KR20030084887A - 안정성이 증강된 면역원성 ＨＢｃ 키머 입자 - Google Patents

안정성이 증강된 면역원성 ＨＢｃ 키머 입자 Download PDF

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Abstract

본원에는 자기-어셈블리된 입자의 안정성 증강과 면역원성 에피토프의 표시를 위해 공학적으로 처리시킨, 카복시-말단 절단된 키머 B형 간염 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질(HBc)이 기재되어 있다. 상기 면역원성 에피토프의 표시는 HBc의 면역원성 루프에서 표시되는 반면, 자기-어셈블리된 입자의 안정성 증강은, 상기 키머 분자의 카복시-말단 근처에 하나 이상의 이종 시스테인 잔기가 존재함으로써 획득된다. 이러한 키머의 제조 및 사용 방법이 또한 기재되어 있다.

Description

안정성이 증강된 면역원성 ＨＢｃ 키머 입자{Immunogenic HBc chimer particles having enhanced stability}
헤파드나비리대(hepadnaviridae) 과는 사람에게서 B형 간염을 유발시킬 수 있는 포막된(enveloped) DNA-함유 동물 바이러스(HBV)이다. 이러한 헤파드나비리대 과에는 기타 포유류(예: 우드척(woodchuck; WHV), 들다람쥐(GSHV))의 B형 간염 바이러스, 및 오리(DHV) 및 백로(HeHV)에서 발견되는 조류 바이러스가 포함된다. 본원에서 사용된 B형 간염 바이러스(HBV)는 달리 구체적인 예가 제시되지 않는 다면, 헤파드나비리대 과의 구성원을 지칭한다.
포유류 B형 간염 바이러스(HBV 또는 헤파드나바이러스)의 뉴클레오캡시드 또는 코어는 바이러스 아유형에 따라서 183 또는 185개 아미노산 잔기 서열을 함유하는 반면, 오리 바이러스 캡시드는 262개 아미노산 잔기를 함유한다. 몇몇 헤파드나비리대의 B형 간염 코어 단백질 단량체는 감염된 세포에서, B형 간염 코어 단백질 입자(HBc 입자)로서 공지된 안정한 응집체 내로 자기-어셈블리된다. 2가지의 3차원적 구조물이 HBc 입자에 대해 보고되었다. 소수 집단을 차지하는 첫 번째 것은 이량체로서 HBc 소단위체 단백질의 90개 복사물을 함유하거나 180개의 개별적인 단량체성 단백질을 함유하고; 주 집단을 차지하는 두 번째 것은 이량체로서 HBc 소단위체 단백질의 120개 복사물을 함유하거나 240개의 개별적인 단량체성 단백질을 함유한다. 이들 입자는 각각 T=4 또는 T=3 입자로서 지칭되는데, 여기서 "T"는 삼각 측량수(triangulation number)이다. 사람 감염성 바이러스(사람 바이러스)의 이들 HBc 입자는 직경이 각각 약 30 또는 34nm이다[참조: Pumpens et al. (1995) Intervirology, 38:63-74; and Metzger et al. (1998) J. Gen. Viol., 79:587-590].
문헌[참조: Conway et al., (1997) Nature, 386:91-94]에는 저온-전자 현미경으로부터 결정된 바와 같이, 9Å 해상능에서의 사람 HBc 입자의 구조가 기재되어 있다. 문헌[참조: Bottcher et al. (1997), Nature, 386:88-91]에는 사람 HBc 단량체에 대한 폴리펩티드 폴딩이 기재되어 있고, 이에는 알파-나선상 영역과 이들의 연결성 루프 영역이 형성되는 아미노산 잔기에 대한 대략적인 넘버링 도식이 제공되어 있다. 문헌[참조: Zheng et al. (1992), J. Biol. Chem., 267(13):9422-9429]에는 코어 입자 형성이, 하나 이상의 시스테인이 결여된 돌연변이체 단백질에 관한 연구와 C-말단-절단된 단백질에 관한 기타 연구 결과[참조: Birnbaum et al.,(1990) J. Virol. 64, 3319-3330]에 근거하여, 디설파이드 결합 형성, 핵산 결합, 또는 아르기닌 풍부한 C-말단 도메인에 좌우되지 않는다고 보고되어 있다.
B형 간염 뉴클레오캡시드 또는 바이러스 코어 단백질(HBc)은 면역된 숙주 동물의 T 세포 반응을 자극하는 면역원성 수송체로서 보고된 바 있다[참조: 미국 특허 제4,818,527호, 제4,882,145호 및 제5,143,726호]. 특히 유용한 상기 수송체의 적용 특성은, 해당 단백질의 아미노 말단(N-말단)으로부터 대략 잔기 위치 70 내지 90, 보다 통상적으로는 약 위치 75 내지 85로 언급되는 잔기에 존재하는 면역우성(immunodominant) 루프의 부위에 외래 또는 이종 B 세포 에피토프를 제시하는 상기 수송체의 능력이다[참조: Clarke et al. (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp.313-318].
바이러스 복제 동안, HBV 뉴클레오캡시드는 바이러스성 RNA 프리-게놈(pre-genome), 바이러스성 역전사효소(Pol) 및 말단 단백질(Pol로부터 유도됨)과 연합하여 복제 적격(competent) 코어를 형성한다. 상기 뉴클레오캡시드와 바이러스성 RNA 프리-게놈과의 연합은 카복실 말단(C-말단)에서의 아르기닌-풍부한 도메인에 의해 매개된다. 이종 발현 시스템, 예를 들면, 바이러스성 RNA 프리-게놈이 존재하지 않는 이. 콜라이(E. coli)에서 발현되는 경우에는, 프로타민-유사 C-말단, 즉 위치 150 내지 183에서의 잔기가 이. 콜라이 RNA와 결합될 수 있다[참조: Zhang et al. (1992) JBC, 267(13) 9422-29].
백신 수송체 잔기로서 적용하는 경우에는, HBV 뉴클레오캡시드가 해당 숙주로부터 유도된 핵산과 결합하지 않는 것이 바람직하다. 문헌[참조: Birnbaum et al. (1990) J. Virol., 64:3319-3330]에는 HBV 뉴클레오캡시드의 프로타민-유사 C-말단 도메인이, 바이러스-유사 입자 내로 어셈블리시키는 상기 단백질의 능력을 간섭하지 않으면서 결실될 수 있다는 사실이 보고되었다. 따라서, 약 위치 144에서 절단된 단백질, 즉 위치 1에서부터 약 144까지의 HBc 서열을 함유하는 단백질은 자기-어셈블리할 수 있는 반면, 잔기 139를 벗어나는 결실물은 캡시드 어셈블리를 상실한다고 보고되어 있다[참조: F. Birnbaum & M. Nassal (1990) J. Virol., 64:3319-3330].
문헌[참조: Zlotnick et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:9556-9561]에는 완전한 길이의 HBc 단백질과 절단된 HBc 단백질의 입자 내로의 어셈블리에 관한 연구가 기재되어 있다. 완전한 길이의 분자에 관한 논의 이외에도, 상기 문헌의 저자는 위치 1에서부터 149까지의 HBc 서열[여기서, 위치 48, 61 및 107에서의 시스테인이 각각 알라닌으로 대체되고 하나의 시스테인 잔기가 C-말단(위치 150)에 부가된다]을 함유하는 절단된 단백질의 제조 방법에 관해 보고하였다. 이러한 C-말단 머캅탄은 전자 현미경에서의 표지화를 위해 금 원자 클러스터(cluster)에 연결하기 위해 사용된다.
보다 최근에, 문헌[참조: Metzger et al. (1998) J. Gen. Viol., 79:587-590]에는 사람 바이러스 서열의 위치 138의 프롤린(Pro-138 또는 P138)이 입자 형성에 요구된다고 보고되었다. 상기 저자는 또한, 카복시 말단에서 142 및 140 잔기 길이로 절단된 입자의 어셈블리 능력이 영향을 미친다고 보고하였는데, 이러한어셈블리 능력은 139 내지 137 잔기 길이를 가져다 주는 절단에 의해서는 완전히 상실된다.
몇몇 그룹을 대상으로 한 연구에서는, 절단된 입자가 표준 B형 간염 코어 입자에 비해 저하된 안정성을 나타내는 것으로 밝혀졌는데[참조: Galena et al. (1989) J. Virol., 63:4645-4652; Inada, et al. (1989) Virus Res., 14:27-48], 이는 정제된 제제 내에서의 입자 단편의 존재 여부와 입자 크기의 가변성으로써 명백히 알 수 있다[참조: Maassen et al., (1994) Arch. Virol., 135:131-142]. 따라서, 상기 메츠거(Metzger) 등의 보고서가 발표되기 이전의 문헌[참조: Pumpens et al. (1995) Intervirology, 38:63-74]에는 자기-어셈블리에 요구되는 HBc 서열에 대한 카복시 말단 경계가 아미노산 잔기 139 내지 144에 위치하고, 첫 번째 2개 또는 3개의 아미노 말단 잔기가 다른 서열로써 대체될 수 있지만, 4개 또는 11개 아미노 말단 잔기를 없애면, 형질전환된 이. 콜라이 세포 내의 키머 단백질이 완전히 소멸되는 결과가 초래된다고 보고되었다. 문헌[참조: Neirynck et al., (October 1999) Nature Med., 5(10):1157-1163]에는 잔기 5에서 HBc와 융합된 인플루엔자 M2 단백질의 N-말단 24-잔기 부분을 함유하는 HBc 키머의 이. 콜라이 발현시 입자 형성이 이루어졌다고 보고되었다.
각종의 삽입된 폴리펩티드 서열을 함유하는 내부 삽입물을 보유하는 재조합적으로 생성된 하이브리드 HBc 입자(당해 분야에서는 HBc 키머 입자 또는 HBc 키머로서 지칭됨)가, 이. 콜라이, 비. 서브틸리스(B. subtilis), 백시니아(Vaccinia), 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 삭카로마이세스세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 포함한 광범위한 유기체에서의 이종 발현에 의해 제조되었다[참조: 예를 들면, Pumpens et al. (1995) Intervirology, 38:63-74, 및 몇몇 조사 그룹 연구 결과를 나타내는 인용문헌].
상기 펌펜스(Pumpens) 등의 보고서에는 상기 삽입된 폴리펩티드 서열이 N-말단, C-말단 및 상기 말단들 사이에 존재하는 입자-형성 키머가 열거되어 있다. 상기 문헌에 보고된 삽입물 길이는 N-말단에서 24 내지 50 잔기, 내부적으로 7 내지 43 잔기, 및 C-말단에서 11 내지 741 잔기이다.
최근, 문헌[참조: Kratz et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96:1915-1920]에는 238-잔기 그린 형광성 단백질(GFP)과 내부적으로 융합된 절단된 HBc 서열로 구성된 키머 HBc 입자의 이. 콜라이 발현이 기재되어 있다. 이러한 키머는 HBc의 아미노산 잔기 79 및 80을 대체하는 한 쌍의 글리신 풍부한 가요성 링커 암(arm)에 의해 플랭킹된 상기 삽입된 GFP 서열을 함유하고 있다. 상기 입자는 숙주 동물로서 래빗트 내의 본래의 GFP에 대한 항체를 효율적으로 유도시키는 것으로 언급된다.
미국 특허 제5,990,085호에는 (i) 잔기 78과 79 사이의 면역원성 루프와 융합되고 (ii) 카복시 말단 절단된 HBc의 잔기 144 다음과 융합된 항원성 소의 인히빈(inhibin) 펩티드로부터 형성된 2가지 융합 단백질이 기재되어 있다. 발현된 융합 단백질은 숙주 동물 내에 투여되는 경우에 항-인히빈 항체의 생성을 유도시키는 것으로 언급되어 있다. 상기 특허에 보고된, 면역시킨지 30일 후의 역가는 비교적 낮은데, 루프 삽입물을 갖는 융합 단백질의 경우에는 1:3000 내지 15,000이고 잔기144 다음의 삽입물의 경우에는 1:100 내지 125이다.
내부 삽입물을 보유하고 있는 키머 B형 간염 코어 입자는, 전자 현미경으로 분석해 보면, 이종 에피토프가 결여된 입자와 비교해서 덜 정리된 구조를 지니는 것으로 종종 여겨진다[참조: Schodel et al. (1994) J. Exp. Med., 180:1037-1046]. 몇몇 경우에는, 이종 에피토프를 C-말단을 절단한 HBc 입자 내로 삽입하면, 상당한 탈안정화 효과가 야기되어 하이브리드 입자를 이종 발현 후에 회수할 수 없었다[참조: Schodel et al. (1994) Infect. Immunol., 62:1669-1676]. 따라서, 많은 키머 HBc 입자는 너무 불안정하여, 이들을 회수할 수 없거나 또는 극히 낮은 안정성 특징을 나타내어 백신 개발에 문제가 될 정도로 상기 입자가 정제 동안 붕괴된다.
완전한 길이의 HBc 입자의 핵산 결합 능력은 없애면서도, 완전한 길이의 HBc 입자의 안정성을 보존시킬 수 있는 구조상의 특징이, 헤파드나바이러스성 뉴클레오캡시드 전이 시스템을 사용한 백신 개발에 상당히 유리할 것이다. 실제로, 외래 에피토프에 대한 수송체로서의 HBc 키머의 용도에 관한 최근의 연구 결과[참조: Ulrich et al., Adv. Virus Res., vol. 50(1998) Academic Press pages 141-182]는, 이들 키머를 사람 백신에 사용하기 위해서는 해결해야 할 3가지 잠재적인 문제점이 있다고 지적하고 있다. 첫 번째 잠재적인 문제점은 키머 백신 내의 핵산이 면역 숙주에게 우연히 전이되는 것이다. 두 번째 잠재적인 문제점은 HBc에 대한 선재(preexisting) 면역으로부터의 간섭이다. 세 번째 잠재적인 문제점은 장기간 저장에 견딜 수 있는 본래의 키머 입자를 재현가능한 수준으로 제조할 수 있어야한다는 것이다.
다음에 논의되는 바와 같이, 본 발명은 HBc 키머 안정성에 관한 문제점을 해결하기 위한 한 가지 해결책을 제공할 뿐만 아니라 강력하게 면역원성인 물질을 제공하면서도, 해당 작제물의 핵산 결합 능력은 실질적으로 존재하지 않게 한다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 재조합 헤파드나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질; 즉, 숙주 세포에서의 발현 후에 입자 내로 자기-어셈블리되는 B형 간염 코어(HBc) 키머 단백질[또는 키머 B형 간염 코어 단백질 분자 또는 HBc 키머 분자, 또는 간단히 키머]을 고려한다. 이러한 키머 단백질은 (i) N-말단, HBc 면역원성 루프 또는 C-말단에 하나 이상의 면역원성 에피토프를 표시하거나 또는 (ii) 상기 면역원성 루프 내의 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기를 가지며, 해당 입자에 증강된 안정성을 부여해 주는 C-말단 또는 C-말단 근처에 시스테인 잔기를 함유한다. 상기 키머 단백질에는 아르기닌 잔기가 충분한 수준으로 존재하지 않기 때문에, 자기-어셈블리된 입자는 핵산과 실질적으로 결합하지 않는다.
본 발명은 또한, 재조합 B형 간염 코어(HBc) 키머 단백질 분자로 구성된 면역원성 입자를 고려한다. 이러한 키머 단백질은 (i) N-말단, HBc 면역원성 루프 또는 C-말단에 하나 이상의 면역원성 에피토프를 표시하거나 또는 (ii) 상기 HBc 면역원성 루프 내의 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기를 갖는다. 상기 재조합 단백질은 C-말단 또는 C-말단 근처에 시스테인 잔기를 함유한다. 상기 입자는시스테인 잔기가 없으며 그 밖에는 동일한 단백질로 구성된 입자에 비해 안정성이 증강되고 핵산과 실질적으로 결합하지 않는다.
본 발명의 한 양태는,
(a) (i) 공유적으로 연결된 펩티드-결합된 이종 에피토프 또는 HBc 면역우성 루프에 존재하는 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기를 포함한 HBc 분자의 N-말단 150 아미노산 잔기의 약 130개 이상의 서열, 또는 (ii) N-말단 150 HBc 아미노산 잔기의 약 135개 이상의 잔기 서열을 함유하고,
(b) HBc 서열의 C-말단 잔기로부터 상기 분자의 C-말단을 향하고 있고 키머 분자의 C-말단으로부터 약 30 잔기 내에 존재하는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)]를 함유하며,
(c) HBc 잔기 위치 135에서부터 HBc C-말단까지의 5개 이상의 아미노산 잔기 서열을 함유하는, 길이가 약 515개 이하의 아미노산 잔기인 재조합 키머 B형 간염 코어(HBc) 단백질 분자를 고려한다.
상기 고려된 키머 분자는, (i) HBc 서열 내의 20% 이하의 치환된 아미노산 잔기를 함유하고, (ii) 숙주 세포에서의 발현시, 핵산과 실질적으로 결합하지 않는 입자 내로 자기-어셈블리된다. 이들 입자는 핵산과 실질적으로 결합하지 않고, 상기 C-말단 시스테인 잔기(들)가 결여되고 그 밖에는 동일한 HBc 키머로부터 형성된 입자 보다 더 안정적이거나, 또는 하나의 C-말단 시스테인 잔기가 상기 키머에 존재하고 이것이 상기 분자 내에서 알라닌 잔기 등의 또 다른 잔기로 대체된 경우 보다 더 안정적이다.
이러한 양태의 한 국면에서 고려된 HBc 키머는 약 135 내지 약 515 아미노산 잔기 서열을 가지며, 도메인 I, II, III 및 IV로 명명된 4가지 일련의 펩티드-연결된 도메인을 함유한다. N-말단으로부터, 도메인 I은 약 71 내지 약 100개 아미노산 잔기를 포함하는데, 이의 서열에는 적어도 HBc의 대략 위치 5에서부터 위치 75까지의 잔기 서열이 포함되고, HBc 잔기 1 내지 4 중의 하나와 펩티드-결합된 약 30개 이하의 아미노산 잔기를 함유하는 이종 에피토프가 포함된다. 도메인 II는 도메인 I의 HBc 잔기 75와 펩티드-결합된 5 내지 약 250개 아미노산 잔기를 포함하는데, 여기서 (i) HBc 위치 76 내지 85의 서열 내의 0 내지 전부, 바람직하게는 4개 이상의 잔기는, HBc와 이종(외래)인 1 내지 약 245개 아미노산 잔기와 펩티드-결합되고; 상기 잔기가 이종 에피토프, 예를 들면, B 세포 에피토프, 또는 특정 에피토프, 예를 들면, B 세포 에피토프에 대한 이종 링커 잔기를 구성하거나; 또는 (ii) 위치 75 내지 85에서의 HBc 서열에는 이종 잔기가 전혀 존재하지 않는다. 도메인 III은 도메인 II의 잔기 85와 펩티드-결합된 위치 86에서부터 위치 135까지의 HBc 서열이다. 도메인 IV는 (i) 도메인 III의 위치 135의 잔기와 펩티드-결합된 위치 136에서부터 149까지의 HBc 아미노산 잔기 서열의 0 내지 14개 잔기; (ii) 상기 HBc 서열과 C-말단 결합된 1 내지 10개, 가장 바람직하게는 1 내지 3개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)]; 및 (iii) 위치 150에서부터 C-말단까지의 HBc와 이종인 서열 내의 0 내지 약 100, 보다 바람직하게는 0 내지 약 50, 가장 바람직하게는 약 25개 아미노산 잔기를 포함하는데, 단 도메인 IV는 상기 (ii)의 1 내지 10개 시스테인 잔기를 포함한 6개 이상의 아미노산 잔기를 함유한다.
고려된 재조합 키머 단백질은 핵산과 실질적으로 결합하지 않는 입자를 형성하고; 동일하긴 하지만, 어떠한 시스테인 잔기도 결여되어 있거나 또는 하나의 시스테인 잔기가 알라닌 등의 또 다른 잔기로 대체되는 도메인 IV 서열, 및 상기 동일한 펩티드-연결된 도메인 I, II 및 III 서열을 함유하는 HBc 키머로부터 형성된 입자 보다 더 안정적이다. 키머 분자가 입자로 어셈블리되는 경우, 이들 입자는 280nm 내지 260nm에서의 흡광도 비(280/260 흡광도 비)가 약 1.2 내지 약 1.7이다. 형성된 입자는 240 단량체성 HBc 키머 또는 120 이량체 HBc 키머를 함유하는 T=4 구조물인 것으로 여겨진다.
보다 광범위하게, 고려된 키머 입자는 면역우성 루프 내의 에피토프에 대한 이종 링커 잔기 또는 이종 에피토프, 또는 중단되지 않은 면역우성 루프, 및 상기 면역우성 루프의 아미노산 잔기 서열에 상관없이, HBc 서열과 이종인 1 내지 3개의 C-말단 시스테인 잔기를 함유하는, C-말단 절단된 HBc 단백질(적어도 잔기 149까지 절단됨)을 포함한다. 이러한 입자는 280/260 흡광도 비가 약 1.2 내지 약 1.7이고; 상기 C-말단 시스테인 잔기(들)가 결여되고 그 밖에는 동일한 키머로부터 형성된 입자 보다 더 안정적이거나 또는 단일 C-말단 시스테인 잔기가 키머 내에 존재하고 이것이 또 다른 잔기로 대체된 경우 보다 더 안정적이다.
또 다른 양태는 전형적으로 물을 함유하기도 하는 약제학적으로 허용되는 희석제 조성물에 용해 또는 분산되는, 상기 HBc 키머 입자와 합텐과의 접합체 또는 상기 HBc 키머 입자를 포함하는 접종원(inoculum) 또는 백신을 포함한다. 면역원성 유효량으로 동물(예: 포유류 또는 조류)에게 투여되는 경우, 접종원은 (i) 상기키머 입자 또는 상기 접합된(펜던트-연결된) 합텐과 특이적으로 면역반응되는 항체를 유도시키거나, (ii) T 세포를 활성화시키거나, 또는 (iii) 이들 둘 다를 수행한다. 이로써 유도된 항체는 또한 바람직하게는, 상기 합텐을 함유하는 항원, 예를 들면, 합텐이 펩티드인 단백질 또는 합텐이 올리고삭카라이드인 삭카라이드와 특이적으로 면역반응된다(이와 결합된다).
본 발명은 몇 가지 이점과 장점을 지니고 있다.
본 발명의 하나의 이점은 수성 조성물에서의 저장시, 어떠한 C-말단 시스테인 잔기도 결여된 유사한 서열의 입자 보다 더 안정적인 키머 HBc 입자가 형성된다는 것이다.
본 발명의 장점은 본래의 HBc 입자의 핵산 결합 능력을 나타내지 않으면서, 본래 HBc 입자의 자기-어셈블리 특징을 나타내는 키머 분자가 제조된다는 것이다.
본 발명의 또 다른 이점은 탁월한 B 세포 및 T 세포 면역원성을 나타내는 키머 입자가 형성된다는 것이다.
또 다른 장점은 본 발명의 키머 입자가 전형적으로, C-말단 시스테인 잔기가 결여된 유사한 입자 보다 고수율로 제조된다는 것이다.
본 발명의 추가의 이점은 C-말단 시스테인 잔기가 결여된 유사한 접합체 보다 종종 훨씬 더 면역원성인 키머 입자가 형성된다는 것이다.
추가의 장점은 하나 이상의 C-말단 시스테인 잔기를 함유하는 키머 분자로부터 어셈블리된 입자의 면역원성이, 하나 이상의 C-말단 시스테인 잔기가 결여된 키머 분자로부터 어셈블리된 유사한 입자와 비교해서 증강된다는 것이다.
추가의 이점 및 장점은 후술되는 본 명세서 내용으로부터 당업자에게는 명백할 것이다.
본 발명은 면역학 분야와 단백질 공학 분야의 공통 부분에 관한 것이고, 특히 자기-어셈블리된 입자의 안정성 증강과 면역원성 에피토프의 표시를 위해 공학적으로 처리시킨 키머(chimer) B형 간염 바이러스(HBV) 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 단백질에 관한 것이다.
본 명세서의 일부를 형성하는 도면에서,
도 1은 몇몇 재조합 HBc 키머를 제조하기 위해 본원에서 사용된 플라스미드 벡터 pKK223-3N을 제조하는데 있어서 시판용 플라스미드 벡터 pKK223-3에 대해 이루어진 변형을 도시한 것이다. 이와 같이 변형된 서열(서열 번호 285)은 시판용 벡터의 서열(서열 번호 286) 아래에 제시된다. 부가된 NcoI 부위의 염기가 소문자로 제시되어 있으며, 부가된 염기 모두는 이중으로 밑줄쳐져 있는 반면, 결실된 염기는 대쉬(-)로 제시된다. 상기 서열의 세그먼트에 존재하는 2개의 제한 부위(NcoI 및 HindIII)가 표시된다.
도 2A, 2B 및 2C로서 3개의 패널로 제시된 도 2는 말라리아성 B 세포 에피토프, 예를 들면, (NANP)4(서열 번호 1)를 위치 78과 79 사이에 존재하는, 공학적으로 처리된 HBc 유전자의 EcoRI 부위 및 SacI 부위 내로 클로닝시켜, SacI 부위는 보존시키면서 EcoRI 부위를 파괴시키기 위한 바람직한 클로닝 전략을 도식적으로 제시하고 있다. 도 2B에는 첫 번째 149 HBc 잔기(HBc149)를 함유하는 공학적으로 처리되고 절단된 HBc 유전자의 C-말단에서 EcoRI 부위와 HindIII 부위 내로 클로닝된 정지 코돈(서열 번호 120) 및 Pf/CS-UTC로서 지칭된 것과 같은 T 세포 에피토프를암호화하는 DNA가 제시되어 있다. 도 2A의 작제물과 증폭된 서열을 잔기 위치 79에서 SacI로 분해시킨 다음 적당한 부분을 연결함으로써 시작하여, HBc-암호화 서열에 인접한 5'-말단 SacI 제한 부위를 갖는 프라이머를 사용하여 도 2B의 작제물을 증폭시켜, 피. 팔시파룸(P. falciparum)에 대한 백신용 면역원의 B 세포- 및 T 세포-함유 에피토프를 암호화하는 V12로서 후술되는 단일 유전자 작제물을 형성시키는 단계가 도 2C에 제시되어 있다.
도 3은 위치 78의 아미노산과 79의 아미노산 사이에 삽입된 (NANP)4를 함유하기도 하는 키머 내의 HBc의 종결 코돈과 C-말단 코돈(V149) 사이에 동일 프레임 하에 삽입된 단일 시스테인 잔기에 대한 코돈의 발현된 입자(V2.Pf1+C)에 대한 안정화 효과, 및 이의 C-말단이 0일 및 37℃에서 15일 후 잔기 V149인 유사한 작제물(V2.Pf1)에 대한 안정화 효과를 제시하기 위한, 환원성 조건 하에서의 SDS-PAGE 분석 사진이다. [레인 1, V2.Pf1 - 0일; 레인 2, V2.Pf1 - 37℃에서 15일; 레인 3, V2.Pf1+C - 0일; 레인 4, V2.Pf1+C - 37℃에서 15일].
도 4는 0일 및 37℃에서 28일 후, 위치 78의 아미노산과 79의 아미노산 사이에 삽입된 (NANP)4를 함유하기도 하는 키머 HBc149 입자에 대한 안정화 효과, 및 C-말단과 융합된 시스테인-함유 T 세포 에피토프[V2.Pf1+Pf/CS-UTC; 또한, V12.Pf1로서 지칭됨]에 대한 안정화 효과를 C-말단 Cys가 Ala 잔기로 대체된 유사한 입자[V2.Pf1+Pf/CS-UTC(C17A); 또한, V12.Pf1(C17A)로서 지칭됨]와 비교해서 도시하는, 환원성 조건 하에서의 SDS-PAGE 분석 사진이다. [레인 1, V2.Pf1+Pf/CS-UTC- 0일; 레인 2, V2.Pf1+Pf/CS-UTC - 37℃에서 28일; 레인 3, V2.Pf1+Pf/CS-UTC(C17A) - 0일; 레인 4, V2.Pf1+Pf/CS-UTC(C17A) - 37℃에서 28일].
도 5는 마우스에서 면역 후 3개의 키머 면역원을 대상으로 하여, 시간(주)에 따른(가로좌표) 결합된 항체 역가(1/희석도의 log; 세로좌표)를 탐지하기 위해 글루타르알데히드-고정된 피. 팔시파룸 포자소체 및 FITC-표지된 항-마우스 IgG(감마-쇄 특이적)를 사용하여 수행된 간접 면역형광 검정(IFA) 결과를 도시한 그래프이다. 선행 기술 키머 면역원 CS-2에 대한 데이터는 사각형으로 도시되고, 재조합 HBc 키머 V12.Pf1에 대한 데이터는 다이아몬드로 도시되는 반면, 재조합 HBc 키머 V12.Pf3.1에 대한 데이터는 삼각형으로 도시된다.
도 6은 (I) 설포-석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산 1-카복실레이트(설포-SMCC)를 사용하여 합텐을 키머 B형 간염 코어 단백질(sm-HBc) 입자에 펜던트하게 연결하기 위한 활성화 수송체를 형성한 다음, (II) 설프하이드릴-말단화(시스테인-말단화) 합텐을 상기 활성화 수송체에 연결하여 접합체 입자를 형성하는 2가지 반응 순서를 도시한 반응식(반응식 1)이 제시되어 있다. 상기 sm-HBc 입자는 단일 펜던트 아미노 그룹을 갖는 박스(명확하게 도시하기 위함)로서 도시되는 반면, 설프하이드릴-말단화 합텐은 SH 그룹으로 종결된 라인으로 도시된다.
도 7은 도 7A 및 7B로서 2개의 패널로 도시되고, 이는 6가지 바이러스로부터의 포유류 HBc 단백질에 대한 6가지 공개된 아미노산 잔기 서열 정렬을 제공해준다. 첫 번째(서열 번호 247) 사람 바이러스 서열은ayw아유형의 것이고, 이는 문헌[참조: Galibert et al. (1983) Nature, 281:646-650]에 공개되어 있으며; 두 번째 사람 바이러스 서열(서열 번호 248)은adw아유형의 것이고, 이는 문헌[참조: Ono et al. (1983) Nucleic Acids Res., 11(6):1747-1757]에 공개되어 있으며; 세 번째 사람 바이러스 서열(서열 번호 249)은adw2아유형의 것이고, 이는 문헌[참조: Valenzuela et al., Animal Virus Genetics, Field et al. eds., Academic Press, New York (1980) pages 57-70]에 공개되어 있으며; 네 번째 사람 바이러스 서열(서열 번호 250)은adyw아유형의 것이고, 이는 문헌[참조: Pasek et al. (1979) Nature, 282:575-579]에 공개되어 있으며; 다섯 번째 서열(서열 번호 251)은 우드척 바이러스의 것이고, 이는 문헌[참조: Galibert et al. (1982) J. Virol., 41:51-65]에 공개되어 있으며; 여섯 번째 포유류 서열(서열 번호 246)은 들다람쥐의 것이고, 이는 문헌[참조: Seeger et al. (1984) J. Virol., 51:367-375]에 공개되어 있다.
도 8은 (1) HBc 위치 149에 결합된 카복시-말단 만능(universal) 피. 팔시파룸 말라리어성 T 세포 에피토프 단백질을 함유하기도 하는, HBc 아미노산 잔기 78과 79 사이에 삽입된 피. 팔시라룸 (NANP)4면역원성 서열을 함유하는 키머 HBc149 입자[UTC; V2.Pf1=V2.Pf1+Pf/CS-UTC]에 대한 안정화 효과, 및 (2) UTC의 위치 17에서의 시스테인을 돌연변이시켜 알라닌 잔기로 만들고 하나의 시스테인 잔기를 잔기 위치 150, 위치 149에서의 HBc 잔기 내지 UTC의 개시 잔기에 부가시킨 유사한 입자[V12.Pf1(C17A)+C150]에 대한 안정화 효과를 제시하기 위한, 37℃에서 0, 1 및 2일 동안 항원 배양한 후 환원성 조건 하에서의 SDS-PAGE 분석 사진이다.
도 9는 ICC-1438 단량체 작제물(레인 2)이 ICC-1492 작제물(레인 3)과 비교해서 불안정하다는 것을 보여주는, 입자 제조 후 환원성 조건 하에서의 SDS-PAGE 분석 사진인데, 여기서 HBc-149(레인 1), ICC-1475(레인 4) 및 ICC-1473(레인 5)은 추가의 분자량 대조군으로서 제공된다.
정의
HBc 키머와 연계해서 사용된 숫자는 아미노산 잔기 서열에 대한 부가물 또는 결실물이 존재하는지의 여부와는 상관없이, 하나 이상의 잔기가 해당 서열에 부가시킨 서열 번호 247의 HBcayw아미노산 잔기 내의 위치를 지시한다. 따라서, HBc149는 키머가 잔기 149에서 종결된다는 것을 지시해주는 반면, HBc149 + C150은 동일한 키머가 HBc 위치 150에서 시스테인 잔기를 함유한다는 것을 지시해준다. 한편, 말라리아성 CS 단백질 만능 T 세포 에피토프(UTC)는 20개 잔기 길이이고, 상기 서열 내의 위치 17에서의 시스테인이 알라닌으로 대체된 것이 CS-UTC(C17A)로서 지칭된다.
용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합되는, 면역글로불린으로 불리우는 글리코실화 단백질 계열의 구성원인 분자를 지칭한다.
용어 "항원"은 항체 또는 수용체에 의해 결합되는 실재물(entity)을 명명하고, 또한 항체 생성을 유도시키는 실재물을 명명하기 위해 역사적으로 사용되어 왔다. 보다 최근의 활용은 항원의 의미를 항체 또는 수용체에 의해 결합된 실재물로 제한하고 있는 반면, 항체 생성을 유도시키거나 수용체와 결합하는 실재물에 대해서는 "면역원"이란 용어가 사용되고 있다. 본원에 논의된 실재물이 면역원성이면서 항원성인 경우에는, 이의 목적하는 활용도에 따라서 면역원 또는 항원으로 지칭된다.
"항원 결정기"는 항체 결합 부위 또는 T 세포 수용체에 의해 면역학적으로 결합되는, 항원의 실제적인 구조 부분을 지칭한다. 상기 용어는 또한, "에피토프"와 상호교환적으로 사용된다. 용어 "항원 결정기"와 "에피토프"는 HBc 서열과 이종이긴 하지만 실제적으로 항체에 의해 결합될 수 없는 부가의 잔기를 포함하기 위해, 본원에서 다소 보다 더 광범위하게 사용된다. 따라서, 예를 들면, 서열 번호 1 및 21의 말라리아성 CS 단백질 반복체 서열(NANP)4및 NANPNVDP(NANP)3NVDP는 각각, 하나 이상의 실제적 에피토프를 함유하는 것으로 여겨지지만, 본원에서는 각각 단일 에피토프를 구성하는 것으로 간주된다. 이들 서열 둘 다를 단일 HBc 키머 분자에 사용하는 것은 다수의 에피토프를 사용하는 것으로 간주된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "접합체"는 수송체 단백질의 아미노산 잔기 측쇄, 예를 들면, 리신, 아스파르트산 또는 글루탐산, 티로신 또는 시스테인 잔기 처럼, 이러한 수송체 단백질에 작동적으로 연결된 합텐을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "보존적 치환"은 하나의 아미노산 잔기를 생물학적으로 유사한 또 다른 잔기로 대체시킨 것을 의미한다. 보존적 치환의 예에는 하나의 소수성 잔기를 또 다른 소수성 잔기, 예를 들면, 이소루이신, 발린, 루이신 또는 메티오닌로 치환하는 것, 또는 하나의 극성 잔기를 또 다른 잔기로 치환하는 것, 예를 들면, 아르기닌과 리신 간의 치환, 글루탐산과 아스파르트산 간의 치환, 또는 글루타민과 아스파라긴 간의 치환 등이 포함된다.
펩티드 서열과 관련해서 사용된 바와 같은 이의 각종 문법적 형태의 용어 "상응하는"은 기재된 펩티드 서열에, 아미노 말단과 카복시 말단 중의 어느 하나 또는 둘 다에 3개 이하의 아미노산 잔기가 부가 또는 결실되고, 해당 폴리펩티드 서열을 따라 특정한 아미노산 잔기 내에 보존적 치환물 만을 함유하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "도메인"은 문헌[참조: Galibert et al., (1979) Nature, 281:646-650(서열 번호 246)]에 보고된 바와 같은 HBcAg 아유형ayw의 위치 번호에 기준한 잔기 위치 넘버링으로써 확인되는 재조합 HBc 키머 분자의 일정 부분을 의미한다. 적어도 키머 도메인 I, II 및 III의 폴리펩티드 부분이, 천연 HBcAg의 상응하는 서열에 대해 유사한 3차 형태로 존재하는 것으로 여겨진다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "융합 단백질"은 각각의 카복시 말단 아미노산 잔기와 아미노 말단 아미노산 잔기 간의 펩티드 결합에 의해 함께 말단-대-말단(헤드-대-테일)으로 작동적으로 연결되는, 천연에서는 함께 연결된 것이 통상적으로 발견되지 않는 둘 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명의 융합 단백질은, 아미노산 서열 면에서 이러한 융합 단백질의 폴리펩티드 또는 병원체-관련 부분에 상응하는 폴리펩티드 또는 병원체-관련 면역원과 면역반응되는 항체 생성을 유도시키는 HBc 키머이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "B형 간염"은 이의 가장 광범위한 맥락에서, 앞서 논의된 바와 같은 헤파드나비리대 과의 모든 구성원을 지칭한다.
용어 "잔기"는 아미노산 잔기와 상호교환적으로 사용되고, 이는 펩티드 또는 단백질 내에 존재하는 바와 같은 반응된 아미노산을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "발현 벡터"는 단백질이 형성되도록 이러한 단백질을 암호화하는 구조 유전자의 발현을 조절하는 제어 요소를 형성하는 DNA 서열을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은, 핵산 맥락에서 사용된 용어 "작동적으로 연결된"이란, 특정 유전자가 정확한 판독 프레임에서 또 다른 DNA(또는 경우에 따라, RNA) 세그먼트와 공유적으로 결합되는 것을 의미하는데, 예를 들면, 발현 벡터와 공유적으로 결합되어 해당 구조 유전자가 이러한 발현 벡터의 제어 하에 있도록 하는 것을 의미한다. 단백질, 폴리펩티드 또는 키머 맥락에서 사용된 용어 "작동적으로 연결된"이란, 언급된 요소가 서로 공유적으로 결합되는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "프로모터"는 특정 유전자에 대한 발현 제어 요소를 제공해주고, 이에 RNA 폴리머라제가 특이적으로 결합되고 상기 유전자의 RNA 합성(전사)을 개시시켜 주는 DNA 서열 또는 DNA 서열 그룹 상의 인식 부위를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "재조합 DNA 분자"는 천연 상태에서는 통상적으로 함께 발견되지 않는 둘 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하이브리드 DNA 서열을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 특정 세포에서 복제할 수 있고/있거나 부착된 세그먼트의 복제를 유발시키도록 또 다른 DNA 세그먼트가 이에 작동적으로 연결될 수 있는 DNA 분자를 의미한다. 플라스미드가 벡터의 한 예다.
본원에서 동정된 모든 아미노산 잔기는 천연 상태의 L-배위이다. 표준 폴리펩티드 명명법에 따라서[참조: J. Biol. Chem., 243:3557-59(1969)], 아미노산 잔기에 대한 약어가 다음 표에 제시된 바와 같다:
본 발명은 키머 헤파드나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질; 즉, (a) 면역원성 B 세포 또는 T 세포 에피토프, 면역원성 B 세포 또는 T 세포 에피토프를 부착시키기 위한 링커, 또는 절단된 HBc 단백질을 표시하도록 공학적으로 처리시키고, (b) 자기-어셈블리된 입자 내에 존재하는 경우에 증강된 안정성을 나타내도록 처리시킬 뿐만 아니라 (c) 자기-어셈블리된 입자로서 핵산과 실제적으로 결합하지 않도록 공학적으로 처리시킨 재조합 B형 간염 코어(HBc) 단백질을 고려한다. 고려된 HBc 키머는 본래의 HBc 분자에 비해 이러한 분자의 C-말단에서 절단된 것이다.
따라서, 상기 키머 단백질은 N-말단, HBc 면역원성 루프 내 또는 C-말단에 하나 이상의 면역원성 에피토프를 표시하거나, 또는 이러한 면역원성 루프 내의 상기 에피토프에 대한 링커를 표시한다. 상기 키머 단백질은 자기-어셈블리된 입자에 증강된 안정성을 부여해 주는 C-말단 또는 C-말단 근처에 시스테인 잔기를 함유한다. 당해 키머 단백질은 HBc 잔기 위치 149의 하단(카복시 말단을 향함)에 아르기닌 잔기를 실질적으로 함유하지 않으므로, 자기-어셈블리된 입자가 핵산과 실질적으로 결합하지 않는다.
검토의 용이성을 위해, 본원에 지칭된, 고려된 키머 서열 및 서열 위치 번호는 아유형ayw의 사람 B형 간염 코어 단백질의 서열 및 위치 넘버링에 기준한 것이다[참조: Galibert et al. (1979) Nature, 281:64-650]. 그러나, 포유류 헤파드나바이러스 캡시드 단백질 서열들 간의 상당한 유사성과, 이러한 단백질에 의해 나타난 유사한 입자 형성 측면에서 보면, 사람 HBc 아유형ayw에 관한 논의는 아유형adw에도 적용할 수 있을 뿐만 아니라 우드척 및 들다람쥐 단백질에게도 적용 가능하는 것을 인지해야 한다. 이러한 상당한 유사성이 존재한 결과로서, HBc 서열은 달리 언급되지 않는 한, 일반적으로 본원에서 "HBc" 서열로서 언급된다.
한 양태에서는, 고려된 HBc 키머가 약 515개 이하 잔기 길이이고,
(a) (i) 공유적으로 연결된 이종 에피토프 또는 HBc 면역우성 루프에 존재하는 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기를 포함한 HBc 분자의 N-말단의 150개 아미노산 잔기중 약 130개 이상의 서열, 또는 (ii) N-말단의 150개 HBc 아미노산 잔기중 약 135개 이상의 잔기 서열을 함유하고,
(b) 키머 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 내에 존재하는 HBc 서열의 C-말단 잔기로부터 상기 분자의 C-말단을 향하고 있는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)]를 함유하며,
(c) HBc 잔기 위치 135에서부터 HBc C-말단까지의 5개 이상의 아미노산 잔기 서열을 함유한다. 이들 6개 잔기 중의 5개가 바람직하게는, 위치 136에서부터 140까지의 HBc 서열의 것이고, 6번째가 요구되는 시스테인이다.
고려된 키머는, 이러한 키머 단백질 분자가 숙주 세포에서 발현될 때 입자 내로 자기-어셈블리되고, 상기 입자는 핵산과 실질적으로 결합하지 않으며, (1) 상기 1 내지 10개 시스테인 잔기가 결여되고 그 밖에는 동일한 HBc 키머로부터 형성된 입자 보다 더 안정적이거나, 또는 (2) 단일 C-말단 시스테인 잔기가 키머에 존재하고, 이것이 알라닌 잔기 등의 또 다른 잔기로 대체되는 경우 보다 더 안정적이다.
한 국면에 있어서, 바람직한 HBc 키머는 약 135 내지 약 515 L-α-아미노산 잔기 서열을 가지며, 4가지 일련의 펩티드 연결된 도메인, 즉 도메인 I, II, III 및 IV를 함유한다. 이들 4가지 도메인은 α-아미노산 이외의 잔기를 함유하므로 펩티드 결합을 형성할 수 없는 폴리펩티드, D-아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드, 또는 둘 이상의 폴리펩티드가 하나의 아미노산 잔기 측쇄를 통하여 작동적으로 연결되는 올리고펩티드 접합체와 비교해서, 본래의 단백질과 동일한 방식으로 함께 연결된다. 따라서, 고려된 키머 HBc 단백질은, 통상적인 재조합 기술 방법을 사용하여 발현함으로써 제조할 수 있다.
아미노-말단으로부터, 도메인 I은 약 71 내지 약 100개 아미노산 잔기를 포함하는데, 이의 서열에는 적어도 HBc의 위치 5 내지 위치 75의 잔기 서열이 포함된다. 바람직하게는, HBc 서열의 잔기 1 내지 75의 서열은 도메인 I의 일부로서 존재한다. 가장 바람직하게는, 도메인 I은 위치 1에서부터 위치 75까지의 HBc 서열로만 구성된다.
도메인 II는 도메인 I의 HBc 잔기 75와 펩티드-결합된 5 내지 약 250개 아미노산 잔기를 포함하는데, 여기서 (i) 위치 76 내지 85의 HBc 서열 내의 0 내지 모든 잔기, 바람직하게는 4개 이상의 잔기, 보다 바람직하게는 8개 이상의 잔기는, HBc와 이종(외래)인 1 내지 약 245 아미노산 잔기와 펩티드-결합되고; 이는 특정 에피토프, 예를 들면, B 세포 에피토프 또는 이종 에피토프, 예를 들면, B 세포 에피토프 그 자체에 대한 이종 링커 잔기를 구성하거나; 또는 (ii) 위치 76 내지 85에서의 HBc 서열에는 이종 잔기가 전혀 존재하지 않는다.
위치 76에서부터 85까지의 10개 잔기 서열(76-85 서열)이 존재하긴 하지만, 상기 이종 링커 또는 이종 에피토프의 1 내지 약 245 잔기에 의해 중단되는 것이 특히 바람직하다. 기타 경우에는, 10개 잔기 서열이 단독으로 존재하고, 어떠한 이종 잔기에 의해서도 중단되지 않는 것이 특히 바람직하다.
다음에 논의된 특징과 함께, 상기 도메인에 HBc 잔기만을 함유하는 키머가 HBc 자체에 대한 B 및/또는 T 세포 반응을 유도시키는데 유용하다. 중단되지 않은 76-85 서열을 갖는 바람직한 HBc 키머 분자는 위치 1에서부터 적어도 위치 140까지의 중단되지 않은 HBc 아미노산 잔기 서열을 함유하고; 보다 바람직하게는 위치 1에서부터 위치 149까지의 중단되지 않은 HBc 아미노산 잔기 서열에, 다음에 논의되는 바와 같은 C-말단에 단일 시스테인 잔기가 부가된 것을 함유한다.
도메인 III은 잔기 85와 펩티드-결합된 위치 86에서부터 위치 135까지의 HBc 서열이다.
도메인 IV는 (i) 도메인 III의 위치 135의 잔기와 펩티드-결합된 위치 136에서부터 149까지의 HBc 아미노산 잔기 서열의 0 내지 14개 잔기; (ii) 1 내지 10개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)]; 및 (iii) 전형적으로 하나의 T 세포 에피토프 또는 다수의 T 세포 에피토프를 함유하는, 위치 150에서부터 C-말단까지의 HBc와 이종인 서열 내의 0 내지 약 100개 아미노산 잔기를 포함하는데, 단 도메인 IV는 상기 (ii)의 1 내지 10개 시스테인 잔기를 포함한, HBc 잔기 위치 135에서부터 해당 키머의 C-말단까지의 6개 이상의 아미노산 잔기 서열을 함유한다. 바람직하게는, 도메인 IV는 HBc와 이종인 서열 내에 0 내지 약 50개의 아미노산 잔기서열을 함유하고, 보다 바람직하게는 상기 서열이 0 내지 약 25개 잔기이다.
한 국면에 있어서, 고려된 키머 분자는 C-말단 시스테인을 제외하고는, HBc와 이종인 잔기 또는 에피토프를 함유하지 않을 수 있다. 또 다른 국면에서는, 고려된 키머 분자가 HBc 잔기 1-5 중의 하나와 펩티드-결합된 N-말단에 이종 에피토프를 함유한다. 추가의 국면에서는, 고려된 키머 분자가 면역우성 루프 내의 HBc 잔기 76 내지 85에 위치된 분자의 중앙 근처에 펩티드-결합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기 또는 이종 에피토프를 함유한다. 또한, 추가의 국면에서는, 이종 에피토프가 HBc 잔기 136-149 중의 하나와 펩티드-결합된 키머 분자의 C-말단에 위치한다. 기타 국면에서는, 2 또는 3개의 이종 에피토프가 상기 위치에 존재하거나, 또는 1개 또는 2개의 이종 에피토프가 특정 에피토프에 대한 이종 링커 잔기를 따라 존재한다. 이러한 키머 분자 각각은 또한, 앞서 논의된 바와 같은 C-말단 시스테인 잔기를 함유한다. 이들 키머 분자 및 이들의 자기-어셈블리된 입자의 몇 가지 구체적인 예가 다음에 논의된다.
앞서 인지된 바와 같이, 고려된 HBc 키머 분자는 약 135 내지 약 515개 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 바람직한 양태에서는, HBc 잔기 1-5가 존재하므로, 도메인 I은 HBc 잔기 1에서 시작하여 잔기 75, 즉 HBc 위치 75에서의 HBc 잔기 까지 계속된다. 면역우성 루프 내의 도메인 II에 존재하는 이종 에피토프는 바람직하게는, 약 15 내지 약 50개 잔기를 함유하지만, 약 6개 아미노산 잔기 정도로 짧은 에피토프가 유도될 수 있고 이는 항체 및 T 세포 수용체에 의해 인식될 수 있다. 도메인 III은 잔기 85와 펩티드-결합된 HBc 잔기 86 내지 135를 함유한다.도메인 IV는 (i) 잔기 135와 펩티드-결합된 HBc 위치 136에서부터 149까지의 잔기 서열의 0 또는 1개 잔기; (ii) 1개 이상의 시스테인 잔기; 및 (iii) 특히 HBc 서열이 잔기 135에서 종결되는 경우에, 약 100개 이하 잔기의 에피토프의 이종 서열을 임의로 함유할 수 있지만, 약 25개 이하의 보다 짧은 서열이 보다 바람직한, 6개 이상의 잔기 서열을 함유한다.
한 양태에서는, 특히 바람직한 키머가 2개의 이종 에피토프를 함유한다. 이들 2개의 이종 에피토프는 도메인 I 및 II, 또는 II 및 IV, 또는 I 및 IV에 존재한다. 이러한 2개의 이종 에피토프 중의 하나가 바람직하게는, 몇몇 양태에서 B 세포 에피토프이다. 기타 양태에서는, 상기 2개의 이종 에피토프 중의 하나가 T 세포 에피토프이다. 보다 바람직하게는, 상기 2개의 이종 에피토프 중의 하나가 B 세포 에피토프이고, 다른 하나가 T 세포 에피토프이다. 또한, 다수의 B 세포 에피토프가 해당 B 세포 에피토프 위치에 존재할 수 있고, 다수의 T 세포 에피토프가 해당 T 세포 에피토프 위치에 존재할 수 있다.
키머 분자가 도메인 II 내에 이종 에피토프를 함유하는 양태에서는, 상기 에피토프가 하나 이상의 B 세포 에피토프이고; 아미노산 잔기 76 내지 85의 HBc 서열이 존재하지만, 상기 이종 에피토프(들)에 의해 중단되며; 상기 키머 분자가 HBc 잔기 140-149 중의 하나와 펩티드-결합된 도메인 IV 내에 하나 이상의 T 세포 에피토프를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
이와 동일한 선호도는, 접합체 에피토프에 대한 이종 링커 잔기가 도메인 II에 존재함으로써, 도메인 II에 하나 이상의 이종 에피토프를 제공해주는 키머 분자에 대해서도 예정되어 있는데, 이때 잔기 76 내지 85가 존재하지만, 상기 이종 링커 잔기에 의해 중단되고, T 세포 에피토프가 HBc 잔기 140-140 중의 하나와 펩티드-결합된다. 이러한 키머 분자로부터 형성된 입자는 접합된 에피토프 대 C-말단 펩티드-결합된 T 세포 에피토프의 비가 전형적으로 약 1:4 내지 1:1, 통상작으로는 약 1:2이다.
상기 언급된 키머 분자의 예시 구조물에서는, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기가 도메인 II에 존재하고, T 세포 에피토프가 도메인 IV에 존재하는데, 부가의 어떠한 B 세포 에피토프도 도메인 II에 존재하지 않는다. 이러한 키머는 다음에 논의되는 바와 같이, ELISA 검정에서 항-루프 모노클로날 항체의 결합으로써 측정된 바와 같은 HBc 항원성이 존재할 경우에는 이를 최소한도로 나타내면서, T 세포 에피토프의 면역원성을 나타낸다.
바람직한 고려된 HBc 키머 분자는 약 140 내지 약 515개 잔기를 함유한다. 바람직한 길이가 각각 약 15 내지 약 50개 잔기이고 바람직한 HBc 부분 길이가 약 140 내지 약 149개 잔기인 2개의 이종 에피토프를 함유하는 바람직한 HBc 키머 분자는 서열 길이가 약 175 내지 약 240개 아미노산 잔기이다. 2개의 이종 에피토프를 함유하는 특히 바람직한 키머 분자는 길이가 약 190 내지 약 210개 잔기이다. 면역원성 루프 내에 삽입될 수 있는 몇 가지 고려된 에피토프의 길이가 다양하고 N- 및 C-말단 HBc 부분의 길이가 다양하다는 측면에서, 광범위한 키머 분자 길이가 고려된다는 것을 인지해야 한다.
고려된 재조합 단백질은 숙주 세포에서의 발현 후에, 자기-어셈블리되어, 핵산과 실질적으로 결합하지 않는 입자를 형성한다. 상기 고려된 HBc 키머 입자는 일반적으로 외형이 구(spherical) 형태이고, 통상적으로 소정의 제제에 대한 크기가 균일하다. 따라서, 이들 키머 입자는 유사한 외형과 크기를 갖는 본래의 HBc 입자와 닮았으므로, 감염자로부터 회수할 수 있다.
고려된 키머 입자는 앞서 논의된 키머 분자를 포함한다. 보다 광법위하게, 이러한 키머 입자는 N-말단의 150개 잔기중 약 130개 이상의 서열을 갖는 키머 C-말단 절단된 HBc 단백질을 포함하고, (i) 면역우성 루프 내의 에피토프에 대한 이종 링커 잔기 또는 이종 에피토프, 또는 중단되지 않은 면역우성 루프 및 N-말단의 150개 잔기중 약 130개 이상의 잔기; 및 (ii) 앞서 언급된 바와 같은 1 내지 3개의 C-말단 시스테인 잔기, 및 위치 135로부터 5개 이상의 HBc 잔기 서열를 함유한다. 이러한 입자는 아르기닌 잔기가 충분한 수준으로 존재하지 않기 때문에, 자기-어셈블리된 입자는 핵산과 실질적으로 결합하지 않으며, 다음에 논의되는 바와 같이 280/260 흡광도 비가 약 1.2 내지 약 1.7이다. 따라서, 고려된 키머 단백질은 위치 150에서부터 183까지의 HBc 서열이 존재하지 않을 수 있다. 고려된 입자는 상기 C-말단 시스테인 잔기(들)가 결여되고 그 밖에는 동일한 HBc 키머 단백질로부터 형성된 입자 보다 더 안정적이다. 유사하게, 이의 키머 분자가 단일 C-말단 시스테인 잔기를 함유하는 입자는, 이러한 시스테인이 알라닌 잔기 등의 또 다른 잔기로 대체된 입자 보다 더 안정적이다. 몇몇 경우에는, C-말단 시스테인이 존재하지 않는다면 입자도 형성되지 않는다. 양 유형의 서열에 대한 안정성 증강 예가 다음의 실시예에 예시되며, 이는 도 3, 4 및 8에 관한 실시예에서 특히 명백하다.
핵산 결합이 실질적으로 없다는 것은 280nm와 260nm 모두에서 측정된 수용액 중에서의 상기 입자의 흡광도, 즉 280/260 흡광도 비를 비교함으로써 용이하게 결정할 수 있다. 고려된 입자는 해당 단백질을 발현하는데 사용된 유기체의 세포 내에 본래부터 존재하는 올리고머성 및/또는 중합체성 DNA 및 RNA 종인 핵산과 실질적으로 결합하지 않는다. 이러한 핵산은 260nm에서 흡광도를 나타내며 280nm에서는 비교적 덜한 흡광도를 나타내는 반면, 고려된 키머와 같은 단백질은 260nm에서 비교적 덜한 정도로 흡수되고, 280nm에서 보다 큰 흡광도를 나타낸다.
따라서, 당해 분야에서 프로타민 영역으로서 종종 언급되는, 잔기 위치 150-183(또는 150-185)에 아르기닌-풍부한 서열을 함유하는 재조합적으로 발현된 HBc 입자 또는 키머 HBc 입자는 280nm에서의 흡광도 대 260nm에서의 흡광도 비가 약 0.8인 반면, 자기-어셈블리된 입자가 핵산과 실질적으로 결합되지 않도록 아르기닌 잔기를 충분한 수준으로 함유하지 않는 입자, 예를 들면, 3개 미만의 아르기닌 또는 리신 잔기 또는 서로 인접한 이들의 혼합물을 함유하는 것과 같은 천연의 HBc의 아르기닌-풍부한 핵산 결합 영역이 없는 입자, 또는 대략 HBc 잔기 위치 140내지 위치 149에서 종결되는 본래 또는 키머 서열을 갖는 입자는 280/260 흡광도 비가 약 1.2 내지 약 1.6이다.
본 발명의 키머 HBc 입자는 핵산과 실질적으로 결합하지 않으며, 280/260 흡광도 비가 약 1.2 내지 약 1.6, 보다 전형적으로는 약 1.4 내지 약 1.6이다. 이러한 범위는 상당 부분, 소정의 키머 HBc 입자의 도메인 II 및 IV에 존재하는 방향족 아미노산 잔기 수에 기인된 것이다. 상기 범위는 또한, 고려된 키머의 도메인 IV내에 Cys가 존재함으로써 일부 비롯된 것이며, 이의 존재는 관찰된 상기 비를 약 0.1 정도로 저하시킬 수 있는데, 이에 대한 이유는 현재 공지되어 있지 않다.
고려된 키머 HBc 입자는 약 2주 내지 약 1개월 간의 기간에 걸쳐 37℃의 수성 완충액에서, 1 내지 10개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)]가 존재하지 않거나 또는 존재하는 단일 C-말단 잔기가 알라닌 잔기 등의 또 다른 잔기로 대체되는 동일한 펩티드-연결된 도메인 I, II 및 III 서열 및 그 밖의 동일한 도메인 IV 서열을 함유하는 HBc 키머로부터 형성된 입자 보다 더 안정적이다. 각종 키머 입자의 안정성은 다음에 논의되는 바와 같이 결정한다.
따라서, 예를 들면, 도메인 II 내의 이종 말라리아성 에피토프[예: (NANP)4] 및 잔기 발린 149에 대한 C-말단인 단일 시스테인 잔기를 함유하는 입자는, 이의 C-말단 잔기가 발린 149인 키머 분자로부터 어셈블리되고 그 밖에는 동일한 입자 보다 더 안정적이다. 유사하게, C-말단 근처에 단일 시스테인을 함유하는 만능 말라리아성 T 세포 에피토프 및 도메인 II 내의 상기 말라리아성 B 세포 에피토프를 함유하는 입자는, 상기 시스테인이 알라닌 잔기로 대체되고 그 밖에는 동일한 입자 보다 더 안정적이다[도 3, 4 및 8, 및 이와 관련하여 후술되는 논의 참조].
C-말단 시스테인 잔기를 함유하는 고려된 입자는 또한 전형적으로, C-말단 시스테인이 결여된 키머 분자로부터 어셈블리된 입자 보다 더 고수율로 제조된다. 이러한 수율 증가는 다음에 논의되고 표 17에 제시된 바와 같이 슈퍼로즈(Superose®) 6 HR을 사용한 분석용 겔 여과 분석으로부터 알 수 있거나 또는 수득된 입자질량으로부터 알 수 있다.
고려된 키머 HBc 단백질의 도메인 I은 적어도 아미노산 잔기 위치 5 내지 위치 75로 시작한 HBc의 아미노산 잔기 서열로 구성되고, 도메인 III은 위치 86에서부터 위치 137까지의 HBc 서열로 구성된다. 포유류 헤파드나바이러스 중의 어떠한 것으로부터의 서열도 도메인 I 및 III 중의 어느 하나에 대해 사용할 수 있으며, 둘 이상의 바이러스로부터의 서열이 하나의 키머에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 작제를 용이하게 하기 위해, 사람ayw서열을 해당 키머 전반에 걸쳐 사용한다.
첫 번째 3개의 아미노-말단(N-말단) 잔기의 결실 보다 더 많은 것을 함유하는 도메인 I을 갖는 HBc 키머는 이. 콜라이 세포에서 HBc 키머 단백질의 완전한 소멸을 초래하는 것으로 보고된 바 있다[참조: Pumpens et al., (1995) Intervirology, 38:63-74]. 한편, 인플루엔자 M2 단백질로부터의 면역원성 23량체 폴리펩티드를 HBc N-말단 서열에 융합시킨 최근의 연구 결과, 이로써 생성된 융합 단백질이, 본래의 HBc 서열의 잔기 1-4를 대체시킨 경우에 입자를 형성하였다고 보고되었다[참조: Neirynck et al. (October 1999) Nature Med., 5(10):1157-1163]. 따라서, 상기 분야는, 부가된 아미노산 서열이 HBc의 잔기 1-4 중의 하나와 펩티드-결합된 채로 존재하는 경우에 입자가 형성될 수 있는 반면, 부가의 서열이 전혀 존재하지 않고 잔기 1-3 보다 더 많은 것이 HBc의 N-말단으로부터 결실되는 경우에 입자가 형성되지 않는다고 교시하고 있다.
HBc의 첫 번째 5개 N-말단 잔기 중의 하나와 펩티드-결합된 N-말단 서열은HBc와 이종인 약 25개 이하의 잔기 서열을 함유할 수 있다. 이러한 서열의 예에는 후술되는 바와 같은 B 세포 또는 T 세포 에피토프, 상기 네이린크(Neirynck) 등의 인플루엔자 M2 단백질로부터의 23량체 폴리펩티드, 사용된 발현 시스템의 결과로서 융합 단백질에서 생성될 수 있는 바와 같은 β-갈락토시다제 등의 또 다른(이종) 단백질의 서열, 또는 또 다른 B형 간염-관련 서열, 예를 들면, 프리-S1 또는 프리-S2 영역으로부터의 서열 또는 주요 HbsAg 면역원성 서열이 포함된다.
도메인 II는 약 5 내지 약 250개 아미노산 잔기 서열이다. 이들 잔기 중에서, 0개(없음) 내지 바람직하게는 4개 이상의 잔기, 더욱 바람직하게는 8개 이상의 잔기가 위치 76 내지 85의 HBc 서열 부분을 구성하고, 1 내지 약 245개 잔기, 바람직하게는 1 내지 약 50개 잔기가 HBc와 이종(외래)이다. 이들 이종 잔기는 (i) 특정 에피토프, 예를 들면, B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프에 대한 이종 링커 잔기로 구성되거나 또는 (ii) 바람직하게는 6 내지 약 50, 더욱 바람직하게는 약 15 내지 약 50, 가장 바람직하게는 약 20 내지 약 30개의 아미노산 잔기를 함유하는 이종 B 또는 T 세포 에피토프로 구성되고, 이들이 HBc 서열의 위치 76에서부터 위치 85까지의 잔기 전부에 대해 0개, 또는 더욱 바람직하게는 4개 이상이 펩티드 결합되도록 위치된다. 이종 B 세포 에피토프는 이러한 위치에서 상기 링커 잔기에 의해 바람직하게 연결되거나 또는 HBc 서열 내로 펩티드-결합되고, B 세포 에피토프의 용도는 다음에 예시적으로 논의된다.
이러한 바람직한 4개 이상의 HBc 잔기는 하나의 서열, 예를 들면, 잔기 82-85에 전부 존재할 수 있거나, 또는 이종 잔기의 (플랭크) 중의 어느 한 면 상에서절단될 있어, 잔기 76-77과 84-85가 존재하거나 잔기 76과 83-85가 존재한다. 더욱 바람직하게는, 잔기 76에서부터 85까지의 HBc 서열의 8개 이상의 잔기를 함유한다. 가장 바람직하게는, 위치 76에서부터 85까지의 모든 10개 잔기 서열이 당해 키머에 존재한다.
HBc 루프 서열에 부가된 1 내지 약 245개 잔기는 HBc 서열과 이종이다. 부가된 단일 이종 잔기는 전술된 바와 같이 B 세포 에피토프에 대한 이종 링커 잔기이다. 보다 긴 서열, 전형적으로는 전술된 바와 같은 6개 이상 아미노산 잔기 길이 내지 약 50개 아미노산 잔기 길이, 더욱 바람직하게는 약 15 내지 약 50개의 잔기 길이가 한 서열 내에 존재하는데, 이러한 서열은 제한 부위에 의해 암호화된 이종 잔기를 제외하고는 B 세포 에피토프와 같은 이종 면역원을 포함한다.
고려된 키머의 발현 후 링커 잔기에 대한 양 연결에 유용하고 HBc 키머 내에서의 발현에 유용한 펩티드 면역원의 예가, 해당 서열을 생성시킨 유전자에 대해 제공된 통상 명칭, 공개된 에피토프에 대한 인용 참조문헌 또는 특허, 및 서열 번호와 함께, 다음 표 A에 제시되어 있다:
* 공개된 에피토프에 대한 참조문헌이 다음 표 B에 제공된다.
이종 잔기 또는 서열의 어느 한 측면 상에 존재하는 도메인 II의 나머지 잔기는 HBc 위치 76 내지 위치 85의 잔기이다. 따라서, 전형적인 예에서, 잔기 78 내지 82를 대체시킨 경우에는, 도메인 II 내의 키머 서열이 76 내지 77이고, 이에 이어 제한 부위-암호화된 잔기, 이종 면역원성(에피토프) 서열, 추가의 제한 부위-암호화된 잔기 및 HBc 서열 84 내지 85가 존재한다. 잔기 78과 79 사이에 삽입시키는 전략에 의해 제조된 키머의 서열에 대한 전형적인 예는, 위치 1에서부터 위치 78까지의 HBc 서열에 이어, 제한 부위-암호화된 잔기, 이종 면역원성 서열, 추가의 제한 부위-암호화된 잔기 및 HBc 서열 79 내지 85가 존재하는 서열이다. 도메인 I 및 II 내의 기타 고려된 키머의 서열은 이들 예시로부터 명백해야 하며, 일일이 열거할 필요는 없다.
앞서 인지된 바와 같이, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커는 아미노산 잔기 76 내지 85의 HBc 서열 내의 특정 위치에서 펩티드-결합된다. 이종 에피토프에 대한 경우와 같이, 잔기 76 내지 85의 HBc 서열이 바람직하게 존재하지만, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커에 의해 중단된다. 이러한 키머는 바람직하게는, 위치 1에서부터 적어도 위치 140까지의 HBc 서열과, 해당 키머 단백질의 C-말단에서의 시스테인 잔기를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 위치 1에서부터 149까지의 HBc 서열이 존재하지만, 이는 접합된 에피토프에 대한 이종 링커에 의해 잔기 76 내지 85가 중단되고, 키머 분자는 C-말단 시스테인을 함유한다. 접합된 에피토프에 대한 이종 링커는 가장 바람직하게는 리신(K) 잔기이다. 티로신 및 시스테인 잔기가 링커로서 사용될 수 있는 바와 같이, 글루탐산 또는 아스파르트산, 티로신 및 시스테인 잔기도 링커 잔기로서 사용될 수 있다. 하나 이상의 링커, 예를 들면, 3개의 리신 서열이 존재할 수 있지만, 이러한 용도는 바람직하지 못한데, 이는 이러한 용도로부터, 접합된 합텐이 제1 키머 중의 하나의 링커 및 제2 키머 분자 중의 상이한 링커에 결합되는 이종 접합체가 형성될 수 있기 때문이라는 사실에 주목해야 한다.국제특허출원 PCT/US 99/03055에는 하나 이상의 연결성 잔기를 함유하지만, 안정화시키는 C-말단 시스테인 잔기가 결여된 HBc 키머 분자가 기재되어 있다.
고려된 HBc 키머에 존재하는 이종 에피토프 서열이, 이종 면역원성(에피토프) 서열을 (플랭킹시키는) 한 측면 또는 양 측면 상의 "가요성 링커 암"에 의해 HBc 서열 잔기로부터 분리시킬 수도 있다는 것에 또한 주목해야 한다. 이는 특히, 이종 면역원성 서열이 약 30개 아미노산 잔기 길이 보다 큰 경우에 해당된다. 예시되는 가요성 링커 암 서열은 전형적으로, 약 4 내지 약 10개 글리신 잔기를 함유하는데, 이는 삽입된 서열이 그 밖의 벌징(bulging) 루프 서열로부터 외향적으로 "벌지(bulge)"되도록 해주고 해당 작제물에 추가의 안정성을 부가해주는 것으로 사료된다. 예시되는 가요성 링커 암 서열이 문헌[참조: Kratz et al. (March 1999) Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 96: 1915-1920]에 기재되어 있고, 이는 다음 아미노산 잔기 서열로써 예시된다:
GGGGSGGGGT (서열 번호 256)
GGGGSGGGG (서열 번호 257)
앞서 인지된 바와 같이, 도메인 III은 위치 86에서부터 위치 135까지의 HBc 서열로 구성된다. 결과적으로, 도메인 I 및 II에 대해 상기 논의된 예시적인 키머의 서열은 연장될 수 있는데, 이로써 첫 번째 논의된 키머가 위치 84에서부터 위치 135까지의 HBc 서열을 갖고, 두 번째 논의된 키머가 위치 79에서부터 위치 135까지의 HBc 서열을 갖는다.
도메인 IV는 (i) 위치 136에서부터 위치 149까지의 HBc 서열을 임의로 포함하고, (ii) 1개 이상 3개 이하의 시스테인 잔기를 함유하며, (iii) 위치 150 내지 C-말단에서 HBc와 이종인 서열 내에 약 100개 이하의 아미노산 잔기를 함유하는 서열인데, 단 도메인 IV는 (ii)의 상기 1 내지 10개 시스테인 잔기를 포함한, 6개 이상의 아미노산 잔기를 함유한다. HBc와 이종인 도메인 IV 서열은 보다 바람직하게는, 약 50개 이하의 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 약 25개 이하의 아미노산 잔기를 함유한다. 따라서, 도메인 IV 서열은 위치 150에서부터 C-말단까지의 C-말단 HBc 서열을 제외하고는, 실질적으로 어떠한 시스테인 함유 서열일 수도 있다.
도메인 IV 서열의 길이는 6개 잔기(즉, 하나의 시스테인 + 총 3개 이하의 시스테인 잔기를 함유하는 5개 잔기) 내지 약 100개 아미노산 잔기일 수 있는데, 이러한 길이는 고려된 키머 단백질의 총 길이가 약 135 내지 약 515 잔기, 더욱 바람직하게는 약 460 이하 잔기, 가장 바람직하게는 약 435 이하 아미노산 잔기를 갖기에 충분해야 한다. 도메인 I 또는 II와 펩티드 결합되는 에피토프가, 이들 에피토프에 대한 바람직한 경우 처럼 각각 약 30 또는 약 50개 이하 잔기를 함유하는 경우에는, 도메인 IV 에피토프를 포함한, 해당 키머 분자의 보다 바람직한 길이가 약 175 내지 약 240개 잔기이다. 2개의 이종 에피토프를 함유하는 특히 바람직한 키머 분자는 길이가 약 190 내지 약 210개 잔기이다. 이로써 생성된 입자에 핵산 결합이 존재하지 않는다는 것은 앞서 논의된 바와 같은 280/260 흡광도 비를 측정함으로써 결정된다.
도메인 IV 서열에는 하나 이상의 시스테인(Cys) 잔기가 포함되고, 이는 3개 이하의 Cys 잔기를 함유할 수 있다. 하나 이상의 Cys 잔기가 당해 키머 단백질 분자의 C-말단의 약 5개 아미노산 잔기에 또는 잔기 내에 존재하는 것이 바람직하다. 또한, 하나 이상의 Cys 잔기가 도메인 IV 서열 내에 존재하는 경우, 이들 Cys 잔기가 서로 인접해 있는 것이 바람직하다.
도메인 IV 서열이 T 세포 에피토프, 동일하거나 상이한 다수의 T 세포 에피토프, 또는 고려된 키머가 면역원으로서 사용하도록 의도된 유기체에 대한 부가의 B 세포 에피토프로 구성되는 것이 또한 바람직하다. 예시되는 도메인 IV T 세포 에피토프 서열이 표 A에서와 같이, 다음 표 B에 제공된다:
*밑줄친 C(C)는 본래의 서열로부터 유도된 것이 아니다.
인용문헌:
도메인 IV에 존재하는 하나 이상의 시스테인 이외에도, 잔기 위치 1에서부터 적어도 위치 140까지의 HBc의 아미노산 서열이 고려된 키머 분자 및 입자에 존재하는 것이 바람직하다. 위치 1에서부터 위치 149까지의 서열이 존재하는 것이 보다 바람직하다. B 세포 에피토프가 잔기 76 내지 85에 존재하고, 하나 이상의 단일 시스테인 잔기 또는 하나의 시스테인 잔기를 함유하는 T 세포 에피토프가 HBc 서열에 대한 C-말단 부가물로서 존재하는 것이 바람직하다. 고려된 재조합 HBc 키머는 실질적으로 결합된 핵산을 함유하지 않는다. 해당 분자의 C-말단 또는 말단 근처에 하나의 부가된 Cys 잔기를 함유하는 고려된 키머 입자는 또한, 부가된 Cys를 함유하지 않는 유사한 입자 보다 37℃에서 보다 더 안정적이다. 이러한 증강된 안정성은 도 3, 4 및 8에 예시되어 있고, 다음에 논의된다.
고려된 재조합 HBc 키머 분자가 전형적으로 존재하고, 이는 자기-어셈블리된 입자로서 사용된다. 이들 분자는 180 내지 240개 키머 분자(90 또는 120개 이량체 쌍), 통상적으로 240개 키머 분자로 구성되는데, 이는 디설파이드 환원제, 예를 들면, 2-머캅토에탄올의 존재 하에 단백질 분자로 분리되므로, 개개의 분자는 주로 디설파이드 결합에 의해 입자 내로 함께 결합되는 것으로 사료된다.
특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 관찰된 안정성 증강 및 몇몇 경우에, 고려된 HBc 키머에 대한 발현 증강이, 당해 키머 입자의 단백질들 간의 추가의 시스틴 디설파이드 결합 형성에 기인된 것으로 여겨진다. 시스테인으로서 존재하는지 아니면 시스틴으로서 존재하는지에 상관없이, C-말단 시스테인(들) 잔기는 시스테인으로서 지칭되는데, 이는 이러한 잔기가 해당 단백질 및 어셈블리된 입자의 발현 유래의 핵산에 존재하는 코돈에 의해 암호화된 잔기이기 때문이다.
이들 입자는 HBV에 감염된 환자에게서 관찰된 입자와 유사하지만, 이는 비-감염성이다. 각종 원핵성 및 진핵성 숙주에서의 발현시, 개개의 재조합 HBc 키머 분자는 이러한 숙주에서 입자 내로 어셈블리되는데, 이러한 입자는 숙주 세포로부터 용이하게 수거할 수 있으며, 경우에 따라 정제할 수 있다.
앞서 인지된 바와 같이, HBc 면역우성 루트는 통상적으로, 본래 단백질의 아미노-말단(N-말단)으로부터 약 위치 75 내지 85에 위치하는 것으로 언급된다. 도메인 II의 이종 B 세포 에피토프-함유 서열이 상기 면역우성 루프 서열 내에 위치된다. 이러한 위치 설정으로 인해, 상기 어셈블리된 키머 입자 내의 극도의 면역원성 위치에 이종 서열 또는 링커 잔기를 표시하면서도, HBc 루프 서열의 HBc 면역원성이 실질적으로 제거된다.
각종 에피토프 및 스페이서의 앞서 논의된 N- 및 C-작제물, 삽입물 이외에도, 고려된 키머 분자는 HBc 도메인 I, II, III 및 IV를 구성하고 있는 아미노산 잔기 내에 보존적 치환물을 함유할 수도 있다. 보존적 치환물은 앞서 규정된 바와 같다.
보다 드물게, "비-보존적" 변화, 예를 들면, 하나의 글리신이 트립토판으로 대체되는 것이 고려된다. 유사한 소수의 변화에는 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 이들 둘 다가 포함될 수도 있다. 생물학적 활성 또는 입자 형성을 없애지 않으면서도, 아미노산 잔기를 치환, 삽입 또는 결실시킬 수 있는지를 결정하는데 있어서, 당해 분야에 널리 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들면, LASERGENE소프트웨어(DNASTAR Inc., Madison, Wis.)를 사용하여 안내받을 수 있다.
본 발명의 키머 분자의 HBc 부분, 즉 하나의 부가된 에피토프, 링커, 가요성 링커 암 또는 이종 잔기(들)(이는 제한 효소 인공물이다)의 서열 또는 잔기 이외의 것을 갖는 HBc 서열을 지닌 부분은 가장 바람직하게는, 도 7에 제시되는 아유형ayw의 위치 1 내지 149에서의 아미노산 잔기 서열(서열 번호 247)을 가지고, 한 말단 또는 양 말단에서의 절단으로 인해 존재하지 않는 아유형ayw서열의 일정 부분은 덜 함유한다. 또한 도 7에 제시된 아유형adw,adw2및adyw의 상응하는 아미노산 잔기 서열(서열 번호 248, 249 및 250)이 다소 덜 바람직하다. 도 7의 마지마 두 서열인, 정렬된 위치 1 내지 149에서의 우드척 및 들다람쥐의 서열(서열 번호 251 및 246)이 또한 덜 바람직하다. 그 밖에 언급된 바와 같이, 상이한 포유류 HBc 단백질로부터의 상이한 서열 부분을 단일 키머에 함께 사용할 수 있다.
상기 언급된 바와 같은 본 발명의 키머 분자의 HBc 부분이 위치 1 내지 149에 상응하는 포유류 HBc 분자의 서열 이외의 것을 갖는 경우에는, 이러한 아미노산 잔기의 약 20% 이하가 위치 1 내지 149에서 서열 번호 247과 비교해서 치환된다. 상기 아미노산 잔기의 약 10% 이하, 보다 바람직하게는 약 5% 이하, 가장 바람직하게는 약 3% 이하가 위치 1 내지 149에서 서열 번호 247과 비교해서 치환된다.
따라서, 149 HBc 잔기의 고려된 키머는 위치 1 내지 149에서 서열 번호 247과는 상이한 약 30개 이하의 잔기, 바람직하게는 약 15개 잔기를 함유할 수 있다. 보다 바람직하게는, 약 7 또는 8개 잔기가 잔기 위치 1 내지 149에서ayw서열(서열 번호 247)과 상이하고, 가장 바람직하게는 약 4 또는 5개 잔기가 상이하다. 도메인 II의 면역우성 루트 내 또는 말단에서의 치환 이외에, 해당 키머 분자의 비-나선상 부분에서의 치환이 바람직하고, 이는 입자 형성 보장을 도와주기 위해 전형적으로 잔기 1 내지 잔기 15 및 잔기 24 내지 약 50에서 이루어진다[참조: Koschel et al., J. Virol., 73(3):2153-2160(Mar. 1999)].
HBc 서열이 위치 149를 벗어난 C-말단, 또는 N-말단에서 절단되거나 또는 면역원성 루프 내에 하나 이상의 결실물을 함유하는 경우, 치환된 잔기의 수는 비례해서 상이한데, 이는 상기 서열의 총 길이가 149 잔기 보다 적기 때문이다. 해당 분자 내의 그 밖의 결실은 계산 목적상 보존적 치환으로 간주된다.
키머 제조
고려된 키머 HBc 면역원은 전형적으로, 널리 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조한다. 따라서, 특정한 폴리펩티드 서열을 암호화하는 핵산 서열을, HBc를 암호화하는 전구체 서열에 가하고 이로부터 결실시켜 고려된 키머를 암호화하는 핵산을 형성시킨다.
2가지 전략 중의 어느 것이든 이종 에피토프 서열을 루프 서열 내에 위치시키는데 바람직하다. 첫 번째 전략은 면역우성 루프의 일정 부분을 암호화하는 DNA를 절단한 다음, 이를 B 세포 에피토프 등의 이종 에피토프를 암호화하는 DNA로 대체시키는 대체 전략으로 지칭된다. 두 번째 전략은 이종 에피토프를 루프 내의 인접한 잔기 사이에 삽입시키는 삽입 전략으로 지칭된다.
폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 이용한 부위 지시된 돌연변이 유발을 한 가지예시적인 대체 접근법에 사용하여, 면역우성 루프-암호화 DNA의 각 말단 근처에 있는 것인, 한 쌍의 상이한 제한 부위, 예를 들면, EcoRI 및 SacI를 암호화하는 키머 HBc DNA 서열을 제공한다. 대체된 잔기의 예는 76 내지 81 잔기이다. 상기 루프 암호화 절편을 절단하고, 이종 B 세포 에피토프를 암호화하는 목적하는 서열을 상기 제한 부위에 연결하며, 이로써 생성된 DNA를 사용하여 상기 HBc 키머를 발현시킨다. 이러한 기술의 용도 예에 대해서는 예를 들어, 문헌[Pumpens et al., (1995) Intervirology, 38:63-74]의 표 2를 참조할 수 있다.
또 다른 한편, 단일 제한 부위를 부위 지시된 돌연변이 유발에 의해 해당 영역 내로 암호화할 수 있고, 이러한 DNA를 제한 효소로 절단하여 "점착성(sticky)" 말단을 제공할 수 있으며, 이러한 점착성 말단을 엔도뉴클레아제로 평활하게 만들고, 평활 말단된 이종 DNA 세그먼트를 상기 절단된 영역에 연결시킨다. HBc 내로의 이러한 유형의 서열 대체의 예가 다음 문헌에 보고된 연구에서 발견될 수 있다[참조: Schodel et al., (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp. 319-325; Schodel et al., Behring Inst. Mitt., 1997 (98): p. 114-119 and Schodel et al., [J.] Exp. Med., (1994) 180 (3): p. 1037-4]. 후자의 2개의 문헌에는 피. 요엘리이(P. yoelii) 및 피. 베르게이(P. berghei) 각각에 대한 백신 제조법이 논의되어 있다.
HBc 면역원성 루프 내의 삽입 위치와 루프 잔기의 존재가 해당 면역원의 활성에 중요할 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 따라서, 후술되는 바와 같이, 말라리아성 B 세포 에피토프를 HBc 잔기 위치 78과 79 사이에 위치시키는 것은, 동일한 면역원이 잔기 76 내지 81의 절단 및 대체된 영역 내에 위치시키는 것 보다 10 내지 100배 더 면역원성인 높은 과립(particulate) 면역원을 제공해준다. 또한, 동일한 말라리아성 면역원을 잔기 77과 78 사이에 위치시키는 것과 비교해서 78과 79 사이에 위치시키는 것이, 면역원성을 약 15배 정도 증강시키는 예상치 못한 결과를 가져다 준다.
따라서, 삽입이 일반적으로 바람직하다. 삽입 전략의 한 예시에서, 부위 지시된 돌연변이 유발을 이용하여, 서로 인접해 있고 인접한 아미노산 잔기, 예를 들면, 잔기 위치 78 및 79에서의 잔기를 암호화하는 코돈 사이에 2개의 제한 부위를 창출시킨다. 이러한 기술은 HBc 루프 내에서 이전에 인접한 잔기들 간의 4개의 아미노산 잔기(각 제한 부위에 대해 2개씩)를 암호화하는 12개 염기 쌍이 부가시킨다.
제한 효소로 절단시키고, 이종 B 세포 에피토프 서열을 암호화하는 DNA를 연결시키며 이러한 DNA를 발현시켜 HBc 키머를 형성시키면, HBc 루프 아미노산 서열이 이의 N-말단 면 상에서, 5' 제한 부위에 의해 암호화된 2개의 잔기에 의해 중단되고, 이어서 상기 이종 B 세포 에피토프에 의해 C-말단을 향하며, 3' 제한 부위에 의해 암호화된 2개 이상의 이종 비-루프 잔기가 그 다음을 따르며, 이어서 나머지 루프 서열이 이어지는 것으로 여겨진다. 이러한 동일한 전략을 문헌[참조: Neirynck et al., (October 1999) Nature Med., 5(10):1157-1163]에 보고된 바와 같이 N-말단 서열의 도메인 I 내로 삽입하는데 사용할 수 있거나 또는 T 세포 에피토프의 일부가 아닌 하나 이상의 시스테인 잔기 또는 T 세포 에피토프의 도메인 IV내로 삽입하는데 사용할 수 있다. 잔기 82와 83 사이의 삽입을 이용한 유사한 전략이 다음 문헌에 보고되었다[참조: Schodel et al., (1990) F. Brown et al. eds., Vaccines 90, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp. 193-198].
보다 구체적으로 언급하면, 이러한 클로닝 전략이 도 2A, 2B 및 2C에 도식적으로 제시되어 있다. 도 2A에서는, C-말단 절단된 HBc 서열(HBc149)을 암호화하는 DNA 서열을 공학적으로 처리하여 잔기 78과 79 사이에 인접한 EcoRI 및 SacI 부위를 함유하도록 한다. 이러한 DNA를 양 효소로 절단하여, EcoRI 점착성 말단으로 3'-종결된 HBc 위치 1-78을 암호화하는 하나의 단편을 제공하는 반면, 다른 단편은 5' 말단 SacI 점착성 말단을 가지며 위치 79-149의 잔기를 암호화한다. 5' AATT 오버행(overhang)에 이어 목적하는 말라리아성 B 세포 에피토프를 암호화하는 서열 및 AGCT 3' 오버행을 갖는 합성 핵산을 연결하여, 통상적으로 EcoRI 부위는 파괴시키고 SacI 부위는 보존시키면서, 잔기 78과 79 사이에 2개의 이종 잔기[각각 GlyIle(GI) 및 GluLeu(EL)]에 의해 각 면 상에서 플랭킹된 B 세포 에피토프를 암호화하는 HBc 키머 서열을 제공한다.
도메인 IV 내의 시스테인 함유 서열, 예를 들면, 위치 326에서부터 위치 345까지의 피. 팔시파룸 CS 단백질 서열을 함유하고 PF/CS326-345(Pf-UTC)로서 본원에 지칭되는 특히 바람직한 말라리아성 T 세포 에피토프를 삽입하기 위한 유사한 전략이 도 2B에 도시되어 있다. 여기서, EcoRI 및 HindIII 제한 부위를 아미노산 잔기 위치 149 다음의 HBc DNA 서열 내로 공학적으로 처리한다. EcoRI 및 HindIII 로분해시킨 후, 상기 AATT 5' 오버행에 이어 T 세포 에피토프 암호화 서열, 하나 이상의 정지 코돈 및 3' AGCT 오버행을 갖는 합성 DNA를 상기 분해된 서열에 연결시켜, HBc 잔기 1-149를 암호화하는 서열에 이어, 2개의 이종 잔기(GI), 정지 코돈 및 HindIII 부위를 형성시킨다.
SacI 제한 부위에 이어, 잔기 위치 79에서 시작하는 HBc를 암호화하는 서열을 갖는 정방향 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킨 다음, SacI 및 HindIII로 분해하여, HBc 위치 79-149를 암호화하는 서열 + 2개의 부가된 잔기 및 C-말단에서의 T 세포 에피토프를 제공한다. 도 2B의 작제물을 SacI로 분해하고 연결시키면, 도 2C에 도시되는, N-말단으로부터 HBc 위치 1-78의 서열, 2개의 부가된 잔기, 말라리아성 B 세포 에피토프, 2개의 부가된 잔기, HBc 위치 79-149, 2개의 부가된 잔기 및 T 세포 에피토프를 갖는 목적하는 재조합 HBc 키머 면역원을 암호화하는 완전한 유전자가 제공된다.
유사한 기술을 사용하여, B 세포 에피토프의 접합을 위한 이종 링커 잔기를 루프 영역 서열 내에 위치시킬 수 있다. 고려된 링커 잔기에는 리신(Lys)(이것이 특히 바람직하다), 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 시스테인(Cys) 및 티로신(Tyr)이 포함된다.
서열 번호 247에 제시된 아미노산 잔기 서열이 위치 77 및 78에서 Glu 및 Asp 잔기를 함유하는 것에 주목해야 한다. 그럼에도 불구하고, 부가의 이종 카복실 함유 잔기를 도입하는 것이 여전히 고려된다. 존재하는 글루탐산 및 아스파르트산의 화학적 반응성을 기타 요인에 의해 저하시킬 수 있다. 예를 들면, 당해 분야에서는, 이웃하는 프롤린, 예를 들면, 위치 79에서 발견되는 프롤린이 근접한 카복실 그룹의 화학적 반응성을 중화시킴으로써 이를 저하시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다.
첫 번째로 언급된 삽입 전략을 사용하여, 5개의 이종 잔기를 루프 서열 내에 위치시키는데; 하나의 잔기는 B 세포 에피토프를 접합시키기 위한 이종 링커 잔기이고, 2개의 잔기는 그 자체가 루프 서열 잔기에 인접해 있고 삽입된 제한 부위(제한 효소 인공물)의 발현 생성물인 상기 하나의 잔기의 어느 한 면 상에서 인접해 있다. B 세포 에피토프에 대한 이종 링커 잔기를 암호화하는 HBc 루프 서열 내로 단일 코돈을 부가하기 위해 부위 지시된 돌연변이 유발을 이용할 수도 있다는 것에 주목해야 한다.
B 세포 또는 T 세포 에피토프를 플랭킹하는 어느 한 면 상에서의 2개의 이종 잔기의 바람직한 용도는 편의 사항이라는 것에 주목해야 한다. 그 결과로서, 삽입된 서열의 어느 한 면 또는 양면 상에서 HBc 서열의 일부가 아닌 0 내지 3개 이상의 부가된 잔기를 사용할 수도 있다. 상기 삽입물 및 HBc 핵산의 한 말단 또는 양 말단을 적당한 뉴클레아제(예: S1 뉴클레아제)로 "츄잉 백(chewed back)"하여 함께 연결될 수 있는 평활 말단을 제공할 수 있다. 삽입된 B 세포 또는 T 세포 에피토프의 일부가 아닐 뿐만 아니라 HBc 서열의 일부도 아닌 부가된 이종 잔기는 언급된 도메인에 존재하는 잔기 수로 계산되지 않는다.
니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)의 59 잔기 리불로즈 비스-포스페이트 카복실라제-옥시게나제 시그널 펩티드를 암호화하는 177개 염기 쌍 DNA를 합성하기위해 미국 특허 제5,656,472호에 예시 및 논의된 바와 같은 널리 공지된 합성 방법을 사용하여, 목적하는 재조합 HBc 키머 핵산의 전부 또는 일부를 합성할 수도 있다는 것에 주목해야 한다. 예를 들면, 도메인 III 및 IV에 연결시킬 수 있는 "점착성" 말단 또는 평활 말단을 갖는 도메인 I 및 II를 합성하여, B 세포 에피토프의 0개 부가 잔기 내지 N-말단 면을 함유하고 C-말단 면 상에 또는 도메인 II/III 연결부 또는 몇몇 기타 목적하는 위치에 0 내지 3개의 부가된 잔기를 함유하는 고려된 HBc 키머를 발현하는 작제물을 제공할 수도 있다.
대안적 삽입 기술이 다음 문헌에 보고되었다[참조: Clarke et al. (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp. 313-318]. 여기서는, 유전 암호 축퇴성(degeneracy)의 이점을 고려하여, 상기 연구자들은 잔기 위치 80 및 81에 존재하는 본래의 잔기를 암호화한 상기 위치 잔기에 상응하는 단일 제한 부위를 공학적으로 처리하였다. 이로써, 이들의 발현된 HBc 키머는 제한 부위-암호화된 잔기를 전혀 함유하고 있지 않으며, 삽입된 서열에 바로 인접한 HBc 루프의 잔기를 함유하고 있다.
앞서 기재된 HBc 키머 또는 이러한 암호화 서열의 상보체를 암호화하는 핵산 서열(세그먼트)가 또한 본원에서 고려된다. 이러한 핵산 세그먼트는 몇몇 바람직한 양태에서 분리 및 정제된 형태로 존재한다.
살아 있는 유기체에서, 특정 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 잔기 서열은 유전 암호를 통하여, 해당 단백질을 암호화하는 유전자의 데옥시리보핵산(DNA) 서열과 직접적인 관계가 있다. 따라서, 널리 공지된 유전 암호 축퇴성을 통하여,동일한 키머 아미노산 잔기 서열을 암호화하지만, 두 서열이 고도로 엄격한 조건 하에 하이브리드화되는 것이 아니라 적당히 엄격한 조건 하에 하이브리드화되기에 충분한 수준으로 전술된 유전자 서열과 상이한 부가의 DNA 및 상응하는 RNA 서열(핵산)을 필요에 따라 제조할 수 있다.
고도로 엄격한 조건은 6XSSC에서 약 50 내지 55℃ 하에 하이브리드화하고 1-3XSSC에서 68℃ 하에 최종 세척하는 것을 포함하는 것으로 규정될 수 있다. 적당히 엄격한 조건은 0.2 내지 0.3M NaCl에서 약 50 내지 약 65℃ 하에 하이브리드화한 다음, 0.2XSSC, 0.1% SDS(나트륨 도데실 설페이트)에서 약 50 내지 약 55℃ 하에 세척하는 것을 포함한다.
(1) 그 자체 또는 이의 상보체가, 잔기 위치 1에서부터 136까지의 HBc 부분(존재하는 경우)이 서열 번호 246, 247, 248, 249, 250 또는 251의 것인 키머 분자를 암호화하고; (2) 적어도 적당히 엄격한 조건(상기 논의됨) 하에서 서열 번호 274, 275, 276, 277, 278 또는 279의 DNA 서열과 하이브리드화되며; (3) 이의 HBc 서열이 서열 번호 274, 275, 276, 277, 278 및 279의 DNA 서열과 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 100%의 동일률을 나타내는 핵산(DNA 서열 또는 RNA 서열)이 DNA 변이체 서열로서 규정된다. 널리 공지된 바와 같이, 고려된 핵산 서열과 같은 핵산 서열은 본원에 논의된 바와 같은 적당한 발현 시스템에서 적당한 프로모터에 작동적으로 연결시킬 때 발현된다.
고려된 키머 분자를 암호화하는 유사체 또는 유사한 핵산(DNA 또는 RNA) 서열이 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 키머 유사체 핵산 서열 또는 이의 상보성 핵산 서열은, 서열 번호 246, 247, 248, 249, 250 및 251에 제시된 잔기 위치 1에서부터 잔기 위치 136까지의 HBc 서열 부분과 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일한 HBc 아미노산 잔기 서열을 암호화한다. 이러한 DNA 또는 RNA는 본원에서, 서열 번호 274, 275, 276, 277, 278 및 279의 핵산 서열과 "유사하거나" 또는 이의 "유사체"로서 지칭되고, 적당히 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 서열 번호 274, 275, 276, 277, 278 및 279의 핵산 서열 또는 이의 상보체와 하이브리드화된다. 적합한 형질감염 및 발현 시, 유사한 서열을 암호화하는 핵산이 또한 고려된 키머를 생성시킨다.
특별한 코돈을 특별한 아미노산 잔기를 암호화시키는데 사용하는데 있어서 상이한 숙주가 종종 선호된다. 이러한 코돈 선호도는 널리 공지되어 있고, 목적하는 키머 서열을 암호화하는 DNA 서열을, 예를 들어, 시험관내 돌연변이 유발을 이용하여 변형시켜, 해당 효소를 발현시켜야 하는 특정한 숙주에 숙주-선호된 코돈을 활용한다. 또한, 유전 암호 축퇴성을 사용하여, 서열 번호 274, 275, 276, 277, 278 또는 279의 DNA 또는 이의 상보체와의 실질적인 동일성을 피하면서, 서열 번호 246, 247, 248, 249, 250 또는 251 서열의 HBc 부분을 암호화할 수 있다. 따라서, 유용한 유사한 DNA 서열은 적당히 엄격한 조건 하에서 서열 번호 274, 275, 276, 277, 278 또는 279의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보체와 하이브리드화할 필요는 없지만, 이는 여전히 고려된 키머 분자를 제공해줄 수 있다.
적합(compatible) 숙주 유기체에서 해당 유전자의 발현을 유도하기에 적합한프로모터, 및 상기 언급된 바와 같은 고려된 키머를 암호화하는 유전자를 규정하는 외인성 핵산 세그먼트(예: DNA 세그먼트 또는 서열)에 작동적으로 연결된 벡터를 포함하는 재조합 핵산 분자(예: DNA 분자)가 또한 본 발명에서 고려된다. 보다 특히, 특정 키머, 또는 서열 번호 274, 275, 276, 277, 278 또는 279의 키머 유전자와 90% 이상의 동일성을 나타내고 적당히 엄격한 조건 하에서 하이브리드화되는 DNA 변이체의 HBc 부분에 대한 유전자를 규정하는 DNA 세그먼트에 작동적으로 연결된 숙주 유기체 세포에서 해당 키머의 발현을 유도하기 위한 프로모터를 포함하는 벡터를 포함하는 재조합 DNA 분자가 고려된다.
서열 번호 246, 247, 248, 249, 250 또는 251 서열의 HBc 부분과 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 나타내는 HBc 키머 부분의 아미노산 잔기 서열을 암호화하는 유사체 핵산 서열인 DNA 세그먼트에 작동적으로 연결된 숙주 유기체 세포에서 해당 키머의 발현을 유도하기위한 프로모터를 함유하는 벡터를 포함하는 재조합 DNA 분자가 추가로 고려된다. 상기 재조합 DNA 분자는 숙주 세포에서의 적합한 형질감염 및 발현시, 고려된 키머 분자를 제공해준다.
들다람쥐의 30개 아미노산 잔기 N-말단 서열이 기타 어떠한 HBc 서열과도 정렬되지 않기 때문에, 이러한 서열 및 이의 암호화 핵산 서열 및 이의 상보체는 상기 동일률에 포함되지 않을 뿐만 아니라 하이브리드화 결정 방법에 사용된 30-잔기 서열 또는 이의 상보체를 암호화하는 핵산 부분도 포함되지 않는다는 것에 주목해야 한다. 유사하게, HBc N- 및 C-말단 중의 어느 하나 또는 둘 다에서 절단되는서열이 동일률 산정에 포함되지 않을 뿐만 아니라 면역우성 루프 잔기가 이종 에피토프의 삽입을 위해 제거된 서열도 포함되지 않는다. 따라서, 키머 분자 내에 존재하는 HBc 서열 잔기 또는 HBc-암호화 염기 만이 동일률 산정에 포함되고 이러한 산정에서 정렬된 핵산 또는 아미노산 잔기 서열과 비교된다.
본원에 기재된 유전자에 대한 암호화 서열이 서열 번호 274, 275, 276, 277, 278 및 279에 예시되기 때문에, 분리된 핵산 세그먼트, 바람직하게는 DNA 서열, 이의 변이체 및 유사체는 당해 분야에 널리 공지되어 있고 문헌[참조: Current Protocols In Molecular Biology, Ausabel et al. eds., John Wiley & Sons (New York: 1987) p. 8.1.1-8.1.6]에 논의된 바와 같이, 특정 유전자에 대한 개시 ATG 코돈으로 시작하고 각 유전자에 대한 정지 코돈에서 종결시키거나 이러한 코돈 바로 하단에서 종결시키는 시험관내 돌연변이 유발에 의해 제조할 수 있다. 따라서, 목적하는 제한 부위를 개시 코돈에서 또는 이러한 코돈 하단, 및 정지 코돈 하단에서 공학적으로 처리하여, 기타 유전자를 제조, 절단 및 분리할 수 있다.
당해 분야에 널리 공지된 바와 같이, 요구되는 핵산, 예시적으로 DNA 서열이 존재하는 한(출발 및 정지 시그널 포함), 부가의 염기 쌍이 해당 세그먼트의 어느 한 말단에 존재하고, 이러한 세그먼트가 해당 단백질을 발현시키는데 여전히 활용될 수 있다. 물론, 이는 발현을 억제시키거나, 발현시키고자 하는 효소를 소모시키는 추가의 생성물을 발현시키거나, 상기 목적하는 효소에 의해 생성된 원하는 반응 생성물을 소모시키는 생성물을 발현시키거나 또는 상기 DNA 세그먼트의 유전자의 발현을 간섭하는, 작동적으로 연결된 DNA 서열의 세그먼트가 존재하지 않는다고가정한 것이다.
따라서, 상기 DNA 세그먼트에 이러한 간섭성 DNA 서열이 존재하지 않는 한, 본 발명의 DNA 세그먼트는 길이가 약 500 내지 약 15,000 염기 쌍일 수 있다. 복제 및 발현에 요구되는 최소 DNA 서열 전부가 경우에 따라 존재한다면, 재조합 DNA 분자, 특히 발현 벡터의 최대 크기는 대부분, 숙주 세포가 수용할 수 있는 벡터 크기에 의해 편의상 좌우된다, 최소 벡터 크기가 널리 공지되어 있다. 이러한 긴 DNA 세그먼트는 바람직하지 않지만, 사용될 수는 있다.
전술된 키머를 암호화하는 DNA 세그먼트는 화학적 기술, 예를 들면, 문헌[참조: Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc., 103: 3185]의 포스포트리에스테르 방법에 의해 합성할 수 있다. 물론, 암호화 서열을 화학적으로 합성함으로써, 목적하는 어떠한 변형물도, 본래의 아미노산 잔기 서열을 암호화하는 것을 적당한 염기로 치환함으로써 간단히 제조할 수 있다. 그러나, 전술된 서열을 포함한 DNA 세그먼트가 바람직하다.
고려된 HBc 키머는 형질전환된 수 많은 숙주 시스템, 전형적으로 숙주 세포에서 생성(발현)될 수 있긴 하지만, 비세포성의 시험관내 시스템에서의 발현도 고려된다. 이들 숙주 세포성 시스템에는 미생물, 예를 들면, 재조합 박테리오파아지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환시킨 세균; 효모 발현 벡터로 형질전환시킨 효모; 바이러스 발현 벡터(예: 바쿨로바이러스)로 감염시킨 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(예: 콜리플라워 모자이크 바이러스; 담배 모자이크 바이러스) 또는 세균성 발현 벡터(예: Ti 플라스미드)로 형질전환시킨 식물세포 시스템; 또는 적당하게 형질전환시킨 동물 세포 시스템, 예를 들면, CHO, VERO 또는 COS 세포가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 이용된 숙주 세포에 의해 제한되지 않는다.
HBc 키머를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 세그먼트는 바람직하게는, 이러한 유전자를 함유하는 재조합 DNA 분자(플라스미드 벡터)로부터 수득한다. 특정 HBc 키머의 단백질 내로의 키머 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터가 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
발현 벡터는 프로모터를 포함한 발현 제어 요소를 함유한다. 키머 암호화 유전자가 상기 발현 벡터에 작동적으로 연결되어, 프로모터 서열이 상기 키머 암호화 유전자의 RNA 폴리머라제 결합과 발현을 지시할 수 있게 해준다. 폴리펩티드 암호화 유전자를 발현하는데 있어서 유용한 것은 문헌[참조: Poszkowski et al. (1989) EMBO J., 3: 2719 and Odell et al. (1985) Nature, 313: 810]에 기재된 바와 같이 유도성, 바이러스성, 합성, 구성성 프로모터 뿐만 아니라 문헌[참조: Chua et al. (1989) Science, 244: 174-181]에 제시된 바와 같이 시간상 조절된, 공간상 조절된 및 시공간상 조절된 프로모터이다.
이. 콜라이 등의 원핵성 세포에 사용하는데 바람직한 한 가지 프로모터는 외부적으로 공급된 날리딕산에 의해 유도 가능한 Rec 7 프로모터이다. 보다 바람직한 프로모터는 외부적으로 공급된 이소프로필-β-D-티오갈락토-피라노시드(IPTG)에 의해 유도 가능한 플라스미드 벡터 JHEX25(공급원: Promega)에 존재한다. 더욱 더 바람직한 프로모터인 tac 프로모터는 플라스미드 벡터 pKK223-3에 존재하고, 이는또한, 외부적으로 공급된 IPTG에 의해 유도 가능하다. 상기 pKK223-3 플라스미드는 유도를 위해 약 25 내지 약 100μM IPTG를 사용하여, XL-1, TB1, BL21 및 BLR 등의 수 많은 이. 콜라이 균주에서 성공적으로 발현될 수 있다. 놀랍게도, 약 25 내지 약 50μM IPTG 농도가 2L 진탕 플라스크 및 발효기에서 최적의 결과를 제공해주는 것으로 밝혀졌다.
몇몇 살모넬라(Salmonella) 균주, 예를 들면, 에스. 티피(S. typhi) 및 에스. 티피무륨(S. typhimurium) 및 에스. 티피무륨-이. 콜라이 하이브리드를 사용하여, 면역원으로서 사용하기 위한 입자의 공급원으로서 및 약독화된 완전 세포 생백신 및 생접종원으로서 선행 HBc 키머 입자를 포함한 면역원성의 형질전환된 유전자를 발현하였으며, 이러한 발현 및 백신 접종 시스템이 본원에서 사용될 수 있다[참조: 미국 특허 제6,024,961호; 제5,888,799호; 제5,387,744호; 제5,297,441호; Ulrich et al., (1998) Adv. Virus Res., 50: 141-182; Tacket et al., (Aug 1997) Infect. Immun., 65 (8): 3381-3385; Schodel et al., (Feb 1997) Behring Inst. Mitt., 98: 114-119; Nardelli- Haefliger et al., (Dec 1996) Infect. Immun., 64 (12): 5219-5224; Londono et al., (Apr 1996) Vaccine, 14 (6): 545-552, 및 이들에서의 인용문헌].
진핵성 세포와 적합한 발현 벡터, 예를 들면, 효소 세포와 적합한 발현 벡터, 또는 고등 식물 또는 포유류 세포와 적합한 발현 벡터가 또한 본원에서 고려된다. 이러한 발현 벡터는 또한, 본 발명의 재조합 DNA 분자를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 효모, 예를 들면, 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에 사용하기 위한 벡터는 널리 공지된 바와 같이 에피솜성 또는 통합성일 수 있다. 진핵성 세포 발현 벡터는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 일부가 시판되고 있다. 통상적으로, 이러한 벡터는 목적하는 DNA 세그먼트와 프로모터 서열을 삽입하기 위한 하나 이상의 편리한 제한 부위를 함유하고 있다. 임의로, 이러한 벡터는 진핵성 세포에서 사용하는데 특이적인 선별성 마커를 함유한다. 에스. 세레비지애에 사용하기 위한 프로모터의 예에는 에스. 세레비지애 포스포글리세르산 키나제(PGK) 프로모터 및 분기성(divergent) 프로모터 GAL 10 및 GAL 1이 포함되는 반면, 알코올 옥시다제 유전자(AOX1)가 피치아 파스토리스에 대한 유용한 프로모터이다.
예를 들면, 메틸-향성 효모인 피. 파스토리스(P. pastoris)에서 키머를 생성하기 위해서는, 목적하는 키머를 암호화하는 유전자를, 피치아 내에서의 구조 유전자의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에 놓아둔다. 이로써 생성된 발현-적격한 형태의 이들 유전자를 피치아 세포 내로 도입한다.
보다 구체적으로 언급하면, 문헌[참조: Cregg et al. (1987) Biotechnology, 5: 479-485 ; (1987) Molecular and Cellular Biology, 12: 3376-3385]에 기재된 형질전환 및 발현 시스템을 사용할 수 있다. 키머 V12.Pf3.1에 대한 유전자를 알코올 옥시다제 유전자(AOX1) 프로모터로부터의 하단 및 동일한 AOX1 유전자의 전사 종결인자 서열로부터의 상단에 놓아둔다. 이어서, 상기 유전자 및 이의 플랭킹 조절 영역을, 피. 파스토리스 HIS4 유전자와 피. 파스토리스 ARS 서열(자동 복제 서열) 모두를 수반하는 플라스미드 내로 도입하여, 피. 파스토리스 세포에서의 플라스미드 복제를 가능케한다[참조: Cregg et al. (1987) Molecular and Cellular Biology, 12: 3376-3385].
상기 벡터는 또한, 이. 콜라이 세포에서의 해당 플라스미드의 성장을 허용해 주는데 적당한 플라스미드(예: pBR322) 부분을 함유한다. 이로써 생성된, 키머 유전자 뿐만 아니라 상기 언급된 각종 부가의 요소를 수반하는 플라스미드를, 피. 파스토리스의 his4 돌연변이체, 즉 기능상 히스티디놀 데하이드로게나제 유전자가 결여된 균주 세포 내로 예시적으로 형질전환시킨다.
히스티딘이 결여된 배지 상에서 형질전환체 콜로니를 선별한 후, 문헌[참조: Cregg et al. (1987) Molecular and Cellular Biology, 12: 3376-3385]에 기재된 바와 같이, 히스티딘이 결여되긴 하지만 메탄올을 함유하는 배지 상에서 세포를 성장시켜, AOX1 프로모터를 유도시킨다. 이와 같이 유도된 AOX1 프로모터는 키머 단백질의 발현과 피. 파스토리스 내에서의 키머 입자의 생성을 유발시킨다.
고려된 키머 유전자는, 문헌[참조: Cregg et al. (1987) Molecular and Cellular Biology, 12: 3376-3385]에 기재된 바와 같이, ARS 서열의 사용을 요구하지 않는 통합 형질전환에 의해 도입될 수도 있다.
포유류 세포에서 재조합 DNA 발현시킴으로써 키머 입자를 생성하는 것은, 상기 키머 유전자를 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현시킬 수 있는 재조합 DNA 벡터를 사용하여 예시적으로 수행된다. 이는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nded.,Cold Spring Harbor Laboratories (1989)]에 보다 상세히 기재되는 과정을 수행하여 달성한다.
한 가지 예시적 예에서는, 원숭이 바이러스(SV40)-이용 발현 벡터인 pKSV-10(Pharmacia Fine Chemicals, Piscatway, NJ)를 대상으로 하여, NcoI 및 HindIII에 의해 제한 엔도뉴클레아제 분해시킨다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 목적하는 HBc 키머를 암호화하는 NcoI/HindIII 서열 단편을 발현 플라스미드에 연결시키면, pSV-Pf로 명명된 환형 재조합 발현 플라스미드가 형성된다.
발현 플라스미드 pSV-Pf는 본래의 이. 콜라이 앰피실린 내성 유전자를 함유한다. 따라서, pSV-Pf로 형질전환될 때, 이. 콜라이 RR101(Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD)은 해당 플라스미드를 함유하는 세균에 대한 앰피실린 내성을 기준으로 하여 선별할 수 있다. 이어서, 플라스미드 함유 세균을 클로닝하고, 이 클론을 대상으로 하여, 삽입된 암호화 유전자가 발현 벡터 내로 적당히 배향되었는지에 대해 연속적으로 스크리닝한다.
목적하는 HBc 키머를 암호화하는 유전자를 함유하는 상기 수득된 플라스미드 pSV-Pf는, 이러한 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이를 배양함으로써 증식시킨다. 이 플라스미드 DNA를 상기 삼브룩(Sambrook) 등의 문헌에 기재된 바와 같이 이. 콜라이 배양물로부터 분리한다.
키머의 발현은, 문헌[참조: Graham et al. (1973) Virol., 52: 456]의 인산칼슘 매개된 형질감염 방법, 또는 유사한 기술을 사용하여, pSV-Pf를 포유류 세포주, 예를 들면, CHO 세포 내로 도입함으로써 달성시킨다.
pSV-Pf를 배양물 중의 CHO 세포 내로 도입하는데 있어서 최대 효율을 보장하기 위해, 문헌[참조: Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet., 1: 327]에 기재된 바와 같이, 제2 플라스미드 pSV2NEO(ATCC #37149) 및 세포독성 약물 G418 (GIBCO Laboratories, Grand Island, N. Y.)의 존재 하에 형질감염을 수행한다. G418에 대해 내성인 CHO 세포를 배양하고, 양 플라스미드 pSV2NEO 및 pSV-Pf를 획득하며, 이를 CHO/pSV-Pf 세포로 명명하였다. pSV-Pf 발현 벡터의 유전적 설계를 통하여, 상기 생성된 CHO/pSV-Pf 세포에서 특정 키머를 발현시키고, 이들 세포의 세포질에서 탐지한 다음 이들로부터 정제할 수 있다. 이로써 생성된, 세포성 단백질을 함유하는 조성물을 본원에 논의되는 바와 같이 칼럼 상에서 분리시킨다.
발현 벡터의 선택과, 궁극적으로 키머 암호화 유전자가 작동적으로 연결되는 프로모터의 선택은 목적하는 기능상 특성, 예를 들면, 단백질 발현 위치 및 시기, 및 형질전환시키고자 하는 숙주에 직접적으로 좌우된다. 재조합 DNA 분자 작제 분야에 내재된 널리 공지된 제한 요인이 있다. 그러나, 본 발명을 실시하는데 유용한 벡터는 복제를 지시할 수 있고, 바람직하게는 DNA 세그먼트에 포함된 키머 유전자(이것이 상기 세그먼트에 작동적으로 연결된다)의 발현(발현 벡터 경우)을 지시할 수 있다.
한 가지 바람직한 양태에서는, 당해 키머를 발현하는 숙주가 원핵생물인 이. 콜라이이고, 바람직한 벡터가 원핵성 레플리콘, 즉 형질전환된 원핵성 숙주 세포에서 염색체외적으로 재조합 DNA 분자의 자동 복제 및 유지를 지시하는 능력을 지닌 DNA 서열을 포함한다. 이러한 레플리콘이 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
원핵성 레플리콘을 포함하는 벡터는 또한, 이를 이용하여 형질전환된 숙주 세포(예: 이. 콜라이)에서 고려된 HBc 키머 유전자의 발현을 지시할 수 있는 원핵성 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 세균성 숙주와 화합성인 프로모터 서열이 전형적으로, 고려된 DNA 세그먼트의 삽입을 위한 하나 이상의 편리한 제한 부위를 함유하는 플라스미드 벡터에 제공된다. 이러한 벡터 플라스미드의 전형적인 예가 pUC8, pUC9 및 pBR329(공급원: Biorad Laboratories, Richmond, CA), 및 pPL 및 pKK223-3 (공급원: Pharmacia, Piscataway, NJ)이다.
고등 식물 및 포유류로부터의 세포에서 유전자를 발현하는데 유용한 전형적인 벡터는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이에는 문헌[참조: Rogers et al. (1987) Meth. in Enzymol., 153: 253-277]에 기재된 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 종양 유도성(Ti) 플라스미드로부터 유도된 식물 벡터; 및 상기 포유류 발현 벡터 pKSV-10, 및 pCI-neo (Promega Corp., #E1841, Madison, WI)가 포함된다. 그러나, 문헌[참조: Fromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 58-24]에 기재된 pCaMVCN 전이 제어 벡터를 포함한 몇몇 기타 발현 벡터 시스템이 식물에서 작용하는 것으로 공지되어 있다. 플라스미드 pCaMVCN(공급원: Pharmacia, Piscataway, NJ)에는 콜리플라워 모자이크 바이러스 CaMV 35S 프로모터가 포함된다.
상기 식물 발현 시스템은 전형적으로, 삽입된 형질전환된 유전자의 체계적(systemic) 또는 구성적(constitutive) 발현을 제공해준다. 체계적 발현은, 대부분의 식물 또는 모든 식물을 고려된 키머 분자 또는 생성된 입자에 대한 공급원으로서 사용하는 경우 또는 식물의 상당 부분이 경구용 백신을 제공하기 위해 사용되는 경우에 유용하다. 그러나, 이는 키머 분자 또는 입자를 식물 저장 기관, 예를 들면, 뿌리, 씨앗 또는 열매(이로부터 상기 입자가 보다 용이하게 분리 또는 섭취될 수 있다)에서 발현시키는데 보다 효율적일 수 있다.
저장 기관 발현을 달성하는 한 가지 방식은 하나 이상의 예비선별되거나 예정된 비-광합성 식물 기관에 이의 제어된 유전자를 발현시키는 특정 프로모터를 사용하는 것이다. 다른 기관에서는 거의 또는 전혀 발현되지 않으면서 하나 이상의 예비선별된 저장 기관에서 발현되는 것(예를 들면, 잎 또는 줄기에 대한 뿌리, 씨앗 또는 열매)이 본원에서는 증강된 발현 또는 우선적 발현으로 지칭된다. 5:1 이상 비율로, 또 다른 기관과 비교해서 하나 이상의 예비선별된 기관에서의 발현을 지시하는 것으로 예시되는 프로모터는 본원에서 기관-증강된 프로모터로서 규정된다. 실질적으로 단지 1개의 저장 기관에서만 발현되고 다른 저장 기관에서는 실질적으로 전혀 발현되지 않는 것은 본원에서 기관-특이적 발현으로서 지칭되는데, 즉 한 저장 기관에서의 발현 생성물 대 또 다른 저장 기관에서의 발현 생성물의 비가 약 100:1 이상인 것은 기관 특이성을 지시해준다. 따라서, 저장 기관 특이적 프로모터는 저장 기관-증강된 프로모터 부류의 구성원이다.
식물 저장 기관의 예에는 당근, 타로토란 또는 카사바, 감자 괴경의 뿌리, 및 열매, 예를 들면, 레드 구아바, 시계풀 열매, 망고, 파파야, 토마토, 아보카도, 체리, 탄제린, 만다린, 야자, 메론(예: 칸타로프 및 수박) 및 기타 신선한 열매, 예를 들면, 스쿼시, 오이, 망고, 살구, 복숭아의 알맹이 뿐만 아니라 옥수수, 대두, 벼, 평지씨 등의 씨앗이 포함된다.
CaMV 35S 프로모터는 통상 구성적 프로모터로 간주된다. 그러나, 최근의 조사 결과, CaMV 35S 프로모터의 21-bp 영역이 또 다른 이종 통상 그린 조직(green tissue) 프로모터인 rbcS-3A 프로모터에 작동적으로 연결되는 경우에, 이로써 생성된 키머 프로모터가 뿌리-증강된 프로모터로 될 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 이러한 21-bp 서열이 미국 특허 제5,023,179호에 기재되어 있다. 미국 특허 제5,023,179호의 21-bp 삽입물을 함유하는 키머 rbcS-3A 프로모터가 본원에 유용한 뿌리-증강된 프로모터이다.
상기 21-bp 세그먼트를 포함하는 유사한 뿌리-증강된 프로모터는 CAMV 35S 프로모터 자체의 -90 내지 +8 영역이다. 미국 특허 제5,110,732호에는 상기 절단된 CaMV 35S 프로모터가, 뿌리, 및 뿌리가 될 운명의 조직인 씨앗 근생에서의 발현 증강을 제공해준다고 기재되어 있다. 이러한 프로모터가 또한 본원에서도 유용하다.
또 다른 유용한 뿌리-증강된 프로모터는 PCT/GB92/00416(1991. 9. 19.자로 공개된 WO 91/13922)에 기재된 평지씨(Brassica napus L.) 유전자의 -1616 내지 -1 프로모터이다. 상기 프로모터를 함유하는 플라스미드 pRlambdaS4 및 박테리오파아지 람다.베타.1을 수반하는 이. 콜라이 DH5.알파.가 1990년 3월 8일자로 기탁기관[the National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, GB]에 기탁되었으며, 이는 수탁 번호 NCIMB40265 및 NCIMB40266이다. 이러한 프로모터의 유용한 부분은, 상기 플라스미드를 HaeIII로 절단함으로써 1.0kb 단편으로서 수득할 수 있다.
바람직한 뿌리-증강된 프로모터는 문헌[참조: DiRita and Gelvin (1987) Mol. Gen. Genet, 207: 233-241]에 기재된 플라스미드 pKan2에 존재하는 만노파인 신타제(mas) 프로모터이다. 이러한 프로모터는 이의 플라스미드 pKan2로부터 XbaI-XbalI 단편으로서 제거 가능하다.
바람직한 만노파인 신타제 뿌리-증강된 프로모터는 위치 -138까지의 코어 만노파인 신타제(mas) 프로모터 영역과 -318에서부터 -213까지의 만노파인 신타제 활성인자로 구성되고, 이는 집합적으로 AmasPmas로서 지칭된다. 이러한 프로모터는 담배 뿌리에서의 생성을, 잎 발현 수준과 비교해서 약 10 내지 약 100배 정도 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
또 다른 뿌리 특이적 프로모터는 측생(lateral) 뿌리 개시 동안 발현되고 문헌[참조: Keller et al. (1989) Genes Dev., 3: 1639-1646]에 보고된, 하이드록시프롤린-풍부한 글리코프레프로테인 유전자인 HRGPnt3을 수반하는 약 500bp의 5' 플랭킹 서열이다. 또 다른 바람직한 뿌리-특이적 프로모터는 문헌[참조: Yamamoto et al. (1991) Plant Cell, 3: 371-381]에 보고된 담배 뿌리-특이적 유전자 ToRBF의 약 -636 내지 -1의 5' 플랭킹 영역에 존재한다. 상기 저자에 의하면, 발현을 조절하는 시스-작용성 요소가 전사 개시 부위로부터 약 -636 내지 약 -299의 5' 영역에 보다 특정하게 위치하고 있다. 야마모토(Yamamoto) 등은 잎, 어린가지 분열조직 또는 줄기에서가 아니라 뿌리에서 상기 ToRBF 유전자로부터의 정상 상태 mRNA 생성을 보고하였다.
또 다른 유용한 저장 기관 특이적 프로모터는 토마토(Lycopersicon esculentum)의 열매-숙성 유전자 E8의 5' 및 3' 플랭킹 영역이다. 이들 영역 및 이들의 cDNA 서열이 문헌[참조: Deikman et al. (1988) EMBO J., 7 (11): 3315-3320 and (1992) Plant Physio., 100: 2013-2017]에 예시 및 논의되어 있다.
3개 영역이 상기 유전자의 5' 플랭킹 서열의 2181bp에 위치하고, 폴리(A) 부가 부위에 대해 3'인 522bp 서열이 상기 E8 유전자의 발현을 제어하는 것으로 보인다. -2181에서부터 -1088까지의 하나의 영역이, 미숙성 열매 내에서의 E8 유전자 개시를 에틸렌에 의해 활성화시키는데 요구되고, 이는 숙성 동안 전사를 유발시킨다. 2개의 추가의 영역, 즉 -1088 내지 -863 및 -409 내지 -263은 미숙성 열매에서 에틸렌 반응성을 부여할 수는 없지만, 숙성 동안 E8 유전자 발현시키기에는 충분하다.
옥수수에서, 이의 제어된 효소를 내배유에서는 고수준으로 발현하고, 뿌리에서는 상당히 저하된 수준으로 발현하며 그린 조직 또는 화분에서는 전혀 발현하지 않는 옥수수 슈크로즈 신타제-1(Sh) 프로모터가, 특정하게는 줄기와 뿌리에 풍부한 담배 인피부 세포에서 키머 리포터 유전자인 β-글루쿠로니다제(GUS)를 발현하는 것으로 보고되었다[참조: Yang et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 87: 4144-4148]. 따라서, 이러한 프로모터는 식물 기관, 예를 들면, 멜론(예: 칸타루프)와 같은 신선한 열매, 또는 내배유를 함유하는 씨앗 및 고수준의 인피유 세포를 갖는 뿌리에 유용하다.
조직 특이적 프로모터의 또 다른 예는 씨앗 조직에 특이적인 레시틴 프로모터이다. 대두유 씨앗 중의 레시틴 단백질은 씨앗 성숙 동안에만 발현되는 단일 유전자(Le1)에 의해 암호화되고, 이는 전체 씨앗 mRNA의 약 2 내지 약 5%를 차지한다. 상기 레시틴 유전자 및 씨앗 특이적 프로모터가 완전히 성상 확인되었으며, 이를 사용하여 형질전환성 담배 식물에서의 씨앗 특이적 발현을 지시하였다[참조: Vodkin et al. (1983) Cell, 34: 1023 and Lindstrom et al. (1990) Developmental Genetics, 11: 160].
특히 바람직한 괴경 특이적 발현 프로모터는 감자 파타틴(patatin) 유전자의 5' 플랭킹 영역이다. 이러한 프로모터의 용도가 문헌[참조: Twell et al. (1987) Plant Mol. Biol., 9: 365-375]에 기재되어 있다. 상기 프로모터는 박테리오파아지 LPOTI의 약 406bp 단편으로 존재한다. 이러한 LPOTI 프로모터는 4개의 기타 파타틴 프로모터와 90% 이상의 상동성을 나타내고 파타틴 프로모터 PGT5와 모든 400개 염기에 걸쳐 약 95%의 상동성을 나타내는 영역을 갖는다. 이들 프로모터 각각이 본원에서 유용하다[참조: Wenzler et al. (1989) Plant Mol. Biol., 12: 41- 50].
추가의 기관 증강된 및 기관 특이적 프로모터가 문헌[참조: Benfey et al. (1988) Science, 244: 174-181]에 기재되어 있다.
활용된 각각의 프로모터 서열은 세포 내의 키머 분자 또는 입자의 양에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 영향을 받지 않는"이란, 해당 프로모터가, 형질전환된 세포 또는 형질전환성 식물에 축적된 키머 분자 또는 입자에 의해 피드백 제어(억제)를 지시하도록 반응성이지 않다는 것을 의미한다.
아그로박테륨 투메파시엔스를 사용한 식물 세포의 형질감염은 전형적으로, 쌍떡잎 식물 상에서 가장 잘 수행된다. 외떡잎 식물은 통상적으로, 소위 원형질체의 직접적인 유전자 전이에 의해 대부분 용이하게 형질환된다. 직접적인 유전자 전이는 통상적으로, 전기천공, 폴리에틸렌글리콜 매개된 전이, 또는 필요한 DNA를 수반하는 마이크로포사체에 의해 세포에 충격을 가함으로써 수행한다. 이들 형질감염 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으므로, 본원에서 추가로 논의될 필요가 없다. 형질감염된 세포와 원형질체로부터 완전 식물을 재생시키는 방법이 또한, 식물 조직으로부터 목적하는 단백질을 수득하기 위한 기술로서 당해 분야에 널리 공지되어 있다[참조: 미국 특허 제5,618,988호 및 제5,679,880호, 및 이에 인용된 인용문헌].
아그로박테륨 형질전환, 전기천공 또는 기타 방법을 사용하여 형성된 형질전환성(transgenic) 식물은 전형적으로, 하나의 염색체 상에 단일 유전자를 함유한다. 이러한 형질전환성 식물은 부가된 유전자에 대해 이형접합성인 것으로 지칭될 수 있다. 그러나, "이형접합성"이란 용어를 사용한다는 것은 통상적으로, 한 쌍의 염색체의 제2 염색체의 동일한 유전자좌에 상보성 유전자가 존재한다는 것을 의미하고, 이와 같이 하나의 부가된 유전자를 함유하는 식물에서는 상기 유전자가 존재하지 않다는 것을 의미하므로, 이러한 식물에 대한 보다 정확한 명칭은 독립적인 분리체인 것으로 여겨지는데, 이는 부가된 외인성 키머 분자 암호화 유전자가 유사분열 및 감수분열 동안 독립적으로 분리되기 때문이다. 고려된 HBc 키머 분자를암호화하는 단일 구조 유전자를 구동시키는 기관 증강된 프로모터를 함유하는 형질전환성 식물, 즉 독립적인 분리체가 바람직한 형질전환성 식물이다.
보다 바람직한 것은 부가된 구조 유전자에 대해 동형접합성인 형질전환성 식물, 즉 염색체 쌍의 각 염색체 상의 동일한 유전자좌에 한 유전자씩 2개의 부가된 유전자를 함유하는 형질전환성 식물이다. 동형접합성 형질전환성 식물은, 단일 부가된 유전자를 함유하는 독립적인 분리체 형질전환성 식물을 성적 교배(자가생식)시키고, 이로써 생성된 씨앗 일부를 발아시킨 다음, 이로써 생성된, 증강된 키머 입자 축적을 위해 생성된 식물을 대조군(본래의 비-형질전환성) 또는 독립적인 분리체 형질전환성 식물과 비교하여 분석함으로써 수득할 수 있다. 동형접합성 형질전환성 식물은 본래의 비-형질전환성 식물과 독립적인 분리체 형질전환성 식물 모두와 비교해서 증강된 키머 입자 축적을 나타낸다.
2개의 상이한 형질전환성 식물을 교배시켜 2가지 독립적으로 분리되는 부가된 외인성(이종) 유전자를 함유하는 자손을 생성할 수 있다는 것은 인식해야 한다. 적당한 자손을 자가생식시켜, 키머 HBc 분자를 암호화하는 양 부가된 외인성 유전자에 대해 동형접합성인 식물을 생성시킬 수 있다. 모 식물에 대한 역교잡(back-crossing) 및 비-형질전환성 식물과의 이계교잡이 또한 고려된다.
따라서, 본 발명의 형질전환성 식물은 고려된 키머 HBc 분자를 암호화하는 이종 구조 유전자를 갖는다. 바람직한 형질전환성 식물은 부가된 이종 키머 HBc 구조 유전자에 대한 독립적인 분리체이고, 이러한 유전자를 이의 자손에게 유전시킬 수 있다. 보다 바람직한 형질전환성 식물은 상기 이종 유전자에 대해 동형접합성이고, 성적 교배시 이러한 유전자를 이의 자손 모두에게 유전시킨다.
키머 HBc 분자를 암호화하는 유전자는 천연상 식물에 존재하지 않기 때문에, 고려된 형질전환성 식물은, 양 식물을 동일한 조건 하에 생장시킬 경우, 동일한 유형 또는 균주의 비-형질전환된 식물 보다 더 많은 양으로 키머 HBc 분자 입자를 축적시킨다.
"동일한 유형" 또는 "동일한 균주"란 표현은 본원에서, 형질전환되지 않은 식물과 동일한 교잡 또는 클론의 식물을 의미한다. 광범위하게 동계 교배된 식물을 사용한 경우와 같이, 특정 교잡의 자매 세포 간의 대립유전자성 변이가 적을 경우에는, 자매 세포들 간의 비교를 이용하거나 또는 몇 가지 자매 세포를 사용하여 수득된 평균치를 사용할 수 있다. 그 밖에도, 클론이 상기 비교에 바람직하다.
형질전환성 식물로부터의 씨앗을 온실 필드, 창턱 등에서 생장시키고, 이로써 생성된 성적으로 성숙한 형질전환성 식물을 자가-화분시켜 진정한 품종개량(breeding) 식물을 생성시킨다. 이들 식물로부터의 자손이 진정한 품종개량 주가 되는데, 이는 환경적인 조건 범위 하에서 바람직하게는 필드에서의 키머 HBc 분자 입자 축적에 대해 평가한 것이다.
키머 HBc 분자 입자 축적에 대해 동형접합성인 형질전환성 식물을 기타 목적하는 특징을 지닌 모 식물과 교잡시킨다. 키머 HBc 분자 입자 축적에 대해 이형접합성이거나 독립적으로 분리 가능한 자손을 한 부모 또는 다른 부모와 역교잡시켜, 키머 HBc 분자 입자 축적과 기타 목적하는 특징을 나타내는 형질전환성 식물을 수득한다. 이러한 자손과 부모와의 역교잡을 1회 이상 반복하여, 수 많은 바람직한특징을 보유하고 있는 형질전환성 식물을 수득할 수 있어야 한다.
곤충 세포 시스템을 사용하여 HBc 키머를 발현시킬 수도 있다. 예를 들면, 이러한 한 시스템에서는, 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드론형성 바이러스(AcNPV) 또는 바쿨로바이러스를 벡터로서 사용하여, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 또는 트리코플루시아(Trichoplusia) 유충에서 외래 유전자를 발현시킨다.
키머를 암호화하는 서열을 상기 바이러스의 비-필수 영역, 예를 들면, 폴리헤드린 유전자 내로 클로닝시키고, 이를 폴리헤드린 프로모터의 제어 하에 놓아둔다. 키머 서열의 성공적인 삽입으로 인해, 상기 폴리헤드린 유전자가 불활성이 되고, 코트 단백질이 결여된 재조합 바이러스가 생성된다. 이어서, 이러한 재조합 바이러스를 사용하여, 예를 들면, 에스. 프루기페르다(S. Frugiperda) 세포 또는 트리코플루시아 유충을 감염시키면, 여기서 HBc 키머를 발현시킬 수 있다[참조: E. Engelhard et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91: 3224-3227; and V. Luckow, Insect Cell Expression Technology, pp. 183-218, in Protein Engineering: Principles and Practice, J. L. Cleland et al. eds., Wiley-Liss, Inc, 1996]. 오토그라파 칼리포르니카 핵 폴리헤드론형성 바이러스(AcNPV)의 폴리헤드린 프로모터의 제어 하에 놓여진 이종 유전자가 종종, 감염 후기 단계 동안 높은 수준으로 발현된다.
이러한 키머 유전자를 함유하는 재조합 바쿨로바이러스는, Bac-To-Bac™ 바쿨로바이러스 발현 시스템(Life Technologies)으로서 시판되고 있는, 바쿨로바이러스 셔틀 벡터 시스템[참조: Luckow et al. (1993) J. Virol., 67: 4566-4579]을 사용하여 작제한다. 재조합 바이러스의 스톡을 제조하고, 재조합 단백질의 발현을 표준 프로토콜에 의해 모니터한다[참조: O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York, 1992; and King et al., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman & Hall, London, 1992].
DNA를 상보성 부착 말단 또는 평활 말단을 통하여 벡터에 작동적으로 연결시키기 위한 각종 방법이 개발되었다. 예를 들면, 상보성 단독중합체 트랙을, 벡터 DNA 내로 삽입시키고자 하는 DNA 세그먼트에 부가할 수 있다. 이어서, 상기 벡터와 DNA 세그먼트를 상기 상보성 단독중합체성 테일 사이의 수소 결합에 의해 연결시켜 재조합 DNA 분자를 형성시킨다.
또 다른 한편, 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 합성 링커를 사용하여, DNA 세그먼트를 전술된 바와 같이 발현 벡터에 연결시킬 수 있다. 평활-말단화 DNA 세그먼트를, 평활-말단화 DNA 분자의 연결을 촉매할 수 있는 효소, 예를 들면, 박테리오파아지 T4 DNA 리가제의 존재 하에 과량의 합성 링커 분자와 함께 항온 배양함으로써, 상기 합성 링커를 평활-말단화 DNA 세그먼트에 부착시킨다.
따라서, 이러한 반응 생성물은 이들의 말단에 합성 링커 서열을 수반하는 DNA 세그먼트이다. 이어서, 이들 DNA 세그먼트를 적당한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 상기 합성 링커와 화합성인 말단을 생성시키는 효소를 사용하여 절단시킨 발현 벡터 내로 연결시킨다. 각종의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 합성 링커는 수 많은 공급원으로부터 시판중이다[New England BioLabs, Beverly, MA 포함]. 목적하는 DNA 세그먼트는 또한, 정방향 및 역방향 프로모터가, 해당 유전자를 벡터 내로 삽입시킬 수 있도록 증폭 후 절단될 수 있는 목적하는 제한 부위을 함유하는 PCR 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 또 다른 한편, PCR 생성물을, 당해 분분야에 널리 공지된 바와 같이, T-오버행을 함유하는 벡터(Promega Corp., A3600, Madison, WI) 내로 직접적으로 클로닝시킬 수 있다.
발현된 키머 단백질은, 숙주 세포가 단일 세포든 아니면 다세포 숙주 내의 세포든지 간에 이러한 숙주 세포 내에서 입자 내로 자기-어셈블리된다. 상기 입자 함유 세포를 표준 과정을 이용하여 수거하고, 이 세포를 프렌치 압력 세포, 리소자임, 초음파기, 비드 비터 또는 미세유동화기(Microfluidics International Corp., Newton MA)를 사용하여 용해시킨다. 상기 용해물을 정화시킨 후, 입자를 45% 황산암모늄으로 침전시키고, 20mM 인산나트륨(pH 6.8)에 재현탁시키며, 동일한 완충액에 대해 투석시킨다. 이와 같이 투석시킨 물질을 간단히 원심분리시킴으로써 정화시키고, 상등액을 대상으로 하여, 세파로즈®CL-4B를 사용하여 겔 여과 크로마토그래피한다. 입자 함유 분획을 동정하고, 이를 대상으로 하여, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피하며, 황산암모늄으로 재침전시키고, 재현탁시키며, 투석시킨 다음, 멸균 여과시키고 -70℃에서 저장한다.
HBc 키머 접합체
B 세포 또는 T 세포 반응이 요망되는 어떠한 합텐도, 고려된 HBc 키머 또는 키머 입자, 예를 들면, 이종 링커 잔기, 예를 들면, 리신, 글루탐산 또는 아스파르트산, 도메인 II의 루트 영역 내의 시스테인 또는 티로신 및 도메인 IV 내의 부가된 시스테인 잔기를 함유하는 키머 입자에 연결시켜 HBc 키머 접합체를 형성할 수 있다. 관심있는 합텐은 전형적으로, B 세포 면역원이다. 이러한 합텐은 폴리펩티드, 탄수화물(삭카라이드, 즉 올리고- 또는 폴리삭카라이드), 또는 비-폴리펩티드, 비-탄수화물 화학물질, 예를 들면, 2,4-디니트로벤젠 또는 약제, 예를 들면, 코카인 또는 니코틴일 수 있다. 이로써 형성된 HBc 키머 입자 접합체는 후술되는 바와 같이, 접종원 또는 백신으로서 유용하다. 이러한 키머 단백질이 발현시 자기-어셈블리되고 접합체가 발현 후에 형성되기 때문에, 접합체 형성은 전형적으로, 자유 단백질 분자와 비교해서 상기 어셈블리된 입자를 사용하여 수행한다.
개개의 합텐을 특정 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 잔기 측쇄를 통하여, 이러한 단백질 또는 폴리펩티드에 작동적으로 연결시켜 펜던트하게 연결된 면역원성 접합체를 형성시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 방법에는 각종 측쇄 상의 한 가지 이상 유형의 작용성 그룹을 통하여 연결시켜, 합텐과 펜던트하게 연결[공유적으로 연결됨(커플링됨)]되지만 하나 이상의 측쇄에 의해 분리되는 입자 내에 수송체 단백질 폴리펩티드 주쇄(본원에서는, HBc 키머)를 발생시키는 방법이 포함된다.
상기 작용성 그룹 각각을 사용하여 수송체 단백질을 합텐에 연결시키는 방법이 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: Erlanger, (1980) Method of Enzymology, 70: 85; Aurameas et al., (1978) Scand. J. Immunol., Vol. 8, Suppl. 7,7-23 and U. S. Patent No. 4,493,795 to Nestor et al]. 또한, 문헌[참조: Rodwell et al. (1985) Biotech., 3: 889-894]에 기재된 바와 같은 부위-지시된 커플링 반응을 수행하여, 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성이 실질적으로 감소되지 않도록 할 수 있다.
더우기, 당해 분야에 널리 공지된 바와 같이, HBc 단백질과 폴리펩티드 합텐 둘 다를 이들의 본래의 형태로 사용할 수 있거나 또는 이들의 작용성 그룹 내용을, 리신 잔기를 석시닐화하거나 시스테인-티오락톤과 반응시킴으로써 변형시킬 수 있다. 아미노 작용성 그룹을 2-이미노티올란, 3-(3-디티오피리딜)-프로피오네이트의 N-하이드록시석신이미드 에스테르, 또는 당해 분야에 공지된 기타 시약과 반응시킴으로써, 설프하이드릴 그룹을 수송체 단백질 또는 접합체 내로 도입시킬 수도 있다.
당해 HBc 키머 또는 합텐을 또한 변형시켜 스페이서 암, 예를 들면, 헥사메틸렌 디아민 또는 또 다른 이작용성 분자를 도입시킴으로써 펜던트 연결을 촉진시킬 수 있다. 이러한 과정이 다음에 논의되어 있다.
폴리펩티드 합텐을 공유 결합시키는 방법은 매우 다양하고, 이는 면역학 분야 업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,818,527호에 따르면, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르((ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA) 또는 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-l-카복실레이트(SMCC, Pierce Chemical Co., Rockford, IL)를 적당한 HBc 키머와 반응시켜 활성화된 수송체를 형성한다.
이어서, 이러한 활성화된 수송체를 합텐, 예를 들면, 설프하이드릴-말단화 합텐, 또는 말단 시스테인을 함유하거나 부가의 아미노- 또는 카복시-말단 시스테인 잔기가 부가된 폴리펩티드와 반응시켜 공유적으로 결합된 HBc 키머 접합체를 형성시킨다. 대체 예로서, 폴리펩티드 합텐의 아미노 그룹을 먼저, N-석신이미딜 3-(2-피리딜티오)프로피오네이트(SPDP, Pharmacia, Piscataway, NJ)와 반응시키고, 이러한 티올 함유 폴리펩티드를 환원 후 상기 활성화된 수송체와 반응시킨다. 물론, 황 함유 잔기와 이중 결합 함유 미카엘(Michael) 수용체를 역전시킬 수 있다. 이들 반응은 공급업자의 문헌과 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: Kitagawa, et al. (1976) J. Biochem., 79: 233 and in Lachmann et al., in 1986 Synthetic Peptides as Antigens, (Ciba Foundation Symposium 119), pp. 25-40 (Wiley, Chichester: 1986].
미국 특허 제4,767,842호에는 본원에 유용한, 수송체와 폴리펩티드 간의 공유 부착에 관한 몇 가지 방식이 교시되어 있다. 한 방법에서는, 톨릴렌 디이소시아네이트를 0℃에서 디옥산-완충제 용매 중에서 해당 수송체와 반응시켜 활성화된 수송체를 형성시킨다. 이어서, 폴리펩티드 합텐을 혼합시키고, 이를 상기 활성화 수송체와 반응시켜 공유 결합된 HBc 키머 접합체를 형성시킨다.
HBc 키머 또는 합텐 내의 티올과 그 자체 간의 디설파이드 연결을 창출시키는 것으로 전술된, 하나의 작용성 그룹에 디설파이드 연결을 형성하고 다른 작용성그룹에 아미드 연결을 형성하는 수 많은 헤테로-이작용성 제제[N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트(SPDP) 포함]가 특히 유용하다. 시약의 예에는 폴리펩티드 합텐 중의 시스테인 잔기, 및 커플링 파트너 상의 아민, 예를 들면, 리신의 ε-아민 또는 수송체 단백질 중의 기타 자유 아미노 그룹이 포함된다. 이러한 각종의 디설파이드/아미드 형성 시약이 공지되어 있다[참조: Immun. Rev. (1982) 62: 185].
기타 이작용성 커플링 제제는 디설파이드 연결이 아닌 티오에테르를 형성한다. 수 많은 이들 티오에테르 형성 제제가 시판중이며, 이에는 6-말레이미도카프로산, 2-브로모아세트산, 2-요오도아세트산, 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실산 등의 반응성 에스테르가 포함된다. 카복실 그룹은, 이를 석신이미드 또는 1-하이드록시-2-니트로-4-설폰산, 나트륨 염과 조합함으로써 활성화시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 특히 바람직한 커플링 제제는 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC)(공급원: Pierce Chemical Co., Rockford, IL)이다. 전술한 목록은 제한적이지 않으며, 이러한 화합물의 변형물을 사용할 수 있다는 것은 명백하다. 도 6은 SMCC를 사용하여 HBc 활성화 수송체를 형성시키는 과정(I)과, 이러한 활성화 수송체를 설프하이드릴-말단화 합텐과 후속 반응시키는 과정(II)을 도식적으로 나타낸 것이다(반응식 1).
폴리펩티드 합텐은 당해 분야에 널리 공지된 수 많은 방식으로 수득할 수 있다. 통상의 펩티드 합성 기술을 용이하게 활용할 수 있다. 예를 들면, 보다 긴 펩티드를 생성시키는 재조합 및 PCR-이용 기술이 유용하다. 목적하는 서열이 통상적으로 비교적 짧기 때문에, 고형 상 화학적 합성법이 유용하다.
폴리펩티드 합텐의 예가 전술된 표 A 및 B에 제시되어 있다. 이들 폴리펩티드 각각을 이의 N-말단 아미노 그룹을 통하여 활용하거나, 또는 상기 표에는 제시되지 않은 부가의 N-말단 시스테인을 사용함으로써 활용할 수 있다.
관련 화학을 이용하여, 소위 "화학적 화합물"을 수송체 단백질에 커플링시킨다. 전형적으로, 커플링에 적당한 작용성 그룹을 화학적 화합물로 지정한다. 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)에 대한 항체 보호를 유도시키는 화학적 합텐의 예가 6-O-포스포콜린 하이드록시헥사노에이트이다[참조: Fischer et al. (1995) J. Immunol., 154: 3373-3382]. 하기 표는 화학적 합텐의 추가의 예를 제공해준다:
화학적 합텐
화학적 합텐 인용문헌
피페리딘 N-옥사이드 미국 특허 제5,304,252호
포스포락톤 또는 락타미드 미국 특허 제5,248,611호
금속 이온 착체 미국 특허 제5,236,825호
[2.2.1] 또는 [7.2.2]바이사이클릭 환 화합물 미국 특허 제5,208,152호
이온으로 하전된하이드록실-함유 화합물 미국 특허 제5,187,086호
카복실레이트 에스테르의포스포네이트 동족체 미국 특허 제5,126,258호
코카인 동족체 Carrera et al., (1995) Nature 378:725
수송체 단백질을 폴리삭카라이드에 커플링시키기 위한 수 많은 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 알데히드 그룹을 올리고삭카라이드 또는 비교적 작은 폴리삭카라이드의 환원성 말단[참조: Anderson (1983) Infect. Immun., 39: 233-238;Jennings, et al. (1981) J. Immunol., 127: 1011-1018; Poren et al. (1985) Mol. Immunol., 22: 907-919] 또는 종결 말단[참조: Anderson et al. (1986) J. Immunol., 137: 1181-1186 ; Beuvery et al. [(1986)] Dev. Bio. Scand., 65: 197-204] 상에서 제조할 수 있는데, 이를 환원적 아민 반응을 통하여 수송체 단백질에 연결시킬 수 있다.
큰 폴리삭카라이드는, 폴리삭카라이드 쇄를 따라 몇몇 작용성 그룹을 무작위 활성화시키거나[참조: Chu et al. (1983) Infect. Immun., 40: 245-256; Gordon, U. S. Patent No. 4,619,828 (1986); Marburg, U. S. Patent No. 4,882,317 (1989)] 또는 말단 활성화시킴으로써[참조: Anderson et al. (1986) J. Immunol., 137: 1181-1186], 접합시킬 수 있다. 폴리삭카라이드 쇄를 따라 몇몇 작용성 그룹을 무작위 활성화시킴으로써, 이러한 폴리삭카라이드 쇄를 따라 이루어진 무작위 연결물로 인해 고도로 교차연결되는 접합체가 유발될 수 있다. 폴리삭카라이드 대 수송체 단백질의 최적의 비는 특정한 폴리삭카라이드, 수송체 단백질 및 사용된 접합체에 좌우된다.
삭카라이드를 수송체 단백질에 접합시키는 방법에 관한 상세한 고찰이 다음 문헌에서 발견될 수 있다[참조: Dick et al., in Contributions to Microbiology and Immunology, Vol. 10, Cruse et al., eds., (S. Karger: 1989), pp. 48-114; Jennings et al., in Neoglycoconjugates: Preparation and Applications, Lee et al., eds., (Academic Press: 1994), pp. 325- 371; Aplin et al., (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 10: 259-306; and Stowell et al. (1980) Adv. Carbohydr.Chem. Biochem., 37: 225-281].
탄수화물 자체는 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 문헌[참조: Witte et al. (1997) J. Am. Chem. Soc., 119: 2114-2118]에 기재된 바와 같은 효소적 당단백질 합성법에 의해 합성할 수 있다.
합성 및 반합성, 및 천연의 몇 가지 올리고삭카라이드가, 본 발명의 HBc 접합체를 제조하는데 사용될 것으로 고려된 합텐인 올리고삭카라이드의 예로서 다음 문단에 논의된다.
해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) b형(Hib)를 치료하기 위한 백신을 제조하는데 적합한 올리고삭카라이드 합텐은, D-리보스-D-리비톨-포스페이트(하기 I), D-리비톨-포스페이트-D-리보스(하기 II), 또는 포스페이트-D-리보스-D-리비톨(하기 III) 2 내지 20개 반복 단위로 만들어진다[참조: Eduard C. Beuvery et al., EP-0 276 516-BL]:
미국 특허 제4,220,717호에는 또한, 해모필루스 인플루엔자 b형에 대한 폴리리보실 리비톨 포스페이트(PRP) 합텐이 기재되어 있다.
문헌[참조: Peterson et al. (1998) Infect. Immun., 66 (8): 3848-3855]에는 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae)로부터의 보호를 제공해주는 트리삭카라이드 합텐인 αKdo(2 8)αKdo(2 4)αKdo가 기재되어 있다. 클라미디아 뉴모니애는 인두염에서부터 신생아 폐렴까지 범위의 사람 호흡기 감염의 원인균이다. Kdo는 3-데옥시-D-만노-옥트-2-울로손산이다.
문헌[참조: Andersson et al., EP-0 126 043-A1]에는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococci pneumoniae)에 의해 유발된 세균성 감염을 치료, 예방 또는 진단하는데 사용될 수 있는 삭카라이드가 기재되어 있다. 한 가지 유용한 부류의 삭카라이드는 디삭카라이드 GlcNAcβ1 3Gal로부터 유도된 것이다. 문헌[참조: Andersson et al. 상기 참조]에는 또한, 네오락토테트라오실세라미드가 유용하다고 기재되어 있으며, 이는 Galβ1 4GlcNAcβ1 3Galβ1 4Glc-Cer이다.
문헌[참조: McKenney et al. (1999) Science, 284: 1523- 1527]에는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 보호를 제공해주는 폴리삭카라이드인 폴리-N-석시닐 β1 6GlcN(PNSG)가 기재되어 있다. 에스. 아우레우스(S. aureus)는 심내막염, 골수염, 패혈성 관절염, 폐렴 및 농양을 포함한, 집단-획득 감염의 가장 흔한 원인균이다.
유럽 특허 제0 157 899-B1호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨)에는 본 발명에 유용한 뉴모코커스성 폴리삭카라이드의 분리 방법이 기재되어 있다. 다음 표에는 본 발명에서 합텐으로서 유용한 협막상(capsular) 폴리삭카라이드를생성시키는 뉴모코커스성 배양 유형이 열거되어 있다:
폴리삭카라이드 합텐 공급원
모랙셀라(Branhamella) 카타르할리스(Moraxella catarrhalis)는 어린이에게서의 중이염과 정맥동염, 및 성인에게서의 하부 호흡기 감염의 원인균으로 보고되어 있다. 상기 세균의 리포올리고삭카라이드 표면 항원(LOS)의 지질 A 부분을 3-데옥시-D-만노-옥툴로손산-글루코사민 연결에서 절단한다. 이러한 절단 생성물을 순한 알칼리로 처리하여, 아미드-연결된 지방산은 보존시키면서 에스테르-연결된 지방산을 제거하여, 엠. 카타르할리스(M. catarrhalis)로부터 데톡시화 리포폴리삭카라이드(dLOS)를 생성시킨다. 이러한 dLOS는, 이것이 단백질 수송체에 부착되지 않는 한은 면역원성이 아니다[참조: Xin-Xing Gu et al. (1998) Infect. Immun., 66 (5): 1891-1897].
그룹 B 스트렙토코커스(GBS)는 사람에게서 패혈증, 수막염, 및 관련된 신경학적 장애의 원인균이다. 협막상 폴리삭카라이드 특이적 항체가 감염으로부터 사람 영아를 보호하는 것으로 공지되어 있다[참조: Jennings et al., U. S. Patent No. 5,795,580]. GBS 협막상 폴리삭카라이드 II형의 반복 단위는 다음과 같다: 4)-β-D-GlcpNAC-(1 3)-[β-D-Galp (1 6)]-β-D-Galp (1 4)-β-D-Glcp- (1 3)-β-D-Glcp-(1 2)- [α-D-NneupNAC] (2 3)]-β-D-Galp-(1 (여기서, 괄호친 부분은 괄호치지 않은 소단위체 바로 다음에 연결된 분지이다). GBS 협막상 폴리삭카라이드 V형의 반복 단위는 다음과 같다: 4) - [α-D-NeupNAC-(2 3)-β-D-Galp-(1 4)-β-D-GlcpNAC-(1 6)]-α-D-Glcp-(1 4)-[β-D-Glcp-(1 3)]-β-D-Galp- (l 4)-β--D-Glcp- (l.
문헌[참조: European patent application No. EU-0 641 568-A1, Brade]에는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 뉴모니애(pneumoniae) 및 시타시(Psittaci)로부터 래더형(ladder) 결합성 패턴 항원을 수득하는 방법이 기재되어 있다.
문헌[참조: Slovin et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 96 (10): 5710-5715]에는 전립선 암에 대해 사용된 백신 제조에서 수송체로서의, KLH에 연결된 합성 올리고삭카라이드인 글로보(globo) H의 용도가 보고되어 있다. 유사하게, 문헌[참조: Helling et al., (July 1995) Cancer Res., 55 : 2783-2788]에는 흑색종 환자를 치료하기 위한 백신에서의 KLH-연결된 GM2의 용도가 보고되어 있다. 후자 백신은 GM2의 세라미드 이중 결합을 오존 절단시키고, 알데히드 그룹을 도입한 다음, KLH 상으로 환원적 알킬화함으로써 제조하였다. 고려된 키머 입자를 사용하여, 유사한 과정을 활용할 수 있다.
기타 종양 세포 뿐만 아니라 정상 세포, 예를 들면, 흑색종, 섬유아세포종 및 건강한 뇌 세포의 표면 상에 존재하는 글로보시드 및 간글리오시드 등의 스핑고지질의 올리고삭카라이드성 부분이 본원에서 유사하게 합텐으로서 사용될 수 있다. 글로보시드 글로보 H의 올리고삭카라이드 부분은 구조 Fucα-(1 2)-GALβ(1 3)-GalNACβ(1 3)-Galα-(1 4)-GALβ(1 4)Glc를 갖는 반면, 간글리오시드 GM2, GM1및 GD1a의 삭카라이드 부분은 다음 구조를 각각 갖는다: GalNAβ- (l 4)- [NeuAcα- (2 3)]- Galβ- (1 4)-Glc; Galβ- (l 3)-GalNAcβ- (l 4)- [NeuAcα- (2 3)]-Galβ(1 4)-Glc; 및 NeuAc-(2 3)-Galβ-(1 3)- GalNAcβ(1 4)-NeuAcα-(2 3)]-Galβ(1 4)-Glc.
미국 특허 제4,356,170호에는 환원시킨 다음 산화시켜, 상당한 교차 연결을 수반하거나 수반하지 않으면서 파상풍 독소 또는 디프테리아 독소 등의 수송체 단백질의 자유 아민 그룹 상으로 환원적으로 아민화시킬 수 있는 말단 알데히드 그룹을 갖는 화합물을 형성시키는, 유용한 폴리삭카라이드의 제조 방법이 기재되어 있다. 유용한 세균성 폴리삭카라이드의 예에는 β-용혈성 스트렙토코커스, 해모필루스 인플루엔자, 메닌고코커스, 뉴모코커스 및 이. 콜라이가 포함된다. 입자를 환원적으로 아민화시키는 것 말고, ε-아미노 C2-C8알킬카복실산에 의해 제공된 바와같은 링커 암을 폴리삭카라이드 상으로 환원적으로 아민화시킨 다음, 수용성 카보디이미드를 사용하여 해당 입자에 연결시킨다.
접종원 및 백신
본 발명의 또 다른 양태에서는, HBc 키머 입자 또는 합텐과의 HBc 키머 입자 접합체를, 접종된 숙주 동물에서 B 세포 또는 T 세포 반응(자극)을 유도시키는, 예를 들면, 이종 에피토프 또는 합텐과 면역반응되는 항체 생성 또는 T 세포 활성화를 유도시키는 접종원의 면역원으로서 사용하거나, 또는 이종 에피토프 또는 합텐을 유도시키는 병원체에 대한 보호를 제공해주는 백신으로서 사용할 수 있다.
T 세포 활성화는 각종 기술에 의해 측정할 수 있다. 통상의 실시에서는, 숙주 동물에 고려된 HBc 키머 입자 백신 또는 접종원을 접종한 후, 말초 단핵성 혈액 세포(PMBC)를 수집한다. 이어서, 이러한 PMBC를 3 내지 5일 동안 T 세포 면역원의 존재 하에 시험관내에서 배양한다. 이어서, 이와 같이 배양된 PMBC를 대상으로 하여, 사이토킨, 예를 들면, IL-2, GM-CSF 또는 IFN-γ의 분비 또는 증식에 대해 검정한다. T 세포 활성화에 대한 검정은 당해 분야에 널리 공지되어 있다[참조: 미국 특허 제5,478,726호 및 이에 인용된 인용문헌].
예시로서 항체 형성을 이용하여, 고려된 접종원 또는 백신은, 전형적으로 물을 함유하기도 하는 약제학적으로 허용되는 희석제 조성물에 용해 또는 분산되는 HBc 키머 입자 또는 HBc 키머 입자 접합체의 면역원성 유효량을 포함한다. 면역시킬 필요가 있거나 항체를 유도시키고자 하는 숙주 동물, 예를 들면, 포유류(예: 마우스, 개, 염소, 양, 말, 소, 몽키, 아페 또는 사람) 또는 조류(예: 치킨, 칠면조, 오리 또는 거위)에게 투여하는 경우, 접종원은 접합된(펜던트하게 연결된) 합텐과 면역반응되는 항체를 유도시킨다. 이들 항체는 또한 바람직하게는, B 세포 면역원의 단백질 또는 삭카라이드와 결합된다.
백신은 말라리아 병원체와 관계된 예시적 말라리아성 B 세포 서열에서와 같이, 이종 B 세포 에피토프 또는 접합된 합텐이 질병 상태와 관계된 특정 단백질 또는 삭카라이드성 구조 일부분에 상응하는 접종원의 한 유형이다. 백신 유도된 항체는 에피토프 또는 합텐과 면역반응하거나 또는 활성화 T 세포가 이러한 이종 에피토프 또는 합텐에 대해 반응할 뿐만 아니라 이러한 항체가 상기 병원체 또는 병에 걸린 세포와 생체내에서 면역반응하고, 상기 질병 상태로부터의 보호를 제공해준다.
각 면역에 활용된 재조합 HBc 키머 면역원의 양은 면역원성 유효량으로서 지칭되고, 이는 특히, 다음에 논의되는 바와 같이, 재조합 HBc 키머 면역원, 면역시킨 포유류, 및 백신 내의 애쥬반트의 존재 여부에 따라서 광범위할 수 있다. 특정 백신 및 접종원에 대한 면역원성 유효량은 전술된 보호 또는 항체 활성을 각각 제공해준다.
백신 또는 접종원은 전형적으로, 1회 접종당(단위 용량당) 약 1마이크로그램 내지 약 1밀리그램, 바람직하게는 약 10마이크로그램 내지 약 50마이크로그램의 재조합 HBc 키머 면역원 농도를 함유한다. 본 발명의 백신 또는 접종원에 속하는 바와 같은 용어 "단위 용량"은 동물에 대한 일단위 투여량으로서 적합한 물리적으로별개의 단위를 지칭하는데, 각 단위는 요구되는 희석제, 즉 담체 또는 비히클과 연합하여 목적하는 면역원성 효과를 개별적으로 또는 집합적으로 가져다 주는 것으로 산정된 활성 물질의 예정량을 함유한다.
백신 또는 접종원은 전형적으로, 면역원, 바람직하게는 과립 형태의 면역원을 생리학적으로 관용되는(허용되는) 희석제 비히클, 예를 들면, 물, 인산염 완충 식염수(PBS), 아세테이트 완충 식염수(ABS), 링거액 등에 분산시켜 수성 조성물을 형성시킴으로써, 회수된 재조합 HBc 키머 면역원으로부터 제조한다. 이러한 희석제 비히클은 또한, 후술되는 바와 같은 유지성 물질, 예를 들면, 땅콩유, 스쿠알란 또는 스쿠알렌을 포함할 수 있다.
활성 성분으로서 단백질 함유 물질을 함유하는 접종원 및 백신 제제가 당해 분야에 널리 인식되어 있다. 전형적으로, 이러한 접종원 또는 백신은 비경구용의 액상 용제 또는 현탁제로서 제조하고; 주사하기에 앞서 액체 형태의 용제 또는 현탁제용으로 적합한 고체 형태를 제조할 수도 있다. 이러한 제제를 유화시킬 수도 있는데, 이것이 특히 바람직하다.
상기 면역원성 활성 성분을 종종, 약제학적으로 허용되고 활성 성분과 화합성인 부형제와 혼합한다. 적합한 부형제는, 예를 들면, 물, 식염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 배합물이다. 또한, 경우에 따라, 접종원 또는 백신은 미량의 보조 물질, 예를 들면, 해당 조성물의 면역원성 효능을 증강시키는 pH 완충제, 습윤제 또는 유화제를 함유할 수 있다.
고려된 백신 또는 접종원은 유리하게는 애쥬반트를 포함하기도 한다. 본 발명의 백신 및 접종원에 적합한 애쥬반트는 해당 키머의 B 세포 에피토프에 대한 항체 반응을 증강시킬 수 있는 애쥬반트 뿐만 아니라 해당 키머 내에 함유된 T 세포 에피토프에 대한 세포 매개된 반응을 증강시킬 수 있는 애쥬반트를 포함한다. 애쥬반트는 당해 분야에 널리 공지되어 있다[참조: Vaccine Design- The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds. Powell, M. F., and Newman, M. J., Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X].
애쥬반트의 예에는 완전 프로인트 애쥬반트(CFA)(이는 사람에게서 사용하지 못한다), 불완전 프로인트 애쥬반트(IFA), 스쿠알렌, 스쿠알란 및 명반[예: Alhydorgel™(Superfos, Denmark)]이 포함되는데, 이는 당해 분야에 널리 공지된 물질이고 몇몇 공급원으로부터 시판중이다.
본 발명의 면역원과 함께 사용하기에 바람직한 애쥬반트에는 알루미늄 또는 칼슘 염(예를 들면, 하이드록사이드 또는 포스페이트 염)이 포함된다. 본원에서 사용하기에 특히 바람직한 애쥬반트는 수산화알루미늄 겔(예: Alhydrogel™)이다. 수산화알루미늄 겔의 경우, 당해 키머 단백질을, 용량당 알루미늄 50 내지 800마이크로그램, 바람직하게는 400 내지 600마이크로그램이 존재하도록 상기 애쥬반트와 혼합한다.
본 발명의 면역원과 함께 사용하기에 특히 바람직한 또 다른 애쥬반트는 에멀션이다. 고려된 에멀션은 수중유 에멀션 또는 유중수 에멀션일 수 있다. 면역원성 키머 단백질 이외에도, 이러한 에멀션은 널리 공지된 바와 같은 오일 상의 스쿠알렌, 스쿠알란, 땅콩유 등, 및 분산제를 포함한다. 비-이온성 분산제가 바람직하고, 이러한 물질에는 솔비탄 및 만니드의 모노- 및 디-C12-C24-지방산 에스테르, 예를 들면, 솔비탄 모노-스테아레이트, 솔비탄 모노-올레에이트 및 만니드 모노-올레에이트가 포함된다. 면역원 함유 에멀션을 에멀션으로서 투여한다.
바람직하게는, 이러한 에멀션은 수성 상 중의 키머 단백질로 유화시킨, 임의로 스쿠알란과 함께, 스쿠알렌 및 만니드 모노-올레에이트를 포함하는 유중수 에멀젼(Arlacel™ A)이다. 이러한 에멀션의 널리 공지된 예에는 Montanide™ ISA-720, 및 Montanide™ ISA 703 (Seppic, Castres, France)이 포함되고, 이들 각각은 스쿠알렌과 스쿠알란 둘 다를 함유하는 것을 인지해야 하는데, 스쿠알렌이 각각에서 더 우세하지만, Montanide™ ISA 703에서는 약간 덜한 정도로 존재한다. 가장 바람직하게는, Montanide™ ISA-720을 사용하고, 7: 3 (w/w)의 수중유 비가 사용된다. 기타 바람직한 수중유 에멀션 애쥬반트에는 WO 95/17210 및 EP 0 399 843에 기재된 것들이 포함된다.
작은 분자 애쥬반트의 사용이 또한 본원에서 고려된다. 본원에 유용한 작은 분자 애쥬반트의 한 가지 유형은 미국 특허 제4,539,205호, 제4,643,992호, 제5,011,828호 및 제5,093,318호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로 삽입됨)에 기재된 7-치환된-8-옥소- 또는 8-설포-구아노신 유도체이다. 이들 물질 중에서, 7-알릴-8-옥소구아노신(록소리빈)이 특히 바람직하다. 상기 분자는 항원-(면역원-) 특이적 반응을 유도시키는데 특히 유효한 것으로 밝혀졌다.
추가의 유용한 애쥬반트에는 모노포스포릴 지질 A(MPL; 공급원: Corixa Corp.)[참조: U. S. Patent No. 4,987,237], CPG(공급원: Coley Pharmaceutical Group), QS21(공급원: Aquila Biopharmaceuticals, Inc.), SBAS2(공급원: SKB), 미국 특허 제4,767,842호에 기재된 소위 무라밀 디펩티드 동족체, 및 MF59(공급원: Chiron Corp.)[참조: U. S. Patents No. 5,709,879 and No. 6,086,901]가 포함된다.
보다 특히, 다음 공급원[the South American treeQuillaja Saponaria Molina의 나무껍질]로부터 유도된 애쥬반트 활성을 갖는 면역학적 활성 사포닌 분획(예: Quil™ A)이 또한 유용하다. Quil™ A의 유도체는, 예를 들어, QS21(Quil™ A의 HPLC 정제된 분획 유도체), 및 이의 제조 방법이 미국 특허 제5,057,540호에 기재되어 있다. QS21(QA21로서 공지됨) 이외에도, 기타 분획, 예를 들면, QA17이 또한 기재되어 있다.
3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A는 다음 제조업체에 의해 제조된 널리 공지된 애쥬반트이다[Ribi Immunochem, Hamilton, Montana]. 이러한 애쥬반트는 세균으로부터 추출된 3가지 성분, 즉 모노포스포릴 지질(MPL) A, 트레할로스 디미콜레이트(TDM) 및 2% 스쿠알렌/트윈(Tween®) 80 에멀션 중의 세포벽 골격(CWS)(MPL+TDM+CWS)를 함유한다. 이러한 애쥬반트는 GB 2122204B에 교시된 방법에 의해 제조할 수 있다. 바람직한 형태의 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A는 직경이 0.2㎛ 미만인 작은 입자 크기를 갖는 에멀션 형태이다(EP 0 689 454 B1).
무라밀 디펩티드 애쥬반트에는 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thur-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, 노르-MDP로서 지칭됨), 및 N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미티올-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP 1938A, MTP-PE로서 지칭됨)이 포함된다.
바람직한 애쥬반트 혼합물에는 3D-MPL과 QS21의 조합물(EP 0 671 948 B1), 3D-MPL과 QS21를 포함하는 수주유 에멀젼(WO 95/17210, PCT/EP98/05714), 기타 담체와 제형화시킨 3D-MPL(EP 0 689 454 B1), 콜레스테롤 함유 리포솜에서 제형화시킨 QS21(WO 96/33739), 또는 면역자극성 올리고뉴클레오티드(WO 96/02555)가 포함된다. 또 다른 애쥬반트에는 WO 99/52549에 기재된 것, 및 폴리옥시에틸렌 에테르의 비-과립 현탁제(UK Patent Application No. 9807805)가 포함된다.
애쥬반트는 애쥬반트 양으로 활용되는데, 이는 해당 애쥬반트, 포유류 및 재조합 HBc 키머 면역원에 따라서 다양할 수 있다. 전형적인 양은 면역시킬 때마다 약 1㎍ 내지 약 1mg으로 다양할 수 있다. 당업자는 적당한 농도 또는 양을 용이하게 결정할 수 있다.
접종원 및 백신은 통상적으로, 주사함으로써 비경구, 예를 들면, 피하 또는 근육내 투여한다. 기타 투여 방식에 적합한 부가의 제형에는 좌제, 및 몇몇 경우에는, 경구용 제형이 포함된다. 문헌[참조: Neirynck et al., (October 1999) Nature Med., 5(10):1157-1163]에 논의된 바와 같이, 접종을 위해 비내 분무제를 사용하는 것이 또한 고려된다. 좌제의 경우, 전통적인 결합제 및 담체에는 예를들어, 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드가 포함될 수 있으며; 이러한 좌제는 0.5 내지 10%, 바람직하게는 1 내지 2% 범위의 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 경구용 제형에는 통상적으로 이용된 부형제, 예를 들면, 약제학적 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 삭카린, 셀룰로즈, 탄산마그네슘 등이 포함된다.
접종원 또는 백신 조성물은 용제, 현탁제, 정제, 환제, 캅셀제, 지속 방출형 제형 또는 산제 형태를 취하고, 이는 활성 성분으로서, 바람직하게는 입자로서 면역학적 유효량의 HBc 키머 또는 HBc 키머 접합체를 함유한다. 전형적인 조성물에서는, 바람직한 HBc 키머 또는 HBc 키머 접합체의 면역학적 유효량은 앞서 인지된 바와 같이, 용량당 활성 성분 약 1㎍ 내지 약 1mg, 보다 바람직하게는 약 5㎍ 내지 약 50㎍이다.
백신은 전형적으로, 비경구 투여용으로 제형화시킨다. 예시되는 면역화는 피하(SC), 근육내(IM), 정맥내(IV), 복강내(IP) 또는 피내(ID) 투여로 수행한다.
상기 HBc 키머 입자 및 HBc 키머 입자 접합체는 중성 또는 염 형태로서 백신으로 제형화시킬 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염에는 산 부가 염(해당 단백질 또는 합텐의 자유 아미노 그룹과 형성됨)이 포함되고, 이는 무기 산, 예를 들면, 염산 또는 인산, 또는 유기 산, 예를 들면, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 형성된 염이다. 자유 카복실 그룹과 형성된 염은 무기 염기, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철; 및 유기 염기, 예를 들면, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도시킬수도 있다.
또 다른 양태에서는, 고려된 HBc 키머를 암호화하는 유전자를 적합하게 약독화된 장내 세균, 예를 들면, 에스. 티피(S. typhi), 에스. 티피무륨(S. typhimurium), 에스. 티피무륨-이. 콜라이 하이브리드 또는 이. 콜라이 내로 형질감염시킨 백신 또는 접종원이 고려된다. 약독화 또는 무독성 에스. 티피 및 에스. 티피무륨 및 에스. 티피무륨-이. 콜라이 하이브리드의 예가 전술된 참조문헌에 논의되어 있다. 이들 백신 및 접종원은 특히, 인플루엔자, 효모, 예를 들면, 아스퍼질루스(Aspergillus) 및 캔디다(Candida), 바이러스, 예를 들면, 폴리오, 구제역, A형 간염, 및 세균, 예를 들면, 콜레라, 살모넬라 및 이. 콜라이, 및 IgG 전신 반응 이외에도 또는 이 반응 대신 점막성 IgA 반응이 요망되는 경우와 같이, 감염 질병 또는 코, 장기 및 생식기의 점막을 통하여 전염되는 질병에 대해 사용하도록 고려된다.
장내 세균을 동결 건조시키고, 무수 약제학적으로 허용되는 희석제와 혼합하며, 섭취용 정제 또는 캅셀제로 만든 다음, 통상의 고체 상 투약에서과 같이 숙주 동물에게 투여한다. 또한, 이들 세균성 백신의 수성 제제를 경구, 비내, 직장 또는 질내 투여에 의해 점막성 면역에 사용하도록 적응시킨다.
고려된 키머 분자 입자를 함유하는 식물을 사용하여 경구 면역시키는 것은, 형질전환성 식물 조직, 예를 들면, 당근과 같은 뿌리 또는 쌀 또는 옥수수와 같은 씨앗을 단순히 섭취함으로써 달성할 수 있다. 이러한 경우, 구강 또는 위장관 내의 물은, 면역에 사용된 통상적으로 사용되는 수성 매질을 제공해주고, 주변 식물조직은 약제학적으로 허용되는 희석제를 제공해준다.
당해 접종원 또는 백신은 투여 제형과 화합성인 방식으로, 치료학적으로 유효하고 면역원성인 양으로 투여한다. 투여될 양은 치료받는 대상체, 대상체의 면역계가 항체를 합성하는 능력, 및 목적하는 보호 정도에 좌우된다. 투여해야 하는 활성 성분의 정확한 양은 담당의의 판단에 따르며, 각 개인에게 대해 고유하다. 그러나, 적합한 투여량 범위는 개개인 마다 수 십 마이크로그램의 활성 성분이다. 초기 투여 및 부스터 투여에 적합한 섭생 또한 다양하지만, 초기 투여한 다음 일정한 간격(주 또는 개월)으로 후속 주사 또는 기타 투여하는 유형을 띤다.
일단 면역시키면, 재조합 HBc 키머 면역원이, 말라리아 백신에 대한 포자소체와 같은 관심있는 항원과 결합하는 충분한 역가의 항체 생성을 유도시키기에 충분한 시간 동안, 상기 포유류를 유지시킨다. 예시되는 항-포자소체 항체 생성을 위한 유지 시간은 전형적으로, 약 3 내지 약 12주간 지속되고, 이는 백신의 부스터, 제2 면역화 투여를 유도시킬 수 있다. 경우에 따라, 제1 면역시킨지 24주 내지 5년 후에, 제3 면역이 또한 고려된다. 일단 보호 수준의 항체 역가가 획득되면, 이와 같이 백신 접종된 동물이, 약 1 내지 약 5년 간격으로 투여된 주기적 부스터 면역에 의해 상기 역가 또는 역가 근사치를 유지하는 것이 바람직하다.
항-포자소체 또는 기타 항체의 생성은, 상기 면역시킨 동물로부터 혈장 또는 혈청 샘플을 수득하고, 이 안에서 해당 항체를 대상으로 하여, 전술된 바와 같은 ELISA 검정 또는 당해 분야에 널리 공지된 바와 같은 웨스턴 블롯 등의 또 다른 면역 검정에 의해, 합성 주변포자소체(circumsporozoite) 면역우성 항원[예: 본원에사용된 피. 팔시파룸 CS 단백질 펩티드(NANP)5]와 같은 적당한 항원과 결합하는 능력에 대해 검정함으로써 용이하게 확인된다.
이와 같이 유도된 항체를 널리 공지된 기술을 사용하여 접종된 숙주 동물의 혈액으로부터 분리한 다음, 널리 공지된 바와 같이 수동 면역을 위해 제2 백신 내로 재구성할 수 있다는 것에 주목해야 한다. 유사한 기술이 사람의 감마-글로불린 면역에 사용된다. 예를 들면, 면역시킨 하나의 숙주 또는 수 많은 숙주로부터의 항혈청을 수성 황산암모늄(전형적으로 40 내지 50% 포화도)에서 침전시키고, 이와 같이 침전된 항체를 친화 크로마토그래피를 사용함으로써 크로마토그래피적으로 정제하는데, 여기서는 (NANP)5가 크로마토그래피 칼럼 상에 고정화된 항원으로서 활용된다. 따라서, 예를 들면, 접종원을 말 또는 양에 사용하여, 사람과 같은 또 다른 동물에게서 수동 면역시키는데 사용하기 위한 말라리아 종에 대한 항체 생성을 유도시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 특정 동물 숙주에 특정 접종원을 접종하는 단계를 포함하여, 이러한 동물 숙주에게서 항체, 활성화 T 세포 또는 이들 둘 다를 유도시키기 위한 방법이다. 이러한 방법에 사용된 접종원은 약제학적으로 허용되는 희석제에 용해 또는 분산된, 전술된 HBc 키머 입자 또는 HBc 키머 입자 접합체의 면역원성 유효량을 포함한다. 이러한 동물 숙주를, 널리 공지된 기술에 의해 검정될 수 있는 바와 같이, 항체 또는 활성화 T 세포가 유도되기에 충분한 시간 동안 유지시키는데, 이를 위해서는 전형적으로, 널리 공지된 바와 같이 수 주 내지 수 개월이 소요된다. 이러한 유지 기간 동안 다수의 상기 면역이 고려된다.
본 발명은 다음의 비-제한적 실시예로써 예시된다.
실시예 1: B 세포 에피토프 함유 키머 제조
A. pKK223-3의 변형된 형태인 플라스미드 벡터 pKK223-3N의 제조
HBc 유전자가 NcoI-HindIII 제한 단편으로서 삽입될 수 있도록 독특한 NcoI 제한 부위를 정착시키고, 이. 콜라이 숙주 세포에서 후속 발현시킴으로써, 플라스미드 벡터 pKK223-3(Pharmacia)를 변형시킨다. pKK223-3 플라스미드 벡터를 변형시키기 위해, PCR 프라이머 pKK223-3/433-452-F 및 pKK223-NcoI-mod-R, 및 주형으로서의 pKK223-3를 사용하여, 새로운 SphI-HindIII 단편을 제조한다. 이러한 PCR 단편을 제한 효소 SphI 및 HindIII로 절단하여 467 bp 단편을 제공한 다음, 이를 pKK223-3 벡터의 4106 bp 단편으로 연결시켜, 본래의 480 bp SphI-HindIII 단편을 대체시킨다. 따라서, 이로써 생성된 플라스미드 (pKK223-3N)는 모 플라스미드 보다 13 bp 정도 더 짧고, 이는 상기 도입된 NcoI 부위의 변형된 뉴클레오티드 서열 상단을 함유한다(도 1 참조; 여기서, 대시(-)가 부재 염기를 지시해준다). 최종 플라스미드 pKK223-3N은 크기가 4573 bp이다. 플라스미드 pKK223-3N 내의 제한 부위가 도 1에 지시되어 있고, 플라스미드 pKK223-3N를 형성하기 위해 pKK223-3에 대해 만들어진 뉴클레오티드 변화가 다음에 제시된 바와 같이 밑줄쳐져 있다:
pKK223-3/433-452-F GGTGCATGCAAGGAGATG 서열 번호 65
pKK223-NcoI-mod-R
GCGAAGCTTCGGATCccatggTTTTTTCCTCCTTATGTGAAATTGTTATCCGCTC 서열 번호 66
B. V1 및 V2 클로닝 벡터의 제조
합성 dsDNA 단편의 면역우성 루프 영역 내로의 지향성 삽입을 수용할 수 있는, 변형된 HBc149 유전자를, PCR을 사용하여 작제한다. [아미노산 E77과 D78 사이에 삽입물을 수용하는 플라스미드는 V1으로 명명되는 반면, D78과 P79 사이에 삽입물을 수용하는 플라스미드는 V2로 명명된다]. 상기 HBc149 유전자를, 2개의 PCR 프라이머 쌍(이중 하나는 아미노 말단을 증폭시키고, 다른 하나는 카복실 말단을 증폭시킨다)을 사용하여 2개의 절반으로 나누어 증폭시킨다. V1의 경우에는, PCR 반응 생성물(N- 및 C-말단)이 둘 다 246 bp 단편이고; V2의 경우에는, 이러한 생성물이 249 bp 단편(N-말단) 및 243 bp 단편(C-말단)이다.
이와 같이 제조된 N-말단 단편을 NcoI 및 EcoRI로 분해시키고, C-말단 단편을 EcoRI 및 HindIII로 분해시킨다. 이어서, 상기 V1 및 V2 단편 쌍을 공통의 EcoRI 오버행에서 함께 연결시킨다. 이어서, 이로써 생성된 NcoI-HindIII 단편을, NcoI 및 HindIII로 분해시킴으로써 제조시킨 pKK223-3N 벡터 내로 연결시킨다.
B 세포 에피토프를 V1 및 V2 플라스미드 내로 삽입하기 위해, 상기 플라스미드를 EcoRI 및 SacI 제한 효소로 분해시킨다. 이어서, 5' EcoRI 및 3' SacI 오버행을 함유하는 합성 dsDNA 단편을 삽입한다. 양 경우에 있어, 상기 제한 효소에의해 암호화된, V1 및 V2, 글리신-이소루이신(EcoRI) 및 글루탐산-루이신(SacI) 아미노산 쌍은 상기 삽입된 B 세포 에피토프를 플랭킹한다. 이와 같이 삽입된 제한 부위가 다음 프라이머에서 밑줄쳐져 있다:
C. V7 클로닝 벡터의 제조
T 세포 에피토프를 HBc 키머의 C-말단에 융합시키기 위해, 새로운 벡터 V7을 작제한다. 독특한 EcoRI 및 SacI 제한 부위를 발린-149와 HindIII 부위 사이에 삽입하여, 합성 dsDNA의 EcoRI-HindIII(또는 EcoRI-SacI) 제한 부위 내로의 지향성 삽입을 촉진시킨다. 다음의 PCR 프라이머 쌍을 사용하여, 아미노 말단에 NcoI 제한 부위를 갖고 카복실 말단에 EcoRI, SacI 및 HindIII 부위를 갖는 HBc 149 유전자를 증폭시킨다. 이러한 PCR 반응 생성물(479bp)를 NcoI/HindIII로 분해시키고, 이를 pKK223-3N 내로 클로닝시켜 V7을 형성한다.
T 세포 에피토프를 삽입하기 위해, 플라스미드(V7)를 EcoRI/HindIII (또는 EcoRI-SacI)로 분해시키고, EcoRI/HindIII(또는 EcoRI/SacI) 오버행을 갖는 합성 dsDNA 단편을 V7에 연결시킨다. 모든 V7 작제물의 경우, 본래 HBc(발린-149)의 마지막 아미노산과 상기 삽입된 T 세포 에피토프의 첫 번째 아미노산을, EcoRI 제한 부위를 형성하는 뉴클레오티드에 의해 암호화된 글리신-이소루이신 디펩티드 서열에 의해 분리시킨다. EcoRI/SacI에 삽입된 에피토프의 경우에는, 상기 SacI 부위에 의해 비롯된, T 세포 에피토프 다음, 종결 코돈 전에 부가의 글루탐산-루이신 잔기가 존재한다. 제한 부위가 제시된 프라이머에서 밑줄쳐져 있다:
HBc149/NcoI-F
5'-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA 서열 번호 67
HBc149/SacI-EcoRI-H3-R
5'-CGCAAGCTTAGAGCTCTTGAATTCCAACAACAGTAGTCTCCG 서열 번호 75
D. V12 발현 작제물의 제조
아미노산 78과 79 사이에 B 세포 에피토프를 함유할 뿐만 아니라 발린-149의 T 세포 에피토프 하단을 함유하는 V12 벡터를 V2 및 V7 벡터로부터 작제한다. EcoRI/HindIII에 삽입된 AT 세포 에피토프를 함유하는 V7 벡터의 카복실 말단을, 2개의 PCR 프라이머(HBc-P79/SacI-F 및 pKK223-2/4515-32R)를 사용하여 증폭시켜, SacI 및 HindIII 제한 부위로 플랭킹된, 아미노산 79-149에 상응하는 dsDNA 단편 + T 세포 에피토프를 제공한다.
상기 PCR 생성물을 SacI 및 HindIII로 절단한 다음, 이와 동일한 2개의 효소로 절단함으로써 제조시킨 목적하는 V2 벡터 내로 클로닝시킨다. 제시된 PCR 생성물은 HBc 유전자의 아미노산 149 다음에 존재하는 T 세포 에피토프에 상관없이, 모든 V7 유전자의 카복실 말단을 증폭할 수 있게 해준다.
이러한 접근법의 보편성에 대한 한 가지 예외는 기존의 V12 작제물로부터 제조된, Pf-CS(C17A) 돌연변이를 함유하는 V12 작제물을 제조하는 경우이다. 이러한 경우, C17A 돌연변이를 촉진시킨 미스매치 역방향 PCR 프라이머(서열 번호 145)와, HBc149/NcoI-F(서열 번호 67)를 사용하여 V12 작제물을 증폭시킨다. 이로써 생성된 PCR 생성물을 NcoI 및 HindIII로 분해시키고, pKK223-3N(상기와 동일한 효소로 미리 절단시킴) 내로 역 클로닝시킨다. 제한 부위가 밑줄쳐져 있다.
HBc-P79/SacI-F 5'-CGCGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG 서열 번호 76
pKK223-2/4515-32R 5'-GTATCAGGCTGAAAATC 서열 번호 77
E. V2 내로 삽입된 피. 팔시파룸 CS-반복체 B 세포 에피토프
V2 및 V7 작제물의 경우, 관심있는 B 세포 에피토프(V2) 또는 T 세포 에피토프(V7)를 암호화하는 합성 dsDNA 단편을 EcoRI/SacI 제한 부위 내로 삽입한다. 관심있는 B 및 T 세포 에피토프를 암호화하는 합성 dsDNA 단편은, 상보성 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 등몰 농도로 혼합하고, 5분 동안 95℃로 가열한 다음, -1℃/분의 비율로 실온으로 냉각시킴으로써 제조한다. 이러한 어닐링 반응을 TE 완충액에서 수행한다. 이중 가닥 DNA가 상기 제시된 암호화된 에피토프 서열과 함께 다음에 제시된다. 파운드 부호 #가 정지 코돈의 존재를 지시하기 위해 몇몇 아미노산 잔기 서열에 사용된다.
실시예 2: 피. 비락스 만능 T 세포 에피토프
A. 부위-지시된 돌연변이 유발을 위한 PCR 프라이머
B. C-말단에서의 시스테인 부가 및 절단을 위한 PCR 프라이머
시스테인 잔기 부가하거나 HBc 유전자의 길이를 다양하게 함으로써, HBc 키머 유전자의 C-말단을 변형시키기 위해, C-말단의 목적하는 변형을 지시해주는 HBc/NcoI-F 프라이머 및 역방향 프라이머(예: HBc149+C/HindIII-R)를 이용하여 주형으로서 HBc149를 사용하여 PCR 반응을 수행한다. PCR 생성물을 NcoI 및 HindIII로 분해하고, 동일한 제한 부위에서 pKK223-3N 내로 클로닝한다.
실시예 3: 검정 과정
A. 항원성
1. 입자 ELISA
정제된 입자를 피복 완충액(50mM 중탄산나트륨, pH 9.6)에서 10㎍/ml의 농도로 희석시키고, ELISA 스트립 웰 상으로 피복시킨다(50㎕/웰). 상기 ELISA 스트립을 실온에서 밤새 항온 배양한다(약 18시간). 그 다음 날, 상기 웰을 ELISA 세척 완충액[인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4, 0.05% Tween®-20]으로 세척하고, PBS 중의 3% BSA로 1시간 동안 차단시킨다(75㎕/웰). ELISA 스트립을 필요할 때까지 -20℃에서 무수 저장한다.
입자의 항원성을 결정하기 위해, PBS 중의 1% BSA를 사용하여 항혈청을 희석키고, 50㎕/웰을 항원-피복된 ELISA 웰에 가한다. 혈청을 1시간 동안 항온 배양하고, ELISA 세척 완충액으로 세척하고, 항-마우스(IgG)-HRP(The Binding Site, San Diego, CA; HRP = 서양고추냉이 퍼옥시다제) 접합체(50㎕/웰) 또는 기타 적당한 항체를 사용하여 30분 동안 프로빙시킨다. ELISA 세척 완충액으로 세척한 후, TM 블루 기질(50㎕/웰)을 부가함으로써, 상기 반응을 가시화한다. 10분 후, 1N H2SO4(100㎕/웰)을 부가함으로써 상기 반응을 중지시키고, 450nm에서 설정된 ELISA 판 판독기 상에서 판독한다.
2. 합성 펩티드 ELISA
20개 아미노산 잔기 합성 펩티드(NANP)5를 피복 완충액(50mM 중탄산나트륨, pH 9.6)에서 2㎍/ml의 농도로 희석시키고, ELISA 스트립 웰 상으로 피복시킨다(50㎕/웰). 후드에서 밤새(약 18시간) 항온 배양하여 고갈시킴으로써, 펩티드를 상기 웰 상으로 건조시킨다. 그 다음날 아침, 상기 웰을 ELISA 세척 완충액[인산염 완충 식염수, pH 7.4, 0.05% Tween®-20]으로 세척하고, PBS 중의 3% BSA로 1시간 동안 차단시킨다(75㎕/웰). ELISA 스트립을 필요할 때까지 -20℃에서 무수 저장한다.
입자의 항체 항원성을 결정하기 위해, PBS 중의 1% BSA를 사용하여 항혈청(모노클로날 또는 폴리클로날)을 희석키고, 50㎕/웰을 항원-피복된 ELISA 웰에 가한다. 혈청을 1시간 동안 항온 배양하고, ELISA 세척 완충액으로 세척하고, 항-마우스(IgG)-HRP 접합체(50㎕/웰에서 상기와 같음) 또는 기타 적당한 항체를 사용하여 30분 동안 프로빙시키며, ELISA 세척 완충액으로 다시 세척한 후, TM 블루 기질(50㎕/웰)을 부가함으로써 가시화한다. 10분 후, 1N H2SO4(100㎕/웰)을 부가함으로써 상기 반응을 중지시키고, 450nm에서 설정된 ELISA 판 판독기 상에서 판독한다.
B. 입자의 면역원성
입자의 면역원성을 검정하기 위해, 프로인트 완전 애쥬반트 중의 20㎍의 입자를 사용하여 마우스를 복강내 면역시킨 다음, 4주 후에, 프로인트 불완전 애쥬반트 중의 10㎍를 사용하여 부스터시킨다. 2, 4, 6 및 8주째에 마우스로부터 채혈한다.
C. 포자소체 IFA
간접 면역형광성 검정(IFA)을, 글루타르알데히드-고정된 피. 팔시파룸 포자소체 및 FITC-표지된 항-마우스 IgG(감마 쇄 특이적)(Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD)를 수행하여, 결합된 항체를 탐지한다[참조: Munesingheet al.,Eur.J.Immunol.1991, 21, 3015-3020]. 사용된 포자소체는, 시험관내 배양물로부터 유도된 피. 팔시라룸(NF54 분리물) 유성생식모세포 상에 공급함으로써 감염된 아노펠리즈(Anopheles) 모기의 타액선으로부터 해부한 것이다.
실시예 4: 재조합 키머 HBc 입자의 발현
A. 면역원성에 대한 삽입 위치의 효과
아미노산 E77/D78(서열 번호 260 및 261) 또는 D78/P79(서열 번호 259 및 260) 사이에 삽입된, 피. 팔시파룸 CS B 세포 에피토프 (NANP)4를 함유하는 HBc 입자를 사용하거나, 또는 루프 대체 접근법(CS)[완전 프로인트 애쥬반트를 사용하여, 문헌(Schodel et al., (1994)J. Exp. Med., 180:1037-1046)에 논의되어 있음]을 사용함으로써 면역시킨 마우스를 대상으로 하여, 항체 역가(1/상호 희석도)를 측정한다. 마우스를 전술된 바와 같은 애쥬반트와 함께, 단일 20㎍ 용량으로 복강내 면역시키고, 고정화된 (NANP)5합성 펩티드를 사용하여 ELISA에서 항체 역가를 결정한다. 이러한 연구 결과가 다음 표 1에 제시되어 있다.
*Schodel et al., (1994)J. Exp. Med., 180:1037-1046.
BALB/c 마우스를 사용하여, 면역원성에 대한 NANP CS-반복체 에피토프의 삽입 위치에 대한 또 다른 비교를 수행한다. 문헌(Schodel et al., (1994)J. Exp. Med., 180:1037-1046)의 CS-2 입자에 의해 유도된 항체 역가를, HBc 위치 78과 79 사이에 삽입된 동일한 (NANP)4B 세포 에피토프를 사용하고 면역원으로서 상기 V2.Pf1 입자를 사용하여 달성된 역가와 비교한다. 1차(1°) 면역한지 4주 후 및 부스터(2°) 면역한지 2주 후에 혈청을 분석하고, 그 결과를 다음 표 2에 제시하였다:
*Schodel et al., (1994)J. Exp. Med., 180:1037-1046.
B10.S 마우스를 사용하여, 면역원성에 대한 NANP CS-반복체 에피토프의 삽입 위치에 대한 유사한 비교를 수행하고, 그 결과를 다음 표 3에 제시하였다:
*Schodel et al., (1994)J. Exp. Med., 180:1037-1046.
반복된 NANP 서열과 함께, 작은 B 세포 에피토프 NANPNVDP(서열 번호 167)를 포함하는 HBc 키머 입자의 면역원성에 대한 효과(ELISA, F1 마우스)를 검사한다. HBc 위치 78과 79 사이에 삽입된 서열 NANPNVDP(NANP)3NVDP(서열 번호 21; V12.Pf3)을 함유한 HBc 키머를 발현시킨다. 이로써 생성된 ELISA 데이터를, 사량체성 반복체 (NANP)4B 세포 에피토프(V12.Pf1) 또는 동일한 위치에서의 작은 B 세포 에피토프의 이량체(V12.Pf7)를 사용하여 수득된 역가와 비교한다. 이들 3개의 키머 각각은, C-말단 서열로서 피. 팔시파룸 만능 T 세포 에피토프와 결합된, 위치 141에서부터 149까지의 HBc 서열을 포함한 도메인 IV를 함유한다. 전술된 바와 같은 1차면역 및 부스터 면역을 사용하고 애쥬반트를 사용한 이들 연구 결과가 다음 표 4에 제시되어 있다:
상기 '작은' 반복체 에피토프를 포함함으로써 면역원성이 20배 이상 증가된 것으로 관찰된 사실은 다소 예상치 못한 것이었다. V12.Pf3은 이. 콜라이에 의해 잘 발현되지 못하기 때문에, 다음에 제시되는 바와 같이, Pf3과 유사한 항원성을 지니지만 발현 수준은 증가된 Pf3 에피토프 NANPNVDP(NANP)3NVDP(서열 번호 21)의 변이체를 작제하였다. 작제물 3.1 및 3.2 만을 대상으로 하여 면역원성에 대해 검정하였다.
재조합 키머 HBc/피. 팔시파룸 입자의 상대적 발현 수준, 및 CS 에피토프 (NANP)4및 (NANPNVDP)에 특이적인 모노클로날 항체에 대한 항원성이 다음 표 5에 제시되어 있다. 상대적 발현 수준은 다음과 같다: ****=75-125mg/L; ***=50-75mg/L; **=25-50mg/L. 모노클로날 항체에 대해 종점 역가 희석함으로써 항원성을 결정하였다[(NANP)4의 경우에는 MoAb 2A10; NANPNVDP의 경우에는 MoAb 2B6D8; 및 E. Nardin of New York University Medical Center에 의해 제공된P.vivaxRpt. MoAb 2F2]. 가장 낮은 역가가 1로 표현되도록 상기 데이터를 표준화시켰다. 예를 들면, V12.Pf3은 (NANP)4특이적 모노클로날에 대해서는 V12.Pf3.10 보다 165배 더 항원성이고, NANPNVDP 특이적 모노클로날 항체에 대해서는 V12.Pf3.2 보다 26배 더 항원성이다. N.D.는 탐지 가능한 항체 결합이 전혀 없다는 것을 의미한다. [주: V12.Pf3.7은 상기 발현 벡터에서 돌연변이로 인해 발현되지 않아 추가로 조사되지 않았는데, 이는 유사한 작제물이 항원성이 아니므로 재-클로닝은 해볼 만한 시도가 아니기 때문이다].
Pf3 에피토프의 변이체를 함유하는 선별된 HBc 키머 입자의 면역원성을 상기 언급된 바와 같이 검정하였다. 1차(1°) 면역한지 4주 후 및 부스터(2°) 면역한지 4주 후에 혈청을 분석하였다. 수득된 데이터가 다음 표 6에 제시되어 있고, 여기서 키머의 "명칭" 및 B 세포 면역원의 상응하는 서열이 상기 예시된 바와 같다:
놀랍게도, NANPNVDP 반복체의 1개 복사물을 함유하는 변형물(V12.Pf3.1)이, NANP 모노클로날 항체에 대한 항원성은 5배 정도 떨어지긴 하지만, 2개의 복사물을 함유하는 변형물(V12.Pf3)과 동일한 항원성(및 더 우수한 발현성)을 나타내었다.
B. 발현 실패
몇 가지 부가의 에피토프를 위치 78과 79 사이의 HBc 루프(도메인 II) 내로 위치시키고자 시도하였으나(V1.Pf1에서와 같음), 공지되지 않은 이유로 인해 발현시키지 못하였다. 다음 표 7에는 HBc 키머 내의 D78과 P79 사이에 삽입될 때(V2), 발현하지 못한 에피토프가 열거되어 있다:
실시예 5: 280/260 흡광도 비 결정
인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4를 사용하여, 단백질 샘플을 0.1 내지 0.3mg/ml의 농도로 희석시킨다. PBS를 사용하여 분광계를 블랭크로 만들고, 단백질 샘플의 흡광도를 260nm 및 280nm 파장에서 측정하였다. 이어서, 280nm에서 특정 샘플에 대해 결정된 흡광도 값을 260nm에서 동일한 샘플에 대해 결정된 흡광도 값으로 나누어, 소정의 샘플에 대한 280/260 흡광도 비를 달성한다. 본래의 입자(HBc 183), 잔기 위치 149 다음에 절단된 HBc 입자(HBc 149), 및 그 밖의 본원에서 동정된 몇 가지 HBc 키머를 포함한, 몇몇 샘플에 대해 수득된 비가 다음 표 8에 제시되어 있다.
실시예 6: 절단된 HBc 입자의 C-말단에서의 시스테인
A. 하이브리드 HBc 입자의 C-말단에 시스테인 잔기를 부가함
폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여, 하이브리드 HBc 입자를 발현하는 유전자를 용이하게 돌연변이시켜 시스테인 또는 시스테인 함유 펩티드를 HBc의 C-말단에 도입할 수 있다. 예를 들면, 서열 번호 148의 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 적합한 제2 프라이머와 함께 사용하여, 하이브리드 HBc 유전자를 증폭시키고 시스테인 코돈을 코돈 V149와 정지 코돈 사이에 도입시킬 수 있다.
B형 간염 코어 입자를 183(또는 185; 바이러스 아유형에 따라 결정됨)에서부터 140까지 절단하여, 과립 바이러스-유사 입자 내로 어셈블리하는 능력을 보유할 수 있다. 많은 그룹은 아미노산 149로 절단된 입자를 사용하는데, 이는 아미노산 150이 아르기닌 풍부한 C-말단 도메인의 첫 번째 아르기닌 잔기를 나타내기 때문이다.
HBc 입자를 안정화시키는 단일 시스테인 잔기의 능력을 평가하기 위해, 전술된 기술을 사용하여, 하나의 시스테인 잔기에 대한 코돈을, HBc 아미노산 잔기 V140에 대한 코돈과, 잔기 78과 79 사이에 삽입된 (NANP)4말라리아성 B 세포 에피토프를 함유하는 키머 HBc 분자(본원에서 V2.Pf1로서 지칭됨)의 종결 코돈 사이에 삽입하여, V2.Pf1+C로서 지칭된 키머 분자 및 입자를 형성한다(HBc149). 이러한 키머 입자(V2.Pf1+C; 서열 번호 264 및 265)의 열 안정성(37℃하)은 삽입된 시스테인이 결여된 유사한 키머 입자(V2.Pf1)과 비교해서 상당히 증가한 것으로 밝혀졌으며, 이는 도 3에 제시된 바와 같다.
하나의 시스테인을 V2 작제물의 C-말단에 부가함으로써 제조되는 벡터 및 발현 생성물은 종종 본원에서 V16 벡터 또는 발현 생성물로서 지칭된다는 것에 주목해야 한다.
도 3으로부터 용이하게 알 수 있는 바와 같이, 2개의 입자가 유사하게 출발하였다. 그러나, 37℃에서 14일 후, 시스테인 함유 입자는 SDS 겔 상에서 보다 작은 밴드를 나타내었는데, 이는 부가된 Cys 잔기가 결여된 입자와 비교해서 안정성 증강을 지시해준다.
B. 열 안정성 프로토콜
50mM NaPO4, pH 6.8을 사용하여, 정제된 입자를 1mg/ml의 농도로 희석시키고, 나트륨 아지드를 0.02%의 최종 농도로 가하여 세균성 성장을 방지시킨다. 입자를 37℃에서 항온 배양하고, 도면의 설명에서 지시된 시점에서 분취량을 취한다. 샘플을 SDS-PAGE 샘플 완충액(환원성)과 혼합하고 15% SDS-PAGE 겔 상에서 수행한다. 쿠마시 블루를 사용하여 겔을 염색시킨 다음 분석한다.
실시예 7: HBc의 C-말단에 융합된 펩티드의 C-말단에서의 시스테인
말단 시스테인 잔기가 150 이외의 위치에서 안정화 효과를 유발시킬 수 있는지를 추가로 연구하기 위해, B형 간염 코어 단백질로부터의 Th 에피토프(아미노산 잔기 74-87)를, 면역우성 루프 내의 말라리아성 에피토프를 함유하는 HBc의 C-말단에 융합시킨다. 이러한 Th 에피토프는 시스테인 잔기를 함유하지 않으므로, Cys 잔기를 상기 C-말단에 가한다("C"로 밑줄쳐져 있음). 대조군은 이러한 시스테인이 결여된 동일한 에피토프이다. 이들 입자는 V2.Pf1을 V7.HBc74-87(및 V7.HBc74-87+C)를 조합함으로써 제조한다. 상기 V7 작제물을 HBc-P79/SacI-F 프라이머(서열 번호 76) 및 pKK223-2/4515-32-R(서열 번호 77)로 PCR 증폭시킨다. 이 생성물을 SacI 및 HindIII로 절단하고, 이러한 SacI/HindIII 단편을, 동일한 효소로 절단시킨 V2.Pf1에 연결시킨다.
다음 표 9는 야생형 HBc 단백질에서 생성되는 본래의 서열에 기준한, C-말단 융합물 HBc(74-87) 및 HBc(74-87) + C의 아미노산 서열 뿐만 아니라 HBc149 + C 입자의 아미노산 서열을 제시하고 있다. "Cys 이동"은 야생형 단백질에서의 이의 위치에 기준하여, 도입된 시스테인의 위치이고, 이는 마지막 잔기(위치 183)이다.
실시예 8: HBc 하이브리드의 C-말단에 융합된 펩티드 내에 위치된 시스테인
시스테인 잔기가 HBc 유전자의 마지막 아미노산이기 위해 절대적으로 요구되는 사항이 있는지(야생형 HBc에서와 같이), 또는 도입된 C-말단 서열 내에서 하나의 시스테인이 내부적으로 작용할 수 있는지를 결정하기 위한 연구를 수행한다.
해당 펩티드의 위치 17에서의 시스테인 또는 CS 단백질의 342에서의 시스테인을 함유하는, 말라리아 기생충 플라스모듐 팔시파룸의 CS 단백질로부터 유도된, 20-잔기 만능 T 세포 에피토프에 상응하는 펩티드[참조: Calvo-Calle et al.,J. Immunol.,(1997) 159(3):p. 1362-1373]를, HBc 키머의 C-말단에 융합시킨다(V2.Pf1; 서열 번호 266 및 267). 이러한 키머는 아미노산 잔기 78과 79 사이에 삽입된 피. 팔시파룸 B 세포 에피토프 (NANP)4를 갖는, 위치 1에서부터위치 149까지의 HBc 서열을 함유한다. 이로써, 상기 HBc 작제물의 도메인 I은 잔기 1-75를 함유하고; 도메인 II는 (제한 부위를 포함하는 4개 잔기와 함께) 잔기 78과 79 사이에 삽입된 (NANP)4에피토프를 갖는 잔기 76-85를 함유하며; 도메인 III은 잔기 86-135를 함유하고; 도메인 IV는 잔기 136-149 + 20-잔기 피. 팔시파룸 T 세포 에피토프 및 EcoRI 클로닝 부위(GI)로부터의 2개의 잔기를 함유한다.
이러한 융합된 C-말단 펩티드는 20개 아미노산 잔기 길이이고(바이러스 아유형에 따라서, 야생형 서열 보다 더 짧은 12 또는 14개 아미노산일 수 있다) 예정된 pI 값이 8 pH 단위 보다 높고 야생형 서열 보다 낮다. 시스테인이 아닌 아미노산에 의해 비롯될 수 있는 잠재적인 안정화 효과를 최소화하기 위해, 위치 17에서 시스테인 대신 알라닌을 갖는 (유사한) 대조군 작제물을 제조한다(하기 표 10 참조).
상기 서열의 안정화 효과를 간단히 평가할 수 있도록 하기 위해, 상기 펩티드를, 37℃에서 용이하게 분해되는 것으로 앞서 밝혀진 입자(V2.Pf1)의 C-말단에 융합시켜 V2.Pf1+Pf/CS-UTC 및 V2.Pf1+Pf/CS-UTC(C17A)로 각각 명명된 HBc 키머를 형성시킨다. 28일 간에 걸친 열 안정성 연구 결과(앞서 논의한 바와 같음)가 도 4에 제시되어 있다.
상기 연구 결과, 피. 팔시파룸의 CS 단백질로부터 유도된 T 세포 에피토프 내에 시스테인이 존재하는 것이 연구된 시간 내에서의 입자 안정성에 필요하다는 사실과, 이러한 시스테인이 상기 에피토프의 C-말단에 반드시 존재해야만 하는 절대적인 요구 사항은 없다는 사실이 밝혀졌다. 다음 표는 야생형 HBc 단백질에서발생되는 본래의 서열에 기준하여, 위치 17에서의 시스테인 또는 알라닌과의 C-말단 융합물의 아미노산 서열을 제시하고 있다.
(GI) = 클로닝 부위로부터 부가된 잔기.
실시예 9: 피. 비박스( P. vivax ) HBc 키머
피. 팔시파룸 B 세포 및 T 세포 면역원을 함유하는 HBc 키머에 대한 전술된 연구를 수행한 후, 피. 비박스 CS 단백질로부터의 서열을 사용하여, 유사한 연구를 수행한다. 예시되는 작제물이 다음 표 11에 예시되어 있다:
상기 반복체의 가변성에 역점을 두기 위해, 다음의 변이체 에피토프를, 아미노산 78과 79 사이의 HBc 내로 삽입하는데 사용한다.
1. I형 CS-반복체
PAGDRADGQPAGDRAAGQPAG (P. vivax-1A형)--서열 번호 197. 이러한 형태의 에피토프는 입자를 만들지못하였다.
DRAAGQPAGDRADGQPAG (P. vivax-1B형)-- 서열 번호 198. 플랭킹 디펩티드 클로닝 부위 나머지를 함유하는 상기 형태의 에피토프는 입자를 성공적으로 만들었으며, 이는 V2.PV-TIB로서 지칭된다. 피. 비박스-I형에 대한 면역원을 성공적으로 클로닝, 발현 및 정제하였고, 이의 면역원성을 마우스에서 성공적으로 시험하였다. 이러한 마우스 연구 결과가 다음 표 12에 제시되어 있다.
2. II형I CS-반복체
II형의 경우에는, 4가지 상이한 형태의 II형 에피토프가 존재함으로써 본 연구가 복잡해진다. 이들 형태는 위치 5에 G 또는 D를 함유하고, 위치 6에 N 또는 D를 함유한다[참조: Qari et al.,Mol. Biochem. Parasitol.,(1992) 55(1-2):p. 105-113]. 따라서, 성공 확률을 최대화하는데 필요한 4가지 상이한 가능한 반복체 서열(GN, GD, DN 및 DD)이 존재한다. 첫 번째의 바람직한 접근법은 다음에 밑줄친 바와 같이, 4개의 반복체 모두를 함유하는 단일 하이브리드 입자를 제조하는 것이다. 이러한 접근법은 I형 반복체에서의 가변성에 역점을 두는데 성공적으로 이용되었다. 이들 작제물 각각은 플랭킹 디펩티드 클로닝 부위 나머지를 함유한다.
ANGAGNQPGANGAGDQPGANGADNQPGANGADDQPG
(피. 비박스-II형-GN/GD/DN/DD) 서열 번호 199
상기 서열을, C-말단에 대한 어떠한 변형도 진행되지 않은 HBc 키머로서 클로닝, 발현 및 정제하였다.
두 번째 접근법은 2개의 하이브리드 입자를 제조함으로써, 각 입자가 2개의 변이체 에피토프를 함유하였다(하기 참조). 이러한 접근법은 덜 바람직한데, 이는 발현 동안 '혼합된' 입자의 생성을 지시해주는 보다 복잡한 발현 시스템의 사용이 요구되거나, 또는 제조 후 II형 입자를 혼합해야 하기 때문이다.
ANGAGNQPGANGAGDQPG (피. 비박스 II형-GN/GD) 서열 번호 200
QANGADNQPGANGADDQPG (피. 비박스 II형-DN/DD) 서열 번호 201
CGCGAATTCAAGCGAACGGCGCCGATAATCAGCCGGCGGGTGCA
(피. 비박스 IIB형-ER1-wt-F) 서열 번호 146
3. III형('비박스-유사') CS-반복체
다른 2개와는 다소 상이한 제3의 피. 비박스 CS-에피토프는 아미노산 변이와 연관되지 않는다[참조: Qari et al.,Lancet, 1993. 341(8848): p. 780-783]. 이 서열을 HBc 발현 시스템 내로 클로닝시키고, 플랭킹 디펩티드 클로닝 부위 나머지를 함유하는 하이브리드를 생성시킨다.
APGANQEGGAAAPGANQEGGAA (피. 비박스-III형) 서열 번호 202
4. HBc의 C-말단에서의 T 세포 에피토프
피. 비박스 Th 에피토프(Pv-UTC; YLDKVRATVGTEWTPCSVT; 서열 번호 196)를 HBc 및 HBc 하이브리드 내로 삽입하는 것은, 합성 DNA 단편(Synthetic Genetics, San Diego CA)을 사용하여 수행하기도 한다. 그러나, HBc 유전자의 면역우성 루프 영역 내로 삽입시킨 B 세포 에피토프와는 달리, T 세포 에피토프를 HBc 유전자의 C-말단에 융합시킨다. 앞서 논의된 클로닝 벡터를, B 세포 에피토프와 Th 에피토프 둘 다를 HBc 내로 삽입시키는데 사용한다. 상기 C-말단에서 Pv-UTC 만을 발현하는 입자가 또한 성공적으로 만들어졌다.
5. 단일 입자에서 B와 T 세포 에피토프를 배합함
B와 Th 에피토프를 단일 HBc 작제물 내로 조합하기 위해, PCR을 사용하여 N-말단 HBc 단편(AA 1-80; 이는 B 세포 에피토프를 함유한다) 및 C-말단 HBc 단편(AA 81-150; 이는 T 세포 에피토프를 함유한다)을 증폭시킨다. 상기 단편을 함께 연결시키고, PCR에 의해 다시 증폭시킨다. 또한, 제한 엔도뉴클레아제 지도화 및 자동화 DNA 서열 분석(Lark Technologies, Houston TX)함으로써, 클론을 확인하였다 상세한 내역은 본질적으로, 피. 팔시파룸에 대해서와 동일하다. 각각의 I, II 및 III B형 세포 에피토프 및 변이체 뿐만 아니라 Pv-UTC를 함유하는 입자를 발현 및 회수하였다.
실시예 10: HBc 키머의 상대적인 면역원성
전술된 IFA 검정 기술을 사용하여, 몇 가지 HBc 키머 면역원의 상대적인 면역원성을 마우스에서 비교하였다. 전술한 바와 같은 2가지 용량 면역 섭생을 이용한 이들 연구 결과가 다음 표 12에 제시되어 있다:
[A = Schodel et al., J. Exp. Med., 1994, 180:1037-1046. B = Schodel et al.,Behring Inst. Mitt., 1997(98): p. 114-119. NT = 시험되지 않았음. * = 3개월 이상 동안의 보호를 나타냄].
상기 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 피. 팔시파룸에 대한 105내지 106역가가 키머 면역원을 사용하여 달성되었는데, 이를 문헌[Schodel et al. 상기 참조]의 대체 기술을 사용한 피. 베르게이에 대한 104역가와 피. 팔시파룸에 대한 103역가와 비교한다.
마우스를, 0일째 20㎍의 입자를 사용하여 CS-2 또는 V12.Pf1로 면역시키고, 4주째에 10㎍으로 부스터시킨다. V12.Pf3 또는 V12.Pf3.1로부터의 입자로 면역시킨 마우스를 0일째에 20㎍의 입자를 사용하여 면역시키고, 전술된 바와 같은 애쥬반트를 사용하여 8주째에 10㎍으로 부스터시킨다. 성취된 역가 기간을 나타내는 데이터가 도 5에 제시되어 있는데, V12.Pf3 입자를 사용한 데이터는 본질적으로, V12.Pf3.1 입자를 사용한 데이터와 동일하며, 이는 제시되지 않았다.
실시예 11: 상대적인 HBc 항원성
본래의 HBcAg(입자)와 비교해서 2개의 모노클로날 항체(MoAb-3120 및 MoAb-3105)에 대한 몇 가지 말라리아성 HBc 키머 입자의 상대적인 항원성을 결정하기 위한 일련의 연구를 수행하였다. 이들 항체는 HBc의 루프 영역에 특이적이고, 이는 고맙게도 다음 공급원으로부터 제공된다[the Immunology Institute, Tokyo, Japan]. 프로브로서 상기 모노클로날 항체를 사용한 ELISA 검정에서 항원으로서 각종 위치에서 HBc 입자 내로 삽입된 말라리아성 에피토프를 함유하는 표 5의 키머를 사용하여 연구를 수행하였다. 이들 연구 결과(종점 희석으로서 제시됨)가 다음 표 13A, 13B 및 13C에 제시되어 있으며, 이는 HBc의 1차 면역원인 루프 영역과 결합하는 모노클로날 항체에 대한 고려된 키머의 항원성이 상당히 결여되어 있다는 사실을 나타낸다. 다르게 표현하면, HBc의 루프 영역과 특이적으로 결합되는 모노클로날 항체는 고려된 키머를 인식한다 하여도 거의 인식하지 못한다.
면역우성 루프 내의 몇몇 부위 내로의 삽입(위치 77-78 또는 78-79 포함)은 MoAb-3105의 결합을 완전히 없앤다. V13은 잔기 129와 130 간의 삽입물이고, 이는 본래의 HBc 면역우성 루프가 상기 작제물에 본래의 상태로 유지되기 때문에 대조군으로 사용된다.
이들 데이터는 잔기 78과 79 사이의 삽입이, 잔기 77과 78 사이의 삽입과 비교해서 항-MoAb-3120 결합을 상당히 더 저하시킬 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 12: 변형된 B형 간염 코어 단백질 발현 벡터의 작제
부위 지시된 돌연변이 유발을 이용하여, 리신 코돈(AAA)을 SacI(GAGCTC) 제한 엔도뉴클레아제 부위를 따라, HBc 유전자의 아미노산 E77과 P78 사이에 도입하여, 링커 그룹 함유 HBc 입자를 생성하기 위한 기타 코돈의 유전적 삽입을 촉진시킨다. 이로써, 상기 삽입물은 KEL의 아미노산 잔기 서열을 갖는데, 이러한 EL은 SacI 부위의 인공물이다. 따라서, 상기 링커 그룹 함유 HBc 단백질은 152개 아미노산 잔기 길이이다. pKK223-3-HBc152-K78 발현 플라스미드의 작제 방법이 다음에 기재되어 있다.
올리고뉴클레오티드 프라이머 P1F(서열 번호 203) 및 P1R(서열 번호 204; 상보성 쇄 상에 존재함)을 사용하여 HBc 유전자의 5' 말단(염기 1-234, 아미노산 1-77)을 증폭시키고, 이와 동시에, 상기 증폭된 생성물의 5' 말단에 NcoI 제한 부위(CCATGG)를 도입하고, 3' 말단에 SacI 제한 부위(GAGCTC)를 도입하며, SacI 부위 앞에 리신 코돈(AAA)를 도입한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 P2F(서열 번호 205) 및 P2R(서열 번호 206, 상보성 쇄 상)을 사용하여 HBc 유전자의 3' 말단(염기 235-450, 아미노산 78-149)을 증폭시키고, 이와 동시에, 상기 증폭된 생성물의 5' 말단에 SacI 제한 부위(GAGCTC)를 도입하고, 3' 말단에 HindIII 제한 부위(AAGCTT)를 도입한다.
상기 2개의 PCR 생성물(아미노산 1-77 및 아미노산 78-149를 암호화함)을, 표준 기술을 사용하여, SacI로 절단하고, 이들의 공통의 SacI 오버행에 함께 연결하며, NcoI 및 HindIII로 절단하고, 발현 플라스미드 pKK223-3(Pharmacia) 내로 클로닝한다. 이로써 생성된 플라스미드가 pKK223-3-HBc152-K78로 명명되었다.
상기 플라스미드를, 면역우성 루프 내의 링커 그룹으로서 리신을 보유하고 있는 HBc 키머의 발현에 사용할 수 있다. 이와 같이 발현된 HBc 키머는 자발적으로 입자를 형성하였다. 따라서, 본 실시예의 링커 그룹 함유 HBc는 서열 번호 247의 HBc의 위치 77에 상응하는 삽입물인, 서열 번호 247의 HBc의 위치 78에 상응하는 위치에서의 화학적으로 반응성인 리신 링커 잔기를 가지며, 이를 서열 번호 247의 HBc의 위치 149에 상응하는 위치에서 절단하였다.
상기 키머를 암호화하고 C-말단 시스테인 잔기를 추가로 포함하는 플라스미드를, 실시예 11에 기재된 PCR 기술을 바로 전에 언급된 제조 방법과 함께 사용하여 제조할 수 있다. 면역원성 합텐과 접합될 수 있는 연결성 잔기와 C-말단 Cys 잔기를 함유하는 HBc 키머 입자는, 본원에 기재된 과정을 수행하여 상기 플라스미드를 발현시킴으로써 비롯된 것이다.
실시예 13: 변형된 B형 간염 코어 입자 정제
실시예 12의 키머 링커 그룹 함유 HBc 입자를 이. 콜라이, 전형적으로 이. 콜라이 BLR 또는 BL21(공급원: Novagen; Madison, Wisconsin) 또는 이. 콜라이 TB1(공급원: Amersham; Arlington, Heights, Illinois)에서 발현시킨다. 형질감염된 이. 콜라이(HBc152-K78로 명명됨)는 플라스미드 pKK223-3-HBc152-K78를 발현하였다. 상기 키머 링커 그룹 함유 HBc 입자[HBc152(K78) 입자]를, 정립된 과정을 사용하여 세파로즈 CL-4B-(Pharmacia) 크로마토그래피하여 정제하였다.
이들 키머 분자 및 입자에 대해 사용된 명명법 시스템에서, "HBc"는 B형 간염 코어 단백질 서열을 의미하고; "152"는 SacI 부위로부터 HBc149 서열에 부가되는 2개의 제한 부위 잔기(글루탐산 및 루이신; EL) 및 리신과 함께 키머에 존재하는 아미노산 잔기 수를 의미하고; "(K79)"는 리신(K)을 새로운 잔기 79로서 잔기 78 다음 서열에 부가한 것을 의미한다. 다음에 논의되는, 해당 분자의 C-말단 잔기로서 시스테인 잔기를 함유하는 키머 분자 및 입자가 "+C"로서 명명된다.
입자는 예측 가능한 방식으로 정제하기 때문에, 풀링에 앞서 개개의 분획의 순도를 평가해주는 SDS-PAGE 분석과 협력하여, 간단한 분광법(OD280)을 이용하여 입자 용출을 모니터하는 것이, 전기영동적으로 순수한 입자를 고수율(5-120mg/L 세포 배양물)로 통상 정제할 수 있게 하는데 충분하다. 순수한 키머 링커 그룹 함유 HBc 입자의 구형 구조를 전자 현미경으로 명백하게 볼 수 있었다.
실시예 14: 활성화 수송체로서 키머 링커 그룹 함유 HBc 입자에 대한 합성 펩티드의 화학적 커플링
실시예 13으로부터의 발현 플라스미드 pKK223-3-HBc152(K78)의 키머 링커 그룹 함유 HBc 입자 생성물을 대상으로 하여, 도입된 리신 잔기 링커 그룹과 플랭킹 5개 아미노산이 결여되어 있다는 것을 제외하고는 HBc152(K78)과 동일한, 유사하게 발현 및 정제된 "야생형" 절단된 B형 간염 코어 입자(HBc149)와 비교해서 이의 화학적 반응성에 대해 검정하였다.
활성화 수송체를 형성하는데 사용된 수용성 헤테로-이작용성 가교결합 시약인 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산 1-카복실레이트(SMCC)를 사용하여, 합성 펩티드(합텐)을 키머 링커 그룹 함유 HBc 입자에 화학적으로 접합시킨다. SMCC는 설프하이드릴 그룹과 1급 아미노 그룹 둘 다에 대해 반응성이어서, 합성 펩티드를 상기 활성화 수송체(이의 1급 아미노 그룹을 미리 SMCC로 변형시킨 HBc 키머 입자)에 순차적으로 접합시킬 수 있다. 추가로, SMCC에 의해 제공된 11.6Å 스페이서 암은 상기 합텐과 HBc 수송체 간의 입체 장애를 저하시키는데 도움을 줌으로써, 커플링 효율을 보다 높힐 수 있다.
간략하게 언급하면, HBc152(K78) 및 HBc149 입자를, 50nM 인산나트륨, pH 7.5에서 실온 하에 2시간 동안, 전체 아미노 그룹(본래의 아미노 그룹 또는 본래의 아미노 그룹 + 삽입체의 리신 잔기로부터의 하나의 아미노 그룹)에 비해 5배 과량의 SMCC와 별개로 반응시켜, 말레이미드-활성화 HBc 입자를 형성시킨다. 반응되지 않은 SMCC는 50mM 인산나트륨, pH 6.8에 대해 반복해서 투석함으로써 제거시킨다. 상기 HBc 입자를 SMCC 유도체화시키면, SDS-PAGE에 의해서는 탐지 가능하지 않은 최소한의 분자량 증가가 야기된다. 그러나, PAGE 분석은 펩티드 접합 단계를 진행하기 이전에 HBc 단백질의 원형 보존을 확인하였다.
합텐의 시스테인 설프하이드릴을 통하여 도입된 리신 잔기의 측쇄 상의 1급 아민에 펩티드 합텐을 지향성 접합시킬 수 있게 해주는 N-말단 시스테인 잔기를 갖도록, 활성화 수송체로서 키머 HBc 입자와 커플링될 합성 펩티드를 고안하였다.
표 14는 펜던트하게 연결된 시토크롬 P450 결정기 합텐을 함유하는 HBc 키머 입자 접합체, 또는 보다 간단하게는, HBc 키머 입자 접합체를 형성하기 위해 HBc 입자 활성화 수송체와 화학적으로 접합시킨 사람 시토크롬 P450 효소로부터 유도된합성 펩티드가 제시되어 있다. 이러한 합성 펩티드를 50mM 인산나트륨, pH 6.8에 용해시켜 10mg/ml의 농도로 만든다. 이어서, 상기 합성 펩티드를 말레이미드-활성화된, 전략적으로 변형된 HBc152(K78) 입자 내의 전체 아미노 그룹에 비해 5배 과량으로 적가하고, 실온에서 2시간 동안 반응시킨다. 말레이미드-활성화 HBc149 입자를 대조군으로서 2개의 2D6 펩티드(2D6 및 2D6-C)와 반응시킨다.
실시예 15: 키머 HBc 입자 접합체의 분석
실시예 14의 시토크롬 P450 결정기 합텐에 펜던트하게 연결된 것을 함유하는 HBc 키머 입자 접합체를 SDS-PAGE 및 면역블롯함으로써 분석하여, 합성 펩티드가HBc에 성공적으로 접합되었는 지를 결정한다. 상기 전기영동 과정의 변성 조건은 입자를 이의 구성 소단위체, 즉 HBc 단량체인 것으로 꾸민다. HBc 단량체는 분자량이 대략 17,000 Da이기 때문에,1A1(289-302),1A2(291-302),2D6(263-277) 또는3A4(253-273) 펩티드와 화학적으로 접합된 HBc152(K78) 입자를 용해시키는 것은 간단한 일인데, 이는 상기 펩티드의 상대적 분자량이 대략 2,000 Da이므로 HBc 단백질 단량체의 가시적인 분자량 증가를 가져다 주기 때문이다.
SDS-PAGE 상의 접합된 밴드와 접합되지 않은 밴드의 상대적인 세기로부터, HBc152(K78) 단량체의 대략 50%가 합텐에 공유적으로 연결된 반면, "야생형" HBc149 입자의 단지 5% 만이 합텐에 연결된 것으로 결정되었다. 활성화 수송체에 합텐을 펜던트하게 연결시키는 것으로 관찰된 성공율이 현저하게 증가한다는 것은, 이와 같이 관찰된 연결이 "야생형"에 존재하기도 하는 리신 잔기와는 달리, 삽입된 리신을 통하여 이루어진다는 결론을 뒷받침해준다.
보다 짧은 C-말단 P450-유도된 펩티드(5량체 또는 6량체)에 접합된 HBc 입자의 이동성 변동은 SDS-PAGE에서 이 보다 긴 억제성 펩티드의 이동성 변동 보다 두드러지지 않지만, 대략 1kDa의 변동이 성공적으로 커플링된 HBc152(K78) 단량체에서 명백하게 입증되었다. 이러한 키머 HBc152(K78) 단백질은, 최소한의 접합을 나타내는 "야생형" HBc149 입자에 비해 합텐와 펜던트하게 연결되는 능력이 현저하게 증강되었다.
180 또는 240 연합된 코어 단백질 단량체의 20면체 입자로 제의된 코어 단백질 모델에서는[참조: Conway et al. (1997) Nature, 386:91-94], 상기 코어 단량체의 비교적 노출된 면역우성 루프 영역의 이량체가 어셈블리된 코어 입자로부터 메이스(mace) 상의 용액형 스파이크 내로 연장된다, 이러한 "스파이크(spike)"는 HBc 입자 상에 공간적으로 밀접하게 배열되어 있다. 도입된 리신 잔기를 스파이크 선단에 전략적으로 위치시키면, 어셈블리된 코어 입자에 합텐을 연결시키는 반응에 대한 입체적 구속 개연성이 최소화된다.
전략적으로 변형시킨 HBc 단량체의 최대 50%가 Cyt P450의 합성 펩티드와 성공적으로 접합되었다. 이러한 펜던트 연결 량은 코어 단백질 이량체 당 부착된 하나의 합텐 평균량에 상응한다. 이와 같이 제안된, 전략적으로 변형된 HBc 입자에 합텐 연결부를 분포시키는 것은, 이량체 연합은 유지시키면서 해당 입자를 속이는 반-변성 조건 하에서의 PAGE 결과에 의해 뒷받침된다.
펩티드 커플링에 의해 제조된 HBc-2D6 입자를 면역블롯팅함으로써 검사하여, 상기2D6폴리펩티드 에피토프의 표시화를 확인하였다. 항-HBc 항혈청으로 프로빙시킨 경우, 화학적으로 커플링된 입자는2D6폴리펩티드를 갖거나 갖지 않는 단량체를 나타내는 2가지 상이한 단량체 밴드를 생성시켰다. 이들의 상단 밴드 만을 항-2D6항혈청으로 블롯팅시킴으로써,2D6폴리펩티드의 부착과 이동성 변동 간의 상관 관계를 확인하였다.
실시예 16: 전략적 리신 삽입
면역우성의 표면 노출된 루프 영역(아미노산 75-85) 내의 모든 위치에 삽입된 리신 잔기를 갖는 HBc 입자를 작제하기 위해, PCR을 사용하여 HBc 유전자의 5'및 3' 단편을 증폭시키고, 단일 리신 코돈을 올리고뉴클레오티드 프라이머를 통하여 도입한다. 이러한 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 이로써 생성된 아미노산 서열이 서열 번호 220 내지 241에 제시되어 있다. "야생형" 서열은 서열 번호 218-219이다. 이들 HBc 키머는, 각 키머 및 입자 명칭 내의 숫자로써 기재된 위치에 리신이 부가된 150개 잔기 길이이다.
위치 75 내지 84에 리신 삽입물을 제조하기 위해[HBc150(K75) 내지 HBc150(K84)], 서열 TTAA를 인식하는 제한 엔도뉴클레아제 MseI로 PCR 단편 쌍을 분해시킨다. 이와 같이 변형된 유전자를, 뉴클레오티드 221-224에 위치된 편리한 MseI 제한 부위에 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머(리신 함유)를 연결함으로써 복구시킨다. HBc-K85(서열 번호 240-241)의 경우에는, 야생형 유전자에는 존재하지 않지만, 어떠한 아미노산도 변화시키지 않고 위치 239-244에 도입될 수 있는 공통의 XhoI 제한 부위(CTCGAG)에 연결시키는 2개의 단편을 제조하는 것이 필요하다.
링커 그룹 함유 HBc 키머를 정제하기 위해, 1L 발효액으로부터 정화된 세포 용해물을 45% 황산암모늄으로 침전시키고, 이로써 생성된 펠릿을 대상으로 하여, 세파로즈(Pharmacia) CL-4B 크로마토그래피(2.5cm x 100cm)를 이용하여 겔 여과시킨다. 과립 HBc는, 해당 입자에 수행된 아미노산 삽입과는 독립적으로, 상기 유형의 칼럼을 사용하여 분석할 때 특징적인 용출 위치를 갖는다. 본 연구를 위해 제조된 11개 링커 그룹 함유 HBc 키머 입자를 상기 과정으로 분석하고, 용출 프로필을 280nm의 흡광도에서 분광측정법으로 측정한다.
작제물로부터 제조된 링커 그룹 함유 HBc 키머 입자 중의 3개 [HBc150(K75), HBc150(K77) 및 HBc150(K79)]가 50 내지 100mg/L의 수준으로 생성되었는데, 이는 야생형의 변형되지 않은 HBc 입자, 예를 들면, HBc149 입자에 대한 전형적인 수득량에 필적한다. 작제물 중의 4개의 링커 그룹 함유 HBc 키머 입자[HBc150(K76), HBc150(K78), HBc150(K81) 및 HBc150(K82)]가 비교적 저수준으로 생성되었다(1 내지 20mg/L). 최종적으로, 4개의 입자[HBc150(K80), HBc150(K83), HBc150(K84) 및 HBc150(K85)]가 거의 탐지 가능하지 않은 수준으로 생성되었다(1mg/L 미만). 이들발현 생성물의 수득량이 다음 표 16에 제시되어 있다.
전술된 바와 같이, 상기 키머를 암호화하고 C-말단 시스테인 잔기를 추가로 포함하는 플라스미드는, 바로 전에 언급된 제조법과 함께, 종결 코돈으로부터 바로 상단에 Cys 코돈을 삽입함으로써 실시예 1I에서 또는 상기 언급된 PCR 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
실시예 17: HIV 서열을 갖는 키머
위치 631-665의 HIV-1 gp41 서열이 잔기 78과 79 사이에 존재하는 재조합 키머 입자를 제조하였다. 한 제제는 C-말단 Cys 잔기(서열 번호 272 및 273)를 함유하는 반면, 다른 것은 이를 함유하지 않고, HBc 위치 149의 발린에서 종결된다(서열 번호 270 및 271). 말단 Cys를 함유하지 않는 입자를, 실시예 1B에서 논의된 V2 벡터를 사용하여 발현시키는 반면, Cys-말단화 입자는 실시예 1I에서 논의된 바와 같이 제조된 벡터로부터 발현시킨다. 이들 작제물은 각각 V2.HIV11.1 및 V16.HIV11.1로서 지칭된다. 발현시 수득량은 각각 1.6mg/L 및 12.4mg/L인데, 이는 Cys-말단화 단백질로부터 어셈블리된 입자에 대한 수득량이 거의 8배 이상 증가하였다는 것을 예시해준다.
HIV B 세포 에피토프의 서열의 다음에 제시되어 있는데, 이는 상기 에피토프에 대한 암호화 및 상보성 DNA 서열로서 제시된다. 이러한 HIV 서열은 편리하게, C-말단 EL 잔기로 종결되고 부가된 N-말단 GI 잔기로 시작되므로, HBc 서열로부터 유래된 것이 아닐 뿐만 아니라 삽입된 에피토프 서열로부터도 유래된 것이 아닌 총 2개의 부가된(이종) 잔기가 존재한다.
삽입된 B 세포 에피토프 서열
GIQWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL 서열 번호 242
암호화 서열
5'AATTTGGATGTGGGAAGATCGTGAGATCAACAATTATACCAGCCTGATACATTCTTTAATTGAAGAGTCCCAGAACCAACAGGAGAAAAATGAACAAGAGCT 서열 번호 243
상보성 서열
5'CTTGTTCATTTTTCTCCTGTTGGTTCTGGGACTCTTCAATTAAAGAATGTATCAGGCTGGTATAATTGTTGATCTCACGATCTTCCCACATCCA 서열 번호 244
실시예 18: 비교성 발현
(부가된 리신의 어느 한 측쇄 상의 2개의 외인성 잔기와 함께) HBc의 잔기 78과 79 사이에 리신을 함유하는 키머 분자를 암호화하는 전술된 HBc150(K77) 벡터와, 해당 단백질의 C-말단에 Cys 잔기를 함유하기도 하는 유사한 벡터를 사용하여, 유사한 비교성 발현 연구를 수행한다. 후자 벡터는, Val-149와 정지 코돈 사이에 Cys에 대한 코돈을 함유하는 C-말단 PCR 프라이머를 사용함으로써 앞서 논으된 기술에 의해 제조하였다. 쌍을 이룬 발현 연구에서는, 전자 벡터가 입자를 55mg/L의 양으로 발현하는 반면, 후자 벡터는 입자를 60mg/L의 양으로 발현하였다.
실시예 19: C-말단 절단된 HBc 키머 유전자 및 입자의 제조
각각의 역방향 프라이머, 즉 HBc138+139C-H3-rev, HBc139C-H3-rev 및 HBc140-H3-rev(후술됨)와 협력하여, HBc-NcoI-fwd(후술됨)를 사용하여 HBc 유전자를 증폭시켜, 다음의 HBc 유전자를 생성시킨다: HBc140, HBc139 및 HBc138+139C. 상기 PCR 생성물을 NcoI 및 HindIII로 절단시키고, 이를 동일한 2개 효소로 절단시킴으로써 제조시킨 pKK223.3N 내로 클로닝한다. 이어서, 플라스미드를 이. 콜라이 균주 TB1 내로 형질전환시키고, 8ml g/L 글루코즈와 50㎍/ml 앰피실린이 보충된 TB 배지 500ml에서 24시간 동안 성장시킨다. 세파로즈RCL-4B 사이징 칼럼(Pharmacia)을 사용하여 조악한 이. 콜라이 제제를 분석함으로써 입자 생성을 결정하여, 입자를 특징적인 용출 위치와 연관시킨다.
따라서, 수거된 세포 5그램을 프렌치 프레스를 사용하여 25ml의 50mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.0), 10mM EDTA에서 용해시킨다. 이 용해물을 20분 동안 16,000rpm(JA-30.50 Ti 로터, Beckman)으로 원심분리시킴으로써 정화시킨다. 황산암모늄 침전(45%)을 사용하여 입자를 침전시키고, 이러한 침전물을 20분 동안 16,000rpm(JA-30.50 Ti 로터, Beckman)으로 원심분리시킴으로써 회수한다. 이로써 형성된 펠릿을 5ml의 50mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.0), 10mM EDTA에서 재현탁시키고, 용해될 때까지 20mm 트리스-HCl, pH 8.0에 대해 투석시킨다. 이어서, 상기 물질을 세파로즈 CL-4B 크로마토그래피 칼럼(2.5 x 100cm) 상으로 부하하고, 500분 동안 1ml/분의 유속으로 수행함으로써, 이때 모든 물질을 용출시켰다. 입자의 용출을 280nm에서 모니터하였다.
용출 프로필에 근거해 보면, HBc 140은 입자를 만든 반면, HBc 139는 그렇치 못하였다. 입자는 또한, 잔기 138에서 종결되는 입자의 위치 139에 시스테인을 부가해도 형성되지 못하였다. 전술된 서열 번호 275, 146, 159, 160, 155, 156, 153및 154의 DNA를 사용하여 벡터를 작제하였다.
실시예 20: 사람에게서 사용하기 위한 HBc 입자 제조용 벡터의 제조
A. 벡터 V17.Pf3.1의 제조
사람 투여에 적합한 방식으로 입자 V12.Pf3.1(서열 번호 268 및 269)를 제조하기 위해서는, 플라스미드 유지를 보장하기 위해 앰피실린의 사용을 요구하지 않는 발현 시스템을 사용하여 입자를 발현시키는 것이 필요하다. 이를 달성하기 위해, 상기 입자를 암호화하는 유전자를, 필수 상단 조절 서열과 함께, 선별성 마커로서 카나마이신을 활용하는 새로운 플라스미드 내로 삽입한다. 이러한 새로운 플라스미드(V17.Pf3.1)는 2 단계 클로닝 과정을 이용하여 합성하였다:
단계 1: 플라스미드 pKK223-3N-V12를 제한 효소 BamHI 및 HindIII로 분해하여 801 및 4869bp의 2개의 DNA 단편을 수득한다. 또한, 시판용 플라스미드 pREP4(Qiagen)을 BglII 및 HindIII로 절단하여 320bp 및 3420bp의 2개의 단편을 수득한다. 이러한 3420bp 및 801bp 단편을 연결시켜 플라스미드 V17을 창출시킨다(BglII 및 BamHI 분해된 DNA를 이들의 공통의 '오버행' 서열을 통하여 연결할 수 있긴 하지만, BglII 또는 BamHI 어느 것도 생성된 단편을 절단할 수는 없다는 것에 주목해야 한다). 따라서, V17 플라스미드는, C-말단에 융합된 Pf-UTC 서열로 완성시킨 HBc149 유전자와, 이러한 HBc 유전자의 D78과 P79 사이에 에피토프를 삽입할 수 있게 해주는 면역우성 루프 영역 내의 EcoRI 및 SacI 제한 부위를함유한다.
단계 2: 제2 단계는 Pf CS-반복체 에피토프의 Pf3.1 변형물을 해당 유전자의 면역우성 루프 영역 내로 삽입시키는 것이다. 이는, V17을 SacI 및 EcoRI로 분해하여 15bp 및 4206bp DNA 단편을 수득함으로써 달성된다. Pf3.1 에피토프를 암호화하는 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 4206bp 단편과 연결시켜, 4275 염기쌍 플라스미드인 V17.Pf3.1을 수득한다. 195 아미노산 말라리아 백신 후보를 암호화하는 유전자 이외에도, 상기 플라스미드는 lac 프로모터 제어 하의 어떠한 유전자도 이소프로필티오갈락토시드(IPTG)에 의해 유도될 때까지 강제로 완전히 억제시킬 수 있는 lac 억제인자(lac I)에 대한 유전자를 함유한다. 이는 또한, 카나마이신을 배양 배지에 부가함으로써 양성 선별을 허용해주는 카나마이신 내성 유전자를 갖는다. 상기 플라스미드는 pACYC 184의 복제 기점을 가지며, 이는 높은 복사 수의 플라스미드로 간주되지 않는다.
관심있는 유전자의 위치는 다음과 같다:
V17.Pf3.1에 적합한 숙주는 이. 콜라이 BLR, 이. 콜라이 BL21의 rec A 유도체, 및 재조합 단백질 제조에 사용된 공통의 균주(공급원: Novagen)이다. 이. 콜라이 BLR은 이의 유전적 안정성 증가 뿐만 아니라 가용성 형태(봉입체 형태가 아님)의 어셈블리된 입자 생성 능력으로 인해, 발현을 위한 숙주 유기체로서 선별되었다.
B. 플라스미드 V17.Pf3.1를 사용한 입자의 발현
V17.Pf3.1 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이(균주 BLR)를, 25㎍/ml 카나마이신 및 10㎍/ml 테트라사이클린이 보충된 LB 한천 판 상으로 스트리킹한 다음, 37℃에서 16 내지 20시간 동안 항온 배양한다. 이어서, 단일 콜로니를 사용하여, 25㎍/ml 카나마이신이 보충된 멸균성 배양 튜브 내의 TB-Phy 배지 3ml를 접종한다. 상기 튜브를 37℃ 및 약 200rpm 하의 진탕기 상에서 밤새(약 18시간) 항온 배양한다.
그 다음날 아침, 100ml의 TB-Phy 배지를 37℃로 가온시킨다. 밤새 배양물 1ml를 꺼내고, 이를 사용하여 플라스크에 접종한 다음, 37℃ 및 약 200rpm 하의 진탕기 상에서 6시간 동안 항온 배양한다.
다음과 같이 설정된 발효 조건을 이용하여 100ml의 접종원을 발효기(Biostat™ UE20)에 접종한다:
진탕 400rpm
온도 37℃
통기 공기, 분당 10리터
pH 7.0, 제어되지 않음.
제1 샘플에 대해 A600값을 측정하고, 그 후 20 내지 30분 마다 샘플에 대한 A600을 모니터한다. 62mg IPTG를 10 내지 15ml 물에 용해시킴으로써 IPTG 용액을 제조한다. A600값이 0.5에 도달하면, 필터-멸균된 IPTG 용액을 주사기를 통해 상기 발효기에 무균적으로 가한다. 그 다음날 까지 항온 배양을 지속시킨다(예를 들면, 약 10 내지 24시간 더 항온 배양함).
유도시킨지 14시간 후, 발효기 온도를 15℃로 설정한다. 다음 조건을 사용하여 발효기(Beckman®J2-MC)에서 원심분리시킴으로써 세포 수거를 시작한다:
로터 JA10
속도 7,500 rpm
온도 4℃
시간 9분.
상기 세포를 액체 질소 내로 동결시킴으로써 수거한다.
C. 벡터 V17.Pf3.1/BLR에 의해 발현된 입자의 정제
수거된 세포의 생체량을 50mM 인산나트륨, pH 6.8에 재현탁시키고,16,000psi에서 프렌치 압력 세포를 사용하여 용해시킨다. Beckman® J2-MC 원심분리기 및 다음 조건을 사용하여 원심분리시킴으로써 세포 부스러기를 제거한다:
로터 JA20
속도 15,000 rpm
온도 4℃
시간 30분.
생성된 상등액 용적을 측정하고, 277g/L의 고체 황산암모늄을 상기 상등액에 서서히 가한다. 이 혼합물을 4℃에서 30분 동안 교반시킨다. 이 용액을 다음 조건을 이용하여 Beckman®J2-MC 원심분리기에서 원심분리시킨다:
로터 JA20
속도 15,000 rpm
온도 4℃
시간 30분.
이어서, 상기 침전물을 최소 용적의 50mM 인산나트륨 완충액에 재현탁시킨 다음, 교반시키면서 1시간 동안 동일한 완충액에 대해 투석시킨다. 이와 같이 투석된 용액을 다음 조건을 이용하여 Beckman®J2-MC 원심분리기에서 원심분리시킨다:
로터 JA20
속도 15,000 rpm
온도 4℃
시간 15분.
상기 상등액을 회수한 다음, 겔 여과 크로마토그래피시킨다.
시스템: 파마시아 바이오테크 AKTA™ 익스플로러(Pharmacia Biotech AKTA™ Explorer)
완충액 B(용출 용매): 50mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8)
칼럼: 밀리포어 반타지(Millipore Vantage™) VL44 x 1000 칼럼(44mm 직경,1000mm 높이, 카타로그 번호: 96441000)
수지: 1.5리터 세파로즈 CL-4B (제조원: Pharmacia)
탐지기: 210, 254 및 280nm에서의 UV
분획: 15ml.
상기 칼럼을 분당 2ml로 완충액 B로 용출시킨다. SDS-PAGE를 사용하여 입자 함유 분획을 동정하고, 모은다. 염화나트륨을 가함으로써, 이와 같이 모은 물질의 염 농도를 5M으로 조정한다.
소수성 상호작용 크로마토그래피:
시스템: 파마시아 바이오테크 AKTA™ 익스플로러
(시스템 번호: 18111241 001152,
아이오와 대학 식별 번호: 540833)
완충액 A: 50mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8) + 5M NaCl
(이 완충액를 사용 전에 매일 30분 동안 탈기시킨다)
완충액 B(용출 용매): 50mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8)
(이 완충액를 사용 전에 매일 30분 동안 탈기시킨다)
ToyoPearl®에테르 650 수지를 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피:
칼럼: 밀리포어 반타지™VL44 x 250 칼럼(44mm 직경, 250mm 높이, 카타로그번호: 96440250)
수지: 200ml ToyoPearl®에테르 650 HIC 수지(제조원: Tosohaas)
탐지기: 210, 254 및 280nm에서의 UV
분획: 15ml.
20ml/min의 유속을 사용하여, 정제를 개시하기에 앞서 1시간 동안 5칼럼 용적(CV)의 완충액 A로 상기 칼럼을 평형시킨다. 이어서, 5M 염을 함유하는 잔류물을 20ml/min의 유속으로 부하한다. 이 칼럼을 2CV의 완충액 A로 세척하고, 2CV의 10% 완충액 B로 세척하며, 3CV의 40% 완충액 B로 용출시키고, 최종적으로 100% 완충액 B로 용출시킨다. 분획을 대상으로 하여, SDS-PAGE 분석함으로써 관심있는 단백질에 대해 완전히 분석한다. 순수한 분획을 함께 합하고, 브래드포드 검정을 이용한 단백질 평가를 수행한다.
부틸 수지를 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피:
칼럼: 밀리포어 반타지™VL44 x 250 칼럼(44mm 직경, 250mm 높이, 카타로그 번호: 96440250)
수지: 200ml ToyoPearl®부틸 650-S HIC 수지(제조원: Tosohaas)
탐지기: 210, 254 및 280nm에서의 UV
분획: 15ml.
20ml/min의 유속을 사용하여, 정제를 개시하기에 앞서 1시간 동안 5칼럼 용적(CV)의 40% 완충액 B로 상기 칼럼을 평형시킨다. 이어서, 에테르 HIC로부터 합한 분획을 20ml/min의 유속으로 부하한다. 이 칼럼을 2CV의 40% 완충액 B로 세척하고, 2CV의 90% 완충액 B로 세척하며, 4CV의 WFI로 용출시킨다.
분획을 대상으로 하여, SDS-PAGE 분석함으로써 관심있는 단백질에 대해 분석한다. 순수한 분획을 함께 합한다.
하이드록시아파타이트 칼럼 크로마토그래피:
칼럼: 밀리포어 반타지™VL16 x 250 칼럼(16mm 직경, 250mm 높이, 카타로그 번호: 96160250)
수지: 200ml 세라믹 하이드록시아파타이트(카탈로그 번호: 158-2200)
탐지기: 210, 254 및 280nm에서의 UV
분획: 15ml.
5ml/min의 유속을 사용하여, 5 칼럼 용적(CV)의 20mM 인산나트륨 완충액으로 상기 칼럼을 평형시킨다. 부하된 합한 분획을 5ml/min으로 부틸 HIC로부터 용출시킨다. A280이 기준선으로 떨어질 때까지 20mM 인산나트륨 완충액으로 상기 칼럼을 세척한다. 분획을 대상으로 하여, SDS-PAGE 분석함으로써 관심있는 단백질에 대해분석한다. 순수한 분획을 함께 합한다.
탈염:
칼럼: 예비패킹된 탈염 칼럼(HiPrep™ 26/10, Pharmacia)
수지: 20ml 세라믹 하이드록시아파타이트(카탈로그 번호: 158-2200)
탐지기: 215, 254 및 280nm에서의 UV
분획: 15ml.
5 CV의 15mM 아세테이트 완충액, pH 6.0으로 상기 칼럼을 평형시킨다. 이러한 하이드록시아파타이트 칼럼으로부터 모은 분획을 상기 칼럼에 부하한 다음, 20ml/min의 유속으로 15mM 아세테이트 완충액, pH 6.0으로 용출시킨다. 분획을 대상으로 하여, SDS-PAGE 분석함으로써 관심있는 단백질에 대해 분석한다. 순수한 분획을 함께 합하고, 브래드포드 검정을 이용하여 단백질 평가를 수행한다. 이러한 순수한 분획을 대상으로 하여, 내독소 수준을 검정하고, 최종적으로 열 여과시키기 위해 0.22-마이크론 필터 내로 통과시킨다.
실시예 21: 시토크롬 P450 서열을 이용한 키머의 비교성 발현
위치 290-302의 사람 시토크롬 P450 1A1 서열이 HBc 잔기 78과 79 사이에 존재하는 재조합 키머 입자를 제조하였다. 한 제제는 C-말단 Cys 잔기를 함유하는 반면, 다른 것은 이를 함유하지 않고, HBc 위치 149의 발린에서 종결된다. 말단 Cys를 함유하지 않는 입자를, 실시예 1B에서 논의된 V2 벡터를 사용하여 발현시키는 반면, Cys-말단화 입자는 실시예 1I에서 논의된 바와 같이 제조된 벡터로부터발현시킨다. 이들 벡터는 각각 V2.1A1(290-302) 및 V16.1A1(290-302)로서 지칭된다. 발현시 수득량은 각각 2.7mg/g 세포, 36mg/L 배양물 및 8.8mg/g 세포, 144mg/L 배양물인데, 이는 키머 분자 입자 생성과 수율을 안정화시키는 상기 말단 시스테인 변형물의 능력을 예시해준다.
P450 1A1 펩티드의 서열이 다음에 제시되어 있는데, 이는 상기 에피토프에 대한 암호화 및 상보성 DNA 서열로서 제시된다. 이러한 P450 1A1 서열은 N-말단 GI 잔기로 시작되고, C-말단 EL 잔기로 종결되므로, HBc 서열로부터 유래된 것이 아닐 뿐만 아니라 삽입된 펩티드 서열로부터도 유래된 것이 아닌 총 4개의 부가된(이종) 잔기 만이 존재한다.
삽입된 B 세포 에피토프 서열
(GI)QEKQLDENANVQL(EL) 서열 번호 280
암호화 서열
5' CAAGAAAAACAGCTAGACGAAAACGCAAATGTACAGCTC 서열 번호 74
상보성 서열
5' CGAGCTGTACATTTGCGTTTTCGTCTAGCTGTTTTTCTTG 서열 번호 71
실시예 22: C-말단 융합된 에피토프 앞에 시스테인 잔기를 갖는 입자를 발현시키는벡터의 제조
HBc 유전자의 V149 다음에 단일 시스테인이 존재하고, 이어서 T 세포 에피토프가 존재하는 입자를 제조하기 위해, PCR 프라이머를 합성하였다(서열 번호 282). 이 프라이머를 HBc149/NcoI-F(서열 번호 67)와 연계해서 사용하여, 상기 HBc 유전자를 증폭시킴으로써, V149 바로 다음에 도입된 단일 시스테인 코돈 뿐만 아니라 EcoRI 및 HindIII 제한 부위(상기 도입된 시스테인 잔기 다음)을 갖는 HBc의 변형물을 생성시킨다. 이러한 478bp PCR 생성물을 NcoI 및 HindIII로 절단하고 pKK223-3N 내로 클로닝시킨다.
이어서, 이로써 생성된 플라스미드를 EcoRI 및 HindIII로 절단하고, Pf/CS-UTC를 암호화하는 어닐링된 올리고뉴클레오티드(서열 번호 121 및 122)를 상기 플라스미드에 연결시킨다. 이어서, 상기 플라스미드를 프라이머 HBc-P79/SacI-F(서열 번호 73) 및 Pf/CS(C17A)(서열 번호 145)와 함께 PCR 반응에 주형으로서 사용하고, 이로써 생성된 PCR 생성물(307bp)은 HBc의 아미노산 잔기 79 내재 149에 이어, 도입된 시스테인, C17A 돌연변이를 갖는 Pf/CS-UTC 서열을 암호화하고, SacI(5') 및 HindIII(3') 제한 부위에 의해 플랭킹된다. 이 단편을 SacI 및 HindIII로 절단하고, 동일한 두 효소로 절단시킨 플라스미드 V2.Pf1[말라리아성(NANP)4에피토프를 암호화함]에 연결시킨다.
이로써 생성된 유전자는 HBc의 아미노산 78과 79 사이에 삽입된 (NANP)4(EcoRI 및 SacI 제한 부위로부터 각각 유도된 Gly-Ile 및 Glu-Leu 서열에 의해 플랭킹됨), 및 C-말단에서의 Pf/CS326-345의 C17A 변형물을 갖는 190개 아미노산 잔기 HBc 키머를 암호화한다. 따라서, 단일 시스테인을, Pf/CS326-345(C17A)[Pf/CS-UTC(C17A)] T 세포 에피토프(서열 번호 284 참조)의 첫 번째 아미노산에 앞서 위치된 Gly-Ile 링커 서열(EcoRI 제한 부위로부터 유도됨)와 HBc의 V149 사이에 위치시킨다.
이러한 하이브리드 입자를 발현하고, 정제한 다음, 37℃에서 수 주 동안 항온 배양함으로써 안정성에 대해 분석한다. 이러한 입자(V12.Pf1(C17A)C150)의 안정성을 V12.Pf1과 비교한 결과, 두 입자 간의 차이점은 시스테인 잔기 위치 뿐이다. V12.Pf1의 경우, 이러한 시스테인에 이어, 해당 단백질의 C-말단에 3개의 아미노산 잔기(SVT)(서열 번호 283)가 존재하는 반면, V12.Pf1(C17A)C150의 경우에는, 상기 시스테인에 이어, 22개의 부가의 아미노산 잔기(서열 번호 284)가 존재한다.
V12.Pf1
TTVV GI EYLNKIQNSLSTEWSP C SVT 서열 번호 283
V12.Pf1(C17A)C150
TTVV C GI EYLNKIQNSLSTEWSP A SVT 서열 번호 284
HBc와 T 세포 에피토프(V12.Pf1(C17A)C150) 사이에 시스테인 잔기를 삽입하는 효과는 C-말단 시스테인을 갖지 않는 유사한 입자(V12.Pf1(C17A)) 보다 상당히 더 안정적인 입자를 생성시키는 것이다. 이는, V12.Pf1(C17A)C150은 V12.Pf1(C17A)와 달리, 단량체를 상당한 정도로 분해시키지 않고서도 용이하게 정제할 수 있다는 사실로부터 명백하며(도 4 및 8에서 이들 입자에 대한 T=0를 비교한다); 추가로, V12.Pf1(C17A)C150는 37℃에서의 항온 배양 후 V12.Pf1(C17A) 보다 상당히 더 안정적이다. 37℃에서 14일 후, V12.Pf1(C17A) 단량체는 완전히 분해된 반면(도 4), V12.Pf1(C17A)C150 단량체는 단지 부분적으로 분해되었다(도 8).
V12.Pf1(C17A)C150이 안정한 V12.Pf1로서 존재하지 않다는 것은 명백하다(도 8). 이들 데이터는 단일 C-말단 시스테인 잔기의 안정화 효과는 HBc 키머의 C-말단 또는 말단 근처(예를 들면, 5개 아미노산 잔기 이내)에 위치할 경우에 가장 효과적이라는 사실을 지시해준다.
실시예 23: 하이브리드 입자의 분석적 겔 여과 분석
25ml 슈퍼로즈 6 HR 10/30 크로마토그래피 칼럼(Amersham Pharmacia # 17-0537-01) 및 BioCAD™ SPRINT 관류 크로마토그래피 시스템을 사용하여, 정제된 하이브리드 HBc 입자의 분석적 겔 여과 분석을 수행한다. 260 및 280nm의 파장 모두를 모니터하도록 탐지기를 설정한다. 이 칼럼을 0.75ml/min의 유속을 사용하여, 3 칼럼 용적(CV; 약 75ml)의 완충액(50mM NaPO4, pH 6.8)으로 평형시킨다.
50mM NaPO4, pH 6.8을 사용하여, 분석하고자 하는 입자를 1mg/ml의 농도로 희석시킨다. 이어서, 상기 샘플 200 마이크로리터(㎕)를 200㎕ 루프 상으로 부하하고 칼럼 상으로 부하한다. 이 샘플을 0.75ml/min의 유속으로 50mM NaPO4, pH 6.8을 사용하여 상기 칼럼으로부터 용출시킨다.
상기 과정을 사용하여, C-말단 시스테인 잔기를 함유하는 몇몇 입자 또는 이러한 시스테인을 갖지 않는 유사한 입자를 분석한다. BioRAD™ 소프트웨어(PerSeptive)를 사용하여, 280nm 트레이스의 통합을 수행하여, 다음 표17에 제시된 결과를 제공한다:
*C-말단 시스테인-안정화된 입자.
정제된 입자를 대상으로 하여, 입자 비율(%)에 대해 검정하고, 이를 전술된 바와 같이 37℃ 하의 수용액에서 항온 배양한다. 이 조성물을 대상으로 하여, 14일 동안 항온 배양한 후의 안정성에 대해 검정한다. 이러한 분석 결과가 다음 표18에 제시되어 있다:
*표 17의 주석 참조.
도 8은 37℃에서 항온 배양한지 0일, 7일 및 14일 후의 표 18의 입자의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다. 이러한 SDS-PAGE 분석의 밀도측정 분석 결과가 다음 표 19에 제시되어 있다:
*표 17의 주석 참조.
C-말단 Cys 잔기를 함유하거나 함유하지 않는 표 18 및 19의 입자 및 실시예 16의 대조군 입자를 대상으로 하여, 실시예 4에 보고된 결과와는 대조적으로, 애쥬반트의 부재 하에 인산염 완충 식염수(pH 7.4) 중의 각각의 입자 20㎍를 사용하여복강내 주사함으로써 BALB/c 마우스에서의 면역원성을 분석한다. 고체 상 포획 항원으로서 HBc 입자(항-HBc) 또는 (NANP)5합성 펩티드[항-(NANP)n]를 사용하여 ELISA를 사용하여 면역시킨지 2주 후에 혈청을 분석한다. 이러한 연구 결과가 다음 표 20에 제시되어 있다:
* 표 17의 주석 참조
상기 연구로부터의 데이터를 해석한 결과, C-말단 시스테인-안정화된 입자가 생성 직후 보다 더 안정적일 뿐만 아니라 각종 시간 동안 37℃ 하에 항온 배양한 후 보다 더 안정적이라는 것을 의미한다. 이러한 안정화 입자는 또한, 애쥬반트의 부재하에서도 증강된 면역원성을 나타낸다. 또한, 과립 물질이 V12.Pf1(C17A)와 같은 비-안정화 물질에도 존재하긴 하지만, 항온 배양한지 14일 후에는 단량체성 키머 단백질이 전혀 존재하지 않고, 이와 같이 존재하는 물질은 초기에 도입된 이종 B 세포 에피토프 서열(여기서는 말라리아성 면역원)에 대한 항체를 유도시키지않았다.
실시예 24: 베타-아밀로이드 단백질 에피토프 서열을 함유하는 키머
42개 아미노산 베타-아밀로이드 전구체 단백질 단편에 대한 항체가 알츠하이머병(REF)을 치료하기 위한 치료용 및 예방용 백신으로서 보고되었다[참조: Schenk et al. (Jul 8, 1999)Nature, 400(6740):116-117]. 상기 단편의 C-말단은 극도로 소수성인 영역을 함유하므로, 키머 HBc 입자의 표면에서 발현하는데 잠재적으로 문제를 유발시킬 수 있다.
따라서, 완전한 42개 아미노산 서열을 함유하는 입자[V16.β-Am(1-42)] 이외에도, 비교적 친수성인 영역 만을 함유하는 3가지 기타 입자를 작제하였다: 아미노산 잔기 1-17 [V16. β-Am(1-17)], 아미노산 잔기 22-32 [V16. β-Am(22-32)], 및 아미노산 잔기 1-32 [V16. β-Am(1-32)]. 상보성 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고, 이들을, EcoRI 및 SacI로 미리 분해시킨 플라스미드 V16에 삽입함으로써, 입자V16. β-Am(1-17) 및 V16. β-Am(22-32 )를 암호화하는 키머 유전자를 작제하였다.
잔기 1-42 [V16. β-Am(1-42)] 및 1-32 [V16. β-Am(1-32)]를 함유하는 키머 유전자의 경우, 올리고뉴클레오티드 β-Am(1-32/42)-T 및 β-Am(1-42)-B 또는 β-Am(1-32)-B를 어닐링시킨 다음, 이에 충진시켜, 용융(94℃)과 충진(72℃) 5 주기를 사용하여 완전하게 이중 가닥을 형성한 단편을 만든다. 벤트(Vent) 폴리머라제(NEB), dNTPs(250 mM) 및 상기 어닐링된 단편(250 nM)을 사용하여, 총 용적 100㎕에서 상기 반응을 수행한다. 이어서, 이들 반응 생성물 2 마이크로리터를 2가지 PCR 반응에서 주형으로서 사용하여, EcoRI 및 SacI 제한 부위에 의해 플랭킹된, 잔기 1-32 및 1-42를 암호화하는 단편을 제조한다. (주: Leu 코돈(CTG)은 프라이머 "β-Am(L+1-32/42)-5'-PCR"에 의해 도입하고, 클로닝 목적을 위해 EcoRI 부위를 복구하기 위해 다음 2가지 작제물에서 첫 번째 β-Am 아미노산 보다 앞에 존재한다).
β-아밀로이드 잔기 1-32 및 1-42 단편의 제조를 위한 올리고뉴클레오티드:
실시예 25: 인플루엔자 M2 작제물
최근에, 문헌[참조: Neirynck et al., (Oct 1999)Nature Med., 5(10):1157-1163 and Wo 99/07839]에는 아미노산 잔기 1-4가 결여된, 완전한 길이의 HBc 입자(HBc183)의 N-말단에 대한 M2의 24 아미노산 세포외 도메인의 융합물이 보고되었다. 본원에서 IM2HBc로서 지칭된 상기 작제물의 도시적 제시가 다음에 나타나 있으며, 여기서 24량체가 HBc의 N-말단에 연결된다.
IM2HBc
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-HBc(5-183) 서열 번호 307
한 가지 예시적인 제조에서는, M2 에피토프를 B형 간염 코어의 면역우성 루프 내로 삽입하고, ICC-1475로서 지칭된 입자를 성공적으로 발현 및 정제하였는데, 이는 이러한 삽입 및 정제에 대해 전술된 기술을 사용하여 수행한다. M2 본래의 위치 17 및 19에서의 2개의 시스테인 잔기를 알라닌 잔기로 치환시킨, M2 에피토프의 돌연변이된 변형물을 또한, 상기 면역우성 루프에서 발현시키고(ICC-1473), 이로써 생성된 입자를 정제하였다. 이들 두 입자가 다음에 도식적으로 예시된다.
ICC-1475
HBc(1-78)-GI-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-EL-HBc(79-149) 서열 번호 308
ICC-1473
HBc(1-78)-GI-SLLTEVETPIRNEWGARANDSSD-EL-HBc(79-149)-C 서열 번호 309
ICC-1473은 본래의 서열(ICC-1475)과 비교할 때 대략 7배 정도 더 정제된 입자를 생성시켰다. 시스테인 잔기의 돌연변이가 해당 입자의 보호 효능을 변화시키는지를 결정해야 한다. 그러나, HBc의 면역우성 루프 상에 전달된 에피토프는 통상적으로, 이들이 다른 영역(N-말단 포함)과 융합되어 이로써 생성된 입자가 감소된 항-HBc 면역원성을 나타내는 경우와 비교해서 상당히 더 면역원성이다.
M2 N-말단 24량체 에피토프를 C-말단 절단된 B형 간염 코어 입자의 N-말단에 융합시킨 입자가 또한 제조되었다. 이러한 작제물(ICC-1438)은 또한, N-말단 예비-코어 서열(서열 번호 310)을 함유한다. 하이브리드 단백질의 말단에 단일 시스테인 잔기를 함유하는 유사한 작제물(ICC-1492)을 제조하는데, 이러한 경우 상기 시스테인 잔기는 HBc 유전자의 Val-149 바로 다음에 온다. 이들 작제물이 다음에 도식적으로 제시된다.
ICC-1438
MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI-HBc(2-149) 서열 번호 310
ICC-1492
MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI-HBc(2-149)-C 서열 번호 311
천연 HBc 개시인자 메티오닌으로부터 해독 개시에 대해 경계하기 위해서는, 상기 잔기에 대한 코돈을 이소루이신 잔기에 대한 코돈으로 돌연변이시켰다는 것을 주지해야 한다. EcoRI (GI) 및 SacI (EL) 제한 부위로부터 비롯된 잔기가 밑줄쳐져 있다. 예비코어 서열은 밑줄쳐진 EL 잔기와 "-HBc(2-149)" 사이에 기재되어 있다.
본원에 논의된 바와 같은 SDS-PAGE에 의한 분석 결과, 제조시, ICC-1438 단량체 작제물이 도 9에서 SDS-PAGE 겔 상의 부가의 분자량 대조군으로서 작용하는 ICC-1492(레인 3), HBc-149(레인 1), ICC-1475(레인 4) 및 ICC-1473(레인 5)와 비교해서 불안정한 것으로 나타났다(레인 2). 이러한 ICC-1438 단량체의 불안정성은 해당 입자의 분석적 겔 여과를 이용해서는 명백하지 않았다.
ICC-1475(도 9, 레인 4)와 ICC-1473(도 9, 레인 5) 둘 다는 ICC-1438 및 ICC-1492 보다 분자량이 약간 더 작은 것으로 예상되는데, 이는 전자 2개의 작제물이 면역우성 루프 내에 직접적으로 삽입된 M2 에피토프를 함유하므로, ICC-1438 및 ICC-1498에 존재하는 예비코어 서열(서열 번호 310)이 결여되어 있기 때문이다. 예상된 바와 같이, ICC-1492는 ICC-1475 및 ICC-1473 보다 더 크지만; ICC-1492 + C-말단 시스테인 잔기와 동일한 ICC-1438은 외견상 절단으로 인해, ICC-1475 및 ICC-1473 보다 더 크지 않다는 것은 명백하다.
HBc N-말단(도메인 I) 또는 루프(도메인 II)에 연결된 상기 논의된 바와 같은 M2 N-말단 세포외 서열을 함유하고, 또한 HBc의 루프(도메인 II) 또는 C-말단(도메인 IV)에 연결된 서열 번호 10(표 A 참조)의 것과 같은 M2 단백질 C-말단 서열을 함유하는 작제물이 또한 고려된다. 이와 같이 고려된 작제물은 또한, 본원에 전술된 바와 같은 하나 이상의 안정화 C-말단 시스테인 잔기를 함유한다.
실시예 26: 원숭이에서의 비교성 면역원성
애쥬반트로서 셉픽(Seppic™) ISA-70 (Seppic Inc., Paris, France) 또는 알하이드로겔(Alhydrogel™) (Superfos, Denmark)로 제형화시키거나 제형화시키지 않은(식염수), V12.Pf3.1에 의해 발현된 입자의 비교성 면역원성을 사이노몰구스(Cynomolgus) 원숭이에서 연구하였다.
셉핍(SeppicTM) ISA-720 제형을 제조업자의 지시에 따라서 제조하였다. 간략하게 언급하면, 상기 ISA-720와 V12.Pf3.1 입자를 70:30(w/w) 비로 혼합하고, 최대 출력으로 설정된 벤치 톱 와동기를 사용하여 1분 동안 와동시킨다. 면역에 앞서 알하이드로겔(AlhydrogelTM)에 물리적으로 결합되는 것으로 밝혀진 V12.Pf3.1 입자와 비해 8배 과량의 알하이드로겔(중량 기준)을 사용하여, 상기 알하이드로겔 제형을 제조한다.
2마리 원숭이 그룹(한 마리는 숫컷이고 다른 한 마리는 암컷이다)을, 근육내 경로를 통하여 면역원으로서 V12.Pf3.1 입자 20㎍을 사용하여 면역시킨다. 0, 21, 42, 56 및 70일 째 동물에게서 채혈하고, ELISA를 사용하여 항-NANP 항체의 역가를 분석한다. 다음 표 15에 제시된 결과는, 알하이드로겔 제형화되거나 제형화되지 않은 물질에 비해 셉픽 ISA-720으로 제형화된 경우에 V12.Pf3.1 입자의 극도로 높은 면역원성을 입증해준다. 항체 반응의 역학은, 셉픽 ISA-720을 애쥬반트로서 사용한 경우에 보다 신속하고, 종점 역가는 알하이드로겔 및 식염수 각각에 대해서보다 100배 및 1000배 더 높다.
실시예 27: T 세포 활성화
마우스를 셉픽 몬타니드(MontanideTM) ISA-720에서 V12.Pf3.1 입자로 2회 면역시킨다. 비장 세포를 꺼내고, 각종 펩티드의 존재 하에 자극시킨다. 106세포를 다음 펩티드의 존재 하에 3일 동안 항온 배양한다: UTC(피. 팔시파룸으로부터의 만능 T 세포 에피토프; 서열 번호 120), HBc 85-100에 상응하는 p85-100 펩티드, 스타필로코커스성(Staphylococcal) 엔테로톡신 B(SEB)의 존재 하에서의 NANP(V12.Pf3.1로부터의 B 세포 에피토프; NANPNVDP(NANP)3, 서열 번호 22), 또는 조직 배양 배지(자극되지 않음). 3일 후에 인터페론 감마 생성을 ELISA로 결정하였다.
다음 표 16에 제시된 상기 결과는 V12.Pf3.1로 면역시키면, 해당 단백질의 UTC 성분을 인식하는 T-세포가 유도되고, 이를 Th1 유형 반응으로 유도시킨다고 지시하고 있다.
* S.D. = 표준 편차
** ND = 수행되지 않음.
본원에 인용된 각각의 특허 및 문헌이 참조 문헌으로써 삽입된다. 문헌의 "a" 또는 "an"의 용도는 하나 이상을 포함하는 것으로 의도된다.
전술된 명세서 및 실시예는 예시적이며, 이로써 제한되지 않는다. 본 발명의 요지 및 범위 내에서의 기타 변형이 가능하고 이는 당업자에게 용이하게 이해될 수 있을 것이다.

Claims (115)

  1. (a) HBc 면역우성 루프에 존재하는 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기 또는 펩티드-결합된 이종 에피토프를 포함하는 HBc 분자의 N-말단의 150개 아미노산 잔기중 약 130개 이상의 HBc 서열, 또는 N-말단의 150개 HBc 아미노산 잔기중 약 135개 이상의 잔기 서열을 함유하고,
    (b) HBc 서열의 C-말단 잔기로부터 상기 분자의 C-말단을 향하고 있고 키머 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 내에 존재하는 1 내지 10개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)]를 함유하며,
    (c) HBc 위치 135에서부터 HBc C-말단까지의 5개 이상의 아미노산 잔기 서열을 함유하는, 길이가 약 515개 이하의 아미노산 잔기이고;
    (i) HBc 서열 내의 20% 이하의 보존적으로 치환된 아미노산 잔기를 함유하고, (ii) 숙주 세포에서의 발현시, 핵산과 실질적으로 결합하지 않는 입자 내로 자기-어셈블리되는데, 이러한 입자가 상기 C-말단 시스테인 잔기(들)가 결여되고 그 밖에는 동일한 HBc 키머로부터 형성된 입자 보다 더 안정적이거나 또는 키머 분자에 존재하는 하나의 C-말단 시스테인 잔기가 또 다른 잔기로 대체된 경우 보다 더 안정적인, 재조합 키머 B형 간염 코어(HBc) 단백질 분자.
  2. 제1항에 있어서, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기 또는 펩티드-결합된 이종 에피토프가 이종 에피토프인 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  3. 제2항에 있어서, 이종 에피토프가 B 세포 에피토프인 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  4. 제3항에 있어서, HBc의 아미노산 잔기 1-4 중의 하나와 펩티드-결합된 제2의 이종 에피토프를 함유하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  5. 제3항에 있어서, B 세포 에피토프가 HBc 서열 내의 아미노산 잔기 76 내지 85의 위치에서 펩티드-결합되고, 위치 76에서부터 85까지의 HBc 서열의 5개 이상의 잔기가 존재하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  6. 제5항에 있어서, B 세포 에피토프에 의해 중단된 아미노산 잔기 76 내지 85의 HBc 서열이 존재하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  7. 제2항에 있어서, 펩티드-결합된 이종 T 세포 에피토프를 추가로 포함하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  8. 제7항에 있어서, T 세포 에피토프가 C-말단 HBc 아미노산 잔기와 펩티드-결합되는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  9. 제8항에 있어서, C-말단 시스테인 잔기(들)가, 당해 HBc 키머 단백질 분자의 C-말단의 5개 아미노산 잔기 이내에 존재하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  10. 제1항에 있어서, 키머가 위치 1에서부터 적어도 위치 140까지의 중단되지 않은 HBc 아미노산 잔기 서열 + 당해 HBc 키머 단백질 분자의 C-말단에서의 하나의 시스테인 잔기를 함유하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  11. 제10항에 있어서, 키머가 위치 1에서부터 위치 149까지의 중단되지 않은 HBc 아미노산 잔기 서열을 함유하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  12. 제1항에 있어서, 키머가 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기를 함유하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  13. 제12항에 있어서, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기가 HBc 서열 내의 아미노산 잔기 76 내지 85의 위치에서 펩티드-결합되고, 위치 76에서부터 85까지의 HBc 서열의 4개 이상의 잔기가 존재하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  14. 제13항에 있어서, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기에 의해 중단된 아미노산 잔기 76 내지 85의 HBc 서열이 존재하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  15. 제14항에 있어서, 위치 1에서부터 적어도 위치 140까지의 HBc 아미노산 잔기 서열 + C-말단에서의 단일 시스테인 잔기를 함유하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  16. 제15항에 있어서, 키머가 위치 1에서부터 위치 149까지의 HBc 아미노산 잔기 서열을 함유하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  17. 제16항에 있어서, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기가 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인 및 티로신 잔기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  18. 도메인 I, II, III 및 IV로 명명된, N-말단으로부터 4개의 펩티드-연결된 아미노산 잔기 서열 도메인을 함유하는 약 135 내지 약 515개 아미노산 잔기 길이를 가지며, 이때
    (a) 도메인 I은 약 71 내지 약 100개 아미노산 잔기를 포함하는데, 이의 서열에는 적어도 HBc의 위치 5에서부터 위치 75까지의 잔기 서열이 포함되고, HBc 잔기 1 내지 4 중의 하나와 펩티드-결합된 약 30개 이하의 아미노산 잔기를 함유하는 이종 에피토프가 임의로 포함되고;
    (b) 도메인 II는 도메인 I의 HBc 잔기 75와 펩티드-결합된 약 5 내지 약 250개 아미노산 잔기를 포함하는데, 여기서 (i) HBc 위치 76에서부터 85까지의 서열내의 0 내지 모든 잔기는, HBc와 이종이고 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기 또는 이종 에피토프를 구성하는 1 내지 약 245개 아미노산 잔기와 펩티드-결합되어 존재하거나, (ii) 위치 75 내지 85에서의 HBc 서열에는 이종 잔기가 전혀 존재하지 않거나, 또는 (iii) 잔기 76 내지 85 중의 하나 이상이 존재하지 않으며;
    (c) 도메인 III은 도메인 II의 잔기 85와 펩티드-결합된 위치 86에서부터 위치 135까지의 HBc 서열이고;
    (d) 도메인 IV는 (i) 도메인 III의 위치 135의 잔기와 펩티드-결합된 위치 136에서부터 149까지의 HBc 아미노산 잔기 서열의 0 내지 14개 잔기; (ii) 키머 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내의 1 내지 10개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)]; 및 (iii) 위치 150에서부터 C-말단까지의 HBc와 이종인 서열 내의 0 내지 약 100개 아미노산 잔기를 포함하는데, 단 도메인 IV는 상기 (ii)의 1 내지 10개 시스테인 잔기를 포함한 6개 이상의 아미노산 잔기를 함유하고;
    숙주 세포에서의 발현시 입자 내로 자기-어셈블리되는데, 상기 입자는 핵산과 실질적으로 결합하지 않고, 상기 C-말단 시스테인 잔기(들)가 결여되고 그 밖에는 동일한 HBc 키머로부터 형성된 입자 보다 안정적이거나 또는 키머 분자 내에 존재하는 하나의 C-말단 시스테인 잔기가 또 다른 잔기로 대체된 경우 보다 더 안정적이고, 아미노산 잔기의 10% 이하가 키머의 HBc 서열에서 치환된 아미노산 잔기 서열을 갖는, 재조합 B형 간염 바이러스 코어(HBc) 키머 단백질 분자.
  19. 제18항에 있어서, 2개의 이종 에피토프를 함유하는 재조합 HBc 키머 단백질분자.
  20. 제19항에 있어서, 2개의 이종 에피토프가 도메인 I 및 II, II 및 IV 또는 I 및 IV에 존재하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  21. 제19항에 있어서, 2개의 이종 에피토프 중의 하나가 B 세포 에피토프인 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  22. 제19항에 있어서, 2개의 이종 에피토프 중의 하나가 T 세포 에피토프인 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  23. 제19항에 있어서, 2개의 이종 에피토프 중의 하나가 B 세포 에피토프이고, 다른 하나가 T 세포 에피토프인 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  24. 제18항에 있어서, 도메인 I에는, HBc 잔기 1-4 중의 하나와 펩티드-결합된 이종 에피토프가 포함되는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  25. 제24항에 있어서, 도메인 II의 이종 에피토프가 B 세포 에피토프인 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  26. 제25항에 있어서, 위치 150에서부터 C-말단까지의 HBc와 이종인 서열이 HBc 잔기 140-149 중의 하나와 펩티드-결합된 T 세포 에피토프인 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  27. 제18항에 있어서, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기 또는 이종 에피토프가 이종 에피토프인 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  28. 제27항에 있어서, 이종 에피토프가 약 245개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  29. 제28항에 있어서, 이종 에피토프가 B 세포 에피토프인 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  30. 제27항에 있어서, 이종 에피토프가 6 내지 약 50개 아미노산 잔기를 함유하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  31. 제27항에 있어서, 이종 에피토프가 20 내지 약 30개 아미노산 잔기를 함유하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  32. 제27항에 있어서, 도메인 IV가, 키머 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기이내에 1 내지 약 5개의 시스테인 잔기를 포함하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  33. 제27항에 있어서, 이종 에피토프에 의해 중단된 아미노산 잔기 76 내지 85의 HBc 서열이 존재하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  34. 제18항에 있어서, C-말단 시스테인 잔기가 키머 단백질 분자의 C-말단의 약 5개 아미노산 잔기 내에 위치하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  35. 제18항에 있어서, 위치 150에서부터 C-말단까지의 HBc와 이종인 서열이 HBc 잔기 140-149 중의 하나와 펩티드-결합된 T 세포 에피토프인 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  36. 제18항에 있어서, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기 또는 이종 에피토프가 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기인 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  37. 제36항에 있어서, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기가 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인 및 티로신 잔기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  38. 제37항에 있어서, HBc 키머 단백질 분자의 C-말단에서의 단일 시스테인 잔기를 함유하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  39. 제18항에 있어서, 키머가 적어도 위치 140까지의 중단되지 않은 HBc 아미노산 잔기 서열을 함유하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  40. 제39항에 있어서, 중단되지 않은 HBc 아미노산 잔기 서열에 잔기 1이 포함되는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  41. 제39항에 있어서, 중단되지 않은 HBc 아미노산 잔기 서열에 잔기 149가 포함되는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  42. 도메인 I, II, III 및 IV로 명명된, N-말단으로부터 4개의 펩티드-연결된 아미노산 잔기 서열 도메인을 함유하는 약 175 내지 약 240개 아미노산 잔기 길이를 가지며, 이때,
    (a) 도메인 I은 대략 HBc의 위치 1에서부터 위치 75까지의 잔기 서열을 포함하고;
    (b) 도메인 II는 도메인 I의 HBc 잔기 75와 펩티드-결합된 약 5 내지 약 55개 아미노산 잔기를 포함하는데, 여기서 HBc 위치 76에서부터 85까지의 서열 내의 4개 이상의 잔기가, HBc와 이종이고 이종 에피토프를 구성하는 6 내지 약 50개 아미노산 잔기와 펩티드-결합되어 존재하고;
    (c) 도메인 III은 도메인 II의 잔기 85와 펩티드-결합된 위치 86에서부터 위치 135까지의 HBc 서열이고;
    (d) 도메인 IV는 (i) 도메인 III의 위치 135의 잔기와 펩티드-결합된 위치 136에서부터 149까지의 HBc 아미노산 잔기 서열의 5 내지 14개 잔기, (ii) 키머 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 하나의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기], 및 (iii) 위치 150에서부터 C-말단까지의 HBc와 이종인 서열 내의 0 내지 약 50개 아미노산 잔기를 포함하며;
    280nm 대 260nm의 흡광도 비가 약 1.2 내지 약 1.6인, 숙주 세포에서의 발현시 입자 내로 자기-어셈블리되는데, 상기 입자는 상기 C-말단 시스테인 잔기가 결여되고 그 밖에는 동일한 HBc 키머 분자로부터 형성된 입자 보다 안정적이거나 또는 키머 분자 내에 존재하는 하나의 C-말단 시스테인 잔기가 또 다른 잔기로 대체된 경우 보다 더 안정적이며, 또한 상기 입자가 아미노산 잔기의 약 5% 이하가 상기 키머의 HBc 서열에서 치환된 아미노산 잔기 서열을 갖는, 재조합 B형 간염 바이러스 코어(HBc) 키머 단백질 분자.
  43. 제42항에 있어서, 도메인 II의 이종 에피토프가 B 세포 에피토프인 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  44. 제43항에 있어서, 이종 에피토프가 15 내지 약 50개 아미노산 잔기를 함유하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  45. 제43항에 있어서, 이종 에피토프가 20 내지 약 30개 아미노산 잔기를 함유하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  46. 제43항에 있어서, 이종 에피토프에 의해 중단된 아미노산 잔기 76 내지 85의 HBc 서열이 존재하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  47. 제43항에 있어서, B 세포 에피토프가 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumonia),크립토스포리듐 파르붐(Cryptosporidium parvum),HIV, 구제역(foot-and-mouth disease) 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis),해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae),모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis),포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis),트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum),플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax),플라스모듐 베르기(Plasmodium berghi),플라스모듐 요엘리(Plasmodium yoelli),스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus),시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri),RSV, 플라스모듐 엔타모에바 히스톨리티카(Plasmodium Entamoeba histolytica),쉬스토소마 자포니쿰(Schistosoma japonicum),쉬스토소마 만소니(Schistosoma mansoni),소의 인히빈 및 에볼라 바이러스로 이루어진 그룹 중에서 선택된 병원체에 존재하는 아미노산 서열인 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  48. 제43항에 있어서, 위치 150에서부터 C-말단까지의 HBc와 이종인 서열이 HBc 잔기 140-149 중의 하나와 펩티드-결합된 T 세포 에피토프인 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  49. 제48항에 있어서, T 세포 에피토프가, 고려된 키머가 면역원으로서 사용될 유기체로부터 유래되는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  50. 제43항에 있어서, C-말단 시스테인 잔기가 키머 단백질 분자의 C-말단의 약 5개 아미노산 잔기 내에 위치하는 재조합 HBc 키머 단백질 분자.
  51. 재조합 B형 간염 코어(HBc) 키머 단백질 분자로 구성되고, 이러한 키머 단백질이 (i) N-말단, HBc 면역원성 루프 또는 C-말단에 하나 이상의 면역원성 에피토프를 표시하거나 또는 (ii) 상기 HBc 면역원성 루프 내의 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기를 갖고, C-말단 또는 C-말단 근처에 시스테인 잔기를 함유하며; 또한 상기 시스테인 잔기가 없으며 그 밖에는 동일한 단백질로 구성된 입자에 비해 안정성이 증강되고 핵산과 실질적으로 결합하지 않는, 면역원성 입자.
  52. 제51항에 있어서, 280/260 흡광도 비가 약 1.2 내지 약 1.7인 면역원성 입자.
  53. 제51항에 있어서, 재조합 HBc 키머 단백질이 N-말단에서 면역원성 에피토프를 표시하는 면역원성 입자.
  54. 제51항에 있어서, 재조합 HBc 키머 단백질이 C-말단에서 면역원성 에피토프를 표시하는 면역원성 입자.
  55. 제51항에 있어서, 재조합 HBc 키머 단백질이 면역원성 루프에서 면역원성 에피토프를 표시하는 면역원성 입자.
  56. 제51항에 있어서, 재조합 HBc 키머 단백질이 B 세포 면역원성 에피토프를 표시하는 면역원성 입자.
  57. 제51항에 있어서, 재조합 HBc 키머 단백질이 T 세포 면역원성 에피토프를 표시하는 면역원성 입자.
  58. 제51항에 있어서, 재조합 HBc 키머 단백질이 별도의 B 세포 및 T 세포 면역원성 에피토프를 표시하는 면역원성 입자.
  59. 제51항에 있어서, 재조합 HBc 키머 단백질이 HBc 면역원성 루프 내의 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기를 갖는 면역원성 입자.
  60. 제59항에 있어서, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기가 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인 및 티로신 잔기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 면역원성 입자.
  61. 제60항에 있어서, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기가 합텐에 접합되는 면역원성 입자.
  62. 제61항에 있어서, 합텐이 올리고삭카라이드인 면역원성 입자.
  63. 다수의 재조합 키머 B형 간염 코어(HBc) 단백질 분자로 구성되는데,
    이러한 재조합 키머 HBc 단백질 분자가 약 515개 이하의 아미노산 잔기 길이를 갖고,
    (a) HBc 면역우성 루프에 존재하는 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기 또는 펩티드-결합된 이종 에피토프를 포함하는 HBc 분자의 N-말단의 150개 아미노산 잔기중 약 130개 이상의 HBc 서열, 또는 N-말단의 150개 HBc 아미노산 잔기중 약 135개 이상의 잔기 서열을 함유하고,
    (b) HBc 서열의 C-말단 잔기로부터 상기 분자의 C-말단을 향하고 있고 키머분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 존재하는 1 내지 10개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)]를 함유하며,
    (c) HBc 위치 135에서부터 HBc C-말단까지의 6개 이상의 아미노산 잔기 서열을 함유하며,
    또한, 상기 키머 분자가 HBc 서열 내의 10% 이하의 보존적으로 치환된 아미노산 잔기를 함유하고;
    핵산과 실질적으로 결합하지 않으며, 상기 C-말단 시스테인 잔기(들)가 결여되고 그 밖에는 동일한 HBc 키머로부터 형성된 입자 보다 더 안정적이거나 또는 키머 분자에 존재하는 하나의 C-말단 시스테인 잔기가 또 다른 잔기로 대체된 경우 보다 더 안정적이고, 또한 아미노산 잔기의 약 20% 이하가 상기 키머의 HBc 서열에서 치환된 아미노산 잔기 서열을 갖는, 면역원성 입자.
  64. 제63항에 있어서, 280nm 대 260nm에서의 흡광도 비가 약 1.4 내지 약 1.6인 면역원성 입자.
  65. 제63항에 있어서, 재조합 키머 HBc 단백질 분자의 길이가 약 175 내지 약 240개 아미노산 잔기인 면역원성 입자.
  66. 제63항에 있어서, 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기 또는 펩티드-결합된 이종 에피토프가 이종 에피토프인 면역원성 입자.
  67. 제66항에 있어서, 이종 에피토프가 B 세포 에피토프인 면역원성 입자.
  68. 제63항에 있어서, 재조합 키머 HBc 단백질 분자의 길이가 약 435개 이하의 아미노산 잔기인 면역원성 입자.
  69. 제63항에 있어서, HBc의 아미노산 잔기 1-4 중의 하나와 펩티드-결합된 제2의 이종 에피토프를 함유하는 면역원성 입자.
  70. 제68항에 있어서, B 세포 에피토프가 HBc 서열 내의 아미노산 잔기 76 내지 85의 위치에서 펩티드-결합되고, 위치 76에서부터 85까지의 HBc 서열의 5개 이상 잔기가 존재하는 면역원성 입자.
  71. 제70항에 있어서, B 세포 에피토프에 의해 중단된 아미노산 잔기 76 내지 85의 HBc 서열이 존재하는 면역원성 입자.
  72. 제68항에 있어서, 펩티드-결합된 이종 T 세포 에피토프를 추가로 포함하는 면역원성 입자.
  73. 제72항에 있어서, T 세포 에피토프가 C-말단 HBc 아미노산 잔기에 펩티드-결합되는 면역원성 입자.
  74. 제73항에 있어서, C-말단 시스테인 잔기(들)가 HBc 키머 단백질 분자의 C-말단의 5개 아미노산 잔기 내에 존재하는 면역원성 입자.
  75. 제63항에 있어서, 재조합 키머 HBc 단백질 분자가 약 135 내지 약 515개 아미노산 잔기 길이를 갖고, 도메인 I, II, III 및 IV로 명명된, N-말단으로부터 4개의 펩티드-연결된 아미노산 잔기 서열 도메인을 함유하며, 이때,
    (a) 도메인 I은 약 71 내지 약 100개 아미노산 잔기를 포함하는데, 이의 서열에는 적어도 HBc의 위치 5에서부터 위치 75까지의 잔기 서열이 포함되고, HBc 잔기 1-4 중의 하나와 펩티드-결합된 약 30개 이하의 아미노산 잔기를 함유하는 이종 에피토프가 임의로 포함되고;
    (b) 도메인 II는 도메인 I의 HBc 잔기 75와 펩티드-결합된 약 5 내지 약 250개 아미노산 잔기를 포함하는데, 여기서 (i) HBc 위치 76에서부터 85까지의 서열 내의 0 내지 모든 잔기는, HBc와 이종이고 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기 또는 이종 에피토프를 구성하는 1 내지 약 245개 아미노산 잔기와 펩티드-결합되어 존재하거나, 또는 (ii) 위치 76 내지 85에서의 HBc 서열에는 이종 잔기가 존재하지 않으며;
    (c) 도메인 III은 도메인 II의 잔기 85와 펩티드-결합된 위치 86에서부터 위치 135까지의 HBc 서열이고;
    (d) 도메인 IV는 (i) 도메인 III의 위치 135의 잔기와 펩티드-결합된 위치 136에서부터 149까지의 HBc 아미노산 잔기 서열의 0 내지 14개 잔기, (ii) 키머 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내의 1 내지 10개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)], 및 (iii) 위치 150에서부터 C-말단까지의 HBc와 이종인 서열 내의 0 내지 약 100개 아미노산 잔기를 포함하는데, 단 도메인 IV는 상기 (ii)의 1 내지 10개 시스테인 잔기를 포함한 6개 이상의 아미노산 잔기를 함유하고;
    또한 상기 키머 HBc 단백질이, 아미노산 잔기의 약 10% 이하가 키머의 HBc 서열에서 치환된 아미노산 잔기 서열을 갖는, 면역원성 입자.
  76. 제75항에 있어서, 도메인 II 내의 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기를 함유하고 이러한 이종 링커 잔기에 연결된 합텐을 추가로 포함하는 면역원성 입자.
  77. 제76항에 있어서, 합텐이 B 세포 면역원인 면역원성 입자.
  78. 제63항에 있어서, 재조합 키머 HBc 단백질 분자가 약 175 내지 약 240개 아미노산 잔기 길이를 갖고, 도메인 I, II, III 및 IV로 명명된, N-말단으로부터 4개의 펩티드-연결된 아미노산 잔기 서열 도메인을 함유하며, 이때
    (a) 도메인 I은 대략 HBc의 위치 1에서부터 위치 75까지의 잔기 서열을 포함하고;
    (b) 도메인 II는 도메인 I의 HBc 잔기 75와 펩티드-결합된 약 5 내지 약 55개 아미노산 잔기를 포함하는데, 여기서 HBc 위치 76에서부터 85까지의 서열 내의 4개 이상의 잔기가, HBc와 이종이며 이종 에피토프를 구성하는 6 내지 약 50개 아미노산 잔기와 펩티드-결합되어 존재하고;
    (c) 도메인 III은 도메인 II의 잔기 85와 펩티드-결합된 위치 86에서부터 위치 135까지의 HBc 서열이고;
    (d) 도메인 IV는 (i) 도메인 III의 위치 135의 잔기와 펩티드-결합된 위치 136에서부터 149까지의 HBc 아미노산 잔기 서열의 5 내지 14개 잔기, (ii) 키머 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내의 1 내지 약 5개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기], 및 (iii) 위치 150에서부터 C-말단까지의 HBc와 이종인 서열 내의 0 내지 약 50개 아미노산 잔기를 포함하고,
    또한 상기 키머 HBc 단백질이 아미노산 잔기의 약 5% 이하가 HBc 서열에서 치환된 아미노산 잔기 서열을 갖는, 약 1.4 내지 약 1.6의 280nm 대 260nm의 흡광도 비를 나타내는 면역원성 입자.
  79. 약제학적으로 허용되는 희석제에 용해 또는 분산된 면역원성 입자의 면역원성 유효량을 포함하며, 이때
    상기 면역원성 입자가 다수의 재조합 키머 B형 간염 코어(HBc) 단백질 분자로 구성되고, 이러한 재조합 키머 HBc 단백질 분자가 약 515개 이하의 아미노산 잔기 길이를 갖고,
    (a) HBc 면역우성 루프에 존재하는 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기또는 펩티드-결합된 이종 에피토프를 포함하는 HBc 분자의 N-말단의 150개 아미노산 잔기중 약 130개 이상의 HBc 서열, 또는 N-말단의 150개 HBc 아미노산 잔기중 약 135개 이상의 잔기 서열을 함유하고,
    (b) HBc 서열의 C-말단 잔기로부터 상기 분자의 C-말단을 향하고 있고 키머 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내에 존재하는 1 내지 10개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)]를 함유하며,
    (c) HBc 위치 135에서부터 HBc C-말단까지의 6개 이상의 아미노산 잔기 서열을 함유하고,
    또한 상기 키머 분자가 HBc 서열 내의 20% 이하의 보존적으로 치환된 아미노산 잔기를 함유하고;
    상기 입자가 핵산과 실질적으로 결합하지 않으며, 상기 C-말단 시스테인 잔기(들)가 결여되고 그 밖에는 동일한 HBc 키머로부터 형성된 입자 보다 더 안정적이거나 또는 키머 분자에 존재하는 하나의 C-말단 시스테인 잔기가 또 다른 잔기로 대체된 경우 보다 더 안정적인, 백신 또는 접종원.
  80. 제79항에 있어서, 재조합 키머 HBc 단백질 분자가 약 135 내지 약 515개 아미노산 잔기 길이를 갖고, 도메인 I, II, III 및 IV로 명명된, N-말단으로부터 4개의 펩티드-연결된 아미노산 잔기 서열 도메인을 함유하며, 이때
    (a) 도메인 I은 약 71 내지 약 100개 아미노산 잔기를 포함하는데, 이의 서열에는 적어도 HBc의 위치 5에서부터 위치 75까지의 잔기 서열이 포함되고, HBc 잔기 1-4 중의 하나와 펩티드-결합된 약 30개 이하의 아미노산 잔기를 함유하는 이종 에피토프가 임의로 포함되고;
    (b) 도메인 II는 도메인 I의 HBc 잔기 75와 펩티드-결합된 약 5 내지 약 250개 아미노산 잔기를 포함하는데, 여기서 (i) HBc 위치 76에서부터 85까지의 서열 내의 4개 이상의 잔기가, HBc와 이종이며 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기 또는 이종 에피토프를 구성하는 1 내지 약 245개 아미노산 잔기와 펩티드-결합되어 존재하거나, 또는 (ii) 위치 76 내지 85에서의 HBc 서열에는 이종 잔기가 존재하지 않으며;
    (c) 도메인 III은 도메인 II의 잔기 85와 펩티드-결합된 위치 86에서부터 위치 135까지의 HBc 서열이고;
    (d) 도메인 IV는 (i) 도메인 III의 위치 135의 잔기와 펩티드-결합된 위치 136에서부터 149까지의 HBc 아미노산 잔기 서열의 0 내지 14개 잔기, (ii) 키머 분자의 C-말단으로부터 약 30개 잔기 이내의 1 내지 10개의 시스테인 잔기[C-말단 시스테인 잔기(들)], 및 (iii) 위치 150에서부터 C-말단까지의 HBc와 이종인 서열 내의 0 내지 약 100개 아미노산 잔기를 포함하는데, 단 도메인 IV는 상기 (ii)의 1 내지 10개 시스테인 잔기를 포함한 6개 이상의 아미노산 잔기를 함유하고;
    상기 재조합 키머 HBc 단백질이, 아미노산 잔기의 약 5% 이하가 HBc 서열에서 치환된 아미노산 잔기 서열을 갖는, 백신 또는 접종원.
  81. 제80항에 있어서, 도메인 II 내의 접합된 에피토프에 대한 이종 링커 잔기를함유하고 이러한 이종 링커 잔기에 연결된 합텐을 추가로 포함하는 백신 또는 접종원.
  82. 제79항에 있어서, 재조합 키머 HBc 단백질 분자가 약 175 내지 약 240개 아미노산 잔기 길이를 갖고, 도메인 I, II, III 및 IV로 명명된, N-말단으로부터 4개의 펩티드-연결된 아미노산 잔기 서열 도메인을 함유하며, 이때
    (a) 도메인 I은 대략 HBc의 위치 1에서부터 위치 75까지의 잔기 서열을 포함하고;
    (b) 도메인 II는 도메인 I의 HBc 잔기 75와 펩티드-결합된 약 5 내지 약 55개 아미노산 잔기를 포함하는데, 여기서 HBc 위치 76에서부터 85까지의 서열 내의 4개 이상의 잔기가, HBc와 이종이며 이종 에피토프를 구성하는 6 내지 약 50개 아미노산 잔기와 펩티드-결합되어 존재하고;
    (c) 도메인 III은 도메인 II의 잔기 85와 펩티드-결합된 위치 86에서부터 위치 135까지의 HBc 서열이고;
    (d) 도메인 IV는 (i) 도메인 III의 위치 135의 잔기와 펩티드-결합된 위치 136에서부터 149까지의 HBc 아미노산 잔기 서열의 5 내지 14개 잔기; 및 (ii) 위치 150에서부터 C-말단까지의 HBc와 이종인 서열 내의 0 내지 약 50개 아미노산 잔기를 포함하며;
    상기 입자가 약 1.4 내지 약 1.6의 280nm 대 260nm의 흡광도 비를 나타내는, 백신 또는 접종원.
  83. 제79항에 있어서, 비경구 투여용으로 적응시킨 백신 또는 접종원.
  84. 제79항에 있어서, 점막성 면역용으로 적응시킨 백신 또는 접종원.
  85. 제79항에 있어서, 재조합 키머 HBc 단백질 분자 입자가 에스. 티피, 에스. 티피무륨 또는 에스. 티피무륨-이. 콜라이 하이브리드의 약독화 균주 내에 존재하는 백신 또는 접종원.
  86. 제79항에 있어서, 재조합 키머 HBc 단백질 분자 입자가 식물 조직 내에 존재하는 백신 또는 접종원.
  87. 제79항에 있어서, 애쥬반트를 추가로 포함하는 백신 또는 접종원.
  88. 제87항에 있어서, 애쥬반트가 명반인 백신 또는 접종원.
  89. 제87항에 있어서, 애쥬반트가 무라밀 디펩티드, 7-치환된-8-옥소- 또는 8-설포-구아노신 유도체, 모노포스포릴 지질 A, 알루미늄 또는 칼슘 염으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 작은 분자인 백신 또는 접종원.
  90. 제87항에 있어서, 애쥬반트가, 면역원성 입자 및 약제학적으로 허용되는 희석제로 유화시킨 오일인 백신 또는 접종원.
  91. 제90항에 있어서, 에멀션이 수 상과 오일 상을 갖는 유중수 에멀션인 백신 또는 접종원.
  92. 제90항에 있어서, 에멀션이 수 상과 오일 상을 갖는 수중유 에멀션인 백신 또는 접종원.
  93. 제92항에 있어서, 에멀션의 오일 상이 스쿠알렌을 포함하는 백신 또는 접종원.
  94. 제92항에 있어서, 에멀션의 오일 상이 스쿠알란을 포함하는 백신 또는 접종원.
  95. 제90항에 있어서, 에멀션의 수 상 및 오일 상이, 솔비탄 또는 만니드 C12-C24지방산 에스테르인 유화제에 의해 유화된 백신 또는 접종원.
  96. 제95항에 있어서, 유화제가 만니드 C12-C24지방산 에스테르인 백신 또는 접종원.
  97. 제96항에 있어서, 만니드 C12-C24지방산 에스테르의 C12-C24지방산이 올레산인 백신 또는 접종원.
  98. 제1항에 따르는 재조합 HBc 단백질 분자를 암호화하는 핵산, 또는 이의 변이체, 유사체 또는 상보체.
  99. 제18항에 따르는 재조합 HBc 단백질 분자를 암호화하는 핵산, 또는 이의 변이체, 유사체 또는 상보체.
  100. 제42항에 따르는 재조합 HBc 단백질 분자를 암호화하는 핵산, 또는 이의 변이체, 유사체 또는 상보체.
  101. 적합(compatible) 숙주 유기체에서 해당 유전자의 발현을 유도하기에 적합한 프로모터, 및 제1항에 따르는 재조합 HBc 단백질 분자를 암호화하는 유전자, 또는 이의 변이체, 유사체 또는 상보체를 한정하는 핵산 세그먼트에 작동적으로 연결된 벡터를 포함하는 재조합 핵산 분자.
  102. 적합 숙주 유기체에서 해당 유전자의 발현을 유도하기에 적합한 프로모터, 및 제18항에 따르는 재조합 HBc 단백질 분자를 암호화하는 유전자, 또는 이의 변이체, 유사체 또는 상보체를 한정하는 핵산 세그먼트에 작동적으로 연결된 벡터를 포함하는 재조합 핵산 분자.
  103. 적합 숙주 유기체에서 해당 유전자의 발현을 유도하기에 적합한 프로모터, 및 제42항에 따르는 재조합 HBc 단백질 분자를 암호화하는 유전자, 또는 이의 변이체, 유사체 또는 상보체를 한정하는 핵산 세그먼트에 작동적으로 연결된 벡터를 포함하는 재조합 핵산 분자.
  104. 제101항에 따르는 재조합 핵산 분자로 형질전환시킨 숙주 세포.
  105. 제104항에 있어서, 숙주 세포가 CHO, VERO 또는 COS 세포, 이. 콜라이, 에스. 세레비지애, 피치아 파스토리스 티피, 에스. 티피무륨 및 에스. 티피무륨-이. 콜라이 하이브리드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 형질전환된 숙주 세포.
  106. 제102항에 따르는 재조합 핵산 분자로 형질전환시킨 숙주 세포.
  107. 제106항에 있어서, 숙주 세포가 CHO, VERO 또는 COS 세포, 이. 콜라이, 에스. 세레비지애, 피치아 파스토리스 티피, 에스. 티피무륨 및 에스. 티피무륨-이.콜라이 하이브리드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 형질전환된 숙주 세포.
  108. 제102항에 따르는 재조합 핵산 분자로 형질전환시킨 숙주 세포.
  109. 제108항에 있어서, 숙주 세포가 CHO, VERO 또는 COS 세포, 이. 콜라이, 에스. 세레비지애, 피치아 파스토리스 티피, 에스. 티피무륨 및 에스. 티피무륨-이. 콜라이 하이브리드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 형질전환된 숙주 세포.
  110. 숙주 동물에게, 제79항에 따르는 백신 또는 접종원을 접종하는 단계; 및 이와 같이 접종된 동물이 면역 반응을 발생시키기에 충분한 시간 동안 당해 동물을 유지시키는 단계를 포함하여, 접종된 숙주 동물에게서 면역 반응을 유도하는 방법.
  111. 숙주 동물에게, 제80항에 따르는 백신 또는 접종원을 접종하는 단계; 및 이와 같이 접종된 동물이 면역 반응을 발생시키기에 충분한 시간 동안 당해 동물을 유지시키는 단계를 포함하여, 접종된 숙주 동물에게서 면역 반응을 유도하는 방법.
  112. 숙주 동물에게, 제82항에 따르는 백신 또는 접종원을 접종하는 단계; 및 이와 같이 접종된 동물이 면역 반응을 발생시키기에 충분한 시간 동안 당해 동물을 유지시키는 단계를 포함하여, 접종된 숙주 동물에게서 면역 반응을 유도하는 방법.
  113. 숙주 동물에게, 제87항에 따르는 백신 또는 접종원을 접종하는 단계; 및 이와 같이 접종된 동물이 면역 반응을 발생시키기에 충분한 시간 동안 당해 동물을 유지시키는 단계를 포함하여, 접종된 숙주 동물에게서 면역 반응을 유도하는 방법.
  114. 숙주 동물에게, 제88항에 따르는 백신 또는 접종원을 접종하는 단계; 및 이와 같이 접종된 동물이 면역 반응을 발생시키기에 충분한 시간 동안 당해 동물을 유지시키는 단계를 포함하여, 접종된 숙주 동물에게서 면역 반응을 유도하는 방법.
  115. 숙주 동물에게, 제92항에 따르는 백신 또는 접종원을 접종하는 단계; 및 이와 같이 접종된 동물이 면역 반응을 발생시키기에 충분한 시간 동안 당해 동물을 유지시키는 단계를 포함하여, 접종된 숙주 동물에게서 면역 반응을 유도하는 방법.
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