CN103796673A - Dna疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗或减轻生活方式相关疾病的试剂，所述试剂包含编码嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，在所述嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽中已经插入了包含生活方式相关疾病的相关因子的特异性表位的氨基酸序列，其中所述包含特异性表位的氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。

Description

DNA疫苗
技术领域
本发明涉及DNA疫苗，其对于生活方式相关疾病例如高血压等的治疗或预防有效。
背景技术
已有报道称，在美国，只有35%的高血压患者能够适当地控制血压。高血压治疗的成果如此之差的主要原因之一是患者不服从(即，不依从)医生的指示。作为能够解决不依从问题的疗法，用于高血压的疫苗引起了关注(非专利文献1)。
用于高血压的疫苗是用于高血压的治疗方法，其包括给高血压患者施用高血压的恶化因子、包含在所述恶化因子中的表位、或编码它们的表达载体，以在所述高血压患者体内诱导针对所述恶化因子的抗体，从而中和所述恶化因子的功能并减轻高血压的症状。建议以包括肾素、血管紧张素II和AT-1受体在内的各种因子作为疫苗的目标(非专利文献1)。
然而，通常已经建立了对于因子例如肾素、血管紧张素II和AT-1受体等的免疫耐受，因为这些因子是患者自身的成分。因此，甚至在将这些因子或其部分肽向患者直接施用时，也难以在所述患者体内诱导针对所述因子的抗体。因而，需要一些技术构思以使患者的免疫系统识别这些自体抗原，从而诱导产生针对这些自体抗原的抗体。
乙型肝炎病毒核心(HBc)抗原蛋白通过自组装构成球形核心颗粒。所述核心颗粒具有非常高的免疫原性。在使用通过将期望的表位插入到HBc抗原蛋白的具体位点，或将期望的表位连接到HBc抗原蛋白的末端而获得的融合多肽时，所述表位递呈在通过自组装形成的颗粒的表面上。使用融合多肽，所插入的表位容易被免疫系统识别，并且能够有效地诱导产生识别所述表位的抗体。因此，使用HBc抗原蛋白作为疫苗的平台，已尝试诱导产生抗体，即便抗原难以被免疫系统识别(非专利文献2、非专利文献3)。
专利文献1公开了由嵌合HBc抗原蛋白构成的颗粒，所述嵌合HBc抗原蛋白包含具有表位的外来氨基酸序列，其中所述外来氨基酸序列插入在HBc抗原的氨基酸残基80-81之间。
专利文献2和非专利文献4公开了包含血管紧张素II的部分肽、间隔区和病毒样颗粒(VLP)的复合物，其中所述血管紧张素II的部分肽通过所述间隔区连接到VLP。描述了所述复合物作为用于高血压的疫苗是有效的。
专利文献3公开了通过将胆固醇酯转运蛋白(CETP)免疫原插入到乙型肝炎核心蛋白的具体区域而获得的免疫原性多肽。
非专利文献5公开了使用DNA疫苗的肌内免疫在兔动脉硬化模型中抑制动脉硬化，其中所述DNA疫苗编码通过乙型肝炎病毒核心(HBc)抗原蛋白展示的，由26个氨基酸组成的胆固醇酯转运蛋白(CETP)的表位，并且包含CpG DNA。此DNA疫苗经设计以允许将CETP表位插入在HBc抗原蛋白的氨基酸残基80-81之间。
非专利文献6公开了插入在乙型肝炎病毒核心(HBc)抗原蛋白中的异源表位的位置决定了其免疫原性。该文献公开了在乙型肝炎病毒核心(HBc)抗原蛋白的氨基酸残基75-81之间插入表位，导致对插入表位的抗体滴度增加，且对HBc的抗体滴度下降。
非专利文献7公开了经设计允许将疟疾CS蛋白重复表位插入在乙型肝炎病毒核心(HBc)抗原蛋白的氨基酸残基75-81之间的杂合HBcAb-CS颗粒，在小鼠中防止疟疾感染。
为了加强免疫作用，已提出向疫苗添加作为佐剂的免疫刺激序列(ISS)，或将ISS插入到活性成分的表达载体中(非专利文献8)。
然而，用于生活方式相关疾病例如高血压等的疫苗的功效不足以令人满意。
[文献列表]
[专利文献]
专利文献1：JP-B-3228737
专利文献2：WO2003/031466
专利文献3：WO99/15655
[非专利文献]
非专利文献1：T. H. Do等，Expert Opin. Biol. Ther., vol.10, no.7, pp.1077-1087, 2010
非专利文献2：D. C. Whitacre等，Expert Rev. Vaccines, vol.8, no.11, pp.1565-1573, 2009
非专利文献3：B. E. Clarke等，Nature, vol.330, pp.381-384, 1987
非专利文献4：P. M. Ambuhl等，Journal of Hypertension, vol.25, no.1, pp.63-72, 2007
非专利文献5：D. Mao等，Vaccine, vol.24, pp.4942-4950, 2006
非专利文献6：F. Schodel等，Journal of Virology, vol.66, no.1, pp.106-114, 1992
非专利文献7：F. Schodel等，The Journal of Experimental Medicine, vol.180, pp.1037-1046, 1994
非专利文献8：J D Marshall等，Journal of Leukocyte Biology, vol.82, pp.497-508, 2007。
发明内容
本发明解决的问题
本发明的目的是提供用于生活方式相关疾病，例如高血压、高脂血症等的优异的疫苗。
解决所述问题的方式
本发明人已进行了深入的研究，并且发现编码插入在乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间的血管紧张素II特异性表位的表达载体能够良好地治疗高血压。本发明人已详细研究了所述表达载体的施用模式，并且通过使用无针注射器等的皮下施用成功地获得了预想不到地良好治疗结果。此外，本发明人已监测了由疫苗施用诱导的针对血管紧张素II的抗体滴度，从而发现通过仅3次施用而获得的极高抗体滴度。基于这些发现，本发明人已进一步研究并完成了本发明。
也即，本发明涉及以下内容。
[1] 用于生活方式相关疾病的治疗或改善剂，其包含编码插入了氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，所述氨基酸序列包含所述生活方式相关疾病的相关因子的特异性表位，其中所述包含特异性表位的氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
[2] 根据[1]的治疗或改善剂，其中所述生活方式相关疾病是选自高血压和高脂血症组成的组中的一种。
[3] 根据[1]或[2]的治疗或改善剂，其中所述生活方式相关疾病的相关因子是血管紧张素II (AngII)或胆固醇酯转运蛋白(CETP)。
[4] 根据[3]的治疗或改善剂，其中所述生活方式相关疾病的相关因子是血管紧张素II (AngII)，并且所述包含特异性表位的氨基酸序列是SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列。
[5] 用于高血压的治疗或改善剂，其包含编码插入了SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，其中所述氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
[6] 根据[3]的治疗或改善剂，其中所述生活方式相关疾病的相关因子是胆固醇酯转运蛋白(CETP)，并且所述包含特异性表位的氨基酸序列是SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列。
[7] 用于高脂血症的治疗或改善剂，其包含编码插入了SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，其中所述氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
[8] 根据[1] - [7]的任一项的治疗或改善剂，进一步包含并入到所述表达载体中的免疫刺激序列(ISS)。
[9] 根据[8]的治疗或改善剂，其中所述免疫刺激序列(ISS)由SEQ ID NO: 22所示的核苷酸序列组成。
[10] 根据[1] - [9]的任一项的治疗或改善剂，其使用无针注射器皮下施用。
[11] 根据[10]的治疗或改善剂，其中所述无针注射器是压力注射器。
[12] 根据[1] - [11]中任一项的治疗或改善剂，其多次施用。
[13] 根据[12]的治疗或改善剂，其中施用次数是2次或3次。
[14] 根据[13]的治疗或改善剂，其中施用次数是3次。
[15] 根据[1] - [14]中任一项的治疗或改善剂，其以2周的间隔施用3次。
[16] 用于治疗或改善生活方式相关疾病的注射制剂，其包含：
编码插入了氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，所述氨基酸序列包含所述生活方式相关疾病的相关因子的特异性表位，和
无针注射器，
其中所述包含特异性表位的氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间，并且其中所述表达载体包封在所述无针注射器之中。
[17] 用于治疗或改善生活方式相关疾病的表达载体，其编码插入了氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽，所述氨基酸序列包含所述生活方式相关疾病的相关因子的特异性表位，其中所述包含特异性表位的氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
[18] 用于治疗或改善高血压的表达载体，其编码插入了SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽，其中所述氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
[19] 用于治疗或改善高脂血症的表达载体，其编码插入了SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽，其中所述氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
[20] 注射制剂，其包含：
编码插入了氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，所述氨基酸序列包含所述生活方式相关疾病的相关因子的特异性表位，和
无针注射器，
所述注射制剂用于治疗或改善生活方式相关疾病，其中所述包含特异性表位的氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间，并且其中所述表达载体包封在所述无针注射器之中。
[21] 用于治疗或改善哺乳动物中的生活方式相关疾病的方法，其包括给所述哺乳动物施用有效量的编码插入了氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，所述氨基酸序列包含所述生活方式相关疾病的相关因子的特异性表位，其中所述包含特异性表位的氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
[22] 用于治疗或改善哺乳动物中的高血压的方法，其包括给所述哺乳动物施用有效量的编码插入了SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，其中所述氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
[23] 用于治疗或改善哺乳动物中的高脂血症的方法，其包括给所述哺乳动物施用有效量的编码插入了SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，其中所述氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
[24] 用于治疗或改善生活方式相关疾病的方法，其包括使用无针注射器向哺乳动物注射有效量的编码插入了氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，所述氨基酸序列包含所述生活方式相关疾病的相关因子的特异性表位，其中所述包含特异性表位的氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
[25] 表达载体用于生产生活方式相关疾病的治疗或改善剂的用途，所述表达载体编码插入了氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽，所述氨基酸序列包含所述生活方式相关疾病的相关因子的特异性表位，其中所述包含特异性表位的氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
[26] 表达载体用于生产高血压的治疗或改善剂的用途，所述表达载体编码插入了SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽，其中所述氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
[27] 表达载体用于生产高脂血症的治疗或改善剂的用途，所述表达载体编码插入了SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽，其中所述氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
[28] 表达载体和无菌注射器用于生产生活方式相关疾病的治疗或改善剂的用途，所述表达载体编码插入了氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽，所述氨基酸序列包含所述生活方式相关疾病的相关因子的特异性表位，其中所述包含特异性表位的氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
发明的效果
本发明提供了用于治疗或预防生活方式相关疾病，例如高血压和高脂血症等的更好的疫苗。
附图说明
图1显示了HBc-AngII ISS(+)施用对高血压的效果，其中纵轴显示了大鼠血压(mmHg)，且横轴显示了在施用开始后的时间(周)。
图2显示了由HBc-AngII ISS(+)施用诱导的针对AngII的抗体滴度的时间进程变化，其中纵轴显示吸光度，且横轴显示血清的稀释比例。
图3显示了在第8周由HBc-AngII ISS(+)施用诱导的针对AngI和AngII的抗体滴度，其中纵轴显示吸光度，且横轴显示血清的稀释比例。
图4显示了HBc-AngII ISS(+)施用对高血压的效果，其中纵轴显示了大鼠血压(mmHg)，且横轴显示了在施用开始后的时间(周)。
图5显示了由HBc-AngII ISS(+)施用诱导的针对AngII的抗体滴度的时间进程变化，其中纵轴显示吸光度，且横轴显示在施用开始后的时间(周)。
具体实施方式
本发明提供了用于生活方式相关疾病的治疗或改善剂，其包含编码插入了氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，所述氨基酸序列包含生活方式相关疾病的相关因子的特异性表位，其中所述包含表位的氨基酸序列插入在乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
在本说明书中，所述生活方式相关疾病是由生活方式例如饮食习惯、运动习惯、休息、吸烟、饮酒等导致的疾病的通称。所述生活方式相关疾病的实例包括高血压、高脂血症、糖尿病、动脉硬化、缺血疾病(心肌梗死、脑卒中等)、肥胖等。所述生活方式相关疾病优选为高血压或高脂血症，特别优选高血压。
在本说明书中，所述生活方式相关疾病的相关因子是指致使生活方式相关疾病恶化的多肽。本发明的治疗或改善剂通过诱导产生针对生活方式相关疾病的相关因子的抗体，并通过所述抗体中和所述生活方式相关疾病的相关因子，而治疗或改善所述生活方式相关疾病。因此，考虑到这种机制，所述生活方式相关疾病的相关因子优选是细胞外分泌的因子，或表达在细胞表面上的因子，从而使得其将由在患者体内诱导的抗体识别。
高血压相关因子的实例包括致使血压升高的多肽，例如血管紧张素II、血管紧张素I、ACE、肾素、AT-1受体等。高血压相关因子优选为血管紧张素II。
高脂血症相关因子的实例包括致使血液中脂质(特别是胆固醇或甘油三酯)浓度升高的多肽，例如胆固醇酯转运蛋白(CETP)等。
在本发明中，预期使用源自哺乳动物的生活方式相关疾病的相关因子，所述哺乳动物与将作为本发明的治疗或改善剂的应用目标的哺乳动物是相同的物种。本发明的治疗或改善剂的应用目标是哺乳动物。所述哺乳动物的实例包括啮齿类，例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等；兔形目，例如兔等；有蹄类，例如猪、牛、山羊、马、绵羊等；食肉动物，例如狗、猫等；灵长类，例如人、猴、猕猴(Macaca mulatta)、食蟹猴(Macaca fascicularis)、狨猴、猩猩、黑猩猩等；诸如此类。所述哺乳动物优选是啮齿类(小鼠等)或灵长类(人等)。因此，例如，当本发明的治疗或改善剂应用于人时，预期使用源自人的生活方式相关疾病的相关因子。当本发明的治疗或改善剂应用于小鼠时，预期使用源自小鼠的生活方式相关疾病的相关因子。
在本说明书中，关于具体的因子X (多肽或多核苷酸)，“源自生物Y的因子X”或“生物Y因子X”是指，因子X的氨基酸序列或核酸序列具有与在生物Y中天然表达的因子X的氨基酸序列或核酸序列相同或基本相同的氨基酸序列或核酸序列。所谓“基本相同”是指，感兴趣的氨基酸序列或核酸序列与在生物Y中天然表达的因子X的氨基酸序列或核酸序列具有不少于70% (优选不少于80%，更优选不少于90%，仍更优选不少于95%，最优选不少于99%)的同一性，并且保持因子X的功能。
在本说明书中，“表位”是指由各个抗体或T细胞受体识别的基本元件或最小单位，其为上述抗体或T细胞受体所结合的具体结构域、区域或分子结构。
生活方式相关疾病的相关因子的表位优选对于所述生活方式相关疾病的相关因子是特异的。所谓“特异的”是指在衍生出所述生活方式相关疾病的相关因子的哺乳动物中天然表达的，除所述生活方式相关疾病的相关因子之外的基因产物不包含所述表位。
作为所述生活方式相关疾病的相关因子的表位，优先选择在以下位置的表位：当识别所述表位的抗体结合至所述表位时，所述生活方式相关疾病的相关因子的活性被抑制。此表位可在功能性位点中，例如，配体结合位点、受体结合位点、底物结合位点、辅酶结合位点、二价离子结合位点、通道部分、由特异的酶识别的位点等。本领域普通技术人员能够基于所述生活方式相关疾病的相关因子的空间结构等，适当地选择所述表位。
表位的氨基酸序列的长度通常为5-30个氨基酸，优选6-25个氨基酸。当氨基酸序列太短时，表位的抗原性可能丧失。当氨基酸序列太长时，嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽不容易由于自组装而形成核心颗粒，其结果导致可能无法产生特异性识别所述表位的抗体，并且可能无法获得对生活方式相关疾病的优异的治疗或改善效果。
生活方式相关疾病的相关因子的优选表位的具体实例包括以下。
(血管紧张素II) (WO2003/031466和Journal of Hypertension, vol.25, no.1, pp.63-72, 2007)
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Figure 458111DEST_PATH_IMAGE002
。
表位a) - l)对于人和小鼠中的生活方式相关疾病(优选高血压)的治疗或改善特别有用。表位序列m)对于人和大鼠中的生活方式相关疾病(优选高血压)的治疗或改善有用。
血管紧张素II的优选表位优选为DRVYIHPF (SEQ ID NO: 16)。在使用所述表位时，诱导出对血管紧张素II的特异性高于对血管紧张素I的特异性的抗体。
(胆固醇酯转运蛋白(CETP)) (Vaccine, vol.24, pp.4942-4950, 2006)
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
表位a)对于人、小鼠和兔中的生活方式相关疾病(优选高脂血症)的治疗或改善特别有用。
在本发明中使用的乙型肝炎病毒核心抗原多肽是：
(1) 包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的多肽，或
(2) 包含与SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有不少于90% (优选不少于95%，更优选不少于97%，仍更优选不少于99%)同一性的氨基酸系列，并且具有由于自组装而形成核心颗粒的活性的多肽。
自组装是指，其中溶解在溶液中的分子结合形成组装体的现象。核心颗粒是指具有特异重复构成的刚性结构。在本说明书中，核心颗粒可以是合成步骤的产物或生物步骤的产物。
作为实施方式(2)的多肽，可提及在WO2003/031466中公开的包含SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的多肽。包含SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列，除了48、61、107和185位的一个或多个半胱氨酸残基被缺失或被其他氨基酸残基(例如丝氨酸残基)取代的多肽，也优选作为实施方式(2)的多肽。如本领域普通技术人员所认识到的，在具有不同于SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽中，在类似位置的半胱氨酸残基可以被缺失或被其他氨基酸残基取代，并且通过此类缺失和取代而获得的多肽也包含在实施方式(2)的多肽中。
实施方式(2)的多肽还包括变体多肽，其中在对应于SEQ ID NO: 3的97位的位置的异亮氨酸残基被亮氨酸残基或苯丙氨酸残基取代(Yuan等，J. Virol. vol. 73, pages 10122 - 10128 (1999))。此外，GenBank报告
Figure 375251DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE005
Figure 92672DEST_PATH_IMAGE006
(各公开均通过引用并入本说明书)中公开了很多HBcAg变体和多种乙型肝炎核心抗原前体变体的氨基酸序列，并且包含这些变体的氨基酸序列的多肽也包含在实施方式(2)的多肽中。上述变体具有在很多位置不同的氨基酸序列，包括对应于存在于SEQ ID NO: 3中的
Figure DEST_PATH_IMAGE007
Figure 425564DEST_PATH_IMAGE008
位的氨基酸残基的氨基酸残基。
此外，包含在WO01/98333、WO01/77158和WO02/14478 (所有均通过引用并入本说明书)中所述的HBcAg变体的氨基酸序列的多肽，也包含在实施方式(2)的多肽中。
在本说明书中，除非具体指明，以SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列作为标准，指定在乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸序列中的氨基酸残基的位置。当多肽不包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列时，将多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列进行比对，并且采用相应氨基酸残基的位置。
在本发明中使用的乙型肝炎病毒核心抗原多肽优选为包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的多肽。
在将要用于本发明的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽中，包含上述生活方式相关疾病的相关因子的表位的氨基酸序列插入在乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。也即，将要用于本发明的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽，从N-末端一侧起，以(a)、(b)、(c)的顺序包含以下元件(a) - (c)：
(a) 乙型肝炎病毒核心抗原多肽的N-末端部分多肽残基(由乙型肝炎病毒核心抗原多肽的从N-末端至氨基酸残基80的连续部分氨基酸序列组成)，
(b) 由生活方式相关疾病的相关因子的表位组成的氨基酸序列，和
(c) 乙型肝炎病毒核心抗原多肽的C-末端部分多肽残基(由乙型肝炎病毒核心抗原多肽的从氨基酸残基81至C-末端的连续部分氨基酸序列组成)。
将要用于本发明的，具有上述构成的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽由于自组装而形成核心颗粒，并且生活方式相关疾病的相关因子的表位递呈在所述颗粒的外面上。
元件(a)和元件(b)可通过共价键直接连接，或通过间隔区序列连接。元件(a)和元件(b)优选通过间隔区序列连接，以使生活方式相关疾病的相关因子的表位稳定地递呈在由嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的自组装而形成的颗粒的外面上，同时保持其结构。间隔区序列是指插入到包含在所述嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的两个相邻元件之间的包含一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。尽管间隔区序列的长度没有限制——只要嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽由于自组装形成核心颗粒并且生活方式相关疾病的相关因子的表位递呈在所述颗粒的外面上，但间隔区序列的长度通常为1-10个氨基酸，优选1-5个氨基酸，更优选1-3个氨基酸，最优选2个或3个氨基酸。间隔区序列的种类同样没有限制，只要嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽由于自组装形成核心颗粒并且生活方式相关疾病的相关因子的表位递呈在所述颗粒的外面上。优选的间隔区序列的实例包括，但不限于IT、GAT、CGG等。
元件(b)和元件(c)可通过共价键直接连接，或通过间隔区序列连接。元件(b)和元件(c)优选通过间隔区序列连接到通过嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的自组装形成的核心颗粒的外面，以使生活方式相关疾病的相关因子的表位能够稳定地递呈，同时保持其结构。尽管间隔区序列的长度没有限制——只要嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽由于自组装形成核心颗粒并且生活方式相关疾病的相关因子的表位递呈在所述颗粒的外面上，但间隔区序列的长度通常为1-10个氨基酸，优选1-5个氨基酸，更优选1-3个氨基酸，最优选2个或3个氨基酸。间隔区序列的种类同样没有限制，只要嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽由于自组装形成核心颗粒并且生活方式相关疾病的相关因子的表位递呈在所述颗粒的外面上。优选的间隔区序列的实例包括，但不限于IT、GAT、CGG等。
在优选的实施方式中，元件(a)和元件(b)通过间隔区序列IT连接，且元件(b)和元件(c)通过间隔区序列GAT连接。
在本发明中使用的表达载体是并入了编码上述嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的多核苷酸的重组载体。在将所述表达载体施用至目标哺乳动物时，所述表达载体经细胞内并入到目标哺乳动物中，并且所述细胞表达上述嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽。插入编码嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的多核苷酸的表达载体的实例包括质粒、病毒、噬菌体、粘粒和本领域中通常使用的其他载体。质粒载体的实例包括，但不限于pCAGGS (Gene 108: 193-199 (1991))、pCR-X8 (Vaccine 24: 4942-4950 (2006))、pcDNA3.1 (商品名，Invitrogen)、pZeoSV (商品名，Invitrogen)、pBK-CMV (商品名，Stratagene)等。病毒载体是DNA病毒或RNA病毒。病毒载体的实例包括，但不限于脱毒的逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德毕斯病毒、日本血球凝集病毒(HVJ)、SV40、人类免疫缺陷病毒(HIV)等。此外，还可利用日本血球凝集病毒包膜(HVJ-E)等。
在上述表达载体中，将编码嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的多核苷酸(优选DNA)可操作地连接到启动子，所述启动子能够在将要作为施用对象的哺乳动物(优选人)的细胞中发挥启动子活性。
将要使用的启动子没有具体的限制，只要其能够在将要作为施用对象的哺乳动物(优选人)的细胞中发挥功能。启动子的实例包括pol I启动子、pol II启动子、pol III启动子等。特别地，使用病毒启动子，例如源自SV40的初始启动子、巨细胞病毒LTR等，哺乳动物的组成蛋白基因启动子，例如β-肌动蛋白基因启动子等，RNA启动子，例如tRNA启动子等，诸如此类。
上述表达载体优选在编码嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的多核苷酸的下游包含转录终止信号，即终止子区。其可进一步包含用于选择转化细胞的选择标记基因(赋予对药物(例如四环素、氨苄青霉素、卡那霉素等)抗性的基因，补充营养缺陷型突变的基因等)。
在一个实施方式中，上述表达载体可包含免疫刺激序列(ISS) (也称作CpG)以加强免疫作用。所述免疫刺激序列是包含细菌的非甲基化CpG基序的DNA，并且已知作为具体受体(Toll样受体9)的配体而发挥作用(详情参见Biochim. Biophys. Acta 1489, 107-116 (1999)和Curr. Opin. Microbiol. 6, 472-477 (2003))。免疫刺激序列的优选实例包括以下。
Figure 676155DEST_PATH_IMAGE010
可选地，可连接并使用来自这些ISS的2、3或4个。连接的ISS序列的优选实例包括以下。
本领域普通技术人员能够根据描述于，例如“Sambrook等编辑，Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.”、“Ausubel等编辑，Current Protocols in Molecular Biology (1987) John Wiley & Sons”等中所述的公知遗传工程改造技术，构建上述表达载体。
本发明的治疗或改善剂可作为药物组合物提供，除治疗有效量的上述表达载体之外，所述药物组合物还包含任意载体(carrier)，例如，药学可接受的载体。
药学可接受的载体的实例包括，赋形剂，例如蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙、碳酸钙等；粘合剂，例如纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、蔗糖、淀粉等；崩解剂，例如淀粉、羧甲基纤维素、羟丙基淀粉、乙二醇淀粉钠(sodium-glycol-starch)、碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙等；润滑剂，例如硬脂酸镁、气相二氧化硅(aerosil)、滑石、月桂基硫酸钠等；芳香剂，例如柠檬酸、薄荷醇、甘草皂苷･铵盐、甘氨酸、橙粉末等；防腐剂，例如苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等；稳定剂，例如柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸等；悬浮剂，例如甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸铝等；分散剂，例如表面活性剂等；稀释剂，例如水、盐水等；基础蜡，例如可可脂、聚乙二醇、白煤油等，诸如此类，但不限于此。
本发明的治疗或改善剂可进一步包含佐剂以加强其效果。佐剂的实例包括氢氧化铝、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、百日咳佐剂、聚(I:C)、CpG-DNA等。
为了促进表达载体的细胞内引入，本发明的治疗或改善剂可进一步包含用于核酸引入的试剂。作为用于核酸引入的试剂，可使用阳离子脂质，例如lipofectin (商品名，Invitrogen)、lipofectamine (商品名，Invitrogen)、transfectam (商品名，Promega)、DOTAP (商品名，Roche Applied Science)、双十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)、L-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、N,N-二-正十六烷基-N,N-二羟基乙基溴化铵(DHDEAB)、N-正十六烷基-N,N-二羟基乙基溴化铵(HDEAB)、聚凝胺、聚(乙烯亚胺) (PEI)等。此外，表达载体可包含在由脂质双层构成的任何已知脂质体中，例如静电脂质体中。此类脂质体可以与病毒(例如灭活的日本血球凝集病毒(HVJ))融合。与一般脂质体相比，HVJ-脂质体具有非常高的与细胞膜融合的活性。在使用逆转录病毒作为表达载体时，可使用RetroNectin、纤连蛋白、聚凝胺等作为转染试剂。
尽管上述表达载体在药物组合物中的含量没有具体限制且适合地选自宽泛的范围，但其通常是整个药物组合物的约0.00001至100 wt%。
通过将上述表达载体引入到应用目标，即哺乳动物组织(或细胞)，本发明的治疗或改善剂诱导上述嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的体内表达，诱导产生针对包含在嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽内的生活方式相关疾病的相关因子的表位的抗体，并且通过所诱导的抗体中和所述生活方式相关疾病的相关因子的活性而治疗或改善所述哺乳动物的生活方式相关疾病。用于将核酸，例如表达载体等，引入到体内的各种方法是已知的(T. Friedman, Science 244: 1275-1281 (1989))，并且可采用任何引入方法，只要其能够诱导上述嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的体内表达，诱导产生针对包含在嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽内的生活方式相关疾病的相关因子的表位的抗体，并且治疗或改善生活方式相关疾病。
用于将表达载体体内引入到哺乳动物组织(或细胞)的方法的实例包括，但不限于内部型脂质体法、静电脂质体法、HVJ-脂质体法、HVJ-AVE脂质体法、受体介导的转基因、颗粒枪法、裸DNA法、通过正电荷聚合物的引入法等。
可选地，可以从应用目标哺乳动物分离细胞，例如血细胞、骨髓细胞等，可将上述表达载体引入到离体细胞，此后，可将所得包含上述表达载体的细胞返回到所述应用目标哺乳动物。
用于将表达载体引入到离体哺乳动物细胞的方法的实例包括，但不限于脂质体转染法、磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、使用玻璃微毛细管的直接DNA导入法等。
本发明的治疗或改善剂可通过任何方法施用，只要所述试剂在施用对象哺乳动物中诱导上述嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的体内表达，诱导产生针对包含在嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽内的生活方式相关疾病的相关因子的表位的抗体，并且治疗或改善生活方式相关疾病。优选地，本发明的治疗或改善剂经胃肠外施用，施用的量足以诱导产生针对包含在嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽内的生活方式相关疾病的相关因子的表位的抗体，并且治疗或改善生活方式相关疾病。例如，将通过静脉内，腹膜内，皮下，皮内，脂肪组织内，乳腺组织内或肌内途径的注射；气体诱导的颗粒轰击法(通过电子枪等)；通过粘膜途径的洗鼻剂等形式的方法等，描述为施用方法的实例。在一个实施方式中，本发明的治疗或改善剂经皮下或肌内注射，优选皮下注射。
在一个实施方式中，本发明的治疗或改善剂通过无针注射器经皮下施用。所述无针注射器优选是压力注射器。无针注射器的实例包括但不限于ShimaJET (商品名，SHIMADZU CORPORATION)、Twinject EZII (商品名，Japan chemical research)、Syrijet (商品名，Keystone)、ZENEO (商品名，Crossject)等。在这种情况下，本发明的治疗或改善剂可作为包含上述表达载体和无针注射器的注射制剂提供，其中所述表达载体包封在所述无针注射器中。
在一个实施方式中，本发明的治疗或改善剂使用基因枪经皮下、皮内或肌内施用。在这种情况下，可将上述表达载体应用到待引入到机体的载体颗粒(例如胶体金颗粒等)上，并用于施用。用于使用多核苷酸包被载体颗粒的技术是已知的(参见，例如WO93/17706)。最后，表达载体可以在适合施用到体内的含水溶液例如生理盐水等中制备。
为了诱导良好的免疫应答，本发明的治疗或改善剂优选以给定的间隔多次施用。尽管可以通过监测免疫应答的水平适当地确定所述频率，但其通常为2-10次，优选2-6次，更优选2-4次，最优选3次。
施用频率通常每3天至3个月一次，优选每1-4周一次，更优选每1.5-3周一次，最优选每2周一次。
在一个实施方式中，本发明的治疗或改善剂以2周的间隔向目标哺乳动物施用3次。
尽管本发明治疗或改善剂的剂量依赖于包含在由活性成分表达载体编码的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽中的生活方式相关疾病的相关因子的表位在施用对象哺乳动物中的免疫原性，但是本领域普通技术人员能够通过将给定量的表达载体施用至施用对象哺乳动物，通过检测方法例如ELISA等测量对所述表位特异性的抗体滴度，并观察免疫应答，而确定良好免疫应答所必需的剂量。本领域普通技术人员理解，本发明的治疗或改善剂的免疫原性还依赖于用于作为活性成分的表达载体的调控序列(例如启动子)的强度。此外，本领域普通技术人员还能依赖于待使用的表达载体的种类，容易地控制本发明的治疗或改善剂的剂量。
本文引用的所有文献，包括专利和专利申请，均通过引用全文并入，达到已在本文中公开的程度。
以下将通过参考实施例更详细地解释本发明，所述实施例不以任何方式限制本发明。
实施例
[实施例1]
1. 方法
1-1. 表达 HBc-AngII 的构建体的制备
1-1-1. HBc-AngII 、 HBc 序列的制备和 TA 克隆
质粒pPLc3 (登记号LMBP 2470)购自BCCM/LMBP Plasmid Collection。设计并合成以下引物。
Figure 436300DEST_PATH_IMAGE012
各个引物序列对应于编码乙型肝炎病毒核心(HBc)抗原蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO: 1)的以下位置：
HBc F：第1至第33个核苷酸。
HBc R：第527至第556个核苷酸。
H2：编码间隔区的2个氨基酸(IT)的核苷酸和部分的AngII序列连接到第221至第241个核苷酸。
H3-II：部分的AngII序列和间隔区的3个氨基酸(GAT)连接到第242至第259个核苷酸。
首先，使用模板(质粒pPLc3)和引物组(HBc F和H2)，通过PCR扩增包含HBc的N-末端、间隔区和部分的AngII的第一DNA片段。此外，使用模板(质粒pPLc3)和引物组(H3-II和HBc R)，通过PCR扩增包含部分的AngII、间隔区和HBc的C-末端的第二DNA片段。两个扩增产物共有部分重叠的AngII序列。利用重叠部分的退火，通过第三PCR (引物组；HBc F和HBc R)连接第一DNA片段和第二DNA片段，以给出扩增产物(HBc-AngII)。也即，将间隔区和编码包含AngII的部分序列的多肽的核苷酸序列插入在编码乙型肝炎病毒核心(HBc)抗原蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO: 1)的第241个碱基与第242个碱基之间。由插入的核苷酸序列编码的氨基酸序列为IT-DRVYIHPF-GAT (SEQ ID NO: 27，13个氨基酸)。进行使HBc-AngII进入到pcDNA 3.1/V5-His TOPO TA表达试剂盒(Invitrogen)的TA克隆，从而给出HBc-AngII ISS(-)载体。类似地，使用模板(质粒pPLc3)和引物组(HBcF和HBcR)进行PCR以制备编码HBc的全长多肽的DNA片段，并进行使所述DNA片段进入pcDNA 3.1/V5-His TOPO载体的TA克隆，从而给出HBc ISS(-)载体。
1-1-2. HBc-AngII ISS(+) 、 HBc ISS(+) 载体的制备 ( 制备 ISS 序列并插入到载体中 )
设计并合成以下模板(CpG (A+B+C+C)-F和CpG (A+B+C+C)-R)和引物(DraIII-F和DraIII-R)。
Figure DEST_PATH_IMAGE013
Figure 641017DEST_PATH_IMAGE014
Figure DEST_PATH_IMAGE015
使用作为模板的CpG (A+B+C+C)-F和CpG (A+B+C+C)-R，以及DraIII-F和DraIII-R的引物组进行PCR，从而给出包含在两个末端具有DraIII位点的ISS序列的DNA片段(DraIII-ISS)。随后，使用DraIII消化DraIII-ISS以及载体HBc-AngII ISS(-)和HBc ISS(-)。使用碱性磷酸酶处理载体，并与DraIII-ISS的酶消化产物连接，以将ISS插入到载体的DraIII位点(1621)。
1-2. 动物试验
使用ShimaJET (商品名，SHIMADZU CORPORATION)，每2周向10周龄高血压大鼠(SHR)的背部皮肤施用各载体3次(100 μg/μl × 2个部位/次)。
HBc-AngII ISS(+)组：12只大鼠
HBc ISS(+)组：7只大鼠
在0周、2周、4周施用，并且在从施用开始起0周、4周、8周、16周进行血压测量、血清收集和抗体滴度测量。
1-2-1(a). 尾套法 (1)
(尾套法的测量设备)
制造商：Softron
产品名称BP-98A (大鼠･小鼠非侵入式自动血压测量装置)
1-2-1(a). 尾套法 (2)
Figure DEST_PATH_IMAGE017
Figure DEST_PATH_IMAGE019
Figure 834252DEST_PATH_IMAGE020
Figure DEST_PATH_IMAGE021
Figure 526264DEST_PATH_IMAGE022
Figure DEST_PATH_IMAGE023
1-2-1(b). 通过尾套法的血压测量
(方法)
通过尾套法进行血压测量。对每只动物进行5-15次测量，并使用测量的平均值。
(结果)
HBc ISS(+)组(对照)显示SHR大鼠的血压升高。另一方面，HBc-AngII ISS(+)组显示血压明显下降(图1)。
1-2-2(a).ELISA 方法
(试剂和测量设备)
･血管紧张素II-BSA缀合物，血管紧张素I-BSA缀合物：使用DSS (辛二酸二琥珀酰亚胺酯)作为间隔区制备
･血管紧张素原(人)：Sigma A2562
･Nunc Maxisorp (Cat.442404)
･3%脱脂乳(PBS稀释)
･PBS-T (0.05% Tween)
･第二抗体：HRP-缀合的抗小鼠IgG第二抗体(GE，NA931V)，HRP-缀合的抗大鼠IgG第二抗体(GE，NA935V)
･TMB溶液：Sigma T0440
･终止溶液：0.5N H2SO4
･微板读数器(InterMed，ImmunoMini NJ-2300)。
1-2-2(b). 通过 ELISA 方法测量血清中对血管紧张素 II 或血管紧张素 I 的抗体滴度
(方法)
以10 μg/ml的浓度将血管紧张素II-BSA、血管紧张素I-BSA和血管紧张素原分别添加到96孔板至50 μl，并在4℃培育过夜。此后，弃去孔中的内容物，添加3%脱脂乳(150 μl/孔)，并在室温下培育2小时以进行封闭。
弃去孔中的内容物，添加3%脱脂乳稀释的小鼠血清至各50 μl，并在4℃培育过夜。
每个孔使用PBS-T清洗5次。添加由3%脱脂乳以1/1000倍稀释的HRP-缀合的抗小鼠IgG第二抗体或HRP-缀合的抗大鼠IgG第二抗体(50 μll/孔)，并在室温下培育3小时。弃去孔中的内容物，并对每个孔使用PBS-T清洗3次。添加TMB溶液(50 μl/孔)，并在室温下培育30分钟。通过添加0.5N H2SO4 (50 μl/孔)终止反应，并且测量在450 nm的吸光度。
(结果)
通过总计3次的疫苗施用(0周和2、4周)提高了在疫苗施用前没有观察到的，对BSA-AngII的抗体滴度。抗体滴度在3次施用后8周的时间点提高得最高，并且维持16周，尽管在下降的趋势中(图2)。通过HBc-AngII疫苗施用，对BSA-AngII的抗体滴度比对BSA-AngI的抗体滴度更强烈地提高(图3)。
2. 总结
上述血压测量和抗体滴度测量结果表明，HBc-AngII ISS(+)DNA疫苗施用能够提高对AngII的抗体滴度，并且预防或治疗高血压。
[实施例2]
1. 动物试验
按照与实施例1中相同的方式，使用ShimaJET (商品名，SHIMADZU CORPORATION)，每2周向10周龄高血压大鼠(SHR)的背部皮肤施用各载体3次(100 μg/μl × 2个部位/次)。
HBc-AngII ISS(+)组：6只大鼠
HBc ISS(+)组：4只大鼠
盐水组：5只大鼠
在0周、2周、4周施用，并且在从施用开始起0周、4周、8周、12周、16周、20周和24周进行血压测量、血清收集和抗体滴度测量。
2. 通过尾套法的血压测量
(方法)
按照与实施例1中相同的方式，通过尾套法进行血压测量。对每只动物进行5-15次测量，并使用测量的平均值。
(结果)
HBc ISS(+)组(对照)和盐水组显示SHR大鼠的血压升高。另一方面，HBc-AngII ISS(+)组显示血压明显下降(图4)。这种血压下降作用持续直至从施用开始起24周之后。
3(a).ELISA 方法
(试剂和测量设备)
血管紧张素II-BSA缀合物，血管紧张素I-BSA缀合物：使用DSS (辛二酸二琥珀酰亚胺酯)作为间隔区制备
血管紧张素原(人)：Sigma A2562
Nunc Maxisorp (Cat.442404)
5%脱脂乳(PBS稀释)
PBS-T (0.05% Tween)
第二抗体：HRP-缀合的抗小鼠IgG第二抗体(GE，NA931V)，HRP-缀合的抗大鼠IgG第二抗体(GE，NA935V)
TMB溶液：Sigma T0440
终止溶液：0.5N H2SO4
微板读数器(日本Bio-Rad Inc.)
3(b). 通过 ELISA 方法测量血清中对血管紧张素 II 的抗体滴度
(方法)
以10 μg/ml的浓度将血管紧张素II-BSA、血管紧张素I-BSA和血管紧张素原分别添加到96孔板至50 μl，并在4℃培育过夜。此后，弃去孔中的内容物，添加5%脱脂乳(150 μl/孔)，并在室温下培育2小时以进行封闭。
弃去孔中的内容物，添加5%脱脂乳稀释的小鼠血清至各50 μl，并在4℃培育过夜。
每个孔使用PBS-T清洗5次。添加由5%脱脂乳以1/1000倍稀释的HRP-缀合的抗小鼠IgG第二抗体或HRP-缀合的抗大鼠IgG第二抗体(50 μll/孔)，并在室温下培育3小时。弃去孔中的内容物，并对每个孔使用PBS-T清洗3次。添加TMB溶液(50 μl/孔)，并在室温下培育30分钟。通过添加0.5N H2SO4 (50 μl/孔)终止反应，并且测量在450 nm的吸光度。
(结果)
通过总计3次的疫苗施用(0周和2、4周)提高了在疫苗施用前没有观察到的，对BSA-AngII的抗体滴度。在从施用开始起4周检测到抗体滴度的增加。这种抗体滴度的增加甚至保持到从施用开始起24周之后(图5)。
4. 总结
上述表明，HBc-AngII ISS(+)DNA疫苗施用能够提高对AngII的抗体滴度，并且预防或治疗高血压。
工业实用性
提供了用于生活方式相关疾病例如高血压、高脂血症等的优异的疫苗。
本申请是基于在日本提交的专利申请号2011-091493 (申请日2011年4月15日)和在日本提交的专利申请号2011-227320 (申请日2011年10月14日)，这些申请的内容全部并入本文。
Figure IDA0000428479680000011
Figure IDA0000428479680000021
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Claims (28)

1.用于生活方式相关疾病的治疗或改善剂，其包含编码插入了氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，所述氨基酸序列包含所述生活方式相关疾病的相关因子的特异性表位，其中所述包含特异性表位的氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
2.根据权利要求1的治疗或改善剂，其中所述生活方式相关疾病是选自高血压和高脂血症组成的组中的一种。
3.根据权利要求1或2的治疗或改善剂，其中所述生活方式相关疾病的相关因子是血管紧张素II (AngII)或胆固醇酯转运蛋白(CETP)。
4.根据权利要求3的治疗或改善剂，其中所述生活方式相关疾病的相关因子是血管紧张素II (AngII)，并且所述包含特异性表位的氨基酸序列是SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列。
5.用于高血压的治疗或改善剂，其包含编码插入了SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，其中所述氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
6.根据权利要求3的治疗或改善剂，其中所述生活方式相关疾病的相关因子是胆固醇酯转运蛋白(CETP)，并且所述包含特异性表位的氨基酸序列是SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列。
7.用于高脂血症的治疗或改善剂，其包含编码插入了SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，其中所述氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
8.根据权利要求1-7中的任一项的治疗或改善剂，进一步包含并入到所述表达载体中的免疫刺激序列(ISS)。
9.根据权利要求8的治疗或改善剂，其中所述免疫刺激序列(ISS)由SEQ ID NO: 22所示的核苷酸序列组成。
10.根据权利要求1-9中的任一项的治疗或改善剂，其使用无针注射器经皮下施用。
11.根据权利要求10的治疗或改善剂，其中所述无针注射器是压力注射器。
12.根据权利要求1-11中的任一项的治疗或改善剂，其多次施用。
13.根据权利要求12的治疗或改善剂，其中施用次数是2或3次。
14.根据权利要求13的治疗或改善剂，其中施用次数是3次。
15.根据权利要求1-14中的任一项的治疗或改善剂，其以2周的间隔施用3次。
16.用于治疗或改善生活方式相关疾病的注射制剂，其包含：
编码插入了氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，所述氨基酸序列包含所述生活方式相关疾病的相关因子的特异性表位，和
无针注射器，
其中所述包含特异性表位的氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间，并且其中所述表达载体包封在所述无针注射器之中。
17.用于治疗或改善生活方式相关疾病的表达载体，其编码插入了氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽，所述氨基酸序列包含所述生活方式相关疾病的相关因子的特异性表位，其中所述包含特异性表位的氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
18.用于治疗或改善高血压的表达载体，其编码插入了SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽，其中所述氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
19.用于治疗或改善高脂血症的表达载体，其编码插入了SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽，其中所述氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
20.注射制剂，其包含：
编码插入了氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，所述氨基酸序列包含所述生活方式相关疾病的相关因子的特异性表位，和
无针注射器，
所述注射制剂用于治疗或改善生活方式相关疾病，其中所述包含特异性表位的氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间，并且其中所述表达载体包封在所述无针注射器之中。
21.用于治疗或改善哺乳动物中的生活方式相关疾病的方法，其包括给所述哺乳动物施用有效量的编码插入了氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，所述氨基酸序列包含所述生活方式相关疾病的相关因子的特异性表位，其中所述包含特异性表位的氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
22.用于治疗或改善哺乳动物中的高血压的方法，其包括给所述哺乳动物施用有效量的编码插入了SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，其中所述氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
23.用于治疗或改善哺乳动物中的高脂血症的方法，其包括给所述哺乳动物施用有效量的编码插入了SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，其中所述氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
24.用于治疗或改善生活方式相关疾病的方法，其包括使用无针注射器向哺乳动物注射有效量的编码插入了氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，所述氨基酸序列包含所述生活方式相关疾病的相关因子的特异性表位，其中所述包含特异性表位的氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
25.表达载体用于生产生活方式相关疾病的治疗或改善剂的用途，所述表达载体编码插入了氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽，所述氨基酸序列包含所述生活方式相关疾病的相关因子的特异性表位，其中所述包含特异性表位的氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
26.表达载体用于生产高血压的治疗或改善剂的用途，所述表达载体编码插入了SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽，其中所述氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
27.表达载体用于生产高脂血症的治疗或改善剂的用途，所述表达载体编码插入了SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽，其中所述氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
28.表达载体和无菌注射器用于生产生活方式相关疾病的治疗或改善剂的用途，所述表达载体编码插入了氨基酸序列的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽，所述氨基酸序列包含所述生活方式相关疾病的相关因子的特异性表位，其中所述包含特异性表位的氨基酸序列插入在所述乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。
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