ES2668672T3

ES2668672T3 - Vacuna de ADN

Info

Publication number: ES2668672T3
Application number: ES12771621.5T
Authority: ES
Inventors: Ryuichi Morishita; Hironori Nakagami; Hiroshi Koriyama; Futoshi NAKAGAMI; Natsuki Yoshida
Original assignee: Osaka University NUC; Anges MG Inc
Current assignee: Osaka University NUC; Anges Inc
Priority date: 2011-04-15
Filing date: 2012-04-13
Publication date: 2018-05-21
Anticipated expiration: 2032-04-13
Also published as: CN103796673A; KR20190006040A; KR20140048119A; US20140099335A1; JP6057296B2; EP2698164B1; JPWO2012141280A1; EP2698164A4; EP2698164A1; HK1245104A1; CN107519498A; US9446120B2; WO2012141280A1; KR102190180B1

Abstract

Un vector de expresión que codifica un polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico insertado con una secuencia de aminoácidos que comprende un epitopo específico de angiotensina II, para su uso en un método para el tratamiento o la mejora de la hipertensión en un mamífero, en el que la secuencia de aminoácidos que comprende el epitopo específico se inserta entre los restos aminoácidos 80 y 81 del polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B, en el que la secuencia de aminoácidos que comprende el epitopo específico es la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:16, y en el que el vector de expresión comprende además una secuencia inmunoestimuladora (ISS) que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:22 incorporada en el vector de expresión y que expresa el polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico en una célula en el mamífero.

Description

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DESCRIPCION

Vacuna de ADN Campo técnico

La presente invención se refiere a una vacuna de ADN eficaz para el tratamiento o la profilaxis de la hipertensión Antecedentes de la técnica

Se ha indicado que, de los pacientes con hipertensión en EE. UU., solo 35% pueden controlar la presión sanguínea de modo apropiado. Una de las principales causas de estos malos resultados del tratamiento de la hipertensión es la desobediencia del paciente (concretamente, la no observancia) a las instrucciones de los médicos. Como terapia capaz de resolver el problema de la no observancia, la vacuna para la hipertensión está atrayendo la atención (documento que no es patente 1).

La vacuna para la hipertensión es un método terapéutico para la hipertensión que incluye administrar un factor agravante de la hipertensión, un epitopo contenido en el factor agravante, o un vector de expresión que los codifica a pacientes con hipertensión para inducir un anticuerpo contra el factor agravante en el cuerpo de los pacientes con hipertensión, neutralizando con ello la función del factor agravante y mitigando los síntomas de la hipertensión. Se han propuesto diversos factores, que incluyen la renina, la angiotensina II y el receptor AT-1 como diana de la vacuna (documento que no es patente 1).

Sin embargo, la tolerancia inmunológica a factores, tales como la renina, la angiotensina II, el receptor AT-1 y similares en general ya ha sido establecida, puesto que estos factores son componentes del propio paciente. Por tanto, es difícil inducir un anticuerpo contra el factor en el cuerpo del paciente, incluso si estos factores o sus péptidos parciales se administran directamente al paciente. Así, son necesarios conocimientos técnicos para que el sistema inmunológico del paciente reconozca estos autoantígenos, induciendo con ello la producción de anticuerpos contra ellos.

La proteína del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B ("hepatitis B virus core", HBc) constituye partículas de la nucleocápsida esféricas por autoensamblaje. Las partículas de la nucleocápsida tienen una alta inmunogenicidad. Cuando se emplea un polipéptido de fusión obtenido insertando un epitopo deseado en un sitio concreto de la proteína del antígeno de HBc, o conectando un epitopo deseado al terminal de la proteína del antígeno de HBc, el epitopo se presenta sobre la superficie de las partículas formadas por autoensamblaje. Empleando el polipéptido de fusión, el epitopo insertado es fácilmente reconocido por el sistema inmunológico, y la producción del anticuerpo que reconoce el epitopo puede inducirse con facilidad. Por tanto, utilizando la proteína del antígeno de HBc como plataforma de vacuna, se ha intentado inducir la producción del anticuerpo, incluso aunque el antígeno sea difícil de reconocer por el sistema inmunológico (documento que no es patente 2, documento que no es patente 3).

El documento de patente 1 describe partículas compuestas de una proteína del antígeno de HBc quimérica que contiene una secuencia de aminoácidos extraña que presenta un epitopo, en las que la secuencia de aminoácidos extraña está insertada entre los restos aminoácidos 80-81 del antígeno de HBc.

El documento de patente 2 y el documento que no es patente 4 describen complejos que contienen un péptido parcial de angiotensina II, un espaciador y partículas similares a virus ("virus-like particles", VLP), en los que el péptido parcial de angiotensina II está conectado a las VLP a través del espaciador. Se indica que el complejo es útil como vacuna para la hipertensión.

El documento de patente 3 describe un polipéptido inmunogénico obtenido insertando un inmunógeno de proteína de transferencia de éster colesterilo ("cholesteryl ester transfer protein", CETP) en una región concreta de la proteína de la nucleocápsida de la hepatitis B.

El documento que no es patente 5 indica que la inmunización intramuscular con una vacuna de ADN que codifica un epitopo de la proteína de transferencia de éster colesterilo (CETP) que consiste en 26 aminoácidos, que es presentado por una proteína del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis (HBc) y que contiene ADN de CpG inhibe la arteriosclerosis en un modelo de arteriosclerosis de conejo. Esa vacuna de ADN está diseñada para permitir la inserción de un epitopo de CETP entre los restos aminoácidos 80-81 de la proteína del antígeno de HBc.

El documento que no es patente 6 indica que la posición de epitopos heterólogos insertados en la proteína del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis (HBc) determina su inmunogenicidad. Indica que la inserción de un epitopo entre los restos aminoácidos 75-81 de la proteína del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis (HBc) produce un aumento en la titulación de anticuerpos contra el epitopo insertado y una disminución de la titulación de anticuerpos contra HBc.

El documento que no es patente 7 indica que partículas híbridas de HBcAb-CS diseñadas para permitir la inserción del epitopo repetido de la proteína CS de la malaria entre los restos aminoácidos 75-81 de la proteína del antígeno

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de la nucleocápsida del virus de la hepatitis (HBc) evita la infección por malaria en ratones.

Pare potenciar el efecto inmunológico, se ha propuesto añadir una secuencia inmunoestimuladora ("immunostimulatory sequence", ISS) como adyuvante para una vacuna, o insertar una ISS en un vector de expresión del ingrediente activo (documento que no es patente 8).

El documento que no es patente 9 describe el efecto de la inmunización contra la angiotensina II con CYT006- AngQb sobre la presión sanguínea ambulatoria en un estudio de fase IIa controlado con placebo, aleatorizado y doble ciego.

Sin embargo, la eficacia de la vacuna para enfermedades relacionadas con el estilo de vida, tal como la hipertensión y similares, no resulta suficientemente satisfactoria.

Lista de documentos

Documentos de patente

- Documento de patente 1: JP-B-3228737

- Documento de patente 2: WO2003/031466

- Documento de patente 3: WO99/15655 Documentes que no son patentes

- Documento que no es patente 1: T. H. Do et al., Expert Opin. Biol. Ther., vol. 10, n.° 7, pp. 1077-1087, 2010.

- Documento que no es patente 2: D. C. Whitacre et al., Expert Rev. Vaccines, vol. 8, n.° 11, pp. 1565-1573, 2009.

- Documento que no es patente 3: B. E. Clarke et al., Nature, vol. 330, pp. 381-384, 1987.

- Documento que no es patente 4: P. M. Ambuhl et al., Journal of Hypertension, vol. 25, n.° 1, pp. 63-72, 2007.

- Documento que no es patente 5: D. Mao et al., Vaccine, vol. 24, pp. 4942-4950, 2006.

- Documento que no es patente 6: F. Schodel et al., Journal of Virology, vol. 66, n.° 1, pp. 106-114, 1992.

- Documento que no es patente 7: F. Schodel et al., The Journal of Experimental Medicine, vol. 180, pp. 1037-1046, 1994.

- Documento que no es patente 8: J. D. Marshall et al., Journal of Leukocyte Biology, vol. 82, pp. 497-508, 2007. Sumario de la invención

Problemas que se van a solucionar mediante la invención

La presente invención se dirige a proporcionar una vacuna mejor para la hipertensión.

Medios para resolver los problemas

Los presentes inventores han realizado estudios a fondo y han descubierto que un vector de expresión que codifica un epitopo específico de angiotensina II insertado entre los restos aminoácidos 80 y 81 del polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B puede tratar bien la hipertensión. Han estudiado en detalle el modo de administración del vector de expresión y han logrado conseguir unos resultados de tratamiento inesperadamente buenos mediante la administración subcutánea con un inyector sin aguja y similares. Además, han controlado la titulación de anticuerpos contra la angiotensina II inducidos por la administración de la vacuna para descubrir una titulación de anticuerpos extremadamente alta solo con 3 administraciones. Basándose en estos descubrimientos, han estudiado más a fondo y completado la presente invención.

Es decir, la presente invención se refiere a lo siguiente:

[1] Un vector de expresión que codifica un polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico insertado con una secuencia de aminoácidos que comprende un epitopo específico de angiotensina II, para su uso en un método para el tratamiento o la mejora de la hipertensión en un mamífero, en el que la secuencia de aminoácidos que comprende el epitopo específico se inserta entre los restos aminoácidos 80 y 81 del polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B, en el que la secuencia de aminoácidos que comprende el epitopo específico es la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:16, y en el que el vector de expresión comprende además una secuencia inmunoestimuladora (ISS) que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:22 incorporada en el vector de expresión y que expresa el polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico en una célula en el mamífero.

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[2] El vector de expresión para su uso según [1], que se administra por vía subcutánea empleando un inyector sin aguja.

[3] El vector de expresión para su uso según [2], en el que el inyector sin aguja es un inyector de presión.

[4] El vector de expresión para su uso según uno cualquiera de [1]-[3], que se administra muchas veces, preferiblemente 2 o 3 veces, más preferiblemente 3 veces.

[5] El vector de expresión para su uso según uno cualquiera de [1]-[4], que se administra 3 veces en intervalos de 2 semanas.

[6] El vector de expresión para su uso según [1], que está introducido en un inyector sin aguja.

Efecto de la invención

Se proporciona una vacuna mejor para el tratamiento o la profilaxis de la hipertensión.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra el efecto de la administración de HBc-AngII ISS(+) sobre la hipertensión, en el que el eje vertical muestra la presión sanguínea de ratas (mmHg) y el eje horizontal muestra el tiempo (semanas) después del inicio de la administración.

La figura 2 muestra los cambios a lo largo del tiempo de la titulación de anticuerpos contra AngII inducidos por la administración de HBc-AngII ISS(+), en el que el eje vertical muestra la absorbancia y el eje horizontal muestra la proporción de dilución del suero.

La figura 3 muestra la titulación de anticuerpos en la semana 8 contra AngI y AngII inducidos por la administración de HBc-AngII ISS(+), en el que el eje vertical muestra la absorbancia y el eje horizontal muestra la proporción de dilución del suero.

La figura 4 muestra el efecto de la administración de HBc-AngII ISS(+) sobre la hipertensión, en el que el eje vertical muestra la presión sanguínea de ratas (mmHg) y el eje horizontal muestra el tiempo (semanas) después del inicio de la administración.

La figura 5 muestra los cambios a lo largo del tiempo de la titulación de anticuerpos contra AngII inducidos por la administración de HBc-AngII ISS(+), en el que el eje vertical muestra la absorbancia y el eje horizontal muestra el tiempo (semanas) después del inicio de la administración.

Descripción de las realizaciones

La presente invención proporciona un agente terapéutico o mejorador de la hipertensión que comprende un vector de expresión que codifica un polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico insertado con una secuencia de aminoácidos que comprende un epitopo específico de angiotensina II, en el que la secuencia de aminoácidos que comprende el epitopo se inserta entre los restos aminoácidos 80 y 81 del polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B, en el que la secuencia de aminoácidos que comprende el epitopo específico es la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:16, y en el que el vector de expresión comprende además una secuencia inmunoestimuladora (ISS) que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:22 incorporada en el vector de expresión y que expresa el polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico en una célula en el mamífero.

En la presente memoria descriptiva, la enfermedad relacionada con el estilo de vida es una expresión genérica de las enfermedades provocadas por el estilo de vida, tales como los hábitos dietéticos, los hábitos de ejercicio, el sedentarismo, el hábito de fumar, el consumo de alcohol y similares. Los ejemplos de la enfermedad relacionada con el estilo de vida incluyen hipertensión, hiperlipidemia, diabetes, arteriosclerosis, enfermedad isquémica (infarto de miocardio, apoplejía cerebral, etc.), obesidad y similares. La enfermedad relacionada con el estilo de vida es preferiblemente la hipertensión o la hiperlipidemia, en particular preferiblemente la hipertensión.

En la presente memoria descriptiva, un factor relacionado con una enfermedad relacionada con el estilo de vida significa un polipéptido que contribuye al agravamiento de las enfermedades relacionadas con el estilo de vida. El agente terapéutico o mejorador de la presente invención trata o mejora la enfermedad relacionada con el estilo de vida mediante la inducción de la producción de un anticuerpo contra un factor relacionado con una enfermedad relacionada con el estilo de vida y la neutralización del factor relacionado con la enfermedad relacionada con el estilo de vida por medio del anticuerpo. Por tanto, considerando este mecanismo, el factor relacionado con una enfermedad relacionada con el estilo de vida es preferiblemente un factor segregado extracelularmente o un factor expresado sobre la superficie de la célula, de modo que será reconocido por un anticuerpo inducido en el cuerpo del paciente.

Los ejemplos del factor relacionado con la hipertensión incluyen polipéptidos que contribuyen a un aumento en la

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presión sanguínea, tales como angiotensina II, angiotensina I, ACE, renina, receptor AT-1 y similares. El factor relacionado con la hipertensión es preferiblemente la angiotensina II.

Los ejemplos de un factor relacionado con la hiperlipidemia incluyen polipéptidos que contribuyen a un aumento en la concentración de lípidos (en particular, colesterol o triglicéridos) en la sangre, tales como la proteína de transferencia de éster colesterilo (CETP) y similares.

En la presente memoria descriptiva, se pretende el uso de un factor relacionado con una enfermedad relacionada con el estilo de vida derivado de un mamífero de la misma especie que el mamífero que será la diana de aplicación del agente terapéutico o mejorador de la presente invención. La diana de aplicación del agente terapéutico o mejorador de la presente invención es un mamífero. Los ejemplos de mamíferos incluyen roedores, tales como ratones, ratas, hámsteres, cobayas y similares, lagomorfos, tales como conejos y similares, ungulados, tales como cerdos, ganado bovino, cabras, caballos, ovejas y similares, carnívoros, tales como perros, gatos y similares, primates, tales como seres humanos, monos, Macaca mulatta, Macaca fascicularis, titíes, orangutanes, chimpancés y similares, y otros animales similares. El mamífero es preferiblemente un roedor (ratón, etc.) o un primate (ser humano, etc.). Por tanto, por ejemplo, cuando el agente terapéutico o mejorador de la presente invención de la presente invención se aplica a un ser humano, se pretende el uso de un factor relacionado con una enfermedad relacionada con el estilo de vida derivado de un ser humano. Cuando el agente terapéutico o mejorador de la presente invención de la presente invención se aplica a un ratón, se pretende el uso de un factor relacionado con una enfermedad relacionada con el estilo de vida derivado de un ratón.

En la presente memoria descriptiva, con respecto al factor X concreto (polipéptido o polinucleótido), el “factor X derivado del organismo Y” o “el factor X del organismo Y” significa que la secuencia de aminoácidos o la secuencia de ácido nucleico del factor X tiene la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico que la secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico del factor X que se expresa naturalmente en el organismo Y. “Sustancialmente la misma” significa que la secuencia de aminoácidos o la secuencia de ácido nucleico de interés no tiene menos del 70% (preferiblemente no menos del 80%, más preferiblemente no menos del 90%, aún más preferiblemente no menos del 95%, lo más preferiblemente no menos del 99%) de identidad con la secuencia de aminoácidos o la secuencia de ácido nucleico del factor X que se expresa naturalmente en el organismo Y, y la función del factor X se mantiene.

En la presente memoria descriptiva, un “epitopo” se refiere a un elemento básico o unidad mínima para el reconocimiento por cada anticuerpo o receptor de células T, que es un dominio, región o estructura molecular concretos al cual se une el anticuerpo o receptor de células T mencionado anteriormente.

El epitopo del factor relacionado con una enfermedad relacionada con el estilo de vida es preferiblemente específico del factor relacionado con la enfermedad relacionada con el estilo de vida. “Específico” significa que un producto génico distinto del factor relacionado con una enfermedad relacionada con el estilo de vida, que se expresa naturalmente en el mamífero del cual se deriva el factor relacionado con una enfermedad relacionada con el estilo de vida, no contiene el epitopo.

Como epitopo del factor relacionado con una enfermedad relacionada con el estilo de vida, preferiblemente se selecciona un epitopo en una posición en la que la actividad del factor relacionado con una enfermedad relacionada con el estilo de vida es inhibida cuando un anticuerpo que reconoce el epitopo se une al epitopo. Este epitopo puede estar en un sitio funcional, por ejemplo, un sitio de unión al ligando, un sitio de unión al receptor, un sitio de unión al sustrato, un sitio de unión de una coenzima, un sitio de unión a iones divalentes, un resto de canal, un sitio reconocido por una enzima específica y similares. Los expertos en la técnica puede seleccionar de modo apropiado el epitopo basándose en la estructura estérica y similares del factor relacionado con una enfermedad relacionada con el estilo de vida.

La longitud de la secuencia de aminoácidos del epitopo es en general de 5-30 aminoácidos, preferiblemente de 6-25 aminoácidos. Cuando la secuencia de aminoácidos es demasiado corta puede perderse la antigenicidad del epitopo. Cuando la secuencia de aminoácidos es demasiado larga, el polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de hepatitis B quimérico no forma con facilidad partículas de nucleocápsida debidas al autoensamblaje, como resultado de lo cual puede que no se produzca un anticuerpo que reconoce específicamente el epitopo y puede no obtenerse un tratamiento mejor o un efecto de mejora en la enfermedad relacionada con el estilo de vida.

Los ejemplos específicos de un epitopo preferible de un factor relacionado con una enfermedad relacionada con el estilo de vida incluyen los siguientes:

-angiotensina II) (documento WO2003/031466, y Journal of Hypertension, vol. 25, n.° 1, pp. 63-72, 2007).

a) CGGDRVYIHPF (SEQ ID NO::4)

b) CGGDRVYIHPFHL (SEQ ID NO:5)

c) DRVYIHPFHLGGC (SEQ ID NO:6)

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d) CDRVYIHPFHL (SEQ ID NO:7)

e) CHPFHL (SEQ ID NO:8)

f) CGPFHL (SEQ ID NO:9)

g) CYIHPF (SEQ ID NO:10)

h) CGIHPF (SEQ ID NO:11)

i) CGGHPF (SEQ ID NO:12)

j) CRVYIGGC (SEQ ID NO:13)

k) DRVYGGC (SEQ ID NO:14)

l) DRVGGC (SEQ ID NO:15)

m) DRVYIHPF (SEQ ID NO:16)

Los epitopos a)-l) son particularmente útiles para el tratamiento o la mejora de enfermedades relacionadas con el estilo de vida (preferiblemente, la hipertensión) en seres humanos y ratones. La secuencia del epitopo m) es útil para el tratamiento o la mejora de enfermedades relacionadas con el estilo de vida (preferiblemente, la hipertensión) en seres humanos y ratones.

El epitopo de angiotensina II preferible es preferiblemente DRVYIHPF (SEQ ID NO:16). Cuando se emplea el epitopo, se induce un anticuerpo con mayor especificidad por la angiotensina II que por la angiotensina I.

- proteína de transferencia del éster colesterilo (CETP) (Vaccine, vol. 24, pp. 4942-4950, 2006).

a) RDGFLLLQMDFGFPEHLLVDFLQSL (SEQ ID NO:17)

El epitopo a) es particularmente útil para el tratamiento o la mejora de enfermedades relacionadas con el estilo de vida (preferiblemente, la hipertensión) en seres humanos, ratones y conejo.

El polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B empleado en la presente invención es:

(1) un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2, o

(2) un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos que no presenta no menos del 90% (preferiblemente no menos del 95%, más preferiblemente no menos del 97%, aún más preferiblemente no menos del 99%) de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2, y que tiene una actividad para formar partículas de nucleocápsida debido al autoensamblaje.

El autoensamblaje se refiere a un fenómeno en el que moléculas disueltas en una disolución se asocian para formar un ensamblaje. La partícula de nucleocápsida se refiere a una estructura rígida que tiene una constitución repetitiva específica. En la presente memoria descriptiva, la partícula de nucleocápsida puede ser un producto de etapas de síntesis o un producto de etapas biológicas.

Como el polipéptido de la realización de (2), puede mencionarse un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos mostrados en SEQ ID NO:3 descrita en el documento WO2003/031466. Un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:3, excepto que uno o más restos cisteínas en las posiciones 48, 61, 107 y 185 están delecionados o sustituidos por otro resto aminoácido (por ejemplo, resto serina) también es preferible como el polipéptido de la realización de (2). Tal como reconocerán los expertos en la técnica, en un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos diferente de la SEQ ID NO:3, los restos cisteína en posiciones similares pueden delecionarse o sustituirse por otros restos aminoácidos, y los polipéptidos obtenidos por dicha deleción y sustitución también se incluyen en el polipéptido de la realización de (2).

El polipéptido de la realización de (2) también incluye un polipéptido variante, en el que el resto isoleucina en la posición correspondiente a la posición 97 de SEQ ID NO:3 está sustituido por un resto leucina o un resto fenilalanina (Yuan et al., J. Virol., vol. 73, pp. 10122-10128 (1999)). Además, se describen secuencias de aminoácidos de muchos variantes de HBcAg y varios tipos de variantes de precursores del antígeno de la nucleocápsida de la hepatitis B en los informes de GenBank AAF121240, AF121239, X85297, X02496, X85305, X85303, AF151735, X85259, X85286, X85260, X85317, X85298, AF043593, M20706, X85295, X80925, X85284, X85275, X72702, X85291, X65258, X85302, M32138, X85293, X85315, U95551, X85256, X85316, X85296, AB033559, X59795, X8529, X85307, X65257, X85311, X85301, X85314, X85287, X85272, X85319, AB010289, X85285, AB010289, AF121242, M90520, P03153, AF110999 y M95589, y los polipéptidos que contienen las secuencias de aminoácidos de estos variantes también se incluyen en el polipéptido de la realización de (2). Los variantes mencionados anteriormente tienen unas secuencias de aminoácidos diferentes en muchos posiciones, que incluyen los restos aminoácidos correspondientes a los restos aminoácidos presentes en las posiciones 12, 13, 21, 22, 24, 29, 32, 33,

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Además, los polipéptidos que contienen las secuencias de aminoácidos de los variantes de HBcAg descritos en los documentos WO01/98333, WO01/77158 y WO02/14478 también se incluyen en el polipéptido de la realización de (2).

En la presente memoria descriptiva, a menos que se indique en concreto, las posiciones de los restos aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B se especifican según la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2 como patrón. Cuando un polipéptido no contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2, la secuencia de aminoácidos del polipéptido se alinea con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2 y se adopta la posición del correspondiente resto aminoácido.

El polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B empleado en la presente invención es preferiblemente un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2.

En el polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico que se va a utilizar en la presente invención, una secuencia de aminoácidos que comprende el epitopo de la angiotensina II se inserta entre los restos aminoácidos 80 y 81 del polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B. Es decir, el polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B que se va a emplear en la presente invención contiene los siguientes elementos (a)-(c):

(a) restos de la parte N-terminal del polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B (que consisten en la secuencia de aminoácidos parcial continua del polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B desde el N-terminal hasta el resto aminoácido 80),

(b) una secuencia de aminoácidos que consiste en un epitopo de la angiotensina II, y

(c) restos de la parte C-terminal del polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B (que consisten en la secuencia de aminoácidos parcial continua del polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B desde el resto aminoácido 81 al C-terminal) en el orden de (a), (b), (c) desde el lado N-terminal, en el orden de (a), (b), (c) desde el lado N-terminal.

El polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico que se va a utilizar en la presente invención que tiene la constitución mencionada anteriormente forma partículas de nucleocápsida debido al autoensamblaje, y el epitopo de la angiotensina II se presenta en el exterior de las partículas.

El elemento (a) y el elemento (b) pueden estar directamente conectados por un enlace covalente o a través de una secuencia de espaciador. El elemento (a) y el elemento (b) están preferiblemente conectados a través de una secuencia de espaciador, de modo que el epitopo de la angiotensina II será presentado de modo estable sobre el exterior de las partículas formadas mediante autoensamblaje de los polipéptidos del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quiméricos, al mismo tiempo que se mantiene su estructura. La secuencia de espaciador significa una secuencia de aminoácidos que contiene uno o más restos aminoácidos insertados entre dos elementos adyacentes contenidos en el polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico. Aunque la longitud de la secuencia de espaciador no se limita, con la condición de que el polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico forme partículas de nucleocápsida debido al autoensamblaje, y que el epitopo de la angiotensina II se presente en el exterior de las partículas, la longitud en general es de 1-10 aminoácidos, preferiblemente 1-5 aminoácidos, más preferiblemente 1-3 aminoácidos, lo más preferiblemente 2 o 3 aminoácidos. Además, el tipo de secuencia de espaciador no se limita, con la condición de que el polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico forme partículas de nucleocápsida debido al autoensamblaje, y que el epitopo de la angiotensina II se presente en el exterior de las partículas. Los ejemplos de un espaciador preferible incluyen, pero no se limitan a IT, GAT, CGG y similares.

El elemento (b) y el elemento (c) pueden estar directamente conectados a través de un enlace covalente o a través de una secuencia de espaciador. El elemento (b) y el elemento (c) están preferiblemente conectados a través de una secuencia de espaciador al exterior de la partículas de nucleocápsida formadas mediante autoensamblaje del polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quiméricos, de modo que el epitopo de la angiotensina II pueda presentarse de modo estable, al mismo tiempo que se mantiene su estructura. Aunque la longitud de la secuencia de espaciador no se limita, con la condición de que el polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico forme partículas de nucleocápsida debido al autoensamblaje, y que el epitopo de la angiotensina II se presente en el exterior de las partículas, la longitud en general es de 1-10 aminoácidos, preferiblemente 1-5 aminoácidos, más preferiblemente 1-3 aminoácidos, lo más preferiblemente 2 o 3 aminoácidos. Además, el tipo de secuencia de espaciador con la condición de que el polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico forme partículas de nucleocápsida debido al autoensamblaje, y que el epitopo de la angiotensina II se presente en el exterior de las partículas. Los ejemplos de un espaciador preferible incluyen, pero no se limitan a IT, GAT, CGG y similares.

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En una realización preferible, el elemento (a) y el elemento (b) están conectados a través de una secuencia de espaciador IT, y el elemento (b) y el elemento (c) están conectados a través de una secuencia de espaciador GAT.

El vector de expresión empleado en la presente invención es un vector recombinante que incorpora un polinucleótido que codifica el polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico mencionado anteriormente. Cuando el vector de expresión se administra a un mamífero diana, el vector de expresión se incorpora intracelularmente al mamífero diana, y la célula expresa el polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico mencionado anteriormente. Los ejemplos del vector de expresión insertado con el polinucleótido que codifica el polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico incluyen plásmidos, virus, fagos, cósmidos y otros vectores que se emplean de modo convencional en la técnica. Los ejemplos del vector de plásmido incluyen, pero no se limitan a pCAGGS (Gene, 108:193-199 (1991)), pCR—X8 (Vaccine, 24:4942-4950 (2006)), pcDNA3.1 (nombre comercial, Invitrogen), pZeoSV (nombre comercial, Invitrogen), pBK-CMV (nombre comercial, Stratagene) y similares. El vector de virus es un virus de ADN o un virus de ARN. Los ejemplos del vector de virus incluyen, pero no se limitan a retrovirus inactivados, adenovirus, virus adenoasociados, herpes virus, virus de vaccinia, poxvirus, virus de la polio, virus Sindbis, virus hemaglutinante de Japón (HVJ), SV40, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y similares. Además, también puede emplearse la envuelta del virus hemaglutinante de Japón (HVJ-E) y similares.

En el vector de expresión mencionado anteriormente, el polinucleótido (preferiblemente ADN) que codifica el polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico está unido operablemente a un promotor capaz de mostrar una actividad de promotor en la célula de un mamífero (preferiblemente un ser humano) que será el sujeto de la administración.

El promotor que se vaya a emplear no está particularmente limitado, con la condición de que pueda actuar en la célula de un mamífero (preferiblemente un ser humano) que será el sujeto de la administración. Los ejemplos del promotor incluyen el promotor pol I, el promotor pol II, el promotor pol III y similares. De modo específico, se emplean promotores de virus, tales como el promotor inicial derivado de SV40, LTR de citomegalovirus y similares, promotores de genes de proteínas constituyentes de mamífero, tales como el promotor del gen de p-actina y similares, promotores de ARN, tales como el promotor de ARNt y similares, y otros promotores similares.

El vector de expresión mencionado anteriormente preferiblemente contiene una señal de fin de la transcripción, es decir, una región de terminador, cadena abajo del polinucleótido que codifica el polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico. También puede contener un gen de marcador de selección para la selección de una célula transformada (un gen que confiere resistencia a medicamentos, tales como tetraciclina, ampicilina, kanamicina y similares, un gen que complementa una mutación auxotrófica, etc.).

En una realización, el vector de expresión mencionado anteriormente puede contener una secuencia inmunoestimuladora ("immune stimulatory sequence", ISS) (también denominada CpG) para potenciar el efecto inmunológico. La secuencia inmunoestimuladora es un ADN que contiene un motivo CpG no metilado de bacteria, y se sabe que actúa como ligando de un receptor concreto (receptor 9 similar a Toll) (véase Biochim. Biophys. Acta, 1489, 107-116 (1999), y Curr. Opin. Microbiol., 6, 472-477 (2003) para los detalles). Los ejemplos de secuencias inmunoestimuladoras son los siguientes:

CpG-B1018 22 pb

5'-tga ctg tga acg ttc gag atg a-3' (SEQ ID NO:18)

CpG-A D19 20 pb (tipo D)

5'-ggt gca tcg atg cag ggg gg-3' (SEQ ID NO:19)

CpG-CC274 21 pb

5'-tcg tcg aac gtt cga gat gat-3' (SEQ ID NO:20)

CpG-CC695 25 pb

5'-tcg aac gtt cga acg ttc gaa cgt t-3' (SEQ ID NO:21)

Pueden conectarse y usarse 2, 3 o 4 de estas ISS. En la invención, la secuencia de ISs empleado consiste en la siguiente:

5'-ggt gca tcg atg cag ggg gg tga ctg tga acg ttc gag atg a tcg tcg aac gtt cgagat gat tcg aac gtt cga acg ttc gaa cgt t- 3' (SEQ ID NO:22)

Los expertos en la técnica pueden construir el vector de expresión mencionado anteriormente según técnicas de ingeniería genética muy conocidas, descritas, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1989), N.Y., edit., y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987), John Wiley & Sons, edit., y similares.

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El agente terapéutico o mejorador de la presente invención puede proporcionarse como una composición farmacéutica que contiene, además de una cantidad terapéuticamente eficaz del vector de expresión mencionado anteriormente, cualquier vehículo, por ejemplo un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los ejemplos del vehículo farmacéuticamente aceptable incluyen, pero no se limitan a excipientes, tales como sacarosa, almidón, manitol, sorbitol, lactosa, glucosa, celulosa, talco, fosfato de calcio, carbonato de calcio y similares, ligantes, tales como celulosa, metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, gelatina, goma arábiga, polietilenglicol, sacarosa, almidón y similares, disgregantes, tales como almidón, carboximetilcelulosa, hidroxipropilalmidón, almidón-glicol sodio, bicarbonato de sodio, fosfato de calcio, citrato de calcio y similares, lubricantes, tales como estearato de magnesio, aerosil, talco, laurilsulfato de sodio y similares, compuestos aromáticos, tales como ácido cítrico, mentol, sal de amonio de glicirrizina, glicina, polvo de naranja y similares, conservantes, tales como benzoato de sodio, bisulfito de sodio, metilparabeno, propilparabeno y similares, estabilizantes, tales como ácido cítrico, citrato de sodio, ácido acético y similares, agentes suspensores, tales como metilcelulosa, polivinilpirrolidona, estearato de aluminio y similares, agentes dispersantes, tales como tensioactivos y similares, diluyentes, tales como agua, disolución salina y similares, bases de ceras, tales como manteca de cacao, polietilenglicol, vaselina y similares, y compuestos similares.

El agente terapéutico o mejorador de la presente invención puede contener además un adyuvante para potenciar su efecto. Los ejemplos del adyuvante incluyen hidróxido de aluminio, adyuvante de Freund completo, adyuvante de Freund incompleto, adyuvante de pertussis, poli(I:C), CpG-ADN y similares.

Para estimular la introducción intracelular de un vector de expresión, el agente terapéutico o mejorador de la presente invención puede contener además un reactivo para la introducción de ácidos nucleicos. Como reactivo para la introducción de ácidos nucleicos, pueden emplearse lípidos catiónicos, tales como lipofectina (nombre comercial, Invitrogen), lipofectamina (nombre comercial, Invitrogen), transfectamo (nombre comercial, Promega), DOTAP (nombre comercial, Roche Applied Science), dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS), L-dioleoíl fosfatidiletanolamina (DOPE), bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), bromuro de N,N-di-n-hexadecil-N,N- dihidroxietilamonio (DHDEAB), bromuro de N-n-hexadecil-N,N-dihidroxietilamonio (HDEAB), polibreno, poli(etilenimina) (PEI) y similares. Además, puede incluirse un vector de expresión en cualquier liposoma conocido constituido por una bicapa lipídica, tal como un liposoma electrostático. Este liposoma puede fusionarse con un virus, tal como el virus hemaglutinante del Japón (HVJ) inactivado. El HVJ-liposoma tiene una actividad de fusión muy alta con una membrana celular, comparado con los liposomas normales. Cuando se emplea un retrovirus como vector de expresión, puede emplearse RetroNectin, fibronectina, polibreno y similares como reactivos de transfección.

Aunque el contenido del vector de expresión mencionado anteriormente en la composición farmacéutica no está particularmente limitado y se selecciona de modo apropiado de un amplio intervalo, en general es de aproximadamente 0,00001% al 100% en peso de la composición farmacéutica completa.

Mediante la introducción del vector de expresión mencionado anteriormente en una diana de aplicación, tejido (o célula) de mamífero, el agente terapéutico o mejorador de la presente invención induce la expresión in vivo del polipéptido del antígeno de nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico mencionado anteriormente, induce la producción de un anticuerpo contra el epitopo de la angiotensina II contenido en el polipéptido del antígeno de nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico, y trata o mejora la hipertensión del mamífero mediante la neutralización de la actividad de la angiotensina II por el anticuerpo inducido. Se conocen diversos métodos para introducir ácidos nucleicos, tales como un vector de expresión y similares, en el cuerpo (T. Friedman, Science, 244:1275-1281 (1989)), y puede adoptarse cualquier método de introducción, con la condición de que pueda inducir la expresión in vivo del polipéptido del antígeno de nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico mencionado anteriormente, que pueda inducir la producción de un anticuerpo contra el epitopo de la angiotensina II contenido en el polipéptido del antígeno de nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico, y que pueda tratar o mejorar la hipertensión.

Los ejemplos del método para introducir un vector de expresión en un tejido (o célula) de mamífero in vivo incluyen, pero no se limitan a un método de liposomas interno, un método de liposomas electrostático, un método de HVJ- liposomas, un método de liposomas HVJ-AVE, un transgén mediado por receptor, el método de la pistola de partículas, el método del ADN desnudo, un método de introducción mediante un polímero de carga eléctrica positiva y similares.

Como alternativa, pueden aislarse células, tales como células sanguíneas, células de la médula ósea y similares, a partir del mamífero diana de aplicación, y el vector de expresión mencionado anteriormente puede introducirse en las células ex vivo, tras lo cual las células obtenidas que contienen el vector de expresión mencionado anteriormente pueden devolverse al mamífero diana de aplicación.

Los ejemplos del método para introducir un vector de expresión en una célula de mamífero ex vivo incluyen pero no se limitan a un método de lipofección, un método de coprecipitación con fosfato de calcio, un método de DEAE- dextrano, un método de introducción directa de ADN que emplea microcapilares de vidrio y similares.

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El agente terapéutico o mejorador de la presente invención puede administrarse mediante cualquier método, con la condición de que, en el mamífero sujeto de la administración, el agente induzca la expresión in vivo del polipéptido del antígeno de nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico mencionado anteriormente, induzca la producción de un anticuerpo contra el epitopo de la angiotensina II contenido en el polipéptido del antígeno de nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico, y trate o mejore la hipertensión. Preferiblemente, el agente terapéutico o mejorador de la presente invención se administra por vía parenteral en una cantidad suficiente para inducir la producción de un anticuerpo contra el epitopo de la angiotensina II contenido en el polipéptido del antígeno de nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico, y para tratar o mejorar la hipertensión. Por ejemplo, como ejemplos de los métodos de administración, se menciona la inyección por vía intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intradérmica, intra-tejido adiposo, intra-tejido de glándula mamaria o por vía intramuscular; el método de bombardeo de partículas inducido por gas (mediante una pistola de electrones y similares); un método en forma de colunario y similares a través de la vía mucósica y similares. En una realización, el agente terapéutico o mejorador de la presente invención se inyecta por vía subcutánea o intramuscular, preferiblemente por vía subcutánea.

En una realización, el agente terapéutico o mejorador de la presente invención se administra por vía subcutánea por medio de un inyector sin aguja. El inyector sin aguja es preferiblemente un inyector de presión. Los ejemplos del inyector sin aguja incluyen, pero no se limitan a ShimaJET (nombre comercial, SHIMADZU CORPORATION), Twinject EZII (nombre comercian, Japan Chemical Research), Syrijet (nombre comercial, Keystone), ZENEO (nombre comercial, Crossject) y similares. En este caso, el agente terapéutico o mejorador de la presente invención puede proporcionarse como una preparación para inyección que contiene el vector de expresión mencionado anteriormente y un inyector sin aguja, en la que el vector de expresión está introducido dentro del inyector sin aguja.

En una realización, el agente terapéutico o mejorador de la presente invención se administra por vía subcutánea, intradérmica o intramuscular con una pistola de genes. En este caso, el vector de expresión mencionado anteriormente puede aplicarse sobre partículas portadoras, tales como partículas de oro coloidal y similares, para ser introducidas en el cuerpo y empleadas para la administración. Se conoce una técnica para revestir partículas portadoras con un polinucleótido (véase, por ejemplo, el documento WO93/17706). Por último, el vector de expresión puede prepararse en una disolución acuosa, tal como disolución salina fisiológica y similares, adecuada para la administración al cuerpo.

Para inducir unas buenas respuestas inmunológicas, el agente terapéutico o mejorador de la presente invención se administra preferiblemente varias veces a intervalos concretos. Aunque la frecuencia puede ser determinada de modo apropiado controlando el nivel de la respuesta inmunológica, en general es de 2-10 veces, preferiblemente de 2-6 veces, más preferiblemente de 2-4 veces, lo más preferiblemente 3 veces.

La frecuencia de administración en general es de una vez cada 3 días-3 meses, preferiblemente una vez cada 1-4 semanas, más preferiblemente una vez cada 1,5-3 semanas, lo más preferiblemente una vez cada 2 semanas.

En una realización, el agente terapéutico o mejorador de la presente invención se administra a un mamífero diana 3 veces en intervalos de 2 semanas.

Aunque la dosis del agente terapéutico o mejorador de la presente invención depende de la inmunogenicidad del epitopo de la angiotensina II contenido en el polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico codificado por el vector de expresión del ingrediente activo en un mamífero sujeto de la administración, los expertos en la técnica pueden determinar la dosis necesaria para lograr una buena respuesta inmunológica mediante la administración de una cantidad concreta de un vector de expresión a un mamífero sujeto de la administración, la medición de la titulación del anticuerpo específico del epitopo mediante un método de detección, tal como ELISA y similares, y la observación de la respuesta inmunológica. Los expertos en la técnica apreciarán que la inmunogenicidad del agente terapéutico o mejorador de la presente invención también depende de la potencia de la secuencia reguladora, tal como un promotor, utilizada para el vector de expresión como ingrediente activo. Además, los expertos en la técnica también pueden controlar la dosis del agente terapéutico o mejorador de la presente invención con facilidad dependiendo del tipo de vector de expresión que se vaya a utilizar.

La presente invención se explica con más detalle a continuación remitiéndose a los ejemplos, que no limitan la presente invención de ninguna manera.

Ejemplos

Ejemplo 1

1. Método

1-1. Preparación de una construcción que expresa HBc-AngII 1-1-1. Preparación de HBc-AngII, secuencia de HBc y clonación de TA

El plásmido pPLc3 (n.° de registro LMBP 2470) se obtuvo en BCCM/LMBP Plasmid Collection. Se diseñó y sintetizó el siguiente cebador:

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HBcF 5'-gcc atg gat atc gat cct tat aaa gaa ttc gga gc-3' (SEQ ID NO:23)

HBcR 5'-ggc ctc tca cta aca ttg aga ttc ccg aga ttg aga-3' (SEQ ID NO:24)

H2 5'-ggg gtg gat gta tac gcg gtc agt gat agc tgg atc ttc caa gtt aac-3' (SEQ ID NO:25)

H3-II 5'-c cgc gta tac atc cac ccc ttt ggt gct act agc agg gac ctg gta gtc-3' (SEQ ID NO:26)

Las respectivas secuencias de cebadores se corresponden con las siguientes posiciones de la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:1) que codifica la proteína del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis (HBc):

HBc F: los nucleótidos 1-33.

HBc R: los nucleótidos 527-556.

H2: el nucleótido que codifica 2 aminoácidos (IT) del espaciador y una parte de la secuencia de AngII se conectan con los nucleótidos 221-241.

H3-II: una parte de la secuencia de AngII y 3 aminoácidos (GAT) del espaciador se conectan con los nucleótidos 242-259.

En primer lugar, empleando un molde (plásmido pPLc3) y un conjunto de cebadores (HBc F y H2), el primer fragmento de ADN que contiene el N-terminal de HBc, un espaciador y una parte de AngII se amplifica mediante PCR. Además, empleando un molde (plásmido pPLc3) y un conjunto de cebadores (H3-II y HBc R), el segundo fragmento de ADN que contiene una parte de AngII, un espaciador y el C-terminal de HBc se amplifica mediante PCR. Ambos productos de la amplificación comparten secuencias de AngII parcialmente solapadas. Empleando la reasociación de la porción solapada, el primer fragmento de ADN y el segundo fragmento de ADN se conectan mediante una tercera PCR (conjunto de cebadores; HBc F y HBc R) para obtener un producto de la amplificación (HBc-AngII). Es decir, un espaciador y una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que contiene una secuencia parcial de AngII se insertan entre la base 241 y la base 242 de una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:1) que codifica la proteína del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis (HBc). La secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos insertada es IT-DRVYIHPF-GAT (SEQ ID NO:27, 13 aminoácidos). Se realizó una clonación con TA de HBc-AngII en el kit de expresión pcDNA 3.1/V5-His TOPO TA (Invitrogen) para obtener el vector HBc-AngII ISS(-). De modo similar, se realizó una PCR empleando un molde (plásmido pPLc3) y un conjunto de cebadores (HBcF y HBcR) para preparar un fragmento de ADN que codifica un polipéptido de longitud completa de HBc, y se llevó a cabo su clonación con TA en el vector pcDNA 3.1/V5-His TOPO para obtener el vector HBc ISS(-).

1-1-2. Preparación del vector HBc-AngII ISS(+), HBc ISS(+) (preparación de la secuencia ISS e inserción en el vector)

Se diseñaron y se sintetizaron los siguientes moldes (CpG (A+B+C+C)—F y CpG (A+B+C+C)—R) y cebadores (DraIII-F y DraIII-R):

CpG (A+B+C+C)-F

5'-ggt gca tcg atg cag ggg gg tga ctg tga acg ttc gag atg a tcg tcg aac gtt cga gat gat tcg aac gtt cga acg ttc gaa cgt t- 3' (SEQ ID NO:28)

CpG (A+B+C+C)-R

5'-a acg ttc gaa cgt tcg aac gtt cga -atc atc tcg aac gtt cga cga -t cat ctc gaa cgt tca cag tca -cc ccc ctg cat cga tgc acc-3'(SEQ ID NO:29)

DraIII-F

5'-ttt-cacgtagtg- ggt gca tcg atg cag g-3' (SEQ ID NO:30) DraIII-R

5'-ggt-cactacgtg- a acg ttc gaa cgt tcg-3' (SEQ ID NO:31)

Empleando CpG (A+B+C+C)—F y CpG (A+B+C+C)—R como moldes y un conjunto de cebadores de DraIII-F y DraIII-R, se realizó una PCR para producir un fragmento de ADN que contenía la secuencia ISS que tiene un sitio DraIII en ambos extremos (DraIII-ISS). Después, DraIII-ISS y los vectores HBc-AngII ISS(-) y HBc ISS(-) se digirieron con DraIII. Los vectores se trataron con fosfatasa alcalina y se acoplaron con el producto de la digestión enzimática de DraIII-ISS para insertar ISS en el sitio DraIII (1621) de los vectores.

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1-2. Experimento con animales

Cada vector se administró 3 veces (100 pg/pl * 2 sitos/momento) en la piel de la espalda de ratas con hipertensión de 10 semanas de edad (SHR) cada 2 semanas empleando ShimaJET (nombre comercial, SHIMADZU CORPORATION).

Grupo de HBc-AngII ISS(+): 12 ratas Grupo de HBc ISS(+): 7 ratas

La administración se realizó en la semana 0, la semana 2, y la semana 4, y las mediciones de la presión sanguínea, la recogida del suero y la medición de la titulación de anticuerpos se realizaron a la 0, la semana 4, la semana 8, y la semana 16 desde el inicio de la administración.

1-2-1(a). Método del manguito en la cola (1)

Dispositivo de medición del método del manguito en la cola

Fabricante: Softron

Nombre del producto: BP-98A (aparato de medición de la presión sanguínea automático no invasivo para ratas y ratones)

1-2-1(a). Método del manguito en la cola (2)

Documentos de referencia

Evaluation of New Tail-cuff Method for Blood Pressure Measurement in Rats with Special Reference to the Effect of Ambient Temperature, EXPERIMENTAL ANIMALS, vol. 40, n.° 3:331-336 (1991).

Antihypertensive Effect of Sesamin. I. Protection against Deoxycorticosterone Acetate-Salt-Induced Hypertension and Cardiovascular Hypertrophy, BIOLOGICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN, vol. 18, 1016-1019 (1995).

Establishment of an adrenocortical carcinoma xenograft with normotensive hyperaldosteronism in vivo, APMIS, 106:1056-1060 (1998).

Endotherin-1 enhances Pressor Responses to Norepinephrine Involvement of Endothelin-B Receptor, JOURNAL OF CARDIOVASCULAR PHARMACOLOGY, vol. 13, 119-121 (1998).

Effect of dopamine receptor antagonists on the calcium-dependent central function that reduces blood pressure in spontaneously hypertensive rats, ELSEVIER NEUROSCIENCE LETTERS, vol. 269, 133-136 (1999). Leprosy in Hypertensive Nude Rats(SHR/NCrj-rnu), INTERNATIONAL JOURNAL OF LEPROSY, vol. 67, n.° 4, 435-443 (1999).

Potentiation by endothelin-1 of vasoconstrictor response in stroke-prone spontaneously hypertensive rats, EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACOLOGY, vol. 415, 45-49 (2001).

1-2-1(b). Medición de la presión sanguínea mediante el método del manguito en la cola

Método

La medición de la presión sanguínea se realizó mediante el método del manguito en la cola. La medición se realizó 5-15 veces por animal, y se empleó el promedio.

Resultados

El grupo de HBc ISS(+) (control) mostró un aumento en la presión sanguínea en las ratas SHR. Por otra parte, el grupo de HBc-AngII ISS(+) mostró una disminución obvia en la presión sanguínea (figura 1).

1-2-2(a). Método de ELISA

Reactivos y dispositivo de medición

- Conjugado de angiotensina II-BSA, conjugado de angiotensina I-BSA: se prepararon utilizando DSS (suberato de disuccinimidilo) como espaciador.

- Angiotensinógeno (humano): Sigma A2562

- Nunc Maxisorp (n.° de catálogo 442404)

- Leche desnatada al 3% (dilución con PBS)

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- PBS-T (Tween al 0,05%)

- Anticuerpo secundario: anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con HRP (GE, NA931V), anticuerpo secundario anti-IgG de rata conjugado con HRP (GE, NA935V)

- Disolución de TMB: Sigma T0440

- Disolución de detención: H2SO4 0,5 N

- Lector de microplacas (InterMed, ImmunoMini NJ-2300)

1-2-2(b). Medición de la titulación de los anticuerpos contra angiotensina II o angiotensina I en el suero mediante un método ELISA

Método

Se añadieron respectivamente la angiotensina II-BSA, la angiotensina I-BSA y el angiotensinógeno a una placa de 96 pocillos a 50 pl a una concentración de 10 pg/ml y se incubó durante la noche a 4 °C. Después se rechazó el contenido de los pocillos, se añadió leche desnatada al 3% (150 pl/pocillo) y se incubó durante 2 hr a temperatura ambiente para el bloqueo.

Se rechazó el contenido de los pocillos, el suero de ratón diluido con leche desnatada al 3% se añadió a 50 pl en cada pocillo y se incubó durante la noche a 4 °C.

Cada pocillo se lavó 5 veces con PBS-T. Se añadieron el anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con HRP o el anticuerpo secundario anti-IgG de rata conjugado con HRP diluidos 1/1000 veces con leche desnatada al 3% (50 pl/pocillo), y se incubó durante 3 hr a temperatura ambiente. El contenido de cada pocillo se rechazó y cada pocillo se lavó 3 veces con PBS-T. Se añadió la disolución de TMB (50 pl/pocillo) y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de H2SO4 0,5 N (50 pl/pocillo) y se midió la absorbancia a 450 nm.

Resultados

La titulación de los anticuerpos contra BSA-AngII, que no se observó antes de la administración de la vacuna, aumentó tras las 3 administraciones totales de la vacuna (semana 0 y semana 2 y 4). La titulación de los anticuerpos aumentó hasta el máximo en el momento de las 8 semanas después de las 3 administraciones y se mantuvo durante 16 semanas aunque con una tendencia a disminuir (figura 2). La titulación de los anticuerpos contra BSA- AngII aumentó mucho más que los anticuerpos contra BSA-AngI por la administración de la vacuna de HBc-AngII (figura 3).

2. Resumen

Los anteriores resultados de la medición de la presión sanguínea y de la medición de las titulaciones de los anticuerpos sugieren que la administración de la vacuna de HBc-AngII ISS(+)ADN puede aumentar las titulaciones de anticuerpos contra AngII y prevenir o tratar la hipertensión.

Ejemplo 2

1. Experimento con animales

De las misma manera que en el ejemplo 1, cada vector se administró 3 veces (100 pg/pl * 2 sitos/momento) en la piel de la espalda de ratas con hipertensión de 10 semanas de edad (SHR) cada 2 semanas empleando ShimaJET (nombre comercial, SHIMADZU CORPORATION).

Grupo de HBc-AngII ISS(+): 6 ratas

Grupo de HBc ISS(+): 4 ratas

Grupo de disolución salina: 5 ratas

2. Medición de la presión sanguínea mediante el método del manguito en la cola Método

De la misma manera que en el ejemplo 1, la medición de la presión sanguínea se realizó mediante el método del manguito en la cola. La medición se realizó 5-15 veces por animal, y se empleó el promedio.

Resultados

El grupo de HBc ISS(+) (control) y el grupo de disolución salina mostraron un aumento en la presión sanguínea en las ratas SHR. Por otra parte, el grupo de HBc-AngII ISS(+) mostró una disminución obvia en la presión sanguínea (figura 4). Este efecto de disminución de la presión sanguínea duró hasta después de 24 semanas desde el inicio de 5 la administración.

3(a). Método de ELISA

Reactivos y dispositivo de medición

10 - Angiotensinógeno (humano): Sigma A2562

- Nunc Maxisorp (n.° de catálogo 442404)

- Leche desnatada al 5% (dilución con PBS)

- PBS-T (Tween al 0,05%)

- Anticuerpo secundario: anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con HRP (GE, NA931V), anticuerpo 15 secundario anti-IgG de rata conjugado con HRP (GE, NA935V)

- Disolución de TMB: Sigma T0440

- Disolución de detención: H2SO4 0,5 N

- Lector de microplacas (Bio-Rad Inc., Japón)

3(b). Medición de la titulación de los anticuerpos contra angiotensina II en el suero mediante un método ELISA 20 Método

Se añadieron respectivamente la angiotensina II-BSA, la angiotensina I-BSA y el angiotensinógeno a una placa de 96 pocillos a 50 pl a una concentración de 10 pg/ml y se incubó durante la noche a 4 °C. Después se rechazó el contenido de los pocillos, se añadió leche desnatada al 5% (150 pl/pocillo) y se incubó durante 2 hr a temperatura ambiente para el bloqueo.

25 Se rechazó el contenido de los pocillos, el suero de ratón diluido con leche desnatada al 5% se añadió a 50 pl en cada pocillo y se incubó durante la noche a 4 °C.

Cada pocillo se lavó 5 veces con PBS-T. Se añadieron el anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con HRP o el anticuerpo secundario anti-IgG de rata conjugado con HRP diluidos 1/1000 veces con leche desnatada al 5% (50 pl/pocillo), y se incubó durante 3 hr a temperatura ambiente. El contenido de cada pocillo se rechazó y cada 30 pocillo se lavó 3 veces con PBS-T. Se añadió la disolución de TMB (50 pl/pocillo) y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de H2SO4 0,5 N (50 pl/pocillo) y se midió la absorbancia a 450 nm.

Resultados

La titulación de los anticuerpos contra BSA-AngII, que no se observó antes de la administración de la vacuna, 35 aumentó tras las 3 administraciones totales de la vacuna (semana 0 y semana 2 y 4). Se detectó un aumento en la titulación de los anticuerpos a las 4 semanas desde el inicio de la administración. El aumento en la titulación de los anticuerpos se mantuvo incluso después de 24 semanas desde el inicio de la administración (figura 5).

4. Resumen

Lo anterior sugiere que la administración de la vacuna de HBc-AngII ISS(+)ADN puede aumentar las titulaciones de 40 anticuerpos contra AngII y prevenir o tratar la hipertensión.

Aplicabilidad industrial

Se proporciona una vacuna mejor para la hipertensión.

Listado de secuencias

<110> ANGES MG INC.

45 OSAKA UNIVERSITY

<120> Vacuna de ADN

<130> 091842

<150> JP2011-091493 <151> 2011-04-15

5 <150> JP2011-227320

<151> 2011-10-14

<160> 31

<170> PatentIn versión 3.4

<210> 1

10 <211> 556

<212> ADN

<213> Virus de la Hepatitis B

<220>

<221> CDS 15 <222> (2)..(553)

<400> 1

c atg gat ate gat cct tat aaa gaa ttc gga gct act gtg gag tta etc 49

Met Asp lie Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 15 10 15

teg: ttt etc ccg agt gac ttc ttt cct

Ser: Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro



: 20 25

acc: gee age gcg ctg tat cgg gaa gee

Thr: Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala


: 35 40

age: cct cae cat act gee etc agg caa

Ser: Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln

: 50 55

etc: atg act ctg gee acg tgg gtg ggt

Leu: Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly

65: 70

age: agg gac ctg gta gtc agt tat gtc

Ser: Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val




: 85

ttc: agg caa etc ttg tgg ttt cae att

Phe: Arg Gln Leu Leu Trp Phe His lie



: 100 105

gaa: aca gtt cta gaa tat ttg gtg tet

Glu: Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser


: 115 120

cct: cea gct tat agg cct ccg aat gee

tea gta cga gat ctt ctg gat 97

Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 30

ttg gag tet cct gag cae tgc 145

Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 45

gca att ctt tgc tgg ggg gag 193

Ala lie Leu Cys Trp Gly Glu 60

gtt aac ttg gaa gat cea gct 241

Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala 75 80

aac act aat atg ggt tta aag 289

Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 90 95

age tgc etc act ttc ggc cga 337

Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 110

ttc gga gtg tgg ate cgc act 385

Phe Gly Val Trp lie Arg Thr 125

cct ate ctg teg aca etc ccg 433

Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro lie Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140

gag act act gtt gtt aga cgt cga ggc agg tea cct aga aga aga act

Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr

145 150 155 160

cct teg cct cgc agg cga agg tet caa teg ccg cgg cgc cga aga tet

Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser

165 170 175

caa tet cgg gaa tet caa tgt tag tga Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180

529

556

<210>2 <211> 183 <212> PRT

5 <213> Virus de la Hepatitis B

<400>2

Met Asp lie Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 15 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala lie Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60

Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80

Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95

Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His lie Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110

Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp lie Arg Thr 115 120 125

Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro lie Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140

Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr

145 150 155 160

Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser

165 170 175

Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180

10 <210> 3

<211> 185 <212> PRT

<213> Virus de la Hepatitis B

<400>3

Met Asp lie Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 15 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala lie Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60

Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80

Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95

lie Arg Gln Leu Leu Trp Phe His lie Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110

Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp lie Arg Thr 115 120 125

Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro lie Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140

Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg 145 150 155 160

Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg 165 170 175

Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 185

<210>4 <211> 11 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Epítopo de Ang II <400 4

Cys Gly Gly Asp Arg Val Tyr lie His Pro Phe 10 1 5 10

<210>5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial

15 <220>

<223> Epítopo de Ang II

<400>5

Cys Gly Gly Asp Arg Val Tyr lie His Pro Phe His Leu 15 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

<210>6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Epítopo de Ang II <400>6

Asp Arg Val Tyr lie His Pro Phe His Leu Gly Gly Cys 15 10

<210>7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Epítopo de Ang II <400>7

Cys Asp Arg Val Tyr lie His Pro Phe His Leu 15 10

<210>8 <211>6 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Epítopo de Ang II <400>8

Cys His Pro Phe His Leu 1 5

<210>9 <211>6 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Epítopo de Ang II <400>9

Cys Gly Pro Phe His Leu 1 5

<210> 10 <211>6 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Epítopo de Ang II <400> 10

Cys Tyr lie His Pro Phe 1 5

<210> 11 <211>6 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Epítopo de Ang II <400> 11

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Cys Gly lie His Pro Phe 1 5

<210> 12 <211>6 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Epítopo de Ang II <400> 12

Cys Gly Gly His Pro Phe 1 5

<210> 13 <211>8 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Epítopo de Ang II <400> 13

Cys Arg Val Tyr lie Gly Gly Cys 1 5

<210> 14 <211>7 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Epítopo de Ang II <400> 14

Asp Arg Val Tyr Gly Gly Cys 1 5

<210> 15 <211>6 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Epítopo de Ang II <400> 15

Asp Arg Val Gly Gly Cys 1 5

<210> 16 <211>8 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Epítopo de Ang II <400> 16

Asp Arg Val Tyr lie His Pro Phe 1 5

<210> 17 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> epítopo CETP

5

10

15

20

25

30

35

40

45

<400> 17

Arg Asp Gly Phe Leu Leu Leu Gln Met Asp Phe Gly Phe Pro Glu His 15 10 15

Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu 20 25

<210> 18 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> CpG-B 1018 <400> 18

tgactgtgaa cgttcgagat ga 22

<210> 19 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> CpG-A D19 <400> 19

ggtgcatcga tgcagggggg 20

<210> 20 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Epítopo de Ang II <400> 20

tcgtcgaacg ttcgagatga t 21

<210> 21 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> CpG-C C695 <400> 21

tcgaacgttc gaacgttcga acgtt 25

<210> 22 <211> 88 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> ISS

<400> 22

ggtgcatcga tgcagggggg tgactgtgaa cgttcgagat gatcgtcgaa cgttcgagat 60

gattcgaacg ttcgaacgtt cgaacgtt 88

<210> 23 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

<220>

<223> Cebador HBcF <400> 23

gccatggata tcgatcctta taaagaattc ggagc 35

<210> 24 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador HBcR <400> 24

ggcctctcac taacattgag attcccgaga ttgaga 36

<210> 25 <211> 48 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador H2 <400> 25

ggggtggatg tatacgcggt cagtgatagc tggatcttcc aagttaac 48

<210> 26 <211> 49 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador H3-II <400> 26

ccgcgtatac atccacccct ttggtgctac tagcagggac ctggtagtc 49

<210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> péptido insertado <400> 27

lie Thr Asp Arg Val Tyr lie His Pro Phe Gly Ala Thr 15 10

<210> 28 <211> 88 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> CpG cebador F <400> 28

ggtgcatcga tgcagggggg tgactgtgaa cgttcgagat gatcgtcgaa cgttcgagat 60

gattcgaacg ttcgaacgtt cgaacgtt 88

<210> 29 <211> 88 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> CpG cebador R <400> 29

aacgttcgaa cgttcgaacg ttcgaatcat ctcgaacgtt cgacgatcat ctcgaacgtt 60

cacagtcacc cccctgcatc gatgcacc 88

5 <210> 30

<211> 28 <212> ADN <213> Artificial

<220>

10 <223> Dra III cebador F

<400> 30

tttcacgtag tgggtgcatc gatgcagg 28

<210> 31 <211> 28 15 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Dra III cebador R <400> 31

20 ggtcactacg tgaacgttcg aacgttcg 28

Claims

REIVINDICACIONES

1. - Un vector de expresión que codifica un polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico insertado con una secuencia de aminoácidos que comprende un epitopo específico de angiotensina II, para su uso en un método para el tratamiento o la mejora de la hipertensión en un mamífero, en el que la secuencia

5 de aminoácidos que comprende el epitopo específico se inserta entre los restos aminoácidos 80 y 81 del polipéptido del antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B, en el que la secuencia de aminoácidos que comprende el epitopo específico es la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:16, y en el que el vector de expresión comprende además una secuencia inmunoestimuladora (ISS) que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:22 incorporada en el vector de expresión y que expresa el polipéptido del antígeno de la 10 nucleocápsida del virus de la hepatitis B quimérico en una célula en el mamífero.
2. - El vector de expresión para su uso según la reivindicación 1, que se administra por vía subcutánea empleando un inyector sin aguja.
3. - El vector de expresión para su uso según la reivindicación 2, en el que el inyector sin aguja es un inyector de presión.

15 4.- El vector de expresión para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que se administra muchas

veces, preferiblemente 2 o 3 veces, más preferiblemente 3 veces.
5. - El vector de expresión para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que se administra 3 veces en intervalos de 2 semanas.
6. - El vector de expresión para su uso según la reivindicación 1, que está introducido en un inyector sin aguja.

20