JP2005517380A - 安定性が強化された免疫原性ＨＢｃキメラ粒子 - Google Patents

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Abstract

自己会合粒子の安定性強化および免疫原性エピトープの提示の両方を目的として操作を施した、カルボキシ末端が切断されたキメラＢ型肝炎ウイルスヌクレオカプシドタンパク質（ＨＢｃ）が開示される。前記免疫原性エピトープの提示は、ＨＢｃの免疫原性ループで実施され、一方、自己会合粒子の安定性の強化は、キメラ分子のカルボキシ末端近くに少なくとも１つの異種システイン残基を存在させることによって得られる。前記キメラの製造方法および使用方法もまた開示される。

Description

【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、免疫学およびタンパク工学の両分野に関し、特に、自己会合（self-assembled）粒子の安定性および免疫原性エピトープ表示の両方を強化するために操作されてあるキメラＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ヌクレオカプシドタンパク質に関する。
【０００２】
従来技術
ヘパドナウイルス科は、エンベロープを有するＤＮＡ含有動物ウイルスで、ヒトでＢ型肝炎をひき起こす能力を有する（ＨＢＶ）。ヘパドナウイルス科には、他の哺乳類（例えばウッドチャック（ＷＨＶ）および地上性リス（ＧＳＨＶ））のＢ型肝炎ウイルス、並びにアヒル（ＤＨＶ）およびサギ科鳥類（ＨｅＨＶ）で見出されるトリのウイルスが含まれる。本明細書で用いられるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、特定例について考察している場合を除いてヘパドナウイルス科のメンバーを指す。
【０００３】
哺乳類のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶまたはヘパドナウイルス）のヌクレオカプシドまたはコアは、ウイルスのサブタイプに応じて１８３または１８５のアミノ酸残基配列を含み、一方、アヒルのウイルスのカプシドは２６２のアミノ酸残基を含む。ヘパドナウイルス科のいくつかのＢ型肝炎ウイルスのコアタンパク質モノマーは、感染細胞内で自己会合して、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質粒子（ＨＢｃ粒子）として知られている安定な凝集物になる。ＨＢｃ粒子については２つの三次元構造が報告されている。小さな集団を構成する第一のものは、ダイマーとしてのＨＢＣサブユニットタンパク質を９０コピー含むか、または１８０個の個々のモノマータンパク質を含み、さらに第二の主要集団は、ダイマーとしてのＨＢｃサブユニットタンパク質を１２０コピー含むか、または２４０個の個々のモノマータンパク質を含む。前記の粒子はそれぞれＴ＝４またはＴ＝３粒子と称され、ここで「Ｔ」は三角測量数である。ヒト感染性ウイルス（ヒトのウイルス）の前記ＨＢｃ粒子は、直径がそれぞれ約３０または３４ｎｍである（Pumpens et al. (1995) Intervirology, 38:63-74; zmetzger et al., (1998) J. Gen. Virol., 79:587-590）。
【０００４】
Conwayら（Nature, 386:91-94(1997)）は、凍結電子顕微鏡写真で決定したとき９オングストロームの解像でヒトＨＢｃ粒子の構造を記載している。Bottcherら（Nature, 386:88-91(1997)）は、ヒトＨＢｃモノマーのポリペプチドの折り畳みについて記載し、アルファらせん領域およびそれらの連結ループ領域が形成されるアミノ酸残基についておおよその番号を付した模式図を提供している。Zhengら（J. Biol. Chem., 267(13):9422-9429(1992)）は、１つまたは２つ以上のシステインを欠く変異体たんぱく質に関する彼らの研究および他の研究者のＣ−末端切断タンパク質に関する研究（Birnbaum et al., J. Virol. 64:319-3330(1990)）により、コア粒子の形成はアルギニン富裕Ｃ−末端ドメイン、核酸の結合またはジスルフィド結合に左右されないことを報告している。
【０００５】
Ｂ型肝炎ヌクレオカプシドまたはウイルスコアタンパク質（ＨＢｃ）は、免疫されたホスト動物のＴ細胞反応を刺激する免疫原性担体部分であると発表された。例えば以下の文献を参照されたい：米国特許第4,818,527号、第4,882,145号および第5,143,726号。前記担体の特に有用な利用は、そのイムノドミナントループの部位で外来または異種Ｂ細胞エピトープを提示するその能力で、前記ループは、前記タンパク質のアミノ末端（Ｎ−末端）から約７０から９０位の残基（より一般的には７５位から８５位といわれている）に存在する（Clarke et al. (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp.313-318）。
ウイルス複製中に、ＨＢＶヌクレオカプシドはウイルスＲＮＡプレゲノム、ウイルス逆転写酵素（Ｐｏｌ）、および末端タンパク質（Ｐｏｌに由来する）と結合し、複製コンピテントを形成する。前記ヌクレオカプシドとウイルスＲＮＡプレゲノムとの結合は、カルボキシル末端（Ｃ−末端）でアルギニン富裕ドメインによって仲介される。異種発現系（例えばウイルスＲＮＡプレゲノムが存在しない大腸菌（E. coli））で発現されるときは、プロタミン様Ｃ−末端（すなわち１５０位から１８３位の残基）が大腸菌ＲＮＡと結合できる（Zhang et al. (1992) JBC, 267(13):9422-29）。
【０００６】
ワクチン担体成分として利用する場合は、ＨＢＶヌクレオカプシドはホスト由来の核酸と結合しないことが好ましい。Birnbaumら（J. Virol., 64:3319-3330(1990)）は、ＨＢＶヌクレオカプシドのプロタミン様Ｃ−末端ドメインは、会合してウイルス様粒子を形成する前記タンパク質の能力を損なうことなく欠落させることができることを示した。したがって、約１４４位で末端を切断された（すなわち１位から約１４４位のＨＢｃ配列を含む）タンパク質は自己会合できるが、残基１３９を越える欠失はカプシドの会合を停止させることが報告された（F. Birnbaum & M. Nassal (1990) J. Virol., 64:3319-30）。
【０００７】
Zlotnickら（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:9556-9561(1997)）は、完全長および切端形ＨＢｃタンパク質の粒子への会合について調べた。完全長分子について考察する以外にも、前記著者らは切端形タンパク質の調製についても報告した。前記切端形タンパク質は、１位から１４９位のＨＢｃ配列を含み、前記配列で４８位、６１位および１０７位のシステインは各々アラニンで置換され、さらに１つのシステイン残基がＣ−末端（１５０位）に付加されてあった。電子顕微鏡法での標識のために、Ｃ−末端メルカプタンを用いて金原子クラスターと結合されてあった。
より最近になって、Metzgerら（J. Gen. Virol., 79:587-590(1998)）は、ヒトのウイルスの配列で１３８位のプロリン（Ｐｒｏ−１３８またはＰ１３８）は粒子の形成に必要であることを報告した。前記著者らはまた、カルボキシ末端で切断された１４２および１４０残基の長さの切端形粒子はその会合能力に影響を受け、１３９および１３７残基の長さを生じる末端切断によって会合能力は完全に失われることを報告した。
【０００８】
いくつかのグループは、切端粒子は標準的なＢ型肝炎コア粒子と比較して安定性が低下することを示した（Galena et al. (1989) J. Virol., 63:4645-4652; Inada et al. (1989) Virus Res., 14:27-48）。前記は、精製調製物に粒子サイズの多様性および粒子フラグメントが存在すること（Maassen et al. (1994) Arch. Virol., 135:131-142）により明白である。したがって、上記のMetzgerらの報告の前に、Pumpensら（Intervirology, 38:63-74(1995)）は文献の報告を以下のように要約した：自己会合に必要なＨＢｃ配列のためのカルボキシ−末端の境界はアミノ酸残基１３９から１４４の間に位置し、最初の２つまたは３つのアミノ酸残基は他の配列に置換できるが、４つまたは１１アミノ−末端残基の排除は、形質転換させた大腸菌細胞内のキメラタンパク質を完全に消失させる。Neirynckら（Nature Med., 5(10):1157-1163(October 1999)）は、粒子の形成は、ＨＢｃと残基５で融合させたインフルエンザＭ２タンパク質のＮ−末端２４残基部分を含むＨＢｃキメラの大腸菌発現で生じることを報告した。
【０００９】
種々の挿入ポリペプチド配列を含む内部挿入物を有する遺伝子組換えによって生成されたハイブリッドＨＢｃ粒子（当分野ではＨＢｃキメラ粒子またはＨＢｃキメラと称される）が、以下を含む多様な生物での異種発現によって調製された：大腸菌、枯草菌（B. subtilis）、ワクシニア、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、ビール酵母菌（Sacharomyces cerevisiae）。例えば以下の文献およびいくつかの研究グループの仕事について述べたその中の引用文献を参照されたい：Pumpens et al. (1995) Intervirology, 38:63-74。
上記の文献（Pumpens et al.）は、挿入されたポリペプチド配列がＮ−末端、Ｃ−末端および両末端の間に存在する粒子生成キメラのリストを示した。前記文献で報告された挿入物の長さは、Ｎ−末端の２４から５０残基、７〜４３の内部残基およびＣ−末端の１１〜７４１残基である。
【００１０】
最近、Kratzら（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96:1915-1920(1999)）は、２３８残基の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に内部融合させた切端ＨＢｃ配列を含むキメラＨＢｃ粒子の大腸菌発現を報告した。前記キメラでは、ＨＢｃのアミノ酸残基７９および８０に代わる一対のグリシン富裕可撓性リンカーアームが前記挿入ＧＦＰ配列に接している。前記のような粒子は、ホスト動物としてウサギで天然のＧＦＰに対して効果的に抗体を誘発するといわれている。
米国特許第5,990,085号は、カルボキシ−末端切断ＨＢｃの（ｉ）残基７８および７９の間の免疫原性ループ、並びに（ｉｉ）残基１４４の後に融合させた抗原性ウシインヒビンペプチドから生成した２つの融合タンパク質を記載している。発現させた融合タンパク質は、ホスト動物に投与したとき、抗インヒビン抗体の産生を誘発すると報告された。前記特許で報告された免疫３０日後の力価は比較的低く、ループ挿入の場合の融合タンパク質では１：３０００〜１５０００で、残基１４４後挿入では１：１００から２５である。
【００１１】
内部挿入物を有するキメラ型Ｂ型肝炎コア粒子は、電子顕微鏡で分析したとき、異種エピトープを欠く粒子と比較してしばしば規律性が低い構造をもつように思われる（Schodel et al. (1994) J. Exptl. Med., 180:1037-1046）。いくつかの事例では、異種エピトープのＣ−末端切断ＨＢｃ粒子への挿入は、ハイブリッド粒子を異種発現後に回収することができないような激烈な安定性喪失作用を与える（Schodel et al. (1994) Infect. Immunol., 62:1669-1676）。したがって、多くのキメラ型ＨＢｃ粒子は非常に不安定であるので、回収不能なほど精製時に分解してしまうか、または非常に貧弱な安定性を示し、ワクチンの開発に問題となる。
【００１２】
完全長ＨＢｃ粒子の核酸結合能を失わせながら、一方、完全長ＨＢｃ粒子の安定性を保持する構造特性は、ヘパドナウイルスヌクレオカプシドデリバリー系を用いるワクチンの開発に極めて有用であろう。実際、Ulrichら（Adv. Virus Res., vol.50 (1998) Academic Press, pages 141-182）は、外来エピトープのための担体としてＨＢｃキメラの使用に関する彼らの論文の中で、前記キメラをヒトのワクチンとして使用するために解決しなければない３つの潜在的な問題を記載している。第一の潜在的問題は、キメラワクチン内の核酸の免疫ホストへの不注意な伝達である。第二の潜在的問題は、既に存在するＨＢｃに対する免疫の干渉である。第三の可能な問題は、長期の保存にも耐えることができる完全なキメラ粒子の複製可能調製物の要求に関する。
本明細書で開示されるように、本発明は、強力な免疫原性を有する物質を提供しつつ、一方、ＨＢｃキメラの安定性だけでなく前記構築物の核酸結合能力の排除に関する問題について１つの解決を提供する。
【００１３】
発明が解決しようとする課題
本発明は、ホスト細胞中で発現後、自己会合して粒子を形成するリコンビナントヘパドナウイルスヌクレオカプシドタンパク質、すなわちＢ型肝炎コアキメラタンパク質（またはキメラ型Ｂ型肝炎コアタンパク質分子またはＨＢｃキメラ分子または単にキメラ）を目的とする。前記キメラタンパク質は、（ｉ）１つまたは２つ以上の免疫原性エピトープをＮ−末端、ＨＢｃ免疫原性ループ、またはＣ−末端に提示するか、または前記免疫原性ループ中に共役エピトープのための異種リンカー残基を有し、さらに前記粒子に安定性の強化を付与するＣ−末端もしくはＣ−末端付近にシステイン残基を含む。
前記キメラタンパク質はアルギニン残基をほとんど含まず、したがって自己会合粒子は実質的に核酸結合から解放されている。
【００１４】
本発明はまた、リコンビナントＢ型肝炎コア（ＨＢｃ）キメラタンパク質分子を含む免疫原性粒子を目的とする。前記キメラタンパク質は（ｉ）１つまたは２つ以上の免疫原性エピトープをＮ−末端、ＨＢｃ免疫原性ループ、またはＣ−末端に提示するか、または（ｉｉ）前記ＨＢｃ免疫原性ループ中に共役エピトープのための異種リンカー残基を有する。前記リコンビナントタンパク質はＣ−末端もしくはＣ−末端付近にシステイン残基を含む。前記キメラタンパク質は実質的に核酸と結合せず、システインを含まないということを除いてその他の点では同一のタンパク質で構成された粒子と比較して強化された安定性を示す。
【００１５】
本発明のある実施態様は、長さが約５１５までのアミノ酸残基のリコンビナントキメラＢ型肝炎コア（ＨＢｃ）タンパク質分子を目的とし、前記分子は、
（ａ）（ｉ）ＨＢｃイムノドミナントループに存在する共有結合したペプチド結合異種エピトープまたは共役エピトープのための異種リンカー残基を含むＨＢｃ分子のＮ−末端１５０アミノ酸残基の少なくとも約１３０残基の配列、または（ｉｉ）Ｎ−末端１５０ＨＢｃアミノ酸残基の少なくとも約１３５残基の配列を含み、
（ｂ）１つから１０、より好ましくは１つから３つのシステイン残基を、その中に存在するＨＢｃ配列のＣ−末端残基から前記キメラ分子のＣ−末端に向かって、さらに前記キメラ分子のＣ−末端から約３０残基内に含み（Ｃ−末端システイン残基）、さらに
（ｃ）ＨＢｃ残基の１３５位からＨＢｃＣ−末端の少なくとも５つのアミノ酸残基配列を含む。
【００１６】
本発明のキメラ分子は、（ｉ）ＨＢｃ配列中に２０％未満の置換アミノ酸残基を含み、さらに（ｉｉ）ホスト細胞中での発現に際して、実質的に核酸と結合しないで、自己会合して粒子を形成する。前記粒子は、実質的に核酸との結合を伴わず、さらに、上記のＣ−末端システイン残基を欠くか、または前記キメラにＣ−末端システインは存在するが分子内で別の残基（例えばアラニン残基）によって置換されてあるがその他の点では同一であるＨＢｃキメラから生成される粒子よりも安定である。
【００１７】
本発明のある特徴では、目的とされるＨＢｃキメラは、約１３５から約５１５アミノ酸残基の配列を有し、ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶと称される４つの連続ペプチド結合ドメインを含む。Ｎ−末端から、ドメインＩは少なくとも約７１から約１００のアミノ酸残基を含み、その配列は、少なくともＨＢｃの約５位から７５位の残基配列を含み、場合によってＨＢｃ残基１−４の１つとペプチド結合した約３０までのアミノ酸残基を含む異種エピトープを含む。ドメインＩＩは、ドメインＩのＨＢｃ残基７５とペプチド結合した５から約２５０アミノ酸残基を含み、ここで、（ｉ）ＨＢｃ７６位から８５位の配列の０から全部、好ましくは少なくとも４つの残基は、ＨＢｃに対して異種（外来性）である１つから約２４５のアミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープ（例えばＢ細胞エピトープ）またはエピトープ（例えばＢ細胞エピトープ）のための異種リンカー残基を構成するか、または（ｉｉ）７６位から８５位のＨＢｃの配列は異種残基を含まず存在する。
【００１８】
ドメインＩＩＩは、ドメインＩＩの残基８５とペプチド結合したＨＢｃ配列の８６位から１３５位である。ドメインＩＶは、（ｉ）ドメインＩＩＩの１３５位の残基とペプチド結合した１３６位から１４９位のＨＢｃアミノ酸残基の０から１４残基、（ｉｉ）前記ＨＢｃ配列のＣ−末端とペプチド結合した１つから１０、より好ましくは１つから３つのシステイン残基、および（ｉｉｉ）１５０位からＣ−末端の、ＨＢｃに対して異種である配列中に０〜約１００、より好ましくは０〜約５０、もっとも好ましくは約２５のアミノ酸残基を含み、ただし、ドメインＩＶは上記（ｉｉ）の１から１０のシステイン残基を含む少なくとも６つのアミノ酸残基を含むことを条件とする。
【００１９】
本発明の目的のリコンビナントキメラタンパク質は、核酸との結合を実質的に伴わず、さらに、ペプチド結合した同じドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩ配列並びに、一切のシステイン残基を欠くかまたはシステイン残基がアラニン残基のような別の残基に置換されていることを除いて他の点では同じであるドメインＩＶを含むＨＢｃキメラから形成される粒子よりも安定な粒子を形成する。キメラ分子が会合して粒子を形成するとき、それら粒子は、約１．２から約１．７の２８０ｎｍ対２６０ｎｍ吸収比（２８０／２６０吸収比）を示す。前記生成粒子は、モノマー２４０個のＨＢｃキメラまたはダイマー１２０個のＨＢｃキメラを含むＴ＝４構造であると考えられている。
【００２０】
より普遍的にいえば、本発明の目的のキメラ粒子はＣ−末端切断ＨＢｃタンパク質（少なくとも残基１４９まで）を含み、前記ＨＢｃタンパク質は、イムノドミナントループ内に異種エピトープもしくはあるエピトープのための異種リンカー残基、または介在物のないイムノドミナントループ、および前記イムノドミナントループのアミノ酸残基配列とは関係なくＨＢｃ配列にとって異種の１つから３つのＣ−末端システイン残基を含む。前記のような粒子は、約１．２から約１．７の２８０／２６０吸収比を示し、さらに、上記のＣ−末端システイン残基を欠くか、またはただ１つのシステイン残基が前記キメラに存在し、それが別の残基によって置換されているという点を除いて同一であるＨＢｃキメラから生成される粒子よりも安定である。
【００２１】
別の実施態様は、上記ＨＢｃキメラ粒子またはハプテンと上記ＨＢｃキメラ粒子との共役物を含む接種物またはワクチンを含む。前記は、医薬として許容できる希釈剤組成物に溶解または分散されてあり、前記希釈剤組成物は典型的にはまた水を含む。免疫誘発に有効な量で動物（例えば哺乳類または鳥類）に投与されるとき、接種物は、（ｉ）前記キメラ粒子または共役（張出して結合）させたハプテンと特異的に免疫反応する抗体を誘発するか、または（ｉｉ）Ｔ細胞を活性化させるか、または（ｉｉｉ）その両方を惹起させる。前記のように誘発された抗体はまた、好ましくはハプテンを含む抗原と特異的に免疫反応する（結合する）。前記抗原は例えばタンパク質で、ハプテンはペプチドまたは糖類で、ここで前記ハプテンはオリゴ糖である。
【００２２】
本発明はいくつかの利益および利点を有する。
本発明の利益の１つは、一切のＣ−末端システイン残基を欠いている同様な配列の粒子よりも水性組成物中で安定に保存されるキメラＨＢｃ粒子が生成されるということである。
本発明の利点は、天然のＨＢｃ粒子の自己会合特性を示し、一方、前記天然の粒子の核酸結合は示さないキメラ分子が生成されるということである。
本発明のまた別の利益は、優れたＢ細胞およびＴ細胞免疫誘発性を示すキメラ粒子が生成されるということである。
別の利点は、本発明のキメラ粒子は、典型的にはＣ−末端システイン残基を含まない同様な粒子よりも高収量で製造されるということである。
【００２３】
本発明のさらに別の利益は、Ｃ−末端のシステイン残基を欠いている同様な共役物よりもはるかに強い免疫誘発性を有するキメラ粒子が生成されるということである。
さらに別の利点は、少なくとも１つのＣ−末端システイン残基を含むキメラ分子が会合した粒子の免疫誘発性は、少なくとも１つのＣ−末端システイン残基を欠いているキメラ分子が会合した同様な粒子と比較して強化されるということである。
さらにまた別の利益および利点は、当業者には下記の開示から明らかとなるであろう。
【００２４】
定義
ＨＢｃキメラと一緒に使用される数字は、配列番号：２４７のＨＢｃａｙｗアミノ酸残基配列（前記配列には、１つまたは２つ以上の残基が前記配列に付加されてある）内の位置を、前記アミノ酸残基に付加または欠失が存在するか否かに関係なく示している。したがって、ＨＢｃ１４９は、キメラが残基１４９で終了し、一方、ＨＢｃ１４９＋Ｃ１５０は、同じキメラがＨＢｃの１５０位にシステイン残基を含むことを示す。他方、マラリアのＣＳタンパク質の普遍的Ｔ細胞エピトープ（ＵＴＣ）は長さが２０残基であり、前記配列の１７位のシステインをアラニンで置換したものは、ＣＳ−ＵＴＣ（Ｃ１７Ａ）と称される。
「抗体」という用語は、糖化タンパク質ファミリーの１つである免疫グロブリンと呼ばれる分子を指し、前記は抗原と特異的に結合することができる。
【００２５】
「抗原」という語は、歴史的に、抗体またはレセプターが結合するる物質を指し、さらにまた抗体の産生を誘発する物質を指して用いられてきた。最近の用い方では、抗原の意味は抗体またはレセプターが結合する物質に限定され、一方、「免疫原」という語は、抗体産生を誘発するか、またはレセプターに結合する物質のために用いられる。本明細書で考察される物質は免疫原性および抗原性の両方を有し、前記用語を免疫原として用いるか抗原として用いるかは、典型的にはその使用意図にしたがう。
【００２６】
「抗原決定基」とは、抗体結合部位またはT細胞レセプターが免疫学的に結合する抗原の現実に存在する構造部分を指す。前記用語はまた、「エピトープ」と互換的に用いることができる。「抗原決定基」および「エピトープ」という語は、本明細書ではいくぶん広い意味で用いられ、ＨＢｃ配列とは異種であるが実際には抗体と結合しない付加残基も含まれる。したがって、例えば、マラリアのＣＳタンパク質リピート配列（ＮＡＮＰ）4およびＮＡＮＰＮＶＤＰ（ＮＡＮＰ）3ＮＶＤＰ（配列番号：１および２）は、各々１つ以上の実際のエピトープを含むと考えられるが、本明細書では各々はただ１つのエピトープを構成すると考える。ただ１つのＨＢｃキメラ分子で前記配列の両方を使用することは、多数のエピトープを使用することであると考える。
【００２７】
本明細書で用いられる「共役物」という語は、担体タンパク質のアミノ酸残基側鎖（例えばリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシンまたはシステイン残基）を介して担体タンパク質と機能的に連結されたハプテンを指す。
本明細書で用いられる「保存的置換」という用語は、あるアミノ酸残基が、また別の生物学的に類似の残基によって置換されてあることを意味する。保存的置換の例には、ある疎水性残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン）と別のものとの置換、または、極性残基と別のものとの置換（例えばアルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸、またはグルタミンとアスパラギンとの置換など）が含まれる。
【００２８】
ペプチド配列の関係で用いられる「対応する」という用語および種々のその文法活用形は、記載のペプチド配列のアミノ末端およびカルボキシ末端のいずれかまたは両方で３つまでのアミノ酸残基がプラスまたはマイナスされ、さらに前記ポリペプチド配列上で個々のアミノ酸残基に保存的置換のみを含むものを指す。
本明細書では、「ドメイン」という用語は、リコンビナントＨＢｃキメラ分子の部分を指すために用いられ、前記ドメインは、文献（Galibert et al., (1979) Nature, 281:646-650）（配列番号：２４６）の報告のようにＨＢｃＡｇサブタイプａｙｗの位置番号に対応して番号付与した残基の位置によって特定される。少なくともキメラドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩのポリペプチド部分は、天然に存在するＨＢｃＡｇの対応する配列と類似の三次元形態で存在すると考えられる。
【００２９】
本明細書で用いられるように、「融合タンパク質」という用語は、自然の状態では一緒に結合したものとして通常は見出されない少なくとも２つのアミノ酸残基配列を含むポリペプチドを指す。前記２つのアミノ酸残基は、それらの対応するカルボキシ−およびアミノ−末端アミノ酸残基との間のペプチド結合によって、端と端で（頭部と尾部で）機能できるように一緒に連結されてある。本発明の融合タンパク質は、アミノ酸配列において前記融合タンパク質のポリペプチド部分または病原体関連部分に一致するポリペプチド免疫原または病原体関連免疫原と免疫反応する抗体の産生を誘発するＨＢｃキメラである。
【００３０】
本明細書で用いられるように、「Ｂ型肝炎」という用語は、そのもっとも広い意味で、上述のヘパドナウイルス科の任意のメンバーを指す。
「残基」という用語はアミノ酸残基という語と互換的に用いられ、ペプチドまたはタンパク質中に存在する反応したアミノ酸を指す。
本明細書で用いられるように、「発現ベクター」という用語は、タンパク質をコードする構造遺伝子の発現を、前記タンパク質を生成できるように調節する制御エレメントを形成するＤＮＡ配列を意味する。
本明細書で用いられるように、核酸に関して使用される「機能的に連結される」という用語は、遺伝子が正確な読み枠内で別のＤＮＡ（または適切な場合はＲＮＡ）セグメント（例えば発現ベクター）と共有結合し、その結果、前記構造遺伝子が前記発現ベクターの制御下に存在することを意味する。タンパク質、ポリペプチドまたはキメラに関して用いられる「機能的に連結される」という用語は、列挙されたエレメントが互いに共有結合されてあることを意味する。
【００３１】
本明細書で用いられるように、「プロモーター」という用語は、ＤＮＡ配列またはＤＮＡ配列群の認識部位を指し、前記は１つの遺伝子に対して発現制御エレメントを提供し、前記にＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合して前記遺伝子のＲＮＡ合成（転写）を開始させる。
本明細書で用いられるように、「リコンビナントＤＮＡ分子」という用語は、自然の状態では通常一緒に見出されることはない少なくとも２つのヌクレオチドを含むハイブリッドＤＮＡ配列を指す。
本明細書で用いられるように、「ベクター」という用語は、細胞内で複製することができるＤＮＡ分子、および／または別のＤＮＡセグメントが機能的に連結され、結合させたセグメントの複製を達成することができるＤＮＡ分子を意味する。プラスミドは典型的なベクターである。
【００３２】
本明細書で特定された全てのアミノ酸残基は天然のＬ型構造である。標準的なポリペプチドの命名法（J. Biol. Chem., 243:3557-59(1969)）にしたがい、アミノ酸残基の略語は以下の対照表に示したとおりである：
対照表
Figure 2005517380
【００３３】
課題を解決するための手段
本発明は、キメラヘパドナウイルスヌクレオカプシドタンパク質（すなわちリコンビナントＢ型肝炎コア（ＨＢｃ）タンパク質）を目的とし、前記は、（ａ）免疫原性Ｂ細胞もしくはＴ細胞エピトープ、免疫原性Ｂ細胞もしくはＴ細胞エピトープもしくは切端ＨＢｃタンパク質の結合のためのリンカーを提示し、（ｂ）自己会合粒子として存在するとき強化された安定性を示すと同時に、（ｃ）自己会合粒子として実質的に核酸と結合しないように操作される。目的のＨＢｃキメラは、天然のＨＢｃ分子に対応する分子のＣ−末端が切断されてある。
【００３４】
したがって、前記キメラタンパク質は、そのＮ−末端、ＨＢｃ免疫原性ループまたはＣ−末端に１つまたは２つ以上の免疫原性エピトープ、または前記免疫原性ループ内に前記のようなエピトープのためのリンカーを提示する。前記キメラタンパク質は、自己会合粒子に安定性の強化を付与するシステイン残基を前記Ｃ−末端またはＣ−末端近傍に含む。前記キメラタンパク質は、自己会合粒子が実質的に核酸結合を免れることができるように、ＨＢｃ残基１４９位の下流で（１４９位からカルボキシ末端に向かって）アルギニン残基が十分に除かれている。
【００３５】
考察を容易にするために、本明細書で言及する本発明のキメラ配列および配列位置番号は、ヒトＢ型肝炎コアタンパク質のサブタイプａｙｗ（Galibert et al. (1979) Nature 281:64:650）の配列および位置番号を基準にしている。しかしながら、哺乳類のヘパドナウイルスカプシドタンパク質配列間の強い類似性および前記タンパク質によって示される類似の粒子生成（これらは当業者には周知である）を考慮すれば、ヒトＨＢｃサブタイプａｙｗに関する考察はまた、サブタイプａｄｗの他に、ウッドチャックおよび地上性リスのタンパク質にも適用できることは理解されよう。それらの強い類似性の結果として、ＨＢｃ配列は、特に記載しないかぎり、「ＨＢｃ」配列として本明細書では一般的に記載する。
【００３６】
ある実施態様では、本発明のＨＢｃキメラは長さが約５１５までの残基で、さらに、前記キメラは、
（ａ）（ｉ）ＨＢｃイムノドミナントループ内にペプチド結合して存在するペプチド結合異種エピトープまたは共役エピトープのための異種リンカー残基を含む前記ＨＢｃ分子のＮ−末端１５０アミノ酸残基の少なくとも１３０残基のＨＢｃ配列、または（ｉｉ）Ｎ−末端１５０ＨＢｃアミノ酸残基の少なくとも約１３５残基の配列を含み、
（ｂ）その中の前記ＨＢｃ配列のＣ−末端残基から前記分子のＣ−末端に向かって、さらに前記キメラ分子のＣ−末端から約３０残基内に１つから１０、より好ましくは１つから３つのシステイン残基（Ｃ−末端システイン残基）を含み、
（ｃ）ＨＢｃ１３５位からＨＢｃＣ−末端の少なくとも５つのアミノ酸残基の配列を含む。前記６つの残基の５つは、好ましくは１３６位から１４０位のＨＢｃ配列であり、その６番目は要求されるシステインである。
【００３７】
本発明のキメラは、ホスト細胞内で前記キメラタンパク質分子が発現されるとき自己会合して粒子を生成し、前記粒子は実質的に核酸の結合から免れ、さらに、（１）上記の１つから１０のシステイン残基（Ｃ−末端システイン残基）を欠くがその他の点では同一のＨＢｃキメラよりも、または（２）ただ１つのＣ−末端システイン残基が前記キメラに存在するが、別の残基（例えばアラニン残基）によって置換されてある場合よりも安定である。
【００３８】
ある特徴では、好ましいＨＢｃキメラは約１３５から約５１５のＬ−α−アミノ酸残基の配列を有し、４つの連続的にペプチド結合したドメイン（すなわちドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ）を含む。α−アミノ酸以外の残基を含み、したがってペプチド結合を形成できないポリペプチド（Ｄ−アミノ酸残基を含むもの）、または２つまたは３つ以上のポリペプチドがアミノ酸残基の側鎖を介して機能的に連結されてあるオリゴペプチド共役物と比較した場合、前記４つのドメインは、天然のタンパク質と同じ態様で一緒に連結されている。本発明のキメラＨＢｃタンパク質は、したがって通常の遺伝子組換え技術を用いる発現によって製造できる。
【００３９】
アミノ末端から、ドメインＩは約７１から約１００アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基の配列は少なくともＨＢｃの５位から７５位の残基配列を含む。好ましくは、前記ＨＢｃ配列の残基１から７５の配列はドメインＩの部分として存在する。もっとも好ましくは、ドメインＩは、１位から７５位のＨＢｃ配列のみで構成される。
ドメインＩＩは、ドメインＩのＨＢｃ残基７５とペプチド結合した５から約２５０のアミノ酸残基を含み、そのうち、（ｉ）７６位から８５位のＨＢｃ配列中の０から全ての残基、好ましくは少なくとも４つの残基、より好ましくは少なくとも８つの残基は、ＨＢｃにとって異種（外来性）である１つから約２４５アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、１つのエピトープ（例えばＢ細胞エピトープ）のための異種リンカー残基または異種エピトープ（例えばＢ細胞エピトープ）それ自体を構成するか、または（ｉｉ）７６位から８５位のＨＢｃの配列は異種残基を含まず存在する。
【００４０】
特に好ましくは、７６位から８５位（７６−８５配列）の１０残基配列は存在するが、異種リンカーまたは異種エピトープの１つから約２４５残基によって中断される。他の事例では、１０残基は単独で存在し、いずれの異種残基によっても中断されないのが特に好ましい。
本ドメインに下記で述べる特色とともにＨＢｃ残基のみを含むキメラは、ＨＢｃそれ自体に対するＢおよび／またはＴ細胞反応を誘発するために有用である。非中断７６−８５配列を有する好ましいＨＢｃキメラ分子は、１位から少なくとも１４０位の非中断ＨＢｃアミノ酸残基配列を含み、より好ましくは１位から１４９位の非中断ＨＢｃアミノ酸残基配列の他に下記で述べるようにＣ−末端にただ１つのシステイン残基を含む。
【００４１】
ドメインＩＩＩは、残基８５とペプチド結合した８６位から１３５位のＨＢｃ配列である。
ドメインＩＶは、（ｉ）ドメインＩＩＩの１３５位の残基とペプチド結合した１３６位から１４９位のＨＢｃアミノ酸残基配列の０から１４残基、（ｉｉ）１つから１０のシステイン残基（Ｃ−末端システイン残基）、および（ｉｉｉ）１５０位からＣ−末端のＨＢｃにとって異種である配列中に０から約１００アミノ酸残基（前記は典型的には１つのＴ細胞エピトープまたは多数のＴ細胞エピトープを構成する）を含み、ここで、ドメインＩＶは前記（ｉｉ）の１つから１０のシステイン残基を含む、ＨＢｃ残基１３５位から前記キメラのＣ−末端の少なくとも６つのアミノ酸残基を含むことを条件とする。好ましくは、ドメインＩＶは、ＨＢｃにとって異種である配列中に０から約５０アミノ酸残基の配列を含み、より好ましくは前記配列は０から約２５残基である。
【００４２】
ある特徴では、本発明のキメラ分子はしたがって、Ｃ−末端システインを除いてＨＢｃにとって異種であるエピトープまたは残基を含まない。別の特徴では、本発明のキメラ分子は、ＨＢｃ残基１−５の１つとペプチド結合したＮ−末端の異種エピトープを含む。さらに別の特徴では、本発明のキメラ分子は、イムノドミナントループ内のＨＢｃ残基７６および８５の間に位置する前記分子の中央近傍にペプチド結合した、異種エピトープまたは１つのエピトープのための異種リンカー残基を含む。さらに別の特徴では、異種エピトープはキメラ分子のＣ−末端部分に位置し、ＨＢｃ残基１３６−１４９の１つとペプチド結合している。さらにまた別の特徴では、２つまたは３つの異種エピトープが上記の位置に存在するか、または、１つまたは２つの異種エピトープは、１つのエピトープのための異種リンカー残基と一緒に存在する。前記キメラ分子の各々はまた、上記で述べたようにＣ−末端システイン残基を含む。これらのキメラ分子およびそれらの自己会合粒子のいくつかの固有例は以下で述べる。
【００４３】
既に記載したように、本発明のＨＢｃキメラ分子は約１３５から約５１５アミノ酸残基を含む。好ましい実施態様では、ＨＢｃ残基１−５は、ドメインＩがＨＢｃ残基で開始し、残基７５までの間ずっと、すなわちＨＢｃ７５位のＨＢｃ残基まで続くことができるように存在する。イムノドミナントループ中のドメインＩＩに存在する前記異種エピトープは、好ましくは約１５から約５０残基を含むが、ただし約６アミノ酸残基のように短いエピトープが抗体およびＴ細胞レセプターを誘発することができ、さらにそれら抗体およびレセプターによって認識される。ドメインＩＩＩは残基８５にペプチド結合したＨＢｃ残基８６から１３５を含む。ドメインＩＶは少なくとも６残基の配列を含み、前記は、（ｉ）残基１３５位とペプチド結合した１３６位から１４９位のＨＢｃの残基配列の０、１つまたは前記残基配列、（ｉｉ）少なくとも１つのシステイン残基で構成され、さらに（ｉｉｉ）場合によって、特にＨＢｃ配列が残基１３５で終わるときは、約１００残基までのエピトープの異種配列を含むことができるが、ただし約２５残基までの短い配列が好ましい。
【００４４】
ある実施態様では、特に好ましいキメラは２つの異種エピトープを含む。前記２つの異種エピトープはドメインＩおよびＩＩ、またはＩＩおよびＩＶ、またはＩおよびＩＶに存在する。２つの異種エピトープの１つは、いくつかの実施態様では好ましくはＢ細胞エピトープである。他の実施態様では、２つの異種エピトープの１つはＴ細胞エピトープである。より好ましくは、２つの異種エピトープの１つはＢ細胞エピトープであり、他方はＴ細胞エピトープである。さらにまた、多数のＢ細胞エピトープが前記Ｂ細胞エピトープの場所に存在することができ、さらに多数のＴ細胞エピトープが前記Ｔ細胞エピトープの場所に存在することができる。
【００４５】
前記キメラ分子がドメインＩＩに異種エピトープを含む実施態様では、前記エピトープは１つまたは２つ以上のＢ細胞エピトープであること、アミノ酸残基７６から８５の間のＨＢｃ配列は存在するが、前記異種エピトープによって中断されていること、および前記キメラはさらに、ＨＢｃ残基１４０−１４９の１つとペプチド結合した１つまたは２つ以上のＴ細胞エピトープをドメインＩＶ内に含むことが好ましい。
前記は、共役エピトープのための異種リンカー残基がドメインＩＩに存在し、それによって１つまたは２つ以上の異種エピトープをドメインＩＩに提供し、残基７６から８５の残基は存在するが前記異種リンカー残基のよって中断されていて、ＨＢｃ残基１４０−１４９の１つとペプチド結合したＴ細胞エピトープが存在するキメラ分子についても同様に好ましい。前記のようなキメラ分子から生成される粒子は、典型的には共役エピトープ対Ｃ−末端ペプチド結合Ｔ細胞エピトープの比が約１：４から約１：１の比を有し、約１：２の比が一般的である。
【００４６】
上記で述べたキメラ分子の例示的構造の１つでは、共役エピトープのための異種リンカー残基はドメインＩＩに存在し、さらにＴ細胞エピトープはドメインＩＶに存在し、ドメインＩＩにはさらに別のＢ細胞エピトープは付加されない。前記のようなキメラはＴ細胞エピトープの免疫原性を示すが、一方、下記で述べるように抗ループモノクローナル抗体の結合によってＥＬＩＳＡアッセイで測定した場合、（存在するとしても）極めてわずかのＨＢｃ抗原性を示すだけである。
【００４７】
本発明の好ましいＨＢｃキメラ分子は約１４０から約５１５残基配列を含む。各々が約１５から約５０残基の好ましい長さを有する２つの異種エピトープおよび約１４０から約１４９残基の好ましい長さのＨＢｃ部分を含む好ましいＨＢｃキメラ分子は、約１７５から約２４０アミノ酸残基の長さの配列を有する。２つの異種エピトープが連続している特に好ましいキメラ分子は約１９０から約２１０残基の長さを有する。キメラ分子の長さに広い幅があることは、Ｎ−末端およびＣ−末端ＨＢｃ部分の長さの多様性および前記免疫原性ループに挿入することができる目的とされるいくつかのエピトープの多様な長さを考慮しようとするものであることは理解されよう。
【００４８】
ホスト細胞で発現された後、本発明のリコンビナントタンパク質は自己会合して、実質的に核酸との結合を免れる粒子を生成する。本発明のＨＢｃキメラ粒子は形状が概して球状で、与えられた調製物についてサイズは通常均質である。したがって、前記キメラ粒子は、同様な形状およびサイズを有し、感染者から回収できる天然のＨＢｃ粒子と類似する。
【００４９】
本発明のキメラ粒子は上記で述べたキメラ分子を含む。より明白に言えば、前記キメラ粒子は、そのＮ−末端１５０残基の少なくとも約１３０残基の配列を有するキメラＣ−末端切断ＨＢｃタンパク質を含み、さらに、（ｉ）イムノドミナントループ内に異種エピトープまたは１つのエピトープのための異種リンカー残基、またはＮ−末端１５０残基の少なくとも約１３０残基および非中断イムノドミナントループ、および（ｉｉ）上記で述べたように１つから３つのＣ−末端システイン残基、および１３５位から少なくとも５ＨＢｃ残基配列を含む。前記のような粒子は、自己会合した粒子が実質的に核酸結合から免れることができるように十分にアルギニン残基が除かれてあり、さらに以下で述べるように約１．２から約１．７の２８０／２６０吸収比を示す。したがって、本発明のキメラタンパク質は１５０位から１８３位のＨＢｃ配列を含まなくてもよい。
【００５０】
本発明の粒子は、上記Ｃ−末端システイン残基を欠くがその他の点では同一のＨＢｃキメラタンパク質から生成される粒子よりも安定である。同様に、キメラ分子がただ１つのＣ−末端システイン残基を含む粒子は、前記システインが別の残基（例えばアラニン残基）によって置換された粒子よりも安定である。いくつかの事例では、Ｃ−末端システインが存在しない場合粒子は形成されない。両タイプの配列について安定性強化の例は下記の実施例で例示され、特に図３、４および８に関連する実施例で明白である。
【００５１】
実質的に核酸と結合しないということは、水溶液中で２８０ｎｍおよび２６０ｎｍの両方で測定される粒子の吸収を比較（すなわち２８０／２６０吸収比）することによって容易に決定することができる。本発明の粒子は、前記タンパク質の発現に用いられる生物の細胞内に本来存在する、オリゴマーおよび／またはポリマーＤＮＡおよびＲＮＡ種である核酸と実質的に結合しない。前記のような核酸は２６０ｎｍでの吸収を示し、２８０ｎｍでは比較的低い吸収を示す、一方、タンパク質（例えば本発明のキメラ）は２６０ｎｍで比較的低い吸収を示し、２８０ｎｍで強い吸収を有する。
【００５２】
したがって、残基１５０位から１８３位（または１５０位から１８５位）（当分野では時にプロタミン領域と称される）にアルギニン富裕配列を含む、遺伝子組換えによって発現させたＨＢｃ粒子またはキメラ粒子は、０．８の２８０ｎｍ吸収対２６０ｎｍ吸収比（２８０／２６０吸収比）を示し、一方、自己会合した粒子が実質的に核酸と結合しないようにアルギニン残基が十分に除かれている粒子（例えば天然に存在するＨＢｃのアルギニン富裕核酸結合領域を含まない粒子（例えば３つ未満のアルギニンまたはリジンを互いに近接して含むもの、または約１４０位から１４９位のＨＢｃ残基で終わる天然またはキメラ配列を含むもの））は約１．２から約１．６の２８０／２６０吸収比を示す。
【００５３】
本発明のキメラＨＢｃ粒子は実質的に核酸と結合せず、さらに、約１．２から約１．６、より好ましくは約１．４から約１．６の２８０／２６０吸収比を示す。前記の範囲は、大部分が与えられたキメラＨＢｃ粒子のドメインＩＩおよびＩＶに存在する芳香族アミノ酸残基数による。前記範囲はまた部分的には目的のキメラのドメインＩＶのＣｙｓの存在による。Ｃｙｓの存在によって観測される比が約０．１減少し、その理由は現在のところ不明である。
本発明のキメラ粒子は、同じペプチド結合したドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩ配列を含み、さらに１つから１０のシステイン残基（Ｃ−末端システイン残基）が存在していないこと、またはただ１つのシステイン残基が別の残基（例えばアラニン残基）によって置換されたこと以外は同じドメインＩＶ配列を含むＨＢｃキメラから生成された粒子よりも、３７℃の水性緩衝液中で約２週間から約１ヶ月の期間にわたって安定である。種々のキメラ粒子の安定性は以下の記載のように測定される。
【００５４】
したがって、例えばドメインＩＩに異種のマラリアエピトープを含み（例えば(ＮＡＮＰ)4）さらにただ１つのシステイン残基をバリン残基１４９に対してＣ−末端に含む粒子は、そのＣ−末端残基がバリンであること以外は同一のキメラ分子から会合して生成された粒子よりも安定である。同様に、ドメインＩＩに上記のマラリアＢ細胞エピトープおよびＣ−末端近傍にただ１つのシステインを含む普遍的マラリアＴ細胞エピトープを含む粒子は、前記システインがアラニンによって置換されていること以外は同一である粒子よりも安定である。図３、４および８並びにそれに関する下記の考察を参照されたい。
【００５５】
Ｃ−末端システイン残基を含む本発明の粒子はまた、Ｃ−末端システインを欠くキメラ分子から会合した粒子よりも典型的には極めて高い収量で製造される。この収量の増加は、得られた粒子量からまたは下記で考察し表１７に示すスーパーロース（Superose（登録商標））６ＨＲを用いた分析用ゲルろ過分析から認められる。
本発明のキメラＨＢｃタンパク質のドメインＩは、少なくともアミノ酸残基５位で始まり７５位まで続くアミノ酸残基配列を構成し、ドメインＩＩＩは８６位から１３７位のＨＢｃ配列を構成する。哺乳類のヘパドナウイルスのいずれの配列もドメインＩまたはドメインＩＩＩのために用いることができ、さらに２つまたは３つ以上のウイルスの配列を１つのキメラに用いることができる。好ましくは、および容易な構築のために、前記キメラを通してヒトのａｙｗ配列を用いることができる。
【００５６】
最初の３つ以上のアミノ末端（Ｎ−末端）残基の欠失を含むドメインＩを有するＨＢｃキメラは、大腸菌細胞でＨＢｃキメラタンパク質の完全な消失をもたらすことが報告された（Pumpens et al. (1995) Intervirology 38:63-74）。他方、インフルエンザＭ２タンパク質由来の２３量体の免疫原性ポリペプチドをＨＢｃのＮ−末端配列に融合させた最近の研究では、天然のＨＢｃ配列の残基１−４が置換されたとき、生成された融合タンパク質は粒子を形成することが報告された（Neirynck et al. (October 1999) Nature Med. 5(10):1157-1163）。したがって、付加されたアミノ酸残基がＨＢｃの残基１−４の１つとペプチド結合して存在するときは粒子が形成され、一方、付加配列が存在せず、残基１−３より多くのものがＨＢｃのＮ−末端から欠失する場合、粒子は形成されないことを示している。
【００５７】
ＨＢｃの最初の５つのＮ−末端残基の１つと結合したＮ−末端配列は、ＨＢｃにとって異種である約２５までの残基配列を含むことができる。模範的な配列には、以下で述べるＢ細胞またはＴ細胞エピトープ、上記のインフルエンザＭ２タンパク質（Neirynck et al）由来の２３量体ポリペプチド、別の（異種の）タンパク質配列（例えば用いられる発現系の結果として融合タンパク質として出現することができるβ−ガラクトシダーゼ）、または別のＢ型肝炎関連配列、例えばプレ−Ｓ１もしくはプレ−Ｓ２領域または主要ＨｂｓＡｇ免疫原性配列に由来するものが含まれる。
【００５８】
ドメインＩＩは約５から約２５０のアミノ酸残基の配列である。前記の残基のうち、０（全く存在しない）、好ましくは少なくとも４残基、およびより好ましくは少なくとも８残基が７６位から８５位でＨＢｃ配列の部分を構成し、さらに１つから約２４５残基、好ましくは１つから５０残基はＨＢｃにとって異種（外来性）である。前記異種残基は、（ｉ）１つのエピトープ（例えばＢ細胞またはＴ細胞エピトープ）のための異種リンカー残基、または（ｉｉ）異種ＢまたはＴ細胞エピトープを構成し、前記異種ＢまたはＴ細胞エピトープは好ましくは６から約５０、より好ましくは約１５から約５０、もっとも好ましくは約２０から約３０アミノ酸残基を含み、さらにそれらが前記ＨＢｃ配列７６位から８５位の残基の０、より好ましくは少なくとも４つから全てとの間でペプチド結合できるように配置されている。異種Ｂ細胞エピトープは、好ましくはこの位置でリンカー残基によって連結されるか、またはＨＢｃ配列とペプチド結合する。Ｂ細胞エピトープの使用は以下で例示的に考察する。
【００５９】
前記好ましい少なくとも４つのＨＢｃ残基は、ある配列の全部（例えば残基８２−８５）であってもよいし、また異種残基のどちらかの側に分割されて（接して）あってもよい（残基７６−７７と８４−８５が存在する場合または残基７６と８３−８５が存在する場合のように）。より好ましくは、ドメインＩＩは、残基７６から８５のＨＢｃ配列の少なくとも８残基を含む。もっとも好ましくは、７６位から８５位の全１０残基の配列が前記キメラに存在する。
【００６０】
前記ＨＢｃループ配列に付加される１つから約２４５残基はＨＢｃにとって異種である。ただ１つの付加される異種残基は、上記で述べたようにＢ細胞エピトープのための異種リンカー残基である。より長い配列、典型的には長さが少なくとも６アミノ酸残基から約５０アミノ酸残基、より好ましくは長さが約１５から約５０残基が、上記で述べたように、異種免疫原（例えばＢ細胞エピトープ）を含む配列内に存在する（制限部位によってコードされる異種残基は除く）。
目的のキメラ発現後のリンカー残基との結合のため、およびＨＢｃキメラ内の発現のために有用な模範的ペプチド免疫原は、その配列が得られる遺伝子に付与された一般名、発表されたエピトープの引用文献または特許および配列番号とともに下記の表Ａに例示される。
【００６１】
【表１】
Figure 2005517380
【表２】
Figure 2005517380
【表３】
Figure 2005517380
【表４】
Figure 2005517380
【００６２】
異種残基または配列のどちらかの側に存在するドメインＩＩの残りの残基はＨＢｃ７６位から８５位の残基である。したがって、残基７８から８２が置換されてある典型的な例では、ドメインＩＩのキメラ配列は、７６から７７、続いて制限部位をコードする残基、異種免疫原性（エピトープ）配列、さらに制限部位をコードする配列、続いて８４から８５のＨＢｃ配列である。残基７８と７９の間に挿入して調製されるキメラの典型的な模範的配列は、１位から７８位のＨＢｃの配列、続いて制限部位コード残基、異種免疫原性配列、さらに制限部位コード配列、およびＨＢｃ配列７９から８５である。他の考えられるキメラのドメインＩおよびＩＩの配列も前記の例示および下記の例示から明白であり、列挙する必要はないであろう。
【００６３】
既に述べたように、共役エピトープのための異種リンカーは、アミノ酸残基７６から８５間のＨＢｃ配列中の１つの位置でペプチド結合している。異種エピトープの事例がそうであったように、残基７６から８５のＨＢｃ配列は好ましくは存在するが、しかし共役エピトープのための異種リンカー残基によって中断されない。本キメラは、好ましくは１位から少なくとも１４０位のＨＢｃ配列および前記キメラたんぱく質のＣ−末端に１つのシステイン残基を含む。より好ましくは、１位から１４９位のＨＢｃ配列は存在するが、共役エピトープのための異種リンカーによって残基７６と８５との間は中断されてあり、さらにキメラ分子は１つのＣ−末端システインを含む。前記共役エピトープのための異種リンカーはもっとも好ましくはリジン（Ｋ）残基である。チロシンおよびシステイン残基を用いることができるように、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシンおよびシステイン残基もまた異種リンカーとして用いてもよい。２つ以上のリンカー（例えば３つのリジンの配列）が存在してもよいが、そのような使用は、異種共役物は、共役ハプテンを第一のキメラ内の１つのリンカーおよび第二のキメラ分子内の別のリンカーと結合させて使用することにより形成することができるという理由から好ましくないことを特記する。出願公開PCT/US99/03055は、１つまたは２つ以上の連結残基を含むが、安定化Ｃ−末端システイン残基を欠くＨＢｃキメラ分子を開示している。
【００６４】
目的のＨＢｃキメラに存在する異種エピトープ配列はまた、前記異種免疫原性（エピトープ）配列の片側または両側の（前記に接する）「可動性（flexible）リンカーアーム」によってＨＢｃ配列残基から分離されてあってもよい。上記は、特に異種免疫原性配列が約３０アミノ酸残基よりも長い場合の事例である。模範的な可動性リンカーアーム配列は、典型的には４つから約１０のグリシン残基を含み、前記グリシン残基は、また別の態様で突き出ているループ配列から前記挿入配列を外側に「突き出させ」さらに本構築物に安定性を付加させると考えられる。例示的可動性リンカーアーム配列はKrantzらの文献（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96:1915-1920(march, 1999)）に記載されてあり、下記のアミノ酸残基配列で表される：
GGGGSGGGGT 配列番号：２５６
GGGGSGGGG 配列番号：２５７
【００６５】
上記に記載したように、ドメインＩＩＩは８６位から１３５位のＨＢｃ配列を構成する。結果として、ドメインＩおよびＩＩについて上記で論じた例示キメラは、第一に論じたキメラが８４位から１３５位のＨＢｃ配列を有し、第二に論じたキメラが７９位から１３５位のＨＢｃ配列を有するように伸張することができる。
ドメインＩＶは、（ｉ）１３６位から１４９位のＨＢｃ配列を含み、（ｉｉ）少なくとも１つのシステイン残基（３つまでのシステイン残基）を含み、さらに（ｉｉｉ）約１００までのアミノ酸残基を１５０位からＣ−末端のＨＢｃにとって異種の配列中に含む配列であるが、ただしドメインＩＶは、上記（ｉｉ）の１つから１０のシステイン残基を含む少なくとも６つのアミノ酸残基を含むことを条件とする。ＨＢｃにとって異種のドメインＩＶの配列は、より好ましくは約５０までのアミノ酸残基を含み、もっとも好ましくは約２５残基までを含む。したがて、ドメインＩＶ配列は、１５０位からＣ−末端のＣ−末端ＨＢｃ配列を除いて実質的に任意のシステイン含有配列である。
【００６６】
ドメインＩＶ配列の長さは、６残基（すなわち１つのシステインおよび合計３つまでのシステイン残基を含む任意の５残基）から約１００アミノ酸残基で、十分な長さを有し、その結果、目的のキメラタンパク質が全長約１３５から約５１５残基、より好ましくは約４６０までの残基、もっとも好ましくは約４３５までのアミノ酸残基を有することができる。エピトープがドメインＩまたはＩＩにペプチド結合して、好ましくはそれぞれ約３０または５０残基を含む場合、ドメインＩＶエピトープを含む前記キメラのより好ましい長さは、約１７５から約２４０残基である。２つの異種エピトープを含む特に好ましいキメラ分子は、約１９０から約２１０残基の長さを有する。得られた粒子が核酸と結合しないことは、上記で述べたように２８０／２６０吸収比の測定によって決定される。
【００６７】
ドメインＩＶ配列は少なくとも１つのシステイン（Ｃｙｓ）残基を含み、さらに３つまでのＣｙｓ残基を含むことができる。１つまたは２つ以上のＣｙｓ残基は、前記キメラ分子のＣ−末端の約５つのアミノ酸残基部位に存在するかまたはそれらの内部に存在するのが好ましい。さらにまた、２つ以上のＣｙｓ残基がドメインＩＶ配列中に存在するときは、これらＣｙｓ残基は互いに隣接していることが好ましい。
さらにまた、ドメインＩＶ配列は、Ｔ細胞エピトープ、多数のＴ細胞エピトープ（これらは同じかまた異なっている）、または目的のキメラを免疫原として用いようとしている生物に対するさらに付加されたＢ細胞エピトープを含むことが好ましい。模範的なドメインＩＶのＴ細胞エピトープ配列を表Ａのように下記の表Ｂに示す。
【００６８】
【表５】
Figure 2005517380
【表６】
Figure 2005517380
【００６９】
Figure 2005517380
【００７０】
ドメインＩＶに存在する少なくとも１つのシステイン残基の他に、好ましくは１位から少なくとも１４０位のＨＢｃアミノ酸配列が目的のキメラ分子および粒子に存在する。より好ましくは１位から１４９位の配列が存在する。Ｂ細胞エピトープは、好ましくは残基７６から８５の間に存在し、さらに少なくともただ１つのシステイン残基またはシステイン残基を含むＴ細胞エピトープが、ＨＢｃ配列へのＣ−末端付加物として存在する。目的のリコンビナントＨＢｃキメラは実質的に結合核酸を含まない。付加されたＣｙｓ残基を前記分子のＣ−末端にまたはＣ−末端近傍に含む目的のキメラ粒子もまた、付加Ｃｙｓを含まない同様な粒子よりも３７℃で安定である。この安定性の強化は図３、４および８に示されてあり、さらに下記で論じる。
【００７１】
目的のリコンビナントＨＢｃキメラ分子は典型的には自己会合粒子として存在し、前記自己会合粒子として用いられる。これら粒子は、１８０から２４０のキメラ分子（９０または１２０ダイマー対）、通常は２４０キメラ分子で構成され、ジスルフィド還元剤（例えば２−メルカプトエタノール）の存在下でタンパク質分子に分離される。個々の分子は、したがって原則的にはジスルフィド結合によって一緒に結合して粒子を形成すると考えられる。
理論に拘束されないが、観察される安定性の強化およびいくつかの事例における目的のキメラの発現強化は、キメラ粒子のタンパク質間の更なるシステインジスルフィド結合の形成によるものと考えられる。システインとして存在するか、またはシスチンとして存在するかに関係なく、Ｃ−末端システイン残基は、それが、前記タンパク質および会合粒子が発現される核酸中に存在するコドンによってコードされる残基であるかぎりシステインと称する。
【００７２】
前記の粒子はＨＢＶ感染患者で観察される粒子と類似しているが、非感染性である。種々の原核細胞および真核細胞ホストで発現したとき、個々のリコンビナントＨＢｃキメラ分子はホスト内で会合し、前記ホストから容易に回収でき、所望の場合は精製できる粒子を形成する。
上記で述べたように、ＨＢｃイムノドミナントループは、完全なタンパク質のアミノ末端（Ｎ−末端）から約７５位から８５位に位置すると通常言われている。ドメインＩＩの異種Ｂ細胞エピトープ含有配列は、前記イムノドミナントループ配列に配置される。前記のように配置することによって、ＨＢｃループ配列のＨＢｃ免疫原性は排除され、一方、会合キメラ粒子の極めて免疫原性の強い位置に異種配列またはリンカー残基を提示する。
【００７３】
以前に論じたＮ−およびＣ−末端切断、種々のエピトープおよびスペーサーの挿入の他に、目的のキメラ分子はまた、ＨＢｃドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶを構成するアミノ酸残基中に保存的置換を含むことができる。保存的置換は上記で定義したとおりである。
より稀なことではあるが、「非保存的」変更、例えばグリシンのトリプトファンによる置換も意図される。同様な稀な変動にはまたアミノ酸の欠失もしくは挿入、またはその両方が含まれるであろう。生物学的活性または粒子の形成を停止させることなくどのアミノ酸残基を置換、挿入または欠失させることができるかを決定する場合の手引きは、当分野で周知のコンピュータープログラム（例えばＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフト（DNASTAR Inc., Madison, Wis.）を用いて見つけることができる。
【００７４】
本発明のキメラ分子のＨＢｃ部分（すなわち付加されたエピトープ、リンカー、可動性リンカーアーム、または制限酵素人工産物である異種残基以外のＨＢｃ配列を有する部分）は、もっとも好ましくは図７に示すサブタイプａｙｗ（配列番号：２４７）の１位から１４９位のアミノ酸残基配列を有し、前記より好ましさは減じるが、一方の端または両端の切端形のゆえに存在しないａｙｗサブタイプ配列の任意の部分を有する。図７に示したサブタイプａｄｗ、ａｄｗ２、およびａｄｙｗ（配列番号：２４８、２４９および２５０）の対応するアミノ酸残基配列もまたいくぶん好ましさは減じるものの好ましい。さらにまた好ましさは減じるが、図７の最後の２つの配列（配列番号：２５１および２４６）であるウッドチャックおよび地上リスのアラインメントを実施した１位から１４９位の配列も好ましい。また別の場所で述べるように、別個の哺乳類のＨＢｃタンパク質の種々の配列部分をただ１つのキメラ内に一緒に用いてもよい。
【００７５】
上記のような本発明のキメラ分子のＨＢｃ部分が、１位から１４９位に対応する哺乳類ＨＢｃ分子以外を有する場合は、配列番号：２４７の１位から１４９位と比較して前記アミノ酸残基の２０％未満が置換されてある。好ましくは１０％未満、より好ましくは約５％未満、もっとも好ましくは３％未満のアミノ酸残基が配列番号：２４７の１位から１４９位と比較して置換されてある。
１４９ＨＢｃ残基を有する目的のキメラは、したがって、配列番号：２４７の１位から１４９位の残基と異なる約３０までの残基、好ましくは約１５までの残基を含むことができる。より好ましくは、約７または８残基が、もっとも好ましくは約４または５残基が、１−１４９のａｙｗ配列（配列番号：２４７）と異なっている。ドメインＩＩのイムノドミナトループまたは末端以外の置換は、好ましくは前記キメラ分子の非らせん部分に存在し、典型的には残基１から約１５、および残基２４から約５０の間に存在し、粒子形成を担保する。例えば以下の文献を参照されたい：Koschel et al., J. Virol., 73(3):2153-2160(Mar. 1999)。
ＨＢｃ配列が１４９位を越えてＣ−末端で、もしくはＮ−末端で切断されているか、または１つもしくは２つ以上の欠失が免疫原性ループ内に存在する場合、置換される残基の数は、前記配列の全長が１４９未満であるので比例的に相違する。前記分子のそれ以外の場合の欠失は、計算のためには保存的欠失と考える。
【００７６】
キメラの調製
目的のキメラＨＢｃ免疫原は、周知のリコンビナントＤＮＡ技術を用いて調製できる。したがって、ＨＢｃをコードする前駆体配列に特定のポリペプチド配列をコードする核酸配列を付加および欠失させて、目的のキメラをコードする核酸を作製する。
異種エピトープ配列をループ配列に配置するためには以下の２つの方法のいずれかが好ましい。第一の方法は置換と称され、この方法ではイムノドミナントループの一部分をコードするＤＮＡが切り出され、異種エピトープ（例えばＢ細胞配列）をコードするＤＮＡで置換される。第二の方法は挿入と呼ばれ、この方法では異種エピトープはループ内の隣接残基間に挿入される。
【００７７】
ある模範的置換手法ではポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による位置特異的突然変異を用いて、１対の異なる制限部位（例えばＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩ、イムノドミナトループをコードするＤＮＡの各末端近くに１つ）をコードするキメラＨＢｃＤＮＡ配列が提供される。置換される典型的な残基は７６から８１である。ループをコードする部分を切り出し、異種Ｂ細胞エピトープをコードする所望の配列を前記制限部位につなぎ、得られたＤＮＡを用いてＨＢｃキメラを発現させる。前記技術の典型的な使用については、例えば以下の文献を参照されたい：Pumpens et al., (1995) Intervirology 38:63-74。
【００７８】
また別には、ただ１つの制限部位を位置特異的突然変異によって前記領域内にコードし、ＤＮＡを制限酵素で切断して「粘着」末端を提供し、前記粘着末端をエンドヌヌクレアーゼを用いて平滑にし、平滑末端をもつ異種ＤＮＡセグメントを前記切断領域につなぐ。このタイプのＨＢｃへの配列置換の例は以下によって報告された研究で見出される：Schodel et al., (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp. 319-325; Schodel et al., Behring Inst. Mitt., 1997(98): 114-119; Schodel et al., J. Exp. Med., (1994) 180(3):1037-4。後者の２つの論文は、それぞれＰ．ヨエリー（yoelii）およびＰ．ベルゲイ（berghei）に対するワクチンの製造を考察している。
【００７９】
ＨＢｃ免疫原性ループ内の挿入位置およびループ残基の存在は免疫原の活性に重要であることが見出された。したがって、以下で例示するように、ＨＢｃ残基７８位と７９位の間にマラリアのＢ細胞エピトープを配置することによって粒子化免疫原が提供され、前記は残基７６から８１の間で切り出し置換した領域中に同じ免疫原を配置した場合よりも１０倍から１０００倍高い免疫原性を有する。さらにまた、残基７８と７９の間に同じマラリア免疫原を配置することによって、残基７７と７８の間に配置した場合と比較して予期されなかった約１５倍の免疫原性の増加が提供された。
【００８０】
したがって挿入が一般に好ましい。前記挿入による方法の例示的実施例では、位置特異的突然変異を用いて、互いに隣接してあって、さらに例えば残基７８位および７９位のような隣接アミノ酸残基をコードするコドンの間に２つの制限部位を創出する。この技術によって、ＨＢｃループ内で以前には隣接していた残基の間に４つのアミノ酸残基（各制限部位について２つ）をコードする１２の塩基対が付加される。
【００８１】
制限酵素による切断、異種Ｂ細胞エピトープ配列をコードするＤＮＡの連結、および前記ＤＮＡのＨＢｃキメラ形成のための発現によって、前記ＨＢｃループのアミノ酸配列は、そのＮ−末端側で５´制限部位によってコードされる２つの残基によって中断され、その後Ｃ−末端に向かって前記異種Ｂ細胞エピトープ配列、その後３´制限部位によってコードされるさらに２つの異種非ループ残基、および続いてループ配列の残りがそれに続くのが認められる。この同じ方法を用いて、Neirynckら（Nature Med., 5(10):1157-1163(October 1999)）が報告したようにＮ−末端の配列をドメインＩに挿入するか、またはドメインＩＶにＴ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープの部分ではない１つもしくは２つ以上のシステイン残基を挿入することができる。残基８２と８３との間の挿入を用いる同様な方法が、Schodelら（Schodel et al., (1990) F. Brown et al. eds., Vaccines 90, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,pp.193-198）によって報告されている。
【００８２】
より具体的には、このクローニング方法は図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに模式的に示されている。図２Ａでは、Ｃ−末端切断ＨＢｃ配列（ＨＢｃ１４９）をコードするＤＮＡ配列を、隣接するＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩ部位を残基７８と７９の間に含むように操作する。両酵素で前記ＤＮＡを切断して、３´末端にＥｃｏＲＩ粘着末端を有するＨＢｃ１−７８をコードする１つフラグメントが提供される。他方のフラグメントは５´末端にＳａｃＩ粘着末端を有し、７９位から１４９位の残基をコードする。５´ＡＡＴＴの張出しの後に所望のマラリアＢ細胞エピトープをコードする配列およびＡＧＣＴ３´張出しを有する合成核酸を連結して、残基７８と７９の間で各側面を２つの異種残基（それぞれＧｌｙＩｌｅ（ＧＩ）およびＧｌｕＬｅｕ（ＥＬ））が接するＢ細胞エピトープをコードするＨＢｃキメラ配列（通常はＥｃｏＲＩ部位は破壊され、ＳａｃＩ部位は温存される）が提供される。
【００８３】
システイン含有配列のドメインＩＶへの挿入のための同様な方法が図２Ｂに示されている。前記システイン含有配列は、例えば特に好ましくはマラリアＴ細胞エピトープで、これは、３２６位から３４５位のＰ．ファルシパルム（falciparum）ＣＳタンパク質配列を含み、本明細書ではＰＦ／ＣＳ３２６−３４５（Ｐｆ−ＵＴＣ）と称される。本例では、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位がＨＢｃＤＮＡのアミノ酸残基１４９位の後に創出される。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、上記のＡＡＴＴ５´張出し、その後にＴ細胞エピトープコード配列、１つまたは２つ以上の終止コドンおよび３´ＡＧＣＴ張り出しを有する合成ＤＮＡを前記消化した配列につないで、ＨＢｃ残基１−１４９、続いて２つの異種残基（ＧＩ）、終止コドンおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位をコードする配列を形成する。
【００８４】
ＳａｃＩ制限部位、続いて残基７９位で始まるＨＢｃをコードする配列を有する前進プライマーを用いてＰＣＲ増幅を実施し、その後ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して７９位から１４９位のＨＢｃ＋２つの付加残基およびＣ−末端にＴ細胞エピトープをコードする配列を提供した。図２Ｂの構築物をＳａｃＩで消化して連結し、図２Ｃに示す、Ｎ−末端からＨＢｃ１−７８位の配列、２つの付加残基、マラリアＢ細胞エピトープ、２つの付加残基、ＨＢｃ７９−１４９位、２つの付加残基およびＴ細胞エピトープを有する所望のリコンビナントＨＢｃキメラ免疫原を提供した。
【００８５】
同様な技術を用いて、Ｂ細胞エピトープをループ領域の配列に共役させるために異種リンカー残基を配置することができる。意図されるリンカー残基にはリジン（Ｌｙｓ）（これが特に好ましい）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、システイン（Ｃｙｓ）およびチロシン（Ｔｙｒ）が含まれる。
配列番号：２４７に示されたアミノ酸残基配列は、７７位および７８位にＧｌｕおよびＡｓｐ残基を含む。それにもかかわらず、さらに別の異種カルボキシル含有残基がなお意図される。現存するグルタミン酸およびアスパラギン酸の化学的反応性は他の因子によって減少させることができる。例えば、近傍のプロリン（例えば７９位で見出されるもの）は、基部のカルボキシル基の化学的反応性を中和し、それによって前記反応性を減少させる。
【００８６】
さて、第一に記載した挿入方法を用いて、５つの異種残基をループ配列に配置する。すなわち、１つはＢ細胞エピトープを共役させるための異種リンカー残基で、２つの残基は前記１つの残基のいずれかの側に隣接し、それら自体もまたループ配列残基に隣接し、挿入された制限部位の発現産物（制限酵素の人工産物）である。さらに位置特異的突然変異を用いてただ１つのコドンを、Ｂ細胞エピトープのための異種リンカー残基をコードするＨＢｃループ配列に付加できることを特記する。
【００８７】
都合がよい場合には、Ｂ細胞またはＴ細胞エピトープのいずれかの側で（前記に接して）２つの異種残基を使用するのが好ましいことを特記する。結果として、ＨＢｃ配列の部分ではない０から３つまたは４つ以上の付加残基を挿入配列のいずれかの端または両端に用いてもよい。挿入物およびＨＢｃ核酸の一方の端または両端を適切なヌクレアーゼ（例えばＳ１ヌクレアーゼ）で「ならし直し（chew back）」て、一緒に連結させることができる平滑端を提供してもよい。挿入したＢ細胞またはＴ細胞エピトープの部分でもなく、ＨＢｃ配列の部分でもない付加異種残基は、表示のドメインに存在する残基の数には数えない。
【００８８】
さらにまた、所望のリコンビナントＨＢｃキメラ核酸の全てまたは一部分は、タバコ（Nicotiana tabacum）の５９残基のリブロースビス−ホスフェートカルボキシラーゼ−オキシゲナーゼシグナルペプチドをコードする１７７塩基対ＤＮＡの合成に関する米国特許第5,656,472号で考察例証されているような周知の合成方法を用いて合成できることも特記されよう。例えば、平滑端または「粘着端」をもつドメインＩおよびＩＩを合成し、これらをドメインＩＩＩおよびＩＶに連結して、Ｂ細胞エピトープのＮ−末端側に付加残基がなく、さらにＣ−末端側またはドメインＩＩ／ＩＩＩ結合部または他の所望の位置に０から３つの付加残基を含む目的のＨＢｃキメラを発現する構築物を提供することができる。
【００８９】
また別の挿入技術が以下の文献に報告された：Clarke et al., (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp.313-318。ここでは、遺伝子コードの縮退を利用して、残基８０および８１に本来存在する残基をコードする、前記残基に対応するただ１つの制限部位が創出された。発現された前記ＨＢｃキメラは、それによって制限部位によってコードされる残基を含まず、挿入配列に直に隣接するＨＢｃループ残基を含んでいた。
上記に記載したＨＢｃキメラ分子またはそのコード配列の相補物をコードする核酸配列（セグメント）もまた本明細書に包含される。前記のような核酸セグメントは、いくつかの好ましい実施態様では単離され精製された形態で存在する。
【００９０】
現存の生物では、タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸残基配列は、前記タンパク質をコードする遺伝子のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の遺伝暗号を介して直接的関係にある。したがって、周知の遺伝暗号の縮退により、さらに別のＤＮＡおよび対応するＲＮＡ配列（核酸）を所望にしたがって調製することができる。前記の核酸は、同じキメラアミノ酸残基配列をコードするが、上記で考察した遺伝子配列とは十分に異なっていて、それら２つの配列は高ストリンジェンシーではハイブリダイズしないが、中等度のストリンジェンシーではハイブリダイズすることができる。
高ストリンジェンシー条件とは、６×ＳＳＣで約５０℃〜５５℃の温度でのハイブリダイゼーションおよび１〜３×ＳＳＣで６８℃の温度での最終洗浄を含むものと定義できる。中等度ストリンジェンシー条件は、約５０℃から約６５℃の温度で０．２から０．３ＭのＮａＣｌでのハイブリダイゼーション、続いて約５０℃から約５５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）での洗浄を含む。
【００９１】
以下の（１）〜（３）の核酸配列（ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列）はＤＮＡ変種配列と定義される：（１）それ自体またはその相補物が、その１位から１３６位の残基のＨＢｃ部分（それが存在する場合）が配列番号：２４６、２４７、２４８、２４９、２５０または２５１の残基であるキメラ分子をコードし、さらに（２）少なくとも中等度のストリンジェンシー（上記に記載した）で配列番号：２７４、２７５、２７６、２７７、２７８または２７９とハイブリダイズし；さらに（３）そのＨＢｃ配列が、配列番号：２７４、２７５、２７６、２７７、２７８および２７９のＤＮＡ配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、もっとも好ましくは１００％の同一性を共有する。周知のように、核酸配列（例えば目的とされる核酸配列）は、本明細書のまた別の場所に記載するように、適切な発現系で適切なプロモーターに機能的に連結されたときに発現される。
【００９２】
目的のキメラ分子をコードする核酸類似体（ＤＮＡまたはＲＮＡ）もまた本発明の部分として包含される。キメラ核酸類似体配列またはその相補核酸配列は、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、もっとも好ましくは９５％が、配列番号：２４６、２４７、２４８、２４９、２５０および２５１に示された１位の残基から１３６位の残基のＨＢｃ配列部分と同一のＨＢｃアミノ酸残基配列をコードする。前記ＤＮＡおよびＲＮＡは、本明細書では配列番号：２７４、２７５、２７７、２７８および２７９の核酸の配列と「類似する」または前記配列の「類似体」と称され、本明細書の中等度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：２７４、２７５、２７６、２７７、２７８および２７９の核酸配列またはそれらの相補物とハイブリダイズする。類似配列をコードする核酸はまた、適切なトランスフェクションおよび発現によって目的のキメラを生成する。
【００９３】
種々のホストはまた、しばしば個々のアミノ酸のコードに使用するために特定のコドンについて優先性を有する。そのようなコドンの優先性は周知であり、例えばin vitro突然変異誘発を用いて所望のキメラ配列をコードするＤＮＡ配列を変更し、前記酵素が発現される個々のホストにとって好ましいコドンを利用することができる。さらにまた、遺伝コードの縮退を用いて、配列番号：２７４、２７５、２７７、２７８もしくは２７９またはそれらの相補物との実質的同一を回避する配列番号：２４６、２４７、２４８、２４９、２５０または２５１の配列をもつＨＢｃ部分をコードすることができる。したがって、有用な類似ＤＮＡ配列は、中等度のストリンジェンシー条件下では配列番号：２７４、２７５、２７６、２７８または２７９のヌクレオチド配列とハイブリダイズするとは限らないが、なお目的のキメラ分子を提供することができる。
【００９４】
上記に記載したような目的のキメラをコードする遺伝子を規定する外因性核酸セグメント（例えばＤＮＡセグメントまたは配列）および適合するホスト生物で前記遺伝子の発現を駆動させるために適したプロモーターと機能的に連結されたベクターを含むリコンビナント核酸分子（例えばＤＮＡ分子）もまた本発明の目的である。より具体的には、本発明の目的は、ＤＮＡセグメントに機能的に連結された、ホスト生物細胞内で前記キメラの発現を駆動させるプロモーターを含むベクターを含むリコンビナントＤＮＡ分子であって、前記ＤＮＡセグメントは、配列番号：２７４、２７５、２７６、２７８または２７９のキメラ遺伝子と少なくとも９０％同一性を有し、さらに中等度のストリンジェンシー条件下で前記遺伝子とハイブリダイズするキメラＨＢｃ部分の遺伝子またはＤＮＡ変種と定義される。
【００９５】
さらに本発明の目的は、ＤＮＡセグメントと機能的に連結されたホスト生物細胞内でキメラの発現を駆動させるプロモーターを含むベクターを含むリコンビナントＤＮＡ分子で、前記ＤＮＡセグメントは、配列番号：２４６、２４７、２４８、２４９、２５０または２５１の配列のＨＢｃ部分と少なくとも８０％同一、より好ましくは９０％同一、もっとも好ましくは９５％同一であるＨＢｃキメラ部分のアミノ酸残基配列をコードする。前記リコンビナントＤＮＡ分子は、適切なトランスフェクションおよびホスト細胞内での発現によって、目的のキメラ分子を提供する。
【００９６】
３０アミノ酸残基のために地上性リスのＨＢｃのＮ−末端配列は他のＨＢｃ配列のいずれともアラインすることがなく、前記配列およびそのコード配列およびそれらの相補物は上記の同一性百分率に含まれず、ハイブリダイゼーション決定で用いられる前記３０残基配列をコードする核酸部分またはその相補物も同様であることを特記しておく。同じように、ＨＢｃのＮ−およびＣ−末端の片方または両方で切断されている配列も同一性の計算に含まれることはなく、異種エピトープの挿入のためにそのイムノドミナントループの残基が除去されるそれら配列も同様である。したがって、キメラ分子に存在するＨＢｃコード塩基またはＨＢｃ配列残基のみが包含され、同一性百分率計算で核酸またはアミノ酸残基配列アラインメントの比較が実施される。
【００９７】
本明細書に開示される遺伝子のコード配列が配列番号：２７４、２７５、２７６、２７７、２７８および２７９に示されているので、単離核酸セグメント（好ましくはＤＮＡ配列）、その変種および類似体は、当分野で周知の文献（"Current Protocols In Molecular Bioligy", Ausabel et al. eds., John Wiley & Sons(New York:1987), p.8.1.1-8.1.6）に論ぜられているように、遺伝子の最初のＡＴＧコドンで開始し、各遺伝子の終止コドンまたはその直ぐ下流で終わるin vitro突然変異誘発によって調製することができる。したがって、所望の制限部位を開始コドンまたはその上流、および終止コドンまたはその下流で創出し、他の遺伝子を調製し、切り出しさらに単離することができる。
【００９８】
当分野では周知のように、所望の核酸（例えばＤＮＡ配列）が存在するかぎり（開始シグナルおよび終止シグナルを含み）、さらに別の塩基対が通常は前記セグメントのいずれかの末端に存在し、前記セグメントはなお前記タンパク質の発現に利用することができる。もちろんのこと、これは、発現を抑圧したり、発現させたい酵素を消費するさらに別の生成物を発現させたり、または前記ＤＮＡセグメントの遺伝子の発現に干渉する機能的に連結されたＤＮＡ配列が前記セグメント内に存在しないことを仮定している。
【００９９】
したがって、前記ＤＮＡセグメントが前記のような干渉ＤＮＡ配列を含まないかぎり、本発明のＤＮＡセグメントは長さが約５００から約１５０００塩基対である。リコンビナントＤＮＡ分子（特に発現ベクター）の最大サイズは、複製および発現（消耗される場合）に必要な最小限のＤＮＡ配列の全てがいったん存在するならば、あとは便利さとホスト細胞が含むことができるベクターサイズによってほぼ決定される。最少のベクターサイズは周知である。非常に長いＤＮＡセグメントは好ましくないが用いることは可能である。
上記で述べたキメラをコードするＤＮＡセグメントは化学的に、例えばホスホトリエステル法（Matteucci et al.(1981) J. Am. Chem. Soc., 103:3185）によって合成してもよい。もちろんのこと、コード配列を化学的に合成することにより、天然のアミノ酸残基配列を適切な塩基で置換して任意の所望の改変を簡単に実施することができる。しかしながら、上記で論じた配列を含むＤＮＡセグメントが好ましい。
【０１００】
目的のＨＢｃキメラは、多数の形質転換ホスト系（典型的にはホスト細胞）で製造することができるが、無細胞系（in vitro）系での発現もまた包含される。前記ホスト細胞系には、リコンビナントバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた微生物（例えば細菌）；酵母発現ベクターで形質転換させた酵母菌；ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス）で形質転換させるか、または細菌発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換させた植物細胞系；または適切に形質転換させた動物細胞系（例えばＣＨＯ、ＶＥＲＯまたはＣＯＳ細胞）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。本発明は用いられるホスト細胞によって制限されない。
【０１０１】
ＨＢｃキメラをコードする遺伝子を含むＤＮＡセグメントは、好ましくは、前記遺伝子を含むリコンビナントＤＮＡ分子（プラスミドベクター）から得られる。キメラ遺伝子の発現を指令してＨＢｃキメラタンパク質を発現させることができるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。
発現ベクターは、プロモーターを含む発現制御エレメントを含んでいる。キメラコード遺伝子は発現ベクターに機能的に連結され、前記プロモーター配列がＲＮＡポリメラーゼにキメラコード遺伝子への結合および発現を指令することを可能にする。ポリペプチドコード遺伝子の発現に有用なプロモーターは、誘発性、ウイルス性、合成、下記文献で報告された構成性（Poszkowski et al. (1989) EMBO J., 3:2719; Odell et al. (1985) Nature, 313:810）プロモーターの他に、時間的調節性、場所的調節性、および時間的場所的調節性プロモーター（Chua et al. (1989) Science, 244:174-181）がある。
【０１０２】
原核細胞(例えば大腸菌)で使用される好ましいプロモーターの１つは、外因的に供給されたナリジクス酸によって誘発されるＲｅｃ７プロモーターである。より好ましいプロモーターは、プラスミドベクターＪＨＥＸ２５（Promegaより入手可能）に存在するもので、外因的に供給されるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト−ピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘発することができる。さらにより好ましいプロモーター、ｔａｃプロモーターはプラスミドベクターｐＫＫ２２３−３に存在し、さらにまた外因的に供給されたＩＰＴＧによって誘発することができる。ｐＫＫ２２３−３プラスミドは多数の大腸菌株、例えばＸＬ−１、ＴＢ１、ＢＬ２１およびＢＬＲで、約２５から約１００μＭのＩＰＴＧを誘発に用いて良好に発現させることができる。驚くべきことには、約２５から約５０μＭの濃度のＩＰＴＧが２Ｌのシェーカーフラスコおよびファーメンターで最適結果を提供することが判明した。
【０１０３】
サルモネラ属のいくつかの株、例えば腸チフス菌およびネズミチフス菌並びにネズミチフス菌−大腸菌ハイブリッドを用いて、先のＨＢｃキメラ粒子を含む免疫原性トランスジーンを、免疫原として使用する粒子の供給源として、さらに全細胞による弱毒生ワクチンおよび接種物として発現させた。前記発現系およびワクチン系を本明細書で用いることができる。以下の文献を参照されたい：米国特許第6,024,961号；米国特許第5,888,799号；米国特許第5,387,744号；米国特許第5,294,441号；Ulrich et al. (1998) Adv. Virus Res., 50:141-182; Tacket et al., (Aug. 1997) Infect. Immun., 65(8):3381-3385; Schodel et al., (Feb. 1997) Behring Inst. Mitt., 98:114-119; Nardelli-Haefliger et al., (Dec. 1996) Infect. Immun., 64(12):5219-5224; Londono et al., (Apr. 1996) Vaccine, 14(6):545-552および前記で引用された文献。
【０１０４】
真核細胞に適合する発現ベクター（例えば酵母細胞に適合するもの、または高等植物または哺乳類の細胞に適合するもの）もまた本明細書で意図される。前記のような発現ベクターもまた本発明のリコンビナントＤＮＡ分子の生成に用いることができる。酵母菌（例えばビール酵母菌またはピキア・パストリス（Pichia pastoris））で使用するベクターは、周知のようにエピソーム型でも組み込み型でもよい。真核細胞発現ベクターは当分野では周知で、いくつかの販売元から入手できる。通常は、前記のようなベクターは、１つまたは２つ以上の便利な制限部位を所望のＤＮＡセグメントおよびプロモーター配列の挿入のために含んでいる。場合によって、前記ベクターは、真核細胞で使用するために特別な選別マーカーを含んでいる。ビール酵母菌で使用する模範的プロモーターには、ビール酵母菌ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよび派生プロモーターＧＡＬ１０およびＧＡＬ１が含まれるが、一方、アルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）はピキア・パストリスで有用なプロモーターである。
【０１０５】
例えば、メチロ栄養型（methylotrophic）酵母菌、Ｐ．パストリスでキメラを製造するために、所望のキメラをコードする遺伝子は、ピキア（Pichia）の構造遺伝子の発現を指令する調節配列の制御下に配置する。得られたこれら遺伝子の発現コンピテント型をピキア細胞に導入する。
より具体的には、Creggら（Biotechnology, 5:479-485(1987)およびMolecular and Cellular Biology, 12:3376-3385(1987)）の報告した形質転換および発現系を用いることができる。キメラＶ１２．Pｆ３．１の遺伝子をアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）プロモーターの下流および同じＡＯＸ１遺伝子の転写ターミネーター配列の上流に配置する。前記遺伝子およびそれに接する調節領域を続いてプラスミドに導入する。前記プラスミドは、Ｐ．パストリス細胞でのプラスミドの複製を可能にするＰ．パストリスＨＩＳ４遺伝子およびＰ．パストリスＡＲＳ配列（自律複製配列）の両方を有している（Cregg et al. (1987) Molecular and cellular Biology, 12:3376-3385）。
【０１０６】
前記ベクターはまた、プラスミド（例えばｐＢＲ３２２）の適切な部分を含み、大腸菌細胞での前記プラスミドの増殖を可能にする。キメラ遺伝子とともに上記で述べた種々の付加エレメントを保持する生成されたプラスミドで、例えばＰ．パストリスのｈｉｓ４変異体（すなわち機能的ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子欠落株の細胞）を形質転換させる。
ヒスチジンを欠く培地上で形質転換コロニーを選別した後、Creggら（Molecular and cellular Biology, 12:3376-3385(1987)）の記載にしたがって、ヒスチジンを欠くがメタノールを含む培地で細胞を増殖させ、ＡＯＸ１プロモーターを誘発する。前記誘発されたＡＯＸ１プロモーターは、Ｐ．パストリスでキメラタンパク質の発現およびキメラ粒子の産生をひき起こす。
目的のキメラ遺伝子はまた、Creggら（Molecular and cellular Biology, 12:3376-3385(1987)）の記載にしたがって、組み込み型形質転換によって導入することができる（前記はＡＲＳ配列の使用を必要としない）。
【０１０７】
哺乳類細胞でのリコンビナントＤＮＡ発現によるキメラ粒子の製造は、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞でキメラ遺伝子を発現させることができるリコンビナントＤＮＡベクターを用いて実施できる。前記は、当分野で周知であり文献（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Hatbor Laboratories (1989)）にも詳細に記載されている技術を用いて達成できる。
例えばある実施例では、サルウイルス（ＳＶ４０）系発現ベクター、ｐＫＳＶ−１０（Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ）にＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる制限エンドヌクレアーゼ消化が施される。実施例１の記載にしたがって調製した所望のＨＢｃキメラをコードするＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ配列フラグメントを前記発現プラスミドに連結し、これによりｐＳＶ−Ｐｆと称される環状リコンビナント発現プラスミドが生成される。
【０１０８】
前記発現プラスミドｐＳＶ−Ｐｆは、無傷の大腸菌アンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。したがって大腸菌ＲＲ１０１（Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD）は、ｐＳＶ−Ｐｆで形質転換したとき、アンピシリン耐性を基準にして前記プラスミドを含む細菌を選別することができる。さらにプラスミド保持細菌をクローニングし、続いて発現ベクターに挿入されたコード遺伝子の適切な向きについてそれらクローンをスクリーニングする。
所望のＨＢｃキメラをコードする遺伝子を含む上記で得られたプラスミド（ｐＳＶ−Ｐｆ）は、前記プラスミドを含む大腸菌を培養することによって増殖させる。プラスミドＤＮＡは前掲書（Sambrook et al.）に記載されたように大腸菌培養から単離される。
【０１０９】
キメラの発現は、ｐＳＶ−Ｐｆを哺乳類細胞株（例えばＣＨＯ細胞）にリン酸カルシウム媒介トランスフェクション法（Graham et al. (1973) Virol. 52:456）または類似の技術を用いて導入することによって実施される。
ｐＳＶ−ＰｆのＣＨＯ細胞培養への最大の導入効率を担保するために、前記トランスフェクションは、Southernら（J. Mol. Appl. Genet., 1:327(1982)）の記載にしたがって、第二のプラスミド、ｐＳＶ２ＮＥＯ（ATCC#37149）および細胞毒性薬剤Ｇ４１８（GIBCO Laboratories, Grand Island, N.Y.）の存在下で実施される。Ｇ４１８に対して耐性を示し培養することができるＣＨＯ細胞は両方のプラスミド、ｐＳＶ２ＮＥＯおよびｐＳＶ−Ｐｆを獲得しており、ＣＨＯ／ｐＳＶ−Ｐｆ細胞と称される。ｐＳＶ−Ｐｆ発現ベクターの遺伝子構成のために、キメラは前記生成ＣＨＯ／ｐＳＶ−Ｐｆ細胞で発現され、前記細胞の細胞質で検出され、前記細胞質から精製することができる。得られた細胞性タンパク質を含む組成物は本明細書の別の場所で論じるとおりカラムで分離される。
【０１１０】
どの発現ベクターに、さらには最終的にどのプロモーターにキメラコード遺伝子を連結させるかという選択は、所望される機能的特性（例えばタンパク質発現の場所およびタイミング）および形質転換されるホスト細胞によって左右される。上記の事柄は、リコンビナントＤＮＡ分子構築技術においては周知の固有の制限である。しかしながら、本発明の実施で有用なベクターは、複製を指令することができ、さらに好ましくは（発現ベクターについては）キメラ遺伝子が機能的に連結されてあるＤＮＡセグメントに含まれる前記キメラ遺伝子の発現を指令することができる。
ある好ましい実施態様では、前記キメラを発現するホストは原核細胞（大腸菌）で、好ましいベクターは原核細胞レプリコン（すなわち、自律的な複製および形質転換ホスト原核細胞内でのリコンビナントＤＮＡ分子の染色体外維持を指令する能力を有するＤＮＡ配列）を含む。前記のようなレプリコンは当分野で周知である。
【０１１１】
原核細胞レプリコンを含むベクターはまた、目的のＨＢｃキメラ遺伝子の形質転換ホスト細胞（例えば大腸菌）内での発現を指令することができる原核細胞プロモーター領域を含むことができる。細菌ホストに適合することができるプロモーター配列は、典型的には１つまたは２つ以上の便利な制限部位を目的のＤＮＡセグメントの挿入のために含むプラスミドベクター中に提供される。前記のようなベクタープラスミドの典型は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９およびｐＢＲ３２９（Biorad Laboratories (Richmond, CA)より入手できる）並びにｐＰＬおよびｐＫＫ２２３−３（Pharmacia (Piscataway, NJ)より入手できる）である。
【０１１２】
高等植物および哺乳類由来の細胞における遺伝子発現に有用な典型的ベクターは当分野では周知で、Rogersら（Meth. in Enzymol., 153:253-277(1987)）が記載したアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミドに由来する植物ベクター、および哺乳類発現ベクターｐＫＳＶ−１０、上記のものおよびｐＣＩ−ｎｅｏ（Promega Corp., #E1841, Madison, WI）が含まれる。しかしながら、Frommら（Proc. Natl Acad. Sci. USA, 82:58-24(1985)）が記載したｐＣａＭＶＣＮトランスファーコントロールベクターを含む、その他のいくつかの発現ベクター系が植物で機能することが判明している。プラスミドｐＣａＭＶＣＮ（Pharmacia (Piscataway, NJ)より入手できる）は、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含む。
【０１１３】
上記の植物発現系は、典型的には挿入されたトランスジーンの系統的または構成的発現を提供する。系統的発現は、目的のキメラ分子または生成粒子の供給源として植物の大半または全体が用いられる場合、または植物の大部分を用いて経口ワクチンを提供する場合に有用であろう。しかしながら、キメラ分子または粒子を植物の貯蔵器官（例えば根、種子または果実）で発現させることがより有効である。前記貯蔵器官から粒子をより容易に単離または摂取できる。
【０１１４】
貯蔵器官での発現を達成する態様の１つは、１つまたは２つ以上の予め選択した、または予め定めた非光合成植物器官でその制御遺伝子を発現するプロモーターを用いることである。他の器官ではほとんどまたは全く発現をひき起こさないが１つまたは２つ以上の予め選択した貯蔵器官（例えば葉または茎に対して根、種子または果実）で発現させることを、本明細書では強化または優先発現と称する。別の器官と比較したとき少なくとも５：１の比で１つまたは２つ以上の予め選択した器官で発現を指令する典型的なプロモーターは、本明細書では器官強化プロモーターと定義する。実質的にただ１つの貯蔵器官でのみ発現され、他の貯蔵器官では実質的に発現されないものを器官特異的発現と称し、すなわち貯蔵器官対別の器官の発現生成物比が約１００：１またはそれ以上は器官特異的であることを示す。貯蔵器官特異的プロモーターはしたがって貯蔵器官強化プロモーター類の中の１つである。
【０１１５】
典型的な植物貯蔵器官には、ニンジン、タロイモもしくはカサバの根、ジャガイモの塊茎および果肉（例えば赤バンジロウ、トケイソウ、マンゴー、パパイヤ、トマト、アボカド、サクランボ、ミカン、ポンカン、ヤシ、メロン（例えばマスクメロン）およびスイカの果肉）、並びに他の多肉質果実（例えばスクオッシュ、キウリ、マンゴー、アプリコット、モモ）の他に種子（トウモロコシ、ダイズ、コメ、ナタネなど）が含まれる。
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは通常は構成性プロモーターとみなされる。しかしながら、最近の研究では、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの２１−ｂｐ量域は、別のもの（異種の常緑組織プロモーター（ｒｂｃＳ−３Ａ））に連結されたとき、根強化プロモーターになる合成キメラプロモーターとなることができることが示された。前記２１−ｂｐ配列は米国特許第5,023,179号に開示されている。米国特許第5,023,179号の２１−ｂｐ挿入物を含むキメラｒｂｃＳ−３Ａプロモーターは、本発明の有用な根強化プロモーターである。
【０１１６】
上記の２１−ｂｐセグメントを含む同様な根強化プロモーターは、ＣＡＭＶ３５Ｓプトモーター自体の−９０から＋８領域である。米国特許第5,110,732号は、切端ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは根および種子の根部（radical）（根になる運命の組織）での発現強化を提供することを開示した。前記プロモーターもまた本発明で有用である。
また別の根強化プロモーターは、ナタネ（Brassica napus L.）遺伝子の−１６１６から−１プロモーターで、PCT/GB92/00416（WO91/13922、1991年9月19日公開）で開示されている。プラスミドｐＲｌａｍｂｄａＳ４を含む大腸菌ＤＨ５．アルファおよびこのプロモーターを有するバクテリオファージ、ラムダ．ベータ．１は、１９９０年３月８日に以下の公的機関に寄託され（National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Alberdeen, GB）、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４０２６５およびＮＣＩＭＢ４０２６６を有する。前記プロモーターの有用部分は、前記プラスミドをＨａｅＩＩＩで切断して１．０ｋｂフラグメントとして得ることができる。
【０１１７】
好ましい根強化プロモーターは、DiRitaおよびGelvin（Mol. Gen.Genet., 207:233-241(1987)）が記載したプラスミドｐＫａｎ２に存在するマンノピンシンターゼ（ｍａｓ）プロモーターである。このプロモーターは、ＸｂａＩ−ＸｂａＩＩフラグメントとして前記プラスミドｐＫａｎ２から取り出される。
好ましいマンノピンシンターゼ根強化プロモーターは、−１３８位までのコアマンノピンシンターゼ（ｍａｓ）プロモーター領域および−１３８から−２１３のマンノピンシンターゼアクチベーターで構成され、まとめてＡｍａｓＰｍａｓと呼ばれる。前記プロモーターは、タバコの葉での発現レベルと比較して根で約１０から約１００倍の産生増加をもたらすことが見出された。
【０１１８】
別の根特異的プロモーターは、側根開始時に発現されるヒドロキシプロリン富裕糖タンパク質遺伝子、ＨＲＧＰｎｔ３に付随する約５００ｂｐの５´フランキング配列で、Kellerら（Genes Dev., 3:1639-1646）が報告した。別の好ましい根特異的プロモーターは、タバコの根特異的遺伝子ＴｏＲＢＦの約−６３６から−１の５´フランキング領域に存在し、Yamamotoら（Plant Cell 3:371-381(1991)）が報告した。発現を調節するシス作動性エレメントは前記著者らによってさらに具体的に位置が決定され、転写開始部位から５´側約−６３６から約−２９９の領域に位置する。Yamamotoらは、根ではＴｏＲＢＦ遺伝子から定常的にｍＲＮＡが産生されるが、葉、シュートの分裂組織または茎ではそうでないことを報告した。
【０１１９】
さらに別の有用な貯蔵器官特異的プロモーターは、トマト（Lycopersicon esculentum）の果実成熟遺伝子Ｅ８の５´および３´フランキング領域である。前記領域およびそれらのｃＤＮＡ配列は、Deikmanら（EMBO J. 7(11):3315-3320(1988)）が例示し論じている。
３つの領域が前記遺伝子の５´フランキング配列から２１８１ｂｐに存在し、ポリ（Ａ）付加部位に対して３´側の５２２ｂｐ配列はＥ８遺伝子の発現を制御するように思われる。−２１８１から−１０８８の１つの両域は未熟な果実におけるエチレンによるＥ８遺伝子転写の活性化に要求され、さらにまた成熟時の転写にも寄与する。さらに別の２つの領域（−１０８８から−８６３および−４０９から−２６３）はエチレン反応性を未熟な果実に付与することはできないが、成熟時のＥ８遺伝子発現のためには十分である。
【０１２０】
トウモロコシの内乳では高レベルで、根でははるかに低レベルでさらに緑色組織または花粉では発現されない制御された態様で発現されるトウモロコシのシュクロースシンターゼ−１（Ｓｈ）プロモーターは、キメラレポーター遺伝子β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を特にタバコの篩部細胞（茎および根に豊富である）で発現させることが報告された（Yang et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4144-4148）。前記プロモーターは、したがって植物器官、例えば多肉質果実（例えばメロン（例えばマスクメロン））、または内乳を含む種子、および高レベルの篩部細胞を含む根で有用である。
【０１２１】
別の典型的な組織特異的プロモーターはレクチンプロモーターで、前記は種子組織に特異的である。ダイズ種子のレクチンタンパク質はただ１つの遺伝子（Ｌｅ１）によってコードされ、前記は種子の成熟時にのみ発現され、全種子ｍＲＮＡの約２から約５％になる。レクチン遺伝子および種子特異的プロモーターは完全に性状が決定され、遺伝子導入タバコ植物における種子特異的発現の誘導に用いられた。例えば以下の文献を参照されたい：Vodkin et al. (1983) Cell, 34:1023; Lindstrom et al. (1990) Developmental Genetics, 11:160。
【０１２２】
特に好ましい塊茎特異的発現プロモーターはジャガイモパタチン遺伝子の５´フランキング領域である。前記プロモーターの使用はTwellら（Plant Mol. Biol., 9:365-375(1987)）が報告している。前記プロモーターはバクテリオファージＬＯＰＴＩの約４０６ｂｐフラグメントに存在する。ＬＰＯＴＩプロモーターは、他の４つのパタチンプロモーターと９０％を越える相同性、およびパタチンプロモーターＰＧＴ５と全４００塩基にわたって９５％の相同性を有する領域を有する。これらのプロモーターの各々が本発明で有用である。例えばまた以下の文献を参照されたい：Wenzler et al. (1989) Plant Mol. Biol., 12:41-50。
【０１２３】
さらに別の器官強化および器官特異的プロモーターはBenfeyら（Science, 244:174-181(1988)）が記載している。
利用される前記プロモーター配列の各々は、細胞内のキメラ分子または粒子の量によって実質的に影響されない。本明細書で用いられるように、「実質的に影響されない」という用語は、前記プロモーターが、形質転換細胞または遺伝子導入植物内に蓄積されたキメラ分子または粒子によって反応してフィードバック制御（抑制）を指令することはないことを意味する。
【０１２４】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いる植物細胞のトランスフェクションは、典型的には双子葉植物でもっとも良好に達成される。単子葉植物は、通常はいわゆるプロトプラストの直接遺伝子導入によってもっとも容易に形質転換される。直接遺伝子導入は、通常は電気穿孔によって、ポチエチレングリコール媒介導入または必要なＤＮＡを含むミクロ発射体による細胞爆撃によって実施される。前記のトランスフェクションの方法は当分野で周知であり、本明細書で詳述する必要はない。トランスフェクトした細胞およびプロトプラストから完全な植物を再生させる方法もまた、植物組織から所望のタンパク質を得る技術と同様に周知である。例えば、米国特許第5,618,988号および第5,679,880号並びにそれらの中に引用された文献を参照されたい。
【０１２５】
アグロバクテリウムトランスフェクション、電気穿孔または他の方法を用いて作製された遺伝子導入植物は、典型的にはただ１つの遺伝子を１つの染色体上に含んでいる。前記のような遺伝子導入植物は前記付加遺伝子に対してヘテロ接合体であるということができる。しかしながら、「ヘテロ接合体」という用語を使用する場合は、通常１対の染色体の第二の染色体の同じ遺伝子座に相補的遺伝子が存在することを示唆し、本明細書の場合のように１つの付加遺伝子を含む植物内では前記のような遺伝子は存在しないので、前記のような植物のためのより正確な名称は、前記付加された外因性キメラ分子コード遺伝子が、有糸分裂および減数分裂時に別個に分離されるので独立セグリガントであると考える。目的のＨＢｃキメラ分子をコードするただ１つの構造遺伝子を駆動する器官強化プロモーターを含む遺伝子導入植物（すなわち独立セグリガント）は、好ましい遺伝子導入植物である。
【０１２６】
より好ましいものは、付加構造遺伝子についてのホモ接合体、すなわち２つの遺伝子（染色体対の各染色体上の同じ遺伝子座に１つの遺伝子）を含む遺伝子導入植物である。ホモ接合体遺伝子導入植物は、ただ１つの付加遺伝子を含む独立セグリガントの遺伝子導入植物を有性交配（自殖）し、生産された種子のいくつかを発芽させ、得られた植物をコントロール（天然の植物または遺伝子非導入植物）または独立セグリガント遺伝子導入植物に対してキメラ粒子蓄積強化について分析することによって得ることができる。ホモ接合体遺伝子導入植物は、天然の植物、遺伝子非導入植物および独立セグリガント遺伝子導入植物と比較してキメラ粒子蓄積強化を示す。
【０１２７】
２つの異なる遺伝子導入植物もまた交配させて、２つの別個に分離させた外因性（異種）付加遺伝子を含む子孫を生産できることは理解されよう。適切な子孫の自殖によってキメラＨＢｃ分子をコードする両方の外因性付加遺伝子についてホモ接合体である植物を生産できる。親植物への戻し交配および遺伝子非導入植物との他家交配（out-crossing）もまた包含される。
したがって、本発明の遺伝子導入植物は、目的のキメラＨＢｃ分子をコードする異種構造遺伝子を有する。好ましい遺伝子導入植物は、付加された異種キメラＨＢｃ構造遺伝子についての独立セグリガントであり、前記遺伝子をその子孫に伝達することができる。より好ましい遺伝子導入植物は前記異種遺伝子についてのホモ接合体で、有性交配で前記遺伝子をその子孫の全てに伝達することができる。
【０１２８】
キメラＨＢｃ分子をコードする遺伝子は天然には植物内に存在しないので、本発明の遺伝子導入植物は、同じタイプまたは株の非形質導入植物よりも、両者を同じ条件下で成育させたときはるかに大量にキメラＨＢｃ分子粒子を蓄積させる。
「同じタイプ」または「同じ株」という語句は、非形質転換植物と同じ雑種の植物または非形質転換植物のクローンを意味するために本明細書では用いられる。雑種の兄弟間の対立遺伝子座の変動が小さい場合（十分に近親交配された植物のように）、兄弟間の比較またはいくつかの兄弟を用いて得られた平均を使用することができる。そうでなければクローンが比較には好ましい。
【０１２９】
遺伝子導入植物から得られた種子を野外の温室、または風防場などで生育させ、得られた性成熟遺伝子導入植物を自家受粉させて標準交配植物を作製する。これらの植物から得られる子孫は、一定範囲の環境条件下で、好ましくは野外でキメラＨＢｃ分子粒子蓄積について評価される標準交配系となる。
キメラＨＢｃ分子粒子の蓄積についてホモ接合体の遺伝子導入植物を他の所望の特色を有する親植物と交配する。前記の子孫（キメラＨＢｃ分子粒子蓄積についてヘテロ接合体であるかまたは独立セグリガントに分離することができる）は、一方または他方の親と戻し交配して、キメラＨＢｃ分子粒子蓄積および前記他の所望の特色を示す遺伝子導入植物が得られる。子孫と親との戻し交配は、２回以上繰り返し、多数の所望の特色をもつ遺伝子導入植物を得る必要があるかもしれない。
【０１３０】
昆虫細胞株もまたＨＢｃキメラ発現に用いることができる。例えば、そのような系の１つでは、オートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）またはバキュロウイルスをベクターとして用いて、スポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperuda）細胞またはトリコプルシア（Trichoplusia）の幼虫で外来遺伝子を発現させる。
キメラをコードする配列は、前記ウイルスの非必須領域、例えばポリヘドリン遺伝子でクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。キメラ配列の挿入の成功によってポリヘドリン遺伝子が不活化され、コートタンパク質を欠くリコンビナントウイルスが産生される。続いて前記リコンビナントウイルスを、例えばＳ．フルジペルダ（Spodoptera frugiperuda）細胞またはトリコプルシア（Trichoplusia）の幼虫の感染に用い、その中でＨＢｃキメラを発現させることができる（E. Engelhard et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3224-3227; V. Luckow, Insect Cell Expression Technology, pp. 183-218, " Protein Engineering: Principles and Practice, J.L. Cleland et al. eds., Wiley-Liss, Inc, 1996）。オートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれた異種遺伝子は、しばしば感染後期に高レベルで発現される。
【０１３１】
キメラ遺伝子を含むリコンビナントバキュロウイルスは、バキュロウイルスシャトルベクター系（Luckow et al. (1993) J. Virol., 67:4566-4579）を用いて構築される。前記ベクター系はＢａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）（Life Technologies）として市販されている。リコンビナントウイルスのストックの調製およびリコンビナントタンパク質の発現は標準的プロトコルによって調製およびモニターされる（O' Reilly et al. "Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual", W.H. Freeman and Company, New York, 1992; King et al. "The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide", Chapman & Hall, London, 1992）。
【０１３２】
相補的な粘着末端または平滑端を介してベクターにＤＮＡを機能的に連結させる種々の方法が開発された。例えば、ベクターＤＮＡに挿入されるべきＤＮＡセグメントに相補的なホモポリマー鎖を付加することができる。続いてベクターおよびＤＮＡセグメントを相補的なホモポリマー尾部間の水素結合によって結合させリコンビナントＤＮＡ分子を作製する。
また別には、１つまたは２つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーを用いて、上記のようにＤＮＡセグメントを発現ベクターと結合させることができる。前記合成リンカーは、平滑端ＤＮＡ分子の連結を触媒することができる酵素（例えばバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ）の存在下で大過剰の合成リンカー分子とともに前記平滑端ＤＮＡセグメントをインキュベートすることによって平滑端ＤＮＡセグメントと結合させることができる。
【０１３３】
したがって、反応生成物は、それらの末端に合成ＤＮＡリンカー配列を含むＤＮＡセグメントである。続いて前記ＤＮＡセグメントを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断し、合成リンカーの末端と適合する末端を生成する酵素で切断した発現ベクターと連結する。種々の制限部位を含む合成リンカーは、多数の供給元（New England BioLabs(Beverley, MA)を含む）から市場で入手できる。所望のＤＮＡセグメントはまたＰＣＲ技術を用いて得ることができる。前記技術では、前進および逆方向プライマーは、ベクターに遺伝子を挿入することができるように、増幅後に切断することができる所望の制限部位を含む。また別には、ＰＣＲ生成物は、当分野で周知のようにＴ−張出しを含むベクター（Promega Corp., A3600, Madison,WI）で直接クローニングしてもよい。
【０１３４】
発現したキメラタンパク質は、単一細胞内であるか、多細胞ホストの細胞内であるかにかかわらずホスト細胞内で自己会合する。標準的な方法を用いて粒子を含む細胞を採集し、フレンチ加圧セル、リゾチーム、超音波破壊装置、ビーズビーターまたはミクロ流動化装置（Microfluidics International Corp., Newton MA）を用いて細胞を溶解させる。溶解物を清澄にした後、４５％硫安で粒子を沈澱させ、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）に再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析する。前記透析済み材料を簡単な遠心沈澱によって清澄にし、セファロースＣＬ−４Ｂを用いて上清をゲルろ過クロマトグラフィーに付す。粒子を含む分画を特定し、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに付し、さらに硫安で再沈澱させ、再懸濁、透析およびろ過滅菌して−７０℃で保存する。
【０１３５】
ＨＢｃキメラ共役物
Ｂ細胞またはＴ細胞反応を所望する任意のハプテンを、目的のＨＢｃキメラまたはキメラ粒子（例えばドメインＩＩのループ領域内に異種リンカー残基（例えばリジン、グルタミンもしくはアスパラギン酸、システインまたはチロシン）およびドメインＩＶに付加システイン残基を含むキメラ粒子）に連結してＨＢｃキメラ共役物を生成することができる。問題のハプテンは典型的にはＢ細胞免疫原である。ハプテンはポリペプチドでも炭水化物（糖類、すなわちオリゴ糖または多糖類）でも、または非ポリペプチド、非炭水化物性化学物質（例えば２，４−ジニトロベンゼン）でも、または医薬（例えばコカインまたはニコチン）でもよい。前記のように生成されたＨＢｃキメラ粒子共役物は、下記で述べるように接種物またはワクチンとして有用である。キメラタンパク質自体は発現によって会合し、共役物は発現後に形成されるので、共役物の形成は典型的には、遊離タンパク質になぞらえて会合粒子を用いて実施される。
【０１３６】
個々のハプテンをタンパク質またはポリペプチドとそれらのアミノ酸残基の側鎖を介して機能的に連結し、懸垂連結（pendently-linked）免疫原性共役物（例えば分枝ポリペプチドポリマー）を作製する方法は当分野では周知である。前記の方法は、種々の側鎖上の１つまたは２つ以上のタイプの官能基を介して連結することを含み、前記ハプテンと懸垂連結（共役）（共有結合）されてあるが少なくとも１つの側鎖によって分離されている粒子内に担体タンパク質ポリペプチド骨格を生じる。
上記の官能基の各々を用いて担体タンパク質をハプテンに連結する方法は以下の文献に記載されている：Erlanger, (1980) Method of Enzymology, 70:85; Aurameas et al. (1978) Scand. J. Immunol., 8(Suppl.7):7-23；米国特許第 4,493,795号（Nestor et al.）。さらに、位置特異的共役反応（Rodwell et al. (1985) Biotech., 3:889-894）を実施して、ポリペプチドの生物学的活性を実質的に減少させないようにすることができる。
【０１３７】
さらにまた、当分野で周知のように、ＨＢｃタンパク質およびポリペプチドハプテンの両方をそれらの天然形で用いてもよく、またそれらの官能基含有量をリジン残基のスクシニル化またはシステイン−チオラクトンとの反応によって改変してもよい。担体タンパク質または共役物のどちらかに、アミノ官能基と２−イミノチオラン、３−（３−ジチオピリジル）−プロピオネートのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、または当分野で公知の他の試薬との反応によってスルフヒドリル基を取り込んでもよい。
【０１３８】
ＨＢｃキメラまたはハプテンはまた、スペーサーアーム（例えばヘキサメチレンジアミン）または別の二官能基分子を取り込ませて改変し、懸垂連結を容易にしてもよい。前記のような方法は下記で考察する。
ポリペプチドハプテンを共有結合させる方法は極めて多様で、免疫学分野の当業者にはよく知られている。例えば、米国特許第4,818,527号に従えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA）またはスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（SMCC, Pierce Chemical Co., Rockford, IL）を適切なＨＢｃキメラと反応させて、活性化担体を生成する。
【０１３９】
続いて、前記活性化担体をハプテン（例えばスルフヒドリルを末端にもつハプテン）またはポリペプチド（前記は末端システインを有するか、またはさらに別のアミノ−もしくはカルボキシ−末端システイン残基が付加されてある）と反応させて、共有結合ＨＢｃキメラ共役物を生成する。また別の例として、ポリペプチドハプテンのアミノ基を先ずＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（SPDP, Pharmacia, Piscataway, NJ）と反応させ、さらに前記チオール含有ポリペプチドを還元後の活性化担体と反応させることができる。もちろん、硫黄含有部分および二重結合含有ミカエルアクセプターを入れ替えてもよい。前記の反応は供給元の文献およびKitagawaら（J. Biochem., 79:233(1976)）およびLachmannら（"1986 Synthetic Peptides as Antigens",(Ciba Foundation Symposium 119), pp.25-40(Wiley, Chichester:1986)）の文献に記載されている。
【０１４０】
米国特許第4,767,842号は、本発明で有用な担体とポリペプチド間の共有結合のいくつかの態様を開示している。ある方法では、トリレンジイソシアネートをジオキサン緩衝液溶媒中で０℃で担体と反応させて活性化担体が生成される。ポリペプチドハプテンをその後で活性化担体と混合し反応させて、共有結合したＨＢｃキメラ共役物を生成する。
１つの官能基末端にジスルフィド結合を生成し、他方にアミド結合を生成する多数のヘテロ二官能基薬剤が特に有用である。前記には、以前に考察したＮ−スクシジミジル−３−（２−ピリジルチオ）−プロピオネート（SPDP）が含まれ、これは、それ自体とＨＢｃキメラまたはハプテンのどちらかのチオールとの間にジスルフィド結合を創出する。模範的な試薬は、ポリペプチドハプテン内にシステイン残基および共役パートナー上にアミン（例えばリジンのε−アミン）または担体タンパク質に他の遊離アミノ基を含む。前記のような種々のジスルフィド／アミド形成薬剤が知られている。例えば以下の文献を参照されたい：Immun. Rev. (1982) 62:185。
【０１４１】
他の二官能基共役試薬は、ジスルフィド結合ではなくチオエーテルを生成する。前記のチオエーテル生成薬剤の多くは市販されており、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸などの反応性エステルが含まれる。カルボキシル基はそれらをスクシンイミドまたは１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸、ナトリウム塩と結合させることによって活性化できる。本発明の方法のために特に好ましい共役剤は、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（SMCC）でピアースケミカル社（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）から入手できる。前述のリストは網羅することを意図していない。名を挙げた化合物の改変物も明らかに使用することができる。図６は、ＳＭＣＣを用いたＨＢｃ活性化担体の生成（Ｉ）および前記活性化担体とスルフヒドリル末端をもつハプテンとのその後の反応（ＩＩ）を示す模式図（模式図１）を提供する。
【０１４２】
ポリペプチドハプテンは当分野で周知の多数の方法で得ることができる。通常のペプチド合成技術を容易に利用することができる。例えば、より長いペプチドを生成するために遺伝子組換え技術およびＰＣＲ系技術は有用である。所望の配列は通常比較的短いので、固相化学合成が有用である。
典型的なポリペプチドハプテンは上記の表Ａおよび表Ｂに示されている。それらポリペプチドの各々はそのＮ−末端アミノ基を介して利用されるか、またはさらに別の表には示されていないＮ−末端システインの使用によっても利用できる。
関連する化学反応を用いて、「化学物質」と呼ぶことができるものを担体タンパク質に共役させる。典型的には、化学物質中に共役に適した官能基をデザインする。誘発された抗体が肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）を防御する模範的なハプテンは６−Ｏ−ホスホコリンヒドロキシヘキサノエートである（Fischer et al. (1995) J. Immunol., 154:3373-3382）。下記の表はさらに別の典型的な化学物質ハプテンを提供する。
【０１４３】
化学物質ハプテン
Figure 2005517380
【０１４４】
担体タンパク質に多糖類を共役させる多くの方法が当分野で知られている。アルデヒド基は、オリゴ糖または比較的小さい多糖類の還元端（Anderson (1983) Infect. Immun., 39:233-238; Poren et al. (1985) Mol. Immunol., 22:907-919）または末端部（Anderson et al. (1986) J. Immunol., 137:1181-1186; Beuvery et al. (1986) Dev. Bio. Scand., 65:197-204）に調製することができる。前記アルデヒド基を還元的アミノ化により担体タンパク質に結合させることができる。
【０１４５】
大きな多糖類は、末端活性化（Anderson et al. (1986) J. Immunol., 137:1181-1186）または多糖類鎖上のいくつかの官能基のランダム活性化（Chu et al. (1983) Infect. Immun., 40:245-256; Gordon (1986) 米国特許第4,619,828号; Marburg (1989) 米国特許第4,882,317号） によって共役させることができる。多糖類鎖上のいくつかの官能基のランダム活性化は、多糖類鎖上のランダム結合により高度に架橋された共役物をもたらすことができる。多糖類対担体タンパク質の最適比は個々の多糖類、担体および用いられる共役に左右される。
糖類と担体タンパク質との共役方法に関する詳細な概論は以下で見出すことができる：Dick et al. "Contributions to Microbiology and Immunolgy, Vol.10, Cruse et al. eds., (S. Karger: 1989), pp.48-114; Jennings et al., "Neoglycoconjugates: Preparation and Applications, Lee et al. eds., (Academic Press: 1994), pp.325-371; Aplin et al. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 10:259-306; Stowell et al. (1980) Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 37:225-281）。
【０１４６】
炭水化物自体は、当分野で公知の方法によって、例えばWitteら（J. Am. Chem. Soc., 119:2114-2118(1997)）の記載した酵素的糖タンパク質合成によって合成することができる。
本発明のＨＢｃ共役物の製造に使用される目的のハプテンであるオリゴ糖の例として、いくつかのオリゴ糖（合成物、半合成物および天然物）を下記の節で論じる。
ｂ型インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）（Ｈｉｂ）の治療用ワクチンを製造するために適したオリゴ糖ハプテンは、Ｄ−リボース−Ｄ−リビトール−ホスフェート（Ｉ、下記）、Ｄ−リビトール−ホスフェート−Ｄ−リボース（ＩＩ、下記）またはホスフェート−Ｄ−リボース−Ｄ−リビトール（ＩＩＩ、下記）の２から２０回繰り返しで製造される（Eduard C. Beuvery et al. EP-0,276,516-B1）。
【０１４７】
【化１】
Figure 2005517380
【０１４８】
米国特許第4,220,717号はまた、ｂ型インフルエンザ菌のためのポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ）を開示している。
Petersonら（Infect. Immun., 66(8):3848-3855(1998)）は、クラミジア・ニュモニエ（Chlamydia pneumoniae）に対する防御を提供する三糖類ハプテン、αＫｄｏ（２ ８）αＫｄｏ（２ ４）αＫｄｏを開示している。クラミジア・ニューモニエは、咽頭炎から致死的肺炎に及ぶヒトの呼吸器感染症の原因である。Ｋｄｏは３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクタ−２−ウロソン酸（3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid）である。
Andersonら（EP-0,126,043-A1）は、肺炎連鎖球菌によってひき起こされる細菌感染症の治療、予防または診断で使用できる糖類を開示している。有用な糖類の１つの種類は、二糖類GlcNAcβ1 3Galに由来する。Andersonらはまた、ネオラクトテトラオシルセラミドが有用であることを報告した。前記はGalβ1 4GlcNAcβ1 3Galβ1 4Glc-Cerである。
【０１４９】
McKenneyら（Science, 284:1523-1527(1999)）は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対する防御を提供する多糖類、ポリ−Ｎ−スクシニルβ1 ６ＧｌｃＮ（ＰＮＳＧ）を開示している。黄色ブドウ球菌は、心内膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎、肺炎および膿瘍を含む集団感染症の一般的原因である。
欧州特許第0,157,899-B1号（この文献は参照により本明細書に含まれる）は、本発明で有用な肺炎球菌の多糖類の分離を開示している。以下の表は、本発明のハプテンとして有用な莢膜多糖類を産生する肺炎球菌標準培養を示す。
【０１５０】
多糖類ハプテン供給源
Figure 2005517380
【０１５１】
モラクセラ（Moraxella）（ブランハメラ（Branhamella））・カタラーリス（catarrhalis）は、小児の中耳炎および静脈洞炎並びに成人の下気道感染症の原因であると報告されている。前記細菌のリポオリゴ糖表面抗原（ＬＯＳ）のリピドＡ部分は３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソン酸−グルコサミン結合で切断される。前記切断生成物を中等度のアルカリで処理してエステル結合脂肪酸を除去し、一方、アミド結合脂肪酸は温存してＭ．カタラーリスから無毒化リポ多糖類（ｄＬＯＳ）を生成する。ｄＬＯＳは、タンパク質担体に結合させないかぎり免疫原性を示さない（Xin-Xing Gu et al. (1998) Infect. Immun., 66(5):1891-1897）。
【０１５２】
Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）は、ヒトの敗血症、髄膜炎、および関連する神経学的疾患の原因である。莢膜多糖類特異的抗体は、幼児を感染から防御することが判明している（米国特許第5,795,580号）。ＧＢＳ莢膜多糖類ＩＩ型の反復単位は以下のとおりである：４）−β−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−（１ ３）−［β−Ｄ−Ｇａｌｐ（１ ６）］−β−Ｄ−Ｇａｌｐ（１ ４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１ ３）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１ ２）−［α−Ｄ−ＮｅｕｐＮＡｃ（２ ３）］−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１、ここで括弧内の部分は、直ぐ後に続く括弧をもたないサブユニットに連結された分枝である。ＧＢＳ莢膜多糖類Ｖ型の反復ユニットは以下のとおりである：４）−［α−Ｄ−ＮｅｕｐＮＡｃ−（２ ３）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１ ４）−β−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−（１ ６）］−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１ ４）−［β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１ ３）］−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１ ４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１。
【０１５３】
欧州特許出願EU-0,641,568-A1（Brade）は、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）、Ｃ．ニューモニエおよびＣ．シッタシ（psittaci）由来のはしご様バンドパターン抗原を得る方法を開示している。
Slovinら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(10):5710-5715(1999)）は、前立腺癌に対して用いられるワクチンの調製で担体としてＫＬＨに結合させた合成オリゴ糖、グロボＨの使用を報告している。同様に、Hellingら（Cancer Res., 55:2783-2788(July 1995)）は、メラノーマの患者の治療のためのワクチンでＫＬＨ結合ＧM2の使用を報告している。後者のワクチンは、ＧM2のセラミド二重結合のオゾン切断、アルデヒド基の導入およびＫＬＨでの還元的アルキル化によって製造された。同様な方法を本発明のキメラ粒子に用いることができる。
【０１５４】
スフィンゴリピドのオリゴ糖部分、例えばグロボシドおよびガングリオシド（これらは、正常細胞と同様に他の腫瘍細胞、例えばメラノーマ、神経芽細胞腫および健常脳細胞の表面に存在する）は、本発明でハプテンとして同様に用いることができる。グロボシド、グロボＨのオリゴ糖部分は、Ｆｕｃα−（１ ２）−Ｇａｌβ（１ ３）−ＧａｌＮＡｃβ−（１ ３）−Ｇａｌα−（１ ４）−Ｇａｌβ−（１ ４）Ｇｌｃの構造を有し、一方ガングリオシド、ＧM2、ＧM1およびＧD1aの糖部分はそれぞれ以下の構造を有する：ＧａｌＮＡｃβ−（１ ４）−［ＮｅｕＡｃα−（２ ３）］−Ｇａｌβ−（１ ４）−Ｇｌｃ；Ｇａｌβ−（１ ３）−ＧａｌＮＡｃβ−（１ ４）−［ＮｅｕＡｃα−（２ ３）］−Ｇａｌβ−（１ ４）−Ｇｌｃ；およびＮｅｕＡｃ−（２ ３）−Ｇａｌβ−（１ ３）−ＧａｌＮＡｃβ−（１ ４）−［ＮｅｕＡｃα−（２ ３）］−Ｇａｌβ−（１ ４）−Ｇｌｃ。
【０１５５】
米国特許第4,356,170号は、以下のようにして得られる有用な多糖類の製造を開示している：還元し続いて酸化して末端アルデヒド基を有する化合物を生成し、前記を顕著な架橋とともにまたは架橋せずに担体タンパク質（例えば破傷風類毒素およびジフテリア類毒素）の遊離アミノ基上で還元によりアミノ化することができる。模範的な有用な細菌多糖類はβ型溶血連鎖球菌、インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）、髄膜炎菌（meningococci）、肺炎球菌（pneumococci）および大腸菌を含む。還元により粒子をアミノ化するよりも、リンカーアーム（例えばε−アミノＣ2−Ｃ8アルキルカルボン酸によって提供されるもの）を多糖類上で還元によりアミノ化し、続いて水溶性カルボジイミドを用い粒子に結合させることができる。
【０１５６】
接種物およびワクチン
本発明のさらに別の実施態様では、ＨＢｃキメラ粒子またはハプテンとＨＢｃキメラ粒子との共役物は、接種物の免疫原として（前記免疫原は、接種されたホスト動物でＢ細胞またはＴ細胞反応（刺激）（例えば前記異種エピトープもしくはハプテンと免疫反応する抗体の産生またはＴ細胞活性化）を誘発する）用いるか、またはワクチンとして用いて前記異種エピトープまたはハプテンが由来する病原体に対して防御を提供する。
【０１５７】
Ｔ細胞活性化は種々の技術によって測定することができる。通常の使用では、ホスト動物に目的のＨＢｃキメラ粒子ワクチンまたは接種物を接種し、その後、末梢単核血球細胞（ＰＭＢＣ）を採集する。続いて前記ＰＭＢＣをin vitroでＴ細胞免疫原の存在下で約３から５日間培養する。続いて前記培養ＰＭＢＣを、増殖またはサイトカイン（例えばＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＦＮ−γ）の分泌についてアッセイする。Ｔ細胞活性化のアッセイは当分野で周知である。例えば、米国特許第5,478,726号およびその中に引用されている文献を参照されたい。
【０１５８】
例えば抗体生成を用いる場合、目的の接種物またはワクチンは、免疫誘発有効量のＨＢｃキメラ粒子またはＨＢｃキメラ粒子共役物（前記は、典型的にはまた水を含む医薬的に許容できる希釈組成物に溶解または分散される）を含む。免疫を必要とするか、または抗体の誘発を所望されるホスト動物、例えば哺乳類（例えばマウス、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、サル、類人猿またはヒト）または鳥類（例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒルまたはカモ）に投与したとき、接種物は、共役させた（懸垂結合させた）ハプテンと免疫反応する抗体を誘発する。前記抗体はまた好ましくはＢ細胞免疫原のタンパク質または糖類と結合する。
【０１５９】
ワクチンは、マラリア病原体と関連する典型的なマラリアＢ細胞配列のように、異種Ｂ細胞エピトープまたは共役ハプテンが、病的状態と関係を有するタンパク質または糖類構造物の一部と一致する接種物の１タイプである。ワクチン誘発抗体はエピトープもしくはハプテンと免疫反応し、また活性化Ｔ細胞は前記異種エピトープもしくはハプテンと反応するだけでなく、前記病原体または病的細胞とin vivoで免疫反応し、前記病的状態に対して防御を提供する。
各々の免疫で用いられるリコンビナントキメラ免疫原の量は免疫誘発有効量と称され、下記で論じるように、とりわけリコンビナントＨＢｃキメラ免疫原、免疫される哺乳類およびワクチン内にアジュバントが存在するか否かによって幅広く変動する。ワクチンおよび接種物の免疫誘発有効量によって、上記で論じたようにそれぞれ防御または抗体活性が提供される。
【０１６０】
ワクチンまたは接種物は、典型的には接種物当たり（単位投与量当たり）約１マイクログラムから約１ミリグラム、好ましくは約１０μグラムから約５０マイクログラムの濃度のリコンビナントＨＢｃキメラ免疫原を含む。本発明のワクチンまたは接種物に関するかぎり、「単位投与量」という用語は、動物に対して分割できない単位投与量として適切な物理的に範囲が定められた一定量を指し、各一定量は、個体としてまたは集団として所望の免疫誘発効果を生じるように計算された予め決定された活性物質量を必要な希釈剤（すなわち担体または賦形剤）とともに含む。
【０１６１】
ワクチンまたは接種物は、典型的には回収されたリコンビナントＨＢｃキメラ免疫原から、前記免疫原（好ましくは粒子形状の）を生理学的に容認できる（許容できる）希釈賦形剤、例えば水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、酢酸緩衝食塩水（ＡＢＳ）、リンゲル氏液などに分散させて水性組成物を作製することによって調製される。希釈賦形剤はまた、油性物質、例えばスクァランまたはスクァレンを下記で考察するように含むことができる。
活性成分としてタンパク質性物質を含む接種物およびワクチンの調製もまた当分野では周知である。典型的には、前記のような接種物またはワクチンは、非経口投与物として（溶液または懸濁液として）調製されるが、溶液用もしくは懸濁液用に適した固形物、注射前の液体もまた調製できる。調製物はまた乳化することができ、前記が特に好ましい。
【０１６２】
免疫誘発（免疫原性）活性を有する成分はしばしば、医薬的に許容され前記活性成分と適合する賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの混合物である。さらに、所望する場合には、接種物またはワクチンは、組成物の免疫誘発性能を強化する微量の補助物質、例えば湿潤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤を含むことができる。
目的のワクチンまたは接種物はまた有利な場合にはアジュバントを含む。本発明のワクチンおよび接種物に適したアジュバントは、キメラのＢ細胞エピトープに対する抗体反応を強化することができるアジュバントの他に、キメラに含まれるＴ細胞エピトープに対する細胞性反応を強化することができるアジュバントを含む。アジュバントは当分野では周知である。例えば以下の文献を参照されたい："Vaccine Design-The Subunit and Adjubant Approach", 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Vol.6, Eds. M.F. Powell & M.J. Newman, Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X。
【０１６３】
典型的なアジュバントには、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）（前記はヒトでは用いられない）、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）、スクァレン、スクァランおよびミョウバン（例えばアルヒドロゲル（Alhydrogel）（登録商標）（Superfos, Denmark））が含まれ、前記は当分野で周知の物質で、いくつかの供給元から市販されている。
本発明の免疫原とともに使用する場合に好ましいアジュバントには、アルミニウムまたはカルシウム塩（例えば水酸化物またはリン酸塩）が含まれる。本発明で使用される特に好ましいアジュバントは水酸化アルミニウムゲル、例えばアルヒドロゲル（登録商標）である。水酸化アルミニウムゲルの場合、本発明のキメラタンパク質は、各投与量につき５０から８００マイクログラム、好ましくは４００から６００マイクログラムのアルミニウムが存在するように前記アジュバントと混合される。
【０１６４】
本発明の免疫原とともに使用されるまた別の好ましいアジュバントは乳液である。目的の乳液は水中油乳液でも油中水乳液でもよい。免疫原キメラタンパク質の他に、前記のような乳液は、周知のようにスクァレン、スクァラン、ピーナッツ油などの油相を含み、さらに分散剤を含む。非イオン性分散剤が好ましく、前記のような物質にはソルビタン並びにマンニドのモノおよびジ−Ｃ12−Ｃ24−脂肪酸エステル（例えばソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエートおよびマンニドモノオレエート）が含まれる。免疫原を含む乳液は乳液として投与される。
【０１６５】
好ましくは、前記のような乳液は油中水乳液であり、水相中のキメラタンパク質とともに乳化されてある、スクァレンおよびマンニドモノオレエート（アーラセル（Arlacel）Ａ（登録商標））を場合によってスクァランとともに含有する。前記のような乳液の周知の例には、モンタニド（Montanide）（登録商標）ＩＳＡ−７２０およびモンタニド（登録商標）ＩＳＡ７０３（Seppic, Castres, France）が含まれ、前記の各々はスクァレンおよびスクァランの両方を含むと考えられている（各々においてスクァレンが圧倒的に多く、モンタニド（登録商標）ＩＳＡ７０３ははるかに少ない）。もっとも好ましくは、モンタニド（Montanide）（登録商標）ＩＳＡ−７２０が用いられ、油対水の比は７：３（ｗ／ｗ）が用いられる。他の好ましい水中油乳液アジュバントには、WO95/17210およびEP0,399,843に開示されたものが含まれる。
【０１６６】
小分子アジュバントの使用もまた本発明に包含される。本発明で有用な小分子アジュバントのタイプの１つは、７−置換−８−オキソ−または８−スルホ−グアノシン誘導体で、米国特許第4,539,205号、同4,643,992号、同5,011,828号、および同5,093,318号に記載されている（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。前記の物質のうちで、７−アリル−８−オキソグアノシン（ロキソリビン）が特に好ましい。前記分子は、抗原（免疫原）特異的反応の誘発に特に有効であることが示された。
さらにまた有用なアジュバントには、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）（corixa Corp.から入手できる（米国特許第4,987,237号を参照されたい））、ＣＰＧ（Coley Pharmaceutical Groupから入手できる）、ＱＳ２１（Aquila Biopharmaceuticals, Inc.から入手できる）、ＳＢＡＳ２（SKBから入手できる）、米国特許第4,767,842号に記載されたいわゆるムラミルジペプチド類似体、およびＭＦ５９（Chiron Corp.から入手できる）（例えば米国特許第5,709,879号および第6,086,901号を参照されたい）が含まれる。
【０１６７】
より具体的には、免疫学的に活性なサポニン分画（例えばクィル（Quil）Ａ（登録商標））もまた有用である。前記分画は、南アメリカの樹木、クィラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の樹皮に由来しアジュバント活性を有する。クィル（登録商標）Ａの誘導体、例えばＱＳ２１（クィル（登録商標）ＡのＨＰＬＣ精製分画誘導体）およびその製造方法は米国特許第5,057,540号に開示されている。ＱＳ２１（ＱＡ２１として知られている）の他に、他の分画（例えばＱＡ１７）もまた開示されている。
【０１６８】
３−デ−Ｏ−アセチル化モノホスホリルリピドＡは、Ribi Immunochem（Hamilton, Montana）によって製造される周知のアジュバントである。前記アジュバントは、細菌から抽出された３つの成分、モノホスホリルリピド（ＭＰＬ）Ａ、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクァレン／トゥイーン（登録商標）８０の乳液中に含んでいる。本アジュバントはGB2122204Bに開示された方法によって調製できる。３−デ−Ｏ−アセチル化モノホスホリルリピドＡの好ましい形態は、直径が０．２μｍ未満の小さな粒子サイズを有する乳液形である（EP0,689,454B1）。
【０１６９】
前記ムラミルジペプチドアジュバントには、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｕｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル−ＭＤＰと称される）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１´−２´−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ）１９８３Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称される）が含まれる。
好ましいアジュバント混合物には、３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１の組合せ（EP0,671,948B1）、３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１を含む水中油乳液（WO95/17210; PCT/EP98/05714）、他の担体とともに製剤化された３Ｄ−ＭＰＬ（EP0,689,454B1）、コレステロール含有リポソームで製剤化されたＱＳ２１（WO96/33739）、または免疫促進性オリゴヌクレオチド（WO96/02555）が含まれる。また別のアジュバントには、WO99/52549に記載されたものおよびポリオキシエチレンエーテルの非粒子状懸濁物（英国特許出願第9807805.8号）が含まれる。
【０１７０】
アジュバントは補助量で用いられ、前記の量はアジュバント、哺乳類およびリコンビナントＨＢｃキメラ免疫原にしたがって変動するであろう。典型的な量は各免疫当たり約１μｇから約１ｍｇで変動するであろう。適切な量および濃度は容易に決定できることは当業者には理解されよう。
接種物およびワクチンは通常は非経口的に、注射によって例えば皮下または筋肉内に投与される。他の投与態様に適したさらに別の製剤には座薬、およびいくつかの事例では経口製剤が含まれる。接種物の経鼻スプレーの使用もまたNeirynckら（Nature Med., 5(10):1157-1163(Oct. 1999)）が論じているように意図される。座薬の場合、伝統的な結合剤および担体には、例えばポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドが含まれる。前記のような座薬は、活性成分を０．５％〜１０％、好ましくは１〜％の範囲で含む混合物から生成することができる。経口製剤は、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤を含む。
【０１７１】
接種物またはワクチン組成物の形態は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤または粉薬であり、活性成分として免疫誘発有効量のＨＢｃキメラまたはＨＢｃキメラ共役物を、好ましくは粒子として含む。典型的な組成物では、好ましいＨＢｃキメラまたはＨＢｃキメラ共役物の免疫誘発量は、先に述べたように単位投与量当たり活性成分が約１μｇから約１ｍｇ、より好ましくは５μｇから約５０μｇである。
ワクチンは典型的には非経口投与用に製剤化される。典型的な免疫は、皮下（ＳＣ）、筋肉内（ＩＭ）、静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）または皮内（ＩＤ）で実施される。
【０１７２】
ＨＢｃキメラ粒子およびＨＢｃキメラ粒子共役物は、中性形または塩の形態としてワクチンに製剤化できる。医薬として許容できる塩には酸付加塩（タンパク質またはハプテンの遊離アミノ基とともに形成される）が含まれ、無機酸（例えば塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）で生成される。遊離カルボキシル基で形成される塩も無機塩基（例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄）および有機塩基（例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロケインなど）から誘導することができる。
【０１７３】
さらに別の実施態様では、目的のＨＢｃキメラをコードする遺伝子が適切に弱毒化させた腸内細菌、例えば腸チフス菌、ネズミチフス菌、ネズミチフス菌−大腸菌ハイブリッドまたは大腸菌にトランスフェクトされてあるワクチンまたは接種物が意図される。典型的な弱毒または無毒な腸チフス菌、ネズミチフス菌およびネズミチフス菌−大腸菌ハイブリッドは、上記に提供した引用文献で考察されている。前記のワクチンおよび接種物は、特に、鼻、腸および生殖管の粘膜に感染またはこれらを介して伝播される疾病（例えばインフルエンザ、酵母菌（例えばアスペルギルス（Aspergillus）およびカンジダ（Candida））、ウイルス（例えばポリオ、口蹄疫、Ａ型肝炎）、および細菌（例えばコレラ、サルモネラ、および大腸菌））に対して、および粘膜のＩｇＡ反応がＩｇＧ全身反応に加えてもしくはＩｇＧ全身反応の代わりに所望される場合に使用されることを意図している。
【０１７４】
前記腸内細菌は凍結乾燥し、医薬的に許容できる乾燥希釈剤と混合し、摂取のために錠剤またはカプセルを製造し、通常の固相医薬のようにホスト動物に投与または摂取させることができる。さらに、前記細菌ワクチンの水性調製物は、経口投与、経鼻投与、直腸投与または膣投与のような粘膜免疫に使用するために適応させることができる。
目的のキメラ分子粒子を含む植物物質を用いる経口免疫は、遺伝子導入植物組織（例えばニンジンのような根、コメまたはトウモロコシのような種子）を単に摂取することによって達成できる。この事例では、口または胃腸管の水は、免疫で使用される通常用いられる水性媒体を提供し、さらに周囲の植物組織は医薬的に許容できる希釈剤を提供する。
【０１７５】
前記接種物またはワクチンは、ユニットドース製剤として適合可能な態様で、さらに治療的に有効であり免疫誘発できる量で投与される。投与されるべき量は、治療される対象者、前記対象者の免疫系の抗体産生能力および所望される防御の程度に左右される。投与に必要とされる正確な活性成分量は、医師の判定にしたがい、さらに各個体に固有である。しかしながら、適切な投与量の幅は、各個体につき活性成分が数十μｇのオーダーである。最初の投与およびブースター接種についての適切な治療スケジュールもまた変動可能であるが、典型的には最初の接種の後で間隔を空けて（数週間または数ヶ月間）注射または他の投与が実施される。
【０１７６】
いったん免疫されると、その哺乳類は、リコンビンナントＨＢｃキメラ免疫原が問題の抗原（例えばマラリアワクチンについてはスポロゾイト）と結合する十分な力価の抗体の産生を誘発することができるように十分な期間維持される。例えば抗スポロゾイト抗体産生のための維持期間は典型的には約３から約１２週間で、さらにブースター（ワクチンの第二回目の免疫投与）を含むことができる。所望の場合は、第三回目の免疫も最初の免疫後２４週から５年に意図される。いったん防御レベルの力価が得られたら、ワクチン接種された哺乳類は好ましくは、約１年から５年の間隔で接種される周期的ブースター免疫によって前記抗体力価でまたは前記力価近くで維持されることが特に意図される。
【０１７７】
抗スポロゾイトまたは他の抗体の産生は、免疫された哺乳類から血漿または血清サンプルを得て、適切な抗原［例えばスポロゾイト周囲イムノドミナント抗原（例えば本明細書で用いられるＰ．ファルシパルム（falciparum）ＣＳタンパク質ペプチド（ＮＡＮＰ）5）］と結合する能力について前記血漿または血清中の抗体を、以下で述べるようにＥＬＩＳＡアッセイで分析するか、または別の当分野で周知のイムノアッセイ（例えばウェスタンブロット）で分析することによって容易に確認される。
【０１７８】
誘発される抗体、例えば抗ＣＳ抗体は、接種されたホスト動物から周知の技術を用いて単離し、続いて受動免疫（これもまたよく知られている）のための第二のワクチンとして再構成することができる。同様な技術がヒトのガンマグロブリン免疫に用いられる。例えば、免疫ホストの１人または多数から得られる抗血清を硫安水溶液（典型的には４０−５０％飽和）で沈澱させ、クロマトグラフィーカラムに固定する抗原として（ＮＡＮＰ）5を用いるアフィニティークロマトグラフィーを利用して、前記沈澱抗体をクロマトグラフィーにより精製することができる。したがって、例えば、１つの接種物をウマまたはヒツジで用い、また別の動物（例えばヒト）での受動免疫で使用するためにマラリアに対する抗体産生を誘発することができる。
【０１７９】
本発明の別の実施態様は、抗体、活性化Ｔ細胞または両者を動物ホストで誘発する方法であり、前記方法は、前記動物ホストに接種物を接種する工程を含む。前記方法で用いられる接種物は、医薬的に許容できる希釈剤に溶解または分散させた、上記で述べた免疫誘発量のＨＢｃキメラ粒子またはＨＢｃキメラ粒子共役物を含む。前記動物ホストは、抗体または活性化Ｔ細胞が誘発されるために十分な期間維持される。前記期間は周知の技術によってアッセイでき、これもまた周知のように典型的には数週から数ヶ月が要求される。前記維持期間の間に前記に述べたような多数の免疫が意図される。
本発明を下記の非制限的実施例によって説明する。
【０１８０】
【実施例】
実施例１：Ｂ細胞エピトープ含有キメラ調製物
Ａ．プラスミドベクターｐＫＫ２２３−３Ｎ、ｐＫＫ２２３−３の改変形の調製
プラスミドベクターｐＫＫ２２３−３（Pharmacia）をただ１つのＮｃｏＩ制限部位を創出して改変し、ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントとしてＨＢｃ遺伝子の挿入およびその後の大腸菌ホスト細胞での発現を可能にした。ｐＫＫ２２３−３プラスミドベクターを改変するために、ＰＣＲプライマーｐＫＫ２２３−３／４３３−４５２−ＦおよびｐＫＫ２２３−ＮｃｏＩ−ｍｏｄ−Ｒ、並びに鋳型としてｐＫＫ２２３−３を用いて新しいＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを調製した。このＰＣＲフラグメントを制限酵素ＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断して４６７ｂｐフラグメントを提供し、これをｐＫＫ２２３−３ベクターの４２０６ｂｐフラグメントに連結し、本来の４８０ｂｐＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと効率的に置き換えた。得られたプラスミド（ｐＫＫ２２３−３Ｎ）はしたがって親のプラスミドよりも１３ｂｐ短く、導入したＮｃｏＩ部位の上流に改変ヌクレオチド配列を含んでいる（図１を参照されたい。図では点線は存在しない塩基を示している）。最終的なプラスミド、ｐＫＫ２２３−３Ｎは４５７３ｂｐのサイズを有する。プラスミドｐＫＫ２２３−３Ｎの制限部位は図１に示されている。さらに、プラスミドｐＫＫ２２３−３Ｎを作製するためにｐＫＫ２２３−３に対して実施したヌクレオチドの変更は、下記に示すように下線によって表示されている。
ｐＫＫ２２３−３／４３３−４５２−Ｆ
GGTGCATGCAAGGAGATG 配列番号：６５
ｐＫＫ２２３−ＮｃｏＩ−ｍｏｄ−Ｒ
GCGAAGCTTCGGATCccatggTTTTTTCCTCCTTATGTGAAATTGTTATCCGCTC 配列番号：６６
【０１８１】
Ｂ．Ｖ１およびＶ２クローニングベクターの調製
改変ＨＢｃ１４９遺伝子（イムノドミナントループ領域に合成ｄｓＤＮＡフラグメントの方向性をもつ挿入を受容することができる）をＰＣＲを用いて構築した。（アミノ酸Ｅ７７およびＤ７８の間に挿入物を受容したプラスミドをＶ１と呼び、Ｄ７８とＰ７９の間に挿入物を受容したプラスミドをＶ２と呼んだ。）ＨＢｃ１４９遺伝子の両半分を増幅させた。２つのＰＣＲプライマー対を用い、そのうちの１つはアミノ末端を増幅し、他方はカルボキシル末端を増幅した。Ｖ１の場合、ＰＣＲ反応の生成物（Ｎ−およびＣ−末端）は両者とも２４６ｂｐフラグメントで、Ｖ２の場合生成物は２４９ｂｐ（Ｎ−末端）および２４３ｂｐフラグメント（Ｃ−末端）である。
【０１８２】
調製したＮ−末端フラグメントをＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、さらにＣ−末端フラグメントをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。Ｖ１およびＶ２フラグメント対を続いて共通のＥｃｏＲＩの突出部で一緒に連結した。得られたＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを続いてｐＫＫ２２３−３Ｎベクター（これはＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して調製した）に連結した。
Ｂ細胞エピトープをＶ１およびＶ２プラスミドに挿入するために、前記プラスミドをＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩ制限酵素で消化した。続いて、５´ＥｃｏＲＩおよび３´ＳａｃＩ突出部を含む合成ｄｓＤＮＡフラグメントを挿入した。両方の事例（Ｖ１およびＶ２）で、グリシン−イソロイシン（ＥｃｏＲＩ）およびグルタミン酸−ロイシン（ＳａｃＩ）アミノ酸対（前記制限部位によってコードされる）は挿入されたＢ細胞エピトープと接する。前記挿入された制限部位は下記のプライマーで下線を施されている。
【０１８３】
Figure 2005517380
【０１８４】
Ｃ．Ｖ７クローニングベクターの調製
Ｔ細胞エピトープとＨＢｃキメラのＣ末端との融合を可能にするために、新規なベクター、Ｖ７を構築した。固有のＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩ制限部位をバリン−１４９とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入し、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ（またはＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ）制限部位への合成ｄｓＤＮＡの方向性をもつ挿入を容易にした。下記のＰＣＲプライマー対を用いて、アミノ末端にＮｃｏＩ制限部位を、さらにカルボキシル末端にＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位をもつＨＢｃ１４９遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ反応の生成物（４７９ｂｐ）をＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＫＫ２２３−３ＮでクローニングしてＶ７を作製した。
【０１８５】
Ｔ細胞エピトープを挿入するために、プラスミド（Ｖ７）をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（またはＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ）で消化し、さらにＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（またはＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ）突出部を有する合成ｄｓＤＮＡフラグメントをＶ７に連結した。全てのＶ７構築物について、天然のＨＢｃの最後のアミノ酸（バリン−１４９）および挿入Ｔ細胞エピトープの最初のアミノ酸を、ＥｃｏＲＩ制限部位を形成するヌクレオチドによってコードされるグリシン−イソロイシンジペプチドによって分離させる。ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩに挿入されたエピトープの場合、終止コドンの前のＴ細胞エピトープの後にさらに別のグルタミン酸−ロイシン残基が存在し、これはＳａｃＩ部位によって提供される。表示のプライマー中の制限部位にもまた下線が施されている。
ＨＢｃ１４９／ＮｃｏＩ−Ｆ
5´-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA 配列番号：６７
ＨＢｃ１４９／ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ−Ｈ３−Ｒ
5´-CGCAAGCTTAGAGCTCTTGAATTCCAACAACAGTAGTCTCCG 配列番号：７５
【０１８６】
Ｄ．Ｖ１２発現構築物の調製
Ｖ１２ベクター（アミノ酸７８と７９の間にＢ細胞エピトープを含み、バリン１４９の下流にＴ細胞エピトープを含む）をＶ２およびＶ７ベクターから構築した。ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに挿入されたＡＴ細胞エピトープを含むＶ７ベクターのカルボキシル末端を２つのＰＣＲプライマー（ＨＢｃ−Ｐ７９／ＳａｃＩ−ＦおよびｐＫ２２３−２／４５１５−３２Ｒ）を用いて増幅し、アミノ酸７９−１４９＋Ｔ細胞エピトープ（ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に接する）と一致するｄｓＤＮＡを提供した。
前記ＰＣＲ生成物をＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、続いて所望のＶ２ベクター（同じ２つの酵素で切断して調製される）でクローニングした。表示したＰＣＲプライマーは、ＨＢｃ遺伝子のアミノ酸１４９の後に存在するＴ細胞エピトープとは関係なく、全Ｖ７遺伝子のカルボキシル末端の増幅が容易である。
【０１８７】
本アプローチの普遍性における１つの例外は、Ｐｆ−ＣＳ（Ｃ１７Ａ）変異を含むＶ１２構築物の調製で、前記は現存のＶ１２構築物から調製した。本事例では、Ｖ１２構築物をＨＢｃ１４９／ＮｃｏＩ−Ｆ（配列番号：６７）およびミスマッチ逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号：１４５）（前記はＣ１７Ａ変異を容易にした）で増幅した。得られたＰＣＲ生成物をＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＫＫ２２３−３Ｎ（先に同じ酵素で切断してある）でクローニングした。制限部位には下線が施されてある。
ＨＢｃ−Ｐ７９／ＳａｃＩ−Ｆ
5´-CGCGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG 配列番号：７６
ｐＫＫ２２３−２／４５１５−３２Ｒ
5´-GTATCAGGCTGAAAATC 配列番号：７７
【０１８８】
Ｅ．Ｖ２に挿入されるＰ．ファルシパルム（ falciparum ）ＣＳ−リピートＢ細胞エピトープ
Ｖ２およびＶ７構築物の場合、問題のＢ細胞エピトープ（Ｖ２）およびＴ細胞エピトープ（Ｖ７）をコードする合成ｄｓＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ制限部位に挿入した。合成ｄｓＤＮＡフラグメント（問題のＢおよびＴ細胞エピトープをコードする）を、相補性一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを等モル濃度で混合し、９５℃で５分加熱し、続いて−１℃／分の速度で室温まで冷却することによって調製した。本アニーリング反応をＴＥ緩衝液中で実施した。前記二本鎖ＤＮＡを、上記に示したコードエピトープ配列とともに下記に示す。ポンド記号（＃）は、終止コドンの存在を表示するために以下のアミノ酸残基配列のいくつかで用いられる。
【０１８９】
Figure 2005517380
【０１９０】
Figure 2005517380
【０１９１】
Figure 2005517380
【０１９２】
Figure 2005517380
【０１９３】
Figure 2005517380
【０１９４】
Figure 2005517380
【０１９５】
Figure 2005517380
【０１９６】
Figure 2005517380
【０１９７】
Figure 2005517380
【０１９８】
Ｂ．切端およびＣ−末端システイン付加のためのＰＣＲプライマー
ＨＢｃキメラ遺伝子のＣ−末端を改変（システイン残基の付加またはＨＢｃ遺伝子の長さの変更により）するために、Ｃ−末端の所望の改変を指令するＨＢｃ／ＮｃｏＩ−Ｆプライマーおよび逆方向プライマー（例えばＨＢｃ１４９＋Ｃ／ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｒ）とともにＨＢｃ１４９を鋳型として用いてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ生成物はＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＫＫ２２３−３Ｎ内の同じ制限部位でクローニングした。
【０１９９】
Figure 2005517380
【０２００】
Figure 2005517380
【０２０１】
実施例３：アッセイ方法
Ａ．抗原性
１．粒子のＥＬＩＳＡ
精製粒子をコーティング緩衝液（５０ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）中で１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、ＥＬＩＳＡストリップのウェルを被覆した（５０μＬ／ウェル）。前記ＥＬＩＳＡストリップを室温で一晩（約１８時間）インキュベートした。次の朝、前記ウェルをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４、０．０５％トゥイーン（登録商標）−２０）で洗浄し、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ（７５μＬ／ウェル）で１時間ブロックした。ＥＬＩＳＡストリップを乾燥させ必要なときまで−２０℃で保存した。
【０２０２】
粒子の抗原性を決定するために、抗血清をＰＢＳ中の１％ＢＳＡを用いて希釈し、５０μＬ／ウェルを抗原被覆ＥＬＩＳＡウェルに添加した。血清を１時間インキュベートし、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で洗浄し、抗マウス（ＩｇＧ）−ＨＲＰ（The Binding Site, San Diego, CA; HRP=セイヨウワサビペルオキシダーゼ）共役物（５０μＬ／ウェル）または他の適切な抗体を用いて３０分間反応させた。ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で洗浄した後、前記反応をＴＭ青色基質（５０μＬ／ウェル）を添加して可視化した。１０分後、１ＮのＨ2ＳＯ4（１００μＬ／ウェル）を添加して反応を停止し、４５０ｎｍに設定したＥＬＩＳＡプレート読取装置で読み取った。
【０２０３】
２．合成ペプチドのＥＬＩＳＡ
２０アミノ酸残基の合成ペプチド、（ＮＡＮＰ）5をコーティング緩衝液（５０ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）で２μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、ＥＬＩＳＡストリップのウェルを被覆した（５０μＬ／ウェル）。フード内で排気をｏｎにして一晩（約１８時間）インキュベートすることによって、ペプチドをウェル上で乾燥させた。次の朝、前記ウェルをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４、０．０５％トゥイーン（登録商標）−２０）で洗浄し、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ（７５μＬ／ウェル）で１時間ブロックした。ＥＬＩＳＡストリップを乾燥させ必要なときまで−２０℃で保存した。
【０２０４】
粒子の抗体抗原性を決定するために、抗血清（モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）をＰＢＳ中の１％ＢＳＡを用いて希釈し、５０μＬ／ウェルを抗原被覆ＥＬＩＳＡウェルに添加した。血清を１時間インキュベートし、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で洗浄し、抗マウス（ＩｇＧ）−ＨＲＰ（上記のとおり５０μＬ／ウェル）または他の適切な抗体を用いて３０分間反応させ、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で洗浄し、続いてＴＭ青色基質（５０μＬ／ウェル）を添加して可視化した。１０分後、１ＮのＨ2ＳＯ4（１００μＬ／ウェル）を添加して反応を停止し、４５０ｎｍに設定したＥＬＩＳＡプレート読取装置で読み取った。
【０２０５】
Ｂ．粒子の免疫原性
粒子の免疫原性をアッセイするために、マウスをフロイント完全アジュバント中の２０μｇの粒子で腹腔内免疫し、さらに４週間してフロイント不完全アジュバント中の１０μｇでブースター免疫した。マウスから２、４、６および８週間で採血した。
Ｃ．スポロゾイトのＩＦＡ
グルタルアルデヒド固定Ｐ．ファルシパルム（falciparum）スポロゾイトおよびＦＩＴＣ−標識抗マウスＩｇＧ（ガンマ鎖特異的）（Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD）を用いて間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）を実施し、結合抗体を検出した（Munesinghe et al. Eur. J. Immunol. 1991, 21:3015-3020）。使用したスポロゾイトは、in vitro培養で得たＰ．ファルシパルム（ＮＦ５４単離株）の生殖母細胞を与えて感染させたハマダラカ（Anopheles）の唾液腺から切り出した。
【０２０６】
実施例４：リコンビナントキメラＨＢｃ粒子の発現
Ａ．免疫原性に対する挿入部位の影響
抗体力価（希釈の逆数）は、アミノ酸Ｅ７７／Ｄ７８（配列番号：２６０および２６１）またはＤ７８／Ｐ７９（配列番号：２５９および２６０）の間のどちらかに挿入された、またはループ置換アプローチ（ＣＳ−２）（以下の文献で考察されている（フロイントの完全アジュバントを使用）：Schodel et al. (1994) J. Exp. Med., 180:1037-1046）を用いることによって挿入されたＰ．ｆ−ＣＳ・Ｂ細胞エピトープ（ＮＡＮＰ）4を含むＨＢｃ粒子で免疫したマウスについて測定した。マウスを１回接種量２０μｇ（ＩＰ）で上記のようにアジュバントともにただ１回免疫し、固定した（ＮＡＮＰ）5合成ペプチドを用いてＥＬＩＳＡで決定した。これらの実験の結果は下記表１に示す。
表１
Figure 2005517380
*Schodel et al. (1994) J. Exp. Med. 180:1037-104
【０２０７】
免疫原性に対するまた別の比較は、ＮＡＮＰ・ＣＳリピートエピトープの挿入部位についてＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて実施した。SchodelらのＣＳ−２粒子によって誘発された抗体力価を、同じ（ＮＡＮＰ）4Ｂ細胞エピトープ（ＨＢｃ７８位および７９位の間に挿入）を用い、されに免疫原として上記Ｖ２．Ｐｆ１粒子を用いて達成される力価と比較した。一次免疫（１°）後４週間、およびブースター免疫（２°）後２週間で血清を調べた。結果は下記表２に示す。
表２
Figure 2005517380
*Schodel et al. (1994) J. Exp. Med. 180:1037-104
免疫原性に対するＮＡＮＰ・ＣＳリピートエピトープの挿入部位の比較をＢ１０．Ｓマウスを用いて実施し、結果を表３に示す。
表３
Figure 2005517380
*Schodel et al. (1994) J. Exp. Med. 180:1037-104
【０２０８】
繰り返されたＮＡＮＰ配列とともに、マイナーＢ細胞エピトープ、ＮＡＮＰＮＶＤＰ（配列番号：１６７）を含むＨＢｃキメラ粒子の免疫原性に対する影響を調べた（ＥＬＩＳＡ、Ｆ１マウス）。ＨＢｃ７８位と７９位の間に挿入された配列ＮＡＮＰＮＶＤＰ（ＮＡＮＰ）3ＮＶＤＰ（配列番号：２１；Ｖ１２．Ｐｆ３）を含むＨｂｃキメラを発現させた。得られたＥＬＩＳＡのデータを、４量体リピート（ＮＡＮＰ）4Ｂ細胞エピトープ（Ｖ１２．Ｐｆ１）または同じ位置のマイナーＢ細胞エピトープ２量体（Ｖ１２．Ｐｆ７）を用いて得た力価と比較した。前記３つのキメラの各々は、Ｃ−末端配列としてＰ．ファルシパルムの普遍Ｔ細胞エピトープに結合されてある１４１位から１４９位のＨＢｃ配列を含むドメインＩＶを含んでいた。上記のような一次免疫およびブースター免疫およびアジュバントを用いた前記実験の結果は下記の表４に示されている。
表４
Figure 2005517380
【０２０９】
「マイナー」リピートエピトープを含むことによって２０倍を越える免疫原性の増加が観察されることは予期せぬことであった。Ｖ１２．Ｐｆ３は大腸菌では良好な発現が得られなかったので、Ｐｆ３と同様な抗原性を有するが、発現レベルを高めたＰｆ３エピトープの変種ＮＡＮＰＮＶＤＰ（ＮＡＮＰ）3ＮＶＤＰ（配列番号：２１）を、下記に示すように構築した。免疫原性について構築物３．１および３．２のみを調べた。
【０２１０】
リコンビナントキメラＨＢｃ／Ｐ．ファルシパルム粒子の相対的な発現レベルおよびＣＳエピトープ（ＮＡＮＰ）4および（ＮＡＮＰＮＶＤＰ）に特異的なモノクローナル抗体の場合の抗原性を下記表５に示す。相対的発現レベルは以下のとおりである：＊＊＊＊＝７５−１２５ｍｇ／Ｌ；＊＊＊＝５０−７５ｍｇ／Ｌ；＊＊＝２５−５０ｍｇ／Ｌ。抗原性は、モノクローナル抗体の終末力価の希釈によって決定した（（ＮＡＮＰ）4の場合はＭｏＡｂ２Ａ１０；ＮＡＮＰＮＶＤＰの場合はＭｏＡｂ２Ｂ６Ｄ８；およびＰ．ｖｉｖａｘＲｐｔ．ＭｏＡｂ２Ｆ２はE. Nardin（New York University Medical Center）によって提供された）。データは、最低の力価を１であらわすことができるように標準化した。例えば、Ｖ１２．Ｐｆ３は、（ＮＡＮＰ）4特異的モノクローナル抗体ではＶ１２．Ｐｆ３．１０よりも抗原性は１６５倍で、ＮＡＮＰＮＶＤＰ特異的モノクローナル抗体ではＶ１２．Ｐｆ３．２よりも抗原性は２６倍高かった。Ｎ．Ｄ．＝抗体結合検出不能。（注記：Ｖ１２．Ｐｆ３．７は変異のために発現ベクターで発現させることができなかった。同様な構築物が抗原性を持たなかったので、前記について更なる調査を実施せず、したがって再クローニングも意味のあることではなかった。）
【表７】
Figure 2005517380
【０２１１】
Ｐｆ３エピトープの変種を含むそれぞれのＨＢｃキメラ粒子の免疫原性を上記のようにアッセイした。血清は、一次免疫（１°）後４週間および二次免疫（２°）後４週間でＥＬＩＳＡで調べた。得られたデータは下記の表６に示されている。表６では、キメラの「名称」およびＢ細胞免疫原の対応する配列は上記で示したとおりである。
表６
Figure 2005517380
驚くべきことに、ＮＡＮＰＮＶＤＰリピートのコピーを１つ含む型（Ｖ１２．Ｐｆ３．１）は、２つのコピーを含む型（Ｖ１２．Ｐｆ３）と、ＮＡＮＰモノクローナル抗体での抗原性は５倍低いにもかかわらず同じ免疫原性（免疫誘発性）を有する。
【０２１２】
Ｂ．発現の失敗
いくつかのさらに別のエピトープをＨＢｃループ（ドメインＩＩ）の７８位および７９位の間（Ｖ２．Ｐｆ１のように）に配置することを試みたが、理由は不明であるが発現させることができなかった。下記の表７では、ＨＢｃキメラのＤ７８およびＰ７９の間（Ｖ２）に挿入したとき発現できなかったこれらエピトープが列挙されている。
【０２１３】
【表８】
Figure 2005517380
【表９】
Figure 2005517380
【０２１４】
実施例５：２８０／２６０吸収比の決定
タンパク質サンプルをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＰＨ７．４）を用いて０．１から０．３ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。ＰＢＳを用いて分光光度計のブランクを決定し、タンパク質サンプルの吸収を２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの波長で測定した。続いて２８０ｎｍで測定したサンプルの吸収値を２６０ｎｍで測定した同じサンプルの吸収値で割って、あるサンプルの２８０／２６０吸収比を得た。天然の粒子（ＨＢｃ１８３）、残基１４９位の後が切断されて切り縮められたＨＢｃ粒子（ＨＢｃ１４９）および本明細書の他の場所で特定されているいくつかのキメラを含む数サンプルについて得られた比率を下記の表８に示す。
表８
Figure 2005517380
【０２１５】
実施例６：切端ＨＢｃ粒子のＣ−末端システイン
Ａ．ハイブリッドＨＢｃ粒子のＣ−末端へのシステイン残基の付加
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ハイブリッドＨＢｃ粒子を発現する遺伝子を容易に変異させてシステインまたはシステイン含有ペプチドをＨＢｃのＣ−末端に導入することができる。例えば配列番号：１４８のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを、適切な第二のプライマーと一緒に用いてハイブリッドＨＢｃ遺伝子を増幅させ、コドンＶ１４９および終止コドンの間にシステインコドンを取り込ませることができる。
Ｂ型肝炎コア粒子を１８３（または１８５、ウイルスの型による）から１４０に端を切断して切り縮め、球状ウイルス様粒子に会合する能力は維持させることができる。多くのグループがアミノ酸１４９まで切り縮めた粒子を用いた。なぜならば、アミノ酸１５０はアルギニン富裕Ｃ−末端ドメインの最初のアルギニン残基を表すからである。
【０２１６】
ＨＢｃ粒子を安定化させる単一システイン残基の能力を評価するために、システイン残基のコドンを以前に記載した技術を用いて、ＨＢｃアミノ酸残基Ｖ１４９およびキメラＨＢｃ分子（残基７８と７９の間に挿入された（ＮＡＮＰ）4マラリアＢ細胞エピトープを含む（本明細書ではＶ２．Ｐｆ１と称する））の終止コドンの間に挿入し、キメラ分子および粒子（Ｖ２．Ｐｆ１＋Ｃと称する）を生成した。本キメラ粒子（Ｖ２．Ｐｆ１＋Ｃ；配列番号：２６４および２６５）の熱安定性（３７℃）は、挿入システインを欠く同様なキメラ粒子（Ｖ２．Ｐｆ１）と比較したとき図３に示されているように劇的に増加することが判明した。
システインをＶ２構築物のＣ−末端に付加して調製したベクターおよび発現生成物は、本明細書では時にＶ１６ベクターまたは発現生成物と称されることを特記する。
図３で容易に認められるように、２つの粒子は同様にスタートするが、３７℃で１４日後に、システイン含有粒子のＳＤＳゲル上のバンドは、Ｃｙｓ残基を欠く粒子と比較して少なく、安定性が強化されていることを示唆した。
【０２１７】
Ｂ．熱安定性プロトコル
５０ｍＭのＮａＰＯ4（ｐＨ６．８）を用いて精製粒子を１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、アジ化ナトリウムを最終濃度０．０２％に添加して細菌の増殖を抑制した。粒子を３７℃でインキュベートし、部分標本を図に表示した時間に採取した。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（還元性）と混合し、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した。クーマシーブルーでゲルを染色し続いて分析した。
【０２１８】
実施例７：ＨＢｃのＣ−末端に融合させたペプチドのＣ−末端のシステイン
末端システイン残基が１５０以外の位置で安定化作用を誘発することができるのか否かをさらに調べるために、Ｂ型肝炎コアタンパク質のＴｈエピトープ（アミノ酸残基７４−８７）を、イムノドミナントループにマラリアエピトープを含むＨＢｃのＣ−末端に融合させた。このＴｈエピトープはシステイン残基を含まず、したがってＣｙｓ残基をＣ−末端に付加した（下線付き「Ｃ」）。コントロールはシステインを欠く同じエピトープであった。これらの粒子はＶ２．Ｐｆ１をＶ７．ＨＢｃ７４−８７（およびＶ７．ＨＢｃ７４−８７＋Ｃ）と結合させて作製した。Ｖ７構築物は、ＨＢｃ−Ｐ７９／ＳａｃＩ−Ｆプライマー（配列番号：７６）およびｐＫＫ２２３−２／４５１５−３２−Ｒ（配列番号：７７）を用いてＰＣＲ増幅させた。前記生成物をＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、前記ＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを同じ酵素で切断したＶ２．Ｐｆ１に連結した。
下記の表９は、野生型ＨＢｃタンパク質に存在する天然の配列およびＨＢｃ１４９＋Ｃ粒子に対して、Ｃ−末端融合物ＨＢｃ（７４−８７）およびＨＢｃ（７４−８７）＋Ｃのアミノ酸配列を示している。「Ｃｙｓシフト」とは、野生型タンパク質におけるシステインの位置に対して導入されたシステインの位置で、前記システインは最後の残基である（１８３位）。
【０２１９】
【表１０】
Figure 2005517380
【０２２０】
実施例８：ＨＢｃハイブリッドのＣ−末端に融合させたペプチド内に存在するシステイン
システイン残基がＨＢｃ遺伝子の最後のアミノ酸であること（野生型ＨＢｃのように）が絶対的な要件であるのか、またはシステインは導入したＣ−末端配列中で内在的に機能することができるのかを調べるために実験を行った。
２０残基の普遍的Ｔ細胞エピトープに対応するペプチドをＨＢｃキメラ（Ｖ２．Ｐｆ１；配列番号：２６６および２６７）に融合させた。前記ペプチドは、マラリア寄生虫、プラスモジウム・ファルシパルムのＣＳタンパク質に由来し、前記ペプチドの１７位またはＣＳタンパク質の３４２位にシステインを含んでいる（Calvo-Calle et al., J. Immunol., 159(3):1362-1373(1997)）。このキメラは１位から１４９位のＨＢｃ配列を含み、アミノ酸７８と７９の間に挿入されたＰ．ファルシパルムＢ細胞エピトープ、（ＮＡＮＰ）4を有する。したがって、このＨＢｃ構築物のドメインＩは残基１−７５を含み；ドメインＩＩは、残基７８と７９の間に挿入された（ＮＡＮＰ）4エピトープを有する残基７６−８５を含み（制限部位を構成する４つの残基とともに）；ドメインＩＩＩは残基８６−１３５を含み；さらにドメインＩＶは残基１３６−１４９プラス２０残基のＰ．ファルシパルムＴ細胞エピトープおよびＥｃｏＲＩクローニング部位（ＧＩ）に由来する２つの残基を含んでいた。
【０２２１】
前記融合Ｃ−末端ペプチドは、長さが２０アミノ酸酸残基で（ウイルスのサブタイプより１２または１４アミノ酸短い）、野生型より８ｐＨ単位低い予想ｐＩ値を有する。システイン以外のアミノ酸によって付与される可能性がある潜在的安定化作用を最小限にするために、１７位のシステインの代わりにアラニンを有する（同様な）コントロール構築物を作製した（下記表１０を参照されたい）。 この配列の安定化作用の評価を簡単にするために、以前に３７℃で容易に分解することが示された粒子（Ｖ２．Ｐｆ１）のＣ−末端に前記ペプチドを融合させ、それぞれＶ２．Ｐｆ１＋Ｐｆ／ＣＳ−ＵＴＣおよびＶ２．Ｐｆ１＋Ｐｆ／ＣＳ−ＵＴＣ（Ｃ１７Ａ）と称されるＨＢｃキメラを作製した。２８日間に及ぶ熱安定性実験（以前に記載したように）の結果は図４に示されている。
【０２２２】
本実験の結果によって、Ｐ．ファルシパルムのＣＳタンパク質に由来するＴ細胞エピトープ内のシステインの存在は、実験期間中の粒子の安定性に必要であることが示され、さらに前記システインがエピトープのＣ−末端に存在する絶対的な必要性は存在しないことが示された。下記表は、野生型に存在する天然の配列に対して１７位にシステインまたはアラニンを有するＣ−末端融合物のアミノ酸配列を示している。
【０２２３】
【表１１】
Figure 2005517380
【０２２４】
実施例９：Ｐ．ビバックス（ vivax ）ＨＢｃキメラ
Ｐ．ファルシパルムＢ細胞およびＴ細胞免疫原を含むＨＢｃキメラに関する上記で述べた実験に続いて、Ｐ．ビバックスのＣＳタンパク質の配列を用いて同様な実験を行った。模範的な構築物は下記の表１１に示されている。
【０２２５】
【表１２】
Figure 2005517380
【０２２６】
リピートの多様性を論じるために、以下の種々のエピトープをアミノ酸７８と７９との間でＨＢｃに挿入するために用いた。
１．Ｉ型ＣＳリピート
ＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧＤＲＡＡＧＱＰＡＧ（Ｐ．ビバックス−１Ａ型）−−配列番号：１９７。この型のエピトープは粒子を形成できなかった。
ＤＲＡＡＧＱＰＡＧＤＲＡＤＧＱＰＡＧ（Ｐ．ビバックス−１Ｂ型）−−配列番号：１９８。この型のエピトープ（側面に接する二ペプチドクローニング部位の残部を含む）は粒子を形成することができ、Ｖ２．ＰＶ−ＴＩＢと称される。Ｐ．ビバックスＩ型の免疫原をクローニングすることができ、これを発現、精製し、さらにその免疫原性（免疫誘発性）をマウスでテストした。前記マウスの実験結果は下記の表１２に示す。
【０２２７】
２．ＩＩ型ＣＳリピート
ＩＩ型については、この実験は、ＩＩ型のエピトープに４つの異なる型が存在するために複雑になる。前記の型は５位にＧまたはＤを、さらに６位にＮまたはＤを含んでいる（Qari et al., Mol. Biochem. Parasitol., (1992) 55(1-2):105-113）。したがって、成功の可能性を最大にするために必要な４つの可能なリピート配列（ＧＮ、ＧＤ、ＤＮおよびＤＤ）が存在する。第一の、かつ好ましいアプローチは、下記に下線で示したように４つのリピートを全て含む単一ハイブリッド粒子を調製することである。このアプローチを用いてＩ型リピートの多様性を論じることに成功した。
前記構築物の各々は側面に接する二ペプチドクローニング部位の残部を含んでいる。
ANGAGNQPGANGAGDQPGANGADNQPGANGADDQPG
（Ｐ．ビバックス−ＩＩ型−ＧＮ／ＧＤ／ＤＮ／ＤＤ）配列番号：１９９。
上記の配列をクローニングし、発現させ、Ｃ−末端に改変を含まないＨＢｃキメラとして精製した。
【０２２８】
第二のアプローチは、２つのハイブリッド粒子を調製することで、それによって各粒子は変種エピトープのうちの２つを含む（下記を参照されたい）。このアプローチは、発現中に「混合」粒子の生成を指令するか、または製造に続いてＩＩ型粒子の混合を指令するためにより複雑な発現系を必要とするので好ましさは劣る。
ANGAGNQPGANGAGDQPG
（Ｐ．ビバックス−ＩＩ型−ＧＮ／ＧＤ） 配列番号：２００
QANGADNQPGANGADDQPG
（Ｐ．ビバックス−ＩＩ型−ＤＮ／ＤＤ） 配列番号：２０１
CGCGAATTCAAGCGAACGGCGCCGATAATCAGCCGGCGGGTGCA
（Ｐ．ビバックスＩＩＢ型−ＥＲ１−ｗｔ−Ｆ） 配列番号：１４６
【０２２９】
３．ＩＩＩ型（「ビバックス様」）ＣＳリピート
第三のＰ．ビバックスＣＳエピトープ（これは他の２つとは極めて異なっている）は、アミノ酸の多様性と関連していない（下記を参照されたい）（Qari et al., Lancet, 341(8848):780-783(1993)）。前記配列をＨＢｃ発現系でクローニングし、側面に接する二ペプチドクローニング部位の残部を含むハイブリッドを産生した。
APGANQEGGAAAPGANQEGGAA
（Ｐ．ビバックス−ＩＩＩ型） 配列番号：２０２
４．ＨＢｃＣ−末端のＴ細胞エピトープ
Ｐ．ビバックスＴｈエピトープ（Ｐｖ−ＵＴＣ；ＹＬＤＫＶＲＡＴＶＧＴＥＷＴＰＣＳＶＴ；配列番号：１９６）のＨＢｃおよびＨＢｃハイブリッドへの挿入もまた合成ＤＮＡフラグメント（Synthetic Genetics, San Diego, CA）を用いて実施した。しかしながら、Ｂ細胞エピトープと異なり（Ｂ細胞エピトープはＨＢｃ遺伝子のイムノドミナントループに挿入される）、Ｔ細胞エピトープはＨＢｃ遺伝子のＣ−末端と融合される。ＢおよびＴｈエピトープの両方をＨＢｃに挿入するために、以前に考察したクローニングベクターを用いた。Ｃ−末端にＰｖ−ＵＴＣを発現している粒子もまた作製することができた。
【０２３０】
５．単一粒子内でのＢおよびＴ細胞エピトープの合体
単一のＨＢｃ構築物中でＢおよびＴｈエピトープを合体させるために、ＰＣＲを用いてＮ−末端のＨＢｃフラグメント（ＡＡ１−８０、これはＢ細胞エピトープを含んでいる）、およびＣ−末端のＨＢｃフラグメント（ＡＡ８１−１５０、これはＴ細胞エピトープを含んでいる）を増幅させる。前記フラグメントを一緒に連結し、再度ＰＣＲで増幅させる。繰り返せば、クローンは制限エンドヌクレアーゼマッピングおよび自動ＤＮＡ配列分析（Lark Technologies, Houston TX）によって立証する。詳細は本質的にＰ．ファルシパルムの場合と同じである。Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型Ｂ細胞エピトープの各々および変種の他にＰｖ−ＵＴＣを含む粒子を発現させ、回収した。
【０２３１】
実施例１０：ＨＢｃキメラの相対的免疫原性（免疫誘発性）
いくつかのＨＢｃキメラ免疫原の相対的な免疫誘発性を上記に記載したＩＦＡアッセイを用いてマウスで比較した。上記で述べた２回投与免疫スケジュールを用いたこれらの実験結果は下記の表１２に示す。
表１２
Figure 2005517380
（Ａ＝Schodel et al., J. Exp. Med., 1994, 180:1037-1046．Ｂ＝Schodel et al., Behring Inst. Mitt., 1997(98):114-119．ＮＴ＝テストを実施せず。*＝３ヶ月を越える防御）
【０２３２】
上記のデータから認められるように、Ｐ．ファルシパルムに対する１０5から１０6の力価はキメラ免疫原を用いて達成された。この力価は、Schodelらの代替技術を用いたＰ．ベルゲイ（berghei）に対するわずか１０4の力価およびＰ．ファルシパルム（falciparum）に対する１０3の力価を凌ぐ。
ＣＳ−２またはＶ１２．Ｐｆ１の粒子２０μｇを用いて０日目にマウスを免疫し、さらに１０μｇを用いて４週間でブースター免疫を実施した。Ｖ１２．Ｐｆ３およびＶ１２．Ｐｆ３．１由来の粒子による免疫マウスは、０日目に２０μｇの粒子で免疫し、さらに上記で述べたようにアジュバントを用いて８週間でブースター免疫を実施した。達成された力価の期間を示すデータは図５に示す。Ｖ１２．Ｐｆ３粒子を用いたデータは、Ｖ１２．Ｐｆ３．１粒子を用いたデータと本質的に同一で、図には示されていない。
【０２３３】
実施例１１：相対的ＨＢｃ抗原性
一連の実験を実施し、天然のＨＢｃＡｇ（粒子）と比較したときのいくつかのマラリアＨＢｃキメラ粒子の相対的抗原性を２つのモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ−３１２０およびＭｏＡｂ−３１０５）に対して決定した。前記抗体は、ＨＢｃのループ領域に特異的で、Immunology Institute（Tokyo, Japan）から贈与された。実験は、プローブとして前記モノクローナル抗体を用いＥＬＩＳＡアッセイでの抗原として表５のキメラ（ＨＢｃ粒子の種々の位置に挿入されたマラリアエピトープを含む）を用いて実施した。これらの実験の結果（終末希釈として表されている）は下記表１３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃに示され、ループ領域（ＨＢｃの主要免疫原）と結合するモノクローナル抗体に対して目的のキメラは実質的に抗原性を欠いていることを明らかにしている。換言すれば、ＨＢｃのループ領域に特異的に結合するモノクローナル抗体は本発明の意図されるキメラをほとんど認識しない。
【０２３４】
表１３Ａ
Figure 2005517380
【０２３５】
表１３Ｂ
Figure 2005517380
イムノドミナントループ（７７−７８位または７８−７９位を含む）内のいくつかの部位への挿入は、ＭｏＡｂ−３１０５の結合を完全に排除する。Ｖ１３は残基１２９と１３０の間の挿入であり、天然のＨＢｃのイムノドミナントループはこの構築物では無傷のままであるのでコントロールとして用いられている。
【０２３６】
表１３Ｃ
Figure 2005517380
これらのデータは、残基７７と７８との間の挿入と比較して、残基７８と７９の間の挿入は、抗ＭｏＡｂ−３１２０の結合をさらに劇的に減少させることを示している。
【０２３７】
実施例１２：改変Ｂ型肝炎コアタンパク質発現ベクターの構築
位置特異的突然変異を用いて、リジンのコドン（ＡＡＡ）をＨＢｃ遺伝子のアミノ酸Ｅ７７およびＰ７８の間にＳａｃＩ（ＧＡＧＣＴＣ）制限エンドヌクレアーゼ部位とともに導入し、リンカー基含有ＨＢｃ粒子の生成のために他のコドンの遺伝的挿入を容易にした。したがって、前記挿入はアミノ酸残基配列ＫＥＬを有し、ここでＥＬはＳａｃＩ部位の人工的産物である。したがって、リンカー基含有ＨＢｃタンパク質は長さが１５２アミノ酸残基であった。ｐＫＫ２２３−３−ＨＢｃ１５２−Ｋ７８発現プラスミドは下記で述べる。
【０２３８】
オリゴヌクレオチドプライマーＰ１Ｆ（配列番号：２０３）およびＰ１Ｒ（配列番号：２０４、相補鎖に対する）を用いて、ＨＢｃ遺伝子の５´末端（塩基１−２３４、アミノ酸１−７７）を増幅し、同時に増幅生成物の５´末端にＮｃｏＩ制限部位（ＣＣＡＴＧＧ）、３´末端にＳａｃＩ制限部位（ＧＡＧＣＴＣ）、およびＳａｃＩ部位の前にリジンのコドンを取り込ませた。オリゴヌクレオチドプライマーＰ２Ｆ（配列番号：２０５）およびＰ２Ｒ（配列番号：２０６、相補鎖に対する）を用いて、ＨＢｃ遺伝子の３´末端（塩基２３５−４５０、アミノ酸７８−１４９）を増幅させ、同時に増幅生成物の５´末端にＳａｃＩ制限部位（ＧＡＧＣＴＣ）、および３´末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（ＡＡＧＣＴＴ）を取り込ませた。
【０２３９】
前記２つのＰＣＲ生成物（アミノ酸１−７７およびアミノ酸７８−１４９をコードする）をＳａｃＩで切断し、それらの共通のＳａｃＩ突出部で一緒に連結し、さらにＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、標準的技術を用いて発現プラスミドｐＫＫ２２３−３（Pharmacia）でクローニングした。得られたプラスミドをｐＫＫ２２３−３−ＨＢｃ１５２−Ｋ７８と称した。
前記プラスミドをイムノドミナントループ内にリンカー基としてリジンを含むＨＢｃキメラの発現に用いることができる。発現されたＨＢｃキメラは偶発的に粒子を形成した。したがって、本実施例のリンカー基含有ＨＢｃは、配列番号：２４７のＨＢｃの７７位に一致して挿入を、配列番号：２４７のＨＢｃの７８位に一致する位置に化学的に反応性を有するリジンリンカー残基を有し、配列番号：２４７のＨＢｃの１４９位に一致する位置で切断して切り縮められていた。
実施例１Ｉで述べたＰＣＲ技術を直前に述べた調製物とともに用いて、上記のキメラをコードし、さらにＣ−末端のシステイン残基を含むプラスミドを調製することができる。Ｃ−末端Ｃｙｓ残基および免疫原ハプテンに共役させることができる連結用残基を含むＨＢｃキメラ粒子はここに記載した方法にしたがって前記プラスミドを発現させて得ることができる。
【０２４０】
Figure 2005517380
【０２４１】
実施例１３：改変Ｂ型肝炎コア粒子の精製
実施例１２のリンカー基含有キメラＨＢｃ粒子を、大腸菌、典型的には大腸菌ＢＬＲまたはＢＬ１２（Novagen, Madison, Wisconsin）または大腸菌ＴＢ１（Amersham, Arlington Heights, Illinois）で発現させた。トランスフェクトされた大腸菌（ＨＢｃ１５２−Ｋ７８と称される）はプラスミドｐＫＫ２２３−３−ＨＢｃ１５２−Ｋ７８を発現した。確立された技術を用い、セファロース（登録商標）ＣＬ−４Ｂ−（Pharmacia）クロマトグラフィーにより前記リンカー基含有キメラＨＢｃ粒子（ＨＢｃ１５２（Ｋ７８）粒子）を精製した。
【０２４２】
これらキメラ分子および粒子に用いられる命名系では、「ＨＢｃ」はＢ型肝炎コアタンパク質配列を示し；「１５２」はキメラに存在するアミノ酸残基の数を示し、前記はリジンおよびＳａｃＩ部位からＨＢｃ１４９に付加された２つの制限部位残基（グルタミン酸およびロイシン；ＥＬ）を含み；さらに「（Ｋ７９）」は、リジン（Ｋ）が新規な残基７９として残基７８の後の配列に付加されていることを示している。分子のＣ−末端残基としてシステイン残基を含むキメラ分子および粒子（これらは以下で考察する）は、「Ｃ＋」と表される。
粒子は予想できる態様で精製されるので、単純な分光分析（ＯＤ２８０）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析とともに用いて粒子の溶出をモニターし、プールする前に個々の分画の純度を調べることによって、電気泳動的に純粋な粒子を高収量（５−１２０ｍｇ／Ｌ細胞培養）で日常的に十分に精製することができた。純粋なリンカー基含有キメラＨＢｃ粒子の球状構造は電子顕微鏡ではっきりと見ることができた。
【０２４３】
実施例１４：活性化担体としてのリンカー基含有キメラＨＢｃ粒子への合成ペプチドの化学的共役
実施例１３の発現プラスミドｐＫＫ２３３−３−ＨＢｃ１５２（Ｋ７８）のリンカー基含有キメラＨＢｃ粒子生成物を、同様に発現させて精製した「野生型」Ｂ型肝炎コア粒子切端形（ＨＢｃ１４９）と比較しその化学的反応性についてアッセイした。前記野生型Ｂ型肝炎コア粒子切端形は、導入リジン残基リンカー基および側面に接する５つのアミノ酸を欠くという点を除いてＨＢｃ１５２（Ｋ７８）と同一である。
【０２４４】
スクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（活性化担体を形成するために用いられる水溶性複素二環式架橋剤）を用いて、合成ペプチド（ハプテン）をリンカー基含有キメラＨＢｃ粒子と化学的に共役させた。ＳＭＣＣは、スルフヒドリル基および一級アミノ基の両方に反応性を有し、前記活性化担体（その一級アミノ基がＳＭＣＣで先に改変されてあるＨＢｃキメラ粒子）に合成ペプチドを連続的に共役させることができる。さらに、ＳＭＣＣによって与えられた１１．６オングストロームのスペーサーアームは、ハプテンとＨＢｃ担体との間の立体的妨害の減少に役立ち、それによってより大きなカップリング効率が得られる。
【０２４５】
簡単に記せば、ＨＢｃ１５２（Ｋ７８）およびＨＢｃ１４９粒子を、全アミノ基（天然のアミノ基または天然のアミノ基＋挿入リジン残基のアミノ基）に対して５倍過剰のＳＭＣＣとそれぞれ別々に、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）中で室温で２時間反応させ、マレイミド活性化ＨＢｃ粒子を生成した。未反応ＳＭＣＣを５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）に対して繰り返し透析して除去した。ＨＢｃ粒子のＳＭＣＣによる誘導によってＳＤＳ−ＰＡＧＥでは検出できないような最少の分子量増加が達成された。しかしながら、ＰＡＧＥ分析ではペプチド共役工程に進む前にＨＢｃタンパク質の完全性は担保されなかった。
【０２４６】
活性化担体としてのキメラＨＢｃ粒子へ共役されるべき合成ペプチドは、導入されたリジン残基の側鎖上の一級アミンとペプチドハプテンがそのシステインスルフヒドリルを介して方向性をもって共役することを可能にするＮ−末端システインをもつようにデザインされた。
表１４は、活性化ＨＢｃ粒子担体に化学的に共役させ、懸垂結合させたチトクロームＰ４５０決定基ハプテンを含有するＨＢｃキメラ粒子共役物（より単純にＨＢｃキメラ粒子共役物）を生成したヒトチトクロームＰ４５０酵素に由来する合成ペプチドを示している。前記合成ペプチドは、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた。続いて戦略的に改変したマレイミド活性化ＨＢｃ１５２（Ｋ７８）粒子の全アミノ基に対して５倍過剰で、前記合成ペプチドを１滴づつ添加し、室温で２時間反応させた。マレイミド活性化ＨＢｃ１４９粒子は、コントロールとして２つの２Ｄ６ペプチド（２Ｄ６および２Ｄ６−Ｃ）と反応させた。
【０２４７】
【表１３】
Figure 2005517380
【０２４８】
実施例１５：キメラＨＢｃ粒子共役物の分析
実施例１４の懸垂結合したチトクロームＰ４５０決定基ハプテンを含むＨＢｃキメラ粒子共役物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロットで分析し、合成ペプチドがＨＢｃに共役できているか否かを調べた。本電気泳動工程の変性条件によって粒子はその構成サブユニット、ＨＢｃモノマーに分解する。ＨＢｃモノマーは約１７０００Ｄａの分子量を有するので、１Ａ１（２８９−３０２）、１Ａ２（２９１−３０２）、２Ｄ６（２６３−２７７）、または３Ａ４（２５３−２７３）ペプチドのいずれかと化学的に共役したＨＢｃ１５２（Ｋ７８）粒子を解析することは簡単で、前記ペプチドは相対分子量が約２０００Ｄａであるので、したがって前記ＨＢｃタンパク質モノマーの分子量の目に見える増加をもたらす。
【０２４９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での共役バンドおよび非共役バンドの相対的濃度から、前記ＨＢｃ１５２（Ｋ７８）モノマーの約５０％がハプテンと共有結合し、一方、「野生型」ＨＢｃ１４９粒子の約５％のみがハプテンと結合していた。活性化担体とハプテンとの懸垂結合の顕著な増加が観察されたことによって、前記観察された結合は、「野生型」にも存在するリジン残基とは反対に挿入されたリジンを介して生じたということが支持される。
より短いＣ−末端Ｐ４５０由来ペプチド（５−および６−量体）と共役させたＨＢｃ粒子の移動度のシフトは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥではより長い抑制ペプチドの場合のように重大ではないが、共役が成功したＨＢｃ１５２（Ｋ７８）モノマーでは約１ｋＤａのシフトが明瞭であった。キメラＨＢｃ１５２（Ｋ７８）タンパク質は、「野生型」ＨＢｃ１４９粒子（極めてわずかの共役を示した）に対して、ハプテンとの懸垂結合能力の顕著な強化を示した。
【０２５０】
１８０個または２４０個の結合コアタンパク質モノマーで構成された二十面体粒子である提示されたコア粒子モデル（Conway et al. (1997) Nature, 386:91-94）では、比較的露出したイムノドミナントループ領域をもつコアモノマーで構成されたダイマーは、会合コア粒子から溶液中に中世の鎚矛のスパイクのように突出している。前記「スパイク」はＨＢｃ粒子上で空間的に接近して並んでいる。スパイクの先端に導入リジン残基を戦略的に配置させることによって、ハプテンと会合コア粒子との結合反応に対する立体的緊張傾向を最小限に留められる。
【０２５１】
戦略的に改変させたＨＢｃモノマーの最大で５０％がＣｙｔＰ４５０の合成ペプチドと共役することができた。前記懸垂結合の量は、各コアタンパク質ダイマーと結合した１つのハプテンの平均と一致する。前記戦略的に改変したＨＢｃ粒子とのハプテン結合の分布についての前記の考えは、ダイマーの結合を維持しながら粒子を分解させる半変性条件下でのＰＡＧＥの結果によって支持される。
イムノブロットを用いてペプチドカップリングによって調製したＨＢｃ−２Ｄ６粒子を調べ、２Ｄ６ポリペプチドエピトープの提示が確認された。抗ＨＢｃ抗血清で調べたとき、前記化学的に共役させた粒子は２つの異なるモノマーバンドを生じ、これらは２Ｄ６をもつモノマーおよびもたないモノマーを表し、したがって移動度のシフトと２Ｄ６ポリペプチドの結合との相関性が確認された。
【０２５２】
実施例１６：戦略的なリジンの挿入
イムノドミナント表面露出ループ領域（アミノ酸７５−８５）の各位置にリジン残基が挿入されたＨＢｃ粒子を構築するために、ＰＣＲを用いてＨＢｃ遺伝子の５´および３´フラグメントを増幅し、オリゴヌクレオチドプライマーを介して単一リジンコドンを導入した。前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび得られたアミノ酸配列は配列番号：２２０−２４１に示されている。「野生型」配列は配列番号：２１８−２１９である。これらのＨＢｃキメラは長さが１５０残基で、各キメラおよび粒子の名称内の数字によって示される位置にリジンが添加されている。
【０２５３】
７５位から８４位［ＨＢｃ１５０（Ｋ７５）からＨＢｃ１５０（Ｋ８４）］にリジンを挿入するために、ＰＣＲフラグメント対を制限エンドヌクレアーゼＭｓｅＩ（配列ＴＴＡＡを認識する）で消化した。前記オリゴヌクレオチドプライマー（リジンを含む）をヌクレオチド２２１−２２４に位置する都合のよいＭｓｅＩ制限部位で連結して、前記改変遺伝子を再生した。ＨＢｃ−Ｋ８５（配列番号：２４０−２４１）の場合、野生型遺伝子には存在しないが、アミノ酸を全く変更しないで２３９位−２４４位に導入することができる共通のＸｈｏＩ制限部位（ＣＴＣＧＡＧ）で連結させた２つのフラグメントを調製することが必要であった。
【０２５４】
【表１４】
Figure 2005517380
【０２５５】
リンカー基含有ＨＢｃキメラを精製するために、１Ｌの発酵から得た清澄な細胞溶解物を４５％硫酸アンモニウムで沈澱させ、得られたペレットをセファロース（登録商標）（Pharmacia）ＣＬ−４Ｂクロマトグラフィー（２．５ｃｍ×１００ｃｍ）に付した。粒子状ＨＢｃは、このタイプのカラムを用いて分析したときは、粒子に施したアミノ酸挿入に左右されないで特徴的な溶出位置を有する。本実験で調製した１１のリンカー基含有ＨＢｃキメラ粒子を前記の方法を用いて分析し、溶出プロフィールを２８０ｎｍの吸収で分光光学的に測定した。
前記構築物から調製したリンカー基含有ＨＢｃキメラ粒子のうちの３つ、ＨＢｃ１５０（Ｋ７５）、ＨＢｃ１５０（Ｋ７７）およびＨＢｃ１５０（Ｋ７９）は５０から１００ｍｇ／Ｌのレベルで生成され、これは未改変野生型ＨＢｃ粒子、例えばＨＢｃ１４９粒子の典型的な収量に匹敵する。前記構築物のリンカー基含有ＨＢｃキメラ粒子のうちの４つ、ＨＢｃ１５０（Ｋ７６）、ＨＢｃ１５０（Ｋ７８）、ＨＢｃ１５０（Ｋ８１）およびＨＢｃ１５０（Ｋ８２）は比較的低レベルで生成された（１から２０ｍｇ／Ｌ）。最後に、前記粒子のうちの４つ、ＨＢｃ１５０（Ｋ８０）、ＨＢｃ１５０（Ｋ８３）、ＨＢｃ１５０（Ｋ８４）およびＨＢｃ１５０（Ｋ８５）は、ほとんど検出不能と思われるレベルで生成された（１ｍｇ／Ｌ未満）。
【０２５６】
表１６
１Ｌの発酵から精製されたリジン含有キメラＨＢｃ粒子
Figure 2005517380
上記に記載したように、上記のキメラをコードし、さらにＣ−末端システイン残基を含むプラスミドを、上記または実施例１Ｉで述べた技術を直前に述べた調製方法とともに用いて、Ｃｙｓコドンを終止コドンの直ぐ上流に挿入することによって調製することができる。
【０２５７】
実施例１７：ＨＩＶ配列を有するキメラ
６３１から６６５位のＨＩＶ−１ｇｐ４１配列がＨＢｃ残基７８と７９の間に存在するリコンビナントキメラ粒子を調製した。調製物の１つはＣ−末端Ｃｙｓ残基を含み（配列番号：２７２および２７３）、一方、他の調製物はＣ−末端Ｃｙｓを含まずＨｂｃ１４９位のバリンで終わっていた（配列番号：２７０および２７１）。末端Ｃｙｓを含まない粒子を実施例１Ｂで述べたＶ２ベクターを用いて発現させ、一方Ｃｙｓで終る粒子は実施例１Ｉで述べたように調製したベクターから発現させた。前記構築物をそれぞれＶ２．ＨＩＶ１１．１およびＶ１６．ＨＩＶ１１．１と呼ぶ。発現収量はそれぞれ１．６ｍｇ／Ｌおよび１２．４ｍｇ／Ｌで、したがってＣｙｓで終るタンパク質から会合する粒子の収量はほぼ８倍の増加であった。
【０２５８】
ＨＩＶのＢ細胞エピトープの配列は、前記エピトープに対するそのコードＤＮＡおよび相補性ＤＮＡと同様に下記に示されている。ＨＩＶ配列はＣ−末端のＥＬ残基で都合よく終わりＮ−末端のＧＩ残基で始まり、したがってＨＢｃ配列由来でもなく挿入ペプチド配列由来でもない合計２つの付加（異種）残基が存在する。
Figure 2005517380
【０２５９】
実施例１８：比較発現
同様な比較発現実験を、上記で述べたＨＢｃ１５０（Ｋ７７）ベクター［ＨＢｃの残基７６と７７の間にリジンを（付加リジンのいずれかの側の２つの外来性残基とともに）含むキメラ分子を発現する］およびタンパク質のＣ−末端にＣｙｓ残基をさらに含む同様なベクターを用いて実施した。後者のベクターは、Ｖａｌ−１４９と終止コドンの間にＣｙｓのためのコドンを含むＣ−末端ＰＣＲプライマーを用いて上記で述べた技術により調製した。対にした発現実験で、前者のベクターは５５ｍｇ／Ｌの量の粒子を発現し、一方、後者のベクターは６０ｍｇ／Ｌの量の粒子を発現した。
【０２６０】
実施例１９：Ｃ−末端切断ＨＢｃキメラ遺伝子および粒子の調製
以下の逆方向プライマー［ＨＢｃ１３８＋１３９Ｃ−Ｈ３−ｒｅｖ、ＨＢｃ１３９−Ｈ３−ｒｅｖおよびＨＢｃ１４０−Ｈ３−ｒｅｖ（下記に示す）］の各々と一緒にＨＢｃ−ＮｃｏＩ−ｆｗｄ（以下に示す）を用いてＨＢｃ遺伝子を増幅させ、以下のＨＢｃ遺伝子を作製した：ＨＢｃ１４０、ＨＢｃ１３９およびＨＢｃ１３８＋１３９Ｃ。ＰＣＲ生成物をＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＫＫ２２３−３Ｎ（同じ２つの酵素で切断して調製されてある）でクローニングした。続いてプラスミドで大腸菌株ＴＢ１を形質転換し、５００ｍＬのＴＢ培養液（８ｍＬｇ／Ｌのグルコースおよび５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充）中で２４時間増殖させた。粒子の産生は粗大腸菌調製物をセファロース（登録商標）ＣＬ−４Ｂサイジングカラム（Pharmacia）（粒子は特徴的な溶出位置に付随する）を用いて分析することによって決定した。
【０２６１】
したがって、５グラムの採集細胞を２５ｍＬの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＥＤＴＡ中でフレンチプレスを用いて溶解した。前記溶解物を１６０００ｒｐｍ（ＪＡ−３０．５０Ｔｉローター（Beckman））で２０分遠心して清澄にした。硫酸アンモニウム沈澱（４５％）を用いて粒子を沈澱させ１６０００ｒｐｍ（ＪＡ−３０．５０Ｔｉローター（Beckman））で２０分遠心して、前記沈殿物を回収した。前記のようにして作製したペレットを５ｍＬの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＥＤＴＡに再懸濁し、溶解するまで２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析した。続いて、前記物質をセファロースＣＬ−Ｂクロマトグラフィーカラム（２．５×１００ｃｍ）に適用し、１ｍＬ／分の流速で５００分溶出させ、前記の時間までに全ての物質が溶出した。粒子の溶出は２８０ｎｍでモニターした。
前記溶出プロフィールを基にすれば、ＨＢｃ１４０は粒子を形成し、一方、ＨＢｃ１３９は形成しない。残基１３８で終わる粒子は、粒子の１３９位にシステインを付加することによってもまた粒子を形成しなかった。ベクターは、上記で示した配列番号：２７５、１４６、１５９、１６０、１５５、１５６、１５３および１５４のＤＮＡを用いて構築した。
【０２６２】
実施例２０：ヒトで使用するＨＢｃ粒子調製用ベクターの調製
Ａ．ベクターＶ１７Ｐｆ３．１の調製
ヒトの投与に適した態様で粒子Ｖ１２．Ｐｆ３．１（配列番号：２６８および２６９）を製造するためには、プラスミドの維持を担保するアンピシリンの使用を必要としない発現系を用いて粒子を発現させることが必要であった。前記の要件を達成するために、粒子をコードする遺伝子は、必要な上流の調節配列とともに、選別マーカーとしてカナマイシンを利用する新しいプラスミドに挿入された。前記新しいプラスミド（Ｖ１７．Ｐｆ３．１）を以下の２段階クローニング工程で合成した。
【０２６３】
工程１：プラスミドｐＫＫ２２３−３Ｎ−Ｖ１２を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して、８０１および４８６９ｂｐの２つのＤＮＡフラグメントを得た。さらに、市販のプラスミドｐＲＥＰ４（Quiagen）をＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、３２０ｂｐおよび３４２０ｂｐの２つのフラグメントを得た。３４２０ｂｐおよび８０１ｂｐフラグメントを連結してプラスミドＶ１７を作製した（ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ消化ＤＮＡはそれらの共通の「突出」配列のために連結できるが、ＢｇｌＩＩもＢａｍＨＩも得られたフラグメントを切断できないことを特記する）。したがって、Ｖ１７プラスミドは、ＨＢｃ１４９遺伝子（Ｃ−末端に融合したＰｆ−ＵＴＣ配列を完備している）およびイムノドミナントループ領域にＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩ制限部位（ＨＢｃ遺伝子のＤ７８およびＰ７９の間にエピトープを挿入することを可能にする）を含んでいる。
【０２６４】
工程２：第二の工程は、Ｐｆ・ＣＳリピートエピトープのＰｆ３．１バージョンを前記遺伝子のイムノドミナントループ領域に挿入することであった。前記はＶ１７をＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化して１５ｂｐおよび４２０６ｂｐのＤＮＡフラグメントを得ることによって達成された。アニールさせたＰｆ３．１エピトープをコードするオリゴヌクレオチドを前記４２０６ｂｐフラグメントと連結して、Ｖ１７．Ｐｆ３．１（４２７５塩基対プラスミド）を得た。１９５アミノ酸のマラリアワクチン候補物をコードする遺伝子の他に、本プラスミドは、ｌａｃリプレッサー（ｌａｃＩ）のための遺伝子を含み、前記遺伝子は、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって誘発されるまでｌａｃプロモーターの制御下にある全ての遺伝子を完全に抑制することができる。前記プラスミドはまた、カナマイシン耐性遺伝子を含み、培養液中へのカナマイシンの添加により陽性選別を可能にする。前記プラスミドはＣＹＣ１８４の複製起点を有し、高コピー数プラスミドであるとは考えられない。
【０２６５】
問題の遺伝子の位置は以下のとおりである：
Figure 2005517380
Ｖ１７．Ｐｆ３．１に適したホストは大腸菌ＢＬＲである。前記は、大腸菌ＢＬ２１のｒｅｃＡ誘導体で、リコンビナントタンパク質の製造に用いられる共通の株である（Novagenから購入できる）。大腸菌ＢＬＲは、その増強された遺伝的安定性の他に、可溶形で（封入体としてではなく）会合粒子を産生する能力のために発現用ホスト生物として選択された。
【０２６６】
Ｂ．プラスミドＶ１７．Ｐｆ３．１を用いた粒子の発現
２５μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを補充したＬＢ寒天プレートにＶ１７．Ｐｆ３．１プラスミドを含む大腸菌（ＢＬＲ株）を画線し、続いて３７℃で１６−２０時間インキュベートした。さらに単一コロニーを用いて滅菌試験管中の３ｍＬのＴＢ−Ｐｈｙ培養液（２５μｇ／ｍＬのカナマイシン補充）に接種した。前記試験管を振盪培養機で約２００ｒｐｍで、３７℃で一晩（約１８時間）インキュベートした。
次の朝、１００ｍＬのＴＢ−Ｐｈｙ培養液を３７℃に加温した。前記の一晩培養の１ｍＬを取り出し、これを前記フラスコへの接種に用いた。前記を続いて振盪培養機で約２００ｒｐｍで６時間３７℃でインキュベートした。
発酵装置（Biostat（登録商標）UE20）に１００ｍＬの接種量で接種した。発酵装置の条件は以下のように設定した：
攪拌：４００ｒｐｍ
温度：３７℃
通気：空気１０リットル／分
ｐＨ：７．０、非制御
【０２６７】
Ａ600値を最初のサンプルについて測定し、さらにその後２０−３０分毎にサンプルのＡ600値をモニターした。６２ｍｇのＩＰＴＧを１０−１５ｍＬの水に溶解してＩＰＴＧ溶液を調製した。Ａ600値が０．５の達したとき、ろ過滅菌したＩＰＴＧ溶液を無菌的に前記発酵装置に注射筒で添加した。次の日まで（さらに約１０−２４時間）インキュベーションを継続した。
誘発後１４時間で、発酵温度を１５℃に設定した。細胞の採集は以下の条件でベックマン（Beckman）（登録商標）Ｊ２−ＭＣ遠心機での遠心によって開始した：ローター：ＪＡ１０、速度：７５００ｒｐｍ、温度：４℃、時間：９分。
細胞を液体窒素で凍結することによって採集した。
【０２６８】
Ｃ．ベクターＶ１７．Ｐｆ３．１／ＢＬＲによって発現された粒子の精製
採集細胞のバイオマスを５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）に再懸濁し、フレンチプレスセルを１．１×１０8Ｐａ（１６０００ｐｓｉ）で用いて前記細胞を溶解させた。ベックマン（登録商標）Ｊ２−ＭＣを用い、以下の条件で遠心して細胞屑を除去した：ローター：ＪＡ２０、速度：１５０００ｒｐｍ、温度：４℃、時間：３０分。
得られた上清の容積を測定し、前記上清に固体の硫酸アンモニウム２７７ｇ／Ｌをゆっくりと添加した。混合物を４℃で３０分攪拌した。ベックマン（登録商標）Ｊ２−ＭＣ遠心機で以下の条件で前記溶液を遠心した：ローター：ＪＡ２０、速度：１５０００ｒｐｍ、温度：４℃、時間：３０分。
【０２６９】
続いて沈澱物を最少容量の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁し、さらに同じ緩衝液に対して攪拌しながら１時間透析した。透析した前記溶液をベックマン（登録商標）Ｊ２−ＭＣ遠心機で以下の条件で遠心した：ローター：ＪＡ２０、速度：１５０００ｒｐｍ、温度：４℃、時間：１５分。
上清を回収し、続いて以下のようにゲルろ過クロマトグラフィーに付した。
系：ファルマシアバイオテクＡＫＴＡ（登録商標）エクスプローラー
緩衝液Ｂ（溶出溶媒）：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）
カラム：ミリポアバンテージ（Millipore Vantage）（登録商標）ＶＬ４４×１０００カラム（直径４４ｍｍ、高さ１０００ｍｍ、カタログ番号９６４４１０００）
樹脂：１．５リットルセファロース（登録商標）ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア製）
検出：２１０、２５４および２８０ｎｍのＵＶ
分画：１５ｍＬ
前記カラムを２ｍＬ／分で緩衝液Ｂで溶出した。粒子を含む分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて特定しプールした。塩化ナトリウムを添加してプールした物質の塩濃度を５Ｍに調節した。
【０２７０】
疎水性相互作用クロマトグラフィー
系：ファルマシアバイオテクＡＫＴＡ（登録商標）エクスプローラー（システム番号：１８１１２４１ ００１１５２、University of Iowa ID No.:540833） 緩衝液Ａ：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）＋５ＭのＮａＣｌ（緩衝液は使用前に毎日３０分脱気した。）
緩衝液Ｂ（溶出溶媒）：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）（緩衝液は使用前に毎日３０分脱気した。）
トヨパール（ Toyopearl ）（登録商標）エーテル６５０樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー
カラム：ミリポアバンテージ（Millipore Vantage）（登録商標）ＶＬ４４×２５０カラム（直径４４ｍｍ、高さ２５０ｍｍ、カタログ番号９６４４０２５０）
樹脂：２００ｍＬトヨパール（登録商標）エーテル６５０ＨＩＣ樹脂（Tosohass製）
検出：２１０、２５４および２８０ｎｍのＵＶ
分画：１５ｍＬ
カラムは、５カラム容積（ＣＶ）の緩衝液Ａで精製開始前に１時間、２０ｍＬ／分の流速で平衡化させた。続いて、５Ｍの塩を含むリテンテートを２０ｍＬ／分の速度でロードした。カラムを２ＣＶの緩衝液Ａで洗浄し、２ＣＶの１０％緩衝液Ｂで洗浄し、３ＣＶの４０％緩衝液Ｂで溶出し、さらに１００％の緩衝液Ｂで最終的に溶出させた。分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で問題のタンパク質について完全に分析した。純粋な分画を一緒にし、ブラッドフォードアッセイを用いて、タンパク質の概算を得た。
【０２７１】
ブチル樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー
カラム：ミリポアバンテージ（Millipore Vantage）（登録商標）ＶＬ４４×２５０カラム（直径４４ｍｍ、高さ２５０ｍｍ、カタログ番号９６４４０２５０）
樹脂：２００ｍＬトヨパール（Toyopearl）（登録商標）ブチル６５０−Ｓ・ＨＩＣ樹脂（Tosohass製）
検出：２１０、２５４および２８０ｎｍのＵＶ
分画：１５ｍＬ
カラムは、５カラム容積（ＣＶ）の４０％緩衝液Ｂで精製開始前に１時間、２０ｍＬ／分の流速で平衡化させた。エーテルＨＩＣから得た、一緒にまとめた分画を２０ｍＬ／分の速度でロードした。カラムを２ＣＶの４０％緩衝液Ｂで洗浄し、２ＣＶの９０％緩衝液Ｂで洗浄し、さらに４ＣＶのＷＦＩで溶出した。分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で問題のタンパク質について分析した。純粋な分画を一緒にまとめた。
【０２７２】
ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー
カラム：ミリポアバンテージ（登録商標）ＶＬ１６×２５０カラム（直径１６ｍｍ、高さ２５０ｍｍ、カタログ番号９６１６０２５０）
樹脂：２０ｍＬセラミックヒドロキシアパタイト（カタログ番号１５８−２２００）
検出：２１５、２５４および２８０ｎｍのＵＶ
分画：１５ｍＬ
カラムは、５カラム容積（ＣＶ）の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で５ｍＬ／分の流速で平衡化させた。ブチルＨＩＣから溶出させ一緒にまとめた分画を５ｍＬ／分の速度でロードした。Ａ２８０が基準値に下がるまでカラムを２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で問題のタンパク質について分析した。純粋な分画を一緒にまとめた。
【０２７３】
脱塩
カラム：予め充填された脱塩カラム、ハイプレップ（HiPrep）（登録商標）２６／１０（Pharmacia）
樹脂：２０ｍＬ、セラミックヒドロキシアパタイト（カタログ番号１５８−２２００）
検出：２１５、２５４および２８０ｎｍのＵＶ
分画：１５ｍＬ
カラムは、５カラム容積（ＣＶ）の１５ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化させた。ヒドロキシアパタイトカラムから得た、一緒にまとめた分画をカラムにロードし、続いて１５ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で２０ｍＬ／分の流速で溶出させた。分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で問題のタンパク質について分析した。純粋な分画を一緒にまとめ、タンパク質の概算はブラッドフォードアッセイを用いて実施した。前記純粋な分画をエンドトキシンレベルに対してアッセイし、最後に０．２２ミクロンフィルターを通して最終ろ過を実施した。
【０２７４】
実施例２１：チトクロームＰ４５０配列をもつキメラの比較発現
ヒトチトクロームＰ４５０・１Ａ１配列の２９０位から３０２位がＨＢｃ残基７８と７９の間に存在するリコンビナントキメラ粒子を調製した。一方の調製物はＣ−末端Ｃｙｓ残基を含み、他方はＣｙｓ残基を含まずＨＢｃ１４９位のバリンで終わっていた。末端Ｃｙｓをもたない粒子は実施例１Ｂで述べたＶ２ベクターを用いて発現させ、一方、末端のＣｙｓをもつ粒子は実施例１Ｉで述べたように調製したベクターから発現させた。これらのベクターは、それぞれＶ２．１Ａ１（２９０−３０２）およびＶ１６．１Ａ１（２９０−３０２）と称される。発現収量は、それぞれ２．７ｍｇ／ｇ細胞、３６ｍｇ／Ｌ培養および８．８ｍｇ／ｇ、１４４ｍｇ／Ｌで、したがって末端システイン改変によるキメラ分子粒子の生成および収量安定化能力が実証された。
【０２７５】
Ｐ４５０・１Ａ１ペプチドの配列は、前記ペプチドのためのコード配列および相補性配列と同様に下記に示されている。Ｐ４５０・１Ａ１配列はＮ−末端ＧＩで始まり、Ｃ−末端ＥＬ残基配列で終わり、その結果、合計して４残基のみが付加されただけで、これらはＨＢｃ配列由来でも挿入ペプチド配列由来でもない。
Figure 2005517380
【０２７６】
実施例２２：Ｃ−末端融合エピトープの前にシステイン残基をもつ粒子を発現するベクターの調製
ＨＢｃ遺伝子のＶ１４９の後にただ１つのシステインを有し、その後にＴ細胞エピトープが続く粒子を調製するために、ＰＣＲプライマー（配列番号：２８２）を合成した。このプライマーをＨＢｃ１４９／ＮｃｏＩ−Ｆ（配列番号：６７）と一緒に用いてＨＢｃ遺伝子を増幅し、Ｖ１４９の直後にただ１つのシステインコドンとともにＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が（前記導入システインの後ろに）導入されたＨＢｃバージョンを作製した。４７８ｂｐＰＣＲ生成物をＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＫＫ２２３−３Ｎでクローニングした。
【０２７７】
Figure 2005517380
【０２７８】
続いて、得られたプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｐｆ／ＣＳ−ＵＴＣをコードするアニールされたオリゴヌクレオチド（ＰＦ／ＣＳ３２６−３４５；配列番号１２１および１２２）を前記プラスミドに連結した。続いて、プライマーＨＢｃ−Ｐ７９／ＳａｃＩ−Ｆ（配列番号：７３）およびＰｆ／ＣＳ（Ｃ１７Ａ）（配列番号：１４５）とともに、前記プラスミドを鋳型としてＰＣＲ反応で用いた。得られたＰＣＲ生成物（３０７ｂｐ）はＨＢｃのアミノ酸残基７９から１４９をコードし、その後に導入されたシステインが続き、さらにその後にＣ１７Ａ変異を有するＰｆ／ＣＳ−ＵＴＣ配列が続き、さらにＳａｃＩ（５´）およびＨｉｎｄＩＩＩ（３´）制限部位が側面に接している。このフラグメントをＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、さらに同じ２つの酵素で切断したプラスミドＶ２．Ｐｆ１［マラリア（ＮＡＮＰ）4エピトープをコードする］と連結した。
【０２７９】
得られた遺伝子は、ＨＢｃのアミノ酸７８と７９の間に挿入された（ＮＡＮＰ）4（ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩからそれぞれ由来するＧｌｙ−ＩｌｅおよびＧｌｕ−Ｌｅｕ配列が側面に接する）、およびＣ−末端にＰｆ／ＣＳ３２６−３４５のＣ１７Ａバージョンをもつ１９０アミノ酸残基のＨＢｃキメラをコードする。ただ１つのシステインは、したがってＨＢｃのＶ１４９とＧｌｙ−Ｉｌｅリンカー配列（ＥｃｏＲＩ制限部位に由来する）の間に位置していた（前記リンカー配列は、Ｐｆ／ＣＳ３２６−３４５（Ｃ１７Ａ）［Ｐｆ／ＣＳ−ＵＴＣ（Ｃ１７Ａ）］Ｔ細胞エピトープ（配列番号：２８４参照）の最初のアミノ酸の前に位置する）。
【０２８０】
前記ハイブリッド粒子を発現させて精製し、３７℃で数週間インキュベートすることによって安定性について分析した。この粒子（Ｖ１２．Ｐｆ１（Ｃ１７Ａ）Ｃ１５０）の安定性をＶ１２．Ｐｆ１と比較した（前記２つの粒子の相違はシステイン残基の位置のみである）。Ｖ１２．Ｐｆ１の場合、システインの後にそのタンパク質（配列番号：２８３）のＣ−末端の３つのアミノ酸残基（ＳＶＴ）が続き、一方、Ｖ１２．Ｐｆ１（Ｃ１７Ａ）Ｃ１５０の場合、システインの後には２２アミノ酸残基が続く（配列番号：２８４）。
Ｖ１２．Ｐｆ１：
TTVV GI EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT 配列番号：２８３
Ｖ１２．Ｐｆ１（Ｃ１７Ａ）Ｃ１５０
TTVV C GI EYLNKIQNSLSTEWSPASVT 配列番号：２８４
【０２８１】
ＨＢｃとＴ細胞エピトープの間にシステイン残基を挿入する（Ｖ１２．Ｐｆ１（Ｃ１７Ａ）Ｃ１５０）効果は、Ｃ−末端残基をもたない同様な粒子（Ｖ１２．Ｐｆ１（Ｃ１７Ａ））よりもはるかに安定な粒子の創出であった。このことは、Ｖ１２．Ｐｆ１（Ｃ１７Ａ）と異なり、Ｖ１２．Ｐｆ１（Ｃ１７Ａ）Ｃ１５０は顕著なモノマーへの分解を生じることなく容易に精製できるという事実（図４および８で前記粒子についてのＴ＝０を比較されたい）から明白であった。さらにＶ１２．Ｐｆ１（Ｃ１７Ａ）Ｃ１５０は、３７℃でインキュベートした後Ｖ１２．Ｐｆ１（Ｃ１７Ａ）よりもはるかに安定であった。３７℃で１４日後、Ｖ１２．Ｐｆ１（Ｃ１７Ａ）モノマーは完全に分解し（図４）、一方、Ｖ１２．Ｐｆ１（Ｃ１７Ａ）Ｃ１５０モノマーは部分的分解しただけである（図８）。
Ｖ１２．Ｐｆ１（Ｃ１７Ａ）Ｃ１５０はＶ１２．Ｐｆ１ほど安定でないことは明白であった（図８）。これらのデータは、Ｃ−末端単一システイン残基の安定化効果は、ＨＢｃキメラのＣ−末端に、またはＣ−末端近く（例えばＣ−末端の５残基以内）に配置されたときもっとも効果的であることを示している。
【０２８２】
実施例２３：ハイブリッド粒子の解析用ゲルろ過による分析
精製ハイブリッドＨＢｃ粒子の解析用ゲルろ過による分析を２５ｍＬのスーパーロース（Superrose）（登録商標）６ＨＲ１０／３０クロマトグラフィーカラム（Amersham Pharmacia #17-0537-01）およびバイオカド（BioCAD）（登録商標）ＳＰＲＩＮＴ灌流クロマトグラフィー系を用いて実施した。ＵＶ検出装置は２６０および２８０ｎｍの両方をモニターするように設定した。カラムは、３カラム容積（ＣＶ；約７５ｍＬ）の緩衝液（５０ｍＭのＮａＰＯ4、ｐＨ６．８）で０．７５ｍＬ／分の流速で平衡化した。
５０ｍＭのＮａＰＯ4（ｐＨ６．８）を用いて分析されるべき粒子を１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。続いて前記のサンプルの２００マイクロリットル（μＬ）を２００μＬのループにロードし、カラムに注入した。５０ｍＭのＮａＰＯ4（ｐＨ６．８）で０．７５ｍＬ／分の流速でサンプルをカラムから溶出させた。
【０２８３】
Ｃ−末端システイン残基を含むいくつかの粒子またはそのようなシステインを含まない同様な粒子を上記の方法を用いて分析した。２８０ｎｍトレースの組み込みは、バイオカド（登録商標）ソフトウェア（PerSeptive（登録商標））を用いて実施し、下記の表１７に示す結果を得た。
表１７
Figure 2005517380
注記：*Ｃ−末端システイン安定化粒子
【０２８４】
粒子の割合について精製粒子を調べ、続いて上記で述べたように３７℃の水溶液中でインキュベートした。１４日インキュベートした後、前記組成物を安定性について分析した。この分析の結果は下記の表１８に示す。
表１８
Figure 2005517380
注記：*表１７の注記を参照されたい
【０２８５】
図８は、３７℃でインキュベーション０日、７日および１４日後の表１８の粒子のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示している。前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のデンシトメーター解析を下記の表１９に示す。
表１９
Figure 2005517380
注記：*表１７の注記を参照されたい
【０２８６】
Ｃ−末端Ｃｙｓ残基を含む、または含まない表１８および１９の粒子並びに実施例１６のコントロール粒子を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内注射により免疫原性について分析した。前記免疫は、実施例４の報告とは反対にアジュバントの非存在下でリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中のそれぞれ対応する粒子２０μｇを用いて実施した。固相捕捉抗原としてＨＢｃ粒子（抗ＨＢｃ）または（ＮＡＮＰ）5合成ペプチド［抗（ＮＡＮＰ）n］を用い、免疫後２週間の血清をＥＬＩＳＡで分析した。本実験の結果は下記の表２０に示す。
表２０
Figure 2005517380
注記：*表１７の注記を参照されたい
【０２８７】
前記実験のデータは、Ｃ−末端安定化粒子は生成直後と同様に３７℃で種々の時間インキュベートした後もはるかに安定であることを意味していると解釈される。前記安定化粒子はまた、アジュバントの非存在下でも免疫原性（免疫誘発性）を強化することを示している。さらに、粒子化物質は非安定化物質（例えばＶ１２．Ｐｆ１（Ｃ１７Ａ）にも存在するが、インキュベーション１４日後にはモノマーのキメラタンパク質は存在せず、１４日後の物質は、最初に導入された異種Ｂ細胞エピトープ（ここではマラリア免疫原）に対して抗体を誘発しなかった。
【０２８８】
実施例２４：ベータ−アミロイドタンパク質エピトープ配列を含むキメラ
４２アミノ酸のベータ−アミロイド前駆体タンパク質フラグメントに対する抗体は、アルツハイマー病（ＲＥＦ）に対する治療用および予防用ワクチンとして提唱された（Schenk et al. (Jul. 8, 1999) Nature, 400(6740):116-117）。前記フラグメントのＣ−末端は、極めて疎水性でしたがってキメラＨＢｃ粒子の表面での発現が潜在的に困難である領域を含んでいる。
したがって、完全な４２アミノ酸配列を含む粒子［Ｖ１６．β−Ａｍ（１−４２）］の他に、以下の比較的親水性の領域のみを含む３つの他の粒子を構築した：アミノ酸残基１−１７［Ｖ１６．β−Ａｍ（１−１７）］、アミノ酸残基２２−３２［Ｖ１６．β−Ａｍ（２２−３２）］およびアミノ酸残基１−３２［Ｖ１６．β−Ａｍ（１−３２）］。粒子Ｖ１６．β−Ａｍ（１−１７）およびＶ１６．β−Ａｍ（２２−３２）をコードするキメラ遺伝子は、相補性オリゴヌクレオチドをアニールさせ、それらをプラスミドＶ１６（先にＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩで消化されてある）に挿入して構築した。
【０２８９】
Figure 2005517380
【０２９０】
残基１−４２［Ｖ１６．β−Ａｍ（１−４２）］および１−３２［Ｖ１６．β−Ａｍ（１−３２）］を含むキメラ遺伝子の場合、前記オリゴヌクレオチドβ−Ａｍ（１−３２／４２）−Ｔおよびβ−Ａｍ（１−４２）−Ｂまたはβ−Ａｍ（１−３２）−Ｂをアニールさせ、続いて５サイクルの溶融（９４℃）および充填（７２℃）により一本鎖部分を充填して完全な二本鎖のフラグメントを作製した。前記反応は、ベント（Vent）ポリメラーゼ（NEB）、ｄＮＴＰ（２５０μＭ）およびアニールさせたフラグメント（２５０ｎＭ）を用いて１００μＬの総容積で実施した。続いて、前記反応生成物の２μＬを２つのＰＣＲ反応の鋳型として用い、残基１−３２および１−４２をコードするフラグメント（ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩ制限部位が側面に接している）を作製した。（注記：Ｌｅｕコドン（ＣＴＧ）は、プライマー「β−Ａｍ（Ｌ＋１−３２／４２）−５´−ＰＣＲ」によって導入され、さらに前記はその後に続く２つの構築物中の最初のβ−Ａｍアミノ酸に先行して前記クローニング目的のＥｃｏＲＩ部位を回復させる。）
β−アミロイド残基１−３２および１−４２フラグメントの調製用オリゴヌクレオチド：
【０２９１】
Figure 2005517380
【０２９２】
実施例２５：インフルエンザＭ２構築物
最近になって、完全長のＨＢｃ粒子（ＨＢｃ１８３）（アミノ酸残基１−４を欠く）のＮ−末端へのＭ２の細胞外２４アミノ酸ドメインの融合が報告された（Neirynck et al. (Oct. 1999) Nature Med., 5(10):1157-1163；およびWO99/07839）。本明細書でＩＭ２ＨＢｃと称する構築物の模式図は下記に示すが、この場合ＨＢｃのＮ−末端に２４量体が連結されている。
ＩＭ２ＨＢｃ：
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-HBc(5-183) 配列番号：３０７
【０２９３】
１つの例示的調製物では、前記Ｍ２エピトープはＢ型肝炎コアのイムノドミナントループに挿入され、ＩＣＣ−１４７５と称される粒子を発現させることができた。前記のような挿入および精製について上記で述べた技術を用いて前記発現粒子を精製した。Ｍ２エピトープの変異バージョンであって、天然のＭ２の１７位および１９位の２つのシステイン残基がアラニン残基によって置換されたものもまたイムノドミナントループで発現され（ＩＣＣ−１４７３）、得られた粒子は精製された。前記２つの粒子は下記に模式的に示されている。
ＩＣＣ−１４７５：
HBc(1-78)-GI-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-EL-hbC(79-149) 配列番号：３０８
ＩＣＣ−１４７３：
HBc(1-78)-GI-SLLTEVETPIRNEWGARANDSSD-EL-HBc(79-149)-C 配列番号：３０９
【０２９４】
ＩＣＣ−１４７３構築物では、天然の配列（ＩＣＣ−１４７５）と比較したとき約７倍多くの精製粒子が得られた。システイン残基の変異は前記粒子の防御能力を変化させるか否かはまだ決定されていない。しかしながら、ＨＢｃのイムノドミナントループに配置されたエピトープは、それらが他の領域（Ｎ−末端を含む）に融合されている場合と比較して、通常は免疫原性ははるかに高くなり、得られた粒子は抗ＨＢｃ免疫原性の低下を示す。
さらに、Ｍ２のＮ−末端の２４量体エピトープがＣ−末端切断Ｂ型肝炎コア粒子のＮ−末端と融合した粒子も調製した。前記構築物（ＩＣＣ−１４３８）はまたＮ−末端プレコア配列（配列番号：３１０）を含んでいた。ただ１つのシステイン残基をハイブリッドタンパク質（ＩＣＣ−１４９２）の末端に含む（この場合はＨＢｃ遺伝子のＶａｌ１４９の直後）同様な構築物を調製した。
ＩＣＣ−１４３８：
MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI-HBc(2-149) 配列番号：３１０
ＩＣＣ−１４９２
MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI-HBc(2-149)-C 配列番号：３１０
【０２９５】
天然のＨＢｃイニシエーター、メチオニンから翻訳が開始するのを防ぐために、前記残基のためのコドンを変異させて、イソロイシン残基をコードさせたことは特記しておくべきであろう。ＥｃｏＲＩ（ＧＩ）およびＳａｃＩ（ＥＬ）制限部位によって提供される残基には下線が付されている。プレコア配列は下線を付したＥＬ残基および「−ＨＢｃ（２４９）」の間に挙げられている。
本明細書の他の場所で述べるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析によって、調製時にＩＣＣ−１４３８モノマー構築物（レーン２）はＩＣＣ−１４９２（レーン３）と比較してより不安定であることが示された［ＨＢｃ−１４９（レーン１）、ＩＣＣ−１４７５（レーン４）およびＩＣＣ−１４７３（レーン５）はさらに別の分子量コントロールとして図９のＳＤＳ−ＰＡＧＥで用いられている］。ＩＣＣ−１４３８モノマーの不安定性は、粒子の分析用ゲルろ過では明瞭ではなかった。
【０２９６】
ＩＣＣ−１４７５（図９、レーン４）およびＩＣＣ−１４７３（図９、レーン５）は両方とも、ＩＣＣ−１４３８およびＩＣＣ−１４９２よりもわずかに小さい分子量を有すると予想された。なぜならば、前者の２つはイムノドミナトループに直接挿入されたＭ２エピトープを含み、したがってＩＣＣ−１４３８およびＩＣＣ−１４９８に存在するプレコア配列（配列番号：３１０）を欠くからである。予想のとおり、ＩＣＣ−１４９２はＩＣＣ−１４７５およびＩＣＣ−１４７３よりも大きかったが、ＩＣＣ−１４３８（ＩＣＣ−１４９２と同一であるがＣ−末端システイン残基が省かれている）は、明らかな切断のためにＩＣＣ−１４７５およびＩＣＣ−１４７３よりも明らかに大きくはなかった。
ＨＢｃのＮ−末端（ドメインＩ）またはループ（ドメインＩＩ）に連結された、上記で述べたＭ２のＮ−末端細胞外配列を含み、さらにまたＨＢｃのループ（ドメインＩＩ）またはＣ−末端（ドメインＩＶ）に連結されたＭ２タンパク質のＣ−末端配列（例えば配列番号：１０の配列、表Ａを参照されたい）を含む構築物もまた意図される。前記のような本発明の構築物はまた、少なくとも１つの安定化Ｃ−末端システイン残基を本明細書の他の場所で考察したように含んでいる。
【０２９７】
実施例２６：サルにおける比較免疫原性
Ｖ１２．Ｐｆ３．１によって発現された粒子の比較免疫原性（免疫誘発性）をキノモルガスマンキー（Cynomolgus monkey）で調べた。前記は、アジュバントとしてセピック（Seppic）（登録商標）ＩＳＡ−７２０（Seppic Inc., Paris, France）またはアルヒドロゲル（Alhydrogel）（登録商標）（Superfos, Denmark）を用いて製剤化するか、または製剤化せずに（食塩水）用いられた。
セピック（登録商標）ＩＳＡ−７２０製剤は製造元の指示にしたがって調製した。簡単に記せば、ＩＳＡ−７２０およびＶ１２．Ｐｆ３．１粒子を７０：３０（ｗ／ｗ）の比率で混合し、最強パワーに設定した卓上ボルテックスミキサーで１分間攪拌した。アルヒドロゲル（登録商標）製剤は、Ｖ１２．Ｐｆ３．１粒子に対して８倍過剰（重量）のアルヒドロゲル（登録商標）を用いて調製した。前記製剤は、免疫の前にアルヒドロゲル（登録商標）との物理的な結合を示した。
【０２９８】
２匹のサル（雄１匹および雌１匹）のグループを免疫原として２０μｇのＶ１２．Ｐｆ３．１粒子で筋肉内ルートで免疫した。０、２１、４２、５６および７０日目で動物から採血し、ＥＬＩＳＡを用いて血清の抗ＮＡＮＰ抗体の力価を調べた。結果（下記の表１５に示されている）は、アルヒドロゲル（登録商標）製剤化材料または非製剤化材料に対してセピック（登録商標）ＩＳＡ−７２０で製剤化したとき、Ｖ１２．Ｐｆ３．１粒子の極めて高い免疫誘発性を示している。抗体反応の動的変化は、アジュバントとしてセピック（登録商標）ＩＳＡ−７２０を用いたときにいっそう迅速で、終末力価はアルヒドロゲルおよび食塩水に対してそれぞれ１００倍および１０００倍高かった。
表１５
Figure 2005517380
【０２９９】
実施例２７：Ｔ細胞活性化
セピック（登録商標）モンタナイド（Montanide）（登録商標）ＩＳＡ−７２０中のＶ１２．Ｐｆ３．１粒子でマウスを２回免疫した。脾臓細胞を取り出し、種々のペプチドの存在下で刺激した。１０6細胞を以下のペプチドの存在下で、ブドウ球菌のエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）の存在下または組織培養液存在下（非刺激）で３日間インキュベートした：ＵＴＣ（Ｐ．ファルシパルムの普遍的Ｔエピトープ、配列番号：１２０）、ＨＢｃ８５−１００に対応するｐ８５−１００ペプチド、ＮＡＮＰ（Ｖ１２．Ｐｆ３．１のＢ細胞エピトープ；ＮＡＮＰＮＶＤＰ（ＮＡＮＰ）3、配列番号：２２）。３日後のインターフェロンγの産生をＥＬＩＳＡで決定した。
【０３００】
下記の表１６に示した結果は、Ｖ１２．Ｐｆ３．１による免疫は、前記タンパク質のＵＴＣ成分を認識するＴ細胞を誘発すること、およびそれらＴ細胞をＴｈ１型反応に向かわせることを示している。
表１６
Figure 2005517380
注記：*Ｓ．Ｄ．＝標準偏差
注記：**ＮＤ＝実施せず
本明細書に引用した特許および論文は参照により本明細書に含まれる。英文明細書中で冠詞「ａ」または「ａｎ」が使用される場合は１つまたは２つ以上のものを含むことを意図している。
前述の記載および実施例は例示を意図しており、制限と解されるべきではない。本発明の範囲内でなお他の変更が可能であり、当業者にはそれらは容易に提示されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、いくつかのリコンビナントＨＢｃキメラを調製するために本明細書で使用するプラスミドベクターｐＫＫ２２３−３Ｎの調製において市販のプラスミドベクターｐＫＫ２２３−３に実施した改変を示している。改変配列（配列番号：２８５）は、市販のベクター（配列番号：２８６）の配列の下に示されている。付加されたＮｃｏＩ部位の塩基は小文字で示され、付加塩基の全ては二重下線により示されている。一方、欠失塩基は点線で示されている。本配列セグメントに存在する２つの制限部位（ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）は表示されている。
【図２】
図２（図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃとして３つのパネルで示されている）は、好ましいクローニング手順を模式的に表している。前記手順では、マラリアＢ細胞エピトープ［例えば（ＮＡＮＰ）4（配列番号：１）］は、操作を施したＨＢｃ遺伝子の７８位および７９位の間のＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩ部位でクローニングされ、これによってＥｃｏＲＩ部位は破壊され、一方、ＳａｃＩ部位は温存される。図２Ｂは、Ｔ細胞エピトープ（例えばＰｆ／ＣＳ−ＵＴＣと称されるもの）および終止コドンをコードするＤＮＡ（配列番号：１２０）を示し、前記ＤＮＡは、最初の１４９ＨＢｃ残基（ＨＢｃ１４９）を含む、操作を施して末端を切り縮めたＨＢｃ遺伝子のＣ−末端のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでクローニングされる。図２Ｃでは、残基７９位で始まるＨＢｃコード配列に隣接して５´末端ＳａｃＩ制限部位を有するプライマーを用いた図２Ｂの構築物のＰＣＲ増幅、前記増幅配列および図２Ａの構築物のＳａｃＩによる消化、続いて適切な部分の連結が示され、それによって以後Ｖ１２と称される、Ｐ．ファルシパルムに対するワクチンのための免疫原を構成するＢ細胞およびＴ細胞含有エピトープをコードする単一遺伝子構築物が形成される。
【図３】
図３は還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。前記は、キメラ（さらに７８位と７９位のアミノ酸の間に挿入された（ＮＡＮＰ）4を含む）（Ｖ２．Ｐｆ１＋Ｃ）内のＨＢｃのＣ−末端コドン（Ｖ１４９）と終止コドンの間の枠内に挿入されたただ１つのシステイン残基のためのコドンによる発現粒子の、０日目および３７℃で１５日後の安定化効果を、同様な構築物でそのＣ−末端が残基Ｖ１４９である構築物（Ｖ２．Ｐｆ１）とともに示している（レーン１、Ｖ２．Ｐｆ１−０日目；レーン２、Ｖ２．Ｐｆ１−３７℃で１５日目；レーン３、Ｖ２．Ｐｆ１＋Ｃ−０日目；レーン４、Ｖ２．Ｐｆ１＋Ｃ−３７℃で１５日目）。
【図４】
図４は還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。前記は、アミノ酸７８と７９の間に挿入された（ＮＡＮＰ）4およびＣ−末端に融合させたシステイン含有Ｔ細胞エピトープを含むキメラＨＢｃ粒子（Ｖ２．Ｐｆ１＋Ｐｆ／ＣＳ−ＵＴＣ、またＶ１２．Ｐｆ１とも称される）の、０日目および３７℃で２８日後の安定化効果を、同様な粒子（Ｃ−末端ＣｙｓがＡｌａに置換されている、［Ｖ２．Ｐｆ１＋Ｐｆ／ＣＳ−ＵＴＣ（Ｃ１７Ａ）、またＶ１２．Ｐｆ１（Ｃ１７Ａ）とも称される］）と比較して示している（レーン１、Ｖ２．Ｐｆ１＋Ｐｆ／ＣＳ−ＵＴＣ−０日目；レーン２、Ｖ２．Ｐｆ１＋Ｐｆ／ＣＳ−ＵＴＣ−３７℃で２８日目；レーン３、Ｖ２．Ｐｆ１＋Ｐｆ／ＣＳ−ＵＴＣ（Ｃ１７Ａ）−０日目；レーン４、Ｖ２．Ｐｆ１＋Ｐｆ／ＣＳ−ＵＴＣ（Ｃ１７Ａ）−３７℃で２８日目）。
【図５】
図５は、マウスの免疫後に３種のキメラ免疫原について週単位（横座標）で結合抗体力価（希釈の逆数の対数；縦座標）を検出するために、グルタールアルデヒド固定Ｐ．ファルシパルムスポロゾイトおよびＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（ガンマ鎖特異的）を用いて実施した間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）の結果を示すグラフである。従来のキメラ免疫原、ＣＳ−２のデータは四角形で、リコンビナントＨＢｃキメラ、Ｖ１２．Ｐｆ１のデータはダイヤモンド形で示され、一方、リコンビナントＨＢｃキメラ、Ｖ１２．Ｐｆ３．１のデータは三角形で示されている。
【図６】
図６は、以下の（Ｉ）および（ＩＩ）の２つの反応工程を示す反応模式図（模式図１）を表している：（Ｉ）キメラＢ型肝炎コアタンパク質（ｓｍ−ＨＢｃ）粒子にハプテンを懸垂結合させるためにスルホ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を用いて活性化担体を形成し；続いて（ＩＩ）スルフヒドリル末端を有する（システイン末端を有する）ハプテンを前記活性化担体に連結させて共役粒子を形成する。前記ｓｍ−ＨＢｃ粒子は（図を明瞭にするために）ただ１つの懸垂アミノ基をもつ四角形として描かれ、一方、スルフヒドリル末端を有するハプテンはＳＨ基の末端を有する棒線として描かれている。
【図７】
図７（図７Ａおよび図７Ｂとして２つのパネルで示されている）は、６種のウイルスに由来する哺乳類のＨＢｃタンパク質について報告された６つのアミノ酸残基配列のアラインメントを提供する。第一の（配列番号：２４７）ヒトのウイルス配列はａｙｗサブタイプで、Galibertら（Nature, 281:646-650(1983)）が報告し；第二のヒトウイルス配列（配列番号：２４８）はａｄｗサブタイプで、Onoら（Nucleic Acids Res., 11(6):1747-1757(1983)）が報告し；第三のヒトウイルス配列（配列番号：２４９）はａｄｗ２サブタイプで、Valenzuelaら（"Animal Virus Genetics", Field et al. eds., Academic Press, New York (1980) pp.57-70）が報告し；第四のヒトウイルス配列（配列番号：２５０）はａｄｙｗサブタイプで、 Pasekら（Nature, 282:575-579(1979)）が報告し；第五の配列（配列番号：２５１）はウッドチャックウイルスの配列で、Galibertら（J. Virol., 41:51-65(1982)）が報告し；さらに第六の哺乳類配列（配列番号：２４６）は地上リスの配列で、Seegerら（J, Virol. 51:367-375(1984)）が報告した。
【図８】
図８は、３７℃で０、１および２日間インキュベートした後の還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真で、以下の（１）および（２）に対する安定化効果を示している：（１）キメラＨＢｃ１４９粒子で、ＨＢｃアミノ酸残基７８および７９の間に挿入されたＰ．ファルシパルム（ＮＡＮＰ）4免疫原性配列を含み、さらにまたＨＢｃ１４９位にペプチド結合させたカルボキシ末端の普遍的Ｐ．ファルシパルムマラリアＴ細胞エピトープを含むもの（ＵＴＣ；Ｖ１２．Ｐｆ１＝Ｖ２．Ｐｆ１＋Ｐｆ／ＣＳ−ＵＴＣ）、および（２）同様な粒子であって、ＵＴＣの１７位のシステインがアラニン残基に変異し、１つのシステイン残基が残基１５０位（１４９位のＨＢｃ残基とＵＴＣの開始位置との間）に付加されてあるもの（Ｖ１２．Ｐｆ１（Ｃ１７Ａ）＋Ｃ１５０）。
【図９】
図９は粒子調製後の還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真で、ＩＣＣ−１４３８モノマー構築物（レーン２）はＩＣＣ−１４９２構築物（レーン３）と比較して不安定であることを示している。ＨＢｃ−１４９（レーン１）、ＩＣＣ−１４７５（レーン４）およびＩＣＣ−１４７３（レーン５）はさらに別の分子量コントロールとして供されている。
【配列表】
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Claims (115)

  1. 長さが約５１５までのアミノ酸残基のリコンビナントキメラＢ型肝炎コア（ＨＢｃ）タンパク質分子であって、
    （ａ）ＨＢｃイムノドミナントループ内に存在するペプチド結合異種エピトープもしくは共役エピトープのための異種リンカー残基を含む前記ＨＢｃ分子のＮ−末端１５０アミノ酸残基の少なくとも１３０残基のＨＢｃ配列、またはＮ−末端１５０ＨＢｃアミノ酸残基の少なくとも約１３５残基の配列を含み、
    （ｂ）前記ＨＢｃ配列のＣ−末端残基から前記分子のＣ−末端に向かって、さらに前記キメラ分子のＣ−末端から約３０残基内に１つから１０のシステイン残基（Ｃ−末端システイン残基）を含み、
    （ｃ）ＨＢｃ１３５位からＨＢｃＣ−末端の少なくとも５つのアミノ酸残基の配列を含み、
    前記キメラ分子が、（ｉ）２０％未満の保存的置換アミノ酸残基を前記ＨＢｃ配列中に含み、（ｉｉ）ホスト細胞内で発現されるとき実質的に核酸と結合しない粒子に自己会合し、さらに前記粒子が、前記Ｃ−末端システイン残基を欠くか、またはキメラ分子内に存在するＣ−末端システイン残基が別の残基に置換されてあるがその他の点では同一のＨＢｃキメラから生成される粒子よりも安定である、前記リコンビナントキメラＢ型肝炎コアタンパク質分子。
  2. 前記ペプチド結合異種エピトープまたは共役エピトープのための異種リンカー残基が異種エピトープである、請求項１に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  3. 前記異種エピトープがＢ細胞エピトープである、請求項２に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  4. ＨＢｃのアミノ酸残基１−４の１つとペプチド結合した第二の異種エピトープを含む、請求項３に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  5. 前記Ｂ細胞エピトープが、アミノ酸残基７６と８５との間のＨＢｃ配列内のある位置でペプチド結合し、さらに７６位から８５位のＨＢｃ配列の少なくとも５残基が存在する、請求項３に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  6. アミノ酸残基７６から８５の間の前記ＨＢｃ配列は存在するが、前記Ｂ細胞エピトープによって中断されている、請求項５に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  7. さらにペプチド結合異種Ｔ細胞エピトープを含む、請求項２に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  8. 前記Ｔ細胞エピトープがＣ−末端ＨＢｃアミノ酸残基とペプチド結合する、請求項７に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  9. 前記Ｃ−末端システイン残基が、ＨＢｃキメラタンパク質分子のＣ−末端の５アミノ酸残基内に存在する、請求項８に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  10. 前記キメラが、中断されていない１位から少なくとも１４０位のＨＢｃアミノ酸残基配列、およびＨＢｃキメラタンパク質分子のＣ−末端にシステイン残基を含む、請求項１に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  11. 前記キメラが、中断されていない１位から１４９位のＨＢｃアミノ酸残基配列を含む、請求項１０に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  12. 前記キメラが、共役エピトープのための異種リンカー残基を含む、請求項１に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  13. 前記共役エピトープのための異種リンカー残基が、アミノ酸残基７６と８５との間のＨＢｃ配列内のある位置でペプチド結合し、さらに７６位から８５位のＨＢｃ配列の少なくとも４残基が存在する、請求項１２に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  14. アミノ酸残基７６から８５の間の前記ＨＢｃ配列は存在するが、共役エピトープのための前記異種リンカー残基によって中断されている、請求項１３に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  15. １位から少なくとも１４０位の前記ＨＢｃアミノ酸残基配列、およびＣ−末端にただ１つのシステイン残基を含む、請求項１４に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  16. 前記キメラが、１位から１４９位の前記ＨＢｃアミノ酸残基配列を含む、請求項１５に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  17. 共役エピトープのための前記異種リンカー残基が、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびチロシン残基から成る群から選択される、請求項１６に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  18. Ｎ−末端からドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶと称される４つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含む、長さが約１３５から約５１５のアミノ酸残基のリコンビナントＢ型肝炎ウイルスコア（ＨＢｃ）タンパク質キメラ分子であって、
    （ａ）ドメインＩは約７１から約１００アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基の配列は少なくともＨＢｃの５位から７５位の残基配列を含み、さらに場合によってＨＢｃ残基１−４の１つとペプチド結合した約３０までのアミノ酸残基を含む異種エピトープを含み；
    （ｂ）ドメインＩＩはドメインＩのＨＢｃ残基７５とペプチド結合した約５から約２５０のアミノ酸残基を含み、ここで、（ｉ）ＨＢｃの７６位から８５位の配列中の０から全ての残基がＨＢｃにとって異種である１つから約２４５アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープまたは共役エピトープのための異種リンカー残基を構成するか、または（ｉｉ）７６位から８５位のＨＢｃの配列は異種残基とは結合せずに存在するか、または（ｉｉｉ）残基７６から８５の１つまたは２つ以上が存在せず；
    （ｃ）ドメインＩＩＩはドメインＩＩの残基８５とペプチド結合した８６位から１３５位のＨＢｃ配列であり；さらに、
    （ｄ）ドメインＩＶは、（ｉ）ドメインＩＩＩの１３５位の残基とペプチド結合した１３６位から１４９位のＨＢｃアミノ酸残基配列の０から１４残基、（ｉｉ）キメラ分子のＣ−末端から約３０残基以内に１つから１０のシステイン残基（Ｃ−末端システイン残基）、および（ｉｉｉ）１５０位からＣ−末端のＨＢｃにとって異種である配列中に０から約１００アミノ酸残基を含み、ここで、ドメインＩＶは前記（ｉｉ）の１つから１０のシステイン残基を含む少なくとも６つのアミノ酸残基を含むことを条件とし、
    前記キメラはホスト細胞内で発現されるとき自己会合して粒子を生成し、前記粒子は実質的に核酸と結合せず、さらに前記のＣ−末端システイン残基を欠くか、またはキメラ分子内に存在するＣ−末端システイン残基が別の残基に置換されてあるがその他の点では同一のＨＢｃキメラから生成される粒子よりも安定であり、さらに、前記キメラのＨＢｃ配列でそのアミノ酸残基の約１０％未満が置換されてあるアミノ酸残基配列を有する、前記リコンビナントＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質キメラ分子。
  19. ２つの異種エピトープを含む、請求項１８に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  20. 前記２つの異種エピトープが、ドメインＩおよびＩＩ、ＩＩおよびＩＶ、またはＩおよびＩＶに存在する、請求項１９に記載の請求項１９に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  21. 前記２つの異種エピトープの１つがＢ細胞エピトープである、請求項１９に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  22. 前記２つの異種エピトープの１つがＴ細胞エピトープである、請求項１９に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  23. 前記２つの異種エピトープの１つがＢ細胞エピトープであり、さらに他方がＴ細胞エピトープである、請求項１９に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  24. 前記ドメインＩが、ＨＢｃ残基１−４の１つとペプチド結合した異種エピトープを含む、請求項１８に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  25. ドメインＩＩの前記異種エピトープがＢ細胞エピトープである、請求項２４に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  26. １５０位からＣ−末端のＨＢｃにとって異種である前記配列が、ＨＢｃ残基１４０−１４９の１つとペプチド結合したＴ細胞エピトープである、請求項２５に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  27. 共役エピトープまたは異種エピトープのための前記異種リンカー残基が異種エピトープである、請求項１８に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  28. 前記異種エピトープが約２４５までのアミノ酸残基を含む、請求項２７に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  29. 前記異種エピトープがＢ細胞エピトープである、請求項２８に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  30. 前記異種エピトープが６から約５０アミノ酸残基を含む、請求項２７に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  31. 前記異種エピトープが２０から約３０のアミノ酸残基を含む請求項２７に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  32. 前記ドメインＩＶが、キメラ分子のＣ−末端から約３０残基内に１つから約５つのシステイン残基を含む、請求項２７に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  33. アミノ酸残基７６から８５の間のＨＢｃ配列は存在するが、前記異種エピトープによって中断される、請求項２７に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  34. 前記Ｃ−末端システイン残基が、前記キメラタンパク質分子のＣ−末端の約５つのアミノ酸残基内に位置する、請求項１８に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  35. １５０位からＣ−末端のＨＢｃにとって異種である前記配列が、ＨＢｃ残基１４０−１４９の１つとペプチド結合したＴ細胞エピトープである、請求項１８に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  36. 共役エピトープまたは異種エピトープのための前記異種リンカー残基が、共役エピトープのための異種リンカー残基である、請求項１８に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  37. 共役エピトープのための前記異種リンカーが、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびチロシン残基から成る群から選択される、請求項３６に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  38. 前記ＨＢｃキメラタンパク質分子のＣ−末端にただ１つのシステイン残基を含む、請求項３７に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  39. 前記キメラが、から少なくとも１４０位まで中断されないＨＢｃアミノ酸残基配列を含む、請求項１８に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  40. 前記非中断ＨＢｃアミノ酸残基配列が残基１を含む、請求項３９に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  41. 前記非中断ＨＢｃアミノ酸残基配列が残基１４９を含む、請求項３９に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  42. Ｎ−末端からドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶと称される４つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含む、約１７５から約２４０アミノ酸残基の長さを有するリコンビナントＢ型肝炎ウイルスコア（ＨＢｃ）タンパク質キメラ分子であって、
    （ａ）ドメインＩが、ＨＢｃの１位から７５位の残基配列を含み；
    （ｂ）ドメインＩＩがドメインＩのＨＢｃ残基７５とペプチド結合した約５から約５５のアミノ酸残基を含み、ここでＨＢｃの７６位から８５位の配列中の少なくとも４つの残基がＨＢｃにとって異種である６から約５０アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープを構成し；
    （ｃ）ドメインＩＩＩはドメインＩＩの残基８５とペプチド結合した８６位から１３５位のＨＢｃ配列であり；さらに、
    （ｄ）ドメインＩＶは、（ｉ）ドメインＩＩＩの１３５位の残基とペプチド結合した１３６位から１４９位のＨＢｃアミノ酸残基配列の５から１４残基、（ｉｉ）キメラ分子のＣ−末端から約３０残基以内に１つのシステイン残基（Ｃ−末端システイン残基）、および（ｉｉｉ）１５０位からＣ−末端のＨＢｃにとって異種である配列内に０から約５０アミノ酸残基を含み、
    前記キメラはホスト細胞内で発現されるとき自己会合して粒子を生成し、前記粒子は、２８０ｎｍ対２６９ｎｍ吸収比が約１．２から約１．６を示し、さらに前記のＣ−末端システイン残基を欠くか、またはキメラ分子内に存在するＣ−末端システイン残基が別の残基に置換されてあるがその他の点では同一のＨＢｃキメラから生成される粒子よりも安定であり、さらに前記キメラのＨＢｃ配列で約５％未満のアミノ酸残基が置換されてあるアミノ酸残基配列を有する、前記リコンビナントＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質キメラ分子。
  43. ドメインＩＩの前記異種エピトープがＢ細胞エピトープである、請求項４２に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  44. 前記異種エピトープが１５から約５０アミノ酸残基を含む、請求項４３に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  45. 前記異種エピトープが２０から約３０アミノ酸残基を含む、請求項４３に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  46. アミノ酸残基７６から８５の間のＨＢｃ配列は存在するが、前記異種エピトープで中断されない、請求項４３に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  47. 前記Ｂ細胞エピトープが下記から成る群から選択される病原体に存在するアミノ酸配列である、請求項４３に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子：肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumonia）、クリプトスポリジウム・パルブム（Cryptosporidium parvum）、ＨＩＶ、口蹄疫ウイルス、インフルエンザウイルス、ペスト菌（Yersinia pestis）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、ポルフィロモナス・ギンギバリス（Porphyromonas gingivalis）、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、げっ歯類住血胞子虫（Plasmodium berghi）、プラスモジウム・ヨエリー（Plasmodium yoelli）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Streptococcus sobrinus）、フレキシナー菌（Shigella flexneri）、ＲＳＶ、プラスモジウム・エントアメーバ・ヒストリティカ（Plasmodium Entamoeba histolytica）、日本住血吸虫（Scistosoma japonicum）、マンソニ住血吸虫（Schistosoma mansoni）、ウシインヒビンおよびエボラウイルス。
  48. 前記１５０位からＣ−末端までのＨＢｃにとって異種の配列がＨＢｃ残基１４０−１４９の１つとペプチド結合したＴ細胞エピトープである、請求項４３に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  49. 前記Ｔ細胞エピトープが、目的のキメラを免疫原として用いようとしている対象生物に由来する、請求項４８に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  50. 前記Ｃ−末端システイン残基が、前記キメラタンパク質分子のＣ−末端の約５つのアミノ酸残基内に位置する、請求項４３に記載のリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質分子。
  51. リコンビナントＢ型肝炎コア（ＨＢｃ）キメラタンパク質分子で構成された免疫原性粒子であって、前記キメラタンパク質が（ｉ）そのＮ−末端、ＨＢｃ免疫原性ループまたはＣ−末端に１つまたは２つ以上の免疫原性エピトープを提示するか、または（ｉｉ）共役エピトープのための異種リンカー残基を前記ＨＢｃ免疫原性ループ内に有し、さらにシステイン残基を前記Ｃ−末端またはＣ−末端近傍に含み、前記粒子は実質的に核酸と結合せず、さらに前記システイン残基を含まないことを除いて他の点では同一のタンパク質で構成された粒子と比較して安定性の強化を示す前記免疫原性粒子。
  52. 約１．２から約１．７の２８０／２６０吸収比を示す請求項５１に記載の免疫原性粒子。
  53. そのリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質が前記Ｎ−末端に免疫原性エピトープを提示する請求項５１に記載の免疫原性粒子。
  54. そのリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質が前記Ｃ−末端に免疫原性エピトープを提示する請求項５１に記載の免疫原性粒子。
  55. そのリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質が前記免疫原性ループ内に免疫原性エピトープを提示する請求項５１に記載の免疫原性粒子。
  56. そのリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質がＢ細胞免疫原性エピトープを提示する請求項１に記載の免疫原性粒子。
  57. そのリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質がＴ細胞免疫原性エピトープを提示する請求項５１に記載の免疫原性粒子。
  58. そのリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質が別々にＢ細胞およびＴ細胞免疫原性エピトープを提示する請求項５１に記載の免疫原性粒子。
  59. そのリコンビナントＨＢｃキメラタンパク質が、共役エピトープのための異種リンカー残基を前記ＨＢｃ免疫原性ループ内に有する請求項５１に記載の免疫原性粒子。
  60. 前記共役エピトープのための異種リンカー残基が、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびチロシン残基から成る群から選択される、請求項５９に記載の免疫原性粒子。
  61. 前記共役エピトープのための異種リンカー残基がハプテンに共役される、請求項６０に記載の免疫原性粒子。
  62. 前記ハプテンがオリゴ糖である請求項６１に記載の免疫原性粒子。
  63. 多数のリコンビナントキメラＢ型肝炎コア（ＨＢｃ）タンパク質分子で構成される免疫原性粒子であって、
    前記リコンビナントキメラＨＢｃタンパク質分子が、約５１５までのアミノ酸残基の長さを有し、残基アミノ酸残基が、
    （ａ）ＨＢｃイムノドミナントループ内に存在するペプチド結合異種エピトープもしくは共役エピトープのための異種リンカー残基を含む前記ＨＢｃ分子のＮ−末端１５０アミノ酸残基の少なくとも１３０残基のＨＢｃ配列、またはＮ−末端１５０ＨＢｃアミノ酸残基の少なくとも約１３５残基の配列を含み、
    （ｂ）前記ＨＢｃ配列のＣ−末端残基から前記分子のＣ−末端に向かって、さらに前記キメラ分子のＣ−末端から約３０残基内に１つから１０のシステイン残基（Ｃ−末端システイン残基）を含み、
    （ｃ）ＨＢｃ１３５位からＨＢｃＣ−末端の少なくとも６つのアミノ酸残基配列を含み、
    前記キメラ分子は、前記ＨＢｃ配列中に１０％未満の保存的置換アミノ酸残基を含み、さらに
    前記粒子は実質的に核酸と結合せず、さらに前記粒子は、前記Ｃ−末端システイン残基を欠くか、またはキメラ分子内に存在するＣ−末端システイン残基が別の残基に置換されてあるがその他の点では同一のＨＢｃキメラから生成される粒子よりも安定であり、さらに、前記キメラのＨＢｃ配列で約２０％未満のアミノ酸残基が置換されてあるアミノ酸残基を有する、前記免疫原性粒子。
  64. 約１．４から約１．６の２８０ｎｍ対２６０ｎｍ吸収比を示す請求項６３に記載の免疫原性粒子。
  65. 前記リコンビナントキメラＨＢｃタンパク質分子の長さが約１７５から約２４０アミノ酸残基である請求項６３に記載の免疫原性粒子。
  66. 前記ペプチド結合異種エピトープまたは共役エピトープのための異種リンカーが、異種エピトープである請求項６３に記載の免疫原性粒子。
  67. 前記異種エピトープがＢ細胞エピトープである、請求項６６に記載の免疫原性粒子。
  68. 前記リコンビナントキメラＨＢｃタンパク質分子の長さが約４３５までのアミノ酸残基である請求項６３に記載の免疫原性粒子。
  69. ＨＢｃのアミノ酸残基１−４の１つとペプチド結合した第二の異種エピトープを含む請求項６３に記載の免疫原性粒子。
  70. 前記Ｂ細胞エピトープが、アミノ酸残基７６から８５の間のＨＢｃ配列内のある位置でペプチド結合されてあり、さらに７６位から８５位のＨＢｃ配列の少なくとも５残基が存在する、請求項６８に記載の免疫原性粒子。
  71. 前記アミノ酸残基７６から８５の間のＨＢｃ配列は存在するが、前記Ｂ細胞エピトープによって中断されている請求項７０に記載の免疫原性粒子。
  72. さらにペプチド結合させた異種Ｔ細胞エピトープを含む、請求項６８に記載の免疫原性粒子。
  73. 前記Ｔ細胞エピトープが、Ｃ−末端のＨＢｃアミノ酸残基とペプチド結合されてある請求項７２に記載の免疫原性粒子。
  74. 前記Ｃ−末端システイン残基が、前記ＨＢｃキメラタンパク質分子のＣ−末端の５アミノ酸残基内に存在する請求項７３に記載の免疫原性粒子。
  75. 前記リコンビナントキメラＨＢｃタンパク質分子が、約１３５から約５１５のアミノ酸残基の長さを有し、さらにＮ−末端からドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶと称される４つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含み、ここで、
    （ａ）ドメインＩは約７１から約１００アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基の配列は少なくともＨＢｃの５位から７５位の残基配列を含み、場合によってＨＢｃ残基１−４の１つとペプチド結合した約３０までのアミノ酸残基を含む異種エピトープを含み；
    （ｂ）ドメインＩＩはドメインＩのＨＢｃ残基７５とペプチド結合した約５から約２５０アミノ酸残基を含み、ここで、（ｉ）ＨＢｃの７６位から８５位の配列中の０から全ての残基がＨＢｃにとって異種である１つから約２４５アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープまたは共役エピトープのための異種リンカー残基を構成するか、または（ｉｉ）７６位から８５位のＨＢｃの配列は異種残基とは結合せずに存在し；
    （ｃ）ドメインＩＩＩはドメインＩＩの残基８５とペプチド結合した８６位から１３５位のＨＢｃ配列であり；さらに、
    （ｄ）ドメインＩＶは、（ｉ）ドメインＩＩＩの１３５位の残基とペプチド結合した１３６位から１４９位のＨＢｃアミノ酸残基配列の０から１４残基、（ｉｉ）キメラ分子のＣ−末端から約３０残基以内に１つから１０のシステイン残基（Ｃ−末端システイン残基）、および（ｉｉｉ）１５０位からＣ−末端のＨＢｃにとって異種である配列内に０から約１００アミノ酸残基を含み、ここで、ドメインＩＶは前記（ｉｉ）の１つから１０のシステイン残基を含む少なくとも６アミノ酸残基を含むことを条件とし、
    前記キメラタンパク質が、ＨＢｃ配列で約１０％未満のアミノ酸残基が置換されてあるアミノ酸残基配列を有する、請求項６３に記載の免疫原性粒子。
  76. ドメインＩＩに共役エピトープのための異種リンカー残基を含み、さらに前記異種リンカー残基と結合したハプテンを含む請求項７５に記載の免疫原性粒子。
  77. 前記ハプテンがＢ細胞免疫原である請求項７６に記載の免疫原性粒子。
  78. 前記リコンビナントキメラＨＢｃタンパク質分子が、約１７５から約２４０のアミノ酸残基を有し、さらにＮ−末端からドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶと称される４つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含み、ここで、
    （ａ）ドメインＩは、ＨＢｃの１位から７５位の残基配列を含み；
    （ｂ）ドメインＩＩは、ドメインＩのＨＢｃ残基７５とペプチド結合した約５から約５５アミノ酸残基を含み、ここで、ＨＢｃの７６位から８５位の配列中の少なくとも４残基が、ＨＢｃにとって異種である６から約５０アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープを構成し；
    （ｃ）ドメインＩＩＩは、ドメインＩＩの残基８５とペプチド結合した８６位から１３５位のＨＢｃ配列であり；さらに、
    （ｄ）ドメインＩＶは、（ｉ）ドメインＩＩＩの１３５位の残基とペプチド結合した１３６位から１４９位のＨＢｃアミノ酸残基配列の５から１４残基、（ｉｉ）キメラ分子のＣ−末端から約３０残基以内に１つから約５つのシステイン残基（Ｃ−末端システイン残基）、および（ｉｉｉ）１５０位からＣ−末端のＨＢｃにとって異種である配列内に０から約５０アミノ酸残基を含み、
    前記粒子が、約１．４から約１．６の２８０ｎｍ対２６０ｎｍ吸収比を示し、さらに前記キメラＨＢｃタンパク質が、ＨＢｃ配列で約５％未満のアミノ酸残基が置換されてあるアミノ酸残基配列を有する請求項６３に記載の免疫原性粒子。
  79. 医薬として許容できる希釈剤に溶解または分散された免疫誘発に有効な量の免疫原性粒子を含むワクチンまたは接種物であって、前記免疫原性粒子が多数のリコンビナントキメラＢ型肝炎コア（ＨＢｃ）タンパク質分子で構成され、ここで、前記リコンビナントキメラＨＢｃタンパク質分子が、約５１５までのアミノ酸残基の長さを有し、前記アミノ酸残基が、
    （ａ）ＨＢｃイムノドミナントループ内に存在するペプチド結合異種エピトープもしくは共役エピトープのための異種リンカー残基を含む前記ＨＢｃ分子のＮ−末端１５０アミノ酸残基の少なくとも約１３０残基の配列、またはＮ−末端１５０ＨＢｃアミノ酸残基の少なくとも約１３５残基の配列を含み、
    （ｂ）前記ＨＢｃ配列のＣ−末端残基から前記分子のＣ−末端に向かって、さらに前記キメラ分子のＣ−末端から約３０残基内に１つから１０のシステイン残基（Ｃ−末端システイン残基）を含み、
    （ｃ）ＨＢｃ１３５位からＨＢｃＣ−末端の少なくとも６つのアミノ酸残基配列を含み、
    前記キメラ分子は、前記ＨＢｃ配列内に２０％未満の保存的置換アミノ酸残基を含み、さらに
    前記粒子は実質的に核酸と結合せず、さらに前記粒子は、前記Ｃ−末端システイン残基を欠くか、またはキメラ分子内に存在するＣ−末端システイン残基が別の残基に置換されてあるがその他の点では同一のＨＢｃキメラから生成される粒子よりも安定である前記ワクチンまたは接種物。
  80. 前記リコンビナントキメラＨＢｃタンパク質分子が、約１３５から約５１５のアミノ酸残基の長さを有し、さらにＮ−末端からドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶと称される４つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含み、ここで、
    （ａ）ドメインＩは、約７１から約１００アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基の配列が少なくともＨＢｃの５位から７５位の残基配列を含み、場合によってＨＢｃ残基１−４の１つとペプチド結合した約３０までのアミノ酸残基を含む異種エピトープを含み；
    （ｂ）ドメインＩＩは、ドメインＩのＨＢｃ残基７５とペプチド結合した約５から約２５０アミノ酸残基を含み、ここで、（ｉ）ＨＢｃの７６位から８５位の配列中の少なくとも４つの残基はＨＢｃにとって異種である１つから約２４５アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープまたは共役エピトープのための異種リンカー残基を構成するか、または（ｉｉ）７６位から８５位のＨＢｃの配列は異種残基とは結合せずに存在し；
    （ｃ）ドメインＩＩＩはドメインＩＩの残基８５とペプチド結合した８６位から１３５位のＨＢｃ配列であり；さらに、
    （ｄ）ドメインＩＶは、（ｉ）ドメインＩＩＩの１３５位の残基とペプチド結合した１３６位から１４９位のＨＢｃアミノ酸残基配列の０から１４残基、（ｉｉ）キメラ分子のＣ−末端から約３０残基以内に１つから１０のシステイン残基（Ｃ−末端システイン残基）、および（ｉｉｉ）１５０位からＣ−末端のＨＢｃにとって異種である配列内に０から約１００アミノ酸残基を含み、ここで、ドメインＩＶは前記（ｉｉ）の１つから１０のシステイン残基を含む少なくとも６つのアミノ酸残基を含むことを条件とし、
    前記リコンビナントキメラＨＢｃタンパク質分子が、前記ＨＢｃ配列で約５％未満のアミノ酸残基が置換されてあるアミノ酸残基配列を有する、請求項７９に記載のワクチンまたは接種物。
  81. ドメインＩＩに共役エピトープのための異種リンカー残基を含み、さらに前記異種リンカー残基に結合したハプテンを含む、請求項８０に記載のワクチンまたは接種物。
  82. 前記リコンビナントキメラＨＢｃタンパク質分子が、約１７５から約２４０のアミノ酸残基の長さを有し、さらにＮ−末端からドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶと称される４つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含み、ここで、
    （ａ）ドメインＩは、ＨＢｃの１位から７５位の残基配列を含み；
    （ｂ）ドメインＩＩは、ドメインＩのＨＢｃ残基７５とペプチド結合した約５から約５５アミノ酸残基を含み、ここで、ＨＢｃの７６位から８５位の配列中の少なくとも４つの残基が、ＨＢｃにとって異種である６から約５０アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープを構成し；
    （ｃ）ドメインＩＩＩは、ドメインＩＩの残基８５とペプチド結合した８６位から１３５位のＨＢｃ配列であり；さらに、
    （ｄ）ドメインＩＶは、（ｉ）ドメインＩＩＩの１３５位の残基とペプチド結合した１３６位から１４９位のＨＢｃアミノ酸残基配列の５から１４の残基、および（ｉｉ）１５０位からＣ−末端のＨＢｃにとって異種である配列内に０から約５０アミノ酸残基を含み、
    前記粒子が、約１．４から約１．６の２８０ｎｍ対２６０ｎｍ吸収比を示す、請求項７９に記載のワクチンまたは接種物。
  83. 非経口投与用に適用させた請求項７９に記載のワクチンまたは接種物。
  84. 粘膜免疫用に適用させた請求項７９に記載のワクチンまたは接種物。
  85. 前記リコンビナントキメラＨＢｃタンパク質分子粒子が、腸チフス菌（S. typhi）、ネズミチフス菌（S. typhimurium）またはネズミチフス菌−大腸菌ハイブリッドの弱毒株に存在する、請求項７９に記載のワクチンまたは接種物。
  86. 前記リコンビナントキメラＨＢｃタンパク質分子粒子が植物組織に存在する、請求項７９に記載のワクチンまたは接種物。
  87. さらにアジュバントを含む請求項７９に記載のワクチンまたは接種物。
  88. 前記アジュバントがミョウバンである請求項８７に記載のワクチンまたは接種物。
  89. 前記アジュバントが、ムラミルジペプチド、７−置換−８−オキソ−もしくは８−スルホ−グアノシン誘導体、モノホスホリル脂質Ａ、アルミニウムもしくはカルシウム塩から成る群から選択される小分子である、請求項８７に記載のワクチンまたは接種物。
  90. 前記アジュバントが、前記免疫原性粒子および前記医薬として許容できる希釈剤とともに乳化される油である、請求項８７に記載のワクチンまたは接種物。
  91. 前記乳剤が水相および油相を有する油中水である、請求項９０に記載のワクチンまたは接種物。
  92. 前記乳剤が水相および油相を有する水中油である、請求項９０に記載のワクチンまたは接種物。
  93. 前記乳剤の油相がスクァレンを含む、請求項９２に記載のワクチンまたは接種物。
  94. 前記乳剤の油相がスクァレンを含む、請求項９２に記載のワクチンまたは接種物。
  95. 前記乳剤の水相および油相が、ソルビタンまたはマンニッドＣ12−Ｃ24脂肪酸エステルである乳化剤によって乳化される、請求項９０に記載のワクチンまたは接種物。
  96. 前記乳化剤がマンニッドＣ12−Ｃ24脂肪酸エステルである、請求項９５に記載のワクチンまたは接種物。
  97. 前記マンニッドＣ12−Ｃ24脂肪酸エステルの前記Ｃ12−Ｃ24脂肪酸がオレイン酸である、請求項９６に記載のワクチンまたは接種物。
  98. 請求項１に記載のリコンビナントＨＢｃタンパク質分子をコードする核酸、またはその変種、類似体もしくは相補物。
  99. 請求項１８に記載のリコンビナントＨＢｃタンパク質分子をコードする核酸、またはその変種、類似体もしくは相補物。
  100. 請求項４２に記載のリコンビナントＨＢｃタンパク質分子をコードする核酸、またはその変種、類似体もしくは相補物。
  101. 請求項１に記載のリコンビナントＨＢｃタンパク質分子をコードする遺伝子を規定する核酸セグメント、またはその変種、類似体もしくは相補物に機能できるように連結されたベクター、および適合ホスト生物中で前記遺伝子の発現を駆動させるために適したプロモーターを含むリコンビナント核酸分子。
  102. 請求項１８に記載のリコンビナントＨＢｃタンパク質分子をコードする遺伝子を規定する核酸セグメント、またはその変種、類似体もしくは相補物に機能できるように連結されたベクター、および適合ホスト生物中で前記遺伝子の発現を駆動させるために適したプロモーターを含むリコンビナント核酸分子。
  103. 請求項４２に記載のリコンビナントＨＢｃタンパク質分子をコードする遺伝子を規定する核酸セグメント、またはその変種、類似体もしくは相補物に機能できるように連結されたベクター、および適合ホスト生物中で前記遺伝子の発現を駆動させるために適したプロモーターを含むリコンビナント核酸分子。
  104. 請求項１０１に記載のリコンビナント核酸分子で形質転換されたホスト細胞。
  105. 前記ホスト細胞が、ＣＨＯ、ＶＥＲＯもしくはＣＯＳ細胞、大腸菌、ビール酵母菌、ピキア・パストリス・ティフィー（Pichia pastoris typhi）、ネズミチフス菌およびネズミチフス菌−大腸菌ハイブリッドから成る群から選択される、請求項１０４に記載の形質転換ホスト細胞。
  106. 請求項１０２に記載のリコンビナント核酸分子で形質転換されたホスト細胞。
  107. 前記ホスト細胞が、ＣＨＯ、ＶＥＲＯもしくはＣＯＳ細胞、大腸菌、ビール酵母菌、ピキア・パストリス・ティフィー（Pichia pastoris typhi）、ネズミチフス菌およびネズミチフス菌−大腸菌ハイブリッドから成る群から選択される、請求項１０６に記載の形質転換ホスト細胞。
  108. 請求項１０２に記載のリコンビナント核酸分子で形質転換されたホスト細胞。
  109. 前記ホスト細胞が、ＣＨＯ、ＶＥＲＯもしくはＣＯＳ細胞、大腸菌、ビール酵母菌、ピキア・パストリス・ティフィー（Pichia pastoris typhi）、ネズミチフス菌およびネズミチフス菌−大腸菌ハイブリッドから成る群から選択される、請求項１０８に記載の形質転換ホスト細胞。
  110. 請求項７９に記載のワクチンまたは接種物をホスト動物に接種し、さらに前記接種動物が免疫反応を発達させるために十分な期間前記動物を維持する工程を含む、接種ホスト動物で免疫反応を誘発する方法。
  111. 請求項８０に記載のワクチンまたは接種物をホスト動物に接種し、さらに前記接種動物が免疫反応を発達させるために十分な期間前記動物を維持する工程を含む、接種ホスト動物で免疫反応を誘発する方法。
  112. 請求項８２に記載のワクチンまたは接種物をホスト動物に接種し、さらに前記接種動物が免疫反応を発達させるために十分な期間前記動物を維持する工程を含む、接種ホスト動物で免疫反応を誘発する方法。
  113. 請求項８７に記載のワクチンまたは接種物をホスト動物に接種し、さらに前記接種動物が免疫反応を発達させるために十分な期間前記動物を維持する工程を含む、接種ホスト動物で免疫反応を誘発する方法。
  114. 請求項８８に記載のワクチンまたは接種物をホスト動物に接種し、さらに前記接種動物が免疫反応を発達させるために十分な期間前記動物を維持する工程を含む、接種ホスト動物で免疫反応を誘発する方法。
  115. 請求項９２に記載のワクチンまたは接種物をホスト動物に接種し、さらに前記接種動物が免疫反応を発達させるために十分な期間前記動物を維持する工程を含む、接種ホスト動物で免疫反応を誘発する方法。
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