CN1896094B - 一种血管紧张素ii受体1型人免疫源性肽段的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种血管紧张素II受体1型人免疫源性肽段的应用，所述肽段选自氨基酸序列为Ala-Phe-His-Tyr-Glu-Ser-Gln，用于制备治疗原发性高血压降压的疫苗或药物组合物。制备的药物组合物和疫苗可通过注射的方式给予，在0～8周的期间内给药1～4剂，使用时优选间隔0～8周给药2剂。此后可定期1～3个月给予增强剂1剂，一个剂量中的肽段量是1pg～100mg/kg宿主。制备一个剂量中的肽段量是100pg～1μg/kg宿主。

Description

一种血管紧张素II受体1型人免疫源性肽段的应用

技术领域

本发明涉及一种血管紧张素II受体1型人免疫源性肽段的应用，属于生物技术药物和生物治疗学领域，涉及一种用于原发性高血压新型免疫学治疗的化合物。本发明特别涉及包含血管紧张素II受体1型(AT1)免疫原性肽段以及用该肽段制备的疫苗和药物组合物可用于原发性高血压的降压治疗。

背景技术

高血压是一种发病率很高的严重危害人类健康的疾病，影响到全球10亿人。Framingham心脏研究提示，在55岁血压正常的人群中，有90％人群可能在其一生中发展为高血压。高血压是心脑血管病的独立危险因素，有效控制血压可以降低脑卒中发生率35-40％、心肌梗死发生率20-25％、心力衰竭发生率50％。

高血压的发病涉及复杂的病理生理机制，其中肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)在高血压的发病中具有重要作用。RAS是调节血压和血容量的激素系统，也是一个复杂的血压反馈控制系统，作为RAS的主要组成因子，血管紧张素II(Ang II)是内源性升压物质中最强的血管活性物质之一，在调节机体心血管系统功能上具有主导性作用，Ang II不仅作为参与高血压的形成，还可引起类似细胞因子、炎症因子等生长因子的作用，引起VSMCs的增殖，参与血管重塑、血管炎症，导致动脉粥样硬化、高血压及相关并发症的形成。Ang II的主要病理生理效应由血管紧张素II受体1型(AT1受体)所介导。

由于肾素血管紧张素系统(RAS)在高血压发病学中起着重要作用，而通过抑制血管紧张素转换酶(ACE)和血管紧张素II受体I型(AT₁受体)可以有效降低血压。因此，ACE抑制剂和AT₁受体拮抗剂是目前高血压治疗的有效药物，然而ACE抑制剂干咳的发生率高，使患者难以耐受；AT₁受体拮抗剂有良好的耐受性，但需要每天服药。为了研发新型RAS的降压药物，S.M.Gardiner等(1)用血管紧张素I肽段类似物作为疫苗，主动免疫大鼠，产生特异性高滴度的抗体，并且能够阻断外源性血管紧张素I引起的血压升高。Zelezna B等(2)用AT₁受体胞外N端肽段片段(氨基酸序列为SEQ ID NO：14-23)，主动免疫自发性高血压大鼠(SHR)，5个月后所有动物均产生抗该肽段的抗体，降低了幼年SHR的血压升高水平，但不能降低成年SHR已经升高的血压。因此，需要寻找可用于高血压治疗有效的AT₁受体降压疫苗。长效降压药物有助于提高原发性高血压病人治疗的依从性，从而达到有效控制血压的目的。

发明内容

本发明的目的之一是寻找一种血管紧张素II受体1型人免疫源性肽段的应用，作为长效降压药物，有助于提高原发性高血压病人治疗的依从性，从而达到有效控制血压的目的。

本发明的目的之二提供一种血管紧张素II受体1型人免疫源性肽段的应用，该血管紧张素II受体1型免疫原性肽段作为疫苗和药物组合物，用于原发性高血压的降压治疗。即提供一种免疫靶向治疗原发性高血压的化合物及方法。

本发明的技术方案：本发明提供了一种血管紧张素II受体1型人免疫源性肽段的应用，所述肽段选自氨基酸序列为Ala-Phe-His-Tyr-Glu-Ser-Gln，用于制备治疗原发性高血压降压的疫苗或药物组合物。

所述的血管紧张素II受体1型人免疫源性肽段的应用，制备的药物组合物和疫苗可通过注射的方式给予，在0～8周的期间内给药1～4剂，此后可定期1～3个月给予增强剂1剂，一个剂量中的肽段量是1pg～100mg/kg宿主。

所述的血管紧张素II受体1型人免疫源性肽段的应用，制备一个剂量中的肽段量是100pg～1μg/kg宿主。

所述的血管紧张素II受体1型人免疫源性肽段的应用，制备的用于原发性高血压降压治疗的疫苗或药物组合物，使用时优选间隔0～8周给药2剂。

本发明的优点：用本发明的血管紧张素II受体1型人免疫源性肽段的应用，作为疫苗和药物组合物用于原发性高血压的降压治疗，可作为长效降压药物，有助于提高原发性高血压病人治疗的依从性，从而达到有效控制血压的目的。即提供一种免疫靶向治疗原发性高血压的化合物及方法。

附图说明

图1是免疫后SHR血清抗体滴度。图2是ATR12185和ATR10014免疫组收缩压对比。图3是大鼠AT1受体短肽免疫SHR后的收缩压变化。图4是肠系膜3级动脉动脉的形态学变化(×100)图。图5是胸主动脉超微结构变化图，超微病理(×5000)。图6ATR12181免疫后心肌组织的形态学改变(×200)图。图7.ATR12181免疫后心肌组织超微结构的改变(×5000)。图8是心脏AngII含量图。图9各免疫组SHR大鼠主动免疫肽段后产生抗体滴度随时间变化图。图10各组SHR免疫后收缩压-时间变化曲线。图11是抗ATR12181抗体VSMC免疫荧光染色及免疫印迹结果图。图12是抗ATR12181抗体拮抗Ang II对VSMC细胞的增殖效应图。图13：ATR12181肽段免疫后SHR血压及抗体滴度随时间变化曲线(64周)。图14是ATR12181肽段主动免疫对心脏靶器官的保护作用(光镜24周)对照图。见图15是ATR12181肽段主动免疫对心脏靶器官的保护作用(透射电镜24周)对照图。图16是ATR12181主动免疫对心脏靶器官的保护作用(64周)对照图。图17是ATR12181主动免疫对SHR大鼠肾脏靶器官的保护作用(64周)对照图。图18是SHR心肾组织c-fos及c-jun mRNA水平(64周)图。

具体实施方式

本发明提供一种血管紧张素II受体1型人免疫源性肽段的应用，该肽段的氨基酸序列为SEQ ID NO：181-187及其变体；含有该肽段和生理学上可接受的载体的组合物，肽段耦联到载体蛋白，耦联物肽段分子配以适当佐剂制备成肽段疫苗。

同时提供了该肽段用于治疗原发性高血压的用途及方法，包括给予有效量的疫苗。施用的过程包括标准的肌肉、皮下途径和过程，可以按照配方和将要被治疗的高血压状态来选择肽段施用量。

本发明属于生物技术药物和生物治疗学领域，涉及原发性高血压新型免疫学治疗的化合物和方法。本发明特别涉及包含血管紧张素II受体1型(AT1)免疫原性的肽段及其变体，其中所述肽段含有由具有选自下述氨基酸序列：Ala-Phe-His-Tyr-Glu-Ser-Gln。

1.肽段及其变体的描述。

所述的血管紧张素II受体1型(AT1)免疫原性肽段，可以在自发性高血压大鼠和原发性高血压患者体内引起特异性免疫应答，产生针对该肽段的抗体。所产生的抗体可以与AT₁受体特异性结合，并且阻滞血管紧张素II与AT₁受体结合，从而在自发性高血压大鼠和原发性高血压病人产生降压效应和靶器官保护。此处所述的肽段免疫原性部分可用抗原抗体结合试验鉴定。可将肽段固定于固相支持物上，与接种本降压疫苗的自发性高血压大鼠和原发性高血压病人血清孵育，可使血清中的抗体与被固定的肽段结合，除去未结合的血清，用辣根过氧化物酶标记的二抗与被固定的肽段结合，通过显色剂识别。

本发明的药物组合物还含有上述肽段的变体。此处所用的肽段“变体”是与所述肽段区别仅在于保守性替代和/或修饰、而仍保留了肽段的治疗性、抗原性和/或免疫原性等特性的肽段。肽段变体与已鉴定的肽段优选有至少约70％、更优选至少约90％、最优选至少约95％同一性。此处所用的“保守性替代”是指某一氨基酸被另一具有相似特性的氨基酸所替代，肽化学领域内的技术人员可预知此肽段的二级结构和亲水性并未实质性改变。

本发明肽段的氨基酸序列为：

SEQUENCE LISTING

<110>华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120>血管紧张素II受体1型肽段

<130>研究报告一二三

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>7

<212>PRT

<213>大鼠血管紧张素II受体1型A亚型

<220>

<221>DOMAIN

<222>(1)..(7)

<223>

<400>1

Ala Phe His Tyr Glu Ser Arg

1               5

<210>2

<211>7

<212>PRT

<213>人血管紧张素II受体1型

<400>2

Ala Phe His Tyr Glu Ser Gln

1               5            。

本发明可用固相化学合成方式生产本文公开的肽段。合成肽段可用本领域普通技术人员熟知的技术设备。例如，肽段可用任何可购买的固相技术合成，如Merrifield固相合成法，其中氨基酸被依次加到正在延长的氨基酸链上。肽段自动合成仪可购买如PerkinElmer/应用生物系统分部等厂家，并可按制照商的指示进行操作。一般说来，不考虑制备方法，此处所公开的肽段被制成基本纯的形式(即氨基酸组成和一级结构分析测定显示此肽段是均一的)。优选该肽段至少约90％纯，更优选至少约95％纯，最优选至少约99％纯。这些基本纯的肽段被掺入药物组合物或疫苗中以用于本文公开的方法内。

2.制备方法、载体和佐剂的描述。

虽然本领域技术人员已知的任何合适载体均可用于本发明的药物组合物中，肽段和生理学上可接受的载体，诸如破伤风类毒素、氢氧化铝、ISCOM、牛血清白蛋白。可用降解的微球体也可用作本发明药物组合物中的载体。但载体类型将根据给药方式的变化而变化。非特异性免疫反应增强剂是一种佐剂，任何非特异免疫应答增强剂均可用于本发明的疫苗中。例如，佐剂即为其中一种。多数佐剂含有设计用来保护抗原免受快速分解代谢的物资，例如氢氧化铝或矿物油，还有免疫应答的非特异刺激物，如脂质A、百日咳杆菌或结核杆菌。下面的佐剂可以购买得到，例如，费氏不完全佐剂和完全佐剂。

施用的过程包括标准的肌肉、皮下途径和过程，溶剂优选地包括水、盐水、酒精、脂质、腊和/或缓冲液。合适的可降解的微球体公开于例如美国专利号4,897,268和5,075,109中。

疫苗纯度的鉴定，可以通过高压液相色谱进行，纯度一般要求在85％以上，优先选用90％以上，更优选在95％以上，最优选在99％以上。

3.免疫治疗方法的描述。

给药方式、频率以及剂量随个体的差异而变化，可与其它疾病免疫疗法中所用的相当。一般说来，药物组合物和疫苗可通过注射(如皮下注射、皮内注射或肌肉注射)的方式给予。可在0～8周的期间内给药1～4剂，优选间隔0～8周给与2剂，此后可定期1～3个月给与增强剂1剂。不同高血压状态的患者可能有其它适当方案。合适的剂量是指有效地在被治疗患者内产生针对原发性高血压患者AT1受体的免疫应答的肽段量。一般说来，一个剂量中的肽段量是大约1pg～100mg/kg宿主，通常是大约10pg～1mg/kg宿主，优选是大约100pg～1μg/kg宿主。合适的剂量大小随患者的体重而变化，但通常是大约0.01ml～5ml。肽段注射于动物可以产生抗体。抗体可由本领域技术人员已知的众多技术制备。参阅如Harlow和Lane，《抗体：实验室手册》(冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1998)。在一种此类技术中，首先将含抗原性肽段的免疫原注射入多种哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔、绵羊和山羊等)中的任一种。在这一步中，本发明的肽段不需修饰即可作为免疫原。或者，可将肽段与载体蛋白(如牛血清白蛋白或破伤风类毒素等)连接在一起，以激发更强的免疫应答。将免疫原注射入动物宿主，优选根据预定的时间表，再注射一次或多次加强免疫，并定时对动物取血。对肽段特异的多克隆抗体可以从抗血清中，通过例如利用了偶联至合适固相支持物上的肽段的亲和层析法纯化得到。

实验报告一：

主动免疫AT₁受体对自发性高血压大鼠血压及靶器官重构的影响：

肾素血管紧张素系统(RAS)在高血压发病中起重要作用，通过抑制血管紧张素转换酶(ACE)和血管紧张素II受体I型(AT₁受体)可以有效降低血压，且对靶器官产生保护作用。ACE抑制剂和AT₁受体拮抗剂是高血压治疗的有效药物，在降低血压的同时，能够改善心脏及血管的重构，保护靶器官。然而ACE抑制剂干咳发生率高，而AT₁R拮抗剂虽有良好耐受性，但需要每天服药。为研发新型抗RAS降压药物，Gardiner等用血管紧张素I肽段类似物作为疫苗，主动免疫大鼠，能够产生特异性抗体，且能阻断外源性血管紧张素I引起的血压升高。而Zelezna B等用AT₁受体胞外N端肽段片段，主动免疫SHR，5个月后产生抗该肽段抗体，能够降低幼年SHR血压升高水平，但不能逆转成年SHR的高血压，而且心脏/体重没有降低，提示所选用的肽段片段对心脏等靶器官的保护作用不明显。本研究采用我们实验室设计、合成的AT1受体胞外的不同肽段，主动免疫血压已经升高的SHR，探讨能否降低其血压及改善血管重构。

1材料与方法

1.1材料破伤风类毒素(TT，由武汉生物制品研究所提供)，福氏佐剂(武汉亚法生物技术有限公司)，硼酸缓冲液(分析纯)，0.3％戊二醛溶液(分析纯)，碳酸缓冲液，牛血清白蛋白(武汉亚法生物技术有限公司)，PBS，辣根过氧化物酶标抗体，PSSM-8型肽段自动合成仪(Shimadzu公司，日本)，ELX-800型酶标仪(Bio-tek公司，美国)，RMS-III型大鼠血压心率仪(上海高血压研究所)，氯沙坦(杭州默沙东公司提供，批号00036)。SHR35只，雄性，4周龄，同龄Wistar大鼠28，雄性。

1.2肽段制备设计AT₁受体胞外3个肽段序列，分别标记为ATR12181，ATR12185，ATR10014，采用PSSM-8型肽段合成仪，固相法合成AT₁受体的不同肽段。破伤风类毒素作为载体蛋白，采用戊二醛偶联法进行偶联。其中ATR12181氨基酸序列来自大鼠血管紧张素II受体1型A亚型的第181-187氨基酸序列，Ala-Phe-His-Tyr-Glu-Ser-Arg。

1.3主动免疫大鼠和药物干预SHR随机分成5组，氯沙坦治疗组(SHR-L)，ATR12181，ATR12185，ATR10014免疫组，对照组，每组7只。SHR(2月龄)血压升高后，给予免疫和药物干预。Wistar大鼠随机分组，为对照组(Wistar-C)、ATR12181、ATR12185及ATR10014免疫组，每组7只。肽溶液与等容积的福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂混匀，皮下多点注射，每只大鼠每次注射50μg，共6次，时间为0、2、4、8、12、16周。第一次用福氏完全佐剂，其余用福氏不完全佐剂。SHR-C用福氏完全佐剂注射，SHR-L给予氯沙坦(10mg·kg^-1·d^-1)灌胃，每天一次。免疫前后鼠尾采血，分离血清，低温冰箱保存，备用。

1.4 ELISA检测抗体试验中设置空白对照和阳性、阴性对照，测OD值时以空白对照调零，以保证检测结果的可靠性。免疫动物组血清与阴性血清的吸光度之比([标本A值-空白对照A值]/[阴性对照A值-空白对照A值])超过2.1倍判为抗体检测阳性。

1.5血压测量鼠尾血压计测定大鼠血压，在免疫前及免疫后每月测定1次。每只重复测量3次，取平均值。

1.6光镜及透射电镜标本制备和称重实验结束时所有大鼠于处死前均称重，大鼠处死后取出心脏、肾脏、主动脉及肠系膜三级动脉血管，置于10％的中性福尔马林液中固定，并称重心脏、左心室及肾脏重量；组织经常规脱水，石蜡切片，HE染色后，光镜观察。通过图象分析系统测定肠系膜三级动脉中膜厚度、内径大小以及二者的比值。取心肌、血管及肾脏等组织标本并修块、固定、包埋、超薄切片，电镜观察。

1.7心肌和血浆Ang II含量大鼠断头取血5ml于冰水浴冷却的抗凝管中(含酶抑制剂0.3mol/LEDTA、0.34mol/L8-羟基奎啉和0.32mol/L二巯基丙醇各50μl)摇匀，离心5min(1000r/min)，分离血浆低温保存。取大鼠心尖组织100mg加入0.5mol/L乙酸2.5ml，煮沸15min，冷却后匀浆(5000r/min)，4℃离心20min(3000r/min)，取上清低温保存。AngII测定严格按照放免试剂盒说明书操作(放免试剂盒由北方生物制品研究所提供，批内变异系数＜5％，批间＜10％)。

1.8统计学分析数据以均数±标准差表示，用SPSS10.0软件进行统计处理，治疗前后比较采用t检验，组间差异性比较采用方差分析(ANOVA)，以P＜0.05具有显著性差异。

2结果

2.1抗AT₁受体短肽抗体滴度被免疫大鼠均产生了抗特定肽段的抗体。抗体滴度自免疫后1月升高，4个月达到高峰，免疫后5个月有所下降，其中ATR12181短肽所产生的抗体滴度最高，见图1。

2.2AT₁受体短肽免疫大鼠后的收缩压变化SHR收缩压2月龄开始升高，3月龄时，SHR-L及ATR12181免疫组SHR收缩压较SHR-C明显降低(P＜0.05)，而ATR12185和ATR10014免疫组收缩压无明显变化，见图2。Wistar大鼠免疫前后、免疫组与未免疫组之间收缩压无差别，见图3。

2.3AT₁受体短肽免疫大鼠后心脏及左室重量的变化经过治疗后SHR-L及ATR12181免疫组心脏重量明显减轻，与SHR-C对比，P＜0.05。各组心脏/体重(HW/BW)以及左心室/体重(LVW/BW)见表1-1。

表1-1.AT1受体短肽免疫大鼠后对心脏及左室重量的变化(n＝7，x±s)

注：与SHR-C相比，*P＜0.05

2.4AT₁受体短肽免疫大鼠对肠系膜三级动脉中膜厚度的影响治疗后SHR-L及ATR12181免疫组中膜厚度/管腔半径及中膜面积/管腔面积有所减少，与SHR-C对比，P＜0.05。见表1-2。

表1-2. ATR12181对中膜厚度/管腔半径及中膜面积的影响(n＝7，x±s)

注：与SHR-C相比，*P＜0.05

2.4肠系膜动脉的形态学变化及对主动脉超微结构的影响光镜观察见Wistar组管壁内膜、中膜、外膜无增厚，中膜平滑肌层平滑肌细胞数目较多，呈同心圆状整齐排列，中膜无空泡样结构，管腔相对较大；SHR组管壁内膜、中膜、外膜均明显增厚，中膜平滑肌层平滑肌细胞数目明显增多，排列极其紊乱，且中膜可见许多空泡样结构，管腔明显狭窄，而ATR12181及SHR-L接近Wistar，见图4。图5是胸主动脉超微结构变化图，显示Wistar大鼠胸主动脉平滑肌细胞核膜完整，肌原纤维清晰、排列整齐，间质胶原纤维无增生；SHR组肌原纤维模糊、排列紊乱，间质胶原纤维重度增生。氯沙坦治疗组肌原纤维模糊程度减轻，排列较整齐，间质胶原纤维无明显增生。ATR12181免疫组肌原纤维模糊程度减轻，排列整齐，间质胶原纤维轻度增生。

2.5.AT₁受体短肽免疫大鼠心肌组织学变化

2.5.1心肌组织形态学观察从心肌的纵切面来看，Wistar组心肌纤维排列整齐、致密，而且心肌纤维的连续性好；SHR对照组心肌纤维排列稀疏、紊乱，中间可见断裂；洛沙坦治疗组心肌纤维排列整齐、致密，断裂不明显；ATR12181免疫组排列较稀疏，但不如SHR组明显，心肌纤维断裂不明显，见图6。

2.5.2心肌组织超微结构的改变Wistar组心肌细胞核膜完整，肌原纤维清晰、排列整齐、可见横纹，线粒体嵴清晰，间质胶原纤维无增生；SHR组肌原纤维模糊、排列紊乱，横纹消失，线粒体增多，线粒体嵴紊乱，内有空泡形成，间质胶原纤维重度增生。洛沙坦治疗组肌原纤维模糊程度减轻，排列较整齐，可见横纹，线粒体减少，线粒体嵴较清晰，间质胶原纤维无明显增生。ATR12181免疫组肌原纤维模糊程度减轻，排列整齐，可见横纹，线粒体减少，间质胶原纤维轻度增生，见图7。

2.6肾脏病理超微结构变化电镜下，SHR对照组中，肾小球血管袢排列不规则，基底膜增厚，部分内皮细胞肿胀，足细胞肿胀，节段性系膜基质增生，肾小管上皮细胞肿胀变性，可见坏死的肾小管上皮细胞脱落于管腔中；在ATR12181免疫SHR组及氯沙坦治疗组中，肾小球血管袢排列欠规则，基底膜无明显增厚，少许足细胞肿胀，无明显的肾小管变性坏死；Wiatar对照组肾小球，肾小管电镜下无异常。

3.讨论

高血压发病涉及复杂的病理生理机制，其中RAS具有重要作用。作为RAS的主要效应因子血管紧张素II(Ang II)是内源性升压物质中很强的血管活性物质，在调节机体心血管系统功能上具有主导性作用。而大规模临床试验证明，抑制RAS活性的药物治疗原发性高血压取得显著的疗效。Makino等研究表明，AT₁R在高血压左室肥厚的发生发展包括间质胶原增生、心肌成纤维细胞增殖、左室心肌细胞的肥大过程中起着关键的作用。AT₁R属于G-蛋白偶联受体超家族，由359个氨基酸组成，包括位于细胞外N端的结合结构域、七次跨膜的α螺旋和胞内含有若干个磷酸化位点(Ser/Thr)的C端，构成胞外胞内各三个环肽段和一段肽段的空间结构，其中胞外部分是接受信号刺激的部位，具有激素受体的所有特征，而胞外第二环肽片段具有抗原决定簇的作用。作为接受信号的锚定在细胞膜外的三个环肽及一个链肽结构，均可作为抗原产生相应抗体，有可能抗AT₁受体不同肽段抗体具有不同的生物学效应。

由于针对AT₁R特定肽段的抗体可以与该肽段特异性地结合，有可能影响AngII与AT₁R的结合，产生阻滞剂样的作用。如能通过主动免疫AT₁R，产生具有阻滞作用的特定抗体，则可以达到降低血压、保护靶器官的目的。本实验应用AT₁R细胞外不同的短肽片段，主动免疫SHR，均产生了针对AT₁R的特异性抗体，其中ATR12181使SHR血压下降。其血压下降的机理，推测ATR12181肽段可能是AT₁R胞外部分与AngII相结合的部位之一，抗ATR12181抗体与AT₁R特异性地结合，占据或者影响了Ang II与AT₁R相结合的部位，进而阻滞了Ang II与AT₁R的作用，从而使SHR血压下降。Wistar大鼠用各个肽段免疫后，虽然均产生抗体，但均对血压无明显影响。

高血压心血管结构重塑是患者心血管事件发生率与死亡率增高的主要原因，高血压治疗不仅要能有效控制血压，更应着眼于恢复心血管系统正常结构与功能。高血压心血管的重塑是高血压靶器官损害的病理基础，也是患者心血管事件发生率和死亡率上升的主要原因。血管重构，其特征包括中层壁增厚，内径减小，二者的比值增大。而动脉壁的肥厚直接造成外周血管阻力的增加，促进血压升高的恶性循环。本试验应用ATR12181主动免疫SHR，不仅降低了血压，而且使肠系膜三级动脉血管内径扩大，改善了血管的重构。

总之，通过AT₁受体不同肽段主动免疫SHR可以产生特异性的抗体，其中ATR12181肽段可以使SHR血压下降，为降压疫苗的研究提供了实验依据。虽然ATR12181可以使SHR血压降低，能够改善靶器官的重构，但是其降压的作用机制以及安全性还需要进一步研究。ATR12181为大鼠AT1A受体181-187氨基酸序列(Ala-Phe-His-Tyr-Glu-Ser-Arg)，大鼠AT_1A受体与人AT₁受体具有高度同源性，人AT₁受体181-187氨基酸序列为(Ala-Phe-His-Tyr-Glu-Ser-Gln)，仅有1个氨基酸差异，提示人AT₁受体相应序列肽段也具备降压及改善靶器官的重构作用。

实验报告二：

AT₁受体胞外不同序列肽段主动免疫SHR降低血压作用的进一步观察

肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system，RAS)作为高血压发病的重要环节，一直作为治疗的主要靶点，在应用ACE抑制剂和AT₁受体拮抗剂药物的同时，研究者们也尝试应用免疫阻滞的手段来阻滞RAS的各个环节来达到治疗高血压的目的，与传统的化学药物相比，疫苗作用的时间长，无需反复给药，对于需要用药物长期控制的高血压，疫苗可能带更多的益处。过去研究已经对包括肾素、Ang I、Ang II、血管紧张素转换酶(ACE)在内的RAS成员的阻滞性抗体或疫苗进行了尝试。最早是应用肾素主动免疫Wistar大鼠与自发高血压大鼠(SHR)，两种大鼠血压均可以下降，但是在反复免疫肾素蛋白后动物肾脏出现的主动免疫损伤。Gardiner SM等利用Ang I肽段类似物对大鼠进行免疫，机体产生相应抗体且显著阻断外源性Ang I升血压效应，证明降压疫苗的可行性，并且已经进行了初步的人体实验。AT₁受体作为RAS的终末环节是重要的治疗靶点，阻滞该受体可以更有效的阻断RAS系统的终末反应。Zelezna B等就曾应用AT₁受体第14-23肽段主动免疫SHR大鼠，在未成年组SHR大鼠中减轻高血压的发展。我们实验室也曾设计并合成了AT₁受体胞外的不同肽段ATR12181、ATR12185、ATR10014主动免疫成年SHR，并发现肽段ATR12181使得SHR血压下降。为了探索针对AT₁受体细胞外不同抗原表位的抗体其生物效应，并进一步筛选具有降压作用的肽段，我们又设计ATR11188、ATR13263、ATR13275三个肽段，与ATR12181一同免疫SHR，进一步筛选具有降压作用的肽段，并探索针对AT₁受体胞外不同肽段抗体的效应。

材料与方法

1.AT₁受体胞外肽片段的合成及其与破伤风类毒素的偶联大鼠AT₁受体存在两个亚型，AT_1A亚型受体和AT_1B亚型受体，大鼠VSMC细胞上主要表达AT_1A亚型受体。根据大鼠AT_1A受体胞外肽段氨基酸序列设计ATR11188、ATR12181、ATR13263、ATR13275四个肽段，其肽段序列如表2-1。采用固相肽段合成技术合成四段肽段序列(PSSM-8型肽段自动合成仪，日本SHIMADZU公司)。高效液相色谱分析其纯度，均达到95％以上。将各个肽应用戊二醛交联法与破伤风类毒素(Tetanus toxoid，TT，分子量150000，总氮为0.043g/100ml武汉生物制品所)偶联。取TT 100ml，以pH＝9.0硼酸缓冲液充分溶解，然后加入合成肽10mg。边振荡边缓慢加入新鲜配制的0.3％戊二醛溶液1ml，室温作用2小时，倒转试管数次。加入1mol/L甘油0.25ml以封闭未反应的戊二醛，继续反应30min。以pH＝8.5硼酸缓冲液透析过夜，换液一次，继续透析4h。将肽-TT耦联物通过0.22u孔滤膜，并浓缩成肽终浓度为1mg/ml的溶液，-20℃冻存备用。

2.动物主动免疫程序SHR大鼠，4周龄、健康、雄性。随机分组：(1).对照组(n＝7)，(2).ATR11188免疫组(n＝7)，(3).ATR12181免疫组(n＝8)，(4).ATR13263免疫组(n＝6)，(5).ATR13275免疫组(n＝6)。在实验开始的第3、5、7、9、13、17、21周接受肽-TT偶联产物皮下多点注射。首次免疫给于每只0.05mg肽量与同体积福氏完全佐剂完全混合后免疫，每次加强免疫每只动物0.05mg肽量与同体积福氏不完全佐剂完全混合后免疫。对照组SHR，给予与肽免疫组相同体积生理盐水与福氏完全佐剂，相同时间点皮下注射。

3.血清抗体滴度的测量分别在免疫前及免疫后5、9、13、17、21、25周，取鼠尾血0.5ml，离心取上清。并采用ELISA法测量血清AT₁受体胞外肽抗体滴度。

4.收缩压与心率的测量大鼠收缩血压在每次免疫前后一月内各测量一次，采用清醒状态鼠尾套管法。RMS-III型大鼠血压心率测量仪测量。

表2-1大鼠AT_1A受体胞外肽片段氨基酸序列

注：下划线的氨基酸表示大鼠AT_1A受体中氨基酸序列与人AT₁受体的不同。

6.抗ATR12181肽段抗体免疫荧光染色得到的抗体采用ELISA测定滴度后备用。对照组血清也过G蛋白层析柱，得到未免疫肽的IgG抗体。培养的平滑肌细胞用丙酮于4℃固定30分钟，室温晾干，以抗ATR12181肽段抗体作为一抗，1∶100稀释于1％BSA/PBS，均匀覆盖于细胞上，37℃作用30分钟。PBS液洗3次，然后用FITC标记的山羊抗大鼠的二抗作用30分钟。最后在荧光显微镜(Nikon E400，日本)下观察。

7.抗ATR12181肽段抗体免疫印迹提取平滑肌细胞总蛋白采用裂解液(含蛋白酶抑制剂的RIPA液，30mol/L NaCl，10％NP-40，50mol/L Tris pH＝8.0，10％SDS)4℃裂解细胞30分钟，10000×g，1分钟得到含蛋白的上清液。含总蛋白的上清液通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，经全湿式电转膜法转移至硝酸纤维素膜，于TBST(5％BSA)室温封闭1小时后，与制备的抗ATR12181肽段抗体即一抗和二抗(羊抗大鼠辣根过氧化物酶标记，稀释度1∶4000)室温各孵育12h和1h，每次孵育完毕后用TBST漂洗3×5min。膜与化学发光增强剂(Surpersignal PRIECE，美国)反应，压入X光片(Kodak，美国)曝光，曝光时间视信号强弱而定，一般为1-5分钟。

8.ATR12181抗体对培养大鼠主动脉VSMC细胞增殖实验应用ATR12181抗体刺激培养的大鼠主动脉VSMC。细胞采用5代细胞，将消化下来的大鼠主动脉VSMC以1×10³个细胞/孔密度接种到96孔细胞培养板，于VSMC细胞贴壁48小时后，弃去含血清的细胞培养液，应用无血清培养基继续培养24小时进行细胞增殖实验。细胞增殖采用BrdU ELISA试剂盒(ExalphaBiologicals，Inc，美国)测定，实验步骤按试剂盒提供的方法进行。实验前2h加入Brdu，让后分别应用Ang II(10^-6mol/L)、空白培养基、ATR12181抗体(50μg/mL)、对照抗体(对照组大鼠血清提取的IgG，50μg/mL)、预先氯沙坦(10^-5mol/L)或ATR12181抗体(50μg/mL)预孵育2小时后采用Ang II(10^-6mol/L)，然后继续孵育24小时，终止实验。BrdU试剂盒ELISA法测定细胞DNA中整合的BrdU的剂量来判断VSMC增殖程度。

9.统计学分析数据以均数±标准差表示，用SPSS10.0软件进行统计处理，统计作图采用Origin7.5软件，治疗前后比较采用t检验，组间差异性比较采用方差分析(ANOVA)，以P＜0.05具有显著性差异。

结果

1.AT₁受体胞外肽段免疫SHR血清抗体滴度的变化各组肽都具有良好的抗原性，在接受第二次免疫即第5周时，体内抗体滴度开始上升，在第13周-17周抗体滴度达到峰值，并在体内维持一定浓度到实验结束，其中ATR12181组在17周抗体滴度达到峰值为8000±500，见图9。

2.ATR12181肽段主动免疫SHR降低收缩压SHR血压在实验开始时对照组为139.6±9.7mmHg，而后随着成长血压逐渐升高，到8周时血压趋于稳定对照组血压为180.6±8.0mmHg，维持至实验结束。ATR12181肽段免疫组血压随时间大鼠年龄变化的趋势与对照组类似，但到第8周时血压水平开始明显低于对照组(ATR12181组167.3±10.4mmHg，对照组为180.6±8.0mmHg P＜0.05)，该血压水平维持到实验结束；其他各组未见到ATR12181这样的降压效果，见图10：各组SHR免疫后收缩压-时间变化曲线。箭头表示免疫时间点。图10a-10d依次代表肽段ATR11188、ATR12181、ATR13263及ATR13275主动免疫SHR，血压随时间变化，其中图10b示ATR12181组血压在免疫后明显下降。*P＜0.05，**P＜0.01。其他各组肽段主免疫后SHR大鼠心率与对照组相比无明显变化。

3.抗ATR12181抗体特异性识别AT₁受体抗ATR12181肽抗体作为一抗免疫荧光染色，可见到平滑肌细胞膜上FITC的绿色荧光；而以非免疫抗体作为一抗，则是阴性结果，见图11。免疫印迹显示大约在41KD分子量可见条带，这与AT₁受体蛋白的分子量相符。说明抗ATR12181肽抗体能与平滑肌细胞膜上的AT₁受体特异性结合，见图11b：抗ATR12181抗体VSMC免疫荧光染色及免疫印迹结果图。注：如图11a培养的大鼠血管平滑肌细胞应用抗ATR12181抗体作为一抗，应用FITC标记的羊抗大鼠抗体作为二抗，免疫荧光染色呈现阳性；图11b应用对照抗体作为一抗，免疫荧光染色呈现阴性。

4.抗ATR12181抗体拮抗Ang II对VSMC细胞的增殖效应如图12所示，较空白培养基相比含Ang II(10^-6mol/L)培养基24小时明显促进培养VSMC的增殖作用。图12a Ang II(10^-6mol/L)24小时明显促进平滑肌细胞的增殖作用；图12b与对照抗体比较，抗ATR12181抗体(50μg/ml)对培养VSMC没有促增殖作用；图12c、d 10^-5mol/L氯沙坦明显Ang II(10^-6mol/L)的增殖效应；图12e含抗ATR12181抗体(50μg/ml)的培养与VSMC预孵育明显阻断Ang II(10^-6mol/L)的增殖效应。

讨论

疫苗一向是作为预防传染性疾病的利器，但随着免疫学的发展，新型疫苗不断出现，包括针对癌症、自身免疫性疾病、脑卒中的治疗性疫苗。高血压作为最常见的心血管疾病，是全球范围内最大的公共卫生问题。研究者们也针对RAS系统研制高血压的治疗性疫苗。目前高血压疫苗的研制主要集中在Ang I这个靶点上，最新的研究表明，患原发高血压的志愿者在接受Ang I-PMD3117疫苗免疫后，能够在一个长的时期内产生抗Ang I的抗体，使得血清中肾素和醛固酮浓度明显下降，但患者血压并没有下降。AT₁受体作为RAS系统病理生理作用的终末环节，阻滞AT₁受体可以更加有效的阻断RAS系统的终末效应。

AT₁受体作为Ang II的一个重要的受体，介导了Ang II主要的生理作用，Ang II与AT₁受体结合，不但可以使血管收缩，还能刺激血管平滑肌增殖，诱发血管炎症，纤维基质增生，而这一系列血管病理生理的改变则与高血压产生密切相关。AT₁受体属于G蛋白耦联受体家族，其肽链七次穿过细胞膜，构成胞外胞内各三个环肽和一段肽段的空间结构，其胞外部分是与Ang II结合接受信号刺激的部位。在以往的研究中，将人类AT1受体胞外第二环肽作为抗原，检测抗AT₁受体抗体，相继发妊娠高血压、恶性高血压及难治性高血压患者的循环中发现存在高滴度的AT1受体的自身抗体，并且自身抗体通过分子模拟引起受体活性激动，引起不随时间而失敏的受体激动剂样活性，参与高血压的发病。

AT₁受体空间结构复杂，作为接受信号锚定于细胞膜外的三个环肽及一个链肽结构，均可作为抗原产生相应的抗体，以上证据表明针对AT₁受体第二环肽的抗体具有激动剂样作用，但尚不清楚针对AT₁受体胞外段不同抗原表位的抗体的生物学效应如何。我们针对其四个胞外肽段的氨基酸序列设计四个抗原表位即抗原肽，与类毒素耦联后主动免疫SHR，如果产生的特异抗体能够与AT₁受体特异结合，影响Ang II与AT₁受体的结合，并达到阻滞AT1受体的作用，则可以达到降压的作用。在本研究中，我们发现短肽ATR12181主动免疫产生的抗体具有阻滞效应，免疫荧光和免疫印迹证实该抗体能够与AT1受体特异结合，并能降低SHR血压，阻断Ang II的激动效应。ATR12181短肽位于大鼠AT_1A受体胞外第二环181-187氨基酸序列，该序列中His¹⁸³是Ang II与AT₁受体结合的关键氨基酸，我们猜测抗ATR12181抗体与AT₁受体结合后不发挥激动效应，并阻断AngII与受体的结合。

我们设计4个大鼠AT_1A受体胞外肽段主动免疫SHR，发现只有大鼠AT1A受体181-187氨基酸序列编码ATR12181肽段能够降低血压，进一步VSMC细胞增殖实验提示抗ATR12181抗体系阻滞性抗体。其他的三个短肽肽段主动免疫动物也能产生抗体，但是对SHR大鼠血压没有影响，提示这三个肽段的抗体可能是中和抗体。大鼠AT1A受体肽段ATR12181的氨基酸序列与人AT₁受体相同位置短肽氨基酸序列只有一个氨基酸的差异(见表-1)，提示应用人AT₁受体181-187氨基酸序列肽段治疗人高血压的前景。

实验报告三：

ATR12181疫苗对自发性高血压大鼠靶器官重塑的影响进一步观察

高血压靶器官重塑是患者心血管事件发生率与死亡率增高的主要原因，抗高血压治疗不仅要能有效地控制血压，更应该着眼于恢复心血管系统的正常结构与功能，以减少心血管事件的发生率。以上研究发现来自大鼠血管紧张素II受体1型A亚型(AT_1A)181-187氨基酸序列肽段ATR12181主动免疫产生的抗体能够与AT_1A受体结合，阻断Ang II的激动效应明显降低SHR的血压。在化学药物的研究中，已经知道拮抗AT₁受体的药物例如氯沙坦能够有效的保护高血压的靶器官心、肾。那么ATR12181疫苗主动免疫，除能够降低血压，是否能够改善SHR的靶器官损伤，也是评估该疫苗的重要因素。

材料与方法

1.动物及免疫程序动物采用SHR高血压模型，4周龄、健康、雄性。随机分组免疫组分为两组，一组观察24周(n＝7)，一组观察64周(n＝6)，对照组同样设置24周(n＝7)及64周(n＝6)两个亚组。24周组在实验开始的第3、5、7、9、13、17、21周接受肽-TT偶联产物皮下多点注射，于24周处死，留取组织标本。64周组动物在实验开始的第0、4、8、12、16、24、32、40、52周接受肽-TT偶联产物皮下多点。注射首次免疫给予每只0.05mg肽量与同体积福氏完全佐剂完全混合后免疫，加强免疫给予每只0.05mg肽量与同体积福氏不完全佐剂完全混合后免疫。24周及64周对照组SHR，给于肽免疫组相同体积生理盐水与福氏完全佐剂，相同时间点皮下注射。

2.收缩压及抗体滴度的测定大鼠收缩压及抗体滴度的测定的方法参见以上的研究。

3.超声心动图64周组动物于处死前麻醉，胸前备皮。采用GE公司的Vivid型超声机，采用11.4-MHz探头。测量舒张期末期室间隔厚度(IVSd)、左室舒张末期直径(LVIDd)、左室舒张末期后壁厚度(LVPWd)、射血分数(EF)心室形态及功能指标。

4.病理学观察于试验开始第24周及64周处死动物，留取心脏、肾标本。测量两个时间点的心，肾重量及动物体重，计算心脏体重比、肾脏体重比。留取部分心脏、肾脏及肠系膜三级动脉，固定、脱水、二甲苯透明，石蜡包埋切片HE染色及Masson三染色，切片采用Olympus BX50型(Olympus公司，日本)显微摄影系统拍摄。左心室及肾脏皮质另取米粒大小组织置于含2％多聚甲醛和2.5％戊二醛的磷酸盐缓冲液4℃固定2小时，切成1.0mm²的小块，固定的标本用0.2％磷酸缓冲液充分洗涤后，切片，透射电镜观察。

4.左心室与肾脏组织c-fos、c-jun mRNA水平检测取左室心肌与肾脏组织，加TRIzol(Sigma公司，美国)组织匀浆，氯仿-异丙醇提取RNA。逆转录及PCR(RT-PCR)反应按试剂盒(TaKaRa逆转录PCR试剂盒大连宝生物公司)说明书进行。引物均由上海生工工程技术服务有限公司合成。目的基因的检测用2.5％琼脂糖凝胶电泳100min，溴化乙锭染色20分钟，在GDS8000图象分析成像系统拍照并分析，以c-fos，c-jun及AT1受体的扩增带辉度与同管GAPDH扩增带辉度之比来表示c-fos，c-jun及AT1R的mRNA表达水平。c-fos上游引物：5’-TCCCAGAGGAGATGTCTGTG-3’，下游引物为：5’GGCTCCAGCTCTGTGACCAT 3’，产物331bp。c-jun上游引物为：5’-TAGTCCCTCCCGTGGTTG-3’，下游引物5’-TCTAGGAGTCGTCAGAATCC-3’，产物大小为290bp。内参GAPDH的上游引物为：5’-AATGCATCCTGCACCACCAA-3’，下游引物为：5’-GTAGCCATATTCATTGTCATA-3’，产物516bp。

5.统计学分析数据以均数±标准差表示，用SPSS10.0软件进行统计处理，治疗前后比较采用t检验，组间差异性比较采用方差分析(ANOVA)，以P＜0.05具有显著性差异。

结果

1.收缩压、心率及抗体滴度24周大鼠收缩压(SBP)、心率及ATR12181抗体滴度结果参见研究第二部分结果。64周组，ATR12181主动免疫产生高滴度的抗体，在第2次加强免疫后，抗体滴度水平上到一个平台水平，滴度为1∶2560-1∶10240，64周组，对照组与免疫组SBP在同一水平，血压为139.3±9.4mmHg，两组血压均在第8周上升到达到一个平台，此时免疫组血压明显下降并维持到实验结束，见图13：ATR12181肽段免疫后SHR血压及抗体滴度随时间变化曲线(64周)。图13a ATR12181肽段免疫后大鼠抗体变化曲线，图13b ATR12181肽段免疫后血压变化曲线，P表示首次免疫，B表示加强免疫。

2.ATR12181肽段明显减轻SHR左室重塑24周时，ATR12181免疫组心脏体重比明显低于对照组，见表3-2。Masson三染色显示对照组SHR心室肌组织呈现典型的心肌间纤维化与血管周纤维化改变，而ATR12181组的变化较对照组轻，见图14ATR12181肽段主动免疫对心脏靶器官的保护作用(光镜24周)对比。图-14a Masson染色示对照组心脏可见明显的心肌间纤维化，及血管周围纤维化，蓝色代表纤维化组织，心肌纤维排列紊乱；图14bMasson染色，ATR12181组未见明显的纤维化，心肌排列整齐。超微病理上，ATR12181的心肌组织病变较对照组轻。对照组及心室肌原纤维排列不规则，线粒体增多并肿胀。而ATR12181组，心肌细胞核形态正常，肌原纤维排列较整齐，线粒体轻度增生，线粒体排列整齐，见图15ATR12181肽段主动免疫对心脏靶器官的保护作用(透射电镜24周)对照。左图免疫组肌丝及线粒体排列整齐；右图对照组心肌肌丝排列紊乱，线粒体大量堆积，线粒体肿胀。

64周ATR12181免疫组与对照组相比，心脏靶器官保护作用更明显。如图16ATR12181主动免疫对心脏靶器官的保护作用(64周)对照。上图心脏超声心动图免疫组左心肥厚明显较对照组减轻；中图心脏大体病理，对照组SHR左心室肥厚明显，而免疫组则明显减轻；下图左心室组织Masson三染色，对照组左心室心肌组织见明显的间质纤维化，心肌纤维排列紊乱，免疫组以上病变明显减轻，放大倍数×400。对照组大体标本呈现典型的左心室向心性肥厚，免疫组左室肥厚则明显减轻。64周对照组大鼠体重明显轻于免疫组，P＜0.05，而免疫组心脏重量明显轻于对照组，P＜0.05，免疫组的心脏体重比显著低于对照组，P＜0.01，免疫组心脏重量明显轻于对照组心脏，P＜0.01，免疫组心脏体重比也明显低于对照组，P＜0.01，数据见表-3。超声心动图结果与大体病理结果一致，免疫组心室厚度指标如IVSd、LVIDd、LVPWd值均显著低于对照组，P＜0.01，但两组动物的心功能没有明显的差异，见表3-2及图16。Masson染色光镜下对照组的心肌间及血管周纤维化明显，心肌纤维明显排列紊乱，而对照组心肌纤维化不明显，心肌排列整齐，见图16。64周，对照组SHR心脏EF值为79.4±3.0％，免疫组为81.5±3.1％，两者心脏收缩功能均正常，P＞0.05没有统计学差异。对照组随时间的推移，长期高血压造成明显的心脏的靶器官损伤，且64周时间点病理损伤重于24周时间点。与对照组相比，免疫ATR12181-TT复合物疫苗后24周及64周两个时间点SHR血压下降的同时心脏的靶器官损伤明显减轻。

3.ATR12181肽段减轻SHR肾脏损伤：64周时，大体病理提示免疫组肾脏重量明显轻于对照组，P＜0.05，见表3-1。Masson三染色示对照组肾脏损伤明显，并可见肾小球旁纤维增生明显，肾小管内管型形成，而免疫组示肾脏病变明显减轻，肾小球基本正常，偶见固缩的肾小球，肾脏间质纤维化不明显，未见管型，见图17ATR12181主动免疫对肾脏靶器官的保护作用(64周)对照。上图肾皮质组织Masson三染色，蓝色代表纤维化组织，对照组可见明显的肾单位损伤，并可间质纤维化及管型，而对照组病变明显减轻，×200；中图透射电镜可见对照组大多数肾小球基底膜增厚，免疫组大多数肾小球基底膜厚度正常；下图透射电镜可见间质纤维化，对照组肾单位偶见肾小球基底膜增厚。透射电镜下，对照组肾脏肾小球基底膜广泛性增厚，间质纤维化，免疫组肾脏超微病变明显见轻，偶见局灶性的基底膜增厚。64周时，对照组SHR肾脏出现明显的损伤，而免疫组肾脏损伤明显减轻，ATR12181主动免疫改善肾脏靶器官损伤，见图17。

4.ATR12181肽段降低AT₁受体胞外肽段免疫SHR心室与肾脏组织c-fos、c-jun mRNA水平ATR12181组心肾组织中c-fos、c-jun mRNA水平均低于显著低于对照组，P＜0.05，见图18 SHR心肾组织c-fos及c-jun mRNA水平(64周)对照。与对照组相比ATR12181肽段免疫组大鼠左室心肌组织及肾皮质组织以c-fos和c-jun mRNA水平均降低*P＜0.05，(n＝6 per group)。

讨论

高血压是一种慢性的累及全身各系统的疾病，导致严重并发症，包括心肌梗死、心力衰竭、脑梗塞、脑出血及肾功能衰竭等。因此，抗高血压治疗不仅要能有效地控制血压，更应该着眼于恢复心血管系统的正常结构与功能，以减少心血管事件的发生率。高血压发病机制复杂，其中肾素-血管紧张素系统(RAS)具有重要的作用，作为RAS的主要效应因子Ang II是内源性升压物质中很强的血管活性物质。Ang II及其AT₁受体，在调节机体心血管系统功能上具有主导性作用。Ang II不仅参与高血压的形成，还可引起引起VSMC的增殖，参与血管重塑及血管炎症，导致动脉粥样硬化及相关靶器官的损伤。

高血压对于心脏损伤，其病理主要表现为左室肥厚。但由于不断增大的心肌细胞与毛细血管供养之间存在的不相适应，加上高血压性血管病，导致心肌供血不足导致心肌的收缩力下降，逐渐出现心腔的扩大，发生离心性肥厚，严重发生心力衰竭。已有的研究证据表明除了心脏负荷增加导致左室肥厚外，Ang II及其AT₁受体在左室肥厚中也起重要的作用。LIFE研究表明化学药物氯沙坦有效的阻断AT₁受体在降低血压的同时可以有效的阻断高血压的左室重塑。本研究中主动免疫AT₁受体胞外肽段ATR12181取的类似结果，血压下降的同时，左室肥厚被明显的抑制。

本研究除了观察ATR12181疫苗对心脏的保护作用外，也发现免疫组的肾脏的病变较对照组明显改善。对照组肾脏重量明显较免疫组轻，镜下多见固缩的肾单位，及肾小球周的纤维结缔组织增生，并可见到管型，电镜间质纤维增生及广泛的肾小球基底膜增厚，而疫苗组的肾脏病变明显减轻，偶见固缩的肾单位，电镜下可见局灶性的肾小球基底膜增生。已有的研究表明，Ang II直接参与了进行性肾脏损害，可通过影响全身及肾脏局部的血液动力学升高肾小球内压力，还可直接促进了多种细胞因子的生成和细胞增殖/肥大以及基质蛋白的积聚。AT₁受体拮抗剂氯沙坦可以通过阻断AT1受体，扩张肾小球出、入球小动脉，降低出球小动脉的阻力，从而改善肾脏血流动力学来保护肾单位。肽段ATR12181主动免疫大鼠后产生的阻滞性抗体可能产生与氯沙坦类似的作用，有效的对肾脏起到保护作用。

为了进一步探究ATR12181肽段改善高血压中心肾靶器官重塑的机制，我们测定左心室及肾皮质两个器官中原癌基因c-fos和c-jun的mRNA水平。ATR12181疫苗能够降低左心室及肾脏中原癌基因c-fos和c-jun的mRNA水平。原癌基因c-fos是生长因子刺激心肌细胞肥大中诱导的最早反应基因。Ang II可快速诱导心肌细胞c-fos基因的表达，是心肌肥大反应标志之一。原癌基因c-fos表达产物fos蛋白与jun基因的表达产物jun形成二聚体即AP-1，AP-1作为心肌肥厚晚期反应基因的转录调节因子调控其表达。心肌肥厚常伴有原癌基因早期的表达过盛，提示原癌基因的激活与表达增强是心肌肥厚发生的重要信号与介导途径。AT₁受体阻断剂氯沙坦则能拮抗Ang II的上述生物学效应，阻滞Ang II所致的离体大鼠心肌细胞的蛋白和DNA合成增加、原癌基因的表达蓄积。ATR12181抗体可能也发挥类似作用通过阻断AT₁受体来抑制心肌原癌基因的表达来阻断心肌肥厚的发生发展。

肾脏组织中原癌基因c-fos和c-jun的表达产物fos和jun形成AP-1核转录因子能够上调多种基因的表达水平，其中最重要的是TGF-β1基因。Ang II能够激动AT₁受体，启动AP-1核转录因子上调TGF-β1的表达，TGF-β1过高表达能够导致肾小球硬化及间质增生，有研究表明抑制AP-1能够阻断Ang II诱导的AP-1表达。ATR12181疫苗免疫后能够阻断AT₁受体及其下游的c-fos和c-jun的表达，从而可能下调TGF-β1来阻断高血压肾脏的损害。

进一步的研究表明，ATR12181疫苗主动免疫产生的特异性抗体不但能够有效的降低高血压动物模型血压，并能下调心室肌及肾脏皮质组织中原癌基因c-fos和c-jun的表达，从而有效的预防心肌肥厚，保护肾脏。

表3-1 ATR12181肽段免疫组及对照组SHR 24周心率血压及器官病理指标

注：n＝7 per group.**P＜0.01 vs.control group.

表3-2 ATR12181免疫组及对照组大鼠64周血压、心率及心脏病理指标

注：n＝6 per group.*P＜0.01，**P＜0.01 vs.control group.

本发明的核心是保护血管紧张素II受体1型人免疫源性肽段的应用，因此，凡是含肽段的氨基酸序列表述为：Ala-Phe-His-Tyr-Glu-Ser-Gln的任何药物组合物或疫苗，都属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种血管紧张素II受体1型免疫原性肽段或包含血管紧张素II受体1型免疫原性肽段的组合物在制备用于原发性高血压中抑制血管平滑肌细胞增生的疫苗或药物组合物中的用途，所述肽段的氨基酸序列为：Ala-Phe-His-Tyr-Glu-Ser-Arg。

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