JP2012139237A - 安定性が強化された免疫原性HBcキメラ粒子 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、ホスト細胞中で発現後、自己会合して粒子を形成するリコンビナントヘパドナウイルスヌクレオカプシドタンパク質、すなわちB型肝炎コアキメラタンパク質を目的とする。
【解決手段】自己会合粒子の安定性強化および免疫原性エピトープの提示の両方を目的として操作を施した、カルボキシ末端が切断されたキメラB型肝炎ウイルスヌクレオカプシドタンパク質(HBc)が開示される。前記免疫原性エピトープの提示は、HBcの免疫原性ループで実施され、一方、自己会合粒子の安定性の強化は、キメラ分子のカルボキシ末端近くに少なくとも1つの異種システイン残基を存在させることによって得られる。前記キメラの製造方法および使用方法もまた開示される。
【選択図】図1
【解決手段】自己会合粒子の安定性強化および免疫原性エピトープの提示の両方を目的として操作を施した、カルボキシ末端が切断されたキメラB型肝炎ウイルスヌクレオカプシドタンパク質(HBc)が開示される。前記免疫原性エピトープの提示は、HBcの免疫原性ループで実施され、一方、自己会合粒子の安定性の強化は、キメラ分子のカルボキシ末端近くに少なくとも1つの異種システイン残基を存在させることによって得られる。前記キメラの製造方法および使用方法もまた開示される。
【選択図】図1
Description
本発明は、免疫学およびタンパク工学の両分野に関し、特に、自己会合(self−assembled)粒子の安定性および免疫原性エピトープ表示の両方を強化するために操作されてあるキメラB型肝炎ウイルス(HBV)ヌクレオカプシドタンパク質に関する。
ヘパドナウイルス科は、エンベロープを有するDNA含有動物ウイルスで、ヒトでB型肝炎をひき起こす能力を有する(HBV)。ヘパドナウイルス科には、他の哺乳類(例えばウッドチャック(WHV)および地上性リス(GSHV))のB型肝炎ウイルス、並びにアヒル(DHV)およびサギ科鳥類(HeHV)で見出されるトリのウイルスが含まれる。本明細書で用いられるB型肝炎ウイルス(HBV)は、特定例について考察している場合を除いてヘパドナウイルス科のメンバーを指す。
哺乳類のB型肝炎ウイルス(HBVまたはヘパドナウイルス)のヌクレオカプシドまたはコアは、ウイルスのサブタイプに応じて183または185のアミノ酸残基配列を含み、一方、アヒルのウイルスのカプシドは262のアミノ酸残基を含む。ヘパドナウイルス科のいくつかのB型肝炎ウイルスのコアタンパク質モノマーは、感染細胞内で自己会合して、B型肝炎ウイルスコアタンパク質粒子(HBc粒子)として知られている安定な凝集物になる。HBc粒子については2つの三次元構造が報告されている。小さな集団を構成する第一のものは、ダイマーとしてのHBCサブユニットタンパク質を90コピー含むか、または180個の個々のモノマータンパク質を含み、さらに第二の主要集団は、ダイマーとしてのHBcサブユニットタンパク質を120コピー含むか、または240個の個々のモノマータンパク質を含む。前記の粒子はそれぞれT=4またはT=3粒子と称され、ここで「T」は三角測量数である。ヒト感染性ウイルス(ヒトのウイルス)の前記HBc粒子は、直径がそれぞれ約30または34nmである(Pumpens et al. (1995) Intervirology, 38:63−74; zmetzger et al., (1998) J. Gen. Virol., 79:587−590)。
Conwayら(Nature, 386:91−94(1997))は、凍結電子顕微鏡写真で決定したとき9オングストロームの解像でヒトHBc粒子の構造を記載している。Bottcherら(Nature, 386:88−91(1997))は、ヒトHBcモノマーのポリペプチドの折り畳みについて記載し、アルファらせん領域およびそれらの連結ループ領域が形成されるアミノ酸残基についておおよその番号を付した模式図を提供している。Zhengら(J. Biol. Chem., 267(13):9422−9429(1992))は、1つまたは2つ以上のシステインを欠く変異体たんぱく質に関する彼らの研究および他の研究者のC−末端切断タンパク質に関する研究(Birnbaum et al., J. Virol. 64:319−3330(1990))により、コア粒子の形成はアルギニン富裕C−末端ドメイン、核酸の結合またはジスルフィド結合に左右されないことを報告している。
B型肝炎ヌクレオカプシドまたはウイルスコアタンパク質(HBc)は、免疫されたホスト動物のT細胞反応を刺激する免疫原性担体部分であると発表された。例えば以下の文献を参照されたい:米国特許第4,818,527号、第4,882,145号および第5,143,726号。前記担体の特に有用な利用は、そのイムノドミナントループの部位で外来または異種B細胞エピトープを提示するその能力で、前記ループは、前記タンパク質のアミノ末端(N−末端)から約70から90位の残基(より一般的には75位から85位といわれている)に存在する(Clarke et al. (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp.313−318)。
ウイルス複製中に、HBVヌクレオカプシドはウイルスRNAプレゲノム、ウイルス逆転写酵素(Pol)、および末端タンパク質(Polに由来する)と結合し、複製コンピテントを形成する。前記ヌクレオカプシドとウイルスRNAプレゲノムとの結合は、カルボキシル末端(C−末端)でアルギニン富裕ドメインによって仲介される。異種発現系(例えばウイルスRNAプレゲノムが存在しない大腸菌(E. coli))で発現されるときは、プロタミン様C−末端(すなわち150位から183位の残基)が大腸菌RNAと結合できる(Zhang et al. (1992) JBC, 267(13):9422−29)。
ウイルス複製中に、HBVヌクレオカプシドはウイルスRNAプレゲノム、ウイルス逆転写酵素(Pol)、および末端タンパク質(Polに由来する)と結合し、複製コンピテントを形成する。前記ヌクレオカプシドとウイルスRNAプレゲノムとの結合は、カルボキシル末端(C−末端)でアルギニン富裕ドメインによって仲介される。異種発現系(例えばウイルスRNAプレゲノムが存在しない大腸菌(E. coli))で発現されるときは、プロタミン様C−末端(すなわち150位から183位の残基)が大腸菌RNAと結合できる(Zhang et al. (1992) JBC, 267(13):9422−29)。
ワクチン担体成分として利用する場合は、HBVヌクレオカプシドはホスト由来の核酸と結合しないことが好ましい。Birnbaumら(J. Virol., 64:3319−3330(1990))は、HBVヌクレオカプシドのプロタミン様C−末端ドメインは、会合してウイルス様粒子を形成する前記タンパク質の能力を損なうことなく欠落させることができることを示した。したがって、約144位で末端を切断された(すなわち1位から約144位のHBc配列を含む)タンパク質は自己会合できるが、残基139を越える欠失はカプシドの会合を停止させることが報告された(F. Birnbaum & M. Nassal (1990) J. Virol., 64:3319−30)。
Zlotnickら(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:9556−9561(1997))は、完全長および切端形HBcタンパク質の粒子への会合について調べた。完全長分子について考察する以外にも、前記著者らは切端形タンパク質の調製についても報告した。前記切端形タンパク質は、1位から149位のHBc配列を含み、前記配列で48位、61位および107位のシステインは各々アラニンで置換され、さらに1つのシステイン残基がC−末端(150位)に付加されてあった。電子顕微鏡法での標識のために、C−末端メルカプタンを用いて金原子クラスターと結合されてあった。
より最近になって、Metzgerら(J. Gen. Virol., 79:587−590(1998))は、ヒトのウイルスの配列で138位のプロリン(Pro−138またはP138)は粒子の形成に必要であることを報告した。前記著者らはまた、カルボキシ末端で切断された142および140残基の長さの切端形粒子はその会合能力に影響を受け、139および137残基の長さを生じる末端切断によって会合能力は完全に失われることを報告した。
より最近になって、Metzgerら(J. Gen. Virol., 79:587−590(1998))は、ヒトのウイルスの配列で138位のプロリン(Pro−138またはP138)は粒子の形成に必要であることを報告した。前記著者らはまた、カルボキシ末端で切断された142および140残基の長さの切端形粒子はその会合能力に影響を受け、139および137残基の長さを生じる末端切断によって会合能力は完全に失われることを報告した。
いくつかのグループは、切端粒子は標準的なB型肝炎コア粒子と比較して安定性が低下することを示した(Galena et al. (1989) J. Virol., 63:4645−4652; Inada et al. (1989) Virus Res., 14:27−48)。前記は、精製調製物に粒子サイズの多様性および粒子フラグメントが存在すること(Maassen et al. (1994) Arch. Virol., 135:131−142)により明白である。したがって、上記のMetzgerらの報告の前に、Pumpensら(Intervirology, 38:63−74(1995))は文献の報告を以下のように要約した:自己会合に必要なHBc配列のためのカルボキシ−末端の境界はアミノ酸残基139から144の間に位置し、最初の2つまたは3つのアミノ酸残基は他の配列に置換できるが、4つまたは11アミノ−末端残基の排除は、形質転換させた大腸菌細胞内のキメラタンパク質を完全に消失させる。Neirynckら(Nature Med., 5(10):1157−1163(October 1999))は、粒子の形成は、HBcと残基5で融合させたインフルエンザM2タンパク質のN−末端24残基部分を含むHBcキメラの大腸菌発現で生じることを報告した。
種々の挿入ポリペプチド配列を含む内部挿入物を有する遺伝子組換えによって生成されたハイブリッドHBc粒子(当分野ではHBcキメラ粒子またはHBcキメラと称される)が、以下を含む多様な生物での異種発現によって調製された:大腸菌、枯草菌(B. subtilis)、ワクシニア、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、ビール酵母菌(Sacharomyces cerevisiae)。例えば以下の文献およびいくつかの研究グループの仕事について述べたその中の引用文献を参照されたい:Pumpens et al. (1995) Intervirology, 38:63−74。
上記の文献(Pumpens et al.)は、挿入されたポリペプチド配列がN−末端、C−末端および両末端の間に存在する粒子生成キメラのリストを示した。前記文献で報告された挿入物の長さは、N−末端の24から50残基、7〜43の内部残基およびC−末端の11〜741残基である。
上記の文献(Pumpens et al.)は、挿入されたポリペプチド配列がN−末端、C−末端および両末端の間に存在する粒子生成キメラのリストを示した。前記文献で報告された挿入物の長さは、N−末端の24から50残基、7〜43の内部残基およびC−末端の11〜741残基である。
最近、Kratzら(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96:1915−1920(1999))は、238残基の緑色蛍光タンパク質(GFP)に内部融合させた切端HBc配列を含むキメラHBc粒子の大腸菌発現を報告した。前記キメラでは、HBcのアミノ酸残基79および80に代わる一対のグリシン富裕可撓性リンカーアームが前記挿入GFP配列に接している。前記のような粒子は、ホスト動物としてウサギで天然のGFPに対して効果的に抗体を誘発するといわれている。
米国特許第5,990,085号は、カルボキシ−末端切断HBcの(i)残基78および79の間の免疫原性ループ、並びに(ii)残基144の後に融合させた抗原性ウシインヒビンペプチドから生成した2つの融合タンパク質を記載している。発現させた融合タンパク質は、ホスト動物に投与したとき、抗インヒビン抗体の産生を誘発すると報告された。前記特許で報告された免疫30日後の力価は比較的低く、ループ挿入の場合の融合タンパク質では1:3000〜15000で、残基144後挿入では1:100から25である。
米国特許第5,990,085号は、カルボキシ−末端切断HBcの(i)残基78および79の間の免疫原性ループ、並びに(ii)残基144の後に融合させた抗原性ウシインヒビンペプチドから生成した2つの融合タンパク質を記載している。発現させた融合タンパク質は、ホスト動物に投与したとき、抗インヒビン抗体の産生を誘発すると報告された。前記特許で報告された免疫30日後の力価は比較的低く、ループ挿入の場合の融合タンパク質では1:3000〜15000で、残基144後挿入では1:100から25である。
内部挿入物を有するキメラ型B型肝炎コア粒子は、電子顕微鏡で分析したとき、異種エピトープを欠く粒子と比較してしばしば規律性が低い構造をもつように思われる(Schodel et al. (1994) J. Exptl. Med., 180:1037−1046)。いくつかの事例では、異種エピトープのC−末端切断HBc粒子への挿入は、ハイブリッド粒子を異種発現後に回収することができないような激烈な安定性喪失作用を与える(Schodel et al. (1994) Infect. Immunol., 62:1669−1676)。したがって、多くのキメラ型HBc粒子は非常に不安定であるので、回収不能なほど精製時に分解してしまうか、または非常に貧弱な安定性を示し、ワクチンの開発に問題となる。
完全長HBc粒子の核酸結合能を失わせながら、一方、完全長HBc粒子の安定性を保持する構造特性は、ヘパドナウイルスヌクレオカプシドデリバリー系を用いるワクチンの開発に極めて有用であろう。実際、Ulrichら(Adv. Virus Res., vol.50 (1998) Academic Press, pages 141−182)は、外来エピトープのための担体としてHBcキメラの使用に関する彼らの論文の中で、前記キメラをヒトのワクチンとして使用するために解決しなければない3つの潜在的な問題を記載している。第一の潜在的問題は、キメラワクチン内の核酸の免疫ホストへの不注意な伝達である。第二の潜在的問題は、既に存在するHBcに対する免疫の干渉である。第三の可能な問題は、長期の保存にも耐えることができる完全なキメラ粒子の複製可能調製物の要求に関する。
本明細書で開示されるように、本発明は、強力な免疫原性を有する物質を提供しつつ、一方、HBcキメラの安定性だけでなく前記構築物の核酸結合能力の排除に関する問題について1つの解決を提供する。
本発明は、ホスト細胞中で発現後、自己会合して粒子を形成するリコンビナントヘパドナウイルスヌクレオカプシドタンパク質、すなわちB型肝炎コアキメラタンパク質(またはキメラ型B型肝炎コアタンパク質分子またはHBcキメラ分子または単にキメラ)を目的とする。
本発明は、ホスト細胞中で発現後、自己会合して粒子を形成するリコンビナントヘパドナウイルスヌクレオカプシドタンパク質、すなわちB型肝炎コアキメラタンパク質(またはキメラ型B型肝炎コアタンパク質分子またはHBcキメラ分子または単にキメラ)を目的とする。
前記キメラタンパク質は、(i)1つまたは2つ以上の免疫原性エピトープをN−末端、HBc免疫原性ループ、またはC−末端に提示するか、または前記免疫原性ループ中に共役エピトープのための異種リンカー残基を有し、さらに前記粒子に安定性の強化を付与するC−末端もしくはC−末端付近にシステイン残基を含む。
前記キメラタンパク質はアルギニン残基をほとんど含まず、したがって自己会合粒子は実質的に核酸結合から解放されている。
本発明はまた、リコンビナントB型肝炎コア(HBc)キメラタンパク質分子を含む免疫原性粒子を目的とする。前記キメラタンパク質は(i)1つまたは2つ以上の免疫原性エピトープをN−末端、HBc免疫原性ループ、またはC−末端に提示するか、または(ii)前記HBc免疫原性ループ中に共役エピトープのための異種リンカー残基を有する。前記リコンビナントタンパク質はC−末端もしくはC−末端付近にシステイン残基を含む。前記キメラタンパク質は実質的に核酸と結合せず、システインを含まないということを除いてその他の点では同一のタンパク質で構成された粒子と比較して強化された安定性を示す。
前記キメラタンパク質はアルギニン残基をほとんど含まず、したがって自己会合粒子は実質的に核酸結合から解放されている。
本発明はまた、リコンビナントB型肝炎コア(HBc)キメラタンパク質分子を含む免疫原性粒子を目的とする。前記キメラタンパク質は(i)1つまたは2つ以上の免疫原性エピトープをN−末端、HBc免疫原性ループ、またはC−末端に提示するか、または(ii)前記HBc免疫原性ループ中に共役エピトープのための異種リンカー残基を有する。前記リコンビナントタンパク質はC−末端もしくはC−末端付近にシステイン残基を含む。前記キメラタンパク質は実質的に核酸と結合せず、システインを含まないということを除いてその他の点では同一のタンパク質で構成された粒子と比較して強化された安定性を示す。
本発明のある実施態様は、長さが約515までのアミノ酸残基のリコンビナントキメラB型肝炎コア(HBc)タンパク質分子を目的とし、前記分子は、 (a)(i)HBcイムノドミナントループに存在する共有結合したペプチド結合異種エピトープまたは共役エピトープのための異種リンカー残基を含むHBc分子のN−末端150アミノ酸残基の少なくとも約130残基の配列、または(ii)N−末端150HBcアミノ酸残基の少なくとも約135残基の配列を含み、 (b)1つから10、より好ましくは1つから3つのシステイン残基を、その中に存在するHBc配列のC−末端残基から前記キメラ分子のC−末端に向かって、さらに前記キメラ分子のC−末端から約30残基内に含み(C−末端システイン残基)、さらに (c)HBc残基の135位からHBcC−末端の少なくとも5つのアミノ酸残基配列を含む。
本発明のキメラ分子は、(i)HBc配列中に20%以下の置換アミノ酸残基を含み、さらに(ii)ホスト細胞中での発現に際して、実質的に核酸と結合しないで、自己会合して粒子を形成する。前記粒子は、実質的に核酸との結合を伴わず、さらに、上記のC−末端システイン残基を欠くか、または前記キメラにC−末端システインは存在するが分子内で別の残基(例えばアラニン残基)によって置換されてあるがその他の点では同一であるHBcキメラから生成される粒子よりも安定である。
本発明のある特徴では、目的とされるHBcキメラは、約135から約515アミノ酸残基の配列を有し、ドメインI、II、IIIおよびIVと称される4つの連続ペプチド結合ドメインを含む。N−末端から、ドメインIは少なくとも約71から約100のアミノ酸残基を含み、その配列は、少なくともHBcの約5位から75位の残基配列を含み、場合によってHBc残基1−4の1つとペプチド結合した約30までのアミノ酸残基を含む異種エピトープを含む。ドメインIIは、ドメインIのHBc残基75とペプチド結合した5から約250アミノ酸残基を含み、ここで、(i)HBc76位から85位の配列の0から全部、好ましくは少なくとも4つの残基は、HBcに対して異種(外来性)である1つから約245のアミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープ(例えばB細胞エピトープ)またはエピトープ(例えばB細胞エピトープ)のための異種リンカー残基を構成するか、または(ii)76位から85位のHBcの配列は異種残基を含まず存在する。
ドメインIIIは、ドメインIIの残基85とペプチド結合したHBc配列の86位から135位である。ドメインIVは、(i)ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した136位から149位のHBcアミノ酸残基の0から14残基、(ii)前記HBc配列のC−末端とペプチド結合した1つから10、より好ましくは1つから3つのシステイン残基、および(iii)150位からC−末端の、HBcに対して異種である配列中に0〜約100、より好ましくは0〜約50、もっとも好ましくは約25のアミノ酸残基を含み、ただし、ドメインIVは上記(ii)の1から10のシステイン残基を含む少なくとも6つのアミノ酸残基を含むことを条件とする。
本発明の目的のリコンビナントキメラタンパク質は、核酸との結合を実質的に伴わず、さらに、ペプチド結合した同じドメインI、IIおよびIII配列並びに、一切のシステイン残基を欠くかまたはシステイン残基がアラニン残基のような別の残基に置換されていることを除いて他の点では同じであるドメインIVを含むHBcキメラから形成される粒子よりも安定な粒子を形成する。キメラ分子が会合して粒子を形成するとき、それら粒子は、約1.2から約1.7の280nm対260nm吸収比(280/260吸収比)を示す。前記生成粒子は、モノマー240個のHBcキメラまたはダイマー120個のHBcキメラを含むT=4構造であると考えられている。
より普遍的にいえば、本発明の目的のキメラ粒子はC−末端切断HBcタンパク質(少なくとも残基149まで)を含み、前記HBcタンパク質は、イムノドミナントループ内に異種エピトープもしくはあるエピトープのための異種リンカー残基、または介在物のないイムノドミナントループ、および前記イムノドミナントループのアミノ酸残基配列とは関係なくHBc配列にとって異種の1つから3つのC−末端システイン残基を含む。前記のような粒子は、約1.2から約1.7の280/260吸収比を示し、さらに、上記のC−末端システイン残基を欠くか、またはただ1つのシステイン残基が前記キメラに存在し、それが別の残基によって置換されているという点を除いて同一であるHBcキメラから生成される粒子よりも安定である。
別の実施態様は、上記HBcキメラ粒子またはハプテンと上記HBcキメラ粒子との共役物を含む接種物またはワクチンを含む。前記は、医薬として許容できる希釈剤組成物に溶解または分散されてあり、前記希釈剤組成物は典型的にはまた水を含む。免疫誘発に有効な量で動物(例えば哺乳類または鳥類)に投与されるとき、接種物は、(i)前記キメラ粒子または共役(張出して結合)させたハプテンと特異的に免疫反応する抗体を誘発するか、または(ii)T細胞を活性化させるか、または(iii)その両方を惹起させる。前記のように誘発された抗体はまた、好ましくはハプテンを含む抗原と特異的に免疫反応する(結合する)。前記抗原は例えばタンパク質で、ハプテンはペプチドまたは糖類で、ここで前記ハプテンはオリゴ糖である。
本発明はいくつかの利益および利点を有する。
本発明の利益の1つは、一切のC−末端システイン残基を欠いている同様な配列の粒子よりも水性組成物中で安定に保存されるキメラHBc粒子が生成されるということである。
本発明の利点は、天然のHBc粒子の自己会合特性を示し、一方、前記天然の粒子の核酸結合は示さないキメラ分子が生成されるということである。
本発明のまた別の利益は、優れたB細胞およびT細胞免疫誘発性を示すキメラ粒子が生成されるということである。
別の利点は、本発明のキメラ粒子は、典型的にはC−末端システイン残基を含まない同様な粒子よりも高収量で製造されるということである。
本発明の利益の1つは、一切のC−末端システイン残基を欠いている同様な配列の粒子よりも水性組成物中で安定に保存されるキメラHBc粒子が生成されるということである。
本発明の利点は、天然のHBc粒子の自己会合特性を示し、一方、前記天然の粒子の核酸結合は示さないキメラ分子が生成されるということである。
本発明のまた別の利益は、優れたB細胞およびT細胞免疫誘発性を示すキメラ粒子が生成されるということである。
別の利点は、本発明のキメラ粒子は、典型的にはC−末端システイン残基を含まない同様な粒子よりも高収量で製造されるということである。
本発明のさらに別の利益は、C−末端のシステイン残基を欠いている同様な共役物よりもはるかに強い免疫誘発性を有するキメラ粒子が生成されるということである。
さらに別の利点は、少なくとも1つのC−末端システイン残基を含むキメラ分子が会合した粒子の免疫誘発性は、少なくとも1つのC−末端システイン残基を欠いているキメラ分子が会合した同様な粒子と比較して強化されるということである。
さらにまた別の利益および利点は、当業者には下記の開示から明らかとなるであろう。
さらに別の利点は、少なくとも1つのC−末端システイン残基を含むキメラ分子が会合した粒子の免疫誘発性は、少なくとも1つのC−末端システイン残基を欠いているキメラ分子が会合した同様な粒子と比較して強化されるということである。
さらにまた別の利益および利点は、当業者には下記の開示から明らかとなるであろう。
定義
HBcキメラと一緒に使用される数字は、配列番号:247のHBcaywアミノ酸残基配列(前記配列には、1つまたは2つ以上の残基が前記配列に付加されてある)内の位置を、前記アミノ酸残基に付加または欠失が存在するか否かに関係なく示している。したがって、HBc149は、キメラが残基149で終了し、一方、HBc149+C150は、同じキメラがHBcの150位にシステイン残基を含むことを示す。他方、マラリアのCSタンパク質の普遍的T細胞エピトープ(UTC)は長さが20残基であり、前記配列の17位のシステインをアラニンで置換したものは、CS−UTC(C17A)と称される。
「抗体」という用語は、糖化タンパク質ファミリーの1つである免疫グロブリンと呼ばれる分子を指し、前記は抗原と特異的に結合することができる。
HBcキメラと一緒に使用される数字は、配列番号:247のHBcaywアミノ酸残基配列(前記配列には、1つまたは2つ以上の残基が前記配列に付加されてある)内の位置を、前記アミノ酸残基に付加または欠失が存在するか否かに関係なく示している。したがって、HBc149は、キメラが残基149で終了し、一方、HBc149+C150は、同じキメラがHBcの150位にシステイン残基を含むことを示す。他方、マラリアのCSタンパク質の普遍的T細胞エピトープ(UTC)は長さが20残基であり、前記配列の17位のシステインをアラニンで置換したものは、CS−UTC(C17A)と称される。
「抗体」という用語は、糖化タンパク質ファミリーの1つである免疫グロブリンと呼ばれる分子を指し、前記は抗原と特異的に結合することができる。
「抗原」という語は、歴史的に、抗体またはレセプターが結合するる物質を指し、さらにまた抗体の産生を誘発する物質を指して用いられてきた。最近の用い方では、抗原の意味は抗体またはレセプターが結合する物質に限定され、一方、「免疫原」という語は、抗体産生を誘発するか、またはレセプターに結合する物質のために用いられる。本明細書で考察される物質は免疫原性および抗原性の両方を有し、前記用語を免疫原として用いるか抗原として用いるかは、典型的にはその使用意図にしたがう。
「抗原決定基」とは、抗体結合部位またはT細胞レセプターが免疫学的に結合する抗原の現実に存在する構造部分を指す。前記用語はまた、「エピトープ」と互換的に用いることができる。「抗原決定基」および「エピトープ」という語は、本明細書ではいくぶん広い意味で用いられ、HBc配列とは異種であるが実際には抗体と結合しない付加残基も含まれる。したがって、例えば、マラリアのCSタンパク質リピート配列(NANP)4およびNANPNVDP(NANP)3NVDP(配列番号:1および2)は、各々1つ以上の実際のエピトープを含むと考えられるが、本明細書では各々はただ1つのエピトープを構成すると考える。ただ1つのHBcキメラ分子で前記配列の両方を使用することは、多数のエピトープを使用することであると考える。
本明細書で用いられる「共役物」という語は、担体タンパク質のアミノ酸残基側鎖(例えばリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシンまたはシステイン残基)を介して担体タンパク質と機能的に連結されたハプテンを指す。
本明細書で用いられる「保存的置換」という用語は、あるアミノ酸残基が、また別の生物学的に類似の残基によって置換されてあることを意味する。保存的置換の例には、ある疎水性残基(例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン)と別のものとの置換、または、極性残基と別のものとの置換(例えばアルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸、またはグルタミンとアスパラギンとの置換など)が含まれる。
本明細書で用いられる「保存的置換」という用語は、あるアミノ酸残基が、また別の生物学的に類似の残基によって置換されてあることを意味する。保存的置換の例には、ある疎水性残基(例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン)と別のものとの置換、または、極性残基と別のものとの置換(例えばアルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸、またはグルタミンとアスパラギンとの置換など)が含まれる。
ペプチド配列の関係で用いられる「対応する」という用語および種々のその文法活用形は、記載のペプチド配列のアミノ末端およびカルボキシ末端のいずれかまたは両方で3つまでのアミノ酸残基がプラスまたはマイナスされ、さらに前記ポリペプチド配列上で個々のアミノ酸残基に保存的置換のみを含むものを指す。
本明細書では、「ドメイン」という用語は、リコンビナントHBcキメラ分子の部分を指すために用いられ、前記ドメインは、文献(Galibert et al., (1979) Nature, 281:646−650)(配列番号:246)の報告のようにHBcAgサブタイプaywの位置番号に対応して番号付与した残基の位置によって特定される。少なくともキメラドメインI、IIおよびIIIのポリペプチド部分は、天然に存在するHBcAgの対応する配列と類似の三次元形態で存在すると考えられる。
本明細書では、「ドメイン」という用語は、リコンビナントHBcキメラ分子の部分を指すために用いられ、前記ドメインは、文献(Galibert et al., (1979) Nature, 281:646−650)(配列番号:246)の報告のようにHBcAgサブタイプaywの位置番号に対応して番号付与した残基の位置によって特定される。少なくともキメラドメインI、IIおよびIIIのポリペプチド部分は、天然に存在するHBcAgの対応する配列と類似の三次元形態で存在すると考えられる。
本明細書で用いられるように、「融合タンパク質」という用語は、自然の状態では一緒に結合したものとして通常は見出されない少なくとも2つのアミノ酸残基配列を含むポリペプチドを指す。前記2つのアミノ酸残基は、それらの対応するカルボキシ−およびアミノ−末端アミノ酸残基との間のペプチド結合によって、端と端で(頭部と尾部で)機能できるように一緒に連結されてある。本発明の融合タンパク質は、アミノ酸配列において前記融合タンパク質のポリペプチド部分または病原体関連部分に一致するポリペプチド免疫原または病原体関連免疫原と免疫反応する抗体の産生を誘発するHBcキメラである。
本明細書で用いられるように、「B型肝炎」という用語は、そのもっとも広い意味で、上述のヘパドナウイルス科の任意のメンバーを指す。
「残基」という用語はアミノ酸残基という語と互換的に用いられ、ペプチドまたはタンパク質中に存在する反応したアミノ酸を指す。
本明細書で用いられるように、「発現ベクター」という用語は、タンパク質をコードする構造遺伝子の発現を、前記タンパク質を生成できるように調節する制御エレメントを形成するDNA配列を意味する。
本明細書で用いられるように、核酸に関して使用される「機能的に連結される」という用語は、遺伝子が正確な読み枠内で別のDNA(または適切な場合はRNA)セグメント(例えば発現ベクター)と共有結合し、その結果、前記構造遺伝子が前記発現ベクターの制御下に存在することを意味する。タンパク質、ポリペプチドまたはキメラに関して用いられる「機能的に連結される」という用語は、列挙されたエレメントが互いに共有結合されてあることを意味する。
「残基」という用語はアミノ酸残基という語と互換的に用いられ、ペプチドまたはタンパク質中に存在する反応したアミノ酸を指す。
本明細書で用いられるように、「発現ベクター」という用語は、タンパク質をコードする構造遺伝子の発現を、前記タンパク質を生成できるように調節する制御エレメントを形成するDNA配列を意味する。
本明細書で用いられるように、核酸に関して使用される「機能的に連結される」という用語は、遺伝子が正確な読み枠内で別のDNA(または適切な場合はRNA)セグメント(例えば発現ベクター)と共有結合し、その結果、前記構造遺伝子が前記発現ベクターの制御下に存在することを意味する。タンパク質、ポリペプチドまたはキメラに関して用いられる「機能的に連結される」という用語は、列挙されたエレメントが互いに共有結合されてあることを意味する。
本明細書で用いられるように、「プロモーター」という用語は、DNA配列またはDNA配列群の認識部位を指し、前記は1つの遺伝子に対して発現制御エレメントを提供し、前記にRNAポリメラーゼが特異的に結合して前記遺伝子のRNA合成(転写)を開始させる。
本明細書で用いられるように、「リコンビナントDNA分子」という用語は、自然の状態では通常一緒に見出されることはない少なくとも2つのヌクレオチドを含むハイブリッドDNA配列を指す。
本明細書で用いられるように、「ベクター」という用語は、細胞内で複製することができるDNA分子、および/または別のDNAセグメントが機能的に連結され、結合させたセグメントの複製を達成することができるDNA分子を意味する。プラスミドは典型的なベクターである。
本明細書で用いられるように、「リコンビナントDNA分子」という用語は、自然の状態では通常一緒に見出されることはない少なくとも2つのヌクレオチドを含むハイブリッドDNA配列を指す。
本明細書で用いられるように、「ベクター」という用語は、細胞内で複製することができるDNA分子、および/または別のDNAセグメントが機能的に連結され、結合させたセグメントの複製を達成することができるDNA分子を意味する。プラスミドは典型的なベクターである。
本明細書で特定された全てのアミノ酸残基は天然のL型構造である。標準的なポリペプチドの命名法(J. Biol. Chem., 243:3557−59(1969))にしたがい、アミノ酸残基の略語は以下の対照表に示したとおりである:
対照表
対照表
本発明は、キメラヘパドナウイルスヌクレオカプシドタンパク質(すなわちリコンビナントB型肝炎コア(HBc)タンパク質)を目的とし、前記は、(a)免疫原性B細胞もしくはT細胞エピトープ、免疫原性B細胞もしくはT細胞エピトープもしくは切端HBcタンパク質の結合のためのリンカーを提示し、(b)自己会合粒子として存在するとき強化された安定性を示すと同時に、(c)自己会合粒子として実質的に核酸と結合しないように操作される。目的のHBcキメラは、天然のHBc分子に対応する分子のC−末端が切断されてある。
したがって、前記キメラタンパク質は、そのN−末端、HBc免疫原性ループまたはC−末端に1つまたは2つ以上の免疫原性エピトープ、または前記免疫原性ループ内に前記のようなエピトープのためのリンカーを提示する。前記キメラタンパク質は、自己会合粒子に安定性の強化を付与するシステイン残基を前記C−末端またはC−末端近傍に含む。前記キメラタンパク質は、自己会合粒子が実質的に核酸結合を免れることができるように、HBc残基149位の下流で(149位からカルボキシ末端に向かって)アルギニン残基が十分に除かれている。
考察を容易にするために、本明細書で言及する本発明のキメラ配列および配列位置番号は、ヒトB型肝炎コアタンパク質のサブタイプayw(Galibert et al. (1979) Nature 281:64:650)の配列および位置番号を基準にしている。しかしながら、哺乳類のヘパドナウイルスカプシドタンパク質配列間の強い類似性および前記タンパク質によって示される類似の粒子生成(これらは当業者には周知である)を考慮すれば、ヒトHBcサブタイプaywに関する考察はまた、サブタイプadwの他に、ウッドチャックおよび地上性リスのタンパク質にも適用できることは理解されよう。それらの強い類似性の結果として、HBc配列は、特に記載しないかぎり、「HBc」配列として本明細書では一般的に記載する。
ある実施態様では、本発明のHBcキメラは長さが約515までの残基で、さらに、前記キメラは、 (a)(i)HBcイムノドミナントループ内にペプチド結合して存在するペプチド結合異種エピトープまたは共役エピトープのための異種リンカー残基を含む前記HBc分子のN−末端150アミノ酸残基の少なくとも130残基のHBc配列、または(ii)N−末端150HBcアミノ酸残基の少なくとも約135残基の配列を含み、 (b)その中の前記HBc配列のC−末端残基から前記分子のC−末端に向かって、さらに前記キメラ分子のC−末端から約30残基内に1つから10、より好ましくは1つから3つのシステイン残基(C−末端システイン残基)を含み、 (c)HBc135位からHBcC−末端の少なくとも5つのアミノ酸残基の配列を含む。前記6つの残基の5つは、好ましくは136位から140位のHBc配列であり、その6番目は要求されるシステインである。
本発明のキメラは、ホスト細胞内で前記キメラタンパク質分子が発現されるとき自己会合して粒子を生成し、前記粒子は実質的に核酸の結合から免れ、さらに、(1)上記の1つから10のシステイン残基(C−末端システイン残基)を欠くがその他の点では同一のHBcキメラよりも、または(2)ただ1つのC−末端システイン残基が前記キメラに存在するが、別の残基(例えばアラニン残基)によって置換されてある場合よりも安定である。
ある特徴では、好ましいHBcキメラは約135から約515のL−α−アミノ酸残基の配列を有し、4つの連続的にペプチド結合したドメイン(すなわちドメインI、II、IIIおよびIV)を含む。α−アミノ酸以外の残基を含み、したがってペプチド結合を形成できないポリペプチド(D−アミノ酸残基を含むもの)、または2つまたは3つ以上のポリペプチドがアミノ酸残基の側鎖を介して機能的に連結されてあるオリゴペプチド共役物と比較した場合、前記4つのドメインは、天然のタンパク質と同じ態様で一緒に連結されている。本発明のキメラHBcタンパク質は、したがって通常の遺伝子組換え技術を用いる発現によって製造できる。
アミノ末端から、ドメインIは約71から約100アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基の配列は少なくともHBcの5位から75位の残基配列を含む。好ましくは、前記HBc配列の残基1から75の配列はドメインIの部分として存在する。もっとも好ましくは、ドメインIは、1位から75位のHBc配列のみで構成される。
ドメインIIは、ドメインIのHBc残基75とペプチド結合した5から約250のアミノ酸残基を含み、そのうち、(i)76位から85位のHBc配列中の0から全ての残基、好ましくは少なくとも4つの残基、より好ましくは少なくとも8つの残基は、HBcにとって異種(外来性)である1つから約245アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、1つのエピトープ(例えばB細胞エピトープ)のための異種リンカー残基または異種エピトープ(例えばB細胞エピトープ)それ自体を構成するか、または(ii)76位から85位のHBcの配列は異種残基を含まず存在する。
ドメインIIは、ドメインIのHBc残基75とペプチド結合した5から約250のアミノ酸残基を含み、そのうち、(i)76位から85位のHBc配列中の0から全ての残基、好ましくは少なくとも4つの残基、より好ましくは少なくとも8つの残基は、HBcにとって異種(外来性)である1つから約245アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、1つのエピトープ(例えばB細胞エピトープ)のための異種リンカー残基または異種エピトープ(例えばB細胞エピトープ)それ自体を構成するか、または(ii)76位から85位のHBcの配列は異種残基を含まず存在する。
特に好ましくは、76位から85位(76−85配列)の10残基配列は存在するが、異種リンカーまたは異種エピトープの1つから約245残基によって中断される。他の事例では、10残基は単独で存在し、いずれの異種残基によっても中断されないのが特に好ましい。
本ドメインに下記で述べる特色とともにHBc残基のみを含むキメラは、HBcそれ自体に対するBおよび/またはT細胞反応を誘発するために有用である。非中断76−85配列を有する好ましいHBcキメラ分子は、1位から少なくとも140位の非中断HBcアミノ酸残基配列を含み、より好ましくは1位から149位の非中断HBcアミノ酸残基配列の他に下記で述べるようにC−末端にただ1つのシステイン残基を含む。
本ドメインに下記で述べる特色とともにHBc残基のみを含むキメラは、HBcそれ自体に対するBおよび/またはT細胞反応を誘発するために有用である。非中断76−85配列を有する好ましいHBcキメラ分子は、1位から少なくとも140位の非中断HBcアミノ酸残基配列を含み、より好ましくは1位から149位の非中断HBcアミノ酸残基配列の他に下記で述べるようにC−末端にただ1つのシステイン残基を含む。
ドメインIIIは、残基85とペプチド結合した86位から135位のHBc配列である。
ドメインIVは、(i)ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した136位から149位のHBcアミノ酸残基配列の0から14残基、(ii)1つから10のシステイン残基(C−末端システイン残基)、および(iii)150位からC−末端のHBcにとって異種である配列中に0から約100アミノ酸残基(前記は典型的には1つのT細胞エピトープまたは多数のT細胞エピトープを構成する)を含み、ここで、ドメインIVは前記(ii)の1つから10のシステイン残基を含む、HBc残基135位から前記キメラのC−末端の少なくとも6つのアミノ酸残基を含むことを条件とする。好ましくは、ドメインIVは、HBcにとって異種である配列中に0から約50アミノ酸残基の配列を含み、より好ましくは前記配列は0から約25残基である。
ドメインIVは、(i)ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した136位から149位のHBcアミノ酸残基配列の0から14残基、(ii)1つから10のシステイン残基(C−末端システイン残基)、および(iii)150位からC−末端のHBcにとって異種である配列中に0から約100アミノ酸残基(前記は典型的には1つのT細胞エピトープまたは多数のT細胞エピトープを構成する)を含み、ここで、ドメインIVは前記(ii)の1つから10のシステイン残基を含む、HBc残基135位から前記キメラのC−末端の少なくとも6つのアミノ酸残基を含むことを条件とする。好ましくは、ドメインIVは、HBcにとって異種である配列中に0から約50アミノ酸残基の配列を含み、より好ましくは前記配列は0から約25残基である。
ある特徴では、本発明のキメラ分子はしたがって、C−末端システインを除いてHBcにとって異種であるエピトープまたは残基を含まない。別の特徴では、本発明のキメラ分子は、HBc残基1−5の1つとペプチド結合したN−末端の異種エピトープを含む。さらに別の特徴では、本発明のキメラ分子は、イムノドミナントループ内のHBc残基76および85の間に位置する前記分子の中央近傍にペプチド結合した、異種エピトープまたは1つのエピトープのための異種リンカー残基を含む。さらに別の特徴では、異種エピトープはキメラ分子のC−末端部分に位置し、HBc残基136−149の1つとペプチド結合している。さらにまた別の特徴では、2つまたは3つの異種エピトープが上記の位置に存在するか、または、1つまたは2つの異種エピトープは、1つのエピトープのための異種リンカー残基と一緒に存在する。前記キメラ分子の各々はまた、上記で述べたようにC−末端システイン残基を含む。これらのキメラ分子およびそれらの自己会合粒子のいくつかの固有例は以下で述べる。
既に記載したように、本発明のHBcキメラ分子は約135から約515アミノ酸残基を含む。好ましい実施態様では、HBc残基1−5は、ドメインIがHBc残基で開始し、残基75までの間ずっと、すなわちHBc75位のHBc残基まで続くことができるように存在する。イムノドミナントループ中のドメインIIに存在する前記異種エピトープは、好ましくは約15から約50残基を含むが、ただし約6アミノ酸残基のように短いエピトープが抗体およびT細胞レセプターを誘発することができ、さらにそれら抗体およびレセプターによって認識される。ドメインIIIは残基85にペプチド結合したHBc残基86から135を含む。ドメインIVは少なくとも6残基の配列を含み、前記は、(i)残基135位とペプチド結合した136位から149位のHBcの残基配列の0、1つまたは前記残基配列、(ii)少なくとも1つのシステイン残基で構成され、さらに(iii)場合によって、特にHBc配列が残基135で終わるときは、約100残基までのエピトープの異種配列を含むことができるが、ただし約25残基までの短い配列が好ましい。
ある実施態様では、特に好ましいキメラは2つの異種エピトープを含む。前記2つの異種エピトープはドメインIおよびII、またはIIおよびIV、またはIおよびIVに存在する。2つの異種エピトープの1つは、いくつかの実施態様では好ましくはB細胞エピトープである。他の実施態様では、2つの異種エピトープの1つはT細胞エピトープである。より好ましくは、2つの異種エピトープの1つはB細胞エピトープであり、他方はT細胞エピトープである。さらにまた、多数のB細胞エピトープが前記B細胞エピトープの場所に存在することができ、さらに多数のT細胞エピトープが前記T細胞エピトープの場所に存在することができる。
前記キメラ分子がドメインIIに異種エピトープを含む実施態様では、前記エピトープは1つまたは2つ以上のB細胞エピトープであること、アミノ酸残基76から85の間のHBc配列は存在するが、前記異種エピトープによって中断されていること、および前記キメラはさらに、HBc残基140−149の1つとペプチド結合した1つまたは2つ以上のT細胞エピトープをドメインIV内に含むことが好ましい。
前記は、共役エピトープのための異種リンカー残基がドメインIIに存在し、それによって1つまたは2つ以上の異種エピトープをドメインIIに提供し、残基76から85の残基は存在するが前記異種リンカー残基のよって中断されていて、HBc残基140−149の1つとペプチド結合したT細胞エピトープが存在するキメラ分子についても同様に好ましい。前記のようなキメラ分子から生成される粒子は、典型的には共役エピトープ対C−末端ペプチド結合T細胞エピトープの比が約1:4から約1:1の比を有し、約1:2の比が一般的である。
前記は、共役エピトープのための異種リンカー残基がドメインIIに存在し、それによって1つまたは2つ以上の異種エピトープをドメインIIに提供し、残基76から85の残基は存在するが前記異種リンカー残基のよって中断されていて、HBc残基140−149の1つとペプチド結合したT細胞エピトープが存在するキメラ分子についても同様に好ましい。前記のようなキメラ分子から生成される粒子は、典型的には共役エピトープ対C−末端ペプチド結合T細胞エピトープの比が約1:4から約1:1の比を有し、約1:2の比が一般的である。
上記で述べたキメラ分子の例示的構造の1つでは、共役エピトープのための異種リンカー残基はドメインIIに存在し、さらにT細胞エピトープはドメインIVに存在し、ドメインIIにはさらに別のB細胞エピトープは付加されない。前記のようなキメラはT細胞エピトープの免疫原性を示すが、一方、下記で述べるように抗ループモノクローナル抗体の結合によってELISAアッセイで測定した場合、(存在するとしても)極めてわずかのHBc抗原性を示すだけである。
本発明の好ましいHBcキメラ分子は約140から約515残基配列を含む。各々が約15から約50残基の好ましい長さを有する2つの異種エピトープおよび約140から約149残基の好ましい長さのHBc部分を含む好ましいHBcキメラ分子は、約175から約240アミノ酸残基の長さの配列を有する。2つの異種エピトープが連続している特に好ましいキメラ分子は約190から約210残基の長さを有する。キメラ分子の長さに広い幅があることは、N−末端およびC−末端HBc部分の長さの多様性および前記免疫原性ループに挿入することができる目的とされるいくつかのエピトープの多様な長さを考慮しようとするものであることは理解されよう。
ホスト細胞で発現された後、本発明のリコンビナントタンパク質は自己会合して、実質的に核酸との結合を免れる粒子を生成する。本発明のHBcキメラ粒子は形状が概して球状で、与えられた調製物についてサイズは通常均質である。したがって、前記キメラ粒子は、同様な形状およびサイズを有し、感染者から回収できる天然のHBc粒子と類似する。
本発明のキメラ粒子は上記で述べたキメラ分子を含む。より明白に言えば、前記キメラ粒子は、そのN−末端150残基の少なくとも約130残基の配列を有するキメラC−末端切断HBcタンパク質を含み、さらに、(i)イムノドミナントループ内に異種エピトープまたは1つのエピトープのための異種リンカー残基、またはN−末端150残基の少なくとも約130残基および非中断イムノドミナントループ、および(ii)上記で述べたように1つから3つのC−末端システイン残基、および135位から少なくとも5HBc残基配列を含む。前記のような粒子は、自己会合した粒子が実質的に核酸結合から免れることができるように十分にアルギニン残基が除かれてあり、さらに以下で述べるように約1.2から約1.7の280/260吸収比を示す。したがって、本発明のキメラタンパク質は150位から183位のHBc配列を含まなくてもよい。
本発明の粒子は、上記C−末端システイン残基を欠くがその他の点では同一のHBcキメラタンパク質から生成される粒子よりも安定である。同様に、キメラ分子がただ1つのC−末端システイン残基を含む粒子は、前記システインが別の残基(例えばアラニン残基)によって置換された粒子よりも安定である。いくつかの事例では、C−末端システインが存在しない場合粒子は形成されない。両タイプの配列について安定性強化の例は下記の実施例で例示され、特に図3、4および8に関連する実施例で明白である。
実質的に核酸と結合しないということは、水溶液中で280nmおよび260nmの両方で測定される粒子の吸収を比較(すなわち280/260吸収比)することによって容易に決定することができる。本発明の粒子は、前記タンパク質の発現に用いられる生物の細胞内に本来存在する、オリゴマーおよび/またはポリマーDNAおよびRNA種である核酸と実質的に結合しない。前記のような核酸は260nmでの吸収を示し、280nmでは比較的低い吸収を示す、一方、タンパク質(例えば本発明のキメラ)は260nmで比較的低い吸収を示し、280nmで強い吸収を有する。
したがって、残基150位から183位(または150位から185位)(当分野では時にプロタミン領域と称される)にアルギニン富裕配列を含む、遺伝子組換えによって発現させたHBc粒子またはキメラ粒子は、0.8の280nm吸収対260nm吸収比(280/260吸収比)を示し、一方、自己会合した粒子が実質的に核酸と結合しないようにアルギニン残基が十分に除かれている粒子(例えば天然に存在するHBcのアルギニン富裕核酸結合領域を含まない粒子(例えば3つ未満のアルギニンまたはリジンを互いに近接して含むもの、または約140位から149位のHBc残基で終わる天然またはキメラ配列を含むもの))は約1.2から約1.6の280/260吸収比を示す。
本発明のキメラHBc粒子は実質的に核酸と結合せず、さらに、約1.2から約1.6、より好ましくは約1.4から約1.6の280/260吸収比を示す。前記の範囲は、大部分が与えられたキメラHBc粒子のドメインIIおよびIVに存在する芳香族アミノ酸残基数による。前記範囲はまた部分的には目的のキメラのドメインIVのCysの存在による。Cysの存在によって観測される比が約0.1減少し、その理由は現在のところ不明である。
本発明のキメラ粒子は、同じペプチド結合したドメインI、IIおよびIII配列を含み、さらに1つから10のシステイン残基(C−末端システイン残基)が存在していないこと、またはただ1つのシステイン残基が別の残基(例えばアラニン残基)によって置換されたこと以外は同じドメインIV配列を含むHBcキメラから生成された粒子よりも、37℃の水性緩衝液中で約2週間から約1ヶ月の期間にわたって安定である。種々のキメラ粒子の安定性は以下の記載のように測定される。
本発明のキメラ粒子は、同じペプチド結合したドメインI、IIおよびIII配列を含み、さらに1つから10のシステイン残基(C−末端システイン残基)が存在していないこと、またはただ1つのシステイン残基が別の残基(例えばアラニン残基)によって置換されたこと以外は同じドメインIV配列を含むHBcキメラから生成された粒子よりも、37℃の水性緩衝液中で約2週間から約1ヶ月の期間にわたって安定である。種々のキメラ粒子の安定性は以下の記載のように測定される。
したがって、例えばドメインIIに異種のマラリアエピトープを含み(例えば(NANP)4)さらにただ1つのシステイン残基をバリン残基149に対してC−末端に含む粒子は、そのC−末端残基がバリンであること以外は同一のキメラ分子から会合して生成された粒子よりも安定である。同様に、ドメインIIに上記のマラリアB細胞エピトープおよびC−末端近傍にただ1つのシステインを含む普遍的マラリアT細胞エピトープを含む粒子は、前記システインがアラニンによって置換されていること以外は同一である粒子よりも安定である。図3、4および8並びにそれに関する下記の考察を参照されたい。
C−末端システイン残基を含む本発明の粒子はまた、C−末端システインを欠くキメラ分子から会合した粒子よりも典型的には極めて高い収量で製造される。この収量の増加は、得られた粒子量からまたは下記で考察し表17に示すスーパーロース(Superose(登録商標))6HRを用いた分析用ゲルろ過分析から認められる。
本発明のキメラHBcタンパク質のドメインIは、少なくともアミノ酸残基5位で始まり75位まで続くアミノ酸残基配列を構成し、ドメインIIIは86位から137位のHBc配列を構成する。哺乳類のヘパドナウイルスのいずれの配列もドメインIまたはドメインIIIのために用いることができ、さらに2つまたは3つ以上のウイルスの配列を1つのキメラに用いることができる。好ましくは、および容易な構築のために、前記キメラを通してヒトのayw配列を用いることができる。
本発明のキメラHBcタンパク質のドメインIは、少なくともアミノ酸残基5位で始まり75位まで続くアミノ酸残基配列を構成し、ドメインIIIは86位から137位のHBc配列を構成する。哺乳類のヘパドナウイルスのいずれの配列もドメインIまたはドメインIIIのために用いることができ、さらに2つまたは3つ以上のウイルスの配列を1つのキメラに用いることができる。好ましくは、および容易な構築のために、前記キメラを通してヒトのayw配列を用いることができる。
最初の3つ以上のアミノ末端(N−末端)残基の欠失を含むドメインIを有するHBcキメラは、大腸菌細胞でHBcキメラタンパク質の完全な消失をもたらすことが報告された(Pumpens et al. (1995) Intervirology 38:63−74)。他方、インフルエンザM2タンパク質由来の23量体の免疫原性ポリペプチドをHBcのN−末端配列に融合させた最近の研究では、天然のHBc配列の残基1−4が置換されたとき、生成された融合タンパク質は粒子を形成することが報告された(Neirynck et al. (October 1999) Nature Med. 5(10):1157−1163)。したがって、付加されたアミノ酸残基がHBcの残基1−4の1つとペプチド結合して存在するときは粒子が形成され、一方、付加配列が存在せず、残基1−3より多くのものがHBcのN−末端から欠失する場合、粒子は形成されないことを示している。
HBcの最初の5つのN−末端残基の1つと結合したN−末端配列は、HBcにとって異種である約25までの残基配列を含むことができる。模範的な配列には、以下で述べるB細胞またはT細胞エピトープ、上記のインフルエンザM2タンパク質(Neirynck et al)由来の23量体ポリペプチド、別の(異種の)タンパク質配列(例えば用いられる発現系の結果として融合タンパク質として出現することができるβ−ガラクトシダーゼ)、または別のB型肝炎関連配列、例えばプレ−S1もしくはプレ−S2領域または主要HbsAg免疫原性配列に由来するものが含まれる。
ドメインIIは約5から約250のアミノ酸残基の配列である。前記の残基のうち、0(全く存在しない)、好ましくは少なくとも4残基、およびより好ましくは少なくとも8残基が76位から85位でHBc配列の部分を構成し、さらに1つから約245残基、好ましくは1つから50残基はHBcにとって異種(外来性)である。前記異種残基は、(i)1つのエピトープ(例えばB細胞またはT細胞エピトープ)のための異種リンカー残基、または(ii)異種BまたはT細胞エピトープを構成し、前記異種BまたはT細胞エピトープは好ましくは6から約50、より好ましくは約15から約50、もっとも好ましくは約20から約30アミノ酸残基を含み、さらにそれらが前記HBc配列76位から85位の残基の0、より好ましくは少なくとも4つから全てとの間でペプチド結合できるように配置されている。異種B細胞エピトープは、好ましくはこの位置でリンカー残基によって連結されるか、またはHBc配列とペプチド結合する。B細胞エピトープの使用は以下で例示的に考察する。
前記好ましい少なくとも4つのHBc残基は、ある配列の全部(例えば残基82−85)であってもよいし、また異種残基のどちらかの側に分割されて(接して)あってもよい(残基76−77と84−85が存在する場合または残基76と83−85が存在する場合のように)。より好ましくは、ドメインIIは、残基76から85のHBc配列の少なくとも8残基を含む。もっとも好ましくは、76位から85位の全10残基の配列が前記キメラに存在する。
前記HBcループ配列に付加される1つから約245残基はHBcにとって異種である。ただ1つの付加される異種残基は、上記で述べたようにB細胞エピトープのための異種リンカー残基である。より長い配列、典型的には長さが少なくとも6アミノ酸残基から約50アミノ酸残基、より好ましくは長さが約15から約50残基が、上記で述べたように、異種免疫原(例えばB細胞エピトープ)を含む配列内に存在する(制限部位によってコードされる異種残基は除く)。
目的のキメラ発現後のリンカー残基との結合のため、およびHBcキメラ内の発現のために有用な模範的ペプチド免疫原は、その配列が得られる遺伝子に付与された一般名、発表されたエピトープの引用文献または特許および配列番号とともに下記の表Aに例示される。
目的のキメラ発現後のリンカー残基との結合のため、およびHBcキメラ内の発現のために有用な模範的ペプチド免疫原は、その配列が得られる遺伝子に付与された一般名、発表されたエピトープの引用文献または特許および配列番号とともに下記の表Aに例示される。
異種残基または配列のどちらかの側に存在するドメインIIの残りの残基はHBc76位から85位の残基である。したがって、残基78から82が置換されてある典型的な例では、ドメインIIのキメラ配列は、76から77、続いて制限部位をコードする残基、異種免疫原性(エピトープ)配列、さらに制限部位をコードする配列、続いて84から85のHBc配列である。残基78と79の間に挿入して調製されるキメラの典型的な模範的配列は、1位から78位のHBcの配列、続いて制限部位コード残基、異種免疫原性配列、さらに制限部位コード配列、およびHBc配列79から85である。他の考えられるキメラのドメインIおよびIIの配列も前記の例示および下記の例示から明白であり、列挙する必要はないであろう。
既に述べたように、共役エピトープのための異種リンカーは、アミノ酸残基76から85間のHBc配列中の1つの位置でペプチド結合している。異種エピトープの事例がそうであったように、残基76から85のHBc配列は好ましくは存在するが、しかし共役エピトープのための異種リンカー残基によって中断されない。本キメラは、好ましくは1位から少なくとも140位のHBc配列および前記キメラたんぱく質のC−末端に1つのシステイン残基を含む。より好ましくは、1位から149位のHBc配列は存在するが、共役エピトープのための異種リンカーによって残基76と85との間は中断されてあり、さらにキメラ分子は1つのC−末端システインを含む。前記共役エピトープのための異種リンカーはもっとも好ましくはリジン(K)残基である。チロシンおよびシステイン残基を用いることができるように、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシンおよびシステイン残基もまた異種リンカーとして用いてもよい。2つ以上のリンカー(例えば3つのリジンの配列)が存在してもよいが、そのような使用は、異種共役物は、共役ハプテンを第一のキメラ内の1つのリンカーおよび第二のキメラ分子内の別のリンカーと結合させて使用することにより形成することができるという理由から好ましくないことを特記する。出願公開PCT/US99/03055は、1つまたは2つ以上の連結残基を含むが、安定化C−末端システイン残基を欠くHBcキメラ分子を開示している。
目的のHBcキメラに存在する異種エピトープ配列はまた、前記異種免疫原性(エピトープ)配列の片側または両側の(前記に接する)「可動性(flexible)リンカーアーム」によってHBc配列残基から分離されてあってもよい。上記は、特に異種免疫原性配列が約30アミノ酸残基よりも長い場合の事例である。模範的な可動性リンカーアーム配列は、典型的には4つから約10のグリシン残基を含み、前記グリシン残基は、また別の態様で突き出ているループ配列から前記挿入配列を外側に「突き出させ」さらに本構築物に安定性を付加させると考えられる。例示的可動性リンカーアーム配列はKrantzらの文献(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96:1915−1920(march, 1999))に記載されてあり、下記のアミノ酸残基配列で表される:
GGGGSGGGGT 配列番号:256
GGGGSGGGG 配列番号:257
GGGGSGGGGT 配列番号:256
GGGGSGGGG 配列番号:257
上記に記載したように、ドメインIIIは86位から135位のHBc配列を構成する。結果として、ドメインIおよびIIについて上記で論じた例示キメラは、第一に論じたキメラが84位から135位のHBc配列を有し、第二に論じたキメラが79位から135位のHBc配列を有するように伸張することができる。
ドメインIVは、(i)136位から149位のHBc配列を含み、(ii)少なくとも1つのシステイン残基(3つまでのシステイン残基)を含み、さらに(iii)約100までのアミノ酸残基を150位からC−末端のHBcにとって異種の配列中に含む配列であるが、ただしドメインIVは、上記(ii)の1つから10のシステイン残基を含む少なくとも6つのアミノ酸残基を含むことを条件とする。HBcにとって異種のドメインIVの配列は、より好ましくは約50までのアミノ酸残基を含み、もっとも好ましくは約25残基までを含む。したがて、ドメインIV配列は、150位からC−末端のC−末端HBc配列を除いて実質的に任意のシステイン含有配列である。
ドメインIVは、(i)136位から149位のHBc配列を含み、(ii)少なくとも1つのシステイン残基(3つまでのシステイン残基)を含み、さらに(iii)約100までのアミノ酸残基を150位からC−末端のHBcにとって異種の配列中に含む配列であるが、ただしドメインIVは、上記(ii)の1つから10のシステイン残基を含む少なくとも6つのアミノ酸残基を含むことを条件とする。HBcにとって異種のドメインIVの配列は、より好ましくは約50までのアミノ酸残基を含み、もっとも好ましくは約25残基までを含む。したがて、ドメインIV配列は、150位からC−末端のC−末端HBc配列を除いて実質的に任意のシステイン含有配列である。
ドメインIV配列の長さは、6残基(すなわち1つのシステインおよび合計3つまでのシステイン残基を含む任意の5残基)から約100アミノ酸残基で、十分な長さを有し、その結果、目的のキメラタンパク質が全長約135から約515残基、より好ましくは約460までの残基、もっとも好ましくは約435までのアミノ酸残基を有することができる。エピトープがドメインIまたはIIにペプチド結合して、好ましくはそれぞれ約30または50残基を含む場合、ドメインIVエピトープを含む前記キメラのより好ましい長さは、約175から約240残基である。2つの異種エピトープを含む特に好ましいキメラ分子は、約190から約210残基の長さを有する。得られた粒子が核酸と結合しないことは、上記で述べたように280/260吸収比の測定によって決定される。
ドメインIV配列は少なくとも1つのシステイン(Cys)残基を含み、さらに3つまでのCys残基を含むことができる。1つまたは2つ以上のCys残基は、前記キメラ分子のC−末端の約5つのアミノ酸残基部位に存在するかまたはそれらの内部に存在するのが好ましい。さらにまた、2つ以上のCys残基がドメインIV配列中に存在するときは、これらCys残基は互いに隣接していることが好ましい。
さらにまた、ドメインIV配列は、T細胞エピトープ、多数のT細胞エピトープ(これらは同じかまた異なっている)、または目的のキメラを免疫原として用いようとしている生物に対するさらに付加されたB細胞エピトープを含むことが好ましい。模範的なドメインIVのT細胞エピトープ配列を表Aのように下記の表Bに示す。
さらにまた、ドメインIV配列は、T細胞エピトープ、多数のT細胞エピトープ(これらは同じかまた異なっている)、または目的のキメラを免疫原として用いようとしている生物に対するさらに付加されたB細胞エピトープを含むことが好ましい。模範的なドメインIVのT細胞エピトープ配列を表Aのように下記の表Bに示す。
ドメインIVに存在する少なくとも1つのシステイン残基の他に、好ましくは1位から少なくとも140位のHBcアミノ酸配列が目的のキメラ分子および粒子に存在する。より好ましくは1位から149位の配列が存在する。B細胞エピトープは、好ましくは残基76から85の間に存在し、さらに少なくともただ1つのシステイン残基またはシステイン残基を含むT細胞エピトープが、HBc配列へのC−末端付加物として存在する。目的のリコンビナントHBcキメラは実質的に結合核酸を含まない。付加されたCys残基を前記分子のC−末端にまたはC−末端近傍に含む目的のキメラ粒子もまた、付加Cysを含まない同様な粒子よりも37℃で安定である。この安定性の強化は図3、4および8に示されてあり、さらに下記で論じる。
目的のリコンビナントHBcキメラ分子は典型的には自己会合粒子として存在し、前記自己会合粒子として用いられる。これら粒子は、180から240のキメラ分子(90または120ダイマー対)、通常は240キメラ分子で構成され、ジスルフィド還元剤(例えば2−メルカプトエタノール)の存在下でタンパク質分子に分離される。個々の分子は、したがって原則的にはジスルフィド結合によって一緒に結合して粒子を形成すると考えられる。
理論に拘束されないが、観察される安定性の強化およびいくつかの事例における目的のキメラの発現強化は、キメラ粒子のタンパク質間の更なるシステインジスルフィド結合の形成によるものと考えられる。システインとして存在するか、またはシスチンとして存在するかに関係なく、C−末端システイン残基は、それが、前記タンパク質および会合粒子が発現される核酸中に存在するコドンによってコードされる残基であるかぎりシステインと称する。
理論に拘束されないが、観察される安定性の強化およびいくつかの事例における目的のキメラの発現強化は、キメラ粒子のタンパク質間の更なるシステインジスルフィド結合の形成によるものと考えられる。システインとして存在するか、またはシスチンとして存在するかに関係なく、C−末端システイン残基は、それが、前記タンパク質および会合粒子が発現される核酸中に存在するコドンによってコードされる残基であるかぎりシステインと称する。
前記の粒子はHBV感染患者で観察される粒子と類似しているが、非感染性である。種々の原核細胞および真核細胞ホストで発現したとき、個々のリコンビナントHBcキメラ分子はホスト内で会合し、前記ホストから容易に回収でき、所望の場合は精製できる粒子を形成する。
上記で述べたように、HBcイムノドミナントループは、完全なタンパク質のアミノ末端(N−末端)から約75位から85位に位置すると通常言われている。ドメインIIの異種B細胞エピトープ含有配列は、前記イムノドミナントループ配列に配置される。前記のように配置することによって、HBcループ配列のHBc免疫原性は排除され、一方、会合キメラ粒子の極めて免疫原性の強い位置に異種配列またはリンカー残基を提示する。
上記で述べたように、HBcイムノドミナントループは、完全なタンパク質のアミノ末端(N−末端)から約75位から85位に位置すると通常言われている。ドメインIIの異種B細胞エピトープ含有配列は、前記イムノドミナントループ配列に配置される。前記のように配置することによって、HBcループ配列のHBc免疫原性は排除され、一方、会合キメラ粒子の極めて免疫原性の強い位置に異種配列またはリンカー残基を提示する。
以前に論じたN−およびC−末端切断、種々のエピトープおよびスペーサーの挿入の他に、目的のキメラ分子はまた、HBcドメインI、II、IIIおよびIVを構成するアミノ酸残基中に保存的置換を含むことができる。保存的置換は上記で定義したとおりである。
より稀なことではあるが、「非保存的」変更、例えばグリシンのトリプトファンによる置換も意図される。同様な稀な変動にはまたアミノ酸の欠失もしくは挿入、またはその両方が含まれるであろう。生物学的活性または粒子の形成を停止させることなくどのアミノ酸残基を置換、挿入または欠失させることができるかを決定する場合の手引きは、当分野で周知のコンピュータープログラム(例えばLASERGENEソフト(DNASTAR Inc., Madison, Wis.)を用いて見つけることができる。
より稀なことではあるが、「非保存的」変更、例えばグリシンのトリプトファンによる置換も意図される。同様な稀な変動にはまたアミノ酸の欠失もしくは挿入、またはその両方が含まれるであろう。生物学的活性または粒子の形成を停止させることなくどのアミノ酸残基を置換、挿入または欠失させることができるかを決定する場合の手引きは、当分野で周知のコンピュータープログラム(例えばLASERGENEソフト(DNASTAR Inc., Madison, Wis.)を用いて見つけることができる。
本発明のキメラ分子のHBc部分(すなわち付加されたエピトープ、リンカー、可動性リンカーアーム、または制限酵素人工産物である異種残基以外のHBc配列を有する部分)は、もっとも好ましくは図7に示すサブタイプayw(配列番号:247)の1位から149位のアミノ酸残基配列を有し、前記より好ましさは減じるが、一方の端または両端の切端形のゆえに存在しないaywサブタイプ配列の任意の部分を有する。図7に示したサブタイプadw、adw2、およびadyw(配列番号:248、249および250)の対応するアミノ酸残基配列もまたいくぶん好ましさは減じるものの好ましい。さらにまた好ましさは減じるが、図7の最後の2つの配列(配列番号:251および246)であるウッドチャックおよび地上リスのアラインメントを実施した1位から149位の配列も好ましい。また別の場所で述べるように、別個の哺乳類のHBcタンパク質の種々の配列部分をただ1つのキメラ内に一緒に用いてもよい。
上記のような本発明のキメラ分子のHBc部分が、1位から149位に対応する哺乳類HBc分子以外を有する場合は、配列番号:247の1位から149位と比較して前記アミノ酸残基の約20%以下が置換されてある。好ましくは約10%以下、より好ましくは約5%以下、もっとも好ましくは約3%以下のアミノ酸残基が配列番号:247の1位から149位と比較して置換されてある。
149HBc残基を有する目的のキメラは、したがって、配列番号:247の1位から149位の残基と異なる約30までの残基、好ましくは約15までの残基を含むことができる。より好ましくは、約7または8残基が、もっとも好ましくは約4または5残基が、1−149のayw配列(配列番号:247)と異なっている。ドメインIIのイムノドミナトループまたは末端以外の置換は、好ましくは前記キメラ分子の非らせん部分に存在し、典型的には残基1から約15、および残基24から約50の間に存在し、粒子形成を担保する。例えば以下の文献を参照されたい:Koschel et al., J. Virol., 73(3):2153−2160(Mar. 1999)。
HBc配列が149位を越えてC−末端で、もしくはN−末端で切断されているか、または1つもしくは2つ以上の欠失が免疫原性ループ内に存在する場合、置換される残基の数は、前記配列の全長が149未満であるので比例的に相違する。前記分子のそれ以外の場合の欠失は、計算のためには保存的欠失と考える。
149HBc残基を有する目的のキメラは、したがって、配列番号:247の1位から149位の残基と異なる約30までの残基、好ましくは約15までの残基を含むことができる。より好ましくは、約7または8残基が、もっとも好ましくは約4または5残基が、1−149のayw配列(配列番号:247)と異なっている。ドメインIIのイムノドミナトループまたは末端以外の置換は、好ましくは前記キメラ分子の非らせん部分に存在し、典型的には残基1から約15、および残基24から約50の間に存在し、粒子形成を担保する。例えば以下の文献を参照されたい:Koschel et al., J. Virol., 73(3):2153−2160(Mar. 1999)。
HBc配列が149位を越えてC−末端で、もしくはN−末端で切断されているか、または1つもしくは2つ以上の欠失が免疫原性ループ内に存在する場合、置換される残基の数は、前記配列の全長が149未満であるので比例的に相違する。前記分子のそれ以外の場合の欠失は、計算のためには保存的欠失と考える。
キメラの調製
目的のキメラHBc免疫原は、周知のリコンビナントDNA技術を用いて調製できる。したがって、HBcをコードする前駆体配列に特定のポリペプチド配列をコードする核酸配列を付加および欠失させて、目的のキメラをコードする核酸を作製する。
異種エピトープ配列をループ配列に配置するためには以下の2つの方法のいずれかが好ましい。第一の方法は置換と称され、この方法ではイムノドミナントループの一部分をコードするDNAが切り出され、異種エピトープ(例えばB細胞配列)をコードするDNAで置換される。第二の方法は挿入と呼ばれ、この方法では異種エピトープはループ内の隣接残基間に挿入される。
目的のキメラHBc免疫原は、周知のリコンビナントDNA技術を用いて調製できる。したがって、HBcをコードする前駆体配列に特定のポリペプチド配列をコードする核酸配列を付加および欠失させて、目的のキメラをコードする核酸を作製する。
異種エピトープ配列をループ配列に配置するためには以下の2つの方法のいずれかが好ましい。第一の方法は置換と称され、この方法ではイムノドミナントループの一部分をコードするDNAが切り出され、異種エピトープ(例えばB細胞配列)をコードするDNAで置換される。第二の方法は挿入と呼ばれ、この方法では異種エピトープはループ内の隣接残基間に挿入される。
ある模範的置換手法ではポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による位置特異的突然変異を用いて、1対の異なる制限部位(例えばEcoRIおよびSacI、イムノドミナトループをコードするDNAの各末端近くに1つ)をコードするキメラHBcDNA配列が提供される。置換される典型的な残基は76から81である。ループをコードする部分を切り出し、異種B細胞エピトープをコードする所望の配列を前記制限部位につなぎ、得られたDNAを用いてHBcキメラを発現させる。前記技術の典型的な使用については、例えば以下の文献を参照されたい:Pumpens et al., (1995) Intervirology 38:63−74。
また別には、ただ1つの制限部位を位置特異的突然変異によって前記領域内にコードし、DNAを制限酵素で切断して「粘着」末端を提供し、前記粘着末端をエンドヌヌクレアーゼを用いて平滑にし、平滑末端をもつ異種DNAセグメントを前記切断領域につなぐ。このタイプのHBcへの配列置換の例は以下によって報告された研究で見出される:Schodel et al., (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp. 319−325; Schodel et al., Behring Inst. Mitt., 1997(98): 114−119; Schodel et al., J. Exp. Med., (1994) 180(3):1037−4。後者の2つの論文は、それぞれP.ヨエリー(yoelii)およびP.ベルゲイ(berghei)に対するワクチンの製造を考察している。
HBc免疫原性ループ内の挿入位置およびループ残基の存在は免疫原の活性に重要であることが見出された。したがって、以下で例示するように、HBc残基78位と79位の間にマラリアのB細胞エピトープを配置することによって粒子化免疫原が提供され、前記は残基76から81の間で切り出し置換した領域中に同じ免疫原を配置した場合よりも10倍から1000倍高い免疫原性を有する。さらにまた、残基78と79の間に同じマラリア免疫原を配置することによって、残基77と78の間に配置した場合と比較して予期されなかった約15倍の免疫原性の増加が提供された。
したがって挿入が一般に好ましい。前記挿入による方法の例示的実施例では、位置特異的突然変異を用いて、互いに隣接してあって、さらに例えば残基78位および79位のような隣接アミノ酸残基をコードするコドンの間に2つの制限部位を創出する。この技術によって、HBcループ内で以前には隣接していた残基の間に4つのアミノ酸残基(各制限部位について2つ)をコードする12の塩基対が付加される。
制限酵素による切断、異種B細胞エピトープ配列をコードするDNAの連結、および前記DNAのHBcキメラ形成のための発現によって、前記HBcループのアミノ酸配列は、そのN−末端側で5´制限部位によってコードされる2つの残基によって中断され、その後C−末端に向かって前記異種B細胞エピトープ配列、その後3´制限部位によってコードされるさらに2つの異種非ループ残基、および続いてループ配列の残りがそれに続くのが認められる。この同じ方法を用いて、Neirynckら(Nature Med., 5(10):1157−1163(October 1999))が報告したようにN−末端の配列をドメインIに挿入するか、またはドメインIVにT細胞エピトープまたはT細胞エピトープの部分ではない1つもしくは2つ以上のシステイン残基を挿入することができる。残基82と83との間の挿入を用いる同様な方法が、Schodelら(Schodel et al., (1990) F. Brown et al. eds., Vaccines 90, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,pp.193−198)によって報告されている。
より具体的には、このクローニング方法は図2A、2Bおよび2Cに模式的に示されている。図2Aでは、C−末端切断HBc配列(HBc149)をコードするDNA配列を、隣接するEcoRIおよびSacI部位を残基78と79の間に含むように操作する。両酵素で前記DNAを切断して、3´末端にEcoRI粘着末端を有するHBc1−78をコードする1つフラグメントが提供される。他方のフラグメントは5´末端にSacI粘着末端を有し、79位から149位の残基をコードする。5´AATTの張出しの後に所望のマラリアB細胞エピトープをコードする配列およびAGCT3´張出しを有する合成核酸を連結して、残基78と79の間で各側面を2つの異種残基(それぞれGlyIle(GI)およびGluLeu(EL))が接するB細胞エピトープをコードするHBcキメラ配列(通常はEcoRI部位は破壊され、SacI部位は温存される)が提供される。
システイン含有配列のドメインIVへの挿入のための同様な方法が図2Bに示されている。前記システイン含有配列は、例えば特に好ましくはマラリアT細胞エピトープで、これは、326位から345位のP.ファルシパルム(falciparum)CSタンパク質配列を含み、本明細書ではPF/CS326−345(Pf−UTC)と称される。本例では、EcoRIおよびHindIII制限部位がHBcDNAのアミノ酸残基149位の後に創出される。EcoRIおよびHindIIIで消化した後、上記のAATT5´張出し、その後にT細胞エピトープコード配列、1つまたは2つ以上の終止コドンおよび3´AGCT張り出しを有する合成DNAを前記消化した配列につないで、HBc残基1−149、続いて2つの異種残基(GI)、終止コドンおよびHindIII部位をコードする配列を形成する。
SacI制限部位、続いて残基79位で始まるHBcをコードする配列を有する前進プライマーを用いてPCR増幅を実施し、その後SacIおよびHindIIIで消化して79位から149位のHBc+2つの付加残基およびC−末端にT細胞エピトープをコードする配列を提供した。図2Bの構築物をSacIで消化して連結し、図2Cに示す、N−末端からHBc1−78位の配列、2つの付加残基、マラリアB細胞エピトープ、2つの付加残基、HBc79−149位、2つの付加残基およびT細胞エピトープを有する所望のリコンビナントHBcキメラ免疫原を提供した。
同様な技術を用いて、B細胞エピトープをループ領域の配列に共役させるために異種リンカー残基を配置することができる。意図されるリンカー残基にはリジン(Lys)(これが特に好ましい)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、システイン(Cys)およびチロシン(Tyr)が含まれる。
配列番号:247に示されたアミノ酸残基配列は、77位および78位にGluおよびAsp残基を含む。それにもかかわらず、さらに別の異種カルボキシル含有残基がなお意図される。現存するグルタミン酸およびアスパラギン酸の化学的反応性は他の因子によって減少させることができる。例えば、近傍のプロリン(例えば79位で見出されるもの)は、基部のカルボキシル基の化学的反応性を中和し、それによって前記反応性を減少させる。
配列番号:247に示されたアミノ酸残基配列は、77位および78位にGluおよびAsp残基を含む。それにもかかわらず、さらに別の異種カルボキシル含有残基がなお意図される。現存するグルタミン酸およびアスパラギン酸の化学的反応性は他の因子によって減少させることができる。例えば、近傍のプロリン(例えば79位で見出されるもの)は、基部のカルボキシル基の化学的反応性を中和し、それによって前記反応性を減少させる。
さて、第一に記載した挿入方法を用いて、5つの異種残基をループ配列に配置する。すなわち、1つはB細胞エピトープを共役させるための異種リンカー残基で、2つの残基は前記1つの残基のいずれかの側に隣接し、それら自体もまたループ配列残基に隣接し、挿入された制限部位の発現産物(制限酵素の人工産物)である。さらに位置特異的突然変異を用いてただ1つのコドンを、B細胞エピトープのための異種リンカー残基をコードするHBcループ配列に付加できることを特記する。
都合がよい場合には、B細胞またはT細胞エピトープのいずれかの側で(前記に接して)2つの異種残基を使用するのが好ましいことを特記する。結果として、HBc配列の部分ではない0から3つまたは4つ以上の付加残基を挿入配列のいずれかの端または両端に用いてもよい。挿入物およびHBc核酸の一方の端または両端を適切なヌクレアーゼ(例えばS1ヌクレアーゼ)で「ならし直し(chew back)」て、一緒に連結させることができる平滑端を提供してもよい。挿入したB細胞またはT細胞エピトープの部分でもなく、HBc配列の部分でもない付加異種残基は、表示のドメインに存在する残基の数には数えない。
さらにまた、所望のリコンビナントHBcキメラ核酸の全てまたは一部分は、タバコ(Nicotiana tabacum)の59残基のリブロースビス−ホスフェートカルボキシラーゼ−オキシゲナーゼシグナルペプチドをコードする177塩基対DNAの合成に関する米国特許第5,656,472号で考察例証されているような周知の合成方法を用いて合成できることも特記されよう。例えば、平滑端または「粘着端」をもつドメインIおよびIIを合成し、これらをドメインIIIおよびIVに連結して、B細胞エピトープのN−末端側に付加残基がなく、さらにC−末端側またはドメインII/III結合部または他の所望の位置に0から3つの付加残基を含む目的のHBcキメラを発現する構築物を提供することができる。
また別の挿入技術が以下の文献に報告された:Clarke et al., (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp.313−318。ここでは、遺伝子コードの縮退を利用して、残基80および81に本来存在する残基をコードする、前記残基に対応するただ1つの制限部位が創出された。発現された前記HBcキメラは、それによって制限部位によってコードされる残基を含まず、挿入配列に直に隣接するHBcループ残基を含んでいた。
上記に記載したHBcキメラ分子またはそのコード配列の相補物をコードする核酸配列(セグメント)もまた本明細書に包含される。前記のような核酸セグメントは、いくつかの好ましい実施態様では単離され精製された形態で存在する。
上記に記載したHBcキメラ分子またはそのコード配列の相補物をコードする核酸配列(セグメント)もまた本明細書に包含される。前記のような核酸セグメントは、いくつかの好ましい実施態様では単離され精製された形態で存在する。
現存の生物では、タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸残基配列は、前記タンパク質をコードする遺伝子のデオキシリボ核酸(DNA)の遺伝暗号を介して直接的関係にある。したがって、周知の遺伝暗号の縮退により、さらに別のDNAおよび対応するRNA配列(核酸)を所望にしたがって調製することができる。前記の核酸は、同じキメラアミノ酸残基配列をコードするが、上記で考察した遺伝子配列とは十分に異なっていて、それら2つの配列は高ストリンジェンシーではハイブリダイズしないが、中等度のストリンジェンシーではハイブリダイズすることができる。
高ストリンジェンシー条件とは、6×SSCで約50℃〜55℃の温度でのハイブリダイゼーションおよび1〜3×SSCで68℃の温度での最終洗浄を含むものと定義できる。中等度ストリンジェンシー条件は、約50℃から約65℃の温度で0.2から0.3MのNaClでのハイブリダイゼーション、続いて約50℃から約55℃で0.2×SSC、0.1%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)での洗浄を含む。
高ストリンジェンシー条件とは、6×SSCで約50℃〜55℃の温度でのハイブリダイゼーションおよび1〜3×SSCで68℃の温度での最終洗浄を含むものと定義できる。中等度ストリンジェンシー条件は、約50℃から約65℃の温度で0.2から0.3MのNaClでのハイブリダイゼーション、続いて約50℃から約55℃で0.2×SSC、0.1%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)での洗浄を含む。
以下の(1)〜(3)の核酸配列(DNA配列またはRNA配列)はDNA変種配列と定義される:(1)それ自体またはその相補物が、その1位から136位の残基のHBc部分(それが存在する場合)が配列番号:246、247、248、249、250または251の残基であるキメラ分子をコードし、さらに(2)少なくとも中等度のストリンジェンシー(上記に記載した)で配列番号:274、275、276、277、278または279とハイブリダイズし;さらに(3)そのHBc配列が、配列番号:274、275、276、277、278および279のDNA配列と少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、もっとも好ましくは100%の同一性を共有する。周知のように、核酸配列(例えば目的とされる核酸配列)は、本明細書のまた別の場所に記載するように、適切な発現系で適切なプロモーターに機能的に連結されたときに発現される。
目的のキメラ分子をコードする核酸類似体(DNAまたはRNA)もまた本発明の部分として包含される。キメラ核酸類似体配列またはその相補核酸配列は、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、もっとも好ましくは95%が、配列番号:246、247、248、249、250および251に示された1位の残基から136位の残基のHBc配列部分と同一のHBcアミノ酸残基配列をコードする。前記DNAおよびRNAは、本明細書では配列番号:274、275、277、278および279の核酸の配列と「類似する」または前記配列の「類似体」と称され、本明細書の中等度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、配列番号:274、275、276、277、278および279の核酸配列またはそれらの相補物とハイブリダイズする。類似配列をコードする核酸はまた、適切なトランスフェクションおよび発現によって目的のキメラを生成する。
種々のホストはまた、しばしば個々のアミノ酸のコードに使用するために特定のコドンについて優先性を有する。そのようなコドンの優先性は周知であり、例えばin vitro突然変異誘発を用いて所望のキメラ配列をコードするDNA配列を変更し、前記酵素が発現される個々のホストにとって好ましいコドンを利用することができる。さらにまた、遺伝コードの縮退を用いて、配列番号:274、275、277、278もしくは279またはそれらの相補物との実質的同一を回避する配列番号:246、247、248、249、250または251の配列をもつHBc部分をコードすることができる。したがって、有用な類似DNA配列は、中等度のストリンジェンシー条件下では配列番号:274、275、276、278または279のヌクレオチド配列とハイブリダイズするとは限らないが、なお目的のキメラ分子を提供することができる。
上記に記載したような目的のキメラをコードする遺伝子を規定する外因性核酸セグメント(例えばDNAセグメントまたは配列)および適合するホスト生物で前記遺伝子の発現を駆動させるために適したプロモーターと機能的に連結されたベクターを含むリコンビナント核酸分子(例えばDNA分子)もまた本発明の目的である。より具体的には、本発明の目的は、DNAセグメントに機能的に連結された、ホスト生物細胞内で前記キメラの発現を駆動させるプロモーターを含むベクターを含むリコンビナントDNA分子であって、前記DNAセグメントは、配列番号:274、275、276、278または279のキメラ遺伝子と少なくとも90%同一性を有し、さらに中等度のストリンジェンシー条件下で前記遺伝子とハイブリダイズするキメラHBc部分の遺伝子またはDNA変種と定義される。
さらに本発明の目的は、DNAセグメントと機能的に連結されたホスト生物細胞内でキメラの発現を駆動させるプロモーターを含むベクターを含むリコンビナントDNA分子で、前記DNAセグメントは、配列番号:246、247、248、249、250または251の配列のHBc部分と少なくとも80%同一、より好ましくは90%同一、もっとも好ましくは95%同一であるHBcキメラ部分のアミノ酸残基配列をコードする。前記リコンビナントDNA分子は、適切なトランスフェクションおよびホスト細胞内での発現によって、目的のキメラ分子を提供する。
30アミノ酸残基のために地上性リスのHBcのN−末端配列は他のHBc配列のいずれともアラインすることがなく、前記配列およびそのコード配列およびそれらの相補物は上記の同一性百分率に含まれず、ハイブリダイゼーション決定で用いられる前記30残基配列をコードする核酸部分またはその相補物も同様であることを特記しておく。同じように、HBcのN−およびC−末端の片方または両方で切断されている配列も同一性の計算に含まれることはなく、異種エピトープの挿入のためにそのイムノドミナントループの残基が除去されるそれら配列も同様である。したがって、キメラ分子に存在するHBcコード塩基またはHBc配列残基のみが包含され、同一性百分率計算で核酸またはアミノ酸残基配列アラインメントの比較が実施される。
本明細書に開示される遺伝子のコード配列が配列番号:274、275、276、277、278および279に示されているので、単離核酸セグメント(好ましくはDNA配列)、その変種および類似体は、当分野で周知の文献("Current Protocols In Molecular Bioligy", Ausabel et al. eds., John Wiley & Sons(New York:1987), p.8.1.1−8.1.6)に論ぜられているように、遺伝子の最初のATGコドンで開始し、各遺伝子の終止コドンまたはその直ぐ下流で終わるin vitro突然変異誘発によって調製することができる。したがって、所望の制限部位を開始コドンまたはその上流、および終止コドンまたはその下流で創出し、他の遺伝子を調製し、切り出しさらに単離することができる。
当分野では周知のように、所望の核酸(例えばDNA配列)が存在するかぎり(開始シグナルおよび終止シグナルを含み)、さらに別の塩基対が通常は前記セグメントのいずれかの末端に存在し、前記セグメントはなお前記タンパク質の発現に利用することができる。もちろんのこと、これは、発現を抑圧したり、発現させたい酵素を消費するさらに別の生成物を発現させたり、または前記DNAセグメントの遺伝子の発現に干渉する機能的に連結されたDNA配列が前記セグメント内に存在しないことを仮定している。
したがって、前記DNAセグメントが前記のような干渉DNA配列を含まないかぎり、本発明のDNAセグメントは長さが約500から約15000塩基対である。リコンビナントDNA分子(特に発現ベクター)の最大サイズは、複製および発現(消耗される場合)に必要な最小限のDNA配列の全てがいったん存在するならば、あとは便利さとホスト細胞が含むことができるベクターサイズによってほぼ決定される。最少のベクターサイズは周知である。非常に長いDNAセグメントは好ましくないが用いることは可能である。
上記で述べたキメラをコードするDNAセグメントは化学的に、例えばホスホトリエステル法(Matteucci et al.(1981) J. Am. Chem. Soc., 103:3185)によって合成してもよい。もちろんのこと、コード配列を化学的に合成することにより、天然のアミノ酸残基配列を適切な塩基で置換して任意の所望の改変を簡単に実施することができる。しかしながら、上記で論じた配列を含むDNAセグメントが好ましい。
上記で述べたキメラをコードするDNAセグメントは化学的に、例えばホスホトリエステル法(Matteucci et al.(1981) J. Am. Chem. Soc., 103:3185)によって合成してもよい。もちろんのこと、コード配列を化学的に合成することにより、天然のアミノ酸残基配列を適切な塩基で置換して任意の所望の改変を簡単に実施することができる。しかしながら、上記で論じた配列を含むDNAセグメントが好ましい。
目的のHBcキメラは、多数の形質転換ホスト系(典型的にはホスト細胞)で製造することができるが、無細胞系(in vitro)系での発現もまた包含される。前記ホスト細胞系には、リコンビナントバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた微生物(例えば細菌);酵母発現ベクターで形質転換させた酵母菌;ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系;ウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルス)で形質転換させるか、または細菌発現ベクター(例えばTiプラスミド)で形質転換させた植物細胞系;または適切に形質転換させた動物細胞系(例えばCHO、VEROまたはCOS細胞)が含まれるが、ただしこれらに限定されない。本発明は用いられるホスト細胞によって制限されない。
HBcキメラをコードする遺伝子を含むDNAセグメントは、好ましくは、前記遺伝子を含むリコンビナントDNA分子(プラスミドベクター)から得られる。キメラ遺伝子の発現を指令してHBcキメラタンパク質を発現させることができるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。
発現ベクターは、プロモーターを含む発現制御エレメントを含んでいる。キメラコード遺伝子は発現ベクターに機能的に連結され、前記プロモーター配列がRNAポリメラーゼにキメラコード遺伝子への結合および発現を指令することを可能にする。ポリペプチドコード遺伝子の発現に有用なプロモーターは、誘発性、ウイルス性、合成、下記文献で報告された構成性(Poszkowski et al. (1989) EMBO J., 3:2719; Odell et al. (1985) Nature, 313:810)プロモーターの他に、時間的調節性、場所的調節性、および時間的場所的調節性プロモーター(Chua et al. (1989) Science, 244:174−181)がある。
発現ベクターは、プロモーターを含む発現制御エレメントを含んでいる。キメラコード遺伝子は発現ベクターに機能的に連結され、前記プロモーター配列がRNAポリメラーゼにキメラコード遺伝子への結合および発現を指令することを可能にする。ポリペプチドコード遺伝子の発現に有用なプロモーターは、誘発性、ウイルス性、合成、下記文献で報告された構成性(Poszkowski et al. (1989) EMBO J., 3:2719; Odell et al. (1985) Nature, 313:810)プロモーターの他に、時間的調節性、場所的調節性、および時間的場所的調節性プロモーター(Chua et al. (1989) Science, 244:174−181)がある。
原核細胞(例えば大腸菌)で使用される好ましいプロモーターの1つは、外因的に供給されたナリジクス酸によって誘発されるRec7プロモーターである。より好ましいプロモーターは、プラスミドベクターJHEX25(Promegaより入手可能)に存在するもので、外因的に供給されるイソプロピル−β−D−チオガラクト−ピラノシド(IPTG)によって誘発することができる。さらにより好ましいプロモーター、tacプロモーターはプラスミドベクターpKK223−3に存在し、さらにまた外因的に供給されたIPTGによって誘発することができる。pKK223−3プラスミドは多数の大腸菌株、例えばXL−1、TB1、BL21およびBLRで、約25から約100μMのIPTGを誘発に用いて良好に発現させることができる。驚くべきことには、約25から約50μMの濃度のIPTGが2Lのシェーカーフラスコおよびファーメンターで最適結果を提供することが判明した。
サルモネラ属のいくつかの株、例えば腸チフス菌およびネズミチフス菌並びにネズミチフス菌−大腸菌ハイブリッドを用いて、先のHBcキメラ粒子を含む免疫原性トランスジーンを、免疫原として使用する粒子の供給源として、さらに全細胞による弱毒生ワクチンおよび接種物として発現させた。前記発現系およびワクチン系を本明細書で用いることができる。以下の文献を参照されたい:米国特許第6,024,961号;米国特許第5,888,799号;米国特許第5,387,744号;米国特許第5,294,441号;Ulrich et al. (1998) Adv. Virus Res., 50:141−182; Tacket et al., (Aug. 1997) Infect. Immun., 65(8):3381−3385; Schodel et al., (Feb. 1997) Behring Inst. Mitt., 98:114−119; Nardelli−Haefliger et al., (Dec. 1996) Infect. Immun., 64(12):5219−5224; Londono et al., (Apr. 1996) Vaccine, 14(6):545−552および前記で引用された文献。
真核細胞に適合する発現ベクター(例えば酵母細胞に適合するもの、または高等植物または哺乳類の細胞に適合するもの)もまた本明細書で意図される。前記のような発現ベクターもまた本発明のリコンビナントDNA分子の生成に用いることができる。酵母菌(例えばビール酵母菌またはピキア・パストリス(Pichia pastoris))で使用するベクターは、周知のようにエピソーム型でも組み込み型でもよい。真核細胞発現ベクターは当分野では周知で、いくつかの販売元から入手できる。通常は、前記のようなベクターは、1つまたは2つ以上の便利な制限部位を所望のDNAセグメントおよびプロモーター配列の挿入のために含んでいる。場合によって、前記ベクターは、真核細胞で使用するために特別な選別マーカーを含んでいる。ビール酵母菌で使用する模範的プロモーターには、ビール酵母菌ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターおよび派生プロモーターGAL10およびGAL1が含まれるが、一方、アルコールオキシダーゼ遺伝子(AOX1)はピキア・パストリスで有用なプロモーターである。
例えば、メチロ栄養型(methylotrophic)酵母菌、P.パストリスでキメラを製造するために、所望のキメラをコードする遺伝子は、ピキア(Pichia)の構造遺伝子の発現を指令する調節配列の制御下に配置する。得られたこれら遺伝子の発現コンピテント型をピキア細胞に導入する。
より具体的には、Creggら(Biotechnology, 5:479−485(1987)およびMolecular and Cellular Biology, 12:3376−3385(1987))の報告した形質転換および発現系を用いることができる。キメラV12.Pf3.1の遺伝子をアルコールオキシダーゼ遺伝子(AOX1)プロモーターの下流および同じAOX1遺伝子の転写ターミネーター配列の上流に配置する。前記遺伝子およびそれに接する調節領域を続いてプラスミドに導入する。前記プラスミドは、P.パストリス細胞でのプラスミドの複製を可能にするP.パストリスHIS4遺伝子およびP.パストリスARS配列(自律複製配列)の両方を有している(Cregg et al. (1987) Molecular and cellular Biology, 12:3376−3385)。
より具体的には、Creggら(Biotechnology, 5:479−485(1987)およびMolecular and Cellular Biology, 12:3376−3385(1987))の報告した形質転換および発現系を用いることができる。キメラV12.Pf3.1の遺伝子をアルコールオキシダーゼ遺伝子(AOX1)プロモーターの下流および同じAOX1遺伝子の転写ターミネーター配列の上流に配置する。前記遺伝子およびそれに接する調節領域を続いてプラスミドに導入する。前記プラスミドは、P.パストリス細胞でのプラスミドの複製を可能にするP.パストリスHIS4遺伝子およびP.パストリスARS配列(自律複製配列)の両方を有している(Cregg et al. (1987) Molecular and cellular Biology, 12:3376−3385)。
前記ベクターはまた、プラスミド(例えばpBR322)の適切な部分を含み、大腸菌細胞での前記プラスミドの増殖を可能にする。キメラ遺伝子とともに上記で述べた種々の付加エレメントを保持する生成されたプラスミドで、例えばP.パストリスのhis4変異体(すなわち機能的ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子欠落株の細胞)を形質転換させる。
ヒスチジンを欠く培地上で形質転換コロニーを選別した後、Creggら(Molecular and cellular Biology, 12:3376−3385(1987))の記載にしたがって、ヒスチジンを欠くがメタノールを含む培地で細胞を増殖させ、AOX1プロモーターを誘発する。前記誘発されたAOX1プロモーターは、P.パストリスでキメラタンパク質の発現およびキメラ粒子の産生をひき起こす。
目的のキメラ遺伝子はまた、Creggら(Molecular and cellular Biology, 12:3376−3385(1987))の記載にしたがって、組み込み型形質転換によって導入することができる(前記はARS配列の使用を必要としない)。
ヒスチジンを欠く培地上で形質転換コロニーを選別した後、Creggら(Molecular and cellular Biology, 12:3376−3385(1987))の記載にしたがって、ヒスチジンを欠くがメタノールを含む培地で細胞を増殖させ、AOX1プロモーターを誘発する。前記誘発されたAOX1プロモーターは、P.パストリスでキメラタンパク質の発現およびキメラ粒子の産生をひき起こす。
目的のキメラ遺伝子はまた、Creggら(Molecular and cellular Biology, 12:3376−3385(1987))の記載にしたがって、組み込み型形質転換によって導入することができる(前記はARS配列の使用を必要としない)。
哺乳類細胞でのリコンビナントDNA発現によるキメラ粒子の製造は、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞でキメラ遺伝子を発現させることができるリコンビナントDNAベクターを用いて実施できる。前記は、当分野で周知であり文献(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Hatbor Laboratories (1989))にも詳細に記載されている技術を用いて達成できる。
例えばある実施例では、サルウイルス(SV40)系発現ベクター、pKSV−10(Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ)にNcoIおよびHindIIIによる制限エンドヌクレアーゼ消化が施される。実施例1の記載にしたがって調製した所望のHBcキメラをコードするNcoI/HindIII配列フラグメントを前記発現プラスミドに連結し、これによりpSV−Pfと称される環状リコンビナント発現プラスミドが生成される。
例えばある実施例では、サルウイルス(SV40)系発現ベクター、pKSV−10(Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ)にNcoIおよびHindIIIによる制限エンドヌクレアーゼ消化が施される。実施例1の記載にしたがって調製した所望のHBcキメラをコードするNcoI/HindIII配列フラグメントを前記発現プラスミドに連結し、これによりpSV−Pfと称される環状リコンビナント発現プラスミドが生成される。
前記発現プラスミドpSV−Pfは、無傷の大腸菌アンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。したがって大腸菌RR101(Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD)は、pSV−Pfで形質転換したとき、アンピシリン耐性を基準にして前記プラスミドを含む細菌を選別することができる。さらにプラスミド保持細菌をクローニングし、続いて発現ベクターに挿入されたコード遺伝子の適切な向きについてそれらクローンをスクリーニングする。
所望のHBcキメラをコードする遺伝子を含む上記で得られたプラスミド(pSV−Pf)は、前記プラスミドを含む大腸菌を培養することによって増殖させる。プラスミドDNAは前掲書(Sambrook et al.)に記載されたように大腸菌培養から単離される。
所望のHBcキメラをコードする遺伝子を含む上記で得られたプラスミド(pSV−Pf)は、前記プラスミドを含む大腸菌を培養することによって増殖させる。プラスミドDNAは前掲書(Sambrook et al.)に記載されたように大腸菌培養から単離される。
キメラの発現は、pSV−Pfを哺乳類細胞株(例えばCHO細胞)にリン酸カルシウム媒介トランスフェクション法(Graham et al. (1973) Virol. 52:456)または類似の技術を用いて導入することによって実施される。
pSV−PfのCHO細胞培養への最大の導入効率を担保するために、前記トランスフェクションは、Southernら(J. Mol. Appl. Genet., 1:327(1982))の記載にしたがって、第二のプラスミド、pSV2NEO(ATCC#37149)および細胞毒性薬剤G418(GIBCO Laboratories, Grand Island, N.Y.)の存在下で実施される。G418に対して耐性を示し培養することができるCHO細胞は両方のプラスミド、pSV2NEOおよびpSV−Pfを獲得しており、CHO/pSV−Pf細胞と称される。pSV−Pf発現ベクターの遺伝子構成のために、キメラは前記生成CHO/pSV−Pf細胞で発現され、前記細胞の細胞質で検出され、前記細胞質から精製することができる。得られた細胞性タンパク質を含む組成物は本明細書の別の場所で論じるとおりカラムで分離される。
pSV−PfのCHO細胞培養への最大の導入効率を担保するために、前記トランスフェクションは、Southernら(J. Mol. Appl. Genet., 1:327(1982))の記載にしたがって、第二のプラスミド、pSV2NEO(ATCC#37149)および細胞毒性薬剤G418(GIBCO Laboratories, Grand Island, N.Y.)の存在下で実施される。G418に対して耐性を示し培養することができるCHO細胞は両方のプラスミド、pSV2NEOおよびpSV−Pfを獲得しており、CHO/pSV−Pf細胞と称される。pSV−Pf発現ベクターの遺伝子構成のために、キメラは前記生成CHO/pSV−Pf細胞で発現され、前記細胞の細胞質で検出され、前記細胞質から精製することができる。得られた細胞性タンパク質を含む組成物は本明細書の別の場所で論じるとおりカラムで分離される。
どの発現ベクターに、さらには最終的にどのプロモーターにキメラコード遺伝子を連結させるかという選択は、所望される機能的特性(例えばタンパク質発現の場所およびタイミング)および形質転換されるホスト細胞によって左右される。上記の事柄は、リコンビナントDNA分子構築技術においては周知の固有の制限である。しかしながら、本発明の実施で有用なベクターは、複製を指令することができ、さらに好ましくは(発現ベクターについては)キメラ遺伝子が機能的に連結されてあるDNAセグメントに含まれる前記キメラ遺伝子の発現を指令することができる。
ある好ましい実施態様では、前記キメラを発現するホストは原核細胞(大腸菌)で、好ましいベクターは原核細胞レプリコン(すなわち、自律的な複製および形質転換ホスト原核細胞内でのリコンビナントDNA分子の染色体外維持を指令する能力を有するDNA配列)を含む。前記のようなレプリコンは当分野で周知である。
ある好ましい実施態様では、前記キメラを発現するホストは原核細胞(大腸菌)で、好ましいベクターは原核細胞レプリコン(すなわち、自律的な複製および形質転換ホスト原核細胞内でのリコンビナントDNA分子の染色体外維持を指令する能力を有するDNA配列)を含む。前記のようなレプリコンは当分野で周知である。
原核細胞レプリコンを含むベクターはまた、目的のHBcキメラ遺伝子の形質転換ホスト細胞(例えば大腸菌)内での発現を指令することができる原核細胞プロモーター領域を含むことができる。細菌ホストに適合することができるプロモーター配列は、典型的には1つまたは2つ以上の便利な制限部位を目的のDNAセグメントの挿入のために含むプラスミドベクター中に提供される。前記のようなベクタープラスミドの典型は、pUC8、pUC9およびpBR329(Biorad Laboratories (Richmond, CA)より入手できる)並びにpPLおよびpKK223−3(Pharmacia (Piscataway, NJ)より入手できる)である。
高等植物および哺乳類由来の細胞における遺伝子発現に有用な典型的ベクターは当分野では周知で、Rogersら(Meth. in Enzymol., 153:253−277(1987))が記載したアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の腫瘍誘発(Ti)プラスミドに由来する植物ベクター、および哺乳類発現ベクターpKSV−10、上記のものおよびpCI−neo(Promega Corp., #E1841, Madison, WI)が含まれる。しかしながら、Frommら(Proc. Natl Acad. Sci. USA, 82:58−24(1985))が記載したpCaMVCNトランスファーコントロールベクターを含む、その他のいくつかの発現ベクター系が植物で機能することが判明している。プラスミドpCaMVCN(Pharmacia (Piscataway, NJ)より入手できる)は、カリフラワーモザイクウイルスCaMV35Sプロモーターを含む。
上記の植物発現系は、典型的には挿入されたトランスジーンの系統的または構成的発現を提供する。系統的発現は、目的のキメラ分子または生成粒子の供給源として植物の大半または全体が用いられる場合、または植物の大部分を用いて経口ワクチンを提供する場合に有用であろう。しかしながら、キメラ分子または粒子を植物の貯蔵器官(例えば根、種子または果実)で発現させることがより有効である。前記貯蔵器官から粒子をより容易に単離または摂取できる。
貯蔵器官での発現を達成する態様の1つは、1つまたは2つ以上の予め選択した、または予め定めた非光合成植物器官でその制御遺伝子を発現するプロモーターを用いることである。他の器官ではほとんどまたは全く発現をひき起こさないが1つまたは2つ以上の予め選択した貯蔵器官(例えば葉または茎に対して根、種子または果実)で発現させることを、本明細書では強化または優先発現と称する。別の器官と比較したとき少なくとも5:1の比で1つまたは2つ以上の予め選択した器官で発現を指令する典型的なプロモーターは、本明細書では器官強化プロモーターと定義する。実質的にただ1つの貯蔵器官でのみ発現され、他の貯蔵器官では実質的に発現されないものを器官特異的発現と称し、すなわち貯蔵器官対別の器官の発現生成物比が約100:1またはそれ以上は器官特異的であることを示す。貯蔵器官特異的プロモーターはしたがって貯蔵器官強化プロモーター類の中の1つである。
典型的な植物貯蔵器官には、ニンジン、タロイモもしくはカサバの根、ジャガイモの塊茎および果肉(例えば赤バンジロウ、トケイソウ、マンゴー、パパイヤ、トマト、アボカド、サクランボ、ミカン、ポンカン、ヤシ、メロン(例えばマスクメロン)およびスイカの果肉)、並びに他の多肉質果実(例えばスクオッシュ、キウリ、マンゴー、アプリコット、モモ)の他に種子(トウモロコシ、ダイズ、コメ、ナタネなど)が含まれる。
CaMV35Sプロモーターは通常は構成性プロモーターとみなされる。しかしながら、最近の研究では、CaMV35Sプロモーターの21−bp量域は、別のもの(異種の常緑組織プロモーター(rbcS−3A))に連結されたとき、根強化プロモーターになる合成キメラプロモーターとなることができることが示された。前記21−bp配列は米国特許第5,023,179号に開示されている。米国特許第5,023,179号の21−bp挿入物を含むキメラrbcS−3Aプロモーターは、本発明の有用な根強化プロモーターである。
CaMV35Sプロモーターは通常は構成性プロモーターとみなされる。しかしながら、最近の研究では、CaMV35Sプロモーターの21−bp量域は、別のもの(異種の常緑組織プロモーター(rbcS−3A))に連結されたとき、根強化プロモーターになる合成キメラプロモーターとなることができることが示された。前記21−bp配列は米国特許第5,023,179号に開示されている。米国特許第5,023,179号の21−bp挿入物を含むキメラrbcS−3Aプロモーターは、本発明の有用な根強化プロモーターである。
上記の21−bpセグメントを含む同様な根強化プロモーターは、CAMV35Sプトモーター自体の−90から+8領域である。米国特許第5,110,732号は、切端CaMV35Sプロモーターは根および種子の根部(radical)(根になる運命の組織)での発現強化を提供することを開示した。前記プロモーターもまた本発明で有用である。
また別の根強化プロモーターは、ナタネ(Brassica napus L.)遺伝子の−1616から−1プロモーターで、PCT/GB92/00416(WO91/13922、1991年9月19日公開)で開示されている。プラスミドpRlambdaS4を含む大腸菌DH5.アルファおよびこのプロモーターを有するバクテリオファージ、ラムダ.ベータ.1は、1990年3月8日に以下の公的機関に寄託され(National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Alberdeen, GB)、アクセッション番号NCIMB40265およびNCIMB40266を有する。前記プロモーターの有用部分は、前記プラスミドをHaeIIIで切断して1.0kbフラグメントとして得ることができる。
また別の根強化プロモーターは、ナタネ(Brassica napus L.)遺伝子の−1616から−1プロモーターで、PCT/GB92/00416(WO91/13922、1991年9月19日公開)で開示されている。プラスミドpRlambdaS4を含む大腸菌DH5.アルファおよびこのプロモーターを有するバクテリオファージ、ラムダ.ベータ.1は、1990年3月8日に以下の公的機関に寄託され(National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Alberdeen, GB)、アクセッション番号NCIMB40265およびNCIMB40266を有する。前記プロモーターの有用部分は、前記プラスミドをHaeIIIで切断して1.0kbフラグメントとして得ることができる。
好ましい根強化プロモーターは、DiRitaおよびGelvin(Mol. Gen.Genet., 207:233−241(1987))が記載したプラスミドpKan2に存在するマンノピンシンターゼ(mas)プロモーターである。このプロモーターは、XbaI−XbaIIフラグメントとして前記プラスミドpKan2から取り出される。
好ましいマンノピンシンターゼ根強化プロモーターは、−138位までのコアマンノピンシンターゼ(mas)プロモーター領域および−138から−213のマンノピンシンターゼアクチベーターで構成され、まとめてAmasPmasと呼ばれる。前記プロモーターは、タバコの葉での発現レベルと比較して根で約10から約100倍の産生増加をもたらすことが見出された。
好ましいマンノピンシンターゼ根強化プロモーターは、−138位までのコアマンノピンシンターゼ(mas)プロモーター領域および−138から−213のマンノピンシンターゼアクチベーターで構成され、まとめてAmasPmasと呼ばれる。前記プロモーターは、タバコの葉での発現レベルと比較して根で約10から約100倍の産生増加をもたらすことが見出された。
別の根特異的プロモーターは、側根開始時に発現されるヒドロキシプロリン富裕糖タンパク質遺伝子、HRGPnt3に付随する約500bpの5´フランキング配列で、Kellerら(Genes Dev., 3:1639−1646)が報告した。別の好ましい根特異的プロモーターは、タバコの根特異的遺伝子ToRBFの約−636から−1の5´フランキング領域に存在し、Yamamotoら(Plant Cell 3:371−381(1991))が報告した。発現を調節するシス作動性エレメントは前記著者らによってさらに具体的に位置が決定され、転写開始部位から5´側約−636から約−299の領域に位置する。Yamamotoらは、根ではToRBF遺伝子から定常的にmRNAが産生されるが、葉、シュートの分裂組織または茎ではそうでないことを報告した。
さらに別の有用な貯蔵器官特異的プロモーターは、トマト(Lycopersicon esculentum)の果実成熟遺伝子E8の5´および3´フランキング領域である。前記領域およびそれらのcDNA配列は、Deikmanら(EMBO J. 7(11):3315−3320(1988))が例示し論じている。
3つの領域が前記遺伝子の5´フランキング配列から2181bpに存在し、ポリ(A)付加部位に対して3´側の522bp配列はE8遺伝子の発現を制御するように思われる。−2181から−1088の1つの両域は未熟な果実におけるエチレンによるE8遺伝子転写の活性化に要求され、さらにまた成熟時の転写にも寄与する。さらに別の2つの領域(−1088から−863および−409から−263)はエチレン反応性を未熟な果実に付与することはできないが、成熟時のE8遺伝子発現のためには十分である。
3つの領域が前記遺伝子の5´フランキング配列から2181bpに存在し、ポリ(A)付加部位に対して3´側の522bp配列はE8遺伝子の発現を制御するように思われる。−2181から−1088の1つの両域は未熟な果実におけるエチレンによるE8遺伝子転写の活性化に要求され、さらにまた成熟時の転写にも寄与する。さらに別の2つの領域(−1088から−863および−409から−263)はエチレン反応性を未熟な果実に付与することはできないが、成熟時のE8遺伝子発現のためには十分である。
トウモロコシの内乳では高レベルで、根でははるかに低レベルでさらに緑色組織または花粉では発現されない制御された態様で発現されるトウモロコシのシュクロースシンターゼ−1(Sh)プロモーターは、キメラレポーター遺伝子β−グルクロニダーゼ(GUS)を特にタバコの篩部細胞(茎および根に豊富である)で発現させることが報告された(Yang et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4144−4148)。前記プロモーターは、したがって植物器官、例えば多肉質果実(例えばメロン(例えばマスクメロン))、または内乳を含む種子、および高レベルの篩部細胞を含む根で有用である。
別の典型的な組織特異的プロモーターはレクチンプロモーターで、前記は種子組織に特異的である。ダイズ種子のレクチンタンパク質はただ1つの遺伝子(Le1)によってコードされ、前記は種子の成熟時にのみ発現され、全種子mRNAの約2から約5%になる。レクチン遺伝子および種子特異的プロモーターは完全に性状が決定され、遺伝子導入タバコ植物における種子特異的発現の誘導に用いられた。例えば以下の文献を参照されたい:Vodkin et al. (1983) Cell, 34:1023; Lindstrom et al. (1990) Developmental Genetics, 11:160。
特に好ましい塊茎特異的発現プロモーターはジャガイモパタチン遺伝子の5´フランキング領域である。前記プロモーターの使用はTwellら(Plant Mol. Biol., 9:365−375(1987))が報告している。前記プロモーターはバクテリオファージLOPTIの約406bpフラグメントに存在する。LPOTIプロモーターは、他の4つのパタチンプロモーターと90%を越える相同性、およびパタチンプロモーターPGT5と全400塩基にわたって95%の相同性を有する領域を有する。これらのプロモーターの各々が本発明で有用である。例えばまた以下の文献を参照されたい:Wenzler et al. (1989) Plant Mol. Biol., 12:41−50。
さらに別の器官強化および器官特異的プロモーターはBenfeyら(Science, 244:174−181(1988))が記載している。
利用される前記プロモーター配列の各々は、細胞内のキメラ分子または粒子の量によって実質的に影響されない。本明細書で用いられるように、「実質的に影響されない」という用語は、前記プロモーターが、形質転換細胞または遺伝子導入植物内に蓄積されたキメラ分子または粒子によって反応してフィードバック制御(抑制)を指令することはないことを意味する。
利用される前記プロモーター配列の各々は、細胞内のキメラ分子または粒子の量によって実質的に影響されない。本明細書で用いられるように、「実質的に影響されない」という用語は、前記プロモーターが、形質転換細胞または遺伝子導入植物内に蓄積されたキメラ分子または粒子によって反応してフィードバック制御(抑制)を指令することはないことを意味する。
アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いる植物細胞のトランスフェクションは、典型的には双子葉植物でもっとも良好に達成される。単子葉植物は、通常はいわゆるプロトプラストの直接遺伝子導入によってもっとも容易に形質転換される。直接遺伝子導入は、通常は電気穿孔によって、ポチエチレングリコール媒介導入または必要なDNAを含むミクロ発射体による細胞爆撃によって実施される。前記のトランスフェクションの方法は当分野で周知であり、本明細書で詳述する必要はない。トランスフェクトした細胞およびプロトプラストから完全な植物を再生させる方法もまた、植物組織から所望のタンパク質を得る技術と同様に周知である。例えば、米国特許第5,618,988号および第5,679,880号並びにそれらの中に引用された文献を参照されたい。
アグロバクテリウムトランスフェクション、電気穿孔または他の方法を用いて作製された遺伝子導入植物は、典型的にはただ1つの遺伝子を1つの染色体上に含んでいる。前記のような遺伝子導入植物は前記付加遺伝子に対してヘテロ接合体であるということができる。しかしながら、「ヘテロ接合体」という用語を使用する場合は、通常1対の染色体の第二の染色体の同じ遺伝子座に相補的遺伝子が存在することを示唆し、本明細書の場合のように1つの付加遺伝子を含む植物内では前記のような遺伝子は存在しないので、前記のような植物のためのより正確な名称は、前記付加された外因性キメラ分子コード遺伝子が、有糸分裂および減数分裂時に別個に分離されるので独立セグリガントであると考える。目的のHBcキメラ分子をコードするただ1つの構造遺伝子を駆動する器官強化プロモーターを含む遺伝子導入植物(すなわち独立セグリガント)は、好ましい遺伝子導入植物である。
より好ましいものは、付加構造遺伝子についてのホモ接合体、すなわち2つの遺伝子(染色体対の各染色体上の同じ遺伝子座に1つの遺伝子)を含む遺伝子導入植物である。ホモ接合体遺伝子導入植物は、ただ1つの付加遺伝子を含む独立セグリガントの遺伝子導入植物を有性交配(自殖)し、生産された種子のいくつかを発芽させ、得られた植物をコントロール(天然の植物または遺伝子非導入植物)または独立セグリガント遺伝子導入植物に対してキメラ粒子蓄積強化について分析することによって得ることができる。ホモ接合体遺伝子導入植物は、天然の植物、遺伝子非導入植物および独立セグリガント遺伝子導入植物と比較してキメラ粒子蓄積強化を示す。
2つの異なる遺伝子導入植物もまた交配させて、2つの別個に分離させた外因性(異種)付加遺伝子を含む子孫を生産できることは理解されよう。適切な子孫の自殖によってキメラHBc分子をコードする両方の外因性付加遺伝子についてホモ接合体である植物を生産できる。親植物への戻し交配および遺伝子非導入植物との他家交配(out−crossing)もまた包含される。
したがって、本発明の遺伝子導入植物は、目的のキメラHBc分子をコードする異種構造遺伝子を有する。好ましい遺伝子導入植物は、付加された異種キメラHBc構造遺伝子についての独立セグリガントであり、前記遺伝子をその子孫に伝達することができる。より好ましい遺伝子導入植物は前記異種遺伝子についてのホモ接合体で、有性交配で前記遺伝子をその子孫の全てに伝達することができる。
したがって、本発明の遺伝子導入植物は、目的のキメラHBc分子をコードする異種構造遺伝子を有する。好ましい遺伝子導入植物は、付加された異種キメラHBc構造遺伝子についての独立セグリガントであり、前記遺伝子をその子孫に伝達することができる。より好ましい遺伝子導入植物は前記異種遺伝子についてのホモ接合体で、有性交配で前記遺伝子をその子孫の全てに伝達することができる。
キメラHBc分子をコードする遺伝子は天然には植物内に存在しないので、本発明の遺伝子導入植物は、同じタイプまたは株の非形質導入植物よりも、両者を同じ条件下で成育させたときはるかに大量にキメラHBc分子粒子を蓄積させる。
「同じタイプ」または「同じ株」という語句は、非形質転換植物と同じ雑種の植物または非形質転換植物のクローンを意味するために本明細書では用いられる。雑種の兄弟間の対立遺伝子座の変動が小さい場合(十分に近親交配された植物のように)、兄弟間の比較またはいくつかの兄弟を用いて得られた平均を使用することができる。そうでなければクローンが比較には好ましい。
「同じタイプ」または「同じ株」という語句は、非形質転換植物と同じ雑種の植物または非形質転換植物のクローンを意味するために本明細書では用いられる。雑種の兄弟間の対立遺伝子座の変動が小さい場合(十分に近親交配された植物のように)、兄弟間の比較またはいくつかの兄弟を用いて得られた平均を使用することができる。そうでなければクローンが比較には好ましい。
遺伝子導入植物から得られた種子を野外の温室、または風防場などで生育させ、得られた性成熟遺伝子導入植物を自家受粉させて標準交配植物を作製する。これらの植物から得られる子孫は、一定範囲の環境条件下で、好ましくは野外でキメラHBc分子粒子蓄積について評価される標準交配系となる。
キメラHBc分子粒子の蓄積についてホモ接合体の遺伝子導入植物を他の所望の特色を有する親植物と交配する。前記の子孫(キメラHBc分子粒子蓄積についてヘテロ接合体であるかまたは独立セグリガントに分離することができる)は、一方または他方の親と戻し交配して、キメラHBc分子粒子蓄積および前記他の所望の特色を示す遺伝子導入植物が得られる。子孫と親との戻し交配は、2回以上繰り返し、多数の所望の特色をもつ遺伝子導入植物を得る必要があるかもしれない。
キメラHBc分子粒子の蓄積についてホモ接合体の遺伝子導入植物を他の所望の特色を有する親植物と交配する。前記の子孫(キメラHBc分子粒子蓄積についてヘテロ接合体であるかまたは独立セグリガントに分離することができる)は、一方または他方の親と戻し交配して、キメラHBc分子粒子蓄積および前記他の所望の特色を示す遺伝子導入植物が得られる。子孫と親との戻し交配は、2回以上繰り返し、多数の所望の特色をもつ遺伝子導入植物を得る必要があるかもしれない。
昆虫細胞株もまたHBcキメラ発現に用いることができる。例えば、そのような系の1つでは、オートグラファ核多角体ウイルス(AcNPV)またはバキュロウイルスをベクターとして用いて、スポドプテラ・フルジペルダ(Spodoptera frugiperuda)細胞またはトリコプルシア(Trichoplusia)の幼虫で外来遺伝子を発現させる。
キメラをコードする配列は、前記ウイルスの非必須領域、例えばポリヘドリン遺伝子でクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。キメラ配列の挿入の成功によってポリヘドリン遺伝子が不活化され、コートタンパク質を欠くリコンビナントウイルスが産生される。続いて前記リコンビナントウイルスを、例えばS.フルジペルダ(Spodoptera frugiperuda)細胞またはトリコプルシア(Trichoplusia)の幼虫の感染に用い、その中でHBcキメラを発現させることができる(E. Engelhard et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3224−3227; V. Luckow, Insect Cell Expression Technology, pp. 183−218, " Protein Engineering: Principles and Practice, J.L. Cleland et al. eds., Wiley−Liss, Inc, 1996)。オートグラファ核多角体ウイルス(AcNPV)のポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれた異種遺伝子は、しばしば感染後期に高レベルで発現される。
キメラをコードする配列は、前記ウイルスの非必須領域、例えばポリヘドリン遺伝子でクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。キメラ配列の挿入の成功によってポリヘドリン遺伝子が不活化され、コートタンパク質を欠くリコンビナントウイルスが産生される。続いて前記リコンビナントウイルスを、例えばS.フルジペルダ(Spodoptera frugiperuda)細胞またはトリコプルシア(Trichoplusia)の幼虫の感染に用い、その中でHBcキメラを発現させることができる(E. Engelhard et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3224−3227; V. Luckow, Insect Cell Expression Technology, pp. 183−218, " Protein Engineering: Principles and Practice, J.L. Cleland et al. eds., Wiley−Liss, Inc, 1996)。オートグラファ核多角体ウイルス(AcNPV)のポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれた異種遺伝子は、しばしば感染後期に高レベルで発現される。
キメラ遺伝子を含むリコンビナントバキュロウイルスは、バキュロウイルスシャトルベクター系(Luckow et al. (1993) J. Virol., 67:4566−4579)を用いて構築される。前記ベクター系はBac−To−Bac(登録商標)(Life Technologies)として市販されている。リコンビナントウイルスのストックの調製およびリコンビナントタンパク質の発現は標準的プロトコルによって調製およびモニターされる(O' Reilly et al. "Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual", W.H. Freeman and Company, New York, 1992; King et al. "The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide", Chapman & Hall, London, 1992)。
相補的な粘着末端または平滑端を介してベクターにDNAを機能的に連結させる種々の方法が開発された。例えば、ベクターDNAに挿入されるべきDNAセグメントに相補的なホモポリマー鎖を付加することができる。続いてベクターおよびDNAセグメントを相補的なホモポリマー尾部間の水素結合によって結合させリコンビナントDNA分子を作製する。
また別には、1つまたは2つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーを用いて、上記のようにDNAセグメントを発現ベクターと結合させることができる。前記合成リンカーは、平滑端DNA分子の連結を触媒することができる酵素(例えばバクテリオファージT4DNAリガーゼ)の存在下で大過剰の合成リンカー分子とともに前記平滑端DNAセグメントをインキュベートすることによって平滑端DNAセグメントと結合させることができる。
また別には、1つまたは2つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーを用いて、上記のようにDNAセグメントを発現ベクターと結合させることができる。前記合成リンカーは、平滑端DNA分子の連結を触媒することができる酵素(例えばバクテリオファージT4DNAリガーゼ)の存在下で大過剰の合成リンカー分子とともに前記平滑端DNAセグメントをインキュベートすることによって平滑端DNAセグメントと結合させることができる。
したがって、反応生成物は、それらの末端に合成DNAリンカー配列を含むDNAセグメントである。続いて前記DNAセグメントを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断し、合成リンカーの末端と適合する末端を生成する酵素で切断した発現ベクターと連結する。種々の制限部位を含む合成リンカーは、多数の供給元(New England BioLabs(Beverley, MA)を含む)から市場で入手できる。所望のDNAセグメントはまたPCR技術を用いて得ることができる。前記技術では、前進および逆方向プライマーは、ベクターに遺伝子を挿入することができるように、増幅後に切断することができる所望の制限部位を含む。また別には、PCR生成物は、当分野で周知のようにT−張出しを含むベクター(Promega Corp., A3600, Madison,WI)で直接クローニングしてもよい。
発現したキメラタンパク質は、単一細胞内であるか、多細胞ホストの細胞内であるかにかかわらずホスト細胞内で自己会合する。標準的な方法を用いて粒子を含む細胞を採集し、フレンチ加圧セル、リゾチーム、超音波破壊装置、ビーズビーターまたはミクロ流動化装置(Microfluidics International Corp., Newton MA)を用いて細胞を溶解させる。溶解物を清澄にした後、45%硫安で粒子を沈澱させ、20mMリン酸ナトリウム(pH6.8)に再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析する。前記透析済み材料を簡単な遠心沈澱によって清澄にし、セファロースCL−4Bを用いて上清をゲルろ過クロマトグラフィーに付す。粒子を含む分画を特定し、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに付し、さらに硫安で再沈澱させ、再懸濁、透析およびろ過滅菌して−70℃で保存する。
HBcキメラ共役物
B細胞またはT細胞反応を所望する任意のハプテンを、目的のHBcキメラまたはキメラ粒子(例えばドメインIIのループ領域内に異種リンカー残基(例えばリジン、グルタミンもしくはアスパラギン酸、システインまたはチロシン)およびドメインIVに付加システイン残基を含むキメラ粒子)に連結してHBcキメラ共役物を生成することができる。問題のハプテンは典型的にはB細胞免疫原である。ハプテンはポリペプチドでも炭水化物(糖類、すなわちオリゴ糖または多糖類)でも、または非ポリペプチド、非炭水化物性化学物質(例えば2,4−ジニトロベンゼン)でも、または医薬(例えばコカインまたはニコチン)でもよい。前記のように生成されたHBcキメラ粒子共役物は、下記で述べるように接種物またはワクチンとして有用である。キメラタンパク質自体は発現によって会合し、共役物は発現後に形成されるので、共役物の形成は典型的には、遊離タンパク質になぞらえて会合粒子を用いて実施される。
B細胞またはT細胞反応を所望する任意のハプテンを、目的のHBcキメラまたはキメラ粒子(例えばドメインIIのループ領域内に異種リンカー残基(例えばリジン、グルタミンもしくはアスパラギン酸、システインまたはチロシン)およびドメインIVに付加システイン残基を含むキメラ粒子)に連結してHBcキメラ共役物を生成することができる。問題のハプテンは典型的にはB細胞免疫原である。ハプテンはポリペプチドでも炭水化物(糖類、すなわちオリゴ糖または多糖類)でも、または非ポリペプチド、非炭水化物性化学物質(例えば2,4−ジニトロベンゼン)でも、または医薬(例えばコカインまたはニコチン)でもよい。前記のように生成されたHBcキメラ粒子共役物は、下記で述べるように接種物またはワクチンとして有用である。キメラタンパク質自体は発現によって会合し、共役物は発現後に形成されるので、共役物の形成は典型的には、遊離タンパク質になぞらえて会合粒子を用いて実施される。
個々のハプテンをタンパク質またはポリペプチドとそれらのアミノ酸残基の側鎖を介して機能的に連結し、懸垂連結(pendently−linked)免疫原性共役物(例えば分枝ポリペプチドポリマー)を作製する方法は当分野では周知である。前記の方法は、種々の側鎖上の1つまたは2つ以上のタイプの官能基を介して連結することを含み、前記ハプテンと懸垂連結(共役)(共有結合)されてあるが少なくとも1つの側鎖によって分離されている粒子内に担体タンパク質ポリペプチド骨格を生じる。
上記の官能基の各々を用いて担体タンパク質をハプテンに連結する方法は以下の文献に記載されている:Erlanger, (1980) Method of Enzymology, 70:85; Aurameas et al. (1978) Scand. J. Immunol., 8(Suppl.7):7−23;米国特許第 4,493,795号(Nestor et al.)。さらに、位置特異的共役反応(Rodwell et al. (1985) Biotech., 3:889−894)を実施して、ポリペプチドの生物学的活性を実質的に減少させないようにすることができる。
上記の官能基の各々を用いて担体タンパク質をハプテンに連結する方法は以下の文献に記載されている:Erlanger, (1980) Method of Enzymology, 70:85; Aurameas et al. (1978) Scand. J. Immunol., 8(Suppl.7):7−23;米国特許第 4,493,795号(Nestor et al.)。さらに、位置特異的共役反応(Rodwell et al. (1985) Biotech., 3:889−894)を実施して、ポリペプチドの生物学的活性を実質的に減少させないようにすることができる。
さらにまた、当分野で周知のように、HBcタンパク質およびポリペプチドハプテンの両方をそれらの天然形で用いてもよく、またそれらの官能基含有量をリジン残基のスクシニル化またはシステイン−チオラクトンとの反応によって改変してもよい。担体タンパク質または共役物のどちらかに、アミノ官能基と2−イミノチオラン、3−(3−ジチオピリジル)−プロピオネートのN−ヒドロキシスクシンイミドエステル、または当分野で公知の他の試薬との反応によってスルフヒドリル基を取り込んでもよい。
HBcキメラまたはハプテンはまた、スペーサーアーム(例えばヘキサメチレンジアミン)または別の二官能基分子を取り込ませて改変し、懸垂連結を容易にしてもよい。前記のような方法は下記で考察する。
ポリペプチドハプテンを共有結合させる方法は極めて多様で、免疫学分野の当業者にはよく知られている。例えば、米国特許第4,818,527号に従えば、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA)またはスクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(SMCC, Pierce Chemical Co., Rockford, IL)を適切なHBcキメラと反応させて、活性化担体を生成する。
ポリペプチドハプテンを共有結合させる方法は極めて多様で、免疫学分野の当業者にはよく知られている。例えば、米国特許第4,818,527号に従えば、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA)またはスクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(SMCC, Pierce Chemical Co., Rockford, IL)を適切なHBcキメラと反応させて、活性化担体を生成する。
続いて、前記活性化担体をハプテン(例えばスルフヒドリルを末端にもつハプテン)またはポリペプチド(前記は末端システインを有するか、またはさらに別のアミノ−もしくはカルボキシ−末端システイン残基が付加されてある)と反応させて、共有結合HBcキメラ共役物を生成する。また別の例として、ポリペプチドハプテンのアミノ基を先ずN−スクシンイミジル3−(2−ピリジルチオ)プロピオネート(SPDP, Pharmacia, Piscataway, NJ)と反応させ、さらに前記チオール含有ポリペプチドを還元後の活性化担体と反応させることができる。もちろん、硫黄含有部分および二重結合含有ミカエルアクセプターを入れ替えてもよい。前記の反応は供給元の文献およびKitagawaら(J. Biochem., 79:233(1976))およびLachmannら("1986 Synthetic Peptides as Antigens",(Ciba Foundation Symposium 119), pp.25−40(Wiley, Chichester:1986))の文献に記載されている。
米国特許第4,767,842号は、本発明で有用な担体とポリペプチド間の共有結合のいくつかの態様を開示している。ある方法では、トリレンジイソシアネートをジオキサン緩衝液溶媒中で0℃で担体と反応させて活性化担体が生成される。ポリペプチドハプテンをその後で活性化担体と混合し反応させて、共有結合したHBcキメラ共役物を生成する。
1つの官能基末端にジスルフィド結合を生成し、他方にアミド結合を生成する多数のヘテロ二官能基薬剤が特に有用である。前記には、以前に考察したN−スクシジミジル−3−(2−ピリジルチオ)−プロピオネート(SPDP)が含まれ、これは、それ自体とHBcキメラまたはハプテンのどちらかのチオールとの間にジスルフィド結合を創出する。模範的な試薬は、ポリペプチドハプテン内にシステイン残基および共役パートナー上にアミン(例えばリジンのε−アミン)または担体タンパク質に他の遊離アミノ基を含む。前記のような種々のジスルフィド/アミド形成薬剤が知られている。例えば以下の文献を参照されたい:Immun. Rev. (1982) 62:185。
1つの官能基末端にジスルフィド結合を生成し、他方にアミド結合を生成する多数のヘテロ二官能基薬剤が特に有用である。前記には、以前に考察したN−スクシジミジル−3−(2−ピリジルチオ)−プロピオネート(SPDP)が含まれ、これは、それ自体とHBcキメラまたはハプテンのどちらかのチオールとの間にジスルフィド結合を創出する。模範的な試薬は、ポリペプチドハプテン内にシステイン残基および共役パートナー上にアミン(例えばリジンのε−アミン)または担体タンパク質に他の遊離アミノ基を含む。前記のような種々のジスルフィド/アミド形成薬剤が知られている。例えば以下の文献を参照されたい:Immun. Rev. (1982) 62:185。
他の二官能基共役試薬は、ジスルフィド結合ではなくチオエーテルを生成する。前記のチオエーテル生成薬剤の多くは市販されており、6−マレイミドカプロン酸、2−ブロモ酢酸、2−ヨード酢酸、4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボン酸などの反応性エステルが含まれる。カルボキシル基はそれらをスクシンイミドまたは1−ヒドロキシ−2−ニトロ−4−スルホン酸、ナトリウム塩と結合させることによって活性化できる。本発明の方法のために特に好ましい共役剤は、スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(SMCC)でピアースケミカル社(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)から入手できる。前述のリストは網羅することを意図していない。名を挙げた化合物の改変物も明らかに使用することができる。図6は、SMCCを用いたHBc活性化担体の生成(I)および前記活性化担体とスルフヒドリル末端をもつハプテンとのその後の反応(II)を示す模式図(模式図1)を提供する。
ポリペプチドハプテンは当分野で周知の多数の方法で得ることができる。通常のペプチド合成技術を容易に利用することができる。例えば、より長いペプチドを生成するために遺伝子組換え技術およびPCR系技術は有用である。所望の配列は通常比較的短いので、固相化学合成が有用である。
典型的なポリペプチドハプテンは上記の表Aおよび表Bに示されている。それらポリペプチドの各々はそのN−末端アミノ基を介して利用されるか、またはさらに別の表には示されていないN−末端システインの使用によっても利用できる。
関連する化学反応を用いて、「化学物質」と呼ぶことができるものを担体タンパク質に共役させる。典型的には、化学物質中に共役に適した官能基をデザインする。誘発された抗体が肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)を防御する模範的なハプテンは6−O−ホスホコリンヒドロキシヘキサノエートである(Fischer et al. (1995) J. Immunol., 154:3373−3382)。下記の表はさらに別の典型的な化学物質ハプテンを提供する。
典型的なポリペプチドハプテンは上記の表Aおよび表Bに示されている。それらポリペプチドの各々はそのN−末端アミノ基を介して利用されるか、またはさらに別の表には示されていないN−末端システインの使用によっても利用できる。
関連する化学反応を用いて、「化学物質」と呼ぶことができるものを担体タンパク質に共役させる。典型的には、化学物質中に共役に適した官能基をデザインする。誘発された抗体が肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)を防御する模範的なハプテンは6−O−ホスホコリンヒドロキシヘキサノエートである(Fischer et al. (1995) J. Immunol., 154:3373−3382)。下記の表はさらに別の典型的な化学物質ハプテンを提供する。
担体タンパク質に多糖類を共役させる多くの方法が当分野で知られている。アルデヒド基は、オリゴ糖または比較的小さい多糖類の還元端(Anderson (1983) Infect. Immun., 39:233−238; Poren et al. (1985) Mol. Immunol., 22:907−919)または末端部(Anderson et al. (1986) J. Immunol., 137:1181−1186; Beuvery et al. (1986) Dev. Bio. Scand., 65:197−204)に調製することができる。前記アルデヒド基を還元的アミノ化により担体タンパク質に結合させることができる。
大きな多糖類は、末端活性化(Anderson et al. (1986) J. Immunol., 137:1181−1186)または多糖類鎖上のいくつかの官能基のランダム活性化(Chu et al. (1983) Infect. Immun., 40:245−256; Gordon (1986) 米国特許第4,619,828号; Marburg (1989) 米国特許第4,882,317号) によって共役させることができる。多糖類鎖上のいくつかの官能基のランダム活性化は、多糖類鎖上のランダム結合により高度に架橋された共役物をもたらすことができる。多糖類対担体タンパク質の最適比は個々の多糖類、担体および用いられる共役に左右される。
糖類と担体タンパク質との共役方法に関する詳細な概論は以下で見出すことができる:Dick et al. "Contributions to Microbiology and Immunolgy, Vol.10, Cruse et al. eds., (S. Karger: 1989), pp.48−114; Jennings et al., "Neoglycoconjugates: Preparation and Applications, Lee et al. eds., (Academic Press: 1994), pp.325−371; Aplin et al. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 10:259−306; Stowell et al. (1980) Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 37:225−281)。
糖類と担体タンパク質との共役方法に関する詳細な概論は以下で見出すことができる:Dick et al. "Contributions to Microbiology and Immunolgy, Vol.10, Cruse et al. eds., (S. Karger: 1989), pp.48−114; Jennings et al., "Neoglycoconjugates: Preparation and Applications, Lee et al. eds., (Academic Press: 1994), pp.325−371; Aplin et al. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 10:259−306; Stowell et al. (1980) Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 37:225−281)。
炭水化物自体は、当分野で公知の方法によって、例えばWitteら(J. Am. Chem. Soc., 119:2114−2118(1997))の記載した酵素的糖タンパク質合成によって合成することができる。
本発明のHBc共役物の製造に使用される目的のハプテンであるオリゴ糖の例として、いくつかのオリゴ糖(合成物、半合成物および天然物)を下記の節で論じる。
b型インフルエンザ菌(Haemophilus influenza)(Hib)の治療用ワクチンを製造するために適したオリゴ糖ハプテンは、D−リボース−D−リビトール−ホスフェート(I、下記)、D−リビトール−ホスフェート−D−リボース(II、下記)またはホスフェート−D−リボース−D−リビトール(III、下記)の2から20回繰り返しで製造される(Eduard C. Beuvery et al. EP−0,276,516−B1)。
本発明のHBc共役物の製造に使用される目的のハプテンであるオリゴ糖の例として、いくつかのオリゴ糖(合成物、半合成物および天然物)を下記の節で論じる。
b型インフルエンザ菌(Haemophilus influenza)(Hib)の治療用ワクチンを製造するために適したオリゴ糖ハプテンは、D−リボース−D−リビトール−ホスフェート(I、下記)、D−リビトール−ホスフェート−D−リボース(II、下記)またはホスフェート−D−リボース−D−リビトール(III、下記)の2から20回繰り返しで製造される(Eduard C. Beuvery et al. EP−0,276,516−B1)。
米国特許第4,220,717号はまた、b型インフルエンザ菌のためのポリリボシルリビトールホスフェート(PRP)を開示している。
Petersonら(Infect. Immun., 66(8):3848−3855(1998))は、クラミジア・ニュモニエ(Chlamydia pneumoniae)に対する防御を提供する三糖類ハプテン、αKdo(2 8)αKdo(2 4)αKdoを開示している。クラミジア・ニューモニエは、咽頭炎から致死的肺炎に及ぶヒトの呼吸器感染症の原因である。Kdoは3−デオキシ−D−マンノ−オクタ−2−ウロソン酸(3−deoxy−D−manno−oct−2−ulosonic acid)である。
Andersonら(EP−0,126,043−A1)は、肺炎連鎖球菌によってひき起こされる細菌感染症の治療、予防または診断で使用できる糖類を開示している。有用な糖類の1つの種類は、二糖類GlcNAcβ1 3Galに由来する。Andersonらはまた、ネオラクトテトラオシルセラミドが有用であることを報告した。前記はGalβ1 4GlcNAcβ1 3Galβ1 4Glc−Cerである。
Petersonら(Infect. Immun., 66(8):3848−3855(1998))は、クラミジア・ニュモニエ(Chlamydia pneumoniae)に対する防御を提供する三糖類ハプテン、αKdo(2 8)αKdo(2 4)αKdoを開示している。クラミジア・ニューモニエは、咽頭炎から致死的肺炎に及ぶヒトの呼吸器感染症の原因である。Kdoは3−デオキシ−D−マンノ−オクタ−2−ウロソン酸(3−deoxy−D−manno−oct−2−ulosonic acid)である。
Andersonら(EP−0,126,043−A1)は、肺炎連鎖球菌によってひき起こされる細菌感染症の治療、予防または診断で使用できる糖類を開示している。有用な糖類の1つの種類は、二糖類GlcNAcβ1 3Galに由来する。Andersonらはまた、ネオラクトテトラオシルセラミドが有用であることを報告した。前記はGalβ1 4GlcNAcβ1 3Galβ1 4Glc−Cerである。
McKenneyら(Science, 284:1523−1527(1999))は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)に対する防御を提供する多糖類、ポリ−N−スクシニルβ1 6GlcN(PNSG)を開示している。黄色ブドウ球菌は、心内膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎、肺炎および膿瘍を含む集団感染症の一般的原因である。
欧州特許第0,157,899−B1号(この文献は参照により本明細書に含まれる)は、本発明で有用な肺炎球菌の多糖類の分離を開示している。以下の表は、本発明のハプテンとして有用な莢膜多糖類を産生する肺炎球菌標準培養を示す。
欧州特許第0,157,899−B1号(この文献は参照により本明細書に含まれる)は、本発明で有用な肺炎球菌の多糖類の分離を開示している。以下の表は、本発明のハプテンとして有用な莢膜多糖類を産生する肺炎球菌標準培養を示す。
モラクセラ(Moraxella)(ブランハメラ(Branhamella))・カタラーリス(catarrhalis)は、小児の中耳炎および静脈洞炎並びに成人の下気道感染症の原因であると報告されている。前記細菌のリポオリゴ糖表面抗原(LOS)のリピドA部分は3−デオキシ−D−マンノ−オクツロソン酸−グルコサミン結合で切断される。前記切断生成物を中等度のアルカリで処理してエステル結合脂肪酸を除去し、一方、アミド結合脂肪酸は温存してM.カタラーリスから無毒化リポ多糖類(dLOS)を生成する。dLOSは、タンパク質担体に結合させないかぎり免疫原性を示さない(Xin−Xing Gu et al. (1998) Infect. Immun., 66(5):1891−1897)。
B群連鎖球菌(GBS)は、ヒトの敗血症、髄膜炎、および関連する神経学的疾患の原因である。莢膜多糖類特異的抗体は、幼児を感染から防御することが判明している(米国特許第5,795,580号)。GBS莢膜多糖類II型の反復単位は以下のとおりである:4)−β−D−GlcpNAc−(1 3)−[β−D−Galp(1 6)]−β−D−Galp(1 4)−β−D−Glcp−(1 3)−β−D−Glcp−(1 2)−[α−D−NeupNAc(2 3)]−β−D−Galp−(1、ここで括弧内の部分は、直ぐ後に続く括弧をもたないサブユニットに連結された分枝である。GBS莢膜多糖類V型の反復ユニットは以下のとおりである:4)−[α−D−NeupNAc−(2 3)−β−D−Galp−(1 4)−β−D−GlcpNAc−(1 6)]−α−D−Glcp−(1 4)−[β−D−Glcp−(1 3)]−β−D−Galp−(1 4)−β−D−Glcp−(1。
欧州特許出願EU−0,641,568−A1(Brade)は、トラコーマクラミジア(Chlamydia trachomatis)、C.ニューモニエおよびC.シッタシ(psittaci)由来のはしご様バンドパターン抗原を得る方法を開示している。
Slovinら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(10):5710−5715(1999))は、前立腺癌に対して用いられるワクチンの調製で担体としてKLHに結合させた合成オリゴ糖、グロボHの使用を報告している。同様に、Hellingら(Cancer Res., 55:2783−2788(July 1995))は、メラノーマの患者の治療のためのワクチンでKLH結合GM2の使用を報告している。後者のワクチンは、GM2のセラミド二重結合のオゾン切断、アルデヒド基の導入およびKLHでの還元的アルキル化によって製造された。同様な方法を本発明のキメラ粒子に用いることができる。
Slovinら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(10):5710−5715(1999))は、前立腺癌に対して用いられるワクチンの調製で担体としてKLHに結合させた合成オリゴ糖、グロボHの使用を報告している。同様に、Hellingら(Cancer Res., 55:2783−2788(July 1995))は、メラノーマの患者の治療のためのワクチンでKLH結合GM2の使用を報告している。後者のワクチンは、GM2のセラミド二重結合のオゾン切断、アルデヒド基の導入およびKLHでの還元的アルキル化によって製造された。同様な方法を本発明のキメラ粒子に用いることができる。
スフィンゴリピドのオリゴ糖部分、例えばグロボシドおよびガングリオシド(これらは、正常細胞と同様に他の腫瘍細胞、例えばメラノーマ、神経芽細胞腫および健常脳細胞の表面に存在する)は、本発明でハプテンとして同様に用いることができる。グロボシド、グロボHのオリゴ糖部分は、Fucα−(1 2)−Galβ(1 3)−GalNAcβ−(1 3)−Galα−(1 4)−Galβ−(1 4)Glcの構造を有し、一方ガングリオシド、GM2、GM1およびGD1aの糖部分はそれぞれ以下の構造を有する:GalNAcβ−(1 4)−[NeuAcα−(2 3)]−Galβ−(1 4)−Glc;Galβ−(1 3)−GalNAcβ−(1 4)−[NeuAcα−(2 3)]−Galβ−(1 4)−Glc;およびNeuAc−(2 3)−Galβ−(1 3)−GalNAcβ−(1 4)−[NeuAcα−(2 3)]−Galβ−(1 4)−Glc。
米国特許第4,356,170号は、以下のようにして得られる有用な多糖類の製造を開示している:還元し続いて酸化して末端アルデヒド基を有する化合物を生成し、前記を顕著な架橋とともにまたは架橋せずに担体タンパク質(例えば破傷風類毒素およびジフテリア類毒素)の遊離アミノ基上で還元によりアミノ化することができる。模範的な有用な細菌多糖類はβ型溶血連鎖球菌、インフルエンザ菌(Haemophilus influenza)、髄膜炎菌(meningococci)、肺炎球菌(pneumococci)および大腸菌を含む。還元により粒子をアミノ化するよりも、リンカーアーム(例えばε−アミノC2−C8アルキルカルボン酸によって提供されるもの)を多糖類上で還元によりアミノ化し、続いて水溶性カルボジイミドを用い粒子に結合させることができる。
接種物およびワクチン
本発明のさらに別の実施態様では、HBcキメラ粒子またはハプテンとHBcキメラ粒子との共役物は、接種物の免疫原として(前記免疫原は、接種されたホスト動物でB細胞またはT細胞反応(刺激)(例えば前記異種エピトープもしくはハプテンと免疫反応する抗体の産生またはT細胞活性化)を誘発する)用いるか、またはワクチンとして用いて前記異種エピトープまたはハプテンが由来する病原体に対して防御を提供する。
本発明のさらに別の実施態様では、HBcキメラ粒子またはハプテンとHBcキメラ粒子との共役物は、接種物の免疫原として(前記免疫原は、接種されたホスト動物でB細胞またはT細胞反応(刺激)(例えば前記異種エピトープもしくはハプテンと免疫反応する抗体の産生またはT細胞活性化)を誘発する)用いるか、またはワクチンとして用いて前記異種エピトープまたはハプテンが由来する病原体に対して防御を提供する。
T細胞活性化は種々の技術によって測定することができる。通常の使用では、ホスト動物に目的のHBcキメラ粒子ワクチンまたは接種物を接種し、その後、末梢単核血球細胞(PMBC)を採集する。続いて前記PMBCをin vitroでT細胞免疫原の存在下で約3から5日間培養する。続いて前記培養PMBCを、増殖またはサイトカイン(例えばIL−2、GM−CSFまたはIFN−γ)の分泌についてアッセイする。T細胞活性化のアッセイは当分野で周知である。例えば、米国特許第5,478,726号およびその中に引用されている文献を参照されたい。
例えば抗体生成を用いる場合、目的の接種物またはワクチンは、免疫誘発有効量のHBcキメラ粒子またはHBcキメラ粒子共役物(前記は、典型的にはまた水を含む医薬的に許容できる希釈組成物に溶解または分散される)を含む。免疫を必要とするか、または抗体の誘発を所望されるホスト動物、例えば哺乳類(例えばマウス、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、サル、類人猿またはヒト)または鳥類(例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒルまたはカモ)に投与したとき、接種物は、共役させた(懸垂結合させた)ハプテンと免疫反応する抗体を誘発する。前記抗体はまた好ましくはB細胞免疫原のタンパク質または糖類と結合する。
ワクチンは、マラリア病原体と関連する典型的なマラリアB細胞配列のように、異種B細胞エピトープまたは共役ハプテンが、病的状態と関係を有するタンパク質または糖類構造物の一部と一致する接種物の1タイプである。ワクチン誘発抗体はエピトープもしくはハプテンと免疫反応し、また活性化T細胞は前記異種エピトープもしくはハプテンと反応するだけでなく、前記病原体または病的細胞とin vivoで免疫反応し、前記病的状態に対して防御を提供する。
各々の免疫で用いられるリコンビナントキメラ免疫原の量は免疫誘発有効量と称され、下記で論じるように、とりわけリコンビナントHBcキメラ免疫原、免疫される哺乳類およびワクチン内にアジュバントが存在するか否かによって幅広く変動する。ワクチンおよび接種物の免疫誘発有効量によって、上記で論じたようにそれぞれ防御または抗体活性が提供される。
各々の免疫で用いられるリコンビナントキメラ免疫原の量は免疫誘発有効量と称され、下記で論じるように、とりわけリコンビナントHBcキメラ免疫原、免疫される哺乳類およびワクチン内にアジュバントが存在するか否かによって幅広く変動する。ワクチンおよび接種物の免疫誘発有効量によって、上記で論じたようにそれぞれ防御または抗体活性が提供される。
ワクチンまたは接種物は、典型的には接種物当たり(単位投与量当たり)約1マイクログラムから約1ミリグラム、好ましくは約10μグラムから約50マイクログラムの濃度のリコンビナントHBcキメラ免疫原を含む。本発明のワクチンまたは接種物に関するかぎり、「単位投与量」という用語は、動物に対して分割できない単位投与量として適切な物理的に範囲が定められた一定量を指し、各一定量は、個体としてまたは集団として所望の免疫誘発効果を生じるように計算された予め決定された活性物質量を必要な希釈剤(すなわち担体または賦形剤)とともに含む。
ワクチンまたは接種物は、典型的には回収されたリコンビナントHBcキメラ免疫原から、前記免疫原(好ましくは粒子形状の)を生理学的に容認できる(許容できる)希釈賦形剤、例えば水、リン酸緩衝食塩水(PBS)、酢酸緩衝食塩水(ABS)、リンゲル氏液などに分散させて水性組成物を作製することによって調製される。希釈賦形剤はまた、油性物質、例えばスクァランまたはスクァレンを下記で考察するように含むことができる。
活性成分としてタンパク質性物質を含む接種物およびワクチンの調製もまた当分野では周知である。典型的には、前記のような接種物またはワクチンは、非経口投与物として(溶液または懸濁液として)調製されるが、溶液用もしくは懸濁液用に適した固形物、注射前の液体もまた調製できる。調製物はまた乳化することができ、前記が特に好ましい。
活性成分としてタンパク質性物質を含む接種物およびワクチンの調製もまた当分野では周知である。典型的には、前記のような接種物またはワクチンは、非経口投与物として(溶液または懸濁液として)調製されるが、溶液用もしくは懸濁液用に適した固形物、注射前の液体もまた調製できる。調製物はまた乳化することができ、前記が特に好ましい。
免疫誘発(免疫原性)活性を有する成分はしばしば、医薬的に許容され前記活性成分と適合する賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの混合物である。
さらに、所望する場合には、接種物またはワクチンは、組成物の免疫誘発性能を強化する微量の補助物質、例えば湿潤もしくは乳化剤、pH緩衝剤を含むことができる。
目的のワクチンまたは接種物はまた有利な場合にはアジュバントを含む。本発明のワクチンおよび接種物に適したアジュバントは、キメラのB細胞エピトープに対する抗体反応を強化することができるアジュバントの他に、キメラに含まれるT細胞エピトープに対する細胞性反応を強化することができるアジュバントを含む。アジュバントは当分野では周知である。例えば以下の文献を参照されたい:"Vaccine Design−The Subunit and Adjubant Approach", 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Vol.6, Eds. M.F. Powell & M.J. Newman, Plenum Press, New York and London, ISBN 0−306−44867−X。
さらに、所望する場合には、接種物またはワクチンは、組成物の免疫誘発性能を強化する微量の補助物質、例えば湿潤もしくは乳化剤、pH緩衝剤を含むことができる。
目的のワクチンまたは接種物はまた有利な場合にはアジュバントを含む。本発明のワクチンおよび接種物に適したアジュバントは、キメラのB細胞エピトープに対する抗体反応を強化することができるアジュバントの他に、キメラに含まれるT細胞エピトープに対する細胞性反応を強化することができるアジュバントを含む。アジュバントは当分野では周知である。例えば以下の文献を参照されたい:"Vaccine Design−The Subunit and Adjubant Approach", 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Vol.6, Eds. M.F. Powell & M.J. Newman, Plenum Press, New York and London, ISBN 0−306−44867−X。
典型的なアジュバントには、フロイントの完全アジュバント(CFA)(前記はヒトでは用いられない)、フロイントの不完全アジュバント(IFA)、スクァレン、スクァランおよびミョウバン(例えばアルヒドロゲル(Alhydrogel)(登録商標)(Superfos, Denmark))が含まれ、前記は当分野で周知の物質で、いくつかの供給元から市販されている。
本発明の免疫原とともに使用する場合に好ましいアジュバントには、アルミニウムまたはカルシウム塩(例えば水酸化物またはリン酸塩)が含まれる。本発明で使用される特に好ましいアジュバントは水酸化アルミニウムゲル、例えばアルヒドロゲル(登録商標)である。水酸化アルミニウムゲルの場合、本発明のキメラタンパク質は、各投与量につき50から800マイクログラム、好ましくは400から600マイクログラムのアルミニウムが存在するように前記アジュバントと混合される。
本発明の免疫原とともに使用する場合に好ましいアジュバントには、アルミニウムまたはカルシウム塩(例えば水酸化物またはリン酸塩)が含まれる。本発明で使用される特に好ましいアジュバントは水酸化アルミニウムゲル、例えばアルヒドロゲル(登録商標)である。水酸化アルミニウムゲルの場合、本発明のキメラタンパク質は、各投与量につき50から800マイクログラム、好ましくは400から600マイクログラムのアルミニウムが存在するように前記アジュバントと混合される。
本発明の免疫原とともに使用されるまた別の好ましいアジュバントは乳液である。目的の乳液は水中油乳液でも油中水乳液でもよい。免疫原キメラタンパク質の他に、前記のような乳液は、周知のようにスクァレン、スクァラン、ピーナッツ油などの油相を含み、さらに分散剤を含む。非イオン性分散剤が好ましく、前記のような物質にはソルビタン並びにマンニドのモノおよびジ−C12−C24−脂肪酸エステル(例えばソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエートおよびマンニドモノオレエート)が含まれる。免疫原を含む乳液は乳液として投与される。
好ましくは、前記のような乳液は油中水乳液であり、水相中のキメラタンパク質とともに乳化されてある、スクァレンおよびマンニドモノオレエート(アーラセル(Arlacel)A(登録商標))を場合によってスクァランとともに含有する。前記のような乳液の周知の例には、モンタニド(Montanide)(登録商標)ISA−720およびモンタニド(登録商標)ISA703(Seppic, Castres, France)が含まれ、前記の各々はスクァレンおよびスクァランの両方を含むと考えられている(各々においてスクァレンが圧倒的に多く、モンタニド(登録商標)ISA703ははるかに少ない)。もっとも好ましくは、モンタニド(Montanide)(登録商標)ISA−720が用いられ、油対水の比は7:3(w/w)が用いられる。他の好ましい水中油乳液アジュバントには、WO95/17210およびEP0,399,843に開示されたものが含まれる。
小分子アジュバントの使用もまた本発明に包含される。本発明で有用な小分子アジュバントのタイプの1つは、7−置換−8−オキソ−または8−スルホ−グアノシン誘導体で、米国特許第4,539,205号、同4,643,992号、同5,011,828号、および同5,093,318号に記載されている(前記文献は参照により本明細書に含まれる)。前記の物質のうちで、7−アリル−8−オキソグアノシン(ロキソリビン)が特に好ましい。前記分子は、抗原(免疫原)特異的反応の誘発に特に有効であることが示された。
さらにまた有用なアジュバントには、モノホスホリルリピドA(MPL)(corixa Corp.から入手できる(米国特許第4,987,237号を参照されたい))、CPG(Coley Pharmaceutical Groupから入手できる)、QS21(Aquila Biopharmaceuticals, Inc.から入手できる)、SBAS2(SKBから入手できる)、米国特許第4,767,842号に記載されたいわゆるムラミルジペプチド類似体、およびMF59(Chiron Corp.から入手できる)(例えば米国特許第5,709,879号および第6,086,901号を参照されたい)が含まれる。
さらにまた有用なアジュバントには、モノホスホリルリピドA(MPL)(corixa Corp.から入手できる(米国特許第4,987,237号を参照されたい))、CPG(Coley Pharmaceutical Groupから入手できる)、QS21(Aquila Biopharmaceuticals, Inc.から入手できる)、SBAS2(SKBから入手できる)、米国特許第4,767,842号に記載されたいわゆるムラミルジペプチド類似体、およびMF59(Chiron Corp.から入手できる)(例えば米国特許第5,709,879号および第6,086,901号を参照されたい)が含まれる。
より具体的には、免疫学的に活性なサポニン分画(例えばクィル(Quil)A(登録商標))もまた有用である。前記分画は、南アメリカの樹木、クィラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja Saponaria Molina)の樹皮に由来しアジュバント活性を有する。クィル(登録商標)Aの誘導体、例えばQS21(クィル(登録商標)AのHPLC精製分画誘導体)およびその製造方法は米国特許第5,057,540号に開示されている。QS21(QA21として知られている)の他に、他の分画(例えばQA17)もまた開示されている。
3−デ−O−アセチル化モノホスホリルリピドAは、Ribi Immunochem(Hamilton, Montana)によって製造される周知のアジュバントである。前記アジュバントは、細菌から抽出された3つの成分、モノホスホリルリピド(MPL)A、トレハロースジミコレート(TDM)および細胞壁骨格(CWS)(MPL+TDM+CWS)を2%スクァレン/トゥイーン(登録商標)80の乳液中に含んでいる。本アジュバントはGB2122204Bに開示された方法によって調製できる。3−デ−O−アセチル化モノホスホリルリピドAの好ましい形態は、直径が0.2μm未満の小さな粒子サイズを有する乳液形である(EP0,689,454B1)。
前記ムラミルジペプチドアジュバントには、N−アセチル−ムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン(thur−MDP)、N−アセチル−ノル−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(CGP11637、ノル−MDPと称される)、およびN−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1´−2´−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン(CGP)1983A、MTP−PEと称される)が含まれる。
好ましいアジュバント混合物には、3D−MPLおよびQS21の組合せ(EP0,671,948B1)、3D−MPLおよびQS21を含む水中油乳液(WO95/17210; PCT/EP98/05714)、他の担体とともに製剤化された3D−MPL(EP0,689,454B1)、コレステロール含有リポソームで製剤化されたQS21(WO96/33739)、または免疫促進性オリゴヌクレオチド(WO96/02555)が含まれる。また別のアジュバントには、WO99/52549に記載されたものおよびポリオキシエチレンエーテルの非粒子状懸濁物(英国特許出願第9807805.8号)が含まれる。
好ましいアジュバント混合物には、3D−MPLおよびQS21の組合せ(EP0,671,948B1)、3D−MPLおよびQS21を含む水中油乳液(WO95/17210; PCT/EP98/05714)、他の担体とともに製剤化された3D−MPL(EP0,689,454B1)、コレステロール含有リポソームで製剤化されたQS21(WO96/33739)、または免疫促進性オリゴヌクレオチド(WO96/02555)が含まれる。また別のアジュバントには、WO99/52549に記載されたものおよびポリオキシエチレンエーテルの非粒子状懸濁物(英国特許出願第9807805.8号)が含まれる。
アジュバントは補助量で用いられ、前記の量はアジュバント、哺乳類およびリコンビナントHBcキメラ免疫原にしたがって変動するであろう。典型的な量は各免疫当たり約1μgから約1mgで変動するであろう。適切な量および濃度は容易に決定できることは当業者には理解されよう。
接種物およびワクチンは通常は非経口的に、注射によって例えば皮下または筋肉内に投与される。他の投与態様に適したさらに別の製剤には座薬、およびいくつかの事例では経口製剤が含まれる。接種物の経鼻スプレーの使用もまたNeirynckら(Nature Med., 5(10):1157−1163(Oct. 1999))が論じているように意図される。座薬の場合、伝統的な結合剤および担体には、例えばポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドが含まれる。前記のような座薬は、活性成分を0.5%〜10%、好ましくは1〜%の範囲で含む混合物から生成することができる。経口製剤は、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤を含む。
接種物およびワクチンは通常は非経口的に、注射によって例えば皮下または筋肉内に投与される。他の投与態様に適したさらに別の製剤には座薬、およびいくつかの事例では経口製剤が含まれる。接種物の経鼻スプレーの使用もまたNeirynckら(Nature Med., 5(10):1157−1163(Oct. 1999))が論じているように意図される。座薬の場合、伝統的な結合剤および担体には、例えばポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドが含まれる。前記のような座薬は、活性成分を0.5%〜10%、好ましくは1〜%の範囲で含む混合物から生成することができる。経口製剤は、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤を含む。
接種物またはワクチン組成物の形態は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤または粉薬であり、活性成分として免疫誘発有効量のHBcキメラまたはHBcキメラ共役物を、好ましくは粒子として含む。典型的な組成物では、好ましいHBcキメラまたはHBcキメラ共役物の免疫誘発量は、先に述べたように単位投与量当たり活性成分が約1μgから約1mg、より好ましくは5μgから約50μgである。
ワクチンは典型的には非経口投与用に製剤化される。典型的な免疫は、皮下(SC)、筋肉内(IM)、静脈内(IV)、腹腔内(IP)または皮内(ID)で実施される。
ワクチンは典型的には非経口投与用に製剤化される。典型的な免疫は、皮下(SC)、筋肉内(IM)、静脈内(IV)、腹腔内(IP)または皮内(ID)で実施される。
HBcキメラ粒子およびHBcキメラ粒子共役物は、中性形または塩の形態としてワクチンに製剤化できる。医薬として許容できる塩には酸付加塩(タンパク質またはハプテンの遊離アミノ基とともに形成される)が含まれ、無機酸(例えば塩酸またはリン酸)または有機酸(例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など)で生成される。遊離カルボキシル基で形成される塩も無機塩基(例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄)および有機塩基(例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロケインなど)から誘導することができる。
さらに別の実施態様では、目的のHBcキメラをコードする遺伝子が適切に弱毒化させた腸内細菌、例えば腸チフス菌、ネズミチフス菌、ネズミチフス菌−大腸菌ハイブリッドまたは大腸菌にトランスフェクトされてあるワクチンまたは接種物が意図される。典型的な弱毒または無毒な腸チフス菌、ネズミチフス菌およびネズミチフス菌−大腸菌ハイブリッドは、上記に提供した引用文献で考察されている。前記のワクチンおよび接種物は、特に、鼻、腸および生殖管の粘膜に感染またはこれらを介して伝播される疾病(例えばインフルエンザ、酵母菌(例えばアスペルギルス(Aspergillus)およびカンジダ(Candida))、ウイルス(例えばポリオ、口蹄疫、A型肝炎)、および細菌(例えばコレラ、サルモネラ、および大腸菌))に対して、および粘膜のIgA反応がIgG全身反応に加えてもしくはIgG全身反応の代わりに所望される場合に使用されることを意図している。
前記腸内細菌は凍結乾燥し、医薬的に許容できる乾燥希釈剤と混合し、摂取のために錠剤またはカプセルを製造し、通常の固相医薬のようにホスト動物に投与または摂取させることができる。さらに、前記細菌ワクチンの水性調製物は、経口投与、経鼻投与、直腸投与または膣投与のような粘膜免疫に使用するために適応させることができる。
目的のキメラ分子粒子を含む植物物質を用いる経口免疫は、遺伝子導入植物組織(例えばニンジンのような根、コメまたはトウモロコシのような種子)を単に摂取することによって達成できる。この事例では、口または胃腸管の水は、免疫で使用される通常用いられる水性媒体を提供し、さらに周囲の植物組織は医薬的に許容できる希釈剤を提供する。
目的のキメラ分子粒子を含む植物物質を用いる経口免疫は、遺伝子導入植物組織(例えばニンジンのような根、コメまたはトウモロコシのような種子)を単に摂取することによって達成できる。この事例では、口または胃腸管の水は、免疫で使用される通常用いられる水性媒体を提供し、さらに周囲の植物組織は医薬的に許容できる希釈剤を提供する。
前記接種物またはワクチンは、ユニットドース製剤として適合可能な態様で、さらに治療的に有効であり免疫誘発できる量で投与される。投与されるべき量は、治療される対象者、前記対象者の免疫系の抗体産生能力および所望される防御の程度に左右される。投与に必要とされる正確な活性成分量は、医師の判定にしたがい、さらに各個体に固有である。しかしながら、適切な投与量の幅は、各個体につき活性成分が数十μgのオーダーである。最初の投与およびブースター接種についての適切な治療スケジュールもまた変動可能であるが、典型的には最初の接種の後で間隔を空けて(数週間または数ヶ月間)注射または他の投与が実施される。
いったん免疫されると、その哺乳類は、リコンビンナントHBcキメラ免疫原が問題の抗原(例えばマラリアワクチンについてはスポロゾイト)と結合する十分な力価の抗体の産生を誘発することができるように十分な期間維持される。例えば抗スポロゾイト抗体産生のための維持期間は典型的には約3から約12週間で、さらにブースター(ワクチンの第二回目の免疫投与)を含むことができる。所望の場合は、第三回目の免疫も最初の免疫後24週から5年に意図される。いったん防御レベルの力価が得られたら、ワクチン接種された哺乳類は好ましくは、約1年から5年の間隔で接種される周期的ブースター免疫によって前記抗体力価でまたは前記力価近くで維持されることが特に意図される。
抗スポロゾイトまたは他の抗体の産生は、免疫された哺乳類から血漿または血清サンプルを得て、適切な抗原[例えばスポロゾイト周囲イムノドミナント抗原(例えば本明細書で用いられるP.ファルシパルム(falciparum)CSタンパク質ペプチド(NANP)5)]と結合する能力について前記血漿または血清中の抗体を、以下で述べるようにELISAアッセイで分析するか、または別の当分野で周知のイムノアッセイ(例えばウェスタンブロット)で分析することによって容易に確認される。
誘発される抗体、例えば抗CS抗体は、接種されたホスト動物から周知の技術を用いて単離し、続いて受動免疫(これもまたよく知られている)のための第二のワクチンとして再構成することができる。同様な技術がヒトのガンマグロブリン免疫に用いられる。例えば、免疫ホストの1人または多数から得られる抗血清を硫安水溶液(典型的には40−50%飽和)で沈澱させ、クロマトグラフィーカラムに固定する抗原として(NANP)5を用いるアフィニティークロマトグラフィーを利用して、前記沈澱抗体をクロマトグラフィーにより精製することができる。したがって、例えば、1つの接種物をウマまたはヒツジで用い、また別の動物(例えばヒト)での受動免疫で使用するためにマラリアに対する抗体産生を誘発することができる。
本発明の別の実施態様は、抗体、活性化T細胞または両者を動物ホストで誘発する方法であり、前記方法は、前記動物ホストに接種物を接種する工程を含む。
前記方法で用いられる接種物は、医薬的に許容できる希釈剤に溶解または分散させた、上記で述べた免疫誘発量のHBcキメラ粒子またはHBcキメラ粒子共役物を含む。前記動物ホストは、抗体または活性化T細胞が誘発されるために十分な期間維持される。前記期間は周知の技術によってアッセイでき、これもまた周知のように典型的には数週から数ヶ月が要求される。前記維持期間の間に前記に述べたような多数の免疫が意図される。
本発明を下記の非制限的実施例によって説明する。
前記方法で用いられる接種物は、医薬的に許容できる希釈剤に溶解または分散させた、上記で述べた免疫誘発量のHBcキメラ粒子またはHBcキメラ粒子共役物を含む。前記動物ホストは、抗体または活性化T細胞が誘発されるために十分な期間維持される。前記期間は周知の技術によってアッセイでき、これもまた周知のように典型的には数週から数ヶ月が要求される。前記維持期間の間に前記に述べたような多数の免疫が意図される。
本発明を下記の非制限的実施例によって説明する。
実施例1:B細胞エピトープ含有キメラ調製物A.プラスミドベクターpKK223−3N、pKK223−3の改変形の調製
プラスミドベクターpKK223−3(Pharmacia)をただ1つのNcoI制限部位を創出して改変し、NcoI−HindIII制限フラグメントとしてHBc遺伝子の挿入およびその後の大腸菌ホスト細胞での発現を可能にした。pKK223−3プラスミドベクターを改変するために、PCRプライマーpKK223−3/433−452−FおよびpKK223−NcoI−mod−R、並びに鋳型としてpKK223−3を用いて新しいSphI−HindIIIフラグメントを調製した。このPCRフラグメントを制限酵素SphIおよびHindIIIで切断して467bpフラグメントを提供し、これをpKK223−3ベクターの4206bpフラグメントに連結し、本来の480bpSphI−HindIIIフラグメントと効率的に置き換えた。得られたプラスミド(pKK223−3N)はしたがって親のプラスミドよりも13bp短く、導入したNcoI部位の上流に改変ヌクレオチド配列を含んでいる(図1を参照されたい。図では点線は存在しない塩基を示している)。最終的なプラスミド、pKK223−3Nは4573bpのサイズを有する。プラスミドpKK223−3Nの制限部位は図1に示されている。さらに、プラスミドpKK223−3Nを作製するためにpKK223−3に対して実施したヌクレオチドの変更は、下記に示すように下線によって表示されている。
pKK223−3/433−452−F
GGTGCATGCAAGGAGATG 配列番号:65
pKK223−NcoI−mod−R
GCGAAGCTTCGGATCccatggTTTTTTCCTCCTTATGTGAAATTGTTATCCGCTC 配列番号:66
プラスミドベクターpKK223−3(Pharmacia)をただ1つのNcoI制限部位を創出して改変し、NcoI−HindIII制限フラグメントとしてHBc遺伝子の挿入およびその後の大腸菌ホスト細胞での発現を可能にした。pKK223−3プラスミドベクターを改変するために、PCRプライマーpKK223−3/433−452−FおよびpKK223−NcoI−mod−R、並びに鋳型としてpKK223−3を用いて新しいSphI−HindIIIフラグメントを調製した。このPCRフラグメントを制限酵素SphIおよびHindIIIで切断して467bpフラグメントを提供し、これをpKK223−3ベクターの4206bpフラグメントに連結し、本来の480bpSphI−HindIIIフラグメントと効率的に置き換えた。得られたプラスミド(pKK223−3N)はしたがって親のプラスミドよりも13bp短く、導入したNcoI部位の上流に改変ヌクレオチド配列を含んでいる(図1を参照されたい。図では点線は存在しない塩基を示している)。最終的なプラスミド、pKK223−3Nは4573bpのサイズを有する。プラスミドpKK223−3Nの制限部位は図1に示されている。さらに、プラスミドpKK223−3Nを作製するためにpKK223−3に対して実施したヌクレオチドの変更は、下記に示すように下線によって表示されている。
pKK223−3/433−452−F
GGTGCATGCAAGGAGATG 配列番号:65
pKK223−NcoI−mod−R
GCGAAGCTTCGGATCccatggTTTTTTCCTCCTTATGTGAAATTGTTATCCGCTC 配列番号:66
B.V1およびV2クローニングベクターの調製
改変HBc149遺伝子(イムノドミナントループ領域に合成dsDNAフラグメントの方向性をもつ挿入を受容することができる)をPCRを用いて構築した。(アミノ酸E77およびD78の間に挿入物を受容したプラスミドをV1と呼び、D78とP79の間に挿入物を受容したプラスミドをV2と呼んだ。)HBc149遺伝子の両半分を増幅させた。2つのPCRプライマー対を用い、そのうちの1つはアミノ末端を増幅し、他方はカルボキシル末端を増幅した。V1の場合、PCR反応の生成物(N−およびC−末端)は両者とも246bpフラグメントで、V2の場合生成物は249bp(N−末端)および243bpフラグメント(C−末端)である。
改変HBc149遺伝子(イムノドミナントループ領域に合成dsDNAフラグメントの方向性をもつ挿入を受容することができる)をPCRを用いて構築した。(アミノ酸E77およびD78の間に挿入物を受容したプラスミドをV1と呼び、D78とP79の間に挿入物を受容したプラスミドをV2と呼んだ。)HBc149遺伝子の両半分を増幅させた。2つのPCRプライマー対を用い、そのうちの1つはアミノ末端を増幅し、他方はカルボキシル末端を増幅した。V1の場合、PCR反応の生成物(N−およびC−末端)は両者とも246bpフラグメントで、V2の場合生成物は249bp(N−末端)および243bpフラグメント(C−末端)である。
調製したN−末端フラグメントをNcoIおよびEcoRIで消化し、さらにC−末端フラグメントをEcoRIおよびHindIIIで消化した。V1およびV2フラグメント対を続いて共通のEcoRIの突出部で一緒に連結した。得られたNcoI−HindIIIフラグメントを続いてpKK223−3Nベクター(これはNcoIおよびHindIIIで消化して調製した)に連結した。
B細胞エピトープをV1およびV2プラスミドに挿入するために、前記プラスミドをEcoRIおよびSacI制限酵素で消化した。続いて、5´EcoRIおよび3´SacI突出部を含む合成dsDNAフラグメントを挿入した。両方の事例(V1およびV2)で、グリシン−イソロイシン(EcoRI)およびグルタミン酸−ロイシン(SacI)アミノ酸対(前記制限部位によってコードされる)は挿入されたB細胞エピトープと接する。前記挿入された制限部位は下記のプライマーで下線を施されている。
B細胞エピトープをV1およびV2プラスミドに挿入するために、前記プラスミドをEcoRIおよびSacI制限酵素で消化した。続いて、5´EcoRIおよび3´SacI突出部を含む合成dsDNAフラグメントを挿入した。両方の事例(V1およびV2)で、グリシン−イソロイシン(EcoRI)およびグルタミン酸−ロイシン(SacI)アミノ酸対(前記制限部位によってコードされる)は挿入されたB細胞エピトープと接する。前記挿入された制限部位は下記のプライマーで下線を施されている。
C.V7クローニングベクターの調製
T細胞エピトープとHBcキメラのC末端との融合を可能にするために、新規なベクター、V7を構築した。固有のEcoRIおよびSacI制限部位をバリン−149とHindIII部位との間に挿入し、EcoRI−HindIII(またはEcoRI−SacI)制限部位への合成dsDNAの方向性をもつ挿入を容易にした。下記のPCRプライマー対を用いて、アミノ末端にNcoI制限部位を、さらにカルボキシル末端にEcoRI、SacIおよびHindIII部位をもつHBc149遺伝子を増幅させた。PCR反応の生成物(479bp)をNcoI/HindIIIで消化し、pKK223−3NでクローニングしてV7を作製した。
T細胞エピトープとHBcキメラのC末端との融合を可能にするために、新規なベクター、V7を構築した。固有のEcoRIおよびSacI制限部位をバリン−149とHindIII部位との間に挿入し、EcoRI−HindIII(またはEcoRI−SacI)制限部位への合成dsDNAの方向性をもつ挿入を容易にした。下記のPCRプライマー対を用いて、アミノ末端にNcoI制限部位を、さらにカルボキシル末端にEcoRI、SacIおよびHindIII部位をもつHBc149遺伝子を増幅させた。PCR反応の生成物(479bp)をNcoI/HindIIIで消化し、pKK223−3NでクローニングしてV7を作製した。
T細胞エピトープを挿入するために、プラスミド(V7)をEcoRI/HindIII(またはEcoRI−SacI)で消化し、さらにEcoRI/HindIII(またはEcoRI/SacI)突出部を有する合成dsDNAフラグメントをV7に連結した。全てのV7構築物について、天然のHBcの最後のアミノ酸(バリン−149)および挿入T細胞エピトープの最初のアミノ酸を、EcoRI制限部位を形成するヌクレオチドによってコードされるグリシン−イソロイシンジペプチドによって分離させる。EcoRI/SacIに挿入されたエピトープの場合、終止コドンの前のT細胞エピトープの後にさらに別のグルタミン酸−ロイシン残基が存在し、これはSacI部位によって提供される。表示のプライマー中の制限部位にもまた下線が施されている。
HBc149/NcoI−F
5´−TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA 配列番号:67
HBc149/SacI−EcoRI−H3−R
5´−CGCAAGCTTAGAGCTCTTGAATTCCAACAACAGTAGTCTCCG 配列番号:75
HBc149/NcoI−F
5´−TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA 配列番号:67
HBc149/SacI−EcoRI−H3−R
5´−CGCAAGCTTAGAGCTCTTGAATTCCAACAACAGTAGTCTCCG 配列番号:75
D.V12発現構築物の調製
V12ベクター(アミノ酸78と79の間にB細胞エピトープを含み、バリン149の下流にT細胞エピトープを含む)をV2およびV7ベクターから構築した。EcoRI/HindIIIに挿入されたAT細胞エピトープを含むV7ベクターのカルボキシル末端を2つのPCRプライマー(HBc−P79/SacI−FおよびpK223−2/4515−32R)を用いて増幅し、アミノ酸79−149+T細胞エピトープ(SacIおよびHindIII制限部位に接する)と一致するdsDNAを提供した。
前記PCR生成物をSacIおよびHindIIIで切断し、続いて所望のV2ベクター(同じ2つの酵素で切断して調製される)でクローニングした。表示したPCRプライマーは、HBc遺伝子のアミノ酸149の後に存在するT細胞エピトープとは関係なく、全V7遺伝子のカルボキシル末端の増幅が容易である。
V12ベクター(アミノ酸78と79の間にB細胞エピトープを含み、バリン149の下流にT細胞エピトープを含む)をV2およびV7ベクターから構築した。EcoRI/HindIIIに挿入されたAT細胞エピトープを含むV7ベクターのカルボキシル末端を2つのPCRプライマー(HBc−P79/SacI−FおよびpK223−2/4515−32R)を用いて増幅し、アミノ酸79−149+T細胞エピトープ(SacIおよびHindIII制限部位に接する)と一致するdsDNAを提供した。
前記PCR生成物をSacIおよびHindIIIで切断し、続いて所望のV2ベクター(同じ2つの酵素で切断して調製される)でクローニングした。表示したPCRプライマーは、HBc遺伝子のアミノ酸149の後に存在するT細胞エピトープとは関係なく、全V7遺伝子のカルボキシル末端の増幅が容易である。
本アプローチの普遍性における1つの例外は、Pf−CS(C17A)変異を含むV12構築物の調製で、前記は現存のV12構築物から調製した。本事例では、V12構築物をHBc149/NcoI−F(配列番号:67)およびミスマッチ逆方向PCRプライマー(配列番号:145)(前記はC17A変異を容易にした)で増幅した。得られたPCR生成物をNcoIおよびHindIIIで消化し、pKK223−3N(先に同じ酵素で切断してある)でクローニングした。制限部位には下線が施されてある。
HBc−P79/SacI−F
5´−CGCGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG 配列番号:76
pKK223−2/4515−32R
5´−GTATCAGGCTGAAAATC 配列番号:77
HBc−P79/SacI−F
5´−CGCGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG 配列番号:76
pKK223−2/4515−32R
5´−GTATCAGGCTGAAAATC 配列番号:77
E.V2に挿入されるP.ファルシパルム(falciparum)CS−リピートB細胞エピトープ
V2およびV7構築物の場合、問題のB細胞エピトープ(V2)およびT細胞エピトープ(V7)をコードする合成dsDNAフラグメントをEcoRI/SacI制限部位に挿入した。合成dsDNAフラグメント(問題のBおよびT細胞エピトープをコードする)を、相補性一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを等モル濃度で混合し、95℃で5分加熱し、続いて−1℃/分の速度で室温まで冷却することによって調製した。本アニーリング反応をTE緩衝液中で実施した。前記二本鎖DNAを、上記に示したコードエピトープ配列とともに下記に示す。ポンド記号(#)は、終止コドンの存在を表示するために以下のアミノ酸残基配列のいくつかで用いられる。
V2およびV7構築物の場合、問題のB細胞エピトープ(V2)およびT細胞エピトープ(V7)をコードする合成dsDNAフラグメントをEcoRI/SacI制限部位に挿入した。合成dsDNAフラグメント(問題のBおよびT細胞エピトープをコードする)を、相補性一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを等モル濃度で混合し、95℃で5分加熱し、続いて−1℃/分の速度で室温まで冷却することによって調製した。本アニーリング反応をTE緩衝液中で実施した。前記二本鎖DNAを、上記に示したコードエピトープ配列とともに下記に示す。ポンド記号(#)は、終止コドンの存在を表示するために以下のアミノ酸残基配列のいくつかで用いられる。
B.切端およびC−末端システイン付加のためのPCRプライマー
HBcキメラ遺伝子のC−末端を改変(システイン残基の付加またはHBc遺伝子の長さの変更により)するために、C−末端の所望の改変を指令するHBc/NcoI−Fプライマーおよび逆方向プライマー(例えばHBc149+C/HindIII−R)とともにHBc149を鋳型として用いてPCR反応を実施した。PCR生成物はNcoIおよびHindIIIで消化し、pKK223−3N内の同じ制限部位でクローニングした。
HBcキメラ遺伝子のC−末端を改変(システイン残基の付加またはHBc遺伝子の長さの変更により)するために、C−末端の所望の改変を指令するHBc/NcoI−Fプライマーおよび逆方向プライマー(例えばHBc149+C/HindIII−R)とともにHBc149を鋳型として用いてPCR反応を実施した。PCR生成物はNcoIおよびHindIIIで消化し、pKK223−3N内の同じ制限部位でクローニングした。
実施例3:アッセイ方法
A.抗原性
1.粒子のELISA
精製粒子をコーティング緩衝液(50mM重炭酸ナトリウム、pH9.6)中で10μg/mLの濃度に希釈し、ELISAストリップのウェルを被覆した(50μL/ウェル)。前記ELISAストリップを室温で一晩(約18時間)インキュベートした。次の朝、前記ウェルをELISA洗浄緩衝液(リン酸緩衝食塩水(PBS)、pH7.4、0.05%トゥイーン(登録商標)−20)で洗浄し、PBS中の3%BSA(75μL/ウェル)で1時間ブロックした。ELISAストリップを乾燥させ必要なときまで−20℃で保存した。
A.抗原性
1.粒子のELISA
精製粒子をコーティング緩衝液(50mM重炭酸ナトリウム、pH9.6)中で10μg/mLの濃度に希釈し、ELISAストリップのウェルを被覆した(50μL/ウェル)。前記ELISAストリップを室温で一晩(約18時間)インキュベートした。次の朝、前記ウェルをELISA洗浄緩衝液(リン酸緩衝食塩水(PBS)、pH7.4、0.05%トゥイーン(登録商標)−20)で洗浄し、PBS中の3%BSA(75μL/ウェル)で1時間ブロックした。ELISAストリップを乾燥させ必要なときまで−20℃で保存した。
粒子の抗原性を決定するために、抗血清をPBS中の1%BSAを用いて希釈し、50μL/ウェルを抗原被覆ELISAウェルに添加した。血清を1時間インキュベートし、ELISA洗浄緩衝液で洗浄し、抗マウス(IgG)−HRP(The Binding Site, San Diego, CA; HRP=セイヨウワサビペルオキシダーゼ)共役物(50μL/ウェル)または他の適切な抗体を用いて30分間反応させた。ELISA洗浄緩衝液で洗浄した後、前記反応をTM青色基質(50μL/ウェル)を添加して可視化した。10分後、1NのH2SO4(100μL/ウェル)を添加して反応を停止し、450nmに設定したELISAプレート読取装置で読み取った。
2.合成ペプチドのELISA
20アミノ酸残基の合成ペプチド、(NANP)5をコーティング緩衝液(50mM重炭酸ナトリウム、pH9.6)で2μg/mLの濃度に希釈し、ELISAストリップのウェルを被覆した(50μL/ウェル)。フード内で排気をonにして一晩(約18時間)インキュベートすることによって、ペプチドをウェル上で乾燥させた。次の朝、前記ウェルをELISA洗浄緩衝液(リン酸緩衝食塩水、pH7.4、0.05%トゥイーン(登録商標)−20)で洗浄し、PBS中の3%BSA(75μL/ウェル)で1時間ブロックした。ELISAストリップを乾燥させ必要なときまで−20℃で保存した。
20アミノ酸残基の合成ペプチド、(NANP)5をコーティング緩衝液(50mM重炭酸ナトリウム、pH9.6)で2μg/mLの濃度に希釈し、ELISAストリップのウェルを被覆した(50μL/ウェル)。フード内で排気をonにして一晩(約18時間)インキュベートすることによって、ペプチドをウェル上で乾燥させた。次の朝、前記ウェルをELISA洗浄緩衝液(リン酸緩衝食塩水、pH7.4、0.05%トゥイーン(登録商標)−20)で洗浄し、PBS中の3%BSA(75μL/ウェル)で1時間ブロックした。ELISAストリップを乾燥させ必要なときまで−20℃で保存した。
粒子の抗体抗原性を決定するために、抗血清(モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体)をPBS中の1%BSAを用いて希釈し、50μL/ウェルを抗原被覆ELISAウェルに添加した。血清を1時間インキュベートし、ELISA洗浄緩衝液で洗浄し、抗マウス(IgG)−HRP(上記のとおり50μL/ウェル)または他の適切な抗体を用いて30分間反応させ、ELISA洗浄緩衝液で洗浄し、続いてTM青色基質(50μL/ウェル)を添加して可視化した。10分後、1NのH2SO4(100μL/ウェル)を添加して反応を停止し、450nmに設定したELISAプレート読取装置で読み取った。
B.粒子の免疫原性
粒子の免疫原性をアッセイするために、マウスをフロイント完全アジュバント中の20μgの粒子で腹腔内免疫し、さらに4週間してフロイント不完全アジュバント中の10μgでブースター免疫した。マウスから2、4、6および8週間で採血した。
C.スポロゾイトのIFA
グルタルアルデヒド固定P.ファルシパルム(falciparum)スポロゾイトおよびFITC−標識抗マウスIgG(ガンマ鎖特異的)(Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD)を用いて間接免疫蛍光アッセイ(IFA)を実施し、結合抗体を検出した(Munesinghe et al. Eur. J. Immunol. 1991, 21:3015−3020)。
使用したスポロゾイトは、in vitro培養で得たP.ファルシパルム(NF54単離株)の生殖母細胞を与えて感染させたハマダラカ(Anopheles)の唾液腺から切り出した。
粒子の免疫原性をアッセイするために、マウスをフロイント完全アジュバント中の20μgの粒子で腹腔内免疫し、さらに4週間してフロイント不完全アジュバント中の10μgでブースター免疫した。マウスから2、4、6および8週間で採血した。
C.スポロゾイトのIFA
グルタルアルデヒド固定P.ファルシパルム(falciparum)スポロゾイトおよびFITC−標識抗マウスIgG(ガンマ鎖特異的)(Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD)を用いて間接免疫蛍光アッセイ(IFA)を実施し、結合抗体を検出した(Munesinghe et al. Eur. J. Immunol. 1991, 21:3015−3020)。
使用したスポロゾイトは、in vitro培養で得たP.ファルシパルム(NF54単離株)の生殖母細胞を与えて感染させたハマダラカ(Anopheles)の唾液腺から切り出した。
実施例4:リコンビナントキメラHBc粒子の発現
A.免疫原性に対する挿入部位の影響
抗体力価(希釈の逆数)は、アミノ酸E77/D78(配列番号:260および261)またはD78/P79(配列番号:259および260)の間のどちらかに挿入された、またはループ置換アプローチ(CS−2)(以下の文献で考察されている(フロイントの完全アジュバントを使用):Schodel et al. (1994) J. Exp. Med., 180:1037−1046)を用いることによって挿入されたP.f−CS・B細胞エピトープ(NANP)4を含むHBc粒子で免疫したマウスについて測定した。マウスを1回接種量20μg(IP)で上記のようにアジュバントともにただ1回免疫し、固定した(NANP)5合成ペプチドを用いてELISAで決定した。これらの実験の結果は下記表1に示す。
表1
*Schodel et al. (1994) J. Exp. Med. 180:1037−104
A.免疫原性に対する挿入部位の影響
抗体力価(希釈の逆数)は、アミノ酸E77/D78(配列番号:260および261)またはD78/P79(配列番号:259および260)の間のどちらかに挿入された、またはループ置換アプローチ(CS−2)(以下の文献で考察されている(フロイントの完全アジュバントを使用):Schodel et al. (1994) J. Exp. Med., 180:1037−1046)を用いることによって挿入されたP.f−CS・B細胞エピトープ(NANP)4を含むHBc粒子で免疫したマウスについて測定した。マウスを1回接種量20μg(IP)で上記のようにアジュバントともにただ1回免疫し、固定した(NANP)5合成ペプチドを用いてELISAで決定した。これらの実験の結果は下記表1に示す。
表1
*Schodel et al. (1994) J. Exp. Med. 180:1037−104
免疫原性に対するまた別の比較は、NANP・CSリピートエピトープの挿入部位についてBALB/cマウスを用いて実施した。SchodelらのCS−2粒子によって誘発された抗体力価を、同じ(NANP)4B細胞エピトープ(HBc78位および79位の間に挿入)を用い、されに免疫原として上記V2.Pf1粒子を用いて達成される力価と比較した。一次免疫(1°)後4週間、およびブースター免疫(2°)後2週間で血清を調べた。結果は下記表2に示す。
表2
*Schodel et al. (1994) J. Exp. Med. 180:1037−104
免疫原性に対するNANP・CSリピートエピトープの挿入部位の比較をB10.Sマウスを用いて実施し、結果を表3に示す。
表3
*Schodel et al. (1994) J. Exp. Med. 180:1037−104
表2
*Schodel et al. (1994) J. Exp. Med. 180:1037−104
免疫原性に対するNANP・CSリピートエピトープの挿入部位の比較をB10.Sマウスを用いて実施し、結果を表3に示す。
表3
*Schodel et al. (1994) J. Exp. Med. 180:1037−104
繰り返されたNANP配列とともに、マイナーB細胞エピトープ、NANPNVDP(配列番号:167)を含むHBcキメラ粒子の免疫原性に対する影響を調べた(ELISA、F1マウス)。HBc78位と79位の間に挿入された配列NANPNVDP(NANP)3NVDP(配列番号:21;V12.Pf3)を含むHbcキメラを発現させた。得られたELISAのデータを、4量体リピート(NANP)4B細胞エピトープ(V12.Pf1)または同じ位置のマイナーB細胞エピトープ2量体(V12.Pf7)を用いて得た力価と比較した。前記3つのキメラの各々は、C−末端配列としてP.ファルシパルムの普遍T細胞エピトープに結合されてある141位から149位のHBc配列を含むドメインIVを含んでいた。上記のような一次免疫およびブースター免疫およびアジュバントを用いた前記実験の結果は下記の表4に示されている。
表4
表4
「マイナー」リピートエピトープを含むことによって20倍を越える免疫原性の増加が観察されることは予期せぬことであった。V12.Pf3は大腸菌では良好な発現が得られなかったので、Pf3と同様な抗原性を有するが、発現レベルを高めたPf3エピトープの変種NANPNVDP(NANP)3NVDP(配列番号:21)を、下記に示すように構築した。免疫原性について構築物3.1および3.2のみを調べた。
リコンビナントキメラHBc/P.ファルシパルム粒子の相対的な発現レベルおよびCSエピトープ(NANP)4および(NANPNVDP)に特異的なモノクローナル抗体の場合の抗原性を下記表5に示す。相対的発現レベルは以下のとおりである:****=75−125mg/L;***=50−75mg/L;**=25−50mg/L。抗原性は、モノクローナル抗体の終末力価の希釈によって決定した((NANP)4の場合はMoAb2A10;NANPNVDPの場合はMoAb2B6D8;およびP.vivaxRpt.MoAb2F2はE. Nardin(New York University Medical Center)によって提供された)。データは、最低の力価を1であらわすことができるように標準化した。例えば、V12.Pf3は、(NANP)4特異的モノクローナル抗体ではV12.Pf3.10よりも抗原性は165倍で、NANPNVDP特異的モノクローナル抗体ではV12.Pf3.2よりも抗原性は26倍高かった。N.D.=抗体結合検出不能。(注記:V12.Pf3.7は変異のために発現ベクターで発現させることができなかった。同様な構築物が抗原性を持たなかったので、前記について更なる調査を実施せず、したがって再クローニングも意味のあることではなかった。)
Pf3エピトープの変種を含むそれぞれのHBcキメラ粒子の免疫原性を上記のようにアッセイした。血清は、一次免疫(1°)後4週間および二次免疫(2°)後4週間でELISAで調べた。得られたデータは下記の表6に示されている。表6では、キメラの「名称」およびB細胞免疫原の対応する配列は上記で示したとおりである。
表6
驚くべきことに、NANPNVDPリピートのコピーを1つ含む型(V12.Pf3.1)は、2つのコピーを含む型(V12.Pf3)と、NANPモノクローナル抗体での抗原性は5倍低いにもかかわらず同じ免疫原性(免疫誘発性)を有する。
表6
驚くべきことに、NANPNVDPリピートのコピーを1つ含む型(V12.Pf3.1)は、2つのコピーを含む型(V12.Pf3)と、NANPモノクローナル抗体での抗原性は5倍低いにもかかわらず同じ免疫原性(免疫誘発性)を有する。
B.発現の失敗
いくつかのさらに別のエピトープをHBcループ(ドメインII)の78位および79位の間(V2.Pf1のように)に配置することを試みたが、理由は不明であるが発現させることができなかった。下記の表7では、HBcキメラのD78およびP79の間(V2)に挿入したとき発現できなかったこれらエピトープが列挙されている。
いくつかのさらに別のエピトープをHBcループ(ドメインII)の78位および79位の間(V2.Pf1のように)に配置することを試みたが、理由は不明であるが発現させることができなかった。下記の表7では、HBcキメラのD78およびP79の間(V2)に挿入したとき発現できなかったこれらエピトープが列挙されている。
実施例5:280/260吸収比の決定
タンパク質サンプルをリン酸緩衝食塩水(PBS)(PH7.4)を用いて0.1から0.3mg/mLの濃度に希釈した。PBSを用いて分光光度計のブランクを決定し、タンパク質サンプルの吸収を260nmおよび280nmの波長で測定した。続いて280nmで測定したサンプルの吸収値を260nmで測定した同じサンプルの吸収値で割って、あるサンプルの280/260吸収比を得た。天然の粒子(HBc183)、残基149位の後が切断されて切り縮められたHBc粒子(HBc149)および本明細書の他の場所で特定されているいくつかのキメラを含む数サンプルについて得られた比率を下記の表8に示す。
表8
タンパク質サンプルをリン酸緩衝食塩水(PBS)(PH7.4)を用いて0.1から0.3mg/mLの濃度に希釈した。PBSを用いて分光光度計のブランクを決定し、タンパク質サンプルの吸収を260nmおよび280nmの波長で測定した。続いて280nmで測定したサンプルの吸収値を260nmで測定した同じサンプルの吸収値で割って、あるサンプルの280/260吸収比を得た。天然の粒子(HBc183)、残基149位の後が切断されて切り縮められたHBc粒子(HBc149)および本明細書の他の場所で特定されているいくつかのキメラを含む数サンプルについて得られた比率を下記の表8に示す。
表8
実施例6:切端HBc粒子のC−末端システイン
A.ハイブリッドHBc粒子のC−末端へのシステイン残基の付加
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、ハイブリッドHBc粒子を発現する遺伝子を容易に変異させてシステインまたはシステイン含有ペプチドをHBcのC−末端に導入することができる。例えば配列番号:148のPCRオリゴヌクレオチドプライマーを、適切な第二のプライマーと一緒に用いてハイブリッドHBc遺伝子を増幅させ、コドンV149および終止コドンの間にシステインコドンを取り込ませることができる。
B型肝炎コア粒子を183(または185、ウイルスの型による)から140に端を切断して切り縮め、球状ウイルス様粒子に会合する能力は維持させることができる。多くのグループがアミノ酸149まで切り縮めた粒子を用いた。なぜならば、アミノ酸150はアルギニン富裕C−末端ドメインの最初のアルギニン残基を表すからである。
A.ハイブリッドHBc粒子のC−末端へのシステイン残基の付加
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、ハイブリッドHBc粒子を発現する遺伝子を容易に変異させてシステインまたはシステイン含有ペプチドをHBcのC−末端に導入することができる。例えば配列番号:148のPCRオリゴヌクレオチドプライマーを、適切な第二のプライマーと一緒に用いてハイブリッドHBc遺伝子を増幅させ、コドンV149および終止コドンの間にシステインコドンを取り込ませることができる。
B型肝炎コア粒子を183(または185、ウイルスの型による)から140に端を切断して切り縮め、球状ウイルス様粒子に会合する能力は維持させることができる。多くのグループがアミノ酸149まで切り縮めた粒子を用いた。なぜならば、アミノ酸150はアルギニン富裕C−末端ドメインの最初のアルギニン残基を表すからである。
HBc粒子を安定化させる単一システイン残基の能力を評価するために、システイン残基のコドンを以前に記載した技術を用いて、HBcアミノ酸残基V149およびキメラHBc分子(残基78と79の間に挿入された(NANP)4マラリアB細胞エピトープを含む(本明細書ではV2.Pf1と称する))の終止コドンの間に挿入し、キメラ分子および粒子(V2.Pf1+Cと称する)を生成した。本キメラ粒子(V2.Pf1+C;配列番号:264および265)の熱安定性(37℃)は、挿入システインを欠く同様なキメラ粒子(V2.Pf1)と比較したとき図3に示されているように劇的に増加することが判明した。
システインをV2構築物のC−末端に付加して調製したベクターおよび発現生成物は、本明細書では時にV16ベクターまたは発現生成物と称されることを特記する。
図3で容易に認められるように、2つの粒子は同様にスタートするが、37℃で14日後に、システイン含有粒子のSDSゲル上のバンドは、Cys残基を欠く粒子と比較して少なく、安定性が強化されていることを示唆した。
システインをV2構築物のC−末端に付加して調製したベクターおよび発現生成物は、本明細書では時にV16ベクターまたは発現生成物と称されることを特記する。
図3で容易に認められるように、2つの粒子は同様にスタートするが、37℃で14日後に、システイン含有粒子のSDSゲル上のバンドは、Cys残基を欠く粒子と比較して少なく、安定性が強化されていることを示唆した。
B.熱安定性プロトコル
50mMのNaPO4(pH6.8)を用いて精製粒子を1mg/mLの濃度に希釈し、アジ化ナトリウムを最終濃度0.02%に添加して細菌の増殖を抑制した。粒子を37℃でインキュベートし、部分標本を図に表示した時間に採取した。サンプルをSDS−PAGEサンプル緩衝液(還元性)と混合し、15%SDS−PAGEゲルで泳動した。クーマシーブルーでゲルを染色し続いて分析した。
50mMのNaPO4(pH6.8)を用いて精製粒子を1mg/mLの濃度に希釈し、アジ化ナトリウムを最終濃度0.02%に添加して細菌の増殖を抑制した。粒子を37℃でインキュベートし、部分標本を図に表示した時間に採取した。サンプルをSDS−PAGEサンプル緩衝液(還元性)と混合し、15%SDS−PAGEゲルで泳動した。クーマシーブルーでゲルを染色し続いて分析した。
実施例7:HBcのC−末端に融合させたペプチドのC−末端のシステイン
末端システイン残基が150以外の位置で安定化作用を誘発することができるのか否かをさらに調べるために、B型肝炎コアタンパク質のThエピトープ(アミノ酸残基74−87)を、イムノドミナントループにマラリアエピトープを含むHBcのC−末端に融合させた。このThエピトープはシステイン残基を含まず、したがってCys残基をC−末端に付加した(下線付き「C」)。コントロールはシステインを欠く同じエピトープであった。これらの粒子はV2.Pf1をV7.HBc74−87(およびV7.HBc74−87+C)と結合させて作製した。V7構築物は、HBc−P79/SacI−Fプライマー(配列番号:76)およびpKK223−2/4515−32−R(配列番号:77)を用いてPCR増幅させた。前記生成物をSacIおよびHindIIIで切断し、前記SacI/HindIIIフラグメントを同じ酵素で切断したV2.Pf1に連結した。
下記の表9は、野生型HBcタンパク質に存在する天然の配列およびHBc149+C粒子に対して、C−末端融合物HBc(74−87)およびHBc(74−87)+Cのアミノ酸配列を示している。「Cysシフト」とは、野生型タンパク質におけるシステインの位置に対して導入されたシステインの位置で、前記システインは最後の残基である(183位)。
末端システイン残基が150以外の位置で安定化作用を誘発することができるのか否かをさらに調べるために、B型肝炎コアタンパク質のThエピトープ(アミノ酸残基74−87)を、イムノドミナントループにマラリアエピトープを含むHBcのC−末端に融合させた。このThエピトープはシステイン残基を含まず、したがってCys残基をC−末端に付加した(下線付き「C」)。コントロールはシステインを欠く同じエピトープであった。これらの粒子はV2.Pf1をV7.HBc74−87(およびV7.HBc74−87+C)と結合させて作製した。V7構築物は、HBc−P79/SacI−Fプライマー(配列番号:76)およびpKK223−2/4515−32−R(配列番号:77)を用いてPCR増幅させた。前記生成物をSacIおよびHindIIIで切断し、前記SacI/HindIIIフラグメントを同じ酵素で切断したV2.Pf1に連結した。
下記の表9は、野生型HBcタンパク質に存在する天然の配列およびHBc149+C粒子に対して、C−末端融合物HBc(74−87)およびHBc(74−87)+Cのアミノ酸配列を示している。「Cysシフト」とは、野生型タンパク質におけるシステインの位置に対して導入されたシステインの位置で、前記システインは最後の残基である(183位)。
実施例8:HBcハイブリッドのC−末端に融合させたペプチド内に存在するシステイン
システイン残基がHBc遺伝子の最後のアミノ酸であること(野生型HBcのように)が絶対的な要件であるのか、またはシステインは導入したC−末端配列中で内在的に機能することができるのかを調べるために実験を行った。
20残基の普遍的T細胞エピトープに対応するペプチドをHBcキメラ(V2.Pf1;配列番号:266および267)に融合させた。前記ペプチドは、マラリア寄生虫、プラスモジウム・ファルシパルムのCSタンパク質に由来し、前記ペプチドの17位またはCSタンパク質の342位にシステインを含んでいる(Calvo−Calle et al., J. Immunol., 159(3):1362−1373(1997))。このキメラは1位から149位のHBc配列を含み、アミノ酸78と79の間に挿入されたP.ファルシパルムB細胞エピトープ、(NANP)4を有する。したがって、このHBc構築物のドメインIは残基1−75を含み;ドメインIIは、残基78と79の間に挿入された(NANP)4エピトープを有する残基76−85を含み(制限部位を構成する4つの残基とともに);ドメインIIIは残基86−135を含み;さらにドメインIVは残基136−149プラス20残基のP.ファルシパルムT細胞エピトープおよびEcoRIクローニング部位(GI)に由来する2つの残基を含んでいた。
システイン残基がHBc遺伝子の最後のアミノ酸であること(野生型HBcのように)が絶対的な要件であるのか、またはシステインは導入したC−末端配列中で内在的に機能することができるのかを調べるために実験を行った。
20残基の普遍的T細胞エピトープに対応するペプチドをHBcキメラ(V2.Pf1;配列番号:266および267)に融合させた。前記ペプチドは、マラリア寄生虫、プラスモジウム・ファルシパルムのCSタンパク質に由来し、前記ペプチドの17位またはCSタンパク質の342位にシステインを含んでいる(Calvo−Calle et al., J. Immunol., 159(3):1362−1373(1997))。このキメラは1位から149位のHBc配列を含み、アミノ酸78と79の間に挿入されたP.ファルシパルムB細胞エピトープ、(NANP)4を有する。したがって、このHBc構築物のドメインIは残基1−75を含み;ドメインIIは、残基78と79の間に挿入された(NANP)4エピトープを有する残基76−85を含み(制限部位を構成する4つの残基とともに);ドメインIIIは残基86−135を含み;さらにドメインIVは残基136−149プラス20残基のP.ファルシパルムT細胞エピトープおよびEcoRIクローニング部位(GI)に由来する2つの残基を含んでいた。
前記融合C−末端ペプチドは、長さが20アミノ酸酸残基で(ウイルスのサブタイプより12または14アミノ酸短い)、野生型より8pH単位低い予想pI値を有する。システイン以外のアミノ酸によって付与される可能性がある潜在的安定化作用を最小限にするために、17位のシステインの代わりにアラニンを有する(同様な)コントロール構築物を作製した(下記表10を参照されたい)。
この配列の安定化作用の評価を簡単にするために、以前に37℃で容易に分解することが示された粒子(V2.Pf1)のC−末端に前記ペプチドを融合させ、それぞれV2.Pf1+Pf/CS−UTCおよびV2.Pf1+Pf/CS−UTC(C17A)と称されるHBcキメラを作製した。28日間に及ぶ熱安定性実験(以前に記載したように)の結果は図4に示されている。
この配列の安定化作用の評価を簡単にするために、以前に37℃で容易に分解することが示された粒子(V2.Pf1)のC−末端に前記ペプチドを融合させ、それぞれV2.Pf1+Pf/CS−UTCおよびV2.Pf1+Pf/CS−UTC(C17A)と称されるHBcキメラを作製した。28日間に及ぶ熱安定性実験(以前に記載したように)の結果は図4に示されている。
本実験の結果によって、P.ファルシパルムのCSタンパク質に由来するT細胞エピトープ内のシステインの存在は、実験期間中の粒子の安定性に必要であることが示され、さらに前記システインがエピトープのC−末端に存在する絶対的な必要性は存在しないことが示された。下記表は、野生型に存在する天然の配列に対して17位にシステインまたはアラニンを有するC−末端融合物のアミノ酸配列を示している。
実施例9:P.ビバックス(vivax)HBcキメラ
P.ファルシパルムB細胞およびT細胞免疫原を含むHBcキメラに関する上記で述べた実験に続いて、P.ビバックスのCSタンパク質の配列を用いて同様な実験を行った。模範的な構築物は下記の表11に示されている。
P.ファルシパルムB細胞およびT細胞免疫原を含むHBcキメラに関する上記で述べた実験に続いて、P.ビバックスのCSタンパク質の配列を用いて同様な実験を行った。模範的な構築物は下記の表11に示されている。
リピートの多様性を論じるために、以下の種々のエピトープをアミノ酸78と79との間でHBcに挿入するために用いた。
1.I型CSリピート
PAGDRADGQPAGDRAAGQPAG(P.ビバックス−1A型)−−配列番号:197。この型のエピトープは粒子を形成できなかった。
DRAAGQPAGDRADGQPAG(P.ビバックス−1B型)−−配列番号:198。この型のエピトープ(側面に接する二ペプチドクローニング部位の残部を含む)は粒子を形成することができ、V2.PV−TIBと称される。P.ビバックスI型の免疫原をクローニングすることができ、これを発現、精製し、さらにその免疫原性(免疫誘発性)をマウスでテストした。前記マウスの実験結果は下記の表12に示す。
1.I型CSリピート
PAGDRADGQPAGDRAAGQPAG(P.ビバックス−1A型)−−配列番号:197。この型のエピトープは粒子を形成できなかった。
DRAAGQPAGDRADGQPAG(P.ビバックス−1B型)−−配列番号:198。この型のエピトープ(側面に接する二ペプチドクローニング部位の残部を含む)は粒子を形成することができ、V2.PV−TIBと称される。P.ビバックスI型の免疫原をクローニングすることができ、これを発現、精製し、さらにその免疫原性(免疫誘発性)をマウスでテストした。前記マウスの実験結果は下記の表12に示す。
2.II型CSリピート
II型については、この実験は、II型のエピトープに4つの異なる型が存在するために複雑になる。前記の型は5位にGまたはDを、さらに6位にNまたはDを含んでいる(Qari et al., Mol. Biochem. Parasitol., (1992) 55(1−2):105−113)。したがって、成功の可能性を最大にするために必要な4つの可能なリピート配列(GN、GD、DNおよびDD)が存在する。第一の、かつ好ましいアプローチは、下記に下線で示したように4つのリピートを全て含む単一ハイブリッド粒子を調製することである。このアプローチを用いてI型リピートの多様性を論じることに成功した。
前記構築物の各々は側面に接する二ペプチドクローニング部位の残部を含んでいる。
ANGAGNQPGANGAGDQPGANGADNQPGANGADDQPG
(P.ビバックス−II型−GN/GD/DN/DD)配列番号:199。
上記の配列をクローニングし、発現させ、C−末端に改変を含まないHBcキメラとして精製した。
II型については、この実験は、II型のエピトープに4つの異なる型が存在するために複雑になる。前記の型は5位にGまたはDを、さらに6位にNまたはDを含んでいる(Qari et al., Mol. Biochem. Parasitol., (1992) 55(1−2):105−113)。したがって、成功の可能性を最大にするために必要な4つの可能なリピート配列(GN、GD、DNおよびDD)が存在する。第一の、かつ好ましいアプローチは、下記に下線で示したように4つのリピートを全て含む単一ハイブリッド粒子を調製することである。このアプローチを用いてI型リピートの多様性を論じることに成功した。
前記構築物の各々は側面に接する二ペプチドクローニング部位の残部を含んでいる。
ANGAGNQPGANGAGDQPGANGADNQPGANGADDQPG
(P.ビバックス−II型−GN/GD/DN/DD)配列番号:199。
上記の配列をクローニングし、発現させ、C−末端に改変を含まないHBcキメラとして精製した。
第二のアプローチは、2つのハイブリッド粒子を調製することで、それによって各粒子は変種エピトープのうちの2つを含む(下記を参照されたい)。このアプローチは、発現中に「混合」粒子の生成を指令するか、または製造に続いてII型粒子の混合を指令するためにより複雑な発現系を必要とするので好ましさは劣る。
ANGAGNQPGANGAGDQPG
(P.ビバックス−II型−GN/GD) 配列番号:200
QANGADNQPGANGADDQPG
(P.ビバックス−II型−DN/DD) 配列番号:201
CGCGAATTCAAGCGAACGGCGCCGATAATCAGCCGGCGGGTGCA
(P.ビバックスIIB型−ER1−wt−F) 配列番号:146
ANGAGNQPGANGAGDQPG
(P.ビバックス−II型−GN/GD) 配列番号:200
QANGADNQPGANGADDQPG
(P.ビバックス−II型−DN/DD) 配列番号:201
CGCGAATTCAAGCGAACGGCGCCGATAATCAGCCGGCGGGTGCA
(P.ビバックスIIB型−ER1−wt−F) 配列番号:146
3.III型(「ビバックス様」)CSリピート
第三のP.ビバックスCSエピトープ(これは他の2つとは極めて異なっている)は、アミノ酸の多様性と関連していない(下記を参照されたい)(Qari et al., Lancet, 341(8848):780−783(1993))。前記配列をHBc発現系でクローニングし、側面に接する二ペプチドクローニング部位の残部を含むハイブリッドを産生した。
APGANQEGGAAAPGANQEGGAA
(P.ビバックス−III型) 配列番号:202
4.HBcC−末端のT細胞エピトープ
P.ビバックスThエピトープ(Pv−UTC;YLDKVRATVGTEWTPCSVT;配列番号:196)のHBcおよびHBcハイブリッドへの挿入もまた合成DNAフラグメント(Synthetic Genetics, San Diego, CA)を用いて実施した。しかしながら、B細胞エピトープと異なり(B細胞エピトープはHBc遺伝子のイムノドミナントループに挿入される)、T細胞エピトープはHBc遺伝子のC−末端と融合される。BおよびThエピトープの両方をHBcに挿入するために、以前に考察したクローニングベクターを用いた。C−末端にPv−UTCを発現している粒子もまた作製することができた。
第三のP.ビバックスCSエピトープ(これは他の2つとは極めて異なっている)は、アミノ酸の多様性と関連していない(下記を参照されたい)(Qari et al., Lancet, 341(8848):780−783(1993))。前記配列をHBc発現系でクローニングし、側面に接する二ペプチドクローニング部位の残部を含むハイブリッドを産生した。
APGANQEGGAAAPGANQEGGAA
(P.ビバックス−III型) 配列番号:202
4.HBcC−末端のT細胞エピトープ
P.ビバックスThエピトープ(Pv−UTC;YLDKVRATVGTEWTPCSVT;配列番号:196)のHBcおよびHBcハイブリッドへの挿入もまた合成DNAフラグメント(Synthetic Genetics, San Diego, CA)を用いて実施した。しかしながら、B細胞エピトープと異なり(B細胞エピトープはHBc遺伝子のイムノドミナントループに挿入される)、T細胞エピトープはHBc遺伝子のC−末端と融合される。BおよびThエピトープの両方をHBcに挿入するために、以前に考察したクローニングベクターを用いた。C−末端にPv−UTCを発現している粒子もまた作製することができた。
5.単一粒子内でのBおよびT細胞エピトープの合体
単一のHBc構築物中でBおよびThエピトープを合体させるために、PCRを用いてN−末端のHBcフラグメント(AA1−80、これはB細胞エピトープを含んでいる)、およびC−末端のHBcフラグメント(AA81−150、これはT細胞エピトープを含んでいる)を増幅させる。前記フラグメントを一緒に連結し、再度PCRで増幅させる。繰り返せば、クローンは制限エンドヌクレアーゼマッピングおよび自動DNA配列分析(Lark Technologies, Houston TX)によって立証する。詳細は本質的にP.ファルシパルムの場合と同じである。
I型、II型およびIII型B細胞エピトープの各々および変種の他にPv−UTCを含む粒子を発現させ、回収した。
単一のHBc構築物中でBおよびThエピトープを合体させるために、PCRを用いてN−末端のHBcフラグメント(AA1−80、これはB細胞エピトープを含んでいる)、およびC−末端のHBcフラグメント(AA81−150、これはT細胞エピトープを含んでいる)を増幅させる。前記フラグメントを一緒に連結し、再度PCRで増幅させる。繰り返せば、クローンは制限エンドヌクレアーゼマッピングおよび自動DNA配列分析(Lark Technologies, Houston TX)によって立証する。詳細は本質的にP.ファルシパルムの場合と同じである。
I型、II型およびIII型B細胞エピトープの各々および変種の他にPv−UTCを含む粒子を発現させ、回収した。
実施例10:HBcキメラの相対的免疫原性(免疫誘発性)
いくつかのHBcキメラ免疫原の相対的な免疫誘発性を上記に記載したIFAアッセイを用いてマウスで比較した。上記で述べた2回投与免疫スケジュールを用いたこれらの実験結果は下記の表12に示す。
表12
(A=Schodel et al., J. Exp. Med., 1994, 180:1037−1046.B=Schodel et al., Behring Inst. Mitt., 1997(98):114−119.NT=テストを実施せず。*=3ヶ月を越える防御)
いくつかのHBcキメラ免疫原の相対的な免疫誘発性を上記に記載したIFAアッセイを用いてマウスで比較した。上記で述べた2回投与免疫スケジュールを用いたこれらの実験結果は下記の表12に示す。
表12
(A=Schodel et al., J. Exp. Med., 1994, 180:1037−1046.B=Schodel et al., Behring Inst. Mitt., 1997(98):114−119.NT=テストを実施せず。*=3ヶ月を越える防御)
上記のデータから認められるように、P.ファルシパルムに対する105から106の力価はキメラ免疫原を用いて達成された。この力価は、Schodelらの代替技術を用いたP.ベルゲイ(berghei)に対するわずか104の力価およびP.ファルシパルム(falciparum)に対する103の力価を凌ぐ。
CS−2またはV12.Pf1の粒子20μgを用いて0日目にマウスを免疫し、さらに10μgを用いて4週間でブースター免疫を実施した。V12.Pf3およびV12.Pf3.1由来の粒子による免疫マウスは、0日目に20μgの粒子で免疫し、さらに上記で述べたようにアジュバントを用いて8週間でブースター免疫を実施した。達成された力価の期間を示すデータは図5に示す。V12.Pf3粒子を用いたデータは、V12.Pf3.1粒子を用いたデータと本質的に同一で、図には示されていない。
CS−2またはV12.Pf1の粒子20μgを用いて0日目にマウスを免疫し、さらに10μgを用いて4週間でブースター免疫を実施した。V12.Pf3およびV12.Pf3.1由来の粒子による免疫マウスは、0日目に20μgの粒子で免疫し、さらに上記で述べたようにアジュバントを用いて8週間でブースター免疫を実施した。達成された力価の期間を示すデータは図5に示す。V12.Pf3粒子を用いたデータは、V12.Pf3.1粒子を用いたデータと本質的に同一で、図には示されていない。
実施例11:相対的HBc抗原性
一連の実験を実施し、天然のHBcAg(粒子)と比較したときのいくつかのマラリアHBcキメラ粒子の相対的抗原性を2つのモノクローナル抗体(MoAb−3120およびMoAb−3105)に対して決定した。前記抗体は、HBcのループ領域に特異的で、Immunology Institute(Tokyo, Japan)から贈与された。実験は、プローブとして前記モノクローナル抗体を用いELISAアッセイでの抗原として表5のキメラ(HBc粒子の種々の位置に挿入されたマラリアエピトープを含む)を用いて実施した。これらの実験の結果(終末希釈として表されている)は下記表13A、13Bおよび13Cに示され、ループ領域(HBcの主要免疫原)と結合するモノクローナル抗体に対して目的のキメラは実質的に抗原性を欠いていることを明らかにしている。換言すれば、HBcのループ領域に特異的に結合するモノクローナル抗体は本発明の意図されるキメラをほとんど認識しない。
一連の実験を実施し、天然のHBcAg(粒子)と比較したときのいくつかのマラリアHBcキメラ粒子の相対的抗原性を2つのモノクローナル抗体(MoAb−3120およびMoAb−3105)に対して決定した。前記抗体は、HBcのループ領域に特異的で、Immunology Institute(Tokyo, Japan)から贈与された。実験は、プローブとして前記モノクローナル抗体を用いELISAアッセイでの抗原として表5のキメラ(HBc粒子の種々の位置に挿入されたマラリアエピトープを含む)を用いて実施した。これらの実験の結果(終末希釈として表されている)は下記表13A、13Bおよび13Cに示され、ループ領域(HBcの主要免疫原)と結合するモノクローナル抗体に対して目的のキメラは実質的に抗原性を欠いていることを明らかにしている。換言すれば、HBcのループ領域に特異的に結合するモノクローナル抗体は本発明の意図されるキメラをほとんど認識しない。
表13B
イムノドミナントループ(77−78位または78−79位を含む)内のいくつかの部位への挿入は、MoAb−3105の結合を完全に排除する。V13は残基129と130の間の挿入であり、天然のHBcのイムノドミナントループはこの構築物では無傷のままであるのでコントロールとして用いられている。
イムノドミナントループ(77−78位または78−79位を含む)内のいくつかの部位への挿入は、MoAb−3105の結合を完全に排除する。V13は残基129と130の間の挿入であり、天然のHBcのイムノドミナントループはこの構築物では無傷のままであるのでコントロールとして用いられている。
実施例12:改変B型肝炎コアタンパク質発現ベクターの構築
位置特異的突然変異を用いて、リジンのコドン(AAA)をHBc遺伝子のアミノ酸E77およびP78の間にSacI(GAGCTC)制限エンドヌクレアーゼ部位とともに導入し、リンカー基含有HBc粒子の生成のために他のコドンの遺伝的挿入を容易にした。したがって、前記挿入はアミノ酸残基配列KELを有し、ここでELはSacI部位の人工的産物である。したがって、リンカー基含有HBcタンパク質は長さが152アミノ酸残基であった。pKK223−3−HBc152−K78発現プラスミドは下記で述べる。
位置特異的突然変異を用いて、リジンのコドン(AAA)をHBc遺伝子のアミノ酸E77およびP78の間にSacI(GAGCTC)制限エンドヌクレアーゼ部位とともに導入し、リンカー基含有HBc粒子の生成のために他のコドンの遺伝的挿入を容易にした。したがって、前記挿入はアミノ酸残基配列KELを有し、ここでELはSacI部位の人工的産物である。したがって、リンカー基含有HBcタンパク質は長さが152アミノ酸残基であった。pKK223−3−HBc152−K78発現プラスミドは下記で述べる。
オリゴヌクレオチドプライマーP1F(配列番号:203)およびP1R(配列番号:204、相補鎖に対する)を用いて、HBc遺伝子の5´末端(塩基1−234、アミノ酸1−77)を増幅し、同時に増幅生成物の5´末端にNcoI制限部位(CCATGG)、3´末端にSacI制限部位(GAGCTC)、およびSacI部位の前にリジンのコドンを取り込ませた。オリゴヌクレオチドプライマーP2F(配列番号:205)およびP2R(配列番号:206、相補鎖に対する)を用いて、HBc遺伝子の3´末端(塩基235−450、アミノ酸78−149)を増幅させ、同時に増幅生成物の5´末端にSacI制限部位(GAGCTC)、および3´末端にHindIII制限部位(AAGCTT)を取り込ませた。
前記2つのPCR生成物(アミノ酸1−77およびアミノ酸78−149をコードする)をSacIで切断し、それらの共通のSacI突出部で一緒に連結し、さらにNcoIおよびHindIIIで切断し、標準的技術を用いて発現プラスミドpKK223−3(Pharmacia)でクローニングした。得られたプラスミドをpKK223−3−HBc152−K78と称した。
前記プラスミドをイムノドミナントループ内にリンカー基としてリジンを含むHBcキメラの発現に用いることができる。発現されたHBcキメラは偶発的に粒子を形成した。したがって、本実施例のリンカー基含有HBcは、配列番号:247のHBcの77位に一致して挿入を、配列番号:247のHBcの78位に一致する位置に化学的に反応性を有するリジンリンカー残基を有し、配列番号:247のHBcの149位に一致する位置で切断して切り縮められていた。
実施例1Iで述べたPCR技術を直前に述べた調製物とともに用いて、上記のキメラをコードし、さらにC−末端のシステイン残基を含むプラスミドを調製することができる。C−末端Cys残基および免疫原ハプテンに共役させることができる連結用残基を含むHBcキメラ粒子はここに記載した方法にしたがって前記プラスミドを発現させて得ることができる。
前記プラスミドをイムノドミナントループ内にリンカー基としてリジンを含むHBcキメラの発現に用いることができる。発現されたHBcキメラは偶発的に粒子を形成した。したがって、本実施例のリンカー基含有HBcは、配列番号:247のHBcの77位に一致して挿入を、配列番号:247のHBcの78位に一致する位置に化学的に反応性を有するリジンリンカー残基を有し、配列番号:247のHBcの149位に一致する位置で切断して切り縮められていた。
実施例1Iで述べたPCR技術を直前に述べた調製物とともに用いて、上記のキメラをコードし、さらにC−末端のシステイン残基を含むプラスミドを調製することができる。C−末端Cys残基および免疫原ハプテンに共役させることができる連結用残基を含むHBcキメラ粒子はここに記載した方法にしたがって前記プラスミドを発現させて得ることができる。
実施例13:改変B型肝炎コア粒子の精製
実施例12のリンカー基含有キメラHBc粒子を、大腸菌、典型的には大腸菌BLRまたはBL12(Novagen, Madison, Wisconsin)または大腸菌TB1(Amersham, Arlington Heights, Illinois)で発現させた。トランスフェクトされた大腸菌(HBc152−K78と称される)はプラスミドpKK223−3−HBc152−K78を発現した。確立された技術を用い、セファロース(登録商標)CL−4B−(Pharmacia)クロマトグラフィーにより前記リンカー基含有キメラHBc粒子(HBc152(K78)粒子)を精製した。
実施例12のリンカー基含有キメラHBc粒子を、大腸菌、典型的には大腸菌BLRまたはBL12(Novagen, Madison, Wisconsin)または大腸菌TB1(Amersham, Arlington Heights, Illinois)で発現させた。トランスフェクトされた大腸菌(HBc152−K78と称される)はプラスミドpKK223−3−HBc152−K78を発現した。確立された技術を用い、セファロース(登録商標)CL−4B−(Pharmacia)クロマトグラフィーにより前記リンカー基含有キメラHBc粒子(HBc152(K78)粒子)を精製した。
これらキメラ分子および粒子に用いられる命名系では、「HBc」はB型肝炎コアタンパク質配列を示し;「152」はキメラに存在するアミノ酸残基の数を示し、前記はリジンおよびSacI部位からHBc149に付加された2つの制限部位残基(グルタミン酸およびロイシン;EL)を含み;さらに「(K79)」は、リジン(K)が新規な残基79として残基78の後の配列に付加されていることを示している。分子のC−末端残基としてシステイン残基を含むキメラ分子および粒子(これらは以下で考察する)は、「C+」と表される。
粒子は予想できる態様で精製されるので、単純な分光分析(OD280)をSDS−PAGE分析とともに用いて粒子の溶出をモニターし、プールする前に個々の分画の純度を調べることによって、電気泳動的に純粋な粒子を高収量(5−120mg/L細胞培養)で日常的に十分に精製することができた。純粋なリンカー基含有キメラHBc粒子の球状構造は電子顕微鏡ではっきりと見ることができた。
粒子は予想できる態様で精製されるので、単純な分光分析(OD280)をSDS−PAGE分析とともに用いて粒子の溶出をモニターし、プールする前に個々の分画の純度を調べることによって、電気泳動的に純粋な粒子を高収量(5−120mg/L細胞培養)で日常的に十分に精製することができた。純粋なリンカー基含有キメラHBc粒子の球状構造は電子顕微鏡ではっきりと見ることができた。
実施例14:活性化担体としてのリンカー基含有キメラHBc粒子への合成ペプチドの化学的共役
実施例13の発現プラスミドpKK233−3−HBc152(K78)のリンカー基含有キメラHBc粒子生成物を、同様に発現させて精製した「野生型」B型肝炎コア粒子切端形(HBc149)と比較しその化学的反応性についてアッセイした。前記野生型B型肝炎コア粒子切端形は、導入リジン残基リンカー基および側面に接する5つのアミノ酸を欠くという点を除いてHBc152(K78)と同一である。
実施例13の発現プラスミドpKK233−3−HBc152(K78)のリンカー基含有キメラHBc粒子生成物を、同様に発現させて精製した「野生型」B型肝炎コア粒子切端形(HBc149)と比較しその化学的反応性についてアッセイした。前記野生型B型肝炎コア粒子切端形は、導入リジン残基リンカー基および側面に接する5つのアミノ酸を欠くという点を除いてHBc152(K78)と同一である。
スクシニミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン1−カルボキシレート(SMCC)(活性化担体を形成するために用いられる水溶性複素二環式架橋剤)を用いて、合成ペプチド(ハプテン)をリンカー基含有キメラHBc粒子と化学的に共役させた。SMCCは、スルフヒドリル基および一級アミノ基の両方に反応性を有し、前記活性化担体(その一級アミノ基がSMCCで先に改変されてあるHBcキメラ粒子)に合成ペプチドを連続的に共役させることができる。さらに、SMCCによって与えられた11.6オングストロームのスペーサーアームは、ハプテンとHBc担体との間の立体的妨害の減少に役立ち、それによってより大きなカップリング効率が得られる。
簡単に記せば、HBc152(K78)およびHBc149粒子を、全アミノ基(天然のアミノ基または天然のアミノ基+挿入リジン残基のアミノ基)に対して5倍過剰のSMCCとそれぞれ別々に、50mMリン酸ナトリウム(pH7.5)中で室温で2時間反応させ、マレイミド活性化HBc粒子を生成した。未反応SMCCを50mMリン酸ナトリウム(pH6.8)に対して繰り返し透析して除去した。HBc粒子のSMCCによる誘導によってSDS−PAGEでは検出できないような最少の分子量増加が達成された。しかしながら、PAGE分析ではペプチド共役工程に進む前にHBcタンパク質の完全性は担保されなかった。
活性化担体としてのキメラHBc粒子へ共役されるべき合成ペプチドは、導入されたリジン残基の側鎖上の一級アミンとペプチドハプテンがそのシステインスルフヒドリルを介して方向性をもって共役することを可能にするN−末端システインをもつようにデザインされた。
表14は、活性化HBc粒子担体に化学的に共役させ、懸垂結合させたチトクロームP450決定基ハプテンを含有するHBcキメラ粒子共役物(より単純にHBcキメラ粒子共役物)を生成したヒトチトクロームP450酵素に由来する合成ペプチドを示している。前記合成ペプチドは、50mMリン酸ナトリウム(pH6.8)に10mg/mLの濃度で溶解させた。続いて戦略的に改変したマレイミド活性化HBc152(K78)粒子の全アミノ基に対して5倍過剰で、前記合成ペプチドを1滴づつ添加し、室温で2時間反応させた。マレイミド活性化HBc149粒子は、コントロールとして2つの2D6ペプチド(2D6および2D6−C)と反応させた。
表14は、活性化HBc粒子担体に化学的に共役させ、懸垂結合させたチトクロームP450決定基ハプテンを含有するHBcキメラ粒子共役物(より単純にHBcキメラ粒子共役物)を生成したヒトチトクロームP450酵素に由来する合成ペプチドを示している。前記合成ペプチドは、50mMリン酸ナトリウム(pH6.8)に10mg/mLの濃度で溶解させた。続いて戦略的に改変したマレイミド活性化HBc152(K78)粒子の全アミノ基に対して5倍過剰で、前記合成ペプチドを1滴づつ添加し、室温で2時間反応させた。マレイミド活性化HBc149粒子は、コントロールとして2つの2D6ペプチド(2D6および2D6−C)と反応させた。
実施例15:キメラHBc粒子共役物の分析
実施例14の懸垂結合したチトクロームP450決定基ハプテンを含むHBcキメラ粒子共役物を、SDS−PAGEおよびイムノブロットで分析し、合成ペプチドがHBcに共役できているか否かを調べた。本電気泳動工程の変性条件によって粒子はその構成サブユニット、HBcモノマーに分解する。HBcモノマーは約17000Daの分子量を有するので、1A1(289−302)、1A2(291−302)、2D6(263−277)、または3A4(253−273)ペプチドのいずれかと化学的に共役したHBc152(K78)粒子を解析することは簡単で、前記ペプチドは相対分子量が約2000Daであるので、したがって前記HBcタンパク質モノマーの分子量の目に見える増加をもたらす。
実施例14の懸垂結合したチトクロームP450決定基ハプテンを含むHBcキメラ粒子共役物を、SDS−PAGEおよびイムノブロットで分析し、合成ペプチドがHBcに共役できているか否かを調べた。本電気泳動工程の変性条件によって粒子はその構成サブユニット、HBcモノマーに分解する。HBcモノマーは約17000Daの分子量を有するので、1A1(289−302)、1A2(291−302)、2D6(263−277)、または3A4(253−273)ペプチドのいずれかと化学的に共役したHBc152(K78)粒子を解析することは簡単で、前記ペプチドは相対分子量が約2000Daであるので、したがって前記HBcタンパク質モノマーの分子量の目に見える増加をもたらす。
SDS−PAGE上での共役バンドおよび非共役バンドの相対的濃度から、前記HBc152(K78)モノマーの約50%がハプテンと共有結合し、一方、「野生型」HBc149粒子の約5%のみがハプテンと結合していた。活性化担体とハプテンとの懸垂結合の顕著な増加が観察されたことによって、前記観察された結合は、「野生型」にも存在するリジン残基とは反対に挿入されたリジンを介して生じたということが支持される。
より短いC−末端P450由来ペプチド(5−および6−量体)と共役させたHBc粒子の移動度のシフトは、SDS−PAGEではより長い抑制ペプチドの場合のように重大ではないが、共役が成功したHBc152(K78)モノマーでは約1kDaのシフトが明瞭であった。キメラHBc152(K78)タンパク質は、「野生型」HBc149粒子(極めてわずかの共役を示した)に対して、ハプテンとの懸垂結合能力の顕著な強化を示した。
より短いC−末端P450由来ペプチド(5−および6−量体)と共役させたHBc粒子の移動度のシフトは、SDS−PAGEではより長い抑制ペプチドの場合のように重大ではないが、共役が成功したHBc152(K78)モノマーでは約1kDaのシフトが明瞭であった。キメラHBc152(K78)タンパク質は、「野生型」HBc149粒子(極めてわずかの共役を示した)に対して、ハプテンとの懸垂結合能力の顕著な強化を示した。
180個または240個の結合コアタンパク質モノマーで構成された二十面体粒子である提示されたコア粒子モデル(Conway et al. (1997) Nature, 386:91−94)では、比較的露出したイムノドミナントループ領域をもつコアモノマーで構成されたダイマーは、会合コア粒子から溶液中に中世の鎚矛のスパイクのように突出している。前記「スパイク」はHBc粒子上で空間的に接近して並んでいる。スパイクの先端に導入リジン残基を戦略的に配置させることによって、ハプテンと会合コア粒子との結合反応に対する立体的緊張傾向を最小限に留められる。
戦略的に改変させたHBcモノマーの最大で50%がCytP450の合成ペプチドと共役することができた。前記懸垂結合の量は、各コアタンパク質ダイマーと結合した1つのハプテンの平均と一致する。前記戦略的に改変したHBc粒子とのハプテン結合の分布についての前記の考えは、ダイマーの結合を維持しながら粒子を分解させる半変性条件下でのPAGEの結果によって支持される。
イムノブロットを用いてペプチドカップリングによって調製したHBc−2D6粒子を調べ、2D6ポリペプチドエピトープの提示が確認された。抗HBc抗血清で調べたとき、前記化学的に共役させた粒子は2つの異なるモノマーバンドを生じ、これらは2D6をもつモノマーおよびもたないモノマーを表し、したがって移動度のシフトと2D6ポリペプチドの結合との相関性が確認された。
イムノブロットを用いてペプチドカップリングによって調製したHBc−2D6粒子を調べ、2D6ポリペプチドエピトープの提示が確認された。抗HBc抗血清で調べたとき、前記化学的に共役させた粒子は2つの異なるモノマーバンドを生じ、これらは2D6をもつモノマーおよびもたないモノマーを表し、したがって移動度のシフトと2D6ポリペプチドの結合との相関性が確認された。
実施例16:戦略的なリジンの挿入
イムノドミナント表面露出ループ領域(アミノ酸75−85)の各位置にリジン残基が挿入されたHBc粒子を構築するために、PCRを用いてHBc遺伝子の5´および3´フラグメントを増幅し、オリゴヌクレオチドプライマーを介して単一リジンコドンを導入した。前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび得られたアミノ酸配列は配列番号:220−241に示されている。「野生型」配列は配列番号:218−219である。これらのHBcキメラは長さが150残基で、各キメラおよび粒子の名称内の数字によって示される位置にリジンが添加されている。
イムノドミナント表面露出ループ領域(アミノ酸75−85)の各位置にリジン残基が挿入されたHBc粒子を構築するために、PCRを用いてHBc遺伝子の5´および3´フラグメントを増幅し、オリゴヌクレオチドプライマーを介して単一リジンコドンを導入した。前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび得られたアミノ酸配列は配列番号:220−241に示されている。「野生型」配列は配列番号:218−219である。これらのHBcキメラは長さが150残基で、各キメラおよび粒子の名称内の数字によって示される位置にリジンが添加されている。
75位から84位[HBc150(K75)からHBc150(K84)]にリジンを挿入するために、PCRフラグメント対を制限エンドヌクレアーゼMseI(配列TTAAを認識する)で消化した。前記オリゴヌクレオチドプライマー(リジンを含む)をヌクレオチド221−224に位置する都合のよいMseI制限部位で連結して、前記改変遺伝子を再生した。HBc−K85(配列番号:240−241)の場合、野生型遺伝子には存在しないが、アミノ酸を全く変更しないで239位−244位に導入することができる共通のXhoI制限部位(CTCGAG)で連結させた2つのフラグメントを調製することが必要であった。
リンカー基含有HBcキメラを精製するために、1Lの発酵から得た清澄な細胞溶解物を45%硫酸アンモニウムで沈澱させ、得られたペレットをセファロース(登録商標)(Pharmacia)CL−4Bクロマトグラフィー(2.5cm×100cm)に付した。粒子状HBcは、このタイプのカラムを用いて分析したときは、粒子に施したアミノ酸挿入に左右されないで特徴的な溶出位置を有する。本実験で調製した11のリンカー基含有HBcキメラ粒子を前記の方法を用いて分析し、溶出プロフィールを280nmの吸収で分光光学的に測定した。
前記構築物から調製したリンカー基含有HBcキメラ粒子のうちの3つ、HBc150(K75)、HBc150(K77)およびHBc150(K79)は50から100mg/Lのレベルで生成され、これは未改変野生型HBc粒子、例えばHBc149粒子の典型的な収量に匹敵する。前記構築物のリンカー基含有HBcキメラ粒子のうちの4つ、HBc150(K76)、HBc150(K78)、HBc150(K81)およびHBc150(K82)は比較的低レベルで生成された(1から20mg/L)。最後に、前記粒子のうちの4つ、HBc150(K80)、HBc150(K83)、HBc150(K84)およびHBc150(K85)は、ほとんど検出不能と思われるレベルで生成された(1mg/L未満)。
前記構築物から調製したリンカー基含有HBcキメラ粒子のうちの3つ、HBc150(K75)、HBc150(K77)およびHBc150(K79)は50から100mg/Lのレベルで生成され、これは未改変野生型HBc粒子、例えばHBc149粒子の典型的な収量に匹敵する。前記構築物のリンカー基含有HBcキメラ粒子のうちの4つ、HBc150(K76)、HBc150(K78)、HBc150(K81)およびHBc150(K82)は比較的低レベルで生成された(1から20mg/L)。最後に、前記粒子のうちの4つ、HBc150(K80)、HBc150(K83)、HBc150(K84)およびHBc150(K85)は、ほとんど検出不能と思われるレベルで生成された(1mg/L未満)。
表16
1Lの発酵から精製されたリジン含有キメラHBc粒子
上記に記載したように、上記のキメラをコードし、さらにC−末端システイン残基を含むプラスミドを、上記または実施例1Iで述べた技術を直前に述べた調製方法とともに用いて、Cysコドンを終止コドンの直ぐ上流に挿入することによって調製することができる。
1Lの発酵から精製されたリジン含有キメラHBc粒子
上記に記載したように、上記のキメラをコードし、さらにC−末端システイン残基を含むプラスミドを、上記または実施例1Iで述べた技術を直前に述べた調製方法とともに用いて、Cysコドンを終止コドンの直ぐ上流に挿入することによって調製することができる。
実施例17:HIV配列を有するキメラ
631から665位のHIV−1gp41配列がHBc残基78と79の間に存在するリコンビナントキメラ粒子を調製した。調製物の1つはC−末端Cys残基を含み(配列番号:272および273)、一方、他の調製物はC−末端Cysを含まずHbc149位のバリンで終わっていた(配列番号:270および271)。末端Cysを含まない粒子を実施例1Bで述べたV2ベクターを用いて発現させ、一方Cysで終る粒子は実施例1Iで述べたように調製したベクターから発現させた。前記構築物をそれぞれV2.HIV11.1およびV16.HIV11.1と呼ぶ。発現収量はそれぞれ1.6mg/Lおよび12.4mg/Lで、したがってCysで終るタンパク質から会合する粒子の収量はほぼ8倍の増加であった。
631から665位のHIV−1gp41配列がHBc残基78と79の間に存在するリコンビナントキメラ粒子を調製した。調製物の1つはC−末端Cys残基を含み(配列番号:272および273)、一方、他の調製物はC−末端Cysを含まずHbc149位のバリンで終わっていた(配列番号:270および271)。末端Cysを含まない粒子を実施例1Bで述べたV2ベクターを用いて発現させ、一方Cysで終る粒子は実施例1Iで述べたように調製したベクターから発現させた。前記構築物をそれぞれV2.HIV11.1およびV16.HIV11.1と呼ぶ。発現収量はそれぞれ1.6mg/Lおよび12.4mg/Lで、したがってCysで終るタンパク質から会合する粒子の収量はほぼ8倍の増加であった。
HIVのB細胞エピトープの配列は、前記エピトープに対するそのコードDNAおよび相補性DNAと同様に下記に示されている。HIV配列はC−末端のEL残基で都合よく終わりN−末端のGI残基で始まり、したがってHBc配列由来でもなく挿入ペプチド配列由来でもない合計2つの付加(異種)残基が存在する。
実施例18:比較発現
同様な比較発現実験を、上記で述べたHBc150(K77)ベクター[HBcの残基76と77の間にリジンを(付加リジンのいずれかの側の2つの外来性残基とともに)含むキメラ分子を発現する]およびタンパク質のC−末端にCys残基をさらに含む同様なベクターを用いて実施した。後者のベクターは、Val−149と終止コドンの間にCysのためのコドンを含むC−末端PCRプライマーを用いて上記で述べた技術により調製した。対にした発現実験で、前者のベクターは55mg/Lの量の粒子を発現し、一方、後者のベクターは60mg/Lの量の粒子を発現した。
同様な比較発現実験を、上記で述べたHBc150(K77)ベクター[HBcの残基76と77の間にリジンを(付加リジンのいずれかの側の2つの外来性残基とともに)含むキメラ分子を発現する]およびタンパク質のC−末端にCys残基をさらに含む同様なベクターを用いて実施した。後者のベクターは、Val−149と終止コドンの間にCysのためのコドンを含むC−末端PCRプライマーを用いて上記で述べた技術により調製した。対にした発現実験で、前者のベクターは55mg/Lの量の粒子を発現し、一方、後者のベクターは60mg/Lの量の粒子を発現した。
実施例19:C−末端切断HBcキメラ遺伝子および粒子の調製
以下の逆方向プライマー[HBc138+139C−H3−rev、HBc139−H3−revおよびHBc140−H3−rev(下記に示す)]の各々と一緒にHBc−NcoI−fwd(以下に示す)を用いてHBc遺伝子を増幅させ、以下のHBc遺伝子を作製した:HBc140、HBc139およびHBc138+139C。PCR生成物をNcoIおよびHindIIIで切断し、pKK223−3N(同じ2つの酵素で切断して調製されてある)でクローニングした。続いてプラスミドで大腸菌株TB1を形質転換し、500mLのTB培養液(8mLg/Lのグルコースおよび50μg/mLのアンピシリンを補充)中で24時間増殖させた。粒子の産生は粗大腸菌調製物をセファロース(登録商標)CL−4Bサイジングカラム(Pharmacia)(粒子は特徴的な溶出位置に付随する)を用いて分析することによって決定した。
以下の逆方向プライマー[HBc138+139C−H3−rev、HBc139−H3−revおよびHBc140−H3−rev(下記に示す)]の各々と一緒にHBc−NcoI−fwd(以下に示す)を用いてHBc遺伝子を増幅させ、以下のHBc遺伝子を作製した:HBc140、HBc139およびHBc138+139C。PCR生成物をNcoIおよびHindIIIで切断し、pKK223−3N(同じ2つの酵素で切断して調製されてある)でクローニングした。続いてプラスミドで大腸菌株TB1を形質転換し、500mLのTB培養液(8mLg/Lのグルコースおよび50μg/mLのアンピシリンを補充)中で24時間増殖させた。粒子の産生は粗大腸菌調製物をセファロース(登録商標)CL−4Bサイジングカラム(Pharmacia)(粒子は特徴的な溶出位置に付随する)を用いて分析することによって決定した。
したがって、5グラムの採集細胞を25mLの50mMトリス−HCl緩衝液(pH8.0)、10mMのEDTA中でフレンチプレスを用いて溶解した。前記溶解物を16000rpm(JA−30.50Tiローター(Beckman))で20分遠心して清澄にした。硫酸アンモニウム沈澱(45%)を用いて粒子を沈澱させ16000rpm(JA−30.50Tiローター(Beckman))で20分遠心して、前記沈殿物を回収した。前記のようにして作製したペレットを5mLの50mMトリス−HCl(pH8.0)、10mMのEDTAに再懸濁し、溶解するまで20mMのトリス−HCl(pH8.0)に対して透析した。続いて、前記物質をセファロースCL−Bクロマトグラフィーカラム(2.5×100cm)に適用し、1mL/分の流速で500分溶出させ、前記の時間までに全ての物質が溶出した。粒子の溶出は280nmでモニターした。
前記溶出プロフィールを基にすれば、HBc140は粒子を形成し、一方、HBc139は形成しない。残基138で終わる粒子は、粒子の139位にシステインを付加することによってもまた粒子を形成しなかった。ベクターは、上記で示した配列番号:275、146、159、160、155、156、153および154のDNAを用いて構築した。
前記溶出プロフィールを基にすれば、HBc140は粒子を形成し、一方、HBc139は形成しない。残基138で終わる粒子は、粒子の139位にシステインを付加することによってもまた粒子を形成しなかった。ベクターは、上記で示した配列番号:275、146、159、160、155、156、153および154のDNAを用いて構築した。
実施例20:ヒトで使用するHBc粒子調製用ベクターの調製A.ベクターV17Pf3.1の調製
ヒトの投与に適した態様で粒子V12.Pf3.1(配列番号:268および269)を製造するためには、プラスミドの維持を担保するアンピシリンの使用を必要としない発現系を用いて粒子を発現させることが必要であった。前記の要件を達成するために、粒子をコードする遺伝子は、必要な上流の調節配列とともに、選別マーカーとしてカナマイシンを利用する新しいプラスミドに挿入された。前記新しいプラスミド(V17.Pf3.1)を以下の2段階クローニング工程で合成した。
ヒトの投与に適した態様で粒子V12.Pf3.1(配列番号:268および269)を製造するためには、プラスミドの維持を担保するアンピシリンの使用を必要としない発現系を用いて粒子を発現させることが必要であった。前記の要件を達成するために、粒子をコードする遺伝子は、必要な上流の調節配列とともに、選別マーカーとしてカナマイシンを利用する新しいプラスミドに挿入された。前記新しいプラスミド(V17.Pf3.1)を以下の2段階クローニング工程で合成した。
工程1:プラスミドpKK223−3N−V12を制限酵素BamHIおよびHindIIIで消化して、801および4869bpの2つのDNAフラグメントを得た。さらに、市販のプラスミドpREP4(Quiagen)をBglIIおよびHindIIIで切断し、320bpおよび3420bpの2つのフラグメントを得た。3420bpおよび801bpフラグメントを連結してプラスミドV17を作製した(BglIIおよびBamHI消化DNAはそれらの共通の「突出」配列のために連結できるが、BglIIもBamHIも得られたフラグメントを切断できないことを特記する)。したがって、V17プラスミドは、HBc149遺伝子(C−末端に融合したPf−UTC配列を完備している)およびイムノドミナントループ領域にEcoRIおよびSacI制限部位(HBc遺伝子のD78およびP79の間にエピトープを挿入することを可能にする)を含んでいる。
工程2:第二の工程は、Pf・CSリピートエピトープのPf3.1バージョンを前記遺伝子のイムノドミナントループ領域に挿入することであった。前記はV17をSacIおよびEcoRIで消化して15bpおよび4206bpのDNAフラグメントを得ることによって達成された。アニールさせたPf3.1エピトープをコードするオリゴヌクレオチドを前記4206bpフラグメントと連結して、V17.Pf3.1(4275塩基対プラスミド)を得た。195アミノ酸のマラリアワクチン候補物をコードする遺伝子の他に、本プラスミドは、lacリプレッサー(lacI)のための遺伝子を含み、前記遺伝子は、イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)によって誘発されるまでlacプロモーターの制御下にある全ての遺伝子を完全に抑制することができる。前記プラスミドはまた、カナマイシン耐性遺伝子を含み、培養液中へのカナマイシンの添加により陽性選別を可能にする。前記プラスミドはCYC184の複製起点を有し、高コピー数プラスミドであるとは考えられない。
問題の遺伝子の位置は以下のとおりである:
V17.Pf3.1に適したホストは大腸菌BLRである。前記は、大腸菌BL21のrecA誘導体で、リコンビナントタンパク質の製造に用いられる共通の株である(Novagenから購入できる)。大腸菌BLRは、その増強された遺伝的安定性の他に、可溶形で(封入体としてではなく)会合粒子を産生する能力のために発現用ホスト生物として選択された。
V17.Pf3.1に適したホストは大腸菌BLRである。前記は、大腸菌BL21のrecA誘導体で、リコンビナントタンパク質の製造に用いられる共通の株である(Novagenから購入できる)。大腸菌BLRは、その増強された遺伝的安定性の他に、可溶形で(封入体としてではなく)会合粒子を産生する能力のために発現用ホスト生物として選択された。
B.プラスミドV17.Pf3.1を用いた粒子の発現
25μg/mLのカナマイシンおよび10μg/mLのテトラサイクリンを補充したLB寒天プレートにV17.Pf3.1プラスミドを含む大腸菌(BLR株)を画線し、続いて37℃で16−20時間インキュベートした。さらに単一コロニーを用いて滅菌試験管中の3mLのTB−Phy培養液(25μg/mLのカナマイシン補充)に接種した。前記試験管を振盪培養機で約200rpmで、37℃で一晩(約18時間)インキュベートした。
次の朝、100mLのTB−Phy培養液を37℃に加温した。前記の一晩培養の1mLを取り出し、これを前記フラスコへの接種に用いた。前記を続いて振盪培養機で約200rpmで6時間37℃でインキュベートした。
発酵装置(Biostat(登録商標)UE20)に100mLの接種量で接種した。発酵装置の条件は以下のように設定した:
攪拌:400rpm
温度:37℃
通気:空気10リットル/分
pH:7.0、非制御
25μg/mLのカナマイシンおよび10μg/mLのテトラサイクリンを補充したLB寒天プレートにV17.Pf3.1プラスミドを含む大腸菌(BLR株)を画線し、続いて37℃で16−20時間インキュベートした。さらに単一コロニーを用いて滅菌試験管中の3mLのTB−Phy培養液(25μg/mLのカナマイシン補充)に接種した。前記試験管を振盪培養機で約200rpmで、37℃で一晩(約18時間)インキュベートした。
次の朝、100mLのTB−Phy培養液を37℃に加温した。前記の一晩培養の1mLを取り出し、これを前記フラスコへの接種に用いた。前記を続いて振盪培養機で約200rpmで6時間37℃でインキュベートした。
発酵装置(Biostat(登録商標)UE20)に100mLの接種量で接種した。発酵装置の条件は以下のように設定した:
攪拌:400rpm
温度:37℃
通気:空気10リットル/分
pH:7.0、非制御
A600値を最初のサンプルについて測定し、さらにその後20−30分毎にサンプルのA600値をモニターした。62mgのIPTGを10−15mLの水に溶解してIPTG溶液を調製した。A600値が0.5の達したとき、ろ過滅菌したIPTG溶液を無菌的に前記発酵装置に注射筒で添加した。次の日まで(さらに約10−24時間)インキュベーションを継続した。
誘発後14時間で、発酵温度を15℃に設定した。細胞の採集は以下の条件でベックマン(Beckman)(登録商標)J2−MC遠心機での遠心によって開始した:ローター:JA10、速度:7500rpm、温度:4℃、時間:9分。
細胞を液体窒素で凍結することによって採集した。
誘発後14時間で、発酵温度を15℃に設定した。細胞の採集は以下の条件でベックマン(Beckman)(登録商標)J2−MC遠心機での遠心によって開始した:ローター:JA10、速度:7500rpm、温度:4℃、時間:9分。
細胞を液体窒素で凍結することによって採集した。
C.ベクターV17.Pf3.1/BLRによって発現された粒子の精製
採集細胞のバイオマスを50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)に再懸濁し、フレンチプレスセルを1.1×108Pa(16000psi)で用いて前記細胞を溶解させた。ベックマン(登録商標)J2−MCを用い、以下の条件で遠心して細胞屑を除去した:ローター:JA20、速度:15000rpm、温度:4℃、時間:30分。
得られた上清の容積を測定し、前記上清に固体の硫酸アンモニウム277g/Lをゆっくりと添加した。混合物を4℃で30分攪拌した。ベックマン(登録商標)J2−MC遠心機で以下の条件で前記溶液を遠心した:ローター:JA20、速度:15000rpm、温度:4℃、時間:30分。
採集細胞のバイオマスを50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)に再懸濁し、フレンチプレスセルを1.1×108Pa(16000psi)で用いて前記細胞を溶解させた。ベックマン(登録商標)J2−MCを用い、以下の条件で遠心して細胞屑を除去した:ローター:JA20、速度:15000rpm、温度:4℃、時間:30分。
得られた上清の容積を測定し、前記上清に固体の硫酸アンモニウム277g/Lをゆっくりと添加した。混合物を4℃で30分攪拌した。ベックマン(登録商標)J2−MC遠心機で以下の条件で前記溶液を遠心した:ローター:JA20、速度:15000rpm、温度:4℃、時間:30分。
続いて沈澱物を最少容量の50mMリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁し、さらに同じ緩衝液に対して攪拌しながら1時間透析した。透析した前記溶液をベックマン(登録商標)J2−MC遠心機で以下の条件で遠心した:ローター:JA20、速度:15000rpm、温度:4℃、時間:15分。
上清を回収し、続いて以下のようにゲルろ過クロマトグラフィーに付した。
系:ファルマシアバイオテクAKTA(登録商標)エクスプローラー
緩衝液B(溶出溶媒):50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)
カラム:ミリポアバンテージ(Millipore Vantage)(登録商標)VL44×1000カラム(直径44mm、高さ1000mm、カタログ番号96441000)
樹脂:1.5リットルセファロース(登録商標)CL−4B(ファルマシア製)
検出:210、254および280nmのUV
分画:15mL
前記カラムを2mL/分で緩衝液Bで溶出した。粒子を含む分画をSDS−PAGEを用いて特定しプールした。塩化ナトリウムを添加してプールした物質の塩濃度を5Mに調節した。
上清を回収し、続いて以下のようにゲルろ過クロマトグラフィーに付した。
系:ファルマシアバイオテクAKTA(登録商標)エクスプローラー
緩衝液B(溶出溶媒):50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)
カラム:ミリポアバンテージ(Millipore Vantage)(登録商標)VL44×1000カラム(直径44mm、高さ1000mm、カタログ番号96441000)
樹脂:1.5リットルセファロース(登録商標)CL−4B(ファルマシア製)
検出:210、254および280nmのUV
分画:15mL
前記カラムを2mL/分で緩衝液Bで溶出した。粒子を含む分画をSDS−PAGEを用いて特定しプールした。塩化ナトリウムを添加してプールした物質の塩濃度を5Mに調節した。
疎水性相互作用クロマトグラフィー
系:ファルマシアバイオテクAKTA(登録商標)エクスプローラー(システム番号:1811241 001152、University of Iowa ID No.:540833)
緩衝液A:50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)+5MのNaCl(緩衝液は使用前に毎日30分脱気した。)
緩衝液B(溶出溶媒):50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)(緩衝液は使用前に毎日30分脱気した。)
トヨパール(Toyopearl)(登録商標)エーテル650樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー
カラム:ミリポアバンテージ(Millipore Vantage)(登録商標)VL44×250カラム(直径44mm、高さ250mm、カタログ番号96440250)
樹脂:200mLトヨパール(登録商標)エーテル650HIC樹脂(Tosohass製)
検出:210、254および280nmのUV
分画:15mL
カラムは、5カラム容積(CV)の緩衝液Aで精製開始前に1時間、20mL/分の流速で平衡化させた。続いて、5Mの塩を含むリテンテートを20mL/分の速度でロードした。カラムを2CVの緩衝液Aで洗浄し、2CVの10%緩衝液Bで洗浄し、3CVの40%緩衝液Bで溶出し、さらに100%の緩衝液Bで最終的に溶出させた。分画は、SDS−PAGE分析で問題のタンパク質について完全に分析した。純粋な分画を一緒にし、ブラッドフォードアッセイを用いて、タンパク質の概算を得た。
系:ファルマシアバイオテクAKTA(登録商標)エクスプローラー(システム番号:1811241 001152、University of Iowa ID No.:540833)
緩衝液A:50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)+5MのNaCl(緩衝液は使用前に毎日30分脱気した。)
緩衝液B(溶出溶媒):50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)(緩衝液は使用前に毎日30分脱気した。)
トヨパール(Toyopearl)(登録商標)エーテル650樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー
カラム:ミリポアバンテージ(Millipore Vantage)(登録商標)VL44×250カラム(直径44mm、高さ250mm、カタログ番号96440250)
樹脂:200mLトヨパール(登録商標)エーテル650HIC樹脂(Tosohass製)
検出:210、254および280nmのUV
分画:15mL
カラムは、5カラム容積(CV)の緩衝液Aで精製開始前に1時間、20mL/分の流速で平衡化させた。続いて、5Mの塩を含むリテンテートを20mL/分の速度でロードした。カラムを2CVの緩衝液Aで洗浄し、2CVの10%緩衝液Bで洗浄し、3CVの40%緩衝液Bで溶出し、さらに100%の緩衝液Bで最終的に溶出させた。分画は、SDS−PAGE分析で問題のタンパク質について完全に分析した。純粋な分画を一緒にし、ブラッドフォードアッセイを用いて、タンパク質の概算を得た。
ブチル樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー
カラム:ミリポアバンテージ(Millipore Vantage)(登録商標)VL44×250カラム(直径44mm、高さ250mm、カタログ番号96440250)
樹脂:200mLトヨパール(Toyopearl)(登録商標)ブチル650−S・HIC樹脂(Tosohass製)
検出:210、254および280nmのUV
分画:15mL
カラムは、5カラム容積(CV)の40%緩衝液Bで精製開始前に1時間、20mL/分の流速で平衡化させた。エーテルHICから得た、一緒にまとめた分画を20mL/分の速度でロードした。カラムを2CVの40%緩衝液Bで洗浄し、2CVの90%緩衝液Bで洗浄し、さらに4CVのWFIで溶出した。分画は、SDS−PAGE分析で問題のタンパク質について分析した。純粋な分画を一緒にまとめた。
カラム:ミリポアバンテージ(Millipore Vantage)(登録商標)VL44×250カラム(直径44mm、高さ250mm、カタログ番号96440250)
樹脂:200mLトヨパール(Toyopearl)(登録商標)ブチル650−S・HIC樹脂(Tosohass製)
検出:210、254および280nmのUV
分画:15mL
カラムは、5カラム容積(CV)の40%緩衝液Bで精製開始前に1時間、20mL/分の流速で平衡化させた。エーテルHICから得た、一緒にまとめた分画を20mL/分の速度でロードした。カラムを2CVの40%緩衝液Bで洗浄し、2CVの90%緩衝液Bで洗浄し、さらに4CVのWFIで溶出した。分画は、SDS−PAGE分析で問題のタンパク質について分析した。純粋な分画を一緒にまとめた。
ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー
カラム:ミリポアバンテージ(登録商標)VL16×250カラム(直径16mm、高さ250mm、カタログ番号96160250)
樹脂:20mLセラミックヒドロキシアパタイト(カタログ番号158−2200)
検出:215、254および280nmのUV
分画:15mL
カラムは、5カラム容積(CV)の20mMリン酸ナトリウム緩衝液で5mL/分の流速で平衡化させた。ブチルHICから溶出させ一緒にまとめた分画を5mL/分の速度でロードした。A280が基準値に下がるまでカラムを20mMのリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。分画は、SDS−PAGE分析で問題のタンパク質について分析した。純粋な分画を一緒にまとめた。
カラム:ミリポアバンテージ(登録商標)VL16×250カラム(直径16mm、高さ250mm、カタログ番号96160250)
樹脂:20mLセラミックヒドロキシアパタイト(カタログ番号158−2200)
検出:215、254および280nmのUV
分画:15mL
カラムは、5カラム容積(CV)の20mMリン酸ナトリウム緩衝液で5mL/分の流速で平衡化させた。ブチルHICから溶出させ一緒にまとめた分画を5mL/分の速度でロードした。A280が基準値に下がるまでカラムを20mMのリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。分画は、SDS−PAGE分析で問題のタンパク質について分析した。純粋な分画を一緒にまとめた。
脱塩
カラム:予め充填された脱塩カラム、ハイプレップ(HiPrep)(登録商標)26/10(Pharmacia)
樹脂:20mL、セラミックヒドロキシアパタイト(カタログ番号158−2200)
検出:215、254および280nmのUV
分画:15mL
カラムは、5カラム容積(CV)の15mMの酢酸緩衝液(pH6.0)で平衡化させた。ヒドロキシアパタイトカラムから得た、一緒にまとめた分画をカラムにロードし、続いて15mMの酢酸緩衝液(pH6.0)で20mL/分の流速で溶出させた。分画は、SDS−PAGE分析で問題のタンパク質について分析した。純粋な分画を一緒にまとめ、タンパク質の概算はブラッドフォードアッセイを用いて実施した。前記純粋な分画をエンドトキシンレベルに対してアッセイし、最後に0.22ミクロンフィルターを通して最終ろ過を実施した。
カラム:予め充填された脱塩カラム、ハイプレップ(HiPrep)(登録商標)26/10(Pharmacia)
樹脂:20mL、セラミックヒドロキシアパタイト(カタログ番号158−2200)
検出:215、254および280nmのUV
分画:15mL
カラムは、5カラム容積(CV)の15mMの酢酸緩衝液(pH6.0)で平衡化させた。ヒドロキシアパタイトカラムから得た、一緒にまとめた分画をカラムにロードし、続いて15mMの酢酸緩衝液(pH6.0)で20mL/分の流速で溶出させた。分画は、SDS−PAGE分析で問題のタンパク質について分析した。純粋な分画を一緒にまとめ、タンパク質の概算はブラッドフォードアッセイを用いて実施した。前記純粋な分画をエンドトキシンレベルに対してアッセイし、最後に0.22ミクロンフィルターを通して最終ろ過を実施した。
実施例21:チトクロームP450配列をもつキメラの比較発現
ヒトチトクロームP450・1A1配列の290位から302位がHBc残基78と79の間に存在するリコンビナントキメラ粒子を調製した。一方の調製物はC−末端Cys残基を含み、他方はCys残基を含まずHBc149位のバリンで終わっていた。末端Cysをもたない粒子は実施例1Bで述べたV2ベクターを用いて発現させ、一方、末端のCysをもつ粒子は実施例1Iで述べたように調製したベクターから発現させた。これらのベクターは、それぞれV2.1A1(290−302)およびV16.1A1(290−302)と称される。発現収量は、それぞれ2.7mg/g細胞、36mg/L培養および8.8mg/g、144mg/Lで、したがって末端システイン改変によるキメラ分子粒子の生成および収量安定化能力が実証された。
ヒトチトクロームP450・1A1配列の290位から302位がHBc残基78と79の間に存在するリコンビナントキメラ粒子を調製した。一方の調製物はC−末端Cys残基を含み、他方はCys残基を含まずHBc149位のバリンで終わっていた。末端Cysをもたない粒子は実施例1Bで述べたV2ベクターを用いて発現させ、一方、末端のCysをもつ粒子は実施例1Iで述べたように調製したベクターから発現させた。これらのベクターは、それぞれV2.1A1(290−302)およびV16.1A1(290−302)と称される。発現収量は、それぞれ2.7mg/g細胞、36mg/L培養および8.8mg/g、144mg/Lで、したがって末端システイン改変によるキメラ分子粒子の生成および収量安定化能力が実証された。
P450・1A1ペプチドの配列は、前記ペプチドのためのコード配列および相補性配列と同様に下記に示されている。P450・1A1配列はN−末端GIで始まり、C−末端EL残基配列で終わり、その結果、合計して4残基のみが付加されただけで、これらはHBc配列由来でも挿入ペプチド配列由来でもない。
実施例22:C−末端融合エピトープの前にシステイン残基をもつ粒子を発現するベクターの調製
HBc遺伝子のV149の後にただ1つのシステインを有し、その後にT細胞エピトープが続く粒子を調製するために、PCRプライマー(配列番号:282)を合成した。このプライマーをHBc149/NcoI−F(配列番号:67)と一緒に用いてHBc遺伝子を増幅し、V149の直後にただ1つのシステインコドンとともにEcoRIおよびHindIII制限部位が(前記導入システインの後ろに)導入されたHBcバージョンを作製した。478bpPCR生成物をNcoIおよびHindIIIで切断し、pKK223−3Nでクローニングした。
HBc遺伝子のV149の後にただ1つのシステインを有し、その後にT細胞エピトープが続く粒子を調製するために、PCRプライマー(配列番号:282)を合成した。このプライマーをHBc149/NcoI−F(配列番号:67)と一緒に用いてHBc遺伝子を増幅し、V149の直後にただ1つのシステインコドンとともにEcoRIおよびHindIII制限部位が(前記導入システインの後ろに)導入されたHBcバージョンを作製した。478bpPCR生成物をNcoIおよびHindIIIで切断し、pKK223−3Nでクローニングした。
続いて、得られたプラスミドをEcoRIおよびHindIIIで切断し、Pf/CS−UTCをコードするアニールされたオリゴヌクレオチド(PF/CS326−345;配列番号121および122)を前記プラスミドに連結した。続いて、プライマーHBc−P79/SacI−F(配列番号:73)およびPf/CS(C17A)(配列番号:145)とともに、前記プラスミドを鋳型としてPCR反応で用いた。得られたPCR生成物(307bp)はHBcのアミノ酸残基79から149をコードし、その後に導入されたシステインが続き、さらにその後にC17A変異を有するPf/CS−UTC配列が続き、さらにSacI(5´)およびHindIII(3´)制限部位が側面に接している。このフラグメントをSacIおよびHindIIIで切断し、さらに同じ2つの酵素で切断したプラスミドV2.Pf1[マラリア(NANP)4エピトープをコードする]と連結した。
得られた遺伝子は、HBcのアミノ酸78と79の間に挿入された(NANP)4(EcoRIおよびSacIからそれぞれ由来するGly−IleおよびGlu−Leu配列が側面に接する)、およびC−末端にPf/CS326−345のC17Aバージョンをもつ190アミノ酸残基のHBcキメラをコードする。ただ1つのシステインは、したがってHBcのV149とGly−Ileリンカー配列(EcoRI制限部位に由来する)の間に位置していた(前記リンカー配列は、Pf/CS326−345(C17A)[Pf/CS−UTC(C17A)]T細胞エピトープ(配列番号:284参照)の最初のアミノ酸の前に位置する)。
前記ハイブリッド粒子を発現させて精製し、37℃で数週間インキュベートすることによって安定性について分析した。この粒子(V12.Pf1(C17A)C150)の安定性をV12.Pf1と比較した(前記2つの粒子の相違はシステイン残基の位置のみである)。V12.Pf1の場合、システインの後にそのタンパク質(配列番号:283)のC−末端の3つのアミノ酸残基(SVT)が続き、一方、V12.Pf1(C17A)C150の場合、システインの後には22アミノ酸残基が続く(配列番号:284)。
V12.Pf1:
TTVV GI EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT 配列番号:283
V12.Pf1(C17A)C150
TTVV C GI EYLNKIQNSLSTEWSPASVT 配列番号:284
V12.Pf1:
TTVV GI EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT 配列番号:283
V12.Pf1(C17A)C150
TTVV C GI EYLNKIQNSLSTEWSPASVT 配列番号:284
HBcとT細胞エピトープの間にシステイン残基を挿入する(V12.Pf1(C17A)C150)効果は、C−末端残基をもたない同様な粒子(V12.Pf1(C17A))よりもはるかに安定な粒子の創出であった。このことは、V12.Pf1(C17A)と異なり、V12.Pf1(C17A)C150は顕著なモノマーへの分解を生じることなく容易に精製できるという事実(図4および8で前記粒子についてのT=0を比較されたい)から明白であった。さらにV12.Pf1(C17A)C150は、37℃でインキュベートした後V12.Pf1(C17A)よりもはるかに安定であった。37℃で14日後、V12.Pf1(C17A)モノマーは完全に分解し(図4)、一方、V12.Pf1(C17A)C150モノマーは部分的分解しただけである(図8)。
V12.Pf1(C17A)C150はV12.Pf1ほど安定でないことは明白であった(図8)。これらのデータは、C−末端単一システイン残基の安定化効果は、HBcキメラのC−末端に、またはC−末端近く(例えばC−末端の5残基以内)に配置されたときもっとも効果的であることを示している。
V12.Pf1(C17A)C150はV12.Pf1ほど安定でないことは明白であった(図8)。これらのデータは、C−末端単一システイン残基の安定化効果は、HBcキメラのC−末端に、またはC−末端近く(例えばC−末端の5残基以内)に配置されたときもっとも効果的であることを示している。
実施例23:ハイブリッド粒子の解析用ゲルろ過による分析
精製ハイブリッドHBc粒子の解析用ゲルろ過による分析を25mLのスーパーロース(Superrose)(登録商標)6HR10/30クロマトグラフィーカラム(Amersham Pharmacia #17−0537−01)およびバイオカド(BioCAD)(登録商標)SPRINT灌流クロマトグラフィー系を用いて実施した。UV検出装置は260および280nmの両方をモニターするように設定した。カラムは、3カラム容積(CV;約75mL)の緩衝液(50mMのNaPO4、pH6.8)で0.75mL/分の流速で平衡化した。
50mMのNaPO4(pH6.8)を用いて分析されるべき粒子を1mg/mLの濃度に希釈した。続いて前記のサンプルの200マイクロリットル(μL)を200μLのループにロードし、カラムに注入した。50mMのNaPO4(pH6.8)で0.75mL/分の流速でサンプルをカラムから溶出させた。
精製ハイブリッドHBc粒子の解析用ゲルろ過による分析を25mLのスーパーロース(Superrose)(登録商標)6HR10/30クロマトグラフィーカラム(Amersham Pharmacia #17−0537−01)およびバイオカド(BioCAD)(登録商標)SPRINT灌流クロマトグラフィー系を用いて実施した。UV検出装置は260および280nmの両方をモニターするように設定した。カラムは、3カラム容積(CV;約75mL)の緩衝液(50mMのNaPO4、pH6.8)で0.75mL/分の流速で平衡化した。
50mMのNaPO4(pH6.8)を用いて分析されるべき粒子を1mg/mLの濃度に希釈した。続いて前記のサンプルの200マイクロリットル(μL)を200μLのループにロードし、カラムに注入した。50mMのNaPO4(pH6.8)で0.75mL/分の流速でサンプルをカラムから溶出させた。
C−末端システイン残基を含むいくつかの粒子またはそのようなシステインを含まない同様な粒子を上記の方法を用いて分析した。280nmトレースの組み込みは、バイオカド(登録商標)ソフトウェア(PerSeptive(登録商標))を用いて実施し、下記の表17に示す結果を得た。
表17
注記:*C−末端システイン安定化粒子
表17
注記:*C−末端システイン安定化粒子
粒子の割合について精製粒子を調べ、続いて上記で述べたように37℃の水溶液中でインキュベートした。14日インキュベートした後、前記組成物を安定性について分析した。この分析の結果は下記の表18に示す。
表18
注記:*表17の注記を参照されたい
表18
注記:*表17の注記を参照されたい
図8は、37℃でインキュベーション0日、7日および14日後の表18の粒子のSDS−PAGE分析の結果を示している。前記SDS−PAGE分析のデンシトメーター解析を下記の表19に示す。
表19
注記:*表17の注記を参照されたい
表19
注記:*表17の注記を参照されたい
C−末端Cys残基を含む、または含まない表18および19の粒子並びに実施例16のコントロール粒子を、BALB/cマウスの腹腔内注射により免疫原性について分析した。前記免疫は、実施例4の報告とは反対にアジュバントの非存在下でリン酸緩衝食塩水(pH7.4)中のそれぞれ対応する粒子20μgを用いて実施した。固相捕捉抗原としてHBc粒子(抗HBc)または(NANP)5合成ペプチド[抗(NANP)n]を用い、免疫後2週間の血清をELISAで分析した。本実験の結果は下記の表20に示す。
表20
注記:*表17の注記を参照されたい
表20
注記:*表17の注記を参照されたい
前記実験のデータは、C−末端安定化粒子は生成直後と同様に37℃で種々の時間インキュベートした後もはるかに安定であることを意味していると解釈される。前記安定化粒子はまた、アジュバントの非存在下でも免疫原性(免疫誘発性)を強化することを示している。さらに、粒子化物質は非安定化物質(例えばV12.Pf1(C17A)にも存在するが、インキュベーション14日後にはモノマーのキメラタンパク質は存在せず、14日後の物質は、最初に導入された異種B細胞エピトープ(ここではマラリア免疫原)に対して抗体を誘発しなかった。
実施例24:ベータ−アミロイドタンパク質エピトープ配列を含むキメラ
42アミノ酸のベータ−アミロイド前駆体タンパク質フラグメントに対する抗体は、アルツハイマー病(REF)に対する治療用および予防用ワクチンとして提唱された(Schenk et al. (Jul. 8, 1999) Nature, 400(6740):116−117)。前記フラグメントのC−末端は、極めて疎水性でしたがってキメラHBc粒子の表面での発現が潜在的に困難である領域を含んでいる。
したがって、完全な42アミノ酸配列を含む粒子[V16.β−Am(1−42)]の他に、以下の比較的親水性の領域のみを含む3つの他の粒子を構築した:アミノ酸残基1−17[V16.β−Am(1−17)]、アミノ酸残基22−32[V16.β−Am(22−32)]およびアミノ酸残基1−32[V16.β−Am(1−32)]。粒子V16.β−Am(1−17)およびV16.β−Am(22−32)をコードするキメラ遺伝子は、相補性オリゴヌクレオチドをアニールさせ、それらをプラスミドV16(先にEcoRIおよびSacIで消化されてある)に挿入して構築した。
42アミノ酸のベータ−アミロイド前駆体タンパク質フラグメントに対する抗体は、アルツハイマー病(REF)に対する治療用および予防用ワクチンとして提唱された(Schenk et al. (Jul. 8, 1999) Nature, 400(6740):116−117)。前記フラグメントのC−末端は、極めて疎水性でしたがってキメラHBc粒子の表面での発現が潜在的に困難である領域を含んでいる。
したがって、完全な42アミノ酸配列を含む粒子[V16.β−Am(1−42)]の他に、以下の比較的親水性の領域のみを含む3つの他の粒子を構築した:アミノ酸残基1−17[V16.β−Am(1−17)]、アミノ酸残基22−32[V16.β−Am(22−32)]およびアミノ酸残基1−32[V16.β−Am(1−32)]。粒子V16.β−Am(1−17)およびV16.β−Am(22−32)をコードするキメラ遺伝子は、相補性オリゴヌクレオチドをアニールさせ、それらをプラスミドV16(先にEcoRIおよびSacIで消化されてある)に挿入して構築した。
残基1−42[V16.β−Am(1−42)]および1−32[V16.β−Am(1−32)]を含むキメラ遺伝子の場合、前記オリゴヌクレオチドβ−Am(1−32/42)−Tおよびβ−Am(1−42)−Bまたはβ−Am(1−32)−Bをアニールさせ、続いて5サイクルの溶融(94℃)および充填(72℃)により一本鎖部分を充填して完全な二本鎖のフラグメントを作製した。前記反応は、ベント(Vent)ポリメラーゼ(NEB)、dNTP(250μM)およびアニールさせたフラグメント(250nM)を用いて100μLの総容積で実施した。続いて、前記反応生成物の2μLを2つのPCR反応の鋳型として用い、残基1−32および1−42をコードするフラグメント(EcoRIおよびSacI制限部位が側面に接している)を作製した。(注記:Leuコドン(CTG)は、プライマー「β−Am(L+1−32/42)−5´−PCR」によって導入され、さらに前記はその後に続く2つの構築物中の最初のβ−Amアミノ酸に先行して前記クローニング目的のEcoRI部位を回復させる。)
β−アミロイド残基1−32および1−42フラグメントの調製用オリゴヌクレオチド:
β−アミロイド残基1−32および1−42フラグメントの調製用オリゴヌクレオチド:
実施例25:インフルエンザM2構築物
最近になって、完全長のHBc粒子(HBc183)(アミノ酸残基1−4を欠く)のN−末端へのM2の細胞外24アミノ酸ドメインの融合が報告された(Neirynck et al. (Oct. 1999) Nature Med., 5(10):1157−1163;およびWO99/07839)。本明細書でIM2HBcと称する構築物の模式図は下記に示すが、この場合HBcのN−末端に24量体が連結されている。
IM2HBc:
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD−HBc(5−183) 配列番号:307
最近になって、完全長のHBc粒子(HBc183)(アミノ酸残基1−4を欠く)のN−末端へのM2の細胞外24アミノ酸ドメインの融合が報告された(Neirynck et al. (Oct. 1999) Nature Med., 5(10):1157−1163;およびWO99/07839)。本明細書でIM2HBcと称する構築物の模式図は下記に示すが、この場合HBcのN−末端に24量体が連結されている。
IM2HBc:
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD−HBc(5−183) 配列番号:307
1つの例示的調製物では、前記M2エピトープはB型肝炎コアのイムノドミナントループに挿入され、ICC−1475と称される粒子を発現させることができた。前記のような挿入および精製について上記で述べた技術を用いて前記発現粒子を精製した。M2エピトープの変異バージョンであって、天然のM2の17位および19位の2つのシステイン残基がアラニン残基によって置換されたものもまたイムノドミナントループで発現され(ICC−1473)、得られた粒子は精製された。前記2つの粒子は下記に模式的に示されている。
ICC−1475:
HBc(1−78)−GI−SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD−EL−hbC(79−149) 配列番号:308
ICC−1473:HBc(1−78)−GI−SLLTEVETPIRNEWGARANDSSD−EL−HBc(79−149)−C 配列番号:309
ICC−1475:
HBc(1−78)−GI−SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD−EL−hbC(79−149) 配列番号:308
ICC−1473:HBc(1−78)−GI−SLLTEVETPIRNEWGARANDSSD−EL−HBc(79−149)−C 配列番号:309
ICC−1473構築物では、天然の配列(ICC−1475)と比較したとき約7倍多くの精製粒子が得られた。システイン残基の変異は前記粒子の防御能力を変化させるか否かはまだ決定されていない。しかしながら、HBcのイムノドミナントループに配置されたエピトープは、それらが他の領域(N−末端を含む)に融合されている場合と比較して、通常は免疫原性ははるかに高くなり、得られた粒子は抗HBc免疫原性の低下を示す。
さらに、M2のN−末端の24量体エピトープがC−末端切断B型肝炎コア粒子のN−末端と融合した粒子も調製した。前記構築物(ICC−1438)はまたN−末端プレコア配列(配列番号:310)を含んでいた。ただ1つのシステイン残基をハイブリッドタンパク質(ICC−1492)の末端に含む(この場合はHBc遺伝子のVal149の直後)同様な構築物を調製した。
ICC−1438:
MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI−HBc(2−149) 配列番号:310
ICC−1492MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI−HBc(2−149)−C 配列番号:310
さらに、M2のN−末端の24量体エピトープがC−末端切断B型肝炎コア粒子のN−末端と融合した粒子も調製した。前記構築物(ICC−1438)はまたN−末端プレコア配列(配列番号:310)を含んでいた。ただ1つのシステイン残基をハイブリッドタンパク質(ICC−1492)の末端に含む(この場合はHBc遺伝子のVal149の直後)同様な構築物を調製した。
ICC−1438:
MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI−HBc(2−149) 配列番号:310
ICC−1492MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI−HBc(2−149)−C 配列番号:310
天然のHBcイニシエーター、メチオニンから翻訳が開始するのを防ぐために、前記残基のためのコドンを変異させて、イソロイシン残基をコードさせたことは特記しておくべきであろう。EcoRI(GI)およびSacI(EL)制限部位によって提供される残基には下線が付されている。プレコア配列は下線を付したEL残基および「−HBc(249)」の間に挙げられている。
本明細書の他の場所で述べるように、SDS−PAGEによる分析によって、調製時にICC−1438モノマー構築物(レーン2)はICC−1492(レーン3)と比較してより不安定であることが示された[HBc−149(レーン1)、ICC−1475(レーン4)およびICC−1473(レーン5)はさらに別の分子量コントロールとして図9のSDS−PAGEで用いられている]。ICC−1438モノマーの不安定性は、粒子の分析用ゲルろ過では明瞭ではなかった。
本明細書の他の場所で述べるように、SDS−PAGEによる分析によって、調製時にICC−1438モノマー構築物(レーン2)はICC−1492(レーン3)と比較してより不安定であることが示された[HBc−149(レーン1)、ICC−1475(レーン4)およびICC−1473(レーン5)はさらに別の分子量コントロールとして図9のSDS−PAGEで用いられている]。ICC−1438モノマーの不安定性は、粒子の分析用ゲルろ過では明瞭ではなかった。
ICC−1475(図9、レーン4)およびICC−1473(図9、レーン5)は両方とも、ICC−1438およびICC−1492よりもわずかに小さい分子量を有すると予想された。なぜならば、前者の2つはイムノドミナトループに直接挿入されたM2エピトープを含み、したがってICC−1438およびICC−1498に存在するプレコア配列(配列番号:310)を欠くからである。予想のとおり、ICC−1492はICC−1475およびICC−1473よりも大きかったが、ICC−1438(ICC−1492と同一であるがC−末端システイン残基が省かれている)は、明らかな切断のためにICC−1475およびICC−1473よりも明らかに大きくはなかった。
HBcのN−末端(ドメインI)またはループ(ドメインII)に連結された、上記で述べたM2のN−末端細胞外配列を含み、さらにまたHBcのループ(ドメインII)またはC−末端(ドメインIV)に連結されたM2タンパク質のC−末端配列(例えば配列番号:10の配列、表Aを参照されたい)を含む構築物もまた意図される。前記のような本発明の構築物はまた、少なくとも1つの安定化C−末端システイン残基を本明細書の他の場所で考察したように含んでいる。
HBcのN−末端(ドメインI)またはループ(ドメインII)に連結された、上記で述べたM2のN−末端細胞外配列を含み、さらにまたHBcのループ(ドメインII)またはC−末端(ドメインIV)に連結されたM2タンパク質のC−末端配列(例えば配列番号:10の配列、表Aを参照されたい)を含む構築物もまた意図される。前記のような本発明の構築物はまた、少なくとも1つの安定化C−末端システイン残基を本明細書の他の場所で考察したように含んでいる。
実施例26:サルにおける比較免疫原性
V12.Pf3.1によって発現された粒子の比較免疫原性(免疫誘発性)をキノモルガスマンキー(Cynomolgus monkey)で調べた。前記は、アジュバントとしてセピック(Seppic)(登録商標)ISA−720(Seppic Inc., Paris, France)またはアルヒドロゲル(Alhydrogel)(登録商標)(Superfos, Denmark)を用いて製剤化するか、または製剤化せずに(食塩水)用いられた。
セピック(登録商標)ISA−720製剤は製造元の指示にしたがって調製した。簡単に記せば、ISA−720およびV12.Pf3.1粒子を70:30(w/w)の比率で混合し、最強パワーに設定した卓上ボルテックスミキサーで1分間攪拌した。アルヒドロゲル(登録商標)製剤は、V12.Pf3.1粒子に対して8倍過剰(重量)のアルヒドロゲル(登録商標)を用いて調製した。前記製剤は、免疫の前にアルヒドロゲル(登録商標)との物理的な結合を示した。
V12.Pf3.1によって発現された粒子の比較免疫原性(免疫誘発性)をキノモルガスマンキー(Cynomolgus monkey)で調べた。前記は、アジュバントとしてセピック(Seppic)(登録商標)ISA−720(Seppic Inc., Paris, France)またはアルヒドロゲル(Alhydrogel)(登録商標)(Superfos, Denmark)を用いて製剤化するか、または製剤化せずに(食塩水)用いられた。
セピック(登録商標)ISA−720製剤は製造元の指示にしたがって調製した。簡単に記せば、ISA−720およびV12.Pf3.1粒子を70:30(w/w)の比率で混合し、最強パワーに設定した卓上ボルテックスミキサーで1分間攪拌した。アルヒドロゲル(登録商標)製剤は、V12.Pf3.1粒子に対して8倍過剰(重量)のアルヒドロゲル(登録商標)を用いて調製した。前記製剤は、免疫の前にアルヒドロゲル(登録商標)との物理的な結合を示した。
2匹のサル(雄1匹および雌1匹)のグループを免疫原として20μgのV12.Pf3.1粒子で筋肉内ルートで免疫した。0、21、42、56および70日目で動物から採血し、ELISAを用いて血清の抗NANP抗体の力価を調べた。結果(下記の表15に示されている)は、アルヒドロゲル(登録商標)製剤化材料または非製剤化材料に対してセピック(登録商標)ISA−720で製剤化したとき、V12.Pf3.1粒子の極めて高い免疫誘発性を示している。
抗体反応の動的変化は、アジュバントとしてセピック(登録商標)ISA−720を用いたときにいっそう迅速で、終末力価はアルヒドロゲルおよび食塩水に対してそれぞれ100倍および1000倍高かった。
表15
抗体反応の動的変化は、アジュバントとしてセピック(登録商標)ISA−720を用いたときにいっそう迅速で、終末力価はアルヒドロゲルおよび食塩水に対してそれぞれ100倍および1000倍高かった。
表15
実施例27:T細胞活性化
セピック(登録商標)モンタナイド(Montanide)(登録商標)ISA−720中のV12.Pf3.1粒子でマウスを2回免疫した。脾臓細胞を取り出し、種々のペプチドの存在下で刺激した。106細胞を以下のペプチドの存在下で、ブドウ球菌のエンテロトキシンB(SEB)の存在下または組織培養液存在下(非刺激)で3日間インキュベートした:UTC(P.ファルシパルムの普遍的Tエピトープ、配列番号:120)、HBc85−100に対応するp85−100ペプチド、NANP(V12.Pf3.1のB細胞エピトープ;NANPNVDP(NANP)3、配列番号:22)。3日後のインターフェロンγの産生をELISAで決定した。
セピック(登録商標)モンタナイド(Montanide)(登録商標)ISA−720中のV12.Pf3.1粒子でマウスを2回免疫した。脾臓細胞を取り出し、種々のペプチドの存在下で刺激した。106細胞を以下のペプチドの存在下で、ブドウ球菌のエンテロトキシンB(SEB)の存在下または組織培養液存在下(非刺激)で3日間インキュベートした:UTC(P.ファルシパルムの普遍的Tエピトープ、配列番号:120)、HBc85−100に対応するp85−100ペプチド、NANP(V12.Pf3.1のB細胞エピトープ;NANPNVDP(NANP)3、配列番号:22)。3日後のインターフェロンγの産生をELISAで決定した。
下記の表16に示した結果は、V12.Pf3.1による免疫は、前記タンパク質のUTC成分を認識するT細胞を誘発すること、およびそれらT細胞をTh1型反応に向かわせることを示している。
表16
注記:*S.D.=標準偏差注記:**ND=実施せず 本明細書に引用した特許および論文は参照により本明細書に含まれる。英文明細書中で冠詞「a」または「an」が使用される場合は1つまたは2つ以上のものを含むことを意図している。
前述の記載および実施例は例示を意図しており、制限と解されるべきではない。本発明の範囲内でなお他の変更が可能であり、当業者にはそれらは容易に提示されるであろう。
表16
注記:*S.D.=標準偏差注記:**ND=実施せず 本明細書に引用した特許および論文は参照により本明細書に含まれる。英文明細書中で冠詞「a」または「an」が使用される場合は1つまたは2つ以上のものを含むことを意図している。
前述の記載および実施例は例示を意図しており、制限と解されるべきではない。本発明の範囲内でなお他の変更が可能であり、当業者にはそれらは容易に提示されるであろう。
本発明の態様として、例えば以下のものがある。
1.長さが約515までのアミノ酸残基のリコンビナントキメラB型肝炎コア(HBc)タンパク質分子であって、
(a)HBcイムノドミナントループ内に存在するペプチド結合異種エピトープもしくは共役エピトープのための異種リンカー残基を含む前記HBc分子のN−末端150アミノ酸残基の少なくとも130残基のHBc配列、またはN−末端150HBcアミノ酸残基の少なくとも約135残基の配列を含み、
(b)前記HBc配列のC−末端残基から前記分子のC−末端に向かって、さらに前記キメラ分子のC−末端から約30残基内に1つから10のシステイン残基(C−末端システイン残基)を含み、
(c)HBc135位からHBcC−末端の少なくとも5つのアミノ酸残基の配列を含み、
前記キメラ分子が、(i)20%以下の保存的置換アミノ酸残基を前記HBc配列中に含み、(ii)ホスト細胞内で発現されるとき実質的に核酸と結合しない粒子に自己会合し、さらに前記粒子が、前記C−末端システイン残基を欠くか、またはキメラ分子内に存在するC−末端システイン残基が別の残基に置換されてあるがその他の点では同一のHBcキメラから生成される粒子よりも安定である、前記リコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。
2.前記ペプチド結合異種エピトープまたは共役エピトープのための異種リンカー残基が異種エピトープである、上記1に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
3.前記異種エピトープがB細胞エピトープである、上記2に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
4.HBcのアミノ酸残基1−4の1つとペプチド結合した第二の異種エピトープを含む、上記3に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
5.前記B細胞エピトープが、アミノ酸残基76と85との間のHBc配列内のある位置でペプチド結合し、さらに76位から85位のHBc配列の少なくとも5残基が存在する、上記3に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
1.長さが約515までのアミノ酸残基のリコンビナントキメラB型肝炎コア(HBc)タンパク質分子であって、
(a)HBcイムノドミナントループ内に存在するペプチド結合異種エピトープもしくは共役エピトープのための異種リンカー残基を含む前記HBc分子のN−末端150アミノ酸残基の少なくとも130残基のHBc配列、またはN−末端150HBcアミノ酸残基の少なくとも約135残基の配列を含み、
(b)前記HBc配列のC−末端残基から前記分子のC−末端に向かって、さらに前記キメラ分子のC−末端から約30残基内に1つから10のシステイン残基(C−末端システイン残基)を含み、
(c)HBc135位からHBcC−末端の少なくとも5つのアミノ酸残基の配列を含み、
前記キメラ分子が、(i)20%以下の保存的置換アミノ酸残基を前記HBc配列中に含み、(ii)ホスト細胞内で発現されるとき実質的に核酸と結合しない粒子に自己会合し、さらに前記粒子が、前記C−末端システイン残基を欠くか、またはキメラ分子内に存在するC−末端システイン残基が別の残基に置換されてあるがその他の点では同一のHBcキメラから生成される粒子よりも安定である、前記リコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。
2.前記ペプチド結合異種エピトープまたは共役エピトープのための異種リンカー残基が異種エピトープである、上記1に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
3.前記異種エピトープがB細胞エピトープである、上記2に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
4.HBcのアミノ酸残基1−4の1つとペプチド結合した第二の異種エピトープを含む、上記3に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
5.前記B細胞エピトープが、アミノ酸残基76と85との間のHBc配列内のある位置でペプチド結合し、さらに76位から85位のHBc配列の少なくとも5残基が存在する、上記3に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
6.アミノ酸残基76から85の間の前記HBc配列は存在するが、前記B細胞エピトープによって中断されている、上記5に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
7.さらにペプチド結合異種T細胞エピトープを含む、上記2に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
8.前記T細胞エピトープがC−末端HBcアミノ酸残基とペプチド結合する、上記7に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
9.前記C−末端システイン残基が、HBcキメラタンパク質分子のC−末端の5アミノ酸残基内に存在する、上記8に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
10.前記キメラが、中断されていない1位から少なくとも140位のHBcアミノ酸残基配列、およびHBcキメラタンパク質分子のC−末端にシステイン残基を含む、上記1に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
7.さらにペプチド結合異種T細胞エピトープを含む、上記2に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
8.前記T細胞エピトープがC−末端HBcアミノ酸残基とペプチド結合する、上記7に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
9.前記C−末端システイン残基が、HBcキメラタンパク質分子のC−末端の5アミノ酸残基内に存在する、上記8に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
10.前記キメラが、中断されていない1位から少なくとも140位のHBcアミノ酸残基配列、およびHBcキメラタンパク質分子のC−末端にシステイン残基を含む、上記1に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
11.前記キメラが、中断されていない1位から149位のHBcアミノ酸残基配列を含む、上記10に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
12.前記キメラが、共役エピトープのための異種リンカー残基を含む、上記1に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
13.前記共役エピトープのための異種リンカー残基が、アミノ酸残基76と85との間のHBc配列内のある位置でペプチド結合し、さらに76位から85位のHBc配列の少なくとも4残基が存在する、上記12に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
14.アミノ酸残基76から85の間の前記HBc配列は存在するが、共役エピトープのための前記異種リンカー残基によって中断されている、上記13に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
15.1位から少なくとも140位の前記HBcアミノ酸残基配列、およびC−末端にただ1つのシステイン残基を含む、上記14に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
12.前記キメラが、共役エピトープのための異種リンカー残基を含む、上記1に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
13.前記共役エピトープのための異種リンカー残基が、アミノ酸残基76と85との間のHBc配列内のある位置でペプチド結合し、さらに76位から85位のHBc配列の少なくとも4残基が存在する、上記12に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
14.アミノ酸残基76から85の間の前記HBc配列は存在するが、共役エピトープのための前記異種リンカー残基によって中断されている、上記13に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
15.1位から少なくとも140位の前記HBcアミノ酸残基配列、およびC−末端にただ1つのシステイン残基を含む、上記14に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
16.前記キメラが、1位から149位の前記HBcアミノ酸残基配列を含む、上記15に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
17.共役エピトープのための前記異種リンカー残基が、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびチロシン残基から成る群から選択される、上記16に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
18.N−末端からドメインI、II、IIIおよびIVと称される4つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含む、長さが約135から約515のアミノ酸残基のリコンビナントB型肝炎ウイルスコア(HBc)タンパク質キメラ分子であって、
(a)ドメインIは約71から約100アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基の配列は少なくともHBcの5位から75位の残基配列を含み、さらに場合によってHBc残基1−4の1つとペプチド結合した約30までのアミノ酸残基を含む異種エピトープを含み;
(b)ドメインIIはドメインIのHBc残基75とペプチド結合した約5から約250のアミノ酸残基を含み、ここで、(i)HBcの76位から85位の配列中の0から全ての残基がHBcにとって異種である1つから約245アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープまたは共役エピトープのための異種リンカー残基を構成するか、または(ii)76位から85位のHBcの配列は異種残基とは結合せずに存在するか、または(iii)残基76から85の1つまたは2つ以上が存在せず;
(c)ドメインIIIはドメインIIの残基85とペプチド結合した86位から135位のHBc配列であり;さらに、
(d)ドメインIVは、(i)ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した136位から149位のHBcアミノ酸残基配列の0から14残基、(ii)キメラ分子のC−末端から約30残基以内に1つから10のシステイン残基(C−末端システイン残基)、および(iii)150位からC−末端のHBcにとって異種である配列中に0から約100アミノ酸残基を含み、ここで、ドメインIVは前記(ii)の1つから10のシステイン残基を含む少なくとも6つのアミノ酸残基を含むことを条件とし、
前記キメラはホスト細胞内で発現されるとき自己会合して粒子を生成し、前記粒子は実質的に核酸と結合せず、さらに前記のC−末端システイン残基を欠くか、またはキメラ分子内に存在するC−末端システイン残基が別の残基に置換されてあるがその他の点では同一のHBcキメラから生成される粒子よりも安定であり、さらに、前記キメラのHBc配列でそのアミノ酸残基の約10%以下が置換されてあるアミノ酸残基配列を有する、前記リコンビナントB型肝炎ウイルスコアタンパク質キメラ分子。
19.2つの異種エピトープを含む、上記18に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
20.前記2つの異種エピトープが、ドメインIおよびII、IIおよびIV、またはIおよびIVに存在する、上記19に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
17.共役エピトープのための前記異種リンカー残基が、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびチロシン残基から成る群から選択される、上記16に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
18.N−末端からドメインI、II、IIIおよびIVと称される4つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含む、長さが約135から約515のアミノ酸残基のリコンビナントB型肝炎ウイルスコア(HBc)タンパク質キメラ分子であって、
(a)ドメインIは約71から約100アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基の配列は少なくともHBcの5位から75位の残基配列を含み、さらに場合によってHBc残基1−4の1つとペプチド結合した約30までのアミノ酸残基を含む異種エピトープを含み;
(b)ドメインIIはドメインIのHBc残基75とペプチド結合した約5から約250のアミノ酸残基を含み、ここで、(i)HBcの76位から85位の配列中の0から全ての残基がHBcにとって異種である1つから約245アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープまたは共役エピトープのための異種リンカー残基を構成するか、または(ii)76位から85位のHBcの配列は異種残基とは結合せずに存在するか、または(iii)残基76から85の1つまたは2つ以上が存在せず;
(c)ドメインIIIはドメインIIの残基85とペプチド結合した86位から135位のHBc配列であり;さらに、
(d)ドメインIVは、(i)ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した136位から149位のHBcアミノ酸残基配列の0から14残基、(ii)キメラ分子のC−末端から約30残基以内に1つから10のシステイン残基(C−末端システイン残基)、および(iii)150位からC−末端のHBcにとって異種である配列中に0から約100アミノ酸残基を含み、ここで、ドメインIVは前記(ii)の1つから10のシステイン残基を含む少なくとも6つのアミノ酸残基を含むことを条件とし、
前記キメラはホスト細胞内で発現されるとき自己会合して粒子を生成し、前記粒子は実質的に核酸と結合せず、さらに前記のC−末端システイン残基を欠くか、またはキメラ分子内に存在するC−末端システイン残基が別の残基に置換されてあるがその他の点では同一のHBcキメラから生成される粒子よりも安定であり、さらに、前記キメラのHBc配列でそのアミノ酸残基の約10%以下が置換されてあるアミノ酸残基配列を有する、前記リコンビナントB型肝炎ウイルスコアタンパク質キメラ分子。
19.2つの異種エピトープを含む、上記18に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
20.前記2つの異種エピトープが、ドメインIおよびII、IIおよびIV、またはIおよびIVに存在する、上記19に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
21.前記2つの異種エピトープの1つがB細胞エピトープである、上記19に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
22.前記2つの異種エピトープの1つがT細胞エピトープである、上記19に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
23.前記2つの異種エピトープの1つがB細胞エピトープであり、さらに他方がT細胞エピトープである、上記19に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
24.前記ドメインIが、HBc残基1−4の1つとペプチド結合した異種エピトープを含む、上記18に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
25.ドメインIIの前記異種エピトープがB細胞エピトープである、上記24に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
22.前記2つの異種エピトープの1つがT細胞エピトープである、上記19に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
23.前記2つの異種エピトープの1つがB細胞エピトープであり、さらに他方がT細胞エピトープである、上記19に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
24.前記ドメインIが、HBc残基1−4の1つとペプチド結合した異種エピトープを含む、上記18に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
25.ドメインIIの前記異種エピトープがB細胞エピトープである、上記24に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
26.150位からC−末端のHBcにとって異種である前記配列が、HBc残基140−149の1つとペプチド結合したT細胞エピトープである、上記25に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
27.共役エピトープまたは異種エピトープのための前記異種リンカー残基が異種エピトープである、上記18に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
28.前記異種エピトープが約245までのアミノ酸残基を含む、上記27に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
29.前記異種エピトープがB細胞エピトープである、上記28に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
30.前記異種エピトープが6から約50アミノ酸残基を含む、上記27に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
27.共役エピトープまたは異種エピトープのための前記異種リンカー残基が異種エピトープである、上記18に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
28.前記異種エピトープが約245までのアミノ酸残基を含む、上記27に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
29.前記異種エピトープがB細胞エピトープである、上記28に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
30.前記異種エピトープが6から約50アミノ酸残基を含む、上記27に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
31.前記異種エピトープが20から約30のアミノ酸残基を含む上記27に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
32.前記ドメインIVが、キメラ分子のC−末端から約30残基内に1つから約5つのシステイン残基を含む、上記27に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
33.アミノ酸残基76から85の間のHBc配列は存在するが、前記異種エピトープによって中断される、上記27に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
34.前記C−末端システイン残基が、前記キメラタンパク質分子のC−末端の約5つのアミノ酸残基内に位置する、上記18に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
35.150位からC−末端のHBcにとって異種である前記配列が、HBc残基140−149の1つとペプチド結合したT細胞エピトープである、上記18に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
32.前記ドメインIVが、キメラ分子のC−末端から約30残基内に1つから約5つのシステイン残基を含む、上記27に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
33.アミノ酸残基76から85の間のHBc配列は存在するが、前記異種エピトープによって中断される、上記27に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
34.前記C−末端システイン残基が、前記キメラタンパク質分子のC−末端の約5つのアミノ酸残基内に位置する、上記18に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
35.150位からC−末端のHBcにとって異種である前記配列が、HBc残基140−149の1つとペプチド結合したT細胞エピトープである、上記18に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
36.共役エピトープまたは異種エピトープのための前記異種リンカー残基が、共役エピトープのための異種リンカー残基である、上記18に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
37.共役エピトープのための前記異種リンカーが、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびチロシン残基から成る群から選択される、上記36に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
38.前記HBcキメラタンパク質分子のC−末端にただ1つのシステイン残基を含む、上記37に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
39.前記キメラが、から少なくとも140位まで中断されないHBcアミノ酸残基配列を含む、上記18に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
40.前記非中断HBcアミノ酸残基配列が残基1を含む、上記39に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
37.共役エピトープのための前記異種リンカーが、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびチロシン残基から成る群から選択される、上記36に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
38.前記HBcキメラタンパク質分子のC−末端にただ1つのシステイン残基を含む、上記37に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
39.前記キメラが、から少なくとも140位まで中断されないHBcアミノ酸残基配列を含む、上記18に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
40.前記非中断HBcアミノ酸残基配列が残基1を含む、上記39に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
41.前記非中断HBcアミノ酸残基配列が残基149を含む、上記39に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
42.N−末端からドメインI、II、IIIおよびIVと称される4つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含む、約175から約240アミノ酸残基の長さを有するリコンビナントB型肝炎ウイルスコア(HBc)タンパク質キメラ分子であって、
(a)ドメインIが、HBcの1位から75位の残基配列を含み;
(b)ドメインIIがドメインIのHBc残基75とペプチド結合した約5から約55のアミノ酸残基を含み、ここでHBcの76位から85位の配列中の少なくとも4つの残基がHBcにとって異種である6から約50アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープを構成し;
(c)ドメインIIIはドメインIIの残基85とペプチド結合した86位から135位のHBc配列であり;さらに、
(d)ドメインIVは、(i)ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した136位から149位のHBcアミノ酸残基配列の5から14残基、(ii)キメラ分子のC−末端から約30残基以内に1つのシステイン残基(C−末端システイン残基)、および(iii)150位からC−末端のHBcにとって異種である配列内に0から約50アミノ酸残基を含み、
前記キメラはホスト細胞内で発現されるとき自己会合して粒子を生成し、前記粒子は、280nm対260nm吸収比が約1.2から約1.6を示し、さらに前記のC−末端システイン残基を欠くか、またはキメラ分子内に存在するC−末端システイン残基が別の残基に置換されてあるがその他の点では同一のHBcキメラから生成される粒子よりも安定であり、さらに前記キメラのHBc配列で約5%以下のアミノ酸残基が置換されてあるアミノ酸残基配列を有する、前記リコンビナントB型肝炎ウイルスコアタンパク質キメラ分子。
43.ドメインIIの前記異種エピトープがB細胞エピトープである、上記42に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
44.前記異種エピトープが15から約50アミノ酸残基を含む、上記43に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
45.前記異種エピトープが20から約30アミノ酸残基を含む、上記43に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
42.N−末端からドメインI、II、IIIおよびIVと称される4つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含む、約175から約240アミノ酸残基の長さを有するリコンビナントB型肝炎ウイルスコア(HBc)タンパク質キメラ分子であって、
(a)ドメインIが、HBcの1位から75位の残基配列を含み;
(b)ドメインIIがドメインIのHBc残基75とペプチド結合した約5から約55のアミノ酸残基を含み、ここでHBcの76位から85位の配列中の少なくとも4つの残基がHBcにとって異種である6から約50アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープを構成し;
(c)ドメインIIIはドメインIIの残基85とペプチド結合した86位から135位のHBc配列であり;さらに、
(d)ドメインIVは、(i)ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した136位から149位のHBcアミノ酸残基配列の5から14残基、(ii)キメラ分子のC−末端から約30残基以内に1つのシステイン残基(C−末端システイン残基)、および(iii)150位からC−末端のHBcにとって異種である配列内に0から約50アミノ酸残基を含み、
前記キメラはホスト細胞内で発現されるとき自己会合して粒子を生成し、前記粒子は、280nm対260nm吸収比が約1.2から約1.6を示し、さらに前記のC−末端システイン残基を欠くか、またはキメラ分子内に存在するC−末端システイン残基が別の残基に置換されてあるがその他の点では同一のHBcキメラから生成される粒子よりも安定であり、さらに前記キメラのHBc配列で約5%以下のアミノ酸残基が置換されてあるアミノ酸残基配列を有する、前記リコンビナントB型肝炎ウイルスコアタンパク質キメラ分子。
43.ドメインIIの前記異種エピトープがB細胞エピトープである、上記42に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
44.前記異種エピトープが15から約50アミノ酸残基を含む、上記43に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
45.前記異種エピトープが20から約30アミノ酸残基を含む、上記43に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
46.アミノ酸残基76から85の間のHBc配列は存在するが、前記異種エピトープで中断される、上記43に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
47.前記B細胞エピトープが下記から成る群から選択される病原体に存在するアミノ酸配列である、上記43に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子:肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumonia)、クリプトスポリジウム・パルブム(Cryptosporidium parvum)、HIV、口蹄疫ウイルス、インフルエンザウイルス、ペスト菌(Yersinia pestis)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、ポルフィロモナス・ギンギバリス(Porphyromonas gingivalis)、クルーズトリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、げっ歯類住血胞子虫(Plasmodium berghi)、プラスモジウム・ヨエリー(Plasmodium yoelli)、ストレプトコッカス・ソブリヌス(Streptococcus sobrinus)、フレキシナー菌(Shigella flexneri)、RSV、プラスモジウム・エントアメーバ・ヒストリティカ(Plasmodium Entamoeba histolytica)、日本住血吸虫(Schistosoma japonicum)、マンソニ住血吸虫(Schistosoma mansoni)、ウシインヒビンおよびエボラウイルス。
48.前記150位からC−末端までのHBcにとって異種の配列がHBc残基140−149の1つとペプチド結合したT細胞エピトープである、上記43に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
49.前記T細胞エピトープが、目的のキメラを免疫原として用いようとしている対象生物に由来する、上記48に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
50.前記C−末端システイン残基が、前記キメラタンパク質分子のC−末端の約5つのアミノ酸残基内に位置する、上記43に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
47.前記B細胞エピトープが下記から成る群から選択される病原体に存在するアミノ酸配列である、上記43に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子:肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumonia)、クリプトスポリジウム・パルブム(Cryptosporidium parvum)、HIV、口蹄疫ウイルス、インフルエンザウイルス、ペスト菌(Yersinia pestis)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、ポルフィロモナス・ギンギバリス(Porphyromonas gingivalis)、クルーズトリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、げっ歯類住血胞子虫(Plasmodium berghi)、プラスモジウム・ヨエリー(Plasmodium yoelli)、ストレプトコッカス・ソブリヌス(Streptococcus sobrinus)、フレキシナー菌(Shigella flexneri)、RSV、プラスモジウム・エントアメーバ・ヒストリティカ(Plasmodium Entamoeba histolytica)、日本住血吸虫(Schistosoma japonicum)、マンソニ住血吸虫(Schistosoma mansoni)、ウシインヒビンおよびエボラウイルス。
48.前記150位からC−末端までのHBcにとって異種の配列がHBc残基140−149の1つとペプチド結合したT細胞エピトープである、上記43に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
49.前記T細胞エピトープが、目的のキメラを免疫原として用いようとしている対象生物に由来する、上記48に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
50.前記C−末端システイン残基が、前記キメラタンパク質分子のC−末端の約5つのアミノ酸残基内に位置する、上記43に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
51.リコンビナントB型肝炎コア(HBc)キメラタンパク質分子で構成された免疫原性粒子であって、前記キメラタンパク質が(i)そのN−末端、HBc免疫原性ループまたはC−末端に1つまたは2つ以上の免疫原性エピトープを提示するか、または(ii)共役エピトープのための異種リンカー残基を前記HBc免疫原性ループ内に有し、さらにシステイン残基を前記C−末端またはC−末端近傍に含み、前記粒子は実質的に核酸と結合せず、さらに前記システイン残基を含まないことを除いて他の点では同一のタンパク質で構成された粒子と比較して安定性の強化を示す前記免疫原性粒子。
52.約1.2から約1.7の280/260吸収比を示す上記51に記載の免疫原性粒子。
53.そのリコンビナントHBcキメラタンパク質が前記N−末端に免疫原性エピトープを提示する上記51に記載の免疫原性粒子。
54.そのリコンビナントHBcキメラタンパク質が前記C−末端に免疫原性エピトープを提示する上記51に記載の免疫原性粒子。
55.そのリコンビナントHBcキメラタンパク質が前記免疫原性ループ内に免疫原性エピトープを提示する上記51に記載の免疫原性粒子。
52.約1.2から約1.7の280/260吸収比を示す上記51に記載の免疫原性粒子。
53.そのリコンビナントHBcキメラタンパク質が前記N−末端に免疫原性エピトープを提示する上記51に記載の免疫原性粒子。
54.そのリコンビナントHBcキメラタンパク質が前記C−末端に免疫原性エピトープを提示する上記51に記載の免疫原性粒子。
55.そのリコンビナントHBcキメラタンパク質が前記免疫原性ループ内に免疫原性エピトープを提示する上記51に記載の免疫原性粒子。
56.そのリコンビナントHBcキメラタンパク質がB細胞免疫原性エピトープを提示する上記1に記載の免疫原性粒子。
57.そのリコンビナントHBcキメラタンパク質がT細胞免疫原性エピトープを提示する上記51に記載の免疫原性粒子。
58.そのリコンビナントHBcキメラタンパク質が別々にB細胞およびT細胞免疫原性エピトープを提示する上記51に記載の免疫原性粒子。
59.そのリコンビナントHBcキメラタンパク質が、共役エピトープのための異種リンカー残基を前記HBc免疫原性ループ内に有する上記51に記載の免疫原性粒子。
60.前記共役エピトープのための異種リンカー残基が、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびチロシン残基から成る群から選択される、上記59に記載の免疫原性粒子。
57.そのリコンビナントHBcキメラタンパク質がT細胞免疫原性エピトープを提示する上記51に記載の免疫原性粒子。
58.そのリコンビナントHBcキメラタンパク質が別々にB細胞およびT細胞免疫原性エピトープを提示する上記51に記載の免疫原性粒子。
59.そのリコンビナントHBcキメラタンパク質が、共役エピトープのための異種リンカー残基を前記HBc免疫原性ループ内に有する上記51に記載の免疫原性粒子。
60.前記共役エピトープのための異種リンカー残基が、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびチロシン残基から成る群から選択される、上記59に記載の免疫原性粒子。
61.前記共役エピトープのための異種リンカー残基がハプテンに共役される、上記60に記載の免疫原性粒子。
62.前記ハプテンがオリゴ糖である上記61に記載の免疫原性粒子。
63.多数のリコンビナントキメラB型肝炎コア(HBc)タンパク質分子で構成される免疫原性粒子であって、
前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子が、約515までのアミノ酸残基の長さを有し、残基アミノ酸残基が、
(a)HBcイムノドミナントループ内に存在するペプチド結合異種エピトープもしくは共役エピトープのための異種リンカー残基を含む前記HBc分子のN−末端150アミノ酸残基の少なくとも130残基のHBc配列、またはN−末端150HBcアミノ酸残基の少なくとも約135残基の配列を含み、
(b)前記HBc配列のC−末端残基から前記分子のC−末端に向かって、さらに前記キメラ分子のC−末端から約30残基内に1つから10のシステイン残基(C−末端システイン残基)を含み、
(c)HBc135位からHBcC−末端の少なくとも6つのアミノ酸残基配列を含み、
前記キメラ分子は、前記HBc配列中に10%以下の保存的置換アミノ酸残基を含み、さらに
前記粒子は実質的に核酸と結合せず、さらに前記粒子は、前記C−末端システイン残基を欠くか、またはキメラ分子内に存在するC−末端システイン残基が別の残基に置換されてあるがその他の点では同一のHBcキメラから生成される粒子よりも安定であり、さらに、前記キメラのHBc配列で約20%以下のアミノ酸残基が置換されてあるアミノ酸残基を有する、前記免疫原性粒子。
64.約1.4から約1.6の280nm対260nm吸収比を示す上記63に記載の免疫原性粒子。
65.前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子の長さが約175から約240アミノ酸残基である上記63に記載の免疫原性粒子。
62.前記ハプテンがオリゴ糖である上記61に記載の免疫原性粒子。
63.多数のリコンビナントキメラB型肝炎コア(HBc)タンパク質分子で構成される免疫原性粒子であって、
前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子が、約515までのアミノ酸残基の長さを有し、残基アミノ酸残基が、
(a)HBcイムノドミナントループ内に存在するペプチド結合異種エピトープもしくは共役エピトープのための異種リンカー残基を含む前記HBc分子のN−末端150アミノ酸残基の少なくとも130残基のHBc配列、またはN−末端150HBcアミノ酸残基の少なくとも約135残基の配列を含み、
(b)前記HBc配列のC−末端残基から前記分子のC−末端に向かって、さらに前記キメラ分子のC−末端から約30残基内に1つから10のシステイン残基(C−末端システイン残基)を含み、
(c)HBc135位からHBcC−末端の少なくとも6つのアミノ酸残基配列を含み、
前記キメラ分子は、前記HBc配列中に10%以下の保存的置換アミノ酸残基を含み、さらに
前記粒子は実質的に核酸と結合せず、さらに前記粒子は、前記C−末端システイン残基を欠くか、またはキメラ分子内に存在するC−末端システイン残基が別の残基に置換されてあるがその他の点では同一のHBcキメラから生成される粒子よりも安定であり、さらに、前記キメラのHBc配列で約20%以下のアミノ酸残基が置換されてあるアミノ酸残基を有する、前記免疫原性粒子。
64.約1.4から約1.6の280nm対260nm吸収比を示す上記63に記載の免疫原性粒子。
65.前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子の長さが約175から約240アミノ酸残基である上記63に記載の免疫原性粒子。
66.前記ペプチド結合異種エピトープまたは共役エピトープのための異種リンカーが、異種エピトープである上記63に記載の免疫原性粒子。
67.前記異種エピトープがB細胞エピトープである、上記66に記載の免疫原性粒子。
68.前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子の長さが約435までのアミノ酸残基である上記63に記載の免疫原性粒子。
69.HBcのアミノ酸残基1−4の1つとペプチド結合した第二の異種エピトープを含む上記63に記載の免疫原性粒子。
70.前記B細胞エピトープが、アミノ酸残基76から85の間のHBc配列内のある位置でペプチド結合されてあり、さらに76位から85位のHBc配列の少なくとも5残基が存在する、上記68に記載の免疫原性粒子。
67.前記異種エピトープがB細胞エピトープである、上記66に記載の免疫原性粒子。
68.前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子の長さが約435までのアミノ酸残基である上記63に記載の免疫原性粒子。
69.HBcのアミノ酸残基1−4の1つとペプチド結合した第二の異種エピトープを含む上記63に記載の免疫原性粒子。
70.前記B細胞エピトープが、アミノ酸残基76から85の間のHBc配列内のある位置でペプチド結合されてあり、さらに76位から85位のHBc配列の少なくとも5残基が存在する、上記68に記載の免疫原性粒子。
71.前記アミノ酸残基76から85の間のHBc配列は存在するが、前記B細胞エピトープによって中断されている上記70に記載の免疫原性粒子。
72.さらにペプチド結合させた異種T細胞エピトープを含む、上記68に記載の免疫原性粒子。
73.前記T細胞エピトープが、C−末端のHBcアミノ酸残基とペプチド結合されてある上記72に記載の免疫原性粒子。
74.前記C−末端システイン残基が、前記HBcキメラタンパク質分子のC−末端の5アミノ酸残基内に存在する上記73に記載の免疫原性粒子。
75.前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子が、約135から約515のアミノ酸残基の長さを有し、さらにN−末端からドメインI、II、IIIおよびIVと称される4つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含み、ここで、
(a)ドメインIは約71から約100アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基の配列は少なくともHBcの5位から75位の残基配列を含み、場合によってHBc残基1−4の1つとペプチド結合した約30までのアミノ酸残基を含む異種エピトープを含み;
(b)ドメインIIはドメインIのHBc残基75とペプチド結合した約5から約250アミノ酸残基を含み、ここで、(i)HBcの76位から85位の配列中の0から全ての残基がHBcにとって異種である1つから約245アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープまたは共役エピトープのための異種リンカー残基を構成するか、または(ii)76位から85位のHBcの配列は異種残基とは結合せずに存在し;
(c)ドメインIIIはドメインIIの残基85とペプチド結合した86位から135位のHBc配列であり;さらに、
(d)ドメインIVは、(i)ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した136位から149位のHBcアミノ酸残基配列の0から14残基、(ii)キメラ分子のC−末端から約30残基以内に1つから10のシステイン残基(C−末端システイン残基)、および(iii)150位からC−末端のHBcにとって異種である配列内に0から約100アミノ酸残基を含み、ここで、ドメインIVは前記(ii)の1つから10のシステイン残基を含む少なくとも6アミノ酸残基を含むことを条件とし、
前記キメラタンパク質が、HBc配列で約10%以下のアミノ酸残基が置換されてあるアミノ酸残基配列を有する、上記63に記載の免疫原性粒子。
72.さらにペプチド結合させた異種T細胞エピトープを含む、上記68に記載の免疫原性粒子。
73.前記T細胞エピトープが、C−末端のHBcアミノ酸残基とペプチド結合されてある上記72に記載の免疫原性粒子。
74.前記C−末端システイン残基が、前記HBcキメラタンパク質分子のC−末端の5アミノ酸残基内に存在する上記73に記載の免疫原性粒子。
75.前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子が、約135から約515のアミノ酸残基の長さを有し、さらにN−末端からドメインI、II、IIIおよびIVと称される4つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含み、ここで、
(a)ドメインIは約71から約100アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基の配列は少なくともHBcの5位から75位の残基配列を含み、場合によってHBc残基1−4の1つとペプチド結合した約30までのアミノ酸残基を含む異種エピトープを含み;
(b)ドメインIIはドメインIのHBc残基75とペプチド結合した約5から約250アミノ酸残基を含み、ここで、(i)HBcの76位から85位の配列中の0から全ての残基がHBcにとって異種である1つから約245アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープまたは共役エピトープのための異種リンカー残基を構成するか、または(ii)76位から85位のHBcの配列は異種残基とは結合せずに存在し;
(c)ドメインIIIはドメインIIの残基85とペプチド結合した86位から135位のHBc配列であり;さらに、
(d)ドメインIVは、(i)ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した136位から149位のHBcアミノ酸残基配列の0から14残基、(ii)キメラ分子のC−末端から約30残基以内に1つから10のシステイン残基(C−末端システイン残基)、および(iii)150位からC−末端のHBcにとって異種である配列内に0から約100アミノ酸残基を含み、ここで、ドメインIVは前記(ii)の1つから10のシステイン残基を含む少なくとも6アミノ酸残基を含むことを条件とし、
前記キメラタンパク質が、HBc配列で約10%以下のアミノ酸残基が置換されてあるアミノ酸残基配列を有する、上記63に記載の免疫原性粒子。
76.ドメインIIに共役エピトープのための異種リンカー残基を含み、さらに前記異種リンカー残基と結合したハプテンを含む上記75に記載の免疫原性粒子。
77.前記ハプテンがB細胞免疫原である上記76に記載の免疫原性粒子。
78.前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子が、約175から約240のアミノ酸残基を有し、さらにN−末端からドメインI、II、IIIおよびIVと称される4つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含み、ここで、
(a)ドメインIは、HBcの1位から75位の残基配列を含み;
(b)ドメインIIは、ドメインIのHBc残基75とペプチド結合した約5から約55アミノ酸残基を含み、ここで、HBcの76位から85位の配列中の少なくとも4残基が、HBcにとって異種である6から約50アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープを構成し;
(c)ドメインIIIは、ドメインIIの残基85とペプチド結合した86位から135位のHBc配列であり;さらに、
(d)ドメインIVは、(i)ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した136位から149位のHBcアミノ酸残基配列の5から14残基、(ii)キメラ分子のC−末端から約30残基以内に1つから約5つのシステイン残基(C−末端システイン残基)、および(iii)150位からC−末端のHBcにとって異種である配列内に0から約50アミノ酸残基を含み、
前記粒子が、約1.4から約1.6の280nm対260nm吸収比を示し、さらに前記キメラHBcタンパク質が、HBc配列で約5%以下のアミノ酸残基が置換されてあるアミノ酸残基配列を有する上記63に記載の免疫原性粒子。
79.医薬として許容できる希釈剤に溶解または分散された免疫誘発に有効な量の免疫原性粒子を含むワクチンまたは接種物であって、前記免疫原性粒子が多数のリコンビナントキメラB型肝炎コア(HBc)タンパク質分子で構成され、ここで、前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子が、約515までのアミノ酸残基の長さを有し、前記アミノ酸残基が、
(a)HBcイムノドミナントループ内に存在するペプチド結合異種エピトープもしくは共役エピトープのための異種リンカー残基を含む前記HBc分子のN−末端150アミノ酸残基の少なくとも約130残基の配列、またはN−末端150HBcアミノ酸残基の少なくとも約135残基の配列を含み、
(b)前記HBc配列のC−末端残基から前記分子のC−末端に向かって、さらに前記キメラ分子のC−末端から約30残基内に1つから10のシステイン残基(C−末端システイン残基)を含み、
(c)HBc135位からHBcC−末端の少なくとも6つのアミノ酸残基配列を含み、
前記キメラ分子は、前記HBc配列内に20%以下の保存的置換アミノ酸残基を含み、さらに
前記粒子は実質的に核酸と結合せず、さらに前記粒子は、前記C−末端システイン残基を欠くか、またはキメラ分子内に存在するC−末端システイン残基が別の残基に置換されてあるがその他の点では同一のHBcキメラから生成される粒子よりも安定である前記ワクチンまたは接種物。
80.前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子が、約135から約515のアミノ酸残基の長さを有し、さらにN−末端からドメインI、II、IIIおよびIVと称される4つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含み、ここで、
(a)ドメインIは、約71から約100アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基の配列が少なくともHBcの5位から75位の残基配列を含み、場合によってHBc残基1−4の1つとペプチド結合した約30までのアミノ酸残基を含む異種エピトープを含み;
(b)ドメインIIは、ドメインIのHBc残基75とペプチド結合した約5から約250アミノ酸残基を含み、ここで、(i)HBcの76位から85位の配列中の少なくとも4つの残基はHBcにとって異種である1つから約245アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープまたは共役エピトープのための異種リンカー残基を構成するか、または(ii)76位から85位のHBcの配列は異種残基とは結合せずに存在し; (c)ドメインIIIはドメインIIの残基85とペプチド結合した86位から135位のHBc配列であり;さらに、
(d)ドメインIVは、(i)ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した136位から149位のHBcアミノ酸残基配列の0から14残基、(ii)キメラ分子のC−末端から約30残基以内に1つから10のシステイン残基(C−末端システイン残基)、および(iii)150位からC−末端のHBcにとって異種である配列内に0から約100アミノ酸残基を含み、ここで、ドメインIVは前記(ii)の1つから10のシステイン残基を含む少なくとも6つのアミノ酸残基を含むことを条件とし、
前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子が、前記HBc配列で約5%以下のアミノ酸残基が置換されてあるアミノ酸残基配列を有する、上記79に記載のワクチンまたは接種物。
77.前記ハプテンがB細胞免疫原である上記76に記載の免疫原性粒子。
78.前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子が、約175から約240のアミノ酸残基を有し、さらにN−末端からドメインI、II、IIIおよびIVと称される4つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含み、ここで、
(a)ドメインIは、HBcの1位から75位の残基配列を含み;
(b)ドメインIIは、ドメインIのHBc残基75とペプチド結合した約5から約55アミノ酸残基を含み、ここで、HBcの76位から85位の配列中の少なくとも4残基が、HBcにとって異種である6から約50アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープを構成し;
(c)ドメインIIIは、ドメインIIの残基85とペプチド結合した86位から135位のHBc配列であり;さらに、
(d)ドメインIVは、(i)ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した136位から149位のHBcアミノ酸残基配列の5から14残基、(ii)キメラ分子のC−末端から約30残基以内に1つから約5つのシステイン残基(C−末端システイン残基)、および(iii)150位からC−末端のHBcにとって異種である配列内に0から約50アミノ酸残基を含み、
前記粒子が、約1.4から約1.6の280nm対260nm吸収比を示し、さらに前記キメラHBcタンパク質が、HBc配列で約5%以下のアミノ酸残基が置換されてあるアミノ酸残基配列を有する上記63に記載の免疫原性粒子。
79.医薬として許容できる希釈剤に溶解または分散された免疫誘発に有効な量の免疫原性粒子を含むワクチンまたは接種物であって、前記免疫原性粒子が多数のリコンビナントキメラB型肝炎コア(HBc)タンパク質分子で構成され、ここで、前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子が、約515までのアミノ酸残基の長さを有し、前記アミノ酸残基が、
(a)HBcイムノドミナントループ内に存在するペプチド結合異種エピトープもしくは共役エピトープのための異種リンカー残基を含む前記HBc分子のN−末端150アミノ酸残基の少なくとも約130残基の配列、またはN−末端150HBcアミノ酸残基の少なくとも約135残基の配列を含み、
(b)前記HBc配列のC−末端残基から前記分子のC−末端に向かって、さらに前記キメラ分子のC−末端から約30残基内に1つから10のシステイン残基(C−末端システイン残基)を含み、
(c)HBc135位からHBcC−末端の少なくとも6つのアミノ酸残基配列を含み、
前記キメラ分子は、前記HBc配列内に20%以下の保存的置換アミノ酸残基を含み、さらに
前記粒子は実質的に核酸と結合せず、さらに前記粒子は、前記C−末端システイン残基を欠くか、またはキメラ分子内に存在するC−末端システイン残基が別の残基に置換されてあるがその他の点では同一のHBcキメラから生成される粒子よりも安定である前記ワクチンまたは接種物。
80.前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子が、約135から約515のアミノ酸残基の長さを有し、さらにN−末端からドメインI、II、IIIおよびIVと称される4つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含み、ここで、
(a)ドメインIは、約71から約100アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基の配列が少なくともHBcの5位から75位の残基配列を含み、場合によってHBc残基1−4の1つとペプチド結合した約30までのアミノ酸残基を含む異種エピトープを含み;
(b)ドメインIIは、ドメインIのHBc残基75とペプチド結合した約5から約250アミノ酸残基を含み、ここで、(i)HBcの76位から85位の配列中の少なくとも4つの残基はHBcにとって異種である1つから約245アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープまたは共役エピトープのための異種リンカー残基を構成するか、または(ii)76位から85位のHBcの配列は異種残基とは結合せずに存在し; (c)ドメインIIIはドメインIIの残基85とペプチド結合した86位から135位のHBc配列であり;さらに、
(d)ドメインIVは、(i)ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した136位から149位のHBcアミノ酸残基配列の0から14残基、(ii)キメラ分子のC−末端から約30残基以内に1つから10のシステイン残基(C−末端システイン残基)、および(iii)150位からC−末端のHBcにとって異種である配列内に0から約100アミノ酸残基を含み、ここで、ドメインIVは前記(ii)の1つから10のシステイン残基を含む少なくとも6つのアミノ酸残基を含むことを条件とし、
前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子が、前記HBc配列で約5%以下のアミノ酸残基が置換されてあるアミノ酸残基配列を有する、上記79に記載のワクチンまたは接種物。
81.ドメインIIに共役エピトープのための異種リンカー残基を含み、さらに前記異種リンカー残基に結合したハプテンを含む、上記80に記載のワクチンまたは接種物。
82.前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子が、約175から約240のアミノ酸残基の長さを有し、さらにN−末端からドメインI、II、IIIおよびIVと称される4つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含み、ここで、
(a)ドメインIは、HBcの1位から75位の残基配列を含み;
(b)ドメインIIは、ドメインIのHBc残基75とペプチド結合した約5から約55アミノ酸残基を含み、ここで、HBcの76位から85位の配列中の少なくとも4つの残基が、HBcにとって異種である6から約50アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープを構成し;
(c)ドメインIIIは、ドメインIIの残基85とペプチド結合した86位から135位のHBc配列であり;さらに、
(d)ドメインIVは、(i)ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した136位から149位のHBcアミノ酸残基配列の5から14の残基、および(ii)150位からC−末端のHBcにとって異種である配列内に0から約50アミノ酸残基を含み、
前記粒子が、約1.4から約1.6の280nm対260nm吸収比を示す、上記79に記載のワクチンまたは接種物。
83.非経口投与用に適用させた上記79に記載のワクチンまたは接種物。
84.粘膜免疫用に適用させた上記79に記載のワクチンまたは接種物。
85.前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子粒子が、腸チフス菌(S. typhi)、ネズミチフス菌(S. typhimurium)またはネズミチフス菌−大腸菌ハイブリッドの弱毒株に存在する、上記79に記載のワクチンまたは接種物。
82.前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子が、約175から約240のアミノ酸残基の長さを有し、さらにN−末端からドメインI、II、IIIおよびIVと称される4つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含み、ここで、
(a)ドメインIは、HBcの1位から75位の残基配列を含み;
(b)ドメインIIは、ドメインIのHBc残基75とペプチド結合した約5から約55アミノ酸残基を含み、ここで、HBcの76位から85位の配列中の少なくとも4つの残基が、HBcにとって異種である6から約50アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープを構成し;
(c)ドメインIIIは、ドメインIIの残基85とペプチド結合した86位から135位のHBc配列であり;さらに、
(d)ドメインIVは、(i)ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した136位から149位のHBcアミノ酸残基配列の5から14の残基、および(ii)150位からC−末端のHBcにとって異種である配列内に0から約50アミノ酸残基を含み、
前記粒子が、約1.4から約1.6の280nm対260nm吸収比を示す、上記79に記載のワクチンまたは接種物。
83.非経口投与用に適用させた上記79に記載のワクチンまたは接種物。
84.粘膜免疫用に適用させた上記79に記載のワクチンまたは接種物。
85.前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子粒子が、腸チフス菌(S. typhi)、ネズミチフス菌(S. typhimurium)またはネズミチフス菌−大腸菌ハイブリッドの弱毒株に存在する、上記79に記載のワクチンまたは接種物。
86.前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子粒子が植物組織に存在する、上記79に記載のワクチンまたは接種物。
87.さらにアジュバントを含む上記79に記載のワクチンまたは接種物。
88.前記アジュバントがミョウバンである上記87に記載のワクチンまたは接種物。
89.前記アジュバントが、ムラミルジペプチド、7−置換−8−オキソ−もしくは8−スルホ−グアノシン誘導体、モノホスホリル脂質A、アルミニウムもしくはカルシウム塩から成る群から選択される小分子である、上記87に記載のワクチンまたは接種物。
90.前記アジュバントが、前記免疫原性粒子および前記医薬として許容できる希釈剤とともに乳化される油である、上記87に記載のワクチンまたは接種物。
87.さらにアジュバントを含む上記79に記載のワクチンまたは接種物。
88.前記アジュバントがミョウバンである上記87に記載のワクチンまたは接種物。
89.前記アジュバントが、ムラミルジペプチド、7−置換−8−オキソ−もしくは8−スルホ−グアノシン誘導体、モノホスホリル脂質A、アルミニウムもしくはカルシウム塩から成る群から選択される小分子である、上記87に記載のワクチンまたは接種物。
90.前記アジュバントが、前記免疫原性粒子および前記医薬として許容できる希釈剤とともに乳化される油である、上記87に記載のワクチンまたは接種物。
91.前記乳剤が水相および油相を有する油中水である、上記90に記載のワクチンまたは接種物。
92.前記乳剤が水相および油相を有する水中油である、上記90に記載のワクチンまたは接種物。
93.前記乳剤の油相がスクァレンを含む、上記92に記載のワクチンまたは接種物。
94.前記乳剤の油相がスクァレンを含む、上記92に記載のワクチンまたは接種物。
95.前記乳剤の水相および油相が、ソルビタンまたはマンニッドC12−C24脂肪酸エステルである乳化剤によって乳化される、上記90に記載のワクチンまたは接種物。
92.前記乳剤が水相および油相を有する水中油である、上記90に記載のワクチンまたは接種物。
93.前記乳剤の油相がスクァレンを含む、上記92に記載のワクチンまたは接種物。
94.前記乳剤の油相がスクァレンを含む、上記92に記載のワクチンまたは接種物。
95.前記乳剤の水相および油相が、ソルビタンまたはマンニッドC12−C24脂肪酸エステルである乳化剤によって乳化される、上記90に記載のワクチンまたは接種物。
96.前記乳化剤がマンニッドC12−C24脂肪酸エステルである、上記95に記載のワクチンまたは接種物。
97.前記マンニッドC12−C24脂肪酸エステルの前記C12−C24脂肪酸がオレイン酸である、上記96に記載のワクチンまたは接種物。
98.上記1に記載のリコンビナントHBcタンパク質分子をコードする核酸、またはその変種、類似体もしくは相補物。
99.上記18に記載のリコンビナントHBcタンパク質分子をコードする核酸、またはその変種、類似体もしくは相補物。
100.上記42に記載のリコンビナントHBcタンパク質分子をコードする核酸、またはその変種、類似体もしくは相補物。
97.前記マンニッドC12−C24脂肪酸エステルの前記C12−C24脂肪酸がオレイン酸である、上記96に記載のワクチンまたは接種物。
98.上記1に記載のリコンビナントHBcタンパク質分子をコードする核酸、またはその変種、類似体もしくは相補物。
99.上記18に記載のリコンビナントHBcタンパク質分子をコードする核酸、またはその変種、類似体もしくは相補物。
100.上記42に記載のリコンビナントHBcタンパク質分子をコードする核酸、またはその変種、類似体もしくは相補物。
101.上記1に記載のリコンビナントHBcタンパク質分子をコードする遺伝子を規定する核酸セグメント、またはその変種、類似体もしくは相補物に機能できるように連結されたベクター、および適合ホスト生物中で前記遺伝子の発現を駆動させるために適したプロモーターを含むリコンビナント核酸分子。
102.上記18に記載のリコンビナントHBcタンパク質分子をコードする遺伝子を規定する核酸セグメント、またはその変種、類似体もしくは相補物に機能できるように連結されたベクター、および適合ホスト生物中で前記遺伝子の発現を駆動させるために適したプロモーターを含むリコンビナント核酸分子。
103.上記42に記載のリコンビナントHBcタンパク質分子をコードする遺伝子を規定する核酸セグメント、またはその変種、類似体もしくは相補物に機能できるように連結されたベクター、および適合ホスト生物中で前記遺伝子の発現を駆動させるために適したプロモーターを含むリコンビナント核酸分子。
104.上記101に記載のリコンビナント核酸分子で形質転換されたホスト細胞。
105.前記ホスト細胞が、CHO、VEROもしくはCOS細胞、大腸菌、ビール酵母菌、ピキア・パストリス・ティフィー(Pichia pastoris typhi)、ネズミチフス菌およびネズミチフス菌−大腸菌ハイブリッドから成る群から選択される、上記104に記載の形質転換ホスト細胞。
102.上記18に記載のリコンビナントHBcタンパク質分子をコードする遺伝子を規定する核酸セグメント、またはその変種、類似体もしくは相補物に機能できるように連結されたベクター、および適合ホスト生物中で前記遺伝子の発現を駆動させるために適したプロモーターを含むリコンビナント核酸分子。
103.上記42に記載のリコンビナントHBcタンパク質分子をコードする遺伝子を規定する核酸セグメント、またはその変種、類似体もしくは相補物に機能できるように連結されたベクター、および適合ホスト生物中で前記遺伝子の発現を駆動させるために適したプロモーターを含むリコンビナント核酸分子。
104.上記101に記載のリコンビナント核酸分子で形質転換されたホスト細胞。
105.前記ホスト細胞が、CHO、VEROもしくはCOS細胞、大腸菌、ビール酵母菌、ピキア・パストリス・ティフィー(Pichia pastoris typhi)、ネズミチフス菌およびネズミチフス菌−大腸菌ハイブリッドから成る群から選択される、上記104に記載の形質転換ホスト細胞。
106.上記102に記載のリコンビナント核酸分子で形質転換されたホスト細胞。
107.前記ホスト細胞が、CHO、VEROもしくはCOS細胞、大腸菌、ビール酵母菌、ピキア・パストリス・ティフィー(Pichia pastoris typhi)、ネズミチフス菌およびネズミチフス菌−大腸菌ハイブリッドから成る群から選択される、上記106に記載の形質転換ホスト細胞。
108.上記102に記載のリコンビナント核酸分子で形質転換されたホスト細胞。
109.前記ホスト細胞が、CHO、VEROもしくはCOS細胞、大腸菌、ビール酵母菌、ピキア・パストリス・ティフィー(Pichia pastoris typhi)、ネズミチフス菌およびネズミチフス菌−大腸菌ハイブリッドから成る群から選択される、上記108に記載の形質転換ホスト細胞。
110.上記79に記載のワクチンまたは接種物をホスト動物に接種し、さらに前記接種動物が免疫反応を発達させるために十分な期間前記動物を維持する工程を含む、接種ホスト動物で免疫反応を誘発する方法。
107.前記ホスト細胞が、CHO、VEROもしくはCOS細胞、大腸菌、ビール酵母菌、ピキア・パストリス・ティフィー(Pichia pastoris typhi)、ネズミチフス菌およびネズミチフス菌−大腸菌ハイブリッドから成る群から選択される、上記106に記載の形質転換ホスト細胞。
108.上記102に記載のリコンビナント核酸分子で形質転換されたホスト細胞。
109.前記ホスト細胞が、CHO、VEROもしくはCOS細胞、大腸菌、ビール酵母菌、ピキア・パストリス・ティフィー(Pichia pastoris typhi)、ネズミチフス菌およびネズミチフス菌−大腸菌ハイブリッドから成る群から選択される、上記108に記載の形質転換ホスト細胞。
110.上記79に記載のワクチンまたは接種物をホスト動物に接種し、さらに前記接種動物が免疫反応を発達させるために十分な期間前記動物を維持する工程を含む、接種ホスト動物で免疫反応を誘発する方法。
111.上記80に記載のワクチンまたは接種物をホスト動物に接種し、さらに前記接種動物が免疫反応を発達させるために十分な期間前記動物を維持する工程を含む、接種ホスト動物で免疫反応を誘発する方法。
112.上記82に記載のワクチンまたは接種物をホスト動物に接種し、さらに前記接種動物が免疫反応を発達させるために十分な期間前記動物を維持する工程を含む、接種ホスト動物で免疫反応を誘発する方法。
113.上記87に記載のワクチンまたは接種物をホスト動物に接種し、さらに前記接種動物が免疫反応を発達させるために十分な期間前記動物を維持する工程を含む、接種ホスト動物で免疫反応を誘発する方法。
114.上記88に記載のワクチンまたは接種物をホスト動物に接種し、さらに前記接種動物が免疫反応を発達させるために十分な期間前記動物を維持する工程を含む、接種ホスト動物で免疫反応を誘発する方法。
115.上記92に記載のワクチンまたは接種物をホスト動物に接種し、さらに前記接種動物が免疫反応を発達させるために十分な期間前記動物を維持する工程を含む、接種ホスト動物で免疫反応を誘発する方法。
112.上記82に記載のワクチンまたは接種物をホスト動物に接種し、さらに前記接種動物が免疫反応を発達させるために十分な期間前記動物を維持する工程を含む、接種ホスト動物で免疫反応を誘発する方法。
113.上記87に記載のワクチンまたは接種物をホスト動物に接種し、さらに前記接種動物が免疫反応を発達させるために十分な期間前記動物を維持する工程を含む、接種ホスト動物で免疫反応を誘発する方法。
114.上記88に記載のワクチンまたは接種物をホスト動物に接種し、さらに前記接種動物が免疫反応を発達させるために十分な期間前記動物を維持する工程を含む、接種ホスト動物で免疫反応を誘発する方法。
115.上記92に記載のワクチンまたは接種物をホスト動物に接種し、さらに前記接種動物が免疫反応を発達させるために十分な期間前記動物を維持する工程を含む、接種ホスト動物で免疫反応を誘発する方法。
Claims (55)
- N−末端からドメインI、II、IIIおよびIVと称される4つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含む、長さが約135から約515のアミノ酸残基のリコンビナントB型肝炎ウイルスコア(HBc)タンパク質キメラ分子であって、 (a)ドメインIは約71から約100アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基の配列は少なくともHBcの5位から75位の残基配列を含み、さらに場合によってHBc残基1−4の1つとペプチド結合した約30までのアミノ酸残基を含む異種エピトープを含み;
(b)ドメインIIはドメインIのHBc残基75とペプチド結合した約5から約250のアミノ酸残基を含み、ここで、(i)HBcの76位から85位の配列中の0から全ての残基がHBcにとって異種である1つから約245アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープまたは共役エピトープのための異種リンカー残基を構成するか、または(ii)76位から85位のHBcの配列は異種残基とは結合せずに存在するか、または(iii)残基76から85の1つまたは2つ以上が存在せず;
(c)ドメインIIIはドメインIIの残基85とペプチド結合した86位から135位のHBc配列であり;さらに、
(d)ドメインIVは、(i)ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した136位から149位のHBcアミノ酸残基配列の5から14残基、(ii)キメラ分子のC−末端から約30残基以内に1つから10のシステイン残基(C−末端システイン残基)、および(iii)150位からC−末端のHBcにとって異種である配列中に0から約100アミノ酸残基を含み、ここで、ドメインIVは前記(ii)の1つから10のシステイン残基を含む少なくとも6つのアミノ酸残基を含むことを条件とし、
前記キメラはホスト細胞内で発現されるとき自己会合して粒子を生成し、前記粒子は実質的に核酸と結合せず、さらに前記のC−末端システイン残基を欠くか、またはキメラ分子内に存在するC−末端システイン残基が別の残基に置換されてあるがその他の点では同一のHBcキメラから生成される粒子よりも安定であり、さらに、配列番号:247の1位から149位の配列と比較して、前記キメラのHBc配列でそのアミノ酸残基の約5%以下が保存的置換されてあるアミノ酸残基配列を有する、前記リコンビナントB型肝炎ウイルスコアタンパク質キメラ分子。 - 前記ペプチド結合異種エピトープまたは共役エピトープのための異種リンカー残基が異種B細胞エピトープである、請求項1に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記B細胞エピトープが、アミノ酸残基76と85との間のHBc配列内のある位置でペプチド結合し、さらに76位から85位のHBc配列の少なくとも5残基が存在する、請求項2に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- さらにペプチド結合異種T細胞エピトープを含む、請求項2に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記C−末端システイン残基が、HBcキメラタンパク質分子のC−末端の5アミノ酸残基内に存在する、請求項4に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記キメラが、中断されていない1位から少なくとも140位のHBcアミノ酸残基配列、およびHBcキメラタンパク質分子のC−末端にシステイン残基を含む、請求項1に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記キメラが、共役エピトープのための異種リンカー残基を含み、前記共役エピトープのための異種リンカー残基が、アミノ酸残基76と85との間のHBc配列内のある位置でペプチド結合し、さらに76位から85位のHBc配列の少なくとも4残基が存在する、請求項1に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 1位から少なくとも140位の前記HBcアミノ酸残基配列、およびC−末端にただ1つのシステイン残基を含む、請求項7に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- ドメインIおよびII、IIおよびIV、またはIおよびIVに存在する2つの異種エピトープを含む、請求項1に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記2つの異種エピトープの1つがB細胞エピトープである、請求項9に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記2つの異種エピトープの1つがT細胞エピトープである、請求項9に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- ドメインIIの前記異種エピトープがB細胞エピトープである、請求項9に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 150位からC−末端のHBcにとって異種である前記配列が、HBc残基140−149の1つとペプチド結合したT細胞エピトープである、請求項1に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 共役エピトープまたは異種エピトープのための前記異種リンカー残基が異種エピトープである、請求項1に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記異種エピトープが6から約50アミノ酸残基を含む、請求項14に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記ドメインIVが、キメラ分子のC−末端から約30残基内に1つから約5つのシステイン残基を含む、請求項14に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記C−末端システイン残基が、前記キメラタンパク質分子のC−末端の約5つのアミノ酸残基内に位置する、請求項1に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 共役エピトープまたは異種エピトープのための前記異種リンカー残基が、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびチロシン残基から成る群から選択される共役エピトープのための異種リンカー残基である、請求項1に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記キメラが、1位から少なくとも140位まで中断されないHBcアミノ酸残基配列を含む、請求項1に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記非中断HBcアミノ酸残基配列が残基149を含む、請求項19に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記共役エピトープのための異種リンカー残基がハプテンに共役される、請求項1に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記ハプテンがオリゴ糖である、請求項21に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- N−末端からドメインI、II、IIIおよびIVと称される4つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含む、約175から約240アミノ酸残基の長さを有する、請求項1に記載のリコンビナントB型肝炎ウイルスコア(HBc)タンパク質キメラ分子であって、
(a)ドメインIが、HBcの1位から75位の残基配列を含み;
(b)ドメインIIがドメインIのHBc残基75とペプチド結合した約5から約55のアミノ酸残基を含み、ここでHBcの76位から85位の配列中の少なくとも4つの残基がHBcにとって異種である6から約50アミノ酸残基とペプチド結合して存在し、異種エピトープを構成し;
(c)ドメインIIIはドメインIIの残基85とペプチド結合した86位から135位のHBc配列であり;さらに、
(d)ドメインIVは、(i)ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した136位から149位のHBcアミノ酸残基配列の5から14残基、(ii)キメラ分子のC−末端から約30残基以内に1つのシステイン残基(C−末端システイン残基)、および(iii)150位からC−末端のHBcにとって異種である配列内に0から約50アミノ酸残基を含み、
前記キメラはホスト細胞内で発現されるとき自己会合して粒子を生成し、前記粒子は、280nm対260nm吸収比が約1.2から約1.6を示し、さらに前記のC−末端システイン残基を欠くか、またはキメラ分子内に存在するC−末端システイン残基が別の残基に置換されてあるがその他の点では同一のHBcキメラから生成される粒子よりも安定であり、さらに、配列番号:247の1位から149位の配列と比較して、前記キメラのHBc配列で約5%以下のアミノ酸残基が保存的置換されてあるアミノ酸残基配列を有する、前記リコンビナントB型肝炎ウイルスコアタンパク質キメラ分子。 - ドメインIIの前記異種エピトープがB細胞エピトープである、請求項23に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- アミノ酸残基76から85の間のHBc配列は存在するが、前記異種B細胞エピトープで中断される、請求項24に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記B細胞エピトープが下記から成る群から選択される病原体に存在するアミノ酸配列である、請求項24に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子:肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumonia)、クリプトスポリジウム・パルブム(Cryptosporidium parvum)、HIV、口蹄疫ウイルス、インフルエンザウイルス、ペスト菌(Yersinia pestis)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、ポルフィロモナス・ギンギバリス(Porphyromonas gingivalis)、クルーズトリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、げっ歯類住血胞子虫(Plasmodium berghi)、プラスモジウム・ヨエリー(Plasmodium yoelli)、ストレプトコッカス・ソブリヌス(Streptococcus sobrinus)、フレキシナー菌(Shigella flexneri)、RSV、プラスモジウム・エントアメーバ・ヒストリティカ(Plasmodium Entamoeba histolytica)、日本住血吸虫(Schistosoma japonicum)、マンソニ住血吸虫(Schistosoma mansoni)、およびエボラウイルス。
- 前記150位からC−末端までのHBcにとって異種の配列がHBc残基140−149の1つとペプチド結合したT細胞エピトープである、請求項23に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記T細胞エピトープが、目的のキメラを免疫原として用いようとしている対象生物に由来する、請求項27に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記C−末端システイン残基が、前記キメラタンパク質分子のC−末端の約5つのアミノ酸残基内に位置する、請求項23に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 更に、N−末端に免疫原性エピトープを提示する、請求項23に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 更に、C−末端に免疫原性エピトープを提示する、請求項23に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 免疫原性粒子として存在する請求項1〜31のいずれか1項に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子であって、
前記粒子は実質的に核酸と結合せず、さらに前記粒子は、前記C−末端システイン残基を欠くか、またはキメラ分子内に存在するC−末端システイン残基が別の残基に置換されてあるがその他の点では同一のHBcキメラから生成される粒子よりも安定である、前記免疫原性粒子として存在するリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。 - 約1.2から約1.7の280/260吸収比を示す請求項32に記載の免疫原性粒子として存在するリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子の長さが約435までのアミノ酸残基である請求項32に記載の免疫原性粒子として存在するリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子の長さが約175から約240アミノ酸残基である請求項32に記載の免疫原性粒子として存在するリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 医薬として許容できる希釈剤に溶解または分散された免疫誘発に有効な量の請求項32に記載の免疫原性粒子として存在するリコンビナントHBcキメラタンパク質分子を含むワクチンまたは接種物。
- 前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子が、約175から約240のアミノ酸残基の長さを有し、かつ、前記免疫原性粒子が、約1.4から約1.6の280nm対260nm吸収比を示す、請求項36に記載のワクチンまたは接種物。
- 非経口投与用に適用させた請求項36に記載のワクチンまたは接種物。
- 粘膜免疫用に適用させた請求項36に記載のワクチンまたは接種物。
- 前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子粒子が植物組織に存在する、請求項36に記載のワクチンまたは接種物。
- 前記リコンビナントキメラHBcタンパク質分子粒子が、腸チフス菌(S. typhi)、ネズミチフス菌(S. typhimurium)またはネズミチフス菌−大腸菌ハイブリッドの弱毒株に存在する、請求項36に記載のワクチンまたは接種物。
- さらにアジュバントを含む請求項36に記載のワクチンまたは接種物。
- 前記アジュバントがミョウバンである請求項42に記載のワクチンまたは接種物。
- 前記アジュバントが、ムラミルジペプチド、7−置換−8−オキソ−もしくは8−スルホ−グアノシン誘導体、モノホスホリル脂質A、アルミニウムもしくはカルシウム塩から成る群から選択される小分子である、請求項42に記載のワクチンまたは接種物。
- 前記アジュバントが、前記免疫原性粒子および前記医薬として許容できる希釈剤とともに乳化されて水相および油相を有する乳液を提供する油である、請求項42に記載のワクチンまたは接種物。
- 前記乳液の油相がスクァレン又はスクァランを含む、請求項45に記載のワクチンまたは接種物。
- 前記乳液の水相および油相が、ソルビタンまたはマンニッドC12−C24脂肪酸エステルである乳化剤によって乳化される、請求項45に記載のワクチンまたは接種物。
- 請求項1〜31のいずれか1項に記載のリコンビナントHBcタンパク質分子をコードする核酸セグメント、またはその変種、類似体もしくは相補物。
- 請求項1〜31のいずれか1項に記載のリコンビナントHBcタンパク質分子をコードする核酸セグメント、またはその変種、類似体もしくは相補物に機能できるように連結されたベクター、および適合ホスト生物中で前記遺伝子の発現を駆動させるために適したプロモーターを含むリコンビナント核酸分子。
- 請求項49に記載のリコンビナント核酸分子で形質転換されたホスト細胞。
- 前記ホスト細胞が、CHO、VEROもしくはCOS細胞、大腸菌、ビール酵母菌、ピキア・パストリス・ティフィー(Pichia pastoris typhi)、ネズミチフス菌およびネズミチフス菌−大腸菌ハイブリッドから成る群から選択される、請求項50に記載の形質転換ホスト細胞。
- ホスト動物で免疫反応を誘発するための請求項36に記載のワクチンまたは接種物の製造のための、免疫誘発に有効な量の請求項32に記載の免疫原性粒子として存在するリコンビナントHBcキメラタンパク質分子の使用。
- ホスト動物で免疫反応を誘発するための請求項37に記載のワクチンまたは接種物の製造のための、免疫誘発に有効な量の請求項32に記載の免疫原性粒子として存在するリコンビナントHBcキメラタンパク質分子の使用。
- ホスト動物で免疫反応を誘発するための請求項42に記載のワクチンまたは接種物の製造のための、免疫誘発に有効な量の請求項32に記載の免疫原性粒子として存在するリコンビナントHBcキメラタンパク質分子の使用。
- ホスト動物で免疫反応を誘発するための請求項43に記載のワクチンまたは接種物の製造のための、免疫誘発に有効な量の請求項32に記載の免疫原性粒子として存在するリコンビナントHBcキメラタンパク質分子の使用。
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