BR112019027488A2 - partículas semelhantes a vírus quiméricas e usos destas como redirecionadores de respostas imunológicas antígeno-específicos - Google Patents

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Abstract

Esta invenção refere-se a partículas semelhantes a vírus (VLPs) quiméricas montadas a partir de um polipeptídeo que compreende uma proteína L1 ou proteína L1/L2 do papilomavírus (PV) e um peptídeo alvo compreendendo um epítopo de células T CD8+ derivado de um patógeno humano. Esta invenção também se refere a métodos que utilizam as VLPs quiméricas como redirecionadores de respostas imunológicas antígeno-específicos.

Description

“PARTÍCULAS SEMELHANTES A VÍRUS QUIMÉRICAS E USOS DESTAS COMO REDIRECIONADORES DE RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS ANTÍGENO-ESPECÍFICOS”
[0001] Este pedido reivindica o benefício da prioridade do pedido no. 62 / 676.566 depositado em 25 de maio de 2018 e pedido no. 62 /
524.308, depositado em 23 de junho de 2017, incorporado neste documento em sua totalidade por referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] Esta invenção refere-se a partículas semelhantes a vírus (VLPs) quiméricas montadas a partir de um polipeptídeo quimérico compreendendo uma proteína L1 do papilomavírus (PV) ou uma proteína L1/L2 compreendendo um(s) peptídeo(s) que contém um epítopo de células T CD8+ derivado de um(s) patógeno(s) humano(s), composições que compreendem essas VLPs quiméricas e usos terapêuticos das VLPs quiméricas no redirecionamento e estímulo da imunidade inata e adaptativa para o tratamento de cânceres.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0003] Segundo o Instituto Nacional do Câncer, a taxa geral de mortes por câncer continua a diminuir: as taxas gerais de incidência de câncer caíram para os homens e estabilizaram para as mulheres. A sobrevivência de cinco anos também melhorou para a maioria, mas não todos os cânceres comuns. E, no entanto, estima-se que em 2017 haverá 1.688.780 novos casos de câncer diagnosticados e 600.920 mortes por câncer somente nos EUA.
[0004] Os linfócitos T CD8+ citotóxicos (geralmente chamados linfócitos T citotóxicos ou LTCs) podem matar seletivamente células cancerígenas e, assim, a imunoterapia antígeno-específica baseada em antígenos associados a tumores foi buscada como uma metodologia promissora para controlar tumores. Foram feitas tentativas de usar essa imunoterapia para estimular o sistema imunológico e visar e eliminar especificamente células tumorais. Tais terapias são atraentes por serem específicas para os alvos e potencialmente menos tóxicas sem autoimunidade não específica. Elas também são consideradas menos invasivas ou traumáticas em comparação com cirurgia, radiação ou quimioterapia. No entanto, as vacinas contra o câncer baseadas em antígenos associados a tumores tiveram um sucesso limitado até o momento devido à baixa imunogenicidade clínica, tolerância imunológica e baixo resultado clínico. Além disso, esses métodos normalmente requerem a identificação de um antígeno associado ao tumor para visar especificamente o tumor. Além disso, há uma crescente apreciação de que o microambiente tumoral pode compreender fatores imunossupressores, por exemplo, proteínas de checkpoint (CP), por exemplo, PD-1/PD-L1, CTLA-4/(B7-1/B7-2), CD86, GITR, LAG3, VISTA, TIGIT e CD137L, que podem inibir eliminação das células cancerígenas pelas células T. As proteínas de CP podem prejudicar a fase indutiva ou efetora da resposta imune induzida pelos esforços direcionados de imunoterapia com antígeno. Para superar essa imunossupressão, inibidores de CP imunes têm sido utilizados para bloquear proteínas de CP e resgatar células T específicas para antígenos tumorais prejudicados no microambiente tumoral, tornando-as mais capazes de eliminar células cancerígenas. Apesar de inovadora, a taxa de resposta dos inibidores de CP é de cerca de 30%, na melhor das hipóteses, pois sua eficácia requer a existência de uma resposta imunológica específica antitumoral. Assim, ainda há a necessidade de composições e métodos que produzam ou reúnam fortes respostas duráveis das células T para inibir o crescimento, a progressão e a metástase do tumor.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[0005] A presente invenção é direcionada a uma partícula semelhante a vírus (VLP) quimérica montada a partir de um polipeptídeo compreendendo uma proteína L1 do papilomavírus (PV), uma proteína PV L1 recombinante ou uma proteína PV L1 e proteína L2. A VLP quimérica desta invenção também compreende um(s) peptídeo(s) alvo. Um peptídeo alvo como definido neste documento compreende um epítopo de célula T reconhecido por uma célula T CD8+ com memória preexistente. Em uma modalidade desta invenção, a VLP quimérica desta invenção compreende um peptídeo(s) alvo exibido na superfície. Em algumas modalidades, o peptídeo alvo é anexado ou conjugado à superfície da VLP e, em algumas modalidades, o peptídeo alvo é inserido de forma recombinante na proteína L1 ou L2, de modo que o peptídeo alvo seja exibido na superfície da VLP montada. O peptídeo alvo compreende um epítopo de célula T de outro patógeno humano e, em algumas modalidades, o peptídeo alvo não é um peptídeo de um papilomavírus. Em algumas modalidades, o peptídeo alvo não compreende um epítopo murino de E7 (aa49-57). A invenção também é dirigida a composições compreendendo as VLPs quiméricas da invenção e métodos para usar as VLPs quiméricas no tratamento de câncer.
[0006] Em um aspecto da invenção, o peptídeo alvo é derivado de um patógeno humano, por exemplo, um vírus, uma bactéria, um fungo ou um parasita, e não é um antígeno associado a um tumor. O vírus inclui, entre outros, um vírus vaccinia, vírus varicela zoster, adenovírus, arbovírus, vírus Epstein-barr, coronavírus, citomegalovírus, vírus de Coxsackie, vírus Herpes zoster, da rubéola, vírus da hepatite, por exemplo, vírus da hepatite A ou vírus da hepatite B ou vírus da hepatite C, vírus do herpes simplex tipo 1 ou tipo 2, vírus JC, influenza tipo A ou tipo B, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus da parainfluenza, poliovírus, vírus da varíola (varíola), vírus da raiva, vírus sincicial respiratório, rinovírus, rotavírus, vírus da dengue, vírus da ebola, vírus do Nilo Ocidental, vírus da febre amarela ou vírus zika.
[0007] Em um aspecto desta invenção, a VLP é montada a partir de proteínas L1 de qualquer membro da família Papillomaviridae. Em um aspecto da invenção, a proteína L1 do papiloma é uma proteína L1 de um vírus papiloma animal (por exemplo, PV de coelho-de-cauda-de-algodão, PV de camundongo ou PV de bovino) ou um PV humano (HPV), por exemplo, HPV 16, HPV18, HPV5, HPV31 etc. Em um aspecto da invenção, a proteína L1 do papiloma é uma proteína L1 de um bovino (BPV) ou um HPV. Em um aspecto desta invenção, a VLP é uma RG1-VLP. O RG1-VLP é montado a partir de uma proteína 16 L1 do HPV que é modificada para apresentar os aminoácidos 17-36 do HPV16 L2 (epítopo RG1) dentro da alça de superfície DE do HPV16 L1 (Schellenbacher et al. 2013 J. Invest Dermatol; 133 (12): 2706-2713; Slupetzky et al., 2007 Vaccine 25: 2001-10; Kondo et al. 2008 J. Med. Virol 80; 841-6; Schellenbacher et al. 2009 J. Virol 83: 10085-95; Caldeira et al. 2010 Vaccine 28: 4384-93.)
[0008] Em um aspecto da invenção, o peptídeo alvo está ligado à VLP. Em um aspecto da invenção, o terminal N ou terminal C do peptídeo alvo é conjugado com um resíduo de aminoácido na superfície da VLP. O resíduo da superfície pode ser, por exemplo, uma cisteína, uma lisina ou uma arginina. Muitos métodos para conjugar um peptídeo a uma proteína são conhecidos na técnica, ver, por exemplo, Bioconjugate Techniques, 3ª Edição (2013) Autor, Greg T. Hermanson, Ionescu et al. Journal of Pharmaceutical Sciences, Jan 2006, 95 (1): 70-79, e Jones et al., Journal of the American Chemical Society, 2012, 134: 1847-1852, todos incorporados a este documento por referência para divulgação de tais métodos.
[0009] Em um aspecto desta invenção, a VLP é montada a partir da proteína L1 do papilomavírus ou da proteína L1 e da proteína L2 e, em seguida, sujeita a condições de redução suficientes para reduzir as ligações dissulfeto aos grupos sulfidril dos resíduos de cisteína na VLP, mantendo a estrutura de icosaedro semelhante ao capsídeo da VLP e o peptídeo alvo é conjugado com o grupo sulfidril através de uma ligação dissulfeto ou uma ligação maleimida. Em uma modalidade desta invenção, a cisteína está na superfície da VLP. Em um aspecto desta invenção, o peptídeo alvo é conjugado a um grupo sulfidil de uma cisteína da proteína L1 da VLP. Em um aspecto desta invenção, o peptídeo alvo é conjugado a um grupo sulfidilo de uma cisteína da proteína L2 da VLP. Em um aspecto da invenção, a cisteína não faz parte de uma sequência poli-iônica:cisteína, policatiônica:cisteína ou polianiônica:cisteína. Em um aspecto desta invenção, a VLP é montada a partir da proteína L1 do papilomavírus ou da proteína L1 e da proteína L2 e o peptídeo alvo é conjugado ao grupo sulfidril de uma cisteína da VLP montada por meio de uma ligação dissulfeto ou uma ligação maleimida em que a reação de conjugação é realizada em atmosfera de nitrogênio. Em uma modalidade desta invenção, a cisteína está na superfície da VLP.
[0010] Em um aspecto desta invenção, a VLP é montada a partir da proteína L1 do papilomavírus ou da proteína L1 e da proteína L2 e, em seguida, sujeita a condições ambientais de pH básico, mantendo a estrutura de icosaedro semelhante ao capsídeo da VLP e o peptídeo alvo com um grupo maleimida no terminal N é conjugado a uma amina primária em um grupo lisina e/ou guanidil em um resíduo arginina da VLP por meio da reação de adição 1-4. Em uma modalidade desta invenção, a lisina e/ou a arginina estão na superfície da VLP.
[0011] Em um aspecto desta invenção, a VLP é montada a partir da proteína L1 do papilomavírus, ou da proteína L1 e da proteína L2, depois sujeita a condições ambientais de pH básico, mantendo a estrutura de icosaedro semelhante ao capsídeo da VLP e o peptídeo alvo com o grupo di- bromo ou di-iodo maleimida no seu terminal N é conjugado a um grupo amina primário em um resíduo de lisina e/ou um grupo guanidil em um resíduo de arginina da VLP via reação de adição 1-4. Em uma modalidade desta invenção, a lisina e/ou a arginina estão na superfície da VLP.
[0012] Em um aspecto desta invenção, a VLP é montada a partir da proteína L1 do papilomavírus ou da proteína L1 e da proteína L2 e, em seguida, sujeita a condições ambientais de pH básico, mantendo a estrutura de icosaedro semelhante ao capsídeo da VLP e o peptídeo alvo N-
protegido com um grupo éster N-hidroxissuccinimida no terminal C é conjugado a um grupo amina primária em um resíduo lisina e/ou grupo guanidil em um resíduo arginina na VLP por meio da reação de formação de amida. Em uma modalidade desta invenção, a lisina e/ou a arginina estão na superfície da VLP.
[0013] Em um aspecto da invenção, o peptídeo alvo está ligado a uma alça da proteína PV L1, por exemplo, uma alça BC, CD, DE, EF, FG, FG ou HI. Em um aspecto da invenção, o peptídeo alvo está ligado à alça DE, alça H1 ou alça-hélice B4 de uma proteína L1 de HPV. Em um aspecto da invenção, o alvo é anexado à alça-hélice B4, por exemplo, entre os aminoácidos 430 e 433 do HPV16 L1, ou anexado à alça DE, por exemplo, entre os aminoácidos 133/134 de PV bovino (BPV), ou os aminoácidos equivalentes 136/137 de um PV, incluindo, entre outros, um HPV.
[0014] Em uma modalidade da invenção, o peptídeo alvo ou a VLP não compreende uma sequência poli-iônica:cisteína, policatiônica:cisteína ou polianiônica:cisteína, para conjugar o peptídeo alvo à VLP para formar uma VLP quimérica. Em uma modalidade da invenção, nem o peptídeo alvo ou a VLP compreende uma sequência poli-iônica:cisteína, policatiônica:cisteína ou polianiônica:cisteína, para conjugar o peptídeo alvo à VLP para formar uma VLP quimérica desta invenção.
[0015] Os peptídeos alvo podem ser conjugados às VLPs via ligação dissulfeto, ver Pejawar-Gaddy et al. Cancer Immunol Immunother (2010) 59 (11): 1685-1696 incorporado a este documento na sua totalidade por referência.
[0016] Em um aspecto da invenção, o peptídeo alvo é inserido de forma recombinante em uma alça da proteína L1 do PV, por exemplo, uma alça BC, CD, DE, EF, FG, ou HI da proteína L1 do PV. Em um aspecto da invenção, o peptídeo alvo é inserido na alça DE ou alça-hélice B4 de uma proteína L1 do HPV. Em um aspecto da invenção, o alvo é inserido na alça-hélice B4 entre os aminoácidos 430 e 433 do HPV16 L1, ou inserido na alça DE entre os aminoácidos 133/134 do PV bovino (BPV) ou os aminoácidos equivalentes 136 / 137 de um HPV.
[0017] Em um aspecto da invenção, um peptídeo carregado, por exemplo, 9 ácidos glutâmicos ou 9 aminoácidos de arginina é inserido de forma recombinante em uma alça da proteína L1 do PV. Um peptídeo alvo é então conjugado aos peptídeos carregados na alça. A alça pode ser, por exemplo, uma alça BC, CD, DE, EF, FG ou HI da proteína L1 do PV. Em um aspecto da invenção, o peptídeo alvo é conjugado a um peptídeo carregado na alça DE ou alça-hélice B4 de uma proteína L1 do HPV. Em um aspecto da invenção, o peptídeo alvo é inserido na alça-hélice B4 entre os aminoácidos 430 e 433 do HPV16 L1, ou na alça DE entre os aminoácidos 133/134 do PV bovino (BPV) ou os aminoácidos equivalentes 136 / 137 de um HPV.
[0018] Em um aspecto da invenção, as VLPs são montadas primeiro a partir de uma proteína L1 do papilomavírus, ou proteínas L1 e L2, e um peptídeo alvo compreendendo um epítopo de célula T CD8+ derivado de um patógeno humano é então anexado à VLP para gerar uma VLP quimérica com um peptídeo alvo exibido na superfície. Em um aspecto da invenção, o peptídeo alvo é ligado à proteína L1 ou L2 e, em seguida, a VLP é montada de modo a que o peptídeo alvo seja exibido na superfície. O peptídeo alvo pode ser ligado à proteína L1 ou à proteína L2 da VLP ou a ambas as proteínas L1 e L2 da VLP. A ligação do peptídeo alvo à VLP pode ser feita conjugando o peptídeo alvo à VLP através de uma ligação dissulfeto, maleimida ou amida.
[0019] A VLP quimérica também pode ser gerada de forma recombinante e montada a partir de uma proteína L1 do papiloma vírus ou proteínas L1 e L2, em que a proteína L1 ou a proteína L2 inseriu nele um peptídeo alvo, de modo que o peptídeo alvo seja exibido na superfície na VLP montada.
[0020] Em uma modalidade da invenção, o peptídeo alvo é ligado a uma VLP por um ligante.
Em uma modalidade da invenção, o peptídeo alvo compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de, um epítopo de célula T CD8+ e um ligante.
Em um aspecto da invenção, o ligante compreende uma sequência de aminoácidos que é reconhecida e clivada por uma ou mais enzimas expressas por uma célula tumoral ou presente no microambiente do tumor.
O(s) sítio(is) de clivagem(s) pode ser posicionado no peptídeo alvo de modo que a clivagem do(s) sítio(s) libere um peptídeo do peptídeo alvo em que o peptídeo liberado compreende, consiste essencialmente em, ou consiste no epítopo de célula T CD8+. O peptídeo liberado é capaz de se ligar a uma MHC de modo que o complexo seja reconhecido por e ative as especificações CTL preexistentes específicas para o epítopo de célula T CD8+ do peptídeo liberado.
A enzima pode ser, por exemplo, furina, metaloproteinases da matriz (MMPs), por exemplo, MMP, 1, 2, 3, 7, 8, 9, 11, 13, 14 ou 19, um ADAM (uma desintegrina e metaloproteinase), por exemplo, ADAMS 8, 9, 10, 15, 17 ou 28, uma catepsina, por exemplo, catepsina B, D, D, G ou H, N.
Elastase, proteinase-3, azurocidina ou ADAMTS- 1, ou uma enzima no proteassoma de uma célula tumoral humana.
O sítio de clivagem da enzima pode ser, por exemplo, RX-K/RR (SEQ ID NO: 209) em que X pode ser qualquer aminoácido, por exemplo, RVKR (SEQ ID Nº: 210) ou um substrato de peptídio clivável por MMP, por exemplo, Glu-Pro-Cit-Gly-Hof- Tyr-Leu (SEQ ID Nº: 211) ou Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln ** (SEQ ID Nº: 212) ou Pro-Val- Gly-Leu-Ile-Gly (SEQ ID Nº: 213). Em um aspecto da invenção, o sítio de clivagem não é um sítio de clivagem de furina ou um sítio de clivagem de metaloproteinases de matriz (MMPs). Em um aspecto da invenção, o sítio de clivagem não é um sítio de clivagem para um ou mais MMP, 1, 2, 3, 7, 8, 9, 11, 13, 14 ou 19, uma ADAM (uma desintegrina e metaloproteinase), por exemplo, ADAMS 8, 9, 10, 15, 17 ou 28, uma catepsina, por exemplo, catepsina B, D, D, G ou H, N.
Elastase, proteinase-3, azurocidina ou ADAMTS-1). Em um aspecto da invenção, o peptídeo alvo não compreende um sítio de clivagem enzimática.
[0021] Em um aspecto da invenção, o peptídeo alvo compreende um epítopo de célula T CD8+ de um ou mais patógenos humanos, por exemplo, um parasita, uma bactéria ou um vírus.
[0022] O peptídeo alvo derivado desse patógeno é preferencialmente um que compreende um epítopo de célula T CD8+ que se liga a uma molécula de classe I do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC). A molécula de MHC de classe I pode ser, por exemplo, um MHC classe I de uma família HLA-A, B ou C. A molécula de MHC de classe I pode ser, por exemplo, uma molécula de MHC de classe I mencionada na Tabela 1 ou Tabela 2. A molécula de MHC de classe I pode ser, por exemplo, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01/HLA-A*11:01, HLA-A*0201, HLA-A*020101, HLA-A*0203, HLA- A*0206, HLA-A2, HLA-A2.1 ou HLA-A*02.
[0023] Em um aspecto da invenção o patógeno é um vírus incluindo, entre outros, um vírus vaccinia, vírus varicela zoster, adenovírus, arbovírus, vírus Epstein-barr, coronavírus, citomegalovírus, vírus de Coxsackie, vírus Herpes zoster, vírus do herpes simplex tipo 1 ou tipo 2, vírus JC, vírus da rubéola, vírus da hepatite, por exemplo, vírus da hepatite A ou vírus da hepatite B ou vírus da hepatite C, vírus influenza tipo A ou tipo B, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus da parainfluenza, poliovírus, vírus da varíola (varíola), vírus da raiva, vírus sincicial respiratório, rinovírus, rotavírus, vírus da dengue, vírus da ebola, vírus do Nilo Ocidental, vírus da febre amarela ou vírus zika. O epítopo da célula T CD8+ pode ser de um vírus da poliomielite, um vírus do sarampo, um vírus Epstein Barr, um vírus influenza, um citomegalovírus (CMV) ou um vírus da hepatite.
[0024] Em um aspecto da invenção, o patógeno é uma bactéria. Exemplos não limitativos dessa bactéria incluem: bordatella pertussis, chlamydia trachomatis, Clostridium tetani, difteria, haemophilus influenza, meningococos, pneumococos, vibrio cholera, Mycobacterium tuberculosis,
BCG, tifoide, E. coli, salmonela, Legionella pneumophila, rickettsias, Treponema pallidum pallidum, estreptococos grupo A ou grupo B, Streptococcus pneumonia, Bacillus anthracis, chostridium botulinum, Yersinia sp, por exemplo, yerisnia pestis.
[0025] Em um aspecto da invenção, o patógeno é um parasita. Exemplos não limitativos de tais parasitas incluem enamoeba histolytica, toxoplasma gondii, trichinella sp., por exemplo, trichinella spiralis, um trichomonas sp., por exemplo, tricomnas vaginalis, um trypanosoma sp., por exemplo, trypanosoma brucei gambiense, Trypanosoma brucei rhodesiense, Trypanosoma cruzi.
[0026] A invenção também é direcionada a métodos de utilização das VLPs e composições quiméricas da presente invenção para inibir crescimento, proliferação e metástase de tumores.
[0027] Em uma modalidade da presente invenção, as VLPs quiméricas da presente invenção, como descritas neste documento, encontram uso na detecção de células que apresentam antígenos com moléculas de MHC capazes de se ligar e exibir o epítopo da célula T CD8+ do peptídeo alvo e na detecção de células T CD8+ que reconhecem o epítopo da célula T CD8+ do peptídeo alvo. Por exemplo, os esplenócitos de um animal com uma resposta imune preexistente podem ser co-cultivados com VLPs quiméricas desta invenção e as células co-cultivadas avaliadas para a reativação de células T utilizando, por exemplo, coloração por imunofluorescência e ensaios de ativação de células T CD8+ por interferon- gama conhecidos na técnica. VLPs puras, isto é, VLPs sem um peptídeo alvo podem ser usadas como controles negativos.
[0028] Um aspecto da invenção descrita neste documento é um método para inibir o crescimento e/ou progressão e/ou metástase do tumor, aproveitando a imunidade preexistente conferida por infecções anteriores e/ou vacinas contra vários patógenos. Os métodos descritos neste documento capitalizam o fato de que grandes populações de pessoas são expostas a ou imunizadas contra vários patógenos. Adicionalmente, com relação aos últimos registros de sua imunização e vacinação, são acessíveis. Por exemplo, grandes populações de pessoas durante a infância são ativamente vacinadas contra uma variedade de patógenos com vacinas bastante conhecidas na técnica. Nos métodos descritos neste documento, uma pessoa versada na técnica pode determinar prontamente o histórico de vacinação/imunização ou histórico de infecção de um sujeito com um tumor e, em seguida, administrar uma VLP quimérica apropriada, que exiba um peptídeo alvo compreendendo um epítopo de célula T relacionado à vacina para desencadear as células T de memória CD8+ existentes do sujeito.
[0029] O método da invenção é vantajoso em relação aos métodos preexistentes porque não requer a identificação de um antígeno associado a um tumor específico, a fim de direcionar as células T para um tumor específico. Assim, os métodos descritos neste documento podem ser aplicados a todos os tumores em um sujeito que foi previamente vacinado contra ou infectado por um patógeno para inibir seu crescimento, progressão e metástase, independentemente do antígeno associado ao tumor que as células tumorais expressam.
[0030] Em um aspecto da invenção, para determinar quais VLP quiméricas administrar ao sujeito, verifica-se se o sujeito foi imunizado ativamente com uma vacina contra um determinado patógeno, por exemplo, um vírus, por exemplo, influenza a, hepatite, sarampo ou poliomielite, uma bactéria, por exemplo, meningicoccus, um fungo, por exemplo, candida albicans ou um parasita. Uma VLP quimérica que compreende um peptídeo alvo que contém um epítopo de célula T CD8+ do patógeno contra o qual o sujeito foi imunizado é então administrada. Em um aspecto da invenção, para determinar quais VLP(s) administrar ao sujeito, verifica-se se o sujeito foi naturalmente infectado com um determinado patógeno, por exemplo, um vírus, por exemplo, influenza a, hepatite, sarampo ou poliomielite, uma bactéria, por exemplo, meningicoccus, um fungo, por exemplo, candida albicans ou um parasita. Uma VLP quimérica que compreende um peptídeo alvo que contém um epítopo de célula T CD8+ desse patógeno é então administrada ao sujeito. O epítopo de célula T CD8+ é aquele que se liga a uma molécula de MHC de classe I. Exemplos não limitantes de epítopo de células T CD8+ que se liga a moléculas de MHC de classe I específicas são apresentados na Tabela 1 e Tabela 2 (ver Rickinson e Moss, Ann. Rev. Immunology (1997) 15: 405-431, incorporado a este documento por referência). O método descrito neste documento também pode compreender a determinação de qual(is) determinante(s) de MHC de classe I o sujeito expressa e, em seguida, administrar uma VLP quimérica compreendendo o peptídeo alvo com o epítopo de célula T CD8+ conhecido por formar um complexo com esse(s) determinante(s) de MHC de classe I.
[0031] Uma modalidade da invenção é um método para inibir ou impedir o crescimento, progressão e/ou metástase de um tumor ou proliferação de células cancerígenas em um sujeito com necessidade do mesmo, compreendendo as etapas de determinação da fonte de tecido do tumor, determinando se o sujeito foi vacinado contra ou infectado por um patógeno possuindo um tropismo para a fonte de tecido e administrando ao sujeito uma VLP quimérica que compreende um epítopo de célula T CD8+ do patógeno ou o componente antigênico da vacina. Em um aspecto da invenção, as VLPs quiméricas são administradas ao sujeito em uma quantidade suficiente para estimular células T CD8+ que reconhecem o epítopo CD8+ em complexo com uma molécula de MHC de classe I e redirecionam sua atividade citotóxica para o tumor. Em um aspecto desta invenção, as VLPs quiméricas são administradas numa quantidade suficiente para inibir o crescimento, progressão e/ou metástase de um tumor. As VLPs quiméricas também podem ser administradas ao sujeito em uma quantidade que seja suficiente para inibir a proliferação de células cancerígenas e/ou induzir apoptosis das células cancerígenas.
[0032] Uma modalidade da invenção é um método para inibir ou impedir o crescimento, progressão e/ou metástase de um tumor ou proliferação de células cancerígenas em um sujeito com necessidade do mesmo, compreendendo determinação de se o sujeito foi vacinado ativamente contra ou infectado por um patógeno possuindo um tropismo para o tecido com a massa do tumor e administrando ao sujeito uma VLP quimérica que compreende um epítopo de célula T CD8+ do patógeno ou o componente antigênico da vacina contra o qual o sujeito foi imunizado. Em um aspecto da invenção, as VLPs quiméricas são administradas ao sujeito em uma quantidade que é suficiente para estimular as células T CD8+, por exemplo, células T de memória residente no tecido no tecido com a massa tumoral, que reconhecem o epítopo CD8+ em complexo com uma molécula de MHC de classe I e redireciona sua atividade citotóxica para o tumor. Em uma modalidade da invenção, a massa do tumor e o tecido onde o tumor reside são tipos diferentes de tecido, por exemplo, uma metástase hepática no tecido pulmonar ou uma metástase de tumor pulmonar no tecido cerebral.
[0033] Uma modalidade da invenção é um método para inibir ou impedir o crescimento, progressão e/ou metástase de um tumor ou proliferação de células cancerígenas, compreendendo as etapas para determinar se um sujeito com tumor foi previamente vacinado contra um patógeno, por exemplo, parasita, uma bactéria ou um vírus, por exemplo, um ou mais vírus do sarampo, vírus influenza, vírus da hepatite ou vírus da poliomielite e, em seguida, administrar a esse paciente uma quantidade eficaz de VLP(s) quimérica(s) compreendendo um peptídeo alvo exibido na superfície derivado dos patógenos contra os quais o sujeito foi vacinado. O peptídeo alvo compreende um epítopo de célula T CD8+ do componente antigênico contido na vacina. Uma modalidade dos métodos desta invenção inclui a etapa de determinação de se um sujeito com tumor foi previamente infectado com um patógeno, por exemplo, parasita, bactéria ou vírus, por exemplo, um ou mais vírus de sarampo, vírus influenza, um vírus da hepatite ou um vírus da poliomielite e, em seguida, administrar a esse paciente uma quantidade eficaz de VLP(s) quimérica(s) compreendendo um peptídeo exibido na superfície compreendendo um epítopo de célula T CD8+ derivado de tais patógenos. As VLPs quiméricas são administradas ao sujeito em uma quantidade que é suficiente para inibir o crescimento, progressão e/ou metástase de um tumor. As VLPs quiméricas também podem ser administradas ao sujeito em uma quantidade que seja suficiente para inibir a proliferação de células cancerígenas e/ou induzir apoptosis das células cancerígenas. Este método pode ainda compreender determinar se o indivíduo foi ou não vacinado contra um patógeno pré-selecionado possui células T de memória contra o patógeno, isto é, CTLs preexistentes que reconhecem um epítopo de célula T CD8+ do patógeno. Se o sujeito não tiver esses CTLs, o método compreende ainda uma etapa adicional de “reforço” que compreende a revacinação do sujeito contra o patógeno. Após o indivíduo ter sido revacinado, a VLP quimérica compreendendo um epítopo de célula T CD8+ do patógeno é administrada em uma quantidade suficiente para ligar o tumor, redirecionando assim os CTLs específicos para células T CD8+ ao tumor com VPL quimérica ligada. Os métodos para testar um sujeito para CTLs ativados específicos para um determinado epítopo de célula T CD8+ são bem conhecidos na técnica.
[0034] Também uma modalidade da invenção é um método para inibir ou impedir o crescimento, progressão e/ou metástase de um tumor, ou proliferação de células cancerígenas, em um indivíduo não exposto, isto é, um sujeito que não possui CTLs preexistentes específicos para um epítopo de um patógeno pré-selecionado. Um sujeito não exposto inclui, por exemplo, um sujeito que não foi previamente vacinado ativamente contra, ou naturalmente imunizado contra/exposto ao patógeno. As células do sujeito também podem ser testadas quanto à presença de CTLs específicos para epítopos de um patógeno pré-selecionado. Se puder ser determinado que um sujeito foi vacinado ou exposto a um patógeno, por exemplo, revisando os registros de vacinação do sujeito ou perguntando ao sujeito se ele foi vacinado contra, exposto a ou contraiu uma doença específica. O método compreende vacinar ativamente um indivíduo não exposto que dele necessite com uma vacina contra um patógeno pré-selecionado. Após a vacinação do sujeito, uma VLP quimérica desta invenção exibindo o epítopo de célula T CD8+ do patógeno é administrada ao sujeito em uma quantidade suficiente para que a VLP quimérica se ligue ao tumor, redirecionando assim os CTLs específicos do epítopo da célula T CD8+ para as células do tumor com VLP quimérica algutinada. Ao redirecionar os CTLs para as células do tumor ligadas à VLP quimérica, o crescimento, progressão e/ou metástase do tumor, ou proliferação de células cancerígenas, são inibidos ou impedidos. Em uma modalidade, a VLP quimérica é administrada ao sujeito 1 semana, 2 semanas ou mais após a vacinação do sujeito para permitir a ativação dos CTLs antes da administração da VLP quimérica. Em uma modalidade da invenção, o sujeito não exposto é vacinado contra o patógeno pré-selecionado e, em seguida, o sujeito é monitorado quanto à presença de células CTL ativadas específicas para um epítopo de célula T CD8+ da vacina. Após a detecção desses CTLs ativados, a VLP quimérica compreendendo o epítopo de célula T CD8+ é administrada ao sujeito. A VLP quimérica é administrada em uma quantidade suficiente para ligar o tumor e redirecionar os CTLs específicos para o epítopo de célula T CD8+ da VLP quimérica para os tumores ligados. Os CTLs redirecionados inibem ou impedem o crescimento, progressão e/ou metástase do tumor ou proliferação de células cancerígenas. A vacina pode ser contra qualquer patógeno conforme descrito neste documento, por exemplo, sarampo, caxumba, catapora ou hepatite B.
[0035] Foi relatado que os capsídeos do HPV (VLP e pseudovírus (PsV)) apresentam tropismo tumoral e se ligam e infectam diretamente células tumorais, incluindo, por exemplo, células de câncer de ovário e pulmão. Ver Kines et al. International Journal of Cancer (15 de fevereiro de 2016) 138 (4): 901–911 incorporado neste documento por referência. Kines relata que essa ligação pode ser dependente de proteoglicanos de heparan sulfato (HSPG). Sem desejar estar vinculado pela teoria, é contemplado que as VLPs quiméricas descritas neste documento se liguem preferencialmente às células tumorais, por exemplo, elas se ligam mais às células tumorais do que às células não tumorais, e a presença de VLPs quiméricas pode resultar em um microambiente tumoral pró-inflamatório positivo que atrai células T CD8+ infiltradas. Ao mesmo tempo, as VLPs podem estimular uma resposta das células T de memória adaptativa resultantes de uma vacinação ou infecção anterior e que reconhecem o epítopo de célula T CD8+ do peptídeo alvo. Está contemplado que essas respostas fortes são capazes de contornar a tolerância imunológica e tornar as células tumorais suscetíveis a essa imunidade preexistente, inibindo desse modo o crescimento, progressão e metástase do tumor.
[0036] As VLPs quiméricas descritas neste documento ou composição compreendendo as VLPs quiméricas podem ser administradas a um sujeito necessitando das mesmas por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, intraocular, intradérmica, intratumoral, transmucosal ou como um aerossol.
[0037] Em outra modalidade da presente invenção, as VLPs quiméricas da presente invenção são administradas ao sujeito com um tumor em conjunto com outra terapia anticâncer, por exemplo, radioterapia, quimioterapia, imunoterapia ou cirurgia. Por exemplo, as VLPs quiméricas são administradas ao sujeito com um tumor juntamente com um inibidor de checkpoint. Os inibidores de checkpoint conhecidos na técnica e úteis na invenção incluem, entre outros, ipilimumabe (Yervoy®), pembrolizumabe (Keytruda®) e nivolumabe (Opdivo®), Atezolizumabe (Tecentriq), Avelumabe (Bavencio), Durvalumabe (Imfinzi). Os esquemas de administração e dosagem para inibidores de checkpoint são estabelecidos nas informações de prescrição para cada inibidor de checkpoint, incorporado a este documento por referência.
[0038] Agentes quimioterapêuticos são bem conhecidos na técnica e incluem, entre outros, aflibercept, asparaginase, bleomicina, bussulfano, carmustina, clorambucil, cladribina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, daunorrubicina, doxorrubicina, etoposídeo, fludarabina, gemcitabina, hidroxiureia, idarubicina, ifosfamida, irinotecano, lomustina, mecloretamina, melfalano, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitoxantrona, pentostatina, procarbazina, topotecano, vinblastina, vincristina, ácido retinóico, oxaliplatina, carboplatina, 5-fluorouracila, teniposídeo, ansacrina, docetaxel, paclitaxel, vinorelbina, bortezomibe, clofarabina, capecitabina, actinomicina D, epirubicina, vindesina, metotrexato, 6-tioguanina, tipifarnibe, imatinib, erlotinibe, sorafenibe, sunitinibe, dasatinibe, nilotinibe, lapatinib, gefitinibe, temsirolimus, everolimo, rapamicina, bosutinibe, pazopanibe, axitinib, neratinibe, vatalanibe, pazopanibe, midostaurina, enzastaurina, trastuzumabe, cetuximab, panitumumab, rituximab, bevacizumabe, mapatumumab, conatumumab e lexatumumab. Os métodos para usar esses agentes também são bem conhecidos na técnica.
[0039] Também uma modalidade desta invenção é uma composição farmaceuticamente aceitável compreendendo as VLPs quiméricas desta invenção e um ou mais carreadores ou excipientes. A composição pode compreender, por exemplo, um único tipo de VLP quimérica ou uma pluralidade de VLPs quiméricas, de modo que pelo menos duas das VLPs quiméricas não compreendam o mesmo peptídeo alvo.
[0040] Outro aspecto da invenção é um kit compreendendo as VLPs quiméricas da invenção. O kit pode compreender instruções para determinar o histórico de vacinação/imunização de um sujeito e/ou histórico de infecção e para administrar uma VLP quimérica apropriada no kit ao sujeito. Uma VLP quimérica apropriada compreende um peptídeo alvo compreendendo um epítopo de célula T CD8+ de um patógeno para o qual o sujeito foi imunizado ativamente ou de um patógeno que já havia infectado o sujeito anteriormente. As instruções também podem incluir instruções para determinar o complemento da molécula de MHC de classe I expresso pelo sujeito, ou espera-se que seja expresso pelo sujeito com base em sua ancestralidade racial e administrar uma VLP quimérica apropriada no kit para o sujeito em que a VLP quimérica apropriada compreende um epítopo de célula T CD8+ do patógeno que se liga a uma molécula de MHC de classe I expressa ou que se espera que seja expressa pelo sujeito.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0041] A Figura 1 representa uma modalidade de um método da invenção descrita neste documento. As VLPs quiméricas com um peptídeo alvo compreendendo um epítopo de célula T CD8+ imunogênico reconhecido pela imunidade preexistente (por exemplo, MMR, catapora, poliomielite) se ligam seletivamente às células tumorais, de modo que a tolerância imune é contornada e a imunidade preexistente é usada para controlar os tumores que ligam as VLPs quiméricas: o sujeito quando criança recebe várias vacinas aprovadas, que produzem forte imunidade tanto nas células T quanto nas respostas de anticorpos (pontos brancos) (I); como adulto, infelizmente, o sujeito desenvolve câncer, o histórico de vacinação do sujeito é avaliado e o sujeito recebe uma VLP(s) quimérica(s) da presente invenção compreendendo um epítopo de célula T CD8+ do patógeno contra o qual o sujeito foi vacinado (III). As células T CD8+ estimuladas existentes, a resposta imune de remoção, são redirecionadas para atacar os tumores que ligaram a VLP quimérica (III), resultando em inibição do crescimento, progressão e/ou metástase do câncer (IV). Em uma modalidade, o epítopo de CTL pode ainda ser de um vírus com tropismo natural do tecido até o órgão de interesse onde o tumor reside.
[0042] A Figura 2 representa um TEM que mostra que as
VLPs conjugadas são ligeiramente maiores (60-70 nM) em comparação com as VLPs não conjugadas vazias (50 nM).
[0043] A Figura 3 mostra uma análise SDS PAGE de VLPs de HPV 16 RG-1 (painel esquerdo) ou VLPs de HPV 16 L1 do tipo selvagem (painel direito) conjugados a epítopos derivados de vírus influenza, hepatite B, sarampo e catapora.
[0044] A Figura 4 representa os resultados de uma análise por citometria de fluxo da ligação de VLP a células tumorais. O deslocamento da população de células demonstra a ligação da VLP a todas as linhagens celulares de tumor testadas. A linha superior mostra os resultados da ligação das VLPs vazias de HPV16 RG-1 às várias linhagens celulares de tumor e a linha inferior mostra os resultados da VLP do papilomavírus bovino (BPV) com um peptídeo inserido de forma recombinante em uma das alças L1.
[0045] A Figura 5 representa os resultados de uma análise por citometria de fluxo da VLP quimérica compreendendo um peptídeo alvo. Os resultados demonstram que a capacidade de ligação ao tumor das VLPs quiméricas não foi comprometida pela conjugação de peptídeos na superfície da VLP.
[0046] A Figura 6 demonstra a ativação de CTL específicos de OT-1, avaliada por CD8 de superfície e coloração intracelular por IFN-γ, seguida por análise por citometria de fluxo.
[0047] A Figura 7 demonstra a ativação de CTL específico de E7, conforme avaliado por CD8 de superfície e coloração intracelular por IFN-γ, seguida por análise por citometria de fluxo.
[0048] A Figura 8 mostra os resultados da geração de imagens por bioluminescência com base na expressão de luciferase por células ID8/luc vivas. Essas células normalmente não são reconhecidas pelas células T CD8+ específicas de OVA. Os resultados demonstram a incubação com AIR- VLPs (VLP quimérica compreendendo um peptídeo alvo OVA), e não com
VLPs não conjugadas vazias, resultaram nas células tumorais sendo reconhecidas por células T CD8+ específicas para OVA. A incubação com as AIR-VLPs levou ao maior número de morte de células tumorais mediada pela morte de células T CD8+ específicas para OVA, demonstrada por uma diminuição significativa na atividade de luminescência.
[0049] A Figura 9 mostra os resultados da geração de imagens por bioluminescência com base na expressão de luciferase por células ID8/luc vivas. Essas células geralmente não são reconhecidas por CTLs específicos de E7aa49-57. As células tumorais ID8/luc foram tratadas com 0,3μg/ml de VLPs não conjugadas vazias ou VLP-R-E7 quimérica (VLPs de papilomavírus bovino conjugados ao epítopo HPV16-E7 de murino restrito a H2-DB (aa49-57), um antígeno associado a tumor) e depois incubou CTLs específicos para E7aa49-57. Foi observada uma atividade de luciferase significativamente menor para células tumorais ID8 tratadas com VLP-R-E7 quimérica e incubadas com CTLs específicos de E7, indicando uma redução significativa na viabilidade das células tumorais ID8 após o tratamento.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0050] Os papilomavírus são pequenos vírus tumorais de DNA circular de fita dupla. As cápsulas do vírion do papilomavírus contêm a proteína do capsídeo principal L1 e a proteína do capsídeo secundária L2. Sabe-se que a expressão da proteína L1 sozinha ou combinada à proteína L2 em sistemas de expressão eucariótica ou procariótica resulta na montagem de capsômeros e VLPs. Como utilizado neste documento, o termo "capsômero" significa um conjunto pentamérico de polipeptídeos L1 do papilomavírus (incluindo a proteína L1 completa e seus fragmentos). As proteínas nativas do capsídeo L1 se automontam através de ligações dissulfeto intermoleculares para formar pentâmeros (capsômeros).
[0051] O vírion do papilomavírus contém 72 pentâmeros (capsômeros) da proteína L1. Trus et ai., 4 Nat. Struct. Biol. 413-20 (1997). A proteína L1 é capaz de se automontar em estruturas semelhantes ao capsídeo que são morfologicamente indistinguíveis de vírions nativos quando expressas em células eucarióticas. Ver Buck et ai., 82 J. Virol. 5190-97 (2008) e Roy et al., 4 Hum. Vaccin. 5-12 (2008), ambos incorporados a este documento por referência. O monômero L1 contém 12 filamentos β, 6 alças (BC, CD, DE, EF, FG, HI) e 5 hélices (H1-H5). A maioria das alças está altamente exposta em direção à superfície externa do capsídeo, a ligação de um peptídeo alvo a uma dessas alças, por exemplo, ligação dissulfeto, ligação maleimida, química de "clique" ou ligação a um sítio de ancoragem poliônico, como descrito neste documento, nessas áreas resultará no peptídeo alvo sendo exibido na superfície externa das VLPs.
[0052] Uma modalidade desta invenção é uma VLP quimérica, compreendendo uma proteína L1 do papilomavírus (PV) ou uma proteína PV L1 e PV L2 e um peptídeo alvo exibido na superfície. O peptídeo alvo compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de, um epítopo de célula T CD8+ de um patógeno humano, em que o epítopo de célula T CD8+ não é um antígeno associado a um tumor. Em um aspecto desta invenção, o peptídeo alvo é conjugado a um grupo sulfidril reduzido de uma cisteína da VLP e, opcionalmente, a cisteína não faz parte de uma sequência poli- iônica:cisteína, policatiônica:cisteína ou polianiônica:cisteína. A VLP pode compreender ambas as proteínas L1 e L2 do papiloma. Os peptídeos alvo podem ser conjugados a um grupo(s) sulfidril reduzido(s) da proteína L1 e/ou da proteína L2 através de uma ligação dissulfeto ou ligação maleimida. Em um aspecto desta invenção, o peptídeo alvo é conjugado à lisina e/ou uma arginina da VLP através de uma ligação amida.
[0053] Como utilizado neste documento, o termo "partícula semelhante a vírus" ou "VLP" refere-se a uma partícula composta por um conjunto de capsômeros de ordem superior. As VLPs são não infecciosas e não replicantes, mas morfologicamente semelhantes ao vírion do papilomavírus nativo. Um exemplo de um conjunto de ordem superior é uma partícula que tem a aparência visual de um capsídeo de papilomavírus vazio inteiro (72 capsômeros) ou substancialmente inteiro, que tem cerca de 50 a cerca de 60 nm de diâmetro e tem uma construção icosaédrica T=7. Outro exemplo de uma montagem de ordem superior é uma partícula de cerca de 30 a cerca de 35 nm de diâmetro, que é menor que o tamanho de um vírus de papilomavírus nativo e tem uma construção T = 1 (contendo 12 capsômeros). Para fins da presente invenção, também se pretende que outros conjuntos de capsômeros de ordem superior sejam abrangidos pelo termo VLP. Em certas modalidades, as VLPs podem replicar epítopos conformacionais do papilomavírus nativo dos quais a proteína ou polipeptídeo L1 ou proteína ou polipeptídeo L2 são derivados. Os métodos para montagem e formação de VLPs e capsômeros de papilomavírus humano da presente invenção são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Patente US Nº. 6,165,471, Nº. 6,153,201 e 9,149,503, bem como WO 94/020137, todos os quais são incorporados a este documento na sua totalidade por referência.
[0054] A presente invenção refere-se a VLPs quiméricas de papilomavírus, composições compreendendo as VLPs quiméricas, métodos para a produção de VLPs quiméricas e uso das VLPs quiméricas no tratamento de tumores. As VLPs quiméricas de papilomavírus desta invenção compreendem um peptídeo alvo. Em algumas modalidades, o peptídeo alvo compreende um epítopo de célula T CD8+, consiste essencialmente de um epítopo CD8+, ou consiste de um epítopo de célula T CD8+. Em algumas modalidades, o peptídeo alvo compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em, um epítopo de célula T CD8 + e um ligante para anexar o peptídeo alvo à VLP. O ligante pode compreender um sítio de clivagem enzimática para liberar o epítopo da célula T CD8+ da VLP. Em um aspecto da invenção, o epítopo da célula T CD8+ é de um patógeno humano, por exemplo, um parasita, um fungo, uma bactéria ou um vírus. Exemplos não limitantes de um vírus incluem um vírus vaccinia, vírus varicella zoster, um vírus Herpes zoster, vírus da rubéola, da hepatite, por exemplo, vírus da hepatite A ou vírus da hepatite B ou vírus da hepatite C, influenza, por exemplo, tipo A ou tipo B, vírus do sarampo, vírus da caxumba, um poliovírus, vírus da varíola (varíola), vírus da raiva, vírus da dengue, vírus do ebola, vírus do Nilo Ocidental, vírus da febre amarela, um vírus zika.
[0055] Exemplos não limitativos de uma bactéria incluem: bordatella pertussis, chlamydia trachomatis, Clostridium tetani, difteria, haemophilus influenza, meningococos, pneumococos, vibrio cholera, Mycobacterium tuberculosis, BCG, tifoide, E. coli, salmonela, Legionella pneumophila, rickettsias, Treponema pallidum pallidum, estreptococos grupo A ou grupo B, Streptococcus pneumonia, Bacillus anthracis, chostridium botulinum, Yersinia sp, por exemplo, yerisnia pestis.
[0056] Exemplos não limitantes de parasita incluem Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, uma Trichinella sp., por exemplo, Trichinella spiralis, um Trichomonas sp., por exemplo, Trichomonas vaginalis, um Trypanosoma sp., por exemplo, Trypanosoma brucei gambiense, Trypanosoma brucei rhodesiense, Trypanosoma cruzi ou um Plasmodium, por exemplo, Plasmodium falciparium, Plasmodium vivax, ou Plasmodium malariae.
[0057] Em um aspecto da invenção, o epítopo das células T CD8+ é de um vírus da poliomielite, um vírus do sarampo, um vírus de Epstein Barr, um vírus influenza A ou um citomegalovírus (CMV) ou um vírus da hepatite B. Em um aspecto da invenção, o epítopo de célula T CD8+ é um epítopo de célula T apresentado na Tabela 1. Em um aspecto da invenção, o epítopo de célula T CD8+ é: KLWESPQEI (SEQ ID Nº: 6), YVYDHSGEAVK (SEQ ID Nº: 15), FLPSDFFPSV (SEQ ID Nº: 69), FLLTRILTI (SEQ ID Nº: 70), WLSLLVPFV (SEQ ID Nº: 71),
GLSRYVARL (SEQ ID Nº: 72), FLLSLGIHL (SEQ ID Nº: 73), (K)GILGFVFTL(T)(V) (SEQ ID Nº: 217), KLSTRGVQIASNEN (SEQ ID Nº: 125), RGLQRRRFVQNALNGNG (SEQ ID Nº: 131), FMYSDFHFI (SEQ ID Nº: 136), NLVPMVATV (SEQ ID Nº: 151), VAIIEVDNEQPTTRAQKL (SEQ ID Nº: 152), TRAQKLFAMWRITYKDTV (SEQ ID Nº: 153), Qualquer sequência de 9-meros de GACVAIIEVDNEQPTTRAQKLFAMWRITYKDTVQLRRKL (SEQ ID Nº: 154), SVRDRLARL (SEQ ID Nº:167), LLDRVRFMGV (SEQ ID Nº: 217), CLGGLLTMV (SEQ ID Nº: 196) ou GLCTLVAML (SEQ ID Nº: 143). SLPRSRTPI (SEQ ID Nº: 218) ou SAPLPSNRV (SEQ ID Nº: 219).
[0058] Em um aspecto da invenção, o epítopo da célula T CD8+ do peptídeo alvo liga-se a uma molécula de MHC de classe I. A molécula de MHC de classe I pode ser das famílias HLA-A, B, C. A molécula de MHC de classe I pode ser uma molécula de MHC de classe I mencionada na Tabela 1 ou Tabela 2. A molécula de MHC de classe I pode ser, por exemplo, HLA- A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*11:01, HLA-A*0201, HLA-A*020101, HLA- A*0203, HLA-A*0206, HLA-A2, HLA-A2.1, ou HLA-A*02.
[0059] Em um aspecto da invenção, o peptídeo alvo tem cerca de 8 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos de comprimento, ou cerca de 8 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos de comprimento, ou cerca de 8 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos de comprimento, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos de comprimento, ou cerca de 8 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos de comprimento, cerca de 8 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos de comprimento, com cerca de 8 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos de comprimento, com cerca de 8 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos de comprimento. Em um aspecto da invenção, o peptídeo alvo é de cerca de 13 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos de comprimento, ou cerca de 13 aminoácidos a cerca de 45 aminoácidos de comprimento, ou cerca de 13 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos de comprimento, cerca de 13 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos de comprimento, ou cerca de 13 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos de comprimento, cerca de 13 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos de comprimento, cerca de 13 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos de comprimento, é cerca de 13 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos de comprimento. Em um aspecto da invenção, o epítopo de célula T CD8+ pode ter, por exemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17 aminoácidos de comprimento.
[0060] Em uma modalidade da invenção, a VLP quimérica do papilomavírus compreende um polipeptídeo L1 e um peptídeo alvo. Em outras modalidades, a VLP quimérica pode compreender um polipeptídeo L1 e um polipeptídeo L2 e um peptídeo alvo. O polipeptídeo L1 pode ser uma proteína L1 completa ou um fragmento de polipeptídeo L1. Em modalidades específicas, proteína L1 completa ou o fragmento de polipeptídeo L1 é capaz de montar a VLP; ou seja, o polipeptídeo L1 se automonta para formar capsômeros que são capazes de automontagem em conjuntos de ordem superior, formando assim uma VLP. Em modalidades mais específicas, as VLPs compreendem um capsídeo do papilomavírus totalmente montado, uma estrutura de cerca de 50 nm e composta por 72 capsômeros ou 360 cópias da proteína L1.
[0061] As sequências L1 são conhecidas por substancialmente todos os genótipos do papilomavírus identificados até o momento, e qualquer uma dessas sequências ou fragmentos L1 pode ser empregado na presente invenção. Exemplos de polipeptídeos L1 incluem, entre outros, polipeptídeos L1 completos (por exemplo, polipeptídeo HPV16 L1, SEQ ID Nº: 205), truncamentos L1 que não possuem o terminal C nativo, truncamentos L1 que não possuem o terminal N nativo e truncamentos L1 que não possuem um domínio interno. Ver Conway et ai., 88(4) J. Dental Res. 307- 17 (2009); Chen et ai., 5 Mol. Cell. 557-67 (2000); e Paintsil et al., 223 (1) Virology 238-44 (1996), todos incorporados a este documento na sua totalidade por referência. A proteína LI pode ser, por exemplo, uma proteína L1 modificada, por exemplo, uma proteína HPV16 L1 modificada, em que os aminoácidos 17-36 do HPV16 L2 (epítopo RG1) são inseridos dentro da alça DE de superfície do HPV16 L1 (Schellenbacher et al. 2013 J. Invest Dermatol; 133 (12): 2706-2713; Slupetzky et al., 2007 Vaccine 25: 2001-10; Kondo et al. 2008 J. Med. Virol 80; 841-6; Schellenbacher et al. 2009 J. Virol 83: 10085-95; Caldeira et al. 2010 Vaccine 28: 4384-93).
[0062] O polipeptídeo L2 pode ser uma proteína L2 completa ou um fragmento de polipeptídio L2. As sequências L2 são conhecidas por substancialmente todos os genótipos do papilomavírus identificados até o momento, e qualquer uma dessas sequências ou fragmentos L2 pode ser empregado na presente invenção. Exemplos de polipeptídeos L2 incluem, entre outros, polipeptídeos L2 completos (por exemplo, polipeptídeo HPV16 L2, SEQ ID Nº: 207), truncamentos L2 que não possuem o terminal C nativo, truncamentos L2 que não possuem o terminal N nativo e truncamentos L2 que não possuem um domínio interno.
[0063] As VLPs de papilomavírus podem ser formadas usando os polipeptídeos L1 e opcionalmente L2 de qualquer papilomavírus animal, ou seus derivados ou fragmentos. Assim, qualquer sequência L1 e L2 opcional conhecida (ou identificada posteriormente) de papilomavírus humanos, bovinos, equinos, ovinos, suínos, cervos, caninos, felinos, roedores,
coelhos, etc., pode ser empregada para preparar as VLPs ou capsômeros da presente invenção. Ver de Villiers et al., Virology 324: 17-27 (2004), para uma lista quase completa dos genótipos de papilomavírus e sua relação, incorporada a este documento por referência.
[0064] Em certas modalidades, os polipeptídeos L1 e opcionalmente L2 que são usados para formar as VLPs são de um papilomavírus não humano ou de um genótipo de papilomavírus humano diferente de HPV-6, HPV-11, HPV-16 e HPV-18. Por exemplo, as proteínas L1 e/ou L2 podem ser de HPV 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 15, 17, 23, 27, 31, 33, 35, 38, 39, 45, 51, 52, 58, 66, 68, 70, 76, ou 92.
[0065] Em modalidades particulares, uma VLP quimérica (se compreende um polipeptídeo L1 ou polipeptídeos L1 e L2) compreende uma região de aminoácidos carregados negativamente em uma área exposta à superfície que é capaz de se ligar a um peptídeo alvo que compreende uma região de aminoácidos carregados positivamente. Em modalidades adicionais, a região de aminoácidos carregados negativamente pode ser flanqueada, em um ou nos dois lados, por um ou mais resíduos de cisteína (referidos como polianiônicos:cisteína ou, mais especificamente, ácido poliglutâmico:cisteína ou ácido poliaspártico:cisteína). Nesses casos, a conjugação da VLP e do peptídeo alvo resultaria da ligação não covalente entre as cargas complementares de aminoácidos da VLP e do peptídeo alvo e uma ligação dissulfeto entre as cisteínas. Em outras modalidades, a(s) cisteína(s) está(ão) a um ou mais aminoácidos de distância da região de aminoácidos carregados, de modo que qualquer estrutura secundária/terciária traga a região de aminoácidos carregada em estreita proximidade com a(s) cisteína(s). Ver, por exemplo, a Publicação US Nº 2014/0050753 publicada em 20 de fevereiro de 2014, incorporada a este documento na íntegra por referência. Em uma modalidade da invenção, o peptídeo alvo compreende um epítopo de célula T CD8+, por exemplo, os epítopos de célula T CD8+ da Tabela 1 ou Tabela 2, e uma sequência poli-iônica:cisteína para anexar o peptídeo alvo a uma VLP compreendendo uma sequência poli-iônica:cisteína complementar. Em uma modalidade da invenção, o peptídeo alvo compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um epítopo de célula T CD8+ e uma sequência poli-iônica:cisteína para anexar o peptídeo alvo a uma VLP compreendendo uma sequência poli-iônica:cisteína complementar e um sítio de clivagem enzimática posicionado entre a cisteína terminal e o epítopo de célula T CD8+. Em uma modalidade da invenção, o peptídeo alvo compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de uma cisteína terminal, um epítopo de célula T CD8+, por exemplo, os epítopos de célula T CD8+ da Tabela 1 ou Tabela 2 e um sítio de clivagem enzimática posicionado entre a cisteína terminal e o epítopo de célula T CD8+.
[0066] Os aminoácidos com carga negativa que podem ser utilizados na produção da VLP quimérica incluem, por exemplo, ácido glutâmico e ácido aspártico. Esses aminoácidos podem ser utilizados isoladamente (por exemplo, ácido poliglutâmico) ou em conjunto. Em uma modalidade específica, a região compreende ácido glutâmico. O número de aminoácidos carregados negativamente pode variar e pode incluir cerca de 4 a cerca de 20 aminoácidos, cerca de 6 a cerca de 18 aminoácidos, cerca de 8 a cerca de 16 aminoácidos e similares. Em uma modalidade específica, a região compreende cerca de 8 aminoácidos carregados negativamente. Em uma modalidade mais específica, a região compreende EEEEEEEEC (E8C) (SEQ ID Nº: 214). Em outra modalidade, a região compreende CEEEEEEEEC (SEQ ID Nº: 215). Para um método para conjugar peptídeos alvo a VLPs via ligação dissulfeto, ver, por exemplo, Pejawar-Gaddy et al. Cancer Immunol Immunother (2010) 59 (11): 1685-1696 incorporado a este documento na sua totalidade por referência. Resumidamente, a presença de uma fração poliarginina-cisteína no peptídeo alvo permite ancoragem do peptídeo ao sítio polianiônico (EEEEEEEEC, E8C (SEQ ID Nº: 214)) presente nas várias alças das partículas L1. A reticulação covalente entre os dois resíduos de cisteína deve tornar essa associação irreversível em condições oxidantes. Para as reações de conjugação, partículas purificadas de HPV são dialisadas em tampão de conjugação (Tris/HCl 20 mM pH = 7,5, NaCl 150 mM, glicerol a 5%, CaCl2 0,5 mM) e, em seguida, o peptídeo e os reagentes oxidantes são adicionados, permitindo que a reação prossiga por 16 horas a 4°C. No final da incubação, as misturas de reação são aplicadas a uma coluna de exclusão de tamanho (Sephadex G-100, Pharmacia, volume 20 ml, vazão de 1 ml/min, Tris/HCl 10 mM (pH = 7,4), NaCl 150 mM, CaCl2 0,5 mM) para remover peptídeo não conjugado e trocar o tampão. As partículas conjugadas que eluem no volume vazio são identificadas pela presença da proteína L1 em SDS-PAGE. As partículas conjugadas são analisadas por microscopia eletrônica. Um versado na técnica pode, através de experimentação de rotina, criar uma VLP que inclua uma região poli-iônica em uma área exposta à superfície (por exemplo, uma ou mais alças) e que seja capaz de montar a VLP.
[0067] Em modalidades alternativas, a VLP do papilomavírus quimérico é projetado para compreender uma região de aminoácidos carregados positivamente e uma ou mais cisteínas (policatiônica:cisteína) em uma área exposta à superfície que é capaz de se ligar a um peptídeo alvo que compreende uma região de aminoácidos de carga negativa e uma ou mais cisteínas (polianiônico:cisteína).
[0068] Em modalidades específicas, uma VLP quimérica compreende um polipeptídeo L1 (por exemplo, completo) em que uma região de aminoácidos polianiônica:cisteína é inserida em uma ou mais alças do polipeptídeo L1 (por exemplo, alça HI). Tais regiões podem, por exemplo, ser inseridas na sequência de aminoácidos que codifica uma alça específica (sem exclusão dos aminoácidos L1 correspondentes), inserção e substituição dos aminoácidos L1 na alça, ou mesmo uma inserção e exclusão parcial de aminoácidos L1 na alça específica). Em modalidades específicas, uma VLP quimérica compreende um polipeptídeo L2 (por exemplo, completo) em que uma região de aminoácidos polianiônica:cisteína está inserida no mesmo. A inserção pode ser sem deleção dos aminoácidos L2 correspondentes ou pode ser inserida e aminoácidos podem ser deletados do polipeptídeo L2. Uma pessoa versada na técnica usando experimentação de rotina pode otimizar a VLP quimérica para a colocação das sequências de aminoácidos polianiônicas para se adequar a peptídeos alvo específicos.
[0069] Alternativamente, para ligação dos peptídeos alvo à VLP, as proteínas L1 e/ou L2 da VLP também podem ser modificadas para compreender pelo menos um primeiro aminoácido não natural (também referido neste documento como aminoácido não natural ou aminoácido não canônico (nnAA)) em um sítio de interesse e os dois ou mais peptídeos alvo podem ser modificados para compreender pelo menos um segundo aminoácido não natural, em que o primeiro aminoácido não natural é diferente do e reativo com o segundo aminoácido não natural. Ver, por exemplo, a Publicação US Nº 2016/0206715 publicada em 21 de julho de 2016, incorporada a este documento por referência. Um exemplo de um primeiro aminoácido não natural é a azidohomoalanina. Um exemplo de um segundo aminoácido não natural é a propargiloxifenilalanina. O grupo funcional azida da azidohomoalanina incorporada a uma proteína de capsídeo de uma VLP pode participar de uma reação de clique de cicloadição (3+2) com um grupo funcional alcino de propargiloxifenilalanina incorporada em um peptídeo alvo, resultando em VLP reticulada em um peptídeo alvo. Outras proteínas de capsídeo contendo aminoácidos não naturais dentro da mesma VLP podem participar de maneira semelhante na reação de clique de cicloadição (3+2) para produzir uma VLP com dois ou mais peptídeos alvo. Em outra modalidade, a VLP quimérica pode exibir um peptídeo alvo e um CpG. Em outra modalidade, a VLP quimérica pode exibir um peptídeo alvo e um ácido nucleico ou um ácido nucleico modificado. Em outra modalidade, a VLP quimérica pode exibir dois ou mais peptídeos alvo e um CpG. Em uma modalidade separada, a VLP quimérica pode exibir dois ou mais peptídeos alvo e um ácido nucleico ou um ácido nucleico modificado.
[0070] Em uma modalidade da invenção, a VLP contém pelo menos um ou pelo menos dois aminoácidos não naturais por subunidade de monômero do capsídeo. Por exemplo, pelo menos um vigésimo do número total de aminoácidos não naturais em uma VLP pode ser usado para anexar um peptídeo alvo ou ácido nucleico para produzir a VLP quimérica. Em outra modalidade, cerca de um quarto do número total de aminoácidos não naturais em uma VLP pode ser usado para anexar um peptídeo alvo ou ácido nucleico. Em uma modalidade adicional, cerca de um terço do número total de aminoácidos não naturais em uma VLP pode ser usado para anexar um peptídeo alvo ou ácido nucleico. Em ainda outra modalidade, cerca de metade do número total de aminoácidos não naturais em uma VLP pode ser usada para conectar um peptídeo alvo ou ácido nucleico.
[0071] Em um aspecto desta invenção, a VLP é montada a partir da proteína L1 do papilomavírus ou da proteína L1 e da proteína L2 e, em seguida, sujeita a condições de redução suficientes para reduzir os grupos sulfidril dos resíduos de cisteína na superfície da VLP, mantendo a estrutura de icosaedro semelhante ao capsídeo da VLP e o peptídeo alvo é conjugado ao grupo sulfidril via uma ligação dissulfeto ou uma ligação maleimida. Em uma modalidade desta invenção, a cisteína está na superfície da VLP. Em um aspecto desta invenção, a VLP é montada a partir da proteína L1 do papilomavírus ou da proteína L1 e da proteína L2 e o peptídeo alvo é conjugado ao grupo sulfidril de uma cisteína por meio de uma ligação dissulfeto ou uma ligação maleimida em que a reação de conjugação é realizada sob atmosfera de nitrogênio. Em uma modalidade desta invenção, a cisteína está na superfície da VLP.
[0072] Em um aspecto desta invenção, a VLP é montada a partir da proteína L1 do papilomavírus ou da proteína L1 e da proteína L2 e, em seguida, sujeita a condições ambientais de pH básico, mantendo a estrutura de icosaedro semelhante ao capsídeo da VLP e o peptídeo alvo com um grupo maleimida no terminal N é conjugado a uma amina primária em um grupo lisina e/ou guanidil em um resíduo arginina da VLP por meio da reação de adição 1-4. Em uma modalidade desta invenção, a lisina e/ou a arginina estão na superfície da VLP.
[0073] Em um aspecto desta invenção, a VLP é montada a partir da proteína L1 do papilomavírus, ou da proteína L1 e da proteína L2, depois sujeita a condições ambientais de pH básico, mantendo a estrutura de icosaedro semelhante ao capsídeo da VLP e o peptídeo alvo com o grupo di- bromo ou di-iodo maleimida no seu terminal N é conjugado a um grupo amina primário em um resíduo de lisina e/ou um grupo guanidil em um resíduo de arginina da VLP via reação de adição 1-4. Em uma modalidade desta invenção, a lisina e/ou a arginina estão na superfície da VLP.
[0074] Em um aspecto desta invenção, a VLP é montada a partir da proteína L1 do papilomavírus ou da proteína L1 e da proteína L2 e, em seguida, sujeita a condições ambientais de pH básico, mantendo a estrutura de icosaedro semelhante ao capsídeo da VLP e o peptídeo alvo N- protegido com um grupo éster N-hidroxissuccinimida no terminal C é conjugado a um grupo amina primária em um resíduo lisina e/ou grupo guanidil em um resíduo arginina por meio da reação de formação de amida. Em uma modalidade desta invenção, a lisina e/ou a arginina estão na superfície da VLP.
[0075] Em vez de anexar o peptídeo alvo à VLP via, por exemplo, ligação de aminoácidos carregados negativa e positivamente, ou via conjugação à base de maleimida, uma sequência de ácido nucleico que codifica o peptídeo alvo pode ser inserida no ácido nucleico que codifica a proteína L1 e/ou proteína L2, de modo que após a expressão, é produzida uma proteína de fusão, em que o peptídeo alvo é inserido em uma alça do polipeptídeo L1 e/ou na proteína L2 e exibido na superfície da VLP.
[0076] Além disso, em uma modalidade da invenção, na
VLP quimérica, pelo menos um décimo das proteínas do revestimento viral pode exibir um peptídeo alvo. Noutra modalidade, pelo menos um quinto das proteínas do revestimento viral pode exibir um peptídeo alvo. Em ainda outra modalidade, cerca de metade das proteínas do revestimento viral pode exibir um peptídeo alvo. Em uma modalidade adicional, cerca de dois terços das proteínas do revestimento viral podem exibir um peptídeo alvo. Em ainda outra modalidade, quase todas as proteínas do revestimento viral podem exibir um peptídeo alvo.
[0077] Em outra modalidade da invenção, a VLP ou os peptídeos alvo podem incluir ainda um ou mais agentes do grupo de: GM-CSF, IL-15, Pam3SK4, poli (I:C), LPS, flagelina, imiquimod e CpG- X e MPL.
[0078] As construções genéticas que codificam a proteína L1 (por exemplo, polipeptídeo L1 de completo ou parcial) e opcionalmente a proteína L2 (por exemplo, polipeptídeo L2 de completo ou parcial) com ou sem uma sequência que codifica o peptídeo alvo, podem ser preparadas de acordo com procedimentos recombinantes padrão bem conhecidos por aqueles versados na técnica. As moléculas de DNA que codificam os vários componentes dos polipeptídios são ligadas entre si para formar uma fusão de genes in-frame que resulta em, por exemplo, uma única fase de leitura aberta que expressa, por exemplo, um polipeptídeo do capsídeo do papilomavírus poliônico (L1 ou L1/L2) ou um polipeptídeo da capsídeo do papilomavírus (L1 ou L1/L2) compreendendo um peptídeo alvo. As sequências de codificação do DNA, ou fases de leitura abertas, que codificam os polipeptídeos L1 e/ou L1/L2 totais ou parciais, podem ser ligados a elementos reguladores apropriados que proporcionam a expressão (isto é, transcrição e tradução) da proteína codificada pela molécula de DNA. Estas sequências reguladoras, tipicamente promotores, elementos potencializadores, sequências líderes, sinais de terminal de transcrição, etc., são bem conhecidas na técnica.
[0079] Em modalidades particulares, as VLPs com ou sem o peptídeo alvo são formadas em células de inseto Sf-9 após a expressão da proteína L1 usando baculovírus recombinante. Os métodos gerais para manipular e preparar vetores de baculovírus e DNA de baculovírus, bem como procedimentos de cultura de células de insetos, são conhecidos por aqueles versados na técnica. Ver, por exemplo, Volpers et al., 69 J. Virol. 3258-64 (1995); Kirnbauer et ai., 67 (12) J. Virol. 6929-36 (1993); Kool et ai., 130 Arch. Virol. 1-16 (1993); Rose et ai., 67 (4) J. Virol. 1936-44 (1993); e Publicação US Nº 20140050753 cada um incorporado a este documento na sua totalidade por referência.
[0080] Quando uma célula hospedeira procariótica é selecionada para transformação subsequente, a região promotora usada para construir a molécula de DNA recombinante deve ser apropriada para o hospedeiro em particular. Como é bem conhecido na técnica, as sequências de DNA de promotores eucarióticos, para expressão em células hospedeiras eucarióticas, diferem das sequências de promotores procarióticos. Os promotores eucarióticos e os sinais genéticos que os acompanham podem não ser reconhecidos ou não funcionar em um sistema procariótico e, além disso, os promotores procarióticos não são reconhecidos e não funcionam em células eucarióticas.
[0081] Assim, as moléculas de DNA que codificam os produtos dos polipeptídios a serem expressos de acordo com a presente invenção podem ser clonadas em um vetor de expressão adequado usando procedimentos de clonagem padrão conhecidos na técnica, incluindo clivagem de enzimas de restrição e ligação com DNA-ligase, como descrito por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Press, NY (2001), e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova York, NY (2008), cada um dos quais é incorporado a este documento por referência na sua totalidade. Moléculas recombinantes, incluindo plasmídeos, podem ser introduzidas nas células por transformação, particularmente transdução, conjugação, mobilização ou eletroporação. Uma vez que estes plasmídeos recombinantes são introduzidos em culturas unicelulares, incluindo organismos procarióticos e células eucarióticas, as células crescem em cultura de tecidos e os vetores podem ser replicados.
[0082] Para a expressão recombinante da proteína L1 do papilomavírus (e opcionalmente uma proteína L2) e o conjunto VLP resultante, os vetores recombinantes produzidos acima são usados para infectar uma célula hospedeira. Qualquer número de combinações vetor-hospedeiro pode ser empregado, incluindo vetores de células vegetais (Agrobacterium) e células vegetais, vetores de leveduras e hospedeiros de leveduras, vetores de baculovírus e células hospedeiras de insetos, vetores de vírus vaccinia e células hospedeiras de mamíferos ou vetores de plasmídeos em E. coli. Os vetores de expressão de mamíferos adicionais incluem aqueles derivados de adenovírus, vírus adeno-associado, nodavírus e retrovírus.
[0083] Em modalidades alternativas, os vetores de expressão recombinantes e sequências reguladoras adequadas para a expressão de VLPs do papilomavírus em células de levedura ou mamífero são bem conhecidos e podem ser utilizados na presente invenção. Ver, por exemplo, Buonamassa et al., 293 (2) Virology 335-44 (2002); Sasagawa et al., 2016 Virology 126-95 (1995); Hagensee et ai., 67 (1) J. Virol. 315-22 (1993). Ver, também, Patente US Nº 7,112,330 e Publicação de Patente US Nº 2008016637, todas incorporadas a este documento por referência.
[0084] Independente do sistema de hospedeiro-vetor utilizado para a expressão recombinante e automontagem de capsômeros e/ou VLPs, esses produtos podem ser isolados das células hospedeiras e depois purificados usando técnicas conhecidas. Em uma modalidade, as VLPs quiméricas de papilomavírus podem ser purificadas por centrifugação em gradientes de CsCl ou sacarose. Ver Sasagawa et al., 2016 Virology 126-95
(1995); Volpers et ai., 69 J. Virol. 3258-64 (1995); Rose et ai., 75 J. Gen. Virol. 2445-49 (1994); Kirnbauer et ai., 67 (12) J. Virol. 6929-36 (1993); Rose et ai., 67 (4) J. Virol. 1936-44 (1993). Preparações de VLP substancialmente puras podem ser conjugadas a um peptídeo alvo e depois usadas nos métodos desta invenção.
[0085] Em uma modalidade da invenção deste documento, a proteína L1 e a proteína L2 são essencialmente as versões do tipo selvagem, exceto a ligação ou inserção do peptídeo alvo e as mudanças nas sequências L1 e L2 necessárias para a ligação. No entanto, um trabalhador qualificado reconhecerá que variantes da proteína L1 e L2 também podem ser usadas, desde que a proteína possa tolerar a inserção ou ligação de um peptídeo alvo adequado e possa se montar em uma VLP ou pelo menos em um pentâmero (capsômero). Vários exemplos de tais variantes foram descritos. Por exemplo, pode-se usar uma L1 truncada, sem até 10 aminoácidos do seu terminal N ou sem até 30 aminoácidos do seu terminal C. (Ver, por exemplo, Chen et al., J Mol Bio 2001 mar. 16; 307 (1): 173-82, ou Bishoop et al. (2007) Journal of Biological Chemistry 282, 31803-31811, ambos os quais são incorporados por referência para a divulgação de fabricação e uso dessas proteínas L1 truncadas). Em outra modalidade, uma pequena fusão com um peptídeo de cerca de 60 aminoácidos pode ser usada. (Ver, por exemplo, Virology 1997 Jul. 21; 234 (1): 93-111, que é incorporado por referência para a divulgação de tais peptídeos de fusão.) Em outra modalidade, podem ser utilizadas moléculas L1 híbridas, nas quais uma porção da molécula de uma primeira cepa de PV é trocada em uma molécula L1 a partir de uma segunda cepa de PV. Por exemplo, certas porções funcionais da molécula L1, como "alças" expostas externamente da proteína, podem ser trocadas entre moléculas de diferentes cepas de PV. Para exemplos de tais proteínas L1 híbridas, ver, por exemplo, Christensen et al., Virology, dezembro de 2001 20: 291(2):324-34 ou Oroczo et al. (2005) J Virol 79, 9503-9514, ambos os quais são incorporados por referência para divulgações dessas proteínas L1 híbridas.
Outros tipos de variantes serão evidentes para um trabalhador qualificado. Ver, por exemplo, Carter et al., J Virol maio de 2006; 80 (10): 4664-72; White et al. (1999) J. Virology 73, 4882-4889; ou Roden et al. (1997) J Virol 71, 6247-52, todos incorporados a este documento por referência para divulgação de outros tipos de variantes adequadas de L1. Outro exemplo adequado de uma proteína L1 para uso nas VLPs quiméricas desta invenção é uma proteína HPV 16 L1 que é modificada para apresentar os aminoácidos 17-36 (epítopo RG1) do HPV16 L2 17-3 dentro da alça DE de superfície do HPV16 L1 (Schellenbacher et al. 2013 J. Invest Dermatol; 133 (12): 2706-2713; Slupetzky et al., 2007 Vaccine 25: 2001-10; Kondo et al. 2008 J. Med. Virol 80; 841-6; Schellenbacher et al. 2009 J. Virol 83: 10085-95; Caldeira et al. 2010 Vaccine 28: 4384-93, todos incorporados a este documento na íntegra por referência).
[0086] Um peptídeo alvo pode ser projetado para dentro ou sobre uma proteína L1 ou L2 em qualquer um dos vários sítios da proteína, desde que a inserção seja exibida na superfície da VLP e que a inserção não interfira na capacidade da proteína de se montar em uma VLP. A cristalização da VLP L1 HPV16 revelou a estrutura atômica do capsídeo viral, em particular as alças de superfície hipervariáveis que contêm os epítopos imunodominantes e dependentes de conformação que são reconhecidos por anticorpos neutralizantes e determinam o sorotipo viral (Chen et al. (2000) Molecular Cell 5, 557-567, incorporado a este documento por referência). Por conseguinte, sítios adequados para inserção ou ligação de um peptídeo alvo na proteína L1 serão evidentes para um trabalhador qualificado.
[0087] O peptídeo alvo pode ser inserido ou ligado a qualquer uma das alças BC, CD, DE, EF, FG, HI de um polipeptídeo L1 do papilomavírus. Em uma modalidade da invenção, o peptídeo alvo é anexado a ou inserido na alça DE de L1, por exemplo, entre os aminoácidos 133 e 134 de BPV1, entre os aminoácidos 136 e 137 de HPV16 L1 ou entre sítios equivalentes de moléculas L1 de outros papilomavírus. Em outras modalidades da invenção, o peptídeo alvo é anexado ou inserido na alça-hélice B4 (por exemplo, entre os aminoácidos 430 e 433 do HPV16 L1).
[0088] A proteína L1 na qual um peptídeo alvo é anexado ou inserido pode ser de qualquer um dos vários tipos (cepas/genótipos) do papilomavírus (PV), por exemplo, PV humano (por exemplo, HPV 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 15, 16, 17, 18, 23, 27, 31, 33, 35, 38, 39, 45, 51, 52, 58, 66, 68, 70, 76 ou 92), PV bovino (por exemplo, BPV1, BPV2, BPV4, BPV6) ou PV oral canino (COPY).
[0089] Como utilizado neste documento, o termo "antígeno" é uma molécula capaz de ser ligada por um receptor de células T. Um antígeno é adicionalmente capaz de induzir uma resposta humoral e/ou uma resposta imunológica celular, levando à estimulação de linfócitos B e/ou T e, de preferência, em relação à invenção derivada neste documento, o antígeno estimula os linfócitos T CD8+ quando em complexo com uma molécula de MHC de classe I. O aspecto estrutural de um antígeno que dá origem a uma resposta biológica é referido neste documento como um "determinante antigênico" ou "epítopo" que são sinônimos. Os linfócitos B respondem a determinantes antigênicos estranhos via produção de anticorpos, enquanto os linfócitos T são os mediadores da imunidade celular. Assim, determinantes antigênicos ou epítopos são aquelas partes de um antígeno que são reconhecidas por anticorpos, ou no contexto de um MHC, por receptores de células T. Um determinante antigênico ou epítopo não precisa ser uma sequência ou segmento de proteína contíguo/consecutivo e pode incluir várias sequências que não são imediatamente adjacentes uma à outra.
[0090] No que diz respeito a uma sequência de aminoácidos específica, um "epítopo" é um conjunto de resíduos de aminoácidos envolvido no reconhecimento por uma imunoglobulina específica, ou no contexto de células T, os resíduos necessários para o reconhecimento pelas proteínas receptoras de células T e/ou receptores MHC. Os resíduos de aminoácidos de um epítopo não precisam ser contíguos/consecutivos. Em uma configuração do sistema imunológico, in vivo ou in vitro, um epítopo é as características coletivas de uma molécula, como estrutura de peptídio primária, secundária e terciária e carga, que juntas formam um sítio reconhecido por uma imunoglobulina, receptor de célula T, ou molécula HLA.
[0091] Como utilizado neste documento, "epítopo de célula T" significa uma característica de um peptídeo ou proteína que em associação com uma molécula de MHC na superfície de uma célula é reconhecida por um receptor de célula T na iniciação de uma resposta imunológica ao peptídeo compreendendo este antígeno. Acredita-se que o reconhecimento de um epítopo de célula T por uma célula T seja através de um mecanismo em que as células T reconhecem fragmentos de peptídios de antígenos que estão ligados a moléculas de MHC de classe I ou classe II expressas em células apresentadoras de antígeno. Em algumas modalidades da presente invenção, os peptídeos alvo compreendendo o epítopo de célula T e as VLPs quiméricas descritos neste documento encontram uso na detecção de células apresentadoras de antígeno com moléculas de MHC capazes de se ligar e exibir os epítopos de célula T dos peptídeos alvo. Um epítopo de célula T tipicamente requer um peptídeo curto que está ligado a uma molécula de MHC de classe I ou II, formando um complexo ternário (cadeia alfa de MHC de classe I, microglobulina beta-2 e peptídeo) que pode ser reconhecido por uma célula T contendo uma molécula de células T compatível ligando-se ao MHC/complexo de peptídeos com a afinidade apropriada. Os peptídeos que se ligam às moléculas de MHC de classe I têm tipicamente de 8-14 aminoácidos de comprimento e mais tipicamente 9 aminoácidos de comprimento.
[0092] Como utilizado neste documento, "HPV" e "papilomavírus humano" referem-se aos membros da família Papilomavírus que são capazes de infectar seres humanos. Existem dois grupos principais de HPVs definidos por seu tropismo (grupos genital/mucoso e cutâneo), cada um dos quais contém vários "tipos" ou "cepas/genótipos" de vírus (por exemplo, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 32, etc.).
[0093] Segundo a Organização Mundial da Saúde, “uma vacina é uma preparação biológica que melhora a imunidade a uma doença específica. Uma vacina normalmente contém um agente que se assemelha a um microrganismo causador de doença e geralmente é feita a partir de formas enfraquecidas ou mortas do micróbio, de suas toxinas ou de uma de suas proteínas de superfície. O agente estimula o sistema imunológico do corpo a reconhecer o agente como estranho, destruí-lo e "lembrar" dele, para que o sistema imunológico possa reconhecer e destruir mais facilmente qualquer um desses microrganismos que encontrar mais tarde”. Ver www.who.int/topics/vaccines/en/.
[0094] O termo "vacina VLP" refere-se a uma formulação que contém 1, 2, 3, 4, 5 ou mais VLPs quiméricas da presente invenção. As composições compreendendo a VLP quimérica desta invenção estarão tipicamente numa forma que pode ser administrada a um sujeito para redirecionar a imunidade existente e inibir a proliferação, crescimento e/ou metástase de um tumor. Tipicamente, uma vacina VLP compreende um meio de solução salina convencional ou de solução aquosa tamponada no qual a composição da presente invenção é suspensa ou dissolvida, embora a administração de pó seco, por exemplo, por inalação, e até a formulação com um adjuvante adicional, como alúmen, também sejam contempladas. A composição da presente invenção pode ser usada para inibir a proliferação, crescimento e/ou metástase de um tumor. Após a introdução em um hospedeiro, uma composição contendo a VLP quimérica da invenção (por exemplo, uma vacina VLP) é capaz de provocar uma resposta imunológica incluindo, entre outros, a produção de citocinas e/ou a ativação de células T citotóxicas, células apresentadoras de antígeno, células T auxiliares, células dendríticas e/ou outras respostas celulares.
[0095] Como utilizado neste documento, composições "terapêuticas" são composições que são projetadas e administradas a pacientes com um tumor. As composições terapêuticas (por exemplo, composições terapêuticas contendo VLPs quiméricas) são usadas para tratar tumores benignos ou malignos. Em algumas modalidades desta invenção, as VLPs quiméricas são administradas a um sujeito que anteriormente tinha um tumor e atualmente está aparentemente livre de tumor/câncer para inibir a recorrência do tumor/câncer.
[0096] Os termos "inibição", "redução" ou "prevenção" ou qualquer variação desses termos, quando usados nas reivindicações e/ou nas especificações, incluem qualquer redução mensurável ou inibição completa para alcançar um resultado desejado, como inibir, reduzir, ou impedir o crescimento, proliferação e/ou metástases de tumores.
[0097] Ao longo deste pedido, o termo "cerca de" é usado para indicar que um valor inclui o desvio-padrão de erro para o dispositivo ou o método a ser empregado para determinar o valor.
[0098] Um "sujeito", ou "sujeito com necessidade de", como utilizado neste documento, inclui qualquer animal que teve um tumor/câncer ou que tenha um tumor/câncer. Sujeitos adequados (pacientes) incluem animais de laboratório (como camundongo, rato, coelho, porquinho-da- índia ou porco), animais de fazenda (como gado), animais esportivos (como cães ou cavalos), animais domésticos ou animais de estimação (como um cavalo, cão ou gato), primatas não humanos e humanos.
[0099] Os termos "proteína", "polipeptídeo" e "peptídeo", como utilizados neste documento, não estão restritos a nenhum número específico de aminoácidos; esses termos são às vezes usados de forma intercambiável neste documento. As propriedades e sequências de aminoácidos das proteínas da invenção e dos ácidos nucleicos que as codificam, são bem conhecidas e podem ser determinadas rotineiramente, bem como baixadas de vários bancos de dados conhecidos. Ver, por exemplo, os bancos de dados NCBI GenBank. Algumas sequências são fornecidas neste documento. No entanto, algumas informações de sequência são atualizadas rotineiramente (por exemplo, para corrigir erros nas entradas anteriores), portanto, informações atualizadas (corrigidas) sobre as proteínas e os ácidos nucleicos que as codificam estão incluídas neste pedido. As informações fornecidas nas bases de dados de sequência discutidas neste documento são incorporadas por referência no presente pedido.
[0100] Como utilizado neste documento, o termo "VLP quimérica" destina-se a designar VLPs que compreendem um peptídeo alvo. Este termo não se destina a conferir qualquer significado relativo à maneira específica pela qual o peptídeo alvo é ligado ou anexado à VLP ou à maneira específica pela qual o peptídeo alvo é inserido na VLP. Em uma modalidade da invenção, o peptídeo alvo é conjugado à VLP através de uma ligação dissulfeto, maleimida ou ligação amida.
[0101] Os termos "HPV" e "papilomavírus humano" referem-se aos membros da família Papilomavírus que são capazes de infectar seres humanos. Existem dois grupos principais de HPVs definidos por seu tropismo (grupos genital/mucoso e cutâneo), cada um dos quais contém vários "tipos" ou "cepas" de vírus (por exemplo, HPV5, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 32, etc.).
[0102] "Inibidor de checkpoint" é um tipo de fármaco que bloqueia certas proteínas, "proteínas de checkpoint", que são produzidas por alguns tipos de células do sistema imunológico, como células T, e algumas células cancerígenas. As proteínas de checkpoint ajudam a manter as respostas imunológicas sob controle e podem impedir que as células T matem as células cancerígenas. Quando as proteínas de checkpoint são inibidas, os freios do sistema imunológico são liberados e as células T são mais capazes de eliminar as células cancerígenas. Exemplos de proteínas de checkpoint encontradas em células T ou células cancerígenas incluem PD-1/PD-L1 e CTLA-4/B7-1/B7-2, CD86, GITR, LAG3, VISTA, TIGIT e CD137L. Exemplos de inibidores de checkpoint incluem, sem limitação, ipilimumabe (Yervoy®), pembrolizumabe (KEYTRUDA®) e nivolumabe (OPDIVO®), Atezolizumabe (TECENTRIQ®), Avelumabe (BAVENCIO®), Durvalumabe (IMFINZI®).
[0103] "MHC" ou "complexo principal de histocompatibilidade" é um grupo de genes que codificam proteínas encontradas na superfície das células que ajudam o sistema imunológico a reconhecer substâncias estranhas. As proteínas do MHC são encontradas em todos os vertebrados superiores. Existem dois tipos principais de moléculas de MHC, MHC classe I e MHC classe II. Nos seres humanos, existem três loci genéticos diferentes que codificam moléculas de MHC de classe I (as moléculas de MHC do ser humano também são designadas por antígenos de leucócitos humanos (HLA)): HLA-A, HLA-B e HLA-C. HLA-A * 01, HLA-A * 02 e HLA-A * 11 são exemplos de diferentes alelos de MHC classe I que podem ser expressos a partir desses loci.
[0104] É contemplado que um ou mais membros de uma lista fornecida neste documento possam ser especificamente excluídos de ou incluídos em uma invenção reivindicada.
[0105] Os métodos para a produção de VLP são conhecidos na técnica, ver, por exemplo, a Patente US Nº 9,149,503 e a Patente US Nº 9,580,474, que são incorporadas neste documento por referência. Um aspecto da invenção é um método para produzir uma VLP quimérica (ou um componente de polipeptídio da mesma) da invenção. Em um aspecto da invenção, os epítopos de células T são sintetizados usando métodos convencionais, modificados para as sequências de aminoácidos específicas. Tais técnicas incluem, por exemplo, métodos bem conhecidos dos versados na técnica de síntese de peptídeos, por exemplo, síntese em fase de Ed solução (ver Finn et al. em Proteins,3ª ., Neurath e Hill (Eds), Academic
Press, NY, 2 105-253, 1976) ou síntese em fase sólida (ver Barany et al.
Em: The Peptides, Gross e Meienhofer (Eds.), Academic Press, NY, 3-284, 1979), ou síntese por etapas em fase sólida, como relatado por Merrifield et al. (1963) J.
Am.
Chem.
Soc. 85, 2149-2154), o conteúdo de cada um deles é incorporado a este documento por referência.
Outras referências às técnicas de síntese de peptídeos incluem peptídeos sintetizados pelo modo Fmoc- poliamida da síntese de peptídeos em fase sólida, como divulgado por Lu et al. (1981) J.
Org.
Chem. 46, 3433, peptídeos sintetizados usando um procedimento Fmoc/tBu (Atherton et al.
Em: Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989). Os aminoácidos Fmoc podem ser obtidos de vários fornecedores, por exemplo, Chem-Impex International (Wood Dale, Illinois, EUA), Merck Biosciences (Nottingham, Reino Unido) e Bachem UK Ltd. (St.
Helens, Reino Unido). O peptídeo sintetizado pode ser anexado à VLP usando métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade desta invenção, o método para produzir a VLP quimérica descrita neste documento compreende a montagem de uma VLP a partir da proteína L1 do papilomavírus por métodos conhecidos na técnica, sujeitando a VLP a condições de redução suficientes para reduzir a VLP, mas mantendo a estrutura de icosaedro semelhante ao capsídeo de uma VLP e conjugando um peptídeo alvo à VLP, formando assim a VLP quimérica.
O peptídeo alvo pode ser conjugado à VLP reduzida ou ativada por meio de uma ligação dissulfeto, maleimida ou amida.
Por exemplo, em uma modalidade desta invenção, o peptídeo alvo é conjugado a um grupo sulfidril de uma cisteína em uma proteína L1 ou L2 ou ambas as proteínas L1 e L2 da VLP quimérica por meio de uma ligação dissulfeto ou uma ligação maleimida.
O peptídeo alvo pode ser conjugado a um grupo sulfidril de uma cisteína em uma proteína L1 ou L2 ou ambas as proteínas L1 e L2 da VLP quimérica por meio de uma ligação dissulfeto ou uma ligação maleimida.
As cisteínas reduzidas podem estar na superfície da VLP.
Em uma modalidade desta invenção, as proteínas L1 ou L2 da VLP podem compreender uma média de um peptídeo alvo, dois peptídeos alvo, três peptídeos alvo, quatro peptídeos alvo ou cinco peptídeos alvo por proteína L1 ou L2. Em uma modalidade desta invenção, uma média de três a cinco peptídeos alvo é conjugada a cada proteína L1 ou L2 da VLP quimérica. Em uma modalidade desta invenção, pelo menos 30% das cisteínas de superfície da VLP compreendem peptídeo alvo. Em uma modalidade desta invenção, cerca de 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100% das cisteínas de superfície da VLP compreendem um peptídeo alvo. Em uma modalidade desta invenção, cerca de 30% a 50% das cisteínas de superfície da VLP compreendem o peptídeo alvo.
[0106] Em uma modalidade da invenção, o peptídeo alvo pode ser conjugado a uma lisina ou uma arginina na proteína L1 ou L2 ou ambas as proteínas L1 e L2 da VLP quimérica por meio de uma ligação amida. As lisinas e/ou argininas conjugadas ao peptídeo alvo podem estar na superfície da VLP. Em uma modalidade desta invenção, cerca de 30% das lisinas de superfície e/ou argininas de superfície da VLP compreendem um peptídeo alvo. Em uma modalidade desta invenção, cerca de 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100% das lisinas de superfície e/ou argininas de superfície da VLP compreendem um peptídeo alvo. Numa modalidade desta invenção, cerca de 30% a 50% das lisinas de superfície e/ou argininas de superfície da VLP compreendem um peptídeo alvo.
[0107] Numa modalidade desta invenção, cerca de 30% a 50% das lisinas de superfície e cisteínas de superfície da VLP são conjugadas com um peptídeo alvo. Numa modalidade desta invenção, pelo menos 30% das lisinas de superfície e/ou cisteínas de superfície da VLP são conjugadas com um peptídeo alvo. Em um aspecto desta invenção, as cisteínas de superfície e lisinas de superfície são conjugadas com o peptídeo alvo de modo que cerca de 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%,
80% 85%, 90%, 95%, 97%, 99% das cisteínas e lisinas de superfície são conjugadas com o peptídeo alvo. As lisinas e cisteínas podem ser conjugadas para direcionar peptídeos tendo o mesmo epítopo de célula T CD8+ ou para direcionar peptídeos tendo epítopo de célula T CD8 + diferente, de modo que a VLP seja conjugada com vários peptídeos alvo tendo diferentes epítopos de célula T CD8 +.
[0108] Numa modalidade desta invenção, cerca de 30% a 50% das lisinas de superfície e cisteínas de superfície da VLP são conjugadas com um peptídeo alvo. Numa modalidade desta invenção, pelo menos 30% das argininas de superfície e/ou superfície de argininas da VLP são conjugadas com um peptídeo alvo. Em um aspecto desta invenção, as cisteínas de superfície e argininas de superfície são conjugadas com o peptídeo alvo de modo que cerca de 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100% das cisteínas e argininas de superfície são conjugadas com o peptídeo alvo. As argininas e cisteínas podem ser conjugadas para direcionar peptídeos tendo o mesmo epítopo de célula T CD8+ ou para direcionar peptídeos tendo epítopo de célula T CD8 + diferente, de modo que a VLP seja conjugada com múltiplos peptídeos alvo tendo diferentes epítopos de célula T CD8 +.
[0109] Numa modalidade desta invenção, todos os peptídeos alvo conjugados à VLP compreendem o mesmo epítopo de célula T CD8 +. Noutra modalidade da presente invenção, a VLP é conjugada com múltiplos peptídeos alvo em que os peptídeos alvo compreendem diferentes epítopos de células T CD8 +. Os epítopos de células T CD8 + podem ser do mesmo patógeno ou patógenos diferentes.
[0110] Também uma modalidade desta invenção é uma composição que compreende uma população de VLPs quiméricas descritas neste documento e um excipiente farmaceuticamente aceitável. A população de VLPs quiméricas pode ser uma população de VLPs quiméricas idênticas ou uma população de VLPs quiméricas não idênticas.
[0111] Alternativamente, um polipeptídeo, por exemplo, um peptídeo alvo, e a proteína L1 ou L2 da invenção, podem ser preparadas de forma recombinante. A presente invenção fornece vetores de clonagem e expressão recombinantes contendo DNA, bem como células hospedeiras contendo os vetores recombinantes. Os vetores de expressão compreendendo DNA podem ser utilizados para preparar os polipeptídeos, por exemplo, os peptídeos alvo e as proteínas L1 e L2, codificadas por um DNA. Um método para a produção de polipeptídeos compreende a cultura de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão recombinante que codifica o polipeptídeo, sob condições que promovem a expressão do polipeptídeo, recuperando, então, os polipeptídeos expressos da cultura. A pessoa versada na técnica reconhecerá que o procedimento para purificar os polipeptídeos expressos variará de acordo com fatores como o tipo de células hospedeiras empregadas e se o polipeptídeo está ligado à membrana ou uma forma solúvel que é secretada a partir da célula hospedeira. Os polipeptídeos da invenção podem incluir várias sequências líderes que direcionam o tráfego ou auxiliam na purificação.
[0112] Qualquer sistema de expressão adequado pode ser empregado. Os vetores incluem um DNA que codifica um polipeptídeo, por exemplo, peptídeo alvo, uma proteína L1 ou L2 ou polipeptídeos compreendendo a proteína L1 ou L2 e um peptídeo alvo da invenção, operacionalmente ligado a sequências nucleotídicas reguladoras da transcrição ou da tradução adequadas, como aquelas derivadas a partir de um gene de mamífero, microbiano, viral ou inseto. Exemplos de sequências reguladoras incluem promotores, operadores ou potencializadores de transcrição, um sítio de aglutinação ribossômica do mRNA e sequências apropriadas que controlam a iniciação e terminação da transcrição e tradução. As sequências nucleotídicas estão operacionalmente ligadas quando a sequência reguladora se relaciona funcionalmente à sequência de DNA. Assim, uma sequência nucleotídica promotora está operacionalmente ligada a uma sequência de DNA se a sequência nucleotídica promotora controla a transcrição da sequência de DNA. Uma origem de replicação que confere a capacidade de replicar nas células hospedeiras desejadas, e um gene de seleção pelo qual os transformantes são identificados, são geralmente incorporados no vetor de expressão.
[0113] As células hospedeiras adequadas para expressão de polipeptídeos incluem células procarióticas, leveduras ou eucarióticas superiores. Células de mamíferos ou insetos são adequadas para uso como células hospedeiras. Os vetores apropriados de clonagem e expressão para uso com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, leveduras e mamíferos são descritos, por exemplo, em Pouwels et al. In: Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, NY, 1985. Os sistemas de tradução isentos de células também podem ser empregados para produzir polipeptídeos utilizando RNA derivado a partir de construtos de DNA divulgados neste documento. Em geral, os métodos de biologia molecular mencionados neste documento são bem conhecidos na arte e são descritos, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, edição atual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova York,
NY
[0114] Os métodos para permitir a montagem de polipeptídeos nas VLPs são bem conhecidos e convencionais, assim como os métodos para purificá-los para uso em sujeitos. Para condições adequadas para auto-montagem, consultar, por exemplo, os métodos descritos nos Exemplos deste documento, ou em Kirnbauer et al. (1993) J. Virol 67, 6929- 6936; Volpers et al. (1994) Virology 200, 504-512; ou Chen et al., J. Mol Biol 2001 mar. 16; 307 (1): 173-82, os quais são incorporados por referência para a descrição de tais métodos.
[0115] Os métodos da presente invenção incluem tratamento de tumores existentes com uma quantidade eficaz das VLPs quiméricas da invenção. Os métodos desta invenção compreendem a administração das VLPs quiméricas desta invenção a um sujeito em necessidade da mesma, em uma quantidade suficiente para inibir o crescimento, progressão ou metástase do tumor. Em uma modalidade dos métodos desta invenção, a VLP quimérica é administrada a um sujeito em necessidade da mesma em uma quantidade suficiente para estimular a produção de citocinas e/ou imunidade celular, particularmente imunidade inata, incluindo estimular a atividade citotóxica de macrófagos e células assassinas naturais. Em aspectos desta invenção, um sujeito em necessidade é um sujeito que foi tratado previamente para um tumor e atualmente é considerado livre de câncer ou livre de doença de acordo com padrões médicos.
[0116] Um aspecto da invenção é um método para o tratamento de um câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, administrando uma VLP quimérica desta invenção ao sujeito em que o epítopo CD8 + do peptídeo alvo é de um patógeno que possui um tropismo para o tecido que é a fonte do câncer (o "tecido fonte"). O método compreende determinar o tecido fonte, determinar se o sujeito foi vacinado ativamente contra ou infectado com um patógeno que possui um tropismo para o tecido fonte e, em seguida, administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de uma VLP quimérica desta invenção, em que o epítopo CD8 + do peptídeo alvo é o determinante antigênico na vacina administrada previamente ao sujeito ou o patógeno que infectou o sujeito.
[0117] É conhecido na arte que alguns vírus exibem um tropismo para um tipo específico de tecido. Por exemplo: vírus que exibem um tropismo para tecido cerebral incluem, sem limitação, vírus JC, sarampo, vírus LCM, arbovírus e raiva; os vírus que exibem um tropismo para o tecido ocular incluem, sem limitação, vírus da herpes simplex, adenovírus e citomegalovírus; os vírus que exibem um tropismo para o tecido nasal incluem, sem limitação, rinovírus, vírus da parinfluenza e vírus sincicial respiratório; os vírus que exibem um tropismo para tecido oral, por exemplo, mucosa oral, gengiva, glândulas salivares, faringe, incluem, sem limitação, vírus herpes simplex tipo I e tipo II, vírus da caxumba, vírus Epstein barr e citomegalovírus; os vírus que exibem um tropismo para o tecido pulmonar incluem, sem limitação, vírus influenza tipo A e tipo B, vírus parainfluenza, vírus sincicial respiratório, adenovírus e coronavírus SARS; vírus que exibem um tropismo para tecido nervoso, por exemplo, medula espinhal, incluem, sem limitação, poliovírus e HTLV-1; os vírus que apresentam um tropismo para o tecido cardíaco incluem, sem limitação, o vírus Coxsackie B; os vírus que exibem um tropismo para o tecido hepático incluem, sem limitação, vírus da hepatite tipos A, B e C; os vírus que exibem um tropismo para o tecido gastrointestinal, por exemplo, estômago e intestino grosso e delgado, incluem, sem limitação, adenovírus, rotavírus, noravírus, astrovírus e coronavírus; os vírus que exibem um tropismo para o tecido pancreático incluem, sem limitação, vírus coxsackie B; os vírus que exibem um tropismo para o tecido da pele incluem, sem limitação, vírus da varicela zoster, vírus da herpes simplex 6, vírus da varíola, molusco contagioso, vírus do papiloma, vírus do parvovírus B19, rubéola, sarampo e coxsackie A; e vírus que exibem um tropismo para tecido genital, incluem, sem limitação, herpes simplex tipo 2, vírus do papiloma, vírus da imunodeficiência humana (HIV).
[0118] Um aspecto desta invenção é um método para o tratamento de um câncer de pulmão, que compreende determinar se um sujeito foi vacinado ativamente contra um patógeno que infecta células pulmonares, por exemplo, um vírus influenza, por exemplo, vírus influenza tipo A ou tipo B, e então administrar uma vacina quantidade eficaz de uma VLP quimérica desta invenção, em que o epítopo da célula T CD8 + do peptídeo alvo é dos determinantes antigênicos do patógeno contidos na vacina e o que o epítopo da célula T forma um complexo com uma molécula MHC classe I do sujeito. Num aspecto de um método desta invenção para o tratamento de um câncer de pulmão, inclui determinar se um sujeito foi infectado com patógeno que infecta células pulmonares, por exemplo, um vírus influenza, por exemplo, vírus influenza tipo A ou tipo B, e então administrar uma quantidade eficaz de uma VLP quimérica desta invenção, em que o epítopo da célula T CD8 + do peptídeo alvo é desse patógeno e que o epítopo da célula T forma um complexo com uma molécula de MHC classe I do sujeito.
[0119] Um aspecto da invenção é um método para o tratamento de um câncer bucal, que faz parte do grupo de câncer comumente referido como câncer de cabeça e pescoço, administrando uma VLP quimérica da presente invenção, em que o epítopo CD8 + do peptídeo alvo é de um patógeno que possui um tropismo para tecido oral, por exemplo, vírus da caxumba, vírus Epstein barr, citomegalovírus ou vírus da herpes simplex tipo 1. O método compreende determinar se um sujeito em necessidade do mesmo foi ativamente vacinado contra ou infectado com, por exemplo, vírus da caxumba, vírus Epstein barr, citomegalovírus ou vírus da herpes simplex tipo 1 e se o sujeito foi vacinado ou infectado anteriormente, então, administrar ao sujeito uma VLP quimérica desta invenção, em que o epítopo CD8 + do peptídeo alvo é de um vírus da caxumba ou de um vírus do sarampo ou do componente antigênico da vacina que o sujeito recebeu ou do patógeno, ou seja, caxumba, sarampo, vírus Epstein-barr, citomegalovírus ou vírus da herpes simplex tipo 1, que já haviam infectado o sujeito.
[0120] Um aspecto desta invenção é um método para estimular a atividade citotóxica de macrófagos e células assassinas naturais, administrando a um sujeito em necessidade da mesma, uma quantidade eficaz de uma VLP quimérica desta invenção. Os macrófagos e células assassinas naturais podem ser aquelas presentes no microambiente tumoral. Num aspecto desta invenção, as VLPs quiméricas são administradas ao sujeito em uma quantidade eficaz para estimular a atividade citotóxica de macrófagos e células assassinas naturais já presentes no microambiente do tumor. Num aspecto desta invenção, as VLPs quiméricas são administradas ao sujeito em uma quantidade eficaz para atrair macrófagos e células assassinas naturais para o microambiente do tumor.
[0121] Num aspecto desta invenção, as VLPs quiméricas são administradas ao sujeito em uma quantidade eficaz para aglutinar um número suficiente de anticorpos ao peptídeo alvo para atrair e estimular macrófagos, neutrófilos e células assassinas naturais.
[0122] Um aspecto desta invenção é um método para redirecionar a atividade citotóxica de uma célula T CD8 + com memória existente para uma célula tumoral ou microambiente tumoral, administrando a um sujeito em necessidade da mesma uma quantidade eficaz da VLP quimérica desta invenção. Preferencialmente, o epítopo da célula T do peptídeo alvo da VLP quimérica é de um patógeno para o qual o sujeito foi vacinado ativamente ou de um patógeno que já infectou o sujeito previamente e o sujeito possui células T CD8 + de memória que reconhecem o epítopo da célula T em complexo com uma molécula de MHC classe I nas células tumorais. Num aspecto desta invenção, a quantidade eficaz da VLP quimérica é uma quantidade suficiente para atrair a célula T CD8 + de memória para o microambiente do tumor. Num aspecto desta invenção, a quantidade eficaz da VLP quimérica é uma quantidade suficiente para estimular a célula T CD8 + de memória presente no microambiente do tumor.
[0123] Um aspecto desta invenção é um método para introduzir um peptídeo alvo conforme descrito neste documento em um microambiente tumoral, através da administração a um sujeito em necessidade de uma VLP quimérica desta invenção. Num aspecto desta invenção, o epítopo da célula T CD8 + do peptídeo alvo é liberado a partir da VLP no microambiente do tumor em uma quantidade suficiente para estimular as células T CD8 + da memória no microambiente. Em um aspecto desta invenção, a VLP quimérica e/ou peptídeo alvo da VLP quimérica é suscetível à clivagem por uma enzima proteolítica no microambiente do tumor e a posição do sítio de clivagem alvo na VLP quimérica ou no peptídeo alvo é tal que a clivagem do sítio alvo libera toda ou uma porção do peptídeo alvo compreendendo o epítopo da célula T CD8 + da VLP quimérica no microambiente do tumor. Em um aspecto da invenção, o sítio de clivagem é reconhecido por uma furina, uma metaloproteinaes de matriz (MMPs), por exemplo, 1, 2, 3, 7, 8, 9, 11, 13, 14 ou 19, uma ADAM (uma desintegrina e metaloproteinase), por exemplo, ADAMS 8, 9, 10, 15, 17 ou 28, uma catepsina, por exemplo, catepsina B, D, D, G ou H, N. Elastase, proteinase-3, azurocidina ou ADAMTS-1. Quantidades suficientes da VLP quimérica são prontamente determinadas pela pessoa versada na técnica e será apreciado que a quantidade dependerá, por exemplo, das características do sujeito, como idade, peso, gênero, condição médica do sujeito e das características do tumor, por exemplo, tipo, volume e status de desenvolvimento.
[0124] Em um aspecto desta invenção, a VLP quimérica e/ou peptídeo alvo da VLP quimérica é suscetível à clivagem por uma enzima proteolítica na célula tumoral e a posição do sítio de clivagem alvo na VLP quimérica ou no peptídeo alvo é tal que a clivagem do sítio alvo libera toda ou uma porção do peptídeo alvo que compreende o epítopo da célula T CD8 + da VLP quimérica, que complexifica com uma molécula I classe MHC do tumor. Quantidades suficientes da VLP quimérica são prontamente determinadas pela pessoa versada na técnica e será apreciada que a quantidade dependerá, por exemplo, das características do sujeito, como idade, peso, gênero, condição médica do sujeito e das características do tumor, por exemplo, tipo, volume e status de desenvolvimento.
[0125] Em um aspecto da invenção, para selecionar uma (s) VLP quimérica(s) apropriada(s) desta invenção para administrar ao sujeito em necessidade da mesma, verifica-se se o sujeito foi vacinado ativamente contra um determinado patógeno, por exemplo, um parasita, uma bactéria, ou vírus, por exemplo, sarampo ou poliomielite e, em seguida, seleciona e administra ao sujeito uma VLP quimérica desta invenção, em que o epítopo da célula T CD8 + do peptídeo alvo é do patógeno contra o qual o sujeito foi imunizado. Pode-se verificar se um sujeito foi vacinado ativamente contra um patógeno específico, revendo os registros médicos dos sujeitos ou entrevistando-o. Em um aspecto da invenção, para selecionar uma VLP quimérica apropriada para administrar ao sujeito em necessidade, verifica-se se o indivíduo foi previamente infectado com um determinado patógeno, por exemplo, um parasita, uma bactéria ou vírus, por exemplo, sarampo ou poliomielite, e resolveu a infecção e, em seguida, seleciona e administra ao sujeito uma VLP quimérica em que o epítopo da célula T CD8 + do peptídeo alvo é um epítopo da célula T CD8 + desse patógeno. Pode-se verificar se um indivíduo foi infectado com um patógeno específico, revisando os registros médicos dos sujeitos ou entrevistando o sujeito. Exemplos não limitativos de epítopos de células T CD8 + que se ligam a moléculas de MHC de classe I específicas são apresentados na Tabela 1 e na Tabela 2. O método também pode compreender a determinação de quais determinantes do MHC de classe I, as células do sujeito expressam e, em seguida, a administração de uma VLP quimérica desta invenção, em que o epítopo da célula T CD8 + do peptídeo alvo é um epítopo da célula T CD8 + do componente antigênico do patógeno na vacina ou no patógeno que infectou previamente o sujeito que forma um complexo com os determinantes de MHC classe I do sujeito.
[0126] Além disso, em algumas modalidades, as VLPs quiméricas descritas neste documento são administradas em conjunto com outras terapias de tratamento de câncer, por exemplo, radioterapia, quimioterapia, cirurgia e/ou imunoterapia. Em alguns aspectos desta invenção, as VLPs quiméricas descritas neste documento são administradas em conjunto com inibidores de ponto de verificação. As VLPs quiméricas da presente invenção e outras terapias ou agentes terapêuticos podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente pela mesma ou diferentes vias de administração. A determinação da identidade e quantidade de agente(s) terapêutico(s) para uso nos métodos da presente invenção pode ser prontamente feita por praticantes de medicina comumente especializados, usando técnicas padrão conhecidas na técnica.
[0127] As VLPs têm propriedades adjuvantes. Em algumas modalidades, a imunogenicidade das composições de VLP quiméricas desta invenção pode ser potencializada pelo uso de estimuladores não específicos adicionais da resposta imune, conhecidos como adjuvantes. Os adjuvantes adequados incluem todos os compostos imunoestimuladores aceitáveis, tais como citocinas, toxinas ou composições sintéticas, como alúmen.
[0128] Os adjuvantes incluem, mas não estão limitados a, emulsões de óleo em água, emulsões de água em óleo, sais minerais, polinucleotídeos e substâncias naturais. Adjuvantes específicos que podem ser utilizados incluem IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, interferon γ, GM-CSF, BCG, sais de alumínio, tais como hidróxido de alumínio ou outro composto de alumínio, compostos de MDP, tais como thur-MDP e nor-MDP, CGP (MTP-PE), lipídeo A e monofosforil lipídeo A (MPL) ou agentes microbianos inativados. O RIBI, que contém três componentes extraídos de bactérias, MPL, dimerolato de trealose (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS) em uma emulsão de esqualeno/Tween 80 a 2%. Os antígenos do MHC podem até ser usados. Outros adjuvantes ou métodos são exemplificados na Pat. US Nos. 6.814.971,
5.084.269, 6.656.462, cada uma das quais é aqui incorporada por referência).
[0129] Vários métodos para obter efeito adjuvante para as composições de VLP quiméricas incluem o uso de agentes como hidróxido de alumínio ou fosfato (alúmen), comumente usados como solução de cerca de 0,05 a cerca de 0,1% em solução salina tamponada com fosfato, mistura com polímeros sintéticos de açúcares (CARBOPOL®) usado como uma solução de cerca de 0,25%, agregação de uma proteína na composição por tratamento térmico com temperaturas variando entre cerca de 70ºC a 101ºC por um período de 30 segundos a 2 minutos, respectivamente. Agregação por reativação com anticorpos tratados com pepsina (Fab) à albumina; mistura com células bacterianas (por exemplo, C. parvum), endotoxinas ou componentes de lipopolissacarídeos de bactérias Gram-negativas; emulsão em veículos oleosos fisiologicamente aceitáveis (por exemplo, mono-oleato de manida (Aracel A)); ou emulsão com uma solução a 20% de um perfluorocarbono (FLUOSOL-DA®) usado como um substituto em bloco também pode ser empregada para produzir um efeito adjuvante. Um adjuvante típico é o adjuvante completo de Freund (contendo Mycobacterium tuberculosis morto), adjuvantes incompletos de Freund e hidróxido de alumínio.
[0130] Para administração com seres humanos, uma variedade de adjuvantes adequados será evidente para um trabalhador qualificado. Isso inclui, por exemplo, Alum-MPL como adjuvante, ou a formulação comparável ASO4, que é usada na vacina aprovada contra o HPV CERVARIX®, AS03, AS02, MF59, montanida, adjuvantes à base de saponina como GPI-0100, à base de CpG adjuvantes ou imiquimode. Nas modalidades da invenção, um adjuvante é fisicamente acoplado ao VLP ou encapsulado pelo VLP, em vez de simplesmente ser misturado a eles.
[0131] Além dos adjuvantes, pode ser desejável co- administrar modificadores da resposta biológica (BRM) para potencializar as respostas imunes. Demonstrou-se que os BRMs aumentam a imunidade das células T ou diminuem a atividade das células supressoras. Esses BRMs incluem, mas não estão limitados a, cimetidina (CIM; 1200 mg/d) (Smith/Kline, PA); ou ciclofosfamida em baixa dose (CYP; 300 mg/m2) (Johnson/Mead, NJ) e citocinas como interferon γ, IL-2 ou IL-12 ou genes que codificam proteínas envolvidas nas funções imunológicas auxiliares, como B-7. Nas modalidades da invenção, esses genes são encapsulados pelo VLP para facilitar sua distribuição a um sujeito.
[0132] A preparação de composições que contêm sequência(s) de polipeptídeo ou peptídeo como ingredientes ativos é geralmente bem entendida na técnica, como exemplificado pela Pat. US Nos.
4.608.251; 4,601,903; 4.599.231; 4.599.230; 4.596.792; e 4.578.770, todos os quais são incorporados neste documento por referência. Tipicamente, tais composições são preparadas como injetáveis, quer como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção podem também ser preparadas. A preparação também pode ser emulsionada. O ingrediente imunogênico ativo é frequentemente misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo. Os excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol ou afins e combinações dos mesmos. Além disso, se desejado, as composições podem conter quantidades de substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes tamponantes de pH ou adjuvantes que aumentam a eficácia das vacinas. Em modalidades específicas, as vacinas são formuladas com uma combinação de substâncias, como descrito na Pat. US Nos.
6.793.923 e 6.733.754, que são incorporados aqui por referência.
[0133] As composições compreendendo as VLPs quiméricas da presente invenção estão em forma biologicamente compatível adequada para administração in vivo em sujeitos. As composições podem adicionalmente compreender um carreador farmaceuticamente aceitável. O termo "farmaceuticamente aceitável", significa aprovado por uma agência reguladora do Governo Federal ou um Estado ou listados na U.S. Pharmacopeia ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e mais particularmente em seres humanos. O termo "carreador" refere- se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual a VLP é administrada. Esses carreadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo os de petróleo, animal, vegetal ou de origem sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e semelhantes. A água pode ser um carreador quando a composição farmacêutica é administrada por via oral. A solução salina e a dextrose aquosa podem ser carreadas quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Soluções salinas e soluções de glicerol e dextrose aquosa também podem ser empregadas como carreadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos adequados também incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e semelhantes. A composição farmacêutica também pode conter quantidades menores de agentes umectantes ou emulsificantes, ou agentes tamponantes de pH.
[0134] As composições farmacêuticas compreendendo as VLPs quiméricas da presente invenção podem assumir a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação sustentada e semelhantes. A formulação oral pode incluir carreadores padrões tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio etc. Numa modalidade específica, uma composição farmacêutica compreende uma quantidade eficaz de uma VLP quimérica da presente invenção juntamente com uma quantidade adequada de um carreador farmaceuticamente aceitável, de modo a fornecer a forma para administração adequada ao paciente. A formulação deve se adequar ao modo de administração.
[0135] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas por qualquer via de administração específica, incluindo, entre outras, intravenosa, intramuscular, intrarticular,
intrabrônquica, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitária, intracelial, intracelular, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intra- gástrica, intra-hepática, intra-miocárdica, intra-óssea, intrapélvica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intraretal, intrarrenal, intraretinal, intraspinal, intrassinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, bolus, oral, parenteral, subcutânea, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal, meios iontoforéticos ou meios transdérmicos. As vias mais adequadas são injeção intravenosa ou administração oral. Em modalidades particulares, as composições são administradas na ou perto da área alvo, por exemplo, injeção intratumoral.
[0136] Para a administração parentérica numa solução aquosa, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tamponada se necessário e o diluente líquido primeiro tornado isotônico com salina ou glicose suficientes. Essas soluções aquosas específicas são especialmente adequadas para administração por via intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. A este respeito, os meios aquosos estéreis que podem ser empregados serão conhecidos pelos versados na técnica à luz da presente divulgação. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em solução isotônica de NaCl e adicionada ao fluido de hipodermóclise ou injetada no local proposto da infusão (consultar, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990). Alguma variação na dosagem ocorrerá necessariamente dependendo da condição do sujeito. A pessoa responsável pela administração pode, em qualquer caso, determinar a dose adequada para o sujeito individual.
[0137] As composições contendo VLP quiméricas desta invenção podem ser administradas por inalação. Em certas modalidades, uma composição pode ser administrada como um aerossol. Conforme utilizado neste documento, o termo "aerossol" ou "composição aerossolizada" refere-se a uma suspensão de partículas sólidas ou líquidas em um gás. Os termos podem ser utilizados geralmente para se referir a uma composição que foi vaporizada, nebulizada ou, de outra forma, convertida a partir de uma forma sólida ou líquida para uma forma inalável, incluindo partículas de fármaco sólidas ou líquidas em suspensão. Tais aerossóis podem ser utilizados para fornecer uma composição através do sistema respiratório. Conforme utilizado neste documento, "sistema respiratório" refere-se ao sistema de órgãos no corpo responsável pela assimilação de oxigênio e pela expiração do dióxido de carbono. O sistema geralmente inclui todas as passagens de ar do nariz para os alvéolos pulmonares. Nos mamíferos, geralmente é considerado incluir pulmões, brônquios, bronquíolos, traqueia, passagens nasais e diafragma. Para os fins da presente divulgação, a distribuição de uma composição para o sistema respiratório indica que um fármaco é distribuído para uma ou mais das passagens de ar do sistema respiratório, especificamente para os pulmões.
[0138] As formulações adicionais que são adequadas para outros modos de administração incluem supositórios (para aplicação anal ou vaginal) e, em alguns casos, formulações orais. Para supositórios, aglutinantes e carreadores tradicionais podem incluir, por exemplo, triglicerídeos ou polialcaleno de glicóis: esses supositórios podem ser formados a partir de misturas que contêm o ingrediente ativo na faixa de cerca de 0,5% a cerca de 10%, preferencialmente cerca de 1% a cerca de 2%. As formulações orais normalmente incluem excipientes empregados como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio e semelhantes. Estas composições tomam a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações ou pós de liberação sustentada e contêm cerca de 10% a cerca de 95% de ingrediente ativo, preferencialmente cerca de 25% a cerca de 70%.
[0139] As composições de VLP quiméricas podem ser formuladas em uma vacina como formas neutras ou salinas. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida (formados com os grupos aminoácidos livres de peptídeos) e aqueles que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácidos hidroclorídricos ou fosfóricos, ou ácidos orgânicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico e semelhantes. Sais formados com os grupos carboxil livres também podem ser derivados a partir de bases inorgânicas, como por exemplo, sódio, potássio, amônio, cálcio ou hidróxidos férricos; e bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína e semelhantes.
[0140] As composições farmacêuticas da presente invenção também podem incluir uma quantidade eficaz de um adjuvante adicional. Conforme observado neste documento, as VLPs têm propriedades adjuvantes. Os adjuvantes adicionais adequados incluem, mas não estão limitados a, géis minerais completos ou incompletos de Freund, como hidróxido de alumínio, substâncias ativas de superfície, como lisolecitina, polióis plurônicos, polianiões, peptídeos, emulsões de óleo, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis, como Bacille Calmette-Guerin, Carynebacterium parvum e toxina da cólera não tóxica.
[0141] .Em condições normais de armazenamento e uso, essas preparações contêm um conservante para evitar o crescimento de microrganismos. Em todos os casos, a forma farmacêutica deve ser estéril e deve ser fluida na medida em que possa ser facilmente injetada. Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e pode ser preservada contra a ação contaminante de microrganismos, tais como bactérias e fungos.
[0142] O carreador pode ser um meio de dispersão ou slovente contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido, e semelhantes), misturas apropriadas do mesmo e óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessária no caso de dispersão e pelo uso de surfactantes. A prevenção da ação de microrganismos pode ser alcançada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada pelo uso nas composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, gelatina e monoestearato de alumínio.
[0143] Soluções injetáveis estéreis são preparadas pela incorporação dos das VLPs quiméricas na quantidade necessária no solvente adequado com vários ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido da esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões podem ser preparadas pela incorporação dos vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril o qual contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferenciais são técnicas de secagem a vácuo e liofilização, as quais permitem um pó de um ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente filtrada esterilizada do mesmo.
[0144] Diferentes aspectos da presente invenção envolvem a administração de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo as VLPs quiméricas para um sujeito em necessidade da mesma. Em algumas modalidades da presente invenção, uma VLP quimérica compreendendo um peptídeo alvo que compreende um epítopo de célula T CD8 + é administrada ao paciente para tratar um tumor ou impedir a recorrência desse tumor. Tais composições serão geralmente dissolvidas ou dispersas num carreador ou meio aquoso farmaceuticamente aceitável.
[0145] Nos métodos desta invenção, o tumor pode ser um câncer de pequenas células pulmonares, carcinoma hepatocelular, câncer de fígado, carcinoma hepatocelular, melanoma, melanoma metastático, câncer adrenal, câncer anal, anemia aplástica, câncer do ducto biliar, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral/do SNC, câncer de mama, câncer de origem primária desconhecida, doença de Castleman, câncer cervical, câncer de cólon/reto, câncer endometrial, câncer de esôfago, família de tumores Ewing, câncer de olho, câncer de vesícula biliar, tumores carcinóides gastrointestinais, tumor estromal gastrointestinal (gist), doença trofoblástica gestacional, doença de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, câncer de rim, câncer de laringe e hipofaringe, leucemia, câncer de fígado, câncer de pulmão, linfoma, mesotelioma maligno, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplásica, câncer de cavidade nasal e seio paranasal, câncer nasofaríngeo, neuroblastoma, câncer de cavidade oral e orofaringe, osteossarcoma, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer de pênis, tumores de hipófise, câncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, câncer de glândula salivar, sarcoma, câncer de pele, câncer de estômago, câncer de testículo, câncer de timo, câncer de tireóide, sarcoma uterino, câncer vaginal, câncer vulvar, Macroglobulinemia de Waldenstrom, Tumor de Wilms, linfoma não-Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma de Burkitt, linfomas linfoblásticos, linfoma de células do manto (MCL), mieloma múltiplo (MM), linfoma linfocitário (LM), linfoma pequeno de linfócitos (SLL), linfoma de zona marginal esplênica, zona marginal esplênica linfoma (extra-nodal ou nodal), linfomas agressivos difusos do tipo de célula mista de adultos, linfomas agressivos difusos do tipo de célula grande de adultos, linfomas agressivos difusos de células grandes do adulto, linfomas agressivos difusos imunoblásticos de células grandes de adultos, linfomas agressivos difusos de células pequenas não clivados do adulto ou linfoma folicular, câncer de cabeça e pescoço, carcinoma endometrial ou uterino, câncer de pulmão de células não pequenas, osteossarcoma, glioblastoma ou câncer metastático. Numa modalidade preferencial, o câncer é um câncer de mama, um câncer de cervical, câncer de ovário, câncer pancreático ou melanoma, por exemplo, melanoma B16F10.
[0146] Por conseguinte, modalidades particulares dos métodos da presente invenção referem-se à administração de quantidades eficazes de composições que compreendem as VLPs quiméricas da presente invenção.
Conforme utilizado neste documento, o termo "eficaz" significa adequado para alcançar um resultado desejado, esperado ou pretendido.
Mais particularmente, uma "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade de uma composição da presente invenção (por exemplo, um VLP quimérica de papilomavírus compreendendo um antígeno alvo), sozinho ou em combinação com outro agente terapêutico (por exemplo, VLP de papilomavírus compreendendo proteína L1 nativa, um agente quimioterapêutico ou um inibidor do ponto de verificação), necessário para fornecer o efeito terapêutico desejado, por exemplo, uma quantidade que seja eficaz para inibir o crescimento, progressão ou metástase do tumor, ou prevenir, aliviar, tratar ou melhorar os sintomas da doença, por exemplo, câncer, ou prolongar a sobrevivência do sujeito a ser tratado.
Aqueles habilidade comum na técnica entendem que a quantidade exata necessária variará de sujeito para sujeito, dependendo da idade, condição geral do sujeito, gravidade da condição a ser tratada, composto em particular e/ou composição específicos administrados e semelhantes.
Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" apropriada ou "quantidade profilaticamente eficaz" em qualquer caso individual pode ser determinada por uma pessoa de habilidade comum na técnica por referência aos textos e literatura pertinentes e/ou usando experimentação de rotina.
Entende-se que a referência a uma composição farmacêutica (por exemplo, uma vacina), sua formulação, administração e afins, pode se referir, dependendo do contexto, a uma VLP quimérica de papilomavírus compreendendo um peptídeo alvo, uma VLP de papilomavírus compreendendo a proteína L1 nativa, ou misturas dos anteriores, incluindo misturas de VLPs quiméricas compreendendo diferentes peptídeos alvo.
O termo "dose unitária" ou "dosagem" refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas para uso em um sujeito, sendo que cada unidade contém uma quantidade predeterminada da composição calculada para produzir as respostas desejadas discutidas acima em associação com sua administração, ou seja, a via apropriada e regime. A quantidade a ser administrada, tanto de acordo com o número de tratamentos como com a dose unitária, depende do resultado.
[0147] A administração das composições de acordo com a presente invenção será tipicamente por meio de qualquer via comum. Isto inclui, mas não está limitado, administração intravenosa, intradérmica, intratumoral, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, respiratória, nasal, oral/ingerida, bucal, sublingual ou ortotópica. Em certas modalidades, uma composição contendo VLP pode ser inalada (por exemplo, Pat. US No
6.651.655, que é especificamente incorporada por referência). As composições contendo VLP quiméricas desta invenção também podem ser administradas diretamente no tumor ou na proximidade do tumor, de modo que as VLPs sejam introduzidas no microambiente do tumor. Tais composições seriam normalmente administradas como composições farmaceuticamente aceitáveis que incluem carreadores, tampões ou outros excipientes fisiologicamente aceitáveis. A dosagem da composição dependerá da via de administração e variará de acordo com, por exemplo, o tamanho e a saúde do sujeito e a gravidade da condição.
[0148] Em geral, as composições contendo VLP quiméricas desta invenção podem ser usadas sozinhas ou em conjunto com outros agentes terapêuticos em dosagens apropriadas definidas por testes de rotina, a fim de obter eficácia ideal enquanto minimiza qualquer toxicidade em potencial. Outros agentes terapêuticos incluem, por exemplo, sem limitação, agentes quimioterapêuticos e inibidores do ponto de verificação. O regime de dosagem utilizando uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser selecionado de acordo com uma variedade de fatores, incluindo tipo, espécie, idade, peso, gênero, condição médica do paciente; a gravidade da condição a ser tratada; objetivo pretendido do tratamento (alívio dos sintomas versus cura); a via de administração; a função renal e hepática do paciente; e a composição farmacêutica específica empregada, e a potência, estabilidade e toxicidade da composição específica. Um médico de habilidade comum pode prontamente determinar e prescrever a quantidade eficaz da composição farmacêutica (e potencialmente outros agentes, incluindo agentes terapêuticos) necessários para prevenir, contrariar ou interromper o progresso da condição, por exemplo, o tumor/câncer.
[0149] A precisão ideal para alcançar concentrações do regime terapêutico dentro da faixa que permite eficácia máxima com toxicidade mínima pode precisar de um regime baseado na cinética da disponibilidade da composição farmacêutica para um ou mais locais-alvo. A distribuição, o equilíbrio e a eliminação de uma composição farmacêutica podem ser considerados ao determinar a concentração ideal para um regime de tratamento. As dosagens de uma composição farmacêutica divulgada neste documento podem ser ajustadas quando combinadas para alcançar os efeitos desejados. Por outro lado, as dosagens da composição farmacêutica e vários agentes terapêuticos podem ser independentemente otimizados e combinados para alcançar um resultado sinérgico em que a patologia é reduzida mais do que seria se fosse usada sozinha.
[0150] Em particular, a toxicidade e a eficácia terapêutica da composição farmacêutica da divulgação pode ser determinada por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dose entre efeito terapêutico e tóxico é o índice terapêutico, e pode ser expressa como a razão LD50 /ED50. As composições farmacêuticas que exibem grandes índices terapêuticos são preferenciais, exceto quando a citotoxicidade da composição é a atividade ou resultado terapêutico desejado. Embora as composições farmacêuticas que exibem efeitos colaterais tóxicos possam ser usadas, um sistema de distribuição pode direcionar tais composições para o sítio do tecido afetado, a fim de minimizar danos potenciais às células não infectadas e, assim, reduzir os efeitos colaterais. Geralmente, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de uma maneira que maximize a eficácia e minimize a toxicidade.
[0151] Em muitos casos, será desejável ter várias administrações da composição contendo VLP, geralmente no máximo, pelo menos ou não excedendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais vacinas, incluindo todos as faixas entre elas. As vacinas normalmente terão intervalos semanais/mensais/anuais de 1, 2, 3, 4, 5, 6, a 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 a 12, incluindo todos os valores e faixas entre eles, mais geralmente de três a cinco intervalos.
[0152] Os dados obtidos de ensaios de cultura celular e estudos em animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagens para uso em seres humanos. As dosagens de tais composições estão, de preferência, dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem o ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa, dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. Para qualquer composição utilizada nos métodos da invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentração plasmática circulante que inclui a IC50 (a concentração da composição de teste que atinge uma inibição quase-máxima de sintomas) conforme determinado na cultura celular. Tal informação pode ser usada para determinar de modo preciso as doses úteis em seres humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficiência.
[0153] Mediante formulação, as soluções serão administradas de maneira compatível com a formulação de dosagem e em tal quantidade que seja terapêutica ou profilaticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tal como o tipo de soluções injetáveis descritas neste documento.
[0154] Outro aspecto da invenção é um kit para tratamento de acordo com a presente invenção. Numa modalidade, o kit compreende uma ampola e opcionalmente uma bula com instruções de administração, a ampola compreende uma composição contendo VLP quimérica para administração de acordo com os métodos da presente invenção.
[0155] Qualquer uma das composições descritas neste documento pode ser incluída em um kit. Em um exemplo não limitativo, os reagentes para preparar uma VLP e/ou administrar uma VLP, por vacinação com VLP, podem ser incluídos em um kit. O kit pode incluir adicionalmente reagentes para avaliar a atividade da VLP in vitro e in vivo. Os kits compreenderão, assim, em um recipiente adequado, uma composição de VLP. Em certos aspectos, o kit pode incluir reagentes e/ou dispositivos para administração, por exemplo, seringa, inalador ou nebulizador. Também pode incluir um ou mais tampões, compostos ou dispositivos para preparar a composição para administração.
[0156] Os componentes do kit podem ser embalados em meio aquoso ou em forma liofilizada. Os meios de recipiente dos kits incluirão geralmente pelo menos uma ampola, tubo de ensaio, frasco, garrafa, seringa ou outros meios de recipiente, no qual um componente pode ser colocado, e preferencialmente, aliquotado adequadamente. Onde houver mais de um componente no kit, o kit conterá também geralmente um segundo, terceiro ou outro recipiente adicional no qual os componentes adicionais podem ser colocados separadamente. No entanto, várias combinações de componentes podem estar compreendidas em uma ampola. Os kits da presente invenção também incluirão meios tipicamente para conter os recipientes em confinamento próximo para venda comercial. Tais recipientes podem incluir recipientes de plástico moldados por injeção ou sopro nos quais as ampolas desejadas são retidas.
[0157] Quando os componentes do kit são fornecidos em uma e/ou mais soluções líquidas, a solução líquida é uma solução aquosa, sendo uma solução aquosa estéril particularmente preferencial. No entanto, os componentes do kit podem ser fornecidos como pó(s) seco(s). Quando os reagentes e/ou componentes são fornecidos como um pó seco, o pó pode ser reconstituído por meio da adição de um solvente adequado. É previsto que o solvente possa também ser fornecido em outro recipiente. Um kit também pode incluir instruções para o emprego dos componentes do kit, bem como o uso de qualquer outro reagente não incluído no kit. As instruções podem incluir variações que podem ser implementadas. É contemplado que tais reagentes são modalidades de kits da invenção.
[0158] Tais kits, no entanto, não estão limitados aos itens específicos identificados acima e podem incluir qualquer reagente usado para a preparação e/ou administração de uma composição de VLP quimérica da invenção.
[0159] Entre outros usos, os kits da invenção podem ser utilizados em aplicações experimentais. Um trabalhador qualificado reconhecerá componentes de kits adequados para realizar um método da invenção.
[0160] Os exemplos seguintes são oferecidos a título ilustrativo e não a título limitativo. Entende-se que várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito da invenção e seriam prontamente conhecidas pelos versados na técnica.
EXEMPLOS
[0161] Exemplo I. Produção de VLPs
[0162] A. A expressão baculovírus de proteínas do HPV
Ll e a produção de partículas VLPs de HPV (VLPs) são produzidas por métodos conhecidos na técnica. Resumidamente, as partículas de HPV são produzidas em células de inseto a partir de um baculovírus recombinante que expressa a proteína L1 do capsídeo principal do papilomavírus. As células de Trichoplusia ni (HighFiveTM) ou Spodoptera frugiperda (células SF9) são infectadas com baculovírus recombinante de alto título em meio Express Five ou SF900-III sob condições sem soro e meio sem soro. Após 96 h de incubação a 27°C, as células são colhidas e o sedimento celular é ressuspenso em tampão de extração (tampão fosfato 20 mM pH 6,5, NaCl 0,5 M, 10mM MgCl2) contendo inibidores de protease. As partículas são liberadas por descongelamento-congelamento. Os ácidos nucleicos são digeridos por incubação na presença de uma nuclease ativa com alto sal. O lisado é clarificado por centrifugação a 8.000 × g por 30 min e delipidado por extração de Vertrel. O lisado clarificado é carregado em uma almofada de sacarose de 40% e centrifugado em um rotor SW-28 a 27.000 rpm por 90 minutos a 4°C. O sedimento é ressuspenso em tampão fosfato 20 mM, pH 6,5, NaCl 1 M, DTT 10 mM e Tween 80 a 0,03%, e armazenado a 4°C. A pureza da preparação de nanopartículas é determinada por SDS-PAGE e a morfologia das partículas por microscopia eletrônica (EM). As preparações típicas são> 90% puras e aparecem como EM de partículas de 50nm do tipo capsídeo totalmente montadas.
[0163] As partículas de HPV também são produzidas em células de mamíferos por métodos conhecidos na técnica. Resumidamente, apenas L1 do papilomavírus otimizado por códon ou os genes capsídeos L1 e L2 são co-transfectados em células 293TT (células renais embrionárias humanas que foram transfectadas com o antígeno SV40 Large-T (Pastrana et al., 2004)). As células co-transfectadas com o vetor de expressão L1 e/ou L1/L2 são mantidas por 24 h e são, então, colhidas. Resumidamente, as partículas de HPV são liberadas das células 293TT por lise detergente. O lisado celular é incubado durante a noite a 37ºC. As partículas maturadas de
HPV são solublizadas por adição de cloreto de sódio ao lisado e o lisado é clarificado por centrifugação a baixa velocidade. Os capsídeos são separados dos detritos celulares e detergente por extração com alto sal seguido de ultracentrifugação através de um gradiente de etapa Optiprep (iodixanol), de acordo com as instruções do fabricante. A pureza da preparação é determinada por SDS-PAGE e morfologia das partículas por microscopia eletrônica (EM). As preparações típicas são> 90% puras e aparecem como EM de partículas de 50nm do tipo capsídeo totalmente montadas.
[0164] As partículas de HPV também são produzidas por meio de transfecção dos genes do capsídeo L1 e L2 ou somente L1 do papilomavírus em células 293EXPI. As células co-transfectadas com o vetor de expressão L1 e/ou L1/L2 são mantidas por 72 horas e são então colhidas. As partículas de HPV são liberadas das células 293EXPI por lise detergente e o lisado é incubado durante a noite a 37ºC com um detergente neutro (por exemplo, Brij58 ou Triton X-100). As partículas no lisado incubado durante a noite são então solublizadas por adição de cloreto de sódio. O lisado é então clarificado por centrifugação a baixa velocidade. Os capsídeos são separados dos detritos celulares e detergente por extração com alto sal seguido de ultracentrifugação através de um gradiente de etapa Optiprep (iodixanol), de acordo com as instruções do fabricante. A pureza da preparação é determinada por SDS-PAGE e morfologia das partículas por microscopia eletrônica (EM). As preparações típicas são> 90% puras e aparecem como EM de partículas de 50nm do tipo capsídeo totalmente montadas B. Anexo do peptídeo alvo ao VLP do HPV
[0165] As VLPs quiméricas compreendendo peptídeos alvo compreendendo uma cisteína terminal, um dos epítopos de células T CD8 + tendo a sequência FMYSDFHFI (SEQ ID NO: 136) (influenza) ou GILGFVFTL SEQ ID NO: 119 (influenza) ou KLWESPQEI (SEQ ID NO: 6) (sarampo), ou FLPSDFFPSV (SEQ ID NO: 69) (HepB), ou SLPRSRTPI (SEQ ID NO: 218)
(vírus da catapora) ou SAPLPSNRV (SEQ ID NO: 219) (vírus da catapora) e um local de clivagem de enzima (por exemplo, RRRR ou RVKR) entre a cisteína e o epítopo da célula T, (por exemplo, C – RRRR - epitopo), são preparados por conjugação dos peptídeos alvo às VLPs de HPV16 (K)-L1 do Exemplo 1.Uma via de conjugação de maleimida. Resumidamente, a VLP do HPV, em NaHCO3 50mM, pH 8,4 a 14 mM em concentração de proteína L1, é misturada com um reticulador heterobifuncional comercial 4-(N- maleimidometil)-ciclo-hexano-1-carboxilato (sSMCC) (Pierce Endogen, Rockfort, IL) para uma razão final de proteína sSMCC/L1 (mol/mol) de cerca de
100. A reação prossegue por 1 h a 2–8ºC e é, então, dessalinizada por diálise contra um tampão de pH 6,2 contendo 10 mM de histidina, 0,5 M de NaCl, 0,015% de polissorbato 80 para gerar VLPs de HPV ativadas por sSMCC. Os equivalentes de maleimida são determinados pelo ensaio DTNB (consultar, Fan et al., Vaccine (2004) Vol. 22: 2993-3003; Ionescu et al. J. Pharmaceutical Sciences, vol. 95 (1): 70-79 (jan. 2006)). Os peptídeos alvo são dissolvidos em tampão dispersadoN2 e cada um é misturado com VLPs de HPV ativado por sSMCC para uma razão tio/maleimida (mom/mol) de cerca de 3. A reação prossegue por cerca de 15 horas a 2–8ºC. Ambas as amostras são, então, tratadas com β-mercaptoetanol para suprimir qualquer excesso de maleimida. Finalmente, as amostras são dialisadas (Dispodialyser MWCO 300000 Spectrum Industries Inc., Rancho Dominguez, CA) contra NaCl 0.5 M e 0,015% de polissorbato 80.
[0166] Exemplo 2. Indução de VLP de citocinas por BMDC e Macrófagos
[0167] VLPs quiméricas de HPV (20 µg) do Exemplo 1 compreendendo os peptídeos alvo, ou VLPs de HPV (20 µg) sem um peptídeo alvo ou solução salina tamponada com fosfato (PBS, 20 µl) são adicionados a culturas in vitro de células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs, 106 células/poço) e macrófagos primários. Os BMDCs e macrófagos que são colhidos de camundongos C57BL6. Após 24 horas de cultura a 37ºC, os sobrenadantes são coletados das culturas celulares e os perfis de citocinas são quantificados usando um ensaio de 32plex luminex de camundongo.
[0168] Resultados: BMDCs e macrófagos expostos a VLPs com ou sem os peptídeos alvo produzem níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias in vitro em comparação com BMDCs e macrófagos de controle expostos apenas a PBS.
[0169] Exemplo 3. Indução de VLP da produção de citocinas por BMDCs co-cultivadas com células T
[0170] Os BMDCs são co-cultivados por 48 h a 37ºC com células T singênicas altamente purificadas (razão 1: 1) na presença de VLPs quiméricas que compreendem os peptídeos alvo que são produzidos conforme descrito no Exemplo 1 acima (10 μg/ml), VLPs de HPV16 (K)-L1 (10 μg/ml) ou rIFN-γ (1000 U/ml). Como controles, os BMDCs são cultivados apenas em meio ou na presença das VLPs quiméricas do Exemplo 1 (10 μg/ml), VLPs de HPV16(K)-L1 (10 μg/ml) ou rIFN-γ na ausência de células T. Cada condição de cultura é realizada pelo menos em duplicado. A produção de IL-12p70 é determinada para cada condição de cultura usando procedimentos padrão.
[0171] Exemplo 4. As VLPs ligam células tumorais in vivo
[0172] A. Método: Em camundongos com ou sem tumores ovarianos SHIN-3 DSR são administrados uma injeção intraperitoneal de 1X108 UI do pseudovírus HPV16-Luc (luciferase) (PsV) (preparado como descrito em Buck et al. Journal of Virology, (2004), 78: 751-757 ou Hung et al. PLoS One (2012); 7 (7): e40983 incorporado neste documento por referência) em 100 µL de PBS ou PBS com i-carragenina a 1% (carragenina inibe a aglutinação do HPV às células). Quarenta e oito horas depois, o substrato luciferina é administrado e a bioluminescência é medida. Uma região de interesse é desenhada ao redor da cavidade peritoneal e o brilho médio é calculado. Todos os dados são representativos de n= 5/grupo.
[0173] Resultados: O HPV16-Luc PsV se aglutina a tumores ovarianos SHIN-3 DSR in vivo.
[0174] B. Método: Os tumores ovarianos humanos passados apenas em animais imunocomprometidos são implantados subcutaneamente em camundongos. Quando os tumores têm entre 7 e 15 mm de diâmetro, os animais recebem uma injeção intratumoral de 50 µl de PBS ou 50 µl de HPV16-Luc PsV (~1 µg/ul). Os animais sem tumores recebem uma injeção subcutânea no seu flanco traseiro de 50 µl de PBS ou 50 µl de HPV16- Luc PsV (~1 µg/ul). As imagens de luminescência são gravadas no dia seguinte à injeção do HPV-16/LucPsV. Um tempo de integração de 2 min é usado para aquisição de imagens de luminescência. Os valores de luminescência são relatados como radiação média.
[0175] Resultados: O HPV16-Luc PsV aglutina e infecta tumores ovarianos humanos estabelecidos no xenoenxerto, mas não tecido saudável in vivo.
[0176] Exemplo 5. Imuno-modulação de VLPs do microambiente tumoral
[0177] Método: Em cada um dos dias 1 a 8, 100 µg de VLPs de HPV do Exemplo 1 com ou sem um peptídeo alvo são administrados em camundongos portadores de tumores. Como controle, os camundongos portadores de tumor recebem 100 µl de PBS por dia, durante 8 dias.
[0178] Vinte e quatro horas após a última injeção (dia 9), os camundongos são sacrificados e os tumores são colhidos e homogeneizados. Os sobrenadantes são coletados e submetidos a perfil de citocinas usando o ensaio de 32plex luminex de camundongo.
[0179] Resultados: Os tumores de camundongos tratados com as VLPs do Exemplo 1 exibem níveis elevados de citocinas pró- inflamatórias e quimioatrativos, em comparação com os tumores de camundongos tratados com PBS.
[0180] Exemplo 6. Imuno-modulação de VLPs do microambiente tumoral
[0181] Método: Em cada um dos dias 1 a 8, a VLP do HPV e cada uma das VLPs quiméricas do Exemplo 1 (100 µg) são administradas a grupos de camundongos portadores de tumores. Como controle, os camundongos portadores de tumor recebem 100 µl de PBS em cada um dos dias 1-8.
[0182] Vinte e quatro horas depois (dia 9), os ratos são sacrificados e os tumores são colhidos e dissociados em suspensão de célula única. Os glóbulos vermelhos são removidos da suspensão usando tampão de lise RBC. A citometria de fluxo é realizada usando BD Facscaliber com anticorpos anti-camundongo específicos para CD45, MHC II, CD86, CD11b, F4/80 e Ly6G e a composição celular dos tumores é comparada.
[0183] Resultados: A administração das VLPs do Exemplo 1 com ou sem peptídeo alvo induz mudanças dramáticas na composição de células imunes a tumores em comparação com tumores de camundongos tratados com PBS.
[0184] Exemplo 7. A imunoterapia com VLPs induz imunidade antitumoral sistêmica duradoura.
[0185] Método: A VLP do HPV e cada uma das VLPs quiméricas do Exemplo 1 (100 µg) foram injetadas diretamente nos melanomas de B16F10 em um camundongo. Os centros necróticos dos tumores se formam rapidamente dentro dos tumores e, alguns dos camundongos tratados eliminam completamente os tumores.
[0186] Os camundongos que eliminam completamente o tumor são novamente desafiados injetando células B16F10 nos seus flancos contralaterais 4 semanas após a confirmação do desaparecimento completo dos seus tumores primários. Os camundongos previamente curados de tumores de flanco B16F10 primários por injecção intratumoral de VLPs quiméricas exibem um aumento na resistência à reintrodução secundária. Isso indica que a injeção direta de tumores primários com nanopartículas quiméricas de VLPs induz uma resposta imune sistêmica protetora contra tumores B16F10.
[0187] Resultados: As VLPs quiméricas com um peptídeo alvo induzem imunidade antitumoral duradoura e sistêmica
[0188] Exemplo 8. As VLPs quiméricas são capazes de redirecionar a imunidade de células T não relacionadas ao tumor e promover a depuração
[0189] Método: A linha celular de câncer de ovário ID8 de murino que expressa em excesso a luciferase será co-cultivada com células T OT-1 CD8 + que são específicas ao epítopo do peptídeo ovalbumina SIINFEKL (SEQ ID NO: 220). As VLPs com ou sem um peptídeo alvo contendo SIINFEKL (SEQ ID NO: 220) serão então adicionadas às co-culturas.
[0190] Resultado: está contemplado que nenhuma morte celular (na forma de sinal de luciferase diminuído) ocorrerá com as VLPs sem o peptídeo alvo co-cultivado com células T CD8+OT-1 e linha celular de câncer de ovário ID8 de murino. Em contraste, é contemplado que a morte de células tumorais na forma de sinal de luciferase diminuído será observada nas co- culturas de células T ID8/OT-1 que receberam VLPs quiméricas compreendendo o peptídeo alvo contendo SIINFEKL (SEQ ID NO: 220) ("VLP quimérico OVA").
[0191] Método in vivo: Camundongos C57/BL6 com 10 semanas de idade com tumores ovarianos são gerados por injeção de linha celular de câncer de ovário ID8 murina nos camundongos. Cem µg de VLP quiméricas de OVA são injetados em cada camundongo i.p. Os controles são (a) camundongos i.p injetados com 100 µg/camundongo da VLP do Exemplo 1 sem um peptídeo alvo e (b) camundongos i.p injetados com 100 µg/camundongo das VLPs quiméricas do Exemplo 1. As VLPs são administradas aos camundongos semanalmente por quatro semanas e 2,5x106 células T CD8 + de OT-1 acima, são injetadas intraperitonealmente duas vezes, ou seja, uma vez a cada duas semanas, nos camundongos. Todos os camundongos são observados quanto à sobrevivência. Uma pequena fração dos camundongos em cada grupo é sacrificada 1 semana após o último tratamento com as VLPs. Os tumores ovarianos são colhidos para medição da histologia macroscópica e infiltração de células T.
[0192] Resultados. Os tumores de camundongos tratados com a VLP quimérica OVA são contemplados como tendo menor massa tumoral do que os tumores de camundongos tratados com VLP sem o peptídeo alvo e os tumores de camundongos tratados com VLP quimérica do Exemplo 1. Os linfócitos infiltrantes de tumor são avaliados para células T CD8 + específicas para SIINFEKL (SEQ ID NO: 220) usando coloração com tetrâmero H-2Kb carregado com SIINFEKL (SEQ ID NO: 220). Também é analisada a percentagem de células T CD8 + específicas de SIINFEKL (SEQ ID NO: 220) no total de TILs (média ± DP).
[0193] Exemplo 9. As VLPs quiméricas capazes de redirecionar a imunidade de células T da vacina infantil humana não relacionada ao tumor
[0194] Grupos de camundongos transgênicos HLA- A*0201 (AAD) C57BL/6 são injetados subcutaneamente três vezes com um décimo de uma dose das VLPs quiméricas do Exemplo 1 em intervalos de uma semana. Os camundongos são sacrificados uma semana após a última imunização e os esplenócitos são coletados para serem analisados quanto a respostas específicas de antígeno de vacina infantil restritas a HLA-A2, utilizando o FMYSDFHF (SEQ ID NO: 136), KLWESPQEI (SEQ ID NO: 6) ou FLPSDFFPSV (SEQ ID NO: 69) ou SLPRSRTPI (SEQ ID NO: 218) ou peptídeos SAPLPSNRV (SEQ ID NO: 219) por meio de coloração por imunofluorescência e ensaios de ativação de células T interferon-gama CD*+.
Após o final do cronograma de vacinação, os esplenócitos são co-cultivados com as VLPs quiméricas do Exemplo 1 compreendendo o peptídeo alvo contendo um FMYSDFHF (SEQ ID NO: 136), KLWESPQEI (SEQ ID NO: 6) ou FLPSDFFPSV (SEQ ID NO: 69) ou SLPRSRTPI (SEQ ID NO: 218) ou SAPLPSNRV (SEQ ID NO: 219) e são avaliados quanto à reativação de células T utilizando coloração por imunofluorescência e ensaios de ativação de células T interferon-gama CD*+. VLPs nuas, ou seja, VLPs que não compreendem peptídeos alvo são usadas como controles. O efeito de aglutinação e antitumoral das VLPs é testado por meio de imagens de luminescência para medir a citotoxicidade in vitro. Várias linhas tumorais positivas para HLA-A2 que expressam luciferase, como ID8 / A2 (ovário), B16 / A2 (melanoma), TC-1 / A2 (câncer cervical) são co-cultivadas com esplenócitos de HLA-A * 0201 (AAD ) camundongos transgênicos vacinados com as VLPs quiméricas. Como estas linhas de células tumorais não estão relacionadas antigenicamente ao epítopo das células T CD8 + dos peptídeos alvo, não se observa morte do tumor. Da mesma forma, a adição de VLPs nuas tem pouco ou nenhum efeito de morte de tumor.
[0195] Resultados: Está contemplado que a adição das VLPs quiméricas do Exemplo 1 compreendendo os peptídeos alvo compreendendo FMYSDFHF (SEQ ID NO: 136), KLWESPQEI (SEQ ID NO: 6) ou FLPSDFFPSV (SEQ ID NO: 69), SLPRSRTPI (SEQ ID NO: 218) ou SAPLPSNRV (SEQ ID NO: 219) nesta co-cultura torna os tumores suscetíveis à morte pelas células T citotóxicas na cultura esplenócita
[0196] Exemplo 10. As VLPs quiméricas são capazes de redirecionar a imunidade de células T da vacina infantil humana não relacionada ao tumor para depuração.
[0197] Métodos: Estabelecimento de tumores: camundongos transgênicos HLA-A * 0201 (AAD) são injetados intraperitonealmente (IP) com células tumorais ID8/A2 que expressam luciferase.
[0198] Geração da resposta da vacina infantil: após a injeção de células tumorais, os camundongos transgênicos HLA-A*0201 (AAD) são imunizados ativamente com um décimo da vacina infantil humana contra vírus influenza, sarampo, hepatite B ou catapora com intervalos de semanas, conforme descrito no Exemplo 8. O componente antigênico das vacinas compreende o epítopo das células T CD8 + FMYSDFHFI (SEQ ID NO: 136) (gripe) ou GILGFVFTL SEQ ID NO: 119 (gripe) ou KLWESPQEI (SEQ ID NO: 6) (sarampo) ou FLPSDFFPSV (SEQ ID NO: 69) (HepB) ou SLPRSRTPI (SEQ ID NO: 218) (vírus da catapora) ou SAPLPSNRV (SEQ ID NO: 219) (vírus da catapora). Um subconjunto de cada grupo de camundongos é separado e eutanasiado para caracterizar e garantir o estabelecimento de imunidade pré- existente à vacina infantil, conforme descrito no Exemplo 8.
[0199] Tratamento e análise dos efeitos antitumorais: os camundongos portadores de tumor são injetados intraperitonealmente com as VLPs quiméricas, ou VLPs nuas (sem um peptídeo alvo) (100 μg/camundongo) semanalmente por 3 vezes. Camundongos não tratados servem como controles. O crescimento do tumor é monitorado por imagem de luminescência
[0200] Resultados: Está contemplado que camundongos portadores de tumor tratados com as VLPs quiméricas exibem efeitos antitumorais terapêuticos que excedem os efeitos obtidos por camundongos administrados à VLP nua e aos camundongos de controle. Especificamente, é contemplado que as VLPs quiméricas são capazes de redirecionar as células T CD8+ específicas para o epítopo da célula T do peptídeo alvo para o tumor e inibem o crescimento do tumor e, em alguns casos, eliminam o tumor, enquanto os camundongos i.p de controle injetados com as VLPs nuas ou sem receber VLPs, não redirecionam as células T CD8+ específicas para os epítopos das células T das VLPs quiméricas. Está contemplado que os camundongos i.p de controle injetados com as VLPs nuas ou que não recebem nenhuma VLPs inibem o crescimento do tumor e eliminam o tumor muito menos do que é alcançado com as VLPs quiméricas com o peptídeo alvo.
[0201] Exemplo 11. Projeto e síntese de VLPs conjugadas com epítopo
[0202] As VLPs foram produzidas em células Trichoplusia ni (HighFiveTM) essencialmente conforme descrito no Exemplo 1. Resumidamente, as VLPs foram produzidas em células Trichoplusia ni (HighFiveTM) infectadas com um baculovírus recombinante que expressa nosso gene L1 quimérico do papilomavírus. As VLPs foram purificadas usando uma centrifugação de sacarose a 40%, seguida por outra rodada de purificação em um gradiente de etapa de CsCl. A pureza da preparação da VLP foi determinada por SDS-PAGE e a morfologia das partículas foram avaliadas por Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM). As preparações típicas foram> 90% puras e apareceram como partículas de 50 nm do tipo capsídeo totalmente montadas por TEM (Figura 2, painel esquerdo TEM). O peptídeo alvo (FMYSDFHFI (SEQ ID NO: 136) (gripe) ou GILGFVFTL SEQ ID NO: 119 (gripe) ou KLWESPQEI (SEQ ID NO: 6) (sarampo) ou FLPSDFFPSV (SEQ ID NO: 69) (HepB), ou SLPRSRTPI (SEQ ID NO: 218) (vírus da catapora) ou SAPLPSNRV (SEQ ID NO: 219) (vírus da catapora)) foram sintetizados com >85% de pureza como policatiônico (epitopo Arg4RVKR-epítopo da malemida N-terminal) peptídeos 17mer, também conhecido como peptídeo MAL. Para conjugação, as VLPs não conjugadas vazias foram submetidas a condições de redução com fosfato de sódio 50 mM pH 6,5, NaCl 500 mM, tampão de reação EDTA 2 mM com TCEP (68 µM, final) (proteína TCEP:VLP (mol: mol) = 10: 1). A mistura (volume = 625 µl) foi agitada suavemente a cada 15 minutos durante 1 hora a 21ºC. Após redução de 1 hora, o peptídeo MAL (170 µM, 625 µl) no tampão de reação foi adicionado às VLPs pré-tratadas com TCEP para uma razão de proteína peptídeo:RG-1 (mol:mol) = 25:1. A mistura foi agitada suavemente a ~ 250 rpm a 21ºC por 1 hora antes de prosseguir imediatamente para um processo de purificação. Após a conjugação, a composição compreendendo as VLPs conjugadas foram dialisadas em PBS pH 7, NaCl 500 mM, que foi seguida por uma etapa de diafiltração para remover o excesso de peptídeo. As VLPs conjugadas ("AIR VLPs") foram analisadas por TEM. Os resultados TEM de múltiplas bateladas AIR VLP foram consistentes, mostrando VLPs ligeiramente maiores (60-70nM) em comparação com as VLPs não conjugadas vazias (50nM). Este resultado, juntamente com uma análise SDS- PAGE das AIR-VLPs, mostra uma quantidade alta de peptídeo ligado à VLP conjugada. Este processo de conjugação pode ser realizado em diferentes VLPs e foi realizado para formar VLPs de HPV 16 RG-1 e VLPs de tipo selvagem HPV16 conjugados com muitos tipos diferentes de epítopos de vacina infantil, conforme visto na Figura 3. A Figura 3 mostra uma análise SDS PAGE de VLPs de HPV 16 RG-1 (painel esquerdo) ou VLPs de HPV 16 L1 do tipo selvagem (painel direito) conjugados a epítopos derivados a partir de vírus influenza, hepatite B, sarampo e catapora.
[0203] Exemplo 12. Aglutinação específica do tumor por diferentes VLPs
[0204] Para confirmar a ampla capacidade de aglutinação tumoral das VLPs quiméricas descritas neste documento, tratamos as linhas celulares de câncer de colo de útero (TC-1), câncer de ovário (ID8), câncer de mama (4T1) e câncer de melanoma (B16) com 0,3 μg/ml de VLPs quiméricas in vitro por 24 horas, coraram-se as células quanto à presença de VLPs ligadas a tumores e depois analisaram-se as células coradas por análise por citometria de fluxo.
[0205] A Figura 4 retrata um deslocamento na população de células que demonstra a agultinação de VLP a todas as linhas celulares de tumor testadas. A Figura 4, fileira superior mostra os resultados da aglutinação das VLPs vazias de HPV16 RG-1 às várias linhas celulares de tumor e a fileira inferior mostra os resultados da VLP do papilomavírus bovino (BPV) com um peptídeo inserido de forma recombinante em uma das alças L1.
[0206] Para demonstrar que a capacidade de aglutinação ao tumor das VLPs não foi comprometida pela conjugação de peptídeos na superfície da VLP, repetimos os estudos de aglutinação ao tumor descritos acima com as VLPs conjugadas. Consistentes com os resultados obtidos com as VLPs não conjugadas, as AIR-VLPs conjugadas mantiveram sua capacidade de se aglutinar às células tumorais (consultar Figura 5).
[0207] Exemplo 13. O redirecionamento imune antitumoral específico do antígeno pela VLP conjugada leva à aglutinação in vitro, carregamento do epítopo CD8 + e morte do antitumoral por CTLs específicos do epítopo revestido.
[0208] Para avaliar a viabilidade das VLPs conjugadas descritas neste documento como um redirecionador imune antitumoral, primeiro usamos o antígeno modelo OVA (SIINFEKL, SEQ ID NO: 220). Conjugamos este epítopo OVA restrito a H2-KB de murino (SIINFEKL, SEQ ID NO: 220) com um local de clivagem de furina a um VLP HPV 16 RG-1 para gerar uma VLP quimérica (AIR-VLP). As células tumorais foram então incubadas com quantidades variadas (concentração de 1,00pM a 0,02nM) de AIR-VLPs, ou VLPs de controle, como VLPs vazias, não conjugadas, ou Mock AIR (uma composição de VLPs não conjugados e peptídeos não conjugados para as VLPs) in vitro durante 24 horas e, então, incubaram as células tumorais tratadas com 1x105 CTLs específicos de OT1. A ativação de CTL específicos de OT-1 foi avaliada por CD8 de superfície e coloração intracelular por IFN-γ, seguida por análise por citometria de fluxo. Significativamente mais células CD8 + IFN-γ + T foram detectadas após a incubação com células tumorais tratadas com AIR-VLPs, indicaram que o tratamento AIR-VLP revestiu com sucesso células tumorais que não expressam OVA com peptídeos OVA, resultando em reconhecimento subsequente e ativação de OT-1 CTLs específicos (consultar Figura 6).
[0209] Para avaliar a viabilidade das VLPs conjugadas a um epítopo CD8 + viral como redirecionador imunológico antitumoral, conjugamos o epítopo HPV16-E7 restrito de murino com H2-DB (aa49-57) a um VLP de papilomavírus bovino com um sítio de clivagem de furina para gerar a VLP quimérica -R-E7. Em seguida, incubamos as células tumorais ID8 com 0,3μg / ml de VLPs não conjugadas vazias ou VLP-R-E7 quimérica in vitro por 24 horas e depois incubamos as células tumorais tratadas com 2x105CTLs específicos para E7aa49-57.
[0210] A ativação de CTL específicos de E7 foi avaliada por meio de CD8 de superfície e coloração intracelular por IFN-γ, seguida por análise por citometria de fluxo. Significativamente mais células CD8+ IFN-γ+ T foram detectadas após a incubação com células tumorais ID8 tratadas com VLP-R-E7 quimérico, indicando que o tratamento VLP-R-E7 quimérico revestiu com sucesso células tumorais ID8 não expressando E7 com peptídeos E7, resultando em subsequente reconhecimento e ativação de CTLs específicos de E7 (consultar Figura 7).
[0211] Para demonstrar que o redirecionamento imunológico induzido por VLP quimérico pode levar à morte citotóxica das células tumorais revestidas, demonstramos que a aglutinação de AIR-VLPs às células tumorais resultou na liberação de CTL que tornou as células tumorais mais suscetíveis à morte por células CD8+ T específico para OVA. Conforme mostrado na Figura 8, a incubação de AIR-VLPs, mas não as VLPs não conjugadas vazias, levou à maior quantidade de morte de células tumorais mediada pela morte de células T CD8+ específicas do OVA, demonstrada por uma diminuição significativa na atividade de luminescência (consultar Figura 8).
[0212] As células tumorais ID8/luc foram tratadas com 0,3μg/ml de VLPs não conjugadas vazias ou VLP-R-E7 quimérica in vitro por 24 horas e depois incubaram-se as células tumorais tratadas com 2x104 CTLs E7aa49-57-específicos. Em seguida, avaliamos a viabilidade das células tumorais por meio de imagens de bioluminescência com base na expressão de luciferase por células ID8/luc vivas.
Foi observada uma atividade de luciferase significativamente menor para células tumorais ID8 tratadas com VLP-R-E7 quimérica e incubadas com CTLs específicos de E7, indicando uma redução significativa na viabilidade das células tumorais ID8 após o tratamento.
Juntos, esses dados demonstram a capacidade das VLPs quiméricas conjugadas com um peptídeo alvo para revestir células tumorais e carregar o MHC-I de superfície das células tumorais com o peptídeo alvo, resultando na morte subsequente de células tumorais revestidas por CTLs ativados (consultar Figura 9). Tabela I Sequência de Epítopo SEQ ID Tipo de vírus Alelo MHC Proteína Viral Referência Espécie NO (PMID / Patente no.) SMLNSQAIDNLRA 1 Sarampo A*02:01 Proteína de 26579122 Humana fusão LMIDRPYVL1 2 Sarampo A*02:01 Hemaglutinina 26579122 Humana VIINDDQGLFKV 3 Sarampo A*02:01 Matriz 26579122 Humana KIIDNTEQL 4 Sarampo A*02:01 Matriz 26579122 Humana RLSDNGYYTV 5 Sarampo A*02:01 Matriz 26579122 Humana KLWESPQEI 6 Sarampo A*02:01 Proteína C 26579122 Humana KLIDGFFPA 7 Sarampo A*02:01 Polimerase 26579122 Humana SMYRVFEV 8 Sarampo A*02:01 Hemaglutinina 26579122 Humana KVSPYLFTV 9 Sarampo A*02:01 Hemaglutinina 26579122 Humana SLMPEETLHQV 10 Sarampo A*02:01 Polimerase 26579122 Humana RQAGQEMILAV 11 Sarampo A*02:01/B*1 Proteína de 26579122 Humana 5:01 fusão GSAPISMGFR 12 Sarampo A*03:01 Gene PVC 26579122 Humana GMYGGTYLVEK2 13 Sarampo A*03:01 Hemaglutinina 26579122 Humana AVRDLERAMTTLK 14 Sarampo A*03:01 Proteína C 26579122 Humana YVYDHSGEAVK 15 Sarampo A*03:01/A*1 Gene PVC 26579122 Humana 1:01 AIYTAEIHK 16 Sarampo A*03:01/A*1 Hemaglutinina 26579122 Humana 1:01 GPRQAQVSF(L) 17 Sarampo B*07:02 Nucleocapsí- 26579122 Humana deo
Sequência de Epítopo SEQ ID Tipo de vírus Alelo MHC Proteína Viral Referência Espécie NO (PMID / Patente no.) YPALGLHEF 18 Sarampo B*07:02/B*3 Nucleocapsí- 26579122 Humana 5:01 deo RPGLKPDL 19 Sarampo B*07:02 Proteína de 26579122 Humana fusão IPYQGSGKGVSF 20 Sarampo B*07:02/B*3 Hemaglutinina 26579122 Humana 5:01 KPNLSSKRSEL 21 Sarampo B*07:02 Hemaglutinina 26579122 Humana RPIYGLEV 22 Sarampo B*07:03 Polimerase 26579122 Humana DALLRLQAM 23 Sarampo B*08:01 Nucleocapsí- 26579122 Humana deo FPKLGKTL 24 Sarampo B*08:01 Gene PVC 26579122 Humana LLKEATEL 25 Sarampo B*08:01 Matriz 26579122 Humana IPPMKNLAL 26 Sarampo B*08:01 Hemaglutinina 26579122 Humana DIKEKVINL 27 Sarampo B*08:01 Polimerase 26579122 Humana HILAKSTAL 28 Sarampo B*08:01 Polimerase 26579122 Humana YLKDKALA 29 Sarampo B*08:01 Polimerase 26579122 Humana GLNEKLVFY 30 Sarampo B*15:01 Matriz 26579122 Humana RITHVDTESY 31 Sarampo B*15:01 Proteína de 26579122 Humana fusão LLKKGNSLY 32 Sarampo B*15:01 Polimerase 26579122 Humana SKESQHVY 33 Sarampo B*15:01 Polimerase 26579122 Humana AQRLNEIY 34 Sarampo B*15:01 Polimerase 26579122 Humana SQQGMFHAY 35 Sarampo B*15:01 Polimerase 26579122 Humana SMIDLVTKF 36 Sarampo B*15:01 Polimerase 26579122 Humana IVSSHFFVY6 37 Sarampo B*15:01 Polimerase 26579122 Humana EPIGSLAIEEAM 38 Sarampo B*35:01 Gene PVC 26579122 Humana EPIRDALNAM 39 Sarampo B*35:01 Proteína de 26579122 Humana fusão APVFHMTNY 40 Sarampo B*35:01 Hemaglutinina 26579122 Humana SAVRIATVY 41 Sarampo B*35:01 Polimerase 26579122 Humana MPEETLHQVM 42 Sarampo B*35:01 Polimerase 26579122 Humana LPAPIGGMNY 43 Sarampo B*35:01 Polimerase 26579122 Humana AEGGEIHEL 44 Sarampo B*40:01 Gene PVC 26579122 Humana AEVDGDVKL 45 Sarampo B*40:01 Hemaglutinina 26579122 Humana LETRTTNQFL 46 Sarampo B*40:01 Hemaglutinina 26579122 Humana
Sequência de Epítopo SEQ ID Tipo de vírus Alelo MHC Proteína Viral Referência Espécie NO (PMID / Patente no.) KESQHVYYL 47 Sarampo B*40:01 Polimerase 26579122 Humana YESGVRIASL 48 Sarampo B*40:01 Polimerase 26579122 Humana QEISRHQALGY 49 Sarampo B*44:02 Gene PVC 26579122 Humana KEIKETGRLF 50 Sarampo B*44:02 Polimerase 26579122 Humana AENLISNGIGKY 51 Sarampo B*44:02 Polimerase 26579122 Humana AVRDLERAM 52 Sarampo C*03:04 Gene PVC 26579122 Humana FRSVNAVAF 53 Sarampo C*07:02 Matriz 26579122 Humana ARVPHAYSL 54 Sarampo C*07:02 Polimerase 26579122 Humana TDTPIVYNDRNL(LD) 55 Sarampo Desconhe- Nucleocapsí- 26579122 Humana cido deo KKQINRQN 56 Sarampo Desconhe- Gene PVC 26579122 Humana cido DTGVDTRIW 57 Sarampo Desconhe- Gene PVC 26579122 Humana cido DQGLFKVL 58 Sarampo Desconhe- Matriz 26579122 Humana cido GKIIDNTEQL 59 Sarampo Desconhe- Matriz 26579122 Humana cido GRLVPQVRVID 60 Sarampo Desconhe- Matriz 26579122 Humana cido GPPISLERLDVGTN 61 Sarampo Desconhe- Proteína de 26579122 Humana cido fusão APVFHMTNYLEQPV 62 Sarampo Desconhe- Hemaglutinina 26579122 Humana S(N) cido PTTIRGQFS 63 Sarampo Desconhe- Hemaglutinina 26579122 Humana cido HYREVNLVY 64 Sarampo Desconhe- Polimerase 26579122 Humana cido (K)KVDTNFIY(QQ) 65 Sarampo Desconhe- Polimerase 26579122 Humana cido LSEIKGVIVHRLEGV 66 Sarampo H-2K Proteína de 9129158 Camun- fusão dongos LDRLVRLIG 67 Sarampo H-2K Nucleocapsídeo 9129158 Camundon gos RRYPDAVYL 68 Sarampo HLA-B27 / Proteína de 10998329 Camun- HLA-A2.1/Kb fusão dongos transgêni- cos HLA- A2.1Kb/ humanos
Sequência de Epítopo SEQ ID Tipo de vírus Alelo MHC Proteína Viral Referência Espécie NO (PMID / Patente no.)
FLPSDFFPSV 69 Hep B Proteína 10751335 Humana FLLTRILTI 70 Hep B Env 10751335 Humana WLSLLVPFV 71 Hep B Env 10751335 Humana GLSRYVARL 72 Hep B POL 10751335 Humana FLLSLGIHL 73 Hep B POL 10751335 Humana MDIDPYKEFGATVEL 74 Hep B Nucleocapsí- US4882145A Humana LSFLP deo RDLLDTASALYREAL 75 Hep B Nucleocapsí- US4882145A Humana ESPEHCSPHH deo TWVGVNLEDPASRD 76 Hep B Nucleocapsí- US4882145A Humana LVVSYVNTNMG deo VVSYVNTNMGLKFR 77 Hep B Nucleocapsí- US4882145A Humana QL deo VVSYVNTNMGLK 78 Hep B Nucleocapsí- US4882145A Humana deo LLWFHISCLTFGRET 79 Hep B Nucleocapsí- US4882145A Humana VIEYLV deo LLWFHISCLTF 80 Hep B Nucleocapsí- US4882145A Humana deo VSFGVWIRTPPA, 81 Hep B Nucleocapsí- US4882145A Humana deo VSFGVWIRTPPAYR 82 Hep B Nucleocapsí- US4882145A Humana PPNAPIL deo PPAYRPPNAPIL 83 Hep B Nucleocapsí- US4882145A Humana deo WIRTPPAYRPPN 84 Hep B Nucleocapsí- US4882145A Humana deo LLAQFTSAI 85 Hep B POL US2003009963 Humana 4 ALMPLYAC 86 Hep B POL US2003009963 Humana 4] KLHLYSHPI 87 Hep B POL US2003009963 Humana 4 YLHTLWKAGI 88 Hep B POL US2003009963 Humana 4]
Sequência de Epítopo SEQ ID Tipo de vírus Alelo MHC Proteína Viral Referência Espécie NO (PMID / Patente no.) YLHTLWKAGV 89 Hep B POL US2003009963 Humana 4 LLVPFVQWFV 90 Hep B Env US2003009963 Humana 4 ILLLCLIFLL 91 Hep B Env US2003009963 Humana 4 VLLDYQGML 92 Hep B Env US2003009963 Humana 4 LLPIFFCLWV 93 Hep B Env US2003009963 Humana 4 VLQAGFFLL 94 Hep B Env US2003009963 Humana 4 PLLPIFFCL 95 Hep B Env US2003009963 Humana 4 ILSTLPETTV 96 Hep B Nucleocapsí- US2003009963 Humana deo 4 NCTCIPIPSSYAFGK 97 Hep B Env WO199300376 Humana FLTGY 4A1 ASARFSYLSLLVPFV 98 Hep B Env WO199300376 Humana GYFVG 4A1 LSPTVYLSVIYMMYY 99 Hep B Env WO199300376 Humana YGPSL 4A1 TNMGLKFRLLYFHIS 100 Hep B Proteína de WO199300376 Humana CLYF núcleo 4A1 AAFEDLRVLSFIRG 101 Influenza A HLA-B37 NP Humana AGFIENGWEGMVDG 102 Influenza A HA Humana
WYGFRHQNSEGTG
QAADLKS AIMDKNIIL 103 HLA- NS1 HUMANO; A*0201;HLA- CAMUN- A*020101;HL DONGO A-A2.1 ASCMGLIY 104 Influenza A HLA- M1 Humana B*35;HLA- B*3501
Sequência de Epítopo SEQ ID Tipo de vírus Alelo MHC Proteína Viral Referência Espécie NO (PMID / Patente no.) ASGRVTVSTKRSQQ 105 Influenza A HA Humana
TV ASQGTKRSYEQMET 106 Influenza A NP Humana
DGERQNATE ATGMRNVPEKQTRG 107 Influenza A HA Humana
IFGAIAGFIENGWEG
MVD CTELKLSDY 108 Influenza A HLA- NP Humana A*0101;HLA A1 CVNGSCFTV 109 Influenza A HLA-A*0201 NA humana; camun- dongo CYPYDVPDYASLRS 110 Influenza A
LV CYPYDVPDYASLRS 111 Influenza A
LVASS CYPYDVPDYASLRS 112 Influenza A HA Humana
LVASSGTLEFINEDF
NWT DPRMCSLMQGSTLP 113 Influenza A NP Humana DYASLRSLVASSGTL 114 Influenza A HA Humana
EFINEGFNWTGVTQ
NGGSSAC EDLTFLARSAL 115 Influenza A NP Humana ELRSRYWAI 116 Influenza A HLA-B8 NP Humana ENQHTIDLTDSEMNK 117 Influenza A HA Humana
LFEKTRKQLRENAE
DMGNGCF FEDLRVLS 118 Influenza A HLA-B37 NP Humana GILGFVFTL 119 Influenza A HLA-A*0201; M1 U.S. humana; HLA- 15/421.758 camun- A*020101; dongo HLA-A*0203; HLA-A*0206; HLA-A2; HLA-A2.1
Sequência de Epítopo SEQ ID Tipo de vírus Alelo MHC Proteína Viral Referência Espécie NO (PMID / Patente no.) GILGFVFTLT 120 Influenza A HLA- M1 humana; A*0201;HLA- camun- A2 dongo GILGFVFTLTV 121 Influenza A HLA- Humana A2;HLA- AW69 GKNTDLEVLMEWLK 122 Influenza A HLA-A2 M1 Humana
TRPILS HHPSTDRDQTSLYV 123 Influenza A HA Humana
RASGRVTVSTKRSQ
QTVTPNI KGILGFVFTLTV 124 Influenza A HLA- M1 humana; A*02;HLA- camun- A*0201;HLA- dongo A2 KLSTRGVQIASNEN 125 Influenza A NP Humana LKGKFQTAAQRAMM 126 Influenza A NP Humana
DQVRES LPRRSGAAGAAVKG 127 Influenza A NP Humana LRVLSFIRGTKVSPR 128 Influenza A NP Humana
GKLSTRG LTKGILGFVFTLTVPS 129 Influenza A HLA-A2.1 M1 Humana
ERG PSFDMSNEGSYFFG 130 Influenza A NP Humana
DNAEEYDN RGLQRRRFVQNALN 131 Influenza A HLA-A2 M1 Humana
GNG RRSGAAGAAVK 132 Influenza A HLA-B27 NP Humana RYWAIRTR 133 Influenza A HLA-B*2705 NP Humana SRYWAIRTR 134 Influenza A HLA- NP humana; B*08;HLAB* camun- 2703; dongo HLAB*2705; HLAB*27052 /KB;HLAB27 VSDGGPNLY 135 Influenza A HLA- PB1 Humana A*0101;HLA A1;MAMU- A*02
Sequência de Epítopo SEQ ID Tipo de vírus Alelo MHC Proteína Viral Referência Espécie NO (PMID / Patente no.) FMYSDFHFI 136 Influenza A HLA-A*0201; PA Humana HLA- A*0202;HLA- A*0206 ILGFVFTLTV 137 Influenza A HLA- M1 humana; A*0201;HLA camundong A*020101;HL o AA*0203 NMLSTVLGV 138 Influenza A HLA- PB1 Humana A*0201;HLA A*0206;HLA A*6802 RMVLASTTAK 139 Influenza A HLA- M1 Humana A*0301;HLA A*11;HLA- A11 SIIPSGPLK 140 Influenza A HLA- M1 Humana A*3101;HLA A11 SLENFRAYV 141 Influenza A HLA- PA Humana A*0201;HLA A*0203;HLA A*6802 LTKGILGFVFTLTVPS 142 Influenza A HLA-A2 M1 3029268 Humana
ERGL GLCTLVAML 143 Vírus de 9143694 Epstein Barr HLA-A2 Humana ARNLVPMVATVQGQ 144 CMV HLA-A2 pp65 Humana RKTPRVTGGGAMAG 145 A CMV HLA-B7 pp65 8892876 Humana QEFFWDANDIYRIFA 146 CMV HAL-B8 pp65 8892876 Humana ARNLVPMVATVQGQ 147 N CMV HLA-A2 pp65 8892876 Humana YYTSAFVFPTKD 148 CMV HLA-B35 pp65 8892876 Humana VFPTKDVALRH 149 CMV HLA-B35 pp65 8892876 Humana DDVWTSGSDSDEEL 150 V) CMV HLA-B35 pp65 8892876 Humana
Sequência de Epítopo SEQ ID Tipo de vírus Alelo MHC Proteína Viral Referência Espécie NO (PMID / Patente no.) NLVPMVATV 151 CMV HLA-A2 pp65 Humana VAIIEVDNEQPTTRA 152 QKL Polio VP1 7679749 TRAQKLFAMWRITY 153 KDTV Polio VP1 7679749 GACVAIIEVDNEQPT 154 QUALQUER TRAQKLFAMWRITY 9MER
KDTVQLRRKL DENTRO
DESTA Polio SEQUÊNCIA VP1 7679749
Tabela 2 Epítopos CTL codificados por EBV* Antíge- Epítopo Sequência de Restrição SEQ Especificida- no EBV coordena Epítopo HLA ID NO de do tipo Classe I EBV Antígenos do ciclo latente EBNA1 407–417 HPVGEADYFEY B35.01 155 NT EBNA2 42–51 DTPLIPLTIF ?A2/B51 156 Tipo 1 EBNA3 158–166 QAKWRLQTL B8 157 Tipo 1
A 176–184 AYSSWMYSY A30.02 158 Tipo 1 e 2 246–253 RYSIFFDY A24 159 Tipo 1 325–333 FLRGRAYGL B8 160 Tipo 1 379–387 RPPIFIRRL B7 161 Tipo 1 406–414 LEKARGSTY B62 162 Tipo 1 450–458 HLAAQGMAY ? 163 Tipo 1 458–466 YPLHEQHGM B35.01 164 Tipo 1 491–499 VFSDGRVAC A29 165 Tipo 1 502–510 VPAPAGPIV B7 166 Tipo 1 596–604 SVRDRLARL A2 167 Tipo 1 e 2 603–611 RLRAEAQVK A3 168 Tipo 1 e 2 EBNA3 101–115 NPTQAPVIQLVHA A11 169 Tipo 1
B VY 149–157 HRCQAIRKK B27.05 170 NT 217–225 TYSAGIVQI A24.02 171 Tipo 1 244–254 RRARSLSAERY B27.02 172 Tipo 1 399–408 AVFDRKSDAK A11 173 Tipo 1 416–424 IVTDFSVIK A11 174 Tipo 1 481–495 LPGPQVTAVLLHE A11 175 Tipo 1
ES 488–496 AVLLHEESM B35.01 176 Tipo 1 551–563 DEPASTEPVHDQL A11 177 Tipo 1
L 657–666 VEITPYKPTW B44 178 Tipo 1 831–839 GQGGSPTAM B62 179 Tipo 1
Antíge- Epítopo Sequência de Restrição SEQ Especificida- no EBV coordena Epítopo HLA ID NO de do tipo Classe I EBV Antígenos do ciclo latente EBNA3 163–171 EGGVGWRHW B44.03 180 Tipo 1 e 2
C 213–222 QNGALAINTF B62 181 Tipo 2 249–258 LRGKWQRRYR B27.05 182 Tipo 1 258–266 RRIYDLIEL B27.02/.04/.0 183 Tipo 1 5 271–278 HHIWQNLL B39 184 Tipo 1 e 2 281–290 EENLLDFVRF B44.02 185 Tipo 1 e 2 284–293 LLDFVRFMGV A2.01 186 Tipo 1 e 2 335–343 KEHVIQNAF B44.02 187 Tipo 1 343–351 FRKAQIQGL B27.05 188 Tipo 1 881–889 QPRAPIRPI B7 189 Tipo 1 e 2 EBNA- Respostas ocasionais identificadas, LP sem epítopos definidos LMP1 Respostas ocasionais identificadas, sem epítopos definidos LMP2 131–139 PYLFWLAAI A23 190 Tipo 1 e 2 200–208 IEDPPFNSL B60 191 Tipo 1 e 2 236–244 RRRWRRLTV B27.04 192 Tipo 1 e 2 329–337 LLWTLVVLL A2.01 193 Tipo 1 e 2 340–350 SSCSSCPLSKI A11 194 Tipo 1 e 2 419–427 TYGPVFMCL A24 195 Tipo 1 e 2 426–434 CLGGLLTMV A2.01 196 Tipo 1 e 2 442–451 VMSNTLLSAW A25 197 Tipo 1 e 2 453–461 LTAGFLIFL A2.06 198 Tipo 1 e 2 BZLF1 190–197 RAKFKQLL B8 199 NT 186–201 RKCCRAKFKQLLQ C6 200 NT
HYR BMLF1 265–273 KDTWLDARM ? 201 NT 280–288 GLCTLVAML A2.01 143 NT
Antíge- Epítopo Sequência de Restrição SEQ Especificida- no EBV coordena Epítopo HLA ID NO de do tipo Classe I EBV Antígenos do ciclo latente 397–405 DEVEFLGHY B18 202 NT BMRF1 86–100 FRNLAYGRTCVLG C3 203 NT
KE 268–276 YRSGIIAVV C6 204 NT *Fonte: Rickson e Moss, Annu. Rev. Immunol. (1997) 15: 405-31 incorporado neste documento na sua totalidade por referência.
Sequência de proteínas HPV16 (114K) L1 SEQ ID NO: 205
Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val 1 5 10 15
Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn 20 25 30
Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro 35 40 45
Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys 50 55 60
Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro 65 70 75 80
Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln 85 90 95
Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro 100 105 110
Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp 115 120 125
Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg 130 135 140
Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly 145 150 155 160
Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr 165 170 175
Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn 180 185 190
Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met 195 200 205
Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile 210 215 220
Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu 225 230 235 240
Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe 245 250 255
Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Thr Val Gly Glu Asn Val Pro 260 265 270
Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser 275 280 285
Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala 290 295 300
Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn 305 310 315 320
Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr 325 330 335
Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu 340 345 350
Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu 355 360 365
Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr 370 375 380
Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu 385 390 395 400
Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp 405 410 415
Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His Thr 420 425 430
Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu 435 440 445
Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu 450 455 460
Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Phe 465 470 475 480
Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr 485 490 495 Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu 500 505
[0213] HPV16 L1 I114K) sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 206) atgtctcttt ggctgcctag tgaggccact gtctacttgc ctcctgtccc agtatctaag 60 gttgtaagca cggatgaata tgttgcacgc acaaacatat attatcatgc aggaacatcc 120 agactacttg cagttggaca tccctatttt cctattaaaa aacctaacaa taacaaaata 180 ttagttccta aagtatcagg attacaatac agggtattta gaatacattt acctgacccc 240 aataagtttg gttttcctga cacctcattt tataatccag atacacagcg gctggtttgg 300 gcctgtgtag gtgttgaggt aggtcgtggt cagccattag gtgtgggcat tagtggccat 360 cctttattaa ataaattgga tgacacagaa aatgctagtg cttatgcagc aaatgcaggt 420 gtggataata gagaatgtat atctatggat tacaaacaaa cacaattgtg tttaattggt 480 tgcaaaccac ctatagggga acactggggc aaaggatccc catgtaccaa tgttgcagta 540 aatccaggtg attgtccacc attagagtta ataaacacag ttattcagga tggtgatatg 600 gttgatactg gctttggtgc tatggacttt actacattac aggctaacaa aagtgaagtt 660 ccactggata tttgtacatc tatttgcaaa tatccagatt atattaaaat ggtgtcagaa 720 ccatatggcg acagcttatt tttttattta cgaagggaac aaatgtttgt tagacattta 780 tttaataggg ctggtactgt tggtgaaaat gtaccagacg atttatacat taaaggctct 840 gggtctactg caaatttagc cagttcaaat tattttccta cacctagtgg ttctatggtt 900 acctctgatg cccaaatatt caataaacct tattggttac aacgagcaca gggccacaat 960 aatggcattt gttggggtaa ccaactattt gttactgttg ttgatactac acgcagtaca 1020 aatatgtcat tatgtgctgc catatctact tcagaaacta catataaaaa tactaacttt 1080 aaggagtacc tacgacatgg ggaggaatat gatttacagt ttatttttca actgtgcaaa 1140 ataaccttaa ctgcagacgt tatgacatac atacattcta tgaattccac tattttggag 1200 gactggaatt ttggtctaca acctccccca ggaggcacac tagaagatac ttataggttt 1260 gtaacatccc aggcaattgc ttgtcaaaaa catacacctc cagcacctaa agaagatccc 1320 cttaaaaaat acactttttg ggaagtaaat ttaaaggaaa agttttctgc agacctagat 1380 cagtttcctt taggacgcaa atttttacta caagcaggat tgaaggccaa accaaaattt 1440 acattaggaa aacgaaaagc tacacccacc acctcatcta cctctacaac tgctaaacgc 1500 aaaaaacgta agctgtaa 1518
Sequência de proteínas HPV L2 (SEQ ID NO: 207) Met Arg His Lys Arg Ser Ala Lys Arg Thr Lys Arg Ala Ser Ala Thr 1 5 10 15
Gln Leu Tyr Lys Thr Cys Lys Gln Ala Gly Thr Cys Pro Pro Asp Ile 20 25 30
Ile Pro Lys Val Glu Gly Lys Thr Ile Ala Asp Gln Ile Leu Gln Tyr 35 40 45
Gly Ser Met Gly Val Phe Phe Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ser 50 55 60
Gly Thr Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Ile Pro Leu Gly Thr Arg Pro Pro 65 70 75 80
Thr Ala Thr Asp Thr Leu Ala Pro Val Arg Pro Pro Leu Thr Val Asp 85 90 95
Pro Val Gly Pro Ser Asp Pro Ser Ile Val Ser Leu Val Glu Glu Thr 100 105 110
Ser Phe Ile Asp Ala Gly Ala Pro Thr Ser Val Pro Ser Ile Pro Pro 115 120 125
Asp Val Ser Gly Phe Ser Ile Thr Thr Ser Thr Asp Thr Thr Pro Ala 130 135 140
Ile Leu Asp Ile Asn Asn Thr Val Thr Thr Val Thr Thr His Asn Asn 145 150 155 160
Pro Thr Phe Thr Asp Pro Ser Val Leu Gln Pro Pro Thr Pro Ala Glu 165 170 175
Thr Gly Gly His Phe Thr Leu Ser Ser Ser Thr Ile Ser Thr His Asn 180 185 190
Tyr Glu Glu Ile Pro Met Asp Thr Phe Ile Val Ser Thr Asn Pro Asn 195 200 205
Thr Val Thr Ser Ser Thr Pro Ile Pro Gly Ser Arg Pro Val Ala Arg 210 215 220
Leu Gly Leu Tyr Ser Arg Thr Thr Gln Gln Val Lys Val Val Asp Pro 225 230 235 240
Ala Phe Val Thr Thr Pro Thr Lys Leu Ile Thr Tyr Asp Asn Pro Ala 245 250 255
Tyr Glu Gly Ile Asp Val Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ser Ser Asn Asp 260 265 270
Asn Ser Ile Asn Ile Ala Pro Asp Pro Asp Phe Leu Asp Ile Val Ala 275 280 285
Leu His Arg Pro Ala Leu Thr Ser Arg Arg Thr Gly Ile Arg Tyr Ser 290 295 300
Arg Ile Gly Asn Lys Gln Thr Leu Arg Thr Arg Ser Gly Lys Ser Ile 305 310 315 320
Gly Ala Lys Val His Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ser Thr Ile Asp Pro Ala 325 330 335
Glu Glu Ile Glu Leu Gln Thr Ile Thr Pro Ser Thr Tyr Thr Thr Thr 340 345 350
Ser His Ala Ala Ser Pro Thr Ser Ile Asn Asn Gly Leu Tyr Asp Ile 355 360 365
Tyr Ala Asp Asp Phe Ile Thr Asp Thr Ser Thr Thr Pro Val Pro Ser 370 375 380
Val Pro Ser Thr Ser Leu Ser Gly Tyr Ile Pro Ala Asn Thr Thr Ile 385 390 395 400
Pro Phe Gly Gly Ala Tyr Asn Ile Pro Leu Val Ser Gly Pro Asp Ile 405 410 415
Pro Ile Asn Ile Thr Asp Gln Ala Pro Ser Leu Ile Pro Ile Val Pro 420 425 430
Gly Ser Pro Gln Tyr Thr Ile Ile Ala Asp Ala Gly Asp Phe Tyr Leu 435 440 445
His Pro Ser Tyr Tyr Met Leu Arg Lys Arg Arg Lys Arg Leu Pro Tyr 450 455 460
Phe Phe Ser Asp Val Ser Leu Ala Ala
[0214] Sequência de ácido nucleico do HPV16 L2 (SEQ ID NO: 208) atgcgacaca aacgttctgc aaaacgcaca aaacgtgcat cggctaccca actttataaa 60 acatgcaaac aggcaggtac atgtccacct gacattatac ctaaggttga aggcaaaact 120 attgctgatc aaatattaca atatggaagt atgggtgtat tttttggtgg gttaggaatt 180 ggaacagggt cgggtacagg cggacgcact gggtatattc cattgggaac aaggcctccc 240 acagctacag atacacttgc tcctgtaaga ccccctttaa cagtagatcc tgtgggccct 300 tctgatcctt ctatagtttc tttagtggaa gaaactagtt ttattgatgc tggtgcacca 360 acatctgtac cttccattcc cccagatgta tcaggattta gtattactac ttcaactgat 420 accacacctg ctatattaga tattaataat actgttacta ctgttactac acataataat 480 cccactttca ctgacccatc tgtattgcag cctccaacac ctgcagaaac tggagggcat 540 tttacacttt catcatccac tattagtaca cataattatg aagaaattcc tatggataca 600 tttattgtta gcacaaaccc taacacagta actagtagca cacccatacc agggtctcgc 660 ccagtggcac gcctaggatt atatagtcgc acaacacaac aagttaaagt tgtagaccct 720 gcttttgtaa ccactcccac taaacttatt acatatgata atcctgcata tgaaggtata 780 gatgtggata atacattata tttttctagt aatgataata gtattaatat agctccagat 840 cctgactttt tggatatagt tgctttacat aggccagcat taacctctag gcgtactggc 900 ataaggtaca gtagaattgg taataaacaa acactacgta ctcgtagtgg aaaatctata 960 ggtgctaagg tacattatta ttatgatttt agtaccattg atcctgcaga agaaatagaa 1020 ttacaaacta taacaccttc tacatatact accacttcac atgcagcctc acctacttct 1080 attaataatg gattatatga tatttatgca gatgacttta ttacagatac ttctacaacc 1140 ccggtaccat ctgtaccctc tacatcttta tcaggttata ttcctgcaaa tacaacaatt 1200 ccttttggtg gtgcatacaa tattccttta gtatcaggtc ctgatatacc cattaatata 1260 actgaccaag ctccttcatt aattcctata gttccagggt ctccacaata tacaattatt 1320 gctgatgcag gtgactttta tttacatcct agttattaca tgttacgaaa acgacgtaaa 1380 cgtttaccat attttttttc agatgtctct ttggct 1416
Local de clivagem Furina
R X R/K R (SEQ ID NO: 209)
Local de clivagem Furina
Arg Val Lys Arg (SEQ ID NO: 210)
Um substrato peptídico clivável por MMP Glu Pro Cit Gly Hof Tyr Leu (SEQ ID NO: 211) Um substrato peptídico clivável por MMP Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln (SEQ ID NO: 212) Um substrato peptídico clivável por MMP Pro Val Gly Leu Ile Gly (SEQ ID NO: 213) Local de ancoragem com ácido poliglutâmico EEEEEEEEC (SEQ ID NO: 214).
Sítio de ancoragem com ácido poliglutâmico CEEEEEEEEC (SEQ ID NO: 215).
O peptídeo EBNA3C aa 284-293 se liga ao HLA-A2.01 LLDRVRFMGV (SEQ ID NO: 216)
Peptídeo EBV (K)GILGFVFTL(T)(V) (SEQ ID NO: 217) Epítopo das células T do vírus da catapora CD8+ SLPRSRTPI (SEQ ID NO:218) Epítopo das células T do vírus da catapora CD8+ SAPLPSNRV (DEQ ID NO: 219) Peptídeo OVA SIINFEKL (SEQ ID NO: 220) Sequência RG-1 VLP
MSLWLPSEAT VYLPPVPVSK VVSTDEYVAR TNIYYHAGTS RLLAVGHPYF PIKKPNNNKI LVPKVSGLQY RVFRIHLPDP NKFGFPDTSF YNPDTQRLVW ACVGVEVGRG QPLGVGISGH PLLNKLDDTE NASAYAQLYK TCKQAGTCPP DIIPKVANAG VDNRECISMD YKQTQLCLIG CKPPIGEHWG KGSPCTNVAV NPGDCPPLEL INTVIQDGDM VDTGFGAMDF TTLQANKSEV PLDICTSICK YPDYIKMVSE PYGDSLFFYL RREQMFVRHL FNRAGAVGEN VPDDLYIKGS GSTANLASSN YFPTPSGSMV TSDAQIFNKP YWLQRAQGHN NGICWGNQLF VTVVDTTRST NMSLCAAIST SETTYKNTNF KEYLRHGEEY DLQFIFQLCK ITLTADVMTY IHSMNSTILE DWNFGLQPPP GGTLEDTYRF VTSQAIACQK
HTPPAPKEDP LKKYTFWEVN LKEKFSADLD QFPLGRKFLL QAGLKAKPKF TLGKRKATPT TSSTSTTAKR KKRKLSR (SEQ ID NO: 221) Peptídeo derivado da proteína HPV L2 QLYKTCKQAG TCPPDIIPKV (SEQ ID NOO: 222)

Claims (44)

REIVINDICAÇÕES
1. Partícula semelhante a vírus (VLP) quimérica caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína L1 do papilomavírus (PV) e um peptídeo alvo exibido na superfície, em que o peptídeo alvo compreende um epítopo de células T CD8+ de um patógeno humano, em que o epítopo de células T CD8+ não é um antígeno associado a tumor, em que o peptídeo alvo é conjugado à VLP e em que o peptídeo alvo não é conjugado à VLP através de uma sequência poli-iônica:cisteína.
2. VLP quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma proteína L2 de PV.
3. VLP quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo alvo é conjugado a uma cisteína, lisina ou arginina da proteína L1 através de uma ligação dissulfeto, uma ligação maleimida ou uma ligação amida.
4. VLP quimérica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o peptídeo alvo é conjugado a uma cisteína, uma lisina ou uma arginina da proteína L2 através de uma ligação dissulfeto, uma ligação maleimida ou uma ligação amida.
5. VLP quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo alvo não é um peptídeo de um papilomavírus.
6. VLP quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o epítopo de células T CD8+ é de um polipeptídeo antigênico de uma vacina infantil.
7. VLP quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o patógeno é um vírus, uma bactéria, um fungo ou um parasita.
8. VLP quimérica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o vírus é um vírus vaccinia, vírus varicela zoster, vírus Herpes zoster, vírus da rubéola, da hepatite, por exemplo, vírus da hepatite A ou vírus da hepatite B ou vírus da hepatite C, um vírus influenza tipo A ou tipo B, vírus do sarampo, vírus da caxumba, um poliovírus, vírus da varíola (varíola), vírus da raiva, vírus da dengue, vírus do ebola, vírus do Nilo Ocidental, vírus da febre amarela ou vírus zika.
9. VLP quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo alvo compreende um peptídeo apresentado na Tabela 1.
10. VLP quimérica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a bactéria é uma Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Chlamydia trachomatis, da difteria, Haemophilus influenzae, meningococos, por exemplo, meningocócica ACWY, pneumococos, Vibrio cholerae, Mycobacterium tuberculosis, BCG, tifoide, E. coli, Salmonella, Legionella pneumophila, rickettsias, Treponema pallidum pallidum, estreptococos grupo A ou grupo B, Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, ou uma Yersinia sp, por exemplo, Yersinia pestis.
11. VLP quimérica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o parasita é Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, uma Trichinella sp., por exemplo, Trichinella spiralis, um Trichomonas sp., por exemplo, Trichomonas vaginalis, um Trypanosoma sp., por exemplo, Trypanosoma brucei gambiense, Trypanosoma brucei rhodesiense, ou um Trypanosoma cruzi, ou um Plasmodium, por exemplo, Plasmodium falciparium, Plasmodium vivax, ou Plasmodium malariae.
12. VLP quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína L1 é a proteína L1 de BPV1 ou HPV tipos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 15, 16, 17, 18, 23, 27, 38, 31, 45, 33, 35, 39, 51, 52, 58, 66, 68, 70, 76 e 92.
13. VLP quimérica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a proteína L2 é a proteína L2 de BPV1 ou HPV tipos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 15, 16, 17, 18, 23, 27, 38, 31, 45, 33, 35, 39, 51,
52, 58, 66, 68, 70, 76 e 92.
14. VLP quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína L1 compreende mais de três cisteínas apresentadas na superfície da VLP.
15. VLP quimérica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a proteína L1 é uma proteína 16 RG-1 L1 de HPV (SEQ ID NO: 221).
16. VLP quimérica, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a proteína L1 compreende QLYKTCKQAG TCPPDIIPKV (SEQ ID NO: 222).
17. VLP quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo é conjugado a um ou mais dentre uma alça DE, alça HI ou uma alça-hélice B4 da proteína L1.
18. VLP quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo alvo é conjugado à alça-hélice B4 da PV16 L1 humana (HPV16 L1), ou conjugado à alça DE de PV bovino (BPV), ou aos aminoácidos equivalentes 136/137 de um PV.
19. Método para inibir o crescimento de células cancerosas caracterizado pelo fato de que compreende o contato das células com uma composição compreendendo uma quantidade eficaz da VLP quimérica conforme definid em qualquer uma das reivindicações 1-16.
20. Método para inibir o crescimento, progressão ou metástase de um tumor em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende (a) determinar se um sujeito em necessidade foi ou não imunizado ou vacinado contra um patógeno, (b) administrar uma partícula semelhante ao papilomavírus (VLP) quimérica ao sujeito em uma quantidade suficiente para inibir o crescimento, progressão ou metástase do tumor, em que a VLP quimérica compreende uma proteína
L1 do papilomavírus e um peptídeo alvo, em que o peptídeo alvo é conjugado a uma cisteína, uma lisina ou uma arginina da proteína L1, em que o peptídeo alvo compreende um epítopo de células T CD8+ do patógeno contra o qual o sujeito foi imunizado e em que o peptídeo alvo é exibido na superfície na VLP quimérica.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a determinação das moléculas de MHC de classe I expressas nas células do sujeito e a seleção de uma VLP quimérica, em que o peptídeo alvo é conhecido por se ligar à molécula de MHC de classe I e, em seguida, a administração da VLP quimérica ao sujeito.
22. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o patógeno é um vírus, uma bactéria ou um parasita.
23. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o vírus é um vírus vaccinia, vírus varicella zoster, um vírus Herpes zoster, vírus da rubéola, da hepatite, por exemplo, vírus da hepatite A ou vírus da hepatite B ou vírus da hepatite C, um vírus influenza tipo A ou tipo B, vírus do sarampo, vírus da caxumba, um poliovírus, vírus da varíola (varíola), vírus da raiva, vírus da dengue, vírus do ebola, vírus do Nilo Ocidental, vírus da febre amarela, um vírus zika.
24. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Chlamydia trachomatis, da difteria, Haemophilus influenzae, meningococos, por exemplo, meningocócica ACWY, pneumococos, Vibrio cholerae, Mycobacterium tuberculosis, BCG, tifoide, E. coli, Salmonella, Legionella pneumophila, rickettsias, Treponema pallidum pallidum, estreptococos grupo A ou grupo B, Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, Yersinia sp, por exemplo, Yersinia pestis,
25. Método, de acordo com a reivindicação 22,
caracterizado pelo fato de que o parasita é Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, uma Trichinella sp., por exemplo, Trichinella spiralis, um Trichomonas sp., por exemplo, Trichomonas vaginalis, um Trypanosoma sp., por exemplo, Trypanosoma brucei gambiense, Trypanosoma brucei rhodesiense, Trypanosoma cruzi, um Plasmodium, por exemplo, Plasmodium falciparium, Plasmodium vivax, ou Plasmodium malariae.
26. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o peptídeo alvo é conjugado a uma cisteína da proteína L1 por uma ligação dissulfeto ou uma ligação maleimida.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o peptídeo alvo é conjugado a uma alça da proteína L1.
28. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o peptídeo alvo não é conjugado a uma alça da proteína L1.
29. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o epítopo de células T CD8+ é um epítopo indicado na Tabela 1.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o epítopo de células T CD8+ se liga a uma molécula MHC de classe I indicada na Tabela I.
31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a molécula MHC de classe I é HLA-A*02:01, HLA-A*03:01/HLA-A*11:01, HLA-A*0201, HLA-A*020101, HLA-A*0203, HLA- A*0206, HLA-A2, HLA-A2.1, ou HLA-A*02.
32. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o epítopo de células T CD8+ se liga à família HLA-A, HLA-B ou HLA-C da molécula MHC de classe I.
33. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que as VLPs quiméricas são administradas após radioterapia ou quimioterapia.
34. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a administração de um inibidor de checkpoint ao sujeito.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o inibidor de checkpoint é administrado sequencial ou essencialmente ao mesmo tempo em que a VLP quimérica.
36. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o inibidor de checkpoint é ipilimumabe (Yervoy®), pembrolizumabe (Keytruda®), e nivolumabe (Opdivo®), Atezolizumabe (Tecentriq), Avelumabe (Bavencio), Durvalumabe (Imfinzi).
37. Método para inibir o crescimento de um câncer em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende (a) identificar o sujeito como um sujeito que tenha câncer, (b) identificar uma vacina compreendendo um agente antigênico que tenha sido administrado anteriormente ao sujeito, (c) administrar, ao sujeito, uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de uma VLP quimérica compreendendo uma proteína L1 do papiloma e um peptídeo alvo, em que o peptídeo alvo é conjugado à proteína L1 e o peptídeo alvo compreende um epítopo de células T CD8+ do agente antigênico na vacina que foi previamente administrada ao sujeito, em que a VLP quimérica é administrada em uma quantidade suficiente para estimular uma resposta imunológica no sujeito que compreende a estimulação de células T CD8+ específicas para o epítopo de células T CD8+ do agente antigênico e, desse modo, inibição do crescimento do câncer.
38. Método para inibir o crescimento de um câncer em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende
(a) identificar o sujeito como um sujeito que tenha um tumor, (b) administrar uma VLP quimérica ao sujeito em uma quantidade suficiente para induzir uma resposta imunológica celular do sujeito ao peptídeo alvo, em que a VLP quimérica compreende uma proteína L1 ou proteína L2 do papiloma, ou ambas, e proteínas L1 e L2, e um peptídeo alvo, em que o peptídeo alvo é conjugado a uma cisteína, uma lisina ou uma arginina da proteína L1 ou L2, em que o peptídeo alvo compreende um epítopo de células T CD8+ que não é um antígeno associado a tumor do tumor, e em que a resposta imunológica celular inibe o crescimento do tumor.
39. Método para produzir a VLP quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a montagem de uma VLP a partir da proteína L1 do papilomavírus, ou uma proteína L1 e uma proteína L2, submetendo a VLP a condições de redução suficientes para reduzir a VLP, ao mesmo tempo em que mantém a estrutura de icosaedro semelhante ao capsídeo da VLP, e conjugando o peptídeo alvo à VLP reduzida, formando, desse modo, a VLP quimérica.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o peptídeo alvo é conjugado a uma cisteína e/ou uma lisina de uma proteína L1 ou L2 da VLP.
41. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o peptídeo alvo é conjugado a uma proteína L1 ou L2 da VLP através de uma ligação dissulfeto, uma ligação maleimida ou uma ligação amida.
42. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que pelo menos 30% das cisteínas de superfície da VLP compreendem o peptídeo alvo.
43. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de 30% das cisteínas de superfície da VLP compreendem o peptídeo alvo compreendem um peptídeo alvo.
44. Composição caracterizada pelo fato de que compreende uma população de VLPs quiméricas, em que cada VLP compreende uma proteína L1 do papilomavírus e um peptídeo alvo, em que pelo menos 30% das cisteínas ou 30% das lisinas ou 30% das cisteínas e lisinas da VLP são conjugadas a um peptídeo alvo através de uma ligação dissulfeto, ligação maleimida ou.
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