ES2440974T3 - Constructos poliepitópicos del VPH y uso de los mismos - Google Patents

Constructos poliepitópicos del VPH y uso de los mismos Download PDF

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Abstract

Un constructo poliepitopico aislado que cornprende a) epitopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) del virus del papiloma humano (VPH) caracterizados por las ID SEC NOS1 a 44, y/o b) los epitopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) del virus del papiloma humano (VPH) caracterizados por las ID SECN051, 23, 39 y 45 a 88.

Description

Constructos poliepitópicos del VPH y uso de los mismos.
Campo de la invención
La presente invención va dirigida a constructos poliepitópicos del virus del papiloma humano (VPH) y al uso de los mismos para la prevención y/o el tratamiento de una infección de VPH.
Antecedentes de la invención
El cáncer del cuello uterino es el segundo cáncer más común entre las mujeres en el mundo entero, estimándose
493.000 nuevos casos y 274.000 fallecimientos en 2002. El campo de la prevención del cáncer de cuello de útero está evolucionando rápidamente como consecuencia de la identificación de la causa de la enfermedad: un número limitado de tipos virales de la familia de los virus del papiloma humano (VPH). De hecho, se ha reconocido que el VPH es una cause del cáncer de cuello de útero, y 2 de los tipos oncogénicos, el 16 y el 18, son conjuntamente responsables del 70% de los casos de cáncer de cuello de útero del mundo entero.
Recientemente, se autorizó el uso de 2 vacunas profilácticas. No obstante, es probable que pasen décadas antes de que pueda evaluarse el impacto de la vacunación contra el VPH sobre la incidencia del cáncer de cuello de útero. Óptimamente, estas vacunas deberían ser administradas antes del inicio de las relaciones sexuales y de la infección de VPH. Como tales, no son de beneficio alguno para mujeres con una infección de VPH ya existente. El tratamiento (cirugía) para la infección de VPH es a menudo poco satisfactorio debido a la persistencia del virus después del tratamiento y es común la recurrencia de la enfermedad clinicamente evidente. El tratamiento puede requerir visitas frecuentes a clinicas y no va dirigido a la eliminación del virus, sino a la eliminación de verrugas. Además, se supone que genotipos oncogénicos de VPH menos extendidos -al menos en parte-tomarán el relevo de los genotipos VPH16 y 18 actualmente objeto de ataque. Las mujeres con lesiones precarcinogénicas resultantes de las infecciones generalizadas de VPH en la actualidad representan una necesidad muy poco atendida.
Así, existe la necesidad de una vacuna eficaz para prevenir y/o tratar la infección persistente de VPH y para prevenir el cáncer que está asociado con la infección de VPH. Vacunas efectivas del VPH serían un avance significativo en el control de infecciones de transmisión sexual y también podrían proteger contra la enfermedad clinica, particularmente en cánceres tales como el cáncer de cuello de útero (véase, por ejemplo, Rowen, P. y Lacey, C., Dermatologic Clinics 16 (4): 835-838, 1998).
En la mayoría de individuos, las infecciones de VPH inducen presumiblemente una inmunidad intensa, local, mediada por células, que da como resultado la eliminación del virus y la protección contra una infección posterior. Se sabe que los linfocitos T citotóxicos (CTL) restringidos a la clase I del antigeno leucocitario humano (HLA) específicos a virus y los linfocitos T colaboradores (HTL) restringidos a la clase 11 del HLA desempeñan un papel fundamental en la prevención de la infección crónica y de la eliminación viral in vivo (Houssaint y otros, 2001; Gruters y otros, 2002; Tsai y otros, 1997; Murray y otros, 1992; Tigges y otros, 1992; Bowen y Walker, 2005).
Una vacuna terapéutica candidata que seleccione el VPH como blanco debería provocar respuestas inmunitarias celulares intensas y multiespecíficas. La inducción de una respuesta celular intensa específica al VPH -que comprende la actividad de las células T citotóxicas (CTL) y de las células T colaboradoras (HTL)-puede lograrse usando un enfoque de vacuna basada en epítopos.
El enfoque poliepitópico al desarrollo de vacunas es para crear racionalmente una respuesta celular multiespecífica, haciendo que el sistema inmunitario sea estimulado específicamente contra múltiples epítopos seleccionados que cumplan criterios estrictos. Estos incluyen epítopos de CTL que están presentados por MHC-1 y son reconocidos por las células T citotóxicas y epítopos de HTL que se enlazan con MHC 11 y son reconocidos por las células T colaboradoras. Los epítopos se seleccionan en vista de su capacidad de provocar respuestas en seres humanos, buscando con ello una gran cobertura de la población (seleccionando como blancos a los alelos fundamentales de la clase I de HLA, así como los alelos fundamentales de la clase 11 de HLA).
La tecnología relevante a las vacunas poliepitópicas está en desarrollo y hay disponibles varios enfoques diferentes que permiten la administración simultánea de múltiples epítopos. Varios estudios independientes han establecido que puede lograrse la inducción de respuestas inmunitarias simultáneas contra péptidos múltiples e individuales (Doolan y otros (1997), Bertoni y colegas (1997». En términos de la inmunización con vacunas poliepitópicas de ácidos nucleicos, se han documentado varios ejemplos en los que se indujeron múltiples respuestas de células T (Thomson y otros, 1995; Woodberry y otros, 1999; Mateo y otros, 1999; Ishioka y otros, 1999; W004/03121O, Innogenetics N.V. y otros).
Los esfuerzos por desarrollar un tratamiento efectivo para una enfermedad relacionada con el VPH tienen un campo de interés muy estrecho. La mayoría de los estudios se concentran en las proteínas E6 y/o E7 de VPH de tipo 16. Además, el documento W005/089164 (Pharmexa y otros) da a conocer constructos poliepitópicos de VPH centrados en las proteínas E6 y E7 y, además, en las E1 y E2. Durante el ciclo vital del virus del papiloma, las proteínas del VPH (E1, E2, E4, E5, E6, E7, L 1 Y L2) son expresadas diferencialmente. Además, durante la progresión de CIN1 a CIN3, el grado de expresión de las diferentes proteínas del VPH es cambiante (Doorbar, 2005). Seleccionar las 6 proteínas tempranas (E1, E2, E4, E5, E6 Y E7) proporciona, así, una forma de inducir respuestas inmunitarias eficientes dirigidas a todas las fases del ciclo vital del virus, con independencia del grado de CIN.
Aunque se estudiaron la E4 y la E5 en busca de epítopos inmunogénicos, el documento W005/089164 no consiguió obtener péptidos reactivos. Se sabe, de hecho, que la mayoría de las proteínas del VPH son comparativamente pequeñas y que, por lo tanto, podrían no comprender muchos epítopos reactivos.
Sin embargo, los presentes inventores han determinado ahora varios epítopos inmunogénicos en las proteínas E4 y E5 de los genotipos del VPH de alto riesgo VPH16, 18, 31 Y 45. Además, los presentes inventores consiguieron crear una vacuna potente multiespecífica y de amplio espectro que abordaba las diferentes fases de la infección de VPH y que ampliaba con ello la ventana de tratamiento. Cuando otras, centradas en la E6 y/o la E7 seleccionan como blanco la CIN2 y la CIN3, esta vacuna permite tratar las fases anteriores de la enfermedad, así como la infección persistente, reduciendo con ello adicionalmente la probabilidad de desarrollar cáncer de cuello de útero.
Los constructos poliepitópicos están diseñados para inducir una respuesta inmunitaria a al menos 4 epítopos diferenciados de CTL y 1-3 epítopos de HTL por genotipo de VPH en la mayoría de los sujetos infectados con uno de los cuatro genotipos del VPH de alto riesgo más extendidos (VPH16, 18, 31 Y 45), con independencia de su origen étnico.
Sumario de la invención
1. Un constructo poliepitópico aislado que comprende
a) epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) al virus del papiloma humano (VPH) caracterizados por las ID SEC N°S 1 a 44, y/o
b) los epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) al virus del papiloma humano (VPH) caracterizados por las ID SEC N°S 1, 23, 39 Y 45 a 88.
2.
El constructo poliepitópico según 1 que comprende los epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) al virus del papiloma humano (VPH) caracterizados por las ID SEC N°S 1 a 88.
3.
El constructo poliepitópico según 1 o 2 que, además, comprende al menos un epítopo de linfocitos T colaboradores (HTL) del virus del papiloma humano (VPH).
4.
El constructo poliepitópico según 3 en el que al menos un epítopo de linfocitos T colaboradores (HTL) del virus del papiloma humano (VPH) se selecciona del grupo consistente en las ID SEC N°S 89 a 121.
5.
El constructo poliepitópico según 4 en el que el constructo poliepitópico de (a) comprende los epítopos de linfocitos T colaboradores (HTL) del virus del papiloma humano (VPH) caracterizados por las ID SEC N°S 89 a 105 Y en el que el constructo poliepitópico de (b) comprende los epítopos de linfocitos T colaboradores (HTL) del virus del papiloma humano (VPH) caracterizados por las ID SEC N°S 106 a 121.
6.
El constructo poliepitópico según uno cualquiera de 1 a 5 que, además, comprende un epítopo de células T universales que se enlaza con más de una molécula HLA-DR de clase 11.
7.
El constructo poliepitópico según 6 en el que el epítopo de células T universales está caracterizado por la ID SEC N° 122.
8.
El constructo poliepitópico según uno cualquiera de 1 a 7 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por ID SEC N° 156, ID SEC N° 158, ID SEC N° 160, ID SEC N° 162, ID SEC N° 123, ID SEC N° 125, ID SEC N° 127 o ID SEC N° 129.
9.
Un polinucleótido aislado que comprende un constructo de polinucleótidos que codifica el constructo poliepitópico de cualquiera de 1 a 8.
10.
El polinucleótido según 9 en el que el constructo de polinucleótidos comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por ID SEC N° 157, ID SEC N° 159, ID SEC N° 161, ID SEC N° 163, ID SEC N° 124, ID SEC N° 126, ID SEC N° 128 o ID SEC N° 130.
11.
Un vector que comprende el polinucleótido de uno cualquiera de 9 o 10.
12.
El vector según 11 en el que dicho vector es un vector de expresión, siendo preferentemente dicho vector de expresión un ADN de vector viral o plasmídico.
13.
El vector según 12 en el que dicho vector viral es un virus vaccinia, siendo preferentemente dicho virus vaccinia MVA.
14.
Una célula que comprende el constructo polipeptídico de cualquiera de 1 a 8, el constructo de polinucleótidos de uno cualquiera de 9 o 10 o el vector de uno cualquiera de 11 a 13.
5 15. Una composición que comprende el constructo polipeptídico de cualquiera de 1 a 8, el constructo de polinucleótidos de uno cualquiera de 9 o 10 o el vector de uno cualquiera de 11 a 13, o cualquier combinación de los mismos, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
16. El constructo polipeptídico de cualquiera de 1 a 8, el constructo de polinucleótidos de uno cualquiera de 9 o 10 o el vector de uno cualquiera de 11 a 13, o cualquier combinación de los mismos, para su uso como medicamento.
10 17. El constructo polipeptídico de cualquiera de 1 a 8, el constructo de polinucleótidos de uno cualquiera de 9 o 10 o el vector de uno cualquiera de 11 a 13, o cualquier combinación de los mismos, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una infección de VPH.
18. El constructo polipeptídico de cualquiera de 1 a 8, el constructo de polinucleótidos de uno cualquiera de 9 o 10 o
el vector de uno cualquiera de 11 a 13, o cualquier combinación de los mismos, para su uso en la prevención y/o el 15 tratamiento de una enfermedad relacionada con el VPH.
Leyendas de las Figuras
Figura 1: A. Orden específico de epítopos de CTL en el constructo ICCG6150
B. Orden específico de epítopos de HTL en el constructo ICCG6150 o ellCCG6149 Figura 2: A. Orden específico de epítopos de CTL en el constructo ICCG6138
B. Orden específico de epítopos de HTL en el constructo ICCG6138 o ellCCG6137 Figura 3: Orden específico de epítopos de CTL en el constructo ICCG6137 Figura 4: Orden específico de epítopos de CTL en el constructo ICCG6149 Figura 5: Constructo ICCG6137
A. Secuencia de aminoácidos de la secuencia señal (en cursiva) y el poliepítopo;
B. Secuencia de ADN: Se subrayan los codones iniciador y finalizador. La secuencia señal se muestra en cursiva, y la secuencia codificadora del epítopo está en negrita.
C. Secuencia de aminoácidos del poliepítopo;
D. Secuencia de ADN del poliepítopo. Figura 6: Constructo ICCG6138
A. Secuencia de aminoácidos de la secuencia señal (en cursiva) y el poliepítopo;
B. Secuencia de ADN: Se subrayan los codones iniciador y finalizador. La secuencia señal se muestra en cursiva, y la secuencia codificadora del epítopo está en negrita.
C. Secuencia de aminoácidos del poliepítopo;
D. Secuencia de ADN del poliepítopo. Figura 7: Constructo ICCG6149
A. Secuencia de aminoácidos de la secuencia señal (en cursiva) y el poliepítopo;
B. Secuencia de ADN: Se subrayan los codones iniciador y finalizador. La secuencia señal se muestra en cursiva, y la secuencia codificadora del epítopo está en negrita.
C. Secuencia de aminoácidos del poliepítopo;
D. Secuencia de ADN del poliepítopo.
Figura 8: Constructo ICCG6150
A. Secuencia de aminoácidos de la secuencia señal (en cursiva) y el poliepítopo;
B. Secuencia de ADN: Se subrayan los codones iniciador y finalizador. La secuencia señal se muestra en cursiva, y la secuencia codificadora del epítopo está en negrita.
C. Secuencia de aminoácidos del pOliepítopo;
D. Secuencia de ADN del poliepítopo.
Descripción detallada de la invención
La presente invención va dirigida a un polinucleótido o polipéptido que comprende un constructo poliepitópico que codifica o que comprende epítopos derivados de las proteínas E1, E2, E4, E5, E6 y/o E7 del virus del papiloma humano (VPH). Los epítopos son aquellos que provocan una respuesta de linfocitos T restringidos a la clase I y/o a la clase II del HLA en un anfitrión inmunizado. Más específicamente, la presente invención describe constructos poliepitópicos sumamente optimizados y efectivos caracterizados por un procesamiento eficiente y que comprenden epítopos altamente inmunogénicos que permiten un tratamiento eficiente de paCientes en diferentes fases de una enfermedad relacionada con el VPH.
Identificación de los epítopos
Se evaluó la inmunogenicidad de los epítopos de enlace de CTL en diferentes ratones transgénicos de HLA. Para esto, se llevó a cabo una sola inmunización con repositorios de péptidos de CTL junto con un epítopo común de HTL emulsionado en IFA y hasta 14 días después, se aislaron y evaluaron células CD8+ del bazo en busca de especificidad epitópica usando un ensayo directo IFNy ELlSPOT ex vivo. Se demostró que la mayoría de los epítopos de CTL con alta afinidad de enlace eran inmunogénicos.
Se evaluaron epítopos de enlace de HTL en busca de su inducción de respuestas de memoria de células T (ex vivo) usando PBMC procedentes de pacientes de VPH. Para esto, se cultivaron in vitro PBMC procedentes de sujetos durante 1-2 semanas en presencia de péptido de ensayo más células que presentaban antígenos (APC) para permitir la activación de células T de "memoria", a diferencia de las células T "vírgenes". Al final del periodo de cultivo, se detectó la actividad de las células T usando ensayos tales como la liberación de 51 Cr que implicaba a células diana cargadas de péptidos, la proliferación de células T o la liberación de citocinas.
La Tabla 1 da los epítopos de CTL del polipéptido aislado según las reivindicaciones. Cada epítopo individual es parte de la invención, así como las combinaciones de dos, más o la totalidad de dichos epítopos. En un aspecto específico de la invención, se han identificado epítopos en las proteínas E4 y E5 de los genotipos del VPH de alto riesgo VPH16, 18,31 Y 45, por lo que dichos epítopos están siendo caracterizados por las ID SEC N°S 8. 17,29,42, 43, 51, 52, 64, 74, 75, 81 Y 86. Como tal, el constructo poliepitópico aislado descrito se relaciona también con una combinación que comprende 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o la totalidad de los epítopos caracterizados por las ID SEC N°S 8, 17, 29, 42, 43, 51, 52, 64, 74, 75, 81 Y86, opCionalmente enlazados entre sí en un constructo poliepitópico.
Partiendo de dicho repositorio de epítopos de CTL, los presentes inventores lograron crear una vacuna potente multiespecífica y de amplio espectro que abordaba las diferentes fases de la infección de VPH y que ampliaba la ventana de tratamiento.
El constructo poliepitópico de la presente invención es particularmente útil para prevenir y/o tratar una infección de VPH, más específicamente una enfermedad relacionada con el VPH, y aún más específicamente las fases precancerosas de la infección de VPH, es decir, las CIN 1-3. Una enfermedad relacionada con el VPH incluye la neoplasia y cánceres relacionados con el VPH, tales como, sin limitación, el cáncer de cuello de útero y el carcinoma de cabeza y cuello. La neoplasia que haya de tratarse con los medicamentos según la presente invención puede ser cualquier neoplasia inducida por el VPH, preferentemente en un tejido epitelial, en la zona ano-genital y/o en el tracto ano-genital, que comprende la vulva, la vagina, el cuello de útero, el pene, el escroto, el ano y el recto. Los trastornos neoplásicos que deben tratarse comprenden la neoplasia cervical intraepitelial de diversos grados (CIN 1, 2 Y 3), las neoplasias vulvares intraepiteliales de diversos grados (VIN 1, 2 Y 3) Y las neoplasias vaginales intraepiteliales (VAIN) y la neoplasia anal intraepitelial (AIN). También pueden ser tratados según esta invención sujetos varones que padezcan neoplasias inducidas viralmente en la zona y/o el tracto ano-genitales, tales como, sin limitación, la neoplasia intraepitelial del pene (PIN) y la neoplasia anal intraepitelial (AIN).
Aunque la mayoría de las infecciones de VPH no progresa hasta el cáncer de cuello de útero, es más frecuente que lo hagan las infecciones que persistan muchos años. La mayoría de cánceres de cuello de útero se desarrolla lentamente a través de una serie de cambios anormales en las células del cuello del útero. Pruebas de Papanicolaou regulares pueden detectar estos cambios y puede extirparse el tejido anormal, previniendo que se desarrolle transformándose en cáncer. Se han usado diversas expresiones para describir las células anormales que pueden
verse en pruebas de Papanicolaou. Las muestras con anormalidades celulares pueden dividirse en diferentes categorías.
La neoplasia cervical intraepitelial (CIN) es una expresión que se usa a menudo para describir hallazgos de tejido anormal. Neoplasia significa un crecimiento anormal de células. El termino CIN junto con un número (1, 2 o 3) describe cuánto del grosor del revestimiento del cuello uterino contiene células anormales. Se considera que CIN-3 es una afección precancerosa que incluye un carcinoma in situ.
Otra clasificación es:
•
ASC: Células escamosas atípicas. Las células escamosas son las células delgadas planas que forman la superficie del cuello uterino.
•
AGC: Células glandulares atípicas. Las células glandulares son células productoras de moco encontradas en el canal endocervical (abertura en el centro del cuello uterino) o en el revestimiento del útero. Las células glandulares no parecen normales, pero los médicos no están seguros de qué significan los cambios celulares.
•
AIS: Adenocarcinoma endocervical in situ. Se encuentran células precancerosas en el tejido glandular.
•
LSIL: Lesión intraepitelial escamosa de bajo grado. Bajo grado significa que hay cambios tempranos en el tamaño y la forma de las células. La palabra lesión se refiere a una zona de tejido anormal. Se considera que las LSIL son anormalidades leves causadas por una infección de VPH y que son una afección común, especialmente entre mujeres jóvenes. La mayoría de las LSIL vuelve a la normalidad en un periodo que va de algunos meses a algunos años.
•
HSIL: Lesión intraepitelial escamosa de alto grado. Alto grado significa que las células tienen un aspecto en tamaño y forma muy diferente del de las células normales. Las HSIL son anormalidades más graves y pueden acabar convirtiéndose en cáncer si se dejan sin tratar.
También se pueden describir los resultados de las pruebas de Papanicolaou usando un conjunto más antiguo de categorías denominado "escala de displasia". Oisplasia es un término usado para describir células anormales. Aunque la displasia no es cáncer, puede desarrollarse transformándose en un cáncer muy temprano del cuello de útero. Las células tienen un aspecto anormal al microscopio, pero no invaden tejido sano contiguo. Hay cuatro grados de displasia: leve, moderada, severa y carcinoma in situ. El carcinoma in situ es una afección precancerosa que implica únicamente a la capa de células de la superficie del cuello uterino y que no se ha extendido a tejidos contiguos. En la actualidad, se clasifica a la displasia leve como LSIL; la displasia moderada o la severa y el carcinoma in situ se combinan en HSIL.
Resumen:
LSIL
HSIL
CIN 1
CIN 2 CIN 3
Oisplasia leve
Oisplasia moderada Oisplasia severa I Carcinoma in situ
Los constructos poliepitópicos están diseñados para inducir una respuesta inmunitaria a al menos 4 epítopos diferenciados de CTL y 1-3 epitopos de HTL por genotipo de VPH en la mayoría de los sujetos infectados con uno de los cuatro genotipos del VPH de alto riesgo más extendidos (VPH16, 18, 31 y 45), con independencia de su origen étnico. Los epítopos de los constructos fueron clasificados y optimizados usando el procedimiento descrito en el documento W004/03121O (Pharmexa Inc. y otros).
Los epítopos fueron incluidos en uno o más constructos. Los constructos fueron sometidos posteriormente a ensayo en ratones transgénicos de HLA y se midió la inmunogenicidad para los epítopos codificados.
Evidentemente, los epítopos de células T dados en las Tablas 1 y/o 2 pueden combinarse en uno o más constructos en cualquier manera apropiada para una aplicación terapéutica específica o un grupo de pacientes. Por ejemplo, únicamente los epítopos de CTL y/o HTL del VPH16 de las Tablas 1 y/o 2 pueden combinarse en 1 constructo. Alternativamente, los epítopos del constructo pueden estar limitados a VPH18, VPH31 o VPH45. Un enfoque diferente es combinar los epítopos para diferentes genotipos del VPH, pero limitarse a ciertas proteínas -por ejemplo, E1, E2, E4, E5, E6 o E7-, o combinaciones de proteínas -por ejemplo, E1 y E2, o E4 Y E5, o E6 Y E7-,
o a otras combinaciones de epítopos de células T derivados de 2 o más proteínas del VPH; esto para un genotipo o, alternativamente, para dos, tres o cuatro de los genotipos descritos en el presente documento.
La presente invención versa acerca de un polinucleótido aislado que comprende un constructo poliepitópico que codifica al menos los siguientes epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) derivados del VPH: ID SEC N°S 1-44 y/o que codifica al menos los siguientes epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) derivados del VPH: ID SEC N°S 1, 23,
39 Y 45-88. Además, la presente invención también abarca un polipéptido codificado por el polinucleótido descrito en
el presente documento. Preferentemente, los epítopos del constructo poliepitópico están enlazados directa o
indirectamente entre sí en el mismo marco de lectura.
Según se usa en el presente documento, el término "constructo" denota generalmente una composición que no se
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da en la naturaleza. Como tal, el constructo de polinucleótidos de la presente invención no codifica una proteína de
forma natural de longitud completa del VPH, sino que codifica una proteína quimérica que contiene epítopos aislados
de al menos una proteína del VPH no necesariamente en el mismo orden secuencial que en la naturaleza. Un
constructo puede ser un "constructo de polinucleótidos" o un "constructo polipeptídico". Los polinucleótidos o
(poli)péptidos descritos en el presente documento son "aislados" o "biológicamente puros". El término "aislado" se
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refiere a material que está sustancialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan según se
encuentra en su entorno natural. Sin embargo, debería estar claro que el polinucleótido o el (poli)péptido aislados de
la presente invención podrían comprender componentes celulares heterólogos o un marcador o similar. Un epítopo
"aislado" se refiere a un epítopo que no incluye los aminoácidos contiguos de toda la secuencia del antígeno o el
polinucleótido de la que se derivó el epítopo. Como tal, la presente invención está relacionada con un polinucleótido
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que comprende un constructo poliepitópico que comprende los siguientes epítopos aislados de CTL del VPH: las ID
SEC N°S 1-44 y/o las ID SEC N°S 1,23,39 Y 45-88. Así, ha de entenderse que el constructo de la presente invención
comprende epítopos aislados que no están embebidos en la proteína de forma natural de longitud completa del
VPH. Los epítopos específicos del constructo pueden estar enlazados directa o indirectamente en cualquier orden o
en el orden dado en las Figuras 1A, 2A, 3 Y 4. Un constructo puede ser producido mediante tecnologías sintéticas,
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por ejemplo preparación y expresión de ADN recombinante, o técnicas químico-sintéticas para ácidos nucleicos y
aminoácidos. También puede producirse un constructo mediante la adición o la afiliación de un material con otro, de
modo que el resultado no se encuentre en la naturaleza en esa forma.
Con respecto a una secuencia particular de aminoácidos, un "epítopo" es un conjunto de residuos de aminoácidos
que está implicado en el reconocimiento por parte de una inmunoglobulina particular o, en el contexto de las células
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T, aquellos residuos necesarios para el reconocimiento por proteínas receptoras de las células T y/o moléculas del
complejo principal de histocompatibilidad (MHC).
Con respecto a una secuencia particular de ácidos nucleicos, un "epítopo de ácidos nucleicos" es un conjunto de
ácidos nucleicos que codifica una secuencia particular de aminoácidos que forma un epítopo.
En el marco del sistema inmunitario, in vivo o in vitro, un epítopo son los rasgos colectivos de una molécula, tales
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como las estructuras primaria, secundaria y terciaria de los péptidos, y la carga, que forman conjuntamente un sitio
reconocido por un receptor de las células T y la molécula del MHC, o una inmunoglobulina.
El término "polipéptido" se usa de forma intercambiable con "oligopéptido" y designa una serie de aminoácidos
conectados entre sí, normalmente mediante enlaces peptídicos entre los grupos amino y carboxilo de aminoácidos
adyacentes.
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La expresión "constructo poliepitópico", cuando se refiere a ácidos nucleicos y polinucleótidos, puede usarse de
forma intercambiable con las expresiones "minigén" y "ácido nucleico poliepitópico" y otras frases equivalentes, y
comprende múltiples epítopos de ácidos nucleicos que codifican péptidos de cualquier longitud que pueden
enlazarse con una molécula que funcione en el sistema inmunitario, preferentemente un HLA de clase I o un HLA de
clase 11 y un receptor de célula T. Todas las divulgaciones del presente documento con respecto a epítopos de
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ácidos nucleicos comprendidos en un constructo de polinucleótidos se aplican mutatis mutandis a epítopos
comprendidos en un constructo de aminoácidos. Los epitopos de un constructo poliepitópico pueden ser epítopos de
HLA de clase I y/o epítopos de HLA de clase 11. Los epitopos de HLA de clase I se denominan epítopos de CTL y los
epitopos de HLA de clase 11 se denominan epítopos de HTL. Algunos constructos poliepitópicos pueden tener un
subconjunto de epítopos de HLA de clase I y otro subconjunto de epítopos de HLA de clase 11. Un epítopo de CTL
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consiste normalmente en 13 o menos residuos de aminoácidos en longitud, 12 o menos aminoácidos en longitud u
11 o menos aminoácidos en longitud, preferentemente de 8 a 13 aminoácidos en longitud, más preferentemente de
8 a 11 aminoácidos en longitud (es decir, 8, 9, 10 u 11), y, con suma preferencia, de 9 o 10 aminoácidos en longitud.
Un epítopo de HTL consiste en 50 o menos residuos de aminoácidos en longitud, y habitualmente de 6 a 30
residuos, más habitualmente de 12 a 25, y preferentemente consiste en de 15 a 20 (es decir, 15, 16, 17, 18, 19 o 20)
50
aminoácidos en longitud.
El constructo poliepitópico descrito en el presente documento incluye preferentemente 2 o más, 5 o más, 10 o más,
15 o más, 20 o más, 25 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, 100 o más y hasta 150 epítopos, preferentemente
hasta 130, y más preferentemente hasta 80 epítopos. De forma más especifica, el constructo poliepitópico
comprende o consiste en 2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,
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29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,55,60,61,62,63,64,65,66,67,
68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 o más epítopos.
En una realización preferente, el constructo poliepitópico de la presente invención comprende, adicionalmente, al
menos un epítopo de CTL y/o de HTL. Dicho epítopo "adicional" de CTL y/o de HTL que ha de usarse en
combinación con los epítopos de la presente invención puede derivarse del VPH o de un antígeno o un organismo
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extraños (distintos del VPH). En consecuencia, la presente invención abarca un polinucleótido que comprende un constructo poliepitópico que codifica al menos los siguientes epítopos de CTL del VPH caracterizados por: las ID SEC N°S 1-44 y/o las ID SEC N°S 1,23,39 Y 45-88, Y al menos un epítopo adicional de CTL y/o de HTL, yen el que el constructo no codifica una proteína de longitud completa del VPH. Preferentemente, el al menos un epítopo de CTL y/o de HTL se deriva del VPH, y, más específicamente, de las proteínas E1, E2, E4, E5, E6, E7, L 1 y/o L2. Preferentemente, el al menos un epítopo de HTL se selecciona de la Tabla 2. Cualquier combinación de epítopos de HTL e incluso todos los epítopos de HTL dados en la Tabla 2 pueden estar incluidos en el constructo. En una realización adicional, la presente invención está relacionada con un polinucleótido que comprende ácidos nucleicos que codifican un constructo poliepitópico que comprende, respectivamente, los siguientes epítopos aislados de CTL Y de HTL del VPH: las ID SEC N°S 1-44 Y la ID SEC 89-105 o, alternativamente, la ID SEC N°S 1, 23, 39 Y 45-88 Y las ID SEC N°S 106-121. Los epítopos de HTL del constructo pueden estar enlazados directa o indirectamente en cualquier orden o en el orden dado en las Figuras 18 Y 28. En una realización adicional, la invención abarca un polipéptido codificado por dicho nucleOtido.
Los epítopos adicionales pueden de cualquier antígeno de interés deseado, por ejemplo un antígeno viral, un antígeno tumoral o cualquier patógeno. Múltiples epítopos de HLA de clase I o clase 11 presentes en un constructo poliepitópico pueden derivarse del mismo antígeno o de diferentes antígenos. Por ejemplo, un constructo poliepitópico puede contener uno o más epítopos de HLA de enlace de los que pueden derivarse de dos antígenos diferentes del mismo virus, o de dos antígenos diferentes de virus diferentes. En una realización preferente, los epítopos se derivan del VPH y, más específicamente, de las proteínas E1, E2, E4, E5, E6, E7, L 1 y/o L2. No hay limitación alguna de la longitud de tales epítopos adicionales; estos pueden tener una longitud de, por ejemplo, 5, 6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24, 25, 30 o más aminoácidos. El "al menos uno" puede incluir 1, 2, 3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,34,35,36,37,38,39,40,45,50,55,60,65,70,75, 80, 85,90,95,100,110,115,120,125, 1300 incluso más epltopos.
En una realización preferente, el constructo poliepitópico de la presente invención comprende, además, el epítopo de células T universales denominado PADRE® (Pharmexa, San Diego; descrito, por ejemplo, en los documentos US 5736142 o US 6 413 935 o en las solicitudes internacionales W095/07707 o W097/26784). Un "epítopo PanDR de enlace o epítopo PADRE®" es un miembro de una familia de moléculas que enlaza más de una molécula HLA-DR de clase 11. Puede concebirse que el patrón que define la familia de moléculas de PADRE® es un supermotivo del HLA de clase 11. PADRE® se enlaza con la mayoría de las moléculas HLA-DR y estimula respuestas de los linfocitos T colaboradores (HTL) humanos in vitro e in vivo. En una realización preferente, el epítopo PADRE® está caracterizado por la ID SEC N° 122.
Alternativamente, pueden incluirse epítopos de HTL procedentes de vacunas usadas universalmente, tal como el toxoide tetánico. En una realización alternativa, los epítopos adicionales son epítopos de células 8.
El objetivo de la presente invención es proporcionar estrategias para optimizar la antigenicidad y la inmunogenicidad de las vacunas poliepitópicas que abarcan un gran número de epítopos relevantes, y proporcionar vacunas poliepitópicas optimizadas, en particular constructos poliepitópicos de VPH. Las Figuras 5-8 representan ejemplos de tales constructos. Dichos constructos comprenden varios epítopos de CTL y de HTL específicos al VPH que son procesados eficientemente y, así, muy inmunogénicos. De aquí que la presente invención se dirija a un polinucleótido que comprende o consiste en un constructo poliepitópico que codifica epítopos de CTL y de HTL, por lo que el constructo poliepitópico está representado por ID SEC N° 124, ID SEC N° 126, ID SEC N° 128 o ID SEC N° 130, o comprendido en las mismas.
En una realización adicional, el constructo poliepitópico codifica un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos representada por ID SEC N° 123, ID SEC N° 125, ID SEC N° 127 o ID SEC N° 129, o comprendida en las mismas.
Más específicamente, el constructo poliepitópico codifica la secuencia de aminoácidos consistente en la secuencia representada por ID SEC N° 156, ID SEC N° 158, ID SEC N° 160, o ID SEC N° 162, o la comprende. Más en particular, el constructo poliepitópico consiste en la secuencia de ácidos nucleicos representada por ID SEC N° 157, ID SEC N° 159, ID SEC N° 161 o ID SEC N° 163, o la comprende.
Según se usan en el presente documento, los términos "inmunogénico" o "inmunogenicidad" se refieren a la capacidad de evocar una respuesta inmunitaria.
La inmunogenicidad puede manifestarse de varias maneras diferentes. La inmunogenicidad corresponde a si se provoca en absoluto una respuesta inmunitaria, y al vigor de cualquier respuesta particular, así como al grado de una población en la que se provoca una respuesta. Por ejemplo, un péptido podría provocar una respuesta inmunitaria en un conjunto diverso de la población y, pese a ello, no producir en ningún caso una respuesta vigorosa. Según estos principios, se ha descubierto que cerca del 90% de los péptidos con alta afinidad de enlace es inmunogénico, a diferencia del aproximadamente el 50% de los péptidos que se enlazan con afinidad intermedia (Sette y otros, 1994; Alexander y otros, 2003). Además, los péptidos con mayor afinidad de enlace llevan a respuestas inmunogénicas más vigorosas. En consecuencia, se requiere menos péptido para provocar un efecto biológico similar si se usa un péptido con alta afinidad de enlace.
Pueden utilizarse diversas estrategias para evaluar la inmunogenicidad, incluyendo, sin limitación:
1) Evaluación de cultivos de células T primarias procedentes de individuos normales (véanse, por ejemplo, Wentworth y otros, 1995; Celis y otros, 1994; Tsai y otros, 1997; Kawashima y otros, 1998). Este procedimiento implica la estimulación de linfocitos sanguíneos periféricos (PBL), procedentes de sujetos normales, con un péptido de ensayo en presencia de células in vitro que presentan antígenos en un periodo de varias semanas. Las células T específicas para el péptido se activan durante este tiempo y se detectan usando, por ejemplo, un ensayo con liberación de 51Cr que implica a células diana sensibilizadas con el péptido.
2) Inmunización de ratones transgénicos de HLA (véanse, por ejemplo, Wentworth y otros, 1996; Alexander y otros, 1997) o ratones sustitutos. En este procedimiento, se administran péptidos (formulados, por ejemplo, en adyuvante incompleto de Freund) de forma subcutánea a ratones transgénicos de HLA o ratones sustitutos. De 11 a 14 días después de la inmunización, se retiran los esplenocitos. Las células se cultivan in vitro en presencia de péptido de ensayo durante aproximadamente una semana. Las células T específicas al péptido se detectan usando, por ejemplo, un ensayo con liberación de 51 Cr que implica a células diana sensibilizadas con el péptido y/o células diana que expresen el antígeno generado endógenamente. Alternativamente, las células se incuban durante la noche junto con las APC cargadas de péptido en el ensayo IFNy ELlSPOT para obtener la cuantificación de las células T individuales específicas al péptido que liberan interferón gamma de ratón al ser estimuladas.
3) Demostración de las respuestas de memoria de las células procedentes de individuos inmunes que han sido vacunados de forma efectiva, se han recuperado de la infección y/o de pacientes infectados crónicamente (véanse, por ejemplo, Rehermann y otros, 1995; Doolan y otros, 1997; Bertoni y otros, 1997; Threlkeld y otros, 1997; Diepolder y otros, 1997). Al aplicar esta estrategia, las respuestas de memoria se detectan cultivando PBL procedentes de sujetos que han estado expuestos de forma natural al antígeno del VPH, por ejemplo a través de la infección, y que, así, han generado "naturalmente" una respuesta inmunitaria, o procedentes de pacientes que fueron vacunados con una vacuna que comprendía el epítopo objeto de interés. Los PBL procedentes de sujetos se cultivan in vitro durante 1-2 semanas en presencia de péptido de ensayo más células que presentaban antígenos (APC) para permitir la activación de células T de "memoria", a diferencia de las células T "vírgenes". Al final del periodo de cultivo, se detecta la actividad de las células T usando ensayos que incluyen la liberación de 51 Cr que implica a células diana sensibilizadas con el péptido, la proliferación de células T o la liberación de citocinas.
Se afirma que un epítopo dado es inmunogénico si puede demostrarse la reactividad de las células T a células diana sensibilizadas con ese péptido. La inmunogenicidad para un epítopo dado puede ser descrita por el número de individuos en un grupo de sujetos (por ejemplo, seres humanos, primates, ratones transgénicos, ratones sustitutos) infectados o vacunados con HLA compatible que muestren reactividad de las células T a ese epítopo particular o, por ejemplo, por el número de puntos detectados en un ensayo ELlSPOT. Las Tablas 8 y 9 indican la inmunogenicidad para los epítopos de la invención.
Los epítopos análogos derivados de secuencias del VPH que se dan en la naturaleza presentan una capacidad de enlace con las moléculas de HLA y una inmunogenicidad mayores debido a la modificación de residuos de aminoácidos específicos con respecto a la secuencia del VPH que se dan en la naturaleza. En consecuencia, en una realización específica, los epítopos del constructo poliepitópico aislado pueden ser analogizados para modificar la afinidad de enlace y/o la capacidad de enlazarse con múltiples alelos dentro de un supertipo de HLA. Los epítopos análogos pueden crearse alterando la presencia o la ausencia de residuos particulares en las posiciones primarias de anclaje. Se usan tales análogos para modular la afinidad de enlace de un péptido que comprenda un motivo o un supermotivo particulares. En consecuencia, la Tabla 1 da los epítopos analogizados.
Un "residuo preferente de anclaje primario" es un residuo de anclaje de un motivo o un supermotivo que está asociado con un enlace óptimo. Los motivos, los supermotivos de enlace de HLA y los residuos preferentes de anclaje primario se dan, por ejemplo, en el documento W005/089164 (Pharmexa Inc. y otros). En el presente documento se definen los "análogos heteroclíticos" como epítopos con una potencia aumentada para una célula T específica, medida por las mayores respuestas a una dosis dada, o por un requerimiento de menores cantidades para lograr la misma respuesta. Las ventajas de los análogos heteroclíticos incluyen que los epítopos pueden ser más potentes, o más económicos (ya que se requiere una cantidad menor para conseguir el mismo efecto). Además, los epítopos modificados podrían superar la insensibilidad de células T específicas a antígenos (tolerancia de células T) (véase, por ejemplo, el documento W001/36452).
Los epítopos del constructo poliepitópico están enlazados directa o indirectamente entre sí en el mismo marco de lectura. Más específicamente, los epítopos son contiguos (conectados directamente) o bien están separados por un conector o un ácido nucleico espaciador que codifica un aminoácido espaciador o un péptido espaciador (conectado indirectamente).
"Conexión" o "unión" se refiere a cualquier procedimiento conocido en la técnica para conectar funcionalmente péptidos (directamente o mediante un conector), incluyendo, sin limitación, la fusión recombinante, el enlace covalente, el enlace no covalente, el enlace bisulfuro, el enlace iónico, el enlace hidrógeno, la polimerización, la ciclización, el enlace electrostático y la conexión a través de un conector o portador central. La polimerización puede lograr, por ejemplo, por medio de la reacción entre glutaraldehído y los grupos -NH2 de los residuos de lisina usando metodología rutinaria.
En una realización específica, el constructo poliepitópico de la presente invención comprende, además, tres o varios ácidos nucleicos espaciadores, enlazados en el mismo marco de lectura con los ácidos nucleicos de epítopos de CTL y/o de HTL. Un marco de lectura es un conjunto contiguo y no solapado de codones de tres nucleótidos en el ADN o el ARN. Hay 3 posibles marcos de lectura en una molécula de ADN de una hebra y seis en una de doble hebra. "En el mismo marco de lectura" significa que no hay ningún cambio de un marco a otro que pudiera llevar a diferentes genes/proteínas.
Para desarrollar constructos poliepitópicos usando los epítopos, dichos epítopos pueden ser ordenados y optimizados usando un programa de ordenador o, para menos epítopos, no usando un programa de ordenador. "Algunos epítopos" se refiere a determinar o designar un orden de los epítopos en un constructo poliepitópico.
"Optimizar" se refiere a íncrementar la inmunogenicidad de un constructo poliepitópico contando con al menos un par de epítopos para minimizar la aparición de epítopos de unión, y a insertar un residuo separador (según se describe en el presente documento) para evitar adicionalmente la aparición de epítopos de unión o para proporcionar un residuo flanqueante. Según se describe en el presente documento, un "residuo flanqueante" es un residuo que está situado junto a un epítopo. Puede introducirse o insertarse un residuo flanqueante en una posición adyacente al término N (N+1) o al término C (C+1) de un epítopo. Un aumento de la inmunogenicidad o la antigenicidad de un constructo poliepitópico optimizado se mide con respecto a un constructo poliepitópico que no se ha construido en función de los parámetros de optimización usando ensayos conocidos por los expertos en la técnica; por ejemplo, evaluación de la inmunogenicidad en ratones transgénicos de HLA, ELlSPOT, tinción con tetrámeros, ensayos de liberación de 51Cr y presentación sobre células que presenten antígeno en el contexto de moléculas de MHC.
El proceso de optimización de constructos poliepitópicos está dado, por ejemplo, en los documentos W001/47541 y W004/03121O (Pharmexa Inc. y otros). Según una realización específica, el constructo poliepitópico de la presente invención está optimizado para el procesamiento de epítopos de CTL y/o de HTL. Más en particular, la optimización comprende la introducción de uno o más espaciadores. De forma más preferente, el constructo poliepitópico descrito en el presente documento comprende O, 3, 6, 9, 12, 15, 18 o más ácidos nucleicos espaciadores o O, 1, 2, 3, 4, 5, 6
o más aminoácidos espaciadores entre dos epítopos. Un "espaciador" se refiere a una secuencia que se inserta entre dos epítopos en un constructo poliepitópico para evitar la presencia de epítopos de unión o para facilitar la escisión entre epítopos y, con ello, mejorar la presentación de los epítopos. "Epítopos de unión" se refiere a epítopos reconocidos por el sistema inmunitario, no presente en el antígeno diana, y creados únicamente por la yuxtaposición de epítopos realizada por el hombre. Un ácido nucleico espaciador puede codificar uno o más aminoácidos. Un ácido nucleico espaciador que flanquee un epítopo de la clase I de HLA en un constructo poliepitópico codifica, preferentemente, de 1 a 8, y, más preferentemente, de 1 a 5 aminoácidos, es decir, 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos. Un ácido nucleico espaciador que flanquee un epítopo de la clase 11 de HLA en un constructo poliepitópico codifica de 1 a 8 aminoácidos, preferentemente 5, 6, 7 o más aminoácidos, y, más preferentemente, 5 o 6 aminoácidos. Un ácido nucleico espaciador que separe un epítopo de la clase I de HLA y un epftopo de la clase 11 de HLA en un constructo poliepitópico codifica, preferentemente, de 1 a 8, y, más preferentemente, de 1 a 5 aminoácidos, es decir, 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos. El número de espaciadores en un constructo, el número de aminoácidos en un espaciador, y la composición de los aminoácidos de un espaciador pueden ser seleccionados para optimizar el procesamiento de los epítopos y/o minimizar los epítopos de unión. Se prefiere que los espaciadores se seleccionen optimizando de forma concomitante el procesamiento de epítopos y evitando los motivos de unión. El "aminoácido espaciador" o "péptido espaciador" comprende normalmente una o más moléculas neutras relativamente pequeñas, como aminoácidos o miméticos de aminoácidos, que carecen sustancialmente de carga en condiciones fisiológicas. Por ejemplo, los espaciadores que flanquean los epítopos de HLA de clase 11 incluyen preferentemente residuos de G (Gly), P (Pro) y/o N (Asn). Un espaciador particularmente preferente para flanquear un epítopo de la clase 11 de HLA incluye la alternancia de residuos G y P, por ejemplo, (GP)n, (PG)n, (GP)nG, (PG)nP, etcétera, siendo n un entero entre 1 y 10, preferentemente 2 o 3, y siendo un ejemplo específico de tal espaciador GPGPG (ID SEC N° 155). Para separar epítopos de clase I o separar un epítopo de clase I y uno de clase 11, los espaciadores se seleccionan normalmente, por ejemplo, de A (Ala), N (Asn), K (Lys), G (Gly), L (Leu), I (lIe), R (Arg), Q (Gln), S (Ser), C (Cys), P (Pro), T (Thr) u otros espaciadores neutros de aminoácidos no polares o aminoácidos polares neutros, aunque también podría haber presentes residuos polares. Un espaciador preferente, particularmente para epítopos de HLA de clase 1, comprende
o consiste en 1, 2, 3 o más residuos consecutivos de alanina (A), lisina (K), asparagina (N) o glicina (G), o una combinación de residuos de K (Lys) y A (Ala), por ejemplo KA, KAA o KAAA, una combinación de residuos de N (Asn) y A (Ala), por ejemplo NA, NAA o NAAA o una combinación de residuos de G (Gly) y A (Ala), por ejemplo GA, GAA o GAAA. La presente invención está dirigida, así, a un polinucleótido que comprende un constructo poliepitópico descrito en el presente documento, y en el que los epítopos del constructo están separados por uno o más aminoácidos espaciadores. En una realización preferente, los uno o más aminoácidos espaciadores se seleccionan del grupo consistente en K, R, N, Q, G, A, S, C, G, P Y T. En algunos constructos poliepitópicos, es
suficiente que cada ácido nucleico espaciador codifique la misma secuencia de aminoácidos. En otros constructos poliepitópicos, uno o más de los ácidos nucleicos espaciadores pueden codificar diferentes secuencias de aminoácidos.
El único límite externo a la longitud total y la naturaleza de cada secuencia espaciadora se deriva de consideraciones de facilidad de síntesis, procesamiento proteolítico y manipulación del polinucleótido.
Los (poli)péptidos de la presente invención pueden estar en sus formas naturales (no cargadas) o en formas que sean sales, y que o bien estén libres de modificaciones tales como la glicosilación, la oxidación de cadenas laterales
o la fosforilación, o bien contengan estas modificaciones. También incluidos en la definición están los péptidos modificados por sustituyentes adicionales unidos a las cadenas laterales de los aminoácidos, tales como unidades glicosilo, lípidos o iones inorgánicos como fosfatos, así como modificaciones relativas a conversiones químicas de las cadenas, como la oxidación de los grupos sulfhidrilo. Así, se contempla que "polipéptido" o sus términos equivalentes incluyan la secuencia apropiada referenciada de aminoácidos, y pueden estar sujetos a las de las modificaciones anteriores, con la condición de que su funcionalidad no se destruya.
Además, la presente invención también contempla un constructo poliepitópico que comprende o consiste en repeticiones o combinaciones múltiples de cualesquiera de los epítopos dados en las Tablas 1 y 2. El constructo poliepitópico puede existir como un homopolímero que comprende múltiples copias del mismo péptido o de la misma combinación de péptidos, o como un heteropolímero de diversos péptidos. Los polímeros tienen la ventaja de la mayor reacción inmunológica y, cuando se usan diferentes epítopos de péptidos para componer el polímero, la capacidad adicional de inducir los HTL y/o los CTL que reaccionan con diferentes determinantes antigénicos del organismo patógeno seleccionado como diana para una respuesta inmunitaria. Como alternativa, los epítopos individuales no están ligados formando un constructo y pueden combinarse por separado; por ejemplo, en una composición.
También se da a conocer un procedimiento de confección de un constructo poliepitópico. Los polinucleótidos o los ácidos nucleicos que estén disponibles comercialmente pueden ser sintetizados químicamente según el procedimiento de la fosforamidita triéster en fase sólida descrito por primera vez por Beaucage y Caruthers, 1981, usando un sintetizador automático, descrito en Van Devanter y otros, 1984. La purificación de los polinucleótidos es por electroforesis en gel de acrilamida nativo o bien por HPLC de intercambio aniónico, como se describe en Pearson y Reanier, 1983. Otros procedimientos de purificación son la separación de fase inversa y la hidroxiapatita y son bien conocidos para la persona experta. Los polinucleótidos sintetizados y purificados químicamente pueden ensamblarse formando polinucleótidos más largos mediante procedimientos basados en la PCR (Stemmer y otros, 1995; Kriegler y otros, 1991).
Normalmente, los epítopos de los constructos poliepitópicos son subclonados formando un vector de expresión que contiene un promotor para dirigir la transcripción, así como otras secuencias reguladoras, tales como potenciadores y sitios de poliadenilación. Elementos adicionales del vector son, por ejemplo, secuencias señal o dianas, secuencias de traducción de iniciación y terminación, regiones e intrones 5' y 3' no traducidos, requeridos para la expresión del constructo poliepitópico en células anfitrionas.
Pueden prepararse constructos poliepitópicos, por ejemplo, según los procedimientos expuestos en Ishioka y otros, 1999; Velders y otros, 2001; o según se describe en el documento W004/03121O -Pharmexa Inc.
Un polipéptido poliepitópico o el polipéptido que comprende el constructo poliepitópico pueden generarse de forma sintética o recombinante. El polipéptido poliepitópico puede expresarse como una única proteína. Para realizar la expresión del polipéptido poliepitópico en bacterias, en células eucariotas (incluyendo la levadura) o en anfitriones vertebrados cultivados, como células de ovario de hámster chino (CHO), células Yero, células RK13, COS 1, BHK Y MDCK, o anfitriones invertebrados tales como células de insectos, se llevan a cabo las etapas siguientes:
-
la transformación de un anfitrión apropiado con un vector recombinante, o por medio de adenovirus, virus de gripe, BCG y cualquier otro sistema de portadores vivos, en los que se ha insertado una secuencia de nucleótidos que codifica uno de los polipéptidos de la invención bajo el control de los elementos reguladores apropiados, particularmente un promotor reconocido por las polimerasas del anfitrión celular o del sistema portador vivo y, en el caso de un anfitrión procariota, un sitio de enlace ribosómico (RBS), que permiten la expresión de dicha secuencia de nucleótidos en dicho anfitrión celular,
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el cultivo de dicho anfitrión celular transformado en condiciones que permitan la expresión de dicho inserto.
Como tal, la presente invención también está relacionada con una célula o una célula anfitriona que comprende un polinucleótido, un polipéptido o un vector que contiene un constructo poliepitópico. En una realización adicional, la "célula" de la presente invención es una célula que presenta antígenos (APC) que comprende el polinucleótido descrito en el presente documento.
El polipéptido poliepitópico puede ser purificado mediante procedimientos bien conocidos para la persona experta en la técnica (véanse, por ejemplo, Lichty JJ y otros, 2005; Gaberc-Porekar V y otros, 2001).
Para fines de inmunización terapéutica o profiláctica, el constructo poliepitópico de la invención puede ser expresado por medio de vectores. La presente invención está relacionada, así, con un vector que comprende el polinucleótido de la presente invención. El término "vector" puede comprender un plásmido, un cósmido, un organismo procariota, un fago, un virus o un organismo eucariota, tal como una célula animal o humana o una célula de levadura. Normalmente, el vector de expresión contiene una unidad de transcripción o una casete de expresión que contiene todos los elementos adicionales requeridos para la expresión del constructo poliepitópico en las células anfitrionas. Así, una casete de expresión típica contiene un promotor ligado operativamente al constructo poliepitópico y señales requeridas para la poliadenilación eficiente del transcrito. Elementos adicionales de la casete pueden incluir potenciadores e intrones con sitios donadores y aceptores de cortes y empalmes funcionales.
Los promotores adecuados son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook y otros, Molecular cloning, A Laboratory Manual (28 ed. 1989) y en Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology (1994). Los sistemas eucariotas de expresión para células de mamíferos son bien conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. Tales elementos promotores incluyen, por ejemplo, el citomegalovirus (CMV), las repeticiones terminales largas del virus del sarcoma de Rous (RSV L TR) Y el virus símico 40 (SV40). Para otras secuencias promotoras adecuadas véanse, por ejemplo, los documentos US 5 580 859 YUS 5 589466 (Vical Inc.).
Además de una secuencia de promotores, la casete de expresión también puede contener una región de terminación de transcripción corriente abajo del gene estructural para permitir una terminación eficiente. La región de terminación puede obtenerse del mismo gen que la secuencia de promotores o puede obtenerse de genes diferentes.
En una realización particular, el polinucleótido de la presente invención comprende, además, una o más secuencias reguladoras. Con "secuencia reguladora" se quiere decir una secuencia de polinucleótidos que contribuye o es necesaria para la expresión de un ácido nucleico asociado de forma operativa o de un constructo de ácidos nucleicos en un organismo anfitrión particular. Las secuencias reguladoras que son adecuadas para los procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operadores, y un sitio interno de enlace ribosómico (IRES). Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores. El promotor puede ser un promotor CMV u otro promotor descrito en el presente documento o conocido en la técnica. Las secuencias reguladoras incluyen los IRES. Otros ejemplos específicos de secuencias reguladoras son descritos en el presente documento o, si no, conocidos en la técnica.
En una realización adicional, el polinucleótido de la presente invención comprende, además, uno o más "ácidos nucleicos de acceso" o "secuencias de acceso" de clase I del MHC y/o de clase 11 del MHC.
El uso de una secuencia de acceso de MHC mejora la respuesta inmunitaria a un antígeno con respecto a la administración del antígeno solo, al dirigir los péptidos al sitio de ensamblaje y transporte de la molécula MHC hacia la superficie celular, proporcionando de ese modo un mayor número de complejos de moléculas-péptidos de MHC disponibles para la unión a las células T y para la activación de las mismas. Los ejemplos de posibles secuencias de acceso son bien conocidos para la persona experta y son descritos, por ejemplo, en el documento W004/031210 (Pharmexa Inc. y otros). En una realización específica, los epítopos del constructo poliepitópico de la presente invención están ligados operativamente con un ácido nucleico que codifica una secuencia de acceso seleccionada del grupo consistente en: secuencia señal activadora del plasminógeno tisular, secuencia señal de la insulina, secuencia señal del retículo endoplasmático, secuencia de acceso lisosomal LAMP-1, secuencia de acceso lisosomal LAMP-2, secuencia de acceso lisosomal HLA-DM, secuencias de asociación con HLA-DM de HLA-DO, dominio cito plasmático Ig-alfa, dominio citoplasmático Ig-beta, proteína Ii, proteína matricial de la gripe, antígeno de superficie del VHB, antigeno del núcleo del VHB y proteina Ty de la levadura.
En una realización adicional, el polinucleótido de la presente invención comprende, además, al menos una secuencia señal. Una "secuencia señal" es o codifica una secuencia de 16-30 aminoácidos, en un polipéptido secretado, que dirige la proteína a su compartimento o su membrana diana. Una secuencia señal preferente es la secuencia señal Ig kappa.
La expresión "ligado operativamente" se refiere a una unión en la que una secuencia de nucleótidos está conectada a otra secuencia (o a otras secuencias) de nucleótidos de tal modo que sea capaz de alterar el funcionamiento de la secuencia (o las secuencias). Por ejemplo, un ácido nucleico o un constructo poliepitópico de ácidos nucleicos que esté ligado operativamente a una secuencia reguladora, tal como un promotor/operador, pone la expresión del ácido nucleico o el constructo bajo la influencia o el control de la secuencia reguladora. Se dice que dos secuencias de nucleótidos (tal como una secuencia que codifique una proteína y una secuencia de una región promotora ligada al extremo 5' de la secuencia de codificación) están ligadas operativamente si la inducción de la función promotora da como resultado la transcripción del ARNm de la secuencia de codificación de la proteína y si la naturaleza de la unión entre las dos secuencias de nucleótidos (1) no resulta en la introducción de una mutación por desplazamiento del marco de lectura (2) ni impide las secuencias reguladoras de expresión para dirigir la expresión del ARNm o de la protelna. Así, una región promotora estaría ligada operativamente a una secuencia de nucleótidos si el promotor fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de nucleótidos.
Uno o más residuos de cisteína comprendidos en los epítopos del constructo poliepitópico pueden ser "bloqueados reversible o irreversiblemente". Una "cisteína bloqueada irreversiblemente" es una cisteína en la que el grupo tiol de la cisteína está protegido irreversiblemente por medios químicos. En particular la "protección irreversible" o el "bloqueo irreversible" por medios químicos se refiere a la alquilación, preferentemente la alquilación de una cisteína en una proteína por medio de agentes alquilantes, tales como, por ejemplo, halógenos activos, etilenimina o N(yodoetil) trifluoro-acetamida. En este sentido, ha de entenderse que la alquilación de los grupos tiol de la cisteína se refiere a la sustitución del hidrógeno del tiol por (CH2)nR, siendo n O, 1,2,3 o 4 y R= H, COOH, NH2, CONH2, fenilo,
o cualquier derivado de los mismos. La alquilación puede llevarse a cabo mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, halógenos activos X (CH2)nR, siendo X un halógeno tal como 1, Br, CI
o F. Ejemplos de halógenos activos son metilyoduro, ácido yodoacético, yodoacetamida y 2-bromoetilamina.
Una "cisteína bloqueada reversiblemente" es una cisteína en la que los grupos tiol de la cisteína están protegidos reversiblemente. En particular las expresiones "protección reversible" o "bloqueo reversible", tal como se usan en el presente documento, contemplan el enlace covalente de agentes de modificación en los grupos tiol de la cisteína, así como la manipulación del entorno de la proteína, de modo que persista el estado redox de los grupos tiol de la cisteína (protección). La protección reversible de los grupos tiol de la cisteína puede llevarse a cabo química o enzimáticamente. La expresión "protección reversible por medios enzimáticos", según se usa en el presente documento, contempla la protección reversible mediada por enzimas, tal como, por ejemplo, las aciItransferasas, por ejemplo las aciltransferasas que están implicadas en la catálisis de la tioesterificación, tal como la palmitoil aciltransferasa. La expresión "protección reversible por medios químicos", según se usa en el presente documento, contempla la protección reversible usando condiciones o agentes bien conocidos para la persona experta en la técnica.
La eliminación del estado de protección reversible de los residuos de cisteína puede lograrse química o enzimátícamente, por ejemplo, por medio de:
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un reductor, en particular OTT, OTE, 2-mercaptoetanol, ditionita, SnCb, borohidruro de sodio, hidroxilamina, TCEP, en particular en una concentración de 1-200 mM, más preferentemente en una concentración de 50-200 mM;
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la eliminación de las condiciones o los agentes estabilizadores del tiol mediante, por ejemplo, el aumento del pH;
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enzimas, en particular tioesterasas, glutarredoxina, tiorredoxina, en particular en una concentración de 0,01-5 IJM, aún más en particularmente en un intervalo de concentración de 0,1-5 IJM;
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combinaciones de las condiciones químicas y/o enzimáticas descritas más arriba.
La eliminación del estado de protección reversible de los residuos de cisteína puede llevarse a cabo in vitro o in vivo; por ejemplo, en una célula o en un individuo.
Alternativamente, un residuo de cisteína o 2 o más residuos de cisteína comprendidos en los epítopos de VPH descritos en el presente documento pueden mutar en un aminoácido natural, preferentemente en metíonina, ácido glutámico, glutamina o lisina.
Composiciones y vacunas
La presente invención versa, además, sobre composiciones que comprenden un polinucleótido, un polipéptido o un vector que comprende el constructo poliepitópico de VPH descritos en el presente documento, o una combinación de los mismos. En una realización específica, la composición comprende, además, al menos unO de un excipiente farmacéutica mente aceptable, es decir, un portador, un adyuvante o un vehículo. Las expresiones "composición", "composición inmunogénica" y "composición farmacéutica" pueden usarse de manera intercambiable. Más en particular, dicha composición inmunogénica es una composición de vacuna. Aún más en particular, dicha composición de vacuna es una composición de vacuna profiláctica. Alternativamente, tal composición de vacuna también puede ser una composición de vacuna terapéutica. La composición de vacuna profiláctica se refiere a una vacuna que tiene como objetivo prevenir una infección persistente de VPH y ser administrada a personas sanas que no están infectadas aún con el VPH. La composición de vacuna terapéutica se refiere a una vacuna que tiene como objetivo el tratamiento de una infección de VPH y ser administrada a pacientes que están infectados con el VPH.
Una vacuna o una composición de vacuna es una composición inmunogénica capaz de obtener una respuesta inmunitaria suficientemente amplia y vigorosa como para provocar al menos uno o ambos de:
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un efecto estabilizante en la multiplicación de un patógeno ya presente en un anfitrión y contra el que va dirigida la composición de la vacuna. Una composición de vacuna también puede inducir una respuesta inmunitaria en un anfitrión ya infectado con el patógeno contra el cual la respuesta inmunitaria conduce a la estabilización, la regresión
o la resolución de la enfermedad. En el caso del VPH, por ejemplo, una vacuna previene el avance adicional de la CIN y previene el desarrollo del cáncer de cuello de útero o promueve la regresión de las lesiones; y
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un aumento de la velocidad a la que un patógeno recién introducido en un anfitrión, tras la inmunización con una composición de vacuna dirigida contra dicho patógeno, se elimina de dicho anfitrión.
En particular, la composición de la invención es una composición inmunogénica o una vacuna del VPH. En particular, la composición o vacuna comprende una cantidad efectiva del polinucleótido, los ácidos nucleicos, el polipéptido o los péptidos de la presente invención. En una realización específica, dicha composición o vacuna comprende un vector, un plásmido, un virus recombinante y/o una célula anfitriona que comprenden el constructo poliepitópico de la presente invención. Dicha composición o vacuna puede comprender, además, una o más sustancias activas adicionales y/o al menos uno de un excipiente farmacéuticamente aceptable, siendo un portador, un adyuvante o un vehículo.
Se denomina "cantidad efectiva" de un polinucleótido o polipéptido en una vacuna o composición a una cantidad requerida y suficiente para provocar una respuesta inmunitaria. Estará claro para el experto en la técnica que la respuesta inmunitaria suficientemente amplia y vigorosa para provocar los efectos contemplados por la vacuna o composición puede requerir inmunizaciones sucesivas (en el tiempo) con la vacuna o composición como parte de un régimen de administración o una pauta de vacunación. La "cantidad efectiva" puede variar dependiendo de la salud y la condición física del individuo que vaya a tratarse, de la edad del individuo que vaya a tratarse (por ejemplo, la dosificación para niños puede ser inferior a la de los adultos), del grupo taxonómico del individuo que vaya a tratarse (por ejemplo, ser humano, primate no humano, primate, etc.), de la capacidad del sistema inmunitario del individuo para desencadenar una respuesta inmunitaria efectiva, del grado de protección deseado, de la formulación de la vacuna, de la evaluación del médico que lleve el caso, de la cepa del patógeno infectante y de otros factores relevantes. En cuanto a dosificación, el tratamiento puede ser una pauta de una sola dosis o una pauta de múltiples dosis. La vacuna o composición puede ser administrada junto con otros agentes inmunorreguladores. Las dosificaciones, las vías de administración y las pautas de dosis se regulan según metodología conocida en la técnica.
Portadores, adyuvantes y vehículos: Administración
La presente invención versa, además, sobre un procedimiento de inducción de una respuesta inmunitaria contra el VPH en un individuo que comprende la administración del polinucleótido, el vector, el polipéptido, la célula anfitriona
o la composición de la presente invención. Más específicamente, la presente invención versa sobre un procedimiento de tratamiento de una infección de VPH y, de forma más específica, de una enfermedad relacionada con el VPH.
La presente invención versa, además, sobre un procedimiento de inducción de una respuesta inmunitaria en diversas fases, por ejemplo CIN 1-3, de una enfermedad relacionada con el VPH, buscando con ello mayor eficacia, que comprende la administración del polinucleótido, el vector, el polipéptido, la célula anfitriona o la composición que contiene epítopos a partir de antlgenos del VPH expresados diferencial mente.
Pueden usarse diversos sistemas de administración reconocidos en la técnica para administrar un constructo poliepitópico a las células apropiadas. Los polinucleótidos y los polipéptidos codificados pueden ser administrados, por ello, en un vehículo farmacéuticamente aceptable o como suspensiones coloidales, o como polvos, con o sin diluyentes. Pueden estar "desnudos" o asociados con vehículos de administración y ser administrados usando sistemas de administración conocidos en la técnica.
Un "portador farmacéutica mente aceptable" o "adyuvante farmacéuticamente aceptable" es cualquier excipiente, diluyente, portador y/o adyuvante adecuado que, por sí mismo, no induzca la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición ni provoque protección. Preferentemente, un portador o adyuvante farmacéutica mente aceptable potencia la respuesta inmunitaria provocada por un antígeno.
Un "vehículo farmacéutica mente aceptable" incluye vehículos como agua, suero fisiológico, soluciones salinas fisiológicas, glicerol, etanol, etc. En tales vehículos pueden incluirse sustancias auxiliares, como humectantes o emulsionantes, sustancias tampón de pH y conservantes.
Normalmente, una composición o vacuna se prepara como un inyectable, ya sea como una solución liquida o una suspensión. La inyección puede ser subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intradérmica, intraepidérmica o mediante "cañón génico". Otros tipos de administración comprenden electroporación, implantación, supositorios, ingestión oral, aplicación entérica, inhalación, aerosolización o pulverización o gotas nasales. También pueden prepararse formas sólidas, adecuadas para ser disueltas o suspendidas en vehículos líquidos de forma previa a la inyección. La preparación también puede ser emulsionada o encapsulada en liposomas para potenciar el efecto adyuvante.
Una formulación líquida puede incluir aceites, polímeros, vitaminas, hidratos de carbono, aminoácidos, sales, tampones, albúmina, tensioactivos o espesantes. Puede usarse cualquier tampón fisiológico, pero se prefieren los tampones de citrato, fosfato, succinato y glutamato o mezclas de los mismos.
Otro sistema de administración de fármacos para aumentar la vida circulatoria media es el liposoma. Los péptidos y los ácidos nucleicos de la invención también pueden ser administrados por medio de liposomas, que sirven para seleccionar como blanco un tejido particular, como el tejido linfoide, o para seleccionar como objetivo células infectadas, así como para aumentar la vida media de la composición de péptidos y ácidos nucleicos. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de fosfolípidos, capas laminares y similares.
Preferentemente, después de que se prepara la composición farmacéutica líquida, es liofilizada para evitar la degradación y conservar la esterilidad. Las personas con un dominio normal de la técnica conocen procedimientos para la liofilización de composiciones líquidas. Inmediatamente antes del uso, la composición puede ser reconstituida con un diluyente estéril (por ejemplo, solución de Ringer, agua destilada o suero fisiológico estéril) que puede incluir ingredientes adicionales. Tras la reconstitución, la composición es administrada preferentemente a sujetos usando los procedimientos que resultan conocidos para los expertos en la técnica.
En la actualidad se está usando el enfoque denominado "ADN desnudo" para la administración intramuscular (1M) en ensayos clinicos. Para maximizar los efectos inmunoterapéuticos de las vacunas de ADN puede resultar deseable un procedimiento alternativo para formular ADN plasmídico purificado. Se han descrito varios procedimientos y puede llegar a haber disponibles nuevas técnicas. También pueden usarse lípidos catiónicos en la formulación (véase, por ejemplo, lo descrito en el documento WO 93/24640; Mannino y Gould-Fogerite 1988; patente estadounidense nO 5279833; WO 91/06309; y Felgner y otros, 1987). Además, también podrían formarse complejos de glucolípidos, liposomas fusogénicos, péptidos y compuestos denominados colectivamente compuestos protectores interactivos sin condensación, convirtiéndolos en ADN plasmídico purificado para influir en variables tales como la estabilidad, la dispersión intramuscular o el tránsito a órganos o tipos celulares específicos.
Ejemplos adicionales de tecnologlas de administración a base de ADN incluyen la administración facilitada (bupivicaína, polímeros, mediada por péptidos), los complejos lipídicos catiónicos, la administración mediada por partículas ("cañón génico") o mediada por presión (véase, por ejemplo, el documento US 5 922 687), el ADN formulado con lípidos cargados o sin carga, el ADN formulado en liposomas, el ADN emulsionado, el ADN incluido en un vector viral, el ADN formulado con una proteina o un polinucleótido que faciliten la transfección, el ADN formulado con una proteína o un polipéptido de acceso, el ADN formulado con agentes de precipitación del calcio, el ADN acoplado a una molécula portadora inerte y el ADN formulado con un adyuvante. En este contexto, se hace notar que casi todas las consideraciones pertenecientes al uso de adyuvantes en la formulación de vacunas tradicionales se aplican a la formulación de vacunas de ADN.
También pueden usarse directamente como vacunas vivas en seres humanos virus recombinantes o vectores portadores vivos. En consecuencia, la presente invención también versa sobre un virus recombinante, un vector bacteriano, un vector de levadura o un plásmido, y una célula anfitriona que comprenda el polinucleótido descrito en el presente documento.
En una realización preferente de la invención, se introduce el polinucleótido en forma de un vector en el que la expresión está bajo el control de un promotor. Por lo tanto, realizaciones adicionales de la presente invención son un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica al menos el constructo poliepitópico descrito en el presente documento, y que es capaz de expresar los respectivos péptidos, una célula anfitriona que comprende el vector de expresión y un procedimiento de producción y purificación de los péptidos descritos en el presente documento, y una composición farmacéutica que comprende los péptidos descritos en el presente documento y un portador y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.
Hay disponibles divulgaciones detalladas relativas a la formulación y el uso de vacunas de ácidos nucleicos, por ejemplo en Donnelly J.J. y otros, 1997 y 1997a. Ejemplos de vectores de expresión incluyen anfitriones virales atenuados, como un poxvirus. Como ejemplo de este enfoque, se usa el virus vaccinia como vector para expresar secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la invención. Tras su introducción en un anfitrión, el virus vaccinia recombinante expresa el péptido inmunogénico, y de ese modo provoca una respuesta de CTL y/o de HTL en el anfitrión. Se describen vectores vaccinia, por ejemplo la vaccinia Ankara modificada (MVA), y procedimientos útiles en los protocolos de inmunización, por ejemplo, en el documento US 4 722 848. Otro vector es el BCG (bacilo de Calmette-Guerin). Se describen vectores BCG en Stover y otros, 1991. Los vectores de levadura preferentes son: Sacharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Hansenula polymorpha. Ejemplos adicionales son: los alfavirus (virus de la selva de Semliki, el virus Sindbis, el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE)), el virus del herpes simple (VHS), cepas de replicación deficiente de adenovirus (humano o símico), vectores SV40, vectores CMV, vectores del virus del papiloma y vectores derivados del virus de Epstein Barr. A partir de la descripción del presente documento, resultará obvia para los expertos en la técnica una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración o la inmunización terapéutica de los epítopos dados a conocer en el presente documento, por ejemplo los vectores retrovirales, vectores de Salmonella typhi, vectores destoxificados de la toxina del carbunclo y similares.
Pueden desearse modificaciones adicionales de los vectores para optimizar la expresión y la inmunogenicidad de los polinucleótidos. En algunos casos, se requieren intrones para la expresión eficiente de los genes y podrían incorporarse en la región transcrita del constructo de polinucleótidos uno o más intrones sintéticos o presentes en la naturaleza. También se puede considerar la inclusión de secuencias de estabilización del ARNm y secuencias para la replicación en células de mamíferos para aumentar la expresión de los polinucleótidos. Además, las secuencias inmunoestimuladoras (ISS o CpG) parecen desempeñar un papel en la inmunogenicidad de las vacunas de ácidos nucleicos. Estas secuencias pueden incluirse en el vector, fuera de la secuencia de codificación del polinucleótido, si se desea potenciar la inmunogenicidad.
En algunas realizaciones, puede usarse un vector de expresión bicistrónico que permita la producción tanto de los epítopos codificados por el minigén como de una segunda proteína (incluida para potenciar o disminuir la inmunogenicidad). Ejemplos de proteínas o polipéptidos que podrían potenciar de forma beneficiosa la respuesta inmunitaria si son coexpresados incluyen las citosinas (por ejemplo, IL-2, IL-12, GM-CSF), las moléculas inductoras de citosinas (por ejemplo, LeIF) y las moléculas coestimuladoras.
Los epítopos colaboradores (HTL) pueden unirse a señales intracelulares de acceso y ser expresados separadamente de los epítopos de CTL expresados; esto permite la dirección de los epitopos de HTL a un compartimento celular diferente del de los epítopos de CTL. Si hace falta, esto podría facilitar una entrada más eficiente de los epitopos de HTL en el sistema de HLA de clase 11, mejorando con ello la inducción de HTL. A diferencia de la inducción de HTL o CTL, disminuir específicamente la respuesta inmunitaria mediante la coexpresión de moléculas inmunosupresoras (por ejemplo TGF-P) puede resultar beneficioso en ciertas enfermedades.
El uso de constructos poliepitópicos está descrito, por ejemplo, en US 6 534 482 (Pharmexa Inc.); An y Whitton, 1997; Thomson y otros, 1996; Whitton y otros, 1993; Hanke y otros, 1998. Por ejemplo, pueden diseñarse un plásmido poliepitópico de ADN que codifica epítopos de VPH portadores de supermotivos y/o motivos derivados de múltiples regiones de la secuencia proliproteínica del VPH, el epítopo PADRE® de células T colaboradoras universales (o múltiples epítopos de HTL del VPH), y una secuencia señal de translocación del retículo endoplasmático.
Todas las divulgaciones del presente documento que estén relacionadas con el uso de adyuvantes en el contexto de composiciones farmacéuticas a base de proteínas o (poli)péptidos se aplican mutatis mutandis a su uso en la tecnología de la vacunación con ácidos nucleicos y vectores. Lo mismo se aplica a otras consideraciones relativas a la formulación y el modo y la vía de administración y, por ende, también estas consideraciones expuestas en el presente documento en relación con la composición farmacéutica tradicional se aplican mutatis mutandis a su uso en la tecnología de la vacunación con ácidos nucleicos y vectores.
Uso médico
En una realización adicional, la presente invención versa sobre el polinucleótido, el vector, la célula anfitriona, el polipéptido o la composición de la presente invención para su uso como medicamente. Preferentemente, dicho medicamento es una vacuna. Más específicamente, la presente invención versa acerca del uso del constructo poliepitópico que comprende los epítopos de la presente invención, o la secuencia de ácidos nucleicos que codifican dichos epítopos, para la fabricación de un medicamento para prevenir y/o tratar una infección de VPH y/o una enfermedad relacionada con el VPH. En una realización específica, la invención también versa acerca de un vector, un plásmido, un virus recombinante o una célula anfitriona que comprenden el polinucleótido descrito en el presente documento para la fabricación de un medicamento para prevenir y/o tratar una infección de VPH y/o una enfermedad relacionada con el VPH.
La presente invención también abarca el constructo poliepitópico que comprende los epítopos dados a conocer, o la secuencia de ácidos nucleicos que codifican dichos epítopos, o un vector, un plásmido, un virus recombinante o una célula anfitriona que comprenden el polinucleótido descrito en el presente documento para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una infección de VPH y/o de una enfermedad relacionada con el VPH.
En una realización adicional, la presente invención versa sobre el uso del polinucleótido, el vector, la célula anfitriona, el polipéptido o la composición para inducir una respuesta inmunitaria contra el VPH en un individuo. Dicho uso puede caracterizarse porque dicho polinucleótido, dicho vector, dicha célula anfitriona, dicho polipéptido o dicha composición pueden usarse como parte de una serie de tiempos y de compuestos. En este sentido, ha de entenderse que la expresión "una serie de tiempos y de compuestos" se refiere a la administración a intervalos temporales a un individuo los compuestos usados para provocar una respuesta inmunitaria. Estos compuestos pueden comprender cualquier de los componentes siguientes: el polinucleótido, el vector, la célula anfitriona, el polipéptido o la composición de la presente invención.
Puede proporcionarse el constructo poliepitópico de esta invención en forma de kit junto instrucciones para la administración de la vacuna. Normalmente, el kit incluiría composiciones de polinucleótidos deseados en un recipiente, preferentemente en forma de dosis unitaria e instrucciones para su administración. Un kit alternativo incluiría un constructo de polinucleótidos con ácidos nucleicos deseados de la invención en un recipiente, preferentemente en forma de dosis unitaria, junto con instrucciones para su administración. También pueden incluirse en el kit linfocinas como IL-2 o IL-12. Otros componentes del kit que también pueden resultar deseables incluyen, por ejemplo, una jeringa estéril, dosis de refuerzo y otros excipientes deseados.
Otras disposiciones de los instrumentos que implementan la invención resultarán obvias para los expertos en la técnica.
Ha de entenderse que aunque las realizaciones, las construcciones y las configuraciones preferentes, así como los materiales, han sido expuestas en el presente documento para los instrumentos según la presente invención, pueden realizarse diversos cambios o modificaciones en forma y en detalle.
Tabla 1: Epítopos de HTL derivados del VPH
Secuencias de epítopos de FN o analogizados
ID SEC N° Fuente Secuencia de FN HLA
LSQMVQWAY
1 VPH16/31.E1.357 A01
QVDYVGLYY
2 VPH16.E2.151 A01
STDLRDHIDY
3 VPH16.E2.23 A01
KSAIVTLTY
4 VPH16.E2.329 A01
ISDYRHYCY
5 VPH16.E6.80.D3 ISEYRHYCY A01
CLYLHIQSL
6 VPH16.E1.259 A02
KLLSKLLCV
7 VPH16.E1.292 A02
FVYIPLFLI
8 VPH16.E5.66 A02
TLHDIILECV
9 VPH 16.E6.29. L2 TIHDIILECV A02
YMLDLQPETV
10 VPH16.E7.11V10 YMLDLQPETI A02
GTLGIVCPV
11 VPH16.E7.85.V9 GTLGIVCPI A02
WLLLVRYK
12 VPH16.E1.274 A11
STAAALYWYK
13 VPH16.E1.314 A11
ATMCRHYKR
14 VPH16.E1.406 A11
KSLFGMSLMK
15 VPH16.E1.483 A11
SVICFVNSK
16 VPH16.E1.497 A11
AATKYPLLK
17 VPH16.E4.9 A11
LYGVSFSEL
18 VPH16.E1.214 A24
RFHNIRGRF
19 VPH16.E6.131.F9 RFHNIRGRW A24
VYDFAFRDLCI
20 VPH16.E6.49 A24
PYAVCDKCF
21 VPH16.E6.66.F9 PYAVCDKCL A24
CYSLYGTIF
22 VPH16.E6.87.F9 CYSLYGTIL A24
GTGCNGWFY
23 VPH18/31.E1.11 A01
LQDKIIDHY
24 VPH18.E2.15 A01
ATCVSHRGLY
25 VPH18.E2.154 A01
TLEKL TNTGL Y
26 VPH18.E6.89 A01
ILYAHIQCL
27 VPH18.E1.266 A02
VAWDSVYYM
28 VPH18.E2.136 A02
TVYVFCFLL
29 VPH18.E5.5.1 A02
SLQDIEITCV
30 VPH18.E6.24 A02
KLTNTGLYNV
31 VPH18.E6.92.V10 KLTNTGLYNL A02
KQGAMLAVFK
32 VPH18.E1.210 A11
TVSATQLVK
33 VPH18.E2.211 A11
STVSVGTAK
34 VPH18.E2.230 A11
QWPAYNISK
35 VPH18.E2.61 A11
Secuencias de epítopos de FN o analogizados
ID SEC N° Fuente Secuencia de FN HLA
FVVYROSIPK
36 VPH18.E6.53.K10 FVVYROSIPH A11
OSVYGOTLER
37 VPH18.E6.83.R10 OSVYGDTLEK A11
ATLQOIVLH
38 VPH18.E7.6 A11
SYFGMSFIHF
39 VPH18/45.E1.491 A24
YYMTOAGTW
40 VPH18.E2.142 A24
GYNTFYIEF
41 VPH18.E2.168 A24
MYVCCHVPL
42 VPH18.E5.14 A24
VYVFCFLLPM
43 VPH18.E5.52 A24
LYNLLlRCF
44 VPH18.E6.98.F9 LYNLLlRCL A24
VMOOSEIAY
45 VPH31.E1.349 A01
LSSALEIPY
46 VPH31.E6.15 A01
AFTOLTIVY
47 VPH31.E6.46 A01
QTEPOTSNY
48 VPH31.E7.44.T2 QAEPOTSNY A01
KLLEKLLCI
49 VPH31.E1.272 A02
YTNWKFIYL
50 VPH31.E2.131 A02
FLLCFCVLL
51 VPH31.E5.15 A02
FIYIPLFVI
52 VPH31.E5.66 A02
FLFTOLTIV
53 VPH31.E6.45.L2 FAFTOLTIV A02
KLTNKGICOL
54 VPH31.E6.90 A02
MVMLMLVRFK
55 VPH31.E1.253 A11
STAAALYWYR
56 VPH31.E1.294 A11
ISFAGIVTK
57 VPH31.E2.205 A11
ATTPIIHLK
58 VPH31.E2.291 A11
KVSEFRWYRY
59 VPH31.E6.72 A11
SVYGTTLER
60 VPH31.E6.82.R9 SVYGTTLEK A11
PYLHSRLWF
61 VPH31.E1.557 A24
VFTFPNPFPF
62 VPH31.E1.565 A24
HYTNWKFIF
63 VPH31.E2.130.F9 HYTNWKFIY A24
WFIYIPLF
64 VPH31.E5.64 A24
FYSKVSEFRW
65 VPH31.E6.69 A24
VYGTTLEKL
66 VPH31.E6.83 A24
LQDKILOHY
67 VPH45.E2.17 A01
NTGILTVTY
68 VPH45.E2.332 A01
LTOVSIACVY
69 VPH45.E6.25.T2 LQOVSIACVY A01
NTELYNLLI
70 VPH45.E6.95 A01
ELOPVOLLCY
71 VPH45.E7.20 A01
TLYAHIQCL
72 VPH45.E1.252 A02
YVVWDSIYYI
73 VPH45.E2.137 A02
SLVFLLCFSV
74 VPH45.E5.3 A02
FLLCFSVCL
75 VPH45.E5.6 A02
YQFAFKOLCV
76 VPH45.E6.45.V10 YQFAFKOLCI A02
Secuencias de epítopos de FN o analogizados
IDSEC N° Fuente Secuencia de FN HLA
TLQEIVLHV
77 VPH45.E7.7.V9 TLQEIVLHL A02
AVMCRHYKR
78 VPH45.E1.399 A11
RQMNMSQWIK
79 VPH45.E1.411 A11
STWHWTGCNK
80 VPH45.E2.322 A11
VTTRYPLLR
81 VPH45.E4.8 A11
RTEVYQFAFR
82 VPH45.E6.41.R10 RTEVYQFAFK A11
SVYGETLEK
83 VPH45.E6.84 A11
VFTFPHAFPF
84 VPH45.E1.578 A24
VYITETGIW
85 VPH45.E2.144 A24
VYVCAFAWLL
86 VPH45.E5.26 A24
VYQFAFKDL
87 VPH45.E6.44 A24
FYSRIRELRF
88 VPH45.E6. 71.F1 O FYSRIRELRY A24
La columna 1 contiene el epítopo analogizado cuando en la columna 4 no se indica ninguna secuencia de FN. Tabla 2: Epítopos de HTL del VPH
Secuencia de epítopos
Fuente ID SEC N°
L YWYKTGISNISEVY
VPH16.E1.319 89
PEWIQRQTVLQHSFN
VPH16.E1.337 90
WKHMRLECAIVYKAR
VPH16.E2.033 91
LQAIELQL TLETIYN
VPH16.E2.070 92
GL YYVHEGIRTYFVQ
VPH16.E2.156 93
QRFHNIRGRWTGRCM
VPH16.E6.130 94
LDLQPETTDLYCYEQ
VPH16.E7.13 95
LCTELQTTIHDIILE
VPH16.E6.22 96
IRTLEDLLMGTLGIV
VPH16.E7.76 97
FKTLlQPFILYAHIQ
VPH18.E1.258 98
IEFITFLGALKSFLK
VPH18.E1.458 99
FLNTVAIPDSVQILV
VPH18.E2.346 100
HKAIELQMALQGLAQ
VPH18.E2.074 101
EVFEFAFKDLFVVYR
VPH18.E6.43 102
LFVVYRDSIPHMCHK
VPH18.E6.52 103
TNTGL YNLLlRCLRCQ
VPH18.E6.94 104
FQQLFLNTLSFVCPW
VPH18.E7.86 105
NGWFYVEAVIDRQTG
VPH31.E1.15 106
PEWIERQTVLQHSFN
VPH31.E1.317 107
WKHIRLECVLMYKAR
VPH31.E2.033 108
TTPIIHLKGDANILK
VPH31.E2.292 109
TGRCIACWRRPRTET
VPH31.E6.132 110
VLDFAFTDL TIVYRD
VPH31.E6.42 111
IRILQELLMGSFGIV
VPH31.E7.76 112
PRKLHELSSALEIPY
VPH31.E6.9 113
Secuencia de epítopos
Fuente ID SEC N°
DWVMAIFGVNPTVAEGF
VPH45.E1.228 114
FKTLlKPATLYAHIQ
VPH45.E1.244 115
PINISKSKAHKAIEL
VPH45.E2.67 116
TIPNSVQISVGYMTI
VPH45.E2.354 117
LCIVYRDCIAYMCH
VPH45.E6.52 118
FHSIAGQYRGQCNTC
VPH45. E6.127 119
EIVLHLEPQNELDPV
VPH45.E7.10 120
LRTLQQLFLSTLSFV
VPH45.E7.84 121
AKFVMWTLKAM
PADRE 122
La presente invención se ilustra por medio de los ejemplos siguientes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Ensayos de enlace competitivo del HLA de clase I usando HLA soluble
El siguiente ejemplo del enlace de péptidos a moléculas solubles de HLA demuestra la cuantificación de las afinidades de enlace de los péptidos de HLA de clase I y clase 11.
Se usaron líneas celulares homocigóticas transformadas del virus Epstein-Barr (EBV), fibroblastos o transfectantes como fuentes de las moléculas de HLA de clase 1. Se prepararon lisados celulares y se purificaron moléculas de HLA según protocolos divulgados (Sidney y otros, 1998; Sidney y otros, 1995; Sette, y otros, 1994).
Las moléculas de HLA se purificaron a partir de lisados por cromatografía de afinidad. Se hizo pasar al lisado por una columna de perlas de sefarosa CL-4B unidas a un anticuerpo apropiado. Los anticuerpos usados para la extracción de HLA de los lisados celulares son W6/32 (para HLA-A) y LB3.1 (para HLA-DR).
Después se lavó la columna anti-HLA con 10mM Tris-HCL, pH8, en 1% NP-40, PBS, y se eluyó PBS que contenía un 0,4% de n-octilglucósido y moléculas de HLA con 50 mM de dietilamina en 0, 15M de NaCI que contenían un 0,4% de n-octilgluc6sido, pH 11,5. Se añadió un volumen 1/25 de 2M de Tris, pH 6,8, al eluato para reducir el pH a +/-pH 8. A continuación, los eluatos se concentraron mediante centrifugación en concentradores Centriprep 30 (Amicon, Beverly, Massachusetts). El contenido proteínico fue evaluado por medio de un ensayo proteínico BCA (Pierce Chemical Co., Rockford, IIlinois) y fue confirmado mediante SDS-PAGE.
Se ha publicado una descripción detallada del protocolo utilizado para medir el enlace de péptidos al MHC de clase I y clase 11 (Sette y otros, 1994; Sidney y otros, 1998). Brevemente, se incubaron moléculas del MHC purificado (5 a 500 nM) con diversos inhibidores de péptidos no marcados y con 1-10 nM de péptidos sonda radiomarcados con 1251 durante 48 horas en PBS que contenía un 0,05% de Nonidet P-40 (NP40) en presencia de un cóctel de inhibidores de proteasa. Todos los ensayos se realizaron con pH 7 con excepción del DRB1 *0301, que se realización con pH 4,5, Yde DRB1*1601 (DR2w21 1) YDRB4*0101 (DRw53), que se realizaron con pH 5.
Tras la incubación, los complejos MHC-péptido se separaron del péptido libre mediante filtración en gel en columnas TSK200 de 7,8 mm x 15 cm (TosoHaas 16215, Montgomeryville, Pensilvania). Se hizo pasar al eluato de las columnas TSK a través de un detector de radioisótopos Beckman 170, y la radiactividad fue trazada e integrada usando un integrador Hewlett-Packard 3396A, y se determinó la fracción de péptido enlazada. Alternativamente, los complejos MHC-péptido se separaron del péptido libre mediante captura sobre placas de ELlSA recubiertas con anticuerpos anti-HLA. Una vez que se eliminó por lavado el péptido libre, se midieron las reactividades restantes usando el mismo procedimiento que antes.
Los péptidos radiomarcados fueron yodados usando el procedimiento de la cloramina T.
Normalmente, en experimentos preliminares, se tituló cada preparación de MHC en presencia de cantidades fijas de péptidos radiomarcados para determinar la concentración de moléculas de HLA necesaria para enlazar un 10-20% de la radiactividad total. Todos los ensayos subsiguientes de inhibición y enlace directo se llevaron a cabo usando estas concentraciones de HLA.
Dado que en estas condiciones [marcador] < [HLA] YCI50 ~ [HLA], los valores CI50 medidos son aproximaciones razonables de los valores reales de Ko. Los inhibidores de péptidos son sometidos a ensayo normalmente con concentraciones que oscilan entre 120 IJg/ml y 1,2 ng/ml, y son sometidos a ensayo en de dos a cuatro experimentos completamente independientes. Para permitir la comparación de los datos obtenidos en diferentes experimentos, se calcula una cifra de enlace relativo para cada péptido dividiendo la CI50 de un control positivo para
la inhibición por la CI50 para cada péptido sometido a ensayo (normalmente versiones no marcadas del péptido sonda radiomarcado). Para fines de bases de datos y comparaciones entre experimentos, se compilan los valores de enlace relativo. Estos valores pueden volver a ser convertidos posteriormente en valores de CI50 en nM dividiendo la CI50 en nM de los controles positivos para la inhibición por el enlace relativo del péptido de interés. Se ha demostrado que este procedimiento de compilación de datos es el más preciso para comparar péptidos que han sido sometidos a ensayo en dias diferentes, o con lotes diferentes de MHC purificado. Las Tablas 3-6 contienen los valores de CI50 para los epitopos de CTL.
Dado que el anticuerpo usado para la purificación de HLA-DR (LB3.1) es especifico a la cadena alfa, las moléculas beta-1 no son separadas de las moléculas beta-3 (ni/o de las beta-4 y beta-5). La especificidad de beta-1 del ensayo de enlace es obvia en los casos de DRB1*0101 (DR1), DRB1*0802 (DR8w2) Y DRB1*0803 (DR8w3), en los que no se expresa beta-3 alguna. También se ha demostrado para DRB1*0301 (DR3) y DRB3*0101 (DR52a), DRB1*0401 (DR4w4), DRB1*0404 (DR4w14), DRB1*0405 (DR4w 15), DRB1*1101 (DR5), DRB1*1201 (DR5w12), DRB1*1302 (DR6w19) Y DRB1*0701 (DR7). El problema de la especificidad de la cadena beta para ensayos de DRB1*1501 (DR2w2beta-1), DRBS*0101 (DR2w2beta-2), DRB1*1601 (DR2w21beta-1), DRB5*0201 (DRS1Dw21) y DRB4*0101 (DRw53) se soslaya mediante el uso de fibroblastos. El desarrollo y la validación de ensayos con respecto a la especificidad de la molécula DRbeta han sido descritos previamente (véase, por ejemplo, Southwood y otros, 1998). La Tabla 7 contiene los valores de CI50 para los epitopos de HTL.
Tabla 3: Enlace de péptidos restringidos al HLA A01
ID SEC Secuencia Fuente 23 GTGCNGWFY VPH18/31.E1.11 24 LQDKIIDHY VPH18.E2.15 25 ATCVSHRGLY VPH18.E2.154 26 TLEKL TNTGL Y VPH18.E6.89 2 QVDYYGLYY VPH16.E2.151 3 STDLRDHIDY VPH16.E2.23 4 KSAIVTLTY VPH16.E2.329 5 ISDYRHYCY VPH 16.E6.80.D3 1 LSQMVQWAY VPH16/31.E1.357 45 VMDDSEIAY VPH31.E1.349 46 LSSALEIPY VPH31.E6.15 47 AFTDLTIVY VPH31.E6.46 48 QTEPDTSNY VPH31.E7.44.T2 67 LQDKILDHY VPH45.E2.17 68 NTGILTVTY VPH45.E2.332 69 LTDVSIACVY VPH45. E6.25. T2 70 NTELYNLLI VPH45.E6.95 71 ELDPVDLLCY VPH45.E7.20
A0101 (nM) 136 68 421 174 2,7 113 9 10 21 18 35 31 19 32 337 2,9 32 26 HLA A2601 (nM) A2902 (nM) 3081 116 --646 4212 265 2378 251 25 758 --96 -10 6448 122 -95 4107 261 36 71 --5000 -3147 1403 8201 764 17294 -2107 4291 A3002 (nM) 9,1 2770 28 476 160 17 6 192 0,93 2551 175 2322 836 8722 72 --
-: CI50 > 20 IJM Campo vacío: no se dispone de datos
Tabla 4: Enlace de péptidos restringidos al HLA A02 Tabla 5: Enlace de péptidos restringidos al HLA A11
IDSEC
Secuencia Fuente HLA
A0201
A0202 A0203 A0206 A6802
(nM)
(nM)
(nM)
(nM)
(nM)
27
ILYAHIGCL VPH18.E1.266 33 8,5 10,2 236
28
VAWDSVYYM VPH18.E2.136 172 603 1332 790 5154
29
TVYVFCFLL VPH18.E5.51 175 587 769 26 41
30
SLQDIEITCV VPH18.E6.24 153 25 38 205
31
KLTNTGLYNV VPH 18. E6.92.v1 O 106 2,9 4,7 83 688
6
CLYLHIQSL VPH16.E1.259 73 45 21 100 1777
7
KLLSKLLCV VPH16.E1.292 31 67,7 23 124,6
8
FVYIPLFLI VPH16.E5.66 206 323 63 59 251
9
TLHDIILECV VPH16.E6.29.L2 3,6 0,54 1,9 92 2947
10
YMLDLQPETV VPH16.E7.11.v10 19 1,9 4,5 86 5446
11
GTLGIVCPV VPH16.E7.85.v9 20 49 68 33 32
49
KLLEKLLCI VPH31.E1.272 19 21 2,4 51
50
YTNWKFIYL VPH31.E2.131 69 14 31 84 146
51
FLLCFCVLL VPH31.E5.15 9,6 13 34 2,6 237
52
FIYIPLFVI VPH31.E5.66 26 97 47 8,1 157
53
FLFTDLTIV VPH31.E6.45.L2 17 1,3 3,5 20 1904
54
KLTNKGICDL VPH31.E6.90 205 440 585 484
21
IOSEC Secuencia
Fuente HLA
A0201
A0202 A0203 A0206 A6802
(nM)
(nM)
(nM)
(nM)
(nM)
72 TLYAHIQCL
VPH45.E1.252 34 4,9 6,2 417 1613
73 YVVWOSIYYI
VPH45.E2.137 77 27 248 20 30
74 SLVFLLCFSV
VPH45.E5.3 8,5 27 49 7,9 20
75 FLLCFSVCL
VPH45.E5.6 38 81 66 59 353
76 YQFAFKOLCV
VPH45.E6.45.V10 15 1,3 4,2 10 3698
77 TLQEIVLHV
VPH45.E7.7.v9 19 30 5,1 309 2457
-: Clso > 20 IJM
IOSEC Secuencia
Fuente HLA
A0301
A1101 A3101 A3301 A6801
(nM)
(nM)
(nM)
(nM)
(nM)
32 KQGAMLAVFK
VPH18.E1.210 35 11 519 - 235
33 TVSATQLVK
VPH18.E2.211 7 4 6137 - 31
34 STVSVGTAK
VPH18.E2.230 34 6 1760 - 10
35 GIWPAYNISK
VPH18.E2.61 308 14 6665 - 8
36 FVVYROSIPK
VPH18.E6.53.K10 3437 2504 8 473 176
37 OSVYGOTLER
VPH18.E6.83.R10 193 73 246 1425 44
38 ATLQOIVLH
VPH18.E7.6 211 11 543 - -
12 WLLLVRYK
VPH16.E1.274 6,3 4,1 0,1 6,1 76
13 STAAALYWYK
VPH16.E1.314 5 2 35 128 6
14 ATMCRHYKR
VPH16.E1.406 90 14 10 17 35
15 KSLFGMSLMK
VPH16.E1.483 3,9 2 230 - 887
16 SVICFVNSK
VPH16.E1.497 109 2,2 25 51 5,4
17 AATKYPLLK
VPH16.E4.9 59 20 - - -
55 MVMLMLVRFK
VPH31.E1.253 10 16 53 20 10
56 STAAALYWYR
VPH31.E1.294 198 10 5,6 47 12
57 ISFAGIVTK
VPH31.E2.205 17 1,6 115 4366 16
58 ATIPIIHLK
VPH31.E2.291 10 1,2 34 - 2,5
59 KVSEFRWYRY
VPH31.E6.72 213 25 3 338 192
60 SVYGTILER
VPH31.E6.82.R9 22 7 75 853 4
78 AVMCRHYKR
VPH45.E1.399 311 38 52 24 29
79 RQMNMSQWIK
VPH45.E1.411 15 11 45 - 2557
80 STWHWTGCNK
VPH45.E2.322 14 2,8 54 428 18
81 VTIRYPLLR
VPH45.E4.8 158 18 483 - 3147
82 RTEVYQFAFR
VPH45.E6.41.R10 755 211 8 696 439
83 SVYGETLEK
VPH45.E6.84 21 9,5 6506 - 7,2
-: CI50 > 20 IJM
Tabla 6: Enlace de péptidos restringidos al HLA A24
IOSEC Secuencia Fuente HLA A2302 A2402 A2902 A3002
(nM) (nM) (nM) (nM) 39 SYFGMSFIHF VPH18/45.E1.491 4,3 17,5 62 1544 40 YYMTOAGTW VPH18.E2.142 14 3,2 3411 2151 41 GYNTFYIEF VPH18.E2.168 13 16 835 1264 42 MYVCCHVPL VPH18.E5.14 24 15 9442 4717 43 VYVFCFLLPM VPH18.E5.52 57 178 5276 44 LYNLLlRCF VPH18.E6.98.F9 10 32 2255 18 LYGVSFSEL VPH16.E1.214 7,2 3,1 19 RFHNIRGRF VPH16.E6.131.F9 2,4 29 346 0,69 20 VYOFAFROLCI VPH16.E6.49 8,9 22 21 PYAVCOKCF VPH 16.E6.66. F9 6,1 7,2 641 157 22 CYSLYGTIF VPH16.E6.87.F9 11 28 2088 7823 61 PYLHSRLWF VPH31.E1.557 2,8 38,7 4365 2229 62 VFTFPNPFPF VPH31.E1.565 12 17 603 63 HYTNWKFIF VPH31.E2.130.F9 16 8,5 433 4847 64 WFIYIPLF VPH31.E5.64 108 276 302 268 65 FYSKVSEFRW VPH31. E6.69 8,8 4,5 1777 1361 66 VYGTILEKL VPH31.E6.83 8,2 26 1237
IOSEC Secuencia
Fuente HLA
A2302
A2402 A2902 A3002
(nM)
(nM)
(nM)
(nM)
84 VFTFPHAFPF
VPH45.E1.578 15,9 90,4 57 -
85 VYITETGIW
VPH45.E2.144 2 8,5 - -
86 VYVCAFAWLL
VPH45.E5.26 8,1 8,4 2346 -
87 VYQFAFKOL
VPH45.E6.44 1,1 4 - 165
88 FYSRIRELRF
VPH45.E6.71.F10 1 3,2 83 -
-: Clso > 20 IJM
Tabla 7: Datos de enlace de epítopos de HTL
ID
leso nM 8 HLA purificado N'do
(1): mostrados k)s datos de enlace para el 15-mero (1M menos en el término carboxi)
(2): datos de enlace para la tanda peptídica sin procesar
SEC
Secuencia Fuente ORB1"Ql0l DRB1"Q301 ORB1"0401 ORB1"0404 ORB1"0405 ORB1"Q701 ORB1"0802 ORB1"0901 ORB1"1101 ORB1"1201 ORB1"1301 ORB1"1501 ORB3"Ql0l ORB4"Ql0l ORB5"Ql0l alelos enlazados
89
L YWYKTGISNISEVY VPH16.El.319 13 12.000 6,2 3543 96 25 2965 98 2757 936 1754 19.572 568 7
90
PEWlQRQTVLQHSFN VPH16.El.337 2086 11.052 14 21 101 - 137 3181 117 862 9450 4,3 1528 7
91
WKHMRLECAIYYKAR VPH16.E2.033 701 437 245 6658 557 504 90 6335 2401 248 1393 786 280 9
95
LCAIELQL TLETIYN (2) VPH16.E2.070 42 534 37 282 384 3280 7612 1433 4378 268 17 688 2 9
93
GL YYVHEGIRTYFVQ VPH16.E2.156 67 17.706 322 - 1870 55 3143 431 5331 - 156 - 10004 6
94
QRFHNIRGRWTGRCM VPH16.E6.13O 36 - 2697 4110 4469 277 894 - 574 14.594 5308 17.214 - 4553 919 5
95
LDLQPETTDLYCYEQ VPH16.E7.13 590 1904 - - - - - - - - - - 17 - 2
96
LCTELQTTIHOIILE VPH16.E6.22 2714 80 3662 7966 - - - - 5529 - - 1044 - 1
97
IRTLEOLLMGTLGIV VPH16.E7.76 142 449 677 277 2008 4018 - 950 1548 10.272 4236 923 - 6
96
FKTUQPFILYAHIQ VPH18El.258 54 - 949 111 3255 1690 6086 1226 8695 4286 7,9 317 11.878 5
99
IEFITFLGALKSFLK VPH18.El.458 36 - 108 32 3645 - 11.001 - 1613 - 49 1229 684 5
100
FLNTVAIPDSVQILV VPH18.E2.346 718 68 209 555 616 15 - 534 - 90 8957 91 446 - 10
101
HKAIELQMALQGLAQ VPH18.E2.074 41 5648 50 27 811 12.784 844 3536 573 3 126 8
105
FQQLFLNTLSFVCPW VPH18.E7.86 204 6522 139 496 376 237 8996 1325 6522 11 555 586 17.298 8
106
LFWYROSIPHAACHK (1) VPH18.E6.52 356 73 4,7 28 2159 2600 108 8598 786 566 84 15.242 3770 8
102
EVFEFAFKDLFVVYR VPH18.E6.43 2865 73 347 553 1320 14.415 1415 - 6079 624 165 1522 - 316 - 6
107
TNTGL YNLLIRCLRCQ 1 VPH18.E6.94 367 9439 1485 62 406 4036 41 13.620 17 4057 719 36 19.877 366 3656 8
106
NGWFYVEAVIORQTG VPH31.El.15 1859 2797 845 18.761 178 1459 3670 627 1203 3
107
PEWlERQTVLQHSFN VPH31.El.317 5969 3657 35 23 127 - 954 1707 535 2855 13.492 23 6231 6
108
WKHIRLECVLMYKAR VPH31.E2.033 1444 148 263 307 71 18449 476 11831 81 54 134 182 412 10
109
TTPIIHLKGDANILK VPH31.E2.292 168 74 6823 627 19514 3714 4480 17365 7331 527 205 4755 49 - 6
112
IRILQELLHGSFGIV VPH31.E7.76 50 5376 361 143 3068 267 7543 141 4037 398 94 24 5383 8
111
VLDFAFTDL TIVYRO VPH31.E6.42 7561 36 936 3309 2839 209 14.078 790 13.068 NT 753 2622 NT 307 - 6
110
TGRCIACWRRPRTET VPH31.E6.132 3167 1033 758 1148 733 11.460 512 13.556 158 4949 2771 84 5961 225 6047 6
113
PRKLHELSSALEIPV VPH31.E6.9 183 1435 1557 117 32 62 17.333 342 2126 59 299 835 13.207 8
114
OWVMAIFGVNPTVAEGF VPH45.El.228 487 3749 91 20 92 52 4265 17945 4957 66 10 571 367 9
115
FKTLIKPATLYAHIQ VPH45.El.244 269 5197 316 111 2234 146 11 8103 24 184 195 69 1004 9
116
PINISKAHKAIEL VPH45.E2.67 122 1.068 255 97 1912 17 3172 170 327 309 231 - 1724 452 9
117
TIPNSVQISVGYMTI VPH45.E2.354 52 483 515 18 196 9 6226 91 487 14 10 10775 16 8328 11
118
LCIVYRDCIAYAACH VPH45.E6.52 402 904 481 1043 702 1060 1104 2150 1867 965 262 1525 673 7
119
FHSIAGQYRGQCNTC VPH45.E6.127 107 - 8,6 3305 358 2403 7844 1992 416 18.126 574 - 1296 43 8
120
EIVLHLEPQNELOPV VPH45.E7.18 967 354 12.052 947 273 3490 - - - - 5352 - - 713 - 5
121
LRTLQQLFLSTLSFV VPH45.E7.84 41 3388 127 19 106 39 4101 394 1675 33 17 21 1254 9
~
Ejemplo 2: Diseño de constructos poliepitópicos
Cada constructo diseñado de ADN contiene epítopos restringidos al HLA que se enlazan con al menos una molécula de HLA con una afinidad < 500 nM y, preferentemente, inferior a 100 nM (Tablas 3-6 del Ejemplo 1). Se demostró que la mayoría de estos epítopos era inmunogénica en los respectivos ratones transgénicos de HLA cuando les fueron administrados como un repositorio de péptidos emulsionados en IFA (Tablas 8-9 en el Ejemplo 3).
El orden de epítopos y los aminoácidos espaciadores de los constructos fueron diseñados para evitar la generación de epítopos de unión y para maximizar el procesamiento proteosómico. Las secuencias de aminoácidos fueron retraducidas usando una tabla de usos de codones de mamíferos y la herramienta de retraducción en línea, proporcionadas ambas por Entelechon (Alemania). Las secuencias de ADN fueron insertadas en un vector pMB75.6 usando sitios de restricción Pstl y BamHI. También se incluyeron una secuencia Kozak, una secuencia señal murina Ig kappa (MGMQVQIQSLFLLLLWVPGSRG, ID SEC N° 131), Yun codón finalizador. En las Figuras 5-8 se dan las respectivas secuencias de aminoácidos y ADN de los constructos ICCG6137, ICCG6138, ICCG6149 e ICCG6150.
Ejemplo 3: Inmunogenicidad de epítopos restringidos al HLA de clase I derivados del VPH codificados en un constructo poliepitópico de ADN de VPH
Se sometió a ensayo la inmunogenicidad de epítopos restringidos al HLA de clase I de VPH en los constructos de ADN en los ratones transgénicos de HLA relevantes. La evaluación de la inmunogenicidad de epítopos restringidos al HLA-A02, el HLA-A11, el HLA-A24 y el HLA-A01 derivados del VPH se llevó a cabo usando el siguiente protocolo. Se inmunizó a ratones transgénicos de HLA (ratones transgénicos F1 HLA-A02/KbxBalb/c, HLA-A 11/Kb, HLA A01/Kb Y HLA-A24/Kb) con uno de los constructos de ADN seleccionados. Para garantizar una distribución equitativa de ratones entre diferentes grupos, se llevó a cabo un procedimiento de aleatorización en función del peso corporal. Se clasificaron ratones hembra y macho (con edades entre 8 y 24 semanas) por peso corporal; los animales sumamente ligeros o pesados fueron excluidos. Los animales restantes fueron agrupados asignando secuencialmente animales para los 2 experimentos.
Inmunización con ADN
Los ratones fueron pretratados con cardiotoxina (Sigma, C9759) en el día -4 mediante inyección intramuscular bilateral de 100ml (2x50 !JI) de una solución de 10 !JM de cardiotoxina. Cuatro días después, todos los ratones fueron inmunizados con 100 !Jg de plásmido de VPH-ADN (diluidos hasta 1 mg/ml en PBS) mediante inyección bilateral de 50 !Jg en el músculo tibial anterior. Los ratones fueron sacrificados entre 13 y 15 días después de la inmunización con ADN.
Inmunización con péptidos
Se disolvieron péptidos en DMSO a una concentración de 10 mg/mL. Para cada uno de los 4 constructos de ADN, se juntaron en repositorios los correspondientes péptidos restringidos de HLA por tipo de HLA (5 a 7 péptidos de CTUrepositorio). Se añadió un péptido de HTL (TPPAYRPPNAPIL) y los repositorios de péptidos fueron diluidos en PBS hasta la concentración requerida de péptidos (es decir, 25 !Jg de cada péptido de CTL y 120 !Jg de péptido HTL in 50 !JI). Tras añadir un volumen igual de IFA (Pierce, lote DG56079), se emulsionó la mezcla obligándola a atravesar un pequeño orificio. Los ratones fueron inmunizados subcutáneamente en la base de la cola con 50 !JI de la mezcla de péptidosllFA.
Régimen de inmunización
De cada línea, se inmunizaron intramuscularmente 4 grupos de 12 ratones (HLA-A02 y HLA-A24) o 6 ratones (HLAA11) con uno de los 4 constructos de ADN de VPH (ICCG6149, ICCG6150, ICCG6137, ICCG6138), respectivamente. Para el HLA A01, solo se evaluaron 2 constructos. Para esto, 2 grupos de 12 ratones fueron inmunizados intramuscularmente con ICCG6150 o con ICCG6138. Un grupo final de 12 ratones no fue inmunizado con ADN ni inmunizado por péptidos y fue incluido como un control negativo (únicamente tratamiento de CT).
Para la evaluación de la inmunogenicidad de los péptidos, 4 grupos de 12 ratones (HLA-A01), 6 ratones (HLA-A02 y HLAA24) o 3 ratones (HLA-A 11) fueron inyectados subcutáneamente con uno de los repositorios de péptidos restringidos al HLA en IFA. Como control negativo para los ratones inmunizados con péptidos, 18 ratones (en total) fueron inyectados con una mezcla de PBS/IFA.
Sistema experimental in vitro
Los ratones fueron sacrificados y se aislaron células del bazo (SPC) 13 días después de la inmunización. Se juntaron SPC de ratones HLA-A01/Kb, F1 HLA-A02/KbxBalb/c y HLA-A24/Kb inmunizados con ADN y péptidos cada 2 ratones, dando como resultado 6, 6 Y 3 puntos de datos por condición, respectivamente. Se analizaron individualmente las células del bazo de los ratones HLA-A11/Kb inmunizados con ADN y péptidos. Se juntaron las SPC de todos los ratones de control negativo cada 2 ratones, dando como resultado 3 puntos de datos para cada péptido sometido a ensayo. Las células CD8+ fueron purificadas mediante selección de perlas magnéticas positivas en SPC usando MicroBeads CD8a (MACS 130-049-401) según el protocolo del fabricante.
Se usó un ensayo directo IFNy ELlSPOT ex vivo como lectura de los CTL sustitutos. Básicamente, se incubaron células CD8+ purificadas con los péptidos individuales restringidos a HLA específicos del VPH (10 IJg/mL) cargados en las células apropiadas que presentaban antígenos (APC) en placas ELlSPOT recubiertas de anticuerpos IFNy antirratón. Debido a la limitada disponibilidad, se sembraron células CD8+ Rurificadas de ratones HLA-A11/Kb inmunizados con péptidos en las placas ELlSPOT recubiertas a razón de 105 células/pocillo, mientras que para todos los demás grupos de tratamiento se usaron 2x105 células CD8+/pocillo. Tras una incubación de 20 horas, las células productoras de IFNy fueron visualizadas desarrollando adicionalmente las placas con anticuerpo IFNy antirratón, estreptavidina-HRP y AEC como sustrato.
Las APC usadas para los diferentes péptidos restringidos a HLA fueron células de bazo procedentes de ratones HLA-A01/Kb no inmunizados para HLA-A01, células JA2.1Kb (2x104 células/pocillo) para HLA-A02, LCL
721.221 HLA A11/Kb (104 células/pocillo) para HLA-A11, Y LCL 721.221 HLA A24/Kb (104 células/pocillo) para HLAA24.
Algunos de los epítopos de CTL incluidos en los constructos de ADN son secuencias analogizadas de los epítopos virales de forma natural. Para estos epltopos particulares, solo se usaron las secuencias de tipo natural como estímulo in vitro para la lectura de CTL. Además, se usaron 3 epítopos variantes en secuencia restringidos a HLAA24 como estímulo in vitro para verificar la reactividad de variantes cruzadas. Las respuestas de referencia hacia todos los péptidos restringidos a HLA usadas para la lectura in vitro fueron evaluadas en ratones transgénicos de HLAA01/Kb, F1 HLA-A02/KbxBalb/c, HLA-A 11/Kb o HLA-A24/Kb vírgenes. No pudo detectarse ninguna respuesta significativa (no se muestran los resultados).
Análisis de datos
Se clasifican como inmunogénicos los péptidos que provocan una respuesta CTL delta específica ~ 30 puntos específicos/106 células CD8 y un cociente de respuesta ~ 2 en al menos un repositorio. Ha de someterse a ensayo un mínimo de 2 repositorios.
Resultados
Las Tablas 8 y 9 muestran los resultados para los diferentes constructos de VPH.
La mayoría de los epítopos que se enlazan con afinidad elevada con el HLA (Clso inferior a 500 nM y preferentemente inferior a 100 nM) es capaz de inducir respuestas positivas de las células T en los respectivos ratones transgénicos de HLA, indicando que la afinidad de enlace con el HLA es un criterio de selección para identificar eprtopos inmunogénicos potenciales. Estas respuestas inmunogénicas pueden ser inducidas con los péptidos aislados y/o con un ADN plasmídico que codifique estos péptidos.
Tabla 8: Datos de inmunogenicidad para epítopos VPH 16 y VPH 18 restringidos al HLA de clase I codificados en los constructos ICCG 6149 e ICCG 6150
HLA-A01
Secuencia de ICCG6149 ICCG6150 Repositorio de péptidos ID SEC péptidos de FN 6 Inmun 6 Inmun 6 Inmun usada para la lectura Delta SFC/1 O Coci t (b) S/N Delta SFC/1 O Cocie t (b) S/N Delta SFC/1 O Cociente(") S/Nde CTL células(") en e células(b) n e células(")
1 LSQMVQWAY 1 1-10) 0,7 0,5-2,0 N 2 (1-13) 1,3 (0,8-2,0) N 2 QVDYVGlYV 121-25) 1,80,8-2,5 N 20(7-92) 2,6(1,5-15,0) S 3 STDlRDHIDY 1 1-20) 1,0 0,8-3,0 N 1 (1-3) 1,0 (0,6-1,5) N 4 KSAlVTlTY 1 1-85) 1,0 0,7-5,3 S 68 (30-205) 5,4 (3,0-30,5) S 132 ISEYRHYCY 3 (1-10) 1,1 (0,4-2,0 N 2 (1-13) 1,1 (0,8-3,0) N 23 GTGCNGWFY 1 (1-7) 0,7 (0,3-1,5) N 6 (3-20) 1,4 1,3-1,5) N 24 lQDKIIDHY 3 (1-7) 1,1 (0,4-1,5) N 8 (1-13) 1,3 1,0-1,8) N 25 ATCVSHRGlY 311-27} 1,1 (0,2-3,0) N 2 (1-23) 1,1 0,5-1,9) N 26 TlEKlTNTGlY 6 (1-20) 1,3 (0,0-2,0) N 1 (1-13) 1,0 0,7-2,3) N
HLA-A02
8 FVYIPlFlI 5 (1-5) 1,4 (1,0-5,0) N 3 (1-20) 1,1 (1,0-5,0) N 145 (30-195) 15,5 (7,0-20,5) S 29 TVYVFCFll 1 (1-9) 1,0 (1,0-10,0) N 3 (1-45) 2,1 (1,0-5,0) S 25 (20-25) 3,5 (2,7-5,0) N 6 ClYlHIQSl 32(1-55) 4,1(1,0-40,0) S 10(1-90) 3,6(1,7-20,0) S 6U35-100) 11,0(4,5-14,0) S 7 KllSKllCV 62 (5-125) 6,2 (1,3-95,0) S 15 (4-120) 4,2 (1,07-15,0) S 95 (75-110) 12, O (10,5-16,0) S 27 IlYAHIQCl 358 (155-720) 41,3 (7,2-525,0) S 613 (440-849) 49,5(30,3-850,0) S 655 (440-865) 66,5 (30,3-174,0) S 1\) 28 VAWDSVYYM 290 (150-640) 34,3(7,0-435,0) S 450 (299-784) 39, O (22,3-785,0) S 495 (335-675) 50,5(23,3-136,0) S
......
30 SlQDIEITCV 3 1-10) 1,3 (1,0-5,0) N 1 (1-5) 1,0 (1,0-5,0) N 1 (1-5) 1,0 (1,0-2,0) N 133 YMlDlQPETT 5 1-34) 1,4 (1,0-35,0) S 10 (4-245) 3,3 (1,3-15,0) S 1 1-15) 1,0 1,0-4,0) N 134 GTlGIVCPI 1 (1-5) 1,0 (1,0-5,0) N 3 (1-20) 1,7 (1,0-10,0) N 55 55-70) 8,0 (6,5-12,0) S 135 TIHDlIlECV 562 (55-1520) 86,7(3,2-525,0) S 358 (135-844) 24,8(10,0-845,0) S 80 (45-155) 10,0 9,0-16,5) S 136 KlTNTGlYNl 6í1-30l 2,0 (1,0-30,0) S 20 (5-39) 2,7 (1,3-40,0) S 280 (115-420) 29,0 8,7-85,0) S
HLA-A11
17 AATKYPllK 40 (1-140) 1,5 (1,0-4,5 S 45 1-310) 1,5 (1,0-16,5) S 630 (200-680) 16,8 (11,0-69,0) S 13 STAAAlYWYK 710 (480-2040) 9,6 (3,8-52,0) S 1305 (200-1970) 21,4 (5,2-81,0) S 950 (720-1010) 37,0 (24,8-102,0) S 14 ATMCRHYKR 1 (1-80) 1,0 (1,0-5,0 S 6 1-80) 1,0 (1,0-1,5) N 60 (1-100) 4,0 (1,0-11,0) S 15 KSlFGMSlMK 1 (1-1) 1,0 (1,0-1,0 N 1 1-50) 1,0 (1,0-2,3) S 620 (370-630) 32,0 (10,3-64,0) S 33 TVSATQlVK 15 (1-40) 1,1 (1,0-2,0) N 1H1-70) 1,1 (1,0-3,0) S 20 (1-90) 1,1 1,0-1,4 N 34 STVSVGTAK 435 (90-1600) 5,1 (3,1-12,0) S 245 (100-670) 4,7(2,6-14,5) S 440 (60-1510) 2,3 1,2-7,0 S 35 QWPAYNISK 1 (1-10) 1,Oí1,0-1,5) N 1 1-20) 1,0 1,0-1,5) N 10 (1-100) 1,0 1,0-1,3 N 137 DSVYGDTlEK 15 (1-110) 1,2 1,0-3,2) S 1 1-10) 1,0 1,0-1,5) N 40 (1-70) 1,1 1,0-1,3 N 38 ATlQDIVlH 775 (10-1290) 7,8 (1,1-40,5) S 115 1-1420) 4,9 (1,0-36,5) S 170 (1-440) 1,7 1,0-2,2 S 12 WlllVRYK 1 1-40 1,0 1,0-2,0 N 15 1-40) 1,4 1,0-2,0 S 540 (420-630) 22,0 (14,5-64,0) S 16 SVICFVNSK 1 1-20 1,0 1,0-2,0 N 40 1-110) 1,6 1,0-5,0 S 320 (320-620) 17,0 (9,0-63,0) S 32 KQGAMLAVFK 1 1-20 1,0 1,0-1,4 N 10 1-150) 1,3 1,0-1,5 N 170 (1-220) 1,5 (1,0-1,9) N 138 FVVYRDSIPH 11-20 1,01,0-2,0 N 1(1-90) 1,0(1,0-5,5 S 110(1-310) 1,3(1,0-2,2) S
(continuación)
IDSEC 18 40 41
HLA-A24 Secuencia de péptidos de FN usada para la lectura deCTL LYGVSFSEL YVMTDAGTW GYNTFYIEF ICCG6149 Delta SFC/l06 células(") Cociente(") 1200 (915-1510) 21,1 (17,6-25,3) 5 (1-15) 1,1 (1,0-1,2) 80 (1-230) 2,2 1,0-5,6) Inmun S/N S N S ICCG6150 Delta SFC/l06 células(b) Cociente(") 1120 (250-1565) 20,7 (4,8-33,8) 3 (1-20) 1,1 (1,0-1,3) 113 (1-435) 3,0 (1,0-9,7) Inmun SIN S N S Repositorio de péptidos Delta SFC/l06 células(") Cociente(") 685 (590-1070) 13,5 (10,1-31,6) 135 (1-135) 2,7 (1,0-3,3) 110 (50-110) 2,2 (1,6-2,8 INMUN S/N S S S
39 139 20
SYFGMSFIHF CYSLYGTTL VYDFAFRDLCI 808 (245-1070) 3 (1-5) 435 (285-1005) 14,1 1,0 8,0 ( 5,5-19,7) 1,0-1,1 5,3-21,1 ) S N S 498(81-1150) 1 (1-10) 760 (155-1075) 8,3 (3,2-24,QL 1,0 14,0 1,0-1,3) 3,6-20,4) S N S 65 (45-1751 1 (1-1) 1 (1-110) 1,8 1,0 1,0 1,5-3,9 1,0-1,0 1,0-4,1 S N N
140 141 42 43 142 143 144 145 (b): resultad
PYAVCDKCL RFHNIRGRW MYVCCHVPL VYVFCFLLPM LYNLLlRCL LYNLLlRWL LYGVSFTEL CYSVYGTTL os expresados como: 3 (1-25) 3 (1-35) 1 (1-15) 1 (1-1) 1 (1-10) 3(1-10) 3 (1-5) 23 (10-35) nmana ; respue(minmax) 1,1 1,0-1,4 1,1 1,0-1,5 1,0 (1,0-1,2 1,0 (1,0-1,0) 1,0 1,0-1,2) 1,0 1,0-1,2) 1,0 1,0-1,1) 1,4 1,2-1,6) stas mediana, mínima y N N N N N N N N máxima de C 1 (1-5) 1 (1-20) 1 (1-25) 1 (1-6) 1 (1-1) 1 (1-1) 1 (1-20) 90 (1-865) TL de los repositorios 1,0 1,0-1,1) 1,0 1,0-1,4) 1,0 1,0-1,4) 1,0 (1,0-1,2) 1,0 (1,0-1,0) 1,0 (1,0-1,0) 1,0 (1,0-1,4) 2,6 (1,0-13,4) individuales de ratones. N N N N N N N S Inmun 150 (35-175) 205 (75-325) 1 (1-1) 365 (345-505) 170 (100-450) 30 (10-40) 5 (1-15) 55 (1-150) =Inmunogénico 4,2 1,5-5,3 6,9 2,2-6,9 1,0 1,0-1,0) 5,3 (5,1-9,41 3,8 (2,3-6,Ol 1,5 (1,1-1,5) 1,1 (1,0-1,2) 1,8 (1,0-5,3) S S N S S N N S
N 00
Tabla 9: Datos de inmunogenicidad para epítopos VPH 31 y VPH 45 restringidos al HLA de clase I codificados en los constructos ICCG 6137 e ICCG 6138
N
ce
HLA-A01
IDSEC
Secuencia de péptidos de FN usada para la lectura de CTl ICCG6137 Delta Cociente SFC/10" células Inmun S/N ICCG6138 Delta Cociente SFC/10° células Inmun S/N Repositorio de péptidos Delta Cociente SFC/10° células Inmun S/N
1
lSQMVQWAY 13 (1-20) 1,5 0,3-3,0) N 4 (1-13) 1,3 (0,5-1,5 N
23
GTGCNGWFY 1 (1-25) 1,0 0,8-3,5) N 1 (1-7) 0,7 (0,5-2,0 N
45
VMDDSEIAY 238 (5-945) 15,0 1,5-64,0) S 53 (26-201) 5,3 (2,6-13,2) S
46
lSSAlEIPY 3 (1-10) 1,1 (0,5-2,0) N 1 (1-3) 1,0 (0,8-1,3) N
47
AFTDlTIVY 55 (15-770) 3,9 (2,4-52,3) S 133 (23-201) 10,8 (2,4-21,5) S
146
OAEPDTSNY 23 (1-351 2,5 0,5-4,5 S 4(1-10) 1,2 (0,2-2,0l N I
67
lQDKllDHY 3 (1-15) 1,3 0,3-1,6 N 2 (1-56) 1,0 (0,6-4,41 S ,
68
NTGllTVTY 6(1-15) 1,3 0,8-2,5) N 2 (1-7) 1,1 (0,6-1,5) N
147
lQDVSIACVY 6 (1-20) 1,4 0,8-3,0) N 1 (1-10) 1,0 (0,6-2,0) N
70
NTElYNlll 5 (1-15) 1,4 1,0-2,5) N 4 (1-10) 1,2 (0,6-2,0) N
71
ElDPVDllCY 6 (1-10) 1,4 0,8-2,0) N 1 (1-10) 0,9 (0,4-2,0) N
HLA-A02
52
FIYIPlFVI 3 (1-15) 1,1 (1,0-4,0) N 1 (1-10) 1,0 1,0-3,0) N 50 (40-65) 5,0 (3,5-7,5) S
73
YVVWDSIYVI 3 (1-10) 1,2 (1,0-2,0) N (1-5) 1,0 1,0-2,0 N 1 (1-5) 1,0 (1,0-2,0) N
49
KllEKllCI 1 (1-50) 1,0 1,0-11,0) S 3 (1-35) 1,5 (1,0-8,0) S 40 (10-100) 5,0 (2,0-6,0) S
50
YTNWKFIYl 1 (1-20) 1,0 1,0-2,0) N 1 (1-5) 1,0 (1,0-2,0) N 75 (65-170) 8,5 (7,5-9,5) S
54
KlTNKGICDl 5 (1-25) 2,0 (1,0-3,0) S 7 (1-57) 1,3 1,0-7,0) S 10 (10-105) 2,0 (2,0-6,3) S
72
TlYAHIQCl 1990 (1875-2185) 259,0 (76,0-438,0) S 1820 (1431-2369) 159,4 (64,6-387,0) S 780 (440-780) 79,0 (45,0-132 O) S
148
FAFTDlTIV 1 (1-5) 1,0 (1,0-2,0) N 1 (1-5) 1,0 1,0-2,0 N 100 (55-150) 8,5 (6,5-11,0) S
149
YQFAFKDlCI 3 (1-5) 1,1 (1,0-2,0) S 1 (1-30) 1,0 1,0-7,0 S 10 (5-85) 2,0 (2,0-9,5) S
150
TlQEIVlHl 5 1-42) 2,0 1,0-9,0) S 3 (1-35) 1,3 1,0-3,3 S 70 (35-310) 8,0 ( 8,0-32,0) S
74
SlVFllCFSV 1 1-10) 1,0 1,0-3,0) N 1 (1-5) 1,0 1,0-2,0 N 1 (1-1) 1,0 1,0-1,0) N
75
FllCFSVCl 1 1-10) 1,0 1,0-3,0) N 1 (1-5) 1,0 1,0-2,0 N 75 (70-85) 8,5 ( 8,0-18,0) S
51
FllCFCVll 8 1-30) 2,0 1,0-3,0) S 8 (1-18) 1,7 1,0-4,0 N 195 (100-236) 11, O 10,8-24,5) S
(continuación)
w
o
Ejemplo 4: Respuestas de recuerdo de los epítopos de HTL en mujeres infectadas de VPH
El propósito de este conjunto de experimentos es demostrar las respuestas de HTL humano de recuerdo in vitro en un panel de sujetos infectados de VPH para la selección final de epítopos de HTL comprendidos en los constructos poliepitópicos de VPH, usando un ensayo optimizado de proliferación de células T humanas.
5 La Tabla 10 que sigue da un resumen de los péptidos usados en el ensayo de proliferación de células T. Se enumeran las secuencias de péptidos y las fuentes. Todos los péptidos son disueltos en dimetilsulfóxido (DMSO) al 100% a una concentración de 5, 10 o 20 mg/ml y almacenados a -20·C. Se usaron los péptidos en el ensayo de proliferación de células T con una concentración final de 10 ¡.Ig/ml. Como antígeno de control positivo se usó toxoide tetánico (TI) a una concentración final de 3 ¡.Ig/ml.
10 Tabla 10
Secuencia
Fuente IDSEC
L YWYKTGISNISEVY
VPH16.E1.319 89
PEWIQRQTVLQHSFN
VPH16.E1.337 90
WKHMRLECAIYYKAR
VPH16.E2.033 91
LQAIELQL TLETIYN
VPH16.E2.070 92
GLYYVHEGIRTYFVQ
VPH16.E2.156 93
QRFHNIRGRWTGRCM
VPH16.E6.130 94
LDLQPETIDLYCYEQ
VPH16.E7.13 95
LCTELQTIIHDIILE
VPH16.E6.22 96
I RTLEDLLMGTLGIV
VPH16.E7.76 97
FKTLlQPFIL YAHIQ
VPH18.E1.258 98
IEFITFLGALKSFLK
VPH18.E1.458 99
FLNTVAIPDSVQILV
VPH18.E2.346 100
HKAIELQMALQGLAQ
VPH18.E2.074 101
EVFEFAFKDLFVVYR
VPH18.E6.43 102
LFVVYRDSIPHAACHK
VPH18.E6.52 103
TNTGL YNLLlRCLRCQ
VPH18.E6.94 104
FQQLFLNTLSFVCPW
VPH18.E7.86 105
NGWFYVEAVIDRQTG
VPH31.E1.15 106
PEWIERQTVLQHSFN
VPH31.E1.317 107
WKHIRLECVLMYKAR
VPH31.E2.033 108
TIPIIHLKGDANILK
VPH31.E2.292 109
TGRCIACWRRPRTET
VPH31.E6.132 110
VLDFAFTDL TIVYRD
VPH31.E6.42 111
IRILQELLMGSFGIV
VPH31.E7.76 112
PRKLHELSSALEIPY
VPH31.E6.9 113
DWVMAIFGVNPTV AEGF
VPH45.E1.228 114
FKTLlKPATLYAHIQ
VPH45. E1.244 115
PINISKSKAHKAIEL
VPH45.E2.67 116
TIPNSVQISVGYMTI
VPH45. E2.354 117
LCIVYRDCIAY AACH
VPH45.E6.52 118
FHSIAGQYRGQCNTC
VPH45.E6.127 119
EIVLHLEPQNELDPV
VPH45.E7.10 120
LRTLQQLFLSTLSFV
VPH45.E7.84 121
Se usaron PBMC procedentes de sujetos infectados con VPH, diagnosticados en el presente o anteriormente con neoplasia cervical intraepitelial (CIN) 1, 2 o 3, y, preferentemente, con genotipo de VPH, para determinar las respuestas de HTL específicas al VPH. Las PBMC se descongelaron siguiendo los procedimientos estándar para su uso en el ensayo de proliferación de células T.
15 Las muestras de PBMC procedentes de sujetos infectados con VPH fueron estudiadas en busca de respuestas de recuerdo de HTL in vitro hacia todo el panel de péptidos de HTL usando un ensayo de proliferación de células T. Brevemente, se sembraron 5x104 células/pocillo en réplicas quíntuples en placas de fondo redondo en RPMI total (= RPMlbic + aminoácidos no esenciales (NEAA) + piruvato de sodio + gentamicina + beta mercapto etanol (j3ME)), complementado con suero de AB humana (ihuAB) inactivada por el calor al 5% e incubadas con 10 ¡.Ig/ml de péptido
20 de HTL o 3 ¡.Ig /ml de TI durante 6 días en una incubadora de C02 a 37·C. Tras este periodo de incubación, se añadió 3 H-timidina (1 ¡.ICi/pocillo)¡,ara la marcación durante la noche (18 horas). A continuación, se recolectaron las células y se midió la cantidad de H-timidina incorporada. Se incluyó TI como control positivo, ya que se supone que la mayor parte de la gente muestra una respuesta hacia este antígeno. Además, se sembraron células procedentes de una muestra sana de PBMC de control (5x104 células/pocillo, réplicas quíntuples) y fueron estimuladas con TI y varicela-zóster para tener un control de ensayo interno en cada placa y evaluar la variabilidad entre ensayos y dentro de cada uno.
Análisis de los datos -Se recogen todos los puntos de datos sin procesar, y los valores calculados y documentados en una base de datos Excel por grupo experimental.
-
La magnitud de la respuesta específica al antígeno determinada en el ensayo de proliferación de células T se expresa como índice de estimulación (la mediana de cpm de cultivos estimulados/no estimulados) y el cpm delta (el valor de la mediana de cpm de los pocillos estimulados restado del valor de la mediana de cpm de los pocillos no estimulados).
-
Se considera que una respuesta es positiva cuando los valores de cpm delta ~ 200 cpm y el índice de
estimulación es ~ 2. En la Figura 9 se muestran las respuestas positivas más altas por epítopo de HTL (únicamente los valores del lE). Estos datos demuestran claramente que -aunque se sometieron a ensayo únicamente en un conjunto limitado de muestras sanguíneas procedentes de pacientes infectados con VPH-, la reactividad de las células T puede ser detectada para la mayoría de los epítopos de HTL seleccionados.
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<213> VPH
<400> 3
Ser Thr Asp Leu Arg Asp His 11e Asp Tyr 1 5 10
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400>4
Lys Ser Ala 11e Val Thr Leu Thr Tyr 1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 5
11e Ser Asp Tyr Arg His Tyr Cys Tyr 1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 6
Cys Leu Tyr Leu His 11e Gln Ser Leu 1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH <400> 7
Lys Leu Leu Ser Lys Leu Leu Cys Val 1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 8
Phe Val Tyr Ile Pro Leu Phe Leu Ile
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 9
Thr Leu His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val 1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 10
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Val 1 5 10
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 11
Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Val 1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 12
Val Val Leu Leu Leu Val Arg Tyr Lys 1 5
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 13
Ser Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Trp Tyr Lys 1 5 10
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH 35
<400> 14
Ala Thr Met Cys Arg His Tyr Lys Arg 1 5
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 15
Lys Ser Leu Phe Gly Met Ser Leu Met Lys 1 5 10
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<211> 9
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<213> VPH
<400> 16
Ser Val Ile Cys Phe Val Asn Ser Lys
1 5
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<211> 9
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<213> VPH
<400> 17
Ala Ala Thr Lys Tyr Pro Leu Leu Lys
1 5
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<211> 9
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<213> VPH
<400> 18
Leu Tyr Gly Val Ser Phe Ser Glu Leu
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 19
Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Phe
1 5
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> VPH
<400> 20
Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile 1 5 10
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
36 <400> 21
Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Phe 1 5
<210> 22
<211> 9
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<213> VPH
<400> 22
Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Phe 1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 23
Gly Thr Gly Cys Asn Gly Trp Phe Tyr 1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 24
Leu Gln Asp Lys Ile Ile Asp His Tyr 1 5
<210> 25 <211>10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 25
Ala Thr Cys Val Ser His Arg Gly Leu Tyr 1 5 10
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> VPH
<400> 26
Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr 1 5 10
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 27
Ile Leu Tyr Ala His Ile Gln Cys Leu
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400>
28
<400>
35
Val Ala 1
Trp Asp Ser Val 5 Tyr Tyr Met
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<400> 29
Thr Val 1
Tyr Val Phe 5 Cys phe Leu Leu
<210> 30 <211>10 <212> PRT <213> VPH
<400> 30
Ser 1
Leu Gln Asp Ile Glu 5 Ile Thr Cys Val 10
<210> 31 <211>10 <212> PRT <213> VPH
<400> 31
Lys 1
Leu Thr Asn Thr Gly 5 Leu Tyr Asn Val 10
<210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> VPH
<400> 32
Lys Gln Gly Ala Met 1 5
Leu Ala Val Phe Lys 10
<210> 33 <211>9 <212> PRT <213> VPH
<400> 33
Thr Val 1
Ser Ala Thr Gln 5 Leu Val Lys
<210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> VPH
<400> 34
Ser Thr Val 1
Ser Val 5 Gly Thr Ala Lys
<210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> VPH
38
Gln Val Val
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 36
Phe Val Val
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<211> 10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 37
Asp Ser Val
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 38
Ala Thr Leu
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 39
Ser Tyr Phe 1
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 40
Tyr Tyr Met
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 41
Gly Tyr Asn
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
Pro Ala Tyr Asn Ile Ser Lys 5 la
Tyr Arg Asp Ser Ile Pro Lys 5 la
Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Arg 5 la
Gln Asp Ile Val Leu His 5
Gly Met Ser Phe Ile His Phe 5 la
Thr Asp Ala Gly Thr Trp 5
Thr Phe Tyr Ile Glu Phe 5
<400> 42
Met Tyr Val Cys Cys His Val Pro Leu 1 5
<210> 43 <211>10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 43
Val Tyr Val Phe Cys Phe Leu Leu Pro Met 1 5 la
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 44
Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Phe 1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 45
Val Met Asp Asp Ser Glu Ile Ala Tyr 1 5
<210> 46
<211> 9
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<213> VPH
<400> 46
Leu Ser Ser Ala Leu Glu Ile Pro Tyr 1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 47
Ala Phe Thr Asp Leu Thr Ile Val Tyr 1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400>48
Gln Thr Glu Pro Asp Thr Ser Asn Tyr 1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 49
Lys Leu Leu Glu Lys Leu Leu Cys Ile
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 50
Tyr Thr Asn Trp Lys Phe Ile Tyr Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 51
Phe Leu Leu Cys Phe Cys Val Leu Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 52
Phe Ile Tyr Ile Pro Leu Phe Val Ile
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 53
Phe Leu Phe Thr Asp Leu Thr Ile Val
1 5
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 54
Lys Leu Thr Asn Lys Gly Ile Cys Asp Leu 1 5 10
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 55
Met Val Met Leu Met Leu Val Arg Phe Lys 1 5 10
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 56
Ser Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Trp Tyr Arg 1 5 10
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 57
Ile Ser Phe Ala Gly Ile Val Thr Lys 1 5
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 58
Ala Thr Thr Pro Ile Ile Bis Leu Lys 1 5
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 59
Lys Val Ser Glu Phe Arg Trp Tyr Arg Tyr 1 5 10
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 60
Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Arg
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 61
Pro Tyr Leu Bis Ser Arg Leu Val Val Phe 1 5 10
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 62
Val Phe Thr Phe Pro Asn Pro Phe Pro Phe 1 5 10
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH 42
<400> 63
His Tyr Thr Asn Trp Lys Phe Ile Phe
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 64
Val Val Phe Ile Tyr Ile Pro Leu Phe
1 5
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 65
Phe Tyr Ser Lys Val Ser Glu Phe Arg Trp 1 5 10
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 66
Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Lys Leu 1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 67
Leu Gln Asp Lys Ile Leu Asp His Tyr 1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 68
Asn Thr Gly Ile Leu Thr Val Thr Tyr 1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 69
Leu Thr Asp Val Ser Ile Ala Cys Val Tyr 1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
43 <400> 70
Asn Thr Glu Leu Tyr Asn Leu Leu Ile 1 5
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<212> PRT
<213> VPH
<400> 71
Glu Leu Asp Pro Val Asp Leu Leu Cys Tyr 1 5 10
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 72
Thr Leu Tyr Ala His Ile Gln Cys Leu
1 5
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<212> PRT
<213> VPH
<400> 73
Tyr Val Val Trp Asp Ser Ile Tyr Tyr Ile 1 5 10
<210> 74 <211>10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 74
Ser Leu Val Phe Leu Leu Cys Phe Ser Val 1 5 10
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<211> 9
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<213> VPH
<400> 75
Phe Leu Leu Cys Phe Ser Val Cys Leu
1 5
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<212> PRT
<213> VPH
<400> 76
Tyr Gln Phe Ala Phe Lys Asp Leu Cys Val 1 5 10
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 77
Thr Leu Gln Glu Ile Val Leu His Val
1 5
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<211> 9
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<213> VPH
<400> 78
Ala Val Met Cys Arg His Tyr Lys Arg 1 5
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<212> PRT
<213> VPH
<400> 79
Arg Gln Met Asn Met Ser Gln Trp Ile Lys 1 5 10
<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 80
Ser Thr Trp His Trp Thr Gly Cys Asn Lys 1 5 10
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 81
Val Thr Thr Arg Tyr Pro Leu Leu Arg 1 5
<210> 82 <211>10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 82
Arg Thr Glu Val Tyr Gln Phe Ala Phe Arg 1 5 10
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 83
Ser Val Tyr Gly Glu Thr Leu Glu Lys 1 5
<210> 84 <211>10
<212> PRT
<213> VPH
45 <400> 84
Val Phe Thr Phe Pro His Ala Phe Pro Phe 1 5 10
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 85
Tyr Tyr 11e Thr Glu Thr Gly Ile Trp 1 5
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<211> 10
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<213> VPH
<400> 86
Val Tyr Val Cys Ala Phe Ala Trp Leu Leu 1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> VPH
<400> 87
Val Tyr Gln Phe Ala Phe Lys Asp Leu 1 5
<210> 88
<211> 10
<212> PRT
<213> VPH
<400> 88
Phe Tyr Ser Arg 11e Arg Glu Leu Arg Phe 1 5 10
<210> 89 <211>15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 89
Leu Tyr Trp Tyr Lys Thr Gly Ile Ser Asn Ile Ser Glu Val Tyr 1 5 10 15
<210> 90
<211> 15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 90
Pro Glu Trp 11e Gln Arg Gln Thr Val Leu Gln His Ser Phe Asn 1 5 10 15
<210> 91
<211> 15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 91
Trp Lys His Met Arg Leu Glu Cys Ala Ile Tyr Tyr Lys Ala Arg 1 5 10 15
<210> 92 <211>15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 92
Leu Gln Ala Ile Glu Leu Gln Leu Thr Leu Glu Thr Ile Tyr Asn 1 5 10 15
<210> 93 <211>15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 93
Gly Leu Tyr Tyr Val His Glu Gly Ile Arg Thr Tyr Phe Val Gln 1 5 10 15
<210> 94 <211>15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 94
Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met 1 5 10 15
<210> 95
<211> 15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 95
Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln 1 5 10 15
<210> 96
<211> 15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 96
Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu 1 5 10 15
<210> 97 <211>15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 97
Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val 1 5 10 15
<210> 98 <211>15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 98
Phe Lys Thr Leu Ile Gln Pro Phe Ile Leu Tyr Ala His Ile Gln
1 5 10 15
<210> 99
<211> 15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 99
Ile Glu Phe Ile Thr Phe Leu Gly Ala Leu Lys Ser Phe Leu Lys
1 5 10 15
<210> 100 <211>15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 100
Phe Leu Asn Thr Val Ala Ile Pro Asp Ser Val Gln Ile Leu Val
1 5 10 15
<210> 101 <211>15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 101
His Lys Ala Ile Glu Leu Gln Met Ala Leu Gln Gly Leu Ala Gln 1 5 10 15
<210> 102 <211>15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 102
Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg 1 5 10 15
<210> 103 <211>16
<212> PRT
<213> VPH
<400> 103
Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala Cys His Lys 1 5 10 15
<210> 104 <211>16
<212> PRT
<213> VPH
<400> 104
Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln 1 5 10 15
<210> 105 <211>15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 105
Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro Trp 1 5 10 15
<210> 106
<211> 15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 106
Asn Gly Trp Phe Tyr Val Glu Ala Val Ile Asp Arg Gln Thr Gly 1 5 10 15
<210> 107 <211>15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 107
Pro Glu Trp Ile Glu Arg Gln Thr Val Leu Gln His Ser Phe Asn 1 5 10 15
<210> 108 <211>15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 108
Trp Lys His Ile Arg Leu Glu Cys Val Leu Met Tyr Lys Ala Arg 1 5 10 15
<210> 109
<211> 15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 109
Thr Thr Pro Ile Ile His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Ile Leu Lys 1 5 10 15
<210> 110 <211>15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 110
Thr Gly Arg Cys Ile Ala Cys Trp Arg Arg Pro Arg Thr Glu Thr 1 5 10 15
<210> 111 <211>15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 111
Val Leu Asp Phe Ala Phe Thr Asp Leu Thr Ile Val Tyr Arg Asp 1 5 10 15
<210> 112 <211>15
<212> PRT
<213> VPH
49 <400> 112
Ile Arg Ile Leu Gln Glu Leu Leu Met Gly Ser Phe Gly Ile Val 1 5 10 15
<210> 113
<211> 15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 113
Pro Arg Lys Leu His Glu Leu Ser Ser Ala Leu Glu Ile Pro Tyr 1 5 10 15
<210> 114
<211> 17
<212> PRT
<213> VPH
<400> 114
Asp Trp Val Met Ala Ile Phe Gly Val Asn Pro Thr Val Ala Glu Gly Phe 1 5 10 15
<210> 115
<211> 15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 115
Phe Lys Thr Leu Ile Lys Pro Ala Thr Leu Tyr Ala His Ile Gln 1 5 10 15
<210> 116
<211> 15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 116
Pro Ile Asn Ile Ser Lys Ser Lys Ala His Lys Ala Ile Glu Leu 1 5 10 15
<210> 117
<211> 15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 117
Thr Ile Pro Asn Ser Val Gln Ile Ser Val Gly Tyr Met Thr Ile 1 5 10 15
<210> 118
<211> 15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 118
Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Cys Ile Ala Tyr Ala Ala Cys His 1 5 10 15
<210> 119
<211> 15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 119
Phe His Ser 11e Ala Gly Gln Tyr Arg Gly Gln Cys Asn Thr Cys 1 5 10 15
<210> 120 <211>15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 120
G1u 11e Val Leu His Leu Glu Pro Gln Asn Glu Leu Asp Pro Val 1 5 10 15
<210> 121 <211>15
<212> PRT
<213> VPH
<400> 121
Leu Arg Thr Leu Gln Gln Leu Phe Leu Ser Thr Leu Ser Phe Val 1 5 10 15
<210> 122
<211> 13
<212> PRT
<213> VPH
<400> 122
Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1 5 10
<210> 123
<211> 894
<212> PRT
<213> artificial
<400> 123
Met Gly Met Gln Val Gln 11e Gln Ser Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15
Val Pro Gly Ser Arg Gly Ala Phe Thr Asp Leu Thr 11e Val Tyr Asn 20 25 30
Ser Thr Trp His Trp Thr Gly Cys Asn Lys Lys Ala Ala Ala Lys Leu 35 40 45
Leu Glu Lys Leu Leu Cys 11e Asn Ala Tyr Gln Phe Ala Phe Lys Asp 50 55 60
Leu Cys Val Lys Met Val Met Leu Met Leu Val Arg Phe Lys Asn Ala 65 70 75 80
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<400> 162
Ala Thr Cys Val Ser His Arg Gly Leu Tyr Asn Ala Ala Ser Thr Asp 1 5 10 15
Leu Arg Asp His Ile Asp Tyr Asn Ala Ala Ala Ala Thr Met Cys Arg 20 25 30
His Tyr Lys Arg Asn Ala Ile Leu Tyr Ala His Ile Gln Cys Leu Asn 35 40 45
Ala Ala Ala G1y Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Val Asn Ala Ala Ala 50 55 60
Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Phe Lys Ala Ala Ala Asp Ser Val 65 70 75 80
Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Arg Asn Gln Val Val Pro Ala Tyr Asn Ile 85 90 95
Ser Lys Asn Ala Ala Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Phe Lys Ala 100 105 110
Ala Phe Val Tyr Ile Pro Leu Phe Leu Ile Asn Tyr Tyr Met Thr Asp 115 120 125
Ala Gly Thr Trp Gly Ala Val Val Leu Leu Leu Val Arg Tyr Lys Asn 130 135 140
Ala Ala I1e Ser Asp Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Lys Ala Ala Thr Val 145 150 155 160
Ser Ala Thr Gln Leu Val Lys Lys Ala Ser Thr Ala Ala Ala Leu Tyr 165 170 175
Trp Tyr Lys Lys Ala Ala Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro Lys 180 185 190
Asn Ala Ser Tyr Phe Gly Met Ser Phe Ile His Phe Lys Ala Ala Tyr 195 200 205
Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Val Asn Ala Ala Val Tyr Asp Phe 210 215 220
Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Lys Ala Ala Leu Gln Asp Lys I1e Ile 225 230 235 240
Asp His Tyr Lys Ala Ala Thr Leu His Asp I1e I1e Leu Glu Cys Val 245 250 255
Lys Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Val Gly Ala Ala Ala Ser 260 265 270
Val Ile Cys Phe Val Asn Ser Lys Gly Ala Ala Ala Met Tyr Val Cys 275 280 285
Cys His Val Pro Leu Asn Ala Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys 290 295 300
Val Lys Cys Leu Tyr Leu His Ile Gln Ser Leu Asn Ala Ala Thr Lys 305 310 315 320
Tyr Pro Leu Leu Lys Asn Val Tyr Val Phe Cys Phe Leu Leu Pro Met 325 330 335
Asn Ala Lys Gln Gly Ala Met Leu Ala Val Phe Lys Lys Ala Ala Leu 340 345 350
Ser Gln Met Val Gln Trp Ala Tyr Lys Ala Ala Pro Tyr Ala Val Cys 355 360 365
Asp Lys Cys Phe Lys Ala Ala Thr Val Tyr Val Phe Cys Phe Leu Leu 370 375 380
Asn Ala Ala Ala Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Gly Ala Lys 385 390 395 400
Ser Leu Phe Gly Met Ser Leu Met Lys Asn Gly Thr Gly Cys Asn Gly 405 410 415
Trp Phe Tyr Asn Ala Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Phe Lys Ala 420 425 430
Ala Lys Leu Leu Ser Lys Leu Leu Cys Val Asn Ala Ala Ala Ser Thr 435 440 445
Val Ser Val Gly Thr Ala Lys Asn Val Ala Trp Asp Ser Val Tyr Tyr 450 455 460
Met Lys Ala Ala Ala Gly Tyr Asn Thr Phe Tyr Ile Glu Phe Lys Ala 465 470 475 480
Ala Ala Leu Tyr Gly Val Ser Phe Ser Glu Leu Lys Gln Val Asp Tyr 485 490 495
Tyr Gly Leu Tyr Tyr Asn Ala Ala Lys Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr 500 505 510
Tyr Lys Ala Ala Ala Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr 515 520 525
Asn Ala Gly Leu Tyr Tyr Val His Glu Gly I1e Arg Thr Tyr Phe Val 530 535 540
Gln Gly Pro Gly Pro Gly Phe Leu Asn Thr Val Ala Ile Pro Asp Ser 545 550 555 560
Val Gln Ile Leu Val Gly Pro Gly Pro G1y Gln Arg Phe His Asn Ile 565 570 575
Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Gly Pro Gly Pro Gly Thr Asn 580 585 590
Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Gly Pro 595 600 605
Gly Pro G1y Ile Glu Phe Ile Thr Phe Leu Gly Ala Leu Lys Ser Phe 610 615 620
Leu Lys G1y Pro Gly Pro Gly Pro Glu Trp Ile Gln Arg Gln Thr Val 625 630 635 640
Leu Gln His Ser Phe Asn Gly Pro Gly Pro Gly Leu Phe Val Val Tyr 645 650 655
Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala Cys His Lys Gly Pro Gly Pro Gly 660 665 670
Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly 675 680 685
Pro Gly Pro Gly Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys 690 695 700
Tyr Glu Gln Gly Pro Gly Pro Gly Leu Gln Ala Ile Glu Leu Gln Leu 705 710 715 720
Thr Leu Glu Thr Ile Tyr Asn Gly Pro Gly Pro Gly Phe Gln Gln Leu 725 730 735
Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro Trp Gly Pro Gly Pro Gly 740 745 750
Trp Lys His Met Arg Leu Glu Cys Ala Ile Tyr Tyr Lys Ala Arg Gly 755 760 765
Pro Gly Pro Gly Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile 770 775 780
Ile Leu Glu Gly Pro Gly Pro Gly Phe Lys Thr Leu Ile Gln Pro Phe 785 790 795 800
Ile Leu Tyr Ala His Ile Gln Gly Pro Gly Pro Gly Leu Tyr Trp Tyr 805 810 815
Lys Thr Gly Ile Ser Asn Ile Ser Glu Val Tyr Gly Pro Gly Pro Gly 820 825 830
Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Gly 835 840 845
Pro Gly Pro Gly His Lys Ala Ile Glu Leu Gln Met Ala Leu Gln Gly 850 855 860
Leu Ala Gln Gly Pro Gly Pro Gly Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr 865 870 875 880
Leu Lys Ala Ala Ala 885
<210> 163
<211> 2655
<212> ADN
<213> artificial
<400> 163
gccacctgcg tgagccacag gggcctctac aacgccgcca gcaccgacct gcgggaccac 60 atcgactaca atgctgctgc cgctacaatg tgccggcact acaagcggaa cgccatcctg 120 tacgcccaca tccagtgcct gaatgctgcc gctggcacac tgggcatcgt gtgccccgtg 180 aatgccgccg cctgctacag cctgtacggc accaccttca aggccgctgc cgactccgtg 240 tacggcgaca ccctggaacg gaaccaggtg gtgcccgcct acaacatctc taagaatgcc 300 gctctgtaca acctgctgat ccggtgcttt aaggctgcct tcgtgtacat ccccctgttt 360 ctgatcaact actacatgac cgacgccggc acatggggag ccgtggtgct gctgctggtg 420 cggtacaaga atgccgccat cagcgactac cggcactact gctacaaggc cgccaccgtc 480 agcgccaccc agctggtgaa gaaggccagc acagccgccg ctctctattg gtataaaaaa 540 gccgcctttg tggtgtaccg ggacagcatc cccaagaacg ccagctactt cggcatgagc 600 ttcatccact tcaaagccgc ctacatgctg gacctccagc ccgagaccgt gaacgctgcc 660 gtgtacgact tcgccttccg ggacctgtgc attaaagccg cactccagga caagatcatc 720 gaccattata aagcagccac cctgcatgat attattctgg aatgcgtgaa gaagctgacc 780 aacaccggcc tctataacgt gggagccgcc gcctctgtga tctgcttcgt gaacagcaag 840 ggggctgccg ccatgtatgt gtgctgccac gtgcccctga acgcctctct ccaggatatt 900 gagatcacct gtgtgaagtg cctgtacctg cacattcagt ctctgaatgc cgccaccaag 960 taccccctgc tgaagaacgt gtatgtcttt tgcttcctgc tgcccatgaa cgccaagcag 1020 ggcgccatgc tggccgtgtt caaaaaggcc gccctgagcc agatggtgca gtgggcctac 1080 aaagccgccc cttacgccgt gtgcgacaag tgttttaagg ccgccacagt gtacgtgttt 1140 tgttttctgc tgaatgccgc tgccgccacc ctccaggaca tcgtgctgca cggcgccaag 1200 tccctgttcg gcatgtccct gatgaagaat ggcaccggct gcaacggctg gttctacaac 1260 gcccggttcc acaacatccg gggcaggttt aaagccgcca agctgctgtc taagctgctg 1320 tgtgtgaacg ccgccgcttc caccgtgagc gtgggcaccg ccaagaacgt ggcctgggac 1380 agcgtgtact acatgaaagc agcagccggg tacaacacct tctacatcga gtttaaagct 1440 gccgccctgt acggcgtgag cttcagcgag ctgaagcagg tggactacta cggcctgtac 1500
tataacgccg ccaagagcgc catcgtgacc ctgacctata aagccgccgc cacactggaa 1560 aagctgacca atacagggct gtacaatgcc ggcctgtatt acgtgcacga gggcatccgg 1620 acctacttcg tgcagggccc agggccaggc ttcctgaaca ccgtggccat ccccgactcc 1680 gtgcagatcc tggtcggccc aggaccaggg cagcggttcc acaatatcag aggccggtgg 1740 5 accggcagat gcatgggccc aggacctggc acaaataccg gactgtataa tctgctgatt 1800 cgctgcctgc ggtgccaggg tccaggacca ggcatcgagt ttatcacctt tctgggcgcc 1860 ctgaagagct tcctgaaagg acctggacca ggacccgagt ggattcagcg gcagaccgtg 1920 ctccagcaca gcttcaacgg acccggaccc ggcctgttcg tggtgtacag agactccatc 1980 ccccacgccg cctgtcacaa gggacctgga ccaggcatca ggaccctgga ggacctgctg 2040 10 atgggcaccc tgggcattgt ggggcctgga cctggactgg atctccagcc tgaaaccacc 2100 gacctgtact gctacgagca ggggccagga cctgggctcc aggctatcga actccagctg 2160 accctggaaa ccatctacaa tggccccgga ccaggcttcc agcagctgtt cctgaatacc 2220 ctgagcttcg tgtgcccttg gggaccaggg cccggatgga agcacatgcg gctggaatgc 2280 gccatctact acaaggccag aggcccagga cccggactgt gcaccgaact ccagaccacc 2340 15 atccacgaca tcattctgga aggaccaggg ccaggcttta agaccctgat ccagcccttc 2400 attctgtatg cccacattca gggacctggg cctggcctgt attggtataa gaccggcatc 2460 agcaacatct ccgaggtgta cgggcctgga ccaggcgagg tgttcgagtt cgccttcaag 2520 gatctgtttg tggtgtatag aggccccgga cctggccaca aggccattga actccagatg 2580 gccctccagg ggctggccca gggaccaggc cctggcgcca agttcgtggc cgcctggacc 2640 20 ctgaaagccg ccgcc 2655

Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un constructo poliepitópico aislado que comprende
    a) epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) del virus del papiloma humano (VPH) caracterizados por las ID SEC N°S 1 a 44, y/o
    b) los epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) del virus del papiloma humano (VPH) caracterizados por las ID SEC N°S 1,23,39 Y 45 a 88.
  2. 2.
    El constructo poliepitópico según la reivindicación 1 que comprende los epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) del virus del papiloma humano (VPH) caracterizados por las ID SEC N°S 1 a 88.
  3. 3.
    El constructo poliepitópico según las reivindicaciones 1 o 2 que, además, comprende al menos un epítopo de linfocitos T colaboradores (HTL) del virus del papiloma humano (VPH).
  4. 4.
    El constructo poliepitópico según la reivindicación 3 en el que al menos un epltopo de linfocitos T colaboradores (HTL) del virus del papiloma humano (VPH) se selecciona del grupo consistente en las ID SEC N°S 89 a 121.
  5. 5.
    El constructo poliepitópico según la reivindicación 4 en el que el constructo poliepitópico de (a) comprende los epítopos de linfocitos T colaboradores (HTL) del virus del papiloma humano (VPH) caracterizados por las ID SEC N°S 89 a 105 y en el que el constructo poliepitópico de (b) comprende los epítopos de linfocitos T colaboradores (HTL) del virus del papiloma humano (VPH) caracterizados por las ID SEC N°S 106 a 121.
  6. 6.
    El constructo poliepitópico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que, además, comprende un epítopo de células T universales que se enlaza con más de una molécula HLA-DR de clase 11.
  7. 7.
    El constructo poliepitópico según la reivindicación 6 en el que el epítopo de células T universales está caracterizado por la ID SEC N° 122.
  8. 8.
    El constructo poliepitópico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por ID SEC N° 156, ID SEC N° 158, ID SEC N° 160, ID SEC N° 162, ID SEC N° 123, ID SEC N° 125, ID SEC N° 127 o ID SEC N° 129.
  9. 9.
    Un polinucleótido aislado que comprende un constructo de polinucleótidos que codifica el constructo poliepitópico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  10. 10.
    El polinucleótido según la reivindicación 9 en el que el constructo de polinucleótidos comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por ID SEC N° 157, ID SEC N° 159, ID SEC N° 161, ID SEC N° 163, ID SEC N° 124, ID SEC N° 126, ID SEC N° 128 o ID SEC N° 130.
  11. 11.
    Un vector que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10.
  12. 12.
    El vector según la reivindicación 11 en el que dicho vector es un vector de expresión, siendo preferentemente dicho vector de expresión un ADN de vector viral o plasmídico.
  13. 13.
    El vector según la reivindicación 12 en el que dicho vector viral es un virus vaccinia, siendo preferentemente dicho virus vaccinia MVA.
  14. 14.
    Una célula que comprende el constructo polipeptídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el constructo de polinucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.
  15. 15.
    Una composición que comprende el constructo polipeptídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el constructo de polinucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, o cualquier combinación de los mismos, y un excipiente farmacéutica mente aceptable.
  16. 16.
    El constructo polipeptídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el constructo de polinucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, o cualquier combinación de los mismos, para su uso como medicamento.
  17. 17.
    El constructo polipeptídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el constructo de polinucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, o cualquier combinación de los mismos, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una infección de VPH.
  18. 18.
    El constructo polipeptídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el constructo de polinucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, o cualquier combinación de los mismos, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad relacionada con el VPH.
    A
    A ATCVSHRGLY -STDLRDHI DY -ATMCRHYKR -I LYAH I QC L GT LG I VCPV -CYSLYGTTF -DSVYGDT LER -QVVPAYN I SK
    LYNLLI RCF FVYI PLFLI -YYMTDAGTW -VVLLLVRYK -I SDYRHYCY
    TVSATQLVK -STAAALYWYK -FVVYRDSI PK -SYFGMSFI HF YMLDLQPETV VYDFAFRDLC I -LQDKII DHY -TLHDI I LECV KLTNTGLYNV SVICFVNSK -MYVCCHVPL -SLODI E I TCV CLYLH IQSL -AATKYPLLK -VYVFCFLLPM -KQGAMLAVFK LSQMVQWAY PYAVCDKCF TVYVFCFLL -AT LQD I V LH
    KSLFGMSLMK GTGCNGWFY RFHN I RGRF -KLLSK LLCV STVSVGTAK VAWDSVYYM -GYNTFYI EF -LYGVSFSEL -QVDYYGLYY KSAIVTLTY -TLEKLTNTGLY
    GLYYVHEGIRTYFVQ -FLNTVA I PDSVQI LVQRFH N I RGRWTGRCMTNTGLYN LLI RC LRCQ I EFITFLGALKSFLK PEWIQRQTVLQHSFN
    LFVVYRDS I PHAACHK -IRTLEDLLMGTLGIVLDLQP ETTDLYCYEQ
    LQAI EL QLTLETIYN FQQLFLNTLSFVCPW WKHMRLECAIYYKAR
    LCTELQTTIHDI I LE -FKTLIQPFI LYAHIQ -LYWYKTG I SN I SEVY
    EV FEFAFKDLFVVYR -HKAI ELQMALOGLAQ -AKFVAAWT LKAAA
    FIGURA 1
    FIGURA 5
    A. Secuencia de aminoicidos ICCG6137
    MGMQVQIQSLFL LLUNPGSRGAFTD LT I VYNSTWHWTGCN KKAAAKLLEKL LC I NA YQFAFKDLCVKMVMLMLVRFKNAALQDKI LDHYKAAFLLCFCVLLNSVYGTTLERNA AVTTRYPLLRNATLQE I VLHVNYYI TETGIWKVVFI YI PLFNQTEPDTSNYGAAELD PVD LLCYKAAA LTDVS IACVYNAARTEVYQFAFRNPYLHSR LVVFN I SFAGIVTKKV MDDSE IAYNAFYSRIRELRFKAAAFIYIPLFVIKAVFTFPHAFPFNAFYSKVSEFRW
    KSLVFLLCFSVNASTAAALYWYRKATLYAH I QC LNAAHYTNWKFI FNAANTE LYN LL I NASYFGMSFI H FKLTNKG I CDLNSVYGET LEKNVYVCAFAWL LNVYGTTLEKLKLS QMVQWAYKAAAYVVWDSIYYI NGTGCNGWFYGAAAVMCRHYKRNFLLCFSVC LNAVY QFAFKDLKAAKVSE FRWYRYKYTNWKFIYLNAALSSA LE I PYKAAFLFTD LT I VNAA TTP I I HLKNAAARQMNMSQWIKNTG I LTVTYNVFTFPNPFPFKAAAE IVLHLEPQNE LDPVGPGPG I RI WEL LMGSFG I VG PGPGTGRCI ACWRRPRTETGPG PGWKH I RLEC VLMYKARGPGPG LC I VYRDC IAYAACHGPGPGPEWI ERQTVLQHSFNGPGPGPIN I S KSKAH KA I E LGPGPG LRT LQQLFLSTLSFVG PGPGFHS I AGQYRGQCNTCGPGPGTT PI I HLKGDAN I LKGPGPGDWVMAI FGVNPTVAEGFGPGPGPRK LH ELSSALEIPYGP GPGFKTLI KPATLYAH I QGPGPGTI PNSVQ I SVGYMT I GPGPGNGWFYVEAVI DRQT GGPGPGV LDFA FTD LT I VYRDGPGPGAKFVAAWT LKAAA
    ( ID SEC N° 123)
    B. Secuencia de ADN ICCG6137
    ATGGGCATGCAGGTGCAGATCCAGAGCCTGT TCCTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGC AGCAGGGGCGCTTTCACCGACCTGACCATCGTGTACAACAGCACCTGGCACTGGACC GGCTGCAACAAGAAAGCCGCTGCCAAGCTGCTGGAAAAGCTGCTGTGCATCAACGCC TATCAGTTTGCCTTCAAGGACCTGTGCGTGAAGATGGTGATGCTGATGCTGGTGCGG TTCAAGAATGCCGCTCTCCAGGACAAGATCCTGGACCACTACAAGGCCGOCTTTCTG CTGTGCTTCTGCGTGCTGCTGAACAGCGTGTACGGCACCACCCTGGAACGGAACGCC GCCGTGACCACCAGATACCCCCTGCTGCGGAATGCCACCCTCCAGGAAATCGTCCTG CACGTCAATTACTACATCACCGAGACCGGCATCTGGAAGGTGGTGTTCATCTACATC CCCCTGTTCAACCAGACCGAGCCCGACACCAGCAACTACGGAGCCGCCGAACTCGAT CCCGTGGACCTGCTGTGCTACAAAGCCGCTGCCCTGACCGACGTGAGCATCGCCTGC GTGTACAACGCCGCCAGGACCGAGGTGTACCAGMGCCTTTCGGAACCCCTACCTG CACAGCAGACTGGTGGTGTTTAACATCAGCTTCGCCGGCATCGTGACCAAGAAAGTG ATGGACGACAGCGAGATCGCCTACAACGCCTTCTACAGCCGGATCAGAGAGCTGAGG TTCAAAGCCGCTGCCTTTATCTACATTCCTCTGTTCGTGATCAAGGCCGTGTTCACC TTCCCCCACGCCITCCCTTTCAATGCCTTCTACTCCAAGGTGTCCGAGTTCCGGTGG AAGAGCCTGGTGTTCCTGCTGTGTTTCAGCGTGAACGCCAGCACCGCCGCTGCCCTG TACTGGTACAGGAAGGCCACCCTGTACGCCCATATCCAGTGCCTGAATGCCGCCCAC TACACCAACTGGAAGTTCATCTTCAATGCCGCCAACACCGAGCTGTACAACCTGCTG ATCAACGCCAGCTACTTCGGCATGAGCTTCATCCACTTCAAGCTGACCAACAAGGGC ATCTGCGACCTGAACTCCGTGTACGGCGAGACACTGGAAAAGAACGTGTACGTGTGC GCCTTCGCCTGGCTGCTGAACGTGTATGGCACAACACTGGAAAAACTGAAGCTGTCC CAGATGGTGCAGTGGGCCTATAAAGCCGCCGCCTACGTGGTGTGGGACAGCATCTAC TATATCAACGGCACCGGCTGTAACGGCTGGTTTTACGGCGCCGCTGCCGTGATGTGC CGGCACTACAAGCGGAATTTTCTGCTGTGTTTTTCCGTGTGCCTGAACGCCGTGTAT CAGTTCGCCTTTAAGGATCTGAAGGCTGCCAAAGTGTCTGAGTTCAGATGGTACAGG TACAAGTACACAAATTGGAAGTTTATCTATCTGAACGCCGCCCTGAGCAGCGCCCTG GAAATCCCCTATAAGGCTGCCTTCCTGTTCACCGATCTGACTATTGTGAACGCCGCC ACCACCCCCATCATCCACCTGAAAAACGCCGCTGCCAGGCAGATGAACATGAGCCAG TGGATCAAGAACACCGGCATCCTGACCGTGACCTACAACGTGTTTACCTTTCCCAAC CCTTTCCCCTTTAAAGCCGCTGCCGAGATCGTGCTGCACCTGGAACCCCAGAACGAG CTGGACCCTGTGGGCCCTGGCCCTGGCATCAGAATCCTCCAGGAACTGCTGATGGGC AGCTICGGCATCGTGGGCCCAGGCCCCGGAACCGGCCGGTGCATCGCCTGTTGGCGG AGGCCCCGGACCGAGACAGGCCCTGGACCCGGCTGGAAGCACATCCGGCTGGAATGC GTGCTGATGTACAAGGCCAGGGGACCCGGCCCTGGCCTCTGTATCGTGTACCGCGAC TGCATCGCCTACGCCGCCTGCCACGGCCCAGGACCTGGCCCCGAGTGGATCGAGCGG CAGACCGTGCTCCAGCATAGCTTCAACGGACCCGGACCAGGCCCCATCAACATCAGC AAGAGCAAGGCCCACAAGGCCATCGAGCTGGGCCCTGGGCCCGGACTGCGGACCCTC CAGCAGCTGTTCCTGAGCACCCTGAGCTTCGTGGGACCTGGGCCAGGCTTCCACAGC ATCGCCGGCCAGTACCGGGGCCAGTGCAACACCTGCGGCCCAGGGCCAGGCACCACA CCTATTATTCACCTGAAGGGCGACGCCAACATCCTGAAGGGGCCAGGACCCGGCGAC TGGGTGATGGCCATCTTCGGCGTGAACCCCACCGTGGCCGAGGGCTTCGGACCTGGA CCIGGGCCTAGGAAGCTGCACGAGCTGTCCTCTGCCCTGGAAATTCCTTACGGCCCT GGCCCAGGCTTCAAGACCCTGATCAAGCCCGCCACACTGTATGCCCACATTCAGGGC CCTGGACCAGGCACCATCCCCAACAGCGTGCAGATCAGCGTGGGCTACATGACCATC GGACCAGGGCCTGGCAATGGCTGGTTCTACGTGGAGGCCGTGATCGACAGGCAGACC GGCGGACCTGGCCCAGGGGTGCTGGACTTCGCCTTTACAGACCTGACAATTGTGTAC CGGGACGGCCCTGGGCCTGGCGCCAAGTTCGTGGCCGCCTGGACCCTGAAGGCCGCT GCCTGA
    ( ID SEC N° 124)
    C.
    AFTDLTI VYNSTWHWTGCNKKAAAKLLEKLLCI NAYQFAFKDLCVKMVMLM LVRFKN AALQDKI LDHYKAAFL LCFCVLLNSVYGTTLERNAAVTTRYPLLRNATLQE I VLHVN YYI TETG I WKVVFIYI PLFNQTEPDTSNYGAAELDPVDLLCYKAAALTDVS I ACVYN AARTEVYQFAFRN PYLH SR LVVFN I SFAG I VTKKVMDDSE IAYNAFYSRI RE LRFKA AAFIYI PLFV I KAVFTFPHAFPFNAFYSKVSEFRWKSLVFLLCFSVNASTAAALYWY RKATLYAH I QC LNAAHYTNWKFI FNAANTE LYN L L I NASYFGMSFI HFKLTNKGICD LNSVYGET LEKNVYVCAFAW L LNVYGTT L EK LK LSQMVOWAYKAAAYVVWDS I YYI N GTGCNGWFYGAAAVMCRHYKRNFLLCFSVC LNAVYQFAFKDLKAAKVSEFRWYRYKY TNWKFIYLNAALSSALE I PYKAAFLFTDLTIVNAATTPI I HLKNAAARQMNMSQWI K NTG I LTVTYNVFTFPNPFPFKAAAE IVLH LEPQN E LDPVGPGPG I RI !AWL LMGSFG I VGPGPGTGRC I ACWRRPRTETGPGPGWKH I RLECVLMYKARGPGPG LCI VYRDC I A YAACHGPGPGPEWI ERQTVLQHSFNGPGPGPI N I SKSKAHKAI ELGPGPGLRTLQQL FLSTLSFVGPGPGFHS I AGQYRGQCNTCGPGPGTTP I I HLKGDAN I LKGPGPGDWVM Al FGVNPTVAEGFGPGPGPRKLHELSSALE I PYGPGPGFKTL I KPATLYAH I QGPGP Gil PNSVQISVGYMT I GPGPG NGWFYVEAV I DRQTGGPGPGVLDFAFTD LT I VYRDG PGPGAKFVAAWTLKAAA
    (ID SEC N° 156)
    FIGURA 5 cont .1
    D.
    GCTTTCACCGACCTGACCATCGTGTACAACAGCACCTGGCACTGGACCGGCTGCAAC AAGAAAGCCGCTGCCAAGCTGCTGGAAAAGCTGCTGTGCATCAACGCCTATCAGTTT GCCTICAAGGACCTGTGCGTGAAGATGGTGATGCTGATGCTGGTGCGGTTCAAGAAT GCCGCTCTCCAGGACAAGATCCTGGACCACTACAAGGCCGCCTTTCTGCTGTGCTTC
    TGCGTGCTGCTGAACAGCGTGTACGGCACCACCCTGGAACGGAACGCCGCCGTGACC ACCAGATACCCCCTGCTGCGGAATGCCACCCTCCAGGAAATCGTCCTGCACGTCAAT
    TACTACATCACCGAGACCGGCATCTGGAAGGTGGTGTTCATCTACATCCCCCTGTTC AACCAGACCGAGCCCGACACCAGCAACTACGGAGCCGCCGAACTCGATCCCGTGGAC CTGCTGTGCTACAAAGCCGCTGCCCTGACCGACGTGAGCATCGCCTGCGTGTACAAC GCCGCCAGGACCGAGGTGTACCAGTTTGCCTTTCGGAACCCCTACCTGCACAGCAGA CTGGTGGTGTTTAACATCAGCTTCGCCGGCATCGTGACCAAGAAAGTGATGGACGAC AGCGAGATCGCCTACAACGCCTTCTACAGCCGGATCAGAGAGCTGAGGTTCAAAGCC GCTGCCITTATCTACATTCCTCTGTTCGTGATCAAGGCCGTGTICACCTTCCCCCAC GCCTTCCCTTTCAATGCCTICTACTCCAAGGTGTCCGAGTTCCGGTGGAAGAGCCTG GTGTTCCTGCTGTGTTTCAGCGTGAACGCCAGCACCGCCGCTGCCCTGTACTGGTAC AGGAAGGCCACCCTGTACGCCCATATCCAGTGCCTGAATGCCGCCCACTACACCAAC TGGAAGTTCATCTTCAATGCCGCCAACACCGAGCTGTACAACCTGCTGATCAACGCC AGCTACTTCGGCATGAGCTTCATCCACTTCAAGCTGACCAACAAGGGCATCTGCGAC CTGAACTCCGTGTACGGCGAGACACTGGAAAAGAACGTGTACGTGTGCGCCTTCGCC TGGCTGCTGAACGTGTATGGCACAACACTGGAAAAACTGAAGCTGTCCCAGATGGTG CAGTGGGCCTATAAAGCCGCCGCCTACGTGGTGTGGGACAGCATCTACTATATCAAC GGCACCGGCTGTAACGGCTGGTTTTACGGCGCCGCTGCCGTGATGTGCCGGCACTAC AAGCGGAATTTTCTGCTGTGTTTTTCCGTGTGCCTGAACGCCGTGTATCAGTTCGCC TTTAAGGATCTGAAGGCTGCCAAAGTGTCTGAGTTCAGATGGTACAGGTACAAGTAC ACAAATTGGAAGTTTATCTATCTGAACGCCGCCCTGAGCAGCGCCCTGGAAATCCCC TATAAGGCTGCCTTCCTGTTCACCGATCTGACTATTGTGAACGCCGCCACCACCCCC ATCATCCACCTGAAAAACGCCGCTGCCAGGCAGATGAACATGAGCCAGTGGATCAAG AACACCGGCATCCTGACCGTGACCTACAACGTGTTTACCTTTCCCAACCCTTTCCCC TTTAAAGCCGCTGCCGAGATCGTGCTGCACCTGGAACCCCAGAACGAGCTGGACCCT GTGGGCCCTGGCCCTGGCATCAGAATCCTCCAGGAACTGCTGATGGGCAGCTTCGGC ATCGTGGGCCCAGGCCCCGGAACCGGCCGGTGCATCGCCTGTTGGCGGAGGCCCCGG ACCGAGACAGGCCCTGGACCCGGCTGGAAGCACATCCGGCTGGAATGCGTGCTGATG TACAAGGCCAGGGGACCCGGCCCTGGCCTCTGTATCGTGTACCGCGACTGCATCGCC TACGCCGCCTGCCACGGCCCAGGACCTGGCCCCGAGTGGATCGAGCGGCAGACCGTG CTCCAGCATAGCTTCAACGGACCCGGACCAGGCCCCATCAACATCAGCAAGAGCAAG GCCCACAAGGCCATCGAGCTGGGCCCTGGGCCCGGACTGCGGACCCTCCAGCAGCTG TTCCTGAGCACCCTGAGCTTCGTGGGACCTGGGCCAGGCTTCCACAGCATCGCCGGC CAGTACCGGGGCCAGTGCAACACCTGCGGCCCAGGGCCAGGCACCACACCTATTATT CACCTGAAGGGCGACGCCAACATCCTGAAGGGGCCAGGACCCGGCGACTGGGTGATG GCCATCTTCGGCGTGAACCCCACCGTGGCCGAGGGCTTCGGACCTGGACCTGGGCCT AGGAAGCTGCACGAGCTGTCCTCTGCCCTGGAAATTCCTTACGGCCCTGGCCCAGGC TTCAAGACCCTGATCAAGCCCGCCACACTGTATGCCCACATTCAGGGCCCTGGACCA GGCACCATCCCCAACAGCGTGCAGATCAGCGTGGGCTACATGACCATCGGACCAGGG CCTGGCAATGGCTGGTTCTACGTGGAGGCCGTGATCGACAGGCAGACCGGCGGACCT GGCCCAGGGGTGCTGGACTTCGCCTTTACAGACCTGACAATTGTGTACCGGGACGGC CCTGGGCCTGGCGCCAAGTTCGTGGCCGCCTGGACCCTGAAGGCCGCTGCC
    (ID SEC N° 157)
    FIGURA 5 cont. 2 FIGURA 6
    A. Secuencia de aminoacidos ICCG6138
    MGMOVOIOSLFULLWVPGSRGFYSKVSEFRWKAARTEVY0FAFRNAAVTTRYPUR
    NVFTFPNPFPFNYTNWKFIYLNASVYGETLEKGAAVMCRHYKRNAVYGTTLEKLKVV
    FIYIPLFGAAKLLEKLLCINGTGCNGWFYNOTEPDTSNYNAAAPYLHSRLVVFGAAA
    LTDVSIACVYNAHYTNWKFIFGAAFIYIPLFVIKAAAMVMLMLVRFKNAANTELYNL
    LINFLFTDLTIVNFLLCFCVLLNAATTPIIHLKGAAKLTNKGICDLNALODKILDHY
    KNTGILTVTYGAAAVMDDSEIAYNSTWHWTGCNKKAASYFGMSFIHFKLSSALEIPY
    KLSOMVQWAYNSLVFLLCFSVNATLYAHIOCLNVFTFPHAFPFNAAARQMNMSOWIK
    NATLQEIVLHVNAAFTDLTIVYNISFAGIVTKKYVVWDSIYYINYYITETGIWKAAA
    FYSRIRELRFKVYQFAFKDLKAFLLCFSVCLNAAYQFAFKDLCVKSVYGTTLERNKV
    SEFRWYRYKAAELDPVDLLCYKSTAAALYWYRKAAAVYVCAFAWLLEIVLHLEPONE
    LDPVGPGPGIRILQELLMGSFGIVGPGPGTGRCIACWRRPRTETGPGPGWKHIRLEC
    VLMYKARGPGPGLCIVYRDCIAYAACHGPGPGPEWIEROTVLQHSFNGPGPGPINIS
    KSKAHKAIELGPGPGLRTLQOLFLSTLSFVGPGPGFHSIAGOYRGQCNTCGPGPGTT
    PIIHLKGDANILKGPGPGDWVMAIFGVNPTVAEGFGPGPGPRKLHELSSALEIPYGP
    GPGFKTLIKPATLYAHIOGPGPGTIPNSVOISVGYMTIGPGPGNGWFYVEAVIDROT
    GGPGPGVLDFAFTDLTIVYRDGPGPGAKFVAAWTLKAAA
    (ID SEC N° 125)
    B. Secuencia de ADN ICCG6138
    ATGGGCATGCAGGTGCAGATCCAGAGCCTGTTCCTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGC AGCCGGGGCTTCTACAGCAAGGTGTCCGAGTTCCGGTGGAAGGCCGCCAGGACCGAG GTGTACCAGTTCGCCTTCCGGAACGCCGCCGTGACCACCAGATACCCCCTGCTGCGG AACGTGTTCACCTTCCCCAACCCCTTCCCTTTCAACTACACCAACTGGAAGTTCATC TACCTGAACGCCAGCGTGTACGGCGAGACCCTGGAAAAGGGAGCAGCCGTGATGTGC CGGCACTACAAGCGGAACGCCGTGTACGGCACCACACTGGAAAAGCTGAAGGTGGTG TTCATCTACATCCCCCTGTTCGGAGCCGCCAAGCTGCTGGAAAAACTGCTGTGCATC AACGGCACCGGCTGCAACGGCTGGTTCTACAACCAGACCGAGCCCGACACCAGCAAC TACAATGCTGCCGCCCCCTACCTGCACAGCAGACTGGTGGTGTTTGGGGCTGCCGCC CTGACCGACGTGAGCATCGCCTGCGTGTACAACGCCCACTACACAAATTGGAAATTC ATTTTTGGAGCCGCCTTCATCTATATTCCTCTGTTCGTGATCAAAGCCGCCGCTATG GTGATGCTGATGCTGGTGCGGTTCAAGAACGCCGCCAACACCGAGCTGTACAACCTG CTGATCAACTTCCTGTTCACCGACCTGACCATCGTGAACTITCTCCTGTGTTTCTGC GTGCTCCTGAATGCCGCCACAACCCCCATCATCCACCTGAAGGGAGCCGCCAAACTG ACCAACAAGGGCATCTGCGACCTGAATGCCCTCCAGGACAAGATCCTGGACCACTAC AAGAACACCGGCATCCTGACCGTGACCTATGGAGCCGCTGCCGTGATGGACGACAGC GAGATCGCCTACAACAGCACCTGGCACTGGACCGGCTGTAACAAGAAGGCCGCCTCC TACTTCGGCATGAGCTICATCCACTTCAAGCTGTCCAGCGCCCTGGAAATCCCCTAC AAGCTGTCCCAGATGGTGCAGTGGGCCTACAACTCCCTGGTGTTCCTGCTGTGTTTC AGCGTGAACGCAACCCTCTATGCCCACATCCAGTGCCTGAATGTGTTTACCTTCCCT CACGCCTTTCCCTTCAATGCCGCCGCCAGACAGATGAACATGAGCCAGTGGATCAAG AATGCCACCCTCCAGGAGATTGTCCTGCACGTCAATGCCGCCTTTACTGATCTGACT ATCGTGTACAACATCAGCTTCGCCGGCATCGTGACCAAGAAATACGTGGTGTGGGAC AGCATCTACTACATCAATTACTACATCACCGAGACCGGCATCTGGAAAGCTGCCGCC TTCTACAGCCGGATCAGGGAGCTGAGGTTCAAAGTGTATCAGTTTGCMCAAAGAC CTGAAAGCCTTCCTGCTGTGCTTTTCCGTGTGCCTGAACGCCGCCTACCAGTTTGCC TTTAAGGATCTGTGCGTGAAGAGCGTGTATGGCACAACCCTGGAACGGAACAAAGTG TCTGAGTTCCGCTGGTACAGGTATAAGGCCGCCGAACTCGATCCCGTGGATCTGCTG TGTTACAAGAGCACTGCCGCCGCACTGTACTGGTATAGGAAGGCTGCCGCCGTGTAC GTGTGCGCCTTCGCCTGGCTGCTGGAGATCGTGCTGCACCTGGAACCCCAGAACGAG CTGGACCCTGTGGGCCCTGGCCCTGGCATCAGAATCCTCCAGGAACTGCTGATGGGC AGCTTCGGCATCGTGGGCCCAGGCCCCGGAACCGGCCGGTGCATCGCCTGTTGGCGG AGGCCCCGGACCGAGACAGGCCCTGGACCCGGCTGGAAGCACATCCGGCTGGAATGC GTGCTGATGTACAAGGCCAGGGGACCCGGCCCTGGCCTCTGTATCGTGTACCGCGAC TGCATCGCCTACGCCGCCTGCCACGGCCCAGGACCTGGCCCCGAGTGGATCGAGCGG CAGACCGTGCTCCAGCATAGCTTCAACGGACCCGGACCAGGCCCCATCAACATCAGC AAGAGCAAGGCCCACAAGGCCATCGAGCTGGGCCCTGGGCCCGGACTGCGGACCCTC CAGCAGCTGTTCCTGAGCACCCTGAGCTTCGTGGGACCTGGGCCAGGCTTCCACAGC ATCGCCGGCCAGTACCGGGGCCAGTGCAACACCTGCGGCCCAGGGCCAGGCACCACA CCTATTATTCACCTGAAGGGCGACGCCAACATCCTGAAGGGGCCAGGACCCGGCGAC TGGGTGATGGCCATCTTCGGCGTGAACCCCACCGTGGCCGAGGGCTTCGGACCTGGA CCTGGGCCTAGGAAGCTGCACGAGCTGTCCTCTGCCCTGGAAATTCCTTACGGCCCT GGCCCAGGCTTCAAGACCCTGATCAAGCCCGCCACACTGTATGCCCACATTCAGGGC CCTGGACCAGGCACCATCCCCAACAGCGTGCAGATCAGCGTGGGCTACATGACCATC GGACCAGGGCCTGGCAATGGCTGGTTCTACGTGGAGGCCGTGATCGACAGGCAGACC GGCGGACCTGGCCCAGGGGTGCTGGACTTCGCCTTTACAGACCTGACAATTGTGTAC CGGGACGGCCCTGGGCCTGGCGCCAAGTTCGTGGCCGCCTGGACCCTGAAGGCCGCT GCCTGA
    (ID SEC N° 126)
    C.
    FYSKVSE FRWKAARTEVYQFAFRNAAVTTRYPLLRNVFTFPNPFPFNYTNWKFI YLN ASVYGETLEKGAAVMCRHYKRNAVYGTTLEKLKVVFIYI PLFGAAKLLEKL LC I NGT GCNGWFYNQTEPDTSNYNAAAPYLHSRLVVFGAAALTDVSI ACVYNAHYTNWKFI FG AAFIYI PLFVIKAAAMVM LM LVRFKNAANTELYNLL I NFLFTDLT I VNFLLCFCVLL NAATTP I I HLKGAAKLTNKG I CD LNALQDKI LDHYKNTG I LTVTYGAAAVMDDSE IA YNSTWHWTGCNKKAASYFGMSFI HFKLSSAL E I PYKLSQMVQWAYNSLVFL LC FSVN AT LYAH I QC LNVFTFPHAFP FNAAAROM N MSQWI KNAT LQE IVLHVNAAFTD LT I VY N I SFAG I VTKKYVVWDSI YY I NYYITETGIWKAAAFYSRI RELRFKVYQFAFKDLKA FLLCFSVCLNAAYQFAFKDLCVKSVYGTTLERNKVSEFRWYRYKAAELDPVDLLCYK STAAALYWYRKAAAVYVCAFAWLLE IV LH LE PQN E LDPVGPGPG I RI LQELLMGSFG IVGPGPGTGRC I ACWRRPRT ETGPGPGWKH I RLECVLMYKARGPGPG LC I VYRDC I A YAACHGPGPGPEWI ERQTVLQHSFNGPGPGP I NI SKSKAHKAI ELGPGPGLRTLQQL FLST LSFVGPGPGFHSIAGQYRGQCNTCGPGPGTTP I IN LKGDAN I LKGPGPGDWVM AI FGVNPTVAEGFGPGPGPRKLHELSSALEI PYGPGPGFKTLI KPATLYAH I QGPGP GTI PNSVQISVGYMTIGPGPGNGWFYVEAVI DRQTGGPGPGVLDFAFTDLTIVYRDG PGPGAKFVAAWTLKAAA
    (ID SEC N° 158)
    FIGURA 6 cont
    FIGURA 7
    A. Secuencia de aminoacidos ICCG6149
    MGMQVQIQSLFLL LLWPGSRGKSLFGMSLMKNSTAAALYWYKKAACYSLYGTTFKA AAVAWDSVYYMKSTDLRDH I DYN I SDYRHYCYKAAQWPAYN I SKNGYNT FYI EFKL QDKI I DHYKAAC LYLH I QS LNAAAAT LQDIVLHGTVYVFCFLLNAI LYAH I QC LNAA LYN LLI RCFKAAFVYI PLFLI NTVSATQLVKNGTGCNGWFYNAATKYPLLKNVYVFC FL LPMNATLHDI I LECVKAAALYGVSFSELKQVDYYGLYYGAYYMTDAGTWNAAPYA VCDKCFKQGAMLAVFKKAAAVVLLLVRYKNAAASYFGMSFI HFKAAKLLSKLLCVNA AAATMCRHYKRNAAASTVSVGTAKNAA LSOMVQWAYKLINTG LYNVNAAATCVSHRG LYNAAKSAI VT LTYKAAADSVYGDT LERNMYVCCHVPLNAARFHN I RGRFKAAFVVY RDS I PKNAS LODI E I TCVKAVYDFAFRDLC I KYMLDLQPETVNAAAGTLG I VCPVNS VI CFVNSKNATL EKLTNTGLYNAGLYYVH EG I RTYFVQGPGPGFLNTVAI PDSVQI L VG PGPGQRFHNI RGRWTG RCMGPGPGTNTG LYN LLI RCLRCQGPGPG I EFITFLGAL KSFLKGPGPGPEWI QRQTVLQHSFNGPGPG L FVVYRDS I PHAACHKGPGPGI RILED LLMGTLGI VGPGPGLDLQPETTDLYCYEQGPGPGLQAI ELQLT LET IYNGPGPGFQQ LFLNTLSFVCPWGPGPGWKHMRLECA I YYKARGPGPGLCTE LQTTI HDI I LEGPGPG
    FKTL I QPFI LYAH I QGPGPGLYWYKTGI SN I SEVYGPGPG EVFEFAFKDLFVVYRGP GPGHKAI ELOMALOGLAQGPGPGAKFVAAWTLKAAA
    ( ID SEC N° 127)
    B. Secuencia de ADN ICCG6149
    ATGGGCATGCAGGTGCAGATCCAGAGCCTGTTCCTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGC AGCCGGGGCAAGAGCCTUTTGGCATGAGCCTGATGAAGAACAGCACCGCCGCTGCC CTCTATTGGTACAAAAAGGCCGCCTGCTACAGCCTGTACGGCACCACCTTCAAGGCT GCTGCCGTGGCCTGGGACAGCGTGTACTACATGAAGAGCACCGACCTGCGGGACCAC ATCGACTACAACATCAGCGACTACCGGCACTACTGCTACAAGGCCGCCCAGGTGGTG CCCGCCTACAACATCTCCAAGAACGGCTACAACACCTTCTACATCGAGTTCAAGCTC CAGGACAAGATCATCGACCACTACAAAGCCGCCTGCCTGTACCTGCACATCCAGAGT CTGAACGCAGCCGCTGCAACCCTCCAGGACATCGTGCTGCACGGCACCGTGTACGTG TTCTGCTTCCTGCTGAACGCCATCCTGTACGCCCACATCCAGTGTCTGAATGCCGCC CTGTACAACCTGCTGATCCGGTGCTTTAAGGCCGCCTICGTGTACATCCCCCTGTTT CTGATCAACACCGTGAGCGCCACCCAGCTGGTGAAGAATGGCACCGGCTGCAACGGC TGGTTCTACAATGCCGCCACCAAGTACCCCCTGCTGAAGAACGTGTATGTGTTTTGT TTTCTGCTGCCCATGAACGCCACACTGCACGACATTATCCTGGAATGCGTCAAGGCC GCTGCCCTGTATGGCGTGAGCTTCAGCGAGCTGAAGCAGGTGGACTACTACGGCCTG TACTACGGCGCCTACTACATGACCGACGCCGGCACCTGGAATGCCGCCCCTTACGCC GTGTGCGACAAGTGCTTCAAGCAGGGCGCCATGCTGGCCGTGTTCAAGAAAGCCGCT GCCGTGGTGCTGCTGCTGGTGCGGTATAAGAATGCCGCCGCCAGCTACTTCGGCATG AGCTTCATCCACTTTAAAGCCGCCAAGCTGCTGTCTAAGCTGCTGTGCGTGAATGCC GCTGCTGCCACAATGTGCCGGCACTACAAGAGAAATGCCGCTGCCAGCACCGTGAGC GTGGGCACCGCCAAGAACGCCGCCCTGAGCCAGATGGTGCAGTGGGCCTACAAGCTG ACCAACACCGGCCTGTACAACGTGAACGCCGCTGCCACCTGCGTGAGCCACCGGGGC CTGTATAACGCCGCCAAGAGCGCCATCGTGACCCTGACCTATAAGGCCGCTGCCGAC AGCGTGTACGGCGACACCCTGGAACGGAACATGTACGTGTGCTGCCACGTGCCCCTG AATGCCGCCAGGITCCACAACATCCGGGGCAGGTTCAAAGCCGCCTTIGTGGTGTAC CGGGACAGCATCCCCAAGAATGCCAGCCTCCAGGATATTGAGATCACCTGTGTGAAG GCCGTGTACGACTTCGCCTICCGGGACCTGTGCATCAAGTACATGCTGGACCTCCAG CCCGAGACAGTGAACGCCGCCGCTGGCACACTGGGCATCGTGTGCCCCGTGAACAGC GTGATCTGCTICGTGAACAGCAAAAACGCCACCCIGGAAAAGCTGACAAATACAGGG CTGTACAATGCCGGCCTGTATTACGTGCACGAGGGCATCCGGACCTACTTCGTGCAG GGCCCAGGGCCAGGCTTCCTGAACACCGTGGCCATCCCCGACTCCGTGCAGATCCTG GTCGGCCCAGGACCAGGGCAGCGGTTCCACAATATCAGAGGCCGGTGGACCGGCAGA TGCATGGGCCCAGGACCTGGCACAAATACCGGACTGTATAATCTGCTGATTCGCTGC CTGCGGTGCCAGGGTCCAGGACCAGGCATCGAGTTTATCACCTTTCTGGGCGCCCTG AAGAGCTTCCTGAAAGGACCTGGACCAGGACCCGAGTGGATTCAGCGGCAGACCGTG CTCCAGCACAGCTTCAACGGACCCGGACCCGGCCTGTTCGTGGTGTACAGAGACTCC ATCCCCCACGCCGCCTGTCACAAGGGACCTGGACCAGGCATCAGGACCCTGGAGGAC CTGCTGATGGGCACCCTGGGCATTGIGGGGCCIGGACCTGGACTGGATCTCCAGCCT GAAACCACCGACCTGTACTGCTACGAGCAGGGGCCAGGACCTGGGCTCCAGGCTATC GAACTCCAGCTGACCCTGGAAACCATCTACAATGGCCCCGGACCAGGCTTCCAGCAG CTGTTCCTGAATACCCTGAGCTTCGTGTGCCCTTGGGGACCAGGGCCCGGATGGAAG CACATGCGGCTGGAATGCGCCATCTACTACAAGGCCAGAGGCCCAGGACCCGGACTG TGCACCGAACTCCAGACCACCATCCACGACATCATTCTGGAAGGACCAGGGCCAGGC TTTAAGACCCTGATCCAGCCCTTCATTCTGTATGCCCACATTCAGGGACCTGGGCCT GGCCTGTATTGGTATAAGACCGGCATCAGCAACATCTCCGAGGTGTACGGGCCTGGA CCAGGCGAGGTGITCGAGTTCGCCTICAAGGATCTGTTTGIGGTGTATAGAGGCCCC GGACCTGGCCACAAGGCCATTGAACTCCAGATGGCCCTCCAGGGGCTGGCCCAGGGA CCAGGCCCTGGCGCCAAGTTCGTGGCCGCCTGGACCCTGAAAGCCGCCGCCTGA
    (ID SEC N° 128)
    C.
    KS L FGMS LMKNSTAAALYWYKKAACYSLYGTTFKAAAVAWDSVYYMKSTD LRDH I DY N I SDYRHYCYKAAQVVPAYN I SKNGYNTFYI EFKLQDKI I DHYKAACLYLH I QS LNA AAATLQD I VLHGTVYVFCFLLNAI LYAH I QCLNAALYNLL I RC FKAAFVY I PLFL I N TVSATQLVKNGTGCNGWFYNAATKYP LLKNVYVFC FL LPM NAT LHDI I LECVKAAAL YGVSFSE LKQVDYYG LYYGAYYMTDAGTWNAAPYAVCDKCFKQGAM LAVFKKAAAVV LLLVRYKNAAASYFGMSFI HFKAAKLLSKLLCVNAAAATMCRHYKRNAAASTVSVGT AKNAALSQMVQWAYKLTNTGLYNVNAAATCVSHRG LYNAAKSA I VTLTYKAAADSVY GDT LERNMYVCCHVPLNAARFH N I RGRFKAAFVVYRDSI PKNASLQD I E I TCVKAVY DFAFRD LC I KYM LDLQPETVNAAAGT LG I VCPVNSV I C FVNSKNATL EKLTNTG LYN AG LYYVH EG I RTYFVQG PG PG FLNTVAI PDSVQ I LVGPGPGQRFHN I RGRWTGRCMG PGPGTNTGLYN LLI RCLRCQGPGPG I EFITFLGALKSFLKGPGPGPEWIQRQTVLQH SFNGPGPGLFVVYRDSI PHAACHKGPGPG I RTLEDL LMGTLGIVGPGPGLDLQPETT DLYCYEQGPGPGLQA I E LQLT LET I YNGPGPGFQQLFLNTLSFVCPWGPGPGWKH MR
    LECAIYYKARGPGPGLCTE LOTT' HD I I LEGPGPGFKTLIQPFI LYAH I QGPGPG LY WYKTG I SN I SEVYGPGPGEVFEFAFKDLFVVYRGPGPG HKA I ELQMALQGLAQGPGP GAKFVAAWTLKAAA
    ( ID SEC N° 160)
    FIGURA 7 cont .1
    D.
    AAGAGCCTGTTTGGCATGAGCCTGATGAAGAACAGCACCGCCGCTGCCCTCTATTGG TACAAAAAGGCCGCCTGCTACAGCCTGTACGGCACCACCTTCAAGGCTGCTGCCGTG GCCTGGGACAGCGTGTACTACATGAAGAGCACCGACCTGCGGGACCACATCGACTAC AACATCAGCGACTACCGGCACTACTGCTACAAGGCCGCCCAGGTGGTGCCCGCCTAC AACATCTCCAAGAACGGCTACAACACCTTCTACATCGAGTTCAAGCTCCAGGACAAG ATCATCGACCACTACAAAGCCGCCTGCCTGTACCTGCACATCCAGAGTCTGAACGCA GCCGCTGCAACCCTCCAGGACATCGTGCTGCACGGCACCGTGTACGTGTTCTGCTTC CTGCTGAACGCCATCCTGTACGCCCACATCCAGTGTCTGAATGCCGCCCTGTACAAC CTGCTGATCCGGTGCTTTAAGGCCGCCTTCGTGTACATCCCCCTGTTTCTGATCAAC ACCGTGAGCGCCACCCAGCTGGTGAAGAATGGCACCGGCTGCAACGGCTGGTTCTAC AATGCCGCCACCAAGTACCCCCTGCTGAAGAACGTGTATGTGTTTTGTTTTCTGCTG CCCATGAACGCCACACTGCACGACATTATCCTGGAATGCGTCAAGGCCGCTGCCCTG TATGGCGTGAGCTTCAGCGAGCTGAAGCAGGTGGACTACTACGGCCTGTACTACGGC GCCTACTACATGACCGACGCCGGCACCTGGAATGCCGCCCCTTACGCCGTGTGCGAC AAGTGCTTCAAGCAGGGCGCCATGCTGGCCGTGTTCAAGAAAGCCGCTGCCGTGGTG CTGCTGCTGGTGCGGTATAAGAATGCCGCCGCCAGCTACTTCGGCATGAGCTTCATC CACTTTAAAGCCGCCAAGCTGCTGTCTAAGCTGCTGTGCGTGAATGCCGCTGCTGCC ACAATGTGCCGGCACTACAAGAGAAATGC CGCTGCCAGCACCGTGAGCGTGGGCACC GCCAAGAACGCCGCCCTGAGCCAGATGGTGCAGTGGGCCTACAAGCTGACCAACACC GGCCTGTACAACGTGAACGCCGCTGCCACCTGCGTGAGCCACCGGGGCCTGTATAAC GCCGCCAAGAGCGCCATCGTGACCCTGACCTATAAGGCCGCTGCCGACAGCGTGTAC GGCGACACCCTGGAACGGAACATGTACGTGTGCTGCCACGTGCCCCTGAATGCCGCC AGGTTCCACAACATCCGGGGCAGGTTCAAAGCCGCCTTTGTGGTGTACCGGGACAGC ATCCCCAAGAATGCCAGCCTCCAGGATATTGAGATCACCTGTGTGAAGGCCGTGTAC GACTTCGCCTTCCGGGACCTGTGCATCAAGTACATGCTGGACCTCCAGCCCGAGACA GTGAACGCCGCCGCTGGCACACTGGGCATCGTGTGCCCCGTGAACAGCGTGATCTGC TTCGTGAACAGCAAAAACGCCACCCTGGAAAAGCTGACAAATACAGGGCTGTACAAT GCCGGCCTGTATTACGTGCACGAGGGCATCCGGACCTACTTCGTGCAGGGCCCAGGG CCAGGCTTCCTGAACACCGTGGCCATCCCCGACTCCGTGCAGATCCTGGTCGGCCCA GGACCAGGGCAGCGGTTCCACAATATCAGAGGCCGGTGGACCGGCAGATGCATGGGC CCAGGACCTGGCACAAATACCGGACTGTATAATCTGCTGATTCGCTGCCTGCGGTGC CAGGGTCCAGGACCAGGCATCGAGTTTATCACCTTTCTGGGCGCCCTGAAGAGCTTC CTGAAAGGACCTGGACCAGGACCCGAGTGGATTCAGCGGCAGACCGTGCTCCAGCAC AGCTTCAACGGACCCGGACCCGGCCTGTTCGTGGTGTACAGAGACTCCATCCCCCAC GCCGCCTGTCACAAGGGACCTGGACCAGGCATCAGGACCCTGGAGGACCTGCTGATG GGCACCCTGGGCATTGTGGGGCCTGGACCTGGACTGGATCTCCAGCCTGAAACCACC GACCTGTACTGCTACGAGCAGGGGCCAGGACCTGGGCTCCAGGCTATCGAACTCCAG CTGACCCTGGAAACCATCTACAATGGCCCCGGACCAGGCTTCCAGCAGCTGTTCCTG AATACCCTGAGCTTCGTGTGCCCTTGGGGACCAGGGCCCGGATGGAAGCACATGCGG CTGGAATGCGCCATCTACTACAAGGCCAGAGGCCCAGGACCCGGACTGTGCACCGAA CTCCAGACCACCATCCACGACATCATTCTGGAAGGACCAGGGCCAGGCTTTAAGACC CTGATCCAGCCCTTCATTCTGTATGCCCACATTCAGGGACCTGGGCCTGGCCTGTAT TGGTATAAGACCGGCATCAGCAACATCTCCGAGGTGTACGGGCCTGGACCAGGCGAG GTGTTCGAGTTCGCCTTC AAGGATCTGTTTGTGGTGTATAGAGGCCCCGGACCTGGC CACAAGGCCATTGAACTCCAGATGGCCCTCCAGGGGCTGGCCCAGGGACCAGGCCCT GGCGCCAAGTTCGTGGCCGCCTGGACCCTGAAAGCCGCCGCC
    (ID SEC N° 161)
    FIGURA 7 cont. 2
    FIGURA 8
    A. Secuencia de aminoacidos ICCG6150
    MGMQVQI QS LF L L L LWPGSRGATCVSHRG LYNAASTDLRDH I DYNAAAATMCRHYK RNA I LYAHIQC LNAAAGTLG I VCPVNAAACYSLYGTTFKAAADSVYGDT L ERNQVVP AYN I SKNAA LYN L L I RC FKAAFVYI P L FL I NYYMTDAGTWGAVVLL LVRYKNAA I SD YRHYCYKAATVSATQLVKKASTAAALYWYKKAAFVVYRDSI PKNASYFGMSFIHFKA AYM LD LQPETVNAAVYD FA FRD LC I KAALQDK I I DHYKAAT LHD I I LECVKKLTNTG LYNVGAAASVI CFVNSKGAAAMYVCC HVPL NASLQD I E I TCVKC LY LH I QSLNAATK YP L LKNVYVFC F L LPMNAKQGAMLAVFKKAALSQMVQWAYKAAPYAVCDKCFKAATV YVFCFLLNAAAAT LODI VLHGAKSLFGMSLMKNGTGCNGWFYNARFHN I RGRFKAAK LLSKLLCVNAAASTVSVGTAKNVAWDSVYYMKAAAGYNTFYI EFKAAALYGVSFSEL KQVDYYG LYYNAAKSAI VT LTYKAAAT LEK LTNTG LYNAGLYYVH EG I RTYFVQGPG PG FLNTVAI PDSVQI LVGPGPGQRFHN I RGRWTGRCMGPGPGTNTG LYN L L I RC LRC QGPGPG I EFI TFLGA LKSF LKGPGPGPEWI QRQTVLQHSFNGPGPGLFVVYRDSI PH AACHKGPGPGI RTLEDLLMGTLG I VGPGPG LDLOPETTDLYCYEQGPGPGLQAI ELQ LTLETIYNGPGPGFQQLFLNTLSFVCPWGPGPGWKHMRLECAIYYKARGPGPGLCTE LOTT I HD I I LEGPGPGFKT L I QPF I LYAH I QGPGPG LYWYKTG I SN I SEVYGPG PG E VFEFAFKDLFVVYRGPG PGH KAI ELQMALOGLAQGPGPGAKFVAAWILKAAA
    (ID SEC N° 129)
    B. Secuencia de ADN ICCG6150
    ATGGGCATGCAGGTGCAGATCCAGAGCCTGTTCCTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGC AGCAGAGGCGCCACCTGCGTGAGCCACAGGGGCCTCTACAACGCCGCCAGCACCGAC CTCCGGGACCACATCGACTACAATGCTGCTGCCGCTACAATGTGCCGGCACTACAAG CGGAACGCCATCCTGTACGCCCACATCCAGTGCCTGAATGCTGCCGCTGGCACACTG GGCATCGTGTGCCCCGTGAATGCCGCCGCCTGCTACAGCCTGTACGGCACCACCTTC AAGGCCGCTGCCGACTCCGTGTACGGCGACACCCTGGAACGGAACCAGGTGGTGCCC GCCTACAACATCTCTAAGAATGCCGCTCTGTACAACCTGCTGATCCGGTGCTTTAAG GCTGCCTTCGTGTACATCCCCCTOTTCTGATCAACTACTACATGACCGACGCCGGC ACATGGGGAGCCGTGGTGCTGCTGCTGGTGCGGTACAAGAATGCCGCCATCAGCGAC TACCGGCACTACTGCTACAAGGCCGCCACCGTCAGCGCCACCCAGCTGGTGAAGAAG GCCAGCACAGCCGCCGCTCTCTATTGGTATAAAAAAGCCGCCITTGTGGTGTACCGG GACAGCATCCCCAAGAACGCCAGCTACTTCGGCATGAGCTTCATCCACTTCAAAGCC GCCTACATGCTGGACCTCCAGCCCGAGACCGTGAACGCTGCCGTGTACGACTTCGCC TTCCGGGACCTGTGCATTAAAGCCGCACTCCAGGACAAGATCATCGACCA1TATAAA GCAGCCACCCTGCATGATATTATTCTGGAATGCGTGAAGAAGCTGACCAACACCGGC CTCTATAACGTGGGAGCCGCCGCCTCTGTGATCTGCTTCGTGAACAGCAAGGGGGCT GCCGCCATGTATGTGTGCTGCCACGTGCCCCTGAACGCCTCTCTCCAGGATATTGAG ATCACCTGTGTGAAGTGCCTGTACCTGCACATTCAGTCTCTGAATGCCGCCACCAAG TACCCCCTGCTGAAGAACGTGTATGTCTTTTGCTTCCTGCTGCCCATGAACGCCAAG CAGGGCGCCATGCTGGCCGTGTTCAAAAAGGCCGCCCTGAGCCAGATGGTGCAGIGG GCCTACAAAGCCGCCCCTTACGCCGTGTGCGACAAGTGTTTTAAGGCCGCCACAGTG TACGTGTTTTGTTTTCTGCTGAATGCCGCTGCCGCCACCCTCCAGGACATCGTGCTG CACGGCGCCAAGTCCCTGTTCGGCATGTCCCTGATGAAGAATGGCACCGGCTGCAAC GGCTGGTTCTACAACGCCCGGTTCCACAACATCCGGGGCAGGTTTAAAGCCGCCAAG
    CTGCTGTCTAAGCTGCTGIGTGTGAACGCCGCCGCTTCCACCGTGAGCGTGGGCACC GCCAAGAACGTGGCCTGGGACAGCGTGTACTACATGAAAGCAGCAGCCGGGTACAAC ACCTTCTACATCGAGTTTAAAGCTGCCGCCCTGTACGGCGTGAGCTTCAGCGAGCTG AAGCAGGTGGACTACTACGGCCTGTACTATAACGCCGCCAAGAGCGCCATCGTGACC CTGACCTATAAAGCCGCCGCCACACTGGAAAAGCTGACCAATACAGGGCTGTACAAT GCCGGCCTGTATTACGTGCACGAGGGCATCCGGACCTACTTCGTGCAGGGCCCAGGG CCAGGCTTCCTGAACACCGTGGCCATCCCCGACTCCGTGCAGATCCTGGICGGCCCA GGACCAGGGCAGCGGTTCCACAATATCAGAGGCCGGTGGACCGGCAGATGCATGGGC CCAGGACCTGGCACAAATACCGGACTGTATAATCTGCTGATTCGCTGCCTGCGGTGC CAGGGTCCAGGACCAGGCATCGAGTTTATCACCTTTCTGGGCGCCCTGAAGAGCTTC CTGAAAGGACCTGGACCAGGACCCGAGTGGATTCAGCGGCAGACCGTGCTCCAGCAC AGCTTCAACGGACCCGGACCCGGCCTGTTCGTGGTGTACAGAGACTCCATCCCCCAC GCCGCCIGTCACAAGGGACCTGGACCAGGCATCAGGACCCTGGAGGACCTGCTGATG GGCACCCTGGGCATTGTGGGGCCTGGACCTGGACTGGATCTCCAGCCTGAAACCACC GACCTGTACTGCTACGAGCAGGGGCCAGGACCTGGGCTCCAGGCTATCGAACTCCAG CTGACCCTGGAAACCATCTACAATGGCCCCGGACCAGGCTTCCAGCAGCTGITCCTG AATACCCTGAGCTTCGTGTGCCCTTGGGGACCAGGGCCCGGATGGAAGCACATGCGG CTGGAATGCGCCATCTACTACAAGGCCAGAGGCCCAGGACCCGGACTGTGCACCGAA CTCCAGACCACCATCCACGACATCATTCTGGAAGGACCAGGGCCAGGCTTTAAGACC CTGATCCAGCCCTICATTCTGTATGCCCACATTCAGGGACCTGGGCCTGGCCTGTAT TGGTATAAGACCGGCATCAGCAACATCTCCGAGGTGTACGGGCCTGGACCAGGCGAG GTGTTCGAGTTCGCCTTCAAGGATCTGTTTGTGGTGTATAGAGGCCCCGGACCTGGC CACAAGGCCATTGAACTCCAGATGGCCCTCCAGGGGCTGGCCCAGGGACCAGGCCCT GGCGCCAAGTTCGTGGCCGCCTGGACCCTGAAAGCCGCCGCCTGA
    (ID SEC N° 130)
    C.
    ATCVSHRGLYNAASTDLRDH I DYNAAAATMCRHYKRNA I LYAH I QC LNAAAGT LG I V CPVNAAACYS LYGTT FKAAADSVYGDTLERNQVVPAYN I SKNAA LYN L L I RCFKAAF VYI PLFL I NYYMTDAGTWGAVVLLLVRYKNAA I SDYRHYCYKAATVSATQLVKKAST AAA LYWYKKAAFVVYRDS I PKNASYFGMSFI HFKAAYMLDLQPETVNAAVYDFAFRD LC I KAA LQDK I I DHYKAATLHDI I LECVKKLTNTGLYNVGAAASVICFVNSKGAAAM YVCCHVP LNAS LQD I E I TCVKC LY LH IQSLNAATKYPLLKNVYVFCFL LP M NAKQGA MLAVFKKAALSQMVQWAYKAAPYAVCDKCFKAATVYVFCFLLNAAAATLODIVLHGA KS LFG MSLMKNGTGCNGWFYNARFHN I RGRFKAAKLLSKL LCVNAAASTVSVGTAKN VAWDSVYYMKAAAGYNTFYI EFKAAALYGVSFSE LKQVDYYG LYYNAAKSAI VT LTY KAAATLEKLTNTGLYNAGLYYVHEG I RTYFVQGPGPG FL N TVA I PDSVQI LVGPGPG QRFHN I RGRWTGRCMGPGPGTNTGLYN L L I RCLRCQGPGPGI EFITFLGALKSFLKG PGPGPEWIQRQTVLQHSFNGPGPGLFVVYRDSI PHAACHKGPGPGI RTLEDLLMGTL GI VGPGPGLDLQP ETT DLYCYEQGPGPGLQAI E LQLT LET I YNGPGPGFQQLFLNTL SFVCPWGPGPGWKHMRLECAI YYKARGPGPGLCTE LQTT I HD I I LEGPGPGFKTLIQ PFI LYAH I QGPGPG LYWYKTGI SN I SEVYGPGPG EVFEFAFKD LFVVYRGPGPGHKA
    I E LQMALQG LAQGPGPGAK FVAAWT LKAAA
    (ID SEC N° 162)
    FIGURA 8 cont .1
    D.
    GCCACCTGCGTGAGCCACAGGGGCC TCTACAACGCCGCCAGCACCGACC TGCGGGAC CACATCGACTACAATGC TGC TGCCGCTACAATGTGCCGGCACTACAAGCGGAACGCC ATCCTGTACGCCCACATCCAGTGCCTGAATGCTGCCGCTGGCACACTGGGCATCGTG TGCCCCGTGAATGCCGCCGCCTGCTACAGCCTGTACGGCACCACC TTCAAGGCCGCT GCCGAC TCCGTGTACGGCGACACCC TGGAACGGAACCAGGTGGTGCCCGCCTACAAC ATCTCTAAGAATGCCGC TCTGTACAACCTGCTGATCCGGTGCTTTAAGGCTGCCTTC GTGTACATCCCCCTGTTTCTGATCAACTAC TACATGACCGACGCCGGCACATGGGGA GCCGTGGTGCTGCTGCTGGTGCGGTACAAGAATGCCGCCATCAGCGACTACCGGCAC TACTGCTACAAGGCCGCCACCGTCAGCGCCACCCAGCTGGTGAAGAAGGCCAGCACA GCCGCCGCTCTCTATTGGTATAAAAAAGCCGCCTTTGTGGTGTACCGGGACAGCATC CCCAAGAACGCCAGCTACTTCGGCATGAGCTTCATCCACTTCAAAGCCGCCTACATG CTGGACCTCCAGCCCG AGACCGTGAACGCTGCCGTGTACGACTTCGCCTTCCGGGAC CTGTGCATTAAAGCCGCAC TCCAGGACAAGATCATCGACCATTATAAAGCAGCCACC CTGCATGATATTATTCTGGAATGCGTGAAGAAGCTGACCAACACCGGCCTCTATAAC GTGGGAGCCGCCGCCTCTGTGATCTGCTTCGTGAACAGCAAGGGGGCTGCCGCCATG TATGTGTGCTGCCACGTGCCCCTGAACGCCTCTC TCCAGGATATTGAGATCACCTGT GTGAAGTGCCTGTACCTGCACATTCAGTCTCTGAATGCCGCCACCAAGTACCCCCTG CTGAAGAACGTGTATGTCTTTTGCTTCCTGCTGCCCATGAACGCCAAGCAGGGCGCC ATGCTGGCCGTGTTCAAAAAGGCCGCCCTGAGCCAGATGGTGCAGTGGGCCTACAAA GCCGCCCCTTACGCCGTGTGCGACAAGTGTTITAAGGCCGCCACAGTGTACGTGTTT TGTTTTCTGCTGAATGCCGCTGCCGCCACCC TCCAGGACATCGTGCTGCACGGCGCC AAGTCCCTGTTCGGCATGTCCCTGATGAAGAATGGCACCGGCTGCAACGGCTGGTTC TACAACGCCCGGTTCCACAACATCCGGGGCAGGTTTAAAGCCGCCAAGCTGCTGTCT AAGCTGCTGTGTGTGAACGCCGCCGCTTCCACCGTGAGCGTGGGCACCGCCAAGAAC GTGGCCTGGGACAGCGTGTACTACATGAAAGCAGCAGCCGGGTACAACACCTTCTAC ATCGAGTTTAAAGCTGCCGCCCTGTACGGCGTGAGCTTCAGCGAGCTGAAGCAGGTG GACTACTACGGCCTGTACTATAACGCCGCCAAGAGCGCCATCGTGACCCTGACCTAT AAAGCCGCCGCCACACTGGAAAAGCTGACCAATACAGGGCTGTACAATGCCGGCCTG TATTACGTGCACGAGGGCATCCGGACCTACTTCGTGCAGGGCCCAGGGCCAGGCTTC CTGAACACCGTGGCCATCCCCGACTCCGTGCAGATCCTGGTCGGCCCAGGACCAGGG CAGCGGTTCCACAATATCAGAGGCCGGTGGACCGGCAGATGCATGGGCCCAGGACCT GGCACAAATACCGGACTGTATAATCTGCTGATTCGCTGCCTGCGGTGCCAGGGTCCA GGACCAGGCATCGAGTTTATCACCTTTCTGGGCGCCCTGAAGAGC TTCCTGAAAGGA CC TGGACCAGGACCCGAGTGGATTCAGCGGCAGACCGTGCTCCAGCACAGCTTCAAC GGACCCGGACCCGGCC TGTTCGTGGTGTACAGAGACTCCATCCCCCACGCCGCC TGT CACAAGGGACCTGGACCAGGCATCAGGACCCTGGAGGACCTGCTGATGGGCACCCTG GGCATTGTGGGGCCTGGACCTGGACTGGATCTCCAGCCTGAAACCACCGACCTGTAC TGCTACGAGCAGGGGCCAGGACCTGGGCTCCAGGCTATCGAACTCCAGCTGACCCTG GAAACCATCTACAATGGCCCCGGACCAGGCTTCCAGCAGCTGTTCCTGAATACCCTG AGCTTCGTGTGCCCTTGGGGACCAGGGCCCGGATGGAAGCACATGCGGC TGGAATGC GCCATCTACTACAAGGCCAGAGGCCCAGGACCCGGACTGTGCACCGAAC TCCAGACC ACCATCCACGACATCATTCTGGAAGGACCAGGGCCAGGCTTTAAGACCCTGATCCAG CCCTTCATTCTGTATGCCCACATTCAGGGACCTGGGCCTGGCCTGTATTGGTATAAG ACCGGCATCAGCAACATC TCCGAGGTGTACGGGCCTGGACCAGGCGAGGTGTTCGAG TTCGCCTTCAAGGATCTGTTTGTGGTGTATAGAGGCCCCGGACC TGGCCACAAGGCC ATTGAACTCCAGATGGCCCTCCAGGGGCTGGCCCAGGGACCAGGCCCTGGCGCCAAG TTCGTGGCCGCCTGGACCCTGAAAGCCGCCGCC
    (ID SEC N° 163) FIGURA 8 cont .2
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