного эпитопа предпочтительно присутствует последовательность НВс из остатков 7685, но эта последовательность прерывается гетерологичным линкером для конъюгированного эпитопа. Эта химера предпочтительно включает последовательность НВс, начиная с положения 1 и, по крайней мере, до положения 140, плюс цистеиновый остаток у С-конца химерного белка. Более предпочтительно, если последовательность НВс простирается от положения 1 до положения 149, но в остатках 76-85 прерывается гетерологичным линкером для конъюгированного эпитопа, и химерная молекула содержит Сконцевой цистеин. Наиболее предпочтительно, если гетерологичный линкер для конъюгированного эпитопа представляет собой лизиновый (К) остаток. В качестве линкерных остатков могут быть также использованы остатки глутаминовой или аспарагиновой кислоты, тирозина и цистеина, а также могут быть использованы тирозиновый и цистеиновый остатки. При этом, следует отметить, что может присутство
- 15 006207 вать более чем один линкер, такой как последовательность из трех лизинов, но этот вариант не является предпочтительным, поскольку в результате такого использования могут образовываться гетерогенные конъюгаты, в которых конъюгированный гаптен связан с одним линкером в первой химерной молекуле, и с другим линкером во второй химерной молекуле. В опубликованной заявке РСТ/υδ 99/03055 описаны химерные молекулы НВс, которые содержат один или несколько линкерных остатков, но в которых отсутствует стабилизирующий С-концевой цистеиновый остаток.
Также следует отметить, что гетерологичная последовательность эпитопа, присутствующая в рассматриваемой НВс-химере, может быть также отделена от остатков последовательности НВс гибким линкерным плечом на одной или обеих сторонах (фланкирующих) гетерологичной иммуногенной последовательности (эпитопа). Это, в частности, происходит в случае, когда указанная гетерологичная иммуногенная последовательность имеет длину более чем 30 аминокислотных остатков. Характерные последовательности гибкого линкерного плеча обычно содержат примерно от 4 до 10 глициновых остатков, которые, как считается, позволяют этой встроенной последовательности значительно выступать за пределы другой выступающей последовательности петли и наделять эту конструкцию дополнительной стабильностью. Характерные последовательности гибкого линкерного плеча описаны в работе 1<га1х е! а1., (Магсй 1999) Ργοο №И. Αсаά. 8сЕ, υδΑ., 96:1915-1920 и представлены последовательностями аминокислотных остатков:
666686666Т 8ЕО ΙΌ N0:256 666686666 8ЕО ΙΌ N0:257.
Как уже отмечалось ранее, домен III состоит из последовательности НВс, простирающейся от положения 86 до положения 135. Следовательно, последовательность типичных химер, обсуждаемых выше для доменов I и II, можно удлинить так, чтобы первая обсуждаемая химера имела последовательность НВс от положения 84 до положения 135, а вторая обсуждаемая химера имела последовательность НВс от положения 79 до положения 135.
Домен IV представляет собой последовательность, которая (1) необязательно включает последовательность НВс от положения 135 до положения 149, (и) содержит по крайней мере от одного до трех цистеиновых остатков и (ίίί) содержит примерно до 100 аминокислотных остатков в последовательности, гетерологичной по отношению к НВс, начиная от положения 150 и до С-конца, при условии, что домен IV содержит по крайней мере 6 аминокислотных остатков, включая вышеуказанные 1-10 цистеиновых остатков (ίί). Более предпочтительно, чтобы последовательность домена IV, гетерологичная по отношению к НВс, содержала последовательность примерно до 50 аминокислотных остатков, а наиболее предпочтительно, примерно до 25 остатков. Таким образом, последовательность домена IV может представлять собой, по существу, любую цистеинсодержащую последовательность, за исключением С-концевой последовательности НВс, простирающейся от положения 150 до С-конца.
Длина последовательности домена IV может составлять шесть остатков, то есть цистеин плюс любые пять остатков, содержащих, в целом, до трех цистеинов, и примерно до 100 аминокислотных остатков, то есть эта длина должна быть достаточной для того, чтобы рассматриваемый химерный белок имел, в целом, длину примерно от 135 до 515 остатков, более предпочтительно примерно до 460 остатков, а наиболее предпочтительно примерно до 435 аминокислотных остатков. В случае если эпитоп, связанный пептидной связью с доменами I или II, содержит примерно до 30 или примерно до 50 остатков соответственно, что является предпочтительным для этих эпитопов, то более предпочтительная длина химерной молекулы, включая эпитоп домена IV, составляют примерно от 175 до 240 остатков. Особенно предпочтительные химерные молекулы, содержащие два гетерологичных эпитопа, имеют длину примерно от 190 до 210 остатков. Отсутствие связывания полученной частицы с нуклеиновой кислотой определяют путем измерения отношения оптических плотностей при 280/260, как обсуждалось ранее.
Последовательность домена IV включает по крайней мере один цистеиновый (Сук) остаток и может содержать вплоть до трех остатков Сук. Предпочтительно, чтобы один или несколько остатков Сук находились возле или в пределах примерно пяти аминокислотных остатков у С-конца химерной молекулы белка. Кроме того, если в последовательности домена IV присутствует более чем один остаток Сук, то предпочтительно, чтобы эти остатки Сук были смежными друг с другом.
Также предпочтительно, чтобы последовательность домена IV состояла из Т-клеточного эпитопа, множества Т-клеточных эпитопов, которые могут быть одинаковыми или различными, или дополнительного В-клеточного эпитопа для организма, против которого предлагается использовать рассматриваемую химеру в качестве иммуногена. Примеры последовательностей Т-клеточного эпитопа домена IV представлены ниже в таблице В, а также в таблице А.
- 16 006207
Таблица В Т-клеточные эпитопы
Микроорганизм Ген Последовательность* Ссылка 8ЕО Ю ΝΟ
ВИЧ Р24 ΟΡΚΕΡΡΕΟΥ-
ТОКРУКС 3 50
СогупеЬасСегз-ит
сИрскегхае токсин ΕΟννΗΝδΥΝ- ΚΡΑΥ3ΡΟΟ 5 51
ВоггеИа Ьигддог£ег1 оврА νΕΙΚΕΟΤνΤΤ.ΚΚΕΙΟΚΝΟΚντνδΕΟ ΊΤ,3ΚΝΙ3Κ80- б 52
ЕУЗУНЫГОС 7 53
Вирус гриппа А8/РК8 НА БЗУЗЗРЕЕРЕС 8 54
ЫОАШЮРС 32 291
ТЫОАЫХЗС 32 292
Тгурапозота сгиг1 зныртьуазун-
ЕЕАРЗСЫТС 13 55
Р1азто&1ит £а1с1рагит МЗР1 δνΟΙΡΚνΡΥΡΝΟίνΥΟ 15 56
ОИМНУУТЬКТОЬЕАОС 57
ΡδϋΚΗΙΕαΥΚΚΙКН818С 23 58
ЕУЬНКЮ»8ЬЗТЕИ8РС8УТ 26 59
Р. νίνβχ ΥΙΛΚνΚΑΤνΟΤΕНТРСЗУТ 60
Р. уое1И ΕΡνΚΟΙδΒΟΒΤΕЕКЗОСЗУТ 287
ЗЫерсососсиз зоЬг1пи8 Ад1/И ΚΡΚΡΙΥΕΑΚϋ-
АОЫОКС ΑΚΑϋΥΕΑΚΙΑ- 16 61
ОУЕКОЬС 62
ЬСМУ (вирус лимфоцитарного хориоменингита)
ΝΡ КРОАЗСУУМ
СЫЬТАОС 17 63
С1оз£г1с11ит СеСап£ Сох ΟΥΙΚΑΝδΚΡΙΟ-
1ТЕЬС 20 64
‘Подчеркнутая буква С (С) означает, что этот нуклеотид не присутствует в нативной последовательности.
Ссылки на литературу:
1. ЕРО 786 521А.
2. \О 98/07320.
3. ϋ8 Νο. 5639854.
4. ϋ8 Νο. 4544500.
5. ЕРО 399001 В1.
6. Воскеп§!еб! е! а1. (1996) I. 1ттипо1., 157, 12:5496.
7. ΖΗοη§ е! а1. (1996) Еиг. I. 1ттипо1., 26, 11:2749.
8. Вгитеапи е! а1. (1996) 1ттипо!ескпо1оду, 2, 2:85.
9. НШ е! а1. (1997) 1п1ес!. 1ттип., 65, 11:4476.
10. ЕРО 432 220 В1.
11. \О 98/06851.
12. Ке11у е! а1. (1997) С1т. Ехр. 1ттипо1., 110, 2:285.
13. Ка11п е! а1. (1997) I. 1ттипо1., 159, 3:4444.
14. \\'О 97/18475.
15. Ок!а е! а1. (1997) 1п!. Лгск. Л11егду 1ттипо1., 114, 1:15.
16. 8!аШ1епо е! а1. (1990) Лгск. Ога1 Вю1., 35: 8ирр1. 478.
- 17 006207
17. 8атоп е! а1. (1997) Ргос. ЙаЙ. Асай. 8οΐ. И8Л, 94, 7:3314.
18. СойНезу е! а1. (1996) 1. Вю1. СНет., 271, 52:33670.
19. ВакНеп е! а1. (1997) У1го1., 234, 1:118.
20. Уаид е! а1. (1997) Уассте. 15, 4:377.
21. Ьо!!ет е! а1. (1997) 1. Ехр. Мей., 185, 10:1793.
22. Йага е! а1. (1997) Уассте 15, 1:79.
23. И.8. Йо. 4886782.
24. 2ауа1а е! а1. (1985) 8с1епсе, 228:1436.
25. 8сНо4е1 е! а1. (1994) 1. Ехрег. Мей., 180:1037.
26. Са1уо-Са11ее! а1. (1997) 1. 1ттипо1. 159, 3:1362.
27. Оап е! а1. (1992) Мо1. ВюсНет. Рагакйок, 55(1-2):105.
28. Оап е! а1. (1993) Ьапсе!, 341 (8848):780.
29. Йе1гупск е! а1. (Ос! 1999) Йа!иге Мей., 5 (10):1157-1163.
30. ТНотркоп е! а1. (1994) Еиг.1. ВюсНет., 226(3):751-764.
31. №11коп е! а1. (2000) 8с1епсе, 287:1664-1666.
32. Вгомп е! а1. (1993) 1. У1го1., 67 (5):2887-2893.
33. И.8. Йо. 4886663.
34. 8сНепк е! а1. (1и1 8, 1999) Йа!иге, 400(6740):116-117.
35. 81ерикНкт е! а1. (1995) Уассте, 13(15) :1399-1402.
Помимо по крайней мере одного цистеинового остатка, присутствующего в домене 1У, в рассматриваемой химерной молекуле и частице предпочтительно присутствует аминокислотная последовательность НВс от положения 1, по крайней мере, до положения 140. Более предпочтительно, если присутствует последовательность, простирающаяся от положения 1 до положения 149. В-клеточный эпитоп, предпочтительно присутствует между остатками 76 и 85, а по крайней мере один цистеиновый остаток или Т-клеточный эпитоп, содержащий цистеиновый остаток, присутствует в виде С-концевого добавления к последовательности НВс. Рассматриваемая рекомбинантная НВс-химера, в основном, не связывается с нуклеиновой кислотой. Рассматриваемая химерная частица, которая содержит добавленный остаток Сук у С-конца или возле С-конца этой молекулы, является также более стабильной при 37°С, чем аналогичная частица, не содержащая такого добавленного Сук. Такая повышенная стабильность проиллюстрирована на фиг. 3, 4 и 8, и обсуждается ниже.
Рассматриваемая рекомбинантная химерная молекула НВс обычно присутствует и используется как самособирающаяся частица. Эти частицы состоят из 180-240 химерных молекул (90 или 120 димерных пар), а обычно из 240 химерных молекул, которые разделяются на белковые молекулы в присутствии дисульфидных восстановителей, таких как 2-меркаптоэтанол, а поэтому очевидно, что отдельные молекулы связываются друг с другом и образуют частицу, главным образом, посредством дисульфидных связей.
Не претендуя на какую-либо теорию, очевидно, что наблюдаемая повышенная стабильность, а в некоторых случаях усиленная экспрессия рассматриваемой НВс-химеры, обусловлена образованием дополнительной дисульфидной связи между цистеинами белков химерных молекул. Независимо от того, присутствует ли цистеин или цистин, этот С-концевой цистеиновый остаток называется цистеином, поскольку этот остаток кодируется кодоном, присутствующим в нуклеиновой кислоте, из которой экспрессируется белок и собранная частица.
Эти частицы аналогичны частицам, наблюдаемым у пациентов, инфицированных НВУ, но эти частицы не являются инфекционными. После экспрессии в различных прокариотических и эукариотических хозяевах, отдельные рекомбинантные химерные молекулы НВс собираются в данном хозяине и образуют частицы, которые могут быть легко выделены из клеток-хозяев и очищены, если это необходимо.
Как указывалось выше, иммунодоминантная петля НВс обычно, как известно, локализована в области примерно от положения 75 до положения 85, от аминоконца (Й-конца) интактного белка. Гетерологичная последовательность домена II, содержащая В-клеточный эпитоп, находится в этой иммунодоминантной последовательности петли. Такая локализация приводит, в основном, к элиминации иммуногенности последовательности петли НВс, хотя присутствующая гетерологичная последовательность или линкерный остаток находится в крайнем иммуногенном положении в собранных химерных частицах.
Помимо обсуждаемых выше Й- и С-усечений, инсерций различных эпитопов и спейсеров, рассматриваемая химерная молекула может также содержать консервативные замены в аминокислотных остатках, которые составляют домены I, II, III и 1У НВс. Консервативные замены являются такими, как они определены выше.
В более редких случаях может быть осуществлена неконсервативная замена, например замена глицина триптофаном. Аналогичные небольшие модификации могут также включать делеции или инсерции аминокислот либо и то и другое. Для того чтобы определить, какой именно аминокислотный остаток может быть заменен, инсертирован или делегирован без воздействия на биологическую активность или образование частицы, можно использовать компьютерные программы, хорошо известные специалистам, например программы ЬАЗЕВОЕЙЕ (БЙА8ТАВ Шс., Майкоп, \νίκ.).
- 18 006207
НВс-часть химерной молекулы настоящего изобретения, то есть часть, имеющая последовательность НВс, которая содержит последовательность, не являющуюся последовательностью или остатком добавленного эпитопа, линкера, гибкого линкерного плеча или гетерологичного(ых) остатка(ов), представляющих собой артефакт рестриктирующего фермента, наиболее предпочтительно имеет последовательность аминокислотных остатков в положениях 1-149 подтипа аует, показанную на фиг. 7 (8ЕО ГО N0:247), менее предпочтительно какую-либо часть или части последовательности подтипа аует, отсутствующих из-за усечения в любом одном или в обоих концах. Несколько менее предпочтительными являются соответствующие последовательности аминокислотных остатков подтипов абет, абет2 и абует, которые также показаны на фиг. 7 (8Е0 ГО N0:248, 249 и 250). Еще менее предпочтительными являются последовательности лесного сурка и земляной белки в выровненных положениях 1-149, которые представляют собой последние две последовательности на фиг. 7 (8Е0 ГО N0:251 и 246). Как уже указывалось, части различных последовательностей других белков НВс млекопитающего могут быть использованы вместе в одной химере.
Если НВс-часть химерной молекулы настоящего изобретения, описанная выше, имеет последовательность, не являющуюся последовательностью молекулы НВс млекопитающего, соответствующей положениям 1-149, то в ней, по сравнению с последовательностью 8Е0 ГО N0:247, простирающейся от положения 1 до положения 149, должно быть заменено не более чем примерно 20% аминокислотных остатков. Предпочтительно, чтобы было заменено не более чем примерно 10%, более предпочтительно не более чем примерно 5% в, а наиболее предпочтительно не более чем примерно 3% аминокислотных остатков по сравнению с последовательностью 8Е0 ГО N0:247, простирающейся от положения 1 до положения 149.
Таким образом, рассматриваемая химера, состоящая из 149 остатков НВс, может содержать примерно до 30 остатков, а предпочтительно, примерно 15 остатков, которые отличаются от остатков последовательности 8Е0 ГО N0:247, простирающейся от положения 1 до положения 149. Более предпочтительно, примерно 7 или 8 остатков, а наиболее предпочтительно примерно 4 или 5 остатков отличаются от остатков в последовательности аует (8Е0 ГО N0:247) в положениях остатков 1-149. Предпочтительно, чтобы замены, сделанные не в иммунодоминантной петле или в концах домена II, находились в неспиральных частях химерной молекулы, и обычно между остатками примерно 1-15 и остатками примерно 24-50, что гарантирует образование частицы. См., Коксйе1 е! а1., Ι.νίτοί., 73(3):2153-2160 (Маг.1999).
Если последовательность НВс усечена у С-конца за положением 149 или у Оконца, либо содержит одну или несколько делеций в иммуногенной петле, то число замененных остатков пропорционально изменяется, поскольку общая длина последовательности составляет менее, чем 149 остатков. Для удобства подсчета, какие-либо другие делеции в данной молекуле рассматриваются как консервативные замены.
Получение химеры
Рассматриваемый химерный иммуноген НВс обычно получают с использованием хорошо известной техники рекомбинантных ДНК. Так, добавляют последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют конкретные полипептидные последовательности, и делетируют из последовательности предшественника, которая кодирует НВс, для получения нуклеиновой кислоты, кодирующей рассматриваемую химеру.
Любая из двух стратегий является предпочтительной для введения гетерологичной последовательности эпитопа в последовательность петли. Первой стратегией является замена, где ДНК, которая кодирует часть иммунодоминантной петли, вырезают и заменяют ДНК, кодирующей гетерологичный эпитоп, такой как В-клеточная последовательность. Вторая стратегия называется инсерционной стратегией, в которой гетерологичный эпитоп встраивают между смежными остатками данной петли.
В одном из примеров стратегии замены используется сайт-направленный мутагенез с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) для получения химерной ДНК-последовательности НВс, которая кодирует пару различных рестрикционных сайтов, например ЕсоШ и 8ас!, по одному вблизи каждого конца ДНК, кодирующей иммунодоминантную петлю. Примерами замененных остатков являются остатки в положениях 76-81. Фрагмент, кодирующий петлю, вырезают, нужную последовательность, кодирующую гетерологичный В-клеточный эпитоп, лигируют в рестрикционные сайты, и полученную ДНК используют для экспрессии НВс-химеры. См., например, табл. 2 в работе Ритрепк е! а1., (1995) Шетуи^оду, 38:63-74, где описаны примеры использования такой техники.
Альтернативно, один рестрикционный сайт может быть введен в кодирующую область с помощью сайт-направленного мутагенеза; ДНК расщепляют рестриктазой с получением липких концов, после чего эти липкие концы затупляют эндонуклеазой и затупленный по концам сегмент гетерологичной ДНК лигируют в вырезанную область. Примеры замены последовательности такого типа в НВс можно найти в работах 8сйобе1 е! а1., (1991) Е.Втоетп е! а1. ебк., νη^ίικκ 91, Со1б 8рппд НатЬот ЬаБотаЮту, Со1б 8рппд НатЬот, №ет Уотк, рр.319-325; 8с1юбе1 е! а1., Вейппд Σηκΐ. Μι!!., 1997(98): р.114-119 и 8с1юбе1 е! а1., I. Ехр. Меб., (1994) 180(3): р.1037-4, где в последних двух работах обсуждается получение вакцин против Р.уоеШ и Р.Ьетдйе! соответственно.
- 19 006207
Было обнаружено, что положение инсерции в иммуногенной петле НВс и присутствие остатков петли может иметь важное значение для активности иммуногена. Таким образом, как проиллюстрировано ниже, введение малярийного В-клеточного эпитопа между остатками НВс в положениях 78 и 79, обеспечивает присутствие специфического иммуногена, что дает в 10-1000 раз большую иммуногенность, чем присутствие того же самого иммуногена в вырезанной и замененной области между остатками 76 и 81. Кроме того, введение того же самого малярийного иммуногена между остатками 78 и 79, по сравнению с иммуногеном, расположенным между остатками 77 и 78, дает неожиданное усиление иммуногенности, примерно в 15 раз.
Поэтому такая инсерция является, в основном, предпочтительной. В иллюстративном примере инсерционной стратегии сайт-направленный мутагенез используют для создания двух рестрикционных сайтов, которые являются смежными по отношению друг к другу и которые расположены между кодонами, кодирующими смежные аминокислотные остатки, такие как остатки в положениях 78 и 79. Эта стратегия позволяет добавлять двенадцать пар оснований, которые кодируют четыре аминокислотных остатка (два для каждого рестрикционного сайта), между указанными ранее смежными остатками в петле НВс.
Очевидно, что после расщепления рестриктазами, лигирования ДНК, кодирующей последовательность гетерологичного В-клеточного эпитопа, и экспрессии ДНК с образованием НВс-химер, аминокислотная последовательность петли НВс прерывается на ее Ν-концевой стороне двумя остатками, кодируемыми 5' рестрикционным сайтом, а далее по направлению к С-концу, последовательностью гетерологичного В-клеточного эпитопа, а затем еще двумя гетерологичными непетлевыми остатками, кодируемыми 3'-рестрикционным сайтом, за которым следует остальная последовательность петли. Та же самая стратегия может быть использована для инсерции в домен I Ν-концевой последовательности, как описано №иупск е! а1., (Ос!оЪег 1999) №11иге Мей., 5(10):1157-1163, или для инсерции в домен IV Тклеточного эпитопа, или одного или нескольких цистеиновых остатков, которые не являются частью Тклеточного эпитопа. Аналогичная стратегия, предусматривающая инсерцию между остатками 82 и 83, описана в работе Зс1юйе1 е! а1., (1990) Б. Вго\уп е! а1., ейк., Vасс^ηек 90, Со1й Зрппд НагЪог ЬаЪога!огу, Со1й Зрппд НагЪог, №\ν Уогк, рр.193-198.
Более конкретно, эта стратегия клонирования схематично проиллюстрирована на фиг. 2А, 2В и 2С. На фиг. 2А ДНК-последовательность, кодирующую усеченную у С-конца последовательность НВс (НВс 149), конструируют так, чтобы она содержала смежные ЕсоЮ и ЗаЛ-сайты между остатками 78 и 79. Расщепление этой ДНК обоими ферментами дает один фрагмент, который кодирует область НВс в положениях 1-78, имеющую липкий ЕсоК1-3'-конец, и другой фрагмент, который имеет липкий ЗаЛ-5'конец и кодирует остатки в положениях 79-149. Лигирование синтетической нуклеиновой кислоты, имеющей 5'-выступающий ААТТ, за которым следует последовательность, кодирующая нужный малярийный В-клеточный эпитоп и 3'-выступающий АССТ, приводит к получению химерной последовательности НВс, которая кодирует В-клеточный эпитоп, фланкированный на каждой стороне двумя гетерологичными остатками [С1уПе (С!) и С1иЬеи (ЕЬ), соответственно], между остатками 78 и 79, при этом обычно ЕсоК1-сайт разрушается, а ЗаЛ-сайт сохраняется.
Аналогичная стратегия проиллюстрирована на фиг. 2В для инсерции цистеинсодержащей последовательности в домен IV и такой особенно предпочтительной последовательностью является малярийный Т-клеточный эпитоп, который содержит последовательность белка СЗ Р. £а1Лрагит, простирающуюся от положения 326 до положения 345 и обозначенную здесь РБ/СЗ326-345 (Р£-ИТС). В данном случае рестрикционные ЕсоК1- и НтЛЛ-сайты были сконструированы так, чтобы они находились в ДНКпоследовательности НВс после аминокислотного остатка в положении 149. После расщепления ферментами ЕсоК! и НтйШ, синтетическую ДНК, имеющую вышеуказанный 5'-выступающий ААТТ, за которым следуют последовательность, кодирующая Т-клеточный эпитоп, один или несколько стоп-кодонов и 3'-выступающий АССТ, лигируют в расщепленную последовательность, в результате чего получают последовательность, кодирующую остатки 1-149 НВс, за которой следуют два гетерологичных остатка (СЦ стоп-кодон и НшйШ-сайт.
После ПЦР-амплификации с использованием прямого праймера, имеющего рестрикционный ЗаЛсайт, за которым следует последовательность, кодирующая НВс и начинающаяся с остатка в положении 79, и после расщепления ферментами ЗаЛ и НтйШ получают последовательность, кодирующую НВс в положениях 79-149 плюс два дополнительных остатка и Т-клеточный эпитоп у С-конца. После расщепления конструкции, представленной на фиг. 2В, ферментом ЗаЛ и после лигирования получают полноразмерный ген, кодирующий нужный рекомбинантный химерный иммуноген НВс, который содержит последовательность от Ν-конца в положениях 1-78 НВс, два добавленных остатка, малярийный Вклеточный эпитоп, два добавленных остатка, остатки НВс в положениях 79-149, два добавленных остатка и Т-клеточный эпитоп, как показано на фиг. 2С.
Аналогичная техника может быть использована для введения гетерологичного линкерного остатка для конъюгирования В-клеточного эпитопа в область последовательности петли. Рассматриваемые линкерные остатки включают лизин (Ъук), который является особенно предпочтительным, аспарагиновую кислоту (Акр), глутаминовую кислоту (С1и), цистеин (Сук) и тирозин (Туг).
- 20 006207
Следует отметить, что последовательность аминокислотных остатков, показанная в 8ЕО ГО ΝΟ:247, содержит остатки С1и и Акр в положениях 77 и 78. Тем не менее, рассматривается также введение дополнительного гетерологичного карбоксилсодержащего остатка. Химическая реакционная способность имеющихся глутаминовой и аспарагиновой кислот может быть снижена под действием других факторов. Так, например, специалистам известно, что находящийся по соседству пролин, такой как пролин в положении 79, может нейтрализовывать и тем самым снижать химическую реакционную способность проксимальной карбоксильной группы.
В данном случае, при использовании первой описанной стратегии инсерции, в последовательность петли вводят пять гетерологичных остатков, один из которых является гетерологичным линкерным остатком для конъюгирования В-клеточного эпитопа, а два смежных остатка, с каждой стороны от этого одного остатка, сами также являются смежными с остатками последовательности петли и представляют собой продукт экспрессии встроенных рестрикционных сайтов (артефакты рестриктазы). Следует отметить, что сайт-направленный мутагенез можно также использовать для добавления одного кодона в последовательность петли НВс, который кодирует гетерологичный линкерный остаток для В-клеточного эпитопа.
При этом следует отметить, что для удобства предпочтительно использовать два гетерологичных остатка на любой стороне (фланкирующей) В-клеточного или Т-клеточного эпитопа. В результате этого, на любой стороне или на обеих сторонах встроенной последовательности можно также использовать 0-3 или более дополнительных остатков, которые не являются частью последовательности НВс. Один или оба конца этой вставки и нуклеиновой кислоты НВс могут быть снова гидролизованы соответствующей нуклеазой (например, нуклеазой 81) с образованием тупых концов, которые могут быть затем лигированы вместе. Добавленные гетерологичные остатки, которые не являются ни частью инсертированного В-клеточного или Т-клеточного эпитопа, ни частью последовательности НВс, не включаются в число остатков, присутствующих в описанном домене.
При этом следует отметить, что может быть также синтезирована часть или вся нужная рекомбинантная химерная нуклеиновая кислота НВс с использованием хорошо известных методов синтеза, обсуждаемых и проиллюстрированных в патенте США № 5656472, для синтеза ДНК из 177 пар оснований, которая кодирует 59 остатков сигнального пептида рибулозо-бис-фосфат-карбоксилазооксигеназы Ксойапа 1аЬасит. Так, например, можно синтезировать домены I и II с тупым или липким концом, которые могут быть лигированы с доменами III и IV с получением конструкции, экспрессирующей рассматриваемую НВс-химеру, которая не содержит дополнительных остатков со стороны Ν-конца Вклеточного эпитопа, и содержит от нуля до трех дополнительных остатков со стороны С-конца или на стыке домена П/Ш, либо в некоторых других нужных положениях.
Альтернативная стратегия инсерции описана у С1агке е1 а1. (1991), Р. Вготеп е1 а1., ебк., Уасстек 91, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаФгу, Со1б 8рппд НагЬог, №те Уогк, рр.313-318. В данном случае, учитывая преимущество, которое дает вырожденность генетического кода, эти авторы сконструировали один рестрикционный сайт, соответствующий остаткам 80 и 81, который кодирует исходные остатки, присутствующие в этих положениях. Таким образом, их экспрессированные НВс-химеры не содержали остатки, кодируемые рестрикционным сайтом, и содержали остатки петли НВс, непосредственно смежные со встроенной последовательностью.
В настоящем описании также рассматривается последовательность нуклеиновой кислоты (сегмент), которая кодирует описанную ранее химерную молекулу НВс, или комплементарная последовательность этой кодирующей последовательности. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, такой сегмент нуклеиновой кислоты присутствует в выделенной и очищенной форме.
В живых организмах, последовательность аминокислотных остатков белка или полипептида непосредственно связана посредством генетического кода с последовательностью дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) гена, кодирующего этот белок. Таким образом, благодаря хорошо известной вырожденности генетического кода могут быть получены, если это необходимо, дополнительные ДНК и соответствующие РНК-последовательности (нуклеиновые кислоты), которые кодируют те же самые химерные последовательности аминокислотных остатков, но которые в достаточной степени отличаются от обсуждаемой выше генной последовательности так, что эти две последовательности не гибридизуются в условиях высокой жесткости, но гибридизуются в условиях умеренной жесткости.
Условия высокой жесткости могут быть определены как условия гибридизации при температуре примерно 50-55°С в 6 х 88С и с конечной промывкой при температуре 68°С в 1-3 х 88С. Условиями умеренной жесткости являются условия гибридизации при температуре примерно от 50 до 65°С в 0,2-0,3 М №С1, с последующей промывкой при температуре примерно от 50 до 55°С в 0,2 х 88С, 0,1% ДСН (додецилсульфате натрия).
Последовательность нуклеиновой кислоты (ДНК-последовательность или РНК-последовательность), (1) которая сама, или ее комплементарная последовательность кодирует химерную молекулу,
НВс-часть которой от остатка 1 до остатка 136, если они присутствуют, представляет собой последовательность 8ЕО ГО ΝΟ:246, 247, 248, 249, 250 или 251; и (2) гибридизуется с ДНК-последовательностью
8ЕО ГО ΝΟ: 274, 275, 276, 277, 278 или 279, по крайней мере, в условиях умеренной жесткости (обсуж- 21 006207 даемых выше); и (3) НВс-последовательность которой по крайней мере на 80%, более предпочтительно по крайней мере на 90%, еще более предпочтительно по крайней мере на 95%, а наиболее предпочтительно по крайней мере на 100% идентична ДНК-последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 274, 275, 276, 277, 278 или 279, определена как вариант ДНК-последовательности. Как хорошо известно специалистам, последовательность нуклеиновой кислоты, такая как рассматриваемая последовательность нуклеиновой кислоты, экспрессируется при ее функциональном присоединении к соответствующему промотору в соответствующей экспрессионной системе, как обсуждается в настоящем описании.
Аналог последовательности нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) или последовательность, аналогичная этой последовательности, которая кодирует рассматриваемую химерную молекулу, также рассматривается как часть настоящего изобретения. Химерный аналог последовательности нуклеиновой кислоты или комплементарная ей последовательность нуклеиновой кислоты кодирует последовательность аминокислотных остатков НВс, которая по крайней мере на 80%, более предпочтительно по крайней мере на 90%, наиболее предпочтительно по крайней мере на 95%, идентична части последовательности НВс от остатка в положении 1 до остатка в положении 136, показанных в 8Е0 ΙΌ N0: 246, 247, 248, 249, 250 и 251. Эта ДНК или РНК называются здесь аналогом или аналогичными последовательности нуклеиновой кислоты 8Е0 ΙΌ N0: 274, 275, 276, 277, 278 или 279, и гибридизуются с последовательностью нуклеиновой кислоты 8Е0 ΙΌ N0: 274, 275, 276, 277, 278 или 279 или с комплементарными им последовательности в условиях гибридизации умеренной жесткости. Нуклеиновая кислота, кодирующая аналогичную последовательность, после соответствующей трансфекции и экспрессии, также продуцирует рассматриваемую химеру.
У различных хозяев часто отдается предпочтение конкретному кодону, используемому для кодирования конкретного аминокислотного остатка. Такая предпочтительность кодонов хорошо известна специалистам, и ДНК-последовательность, кодирующая нужную химерную последовательность, может быть модифицирована с использованием, например, ш уйго-мутагенеза так, чтобы в данном хозяине, в котором должен экспрессироваться данный фермент, использовались предпочтительные для этого хозяина кодоны. Кроме того, вырожденность генетического кода можно также использовать для кодирования части НВс последовательности 8Е0 ΙΌ N0; 246, 247, 248, 249, 250 и 251, которая не имеет существенной идентичности с ДНК 8Е0 ΙΌ N0: 274, 275, 276, 277, 278 или 279 или комплементарными им последовательностями. Таким образом, используемая аналогичная ДНК-последовательность необязательно должна гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями 8Е0 ΙΌ N0: 274, 275, 276, 277, 278 или 279 или их комплементарными последовательностями в условиях умеренной жесткости, но при этом они могут образовывать рассматриваемую химерную молекулу.
Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, такая как молекула ДНК, включающая вектор, функционально присоединенный к экзогенному сегменту нуклеиновой кислоты (например, сегменту или последовательности ДНК), который определяет ген, кодирующий рассматриваемую химеру, как обсуждалось выше, и промотору, подходящему для регуляции экспрессии этого гена в совместимом организме-хозяине, также входит в объем настоящего изобретения. Более конкретно, рассматривается также рекомбинантная молекула ДНК, включающая вектор, содержащий промотор для регуляции экспрессии химеры в клетках организма-хозяина, функционально присоединенный к сегменту ДНК, определяющему ген для части НВс-химеры или ДНК-варианта, который по крайней мере на 90% идентичен химерному гену 8Е0 ΙΌ N0: 274, 275, 276, 277, 278 или 279 и гибридизуется с этим геном в условиях умеренной жесткости.
Кроме того, рассматривается рекомбинантная молекула ДНК, содержащая вектор, включающий промотор для регуляции экспрессии химеры в клетках организма-хозяина, функционально присоединенный к сегменту ДНК, который является аналогом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность аминокислотных остатков части химерной НВс, которая по крайней мере на 80%, более предпочтительно по крайней мере на 90%, а наиболее предпочтительно по крайней мере на 95%, идентична части НВс последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 246, 247, 248, 249, 250 и 251. Эта рекомбинантная ДНК-молекула, после соответствующей трансфекции и экспрессии в клетке-хозяине, также продуцирует рассматриваемую химерную молекулу.
Следует отметить, что поскольку ^концевая последовательность из 30 аминокислотных остатков НВс земляной белки не соответствует каким-либо другим последовательностям НВс, то эта последовательность и кодирующие ее последовательности нуклеиновой кислоты и комплементарные им последовательности не имеют идентичность, соответствующую вышеуказанному проценту и не являются частями нуклеиновой кислоты, которая кодирует последовательность из 30 остатков или комплементарную ей последовательность, используемую при определении гибридизации. Аналогичным образом, последовательности, которые являются усеченными по любому из К’-и С-концов НВс или по обоим концам, не соответствуют оценкам идентичности, и не являются последовательностями, в которых остатки иммунодоминантной петли удалены для инсерции гетерологичного эпитопа. Таким образом, при оценке идентичности со сравниваемой последовательностью нуклеиновой кислоты или аминокислотных остатков учитываются и сравниваются только те НВс-кодирующие основания или остатки последовательности НВс, которые присутствуют в химерной молекуле.
- 22 006207
Поскольку кодирующие последовательности для описанного здесь гена проиллюстрированы в 8ЕС ΙΌ N0: 274, 275, 276, 277, 278 или 279, то изолированные сегменты нуклеиновой кислоты, предпочтительно ДНК-последовательности, их варианты и аналоги, могут быть получены методом ίη У1!гомутагенеза, известным специалистам и обсуждаемым в монографии. Сштеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Ν.Υ. Аи8иЬе1 е! а1. ебк., 1ойп Абеу & 8опк (№\ν Уогк: 1987) р. 8.1.1-8.1.6, где указанные сегменты, их варианты и аналоги начинаются с начального кодона АТС для данного гена и кончаются стопкодоном или простираются правее этого стоп-кодона для каждого гена. Таким образом, нужный рестрикционный сайт может быть сконструирован у инициирующего кодона или левее от него, и у стопкодона или правее от него так, чтобы можно было получить, вырезать и изолировать другие гены.
Как хорошо известно специалистам, если присутствует требуемая нуклеиновая кислота, например ДНК-последовательность (включая старт- и стоп-сигналы), то дополнительные пары оснований могут обычно присутствовать у любого конца сегмента, и этот сегмент может быть еще использован для экспрессии белка. При этом, разумеется, предполагается отсутствие в данном сегменте функционально присоединенной ДНК-последовательности, которая подавляет экспрессию, экспрессирует дополнительный продукт, который утилизует нужный экспрессируемый фермент, экспрессирует продукт, который утилизует нужный реакционный продукт, продуцируемый этим нужным ферментом, либо оказывает какоелибо другое влияние на экспрессию гена указанного сегмента ДНК.
Таким образом, если ДНК-сегмент не имеет таких интерферирующих ДНК-последовательностей, то ДНК-сегмент настоящего изобретения может иметь длину примерно от 500 до 15000 пар оснований. Максимальный размер рекомбинантной ДНК-молекулы, а в частности экспрессирующего вектора, определяется, главным образом, удобством использования и размером вектора, который может быть подходящим для клетки-хозяина, когда присутствуют все минимальные ДНК-последовательности, требуемые для репликации и экспрессии, если это необходимо. Минимальные размеры вектора хорошо известны. Могут быть также использованы и длинные ДНК-сегменты, но они не являются предпочтительными.
ДНК-сегменты, которые кодируют вышеописанные химеры, могут быть синтезированы методами химического синтеза, например фосфотриэфирным методом Ма!!еисс1 е! а1. (1981) ТАт.С.’йет.8ос. 103:3185. Разумеется, при химическом синтезе кодирующей последовательности могут быть введены любые нужные модификации просто путем замены оснований, кодирующих нативную последовательность аминокислотных остатков, соответствующими основаниями. Однако предпочтительными являются ДНК-сегменты, включающие последовательности, описанные выше.
Рассматриваемая НВс-химера может быть получена (экспрессирована) в ряде трансформированных систем-хозяев, обычно клеток-хозяев, хотя также рассматривается экспрессия в бесклеточных ίη уйго системах. Этими клеточными системами-хозяевами являются, но не ограничиваются ими, микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидными или космидными экспрессирующими ДНК-векторами; дрожжи, трансформированные векторами для экспрессии в дрожжах; клеточные системы насекомых, инфицированные вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусом); клеточные системы растений, трансформированные вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты; вирусом мозаики табака) или бактериальными экспрессирующими векторами (например, плазмидой Т1); либо соответствующим образом трансформированные клеточные системы животных, такие как клетки СНО, УЕВО или С08. Настоящее изобретение не ограничивается используемыми клетками-хозяевами.
ДНК-сегменты, содержащие ген, кодирующий НВс-химеру, предпочтительно получают из рекомбинантных молекул ДНК (плазмидных векторов), содержащих этот ген. Векторы, способные регулировать экспрессию химерного гена в белок НВс-химеры, называют в настоящем описании экспрессирующими векторами.
Экспрессирующий вектор содержит элементы регуляции экспрессии, включая промотор. Этот кодирующий химеру ген функционально присоединен к экспрессирующему вектору, что позволяет промоторной последовательности регулировать связывание с РНК-полимеразой и экспрессию кодирующего химеру гена. Для экспрессии полипептид-кодирующего гена могут быть использованы индуцибельные, вирусные, синтетические, конститутивные промоторы, описанные Ро$хко\\'$к| е! а1. (1989) ЕМВО ί. 3:2719 и Обе 11 е! а1., (1985) №!иге, 313:810, а также промоторы с временной, пространственной и пространственно-временной регуляцией, как указано в работе Сйиа е! а1. (1989) 8с1епсе, 244:174-181.
Одним из предпочтительных промоторов, используемых в прокариотических клетках, таких как Е.сой, является промотор Вес 7, который индуцируется путем экзогенной доставки налидиксовой кислоты. Более предпочтительным промотором является промотор, присутствующий в плазмидном векторе ЕНЕХ25 (поставляемом от Рготеда), который индуцируется путем экзогенной доставки изопропил-β-Όтиогалактопиранозида (1РТС). Еще более предпочтительный промотор, промотор !ас, присутствует в плазмидном векторе рКК223-3, и также индуцируется экзогенно поставляемым 1РТС. Плазмида рКК2233 может быть успешно экспрессирована в ряде штаммов Е.сой, таких как ХЬ-1, ТВ1, ВБ21 и ВЬВ, с использованием примерно от 25 до 100 мкМ 1РТС для индуцирования. Неожиданно было обнаружено, что при экспрессии в 2-литровых шейкерных колбах и ферментерах, оптимальные результаты дают концентрации, составляющие примерно от 25 до 50 мкМ 1РТС.
- 23 006207
Несколько штаммов 8а1топе11а, таких как 8.1урЫ и 8.1урЫтипит и гибриды 8.1урЫтигшт-Е.со1Е были использовали для экспрессии иммуногенных трансгенов, включающих ранее полученные химерные частицы НВс, как источники частиц, используемых в качестве иммуногенов и в качестве живых аттенюированных вакцин, содержащих целые клетки, и инокулятов, и эти системы экспрессии и вакцинации могут быть использованы в настоящем изобретении. См. патент США № 6024961; патент США № 5888799; патент США № 5387744; патент США № 5297441; Шпек е1 а1., (1998) Αάν. Уйиз Кез. 50:141182; Таске! е! а1., (Аид 1997) 1пГесЕ 1ттип. 65(8):3381-3385, 8скобе1 е! а1., (ТеЬ 1997) ВеЫтд 1пз!. Мй!., 98:114-119; №1гбеШ-НаеГНдег е! а1., (Эес 1996) ЫГесЕ 1ттип., 64(12):5219-5224; Ьопбопо е! а1. (Арг 1996) Уассше, 14(6):545-552 и указанные там ссылки.
Экспрессирующие векторы, совместимые с эукариотическими клетками, такие как экспрессирующие векторы, совместимые с дрожжевыми клетками или с клетками высших растений или млекопитающих, также рассматриваются в настоящем изобретении. Такие экспрессирующие векторы могут быть также использованы для образования рекомбинантных ДНК-молекул настоящего изобретения. Векторы для использования в дрожжах, таких как 8. сеге\зз1ае или РюЫа раз!ойз, могут быть эписомными или интегрирующимися, и хорошо известны специалистам. Эукариотические экспрессирующие векторы клеток хорошо известны специалистам и могут быть получены из нескольких коммерческих источников. Обычно, такие векторы содержат один или несколько подходящих рестрикционных сайтов для инсерции нужного ДНК-сегмента и промоторных последовательностей. Такие векторы содержат, но необязательно, селективные маркеры для использования в эукариотических клетках. Примерами промоторов для использования в 8. сеге\зз1ае является промотор киназы фосфоглицериновой кислоты (РСК) 8. сеге\зз1ае и дивергентные промоторы САЬ 10 и САЬ 1, тогда как подходящим промотором для РюЫа разЮпз является промотор гена алкогольоксидазы (АОХ1).
Так, например, для продуцирования химер в метилотропных дрожжах, Р. раз!опз, ген, который кодирует нужную химеру, помещают под контроль регуляторных последовательностей, регулирующих экспрессию структурных генов в РюЫа. Полученные компетентные по экспрессии формы этих генов вводят в клетки РюЫа.
Более конкретно, может быть использована система трансформации и экспрессии, описанная в работе Сгедд е! а1. (1987) Вю!есйпо1оду, 5:479-485; (1987) Мо1еси1аг апб Се1Ы1аг Вю1оду, 12:3376-3385. Ген химеры У12.РГ3.1 помещают правее промотора гена алкогольоксидазы (АОХ1) и левее последовательности терминатора транскрипции того же самого гена АОХ1. Затем ген и его фланкирующие регуляторные области встраивают в плазмиду, несущую ген Н184 Р. разЮпз и последовательность АК8 Р. разЮпз (автономно реплицирующуюся последовательность), которая позволяет плазмиде реплицироваться в клетках Р. разЮпз [Сгедд е! а1. (1987) Мо1еси1аг апб Се11и1аг Вю1оду, 12:3376-3385].
Указанный вектор также содержит соответствующие части плазмиды, такой как рВК.322, которые обеспечивают репликацию этой плазмиды в клетках Е.сой. Полученная плазмида, несущая химерный ген, а также различные дополнительные вышеописанные элементы соответствующим образом трансформируются в мутант Ыз4 Р. разЮпз, т.е. в клетки штамма, у которого отсутствует функциональный ген гистидинолдегидрогеназы.
После отбора колоний трансформантов на средах, не содержащих гистидина, клетки культивируют на средах, не содержащих гистидина, но содержащих метанол, как описано Сгедд е! а1., (1987) Мо1еси1аг апб Се1Ы1аг Вю1оду, 12:3376-3385, для индуцирования промоторов АОХ1. Эти индуцированные промоторы АОХ1 приводят к экспрессии химерного белка и продуцированию химерных частиц в Р. раз!ойз.
Рассматриваемый химерный ген может быть также введен путем интеграционной трансформации, для которой не требуется использования последовательности АК8, как описано Сгедд е! а1., (1987) Мо1еси1аг апб Се1Ы1аг Вю1оду, 12:3376-3385.
Продуцирование химерных частиц с помощью экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках млекопитающих осуществляют, в качестве примера, с использованием рекомбинантного ДНК-вектора, способного экспрессировать химерный ген в клетках яичника китайского хомячка (СНО). Это продуцирование осуществляют в соответствии с процедурами, хорошо известными специалистам и более подробно описанными у 8атЬгоок е! а1., (1989), Мо1еси1аг С1оЫпд: А 1аЬога!огу тапиа1, 2пб еб., Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!опез.
В одном иллюстративном примере, экспрессирующий вектор рК8У-10, полученный на основе обезьяньего вируса 8У40 (Рйагтааа Рте Сйетка1з, Р1зса!а^ау, N1) подвергают расщеплению рестриктазами №о1 и НшбШ. №о1/НтбШ-фрагмент последовательности, который кодирует нужную НВс-химеру, полученную как описано в примере 1, лигируют в экспрессирующую плазмиду, что приводит к образованию кольцевой рекомбинантной экспрессирующей плазмиды, обозначенной р8У-РТ
Эта экспрессирующая плазмида р8У-РЕ содержит интактный ген резистентности к ампициллину
Е.сой. Таким образом, штамм Е.сой КК101 (Ве!кезба Кезеагсй ЬаЬога!опез, СаййегзЬигд, МО), при его трансформации плазмидой р8У-РЕ, может быть отобран исходя из резистентности к ампициллину тех бактерий, которые содержат эту плазмиду. Затем, содержащие плазмиду бактерии клонируют, и эти клоны скринируют на соответствующую ориентацию кодирующего гена, встроенного в этот экспрессирующий вектор.
- 24 006207
Вышеуказанную полученную плазмиду, рЗУ-РГ, содержащую ген, кодирующий нужную НВсхимеру, размножают путем культивирования Е.сой, содержащей эту плазмиду. Плазмидную ДНК выделяют из культур Е.со11, как описано у ЗатЬгоок е! а1., см выше.
Экспрессию химеры осуществляют путем введения рЗУ-РГ в клеточную линию млекопитающих, например, в клетки СНО, методом трансфекции с использованием фосфата кальция, бгайат е! а1. (1973) У1го1., 52:456, или аналогичным методом.
Для обеспечения максимальной эффективности введения рЗУ-РГ в клетки СНО в культуре, трансфекцию осуществляют в присутствии второй плазмиды рЗУ2^№0 (АТСС #37149) и цитотоксического лекарственного средства 6418 (6ШС0 ЬаЬога!ог1ек, 6гапб Ыапб, Ν.Υ.), как описано в работе ЗоиШегп е! а1. (1982) ЕМо1.Арр1. 6епе!. 1:327. Эти клетки СНО, которые являются резистентными к 6418, имеют обе плазмиды рЗУ2^№0 и рЗУ-РГ, культивируют, и эти клетки обозначают СН0/рЗУ-РГ. Благодаря генетической архитектуре экспрессирующего вектора рЗУ-РГ, химера экспрессируется в полученных клетках СН0/рЗУ-РГ, может быть детектирована и выделена из цитоплазмы этих клеток. Полученную композицию, содержащую клеточный белок, выделяют на колонке, как обсуждается в настоящем описании.
Выбор конкретного экспрессирующего вектора и в конечном счете конкретного промотора, функционально присоединенного к кодирующему химеру гену, непосредственно зависит от нужных функциональных свойств, например от локализации и времени экспрессии белка и от конкретной трансформируемой клетки-хозяина. Эти ограничения хорошо известны специалистам в области конструирования молекул рекомбинантной ДНК. Однако, вектор, используемый для осуществления настоящего изобретения, может регулировать репликацию, а предпочтительно также экспрессию (для экспрессирующего вектора) химерного гена, встроенного в ДНК-сегмент, к которому он функционально присоединен.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения, хозяином, экспрессирующим данную химеру, является прокариот, Е.со11, а предпочтительным вектором является прокариотический репликон; то есть ДНК-последовательность, способная регулировать автономную репликацию и поддерживать рекомбинантную в не хромосомную ДНК-молекулу в прокариотическом хозяине, трансформированном этой молекулой. Такие репликоны хорошо известны специалистам.
Векторы, которые включают прокариотический репликон, могут также содержать область прокариотического промотора, способную регулировать экспрессию рассматриваемого химерного гена НВс в клетке-хозяине, такой как Е.со11, трансформированной этим геном. Промоторные последовательности, совместимые с бактериальными хозяевами, обычно находятся в плазмидных векторах, содержащих один или несколько удобных рестрикционных сайтов для встраивания рассматриваемого ДНК-сегмента. Такими типичными векторными плазмидами являются рИС8, рИС9 и рВР329, поставляемые Вюгаб ЬаЬога!ог1ек, (Шсйтопб, СА) и рРЬ и рКК223-3, поставляемые от РЬагтас1а, Р1кса!атеау, ΝΣ.
Типичные векторы, используемые для экспрессии генов в клетках высших растений и млекопитающих, хорошо известны специалистам, и такими векторами являются растительные векторы, происходящие от опухоль-индуцирующей плазмиды (Т1) АдгоЬас!егшт !итеГааепк и описанные Яодегк е! а1., (1987) Ме111. т ЕпхутоЕ 153:253-277; экспрессирующие векторы млекопитающих, вышеупомянутый вектор рКЗУ-10 и рСЕпео (Рготеда Согр., # Е1841, Маб1коп, ^Ι). Однако известно, что имеется несколько других систем экспрессирующих векторов, которые функционируют в растениях, включая вектор регуляции переноса рСаМУСЫ, описанный в работе Еготт е! а1., (1985) Ргос. №!1. Асаб. ЗсЕ ИЗА, 82:5824. Плазмида рСаМУСЫ (поставляемая от Рйагташа Р1кса!атеау, ΝΣ) включает промотор вируса мозаики цветной капусты СаМУ 35З.
Вышеуказанные системы экспрессии в растениях обычно обеспечивают системную или конститутивную экспрессию встроенного трансгена. Системная экспрессия может быть осуществлена в том случае, когда большинство или все растения используются как источник для рассматриваемой химерной молекулы или полученных частиц, или в том случае, когда большая часть растения используется для получения пероральной вакцины. Однако более эффективной может оказаться экспрессия химерной молекулы или частицы в запасающем органе растения, таком как корень, семена или плоды, из которых указанные частицы могут быть легко выделены или гидролизованы.
Один из способов достижения экспрессии в запасающем органе заключается в использовании промотора, который экспрессирует регулируемый им ген в одном или нескольких предварительно выбранных или предварительно определенных органов растения, в которых не происходит фотосинтеза. Экспрессия в одном или нескольких предварительно выбранных запасающих органах при незначительной экспрессии или при отсутствии экспрессии в других органах, таких как корни, семена или плоды в отличие от листьев или стеблей, рассматривается здесь как повышенная или преимущественная экспрессия. Характерный промотор, который регулирует экспрессию в одном или нескольких предварительно выбранных органах по сравнению с другими органами в отношении по крайней мере 5:1, определяется здесь как промотор, усиливающий экспрессию в данном органе. Экспрессия, происходящая, в основном, только в одном запасающем органе и, в основном, не происходящая в других запасающих органах, называется орган-специфической экспрессией, то есть отношение продуктов экспрессии в данном запасающем органе к продуктам экспрессии в другом запасающем органе, составляющие примерно 100:1 или более, указывает на специфичность экспрессии в данном органе. Таким образом, промоторы, специфиче- 25 006207 ские в отношении экспрессии в запасающем органе, являются членами класса промоторов, усиливающих экспрессию в запасающем органе.
Примерами запасающих органов растения являются корни моркови, таро или маниоки, клубни картофеля и мякоть фруктов, таких как красная гуава, маракуйя, манго, папайя, томаты, авокадо, вишня, танжерин, мандарин, пальма, дыни, такие как канталупские дыни, и арбузы, а также другие мясистые плоды, такие как американская тыква, огурцы, манго, абрикосы, персики и семена маиса (кукурузы), сои, риса, масличного рапса и т.п.
Промотор СаМV 358 обычно считается конститутивным промотором. Однако недавно проведенные исследования показали, что 21 п.н.-область промотора СаМV 358, при ее функциональном присоединении к другому гетерологичному обычному промотору зеленой ткани, промотору гЬс8-3А, может превращать полученный химерный промотор в промотор, усиливающий экспрессию в корнях. Эта 21 п.н.последовательность описана в патенте США № 5023179. Химерный промотор гЬс8-3А, содержащий 21 п.н.-вставку, как описано в патенте США № 5023179, используется здесь как промотор, усиливающий экспрессию в корнях.
Аналогичным промотором, усиливающим экспрессию в корнях, который включает вышеуказанный 21 п.н.-сегмент, является область от -90 до +8 самого промотора СаМV 358. В патенте США № 5110732 указано, что усеченный промотор СаМV 358 обеспечивает повышенную экспрессию в корнях и прикорневом семени, то есть ткани, превращающейся в корень. Этот промотор также используется в настоящем изобретении.
Другим подходящим усиливающим экспрессию в корнях промотором является промоторная область от -1616 до -1 гена семян масличного рапса (Вгаккюа парик Ь.), описанного в ΡΟΓ/6Β 92/00416 (\У0 91/13922, опубликованная 19 сент. 1991). Штамм ΌΗ5α Е.сой, содержащий плазмиду рК1атЬ6.а84, и бактериофаг лямбда.бета.1, который содержит этот промотор, были депонированы в Национальной коллекции промышленных и морских бактерий (№11юпа1 Со11есйоп оГ !пИик(г1а1 апб Маппе Вас!епа, ΑЬе^άееη, 6В) 8 марта 1990 и имеют регистрационные номера NСIМΒ40265 и NСIМΒ40266. Используемая часть этого промотора может быть получена как 1,0 т.п.н.-фрагмент путем расщепления этой плазмиды ферментом НаеШ.
Предпочтительным промотором, усиливающим экспрессию в корнях, является промотор маннопинсинтазы (так), присутствующий в плазмиде рКап2, описанной ΌίΒίΙη & 6еМп (1987) Мо1. 6еп. 6епе1., 207:233-241. Этот промотор может быть удален из плазмиды рКап2 в виде ХЬаВХ.ЬаП-фрагмента.
Предпочтительный корнеспецифический промотор маннопин-синтазы состоит из сердцевинной области промотора маннопин-синтазы (так), простирающейся до положения -138, и активатора маннопинсинтазы, простирающегося от положения -318 до положения -213, и называется в целом ΑтакΡтак. Было обнаружено, что этот промотор способствует увеличению экспрессии в корнях табака примерно в 10-100 раз по сравнению с уровнями экспрессии в листьях.
Другим корнеспецифическим промотором является 5'-фланкирующая последовательность длиной примерно из 500 п.н., за которой следует ген богатого гидроксипролином гликопротеина, ΗΒ6Ρΐ'ΐΐ3, экспрессируемый в процессе образования боковых корней и описанный у Ке11ег е! а1. (1989) 6епек Эеу. 3:1639-1646. Другой предпочтительный корнеспецифический промотор присутствует в 5'-фланкирующей области корнеспецифического гена табака ТоКВЕ, в положении примерно от -636 до -1, как описано УататоЮ е! а1. (1991) ΡΕ-ιτιΙ. Се11.. 3:371-381. Цис-действующие элементы, регулирующие экспрессию, находятся, как более точно определено этими авторами, в области примерно от -636 до -299 со стороны 5'конца от сайта инициации транскрипции. УататоЮ е! а1. описали стабильное продуцирование мРНК из гена ТоКВЕ в корнях, но не в листьях, не в меристемах побегов и не в стеблях.
Еще одним подходящим промотором, специфичным для запасающих органов, являются 5'- и 3'фланкирующие области гена созревания плодов Е8 томатов, Ьусорегкюоп екси1еп1ит. Эти области и их кДНК-последовательности проиллюстрированы и описаны в работе Ое1ктап е! а1. (1988) ЕМВ0 1., 7 (11):3315-3320 и (1992) Ρ^ΐ ΡЬу8^о1., 100:2013-2017.
Очевидно, что экспрессию гена Е8 регулируют три области, локализованные в 5'-фланкирующей последовательности этого гена, длиной 2181 п.н., и в 522 п.н.-последовательности со стороны 3'-конца от сайта добавления ро1у(А). Одна область, простирающаяся от -2181 до -1088, требуется для активации транскрипции гена Е8 в незрелом плоде в присутствии этилена, а также способствует транскрипции в процессе созревания. Две другие области, от -1088 до -863 и от -409 до -263, неспособны сообщать восприимчивость к этилену в незрелом плоде, но являются достаточными для экспрессии гена Е8 в процессе созревания.
Сообщалось, что промотор сахарозосинтазы 1 (811) кукурузы, который экспрессирует высокие уровни контролируемого им фермента в эндосперме, но гораздо более низкие уровни в корнях и не экспрессирует этот фермент в зеленых тканях или в пыльце, специфически экспрессирует химерный ген репортера, бета-глюкуронидазы (6υ8), в клетках флоэмы табака, которые находятся в избыточном количестве в стеблях и корнях. Уаид е! а1. (1990) Ργθο. Αсаά. 8ск υ8Α., 87:4144-4148. Таким образом, этот промотор может быть использован в органах растений, таких как мясистые плоды, например дыни,
- 26 006207 то есть канталупские дыни, или семян, которые содержат эндосперм, и корни, которые имеют высокие уровни клеток флоэмы.
Другим примером тканеспецифического промотора является промотор лектина, который обладает специфичностью к тканям семян. Этот лектиновый белок в семенах сои кодируется одним геном (Ье1), который экспрессируется только во время созревания семян и обеспечивает примерно 2-5% от общего уровня мРНК семян. Ген лектина и семяспецифический промотор были полностью охарактеризованы и использованы для прямой семяспецифической экспрессии в трансгенных растениях табака. См. например, Уобкш е! а1. (1983) Се11, 34:1023 аиб Ьшбйтот е! а1. (1990) Эеуе1ортеп1а1 Сеиебск, 11: 160.
Особенно предпочтительным клубнеспецифическим экспрессирующим промотором является 5'фланкирующая область гена пататина картофеля. Использование этого промотора описано в работе Т\се11 е! а1. (1987) Р1ап!. Мо1. Бю1., 9:365-375. Этот промотор присутствует во фрагменте бактериофага ЕРОТ1, длиной примерно из 406 п.н. Промотор БРОТ1 включает области, имеющие более чем 90процентную гомологию с четырьмя другими промоторами пататина, и примерно 95-процентную гомологию на протяжении всех 400 оснований с промотором пататина РСТ5. Каждый из этих промоторов может быть использован в настоящем изобретении. См. также \Уепх1ег е! а1., (1989) Р1ап1 Мо1. Бю1., 12:4150.
Еще один промотор, усиливающий экспрессию в данном органе, и органспецифический промотор описан ВепРеу е! а1. (1988) 8с1епсе, 244:174-181.
Ни на одну из используемых промоторных последовательностей, в основном, не влияет количество химерных молекул или частиц в клетке. Используемый здесь термин в основном, не влияет означает, что данный промотор не является восприимчивым к прямому торможению по типу обратной связи (ингибированию) химерными молекулами или частицами, аккумулированными в трансформированных клетках или в трансгенных растениях.
Трансфекцию растительных клеток с использованием АдтоЬас!етшт !итеРас1епк обычно лучше всего осуществлять на двудольных растениях. Однодольные растения обычно наиболее легко трансформируются путем так называемого прямого переноса гена протопластов. Прямой перенос гена обычно осуществляют путем электропорации, путем опосредуемого полиэтиленгликолем переноса или путем бомбардировки клеток микрочастицами, несущими нужную ДНК. Эти методы трансфекции хорошо известны специалистам и не обсуждаются в настоящем описании. Методы регенерации целых растений из трансфицированных клеток и протопластов также хорошо известны специалистам, как и методы получения нужного белка из ткани растений. См. также патенты США №№ 5618988 и 5679880 и указанные там ссылки.
Трансгенное растение, получаемое методами трансформации АдгоЬас!етшт, электропорации или другими методами, обычно содержит один ген на одной хромосоме. Такие трансгенные растения могут называться гетерозиготными по добавленному гену. Однако, поскольку использование термина гетерозиготный обычно подразумевает присутствие комплементарного гена на том же самом локусе второй хромосомы из данной пары хромосом, то очевидно, что при отсутствии такого гена в растении, содержащем один добавленный ген, как в данном случае, было бы более точным назвать такое растение независимым сегрегантом, так как добавленный экзогенный ген, кодирующий химерную молекулу, независимо сегрегируется в процессе митоза и мейоза. Предпочтительным трансгенным растением является трансгенное растение, содержащее промотор, усиливающий экспрессию в данном органе и регулирующий один структурный ген, кодирующий рассматриваемую химерную молекулу НВс, то есть независимый сегрегант.
Более предпочтительным является трансгенное растение, гомозиготное по добавленному структурному гену, то есть трансгенное растение, которое содержит два дополнительных гена, по одному гену в одном и том же локусе на каждой хромосоме из пары хромосом. Гомозиготное трансгенное растение может быть получено путем самоопыления трансгенного растения, являющегося независимым сегрегантом и содержащего один добавленный ген, с последующим проращиванием некоторых продуцированных семян и анализом полученных растений на повышенную аккумуляцию химерных частиц по сравнению с контрольным (нативным, нетрансгенным) растением или с трансгенным растением, являющимся независимым сегрегантом. Гомозиготное трансгенное растение, по сравнению с нативным нетрансгенным растением и с трансгенным растением, являющимся независимым сегрегантом, обнаруживает повышенную аккумуляцию химерных частиц.
Следует отметить, что можно также скрещивать два различных трансгенных растения с продуцированием потомства, которое содержит два добавленных независимо сегрегирующихся экзогенных (гетерологичных) гена. Самоопыление соответствующего потомства может приводить к продуцированию растений, которые являются гомозиготными по обоим добавленным экзогенным генам, кодирующим химерную молекулу НВс. Могут быть также рассмотрены возвратное скрещивание с родительским растением и ауткроссинг с нетрансгенным растением.
Таким образом, трансгенное растение настоящего изобретения имеет гетерологичный структурный ген, кодирующий рассматриваемую химерную молекулу НВс. Предпочтительным трансгенным растением является независимый сегрегант по добавленному гетерологичному химерному структурному гену
- 27 006207
НВс, который может передавать этот ген потомству. Более предпочтительным трансгенным растением является растение, гомозиготное по гетерологичному гену и способное передавать этот ген всему потомству после полового скрещивания.
Поскольку ген, который кодирует химерную молекулу НВс, не встречается в нативных растениях, то рассматриваемое трансгенное растение аккумулирует частицы химерной молекулы НВс в количестве, превышающем количество этих частиц в нетрансформированном растении такого же типа или линии, если оба этих растения были выращены в одних и тех же условиях.
Используемые здесь термины тот же самый тип или та же самая линия означает растение того же самого кросса, что и клон ^трансформированного растения. Если аллельные вариации между сибсами данного кросса являются незначительными, как в случае в высокой степени инбредного растения, то могут быть проведены сравнения между сибсами или выведено среднее, полученное с использованием нескольких сибсов. И в тех, и в других случаях клоны являются предпочтительными для сравнения.
Семена от трансгенного растения выращивают в теплицах, на подоконниках или т.п., и полученные зрелые трансгенные растения подвергают самоопылению с продуцированием генетически чистых растений. Потомство от этих растений дает генетически чистые линии, которые оценивают на аккумуляцию химерных молекулярных частиц НВс, предпочтительно, в открытом поле при ряде различных условий окружающей среды.
Трансгенное растение, гомозиготное по аккумуляции частиц химерной молекулы НВс, скрещивают с родительским растением, имеющим другие желательные признаки. Потомство, которое является гетерозиготным или независимо сегрегируемым по аккумуляции частиц химерной молекулы НВс, подвергают возвратному скрещиванию с одним или с другим родителем с получением трансгенных растений, которые обнаруживают аккумуляцию частиц химерной молекулы НВс и другие нужные признаки. Возвратное скрещивание потомства с родителем можно повторять более чем один раз с получением трансгенного растения, которое обладает рядом желательных признаков.
Для экспрессии НВс-химеры может быть использована клеточная система насекомых. Так, например, в одной такой системе вирус нуклеарного полиэдроза Аи!одгарйа саНГогшса (Ас№'У) или бакуловирус используют в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках 8ройор!ега Ггид1рейга или 1лсйор1ик1а 1агуае.
Последовательности, кодирующие химеру, могут быть клонированы в неосновную область вируса, такую как ген полиэдрина, и помещены под контроль промотора полиэдрина.
Последующее встраивание химерной последовательности делает ген подиэдрина неактивным и приводит к продуцированию рекомбинантного вируса, не содержащего белка оболочки. Затем рекомбинантные вирусы используют для инфицирования, например, клеток 8. Ггид1рейга или 1лсйор1ик1а 1агуае, в которых может быть экспрессирована НВс-химера. Е. Епде1йагй е! а1., (1994) Ргос. Асай. 8с1. И8А, 91:3224-3227 апй V. Ьискоте, Шкес! Се11 Ехргеккюп Тесйпо1оду, рр. 183-218, ш Рго!еш Епдтеегшд: РгшсЕ р1ек апй Ргасйсе, ЬЕ С1е1апй е! а1. ейк., ^11еу-Ь1кк, Шс. 1996). Гетерологичные гены, помещенные под контроль промотора полиэдрина вируса нуклеарного полиэдроза Аи!одгарйа сайГогшса (Ас№^, часто экспрессируются на высоких уровнях на поздних стадиях инфицирования.
Рекомбинантные бакуловирусы, содержащие указанный химерный ген, конструируют с использованием системы бакуловирусных челночных векторов |Ьиско\у е! а1., (1993) 1. νίΐΌ1., 67:4556-4579], коммерчески доступных в виде экспрессирующей системы бакуловирусов Вас-То-Вас™ (Ь1Ге Тесйпо1од1ек). Получают биомассу рекомбинантных вирусов и мониторинг экспрессии рекомбинантного белка проводят в соответствии со стандартными протоколами (0'ВеШу е! а1., Васи1оу1гик Ехргеккюп Vес!ο^к: А ЬаЬога!огу Мапиак XV. Н. Ргеетап апй Сотрапу, №\ν Уогк, 1992; апй Ктд е! а1., Тйе Васи1оу1гик Ехргеккюп 8ук!ет: А ЬаЬога!огу Сшйе, Сйартап & На11, Ьопйоп, 1992).
Для функционального присоединения ДНК к векторам посредством комплементарных липких концов или тупых концов были разработаны различные методы. Так, например, для встраивания в векторную ДНК, к ДНК-сегменту могут быть добавлены комплементарные гомополимерные хвосты. Затем вектор и ДНК-сегмент соединяют посредством водородной связи между комплементарными гомополимерными хвостами с образованием рекомбинантных молекул ДНК.
Альтернативно, синтетические линкеры, содержащие один или несколько рестрикционных эндонуклеазных сайтов, могут быть использованы для присоединения ДНК-сегмента к экспрессирующему вектору, как описано выше. Эти синтетические линкеры присоединяют к затупленным по концам ДНКсегментам путем инкубирования этих затупленных по концам ДНК-сегментов с большим избытком синтетических линкерных молекул в присутствии фермента, способного катализировать лигирование затупленных по концам молекул ДНК, такого как ДНК-лигаза бактериофага Т4.
Таким образом, продуктами указанной реакции являются ДНК-сегменты, несущие у своих концов синтетические линкерные последовательности. Затем, эти ДНК-сегменты расщепляют соответствующей рестриктионной эндонуклеазой и лигируют в экспрессирующий вектор, который расщепляют ферментом, продуцирующим концы, совместимые с концами этого синтетического линкера. Синтетические линкеры, содержащие ряд рестрикционных эндонулеазных сайтов, могут быть закуплены у ряда фирм, включая №\ν Епд1апй Вю1аЬк, Веуег1у, МА. Нужный ДНК-сегмент может быть также получен с исполь- 28 006207 зованием ПЦР-технологии, где прямой и обратный праймеры содержат нужные рестрикционные сайты, которые после амплификации могут быть разрезаны так, чтобы указанный ген мог быть встроен в данный вектор. Альтернативно, ПЦР-продукты могут быть непосредственно клонированы в векторы, содержащие выступающие Т-участки (Рготеда Согр., А3600, Майкоп, XVI), как хорошо известно специалистам.
Экспрессированный химерный белок подвергается самосборке с образованием частиц в клеткаххозяевах, независимо от того, является ли хозяином одна клетка или многоклеточный организм. Клетки, содержащие эти частицы, собирают в соответствии со стандартными процедурами, и эти клетки подвергают лизису с использованием камеры пресса Френча, лизоцима, ультразвукового аппарата, бисерной дробилки или микрофлюидизатора (Мкгойшбкк Согр., №\\1оп МА). После осветления лизата, частицы осаждают 45% сульфатом аммония, ресуспендируют в 20 мМ фосфате натрия, рН 6,8, и диализуют против того же самого буфера. Этот диализованный материал осветляют путем быстрого центрифугирования и полученный супернатант подвергают гель-фильтрации на сефарозе® СЬ-4В. Фракции, содержащие частицы, идентифицируют, подвергают хроматографии на гидроксиапатитах и повторно осаждают сульфатом аммония, а затем ресуспендируют, диализуют, подвергают стерильной фильтрации и хранят при -70°С.
Конъюгаты НВс-химеры
Любой гаптен, против которого желательно продуцировать В-клеточный или Т-клеточный ответ, может быть присоединен к рассматриваемой НВс-химере или к химерной частице, такой как химерная частица, содержащая гетерологичный линкерный остаток, такой как лизин, глутаминовая или аспарагиновая кислота, цистеин или тирозин, в области петли домена II, и добавленный цистеиновый остаток в домене IV, с получением конъюгата НВс-химеры. Представляющим интерес гаптеном обычно является В-клеточный иммуноген. Таким гаптеном может быть полипептид, углевод (сахарид, то есть олиго- или полисахарид), или неполипептид, неуглеводное химическое соединение, такое как 2,4-динитробензол, или лекарственное средство, такое как кокаин или никотин. Полученный таким образом конъюгат НВсхимерной частицы, может быть использован в качестве инокулята или вакцины, как обсуждается ниже. Поскольку указанный химерный белок подвергается самосборке при экспрессии, а конъюгат образуется после экспрессии, то образование конъюгата обычно происходит с использованием собранных частиц, а не свободных молекул белка.
Методы функционального присоединения отдельных гаптенов к белку или полипептиду посредством боковой цепи аминокислотных остатков белка или полипептида с образованием связанного через боковые группы иммуногенного конъюгата, например полипептидного полимера с разветвленной цепью, хорошо известны специалистам. Такими методами являются присоединение посредством функциональных групп одного или нескольких типов, присутствующих на различных боковых цепях, и получения, в результате этого, полипептидного остова белка-носителя (в данном случае НВс-химеры) в этой частице, которая присоединена через боковую цепь, то есть ковалентно присоединена (связана), с гаптеном, но отделена по крайней мере одной боковой цепью.
Методы присоединения белков-носителей к гаптенам с использованием каждой из вышеуказанных функциональных групп описаны в работе Ег1апдег (1980) Ме!йоб о£ Епгуто1оду, 70:85; Аигатеак е1 а1., (1978) 8сапб. I. Iттипо1., ^1. 8, 8ирр1. 7, 7-23 и в патенте США № 4493795, №к1ог е1 а1. Кроме того, реакция сайт-направленного присоединения, описанная в работе ЯобтееП е1 а1. (1985) Вю1ес11., 3:889-894, может быть осуществлена так, чтобы не наблюдалось значительного снижения биологической активности указанных полипептидов.
Кроме того, как известно специалистам, белок НВс и полипептидный гаптен могут быть использованы в своей нативной форме либо их функциональные группы могут быть модифицированы путем сукцинилирования лизиновых остатков или посредством реакции с цистеином-тиолактоном. Сульфгидрильная группа может быть также включена либо в белок-носитель, либо в конъюгат посредством реакции функциональных аминогрупп с 2-иминотиоланом, Ν-гидроксисукцинимидоэфиром 3-(3-дитиопиридил) пропионата или с другими реагентами, известными специалистам.
Для облегчения присоединения к боковой группе указанные НВс-химера или гаптен могут быть также модифицированы так, чтобы они включали спейсерное плечо, такое как гексаметилендиамин или другая бифункциональная молекула. Такая процедура обсуждается ниже.
Методы ковалентного связывания полипептидного гаптена сильно варьируются и хорошо известны специалистам в области иммунологии. Так, например, в соответствии с патентом США № 4818527 метамалеимидобензоил-Ы-гидроксисукцинимидоэфир (Κ',’Ν Вюсйетка1к, Шс., Сок!а Мека, СА) либо сукцинимидил-4-(Кмалеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (8МСС, Р1егсе С11ет1са1 Со., Яоск&гб, ГО) подвергают реакции с соответствующей НВс-химерой, в результате чего образуется активированный носитель.
Затем этот активированный носитель подвергают реакции с гаптеном, таким как терминированный сульфгидрилом гаптен или полипептид, который либо содержит концевой цистеин, либо к которому присоединен дополнительный амино- или карбоксиконцевой цистеиновый остаток, в результате чего образуется ковалентно связанный конъюгат НВс-химеры. В качестве альтернативного примера, амино- 29 006207 группа полипептидного гаптена может быть сначала подвергнута реакции с №сукцинимидил-3-(2пиридилтио)пропионатом (8ΡΌΡ, РНагтаФа, Р1кса!аетау, N1), а затем этот тиолсодержащий полипептид может быть подвергнут реакции с активированным носителем после восстановления. Разумеется, что серусодержащая часть и акцептор Михаэля, содержащий двойную связь, могут быть подвергнуты обратимой реакции. Эти реакции описаны в инструкциях поставщиков, а также у Кйадаета е! а1. (1976) I. Вюсйет., 79:233 и у Ьасйтапп е! а1., 1986 ЗупШейс Рерйбек ак Апйдепк, (С1Ьа РоипбаНоп Зутрокшт 119), рр.25-40 (^Неу, СЫсЬек!ег: 1986).
В патенте США № 4767842 описаны несколько методов ковалентного связывания носителя с полипептидом, которые используются в настоящем изобретении. В одном из этих методов, толилендиизоцианат подвергают реакции с носителем в забуференном диоксаном растворителе при температуре 0°С с получением активированного носителя. Затем полипептидный гаптен смешивают и подвергают реакции с активированным носителем с образованием ковалентно связанного конъюгата НВс-химеры.
В частности, может быть использовано большое число гетеробифункциональных агентов, которые образуют дисульфидную связь у одного конца функциональной группы и амидную связь у другого ее конца, включая №сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (8РБР), как описано выше, и которые образуют дисульфидную связь с тиолом либо в НВс-химере, либо в гаптене. Примерами реагентов являются цистеиновый остаток в полипептидном гаптене и амин на партнере по связыванию, таком как εамин лизина или другая свободная аминогруппа в белке-носителе. Варианты таких дисульфид/амидобразующих агентов известны специалистам. См., например, Iттиη. Кеу. (1982) 62:185.
Другие бифункциональные связывающие агенты образуют тиоэфирную, а не дисульфидную связь. Многие из этих тиоэфиробразующих агентов являются коммерчески доступными и представляют собой реакционноспособные сложные эфиры 6-малеимидокапроновой кислоты, 2-бромуксусной кислоты, 2иодуксусной кислоты, 4-(№малеимидометил)циклогексан-1-карбоновой кислоты и т.п. Карбоксильные группы могут быть активированы путем их объединения с сукцинимидом или натриевой солью 1гидрокси-2-нитро-4-сульфоновой кислоты. Особенно предпочтительным связывающим агентом способа настоящего изобретения является сукцинимидил-4-(№малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (8МСС), поставляемый от Р1егсе Сйет1са1 Со., КоскГогб, Ш. Вышеприведенный список не является исчерпывающим, и очевидно, что могут быть использованы модификации указанных соединений. На фиг. 6 схематично проиллюстрированы (схема 1) получение активированного носителя НВс с использованием 8МСС (I) и последующая реакция этого активированного носителя с гаптеном, на конце которого находится сульфгидрил (II).
Полипептидный гаптен может быть получен различными путями, хорошо известными специалистам. При этом может быть легко использована обычная техника пептидного синтеза. Так, например, для продуцирования более длинных пептидов может быть использована техника рекомбинантных ДНК и ПЦР-технология. Поскольку нужные последовательности обычно являются относительно короткими, то может быть использован твердофазный химический синтез.
Примеры полипептидных гаптенов представлены выше в таблицах А и В. Каждый из этих полипептидов может быть присоединен посредством своей ^концевой аминогруппы или с использованием дополнительного ^концевого цистеина, который не показан в таблице.
Аналогичные подходы используют для связывания так называемых химических соединений с белками-носителями. Обычно для связывания химического соединения используют его соответствующую функциональную группу. Примером химического гаптена, индуцированные антитела против которого защищают от инфекции 8!гер!ососсик рпеитошае, является гидроксигексаноат 6-0-фосфохолина. Р1ксйег е! а1. (1995) I. Тттипо1., 154:3373-3382. В нижеприведенной таблице представлены другие примеры химических гаптенов.
Химические гаптены
Химический гаптен Литература
Ν-оксид пиперидина патент США № 5304252
Фосфолактон или лактамид патент США № 5248611
Комплексы ионов металла патент США № 5236825
Бициклические соединения [2.2.1] или [7.2.2] патент США № 5208152
Гидроксил-содержащие ионные соединения патент США № 5187086
Фосфонатные аналоги сложных эфиров карбоновых кислот патент США № 5126258
Аналоги кокаина Саггега еб а1.,(1995) йабиге 378:725
- 30 006207
Специалистам известно множество методов связывания белков-носителей с полисахаридами. Альдегидные группы могут быть получены либо на редуцированном конце [Апдегкоп (1983) ЫГес!. !ттпп., 39:233-238; 1ептп§к е! а1. (1981) I. !ттипо1., 127:1011-1018; Рогеп е! а1. (1985) Мо1. !ттипо1., 22:907919], либо на терминальном конце [Апдегкоп е! а1., (1986) I. !ттипо1., 137:1181-1186; Веиуегу е! а1. (1986) □ее. Вю. 8сапд., 65:197-204] олигосахарида или относительно небольшого полисахарида, который может быть присоединен к белку-носителю посредством восстановительного аминирования.
Более крупные полисахариды могут быть конъюгированы либо путем концевой активации [Апдегкоп е! а1., (1986) I. !ттипо1., 137:1181-1186], либо путем произвольной активации нескольких функциональных групп на полисахаридной цепи [СНи е! а1., (1983) I пГеск !ттпп., 40:245-256; Оогдоп, патент США № 4619828 (1986); МагЪигд, патент США № 4882317 (1989)]. Произвольная активация нескольких функциональных групп на полисахаридной цепи может приводить к образованию конъюгата, который является в высокой степени сшитым вследствие случайного образования связей по всей полисахаридной цепи. Оптимальное отношение полисахарида к белку-носителю зависит от конкретно используемого полисахарида, белка-носителя и конъюгата.
Подробный обзор методов конъюгирования сахаридов с белками-носителями можно найти в работах О1ск е! а1.. Соп!лЪи!юпк !о М1сгоЪю1оду апй !ттппо1оду, Уо1. 10, Сгике е! а1., ейк., (8. Кагдег: 1989), рр. 48-114; 1ептп§к е! а1., Йео§1усосоп]ида!ек: Ргерагайоп апй АррНсайопк, Ьее е! а1., ейк., (Асадетю Ргекк: 1994), рр. 325-371; Ар1т е! а1., (1981) СКС Сгй. Кеу. ВюсНет., 10:259-306; и 8!оме11 е! а1. (1980) Аду. СагЪоНудг. СНет. ВюсНет., 37:225-281.
Сам углевод может быть синтезирован методами, известными специалистам, например путем ферментативного синтеза гликопротеинов, как описано \\д11е' е! а1. (1997) I. Ат. СНет. 8ос., 119:2114-2118.
Некоторые синтетические, полусинтетические и природные олигосахариды обсуждаются в нижеследующих разделах, где приводятся примеры олигосахаридов, которые используются как гаптены для получения НВс-конъюгата настоящего изобретения.
Олигосахаридный гаптен, подходящий для получения вакцин для лечения гриппа, вызываемого вирусом НаеторНПик 1п11пеп/ае типа Ъ (Н1Ъ), состоит из 2-20 повторов Ώ-рибозо-В-рибитолфосфата (I, см. ниже), Ώ-рибитолфосфат-О-рибозы (II, см. ниже), или фосфат-П-рибозо-Э-рибитола (III, см. ниже). Едиагд С. Веиуегу е! а1., ЕР-0276516-Р1.
В патенте США № 4220717 также описан полирибозилрибитолфосфат (РКР), используемый в качестве гаптена, защищающего от НаеторНдик 1п11пеп/ае типа Ъ.
В работе Ре!егкоп е! а1. (1998) ЫГес!. Iттип., 66(8):3848-3855, описан трисахаридный гаптен, аКдо(2 8)аКдо(2 4)аКдо, который обеспечивает защиту от СН1атуд1а рпеитотае. СН1атуд1а рпеитотае вызывает респираторные инфекции у человека от фарингита до пневмонии с летальным исходом. Кдо представляет собой 3-дезокси-О-манно-окт-2-улозоновую кислоту.
В работе Апдегккоп е! а1., ЕР-0126043-А1 описаны сахариды, которые могут быть использованы для лечения, профилактики или диагностики бактериальных инфекций, вызываемых 8!гер!ососсик рпеитотае. Один класс используемых сахаридов происходит от дисахарида О1сЙАсв1 3Оа1. Апдегккоп е! а1., также сообщали об использовании неолактотетраозилкерамида, который представляет собой Οη1β1 4О1сЙАсв1 3Оа1в1 4О1с-Сег.
МсКеппеу е! а1., (1999) 8с1епсе, 284:1523-1527 описывают полисахарид, поли-Й-сукцинил β1 6О1сЙ (РЙ8О), который обеспечивает защиту от 8!арНу1ососсик аигеик. 8. аигеак является общим возбудителем наиболее распространенных инфекций, включая эндокардит, остеомиелит, септический артрит, пневмония и абсцессы.
В Европейском патенте № 0157899-В1, описание которого вводится в настоящее описание посредством ссылки, описано выделение пневмококковых полисахаридов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении. В нижеследующей таблице перечислены типы пневмоккоковых культур, кото- 31 006207 рые продуцируют капсулярные полисахариды, используемые в настоящем изобретении в качестве гаптенов.
Источники полисахаридных гаптенов
Как сообщалось, Могахе11а (Вгапйате11а) са!аггйа118 вызывает отит среднего уха и синусит у детей и инфекции нижних дыхательных путей у взрослых. Липид А поверхностного липоолигосахаридного антигена (ЬО8) указанной бактерии отщепляется по связи 3-дезокси-О-манно-октулозоновая кислота глюкозамин. Продукт отщепления обрабатывают слабой щелочью для удаления связанных со сложным эфиром жирных кислот, но с сохранением связанных с амидом жирных кислот для получения нетоксичного липополисахарида (бЬО8) из М. са!аггйа118. бЬО8 не является иммуногенным до тех пор, пока он не присоединяется к белку-носителю. Хш-Хшд Си е! а1., (1998) 1п£ес!. 1ттип., 66(5): 1891-1897.
Стрептококки группы В (СВ 8) вызывают сепсис, менингит и родственные неврологические расстройства у человека. Известно, что антитела, специфичные к капсулярному полисахариду, обеспечивают защиту от инфекции у детей. кишпдк е! а1., патент США № 5795580. Повторяющаяся единица капсулярного полисахарида СВ8 типа II представляет собой: 4) -в-Э-С1ср№с-(1 3)-[в-Э-Са1р(1 6)]-в-Э-Са1р (1 4)-в-Э-С1ср-(1 3)-в-Э-С1ср-(1 2)-[а-Э-№ир№с (2 3)]-в-Э-Са1р-(1, где часть, указанная в скобках, представляет собой ветвь, непосредственно соединенную с последующей субъединицей, указанной без скобок. Такой повторяющейся единицей капсулярного полисахарида СВ8 типа У является: 4) -[α-ϋ№ир№с-(2 3)-в-П-Са1р-(1 4)-в-П-С1ср№с-(1 6)]-а-П-С1ср-(1 4)-[в-П-С1ср-(1 3)]-в-П-Са1р-(1 4)-β-ΌС1ср-(1.
В Европейской патентной заявке № ЕИ-0641568-А1, Вгабе, описан метод получения антигена с распределением полос по типу лестницы от Сй1атуб1а !гасйота!18, рпеитошае и р^Шаск
В работе 81оут е! а1., (1999) Ргос. Ν;·ι11. Асаб. 8ск, И8А, 96 (10):5710-5715 описано использование синтетического олигосахарида, д1оЬо Н, связанного с КЬН, используемого в качестве носителя для получения вакцины, направленной против рака предстательной железы. Аналогичным образом, в работе Не11тд е! а1., (1и1у 1995) Сапсег Ве5., 55:2783-2788, описано использование КЬН-связанного СМ2 в вакцине для лечения пациентов с меланомой. Эту последнюю вакцину получают путем расщепления озоном керамидной двойной связи СМ2, введения альдегидной группы и восстановительного алкилирования КЬН. Аналогичная процедура может быть осуществлена с использованием рассматриваемой химерной частицы.
Олигосахаридные части сфинголипидов, таких как глобозиды и ганглиозиды, которые присутствуют на поверхности других опухолевых клеток, а также нормальных клеток, таких как меланома, нейроб- 32 006207 ластома и здоровые клетки головного мозга, могут быть аналогичным образом использованы в настоящем изобретении в качестве гаптена. Олигосахаридная часть глобозида д1оЪо Н имеет структуру: Биса(1 2)-Са1в(1 3)-СаШАсР-(1 3)-Са1а-(1 4)-Са1в-(1 4)С1с, а сахаридные части ганглиозидов СМ2, СМ1 и СС1а имеют следующие структуры: СаШАсР-(1 4)-[№иАса-(2 3) |-Са1[3-(1 4)-С1с; СаЩ-(1 3)-СаШАсР-(1 4)[№иАса(2 3)]-Са1в-(1 4)-С1с; и ХеиАс-(2 3)]-Са1р(1 3)-СаШАсР-(1 4)-[№иАса-(2 3)]-Са1р-(1 4)-С1с соответственно.
В патенте США № 4356170 описано получение нужных полисахаридов, которые восстанавливают, а затем окисляют с получением соединений, имеющих концевые альдегидные группы, которые могут быть подвергнуты восстановительному аминированию с образованием свободных аминогрупп белковносителей, таких как токсоид столбняка или дифтерийный токсоид, со значительной степенью сшивания или без сшивания. Примерами используемых бактериальных полисахаридов являются β-гемолитические стрептококки, НаеторЫ1ик тПиеи/ае, менингококки, пневмококки и Е.соН. Вместо восстановительного аминирования частиц такому аминированию на указанном полисахариде может быть подвергнуто линкерное плечо, такое как плечо, образуемое е-амино-С2-С8-алкилкарбоновой кислотой, с последующим связыванием этого плеча с указанными частицами с использованием водорастворимого карбодиимида.
Инокуляты и вакцины
В другом варианте осуществления изобретения, химерную частицу НВс или конъюгат химерной частицы НВс с гаптеном используют в качестве иммуногена инокулята, который индуцирует Вклеточный или Т-клеточный ответ (стимуляцию) в инокулированном животном-хозяине, такой как продуцирование антител, вступающих в иммунную реакцию с гетерологичным эпитопом или гаптеном, или активация Т-клеток, либо эту частицу или конъюгат используют в качестве вакцины для обеспечения защиты от патогена, от которого происходит указанный гетерологичный эпитоп или гаптен.
Активация Т-клеток может быть измерена различными методами. В обычной практике, животногохозяина инокулируют вакциной или инокулятом, полученными на основе рассматриваемой химерной частицы НВс, а затем собирают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК). Затем эти МКПК культивируют ш νίΙΐΌ в присутствии Т-клеточного иммуногена в течение периода времени примерно от трех до пяти дней. После этого, культивированные МКПК анализируют на пролиферацию или секрецию цитокинов, таких как ГЬ-2, СМ-СЗБ или ΣΡΝ-γ. Анализ на активацию Т-клеток хорошо известен специалистам. См., например, патент США № 5478726 и цитируемые в нем работы.
Что касается образования антитела, описываемого в качестве примера, то рассматриваемый инокулят или вакцина включают иммуногенно эффективное количество химерных частиц НВс или конъюгатов химерных частиц НВс, которые растворяют или диспергируют в композиции фармацевтически приемлемых разбавителей, обычно также содержащей воду. При введении животному-хозяину, нуждающемуся в иммунизации, или животному-хозяину, у которого необходимо индуцировать нужные антитела, такому как млекопитающее (например, мышь, собака, коза, овца, лошадь, корова, обезьяна, примат или человек) или птица (например, курица, индюк, утка или гусь), инокулят индуцирует антитела, иммунореагирующие с конъюгированным (связанным через боковые группы) гаптеном. Предпочтительно эти антитела также связываются с белком или сахаридом В-клеточного иммуногена.
Вакцина представляет собой тип инокулята, в котором гетерологичный В-клеточный эпитоп или конъюгированный гаптен соответствуют части белковой или сахаридной структуры, которая ассоциируется с патологическим состоянием, как, например, малярийная В-клеточная последовательность ассоциируется с малярийным патогеном. Индуцированные вакциной антитела не только вступают в иммунную реакцию с эпитопом или гаптеном или активированные Т-клетки, отвечают на этот гетерологичный эпитоп или гаптен, но также вступают в иммунную реакцию с патогеном или с патологическими клетками ш у1уо и обеспечивают защиту от данного патологического состояния.
Количество рекомбинантного НВс-химерного иммуногена, используемое при каждой иммунизации, означает иммуногенно эффективное количество и может широко варьироваться, в зависимости т!ег а11а, от рекомбинантного НВс-химерного иммуногена, от иммунизованного млекопитающего и от присутствия адъюванта в вакцине, как обсуждается ниже. Иммуногенно эффективное количество вакцины и инокулята обеспечивает протективный эффект или активность антител соответственно, как обсуждается выше.
Вакцины или инокуляты обычно содержат рекомбинантный НВс-химерный иммуноген в концентрации, составляющей примерно от 1 мкг до 1 млг на инокуляцию (разовая доза), а предпочтительно, примерно от 10 до 50 мкг на разовую дозу. Термин разовая доза, относящаяся к вакцине или инокуляту настоящего изобретения, означает физически дискретные единицы, подходящие для введения животным, в качестве унифицированной дозы, при этом каждая единица, содержащая заранее определенное количество активного материала, вычисленное для одного животного или группы животных, вместе с требуемым разбавителем, то есть носителем или наполнителем, продуцирует нужный иммуногенный эффект.
Вакцины или инокуляты обычно получают из выделенного рекомбинантного НВс-химерного иммуногена путем диспергирования иммуногена, предпочтительно, в форме частиц, в физиологически переносимом (приемлемом) разбавителе-носителе, таком как вода, забуференный фосфатом физиологиче- 33 006207 ский раствор (РВЗ), забуференный ацетатом физиологический раствор (АВЗ), раствор Рингера или т.п. с образованием водной композиции. Разбавитель-носитель может также включать маслянистые материалы, такие как арахисовое масло, сквалан или сквален, как обсуждается ниже.
Получение инокулятов и вакцин, которые содержат белковые вещества в качестве активных ингредиентов, также хорошо известно специалистам. Обычно такие инокуляты или вакцины получают в виде парентеральных препаратов либо в виде жидких растворов или суспензий; при этом могут быть также получены твердые формы, подходящие для их растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Этот препарат может быть также эмульгирован и является наиболее предпочтительным.
Иммуногенный активный ингредиент часто смешивают с наполнителями, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с указанным активным ингредиентом. Подходящими наполнителями являются, например, вода, физиологический раствор, декстроза, глицерин, этанол или т.п. и их комбинации. Кроме того, при необходимости, инокулят или вакцина могут содержать небольшие количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие агенты или эмульгаторы, и рНкорректирующие буферы, которые усиливают иммуногенную эффективность указанной композиции.
Рассматриваемая вакцина или инокулят также преимущественно включает адъювант. Адъювантами, подходящими для вакцин или инокулятов настоящего изобретения, являются адъюванты, способные усиливать гуморальный ответ против В-клеточных эпитопов указанной химеры, а также адъюванты, способные усиливать клеточно-опосредованные ответы на Т-клеточные эпитопы, содержащиеся в данной химере. Адъюванты хорошо известны специалистам (см, например. Уассте Оек1дп - Тйе ЗиЬиш! апб Абщуап1 Арргоасй, 1995, Рйагтасеийса1 Вю!есйпо1оду, Уо1ите 6, Ебк. Ротее11, М.Е., апб №тетап М.Е Р1епит Ргекк, №те Υο^к апб Ьопбоп, IЗВN 0-306-44867-Х).
Примерами адъювантов являются полный адъювант Фрейнда (ПАФ), который не используется для человека, неполный адъювант Фрейнда (НАФ), сквален, сквалан и квасцы [например, А1йубгоде1™ (ЗирегГок, Оептагк)], которые представляют собой материалы, хорошо известные специалистам и поставляются различными коммерческими фирмами.
Адъювантами, предпочтительными для использования с иммуногенами настоящего изобретения, являются соли алюминия или кальция (например, гидроксид или соли фосфорной кислоты). Особенно предпочтительным адъювантом для использования в настоящем изобретении является гель гидроксида алюминия, такой как А1йубгоде1™. Для гелей гидроксида алюминия химерный белок смешивают с адъювантом так, чтобы в нем присутствовало 50-800 мкг алюминия, а предпочтительно 400-600 мкг алюминия на дозу.
Другим особенно предпочтительным адъювантом для использования с иммуногеном настоящего изобретения является эмульсия. Рассматриваемой эмульсией может быть эмульсия типа масло в воде или эмульсия типа вода в масле. Как хорошо известно специалистам, помимо иммуногенного химерного белка, такие эмульсии содержат в качестве масляной фазы сквален или сквалан, арахисовое масло или т.п., и диспергирующий агент.
Предпочтительными являются неионогенные диспергирующие агенты, и такими агентами являются эфиры сорбитана и маннида и моно- и ди-С12-С24-жирных кислот, такие как моностеарат сорбитана, моноолеат сорбитана и моноолеат маннида. Иммуногенсодержащую эмульсию вводят в качестве эмульсии.
Предпочтительно, такие эмульсии представляют собой эмульсии типа масло в воде, которые содержат сквален и моноолеат маннида (Аг1асе1™ А), необязательно со скваланом, эмульгированным с химерным белком в водной фазе. Хорошо известными примерами таких эмульсий являются Моп!ашбе™ КА-720 и Моп!ап1бе™ КА-703 (Зеррю, Сак!гек, Егапсе), каждая из которых, как известно, содержит сквалан и сквален, причем в каждой эмульсии преобладает сквален, но в эмульсии Моп!ашбе™ КА-703 он присутствует в меньшей степени. Наиболее предпочтительно использовать Моп!ашбе™ КА-720, при этом отношение масла к воде предпочтительно составляет 7:3 (мас./мас.). Другими предпочтительными адъювантами эмульсии типа масло в воде являются адъюванты, описанные в XV0 95/17210 и ЕР 0399843.
В настоящем изобретении рассматривается также использование небольших молекул адъювантов. Одним из типов используемых здесь небольших молекул адъювантов является 7-замещенный-8-оксоили 8-сульфогуанозиновое производное, описанное в патентах США №№ 4539205, 4643992, 5011828 и 5093318, описание которых вводится в настоящую заявку посредством ссылки. Из этих материалов особенно предпочтительным является 7-аллил-8-оксогуанозин (локсорибин). Было показано, что эта молекула особенно эффективно индуцирует антиген(иммуноген)специфический ответ.
Другими подходящими адъювантами являются монофосфориллипид А (МРЬ), поставляемый от Сопха Согр. (см. патент США № 4987237); СР6, поставляемый от Со1еу Рйагтасеи!юа1 бгоир; фЗ21, поставляемый от Ас.|ш1а Вюрйагтасеи!юа1к, Кс.; ЗВАЗ2, поставляемый от ЗКВ; так называемые мурамилдипептидные аналоги, описанные в патенте США № 4767842 и МЕ59 и поставляемые от СЫгоп Согр. (см. патенты США № 5709879 и 6086901).
Можно также использовать фракции иммунологически активного сапонина, обладающие адъювантной активностью и полученные из коры южноамериканского дерева Ош11е)а Заропапа Мойпа (например, фиб™ А). Производные фиб™ А, например, ОЗ21 (производное ВЭЖХ-очищенной фракции
- 34 006207
ОшТ™ А) и способ их получения описан в патенте США № 5057540. Помимо 0821 (известного как 0А21) были также описаны и другие фракции, такие как 0А17.
3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А является хорошо известным адъювантом, изготавливаемым К1Ь1 1ттипос11ет. НатШоп, Моп!апа. Этот адъювант содержит три компонента, экстрагированных из бактерий: монофосфориллипид А (МРЬ), димиколат трегалозы (ΤΌΜ) и скелет клеточной стенки (С\У8) (МРЬ+ТОМ+С^8), в 2% эмульсии сквален/Твин® 80. Этот адъювант может быть получен методами, описанными в СВ 2122204В. Предпочтительной формой 3-де-О-ацилированный монофосфориллипида А является форма эмульсии, содержащей частицы небольшого размера, диаметром менее чем 0,2 мкм (ЕР 0689454 В1).
Мурамилдипептидными адъювантами являются Ν-ацетилмурамил-Ь-треонил-Э-изоглутамин (!йигМОР), Ν-ацетил-нор-мурамил-Ь-аланил-Э-изоглутамин (ССР 11637, называемый пог-МОР) и Νацетилмурамил-Ь-аланил-О-изоглутаминил-Ь-аланин-2-(1',2'-дипальмитоил-кп-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (ССР) 1983А, называемый МТР-РЕ.
Предпочтительные смеси адъювантов включают комбинации 30-МРЬ и 0821 (ЕР 0671948 В1); эмульсии типа масло в воде, содержащие 3П-МРЬ и 0821 (\УО 95/17210, РСТ/ЕР98/05714); 3П-МРЬ, смешанные с другими носителями (ЕР 0689454В1); 0821, включенные в холестеринсодержащие липосомы (\УО 96/33739); или иммуностимулирующие олигонуклеотиды (\УО 96/02555). Альтернативными адъювантами являются адъюванты, описанные в XVО 99/52549, и некорпускулярные суспензии полиоксиэтиленового эфира (заявка на патент Великобритании № 9807805.8).
Адъюванты используются в количествах, которые могут варьироваться в зависимости от используемого адъюванта, млекопитающего и рекомбинантного НВс-химерного иммуногена.
Обычно, такие количества могут варьироваться в пределах примерно от 1 мкг до 1 мг на иммунизацию. Каждый специалист может легко определить соответствующую концентрацию или количество адъюванта.
Инокуляты и вакцины обычно вводят парентерально путем инъекции, например, подкожно или внутримышечно. Другими композициями, которые являются подходящими для введения другими способами, являются суппозитории, а в некоторых случаях пероральные композиции. Также предусматривается использование для инокуляции интраназальных аэрозолей, обсуждаемых в работе №1гупск е! а1. (Ос!. 1999) №щ.1ге Меб., 5(10):1157-1163. Для суппозиториев в качестве традиционных связующих веществ и носителей могут быть использованы, например, полиалкаленгликоли или триглицериды; и такие суппозитории могут быть получены из смесей, содержащих активный ингредиент в пределах от 0,5 до 10%, а предпочтительно 1-2%. Пероральные композиции включают обычно используемые наполнители, такие как, например, фармацевтические сорта маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, натрийсодержащего сахарина, целлюлозы, карбоната магния и т.п.
Композиции инокулята или вакцины изготавливают в форме раствора, суспензии, таблетки, пилюли, капсулы, препарата или порошка пролонгированного высвобождения, и указанные композиции, в качестве активного ингредиента, содержат иммуногенное эффективное количество НВс-химеры или конъюгата НВс-химеры, предпочтительно, в виде частиц. В типичной композиции, иммуногенное эффективное количество предпочтительной НВс-химеры или частиц конъюгата НВс-химеры составляет примерно от 1 мкг до 1 мг, а более предпочтительно, примерно от 5 до 50 мкг активного ингредиента на дозу, как указано выше.
Обычно вакцину получают в виде композиции для парентерального введения. Например, иммунизацию осуществляют подкожно (8С), внутримышечно (1М), внутривенно (IV), внутрибрюшинно (1Р) или внутрикожно (ГО).
НВс-химерные частицы и конъюгаты НВс-химерных частиц могут быть включены в вакцины в виде нейтральной или солевой формы.
Фармацевтически приемлемыми солями являются кислотно-аддитивные соли (образованные свободными аминогруппами белка или гаптена), образуемые неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, или органическими кислотами, такими как уксусная, щавелевая, винная, миндальная кислоты и т. п. Соли, образованные свободными карбоксильными группами, могут быть также получены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и из органических оснований, таких как изопропиламин, триметиламин, 2этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и т. п.
В другом варианте осуществления изобретения рассматриваются вакцина или инокулят, в которых ген, кодирующий рассматриваемую НВс-химеру, трансфицируют в соответствующим образом аттенюированные кишечные бактерии, такие как 8. 1урЫ, 8.1урЫтигшт, гибриды 8.1урЫтигшт-Е. со11 или Е.со11. Примеры аттенюированных или невирулентных 8. 1урЫ, 8.1ур1птипит и гибридов 8. 1урЫтигштЕ. со11 обсуждаются в цитируемых выше работах. Эти вакцины и инокуляты могут быть, в частности, использованы для лечения заболеваний или инфекций, которые передаются через слизистую носа, кишечник и половые пути, таких как грипп, заболевания, вызываемые дрожжами, такими как Акрегдш11ик и Сапб1ба, заболевания, вызываемые вирусами, такими как полиовирус, ящур, гепатит А, и заболевания,
- 35 006207 вызываемые бактериями, такими как СЬо1ега, 8а1топе11а и Е. сой, при этом помимо или вместо системного [д6-ответа желательно продуцировать ^Α-ответ слизистой.
Кишечные бактерии могут быть лиофилизированы, смешаны с сухими фармацевтически приемлемыми разбавителями, включены в таблетки или капсулы для проглатывания и введены животномухозяину или получены им как обычные твердофазные лекарственные средства. Кроме того, водные препараты таких бактериальных вакцин адаптированы для использования в целях иммунизации слизистой путем перорального, интраназального, ректального или вагинального введения.
Пероральная иммунизация с использованием растительного материала, содержащего рассматриваемые молекулы химерных частиц, может быть достигнута путем простого проглатывания животным ткани трансгенного растения, такой как корень, например, моркови, или семена, например, риса или кукурузы. В этом случае, вода в ротовой полости или в желудочно-кишечном тракте создает водную среду, обычно используемую для иммунизации, а окружающая ткань растения является фармацевтически приемлемым разбавителем.
Инокуляты или вакцины вводят способом, совместимым с лекарственной композицией, и в количестве, которое является терапевтически эффективным и иммуногенным. Вводимое количество зависит от индивидуума, подвергаемого лечению, способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела и от степени нужной защиты. Точное количество активного ингредиента, необходимого для введения, зависит от оценки лечащего врача и является индивидуальным для каждого пациента. Однако, подходящие дозы составляют порядка десяти микрограммов активного ингредиента на одного индивидуума. Подходящие схемы для первичного введения и повторного введения также варьируются, но обычно повторную инъекцию или введение другим способом осуществляют через определенные интервалы времени (недели или месяцы) после первого введения.
После иммунизации млекопитающее выдерживают в течение определенного периода времени, достаточного для того, чтобы рекомбинантный НВс-химерный иммуноген индуцировал вырабатывание достаточного титра антител, которые связываются с представляющим интерес антигеном, таким как спорозоит, используемый для противомалярийной вакцины. Время выдерживания для продуцирования, например, антител против спорозоита обычно составляет в течение примерно от трех до двенадцати недель и может включать бустерную вторую иммунизацию вакциной. Если это необходимо, то может быть также осуществлена третья иммунизация через промежуток времени от 24 недель до пяти лет после первой иммунизации. В частности, предусматривается, что после достижения протективного уровня титра антител у вакцинированного млекопитающего предпочтительно поддерживают достигнутый или почти достигнутый титр антител путем периодических повторных иммунизаций через периоды времени примерно от 1 до 5 лет.
Продуцирование антител против спорозоита или других антител легко устанавливается путем получения образца плазмы или сыворотки от иммунизированного млекопитающего и анализа присутствующих антител на их способность связываться с соответствующим антигеном, таким как синтетический иммунодоминантный антиген, которым является круглый спорозоит [например, используемый здесь С8 пептид ^ΑΜΡ^ белка Р. ГаШрагит], в анализе ΕΟ8Α, описанном ниже или в другом иммуноанализе, таком как Вестерн-блот-анализ, хорошо известный специалистам.
Следует отметить, что индуцированные антитела, такие как анти-С8 антитела, могут быть выделены из крови инокулированного млекопитающего-хозяина хорошо известными методами, а затем включены во вторую вакцину для пассивной иммунизации, также хорошо известной специалистам. Аналогичные методы используются для гамма-глобулиновой иммунизации человека. Так, например, антисыворотка от одного или нескольких иммунизованных хозяев может быть преципитирована в водном сульфате аммония (обычно при 40-50% насыщения), и преципитированные антитела очищают хроматографией, например, аффинной хроматографией, в которой в качестве антигена используют (NΑNΡ)5, иммобилизованный на хроматографической колонке. Так, например, инокулят может быть введен лошади или овце в целях индуцирования вырабатывания антител против малярийных патогенов для использования в пассивной иммунизации другого животного, такого как человек.
В другом варианте осуществления изобретения, настоящее изобретение относится к способу индуцирования антител, активированных Т-клеток, либо того и другого у животного-хозяина, где указанный способ включает стадии инокуляции указанного животного-хозяина инокулятом. Инокулят, используемый в этом способе, включает иммуногенное количество вышеописанной НВс-химерной частицы или ее конъюгата, растворенных или диспергированных в фармацевтически приемлемом разбавителе. Животное-хозяина выдерживают в течение периода времени, достаточного для индуцирования антител или активированных Т-клеток, и этот период времени может быть определен хорошо известными методами и обычно составляет недели или месяцы, что также хорошо известно специалистам. Во время такого периода выдерживания предусматривается проведение множества таких иммунизаций.
Настоящее изобретение проиллюстрировано нижеследующими неограничивающими примерами.
Пример 1. Химерный препарат, содержащий В-клеточный эпитоп.
А. Получение плазмидного вектора р1<1<223-3Н являющегося модифицированной формой рКК223-3.
- 36 006207
Плазмидный вектор рКК223-3 (Рйагтас1а) модифицировали путем введения уникального рестрикционного №о1-сайта для встраивания генов НВс в виде рестрикционных Νθ()Ι-Ι ΙπκΙΙ11-фрагментов и их последующей экспрессии в клетках-хозяевах Е.сой. Для модификации плазмидного вектора рКК223-3 получали новый 8рй1-НтбШ-фрагмент с использованием ПЦР-праймеров рКК223-3/433-452-Р и рКК223^со1-тоб-К, а также рКК223-3 в качестве матрицы. Этот ПЦР-фрагмент разрезали рестриктазами 8рй1 и НтбШ с получением 467 п.н.-фрагмента, который затем лигировали с 4106 п.н.-фрагментом вектора рКК223-3 для эффективного встраивания уникального 480 п.н.-8рй1-НтбШ-фрагмента. Поэтому, полученная плазмида (рКК223-3У) на 13 п.н. короче, чем исходная плазмида, и содержит модифицированную нуклеотидную последовательность, расположенную левее встроенного Жо1-сайта (см. фиг. 1, где пунктирные линии указывают на отсутствие оснований). Конечная плазмида рКК223-3N имела размер 4573 п.н. Рестрикционные сайты в плазмиде рКК223-3N показаны на фиг. 1, а замены в нуклеотидах, внесенные в рКК223-3 для создания плазмиды рКК223-3У подчеркнуты, как показано ниже.
рКК223-3/433-452-Р. СОТССАТССААССАОАТС ЗЕО ΙΟ N0:65 рКК223-Ысо1-тОЙ-К
ОССААОСТТСССАТСссаЬадТТТТТТССТССТТАТОТОАААТТСТТАТССеСТС ЗЕО Ю N0:66
В. Получение клонирующих векторов У1 и У2.
Модифицированные гены НВс 149, которые позволяют осуществлять направленную инсерцию синтетических дцДНК-фрагментов в область иммунодоминантной петли, были сконструированы с использованием ПЦР. [Плазмида, имеющая вставки между аминокислотами Е77 и 078, была обозначена У1, а плазмида, имеющая вставки между 1)78 и Р79, была обозначена У2]. Были амплифицированы две половины гена НВс149 с использованием двух пар ПЦР-праймеров, один из которых амплифицировал аминоконец, а другой амплифицировал карбоксильный конец. Для У1, продуктами ПЦР-реакций (Ν и С-концы) являются оба 246 п.н.-фрагмента; а для У2, указанными продуктами являются 249 п.н. (Ν-конец) и 243 п.н.-фрагмент (С-конец).
Полученные Ν-концевые фрагменты расщепляли ферментами Νθ()Ι и ЕсоК1, а С-концевые фрагменты расщепляли ферментами ЕсоК1 и НтбШ. Затем пары фрагментов У1 и У2 лигировали вместе у общих выступающих ЕсоК1-участков. После этого полученные Νθ()Ι-Ι ΙπκΙΙ11-фрагменты лигировали в вектор рКК223-3У который был получен путем расщепления ферментами Νθ()Ι и НтбШ.
Для вставки В-клеточных эпитопов в плазмиды У1 и У2, эти плазмиды расщепляли рестриктазами ЕсоК1 и 8ас1. Затем встраивали синтетические дцДНК-фрагменты, содержащие выступающие 5'-ЕсоК1-и 3' -8ас1-участки. В обоих случаях, как для У1, так и для У2, пары аминокислот глицин-изолейцин (ЕсоК1) и глутаминовая кислота-лейцин (8ас1), кодируемые рестрикционными сайтами, фланкировали встроенные В-клеточные эпитопы. В праймерах, приведенных ниже, встроенные рестрикционные сайты подчеркнуты.
VI
ΗΒσ149/ΝοοΙ-Ρ ’ -ТТССОССАТОСАСАТССАСССТТА
ЗЕО
НВс-Е77/ЕсоН1
' -ОСООААТТССТТССАААТТААСАСССАСС
ЗЕО
НВс-078/ЕсоН!
5' -СОСОААТТСАААААОАОСТСОАТССАОС5ТСТАСЗАОАС
ЗЕО
НВс14 9/Н1паИ1-К
5' -СССААОСТТАААСААСАСТАаТСТСССКЗААС
ЗЕО
- 37 006207
У2
НВс149/Исо1-Р 1 -ТТОСОССАТСОАСАТССАСССТТА ЗЕО Ιϋ N0:67
НВС-078/ЕСОК1-В ' -ОССЗСААТТССАТСТТССАААТТААСАСССАС ЗЕО Ιϋ N0: 72
НВс-Р79/ЕсоН1-Зас1-Р
5'-СОСОААТТСАААААОАаСТСССАОССТСТАСАОАССТАа
ВЕО Ιϋ N0:73
ΗΒο149/ΗϊηάΙΙΙ-Η '
5’-СССААОСТТАААСААСАОТАОТСТССООААС ЗЕО Ю N0:70
С. Получение клонирующего вектора ν7.
Для присоединения Т-клеточных эпитопов к С-концу НВс-химеры, был сконструирован новый вектор ν7. Для облегчения направленной инсерции синтетических дцДНК в рестрикционные ЕсоВЕНтйШсайты (или ЕсоШ^ай), между валином-149 и НтйШ-сайтом встраивали уникальные ЕсоВЕ и 8асЕ сайты. Для амплификации гена НВс 149, имеющего рестрикционный ^оЕсайт у амино-конца, и ЕсоВЕ, 8асЕ и НтйШ-сайты у карбоксильного конца, использовали пару ПЦР-праймеров, указанных ниже. Продукт ПЦР-реакции (479 п.н.) расщепляли ферментами ^оЕН^т и клонировали в рКК223-3N с получением ν7.
Для встраивания Т-клеточных эпитопов, плазмиду ν7 расщепляли рестриктирующими ферментами ЕсоВЕНтйШ (или Е'соШ^асГ) и синтетические дцДНК-фрагменты, имеющие выступающие ЕсоВЕНтйШ (или ЕсоШ^асХ-участки, лигировали в ν7. Для всех конструкций ν7, конечная аминокислота нативного НВс (валин 149) и первая аминокислота встроенного Т-клеточного эпитопа были разделены дипептидной последовательностью глицин-изолейцин, кодируемой нуклеотидами, которые образуют рестрикционный ЕсоВЕсайт. У эпитопов, встроенных в ЕсоШ^асф имеются дополнительные остатки глутаминовой кислоты/лейцина, которые расположены за Т-клеточным эпитопом, но перед стопкодоном, и которые были введены 8асЕсайтом. В праймерах, приведенных ниже, рестрикционные сайты также подчеркнуты.
НВс149/Исо1-Р
5'-ТТОСОССАТООАСАТСОАСССТТА ЗЕО ΙΌ N0: 67
НВс149/5ас1-ЕсоЕ1-НЗ-В ' -СССААОСТТАОАОСТСТТОААТТССААСААСАОТАОТСТССО
ЗЕО ΙΏ ΝΟ: 75
Ό. Получение экспрессирующих конструкций ν12.
Векторы ν12, которые содержат В-клеточные эпитопы между аминокислотами 78 и 79, а также Тклеточные эпитопы, расположенные правее валина 149, конструировали из векторов ν2 и ν7. Карбоксильный конец вектора ν7, содержащего АТ-клеточный эпитоп, встроенный в ЕсоВЕНтйШ, амплифицировали с использованием двух ПЦР-праймеров (НВс-Р79/8асЕР и рКК223-2/4515-32В), в результате чего получали дцДНК-фрагмент, соответствующий аминокислотам 79-149 плюс Т-клеточный эпитоп, фланкированный рестрикционными 8асЕ и НтйШ-сайтами.
ПЦР-продукты разрезали ферментами 8ай и НтйШ, а затем клонировали в нужный вектор ν2, полученный путем разрезания теми же самыми двумя ферментами. Было показано, что ПЦР-праймеры являются подходящими для амплификации карбоксильного конца всех генов ν7 независимо от того, присутствует ли Т-клеточный эпитоп за аминокислотой 149 гена НВс.
Одним исключением из описанного общего метода является получение конструкций ν12, содержащих мутацию РГ-С8(С17А), которые были получены из уже существующих конструкций ν12. В этом случае, конструкции ν12 амплифицировали с использованием НВй49/NсοI-Р (8ЕО ΙΌ N0:67) и обратного ПЦР-праймера ошибочного спаривания (8ЕО ΙΌ N0:145), которые облегчали образование мутации С17А. Полученный ПЦР-продукт расщепляли ферментами NсοI и НтйШ и снова клонировали в плазмиду рКК223-3N (предварительно разрезанную теми же самыми ферментами). Рестрикционные сайты подчеркнуты.
НВс-Р79/5ас1-Р 5'-СССОАОСТСССАОСОТСТАОАОАССТАО
ЗЕО ΙΠ N0: 76 рКК223-2/4515-32Е 5 ’ -ОТАТСАООСТОААААТС
ЗЕО Ιϋ N0: 77
- 38 006207
Е. В-клеточные эпитопы с С8-повторами Р. Га1с1рагит, встроенные.
в У2 Для конструкций У2 и У7, синтетические дцДНК-фрагменты, кодирующие нужный Вклеточный (У2) или Т-клеточный (У7) эпитоп, встраивали в рестрикционные ЕсоВ1/8ас1-сайты. Синтетические дцДНК-фрагменты, кодирующие нужные В- и Т-клеточные эпитопы, получали путем смешивания комплементарных одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов в эквимолярных концентрациях с последующим нагреванием в течение 5 мин при 95°С, а затем охлаждением до комнатной температуры в режиме -1°С в мин. Эту реакцию отжига осуществляли в буфере ТЕ. Двухцепочечные ДНК представлены ниже вместе с кодируемой последовательностью эпитопа, указанной выше. Знак фунта #, используемый в некоторых последовательностях аминокислотных остатков, указывает на присутствие стопкодона.
Ρίΐ
ΙΝΑΝΡΝΑΝΡΝΑΝΡΝΑ
ААТТААСССТААТССОААСССТААТССОААСОСТААТСССААСОСТА
ТТСССАТТАОССТТаССАТТАОССТТССОАТТАОССТТСССАТ
Ν Ρ Ε Ь 8Ε0 Ю N0: 78
АТССОСАОСТ 8Ε<2 ΙΟ N0: 79
ТАС30СС 8Ε0 ΙΟ N0: 80
Р£3
ΙΝΑΝΡΝνϋ
ААТТААСОСТААТССОААСОТТОАСССОААСОСТААТССОААСОСТААТССЗА
ТТСССАТТАСаСТТССААСТСаОСТТСССАТТАООС'ГТОССАТТАСССТ
ΝΑΝΡΝνϋΡΝΑΝΡΕΙι 3Ε<2 Ю N0:81
АСССТААТСССЗААСОТТОАССССААСОСТААТСССОАССТ 5ЕО 10 N0:82
ТСССАТТАООСТТССААСТОООСТТССОАТТАССССТССАОО
Р£3.1
5Е0 Ю N0:83
ΙΝΑΝΡΝΥΟΡΝΑΝΡΝΑΝΡ
ААТТААСОСОААТСССААСОТСОАТСССААТаССААСССТААСаССААССС ттссссттАоссттасАсстАОосттАСсаттоооАТтосоаттаоа
АААТОСОААСССАОАОСТ
ТТТАСССТТОСОТС
5Е0
8Е0
8Е0
N0:84
N0:85
N0:86
Р£3.2
ΙΝΑΝΡΝΑΝΡΝ Α
ААТТААСОССААТССОААТСССААСССТААССССААСССАААСОТООАТСССА
ТТОСССТТАОССТТАСОСТТООаАТТаСООТТаООТТТОСАССТАСССТ
АТСССААСССАОАОСТ тАСОСттсазтс
5Е0
8Е0 зкэ
N0:87
N0:88
N0:89
Р£3.3
ΙΝΑΝΡΝνΟΡΝΑ
ААТТААСЗСОААТССОААСОТСХЗАТССАААТОССААСССТААСОСТААТССАА
ТТОСОСТТАООСТТОСАССТАООТТТАСООТТСвСАТТОСОАТТАООТТ
ΝΑΝΡΝνϋΡΝΑΝΡΕΙι
5Е0
Ю N0:90
АССССААССССААТСТТОАССССААТОССААТССООАОСТ
5Е0
N0:91
ТССООТТООССТТАСААСТООООТТАСОСТТАОаСС
5Е0
Ю N0:92
Р£3.4
ΙΝΡΝνϋΡΝΑΝΡΝΑ
ААТТААТССОААСаТ<Э<ЗАТССАААТ<ЗССААСССТААСаСТААТССАААСОССА
ТТАСОСТТОСАССТАОСТТТАСООТТСООАТТвСОАТТАСОТТТОСОСТ
ЗЕО
N0:93
АСССОААТОТТОАОСТ
8Е0
N0:94
ТССОСТТАСААС
ЗЕО
Ю
N0:95
- 39 006207
Ρί3.5
ΙΝΡΝνΟΡΝΑΝΡΝΑΝΡΝΑ
ААТТААТССОААСОТООАТССАААТСССААСССТААСОСТААТССАААСОССА ттАоосттсзсАсетАастттАссзсттоасАттосаАТТАоатттассст
ЗЕО
Ιϋ N0:96
АССССААТОТТОАСССТСАСЗСТ
ЗЕО
Ιϋ N0:97
ТОООСТТАСААСТОООАС
ЗЕО
N0:98
РЕЗ.б
ΙΝΡΝνΟΡΝΑΝ
ААТТААТСССААСОТООАТССАААТСССААСССТААСОСТААТССАААССССА
ТТАООСТТОСАССТАОСТТТАССОТТОООАТТОССАТТАОЗТТТЗСОСТ
ЗЕО
N0:99
АССССААТСТТОАСССТААТОСТОАОСТ
ЗЕО
N0:100
ТОООСТТАСААСТЗСОАТТАСОАС
ЗЕО
N0:101
РЕЗ.7
ΙΝνΟΡΝΑΝΡΝΑΝΡ
ААТТААСОТООАТССАААТОССААСССТААСССТААТССАААССССААСССаА
ТТОСАССТАООТТТАСОСТТСССАТТОСОАТТАООТТТОСООТТСЗООСТ
3Ξ0
Ю N0:102
АТОТТОАОСТ
ЗЕО
N0:103
ТАСААС
ЗЕО
Ю N0:104
ΙΝνϋΡΝΑΝ
ААТТААСаТО(ЗАТССАААТаССААСССТААССЮТААТССАААС(ЗССААСССОА ттосАсстАсзатттАсаоттаааАттсазАТТАОотттосооттсоаст
ЗЕО
N0:105
АТОТТОАСССТОАОСТ
ЗЕО
N0:106
ТАСААСТСОСАС
ЗЕО
N0:107
РЕЗ. 9
ΙΝνϋΡΝΑΝΡΝΑΝΡΝ
ААТТААССТСОАТССАААТОССААСССТААСССТААТССАААССССААСССаА
ТТСЗСАССТАССТТТАСааТТОССАТТОССАТТАСЗСТТТаСССТТССССТ
ΝνϋΡΝΑΕΟ
5Е0
N0:108
АТСТТСЗАСССТААТССТОАССТ
ЗЕО
N0:109
ТАСААСТОСОАТТАССАС
ЗЕО
Ю N0:110
РЕЗ.10
ΙϋΡΝΑΝΡΝΑΝΡ
ААТТСАТССАААТСССААСССТААСОСТААТССАААСаССААСС стАастттАссаттсаоАттссаАТТАостттососттзс
8Е0
N0:111
СЗААТОТТОАОСТ
8Е0
N0:112
ССТТАСААС
ЗЕО
N0:113
РЕЗ.11
ΙϋΡΝΑΝΡΝ
ААТТОАТССАААТеССААСССТААСССТААТССАААССССААСССОААТОТТС
СТАСЮТТТАСССТТООСАТТОСаАТТАОСТТТОССаТТССОСТТАСААС
АСССТСАОСТ таакзАС
ЗЕО
ЗЕО
ЗЕО
1Э
N0:114
Ν0ί115
N0:116
РЕЗ.12
ΙΟΡΝΑΝΡΝΑΝΡΝΑΝ
ААТТСАТССАААТЗССААСССТААСССТААТССАААСЗССААСССОААТОТТО
СТАЗСТТТАСООТТаССАТТССОАТТАССТТТвСЗаТТЗОаСТТАСААС
ЗЕО
N0:117
АСССТААТЗСС0А0СТ
ЗЕО
N0:118
ТССОАТТАССЗС
ЗЕО
N0:119
- 40 006207
Е. Универсальный Т-клеточный эпитоп Р. £а1с1рагит
Ρί-ЦТС (РР/С5326-345)
ΙΕ ΥΙιΝΚΙΟΝδΙ,δ ТЕМЗ Р
ААТТСААТАТСТСААСААААТССАОААСТСТСТОТССАСССААТООТСТСССТ СТТАТАСАСТТСТТТТАССТСТТСАОАСАСАСаТСССТТАССАСАСССА
С 3 V Τ # # ЗЕф Ю N0:120
ССТССОТТАССТАОТА ЗЕф Ю N0:121
ССАООСААТСОАТСАТТССА ЗЕф Ю N0:122
В-клеточные эпитопы с СЗ-повторами Р.у1уах
Ρν-Τ1Α
ΙΡΑΟΟΕΑΟΟφΡΑΟΟΚΑΑ
ААТТССваСТСОТОАССаТССАСАТааССАбССАОСОаСТОАССССССТССАО
ООСССАССАСТааСАССТСТАССОаТСОСТСССССАСТСССССОАСаТС
О φ Р А 0 Е Ь оссАССсаостоасаАост ссатссвссоАссас ЗЕф 10 N0:123 ЗЕф Ю N0:124 ЗЕФ Ю N0:125
Ρν-Τ1Β
I 0 В ААОфРАОО н α ϋ а Ф Р
ААТТОАСАСАОСАСССССАСААССАОСАООСОАТССАбСАСАССОАСАОСССО
СТСТСТСОТСОСССТСТТОСТССТССОСТАОСТСОТСТаССТОТССОСС
Ρν-Τ2Α А а Е ь САОССОАССТ отсссс ЗЕф 10 N0:126 ЗЕФ 10 N0:127 ЗЕФ 10 N0:128
I А N С А 0 N ф ₽ 0 А N С А С 0 Ф
ААТТаСОААСОСССССССТААТСАаССвааОССАААССЗОСОСССОТаАТСААС
СССТТаССОСООССАТТАСТССССССССОТТТОССОСаСССАСТАСТТС
Ρ о Е Ь ЗЕф Ю N0:129
САОСООАССТ ЗЕФ 10 N0:130
СТСССС ЗЕФ Ю N0:131
ΡΥ-Τ2Β
I ΑΝΟΑΟΝφΡΟΑΝΟΑϋΟφ
ААТТаСОААСОасаССОАТААТСАОССаааТОСАААССОСОССЗвАТаАССААС
СССТТОССОСООСТАТТАОТСавСССАСОТТТССССССССТАСТОСТТО
р а е ъ САССССАОСТ атссас ЗЕф Ю N0:132 ЗЕф Ю N0:133 ЗЕф Ю N0:134
РУ-Т2С
I А ν σ α σ ν ф Р 0 А N О А 0 о 0
ААТТОСОААССОСОСССОТААТСАССССССАССАААСООСССОаОСЮАТСААС
СаСТТаССОСООССАТТАОТСООСССТСОТТТСССОСОСССССТАСТТС
ΡΟΑΝΟΑΟΝφΡΟΑΝαΑΟϋ САООССССААТСОТОСАОАСААССАСССТСОСССОААТССАОССвАТСАСС стссасооттАссАсатстсттсатсоаАссссссттАСстсоостАстас
Φ р а е о ЗЕф ЗЕф ЗЕФ 10 N0:135 Ю N0:136 Ю N0:137
ААССС&ССОАССТ ттссоссас
ρν-тз
I А ₽ ΟΑΝφΞΟΦΑΑΑ Р <3 А N
ААТТССОССа<ЗОСаССААССАСОААООТСО<35СТОСАОСОССАООА(ЗССААТС
СОСООСССаССаТТСОТССТТССАССССОАСОТСОСвОТССТСООТТАО
ФЕООААЕЬ ААСААСССООТОСАОССФАССТ ТТСТТСССССАССТСвСС
ЗЕф Ю N0:138
5ЕФ Ю N0:139
ЗЕф Ю N0:140
- 41 006207
Пример 2. Универсальный Т-клеточный эпитоп Р.у1уах. Ρν-итс
1ЕУЬ0КУЕАТУвТЕМТР
ААТТОААТАТСТООАТАААОТОСОТССОАСССТТ®ЗСАСС<ЗААТ(ЗОАСТСССТ
СТТАТАСАССТАТТТСАСЗСАСССТСССААСССТСССТТАССТСАСССА
ЗЕО
Ю N0:141
ССАССОТОАССТААТА
ЗЕО
N0:142
СОТСОСАСТаОАТТАТТСОА
ЗЕО
А. ПЦР-праймеры для сайт-направленного мутагенеза. РЕ-СЗ (С17А) -К
N0:143
ЗЕО 10 N0:144 ##ТУЗАРЗИЕТЗ
ОССААОСТТАСТАООТААСССАООСССЗОАСАССАТТСОСТСЭО
ΗίπάΙΙΙ ЗЕО Ιϋ N0:145
В. ПЦР-праймеры для усечения и добавления цистеина в С-конец.
Для модификации С-конца генов НВс-химеры либо путем добавления цистеиновых остатков, либо путем изменения длины гена НВс, ПЦР-реакции осуществляли с использованием НВс149 в качестве матрицы и праймера НВс/ИсоНБ и обратного праймера (например, НВс149+С/НтйШ-Н), который регулирует нужную модификацию С-конца. ПЦР-продукты расщепляли ферментами и НшйШ и клонировали в рΚΚ223-3N в тех же самых рестрикционных сайтах.
СССААССТТАССОААСТдТТСАТАСОАТАСОО
N0:150
ЗЕО
ГО
ЗЕО
ΗΒθ142/ΗίηάΙΙΙ-Κ
ГО
N0:151 #Τ31ιΙΡΑΝΡ
СОСААОСТТАТОТТСЗАТАООАТАООСаСАТТТаО
ЗЕО
Ιϋ
N0:152
ΗΒ(2140/ΗίηάΙΙΙ-Η
ЗЕО ΐϋ
N0:153 #ΟΙΡΑΝΡΡ
СОСААССТТАТАОбАТАССОаСАТТТООТСО
5Е0
Ιϋ
N0:154
ΗΒο139/ΗίηάΙΙΙ-Κ
ЗЕО
ГО
N0:155
ССаААОСТТАОАТАССООСАТТТСОТОО
ЗЕО
ГО
N0:156
НВсХЗЭ/НхпЛИ-К
ЗЕО
N0:157
СОСААОСТТААООООСАТГТСОТСОТСТ
ЗЕО
N0:158
ΗΒθ138+0/Η1ηάΙΙΙ-Β
5Е0
ГО
N0:159 #ΟΡΑΝ₽ΡΒ
ОСОААССТТАССААОбСОСАТТТССТООТСТ
ЗЕО
N0:160
ΗΒ0137/ΗίηάΙΙΙ-Β
ЗЕО
N0:161 #ΑΝΡΡΚΥΑ
ОСОААОСТТАСССАТТТООТССТСТАТАбС
ЗЕО
N0:162
НВс137+С/Н1п<1111-К
ЗЕО
N0:163 #ΟΑΝΡΡΗΥΑ (ЗСОААССТТАОСАОССАТТТООТООТСТАТАА
ЗЕО
ГО
N0:164
НВс13б/Н1паИ1-Н
ЗЕО го
N0:165
СОСААОСТТААТТТООТОСТСТАТААОСТСО
ЗЕО
N0:166 #ΝΡΡΒΥΑΡ
- 42 006207
Пример 3. Процедуры анализа А. Антигенность 1. ЕЫ8А частиц.
Очищенные частицы разводили до концентрации 10 мкг/мл в буфере для сенсибилизации (50 мМ бикарбонат натрия, рН 9,6) и использовали для покрытия лунок ЕЫЗА-панели (50 мкл/лунка). ЕЫ8Апанели инкубировали при комнатной температуре в течение ночи (примерно 18 ч). На следующее утро лунки промывали промывочным буфером для ЕЫ8А [забуференный фосфатом физиологический раствор (РВ8), рН 7,4, 0,05% Твин®-20] и блокировали 3% В8А в РВ8 в течение 1 ч (75 мкл/лунку). ЕЫ8Апанели хранили, в сухом виде при -20°С вплоть до использования.
Для определения антигенности частиц антисыворотку разводили с использованием 1% В8А в РВ8 и 50 мкл/лунку добавляли в сенсибилизированные антигеном Е118Л-.чунки. Сыворотку инкубировали в течение 1 ч, промывали промывочным буфером для ЕЫ8А и зондировали с использованием конъюгата антимышиное^дО) антитело - ПХ (сайт связывания, 8ап В1едо, СА, ПХ = пероксидаза хрена) (50 мкл/лунку) или другого соответствующего антитела в течение 30 мин. После промывки промывочным буфером для ЕЫ8А реакцию визуализировали добавлением субстрата ТМ синего (50 мкл/лунку). Через 10 мин реакцию прекращали добавлением 1н. Н2804 (100 мкл/лунку) и считывали на планшет-ридере для ЕЫ8А, установленном при 450 нм.
2. ЕЫ8А синтетического пептида.
Синтетический пептид длиной в 20 аминокислотных остатков разводили до концентрации мкг/мл в буфере для сенсибилизации (50 мМ бикарбонат натрия, рН 9,6) и использовали для покрытия лунок ЕЬ^А-панели (50 мкл/лунку). Пептиды осушали на лунках путем инкубирования в течение ночи (примерно 18 ч) в вытяжном шкафу. На следующее утро лунки промывали промывочным буфером для ЕЫ8А [забуференным фосфатом физиологическим раствором (РВ8), рН 7,4, 0,05% Твин®-20] и блокировали 3% В8А в РВ8 в течение 1 ч (75 мкл/лунку). ЕЬ^А-панели хранили в сухом виде при -20°С вплоть до использования.
Для определения антигенности частиц, индуцирующих антитела (моноклональные или поликлональные), антисыворотку разводили с использованием 1% В8А в РВ8 и 50 мкл/лунку добавляли в сенсибилизированные антигеном ЕЬ^А-лунки. Сыворотку инкубировали в течение 1 ч, промывали промывочным буфером для ЕЫ8А и зондировали с использованием конъюгата антимышиное (!дО) антитело ПХ (как и выше, 50 мкл/лунку) или другого соответствующего антитела в течение 30 мин, а затем снова промывали промывочным буфером для ЕЫ8А и визуализировали добавлением субстрата ТМ синего (50 мкл/лунку). Через 10 мин реакцию прекращали добавлением 1н. Н2804 (100 мкл/лунку) и считывали на планшет-ридере для ЕЫ8А, установленном при 450 нм.
B. Иммуногенность частиц.
Для оценки иммуногенности частиц мышей иммунизировали, 1.р., 20 мкг частиц в полном адъюванте Фрейнда, а затем, через 4 недели, вводили бустер-инъекцию 10 мкг в неполном адъюванте Фрейнда. У мышей брали кровь через 2, 4, 6 и 8 недель.
C. ИФА спорозоитов.
Непрямой иммунофлуоресцентный анализ (ИФА) осуществляли с использованием фиксированных глутаральдегидом спорозоитов Р. £а1с1рагит и ФИТЦ-меченных антимышиных !дО (специфичных к гамма-цепи) (Кйкедаагб & Реггу, ОайЪегкЬигд, МИ) для детекции связанного антитела [МипектдЪе е! а1., Еиг. 1. !ттипо1. 1991, 21, 3015-3020]. Используемые спорозоиты выделяли из слюнных желез комаров АпорЪе1ек, инфицированных путем их вскармливания на гаметоцитах Р.£а1с1рагит (изолята N154), полученных из 1п уЦго-культур.
Пример 4. Экспрессия рекомбинантных НВс-химерных частиц.
А. Влияние положения инсерции на иммуногенность Титры антитела (1/обратное разведение) измеряли у мышей, иммунизованных частицам НВс, содержащими В-клеточный эпитоп Р.Г-С8 (NАNΡ)4, встроенный либо между аминокислотами Е77/О78 (8ЕР ГО N0:260 и 261), либо О78/Р79 (8ЕР ГО N0:259 и 260), или с использованием метода замены петли (С8-2)[как обсуждается в работе 8сЪобе1 е! а1., (1994) 1. Ехр. Меб., 180:1037-1046, с использованием полного адъюванта Фрейнда]. Мышей иммунизировали одной дозой в 20 мкг, 1.р., с адъювантом, как описано выше, и титры антител определяли в ЕЫ8А с использованием иммобилизованного синтетического пептида (NАNΡ)5. Результаты этих исследований представлены ниже в табл. 1.
Таблица1
Время СЗ-2* Ε77/Ό78 (VI) О78/Р79 (У2)
2 недели 0 2560 2560
4 недели 640 2560 40960
* ЗсНойе! ей а1., (1994) Ц. Ехр. Мей., 180:1037-1046
Другие сравнения влияния положений инсерции эпитопа с С8-повторами NАNΡ на иммуногенность были проведены на мышах ВАЬВ/с. Титры антител, индуцированные частицей С8-2, как описано 8с1юбе1 и др., сравнивали с титрами, полученными с использованием того же самого В-клеточного эпитопа (NАNΡ)4, встроенного между положениями 78 и 79 в НВс, и с использованием вышеуказанных частиц
- 43 006207
V2.ΡΓ1 в качестве иммуногена. Сыворотки анализировали через 4 недели после первой иммунизации (1°) и через две недели после бустер-иммунизации (2°) , и результаты представлены ниже в табл. 2.
Таблица 2
Химера Первичная иммунизация Бустер-иммунизация
СЗ-2 0 640*
Υ2. Р£1 10240 655360
* ЗсПоЦе1 еЕ а1. , (1994) Ц. Ехр. Мес!., 180:1037-1046
Аналогичное сравнение влияния положений инсерции эпитопа с С8-повторами NΑNΡ на иммуногенность было проведено на мышах В10.8, и результаты представлены ниже в табл. 3.
Таблица 3
Химера Первичная иммунизация Бустер-иммунизация
СЗ-2 640* 20480*
У2,Р£1 163840 655360
* ЗсЬоЦе! еТ а1., (1994) <1. Ехр. Мес!., 180:1037-1046
Была проведена оценка влияния на иммуногенность НВс-химерных частиц (1338.^, мыши Е1), включающих небольшой В-клеточный эпитоп, NΑNΡNV^Ρ (8 ЕС) ГО N0:167), вместе с повторяющейся последовательностью NΑNΡ. Была экспрессирована НВс-химера, содержащая последовательность NΑNΡNV^Ρ(NΑNΡ)зNV^Ρ (8ЕР ГО N0:21; V12.ΡΓ3), встроенная между положениями 78 и 79 в НВс. Полученные 1338 Α-даииые сравнивали с данными для титров, полученных с использованием Вклеточного эпитопа с тетрамерным повтором (NΑNΡ)4 ^12^11) или димера минорного В-клеточного эпитопа в том же самом положении (У^ТГ?). Каждая из этих трех химер содержала домен IV, который включал последовательность НВс от положения 141 до 149, связанную с универсальным Т-клеточным эпитопом Р. Га1с1рагиш в виде С-концевой последовательности. Результаты этих исследований с использованием первичных и бустер-иммунизаций, осуществляемых как описано выше, и с использованием адъювантов, представлены ниже в табл. 4.
Таблица 4
Химера Первичная иммунизация Бустер-иммунизация
νΐ2.Р£1 163840 . 655360
У12.РЕЗ 2621440 10485760
Υ12.РЕ7 2560
Наблюдаемое более чем 20-кратное повышение иммуногенности путем включения эпитопа с минорными повторами явилось полной неожиданностью. Поскольку V12.ΡΓ3 плохо экспрессировался в Е.сой, то были сконструированы варианты эпитопа ΡΓ3 NΑNΡNV^Ρ(NΑNΡ)зNV^Ρ (8ЕР ГО N0:21), которые обладали аналогичной антигенностью по отношению к ΡΓ3, но имели повышенные уровни экспрессии, как показано ниже. На иммуногенность были проанализированы лишь конструкции 3.1 и 3.2.
Относительные уровни экспрессии рекомбинантных химерных частиц НВс/Р. ПЕаравши и антигенности для моноклональных антител, специфичных к С8-эпитопам (NΑNΡ)4 и (NΑNΡNV^Ρ), указаны ниже в табл. 5. Относительные уровни экспрессии составляли: ****=75-125 мг/л; ***=50-75 мг/л; **=2550 мг/л. Антигенность определяли по конечному разведению титров моноклональных антител [МоΑЬ 2Α10 для (NΑNΡ)4; МоΑЬ 2В6В8 для NΑNΡNV^Ρ; и МоΑЬ 2Е2 для Кр!. Ρ.νΐνΒχ были получены от Е.\агс1111 из №те Уогк С’ттегкНу Меб1са1 Сеп!ег]. Данные были нормализованы так, что за наименьший титр принимали 1. Так, например, антигенность V12.ΡΓ3 была в 165 раз больше, чем антигенность V12.ΡΓ3.10 для (NΑNΡ)4-специфического моноклонального антитела и в 26 раз больше, чем антигенность V12.ΡΓ3.2 для NΑNΡNV^Ρ-специфического моноклонального антитела. Χ.Ι). отсутствие детектируемого связывания с антителом. [Примечание: V12.ΡΓ3.7 не экспрессировался из-за мутации в экспрессирующем векторе; последующую оценку не проводили, поскольку аналогичные конструкции не обладали антигенностью, а поэтому повторное клонирование не имело смысла].
- 44 006207
Таблица 5
Название В-кпеточный эпитоп Р. Га1с1'рагит Относительная экспрессия Антигенность
(ΝΆΝΡ)4 ΝΑΝΡΝνΏΡ
νΐ2.Р£1 (ΝΑΝΡ)4 ЗЕО 10 N0:1 **** 33 ΝΟ
У12. Р£3 ΝΑΝΡΝνΟΡ(ΝΑΝΡ)3ЫУ0Р ЗЕО Ю N0:21 * * 165 31
У12.Р£3.1 ΝΑΝΡΝνϋΡ(ΝΑΝΡ)3 ЗЕО Ю N0:22 й Й Й Й 33 31
У12.Р£3.2 (ΝΑΝΡ)3ΝνΌΡΝΆΝΡ 1 ЗЕО 10 N0:23 33 1.2 ...
VI2.Р£3.3 ΝΑΝΡΝνϋΡ(ΝΑΝΡ)3 ΝνϋΡΝΑΝΡ ЗЕО 10 N0:24 й й 5 1
VI2.РЕЗ.4 ΝΡΝνϋΡ(ΝΑΝΡ)3Νν ЗЕО ΙΟ N0:25 й й й й 5 5
У12.РЕЗ.5 ΝΡΝνϋΡ(ΝΑΝΡ)3Ν4ϋΡ ЗЕО Ιϋ N0:26 **** 5 5
νΐ2.ΡΕ3.6 ΝΡΝνϋΡ(ΝΑΝΡ)3 ΝνϋΡΝΑ ΞΕΟ Ю N0:27 й ййй 5 5
VI2.РЕЗ .7 ΝνΟΡ(ΝΑΝΡ)3Νν ЗЕО Ιϋ N0:28 - - -
VI2.РЕЗ .8 ΝνΟΡ(ΝΑΝΡ)3ΝνθΡ ЗЕО Ιϋ N0:29 **** 5 1
У12.РЕЗ .9 ΝνΟΡ(ΝΑΝΡ)3ΝΥϋΡΝΑ ЗЕО Ιϋ N0:30 *** 5 N0
VI2.РЕЗ .10 ϋΡ(ΝΑΝΡ)3Νν 3Ε0 ΙΟ N0:31 ★ й й Й 1 ΝΟ
νΐ2.РЕЗ.11 ϋΡ(ΝΑΝΡ)3ΝνϋΡ 3Ε0 Ш N0:32 й й й й 5 N0
У12.РЕЗ.12 ϋΡ(ΝΑΝΡ)3Νν0ΡΝΑ 3Ε0 ГО N0:33 ййй 5 N0
Иммуногенность отобранных НВс-химерных частиц, содержащих варианты эпитопа Р13, была проанализирована как описано выше. Сыворотки анализировали с помощью ЕО8А через 4 недели после первой иммунизации (1°) и через 4 недели после бустер-иммунизации (2°). Полученные данные представлены ниже в табл. 6, где название химеры и соответствующие последовательности В-клеточного иммуногена являются такими, как они были проиллюстрированы выше.
Таблица 6
Название Первичная иммунизация Бустер-иммунизация
У12.Ρ£1 40960 655360
νΐ2.Ρ£3 2621440 10485760
νΐ2.Ρ£3.1 2621440 10485760
νΐ2.Ρ£3.2 2621440 2621440
Неожиданно было обнаружено, что вариант, содержащий одну копию повтора ЙАЙРЙУОР (У12.Р13.1), имел такую же иммуногенность (и лучше экспрессировался), как и вариант, содержащий 2
- 45 006207 копии (У12.РГ3), несмотря на то, что антигенность NΑNΡ для моноклонального антитела была меньше в 5 раз.
В. Недостаточная экспрессия.
Были предприняты попытки внести несколько дополнительных эпитопов в петлю НВс (домен ΙΙ) между положениями 78 и 79 (как в У2.РГ1), но эти попытки оказались неудачными по неизвестным причинам. Ниже, в табл. 7, перечислены эпитопы, которые не экспрессировались при их встраивании в НВсхимеру между 1)78 и Р79 (У2).
Таблица 7
Обозначение Источник эпитопа Эпитоп (однобуквенный код)
У2.РОР-1(Ν7-Κ12) Человеческий РОЕ-1 ΝΥΚΚΡΚ ЕЕО Ю N0:168
У2.РОТ-1(К118- Н124) Человеческий ГОР-1 КИОРНТН ЗЕО Ιϋ N0:169
\Г2 .Агот-479 Р450 ароматаза ΙΛΡΟΕΤΚΝΜϋΕΜΙΡΤΡΙΙΝδΟΕ ЗЕО ГО N0:170
У2.Н1У3.1 Ηΐν-1 (др120) ΒΙΚΟΙ ЗЕО Ю N0:171
У2.Ηΐν4.1 Ηΐν-1 (др120) κικοιΟΜρσσκ ЗЕО 10 N0:172
ν2.Ηΐν5.1 Ηΐν-1 (др41) ЬЬЕЬОКИАЗЬ ЗЕО ΙΟ N0:173
ν2.Ηΐνβ.1 Ηΐν-1 (др41) ВОЕЬЬЕЫЗКИАЗЬИ ЗЕО ГО N0:174
ν2.Ηΐν9.1 Ηΐν-1 (др41) УОООШПЛ>КА1ЕАООНЬЬ - 0ЬТУИ<31К0Ь0АК1Ь ЗЕО ГО N0:175
ν2.Ηΐνΐ0.1 Ηΐν-1 (др41) НЬЬ0ЬТУК81К0Ь0АК ЗЕО ГО N0:176
У2.Н1У12.1 Ηΐν-1 (др41) УТН1I УЗЫ ΕΟ80ΝΟΟΕΚ- ЫЕ0ЕЬЪА1ЛЭКИАЗЫГСШГ ЗЕО ГО N0:177
ν2.Ηΐνΐ3.1 Ηΐν-1 (др41) УТНИУЗЫЕОЗОЫ- ООЕКНЕОЕЬЬВХ. ЗЕО ГО N0:178
У2.1А2(351-370) Человеческий Р450-1А2 ЭЕЕЕНРЯЬЗОВРОЬРУЬВА ЗЕО ГО N0:179
У2.206(129-148) Человеческий Ρ450-2ϋ6 КЕОККГЗУЗТЬЕНГХЗЬСККЗ ЗЕО ГО N0:180
ν2.Ру-В1 Р. уоеШ (ТНАР) РЫКЬРРЗТАУУНОЬКККН ЗЕО ГО N0:181
У2.Ру-ВЗ Ρ. уоеШ (ΤΚΑΡ) ТАУУНОЬКЙКН ЗЕО Го N0:182
У2.Ρν-Τ1Α ₽. νινβχ РАаОКАОООРАСОКАААООРАО ЗЕО ГО N0:183
ΤΖ2 .ΑΙΛΖ1.2 кич-а Ν03ΚΤΜν5ΡΙΝν ЗЕО ГО N0:184
ν2·ΑΙ>νΐ.2 кич-δ ΜΙΚΝΟΤΚΡΤΑνΤΡΟδν ЗЕО ГО N0:185
У2.ΡΜϋν (142-160) ΓΜΟν РКЬЙСЛЬОУЬАОКУАЯТЬР ЗЕО ГО N0:186
У2.ΓΜϋν (135-160) ΡΜϋν ΚΥΝΕΝΑνΡΝΕΡΟϋΙ: ОУЬАОКУАКТЬР ЗЕО ΙΡ N0:187
- 46 006207
Пример 5. Определение отношения оптических плотностей при 280/260.
Образцы белка разводили до концентрации в пределах от 0,1 до 0,3 мг/мл с использованием забуференного фосфатом физиологического раствора (РВ8), рН 7,4. Спектрофотометр был заперт с использованием РВ8, и оптическую плотность образца белка измеряли при длинах волн 260 и 280 нм. При этом были определены величины оптической плотности для образца при 280 нм, которые затем делили на величины оптической плотности для того же самого образца при 260 нм в целях получения отношения оптических плотностей 280/260 для данного образца. Отношения, полученные для нескольких образцов, включая нативные частицы (НВс 183), усеченные после положения 149 НВс-частицы (НВс 149) и для нескольких НВс-химер, которые были идентифицированные выше, представлены ниже в табл. 8.
Таблица 8
Пример 6. Цистеин у С-конца усеченных НВс-частиц А.
Добавление цистеинового остатка к С-концу гибридных НВс-частиц.
С использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) гены, экспрессирующие гибридные НВсчастицы, могут быть легко мутированы для введения цистеина или цистеинсодержащего пептида в Сконец НВс. Так, например, олигонуклеотидный ПЦР-праймер 8ЕС) 10 NО:148 может быть использован в сочетании со вторым подходящим праймером для амплификации гибридного гена НВс и для введения цистеинового кодона между кодоном У149 и стоп-кодоном.
Коровые частицы вируса гепатита В могут быть усеченными от положения 183 (или 185 в зависимости от подтипа вируса) до положения 140, и при этом сохранять способность к сборке в вирусоподобные макрочастицы. Многие группы исследователей использовали частицы, усеченные по аминокислоте 149, поскольку аминокислота 150 представляет собой первый аргининовый остаток богатого аргинином С-концевого домена.
Для оценки способности одного цистеинового остатка стабилизировать НВс-частицы, кодон для цистеинового остатка был встроен вышеописанными методами между кодоном аминокислотного остатка У149 НВс и стоп-кодоном химерной НВс-молекулы, содержащей малярийный В-клегочный эпитоп (ΝΑΝΡ)4, встроенный между остатками 78 и 79 (обозначаемый здесь У2.РП), в результате чего была получена химерная молекула и частица, обозначенная У2.РП+С (НВс149С). Было обнаружено, что термостабильность (при 37°С) этой химерной частицы (У2.РР1+С; 8ЕС) ГО NО:264 и 265), по сравнению с аналогичной химерной частицей, не содержащей встроенного цистеина (У2.РЙ), резко увеличивалась, как показано на фиг.3.
Следует отметить, что векторы и продукты экспрессии, которые были получены добавлением цистеина к С-концу конструкции У2 иногда называются здесь векторами У16 или продуктами экспрессии.
Как видно на фиг. 3, сначала эти две частицы ведут себя одинаково. Однако, через 14 дней при 37°С цистеинсодержащая частица обнаруживает меньше полос на ДСН-геле, что указывает на ее большую стабильность по сравнению с частицей, у которой отсутствует остаток Суз.
В. Протокол термостабильности.
Очищенные частицы разводили до концентрации 1 мг/мл с использованием 50 мМ \аРО.|, рН 6,8, и добавляли азид натрия до конечной концентрации 0,02% для предупреждения бактериального роста. Частицы инкубировали при 37°С и брали аликвоты через промежутки времени, указанные в описании графического материала. Образцы смешивали с буфером для ДСН-ПААГ-образца (восстанавливающим) и проводили электрофорез в 15% ПААГ-гелях с ДСН. Гели окрашивали кумасси синим, а затем анализировали.
Пример 7. Цистеин на С-конце пептида, присоединенного к С-концу НВс.
Затем для того, чтобы выяснить, могут ли концевые цистеиновые остатки, присутствующие не в положении 150, обладать стабилизирующим действием, Тй-эпитоп корового белка вируса гепатита В (аминокислотные остатки 74-87) присоединяли к С-концу НВс, содержащего малярийный эпитоп в иммунодоминантной петле. Этот Тй-эпитоп не содержит цистеинового остатка, а поэтому остаток Суз был добавлен к С-концу (подчеркнутый С). Контроль представлял собой тот же самый эпитоп, но не содержащий цистеина. Эти частицы получали путем объединения У2.РЙ с У7.НВс74-87 (и У7.НВс7487+С). Конструкцию У7 подвергали ПЦР-амплификации с использованием праймера НВс-Р79/8ас1-Р
- 47 006207 (8ЕЦ Ю NО:76) и рКК223-2/4515-32-К (8ЕЦ Ю NО:77). Продукт разрезали ферментами 8ас1 и НшбШ, и 8ас1/НтбШ-фрагмент лигировали в V2.РίΊ, разрезанный теми же самыми ферментами.
Ниже в табл. 9, показаны аминокислотные последовательности С-концевых гибридов НВс (74-87) и НВс (74-87)+С по сравнению с нативной последовательностью, присутствующей в белке НВс дикого типа, а также по сравнению с частицей НВс149+С. Сдвиг С означает положение встроенного цистеина по отношению к его локализации в белке дикого типа, где он является последним остатком (положение 183).
Таблица 9
Источник Последовательность ΡΙ Длина Положение С75 Сдвиг СУ5
Нативный КННСНЗРНЯНТ- Р8РКЕВР308РНКНК808НЕ80С 8Е0 ГО N0:189 12.74 34 34 Ноль
НВс(74-87) ΟίνΝΙ,ΕϋΡΑΒ- РВЩДГЗ ЗЕО ГО N0:190 3.78 16 н/о н/о
НВс(74-87)+С <3ΐνΝ6ΕΟΡΑ5- КОЬУУЗС ЗЕО ГО N0:191 3.78 16 16 -17
НВс-149+С С н/о 1 1 -33
Пример 8. Цистеин, локализованный в пептиде, присоединенном к С-концу гибрида НВс.
Были проведены исследования для того, чтобы определить, является ли требование присутствия цистеинового остатка в качестве концевой аминокислоты гена НВс абсолютно строгим (как это наблюдается в НВс дикого типа) либо этот цистеин может функционировать внутри введенной С-концевой последовательности.
Пептид, соответствующий универсальному Т-клеточному эпитопу из 20 остатков, полученному из белка С8 малярийного паразита Р1азтобшт РаЫрагит, который содержит цистеин в положении 17 пептида или в положении 342 белка С8 [СаКо-СаПе е! а1., 4.1ттипо1., (1997) 159 (3):р.1362-1373], присоединяли к С-концу НВс-химеры (У2.Р£1: 8ЕЦ ГО NО:266 и 267). Эта химера содержит последовательность НВс от положения 1 до положения 149, при этом В-клеточный эпитоп (NАNР)4 Р. РаЫрагит встроен между аминокислотными остатками 78 и 79. Таким образом, домен I этой НВс-конструкции содержал остатки 1-75; домен II содержал остатки 76-85 с эпитопов (NАNР)4, встроенным между остатками 78 и 79 (вместе с четырьмя остатками, содержащими рестрикционные сайты); домен III содержал остатки 86135; а домен IV содержал остатки 136-149 плюс Т-клеточный эпитоп Р. РаЫрагит из 20 остатков и два остатка клонирующего ЕсоШ-сайта (О).
Этот гибридный С-концевой пептид имеет 20 аминокислотных остатков (на 12 или 14 аминокислот короче, чем последовательность дикого типа, в зависимости от подтипа вируса) и имеет предсказанное значение р1, которое более чем на 8 единиц рН меньше, чем р1 последовательности дикого типа. Для минимизации возможных стабилизирующих эффектов, которые могут давать другие нецистеиновые аминокислоты, была получена (аналогичная) контрольная конструкция, содержащая в положении 17 аланин вместо цистеина (см. ниже, табл. 10).
Для облегчения оценки стабилизирующих эффектов этой последовательности, пептиды были присоединены к С-концу частицы, которая, как было показано ранее, легко деградирует при 37°С (У2.Р£1), в результате чего были получены НВс-химеры, обозначенные У2.Р£1+Р£/С8-ИТС и У2.Р£1+Р£/С8ИТС(С17А) соответственно. Результаты исследования на термостабильность в течение 28 дней (которые обсуждались ранее) представлены на фиг. 4.
Результаты этих исследований показали, что присутствие цистеина в Т-клеточном эпитопе, происходящем от белка С8 Р. РаЫрагит, является необходимым для стабильности частицы во время исследований, и что присутствие указанного цистеина на С-конце данного эпитопа не является абсолютно строгим требованием. В нижеуказанной таблице показана аминокислотная последовательность С-концевых гибридов с цистеином или аланином в положении 17, по сравнению с нативной последовательностью, которая присутствует в белке НВс дикого типа.
- 48 006207
Таблица 10
Источник Последовательность
Нативный ККНОНЗРЙНЯТ- РЗРКНККЗОЗРНЕНК303НЕ30С 5Е0 ГО N0:189
₽£/сз-итс (ΟΙ) ΕΥΙ>ΝΚΙ0Ν5- ЬЗТЕИЗРСЗУТ 5Е0 ГО N0:2
Р£/С5- (<3Ι)ΕΥΙιΝΚΙ<3Ν3-
ОТС(С17А) ЬЗТЕНЗРАЗУТ 5Е<2 ГО N0:192
Длина Положение СУ5 Сдвиг Суз
12.74 34 34 Ноль
4.44 20 17 -15
4.44 20 н/о н/о
(61) = остатки, добавленные из сайта клонирования
Пример 9. НВс-химеры Ρ.νΐναχ.
В соответствии с исследованием, обсуждаемым выше и проведенном на НВс-химерах, содержащих В-клеточный и Т-клеточный иммуногены Р. 1а1е1рагиш, было проведено аналогичное исследование с использованием последовательностей белка С8 Ρ.νΐναχ. Примеры конструкций проиллюстрированы ниже в табл. 11.
Таблица 11
Тип иммуногена Ρ. νίνβχ Малярийный В-клеточный иммуноген (между О78/Р79) С5-иТС (После У149)
Тип-1 ΦΚΆ (Ά/ϋ) СОРАСЗ) ЗЕ<2 10 N0:193 УЪОКУКАТУОТЕИТРСЗУТ 350 ΙΟ N0:196
Тип-11 (ΑΝΟΑ(α/ϋ) (Ν/ϋ)ΟΡα) ЗЕО ГО N0:194 ΥΙ»ϋ ΚνΕΑΤναΤΕΝΤΡΟδ ντ 3Ε0 Ιϋ N0:196
Тип-111 (ΑΡΟΑΝΟΕΟΟΛΑ) УЬОКУКАТУаТЕИТРСЗУТ
(\Луах-подобный) ЗЕО ГО N0:195 3Εζ> 10 N0:196
Что касается вариабельности повторов, то для вставки НВс между аминокислотами 78 и 79 были использования нижеследующие варианты эпитопов:
1. С8-повтор типа I.
ΡΆΟΌΚΛΒΟΟΡΆΟΌΚΛΆΟΟΡΆΟ (1А типа Ρ.νΐναχ) - 8 ЕС) Ш N0:197. Эта форма эпитопа не способна образовывать частицу.
ΌΚΑΑΟΡΡΑΟΌΚΑΌΟΡΡΑΟ (1В типа Ρ.νΐναχ) - 8ЕС) Ш N0: 198. Эта форма эпитопа, содержащая фланкирующие дипептидные остатки клонирующего сайта, успешно образовывала частицу и была обозначена V2.ΡV-ΤIΒ. Иммуноген для Ρ.νΐναχ типа I был успешно клонирован, экспрессирован и очищен, и его иммуногенность была протестирована на мышах. Результаты таких исследований на мышах показаны ниже в табл. 12.
2. С8-повтор типа II.
Что касается типа II, то это исследование осложнялось наличием четырех различных форм эпитопа типа II. Эти формы содержат либо О, либо Ό в положении 5, и либо Ν, либо Ό в положении 6 [Ραπ е! α1., Мо1. Бюейеш. Ραταδΐΐοΐ., (1992) 55(1-2):р.105-113]. Следовательно, существуют 4 различных возможных последовательности повторов (ΟΝ, ΟΌ, ΌΝ и ΌΌ), необходимых для максимизации нужного эффекта. Первый и предпочтительный метод заключается в получении одной гибридной частицы, содержащей все четыре повтора, которые подчеркнуты в нижеуказанной последовательности. Этот метод был успешно применен для определения вариабельности повтора типа I. Каждая из этих конструкций содержит фланкирующие дипептидные остатки сайта клонирования.
ΑΝΟΑΟΝΟΡΟΑΝΟΑΘΡΟΡΟΑΝΟΑΡΝΟΡΟΑΝΟΑΡΡΟΡΘ (Р.уТузх типа II -ΟΝ/ΟΡ/ΡΝ/ΡΡ) 8Е<2 ΙΡ N0:199.
Вышеуказанная последовательность была клонирована, экспрессирована и очищена как и НВсхимера, но без модификации в С-конце.
Второй метод заключается в получении двух гибридных частиц, каждая из которых содержала два варианта эпитопов (см. ниже). Этот метод является менее предпочтительным, поскольку он требует либо
- 49 006207 использования более сложной экспрессирующей системы для регуляции продуцирования смешанных частиц в процессе экспрессии, либо смешивания частиц типа II после их получения.
ΑΝΟΑΟΝΩΡΟΑΝΟΑΟρΟΡΟ {Ρ.νϊνΆΧ типа ΙΙ-ΟΝ/Οϋ) 3Εζ) ΙΟ N0:200. ΟΑΝΟΑϋΝΟΡ&ΑΝΟΑρρΟΡΟ (Ρ. νίνβχ типа ΙΙ-ΌΝ/ϋϋ) 3Ε<2 Ιϋ N0:201. ССССААТТСААСССААССССОСССАТААТСАСССОСССССТССА (Ρ.νίναχ типа ΙΙΒ-ΕΚΐ-мЬ-Г) 3Εζ) ΙΌ N0:146.
3. С8-повтор типа III (у1уах-подобный).
Третий С8-эпитоп Р.У1уах, который очень отличается от двух других эпитопов, не ассоциируется с аминокислотными вариациями (см.ниже) |Е)ап е! а1., Бапее!, 1993. 341(8848):р.780-783]. Эта последовательность была клонирована в экспрессирующую систему НВс, в результате чего были продуцированы гибриды, содержащие фланкирующие дипептидные остатки клонирующего сайта.
ΑΡΘΑΝΡΕΘΘΑΑΑΡΘΑΝΡΕΘΘΑΑ (типа III Р.У1уах) ЕЕЦ) ГО N0:202.
4. Т-клеточный эпитоп у С-конца НВс.
Инсерцию ТЬ-эпитопа Р.У1уах (Ρν-ИТС; ΥΕϋΚУКЛТУОТЕУТЕСЕ УТ; ЕЕЦ) ГО N0:196) в НВс и получение гибридов НВс также осуществляли с использованием синтетических ДНК-фрагментов (8уп!Ье!1с ОепеЕез, 8ап 1)1еуо СΑ). Однако в отличие от В-клеточных эпитопов, которые встраивают в область иммунодоминантной петли гена НВс, Т-клеточные эпитопы присоединяют к С-концу этого гена НВс. Для встраивания В- и ТЬ-эпитопов в НВс были использованы обсуждаемые ранее клонирующие векторы. Кроме того, была успешно получена частица, экспрессирующая только Ρν-υТС у С-конца.
5. Объединение В- и Т-клеточных эпитопов в одной частице.
Для объединения В- и ТЬ-эпитопов в одну конструкцию НВс, использовали ПЦР для амплификации Ν-концевых фрагментов НВс (АА 1-80, которые содержат В-клеточные эпитопы) и С-концевых фрагментов НВс (АА 81-150, которые содержат Т-клеточные эпитопы). Фрагменты лигировали вместе и снова амплифицировали с помощью ПЦР. Затем клоны подтверждали путем эндонуклеазного рестрикционного картирования и анализировали на автоматическом ДНК-секвенаторе (Еагк ТееЬпо1од1е8, Ноиз!оп ТХ). Более подробно см. описание, приведенное для Р. ГаШрагит. Были экспрессированы и выделены частицы, которые содержат каждый из В-клеточных эпитопов типов I, II и III и их вариантов, а также ΡνИТС.
Пример 10. Относительная иммуногенность НВс-химер.
Относительные иммуногенности нескольких НВс-химерных иммуногенов сравнивали у мышей с использованием анализа ИФА, описанного ранее. Результаты этих исследований, полученные с использованием схем иммунизации с введением двух доз, как было описано выше, представлены в табл. 12.
Таблица 12
Иммуноген Титр ИФА Защита Цитата
Р.Ьегдкех (СЗ-1) 40960 95% А
Р.уоеШ (СЗ-З) 12800 95%* В
Р.£а1с1рагит (С5-2) 1200 ΝΤ А
Р.£а1с1рагит (У12.РГ3.1) 5200000 ΝΤ —
Р.уЦуах (У2.РУ-Т1В) 160000 ΝΤ —
[Α=8сЬоάе1 е! а1., (1994) I. Ехр. МеФ, 180:1037-1046. В=8еЬоТе1 е! а1., ВеЕппд ЫзБМШ., 1997(98): р.114-119. КГ=Не тестированы, *=защита в течение более чем 3 трех месяцев.]
Как видно из вышеуказанных данных, титры 105-106 для Р. ГаШрагит были получены с использованием химерного иммуногена; в отличие от этого, титры, полученные с помощью технологии замен 8еЬос!е! е! а1., составляли лишь 103 для Р. ГаШрагит и 104 для Р. ЪегдЬек
Мышей иммунизировали С8-2 или У12.РГ1 с использованием 20 мкг частиц на день ноль, а через четыре недели была проведена повторная иммунизация с использованием 10 мкг. Мышей, иммунизированных частицами У12.РГ3 и У12.РГ3.1, затем иммунизировали с использованием 20 мкг частиц на день 0, а затем, через восемь недель повторно иммунизировали 10 мкг с использованием адъювантов, описанных выше. Данные, касающиеся времени сохранения полученных титров, представлены на фиг. 5, а данные, касающиеся использования частиц У12.РГ3, в основном, идентичны данным, полученным для частиц У12.РГ3.1 (не приводятся).
Пример 11. Относительная антигенность НВс.
Был проведен ряд исследований в целях определения относительной антигенности нескольких малярийных химерных частиц НВс для двух моноклональных антител (МоАЪ-3120 и МоАЪ-3105), по сравнению с нативной частицей НВсАд. Эти антитела являются специфическими по отношению к области петли НВс и были любезно предоставлены Японским институтом иммунологии в Токио. Эти исследования были проведены с использованием химер, указанных в табл. 5 и содержащих малярийные эпитопы, встроенные в частицы НВс в различных положениях, в качестве антигенов, в анализах ΕΙ4ΒΑ, где в каче- 50 006207 стве зондов использовали моноклональные антитела. Результаты этих исследований (как конечные разведения) представлены ниже в табл. 13А, 13В и 13С, и эти результаты иллюстрируют, в основном, отсутствие антигенности рассматриваемой химеры для моноклональных антител, которые связываются с областью петли, то есть первичным иммуногеном НВс. Иначе говоря, моноклональные антитела, которые связываются специфически с областью петли НВс, почти не распознавали или вообще не распознавали рассматриваемую химеру.
Таблица 13 А
Частицы Конечное разведение анти-МоАЬ- 3120 Относительная антигенность
НВсАд 625000 100
νΐ2.РЕЗ 80000 12,8
У12.РЕ3.1 20000 3,2
νΐ2.РЕЗ.2 10000 1,6
νΐ2.Ρ£3.3 10000 1,6
νΐ2.Ρ£3.4 80000 12,8
ν12.ΡΕ3.5 40000 6,4
νΐ2.Ρ£3.6 80000 12,8
νΐ2.ΡΕ3.8 80000 12,8
νΐ2.Ρ£3.9 160000 25, 6
νΐ2.ΡΕ3.10 10000 1,6
νΐ2.Ρ£3.11 80000 12,8
νΐ2.Ρ£3.12 80000 12,8
Таблица 13В
Частицы Конечное разведение анти-МоАЬ-3105
НВсАд 1300000
ν2.Ρ£1 (78/79) Ноль
У12.Р£1 (78/79) Ноль
νΐ2.Ρ£3 (78/79) Ноль
νΐ.ΡίΙ (77/78) Ноль
У13.Р£1 (78/79) 1300000
Инсерция в несколько сайтов иммунодоминантной петли (включая положение 77-78 или 78-79) приводит к полной элиминации связывания с МоΑЬ-3105. V13 представляет собой вставку между остатками 129 и 130 и используется в качестве контроля, поскольку нативная иммунодоминантная петля НВс остается интактной в этой конструкции.
Таблица 13С
Частицы Конечное разведение анти-МоАЬ-3120
77/78 νΐ.ΡίΙ 102400
78/79 ν2.Ρ£1 400
НВсАд 409600
Эти данные показали, что инсерция между остатками 78 и 79, по сравнению с инсерцией между остатками 77 и 78, приводит к более резкому снижению уровней связывания с анти-МоАЬ-3120.
Пример 12. Конструирование вектора, экспрессирующего модифицированный коровый белок вируса гепатита В.
С использованием сайт-направленного мутагенеза, лизиновый кодон (ААА) был встроен между аминокислотами Е77 и Р78 гена НВс вместе с сайтом рестриктазы 8ай (6Α6СТС) для облегчения генетического встраивания других кодонов, осуществляемого в целях продуцирования частиц НВс, содержащих линкерную группу. Так, например, эта вставка содержит последовательность аминокислотных
- 51 006207 остатков КЕЬ, где ЕЬ представляет собой артефакт 8ас!-сайта. Поэтому белок НВс, содержащий линкерную группу, имел длину в 152 аминокислотных остатка. Конструирование экспрессирующей плазмиды рКК223-3-НВс152-К78 осуществляли, как описано ниже.
Для амплификации 5'-конца гена НВс (основания 1-234, аминокислоты 1-77) и одновременного встраивания рестрикционного сайта ^оНсайта (ССАТОО) у 5'-конца, рестрикционного сайта 8асЬсайта (ОАОСТС) у 3'-конца амплифицированного продукта и лизинового кодона (ААА) перед 8асЬсайтом использовали олигонуклеотидные праймеры Р1Р (8Ер ГО N0: 203) и Р1К (8Ер ГО N0:204 на комплементарной цепи). Для амплификации 3'-конца гена НВс (основания 235-450, аминокислоты 78-149) и одновременного встраивания рестрикционного 8асЬсайта (ОАОСТС) у 5'-конца и рестрикционного НшбШсайта (ААОСТТ) у 3'-конца амплифицированного продукта использовали олигонуклеотидные праймеры Р2Р (8Ер ГО N0:205) и Р2К (8Ер ГО N0:206 на комплементарной цепи).
Два ПЦР-продукта (кодирующих аминокислоты 1-77 и аминокислоты 78-149) расщепляли 8ас£ лигировали вместе у их общих выступающих 8асТ-участков, расщепляли №о! и НтйШ и клонировали в экспрессирующую плазмиду рКК223-3 (Рйагтасла) с использованием стандартной техники. Полученную плазмиду обозначали рКК223-3-НВс152-К78.
Эта плазмида может быть использована для экспрессии НВс-химеры, несущей лизин в качестве линкерной группы в иммунодоминантной петле. Экспрессированная НВс-химера спонтанно образовывала частицы. Таким образом, в этом примере НВс, содержащий линкерную группу, имел вставку, соответствующую положению 77 НВс 8Е0 ГО N0:247, химически реакционноспособный лизиновый линкерный остаток в положении, соответствующем положению 78 НВс 8Ер ГО N0: 2 47, и был усечен в положении, соответствующем положению 149 НВс 8Ер ГО N0:247.
Плазмида, которая кодирует вышеуказанную химеру, и, кроме того, включает С-концевой цистеиновый остаток, может быть получена методами ПЦР, описанными в примере 11, а также методами, описанными непосредственно выше. НВс-химерные частицы, содержащие С-концевой остаток Сук и линкерный остаток, который может быть конъюгирован с иммуногенным гаптеном, получают в результате экспрессии плазмиды в соответствии с описанными здесь процедурами.
Праймер Р1Р
ТТОООССАТОСАСАТСОАСССТТА
Праймер Р1К.
5Е0
ΙΏ
N0:
203
ОСаОАССТСТТТТТССАААТТААСАСССАС
8Е<2
Ιϋ
ΝΟ
204
Праймер Р2Г
СССОАССТССАТССАСССТСТАСАСЗАОАСС
8Е0
Ιϋ
ΝΟ:
205
Праймер Р2К
СССААССТТАААСААСАСЗТАеТСТССООААС
5Е<2
Ιϋ
ΝΟ:
206
Пример 13. Очистка модифицированной коровой частицы вируса гепатита В.
Химерные частицы НВс, содержащие линкерную группу, и описанные в примере 12, были экспрессированы в Е.сой, а обычно в штамме ВЬК или ВЬ21 Е.сой, поставляемом Шсадеп (Майкоп, Мксопкт) или в ТВ1 Е.сой, поставляемом Атегкйат (Агйпд!оп Не1дй!к, Што1к). Трансфецированная Е.сой [обозначенная НВс152-К78] экспрессировала плазмиду рКК223-3-НВс152-К78. Химерные частицы НВс, содержащие линкерную группу [частицы НВс153(К78)] очищали с помощью хроматографии на Сефарозе® СЬ-4В (Рйагтасла) в соответствии со стандартными процедурами.
В номенклатурной системе, используемой для этих химерных молекул и частиц, НВс означает последовательность корового белка вируса гепатита В; 152 означает число аминокислотных остатков, присутствующих в химере с лизином и двумя остатками рестрикционных сайтов (глутаминовой кислоты и лейцина; ЕЬ), добавленными к последовательности НВс149 из 8асЬсайта; а (К79) означает, что лизин (К) добавлен к этой последовательности после остатка 78 в качестве нового остатка 79. Химерные молекулы и частицы, содержащие цистеиновый остаток в качестве С-концевого остатка этой молекулы, описанной ниже, обозначены +С.
Поскольку частицы очищают заранее определенным способом, то для рутинной очистки электрофоретически чистых частиц с высоким выходом (5-120 мг/л клеточной культуры) достаточно проводить
- 52 006207 мониторинг элюирования частиц с помощью простой спектроскопии (ОО280) в сочетании с ДСН-ПААГанализом для оценки чистоты отдельных фракций перед их объединением. Сферическая структура чистых химерных частиц НВс, содержащих линкерную группу, ясно наблюдается на фотографии, сделанной под электронным микроскопом.
Пример 14. Химическое связывание синтетических пептидов с содержащими линкерную группу химерными частицами НВс, используемыми в качестве активированных носителей.
Химерный продукт содержащей линкерную группу НВс-частицы экспрессионной плазмиды рКК223-3-НВс152(К78), полученный как описано в примере 13, анализировали на его химическую реакционную способность по сравнению с аналогичным образом экспрессированной и очищенной усеченной коровой частицей вируса гепатита В дикого типа (НВс149), которая была идентична НВс152(К78), за исключением того, что в ней отсутствовали введенный лизиновый остаток в качестве линкерной группы и фланкирующие пять аминокислот.
Синтетические пептиды (гаптены) были химически конъюгированы с содержащими линкерную группу химерными НВс-частицами с использованием сукцинимидил-4-(№малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (8МСС), водорастворимого гетеробифункционального сшивающего реагента, используемого для получения активированных носителей. 8МСС является реакционноспособным как в отношении сульфгидридных групп, так и в отношении первичных аминогрупп, что позволяет затем конъюгировать синтетические пептиды с этими активированными носителями (химерными частицами НВс, первичные аминогруппы которых были ранее модифицированы 8МСС). Кроме того, спейсерное плечо в 11,6 А, образуемое 8МСС, способствует снижению стерического затруднения между гаптеном и носителем НВс, что обеспечивает более высокую эффективность связывания.
Вкратце, частицы НВс152(К78) и НВс149 были отдельно подвергнуты реакции с 5-кратным избытком 8МСС по отношению ко всем аминогруппам (нативным аминогруппам или нативным аминогруппам плюс один из лизиновых остатков данной вставки) в течение 2 ч при комнатной температуре в 50 мМ фосфата натрия, рН 7,5, с получением активированных малеимидом частиц НВс. Непрореагировавший 8МСС удаляли путем повторного диализа против 50 мМ фосфата натрия, рН 6,8. 8МСС-дериватизация частиц НВс приводила к увеличению минимальной молекулярной массы, которая не детектировалась посредством электрофореза в ДСН-ПААГ. Однако, ПААГ-анализ подтвердил целостность белков НВс перед проведением стадии конъюгирования пептидов.
Синтетические пептиды, связываемые с химерными частицами НВс в качестве активированных носителей, были сконструированы так, чтобы они имели Ν-концевые цистеиновые остатки, которые позволяли бы осуществлять направленное конъюгирование пептидных гаптенов с первичным амином на боковой цепи встроенного лизинового остатка через цистеиновый сульфгидрил этого гаптена.
В табл. 14 представлены синтетические пептиды, происходящие от ферментов цитохрома Р450 человека, которые были химически конъюгированы с активированными носителями частицы НВс с образованием конъюгатов химерной частицы НВс, содержащих связанные через боковые группы детерминантные гаптены цитохрома Р450, или более просто, конъюгатов химерной частицы НВс. Синтетические пептиды растворяли в 50 мМ фосфата натрия, рН 6,8, до концентрации 10 мг/мл. Затем, по каплям добавляли синтетические пептиды до получения 5-кратного избытка по отношению к общему количеству аминогрупп, присутствующих в активированных малеимидом и стратегически модифицированных частицах НВс152(К78), и оставляли на 2 ч при комнатной температуре для прохождения реакции. Активированные малеимидом частицы НВс 149 подвергали реакции с двумя пептидами 2Ό6 (2Ό6 и 2Э6-С), используемыми в качестве контроля.
Таблица 14. Гаптены цитохрома Р450
Название пептида Последовательность 5Е0 Ю ΝΟ:
1А1 (289-302) СОЕКОЬОЕЫАетУОЬ 207
1А2 (291-302) СЗККСЗРКАЗОЫЫ 208
2Э6 (263-277) СЬЬТЕНКМТИОРАОРРКОЬТЕ 209
ЗА4 (253-273) СУКРМКЕЗКЬЕОТОКНЕУОРЬО 210
1А1-С СМ01АЗ 211
1А2-с СКРЗТЫ 212
2Ц6-С САУРН 213
2Е1-с СУ1РН5 214
2С-с СПРУ 215
ЗАЗ/4/7-С СТУЗСЗА 216
ЗА5-с СТЬЗСЕ 217
- 53 006207
Пример 15. Анализ конъюгатов химерных частиц НВс.
Конъюгаты химерных частиц НВс, содержащие связанные через боковые группы детерминантные гаптены цитохрома Р450, описанные в примере 14, анализировали с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН и с помощью иммуноблоттинга для того, чтобы определить, были ли синтетические пептиды конъюгированы с НВс. Денатурирующие условия процедуры электрофореза приводили к распаду частиц на составляющие их субъединицы: мономеры НВс. Поскольку мономеры НВс имели молекулярную массу приблизительно 17000 Да, то было просто разделить частицы НВс152(К78), химически конъюгированные с пептидом 1А1 (289-302), 1А2 (291-302), 2Ό6 (263-277) или 3А4 (253-273), поскольку эти пептиды имели относительную молекулярную массу приблизительно 2000 Да, что приводило к видимому увеличению молекулярной массы мономеров белка НВс.
Исходя из относительной интенсивности конъюгированных и неконъюгированных полос на ДСНПААГ, было установлено, что приблизительно 50% мономеров НВс152(К78) были ковалентно связаны с гаптеном, тогда как лишь примерно 5% частиц НВс149 дикого типа были связаны с гаптеном. Заметное увеличение наблюдаемого уровня связывания через боковые группы гаптена с активированными носителями подтверждает предположение о том, что наблюдаемое связывание происходит посредством введенного лизина, в противоположность лизиновому остатку, который также присутствует в последовательности дикого типа.
Сдвиг подвижности НВс-частиц, конъюгированных с более короткими С-концевыми пептидами (5и 6-мерами), происходящими от Р450, не был явно выражен на ДСН-ПААГ, как это наблюдалось для более длинных ингибирующих пептидов, но для уже связанных мономеров НВс152(К78) были явно заметны сдвиги приблизительно в 1 кДа. Химерный белок НВс152(К78) обнаруживал заметно повышенную способность связываться с гаптеном посредством боковых групп по сравнению с частицами НВс149 дикого типа, которые обнаруживали минимальное конъюгирование.
В модели коровых частиц, построенной исходя из предположения о том, что они являются икосаэдральными частицами, состоящими из 180 или 240 ассоциированных мономеров корового белка [Сопетау е! а1., (1997) №!иге, 386:91-94], димеры относительно доступных областей иммунодоминантной петли коровых мономеров выступают из собранной коровой частицы в растворе подобно шипам на булаве. Эти шипы находятся на частицах НВс в пространственной близости друг к другу. Стратегическая локализация введенного лизинового остатка на кончике этого шипа минимизирует тенденцию к стерическим затруднениям для прохождения реакций связывания гаптенов с собранной коровой частицей.
Максимум 50% таких стратегически модифицированных мономеров НВс было успешно конъюгировано с синтетическими пептидами Су! Р450. Такое количество боковых связей соответствует, в среднем, одному присоединенному гаптену на один димер корового белка. Это предполагаемое распределение гаптеновой связи со стратегически модифицированной частицей НВс подтверждается ПААГрезультатами, полученными в полуденатурирующих условиях, которые приводят к распаду частиц, но сохраняют димерную ассоциацию.
Частицы НВС-2И6, полученные путем пептидного связывания, были оценены с помощью иммуноблот-анализов, которые подтвердили присутствие полипептидного эпитопа 2Ό6. При зондировании анти-НВс антисывороткой, эта химически связанная частица давала две различных мономерных полосы, представляющих мономеры с полипептидом 2Ό6 и без него. Из них, только верхняя полоса блотировалась анти-2Э6 антисывороткой, что подтверждало корреляцию между сдвигом подвижности и присоединением полипептида 2Ό6.
Пример 16. Стратегические инсерции лизина.
Для конструирования частиц НВс с инсертированными лизиновыми остатками в каждом положении иммунодоминантной поверхностно-экспонируемой области петли (аминокислоты 75-85) проводили ПЦР для амплификации 5'- и 3'-фрагментов гена НВс и один лизиновый кодон встраивали посредством олигонуклеотидных праймеров. Эти олигонуклеотидные праймеры и полученные аминокислотные последовательности представлены в 8ЕО ΙΌ №№ 220-241. Последовательности дикого типа представлены в 8ЕО ΙΌ №№ 218-219. Эти НВс-химеры имели длину 150 остатков с добавленным лизином в положении, указанном цифрой для каждой химеры с указанием названия частицы.
Для получения лизиновых вставок в положениях 75-84 [НВс150(К75)-НВс150(К84)], пары ПЦРфрагментов были расщеплены рестриктазой Мзе1, которая распознает последовательность ТТАА. Модифицированный ген был восстановлен путем лигирования олигонуклеотидного праймера (содержащего лизин) в подходящем рестрикционном Мзе1-сайте, локализованном в нуклеотидных положениях 221224. Для НВс-К85 (8ЕО ΙΌ №№ 240-241) необходимо получить два фрагмента, которые были лигированы в общем рестрикционном Хйо1-сайте (СТССАС), который не присутствует в гене дикого типа, но может быть введен в положениях 239-244 без какой-либо замены аминокислот.
- 54 006207
Таблица 15. Мутанты НВс, полученные путем инсерции лизина в иммунодомонатную петлю
Название Последовательность 3Ε0 Ιϋ ΝΟ:
НВс дикого типа ТИУСЗТЫЪЕОРАЗШЭЮТЗУУ 218
НВС150К75 ТИУСуЮТЬЕВРАЗЕОЬУУЗУУ 220
НВС150К76 ΤΗνονΝΚΙιΕϋΡΑΒΗΟΙ,ννδΥν 222
НВС150К77 ΤΚνσνΝΗΚΕηΡΑδΚϋΗννεγν 224
НВС150К78 ΤΝνσνΝΕΕΚϋΡΑ3ΚΏΙ,νν3Υν 226
НВС150К79 ΤντνθνΝΙιΕΟΚΡΑ5ΓίΌΕνν3Υν 228
НВС150К80 ΤΜνανΝΏΕϋΡΚΑ3ΗΌΕνν5Υν 230 '
НВС150К81 ΤΪ^ΟνΝΪΕϋΡΑΚδ^ννδΥν ί 232 1
НВС150К82 ΤΝνονΝί^ΒΡΑδκΕϋΕννδΥν I 234
НВС150К83 ΤνΐνανΝΏΕΟΡΑ3ΚΚύΗνν5Υν 236
НВС150К84 τΝνονΝΏΕϋΡΑ3Ηϋΐανν3Υν ; 238 *
НВС150К85 ΤΝνσν^ΕϋΡΑδΗϋΒκννδΥν ι 240 '
Для очистки НВс-химер, содержащих линкерную группу, осветленные клеточные лизаты из 1литрового ферментера осаждали 45% сульфатом аммония, и полученный осадок подвергали гельхроматографии (2,5 см х 100 см) на сефарозе® СВ-4В (Рйагтас1а). При анализе с использованием колонки этого типа, частица НВс имела характерное положение при элюции независимо от инсерций аминокислот, введенных в эту частицу. Полученные в этом исследовании одиннадцать НВе-химерных частиц, содержащих линкерные группы, были проанализированы с использованием описанной процедуры и профили элюции измеряли на спектрофотометре при оптической плотности на 280 нм.
Три химерных частицы НВс, содержащие линкерную группу и полученные из конструкций [НВс150(К75), НВс150(К77) и НВс150 (К79)], были продуцированы на уровнях от 50 до 100 мг/л, которые соответствовали типичным выходам для немодифицированных НВс-частиц дикого типа, например, частиц НВс 149. Химерные частицы НВс, содержащие линкерную группу и полученные из четырех конструкций [НВс150(К76), НВс150(К78), НВс150(К81) и НВс150(К82)], были продуцированы на относительно низких уровнях (от 1 до 20 мг/л). И наконец, четыре частицы [НВс150 (К80), НВс150(К83), НВс150(К84) и НВс150(К85)] были продуцированы на уровнях, которые, как предполагалось, были едва детектируемыми (менее чем 1 мг/л). Выходы этих продуктов экспрессии представлены ниже в табл. 16.
Таблица 16. Очищенные лизинсодержащие химерные частицы НВс из 1-литрового ферментера
Как описано выше, плазмида, кодирующая вышеуказанную химеру, и, кроме того, включающая Суконцевой цистеиновый остаток, может быть получена путем встраивания кодона Сук непосредственно левее стоп-кодона методами ПЦР, описанными выше или в примере 11, а также методами, описанными непосредственно выше.
- 55 006207
Пример 17. Химеры с последовательностями ВИЧ.
Были получены рекомбинантные химерные частицы, в которых последовательность др41 ВИЧ-1 в положениях 631-665 присутствует между остатками НВс 78 и 79. Один препарат содержал С-концевой остаток Сук (8ЕР ГО N0:272 и 273), тогда как другой препарат не содержал этого остатка и был терминирован у валина в положении 149 НВс (8ЕР ГО №№ 270 и 271). Частицы, не имеющие концевого Суз, были экспрессированы с использованием вектора V2, описанного в примере 1В, тогда как Суктерминированные частицы были экспрессированы с использованием вектора V2, полученного как описано в примере 11. Эти конструкции были обозначены V2.ΗIV 11.1 и V! 11.1 соответственно. Выходы экспрессии составляли 1,6 мг/л и 12,4 мг/л соответственно, что продемонстрировало почти 8-кратное увеличение выхода частиц, собранных из Сук-терминированного белка.
Последовательность В-клеточного эпитопа ВИЧ представлена ниже, а также представлены кодирующие и комплементарные ДНК-последовательности для этого эпитопа. Эта последовательность ВИЧ обычно оканчивается С-концевым остатком ЕЕ и начинается с добавленных Х-концевых остатков СС так что в ней присутствует всего два добавленных (гетерологичных) остатка, которые не происходят ни от последовательности НВс, ни от инсертированной пептидной последовательности.
Инсертированная последовательность В-клеточного эпитопа
СЮММЕИОКЕГШУТЗЫНЗЫЕЕЗОЫООЕКЫЕОЕЬ
ЗЕО ΙΠ ΝΟ: 242
Кодирующая последовательность
5'
ААТТТООАГСТОСОААЗАТССТСАОАТСААСААТТАТАССАСССТСАТАСАТТ
СТТТААТТСААСАСТСССАСААССААСАССАСАААААТСААСААеАССТ
ЗЕО Ιϋ N0: 243
Комплементарная последовательность
5’
СТТСТТСАТТТТТСТССТОТТССТТСТССОАСТСТТСААТТАААОААТСТАТС
АОССТСОТАТААТТСТТСАТСТСАССАТСТТСССАСАТССА
ЗЕО ΙΌ N0: 244
Пример 18. Сравнительная экспрессия.
Аналогичные исследования сравнительной экспрессии осуществляли с использованием описанного ранее вектора НВс150(К77), который экспрессирует химерную молекулу, содержащую лизин между остатками 76 и 77 НВс (вместе с двумя экзогенными остатками на обоих сторонах от добавленного лизина), и аналогичного вектора, который также содержит остаток Сук у С-конца этого белка. Последний вектор был получен описанными выше методами с использованием С-концевого ПЦР-праймера, содержащего кодом Сук между кодоном Vа1-149 и стоп-кодонами. В исследованиях парной экспрессии первый вектор экспрессировал частицы в количестве 55 мг/л, тогда как последний вектор экспрессировал частицы в количестве 60 мг/л.
Пример 19. Получение генов и частиц, усеченных по С-концу НВс-химер.
Ген НВс амплифицировали с использованием I ПЗс-ХсоЕГтес! (показанного ниже) в сочетании с каждым из нижеследующих обратных праймеров: НВс138+139С-Н3-геу, НВс139-Н3-хеу и НВс140-Н3-х^ (показанных ниже), с получением нижеследующих генов НВс: НВс140, НВс139 и НВс138+139С. Эти ПЦР-продукты разрезали ферментами NсоI и НтбШ и клонировали в плазмиду рКК223-3^ которая была получена путем разрезания теми же самыми двумя ферментами. Затем плазмиды трансформировали в штамм ТВ1 Е.соб и культивировали в течение 24 ч в 500 мл среды ТВ, в которую было добавлено 8 мг/л глюкозы и 50 мкг/мл ампициллина. Продуцирование частиц определяли путем анализа неочищенных препаратов Е.со11 с использованием эксклюзионной колонки (Ρйа^тас^а) с сефарозой® СЬ-4В, при этом частицы ассоциировались с характерным положением при элюции.
Таким образом, пять граммов собранных клеток лизировали в 25 мл 50 мМ буфера Трис-НС1, рН 8,0, 10 мМ ЕОТ.Л с использованием пресса Френча. Лизат осветляли путем центрифугирования при 16000 об/мин (1Α-30.50 го£ог Т1, Весктап) в течение 20 мин. Для преципитации частиц осуществляли осаждение сульфатом аммония (45%) и этот преципитат выделяли путем центрифугирования при 16000 об/мин (1Α-30.50 го£ог Т1, Весктап) в течение 20 мин. Полученный таким образом осадок ресуспендировали в 5 мл 50 мМ буфера Трис-НС1, рН 8,0, 10 мМ ЕОТ.Л и диализовали против 20 мМ Трис-НС1, рН 8,0, вплоть до растворения. Затем этот материал загружали на хроматографическую колонку с сефарозой СЕ4В (2,5 х 100 см) и пропускали через колонку со скоростью потока 1 мл/мин в течение периода времени 500 мин, за который весь этот материал был проэлюрован. Мониторинг элюирования частиц проводили при 280 нм.
- 56 006207
По профилям элюирования было видно, что НВс 140 образует частицы, а НВс 139 не образует таких частиц. Частицы также не образовывались при добавлении цистеина в положении 139 частицы, которая оканчивалась остатком 138. Векторы были сконструированы с использованием ДНК ЗЕО ГО №№ 275, 146, 159, 160, 155, 156, 153 и 154, показанных ранее.
Пример 20. Получение вектора в целях продуцирования частиц НВс, используемых для человека.
А. Получение вектора ν17Ρί3.1.
Для продуцирования частицы ν12.Ρί3.1 (ЗЕ9 ГО №№:268 и 269) способом, подходящим для введения человеку, необходимо экспрессировать частицу с использованием экспрессирующей системы, которая не требует использования ампициллина для сохранения плазмиды. Для достижения этого, ген, кодирующий данную частицу, вместе с необходимыми расположенными левее регуляторными последовательностями, встраивали в новую плазмиду, в которой в качестве селективного маркера используется канамицин. Эту новую плазмиду (ν17.Ρί3.1) синтезировали с помощью двухстадийной процедуры клонирования.
Стадия 1. Плазмиду рΚΚ223-3N-V12 расщепляли рестриктазами ВатШ и НтбШ с получением двух ДНК-фрагментов, имеющих 801 и 4869 п.н. Кроме того, коммерчески доступную плазмиду рКЕР4 (91а§еп) разрезали ферментами ВдШ и НтбШ с получением двух фрагментов размером 320 и 3420 п.н. 3420 п.н.- и 801 п.н.-фрагменты лигировали с получением плазмиды ν17. (следует отметить, что ДНК, расщепленные ферментами ВдШ и ВатЫ, могут быть лигированы благодаря их общим выступающим последовательностям, хотя ни фермент ВдШ, ни фермент ВатШ не могут разрезать полученный фрагмент). Поэтому, плазмида ν17 содержит ген НВс149, оканчивающийся последовательностью РГ-ИТС, присоединенной к С-концу, и рестрикционные ЕсоЕН и ЗасПсайты в области иммунодоминантной петли, которые позволяют встраивать эпитопы между Ώ78 и Р79 гена НВс.
Стадия 2. Вторая стадия предусматривала инсерцию варианта Р13.1 эпитопа РГ с СЗ-повторами в область гена иммунодоминантной петли. Это было достигнуто путем расщепления ν17 ферментами ЗаЛ и ЕсоМ с получением 15 п.н. и 4206 п.н.-ДНК-фрагментов.
Подвергнутые отжигу олигонуклеотиды, кодирующие эпитоп Р13.1, лигировали с 4206 п.н.фрагментом с получением νΠ^βΛ, плазмиды длиной 4275 пар оснований. Помимо гена, кодирующего малярийную вакцину-кандидат размером 195 аминокислот, эта плазмида содержит ген репрессора 1ас (1ас I) для полного ингибирования любого гена под контролем промотора 1ас до тех пор, пока он не будет индуцирован изопропилтиогалактозидом (ГОТС). Эта плазмида также содержит ген резистентности к канамицину, что позволяет проводить позитивный отбор путем добавления канамицина в культуральную среду. Указанная плазмида имеет сайт инициации репликации рАСУС 184 и не является высококопийной плазмидой.
Локализация представляющих интерес генов
Ген Старт-кодон Стоп-кодон Аминокислоты Молекулярная масса (кДа)
Ъас I 2128 3087 319 34,1
У17.Р£3.1 281 868 195 21,7
КтК 4259 3465 264 29,1
Подходящим штаммом-хозяином ν17Τβ.1 является ВЬЕ Е.соН, производный штамм гес А ВЬ21 Е.соН и общеизвестный штамм, используемый для продуцирования рекомбинантных белков (поставляемый от Уоуачеп). ВЬЕ Е.соН, благодаря своей повышенной генетической стабильности, а также способности продуцировать собранные частицы в растворимой форме (но не в тельцах включения) был отобран в качестве организма-хозяина для экспрессии.
В. Экспрессия частиц с использованием плазмиды ν17Τβ.1.
Е.соН (штамм ВЬЕ), содержащую плазмиду ν17Τβ.1, высевали штрихом на планшет с агаром ЬВ, в который были добавлены 25 мкг/мл канамицина и 10 мкг/мл тетрациклина, а затем инкубировали при 37°С в течение 16-20 ч. Моноколонию затем использовали для инокуляции 3 мл среды ТВ-РНу в стерильной пробирке для культивирования, в которую добавляли 25 мкг/мл канамицина. Эту пробирку инкубировали в течение ночи (примерно 18 ч) на шейкере при 37°С и примерно при 200 об/мин.
На следующее утро 100 мл среды ТВ-РНу нагревали до 37°С. Затем брали 1 мл ночной культуры и использовали для инокуляции колбы, которую затем инкубировали на шейкере при 37°С примерно при 200 об/мин в течение шести часов.
Ферментер (Вюз1а1™ ИЕ20) инокулировали 100 мл инокулята при нижеследующих условиях ферментации:
Перемешивание 400 об/мин
Температура 37°С
Аэрация воздухом 10 л/мин
РН 7,0, не регулировался
Для первого образца измеряли величину А600, а затем проводили мониторинг А600 образцов через каждые 20-30 мин. Раствор НРТС получали путем растворения 62 мг НРТС в 10-15 мл воды. При дости- 57 006207 жении А600 значения 0,5, в ферментер шприцем в асептических условиях добавляли стерилизованный на фильтре раствор ГРТС. Инкубирование продолжали вплоть до следующего дня (например, приблизительно еще 10-24 ч).
Через 14 ч после индуцирования, температуру ферментера доводили до 15°С. Сбор клеток начинали с центрифугирования в центрифуге Весктап® 12-МС при следующих условиях:
Ротор ЛА10
Скорость 7500 об/мин
Температура 4°С
Время 9 мин
Клетки собирали путем замораживания в жидком азоте.
С. Очистка частиц, экспрессированных вектором V17.РГ3.1/В^В.
Биомассу собранных клеток ресуспендировали в 50 мМ фосфата натрия, рН 6,8, и подвергали лизису в камере пресса Френча при 16000 фунт/кв.дюйм. Клеточный дебрис удаляли путем центрифугирования в центрифуге Весктап® 12-МС при следующих условиях:
Ротор 1А20
Скорость 15000 об/мин
Температура 4°С
Время 30 мин
Измеряли объем полученного супернатанта и к этому супернатанту медленно добавляли 277 г/л твердого сульфата аммония. Полученную смесь перемешивали при 4°С в течение 30 мин. Раствор центрифугировали в центрифуге Весктап® 12-МС при следующих условиях:
Ротор 1А20
Скорость 15000 об/мин
Температура 4°С
Время 30 мин
Затем преципитат ресуспендировали в минимальном объеме 50 мМ фосфатно-натриевого буфера, и диализовали против того же самого буфера при перемешивании в течение одного часа. Диализованный раствор центрифугировали в центрифуге Весктап® 12-МС при следующих условиях:
Ротор 1А20
Скорость 15000 об/мин
Температура 4°С
Время 15 мин
Супернатант отбирали, а затем подвергали гель-хроматографии.
Система: Рйагташа В1о!есй АКТА™ Ехр1огег
Буфер В (элюирующий растворитель): 50 мМ фосфатно-натриевый буфер (рН 6,8).
Колонка: колонка М1Шроге Vаи!аде™ АЕ44 х 1000 (диаметр 44 нм, высота 1000 мм, каталог № 96441000)
Смола: 1,5 л Сефарозы® СЬ-4В, изготавливаемой Рйагташа.
Детектор: УФ при 210, 254 и 280 нм.
Фракция: 15 мл.
Колонку элюировали буфером В со скоростью 2 мл/мин. Фракции, содержащие частицы, идентифицировали с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН и собирали. Концентрацию соли собранного материала доводили до 5М добавлением хлорида натрия.
Гидрофобная хроматография
Система: Рйагташа В1о!есй АКТА™ Ехр1огег (Система № 18111241 001152, Университет Йовы 8ЕЦ ΙΌ N0:540833)
Буфер А: 50 мМ фосфатно-натриевый буфер (рН 6,8)+5 М №С1.
(Перед использованием этот буфер дегазировали ежедневно в течение 30 мин)
Буфер В (элюирующий растворитель): 50 мМ фосфатно-натриевый буфер (рН 6,8).
(Перед использованием этот буфер дегазировали ежедневно в течение 30 мин)
Гидрофобная хроматография с использованием эфирной смолы ТоуоРеаг1® 650
Колонка: колонка М1Шроге Vаи!аде™ АЕ44 х 250 (диаметр 44 нм, высота 250 мм, каталог № 96440250)
Смола: 200 мл эфирной смолы Тоуореаг1® 650 ШС, изготавливаемой Токойаак.
Детектор: УФ при,210, 254 и 280 нм.
Фракция: 15 мл.
Колонку уравновешивали 5 колоночными объемами (КО) буфера А за один час до начала очистки при скорости потока 20 мл/мин. Затем ретентат, содержащий 5М соль, загружали при скорости потока 20 мл/мин. Колонку промывали 2 колоночными объемами буфера А, а затем промывали 2 колоночными объемами 10% буфера В, элюировали 3 колоночными объемами 40% буфера В и наконец элюировали
100% буфера В. Фракции полностью анализировали на нужные белки с помощью электрофореза в ДСНПААГ. Чистые фракции объединяли и проводили оценку белка с помощью анализа Брэдфорда.
- 58 006207
Гидрофобная хроматография с использованием бутиловой смолы.
Колонка: колонка МПИроге Уап!аде™ УЬ44 х 250 (диаметр 44 нм, высота 250 мм, каталог № 96440250).
Смола: 200 мл бутиловой смолы Тоуореаг1® 650-8 ШС, изготавливаемой ТокоНаак.
Детектор: УФ при 210, 254 и 280 нм.
Фракция: 15 мл.
Колонку уравновешивали 5 колоночными объемами (КО) 40% буфера В за один час до начала очистки при скорости 20 мл/мин. Объединенные фракции из эфирной ШС загружали при скорости 20 мл/мин. Колонку промывали 2 колоночными объемами (КО) 40% буфера В, а затем промывали 2 колоночными объемами 90% В, и элюировали 4 колоночными объемами ТО!.
Фракции анализировали на нужный белок с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ. Чистые фракции объединяли.
Колоночная хроматография на гидроксиапатитах.
Колонка: колонка МПИроге Уап!аде™ УШ 6 х 250 (диаметр 16 нм, высота 250 мм, каталог № 96160250).
Смола: 20 мл керамических гидроксиаппатитов (№ каталога 158-2200).
Детектор: УФ при 215, 254 и 280 нм.
Фракция: 15 мл.
Колонку уравновешивали 5 колоночными объемами (КО) 20 мМ фосфатно-натриевого буфера, скорость потока 5 мл/мин. Загружали объединенные фракции, проэлюированные из бутиловой смолы ШС при скорости потока 5 мл/мин. Колонку промывали 20 мМ фосфатно-натриевого буфера до тех пор, пока А280 не снижалась до фонового значения. Фракции анализировали на нужный белок с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН. Чистые фракции объединяли.
Обессоливание
Колонка: предварительно упакованная колонка для обессоливания ШРгер™ 26/10, РНагтаФа Смола: 20 мл керамических гидроксиаппатитов (№ каталога 158-2200)
Детектор: УФ при 215, 254 и 280 нм.
Фракция: 15 мл.
Колонку уравновешивали 5 колоночными объемами (КО) 15 мМ ацетатного буфера, рН 6,0. Объединенные фракции из колонки на гидроксиапатитах загружали на колонку, а затем элюировали 15 мМ ацетатного буфера, рН 6,0, при скорости потока 20 мл/мин. Фракции анализировали на нужный белок с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН. Чистые фракции объединяли, и оценку белка проводили с использованием анализа Брэдфорда. Чистые фракции анализировали на уровни эндотоксина, и, наконец, пропускали через 0,22-микронный фильтр для конечной фильтрации.
Пример 21. Сравнительная экспрессия химер с последовательностями цитохрома Р450.
Получали рекомбинантные химерные частицы, в которых последовательность 1А1 человеческого цитохрома Р450 в положениях 290-302 находится между остатками 78 и 79. Один препарат содержал Сконцевой остаток Сук, тогда как другой препарат не содержал этого остатка и был терминирован у валина в положении 149 НВс. Частицы, не имеющие концевого Сук, были экспрессированы с использованием вектора У2, описанного в примере 1В, тогда как Сук-терминированные частицы были экспрессированы с использованием вектора, полученного как описано в примере 11. Эти векторы были обозначены У2.1А1(290-302) и У16.1А1(290-302) соответственно. Выходы экспрессии составляли 2,7 мг/г клеток, 36 мг/л культуры и 8,8 мг/г, 144 мг/л соответственно, что указывало на то, что концевая цистеиновая модификация может стабилизировать продуцирование и выход химерной частицы.
Ниже представлена последовательность пептида 1А1 Р450, а также кодирующие и комплементарные ДНК-последовательности для этого эпитопа. Последовательность 1А1 Р450 начинается с последовательности Й-концевого остатка 6Ί и оканчивается С-концевым остатком ЕЬ, таким образом в ней присутствует всего лишь четыре добавленных (гетерологичных) остатка, которые не происходят ни от последовательности НВс, ни от инсертированной пептидной последовательности.
Инсертированная последовательность В-клеточного эпитопа (С1)ОЕКОЬОЕЫАЫУОЬ(ЕЬ) ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 280
Кодирующая последовательность
5'
СААОАААААСАССТАСАССААААСОСАААТбТАСАССТС
БЕО Ю ΝΟ: 74
Комплементарная последовательность
5'
СОАССТСЗТАСАТТТСССТТТТССТСТАССТСТТТТТСТТС
ЗЕО Ю ΝΟ: 71
- 59 006207
Пример 22. Получение векторов для экспрессии частиц с цистеиновым остатком, расположенным перед С-концевым гибридным эпитопом.
Для получения частиц с одним цистеином, расположенным за У149 гена НВс, за которым следует Т-клеточный эпитоп, был синтезирован ПЦР-праймер (8 ЕС) ΙΌ N0:282). Этот праймер в сочетании с НВс149Жсо1-Е (8ЕР ΙΌ N0:67) использовали для амплификации гена НВс в целях продуцирования варианта НВс, имеющего один цистеиновый кодон, встроенный непосредственно за У149, а также рестрикционные ЕсоК1- и НтбШ-сайты (за введенным цистеином). 478 п.н.-ПЦР-продукт разрезали ферментами \ео1 и НтбШ и клонировали в рКК223-3№
ЗЕО Ю Νο. 281
С V V Τ Τ Ε Р
5' 0СААССТТАСТАТТ5ААТТСС0САААСААСА0ТА0ТСТСС0С
ΗίηάΙΙΙ ЕСОК1
5Е0 Ιϋ N0:282
Затем полученную плазмиду разрезали ферментами ЕсоК1 и НтбШ, и подвергнутые отжигу олигонуклеотиды, кодирующие Р£/С8-иТС (РЕ/С8326-345; 8ЕР ΙΌ №№ 121 и 122), лигировали в эту плазмиду. Затем эту плазмиду использовали в качестве матрицы в ПЦР-реакции вместе с праймерами НВсР79/8ас1-Р (8Ер ΙΌ N0:73) и Р1/С8(С17А) (8Ер ΙΌ N0:145) и получали ПЦР-продукт (307 п.н.), кодирующий аминокислотные остатки 79-149 НВс, за которыми находится введенный цистеин, а за ним последовательность Р£/С8-иТС, имеющая мутацию С17А, и этот продукт был фланкирован рестрикционными 8ас1(5')- и НтбШ(3')-сайтами. Этот фрагмент разрезали ферментами 8ас1 и НтбШ и лигировали с плазмидой У2.Р£1 [кодирующей малярийный эпитоп (NΑNР)4], которая была разрезана теми же самыми двумя ферментами.
Полученный ген кодирует НВс-химеру из 190 аминокислотных остатков, имеющую (NΑNР)4, встроенный между аминокислотами 78 и 79 НВс (фланкированный последовательностями С1у-11е и С1и1.еи, происходящими от рестрикционных ЕсоК1- и 8ас1-сайтов, соответственно), и вариант С17А Р£/С8326-345 у С-конца. Поэтому один цистеин был локализован между У149 НВс и линкерной последовательностью С1у-11е (происходящей от рестрикционного ЕсоШ-сайта), расположенной перед первыми аминокислотами Т-клеточного эпитопа РЕС8326-345 (С17А) [Р£/С8-иТС(С17А)](см. 8Ер ΙΌ N0:284).
Эту гибридную частицу экспрессировали, очищали и анализировали на стабильность путем инкубирования при 37°С в течение нескольких недель. Стабильность этой частицы (У 12.Р£1(С17А)С150) сравнивали со стабильностью У12.Р11, при этом различие между двумя частицами наблюдалось только в положении цистеинового остатка. В У12.РН, за цистеином следовали три аминокислотных остатка (8УТ) С-конца этого белка (8ЕР ΙΌ N0:283), тогда как в У12.Р£1(С17А)150, за цистеином следовали 22 дополнительных аминокислотных остатка (8ЕС) ΙΌ N0:284).
У12.Р£1
ΤΤνν ΟΙ ЕУШК10ЦЗЬЗТЕИЗРСЗУТ ЗЕО Ю Νθ: 283
У12.РГ1(С17А)С150 ,
ТТУУ С 01 ЕУШК10ЦЗЬЗТЕИЗРАЗУТ ЗЕО Ю Νθ: 284
Введение цистеинового остатка между НВс и Т-клеточным эпитопом (У12.Р£1(С17А)С150) приводило к образованию частицы, которая была значительно более стабильной, чем аналогичная частица, не имеющая С-концевого цистеина (У 12.Р£1(С17А)). Это очевидно из того факта, что, в отличие от У12.Р£1(С17А), У12.Р£1(С17А)С150 может быть легко очищен без значительного разложения мономеров (ср. Т=0 для этих частиц на фиг. 4 и 8); и, кроме того, У12.Р£1(С17А)С150 был значительно более стабильным, чем У 12.Р£1(С17А) после инкубирования при 37°С. После инкубирования в течение 14 дней при 37°С, мономеры У12.Р£1(С17А) полностью деградировали (фиг. 4), тогда как мономеры У12.Р£1(С17А)С150 деградировали лишь частично (фиг. 8).
Очевидно, что У12.Р£1(С17А)С150 не был таким стабильным, как У12.РН (фиг. 8). Эти данные указывают на то, что стабилизирующее действие одного С-концевого цистеинового остатка является наиболее эффективным в том случае, когда он помещен у С-конца или вблизи С-конца, например в пяти остатках этого С~ конца НВс-химеры.
Пример 23. Анализ гибридных частиц методом гель-фильтрации.
Аналитическую гель-фильтрацию очищенных гибридных частиц НВс осуществляли с использованием хроматографической колонки (Атегзйат Рйагтата # 17-0537-01) с 25 мл сефарозой® 6 НК 10/30 и хроматографической перфузионной системы (ВюСАО™ 8РКЖТ Рег£лзюп Сйгота!одгарйу 8уз!ет). УФдетектор устанавливали для мониторинга на длинах волн 260 и 280 нм. Колонку уравновешивали 3 колоночными объемами (КО; примерно 75 мл) буфера (50 мМ №Р04, рН 6,8) при скорости потока 0,75 мл/мин.
- 60 006207
Анализируемые частицы разводили до концентрации 1 мг/мл с использованием 50 мМ №Р04, рН 6,8. Затем 200 микролитров (мкл) образца загружали в 200 мкл-петлю и вводили в колонку. Образец элюировали с колонки 50 мМ №Р0.|, рН 6,8, при скорости потока 0,75 мл/мин.
Несколько частиц, содержащих С-концевые цистеиновые остатки, или аналогичные частицы, не содержащие таких цистеиновых остатков, анализировали в соответствии с вышеописанной процедурой. Интегрирование 280 нм-траектории осуществляли с использованием программного обеспечения ВюСАЭ™ (Рег8ер!1уе™) и получали результаты, представленные ниже в табл. 17.
Таблица 17
Частица Процент после очистки
Содержание частиц Отсутствие частиц
У2.1А1 (290-302) 43 57
У16.1А1 (290-302)* 96 4
У12.РТ1 (С17А) 67 33
νΐ2.Ρ£1 (С17А)+С150* 100 0
νΐ2.Ρ£1* 98 2
НВС150 (К77) 40,1 59,9
НВС150 (К77)+С* 100 0
НВС150 (К79) 59 41
НВс150 (К79)+С* 100 0
У2.Р£1+СГ/НВс74-87+С* 97,8 2,2
У2.Р£1+СЕ/НВс74-87 80,7 19,3
* Частицы, стабилизированные С-концевым цистеином
Очищенные частицы были проанализированы на процентное содержание частиц, а затем инкубировали в водном растворе при 37°С, как описано выше. После 14-дневного инкубирования композиции анализировали на стабильность. Результаты этого анализа представлены ниже в табл. 18.
Таблица 18
Частица Процент частиц после инкубирования при 37°С (дни)
Ноль
У12.Р£1* 98 96
У12.Р£1(С17А) 67 63
У12.Р£1(С17А)+С150* 100 98
* см. примечание к Таблице 17
На фиг. 8 представлены результаты ДСН-ПААГ-анализа частиц, указанных в табл. 18 на дни ноль, 7 и 14, после инкубирования при 37°С. Результаты денситометрического анализа этого ДСН-ПААГ представлены ниже в табл. 19.
Таблица 19
Частица Процент полноразмерного мономера после инкубирования при 37°С
Дни
Ноль 7 14
νΐ2.Ρ£1* 100 94 93
412.Р£1(С17А) 100 13 1
νΐ2.Ρ£1(С17А)+С150* 100 83’ 63
★ см. примечание к Таблице 17.
Частицы, указанные в табл. 18 и 19, и контрольные частицы, описанные в примере 16 с С-концевым остатком Сук и без него, анализировали на иммуногенность у мышей ВАЬВ/с путем внутрибрюшинной инъекции с использованием 20 мкг соответствующих частиц в забуференном фосфатом физиологическом растворе (рН 7,4) в отсутствие адъюванта, по сравнению с результатами, представленными в табл.
4. Сыворотку анализировали с помощью ЕЫ8А через две недели после иммунизации НВс-частицами (анти-НВс) или синтетическим пептидом ^А№)5 [анти-^А№)п], используемых в качестве твердофазного антигена-ловушки. Результаты этого исследования представлены ниже в табл. 20.
- 61 006207
Таблица 20
Частица Титр конечной точки
Анти-НВс анти-(ΝΑΝΡ)η
У12.РЕ1(С17А) 10240 0
νΐ2.Ρ£1(С17А) +С150* 10240 2560
νΐ2.Ρ£1* 10240 10240
НВС150(К77) 40960 0
НВс150(К77)+С* 163840 0
* см. примечание к Таблице 17.
Данные этих исследований можно объяснить тем, что частицы, стабилизированные С-концевым цистеином, являются более стабильными непосредственно после их продуцирования, а также после инкубирования при 37°С в течение различных периодов времени. Эти стабилизированные частицы также обладают повышенной иммуногенностью даже в отсутствии адъюванта. Кроме того, хотя частицы присутствуют в нестабилизированном материале, таком как \12.Р£1(С17А), однако, после 14-дневного инкубирования, в нем не обнаруживалось мономерных химерных белков, и этот материал не индуцировал антител против ранее введенной гетерологичной последовательности В-клеточного эпитопа, а в данном случае, малярийного иммуногена.
Пример 24. Химеры, содержащие последовательности эпитопов бета-амилоидного белка.
Было предложено использовать антитела против фрагмента бета-амилоидного белка-предшественника, состоящего из 42 аминокислот, в качестве терапевтической и профилактической вакцины для лечения болезни Альцгеймера (КЕТ) [ЗсБепк е! а1. (1и1 8, 1999) ХаИпц, 400 (6740):116-117]. С-конец этого фрагмента содержит область, которая является в высокой степени гидрофобной, а поэтому она создает потенциальную проблему для экспрессии на поверхности химерных частиц НВс.
Поэтому, помимо частицы, содержащей полную последовательность из 42 аминокислот [ν16.βАт(1-42)], были сконструированы три другие частицы так, что они содержали только относительно гидрофильные области: аминокислотные остатки 1-17 [У16.в-Ат(1-17)], аминокислотные остатки 22-32 [\16Д-Ат(22-32)] и аминокислотные остатки 1-32 [У16.в-Ат(1-32)]. Химерные гены, кодирующие частицы \Ί6.β-Αιη (1-17) и V16.β-Ат(22-32), конструировали путем отжига комплементарных олигонуклеотидов и их встраивания в плазмиду ν16, которая была предварительно расщеплена ферментами ЕсоК4 и 8асГ β-Ατη(1-17) -Т
5' -ААТТОАТССССААТТТС(ЗТСАТаАСАСС(ЗССТАТ(ЭАССТССАССАТСАОАААСТСЮАОСТ ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 296 β-Αιη(1-17) -В
5' -ССАСТТТСТСАТСЮТССАССТСАТАСЗССаСТСТСАТ’ОАСаАААТТССССАТС ЗЕО Ю ΝΟ: 297 р-Ат(22-32)-Т
5' -ААТТСААСАТСТССЗвТТСТААСААСаССаСААТТАТССАССТ
ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 298 β-Απΐ(22-32) -В
5'-СбАТААТТССССССТТСТТАСЗААСССАСАТСТТС
ЗЕО Ю N0: 299
Для получения химерных генов, содержащих остатки 1-42 [ν16.β-Αη(1-42)] и 1-32 [ν16.β-Αη(132)], олигонуклеотиды β-Αη^-βΙ^)^ и β^η^^)^ или β^η^^)^ отжигали, а затем достраивали с получением полностью двухцепочечного фрагмента, с использованием 5 циклов плавления (94°С) и достраивания (72°С). Реакции осуществляли в полном объеме 100 мкл с использованием полимеразы \е1П (ΝΕΒ), ΤΝΤΡ (250 мкМ) и подвергнутых отжигу фрагментов (250 нМ). Затем два микролитра этих реакционных продуктов использовали в качестве матриц в двух ПЦР-реакциях для получения фрагментов, кодирующих остатки 1-32 и 1-42 и фланкированных рестрикционными ЕсоК1- и ЗасПсайтами.
(Примечание: в нижеследующих двух конструкциях, кодон Ьеи (СТО) введен посредством праймера β-Αη(Ε+1-32/42)-5'-ΡΟΚ и расположен перед первой аминокислотой β-Ат для сохранения ЕсоК4сайта, используемого для клонирования).
- 62 006207
Олигонуклеотиды, используемые для получения фрагментов из β-амилоидных остатков 1-32 и 1-42: Р~Ат(1-32/42) -Т
5'-ССЗССААТТСАТССССААТТТСОТСАТ(ЗАСАСССССТАТСАС<ЗТССАССАТСАСАААСТаОТТТТСТТТОСССААОАТаТСС
ЗЕО Ю N0: 300 β-Αιτι(1-42) -В
5' -ССССАССТССССТАТСАСААССССАСССАССАТТААССССАТААТТОСССССТТСТТАСААСССАСАТСТТССССАААСАААА
ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 301 р-Ат(1-32)-В
5' -СЗСССАССТССАТААТТССССССТТОТТАСААСССАСАТСТТССССАААСАААА
5Е0 ΣΕ ХО: 302
ПЦР-праймеры для амплификации остатков 1-42:
β-Ат(Ь+1-32/42)-5'-РСК
5' -СССОСААТТСТССАТССОСААТТТСбТСАТС
ЗЕО ΙΒ ΝΟ: 303 β-Ат (1-42)-З'РСК
5'-ССССАССТССССТАТСА
ЗЕО Ю N0: 304
ПЦР-праймеры для амплификации остатков 1-32:
β-Ат(Ь+1-32/42)-5'-РСК
5' -ССССОААТТСТССАТаСОСААТТТССТСАТС
8Е0 Ю ΝΟ: 305 р-Ат(1-32)-З'РСК
5'-ССССАССТССАТААТТСС
ЗЕО Ю N0: 306
Пример 25. Конструкции на основе М2 вируса гриппа.
Недавно, №нупск е! а1. в работах (Ос! 1999) ΝαΗιιν Мед., 5 (10):1157-1163 и \О 99/07839 сообщали о присоединении внеклеточного домена М2, состоящего из 24 аминокислот, к Ν-концу полноразмерных частиц НВс (НВс 183), в которых отсутствовали аминокислотные остатки 1-4. Ниже схематически представлена конструкция, обозначенная здесь 1М2НВс, в которой 24-мер присоединен к Ν-концу НВс.
1М2НВС
МЗЬЬТЕУЕТР1ЕЫЕЧССНСЫЦЗЗЭ-НВс (5-183)
ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 307
В одном иллюстративном варианте получения этой конструкции эпитоп М2 был инсертирован в иммунодоминантную петлю кора вируса гепатита В, и частицы, обозначенные 1СС-1475, были успешно экспрессированы и очищены методами, описанными ранее для таких инсерций и очистки. Мутированный вариант эпитопа М2, в котором два цистеиновых остатка в положениях 17 и 19 нативного М2 были заменены аланиновыми остатками, также экспрессировался в иммунодоминантной петле (1СС-1473) и полученные в результате частицы очищали. Эти две частицы схематично проиллюстрированы ниже.
1СС-1475
НВс (1-78)-С1-5ЬЬТЕ7ЕТР1КЫЕИССКСЫ0330-ЕЬ-НВс(79149)
ЗЕО Ю N0: 308
1СС-1473
НВс (1-78)-О1-ЗЬЬТЕУЕТР1КЫЕМСАЕАЫО58О-ЕЬ-НВс(79149)-С
ЗЕО Ю N0: 309
- 63 006207
Конструкция ТСС-1473 давала приблизительно в 7 раз лучше очищенные частицы по сравнению с нативной последовательностью (ТСС-1475). Оставалось только определить, влияет ли мутация цистеиновых остатков на защитный потенциал этих частиц. Однако, эпитопы, присутствующие на иммунодоминантной петле НВс, обычно являются значительно более иммуногенными, чем те эпитопы, которые могут быть присоединены к другим областям (включая Ν-конец), и полученные частицы обладали пониженной анти-НВс иммуногенностью.
Были также получены частицы, в которых Ν-концевой 24-мерный эпитоп М2 был присоединен к Νконцу усеченных по С-концу коровых частиц вируса гепатита В. Эта конструкция (ТСС-1438) также содержала пред-коровую Ν-концевую последовательность (8ЕР ГО Ν0:310). Была получена аналогичная конструкция, которая содержала 1 цистеиновый остаток у конца гибридного белка (ТСС-1492), а в данном случае непосредственно за Vа1-149 гена НВс. Эти конструкции схематично представлены ниже.
1СС-1438
МОГЗЬЬТЕУЕТПКЫЕИОСКСЫОЗЗОЕЬЬОИЬИС! -НВс (2-149)
8Е0 ΙΏ N0:310
1СС-1492
МО13ЬЬТЕ7ЕТР1ВЫЕКССВСЫП53О^ЬаИЬИ(31-НВс (2-149) -С
5Е0 ΙΏ N0:311
Следует отметить, что во избежание инициации трансляции с инициирующего метионина природного НВс, кодон для этого остатка был мутирован так, чтобы он кодировал изолейциновый остаток. Остатки, вносимые рестрикционными ΕοοΚΣ(ΟΙ) и 8асI(Е^)-сайтами, подчеркнуты. Указанная предкоровая последовательность расположена между подчеркнутыми остатками ЕЬ и -НВс(2-149).
ДСН-ПААГ-анализ, обсуждаемый в настоящем описании, показал, что после получения мономерной конструкции ТСС-1438, эта конструкция оказалась нестабильной (дорожка 2), по сравнению с ТСС1492 (дорожка 3), при этом в качестве дополнительного молекулярно-массового контроля на ДСНПААГ-геле, как показано на фиг. 9, служили НВс-149 (дорожка 1), ТСС-1475 (дорожка 4) и ТСС-1473 (дорожка 5). Нестабильность мономеров ТСС-1438 не была очевидной при анализе методом аналитической гель-фильтрации частиц.
Ожидалось, что обе конструкции ТСС-1475 (фиг. 9, дорожка 4) и ТСС-1473 (фиг. 9, дорожка 5) будут иметь несколько меньшие молекулярные массы, чем ТСС-1438 и ТСС-1492, поскольку первые две конструкции содержат эпитоп М2, встроенный непосредственно в иммунодоминантную петлю, а поэтому они не содержали пред-коровую последовательность (8ЕР ГО Ν0:310), присутствующую в ТСС-1438 и в ТСС1498. Как и ожидалось, ТСС-1492 была больше, чем ТСС-1475 и ТСС-1473, однако, ТСС-1438, которая была идентична 1СС-1492, сохраняла С-концевой цистеиновый остаток и была явно не больше, чем ТСС1475 и ТСС-1473, из-за заметного расщепления.
Рассматривается также конструкция, содержащая Ν-концевую внеклеточную последовательность М2, обсуждаемую выше и присоединенную к Ν-концу (домен I) или к петле (домен II) НВс, а также содержащая С-концевую последовательность белка М2, такую как последовательность 8ЕР ГО Ν0:10 (см. табл. А), присоединенную к петле (домен II) или к С-концу (домен IV) НВс. Такая рассматриваемая конструкция также содержит по крайней мере один стабилизирующий С-концевой цистеиновый остаток, обсуждаемый в настоящем описании.
Пример 26. Сравнительная иммуногенность у обезьян.
На собакоподобных обезьянах проводили исследования сравнительной иммуногенности частиц, экспрессированных V12.Ρί3.1 и приготовленных либо с адъювантом 8ерр1с™ КА-720 (8ерр1с Ые., Ραπδ, 1;гапсе). либо с адъювантом АШу4го§е1™ (8ирег£оз, ^еηта^к), либо вообще без адъювантов (физиологический раствор).
Композицию с 8ерр1с™ КА-720 получали в соответствии с инструкциями производителей. Вкратце, КА-720 и частицы V12.Ρί3.1 смешивали в отношении 70:30 (мас./мас.) и подвергали интенсивному перемешиванию в течение 1 мин в настольном смесителе, установленном на максимальной мощности. Композиция с АШу4го§е1™ была получена с использованием 8-кратного избытка АШу4го§е1™ (по массе) по сравнению с частицами V12.Ρί3.1, которые, как показано, были физически связаны с АШу4го§е1™ перед иммунизацией.
Группы из двух обезьян (одного самца и одной самки) внутримышечно иммунизировали 20 мкг частиц V12.Ρί3.1, используемых в качестве иммуногена. У животных брали кровь на дни 0, 21, 42, 56 и
70, и сыворотку анализировали на титры анти-NΑNΡ антител с использованием ЕЙ18А. Результаты, представленные ниже в таблице 15, продемонстрировали исключительно высокую иммуногенность частиц V12.Ρί3.1 в случае использования 8ерр1с™ КА-720, по сравнению с частицами, приготовленными с
АШу4го§е1™ или без использования адъювантов. Кинетика гуморального ответа была более быстрой в случае, когда в качестве адъюванта использовали 8ерр1с™ КА-720, а титры в конечной точке титрования
- 64 006207 в 100 и 1000 раз превышали титры, полученные с использованием А1йуйгоде1™ и физиологического раствора соответственно.
Таблица 15
Адъювант Титры антител в установленное время (дни)
Ноль 21 42 56 70
Физиологический Раствор ноль 40 240 1200 640
А1Ьус1годе1™ ноль 2880 1920 11500 6400
Зерргс™ Ι3Ά-720 ноль 81920 348160 26000000 1920000
Пример 27. Активация Т-клеток.
Мышей дважды иммунизировали частицами ν12ΤΓ3.1 в 8ерр1с™ Моп!ашйе™ ША-720. Клетки селезенки удаляли и стимулировали в присутствии различных пептидов. 106 клеток инкубировали в течение 3 дней в присутствии пептидов: ИТС (универсального Т-эпитопа Р. Га1с1рагит; 8ЕО ГО N0:120), пептида р85-100, соответствующего 85-100 НВс, NАNР (В-клеточного эпитопа от ν12ΤΓ3.1; NАNРNV^Р((NАNР)3, 8ЕО ΙΌ N0:22) в присутствии энтеротоксина В 8!арйу1ососсик (8ЕВ), или среды для культивирования тканей (нестимулированной). Продуцирование интерферона гамма через 3 дня определяли с помощью ЕЫ8А.
Результаты, представленные ниже в табл. 16, показали, что иммунизация ν12ΤΓ3.1 индуцирует Тклетки, которые распознают компонент ИТС данного белка, и стимулирует продуцирование ими ответа Тй1-типа.
Таблица 16
Иммуноген ΙΕΝ-γ (пг/мл) З.О.*
итс 1600 750
Р85-100 350 30
ΝΑΝΡΝνϋΡ(ΝΑΝΡ)3 ЗЕ<2 Ю N0:22 370 50
ЗЕВ 4300 ΝΟ**
Нестимулирован 900 1100
* 5 . ϋ. стандартное отклонение **ИБ=не определяли
Каждый из цитируемых здесь патентов и статей вводится в настоящее описание посредством ссылки. Использование артикля а или ап перед существительным предусматривает, что данное существительное может означать как единственное, так и множественное число.
Описание и примеры, приведенные выше, даны лишь в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничение изобретения. В настоящее изобретение могут быть внесены другие изменения, не выходящие за рамки существа и объема изобретения, и эти изменения могут быть сделаны самим специалистом.
- 65 006207
Список последовательностей <110> ЗлгИеСС, АзЫеу < 12 0 > Иммуногенные химерные частицы НВс, имеющие повышенную стабильность <130> 4564/83501 1СС-102.2 РСТ < 14 0 > еще не переуступленная <141> 2001-08-16 <150> 60/226,867 <151> 2000-08-22 <150> 60/225,843 <151> 2000-08-16 <150> υβ3Ν ΝΟΤ Α55Ι0ΝΕ0 <151> 2001-08-15 <160> 313 <170> Ра^епЫп Уег. 2.1 <210> 1 <211> 16 <212> РЕТ <213> Р1азтосНит £а!с!рагит <400> 1
Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго
1 5 10 15
<210> 2
<211> 20
<212> РЕТ
<213> Р1азтосНит £а!с1рагит
<400> 2
(31и Туг Ьеи Азп Ьуз 11е С1п Азп Зег Ьеи Яег Таг □1и Тгр Зег Рго
1 5 10 15
А1а Зег 57а1 ТЬг <210> 3 <211> 15 <212> РЕТ <213> ЗЬгерЪососсиз рпеитопхае <400> 3
Ьуз Ьеи (31и О1и Ьеи Зег Азр Ьуз Не Азр С31и Ьеи Азр А1а βία 15 10 15
- 66 006207 <210> 4 <211> 35 <212> РРТ <213> ЗЪгерсососсиз рпеитопхае <400> 4
01п Ьуз Ьуз Туг Азр С1и Азр (31п Ьуз Ьуз ТЬг С1и 31и Ьуз А1а А1а
1 5 10 15
Ьеи С1и Ьуз А1а А1а Зег О1и □1и МеС Азр Ьуз А1а Уа1 А1а А1а Уа1
20 25 30
С1п 01п А1а <210> 5 <211> 27 <212> РНТ <213> СгурСозрогхсНит рагуит <400> 5 <31п Азр Ьуз Рго А1а Азр А1а Рго А1а А1а О1и А1а Рго А1а А1а О1и 15 10 15
Рго А1а А1а С1п О1п Азр Ьуз Рго А1а Азр А1а
25 <210> 6 <211> 17 <212> РНТ <213 > Вирус иммунодефицита типа I <$00> 6
Агд Ьуз Агд Не Н13 11е С1у Рго С31у Агд А1а РЬе Туг 11е ТЬг Ьуз 15 10 15
Азп <210> 7 <211> 31 <212> РНТ <213> Вирус ящура <400> 7
Туг Азп С1у С1и Суз Агд Туг Азп Агд Азп А1а \7а1 Рго Азп Ьеи Агд
1 5 10 15
С1у Азр Ьеи О1п Уа1 Ьеи А1а <31п Ьуз Уа1 А1а Агд ТЬг Ьеи Рго
20 25 30
<210> 8 <211> 10 <212> РНТ <213> Вирус гриппа А
- 67 006207 <400> 8
Туг Агд Азп Ьеи Ьеи Тгр Ьеи ТЫ О1и
5
Ьуз
<210> 9 <211> 23 <212> РНТ <213> Вирус гриппа А
<400> 9
Зег Ьеи Ьеи ТЫ О1и Уа1 О1и ТЬг Рго Не Агд Анп О1и Тгр О1у Суз
1 5 10 15
Агд Сун Азп С1у Зег Зег Анр <210> 10 с211> 23 <212> РНТ <213> Вирус гриппа А <400> 10
Зег Ьеи Ьеи ТЬг О1и Уа1 81и ТЬг Рго Не Агд Азп С1и Тгр О1у Суз
10 15
Агд Суз Азп Азр Зег Зег Азр <210> 11 <211> 142 <212> РНТ <213> Уегз1п1а ревСхз
<400> 11 О1у Азр А1а 15
Азр 1 11е Ьеи Ьуз Уа1 5 Г1е Уа1 Азр Зег МеС 10 Азп Н18 Н13
Агд Зег Ьуз Ьеи Агд З1и О1и Ьеи А1а О1и Ьеи ТЫ А1а О1и Ьеи Ьуз
20 25 30
Не Туг Зег Уа1 11е О1п А1а О1и Не Азп Ьуз ΗΪ3 Ьеи Зег Зег Зег
35 40 45
О1у ТЫ Не Азп Не Н18 Азр Ьуз Зег Не Азп Ьеи МеС Азр Ьуз Азп
50 55 60
Ьеи Туг αίγ Туг ТЬг Азр О1и О1и Не РЬе Ьуз А1а Зег А1а О1и Туг
65 70 75 80
Ьуз Не Ьеи С1и Ьуз МеЪ Рго 01п ТЬг ТЫ Не О1п Уа1 Азр О1у Зег
85 90 95
О1и Ьуз Ьуз Не Уа1 Зег 11е Ьуз Азр РЬе Ьеи С1у Зег О1и Азп Ьуз
100 105 но
Агд ТЬг 01 у А1а Ьеи О1у Азп Ьеи Ьуз Азп Зег Туг Зег Туг Азп Ьуз
115 120 125
- 68 006207
<210> 16
<211> 28
<212> РЕТ
<213> Могахе11а са^аггЬаНз
<400> 16
Ьеи Азр Не О1и Ьуз Азп Ьуз Ьуз Ьуз Агд ТЬг С1и АЗ а С1и Ьеи С1п
1 5 10 15
А1а С1и Ьеи Азр Азр Ьуз Туг А1а С1у Ьуз С1у Туг
20 25
- 69 006207 <210> 17 <211> 27 <212> РКТ <213> МогахеНа саЪаггЬаНз <400> 17
Не Азр Не С1и Ьуз Ьуз С1у Ьуз Не Агд ТЬг О1и А1а Ьеи Ьеи А1а 15 10 15
С1и Ьеи Азп Ьуз Азр Туг Рго 01у <31п <31у Туг
25 <210> 18 <211> 25 <212> РКТ <213 > РогрЬуготопаз дхпдгуаНэ <400> 18
С1у Уа1 Зег Рго Ьуз Уа1 Суз Ьуз Азр Уа1 ТЬг Уа1 (31и О1у Зег Азп 15 1015
О1и РЬе А1а Рго Уа1 О1п Азп Ьеи ТЬг
2025
<210> 19
<211> 20
<212> РКТ
<213> РогрЬуготопаз дхпддлгаНз
<400> 19
Агд Не О1п Зег ТЬг Тгр Агд (31п Ьуз ТЬг Уа1 Азр Ьеи Рго А1а С1у
* 1 5 10 15
ТЬг Ьуз Туг Уа1
<210> 20 <211> 21 <212> РКТ <213> Тгурапозота ςηιζι<400> 20—
Ьуз А1а А1а Не А1а Рго А1а Ьуз А1а А1а А1а А1а Рго А1а Ьуз А1а 15 1015
А1а ТЬг А1а Рго А1а <210> 21 <211> 24 <212> РКТ <213> Р1азтосИит £а!с1рагит
- 70 006207 <400> 21
Азп А1а Азп Рго Азп Уа1 Азр 1 5
Азп А1а Азп Рго Азп Уа1 Азр
Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго
15
Рго <210> 22 <211> 20 <212> РРТ <213 > Р1азтос11ит £а1с1рагит <400> 22
Азп А1а Азп Рго Азп Уа1 Азр 1 5
Азп А1а Азп Рго
Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго
15 <210> 23 <211> 20 <212> РРТ <213> Р1азтойхит £а1схрагит <400> 23
Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп
5
Азп А1а Азп Рго
Рго Азп А1а Азп Рго Азп Азр Рго
15 <210> 24 <211> 28 <212> РРТ <213> Р1азтосКит £а1с1рагит <400> 24
Азп А1а Азп Рго Азп Уа1 Азр 1 5
Азп А1а Азп Рго Авп Уа1 Азр
Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго
15
Рго А&п А1а Азп Рго <210> 25 <211> 20 <212 > РРТ <213> Р1авто0хит £а!с1рагит <400> 25
Азп Рго Азп Уа1 Азр Рго Азп 1 5
Азп Рго Азп Уа1
А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а
15
- 71 006207 <210> 26 <211> 22 <212 > РНТ <213> Р1азтос11ит £а1с1рагит <400> 26
Азп Рго Азп νβΐ Азр Рго Азп А1а 1 5
Азп Рго Азп Уа1 Азр Рго
Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а
15 <210> 27 <211> 24 <212> РНТ <213> Р1азтос11ит £а1схрагит <400> 27
Азп Рго Азп Уа1 Азр Рго Азп А1а 1 5
Азп Рго Азп Уа1 Азр Рго Азп А1а
Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а
15 <210> 2В <211> 18 <212> РЕТ <213> Р1азтосНит £а1с!рагит <400> 28
Азп Уа1 Азр Рго Азп А1а Азп Рго
5
Азп Уа1
Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго
15 <210> 29 <211> 20 <212> РЕТ <213 > Р1азтосНит £а1с1рагшп <400> 29
Азп Уа1 Азр Рго Азп А1а Азп Рго
5
Азп Уа1 Азр Рго
Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго
15 <210> 30 <211> 22 <212> РНТ <213> Р1азтод1ит £а1Нрагит <400> 30
Азп Уа1 Азр Рго Азп А1а Азп Рго
5
Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго
15
- 72 006207
Азп Уа1 Азр Рго Азп А1а <210> 31 <211> 16 <212> РНТ <213> РХазтосНит £аХсхрагит <400> 31
Азр Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп 7а1
1 5 10 15
<210> 32 <211> 18 <212> РНТ <213> РХазтосНит £аХсхрагит
<400> 32
Азр Рго Азп АХа Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп Уа1
1 5 10 15
Азр Рго <210> 33 <211> 20 <212> РНТ <213 > Р1авто<11итп £аХсхрагит <400> 33
Азр Рго Азп А1а Авп Рго Авп А1а Авп Рго Авп А1а Азп Рго Азп 7аХ 15 10 15
Авр Рго Авп А1а <210> 34 <211> 19 <212> РНТ <213 > РХазтодхит νίνΒΧ <400> 34
СХу Азр Агд А1а Азр ОХу С1п Рго А1а ОХу Азр Αχ-д А1а Азр С1у ОХп 15 10 15
Рго А1а С1у <210> 35 <211> 1В <212> РНТ <213> РХазтодхит νχναχ <400> 35
Агд А1а Авр Азр Агд А1а А1а ОХу 01/. Рго А1а ОХу Азр ОХу ОХп Рго * 5 10 * 15
- 73 006207
- 74 006207 <400> 40
А1а Рго С1у А1а Азп 01п 01и <31у <31у А1а А1а А1а Рго С1у А1а Азп 15 10 15
О1п С1и <31у С1у А1а А1а <210> 41 <211> 16 <212> РРТ <213> Р1авто(Иит ЬегдЬе1 <400> 41
Азр Рго Рго Рго Рго Азп Рго Азп
1 5
<210> 42
<211> 24
<212> РРТ '
<213> Р1азтосИит уоеНх
<400> 42
С1п С1у Рго <31у А1а Рго О1п С1у
1 5
А1а Рго 01п С1у Рго С1у А1а Рго
20
<210> 43
<211> 15
<212> РРТ
<213> ЗЫерЬососсиз зоЬгхпиз
<400> 43
Ьуз Рго Агд Рго Не Туг 01и А1а
1 5
<210> 44
<211> 16
<212> РРТ
<213> ЗСгерЬососсиз зоЬг!пиз
<400> 44
А1а Ьуз А1а Азр Туг <Э1и А1а Ьуз
1 5
Азр Рго Рго Рго Рго Азп Рго Азп
15
Рго О1у А1а Рго С1п С1у Рго С1у
15
Ьуз Ьеи А1а С1п Аэп 01п Ьуз 10 15
Ьеи А1а С1п Туг О1и Ьуз Азр Ьеи
15 <210> 45 <211> 9 <212> РРТ <213 > ЗЫдеИа £1ехпег1 <400> 45
Ьуз Азр Агд ТЬг Ьеи 11е С1и С1п Ьуз ’ 5
- 75 006207 <210 46 <211> 15 <212> РИТ <213> Респираторно-синцитиальный вирус <400> 46
Суз Зег 11е Суз Зег Азп Азп Рго ТЫ Суз Тгр А1а Не Суз Ьуз
1 5 10 15
<210> 47
<211> 25
<212> РИТ
<213> ЕпСатоеЬа Ывео1уе1са
<400> 47
Уа1 01и Суз А1а Зег ТЫ Уа1 Суз 01П Азп Азр Азп Зег Суз Рго Не
1 5 10 15
Не А1а Азр Уа1 С1и Ьуз Суз Азп 01п
25 <210> 48 <211> 34 <212> РИТ <213> ЗсМэЪозота ^аропхсит <400> 48
Аар Ьеи С1п Зег 1 <31и Не 5 Зег Ьеи Зег Ьеи 10 С31и Азп С1у С1и Ьеи 15 Не
Агд Агд А1а Ьуз Зег А1а 01и Зег Ьеи А1а Зег (31 и Ьеи 01п Агд Агд
25 30
Уа1 Азр <210> 49 <211> 34 <212> РПТ <213> ЗсЫз^озота тапзоп!
<400> 49
Азр Ьеи С1п Зег С1и Не Зег Ьеи Зег Ьеи О1и Азп Зег С1и Ьеи Не
1 5 10 15
Агд Агд А1а Ьуз А1а А1а 01и Зег Ьеи А1а Зег Азр Ьеи αΐη Агд Агд
20 25 30
Уа1 Азр <210> 50 <211> 16 <212> РИТ <213 > Вирус иммунодефицита человека
- 76 006207 <400> 50
О1у Рго Ьуз О1и Рго РЬе Агд Азр Туг Уа1 Азр Агд РЬе Туг Ьуз Суз
1 5 10 15
<210> 51
<211> 17
<212> РКТ
<213> СогупеЬасЬегАит сНрЬЪЬеНае
<400> 51
РЬе О1п Уа1 Уа1 Н13 Азп Зег Туг Авп Агд Рго А1а Туг Зег РГО С1у
1 5 10 15
Суз <210> 52 «211> 25 <212> РКТ <213> ВоггеНа Ьигдпог£ег1 <400> 52
Уа1 С1и Не Ьув С1и О1у ТЬг 7а1 ТЬг Ьеи Ьуз Агд Э1и Не Азр Ьуз 15 10 15
Азп <31у Ьув Уа1 ТЬг Уа1 Зег Ьеи Сув
25 <210> 53 <211> 19 <212> РКТ <213> ВоггеНа Ьигдбог£егх <400? 53
ТЬг Ьеи Зег Ьув Авп Не Зег Ьув Зег <31у <31и
10
Уа1 Зег Уа1
С1 и Ьеи
Азп Авр Суз
<210> 54
<211> 11
<212> РКТ
<213> Вирус гриппа А
<400> 54
Зег Зег Уа1 Зег Зег РЬе 01и Агд РЬе <Э1и Сув
1 5 10
<210> 55 <211> 21 <212> РКТ <213> Тгураповота сгигх
- 77 006207 <400> 55
5ег Н1з Азп РЬе ТЬг Ьеи Уа1 А1а Зег 7а1 Не Не С1и <Э1и А1а Рго 15 10 15
Зег С1у Азп ТЬг Суз <210> 56 <211> 16 <212> РНТ <213> Р1азтоп1ит £а!с1рагит <400> 56
Зег Уа1 С1п Не Рго Ьуз Уа1 Рго Туг Рго Азп С1у Не Уа1 Туг Суз 15 10 15 <210> 57 <211> 16 <212> РНТ <213> Р1азпюсИит £а1с1рагит <400> 57
Азр РЬе Азп ΗΪ3 Туг Туг ТЬг Ьеи Ьуз ТЬг <31у Ьеи <31и А1а Азр Суз
10 15 <210> 58 <211> 18 <212> РНТ <213> Р1азтодхит £а1схрагит <400> 58
Рго Зег Авр Ьуз Нхз Не О1и С1п Туг Ьуз Ьуз
10
Не Ьуз Азп Зег Не
Зег Суз
<210> 59 <211> 20 <212> РНТ <213> Р1азтодхит £а!схрагит
<400> 59
О1и Туг Ьеи Азп Ьуз Не С1п Азп Зег Ьеи Зег ТЬг О1и Тгр Зег Рго
1 5 10 15
Суз Зег Уа1 ТЬг <210> 60 <211> 19 <212> РНТ <213> Р1азтосНит νίνβχ
- 78 006207 <400> 60
Туг Ьеи Азр Ьуз Уа1 Агд А1а ТЬг Уа1 С1у ТЬг О1и Тгр ТЬг Рго Суз 15 10 15
Зег Уа1 ТЬг <210> 61 <211> 16 <212> РРТ <213> ЗСгерЬососсиз зоЬг1пиз <400> 61
Ьуз Рго Агд Рго Не Туг С1и А1а Ьуз Ьеи А1а (31п Азп <31п Ьуз Суз 15 10 15 <210> 62 <211> 17 <212> РЕТ <213 > ЗСгерСососсиз зоЬгЬпиз <400> 62
А1а Ьуз А1а Азр Туг С1и А1а Ьуз Ьеи А1а О1п Туг <31и Ьуз Азр Ьеи 15 10 15
Суз <210> 63 <211> 16 <212> РКТ <213 > Вирус лимфоцитарного хореоменингита <400> 63
Агд Рго (31п А1а Зег О1у Уа1 Туг МеЬ <31у Азп Ьеи ТЬг А1а СЯп Суз
1 5 10 15
<210> 64 <211> 16 <212> РЕТ <213 > С1озегЬс11ит СеЬапх <400> 64 (31п Туг 11е Ьуз А1а Азп Зег Ьуз РЬе 11е С1у 11е ТЬг <31и Ьеи Суз
1 5 10 15
<210> 65 <211> 18 <212> ДНК <213 > Плазмида рКК223 <400> 65 ддсдсасдса аддадаСд
- 79 006207 <210>
<211>
<212>
<213>
6
ДНК
Плазмида рКК223 <400> дсдаадс^хс ддаъсссагд ссссаЪдЪда ааъсдсъасс сдсхс <210>
<221>
<212>
<213>
ДНК
Вирус гепатита В <400>
СЪдддссаГд дасаСсдасс сП<:а <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Вирус гепатита В <400>
дсддааЪЪсс £€ссаааЪ£а асасссасс <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Вирус гепатита В <400> сдсдааЪЪса аааададсСс даСссадсдС с&ададас <210> <211> <212> <213>
ДНК
Вирус гепатита В <400>
сдсаадсеЪа аасаасадЬа дЪсЪссддаа <210> <211> <212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: цитохром 450 человека <400>
сдадс^д^ас аееъдсдПсх ъсдСсЬадсе д^^ъесъед
- 80 006207 <210> 72 <211> 31 <212> ДНК < 213 > Вирус гепатита В <400> 72 дсддааСЪсс аЪсЬСссааа Ь^аасассса с 31 <210> 73 <211> 39 <212> днК <213 > Вирус гепатита В <400> 73 сдсдааесса аааададссс ссадсдСсЬа дадасс&ад 39 <210> 74 <211> 39 <212> ДНК ' <213 > Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: цитохром 450 человека <400> 74 саадааааас адсЪадасда ааасдсаааъ дЪасадс&с 39 <210> 75 <211> 42 <212> ДНК <213> Вирус гепатита В <400> 75 сдсаадсеъа дадсЪсСЬда аеессаасаа садеадесЬс сд 42 <210> 76 <211> 28 <212> ДНК <213 > Вирус гепатита В <400> 76 сдсдадсСсс садсдЬс^ад адассСад 20 <210> 77 <211> 17 <212> ДНК <213> Плазмида рКК223 <400> 77 дЪа£саддс£ дааааЪс
- 81 006207 <210> 73 <211> 19 <212> Р?.Т <213 > ?1азто<Лит £а1схрагит <400> 78
Не Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп 15 10 15
Рго О1и Ьеи <210> 79 <211> 57 <212> ДНК <213> Р1азтосИит £а1схрагит <400> 79 ааСЬаасдсР ааЪссдаасд сЪааСссдаа сдс£ааессд аасдссааес сддадсС 57 <210> 80 <211> 49 <212> ДНК <213> Р1азто01ит £а1схрагит <400> 80 ссддаСЬадс дЪЬсддаЬСа дсдРСсддас ЬадсдРЬсдд аЬСадсдЫ:
<210> 81 <211> 31 <212> РНТ <213> Р1азто(Нит £а1схрагит <400> 81
11е 1 Азп А1а Азп Рго 5 Азп Уа1 Азр Рго Азп 10 А1а Азп Рго Азп А1а Азп 15
Рго Азп А1а Азп 20 Рго Азп Уа1 Азр Рго 25 АЗП А1а Азп Рго (31и 30 Ьеи
<210> 82 <211> 93 <212> ДНК <213> Р1азтос11ит £а1схрагит <400> 82 ааССаасдсС ааСссдаасд ЪЬдасссдаа сдсСааЬссд аасдсЕаа^с сдаасдсСаа 60 СссдаасдЫ: дасссдаасд скааСссдда дсС 93 <210> 83 <211> 91 <212> ДНК <213> Р1азто0хит £а!схрагит
- 82 006207 <400> 83 ддадсЬссдд аеъадсдеъс дддЬсаасдЬ Ъсддаеьадс депеддас^а дсдЬСсддаъ 60 ^адсдсесдд десаасдЪЬс ддаЬ^адсдЪ € 91 <210> 84 <211> 23 <212 > РРТ <213> Р1азтос11ит £а1С1рагит <400> 84
Не Азп А1а Азп Рго Азп \7а1 Азр Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп
10 15
Рго Азп А1а Азп Рго (31и Ьеи <210> 85 <211> 69 <212> ДНК <213 > Р1аетоШит £а1с1рагит <400> 85 аа££аасдсд ааЬссдаасд ЬддаСссдаа £дссаассс£ аасдссаасс саааЬдсдаа сссададсЕ <210> 86 <211> 61 <212> ДНК <213> Р1азтосНит £а!с1рагит <400> 86 сйдддъесдс аЪЪЕдддЪЪд дсдЬЬадддЪ ЬддсаЬ^сдд аЪссасдЬСс ддаЬСсдсдЬ 60
Ъ 61 <210> 87 <211> 23 <212> РРТ <213> Р1азтос11ит £а!с1рагит <400> 87
11е Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп Уа1 Азр ю 15
Рго Азп А1а Азп Рго С1и Ьеи <210> 8В <211> 69 <212> ДНК <213 > Р1азтос11ит £а1с1рагит <400> 88 ааЬЪаасдсд ааЕссдааСд ссаасссЬаа сдссаассса аасдСддаъс сдаа^дсдаа 60 сссададсС 69
- 83 006207 <210> 89 <211> 61 <212> ДНК <213> Р1азто01ит £а1с1рагит <400> 89 седддеесдс аеесддаесс асдеееддде еддсдееадд дседдсаеес ддаеесдсде 60 е 61 <210> 90 <211> 31 <212> РНТ <213> Р1азтод1ит £а1с1рагит <400> 90
Х1е 1 Азп АХ а Азп Рго 5 Азп УаХ Азр Рго Азп 10 А1а АЗП Рго Азп А1а Азп 15
Рго Азп АХ а Азп 20 Рго Азп УаХ Азр РГО 25 Азп А1а Азп Рго С1и 30 Ьеи
<210> 91 <211> 93 <212> ДНК <213 > Р1азтосЦ.ит £а1с1рагит <400> 91 ааееаасдсд ааЪссдаасд еддаессааа едссаасссЪ аасдсЬааЬс сааасдссаа 60
сссдааедее дассссааЪд ссааЬссдда дсЬ 93
<210> 92
<211> 85
<212> ДНК
<213> РХазтосИит £а1сХрагит
<400> 92
ссддаееддс аеЬддддеса асаЬЪсддде еддсдЬЫдд аЪЬадсдееа дддЬЪддсае 60
ееддаессас дЪесддаеес дсдЪЪ 85
<210> 93 <211> 23 <212> РНТ
<2ХЗ> Р1автой1ит £аХсХрагит
<400> 93 Не Азп Рго Азп УаХ Азр Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп
1 5 10 15
А1а Азп Рго Азп Уа1 ОХи Ьеи <210> 94 <211> 69 <212> ДНК <213 > Р1азто<31Г’П £а!с1рагит
- 84 006207
- 85 006207 <210> 100 <211> 81 <212> ДНК <213 > Р1азто<Иит £а1с1рагит <400> 100 ааЪЬаасссд аасдСддаЪс саааЬдссаа ссс^аасдсс ааДссааасд ссаасссдаа 60 ЬдСЬдасссЪ ааСдсСдадс е 81 <210> 101 <211> 73 <212> ДНК <213> Р1азтосНит £а1сграгит <400> 101 садса^Садд дСсаасаЬСс дддСЬддсдЪ СЬддаЪЪадс дЬЬадддйСд дсаСЬЬддаГ ссасдЬЪсдд аСЬ
<210> 102 <211> 21 <212> РВТ <213> Р1азтос11ит £а1с1рагит
<400> 102
11е Азп Уа1 Азр Рго Азп А1а Азп Рго Авп А1а Азп Рго Азп А1а Азп
1 5 10 15
Рго Азп Уа1 б1и Ьеи <210> 103 <211> 63 <;212> ДНК <213> Р1азтос11ит £а1с1рагит <400> 103 ааЬЬаасдЬд даЬссаааЬд ссаасссЪаа сдсЪааСсса дсЬ аасдссаасс сдааЬдседа 60 <210> 104 >----<211> 55 <212> ДНК <213> Р1азтоб1.ит £а1с1рагит <400> 104 саасаСПсдд дсьддсдеес ддаъеадсдЬ Ъадддссддс аЬПЪддаЬсс асдЬЬ <210> 105 <211> 23 <212> РНТ <213> Р1азтоб1ит £а1с1рагит <400> 105
Не Азп Уа1 Азр Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Аэп А1а Азп
10 15
- 86 006207
Рго Азп \'а1 Авр Рго С1ч Ьеи <210> 106 <211> 69 <212> ДНК <213> Р1а5пто<Иит £а1с1рагит <400> 106
ааЕЪаасдСд даСссаааЬд ссаасссПаа сдсйааЬсса аасдссаасс сдааСдЬЬда 60
сссЬдадс!: 69
<210> 107
<211> 61
<212> ДНК
<213> Р1азтоа1ит £а1с1рагит
<400> 107
садддесаас аЬйсдддЬЬд дсдСЬЪддаЬ Ъадсдееадд дЪСддсаЕге ддайссасде 60 )
η 61
<210> 10Θ
<211> 25
<212> РНТ
<213> Р1азтоб£ит £а1с1рагит
<400> 108
Не Азп 17а1 Авр Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Авп А1а Азп
1 5 10 15
Рго Азп Уа1 Азр Рго Азп А1а С1и Ьеи
20 25
<210> 109 <211> 75 <212> ДНК <213 > Р1азто<Нит £а1с1рагит <400> 109 ааьеаасдйд даПссаааСд ссаасссСаа сдсСааЬсса аасдссаасс сдааСдЬЬда 60
сссЪааСдсС дадсЪ 75
<210> 110
<211> 67
<212> ДНК
<213> Р1азтосИит £а1с!рагит
<400> 110
садсаеьадд дСсаасаССс дддййддсдС ееддаССадс дссадддЪИд дсаСССддаЬ 60
ссасдег. 67
<210> 111 <211> 19 <212 > РНТ <213-» ?1азтосПит £а1с1рагит
- 87 006207 <400> 111
Не Азр Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Аэп 15 10 15
Уа1 <31и Ьеи <210> 112 <211> 57 <212> ДНК <213> Р1азтосИит £а1с1рагит <400> 112 ааеьдаСсса аапдссаасс сеаасдспаа Ъссааасдсс аасссдааед иСдадсс 57 <210> 113 <211> 49 <212> ДНК <213 > РГазтосИит £а1с1рагит <400> 113 саасаЬЬсдд дССддсдЬЬР ддаЪСадсдЬ ьадддЬСддс а£Ь£дда£с <210> 114 <211> 21 <212> РНТ <213> Р1азто{Нит £а1с!рагит <400> 114
11е Азр Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп 15 10 15
Уа1 Азр Рго О1и Ьеи <210> 115 <211> 63 <212> ДНК <213> Р1аатосПит £а1с1рагит <400> 115 ааПЬдаСсса аапдссаасс сЬаасдсПаа Ьссааасдсс аасссдааПд ъидассседа 60 дсЪ 63 <210> 116 <211> 55 <212> ДНК <213> Р1азто<Иит £а1с1рагит <400> 116 садддксаас аЬСсдддСЬд дсдЪСЬдда!: ЬадсдЬЪадд дсПдосаППС дда£с 55
- 88 006207 <210> 117 <211> 23 <212> РКТ <213 > Р1автойэ.ит £а!с1рагит <400> 117
Не Авр Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп 15 10 15 \7а1 Авр Рго Азп А1а (31 и Ьеи <210> 118 <211> 69 <212> ДНК <213> Р1азтодлит £а1с1рагит <400> 118 ааъедаЬсса ааЬдссаасс сеаасдспаа Сссааасдсс СдссдадсЕ аасссдааСд СЕдассссаа бй <210> 119 <211> 61 <212> ДНК <213> Р1а8тосИит £а1с!рагит <400> 119 сддсаЬЬадд дЕсаасаЬЕс дддЕЬддсдЪ с
ЕЬддаЬЬадс дЬЬадддЪЬд дсаьеСддаС
<210> 120 <211> 21 <212 > РКТ <213 > Р1азтос11ит £а1с1рагит
<400> 120
11 е С1и Туг Ьеи Азп Ьуз Не (31п Азп Зег Ьеи Зег ТЬг С1и Тгр Зег
1 5 10 15
Рго Сув Зег Уа1 ТЬг
<210> 121 <211> 69 <212> ДНК <213> Р1азтосН.ит £а1с1рагит <400> 121 ааеидааСаЬ сЬдаасаааа ПссадаасПс ЬсЪдЪссасс дааЬддесбс сдедсСссдС 60 сассСадЬа 69 <210> 122 <211> 69 <212> ДНК <213> Р1а81<юсНит £а!с1рагит
- 89 006207 <400> 122 адсЪЕасйад дЬаасддадс асддадасса ьссддпддас адададсЬс* ддаССЬЪдЬЬ 60 садаЬаеЕс 69 <210> 123 <211> 24 <212> РЫТ <213> Р1азто0гит νίνβχ <400> 123
Не Рго А1а С1у Азр Агд А1а Азр 01у С1п Рго А1а О1у Азр Агд А1а
5 10 15
А1а <31у С1п Рго А1а С1у 01и Ьеи <210> 124 <211> 72 <212> ДНК .
<213> Р1аетос11ит νϊνβχ <400> 124 ааеессддсЬ ддьдассдьд садаеддсса дссадсдддй дассдсдсСд саддссадас 60 ддседдсдад се 72 <210> 125 <211> 64 <212> ДНК <213> Р1азтосНит νίνβχ <400> 125 сдссадссдд сСддссСдса дсдсддЪсас ссдседдсйд дссаСсСдса сддПсассад 60 срдд 64 <210> 126 <211> 21 <212> РКТ <213> Р1азтосНит угуэх <400> 126
11е Азр Агд А1а А1а С1у <31 η Рго А1а С1у Авр Агд А1а Азр С1у 01п
1015
Рго А1а <31у С1и Ьеи <210> 127 <211> 63.
<212> ДНК <213 > Р1азтосНит νίνβχ <400> 127 ааЬСдасада дсадссддас аассадсадд сдаЬсдадса дасддасадс ссдсадддда 60 дсе63
- 90 006207 <210> 128 <211> 55 <212> ДНК <213 > Р1азтосИит νίνβχ <400> 128 ссссрдсддд сЬдйссдЬсС дсЬсдаксдс сРдсРддерд РссддсСдсЕ сРдЬс 55 <210> 129 <211> 21 <212> РЕТ <213> Р1азтосИит νίνβχ <400> 129
Не А1а Азп С1у А1а <31у Азп 01п Рго 01у А1а Азп С1у А1а 01у Азр 15 10 15
О1п Рго С1у б1и Ьеи <210> 130 <211> 63 <212> ДНК <213 > Р1азто(Нит νίναχ <400> 130 ааЕйдсдаас ддсдссддЬа аЬсадссддд ддсааасддс дсдддЬдаЬс аассадддда 60 дсе 63 <210> 131 <211> 55 <212> ДНК <213> Р1аэтос1хит νίνβχ <400> 131 ссссСддЪЪд аРсасссдсд ссдСССдссс ссддсрдарс ассддсдссд СЪсдс 55 <210> 132 <211> 21 <212> РЕТ <213> Р1азтосИ.ит νίνβχ <400> 132
Не А1а Азп 31у А1а Азр Азп <31п Рго <31у А1а Азп (31у А1а Азр Азр
10 15
С1п Рго С1у С1и Ьеи <210> 133 <211* 63 <212> ДНК <213> Р1азтоб1ит νίνακ
- 91 006207 <400:» 133
ааЪЬдсдаас ддсдссдаЬа аЬсадссддд сдсааасддд дсддасдасс аассаддсда 60
дсг 63
<210> 134
<211> 55
<212 > ДНК
<213> Р1азтодхит νχνβχ
<400> 134
сдссЬддСЬд дЬсаЬссдсс ссдЫХдсас ссддсбдаЬЪ аЬсддсдссд ЬЬсдс 55
<210> 135 <211> 39 <212> РЕТ <213 > Р1азтодхшп νΐνβχ <400> 135
11е А1а Азп С1у А1а <31у Азп О1п Рго 01у А1а Азп С1у А1а С1у Азр
5 10 15
01п Рго С1у А1а Азп (31у А1а Азр Азп С1п Рго <31у А1а Азп С1у А1а
25 30
Азр Азр <Э1п Рго б1у б1и Ьеи <210> 136 <211> 117 <212> ДНК <213 > Р1азтос11ит νίναχ <400> 136 ааЬЬдсдаас ддсдссддЬа аЬсадссддд адсааасддс дсдддддаЬс аассаддсдс 60 сааЬддЬдса дасаассадс сЬддддсдаа ЬддадссдаЬ дассаасссд дсдадсЬ 117 <210> 137 <211> 109 <212> ДНК <213 > Р1азто<Нит νΐνειχ <400> 137 сдссдддЬЬд дЬсайсддсЬ ссаЬЬсдссс саддсЬддкЬ дссьдсасса СйддсдссСд 60 дСЬдаСсссс сдсдссдЬСС дсЬсссддсЬ даЬСассддс дссдЪСсдс 109 <210> 138 <211> 25 <212> РКТ <213 > Р1азтос1хит ухуах <400> 138
11е А1а Рго С1у А1а Азп <31п С1и 01у <31у А1а А1а А1а Рго С1у А1а
10 15
Азп <Э1п <31и С1у С1у А1а А1а <31и Ьеи
25
- 92 006207 <210> 139 <211> 75 <212> ДНК <213> Р1азп»о<Нит νίνβχ <400> 139 ааРсдсдсс^ ддсдссаасс аддааддЬдд ддскдсадсд ссаддадсеа аксаадаадд 60 сддЬдсадсд дадсЬ 75 <210> 140 <211> 67 <212> ДНК <213> Р1азтоб1ит νίνβχ <400> 140 ссдсСдсасс дссЬЬсСЬда еЬддскссЬд дсдсЬдсадс сссассРЬсс еддс+ддсдс 60 ссддсдс 67 <210> 141 ' <211> 21 <212 > РКТ <213> Р1автосНит νίνβχ <400> 141
Не С1и Туг Ьеи Азр Ьуз Уа1 Агд А1а ТЬг Уа1 <31у ТЬг С1и Тгр Тпг
10 15
Рго Суз 8ег Уа1 ТНг <2Ю> 142 <211> 69 <212> ДНК <213> Р1азто<Нит νίνβχ <400> 142 ааШдааЪае скддакааад СдсдСдсдас сдСЬддсасд даакддаскс сдСдсадсдС 60 дасскаака 69 <210> 143 <211> 69 <212> ДНК <213> Р1азто(Иип> νϊνβχ <400> 143 адсееасеад дЬсасдсЬдс асддадесса ЬСсрдЬдсса асддСсдсас дсасССИаСс 60 садабасьс 69 <210> 144 <211> 10 <212> РКТ <213> Р1азтосНит £а1с1рагит
- 93 006207
- 94 006207 <210> 151 <211> 8 <212> РЕТ <213> Вирус гепатита В <400> 151
Тйг Зег Ьеи Не Рго А1а Азп Рго
5 <210> 152 <211> 34 <212> ДНК <213> Вирус гепатита В <400> 152 сдсаадссеа ЬдПЪдасадд аЬаддддсас СЬдд 34 <210> 153 <211> 7 <212> РКТ <213> Вирус гепатита В <400> 153
Ьеи 11е Рго А1а Азп Рго Рго
5 <210> 154 <211> 31 <212> ДНК <213> Вирус гепатита В <400> 154 сдсаадсСйа ЬаддаЬаддд дсаЪЬЬддьд д 31 <210> 155 <211> б <212> РЕТ < 213 > Вирус гепатита В <400> 155
11е Рго А1а Аап Рго Рго
5 <210> 156 <211> 28 <212> ДНК <213 > Вирус гепатита В <400> 156 дсдаадсььа даСаддддса еьеддЪдд 28 <210> 157 <211> б <212 > РР.Т < 213 > Вирус гепатита В
- 95 006207 <400> 157
Рго А1а Азп Рго Рго Агд
5 <210> 158 <211> 28 <212> ДНК <213 > Вирус гепатита В <400> 158 сдсаадскеа аддддсаССЬ ддЬддСсЬ 28 <210> 159 <211> 7 <212> РКТ <213 > Вирус гепатита В <400> 159
Суз Рго А1а Азп Рго Рго Агд
5 <210> 160 <211> 7 <212> РКТ <213 > Вирус гепатита В <400> 160
А1а Азп Рго Рго Ахд Туг А1а
5 <210> 161 <211> 31 <212> ДНК <213 > Вирус гепатита В <400> 161 дсдаадсееа дсааддддса кееддЪддЬс ύ 31 <210> 162 <211> 30 <212> ДНК <213 > Вирус гепатита В <400> 162 дсдаадссеа ддсаЬЫгддк ддСскаСадс 30 <210> 163 <211> 8 <212> РКТ < 213 > Вирус гепатита В <400> 163
Суз А1а Азп Рго Рго Агд Туг А1а
5
- 96 006207 <210> 164 <211> 32 <212> ДНК <213> Вирус гепатита Β <400> 164 дсдаадс££а дсаддсаССС ддЬддЬскаЬ аа 32 <210> 165 <211> 7 <212> РКТ <213> Вирус гепатита В <400> 165
Азп Рго Рго Агд Туг А1а Рго
5 <210> 166 <211> 31 <212> ДНК <213 > Вирус гепатита В <400> 166 сдсаадсСЬа аГседдЬдде сЬаеаадсЬд д 31 <210> 167 <211> 8 <212> РКТ <213> Р1азтоб1ит £а1с1рагшп <400> 167
Азп А1а Азп Рго Азп Уа1 Азр Рго
5 <210> 168 <211> б <212> РКТ <213> Ното заргепз <400» 168
Азп Туг Ьуз Ьуз Рго Ьуз
5 <210> 169 <211> 7 <212> РКТ <213 > Вирус гепатита В <400> 169
Ьуз Агд <31у Рго Агд ТЬг Нхз
5
- 97 006207 <210> 170 <211> 21 <212> РКТ <213> Кото вархепз <400> 170
Ьеи ΗΪ8 Рго Азр <31и ТЬг Ьуз Азп МеС Ьеи <Э1и МеС 11е РЬе ТЬг Рго 15 10 15
Агд Азп Зег Азр Агд <210> 171 <211> 5 <212 > РКТ <213 > Вирус иммунодефицита человека типа I <400> 171
Агд 11е Ьуз С1п 11е
5 <210> 172 <211> 11 <212> РКТ < 213 > Вирус иммунодефицита человека типа I <400> 172
Агд 11е Ьуз (31п 11е В1у МеЕ Рго О1у О1у Ьуз 15 10 <210> 173 <211> 10 <212> РКТ < 213 > Вирус иммунодефицита человека типа I <400> 173
Ьеи Ьеи С1и Ьеи Азр Ьув Тгр А1а Зег Ьеи
10 <210> 174 <211> 14 <212> РКТ <213 > Вирус иммунодефицита человека типа I <400> 174
01и <31п <31и Ьеи Ьеи С1и Ьеи Азр Ьуз Тгр А1а Зег Ьеи Тгр 15 10 <210> 175 <211> 33 <212> РКТ < 213 > Вирус иммунодефицита человека типа I <400> 175
Уа1 О1п С1п 01п Авп Азп Ьеи Ьеи Агд А1а 11е С1и Л1а 01п О1п Нхв 15 10 15
- 98 006207
Ьеи Ьеи 01п Ьеи ТНг Уа1 Тгр С1у Не Ьуз О1п Ьеи С~п А1а Агд Не
20 25 30
Ьеи
<210> 176
<211> 16
<212> РНТ
<213> Вирус иммунодеф )ицита человека типа 1
<400> 176
Ηίβ Ьеи Ьеи 01п Ьеи ТНг Уа1 Тгр О1у 11е Ьуз О1п Ьеи 01п А1а Агд
1 5 10 15
<210> 177 <211> 36 <212> РНТ < 213 > Вирус иммунодефицита человека типа I <400> 177
Туг ТНг Ηίβ Не Не Туг Зег Ьеи Не С1и О1п Зег С1п Азп О1п С1п
1 5 10 15
О1и Ьуз Азп С1и С1п (31и Ьеи Ьеи А1а Ьеи Азр Ьуз Тгр А1а Зег Ьеи
20 25 30
Тгр Азп Тгр РЬе <210> 178 <211> 26 <212> РКТ <213 > Вирус иммунодефицита человека типа I <400> 178
Туг ТНг Ηίβ Не Не Туг Зег Ьеи 11е О1и О1п Зег С1п Азп О1п О1п 15 10 15
О1и Ьуз Азп О1и С1п О1и Ьеи Ьеи О1и Ьеи
25 <210> 179 <211> 19 <212> РНТ <213> Ното зархепз <400> 179 (31у Агд 01и Агд Агд Рго Агд Ьеи Зег Азр Агд Рго-βΐη Ьеи Рго Туг 15 10 15
Ьеи О1и А1а
- 99 006207 <210> 180 <211> 20 <212> РНТ <213> Нойю вар1епз <400> 180
Зег ТЬг Ьеи Агд Азп Ьеи О1у Ьеи
15
Агд О1и С1п Агд Агд РЬе Зег Уа1
1 <31у Ьув Ьув 5 Зег 20
<210> 181
<211> 18
<212> РКТ
<213> Р1азтойхит уое1хх
<400> 181
Рго Азп Ьув Ьеи Рго Агд Зег ТЬг
1 5
Ьуз НХВ
<210> 182
<211> 11
<212> РКТ
<213> Р1азто(3хит уое1И
<400> 182
ТЬг А1а Уа1 Уа1 Нхв С1п Ьеи Ьуа
1 5
<210> 183
<211> 22
<212> РКТ
<213> Р1азто<1хит νχνβχ
<400> 183
РГО А1а С1у Азр Агд А1а Аар О1у
1 5
А1а С1у С1п Рго А1а В1у
20
А1а Уа1 Уа1 Нхз С1п Ьеи Ьуз Агд 10 15
Агд Ьув Нхв
С1п Рго А1а С1у Азр Агд А1а А1а
15 <210> 184 <211> 12 <212> РКТ <213> Вирус птичьего лейкоза <400> 184
Азп <31п Зег Тгр ТЬг МеЬ Уа1 Зег
5
Рго 11е Азп Уа1
- 100 006207 <210> 185 <211> 16 <212> РКТ < 213 > Вирус птичьего лейкоза <400> 185
Мег 11е Ьуз Азп С1у ТЬг Ьуз Агд ТЬг А1а Уа1 ТЫ РЬе С1у Бег 1/а1 15 10 15 <210> 186 <211> 19 <212> РНТ <213 > Вирус ящура <400> 186
Рго Азп Ьеи Агд (31у Азр Ьеи 01п Уа1 Ьеи А1а С1п Ьуз 1!а1 А1а Агд 15 10 15
ТЬг Ьеи Рго <210> 187 <211> 26 <212> РНТ <213> вирус ящура <400> 187
Агд Туг Азп Агд Азп А1а Уа1 Рго Азп Ьеи Агд 01у Азр Ьеи С1п Уа1 15 10 15
Ьеи А1а <31п Ьуз Уа1 А1а Агд ТЬг Ьеи Рго
25 <210> 188 <211> 16 <212> РЕТ <213 > Вирус гепатита С <400> 188
Азр А1а О1и РЬе Агд Нгз Азр Бег 01у Туг С1и 17а1 Ηίβ ΗΪ8 О1п Ьуз 15 10 15
Ьеи <210> 189 <211> 34 <212> РКТ <213> Вирус гепатита В <400> 189
Агд Агд Агд <31у Агд Бег Рго Агд Агд Агд ТЬг Рго Бег Рго Агд Агд 15 10 15
Агд Агд Бег 01 η Бег Рго Агд Агд Агд Агд Бег 01п Бег Агд О1и Зег 20 25 30
- 101 006207
01η Суз <210> 190 <211> 16 <212> ΡΗΤ <213 > Вирус гепатита В <400> 190
ОХу 11е Уа1 Азп Ьеи О1и Азр Рго А1а Зег Агд Азр Ьеи Уа1 νβΐ Зег
1 5 10 15
<210> 191 <211> 17 <212> РНТ <213 > Вирус гепатита В <400> 191 О1у Не УаХ Азп Ьеи О1и Азр Рго АХа' Зег Агд Азр Ьеи Уа1 Уа1 5ег
1 5 10 15
Суа <210> 192 <211> 20 <212> ΡΗΤ <213> Р1азтосНит £а1с1рагит <400> 192
О1и Туг Ьеи Азп Ьуз Не <31п Азп Зег Ьеи Зег ТЬг ОХи Тгр Зег Рго
1 5 10 15
Суз Зег Уа1 ТНг
20
<210> 193
<211> 9
<212> РНТ
<213> Р1автосНит νίνΗΧ
<400> 193
Авр Агд А1а Хаа О1у ОХп Рго АХа О1у
1 5
<210> 194
<211> 9
<212> РНТ
<2ХЗ> РХазтосНит νίναχ
<400> 194
АХа Азп ОХу А1а Хаа Азх О1п Рго С1у-
1 5
- 102 006207 <210> 195 <211> 11 <212> РНТ <213> Р1азтод1ит νίνΒΧ <400> 195
А1а Рго 01у А1а Азп 01п О1и О1у
5 <31у А1а А1а <210> 196 <211> 19 <212> РНТ <213> Р1автос1хит νίνβχ <400> 196
Туг Ьеи Аар Ьуз Уа1 Агд А1а ТЬг
5
8ег \Га1 ТЬг
Уа1 С1у ТЬг С1и Тгр ТЬг Рго Сув 10 15 <210> 197 <211> 21 <212> РНТ <213> Р1антос1хшп νινβ,χ <400> 197
Рго А1а (31у Авр Агд А1а Авр О1у
5
О1у О1п Рго А1а С1у
01п Рго А1а С1у Авр Агд А1а А1а 10 15 <210> 198 <211> 18 <212> РНТ <213> Р1азтодхит νχναχ <400> 198
Азр Агд А1а А1а О1у 01п Рго А1а
5
А1а С1у
01у Авр Агд А1а Авр О1у О1п Рго 10 15 <210* 199 <211> 36 <212> РНТ <213> ₽1автодхит νίναχ <400> 199
А1а Авп С1у А1а О1у Азп 01п Рго 1 5
Рго О1у А1а Авп С1у А1а Авр Азп *
О1у А1а Азп С1у А1а 01у Азр <31п
15
О1п Рго С1у А1а Авп О1у А1а Авр 25 30
- 103 006207
Азр О1п Рго 01у <210> 200 <211> 18 <212> РКТ <213 > Р1азтосИип> νίνβχ <400> 200
А1а Азп С1у А1а 01у Азп О1п Рго С1у А1а Азп С1у А1а 01у Азр О1п 15 10 15
Рго С1у
201
<210> <211
РКТ
Р1азто41ит νίνβχ <213>
₽ГО
<210> 202 <211> 22 <212> РКТ <213> РТавтосИит νίνβχ
·ς400> 202
А1а Рго <31у А1а Азп О1п О1и С1у О1у А1а А1а А1а Рго О1у А1а Азп
1 5 10 15
С1п С1и С1у С1у А1а А1а <210> 203 <211> 24 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220>
<22 3 > Описание искусственной последовательности: ПЦР-праймер вируса гепатита В с рестрикционным Ысо1-сайтом <400> 203 пьдддссабд дасаЬсдасс сПЬа 24 <210> 204 <211> 34 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность
- 104 006207 <220>
< 2 2 3 > Описание искусственной последовательности: ПЦР-праймер вируса гепатита В с рестрикционным ЕсоК1-сайтом <400> 204 дсддадсьсС. еСЕЕссаааЬ ЬааСЕаасас ссас 34 <210> 205 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: ПЦР-праймер вируса гепатита В с рестрикционными ЕсоК1- и ЗасЬсайтами и встроенным лизиновым кодоном <400> 205 сдсдадсьсд аессадсдес садададасс 30 <210> 206 <211> 31 <212> ДНК < 213 > Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: ПЦР-праймер вируса гепатита В с рестрикционным НтШП-сайтом <400> 206 сдсаадсСЕа аасаасадЪа дСсЬссддаа д 31 <2Ю> 207 <211> 14 <212> РРТ <213 > Вирус гепатита В <400> 207
Суз О1п <31и Ьув 01п Ьеи ΆΒρ С1и Азп А1а Авп Уа1 О1п Ьеи
10 <210> 208 <211> 13 <212> РРТ < 213 > Вирус гепатита В <400> 208
Суз Зег Ьуз Ьуз О1у Рго Агд А1а Зег С1у Азп Ьеи Не 15 10 <210> 209 <211> 21 <212> РРТ < 213 > вирус гепатита В
- 105 006207
<400> 209 Сув Ьеи Ьеи ТЬг <31и Ηϊβ Агд Мес ТЬг Тгр Лзр Рго А1а О1п Рго Рго
1 5 10 15
Агд Авр Ьеи ТЬг О1и 20
<210> 210 <211> 22 <212> РКТ <213 > Вирус гепатита В <400> 210
Суз Уа1 Ьуз Агд МеС Ьуз С1и Зег Агд Ьеи <31и Азр Гпг <31п Ьуз Ηϊβ 15 10 15
Агд Уа1 Азр РЬе Ьеи О1п <210> 211 <211> 6 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: фрагмент цитохрома Р450 <400> 211
Сув Мее <31п Ьеи Агд Зег
5 <210> 212 <211> б <212> РКТ < 213 > Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: фрагмент цитохрома Р450 <400> 212
Суд Агд РЬе Зег Не Аап
5 <210> 213 <211> 5 <212> РКТ < 213 > Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: фрагмент цитохрома Р450 <400> 213
Суз А1а 1/а1 Рго Агд
5
- 106 006207 <210> 214 <211> 6 <212> РНТ <213 > Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: фрагмент цитохрома Р450 <400> 214
Суз Уа1 Не Рго Агд Зег
5 <210> 215 <211> 5 <212> РРТ < 213 > Искусственная последовател ьность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: фрагмент цитохрома Р450 <400> 215
Суз Рйе 11е Рго Уа1
5 <210> 216 <211> б <212> РНТ < 213 > Искусственная последовательность <22 0 >
<22 3 > Описание искусственной последовательности: фрагмент цитохрома Р450 <400> 216
Суз ТИг Уа1 Зег 01у А1а
5 <210> 217 <211> б --<212> РНТ < 213 > Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: фрагмент цитохрома Р460 <400> 217
Суз ТЬг Ьеи Зег С1у О1и
5
- 107 006207 <210> 218 <211> 20 , <212> РКТ <213 > Вирус гепатита В <400> 218
ТЬг Тгр Уа1 О1у Уа1 Азп Ьеи С1и Азр Рго А1а Зег Агд Азр Ьеи Уа1
10 15
Уа1 Зег Туг Уа1 <210> 219 <211> 63 <212> ДНК <213 > Вирус гепатита В <400> 219 дсРассСддд Ьдддрдрраа РЬСддаадаР ссадсдРсРа дадассрадР адРсадРРаР 60 дрс 63 <210> 220 <211> 21 <212 > РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: К, инсертированный в положении 75 аминокислотной последовательности корового белка гепатита В <400> 220
ТЬг Тгр Уа1 <31у Уа1 Ьуз Азп Ьеи С1и Азр Рго А1а Зег Агд Азр Ьеи 15 10 15
Уа1 Уа1 Зег Туг Уа1 <210> 221 <211> 41 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность....___, <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: лизиновый кодон, встроенный для получения мутанта НВС-К75 <400> 221 дсрассрддд рдддрдрраа ааарррддаа даРссадсдР с 41 <210> 222 <211> 21 <212> РКТ < 213 > Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: К, инсертированный в положении аминокислотной последовательности корового белка гепатита В
- 108 006207 <400> 222
ТЬг Тгр Уа1 О1у Уа1 Азп Ьуз Ьеи С1и Авр Рго А1а Зег Агд Азр Ьеи
10 15
Уа1 7а1 Зег Туг Уа1 <210> 223 <211> 27 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: лизиновый кодон ааа, встроенный для получения мутанта НВс-К76 <400> 223
ЬЬаасаааЫ: ддаадассса дсдСсЬа 27 <210> 224 <211> 21 <212> РНТ < 213 > Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: К, инсертированный в положении 77 аминокислотной последовательности корового белка гепатита В <400> 224
ТЬг Тгр Уа1 О1у Уа1 Азп Ьеи Ьуз <31и Авр Рго А1а Зег Агд Авр Ьеи 15 10 15
Уа1 Уа1 Зег Туг Уа1 <210> 225 <211> 27 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220> _ <223> Описание искусственной последовательности: лизиновыи “кодон ааа, встроенный для получения мутанта НВс-К77 <400> 225 ьеааеседаа адаадаЬсса дсдСсСа 27 <210> 226 <211> 21 <212> РАТ < 213 > Искусственная последовательность <22 0 >
< 2 2 3 > Описание искусственной последовательности: К, инсертированный в положении аминокислотной последовательности корового белка гепатита В
- 109 006207 <400> 226
ТЬг Тгр Уа1 01у Уа1 Авп Ьеи С1и Ьуз Азр Гго А1а Зег Агд Азр Ьеи
5 10 15
Уа1 Уа1 Зег Туг Уа1 <210> 227 <211> 32 <212 > ДНК <213 > Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: лизиновый кодон ааа, встроенный для получения мутанта НВС-К78 <400> 227
Ыхааьььдда аааадаЬсса дсдЬсЬадад ас 32 <210> 228 <211> 21 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
< 2 2 3 > Описание искусственной последовательности: К, инсертированный в положении аминокислотной последовательности корового белка гепатита В <400> 228
ТЬг Тгр Уа1 01у Уа1 Авп Ьеи О1и Азр Ьув Рго А1а Зег Агд Авр Ьеи 15 10 15
Уа1 Уа1 Зег Туг Уа1 <210> 229 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: лизиновый кодон ааа, встроенный для получения мутанта НВс-К79 <400> 229
Ь+ааЬЬСдда адаСааасса дсдСсЬадад ассеад 36 <210> 230 <211> 21 <212> РКТ <213 > Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: К, инсертированный в положении аминокислотной последовательности корового белка гепатита В
- 110 006207 <400> 230
ТНг Тгр Уа1 С1у Уа1 Азп Ьеи С1и Азр Рго Ьуэ А1а Зег Агд Азр Ьеи
10 15
Уа1 Уа1 Зег Туг Уа1 <210> 231 <211> 39 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220>
<2 2 3 > Описание искусственной последовательности: лизиновый кодон ааа, встроенный для получения мутанта НВс-К80 <400> 231 сеааеесдда адаЬссаааа дсдссПадад асссадеад 39 <210> 232 ' <211> 21 <212> РРТ < 213 > Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: К, инсертированный в положении аминокислотной последовательности корового белка гепатита В <400> 232
ТЬ.г Тгр Уа1 <31у Уа1 Азп Ьеи С1и Азр Рго А1а Ьуз Зег Агд Азр Ьеи 15 10 15
Уа1 Уа1 Зег Туг Уа1 <210> 233 <211> 43 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: лизиновый кодон ааа, встроенный для получения мутанта НВс-К81 <400> 233
ЪДааииьдда адаСссадсд аааесСадад ассСадСадь сад 43 <210> 234 <211> 21 <212> РЕТ <213 > Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: К, инсертированный в положении 82 аминокислотной последовательности корового белка гепатита В
- 111 006207 <400> 234
ТЬг Тгр Уа1 С1у Уа1 Азп Ьеи 01и Азр Рго А1а Зег Ьуз Агд Азр Ьеи
10 15
Уа1 Уа1 Зег Туг Уа1 <210> 235 <211> 45 <212> ДНК < 213 > Искусственная последовател ьность <220>
< 2 2 3 > Описание искусственной последовательности: лизиновый кодон ааа, встроенный для получения мутанта НВС-К82 <400> 235
ЬСааСССдда адасссадсд СсЬаааадад ассЬадЪадЪ садсЕ 45 <210> 236 <211> 21 <212> РКТ <213 > Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: К, инсертированный в положении аминокислотной последовательности корового белка гепатита В <400> 236
ТЬг Тгр Уа1 (31у Уа1 Азп Ьеи (31и Азр Рго А. а Зег Агд Ьуз Азр Ьеи 1 5 10 15
Уа1 Уа1 Зег Туг Уа1 <210> 237 <211> 50 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220> 1 <223 > Описание вещественной последовательности: лизиновый кодон ааа, встроенный для получения мутанта НВс-К83 <400> 237 еьааеседда адаессадсд СсЬадаааад асссадРадС садсеасдес 50 <210> 238 <211> 21 <212> РКТ < 213 > Искусственная последовательность <220>
<22 3 > Описание искусственной последовательности: К, инсертированный в положении аминокислотной последовательности корового белка гепатита В
- 112 006207 <400> 238
ТЬг Тгр Уа1 О1у Уа1 Азп Ьеи С1и Азр Рго А1а Зег Агд Азр Ьуз Ьеи
10 15
Уа1 Уа1 Зег Туг Уа1 <210> 239 <211> 50 <212> ДНК < 213 > Искусственная последовательность <220>
< 2 2 3 > Описание искусственной последовательности: лизиновый кодон ааа, встроенный для получения мутанта НВс- К84 <400> 239
ЬЬаасссдда адаЬссадсд ЬсЬададаса аасьадСадС садслаьдсс 50 <210> 240 <211> 21 <212> РЙТ < 213 > Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: К, инсертированный в положении аминокислотной последовательности корового белка гепатита В <400> 240
ТЬг Тгр Уа1 (31у Уа1 Азп Ьеи О1и Азр Рго А1а Зег Агд Авр Ьеи Ьуз 15 10 15
Уа1 Уа1 Зег Туг Уа1 <210> 241 <211> 31 <212> ДНК < 213 > Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: лизиновый кодон ааа, встроенный для получения мутанта НВс-К85 <400> 241 сЬсдададас сЪаааадЪад ЪсадЬЬаЬде с 31 <210> 242 <211> 36 <212> РЙТ <213 > Вирус гепатита В <400> 242
01у Не О1п Тгр Меь О1и Тгр Азр Агд <31 и 11е Азп Азп Туг ТЬг Зег 15 10 15
- 113 006207
Ьеи 11е ΗΪ3 Зег Ьеи 11е С1и <31и Зег О1п Азп О1п О1п С1и Ьуз Азп 20 25 30 и <31п 31 и Ьеи <210> 243 <211> 102 <212> ДНК < 213 > Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: человеческий цитохром Р450 <400> 243 ааеееддаед едддаадаес дедадаСсаа сааееаеасс адсеедаеас аеесеееаас 60 едаададесс садаассаас аддадааааа едаасаадад с1 102 <210> 244 <211> 94 <212> ДНК <213 > Вирус гепатита В <400> 244 сеедеесаее ееесесседе еддееседдд асесеесааС еааадаасде аесаддсСдд 60 еаеааеедее даесесасда есеесссаса есса 94 <2Ю> 245 <211> 6 <212> РКТ <213> Вирус гепатита В <400> 245
Мей Азр Не Авр Рго Туг
5 <210> 246 <211> 217 <212> РКТ <213> ЗрегторЬНиз уагхедаСиз <400> 246
МеС Туг Ьеи РЬе Нхз Ьеи Суз Ьеи Уа1 РЬе А1а Суз Уа1 Рго Суз 15 Рго
1 5 10
ТЬг Уа1 С1п А1а Зег Ьуз Ьеи Суз Ьеи С1у Тгр Ьеи Тгр Азр Мее Азр
20 25 30
11е Азр Рго Туг Ьуз 31и РЬе 31у Зег Зег Туг С1п Ьеи Ьеи Азп РЬе
35 40 45
Ьеи Рго Ьеи Азр РЬе РЬе Рго Азр Ьеи Азп А1а Ьеи 7а1 Азр ТЬг А1а
50 55 60
А1а А1а Ьеи Туг С1и С1и 01 и Ьеи ТЬг С1у Агд С1и Н13 Суз Зег Рго
65 70 75 80
- 114 006207
ΗΪ8 ΗΪ3 ТЬг А1а Не Агд С1п А1а Ьеи Уа1 Суз Тгр С1и С1и Ьеи 95 ТЫ
85 90
Агд Ьеи 11е ТЬг Тгр Мес Зег <31и Азп ТЬг ТЬг С1и О1и Уа1 Агд Агд
100 105 110
Не Не Уа1 Азр Нлз Уа1 Азп Азп ТЬг Тгр С1у Ьеи Ьуз Уа1 Агд С1п
115 120 125
ТЬг Ьеи Тгр РЬе ΗΪ3 Ьеи Зег Суз Ьеи ТЬг РЬе 31у С1П ΗΪ3 ТЬг Уа1
130 135 140
С1п О1и РЬе Ьеи \/а1 Зег РЬе О1у Уа1 Тгр 11е Агд ТЬг Рго А1а Рго
145 150 155 160
Туг Агд Рго Рго Азп А1а Рго Не Ьеи Зег ТЬг Ьеи Рго 01и ΗΪ8 ТЬг
165 170 175
Уа1 Не Агд Агд Агд (31у 01у Зег Агд А1а А1а Агд Зег Рго Агд Агд
180 185 190
Агд ТЬг Рго Зег Рго Агд Агд Агд Агд Зег <31п Зег Рго Агд Агд Агд
195 200 205
Агд Зег <31п Зег Рго А1а Зег Азп Суз
210 215 <210> 247 <211> 183 <212> РЙТ < 213 > Вирус гепатита В <400> 247
МеС 1 Азр Не Азр Рго Туг Ьуз 31и РЬе С1у А1а ТЬг Уа1 31и Ьеи Ьеи
5 10 15
Зег РЬе Ьеи Рго Зег Азр РЬе РЬе Рго Зег Уа1 Агд Азр Ьеи Ьеи Азр
20 25 30
ТЬг А1а Зег А1а Ьеи Туг Агд О1и А1а Ьеи 01и Зег Рго С1и ΗΪ8 Суз
35 40 45
Зег Рго ΗΪ8 ΗΪ5 ТЬг А1а Ьеи Агд О1п А1а Не Ьеи Суз Тгр О1у О1и
50 55 60
Ьеи МеС ТЬг Ьеи А1а ТЬг Тгр νβΐ О1у Уа1 Азп Ьеи С1и Азр Рго А1а
65 70 75 80
Зег Агд Азр Ьеи Уа1 Уа1 Зег Туг νβΐ Азп ТЬг Азп Мес 01у Ьеи Ьуз
85 90 95
РЬе Агд С1п Ьеи Ьеи Тгр РЬе Н1з Не Зег Суз Ьеи ТЬг РЬе <31у Агд
100 105 110
<31и ТЬг Уа1 Не О1и Туг Ьеи Уа1 Зег РЬе О1у Уа1 Тгр Не Агд *ГЬг
115 120 125
Рго Рго А1а Туг Агд Рго Рго Азп А1а Рго Не Ьеи Зег ТЬг Ьеи Рго
130 135 140
- 115 006207
С1и ТИг ТНг Уа1 Уа1 Агд Агд Агд <31у Агд Зег Рго Агд Агд Агд ТЬг
145 150 1ь5 160
Рго Зег Рго Агд Агд Агд Агд Зег 01п Зег Рго Агд Агд Агд Агд Зег
165 170 175
О1п Зег Агд О1и Зег О1п Суз
180 <210> 248 <211> 185 <212> РНТ <213 > Вирус гепатита В <400> 248
Мее 1 Азр 11е Азр Рго Туг Ьуз С1и РИе 01у А1а ТИг 7а1 31и Ьеи 15 Ьеи
5 10
Зег РНе Ьеи Рго Зег Азр РНе РНе Рго Зег Уа1 Агд Азр Ьеи Ьеи Азр
20 25 30
ТИг А1а Зег А1а Ьеи Туг Агд С1и А1а Ьеи (31и Зег Рго О1и Нхз Суз
35 40 45
Зег Рго Нхз Н1з ТИг А1а Ьеи Агд С1п А1а 11е Ьеи С'/З Тгр О1у 01и
50 55 60
Ьеи Мее ТИг Ьеи А1а ТИг Тгр Уа1 О1у Азп Азп Ьеи <31п Азр Рго А1а
65 70 75 80
Зег Агд Азр Ьеи Уа1 Уа1 Азп Туг Уа1 Азп ТИг Азп МеС С1у Ьеи Ьуз
85 90 95
Не Агд <31п Ьеи Ьеи Тгр РНе Нхз 11е Зег Суз Ьеи ТИг РНе С1у Агд
100 105 110
<31и ТИг Уа1 Ьеи О1и Туг Ьеи Уа1 Зег РНе С1у Уа1 Тгр 11е Агд ТНг
115 120 125
Рго Рго А1а Туг Агд Рго Рго Азп А1а Рго Не Ьеи Зег ТНг Ьеи Рго
130 135 140
<31и ТНг ТИг Уа1 Уа1 Агд Агд Агд Азр Агд <31у Агд Зег Рго Агд Агд
145 150 155 160
Агд ТИг Рго Зег Рго Агд Агд Агд Агд Зег αΐη Зег Рго Агд Агд Агд
165 170 175
Агд Зег αΐη Зег Агд <31и Зег С1п Суз
180 185 <210> 249 <211> 185 <212> РНТ <213 > Вирус гепатита В
- 116 006207 <400* 249
Мес 1 Азр Не Азр Рго Туг Ьуз <31и РЬе С1у А1а ТЬг ?а1 С1и Ьеи 15 Ьеи
5 10
Зег РЬе Ьеи Рго Зег Азр РЬе РЬе Рго Зег Уа1 Агд Азр Ьеи Ьеи Азр
20 25 30
ТНг А1а Зег А1а Ьеи Туг Агд О1и А1а Ьеи С1и Зег Рго <31и ΗΪ5 Суз
35 40 45
Зег Рго Н1з Нхз ТЬг А1а Ьеи Агд С1п А1а Не Ьеи Суз Тгр 01у 01и
50 55 60
Ьеи МеС ТЬг Ьеи А1а ТЬг Тгр Уа1 О1у Азп Азп Ьеи С1и Азр Рго А1а
65 70 75 80
Зег Агд Азр Ьеи Уа1 Уа1 Азп Туг Уа1 Азп ТНг Азп νβΐ С1у Ьеи Ьуз
85 90 95
Не Агд Сг1п Ьеи Ьеи Тгр РНе Ηίβ 11е Зег Суз Ьеи ТНг РНе С1у Агд
100 105 110
О1и ТЬг ν*ι Ьеи (31и Туг Ьеи νβΐ Зег РЬе С1у Уа1 Тгр Не Агд ТНг
115 120 125
Рго Рго А1й Туг Агд Рго Рго Αβη А1а Рго Не Ьеи Зег ТНг Ьеи Рго
130 135 140
С1и ТЬг ТЬг νβΐ Уа1 Агд Агд Агд Азр Агд С1у Агд Зег Рго Агд Агд
145 150 155 160
Агд ТЬг Рго Зег Рго Агд Агд Агд Рго Зег С1п Зег Рго Агд Агд Агд
165 170 175
Агд Зег <31п Зег Агд С1и Зег С1п Суз
180 185 <210> 250 <211> 183 <212> РКТ <213 > Вирус гепатита В <40.0>_250
МеС Азр Не Азр Рго Туг Ьув 01и РЬе 01у А1а ТЬг Уа1 О1и Ьеи Ьеи
1 5 10 15
Зег РНе Ьеи Рго Зег Азр РНе РЬе Рго Зег Уа1 Агд Азр Ьеи Ьеи Авр
20 25 30
ТНг А1а А1а А1а Ьеи туг Агд Авр А1а Ьеи О1и Зег Рго (31и Ηίβ Суз
35 40 45
Зег Рго ΗΪ3 Ηίβ ТНг А1а Ьеи Агд С1п А1а Не Ьеи Суз Тгр С1у Азр
50 55 60
Ьеи Мес ТНг Ьеи А1а ТНг Тгр Уа1 01у ТЬг Азп Ьеи С1и Азр Рго А1а
65 70 75 80
Зег Агд Азр Ьеи Уа1 Уа1 Зег Туг Уа1 Азп ТЬг Азп Уа1 С1у Ьеи Ьув
85 90 95
- 117 006207
РЬе Агд (31п 1>еи 100 Ьеи Тгр РЬе ΗΪ3 Не 105 Зег Суз Ьеи ТЬг РЬе 110 <31у Агд
01и ТЫ Уа1 115 Ьеи СНи Туг Ьеи ν<1 120 Зег РЬе СНу Уа1 тгр 125 Не Агд ТЬг
Рго Рго 130 А1а Туг Агд Рго Рго 135 Азп А1а Рго 11е Ьеи 140 Зег ТЬг Ьеи Рго
С1и 145 ТЬг ТЬг Уа1 Уа1 Агд 150 Агд Агд <31у Агд Зег 155 Рго Агд Агд Агд ТЬг 160
Рго Зег Рго Агд Агд 165 Агд Агд Зег С1п Зег 170 Рго Агд Агд Агд Агд 175 Зег
С1п Зег Агд (Ни Зег СНп Суз
180 <210> 251 <211> 183 <212> РКТ <213> МагтоЬа топах <400> 251
МеЬ Азр 11е Азр Рго Туг Ьуз СНи РЬе С1у Зег Зег Туг С1п Ьеи Ьеи
1 5 10 15
Азп РЬе Ьеи Рго Ьеи Азр РЬе РЬе Рго Азр Ьеи Азп А1а Ьеи Уа1 Азр
20 25 30
ТЬг А1а ТЬг А1а Ьеи Туг С1и 01и СНи Ьеи ТЬг О1у Агд <31и ΗΪ5 Суз
35 40 45
Зег Рго Н1з Н1з ТЫ А1а 11е Агд О1п А1а Ьеи Уа1 Суз Тгр Азр СНи
50 55 60
Ьеи ТЫ Ьуз Ьеи 11е А1а Тгр Меь Зег Зег Азп Не ТЬг Зег <31и СНп
65 70 75 ВО
Уа1 Агд ТЫ 11е Не Уа1 Азп ΗΪ8 Уа1 Азп Азр ТЬг Тгр С1у Ьеи Ьуз
85 90 95
Уа1 Агд (31п Зег Ьеи ’Γιρ РЬе Н13 Ьеи Зег Суз Ьеи ТЬг РЬе С1у СНп
100 105 110
Н1з ТЫ Уа1 С31п С1и РЬе Ьеи Уа1 Зег РЬе СНу Уа1 Тгр 11е Агд ТЬг
115 120 127
Рго А1а Рго Туг Агд Рго Рго Азп А1а Рго Не Ьеи Зег ТЬг Ьеи Рго
130 135 140
О1и ΗΪ8 ТЫ Уа1 Не Агд Агд Агд С1у СНу А1а Агд А1а Зег Агд Зег
145 150 155 160
Рго Агд Агд Агд ТЫ Рго Зег Рго Агд Агд Агд Агд Зег СНп Зег Рго
165 170 175
Агд Агд Агд Агд Зег <Э1п Суз
180
- 118 006207
<210> 252
<211> 26
<212> РКТ
<213> Вое Саигиз
<400> 252
Зег ТЬг Рго Рго Ьеи Рго Тгр Рго
1 5
Ьеи 01п Агд Рго Рго С1и 01и Рго
20
<210> 253
<211> 17
<212> РКТ
<213> Вирус Эбола
<400> 253
А1а ТЬг 01п Уа1 С1и 01п ΗΪ8 ΗΪ3
1 5
А1а
<210> 254
<211> 17
<212> РЕТ
<213> Вирус Эбола
<400> 254
Н15 Азп ТЬг Рго Уа1 Туг Ьуз Ьеи
1 5
О1и
<210> 255
<211> 17
<212> РКТ
<213> Вирус Эбола
<400> 255
<31у Ьуз Ьеи О1у Ьеи Не ТЬг Азп
1 5
Не
Тгр Зег Рго А1а А1а Ьеи Агд Ьеи 10 15
А1а А1а
Агд Агд ТЬг Азр Азп Авр Зег ТЬг ' 15
Азр Не Зег 01и А1а ТЬг О1п Уа1
15
ТЬг Не А1а <31у Уа1 А1а Уа1 Ьеи
15 <210> 256 <211> 10 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: гибкое линкерное плечо
- 119 006207 <400> 256
С1у <31 у <31у <31у Зег <31у 31у <31у С1у ТЬг
10 <210> 257 <211> 9 <212> РКТ < 213 > Искусственная последовательность <220>
<2 2 3 > Описание искусственной последовательности: гибкое линкерное плечо <400> 257
С1у (31у О1у СИ у Вег С1у С31у О1у О1у
5 <210> 258 <211> 513 ' <212> ДНК <213> Р1азто0хит £а1схрагит <220>
<221> СОЗ <222> (1)..(513) <400> 258
аед дас аес дас ссе Рго 5 еае Туг ааа Ьуз даа еее дда дсп асе ТЬг дед дад ееа сес 48
МеС 1 Азр 11е Азр О1и РЬе С1у А1а 10 Уа1 С1и Ьеи 15 Ьеи
Ссд псе еед ссе есе дас еес еее ссе Сса деа еда даС сее сСа дае 96
Зег РЬе Ьеи Рго Зег Азр РЬе РЬе Рго Зег Уа1 Агд Азр Ьеи Ьеи Азр
20 25 30
асс дсс Сса дсе сед еае едд даа дсс ееа дад ссе ссе дад сае еде 144
ТЬг А1а Зег А1а Ьеи Туг Агд <31и А1а Ьеи О1и Зег Рго (31и Нхз Суз
35 40 45
еса ссС сас сае асе дса сСс адд саа дса асе сее Сдс едд ддд даа 192
Зег Рго Нхз Нхз ТЬг А1а Ьеи Агд αΐη А1а 11е Ьеи Суз Тгр О1у О1и
50 55 60
сСа аСд асе сеа дсе асс едд дьд дде дее аае сед даа дае дда аес 240
Ьеи Мее ТЬг Ьеи А1а ТЬг Тгр ν31 С1у Уа1 Азп Ьеи (31и Азр О1у 11е
65 70 75 80
аас дсе аае ссд аас дсс аае ссд аас дсе аае ссд аас де с ааС ссд 288
Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго
85 90 95
дад сес сса д=д есе ада дас сСа деа дес аде еае дсс аас асе ДаС 336
О1и Ьеи Рго А1а Зег Аго Азр Ьеи Уа1 Уа1 Зег Туг 7а1 Азп ТЬг Азп
100 105 110
абд ддс сСа аад еес адд саа сес еед ьдд еее сас асе есе еде сес 384
МеС О1У Ьеи Ьуз РЬе Агд С1п Ьеи Ьеи Тгр РЬе Нхз 11е Зег Суз Ьеи
115 120 125
- 120 006207
432
асе еее дда ада даа аса дее аеа дад еае еед дед Ьеи Уа1 140 ссс Зег сес дда дед РЬе С1у Уа1
ТЬг РЬе <31у 130 Агд <31и ТЬг Уа1 135 Не С1и Туг
ьдд аее сдс асе ссе сса дсе еае ада сса сса аас дсс асе сеа
Тгр Не Агд ТЬг Рго Рго А1а Туг Агд Рго Рго Азп А1а ?го Не Ьеи
145 150 155 160
еса аса есс ссд дад асе асе дсь д« еад еаа
Зег ТЬг Ьеи Рго С1и ТЬг ТЬг Уа1 Уа1
165 170
480
513 <210> 259 <211> 169 <212> РКТ <213> РХавтосНит £а!с1рагит <400> 259
Мее 1 Авр 11е Азр Рго Туг Ьув <31и РЬе С1у А1а ТЬг νβΐ (31и Ьеи Ьеи 15
5 10
Зег РЬе Ьеи Рго Зег Азр РЬе РЬе Рго Зег Уа1 Агд Азр Ьеи Ьеи Азр
20 25 30
ТЬг А1а Зег А1а Ьеи Туг Агд б1и А1а Ьеи <31и Зег Рго С1и ΗΪ5 Суз
35 40 45
Зег Рго Ηί.3 ΗΪ3 ТЬг А1а Ьеи Агд С1п А1а Не Ьеи Суз Тгр О1у С1и
50 55 60
Ьеи Мее ТЬг Ьеи А1а ТЬг Тгр Уа1 О1у Уа1 Азп Ьеи О1и Азр С1у Не
65 70 75 80
Азп А1а Азп Рго Авп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго
85 90 95
О1и Ьеи Рго А1а Зег Агд Азр Ьеи* Уа1 Уа1 Зег Туг Уа1 Азп ТЬг Азп
100 105 110
Мее С1у Ьеи Ьуз РЬе Агд О1п Ьеи Ьеи Тгр РЬе ΗΪ8 Не Зег Суз Ьеи
115 120 125
ТЬг РЬе С1у Агд С1и ТЬг Уа1 Не С1и Туг Ьеи 7а1 Зег РЬе С1у Уа1
130 135 14 0
Тгр Не Агд ТЬг Рго Рго А1а Туг Агд Рго Рго АЗП А1а Рго Не Ьеи
145 150 155 160
Зег ТЬг Ьеи Рго О1и ТЬг ТЬг Уа1 Уа1
165
<210> 260 <211> 513 <212> ДНК <213> Р1азтосИит £а1с1рагит <220>
<221> СОЗ <222> (1)..(513) <400> 260 аСд дас аЬс дас ссЬ сас ааа даа МеС Азр Не Азр Рго Туг Ьуз С1и 1 5
ССС дда дсС асе дед дад сеа сес
РЬе (31у А1а ТЬг Уа1 01и Ьеи Ьеи
15
- 121 006207
Сед РРР ррд ссе РСР Зег дас Азр РРс РРР ССР РЬе РЬе Рго 25 Рса дРа еда дар Агд Азр ерр сРа дас 96
Зег РЬе Ьеи Рго 20 Зег Уа1 Ьеи Ьеи 30 Азр
асе дсс Рса дсР ерд раР сдд даа дсс РРа дад РсР ССР дад саР рдр 144
ТЬг А1а Зег А1а Ьеи Туг Агд С1и А1а Ьеи С1и Зег Рго О1и ΗΪ5 Суз
35 40 45
Рса ссР сас саР аср дса сРс адд саа дса аРР сРР Рдс Рдд ддд даа 192
Зег Рго Н13 НХ8 ТЬг А1а Ьеи Агд (31 η А1а Не Ьеи Суз Тгр <31у С1и
50 55 60
сРа ард асР сРа дсР асе Рдд дрд ддс дрр ааР ррд даа дда аРР аас 240
Ьеи Мер ТЬг Ьеи А1а ТЬг Тгр Уа1 С1у Уа1 Азп Ьеи <31и С1у Не Азп
65 70 75 80
дсР А1а ааР ссд аас дсР ааР ссд аас дер ааР ссд аас дсс аас Азп ссд дад 288
Азп Рго Азп А1а Азп Рго 85 Азп А1а Азп 90 Рго Азп А1а Рго 95 С1и
сРс даР сса дед РсР ада дас сРа дРа дрс адр РаР др с аас асР ааР 336
Ьеи Азр Рго А1а Зег Агд Азр Ьеи Уа1 Уа1 Зег Туг 7а1 Азп ТЫ Азп
100 105 110
ард ддс сРа аад РРс адд саа сРс ррд Рдд РРР сас аРР РсР рдр сРс 384
Мер С1у Ьеи Ьуз РЬе Агд С1п Ьеи Ьеи Тгр РЬе ΗΪ3 Не Зег Суз Ьеи
115 120 125
аср ТЬг РРР дда ада даа аса дрр аРа дад 11е 01 и РаР Туг ерд дед рср Ьеи Уа1 Зег 140 РРс дда дрд Уа1
РЬе 130 С1у Агд С1и ТЬг Уа1 135 РЬе О1у
Рдд аРР сде асР ссР сса дер РаР ада сса сса ааР дсс ссР аРс сРа
Тгр Не Агд ТЬг Рго Рго А1а Туг Агд Рго Рго Азп А1а Рго Не Ьеи
145 150 155 160
Рса аса сРР ссд дад асР аср дрр дрр Рад Раа 513
Зег ТЬг Ьеи Рго <31и ТЬг ТЬг Уа1 Уа1
165 170
<210> 261 <2Η> 169 <212> РКТ <213> РХазтобхит £а1с1рагит <400> 261
Мер Азр Не Авр Рго Туг Ьуз О1и РЬе О1у А1а ТЬг ν81 <31и Ьеи Ьеи
1 5 10 15
Зег РЬе Ьеи Рго Зег Азр РЬе РЬе Рго Зег Уа1 Агд Азр Ьеи Ьеи Азр
20 25 30
ТЬг А1а Зег А1а Ьеи Туг Агд О1и А1а Ьеи С1и Зег Рго О1и Н1з Суз
35 40 45
Зег Рго Нхз Нхв ТЬг А1а Ьеи Агд (31п А1а Не Ьеи Суз Тгр О1у 01и
50 55 60
Ьеи Мер ТЬг Ьеи А1а ТЬг Тгр Уа1 О1у Уа1 Азп Ьеи О1и С1у Не Азп
65 70 75 80
А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а АЗП Рго 31и
85 90 95
Ьеи Азр Рго А1а Зег Агд Азр Ьеи Уа1 Уа1 Зег Туг 7а1 Азп ТЬг Азп
100 105 НО
- 122 006207
Мее (31у Ьеи Ьуз 115 РЬе Агд <31п Ьеи Ьеи 120 Тгр РЬе ΗΪ5 Не Зег 125 Суз Ьеи
ТЬг РЬе О1у Агд <31и ТЬг Уа1 Не С1и Туг Ьеи Уа1 Зег РЬе <Э1у Уа1
130 135 14 0
Тгр Не Агд ТЫ Рго Рго А1а Туг Агд Рго Рго Азп А1а Рго Не Ьеи
145 150 155 150
Зег ТЬг Ьеи Рго <31и ТЬг ТЬг Уа1 Уа1
165
<210> 262
<211> 519
<212> ДНК
<213> Р1азтосИит £а1с1рагит
<220>
<221> СДЗ
<222> (1) . . (519)
<400> 262
агд дас аее дас ССС Сае ааа даа ССС дда дее асе дгд дад ееа ССС 48
МеС Азр Не Азр Рго Туг Ьуз 31и РЬе О1у А1а ТЬг Уа1 <31и Ьеи Ьеи
1 5 10 15
Сед ССС ССд ссе СсС дас ССс ссС Сса дьа еда дас сСС сса даС 96
Зег РЬе Ьеи Рго Зег Азр РЬе РЬе Рго Зег Уа1 Агд Азр Ьеи Ьеи Азр
Сса ссС Зег Рго сас сае асе дса сСс адд саа дса аСС сСС Сдс Сдд ддд даа 192
Ηίβ ΗΪ3 ТЬг А1а Ьеи 55 Агд 01п А1а 11е Ьеи Суз 60 Тгр О1у С1и
50
сСа аСд асе сЬа дсЬ асе Ь99 дед дде дее аае еед даа дас сса дед 240
Ьеи МеС ТЬг Ьеи А1а ТЬг Тгр Уа1 б1у Уа1 Азп Ьеи 01и Азр Рго А1а
СсС Зег ада Агд дас Азр сСа Ьеи дСа дСс аде Сае дЬс аас асС ааС аСд ддс сСа О1у Ьеи 95 аад Ьуз 288
Уа1 Уа1 85 Зег Туг Уа1 Азп 90 ТЫ Азп МеЬ
ССс адд саа сСс сед ьдд еее сас асе СсС СдС сес асе еее дда ада 336
РЬе Агд С1п Ьеи Ьеи Тгр РЬе Н1з Не Зег Су 8 Ьеи ТЫ РЬе О1у Агд
100 105 но
даа аса дее аСа дад СаС еед дьд есе еее дда дед Сдд аее сдс асе 384
С1и ТЬг Уа1 11е О1и Туг Ьеи Уа1 Зег ₽Ье С1у Уа1 Тгр Не Агд ТЬг
ссе Рго сса дес СаС ада сса сса ааС дсс ссе аСс сСа Сса аса сее Ьеи ссд Рго
Рго А1а Туг Агд 130 Рго Рго 135 Азп А1а Рго Х1е Ьеи 140 Зег ТЬг
дад асе асе дее дее дда аее даа еае сед аас ааа аСс сад аас СсС
С1и ТЬг ТЬг Уа1 Уа1 01у 11е £31и Туг Ьеи АЗП Ьуз Не С1п Азп Зег
145 150 155 160
- 123 006207 сед Ссс асе даа едд СсС сед Сде ссс дСС асе сад саа 519
Ьеи Бег ТЬг С1и Тгр Бег Рго Суз Бег Уа1 ТЬг
165 170 <210> 263 <211> 171 <212> РКТ <213 > Р1азтпоб1ит £а1с1рагит <400> 263
МеС Азр Не Авр 1 Рго Туг Ьуз С1и РЬе С1у А1а ТЬг Уа1 <31и Ьеи 15 Ьеи
5 10
Бег РЬе Ьеи Рго Бег Авр РЬе РЬе Рго Бег Уа1 Агд л*.3р Ьеи Ьеи Азр
20 25 30
ТЬг А1а Бег А1а Ьеи Туг Агд С1и А1а Ьеи С1и Бег РГО С1и ΗΪ3 Суз
35 40 45
Бег Рго ΗΪ8 Н1з ТЬг А1а Ьеи Агд О1п А1а Не Ьеи Зуз Тгр С1у О1и
50 55 60
Ьеи МеС ТЬг Ьеи А1а ТЬг Тгр Уа1 С1у Уа1 Авп Ьеи С1и Азр Рго А1а
65 70 75 80
Бег Агд Азр Ьеи Уа1 Уа1 Бег Туг Уа1 Авп ТЬг Азп МеС С1у Ьеи Ьув
85 90 95
РЬе Агд С1п Ьеи Ьеи Тгр РЬе ΗΪ3 Не Бег Суз Ьеи ТЬг РЬе С1у Агд
100 105 НО
<31и ТЬг Уа1 11е С1и Туг Ьеи Уа1 Бег РЬе С1у Уа1 Тгр Не Агд ТЬг
115 120 125
Рго Рго А1а Туг Агд Рго Рго Азп А1а Рго Не Ьеи Бег ТЬг Ьеи Рго
130 135 140
□1и ТЬг ТЬг Уа1 Уа1 С1у Не 01и Туг Ьеи Авп Ьуз Не С1п Азп Бег
145 150 155 160
Ьеи Бег ТЬг 01и Тгр Бег Рго Суз Бег Уа1 ТЬг
165 170
<210> 264 <211> 516 <212> ДНК <213> Р1авто<Иит £а1с1рагит <220>
<221> СОЗ <222> (1)..(516) <400> 264
аСд дас аСс Мес Азр Не 1 дас Авр ссс Рго 5 СаС ааа даа Туг Ьуз С1и ССС дда дсС асе дСд дад сса сСс Ьеи Ьеи 15 48
РЬе О1у 10 А1а ТЬг Уа1 С1и
Сед ссс ССд ссС СсС дас еес ССС ссС Сса дса еда да- есс сСа да С 96
Зег РЬе Ьеи Рго Зег Азр РЬе РЬе Рго Бег Уа1 Агд Авр ьеи Ьеи Азр
20 25 30
асе дсс Сса дсс сСд СаС едд даа дсс ССа 9а9 Ссс ссс дад сае еде 144
ТЬг А1а Бег А1а Ьеи Туг Агд <31и А1а Ьеи (31и Бег Рго С1и Н13 Суз
35 40 45
Сса ссС сас саС асе дса ссс адд саа дса асе еес Сдс едд 999 даа 192
Бег Рго НлЗ ΗΪΒ ТЬг А1а Ьеи Агд С1п А1а Не Ьеи Суз Тгр О1у О1и
5П 55 60
- 124 006207
сСа Ьеи 65 аСд асС сеа дсс асе сдд дед ддс дсс аас Азп 75 Ссе Ьеи даа дас 01и Азр дда асе О1у Не 80
Мес ТЬг Ьеи А1а ТЬг 70 Тгр Уа1 О1у Уа1
аас дсс аае ссд аас дсЬ аас ссд аас дее аас ссд аас дсс ааС ссд
Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго
85 90 95
дад сСс сса дед ЬсС ада да с сСа деа дСс аде ЬаС дес аас асе аае
С1и Ьеи Рго А1а Зег Агд Азр Ьеи Уа1 Уа1 Зег Туг Уа1 Азп ТЬг Азп
100 105 110
асд ддс сеа аад еес адд саа ССС сед ьдд еес сас асе есе еде сСс
Мес 01 у Ьеи Ьуз РЬе Агд 01п Ьеи Ьеи Тгр РЬе ΗΪ3 — ' А Зег Суз Ьеи
115 120 125
асС ССС дда ада даа аса дее аеа дад Сае сед дед ССС еес дда дед
ТЬг РЬе О1у Агд О1и ТЬг Уа1 Не <31и Туг Ьеи Уа1 Зег РЬе О1у Уа1
130 135 140
Сдд асе сдс асС ссе сса дсс Сае ада сса сса аае дсс ссе аес сеа
Тгр Не Агд ТЬг Рго Рго А1а Туг Агд Рго Рго Азп А1а Рго 11е Ьеи
145 150 155 160
Сса аса сСС ссд дад асе асе дее дее Сдс Сад еаа
Зег ТЬг Ьеи Рго О1и ТЬг ТЬг Уа1 Уа1 Суз
165 170
<210> 265 <211> 170 <212> РЕТ <213 > РХазтосИит £а1с1рагит <400> 265
ЙеС 1 Азр Не Азр Рго Туг Ьуз 01и РЬе 01у А1а ТЫ Уа1 01и Ьеи 15 Ьеи
5 10
Зег РЬе Ьеи Рго Зег Азр РЬе РЬе Рго Зег Уа1 Агд Азр Ьеи Ьеи Азр
20 25 30
ТЬг А1а Зег А1а Ьеи Туг Агд 01и А1а Ьеи О1и Зег Рго 01и ΗΪ3 Суз
35 40 45
Зег Рго ΗΪ3 ΗΪ3 ТЬг А1а Ьеи Агд 01п А1а 11а Ьеи Суз Тгр 01у С1и
50 55 60
Ьеи МеС ТЬг Ьеи А1а ТЬг -Тгр Уа1 О1у Уа1 Лап Ьеи С1и Азр О1у Не
65 70 75 80
АЗП А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго
85 90 95
О1и Ьеи Рго А1а Зег Агд Азр Ьеи Уа1 Уа1 Зег Туг Уа1 Азп ТЬг Азп
100 105 НО
Мес О1у Ьеи Ьуз РЬе Агд О1п Ьеи Ьеи Тгр РЬе ΗΪ3 Не Зег Суз Ьеи
115 120 125
ТЬг РЬе 01у Агд 01и ТЫ Уа1 Не О1и Туг Ьеи Уа1 Зег РЬе О1у Уа1
130 135 140
Тгр Не Агд ТЬг Рго Рго А1а Туг Агд Рго Рго Азп А1а Рго Не Ьеи
145 150 155 160
Зег ТЬг Ьеи Рго С1и ТЫ ТЬг Уа1 Уа1 Суз
165 170
- 125 006207 <210> 266 <211> 579 <212> ДНК <213> Р1азтосНит £а1с1рагит <220>
<221> СДЗ <222> (1)..(579) <400> 266
аСд дас асе дас Мес Авр Не Азр 1 ссе Рго 5 Сае ааа даа сее дда дсС асе дед дад ееа Ьеи 15 сес Ьеи 48
Туг Ьуз О1и РЬе с1у 10 А1а ТЬг Уа1 С1и
Сед ССС сед ссС СсС дас еес еее ссе Сса дса еда дап сее сеа аае 96
Зег РЬе Ьеи Рго Зег Азр РЬе РЬе Рго Зег Уа1 Агд Азр Ьеи Ьеи Азр
20 25 30
асе дес Сса дсС сед Сае едд даа дсс ееа дад есс ссС дад сае еде 144
ТЬг А1а Зег А1а Ьеи туг Агд <31и АХа Ьеи (31и Зег Рго (31ц ΗΪ3 Сув
35 40 45
Сса ссС сас сап асе дса сСс адд саа дса аее сее Сдс едд ддд даа 192
Зег Рго Н13 ΗΪ8 ТЬг Айа Ьеи Агд 01 п А1а 11е ьеи Суз Тгр О1у С1и
50 55 60
сСа аСд асе сса дсе асе едд дед дде дСС аае еед даа да с дда аее 240
Ьеи МеС ТЬг Ьеи А1а ТЬг Тгр Уа1 С1у Уа1 Азп Ьеи О1п Азр 01у 11е
65 70 75 80
аас дсе ааС ссд аас дсЬ аае ссд аас дсе аае ссд аас дсе аае ссд 288
Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго Азп АХа Азп Рго
85 90 95
дад сСс сса дед есе ада дас сСа дСа дСс аде еае дес аас асС аае 336
О1и Ьеи Рго А1а Зег Агд Азр Ьеи Уа1 Уа1 Зег туг УаХ Азп ТЫ Азп
100 105 110
аед ддс сеа аад еес адд саа сес еед едд еее сас аее есе еде сСс 384
МеС С1у Ьеи Ьуз РЬе Агд 01п Ьеи Ьеи Тгр РЬе ΗΪ8 11е Зег Суз Ьеи
115 120 125
асС ССС дда ада даа аса дее аЬа дад еае еед дед есе еес дда дед 432
ТЬг РЬе <31у Агд <31и ТЬг Уа1 11е С1и Туг Ьеи Уа1 Зег РЬе С) у Уа1
130 135 140
едд аСС сдс асС ссС сса дсе Сае ада сса сса аае дсс ссе аее сеа 480
Тгр 11е Агд ТЬг Рго Рго А1а Туг Агд Рго Рго Азп А1а Рго 11е Ьеи
145 150 155 160
Сса аса ССС ссд дад асе асе дее дее дда асе даа еае сед аас ааа 528
Зег ТЬг Ьеи Рго <31и ТЬг ТЬг Уа1 Уа1 (31у 11е (31и Туг Ьеи Азп Ьуз
165 170 175
асе сад аас есе сед есс асе даа едд есе ссд Сдс есс дее асе Сад 576
11е О1п Азп Зег Ьеи Зег ТЬг О1и Тгр Зег Рго Суз Зег Уа1 ТЫ
180 185 190
Саа
579
- 126 006207 <210> 267 <211> 191 <212> РКТ <213> Р1автод1ит £а1с1рагит <400> 267
МеП 1 Азр Не Авр Рго 5 Туг Ьуз <31и РЬе О1у А1а ТЬг Уа1 <31и Ьеи Ьеи
10 15
Зег РЬе Ьеи Рго Зег Азр РЬе РЬе Рго Зег Уа1 Агд Азр Ьеи Ьеи Авр
20 25 30
ТЬг А1а Зег А1а Ьеи Туг Агд С1и А1а Ьеи 01и Зег Рго С1и ΗΪ5 Суз
35 40 45
Зег Рго ΗΪ5 ΗΪ3 ТЬг А1а Ьеи Агд <Э1п А1а 11с Ьеи Суз Тгр О1у С1и
50 55 60
Ьеи Мее ТЬг Ьеи А1а ТЬг Тгр Уа1 01у Уа1 Азп Ьеи С Хи Азр С1у Не
65 70 75 80
Азп А1а Азп Рго Азп А1а Авп Рго Азп А1а АЗП Рго Азп А1а Азп Рго
85 90 95
О1и Ьеи Рго А1а Зег Агд Азр Ьеи Уа1 Уа1 Зег Туг Уа1 Авп ТЬг Азп
100 105 110
Мее С1у Ьеи Ьуз РЬе Агд С31п Ьеи Ьеи Тгр РЬе Н18 Не Зег Суз Ьеи
115 120 125
ТЬг РЬе С1у Агд С1и ТЬг Уа1 Не С1и Туг Ьеи Уа1 Зег РЬе С1у Уа1
130 135 14 0
Тгр Не Агд ТЬг Рго Рго А1а Туг Агд Рго Рго Азп А1а Рго Не Ьеи
145 150 155 160
Зег ТЬг Ьеи Рго С1и ТЬг ТЬг Уа1 Уа1 01у Не С1и Туг Ьеи Азп Ьуз
165 170 175
Не С1п Авп Зег Ьеи Зег ТЬг С1и Тгр Зег Рго Суз Зег Уа1 ТЬг
180 185 190
<2Ю> 268 <211> 591 <212 > ДНК <213> Р1азтосНит £а1с1рагит <220>
<221> СОЗ <222> (1)..(591) <400> 268
аПд дас аНс дас ссН МеН Азр Не Азр Рго НаН ааа даа ПНИ дда дсЬ асН дНд дад ПНа сНс С1у А1а ТЬг Уа1 С1и Ьеи Ьеи 48
Туг Ьуз С1и РЬе
1 5 10 15
Нед пен ННд ссН НсЬ дас ННс нпп ссН Пса дПа еда дап СНП сна дап 96
Зег РЬе Ьеи Рго Зег Азр РЬе РЬе Рго Зег Уа1 Агд Азр Ьеи Ьеи Азр
20 25 30
асс дсс пса дсп сед Пап сдд даа дсс ппа дад ПсП ссп дад сап ндп 144
ТЬг А1а Зег А1а Ьеи Туг Агд С1и А1а Ьеи 01и Зег Рго <31и Ηΐ3 Суз
35 40 45
Пса ссН сас сап асп дса сНс адд саа дса аПП сПС сде ьдд ддд даа 192
Зег Рго Н1з Η13 ТЬг А1а Ьеи Агд С1п А1а Не Ьеи Суз Тгр <31у С1и
50 55 60
- 127 006207
сеа Ьеи 65 асд асе сса дес асе ТЬг 70 Сдд дед дде О1у дее Уа1 ааС Азп 75 еед Ьеи даа дае дда С1и Азр С1у аее Х1е 80 240
Мес ТЬг Ьеи А1а Тгр Уа1
аас дед аас сед аас дьд дас сед аае дсс аас ссе аас ссс аас сса 288
Азп А1а Азп Рго Азп Уа1 Азр Рго Азп А1а Азп Рго Ага /Да Азп Рго
85 90 95
аае дед аас сса дад ССС сса дед есе ада дас сеа деа ссс аде еае 336
Азп А1а Азп Рго <31и Ьеи Рго А1а Зег Агд Азр Ьеи Уа1 Уа1 Зег Туг
100 105 но
дес аас асе аае аСд ддс сСа аад еес адд саа сес есд едд еее сас 384
Уа1 Азп ТЬг Азп МеС С1у Ьеи Ьуз РЬе Агд О1п Ьеи Ьеи Тгр РЬе Н13
115 120 125
аее есе еде сСс асе еес дда ада даа аса дее аса дад еае еед дед 432
Не Зег Суя Ьеи ТЬг РЬе О1у Агд <31и ТЬг νβΐ 11е О1и Туг Ьеи Уа1
130 135 140
СсС ССС дда дСд едд асе еде асС ссе сса дее еае ада сса сса аае 480
Зег РЬе С31у Уа1 Тгр 11е Агд ТЬг Рго Рго А1а Туг Агд Рго Рго Аэп
145 150 155 160
дес ссС аСс сСа Сса аса сее ссд дад асе асе дее дес дда аее даа 528
А1а Рго 11е Ьеи Зег ТЬг Ьеи Рго О1и ТЬг ТЬг Уа1 Уа1 01у 11е О1и
165 170 175
СаС сед аас ааа аСс сад аас есе сСд Ссс асе даа ьдд есе ссд Сдс 576
Туг Ьеи Азп Ьуз 11е С1п Азп Зег Ьеи Зег ТЬг С1и Тгр Зег Рго Суз
180 185 190
591
Ссс дее асе Сад Саа
Зег Уа1 ТЬг
195 <210> 269 <211> 195 <212> РКТ <213> Р1авто«Нит £а!с1рагит <400> 269
Мее Авр 11е Азр Рго Туг Ьуз О1и РЬе <31у А1а ТЬг Уа1 <31и Ьеи 15 Ьеи
1 5 10
Зег РЬе Ьеи Рго Зег Азр РЬе РЬе Рго Зег Уа1 Агд Азр Ьеи Ьеи Авр
20 25 30
ТЬг А1а Зег А1а Ьеи Туг Агд С1и А1а Ьеи 01и Зег Рго О1и Н1в Сув
35 40 45
Зег Рго ΗΪ5 ΗΪ8 ТЬг А1а Ьеи Агд С1п А1а 11е Ьеи Суз Тгр <31у С1и
50 55 60
Ьеи МеС ТЬг Ьеи А1а ТЬг Тгр Уа1 С1у Уа1 Авп Ьеи <31и Азр О1у 11е
65 70 75 80
Азп А1а Азп Рго Азп Уа1 Азр Рго Азп А1а Азп Рго Азп А1а Азп Рго
85 90 95
Азп А1а Азп Рго С1и Ьеи Рго А1а Зег Агд Азр Ьеи Уа1 Уа1 Зег Туг
100 105 ГО
Уа1 Азп ТЬг Азп МеС <31у Ьеи Ьуз РЬе Агд (31п Ьеи Ьеи Тгр РЬе ΗΪ8
115 120 125
11е Зег С? о Ьеи ТЬг РЬе <31у Агд <31 и ТЫ Ие 01 и Туг Ьеи Уа1
130 135 140
- 128 006207
Зег РЬе С1у Уа1 Тгр 11е Агд ТЬг Рго Рго А1а Туг Агд Рго Рго Азп
145 150 155 160
А1а Рго Не Ьеи Зег ТЬг Ьеи Рго С1и ТЬг Тлг Уа1 Уа1 (31у Не С1и
165 170 175
Туг Ьеи Авп Ьув 11е αΐη Авп Зег Ьеи Зег ТЬГ С1и Тгр Зег Рго Суз
180 185 190
Зег Уа1 ТЫ
195 <210> 270 <211> 561 <212> ДНК < 213 > Вирус иммунодефицита человека типа I <220>
<221> СОЗ <222> (1)..(561) <400> 270 .
аСд МеС 1 дас аСс дас ссе Рго 5 СаС ааа даа еее дда дсе асе дед дад ееа сес 48
Азр Не Азр Туг Ьуз <31и РЬе С1у 10 А1а ТЬг 7а1 С1и Ьеи 15 Ьеи
еед еее еее? ссС есе дас еее еее ссе Сса деа еда дае ссе сеа дае 96
Зег РЬе Ьеи Рго Зег Азр РЬе РЬе Рго Зег Уа1 Агд Азр Ьеи Ьеи Азр
20 25 30
асе дес Сса дсе сед еае едд даа дес ееа дад есе ссе дад сае еде 144
ТЬг А1а Зег А1а Ьеи Туг Агд <31и А1а Ьеи С1и Зег Рго С1и Ηϊβ Суз
35 40 45
Сса ссе сас саС асе дса сес адд саа дса аее сее еде едд ддд даа 192
Зег Рго Н±Б Ηϊβ ТЬг А1а Ьеи Агд О1п А1а Не Ьеи Суз Тгр С1у С1и
- 50 55 60
сеа асд асе сСа дсе асе едд дед ддь дее аае ьед даа дае дда асе 240
Ьеи МеС ТЫ Ьеи А1а ТЬг Тгр Уа1 <31у Уа1 Азп Ьеи С1и Азр 01у Не
65 70 75 80
саа ьдд аед даа едд дае еде дад аСс аас аае еае асе аде сед аСа 288
С1п Тгр Мее <31и Тгр Аар Агд С1и Не Азп Азп туг ТЬг Зег Ьеи Не
85 90 95
саб есе ееа асе даа дад есс сад аас саа сад дад ааа аае даа саа 336
ΗΪ5 Зег Ьеи 11е 01и С1и Зег О1П Азп О1п 01п С1и Ьуз Азп <31и С1п
100 105 110
дад сес сса дед есе ада дас сеа деа дес аде еае дес аас асе аае 384
01и Ьеи Рго А1а Зег Агд Азр Ьеи Уа1 Уа1 Зег Туг Уа1 Азп ТЫ Азп
115 120 125
асд ддс сСа аад еее адд саа сСс еед ьдд еее сас аее есе еде сес 432
Мее □1у Ьеи Ьуз РЬе Агд О1п Ьеи Ьеи Тгр РЬе Н1з 11е Зег Суз Ьеи
130 135 140
асе еее дда ада даа аса дес аСа дад еае еед дед есе сес дда дед 480
ТЫ РЬе О1у Агд О1и ТЫ Уа1 11е <31и Туг ьеи Уа1 Зег РЬе С1у Уа1
145 150 155 160
- 129
ьдд Тгр асе Не сдс Агд асе ТЬг ССС Рго 165 сса Рго дес А1а СаС Туг ада Агд сса Рго 1' 0 сса Рго аас Азп дес А1а ссС Рго аес Не 175 сСа Ьеи 528
Сса аса сее ссд дад асе асе дее дес ьад саа 561
Зег ТЬг Ьеи Рго О1и ТЬг ТЬг νβΐ Уа1
180 185
<210> 271 <211> 185 <212> РКТ < 213 > Вирус иммунодефицита человека типа I <400> 271
МеС 1 Авр Не Азр Рго 5 Туг Ьуз (31и РЬе С1у 10 А1а ТЫ 7а1 С1и Ьеи Ьеи 15
Зег РЬе Ьеи Рго Зег Азр РЬе РЬе Рго Зег Уа1 Агд Азр Ьеи Ьеи Азр
20 25 30
ТЬг А1а Зег А1а Ьеи Туг Агд С51и А1а Ьеи (31и Зег Рго С1и ΗΪ3 Суз
35 40 45
Зег Рго Н£в Н13 ТЬг А1а Ьеи Агд С1п А1а Не Ьеи Суз Тгр □1у О1и
50 55 60
Ьеи МеС ТЬг Ьеи А1а ТЬг Тгр Уа1 С1у Уа1 Азп Ьеи С1и Азр (31у Не
65 70 75 80
С1п Тгр мее С1и Тгр Азр Агд С1и Не Авп Азп Туг ТЬг Зег Ьеи Не
85 90 95
ΗΪ3 Зег Ьеи Не (Пи С1и Зег О1п Азп С1п С1п <31и Ьув Авп О1и 01п
100 105 110
О1и Ьеи Рго А1а Зег Агд Азр Ьеи Уа1 Уа1 Зег Туг Уа1 Азп ТЬг Азп
115 120 125
Мес С1у Ьеи Ьуз РЬе Агд 31п Ьеи Ьеи Тгр РЬе Н1з Не Зег Суз Ьеи
130 135 140
ТЬг РЬе <31у Агд С1и ТЬг Уа1 Не С1и Туг Ьеи Уа1 Зег РЬе (31у Уа1
145 150 155 160
Тгр 11е Агд ТЫ Рго Рго А1а Туг Агд Рго Рго Азп А1а Рго 11е Ьеи
165 170 175
Зег ТЫ Ьеи Рго <31и ТЬг ТЬг Уа1 Уа1
180 185
<210> 272 <211> 564 <212> ДНК <213 > Вирус иммунодефицита человека типа I <220>
<221> СОЗ <222> (1)..(564) <400> 272
асд дас абс дас ссС МеС Азр Не Авр Рго СаС ааа Туг Ьув даа ССС 01и РЬе дда дсС <31у А1а 10 асе ТЫ дед Уа1 дад С1и ССа сСс 48
Ьеи 15 Ьеи
1 5
Сед еее сед ссе есе дас ССс ССС ССС Сса дСа еда дас сее сса дас 96
5ег РЬе Ьеи Рго Зег Азр РЬе РЬе Рго Зег ν81 Агд Авр Ьеи Ьеи Азр
20 25 30
- 130 006207
асе ТНг дес А1а еса дсе Зег А1а 35 сед Ьеи Нае едд даа дсс ееа дад ссе Зег ссе РГО 45 дад сае еде <31 и Нхз Суз
Туг Агд С1и А1а 40 Ьеи О1и
еса ссе сас сае асе дса сес адд саа дса аее ссе еде едд 999 даа
Зег Рго Нхв ΗΪ3 ТНг А1а Ьеи Агд 01 η А1а 11е Ьеи Сув Тгр 0_у <31и
50 55 60
сеа аед асе сеа дсе асе едд дед дде дее аае еед даа дае дда аее
Ьеи МеЪ ТНг Ьеи А1а ТНг Тгр Уа1 01у Уа1 Азп Ьеи <31и Азр 01у 11е
65 70 75 80
саа едд аед даа едд дае еде дад аее аас аае еае асе аде сед аеа 288
01п Тгр Мее С1и Тгр Азр Агд <31и 11е Азп Азг. Туг ТНг Зег Ьеи 11е
85 90 95
сае есе ееа аее даа дад есс сад аас саа сад дад ааа аае даа саа 336
ΗΪ8 Зег Ьеи 11е О1и С1и Зег (31п Азп С1п <31п О1и Ь\'3 Азп С1и С1п
100 105 110
дад сес сса дед есе ада дас сеа деа дес аде еае дес аас асе аае 384
С1и Ьеи Рго А1а Зег Агд Азр Ьеи Уа1 Уа1 Зег Туг 7а 1 Азп ТНг Азп
115 120 125
аед ддс сеа аад еее адд саа сес еед едд еее сас аее есе еде сес 432
Мее С1у Ьеи Ьуз РНе Агд <31п Ьеи Ьеи Тгр РНе Нхз 11е Зег Суз Ьеи
130 135 140
асе еее дда ада даа аса дее аеа дад еае еед дед есе еее дда дед 480
ТНг РНе (31у Агд <31и ТНг Уа1 11е О1и Туг Ьеи Уа1 Зег РНе О1у Уа1
145 150 155 160
едд аее сдс асЪ ссЪ сса дсе еае ада сса сса аае дсс ссе аее сеа 528
Тгр 11е Агд ТНг Рго Рго А1а Туг Агд Рго Рго Азп А1а Рго 11е Ьеи
165 170 175
еса аса сее ссд дад асе асе дее дее еде Над еаа 564
Зег ТНг Ьеи Рго О1и ТНг ТНг Уа1 Уа1 Суз
180 185
<210> 273 <211> 186 <212> РНТ < 213 > Вирус иммунодефицита человека типа I <400> 273
МеН Азр Не Азр Рго Туг Ьуз О1и РНе 01у А1а ТНг Уа1 01 и Ьеи Ьеи
1 5 10 15
Зег РНе Ьеи Рго Зег Азр РНе РНе Рго Зег Уа1 Агд Азр Ьеи Ьеи Азр
20 25 30
ТНг А1а Зег А1а Ьеи Туг Агд <31и А1а Ьеи С1и Зег Рго С1и Нхз Суз
35 40 45
Зег Рго Цхз НХ8 ТНг А1а Ьеи Агд О1п А1а 11е Ьеи Суз Тгр О1у С1и
50 55 60
Ьеи Мее ТНг Ьеи А1а ТНг Тгр Уа1 О1у Уа1 Азп Ьеи С1и Азр 01у 11е
65 70 75 80
О1п Тгр Мее С1и Тгр Азр Агд <31и 11е Азп Азп Туг ТНг Зег Ьеи Не
85 90 95
ΗΪ3 Зег Ьеи 11е О1и С31и Зег σΐη Азп О1п С1п О1и Ьуз Азп О1и С1п
100 105 110
- 131 006207
С1и Ьеи Рго 115 А1а Зег Агд Авр Ьеи Уа1 Уа1 Зег Туг Уа1 Азп ТЬг Азп
120 125
МеС С1у Ьеи Ьув РЬе Агд С1п Ьеи Ьеи Тгр РЬе Ηϊβ 11е Зег Сув Ьеи
130 135 140
ТЬг РЬе С1у Агд С1и ТЬг Уа1 11е О1и Туг Ьеи Уа1 Зег РЬе <31у Уа1
145 150 155 160
Тгр 11е Агд ТЬг Рго Рго А1а Туг Агд Рго Рго Азп А1а Рго 11е Ьеи
165 170 175
Зег ТЬг Ьеи Рго <31 и ТЬг ТЬг Уа1 Уа1 Суз
180 185
<210> 274 <211> 651 <212> ДНК <213> ЗрегторЬНив уагЧедаСив <400> 274 аСдсаСсССС ССсассСдСд ссССдССССС дссСдСдЬСс саСдссссас СдсСсаадсс60
СссаадсСдС дссССддасд дсеесдддас асддасасад аСссссасаа адааСССддС120
СсССсССасс адссдссдаа ЬСЬСсССссС ССддассьес ССсссдассС сааСдсассд180 дСддасасСд сСдсСдсСсС ССаСдаадаа дааССаасад дСадддадса ССдССсСссС240 саСсаСасСд сСаССадаса ддссССадСд СдССдддаад ааССаассад асеааССаса300
СддаСдадСд ааааСасаас адаадаадсс адаадаасса СЬдСсдасса СдСсааСааъ360 аессддддас ССааадСаад асадасСССа СддСССсаСС СассасдссС СасССССдда420 саасасасад ССсаадааСС СССддсСадС СССддадсаС ддассадаас СссадсСссС480
СаСадассас ссааедсасс сасЬССаСса асссССссдд аасасасадС саССаддада540 ададдаддСС саададсСдс СаддСссссс сдаадасдса сЬсссссСсс Ссдсаддада600 аддСсСсааС сассдсдСсд садасдсСсС сааСсСссад сЕСссаасСд с651 <210> 275 <211> 549 <212> ДНК <213 > Вирус гепатита В <400> 275 аЬддасаСсд асссССаСаа адааСССдда дсСасСдСдд адССасЕсСс дСССССдссС 60
СсСдасССсС ССссССсадС асдадаСсСС сСадаСассд ссСсадсСсС дСаСсдддаа 120 дссССададС сСссСдадса ССдССсассС сассаСасСд сасСсаддса адсааССсСС 180
СдсСдддддд аасСааСдас СсСадсСасс СдддСдддСд СЬааСССдда адаСссадсд 240
СсЬададасс СадСадСсад ССаСдСсаас асСааСасдд дссСааадСС саддсаасСс 300
ССдСддСССс асаСССсССд СсСсасСССС ддаададааа садССакада дСаСССддСд 360
СсСССсддад СдСддаССсд сасСссСсса дсССаСадас сассаааСдс сссСаСссСа 420
СсаасасССс сддадасЪас СдсСдССада сдасдаддса ддСссссСад аадаадаасС 480 сссСсдссСс дсадасдаад дСсСсааСсд ссдсдСсдса даадаСсСса аСсСсдддаа 540 СсСсааСдс 549 <210> 276 <211> 554 <212> ДНК <213 > Вирус гепатита В <400> 276 аСддасаССд асссССаСаа адааСССдда дссаскдСдд адССасссСс дСССЫдссС60
СсСдасССсС ССссССссдС асдадаСсСс сСадасассд ссСсадсСсС дсаСсдадаа120 дссССададС сСссСдадса СЬдсСсассС сассаСасСд сасСсаддса адссаССссс180
ЬдсСдддддд ааССдаСдас СсСадсСасс ЬдддСдддСа аСааСССдса адаСссадса240
Сссада^аСс СадСадСсаа ссасдсьаас асСаасаСдд дссСаа«дэС саддсаасСа300
- 132 006207
ССдСддСССс ссСССсддад ссаасасССс адаасссссс сдддаасссс асасассссд СдСддаССед сддааасСас сдссСсдсад ааСдС сессассссс сассссСсса СдССдССада асдсадаСсс ддаададада дссСаСадас сдасдддасс саассдссдс ссдсаессда сэссаааСдс даддсаддСс дссдсадаад асаСССддсс сссСассССа сссСадаада аСсСсааСсС
360
420
480
540
555 <210> 277 <211> 555 <212> ДНК <213> Вирус гепатита В <400> 277 аСддасаССд СсСдасССсС дсссСададС сдеедддддд сссадддасс ССдСддСССс СсСССсддад СсаасасССс адаасСсссС сдддааСсСс асссССаСаа ССссССссдс сСссСдадса ааССдаСдас ссдсадсааа аСаСаСсССд ЬдЬддаССсд сддааасСас сдссСсдсад ааСдС адааСССдда сададаСсСс ССдсСсассс ссеадсСасс ССаСдССааС ссССасСССС сасСссСсса СдССдССада асдсадаСсс дсСаседСдд сСадасассд сассаСассд сдддсдддса асСаасдСдд ддаададада дссСаСадас сдасдддасс ссаСсдссдс адссасссСс ссссадсСсс сасссаддса аСаасссдда дсссааадаС ссдсаессда сассаааСдс даддсаддсс дссдсадаад дСССССдссС дСаСсдадаа адссасссСс адаСссадса саддсаасса асасссддсс сссСаСсССа сссСадаада аСсСсааСсС
120
180
240
300
360
420
480
540
555 <210> 278 <211> 549 <212> ДНК <213 > Вирус гепатита В <400> 278 аСддасаССд СсСдасССсС дссССададс СдсСддддад СсСадддасс ССдСддСССс СсССССддад СсаасдсССс сссСсдссСс СсСсааСдС асссССаСаа ССссССссдС сСссСдадса асССааСдас СадСадСсад асаСССсССд СдСддаССед сддадасСас дсадасдаад адааСССдда асдадаСс£С ССдССсассС СсСадсСасс ССаСдСсаас СсСсасСССС сасСссСсса СдССдССада аСсСсааСсд дсСасСдСдд сСадасассд сассаСасСд СдддСдддСа асСааСдСдд ддаададааа дсССаСадас сдасдаддса ссдсдСсдса адССасСсСс ссдсадсСсС сасСсаддса сСааСССада дссСааадСС сддсСсСада сассаааСдс ддСссссСад даадасссса дСССССдссС дСаСсдддаС адсааССсСС адаСссадса садасааССа дСаСССддсд сссСаСссСа аадаадаасС аСсСсдддаа
120
180
240
300
360
420
480
540
549 <210> 279 <211> 549 <212> ДНК <213> МагшоСа топах <400> 279 аСддсСССдд ддсаСддаса СадаСсссСа Сааадаассс ддсссаСсСС аСсадССдСС 60 дааССССсСС ссСССддасС СсСССссСда СсССаасдсС ССддСддаса сСдсСасСдс 120 сССдСаСдаа даадаасСаа саддСаддда асаССдсСсС ссдсассаса садсСаССад 180 асаадсСССа дСаСдсСддд аСдааССаас СаааССдаСа дсссддасда дсСсСаасаС 240 аасССссдаа саадСаадаа сааСсаССдС аааСсаСдсс ааСдасассС ддддасССаа 300 ддСдадасаа адСССаСдде ССсаСССдСс асдСсСсасС Сссддасаас аеасадССса 360 адааСССССа дсаадССССд дадСаСддаС саддасссса дссссаСаСа дассссссаа 420 сдсасссаСС сСсСсдасСс ССссддааса СасадСсаСС аддадаадад даддсдсаад 480 адссСсСадд Ссссссадаа дасдсасСсс сСсСссСсдс аддадаадаС сСсаассасс 540 дсдСсдсад 549
- 133 006207 <210> 280 <211> 13 <212> РЙТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: человеческий цитохром Р460 <400> 280
С1п О1и Ьуз С1п Ьеи Азр С1и Азп А1а Азп Уа1 С1п Ьеи
5 10 <210> 281 <211> 7 <212> РЙТ < 213 > Искусственная последовательность <220>
< 2 2 3 > Описание искусственной последовательности: модифицированная часть корового белка вируса гепатита В <400> 281
Суз Уа1 Уа1 ТЬг ТЬг С1и Рго
5 <210> 282 <211> 42 <212> ДНК < 213 > Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: модифицированная часть корового белка вируса гепатита В <400> 282 дсаадсЫас СаЬЕдааЁЬс сдсааасаас адЬадЬсесс дд 42 <210> 283 <211> 26 <212> РЙТ <213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> Описание искусственной последовательности: модифицированная часть корового белка вируса гепатита В
<400 > 283
ТЬг ТЬг νβΐ Уа1 О1у Не <31и Туг Ьеи Азп Ьуз Не С1п Азп Зег Ьеи
1 5 10 15
Зег ТЬг О1и Тгр Зег Рго Суз Зег Уа1 ТЬг
20 25
- 134 006207 <210> 284 <211> 27 <212> РР.Т < 213 > Искусственная последовател ьность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: модифицированная часть корового белка вируса гепатита В <400> 284
ТЬг ТЬг Уа1 Уа1 Сув 01у 11е С1и Туг Ьеи Авп Ьув 11е <31п Азп Зег 15 10 15
Ьеи Зег ТЬг <31и Тгр Зег Рго А1а Зег Уа1 ТЬг
25 <210> 285 <211> 51 <212> ДНК <213> Плазмида рКК223 <400> 285
ССсасасадд ааасадааСС сссддддаСс сдСсдассСд садссаадсС Ъ 51 <210> 286 <211> 38 <212> ДНК <213 > Плазмида рКК223 <400> 286
ССсасаСаад даддаааааа саССдддаСс сдаадсСС 38 ?210> 287 <211> 20 <212> РКТ <213> Р1азтос11ит уое1Н <400> 287
С1и РЬе Уа1 Ьуз С1п 11е Зег Зег О1п Ьеи ТЬг О1и О1и Тгр Зег С1п 15 10 15
Суз Зег Уа1 ТЬг <210> 288 <211> 14 <212> РКТ <213 > ЕзсЬегзсЫа οοΐϊ <400> 288
Суз Сув О1и Ьеи Суз Суз Туг Рго А1а Сув А1а С1у Суз Азп
5 10
- 135 006207 <210> 28-9 <211> 18 <212> РКТ <213> ЕзсЬеггсЫа соИ <400> 289
Азп ТЬг РЬе Туг Суз Суз <31и Ьеи Суз Суз Туг Рго А1а Суз А1а С1у
5 10 15
Суз АЗП <210> 290 <211> 1В <212> РКТ <213> ЕзсЬегхсЫа соИ <400> 290
Зег Зег Азп Туг Суз Суз 01и Ьеи Суз
5
Суз Туг Рго А1а 10
Суз А1а С1у
15,
Суз Азп <210> 291 <211> 10 <212> РНТ <213 > Вирус гриппа <400> 291
Ьеи 11е Азр А1а Ьеи Ьеи С1у Азр Рго Суз
10 <210> 292 <211> 9 <212> РКТ <213> Вирус гриппа <400> 292
ТЬг Ьеи 11е Азр А1а Ьеи Ьеи О1у Суз
5 <210> 293 <211> 42 <212 > РКТ <213> Ното зархепз <400> 293
Азр А1а 01и РЬе Агд Ηίε Азр Зег <31у Туг (31и Уа1 Н£з Нхз О1п Ьуз
1 5 10 15
Ьеи Уа1 РЬе РЬе А1а Азр νβΐ (31у Зег Азп Ьуз С1у А1а Пе 11е
20 25 30
(31у Ьеи Мее Уа1 С1у С1у Уа1 Уа1 Не А1а
40
- 136 006207 <210> 294 <211> 11 <212> РЙТ <213> Ното зархепз <400> 294
С1и Азр Уа1 С1у Зег Азп Ьуз <31у А1а Не 11е
10 <210> 295 <211> 33 <212» РНТ <213> Ното зархепз <400> 295 ν
Азр А1а О1и РЬе Агд ΗΪ8 Азр Зег О1у Туг <31и Уа1 На.з Н1з <31п Ьуз 15 10 15
Ьеи Уа1 РЬе РЬе А1а С1и Азр Уа1 О1у Зег Азп Ьуз <31 у А1а Не Не
С1у
30 <210> 296 <211> 60 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 296 ааеедаЬдсд дааееесдСс аЬдасадсдд <210> 297 <211> 52 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 297 ссадССЬсед аеддедсасс СсаСадссдс <210> 298 <211> 42 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 298 ааеедаадаС десддССсСа асаадддддс сеаедаддЬд сассаСсада ааседдадсе 60
ЬдЬсаСдасд аааЬЬссдса Сс 52 ааееаСсдад се 42 <210> 299 <211> 34 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 299 сдаЬааСЬдс ссссеЪдееа даассдасае сеес 34
- 137 006207
<210> 300
<211> 82
<212> ДНК
<213> Ното вархепв
<400> 300
дсдддааеед аСдсддааее Ссдесаедас адсддсСаСд аддСдсасса СсадааасСд 60
деееесееед ссдаадаСде сд 82
<210> 301
<211> 83
<212> ДНК
<213> Ното вархепз
<400> 301
дсддадсСсс дсСаСдасаа ссссасссас саееаадссд аСаассдссс ссССдССада 60
ассдасаСсе есддсааада ааа 83
<210> 302
<211> 53
<212> ДНК
<213> Ното вархепе
<400> 302
дсддадсСсд аСааССдссс ссССдЬСада ассдасаесе есддсааада ааа 53
<210> 303
<211> 31
<212> ДНК
<213> Ното вархепв
<400> 303
дсдддааЬСс ЬддаЬдсдда аееесдЪсае 9 31
<210> 304
<211> 17
<212> ДНК
<213> Ното зархепа
<400> 304
дсддадсСсс дсСаСда 17
<210> 305
<211> 31
<212> ДНК
<213> Ното аархепз
<400> 305
дсдддааеес еддаедсдда аееесдесае 9 31
- 138 006207 <210> 306 <211> 18 <212> ДНК <213> Ното зар!епз <400> 306 осддадсРсд аРааРРдс <210> 307 <211> 24 <212> РКТ <213> НаеторЬНиз 1п£1иепгае <400> 307
Мер Зег Ьеи Ьеи ТЬг О1и Уа1 О1и
5
Суз Агд Суз Азп Авр Зег Зег Азр
ТЬг Рго Не Агд Азп С1и Тгр С1у 10 15 <210> 308 <211> 23 <212> РЕТ <213> НаеторЫ1из хпЕЬиепзае <400> 308
Зег Ьеи Ьеи ТЬг О1и Уа1 О1и ТЬг 1 5
Агд Суз Азп Азр Зег Зег Азр
Рго Не Агд Азп С1и Тгр С1у Суз
15 <210> 309 <211> 23 <212> РКТ <213> НаеторЬНиз 1п£1иепзае <400> 309
Зег Ьеи Ьеи ТЬг (31и Уа1 О1и ТЬг 1 5
Агд А1а Азп Авр Зег Зег Азр
Рго Не Агд Азп С1и Тгр С1у А1а
15 <210> 310 <211> 35 <212> РЕТ <213* НаеторЬНиз хп£1иепзае <400> 310
МеР О1у Не Зег Ьеи Ьеи ТЬг О1и 1 5
Тгр С1у Суз Агд Суз Азп Азр Зег
Уа1 С1и ТЫ Рго Не Агд Азп С1и 10 15
Зег Азр <Э1и Ьеи Ьеи <31у Тгр Ьеи 25 30
- 139 006207
Тгр <31у Не <210> 311 <211> 35 <212> РКТ <213 > НаеторйНиз 1п£1иепзае <400> 311
Мес 1 <31у Не Зег Ьеи 5 Ьеи ТЫ С1и Уа1 С1и 10 ТЬг Рго Не Агд Азп 15 С1и
Тгр С1у Суз Агд Суз 20 Азп Азр Зег Зег 25 Азр О1и Ьеи Ьеи (31у 30 Тгр Ьеи
Тгр <31у Не 35
<210> 312 <211> 23 <212> РКТ <213> Вирус гриппа А <400> 312
Зег Ьеи Ьеи ТЫ С1и ЛГа1 О1и ТЫ Рго 11е Агд Азп С1и Тгр <31у А1а 15 10 15
Агд А1а Азп Авр Зег Зег Азр <210> 313 <211> 19 <212> РКТ <213> Вирус гриппа А <400> 313
О1и С1п О1п Зег А1а Уа1 Азр А1а Азр Азр Зег Н1з РЬе Уа1 Зег Не 15 10 15
С1и Ьеи <31 и

Claims (18)

1. Рекомбинантная химерная молекула корового белка вируса гепатита В (НВс) длиной примерно вплоть до 515 аминокислотных остатков, которая содержит (a) последовательность НВс, имеющую по крайней мере примерно 130 из 150 Ν-концевых аминокислотных остатков молекулы НВс, которая включает связанный пептидной связью гетерологичный эпитоп или гетерологичный линкерный остаток для конъюгированного эпитопа, присутствующего в иммунодоминантной петле НВс или последовательность, имеющую по крайней мере примерно 135 остатков из 150 Ν-концевых аминокислотных остатков НВс;
(b) от одного до десяти цистеиновых остатков, расположенных в направлении С-конца данной молекулы от С-концевого остатка последовательности НВс в пределах примерно 30 остатков от С-конца химерной молекулы [С-концевого цистеинового остатка(ков)], и (c) последовательность по крайней мере из пяти аминокислотных остатков от положения 135 последовательности НВс до С-конца НВс, где указанные химерные молекулы (ί) содержат не более чем 20% консервативно замененных аминокислотных остатков в последовательности НВс и (ίί) подвергаются самосборке в частицы, которые, в основном, не связываются с нуклеиновыми кислотами после экспрессии в клетке-хозяине, и где указанные частицы являются более стабильными, чем частицы, образованные из какой-либо другой идентичной НВс-химеры, в которой отсутствует указанный С-концевой цистеиновый остаток(ки), или в которой С-концевой цистеиновый остаток, присутствующий в данной химерной молекуле, заменен другим остатком.
- 140 006207
2. Рекомбинантная химерная молекула белка НВс по п.1, где указанным связанным пептидной связью гетерологичным эпитопом или гетерологичным линкерным остатком для конъюгированного эпитопа является гететерологичный эпитоп.
3. Рекомбинантная химерная молекула белка НВс по п.2, где указанным гетерологичным эпитопом является В-клеточный эпитоп.
4. Рекомбинантная химерная молекула белка НВс по п.3, которая содержит второй гетерологичный эпитоп, связанный пептидной связью с одним из аминокислотных остатков 1-4 НВс.
5. Рекомбинантная химерная молекула белка НВс по п.3, где указанный В-клеточный эпитоп связан пептидной связью в положении последовательности НВс между аминокислотными остатками 76 и 85, и где в положениях 76-85 присутствуют по крайней мере 5 остатков последовательности НВс.
6. Рекомбинантная химерная молекула белка НВс по п.5, где указанная последовательность НВс находится между аминокислотными остатками 76 и 85, но прерывается указанным В-клеточным эпитопом.
7. Рекомбинантная химерная молекула белка НВс по п.2, которая, кроме того, включает связанный пептидной связью гетерологичный Т-клеточный эпитоп.
8. Рекомбинантная химерная молекула белка НВс по п.7, где указанный Т-клеточный эпитоп связан пептидной связью с С-концевым аминокислотным остатком НВс.
9. Рекомбинантная химерная молекула белка НВс по п.8, где указанный С-концевой цистеиновый остаток(ки) присутствует(ют) в пределах пяти аминокислотных остатков С-конца химерной молекулы белка НВс.
10. Рекомбинантная химерная молекула белка НВс по п.1, где указанная химера содержит непрерываемую последовательность аминокислотных остатков НВс от положения 1 и, по крайней мере, до положения 140 плюс цистеиновый остаток у С-конца химерной молекулы белка НВс.
11. Рекомбинантная химерная молекула белка НВс по п.10, где указанная химера содержит непрерываемую последовательность аминокислотных остатков НВс от положения 1 до положения 149.
12. Рекомбинантная химерная молекула белка НВс по п.1, где указанная химера содержит гетерологичный линкерный остаток для конъюгированного эпитопа.
13. Рекомбинантная химерная молекула белка НВс по п.12, где указанный гетерологичный линкерный остаток для конъюгированного эпитопа связан пептидной связью в положении аминокислотных остатков последовательности НВс между аминокислотными остатками 76 и 85, где в положениях 76-85 присутствуют по крайней мере 4 остатка последовательности НВс.
14. Рекомбинантная химерная молекула белка НВс по п.13, где последовательность НВс присутствует между аминокислотными остатками 76 и 85, но эта последовательность прерывается указанным гетерологичным линкерным остатком для конъюгированного эпитопа.
15. Рекомбинантная химерная молекула белка НВс по п.14, которая содержит последовательность аминокислотных остатков НВс от положения 1 и, по крайней мере, до положения 140 плюс один цистеиновый остаток у С-конца.
16. Рекомбинантная химерная молекула белка НВс по п.15, где указанная химера содержит последовательность аминокислотных остатков НВс от положения 1 до положения 149.
17. Рекомбинантная химерная молекула белка НВс по п.16, где указанный гетерологичный линкерный остаток для конъюгированного эпитопа выбран из группы, состоящий из лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина и тирозина.
18. Рекомбинантная химерная молекула корового белка вируса гепатита В (НВс) длиной примерно от 135 до 515 аминокислотных остатков, которая содержит четыре связанных пептидной связью домена последовательности аминокислотных остатков, обозначенных доменами I, II, III и IV, начиная с №конца, где (a) домен I содержит примерно от 71 до 100 аминокислотных остатков, последовательность которых включает, по крайней мере, последовательность остатков от положения 5 до положения 75 НВс и необязательно включает гетерологичный эпитоп, содержащий примерно вплоть до 30 аминокислотных остатков, связанных пептидной связью с одним из остатков НВс 1-4;
(b) домен II содержит от примерно 5 до 250 аминокислотных остатков, связанных пептидной связью с остатком 75 НВс домена I, в котором (1) присутствуют от нуля до всех остатков последовательности НВс в положениях 76-85, связанных пептидной связью примерно с 1-245 аминокислотными остатками, которые являются гетерологичными по отношению к НВс и составляют гетерологичный эпитоп или гетерологичный линкерный остаток для конъюгированного эпитопа или (и) присутствует последовательность НВс в положениях 76-85, не содержащая гетерологичных остатков или (ίίί) отсутствует 1 или несколько остатков в положениях 76-85;
(c) домен III представляет собой последовательность НВс от положения 86 до положения 135, связанную пептидной связью с остатком 85 домена II; и (6) домен IV содержит (ί) от нуля до четырнадцати остатков аминокислотной последовательности НВс от положения 136 до положения 149, связанной пептидной связью с остатком в положении 135 домена III, (ίί) от одного до десяти цистеиновых остатков [С-концевых цистеиновых остатков] в пределах
- 141 006207 примерно 30 остатков от С-конца химерной молекулы и (ίίί) от нуля до примерно 100 аминокислотных остатков в последовательности, гетерологичной по отношению к НВс и простирающейся от положения 150 до С-конца, при условии, что указанный домен IV содержит по крайней мере 6 аминокислотных остатков, включая вышеуказанные 1-10 цистеиновых остатков (ίί), причем указанная химера, после экспрессии в клетке-хозяине, подвергается самосборке в частицы, которые, в основном, не связываются с нуклеиновыми кислотами и являются более стабильными, чем частицы, образованные из какой-либо другой идентичной НВс-химеры, у которой отсутствует указанный С-концевой цистеиновый остаток(ки), или у которой С-концевой цистеиновый остаток, присутствующий в химерной молекуле, заменен другим остатком, и которая имеет последовательность аминокислотных остатков, где не более, чем примерно 10% аминокислотных остатков в последовательности НВс данной химеры являются замененными.
EA200300270A 2000-08-16 2001-08-16 ИММУНОГЕННЫЕ ХИМЕРНЫЕ ЧАСТИЦЫ НВс, ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ EA006207B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22584300P 2000-08-16 2000-08-16
US22686700P 2000-08-22 2000-08-22
US09/930,915 US20030138769A1 (en) 2000-08-16 2001-08-15 Immunogenic HBc chimer particles having enhanced stability
PCT/US2001/041759 WO2002014478A2 (en) 2000-08-16 2001-08-16 IMMUNOGENIC HBc CHIMER PARTICLES HAVING ENHANCED STABILITY

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200300270A1 EA200300270A1 (ru) 2004-04-29
EA006207B1 true EA006207B1 (ru) 2005-10-27

Family

ID=27397530

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200300270A EA006207B1 (ru) 2000-08-16 2001-08-16 ИММУНОГЕННЫЕ ХИМЕРНЫЕ ЧАСТИЦЫ НВс, ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ

Country Status (12)

Country Link
US (3) US20030138769A1 (ru)
EP (1) EP1333857A4 (ru)
JP (2) JP2005517380A (ru)
KR (1) KR20030084887A (ru)
AP (1) AP2003002752A0 (ru)
AU (2) AU2001285452B2 (ru)
BR (1) BR0113307A (ru)
CA (1) CA2420037A1 (ru)
EA (1) EA006207B1 (ru)
MX (1) MXPA03001338A (ru)
OA (1) OA12366A (ru)
WO (1) WO2002014478A2 (ru)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6942866B2 (en) 2000-08-16 2005-09-13 Apovia, Inc. Malaria immunogen and vaccine
US7022830B2 (en) * 2000-08-17 2006-04-04 Tripep Ab Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene
US7128911B2 (en) 2001-01-19 2006-10-31 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of bone disease
US7094409B2 (en) 2001-01-19 2006-08-22 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases
US7361352B2 (en) 2001-08-15 2008-04-22 Acambis, Inc. Influenza immunogen and vaccine
WO2003102165A2 (en) * 2002-02-21 2003-12-11 Apovia, Inc. IMMUNOGENIC HBc CHIMER PARTICLES STABILIZED WITH AN N-TERMINAL CYSTEINE
DE60234375D1 (de) 2001-09-14 2009-12-24 Cytos Biotechnology Ag VERPACKUNG VON IMMUNSTIMULIERENDEM CpG IN VIRUSÄHNLICHEN PARTIKELN: HERSTELLUNGSVERFAHREN UND VERWENDUNG
BR0213117A (pt) 2001-10-05 2004-09-21 Cytos Biotechnology Ag Conjugados peptìdeo angiotensina-veìculo e seus usos
US7115266B2 (en) 2001-10-05 2006-10-03 Cytos Biotechnology Ag Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof
AT410666B (de) * 2001-12-11 2003-06-25 Intercell Biomedizinische Forschungs & Entwicklungs Gmbh Nukleinsäure bindende peptide und die verwendung derartiger peptide in pharmazeutischen präparaten
US7351413B2 (en) 2002-02-21 2008-04-01 Lorantis, Limited Stabilized HBc chimer particles as immunogens for chronic hepatitis
NZ537003A (en) 2002-07-18 2008-03-28 Cytos Biotechnology Ag Hapten-carrier conjugates comprising virus like particles and uses thereof
BR0312792A (pt) 2002-07-19 2005-05-03 Cytos Biotechnology Ag Composições de vacinas contendo séries antigênicas de amilóide beta1-6
EP1572234B1 (en) * 2002-12-10 2012-02-22 Sanofi Pasteur Biologics Co. STABILIZED IMMUNOGENIC HBc CHIMER PARTICLES
US7517520B2 (en) 2003-03-26 2009-04-14 Cytos Biotechnology Ag Packaging of immunostimulatory oligonucleotides into virus-like particles: method of preparation and use
US7537767B2 (en) 2003-03-26 2009-05-26 Cytis Biotechnology Ag Melan-A- carrier conjugates
US7320795B2 (en) * 2003-07-30 2008-01-22 Vaccine Research Institute Of San Diego Rodent hepatitis B virus core proteins as vaccine platforms and methods of use thereof
US7883843B2 (en) 2003-07-30 2011-02-08 Vaccine Research Institute Of San Diego Hepatitis virus core proteins as vaccine platforms and methods of use thereof
US7144712B2 (en) 2003-07-30 2006-12-05 Vaccine Research Institute Of San Diego Human hepatitis B virus core proteins as vaccine platforms and methods of use thereof
US7408075B1 (en) * 2005-03-23 2008-08-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Synthesis of phosphocholine ester derivatives and conjugates thereof
US20070160628A1 (en) * 2005-08-31 2007-07-12 Birkett Ashley J Stabilized virus-like particles and epitope display systems
AU2007297801A1 (en) 2006-07-14 2008-03-27 Sanofi Pasteur Biologics Co. Construction of recombinant virus vaccines by direct transposon-mediated insertion of foreign immunologic determinants into vector virus proteins
EP1897887A1 (de) * 2006-09-08 2008-03-12 Universitätsklinikum Freiburg Split-Core-Partikel für die Präsentation von Fremdmolekülen, insbesondere für Impfstoffanwendungen und Verfahren zu deren Herstellung
ZA200901993B (en) * 2006-09-29 2010-07-28 Sanofi Pasteur Biologics Co Novel neutralizing immunogen (NIMIV) of rhinovirus and its use for vaccine applicants
EP2069483A4 (en) * 2006-09-29 2010-10-27 Sanofi Pasteur Biologics Co RECOMBINANT RHINOVIRAL VECTORS
EP1920782A1 (en) * 2006-11-10 2008-05-14 Glycotope Gmbh Carboyhdrate specific cellular immunity inducing microorganisms and fractions thereof
KR100861923B1 (ko) * 2006-12-07 2008-10-09 메디칸(주) 바이러스 항원 발현 재조합 벡터로 형질전환된 곤충세포를 이용한 ａ형 간염 바이러스 항원의 제조방법
EP2185195A2 (en) * 2007-08-16 2010-05-19 Tripep Ab Immunogen platform
ITUD20080055A1 (it) * 2008-03-13 2009-09-14 Transactiva S R L Procedimento per la produzione di una proteina umana in pianta, in particolare un enzima lisosomiale umano ricombinante in endosperma di cereali
US10485879B2 (en) 2008-04-15 2019-11-26 Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Plasma cell cytokine vehicle containing fusion proteins for targeted introduction of siRNA into cells and tissues
KR101644221B1 (ko) 2008-12-09 2016-07-29 화이자 백신스 엘엘씨 ＩｇＥ ＣＨ３ 펩티드 백신
RU2518291C2 (ru) 2009-07-30 2014-06-10 Пфайзер Вэксинс ЭлЭлСи Антигенные tau-пептиды и их применения
MY163512A (en) 2009-09-03 2017-09-15 Pfizer Vaccines Llc Pcsk9 vaccine
WO2011154878A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Pfizer Vaccines Llc Ige ch3 peptide vaccine
US20120328605A1 (en) * 2010-10-27 2012-12-27 Daniel Larocque Compositions and uses
US10238747B2 (en) * 2010-12-13 2019-03-26 Cel-Sci, Corp Method for inducing an immune response against avian, swine, spanish, H1N1, H5N9 influenza viruses and formulations thereof
EA202092990A3 (ru) 2011-02-11 2021-07-30 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая коровый белок вируса гепатита в, и вакцина, содержащая указанную молекулу
US20140004142A1 (en) 2011-03-02 2014-01-02 Pfizer Inc. Pcsk9 vaccine
EP2698164B1 (en) 2011-04-15 2018-04-04 Osaka University Dna vaccine
US10179174B2 (en) 2011-05-25 2019-01-15 Cel-Sci Corp. Method for inducing an immune response and formulations thereof
US9486507B2 (en) * 2011-06-10 2016-11-08 Biogen Ma Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
US10543261B2 (en) 2012-08-31 2020-01-28 Osaka University DNA vaccine containing VEGF-specific epitope and/or angiopoietin-2-specific epitope
WO2015123291A1 (en) 2014-02-11 2015-08-20 The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Pcsk9 vaccine and methods of using the same
CN105624124B (zh) * 2014-11-07 2020-09-29 普莱柯生物工程股份有限公司 一种抗o型口蹄疫的疫苗组合物及其制备方法和应用
EP3424524A3 (en) 2017-07-04 2019-02-27 CureVac AG Cancer rna-vaccine
SG11202002186VA (en) 2017-10-19 2020-05-28 Curevac Ag Novel artificial nucleic acid molecules
TW202039534A (zh) 2018-12-14 2020-11-01 美商美國禮來大藥廠 KRAS變體mRNA分子
EP4048795A1 (en) 2019-10-23 2022-08-31 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Synthetic rig-i-like receptor agonists
CN113943075A (zh) * 2020-07-15 2022-01-18 湖南怡田美农业科技有限公司 一种剑麻皂素提取后的污染处理方法

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4767842A (en) * 1973-05-07 1988-08-30 The Ohio State University Antigenic modification of polypeptides
US5614194A (en) * 1981-02-12 1997-03-25 New York University Protective peptide antigen
US4888170A (en) * 1981-10-22 1989-12-19 Research Corporation Vaccines obtained from antigenic gene products of recombinant genes
US4539205A (en) * 1982-11-09 1985-09-03 Scripps Clinic And Research Foundation Modulation of animal cellular responses with compositions containing 8-substituted guanine derivatives
US4643992A (en) * 1982-11-09 1987-02-17 Scripps Clinic And Research Foundation Modulation of animal cellular responses with compositions containing 8-substituted guanine derivatives
US4987237A (en) * 1983-08-26 1991-01-22 Ribi Immunochem Research, Inc. Derivatives of monophosphoryl lipid A
US5093318A (en) * 1983-11-01 1992-03-03 Scripps Clinic And Research Foundation Immunostimulating guanosine derivatives and their pharmaceutical compositions
US5011828A (en) * 1985-11-15 1991-04-30 Michael Goodman Immunostimulating guanine derivatives, compositions and methods
US4818527A (en) * 1986-12-09 1989-04-04 Scripps Clinic And Research Foundation T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein
US4882145A (en) * 1986-12-09 1989-11-21 Scripps Clinic And Research Foundation T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein
US5143726A (en) * 1986-12-09 1992-09-01 The Scripps Research Institute T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein
US4886782A (en) * 1987-02-26 1989-12-12 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Malarial immunogen
US5057540A (en) * 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US5387744A (en) * 1987-06-04 1995-02-07 Washington University Avirulent microbes and uses therefor: Salmonella typhi
EP0433372B1 (en) * 1988-09-06 2002-06-12 Washington University Oral immunization by transgenic plants
US5023179A (en) * 1988-11-14 1991-06-11 Eric Lam Promoter enhancer element for gene expression in plant roots
US5110732A (en) * 1989-03-14 1992-05-05 The Rockefeller University Selective gene expression in plants
NZ235315A (en) * 1989-09-19 1991-09-25 Wellcome Found Chimaeric hepadnavirus core antigen proteins and their construction
DE69132769T2 (de) * 1990-03-02 2002-04-18 Bp Corp. North America Inc., Chicago Biosynthese von carotinoiden in genetisch hergestellten wirtszellen
US5618988A (en) * 1990-03-02 1997-04-08 Amoco Corporation Enhanced carotenoid accumulation in storage organs of genetically engineered plants
US5709879A (en) * 1990-06-29 1998-01-20 Chiron Corporation Vaccine compositions containing liposomes
US5928902A (en) * 1992-02-27 1999-07-27 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Hybrid protein between CS from plasmodium and HBsAg
US5297441A (en) * 1992-08-14 1994-03-29 The Boeing Company Apparatus for supporting a test specimen for compression testing
US6024961A (en) * 1997-11-14 2000-02-15 Washington University Recombinant avirulent immunogenic S typhi having rpos positive phenotype
CA2314934C (en) * 1997-12-16 2006-08-29 Chiron Corporation Use of microparticles combined with submicron oil-in-water emulsions
NZ506245A (en) * 1998-02-12 2003-08-29 Immune Complex Corp Strategically modified hepatitis b core proteins and their derivatives
US5990085A (en) * 1998-05-04 1999-11-23 Michigan State University Inhibin-HBc fusion protein
CA2407897A1 (en) * 2000-05-05 2001-11-15 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen arrays and vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
US20040152876A1 (en) 2004-08-05
MXPA03001338A (es) 2004-01-26
US20040156864A1 (en) 2004-08-12
OA12366A (en) 2006-05-17
CA2420037A1 (en) 2002-02-21
WO2002014478A3 (en) 2003-06-05
JP2012139237A (ja) 2012-07-26
EP1333857A4 (en) 2006-02-22
EA200300270A1 (ru) 2004-04-29
AU8545201A (en) 2002-02-25
WO2002014478A2 (en) 2002-02-21
JP2005517380A (ja) 2005-06-16
AP2003002752A0 (en) 2003-06-30
AU2001285452B2 (en) 2006-11-02
BR0113307A (pt) 2005-06-28
EP1333857A2 (en) 2003-08-13
KR20030084887A (ko) 2003-11-01
US20030138769A1 (en) 2003-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA006207B1 (ru) ИММУНОГЕННЫЕ ХИМЕРНЫЕ ЧАСТИЦЫ НВс, ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ
FI110613B (fi) Kapsidia muodostava ja kysteiini-modifioitu kimeerinen MS2-vaippaproteiini
AU2001285452A1 (en) Immunogenic HBc chimer particles having enhanced stability
AU2016328582B2 (en) Improved methods and compounds for eliminating immune responses to therapeutic agents
JP2012056954A (ja) 安定化させた免疫原性ＨＢｃキメラ粒子
JP2007525421A (ja) 慢性肝炎の治療用ワクチンとしての安定化ＨＢｃキメラ粒子
JPH10504702A (ja) 免疫原製剤
US20070015199A1 (en) Stabilized immunogenic HBc chimer particles
JP3215692B2 (ja) 組み換えコクシジウム症ワクチン
JP5065004B2 (ja) 安定化Ｔａｔ抗原及び抗ＨＩＶワクチン接種のためのその使用
HU217420B (hu) Új immunogén polipeptidek, ezeket tartalmazó vakcina, és eljárás a fenti anyagok előállítására és felhasználására
JP3764476B2 (ja) 組合せポリペプチド抗原
TWI231300B (en) Coccidiosis vaccines
KR20020073149A (ko) 핵산 백신접종
JPH06505397A (ja) マラリア組換体ポックスウイルス
CN101052414B (zh) 具有增强的稳定性的免疫原性HBc嵌合体颗粒
JPS63503512A (ja) 新規ワクチン
JPS6345227A (ja) Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原蛋白質
WO2003072722A2 (en) IMMUNOGENIC AVIAN HBc CHIMER PARTICLES HAVING ENHANCED STABILITY

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY KZ

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU