CN102247604B - 一种血管紧张素ⅱ受体1型多肽-载体疫苗及其用途 - Google Patents

Abstract

一种血管紧张素II受体1型多肽-载体疫苗及其用途，属于生物技术药品和生物治疗学领域。将包含第一连接位点的血管紧张素II受体1型的免疫原性肽段及其衍生物与一种或多种载体、优选地与重组Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白耦联结合，以形成有序、重复的多肽-载体疫苗。公开了该疫苗在治疗原发性高血压方面的应用，该疫苗能够产生高效的特异性的抗人血管紧张素II受体1型的一段免疫原性肽段及其衍生物的抗体，可以有效阻断RAS的激活，能够显著降低自发性高血压大鼠的血压，且具有良好的靶器官保护作用。

Description

一种血管紧张素Ⅱ受体1型多肽-载体疫苗及其用途

发明领域

本发明属于生物技术药品和生物治疗学领域，具体涉及一种血管紧张素II受体1型(AT1R)的一段免疫原性肽段及其衍生物与一种载体特别是病毒样颗粒(VLP)耦联后制备成的多肽-载体疫苗，以及该疫苗在治疗原发性高血压方面的作用。

发明背景

高血压是严重危害人类健康的世界性问题，中国高血压患病率18.8％(2002年)，目前全国有近2亿高血压患者。高血压是心脑血管病的主要危险因素，中国脑卒中发病率约250/10万人，冠心病发病率约50/10万人，积极控制高血压是预防脑卒中和冠心病的重要措施。目前中国门诊高血压患者治疗控制率30.6％，而中国高血压治疗总体控制率仅6.1％。

高血压的发病涉及复杂的病理生理机制，其中肾素-血管紧张素系统(RAS)在高血压的发病中具有极其重要的作用。RAS是机体调节血容量和血压的激素系统，具有复杂的血压反馈控制系统。作为RAS最主要的组成成分，血管紧张素II(Ang II)是机体内具有最强升压性作用的物质之一，而AT1R是Ang II的主要下游作用受体，AT1R介导Ang II的后续级联升压效应和病理性靶器官结构重构。

RAS在高血压的发病中起着极其重要的作用，目前针对RAS的主流治疗体系是使用小分子化合物对靶标肾素、血管紧张素转换酶(ACE)及血管紧张素II受体进行阻断。肾素抑制剂目前主要是阿利吉仑，能够有效降低高血压患者血压，但是作用并不强于现有的其它一线降压药物，进一步的临床实验在进行之中。ACE抑制剂(ACEI)包括卡托普利、雷米普利、培哚普利等，能够有效降低血压，且具有良好的靶器官保护，但是问题是容易发生干咳、首剂低血压效应，且不能完全阻断ACE的活性。血管紧张素II受体拮抗剂(ARB)能够较完全阻断Ang II与AT1R的特异性作用，不引起干咳等发生在ACE抑制剂上的不良反应。但是，以上所述肾素抑制剂、ACEI及ARB均需要每日服用，且是长期甚至终生的，总体的经济负担重，加之药物本身存在的不良反应，导致了高血压患者的治疗依从性差，且靶器官保护作用也未能达到最大效应。

治疗或者预防与激素相关的疾病可以通过免疫学的方法进行，其在于应用激素本身或者截取其中的一部分，使之产生抗体后可与激素结合而达到中和或者降低激素的作用。即是说，可以针对RAS应用免疫阻滞的手段来阻滞RAS系统的各个环节，从而实现高血压的防治。迄今为止，针对RAS系统的各个环节的高血压疫苗研究均有报道，其主要分为4种：①肾素疫苗：阻断肾素作用，达到良好的降压作用，但是全肾素免疫导致了免疫动物肾脏免疫复合物的沉积，发生了严重的自身免疫损害；②Ang I及其类似物疫苗：Brown MJ等报道了PMD3117疫苗，针对Ang I及其类似物的特异性抗体能有效阻断Ang I，但是后续的临床实验发现因为抗体滴度不够高而未有血压的明显下降，进一步的改进临床试验正在进行中；③Ang II疫苗：瑞士Cytos公司的CYT006-AngQβ疫苗已经完成了IIa期临床实验，有较好的降压效果，且安全性和耐受性良好，特别对于清晨血压能够达到25/13mmHg的下降；④Ang II受体疫苗：本团队发明了一种大鼠AT1受体短肽疫苗(ATR12181)，其能够有效降低SHRs血压，并能发挥良好的靶器官保护作用，长达64周的观察ATR12181疫苗免疫大鼠安全性良好。

上述实例表明，应用免疫阻滞的手段来阻断RAS系统的各个环节的实践是可行且有效的，其作用不仅能够达到长效，从而改善依从性，也能达到最大的靶器官保护作用。

发明内容

本发明旨在将血管紧张素II受体1型的一段免疫原性肽段及其衍生物与一种载体特别是病毒样颗粒耦联后制备成一种多肽-载体疫苗，并将该疫苗用于治疗原发性高血压。

该发明通过以下技术方案实现：

首先合成人血管紧张素II受体1型的一段免疫原性肽段及其衍生物，该免疫原性肽段及其衍生物包含第一连接位点，至少能够通过一个共价键与载体的第二连接位点结合。使用重组Qβ-2aa噬菌体颗粒蛋白、重组牛乳头瘤病毒蛋白、重组乙型肝炎病毒蛋白、匙孔血蓝素蛋白、破伤风类毒素作为载体，这些载体至少具有一个第二连接位点，优选的第二连接位点包括氨基、羧基和巯基，选自赖氨酸残基、精氨酸残基、谷氨酸残基、天冬氨酸残基和半胱氨酸残基，优选赖氨酸残基。使用异双功能交联剂将血管紧张素II受体1型的免疫原性肽段及其衍生物与上述载体、优选地与重组Qβ-2aa噬菌体颗粒蛋白耦联结合，以形成有序、重复的多肽-载体疫苗。免疫原性肽段及其衍生物多肽被重复并以一定密度展示排列在载体上或者表面，形成高抗原性的阵列展示，这种状态下可以在不加佐剂的情况下也能高效地诱导抗体的生成，利于高效的特异性的抗人和大鼠血管紧张素II受体1型的一段免疫原性肽段及其衍生物抗体的生成，可以有效阻断AT1R介导Ang II的后续级联升压效应和病理性靶器官结构重构，显著降低自发性高血压大鼠的血压，有效逆转其靶器官病理性重构，可用于原发性高血压的治疗。

本发明的优点是：

1、合成的肽段可以在自发性高血压大鼠体内引起特异性的免疫应答，产生针对肽段的特异性抗体。所产生的抗体能够与AT1受体特异性结合，阻滞血管紧张素II与AT1受体结合引起的激动性反应。

2、使用的异双功能交联剂具有能够同时连接两种基团的特点，而且不同的基团可以通过两步先后连接上去，这些基团是巯基、氨基、羧基和胍基，而这些异双功能交联剂是SMCC、Sulfo-SMCC、LC-SMCC等。

3、本发明制备的多肽-载体疫苗主要用于治疗原发性高血压，能够显著降低自发性高血压大鼠的血压，且具有良好的靶器官保护作用。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明构建Qβ-2aa病毒样颗粒所用核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：2是本发明构建牛乳头瘤病毒样颗粒所用核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：3是本发明构建乙肝核心抗原病毒样颗粒所用核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：4是本发明构建Qβ-2aa病毒样颗粒所用核苷酸序列编码的氨基酸序列。

序列表SEQ ID NO：5是本发明构建牛乳头瘤病毒样颗粒所用核苷酸序列编码的氨基酸序列。

序列表SEQ ID NO：6是本发明构建乙肝核心抗原病毒样颗粒所用核苷酸序列编码的氨基酸序列。

图1：ATRQβ-001疫苗制备后鉴定。图中A：病毒样颗粒和短肽耦联后Tricine-SDS-PAGE电泳结果，M为Marker，泳道1-2为病毒样颗粒单体，泳道3-4为耦联短肽后病毒样颗粒；图中B：病毒样颗粒和短肽耦联后免疫电镜结果。

图2：ATRQβ-001疫苗抗ATR-001短肽抗体滴度。

图3：免疫印迹法和细胞免疫荧光鉴定ATRQβ-001抗肽抗体CQ-8的特异性。CQ-8为ATRQβ-001疫苗免疫动物后的抗肽抗体，DCQ-8指CQ-8被ATR-001短肽中和后的混合物，CON为阴性对照抗体。图中A：免疫印迹法鉴定ATRQβ-001抗肽抗体CQ-8的特异性。图中B：细胞免疫荧光鉴定ATRQβ-001抗肽抗体CQ-8的特异性。

图4：细胞免疫荧光法观察CQ-8对血管平滑肌细胞AT1受体激活后引起PKC转位的影响。CQ-8为ATRQβ-001疫苗免疫动物后的抗肽抗体，DCQ-8指CQ-8被ATR-001短肽中和后的混合物，CON为对照抗体，ANG为Ang II，代表阳性刺激，LOS代表氯沙坦组。

图5：应用免疫印迹法探究CQ-8对细胞外信号蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化水平的影响。P-ERK、T-ERK分别代表磷酸化的ERK1/2和总的ERK1/2。

图6：用激光共聚焦显微镜观测CQ-8对Ang II刺激引起的血管平滑肌细胞内钙离子浓度升高的影响。F_o、F_max分别代表平衡后血管平滑肌细胞基础和最大荧光强度。

图7：SHRs血压变化趋势图。图中A为SHRs收缩压趋势图；图中B为SHRs免疫后抗体滴度变化图(标本按1∶1000稀释)。分为四组：ATRQβ-001疫苗组，AngQβ疫苗组(Ang II-Qβ-2aa疫苗)，缬沙坦灌胃组和阴性对照组。

图8：SHRs心脏B超参数探查：A图为阴性对照组，B图为ATRQβ-001疫苗组；IVS，室间隔厚度；LVID，左室内径；LVPW，左室后壁厚度；EF％，左室射血分数；d，舒张期；s，收缩期。

图9：电镜观测ATRQβ-001疫苗对SHRs肾脏的保护作用。A为ATRQβ-001疫苗免疫组，B为SHRs对照组(注：片中显示足细胞水肿系取材原因，非原始病理变化)。

图10：流式细胞术检测大鼠外周血分泌特征细胞因子淋巴细胞比例。Control为对照组，Vaccine为ATRQβ-001疫苗免疫组。图10-1中：A组显示分泌IFN-γ的CD4⁺淋巴细胞比例，B组显示分泌IL-4CD4⁺淋巴细胞比例，C组显示分泌IFN-γCD8⁺淋巴细胞比例，D组显示表达FasL CD8⁺淋巴细胞比例。图10-2中：外周血淋巴细胞中分泌IL-4CD4⁺淋巴细胞的比例的统计图(*代表P＜0.01)。

图11：光镜观测Wistar大鼠组织器官(肺脏、心脏、肠系膜三级动脉、肾脏、肝脏及脾脏)的病理变化。图11-1：为ATRQβ-001疫苗组，图11-2：为PBS对照组。

图12：电镜观测肾脏病理变化。A为ATRQβ-001疫苗免疫组，B为对照组Wistar大鼠肾脏。

具体实施方式

以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。

实施案例1 ATRQβ-001疫苗的制备和鉴定

短肽CGGAFHYESQ由上海吉尔生化有限公司直接合成，短肽纯度95％。

载体Qβ-2aa病毒样颗粒由本实验室构建表达并纯化得到，纯度90％以上，其按以下方法制备：

1)将Qβ噬菌体CP蛋白基因终止密码子由TGA突变为强终止密码子TAA后，克隆至原核表达载体pET28a(+)中，得到编码CP蛋白质粒pETQβ-CP；

2)在Qβ噬菌体CP延伸蛋白基因中编码免疫优势决定区位置，即Qβ噬菌体CP延伸蛋白基因第72位至73位密码子间，插入编码赖氨酸和亮氨酸的核苷酸AAGCTT，并将CP蛋白基因终止密码子由TGA突变为GGA后克隆至原核表达载体PGEX4T-2中，得到编码A1蛋白质粒pGEXQβ-A1；

3)突变后编码Qβ噬菌体CP蛋白质粒与A1蛋白质粒共同转化大肠杆菌，诱导后表达得到病毒样颗粒蛋白Qβ-2aa。

上述编码Qβ噬菌体CP蛋白质粒其培养物于2009年11月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M209281，保藏命名为：大肠杆菌DH5α/pETQβ-CPEscherichia coli DH5α/pETQβ-CP。

上述编码Qβ噬菌体A1蛋白质粒其培养物于2009年11月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M209282，保藏命名为：大肠杆菌DH5α/pETQβ-A1Escherichia coli DH5α/pETQβ-Al。

使用异双功能交联剂Sulfo-SMCC(Pierce，USA)将短肽CGGAFHYESQ与载体Qβ-2aa病毒样颗粒进行耦联制备ATRQβ-001疫苗，其步骤如下：

1)称取Sulfo-SMCC试剂2mg，400ul纯水完全溶解后加入至20mg Qβ-2aa病毒样颗粒(10mg/m1)中，混匀，室温放置30分钟；

2)将活化的载体加入至100K的TFF浓缩柱(Millipore，USA)中，添加50mM PBS(含1mM EDTA，pH 7.2)，5,000g离心3次，脱去游离的Sulfo-SMCC；

3)称取短肽约5mg，50mM PBS(含1mM EDTA，pH7.2)1ml充分溶解加入活化的载体中，室温反应1小时，每隔20min轻轻振荡一次；

4)将疫苗混合物加入至100K的TFF浓缩柱，5,000g离心3次，脱除游离的未反应的该短肽；

5)疫苗定量后，取20ul疫苗分别做Tricine-SDS-PAGE和免疫电镜鉴定之用，剩余疫苗分装，储存于-80°冰箱。

Tricine-SDS-PAGE和免疫电镜鉴定ATRQβ-001疫苗(图1)。图中A：病毒样颗粒和短肽耦联后Tricine-SDS-PAGE电泳结果，M为Marker，泳道1-2为病毒样颗粒单体，泳道3-4为耦联短肽后病毒样颗粒单体，电泳结果显示：Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒的单体可以耦联1～4个ATR-001短肽，一个单体上连得最多的是2个ATR-001半抗原，其次是3个；图中B：病毒样颗粒和短肽耦联后免疫电镜结果显示：胶体金颗粒可以分散围绕在近球形的Qβ-2aa病毒样颗粒表面上。

实施案例2 抗ATRQβ-001疫苗短肽抗体滴度

雄性自发性高血压大鼠来自上海斯莱克实验动物中心，动物饲养于同济医学院SPF动物实验中心，采用12h/12h光照及非限制性普通饮食。具体分为4组：ATRQβ-001疫苗免疫组；Ang II-Qβ疫苗免疫组(Ang II衍生物与Qβ-2aa病毒样颗粒耦联疫苗)；缬沙坦药物(Novartis，Switzerland)灌胃组；PBS对照SHR组。除缬沙坦药物灌胃组为8周龄外，余组均为6周龄雄性SHR大鼠，各组只数为9只。

取等体积疫苗(不足以PBS补齐)和PBS，于大鼠背部皮下3-4点注射，400ul/只，疫苗组疫苗剂量约300ug/只，于初次免疫后每隔两周加强2次、隔四周各加强2次，共5次。于2、4、7、12、16周进行割尾取血，ELISA法测定抗肽抗体滴度，其趋势见图2。第二次免疫后第三天ATRQβ-001疫苗抗肽抗体滴度大约为1∶4000，一个月时的抗肽抗体滴度升至为1∶8000，后续将免疫时间间隔延长后，抗体滴度有所下降。

实施案例3 抗ATRQβ-001疫苗短肽抗体的特异性

提纯ATRQβ-001疫苗抗肽抗体CQ-8，应用免疫印迹法和细胞免疫荧光鉴定ATRQβ-001抗肽抗体CQ-8的特异性。设置三个组：CQ-8为ATRQβ-001疫苗免疫动物后的抗肽抗体，DCQ-8指CQ-8被ATR-001短肽中和后的混合物，CON为阴性对照抗体。提取SD大鼠肠系膜三级动脉血管平滑肌细胞总蛋白，进行免疫印迹分析，结果显示CQ-8能够与该总蛋白提取物中约41kDa大小的蛋白结合，该蛋白与大鼠AT1A受体分子量(约41kDa)一致(图3A)。同时，通过细胞免疫荧光发现，CQ-8可以和大鼠肠系膜三级动脉血管平滑肌细胞表面AT1A受体结合，而DCQ-8与AT1A受体结合能力下降，对照抗体和AT1A受体基本无结合(图3B)。

实施案例4 ATRQβ-001抗肽抗体CQ-8抑制Ang II诱导的蛋白激酶C转位

细胞免疫荧光法观察CQ-8对血管平滑肌细胞AT1受体激活后引起蛋白激酶C(PKC)转位的影响。设置如下组：CQ-8为ATRQβ-001疫苗免疫动物后的抗肽抗体，DCQ-8指CQ-8被ATR-001短肽中和后的混合物，CON为对照抗体，ANG为Ang II，代表阳性刺激，LOS代表氯沙坦组。本案例分别使用对照抗体、LOS和Ang II单独刺激血管平滑肌细胞，观察PKC转位情况；同时将血管平滑肌细胞与CQ-8、LOS和DCQ-8预孵育1小时后，再予以Ang II刺激，对比观察PKC转位状态。结果显示，对照抗体和LOS单独作用，不引起PKC转位，ANG组在Ang II(100uM)刺激5分钟后，PKC转位明显增强；CQ-8和LOS预孵育1小时后，可以明显抑制Ang II(100uM)诱导的PKC转位，而DCQ-8则对其无影响(图4)。

实施案例5 CQ-8显著抑制细胞外信号蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化水平

应用免疫印迹法探究CQ-8对细胞外信号蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化水平的影响。本案例亦分别使用对照抗体、LOS和Ang II单独刺激血管平滑肌细胞，观察ERK1/2磷酸化水平变化；同时将血管平滑肌细胞与CQ-8、LOS和DCQ-8预孵育1小时后，再予以Ang II刺激，对比观察ERK1/2磷酸化水平变化。分组与PKC转位实验一致，P-ERK、T-ERK分别代表磷酸化的ERK1/2和总的ERK1/2。结果显示：与对照抗体相比，ANG组刺激可以显著地升高ERK1/2的磷酸化水平(P＜0.001)；而与Ang II单纯刺激组相比，氯沙坦预孵育可以显著降低Ang II刺激引起的ERK1/2磷酸化水平的升高(P＜0.01)，CQ-8预孵育也同样可以显著降低ANG刺激引起的ERK1/2升高(P＜0.01)，两者作用强度类似，但DCQ-8预孵育对Ang II刺激引起的ERK1/2磷酸化水平的升高无明显影响，与CQ-8预孵育组相比，有显著差异(P＜0.01)(*代表ANG组与对照抗体组相比，P＜0.001；#代表CQ-8预孵育组和LOS预孵育组与ANG组相比，P＜0.01；**代表DCQ-8预孵育组与CQ-8预孵育组相比，P＜0.01)(图5)。

实施案例6 CQ-8抑制Ang II刺激引起的血管平滑肌细胞内钙离子浓度升高

借助激光共聚焦显微镜观测CQ-8对Ang II刺激引起的血管平滑肌细胞内钙离子浓度升高的影响。F_o、F_max分别代表平衡后血管平滑肌细胞基础和最大荧光强度。将血管平滑肌细胞与CQ-8和DCQ-8预孵育1小时后，再予以Ang II刺激。结果显示，CQ-8可以显著抑制Ang II刺激引起的血管平滑肌细胞内钙离子浓度升高，而DCQ-8基本无影响(*代表C0-8组与DCQ-8组相比，P＝0.01；#代表CQ-8组和对照抗体组相比，P＝0.00)(图6)。

实施案例7 ATRQβ-001疫苗有效降低SHRs的血压

于0、2、3、4、5、7、9、12、16周测量ATRQβ-001疫苗免疫组、Ang II-Qβ-2aa疫苗(AngQβ疫苗)免疫组、缬沙坦灌胃组和阴性对照组SHRs的鼠尾血压和心率，每次测量8次，取其平均值，其血压趋势见图7。ATRQβ-001疫苗组SHRs的血压在免疫后两周与阴性对照组相比即见轻微下降，至一月时达到高峰，下降11.51mmHg，维持至约7周时血压下降幅度有所降低，在我们的观察终止时，只有轻微的血压下降，同样的，AngQβ疫苗组也有类似的现象，而缬沙坦灌胃组一直保持良好的血压下降。

实施案例8 ATRQβ-001疫苗对心脏的有效保护

16周的饲养及观察结束后，麻醉SHRs，进行心脏超声探查，主要探究收缩期和舒张期左室心腔的直径及其前后壁的厚度，见图8。ATRQβ-001疫苗组收缩期室间隔厚度(IVSs，3.61±0.30mm)、收缩期后壁厚度(LVPWs，3.37±0.52mm)和舒张期室间隔厚度(IVSd，2.48±0.20mm)、舒张期后壁厚度(LVPWd，2.29±0.38mm)与阴性对照组(IVSs，4.11±0.50mm；LVPWs，3.79±0.26mm；IVSd，LVPWd，2.90±0.75mm)相比，均明显要薄(P＜0.01)，而同时ATRQβ-001疫苗组收缩期、舒张期左室内径(LVIDs，3.68±0.60mm；LVIDd，5.88±0.50mm)比阴性对照组(LVIDs，2.36±0.60mm；LVIDd，4.58±0.74mm)要大(P＜0.01)(表1)。同时发现，ATRQβ-001疫苗组SHRs左室的以上参数与AngQβ疫苗组类似，但要优于缬沙坦药物灌胃组(未显示数据结果)。疫苗组与对照组之间的射血分数(EF％)无显著差异(表1)(注：*代表ATRQβ-001疫苗组与阴性对照组相比，P＜0.01，各组数为9只。)。

表1：对照组和ATRQβ-001疫苗组心脏彩超重要参数比较

实施案例9 ATRQβ-001疫苗对肾脏的有效保护

取SHRs的肾脏进行电镜观测，并对比疫苗免疫组大鼠和对照组大鼠的肾脏病理表现，发现对照组大鼠的肾脏有较为明显的系膜增生，且基底膜增厚，而疫苗免疫组没有，显示了ATRQβ-001疫苗良好的肾脏靶器官保护作用，同时亦未发现明显的免疫复合物的沉积，显示了该疫苗的安全性(图9)。

实施案例10 ATRQβ-001疫苗的安全性

雄性Wistar大鼠来自湖北省实验动物中心，8周龄，饲养于同济医学院SPF动物实验中心，采用12h/12h光照及非限制性普通饮食。具体分为3组：ATRQβ-001疫苗免疫组、Qβ-2aa载体免疫组和空白对照组，每组30只。大鼠背部皮下3-4点注射疫苗，400ul/只，剂量约300ug/只，于初次免疫后每隔两周加强1次，共4次。

于免疫后第3、7、14、28、42、56天分别取各组动物，每次每组5只，处死取血进行流式细胞学分析。将检测管分为两群4个亚组：CD4⁺细胞组(IFN-γ和IL-4)和CD8⁺细胞组(IFN-γ和FasL)。流式细胞术检测大鼠外周血分泌特征细胞因子淋巴细胞比例。结果显示，ATRQβ-001疫苗免疫组的外周血淋巴细胞中分泌IL-4CD4⁺淋巴细胞的比例显著高于对照组(*代表P＜0.01)，其余各组间无显著差异(图10)，提示疫苗免疫后产生以Th2为主的免疫反应。考虑到ATRQβ-001降压疫苗可能会出现的自身免疫损伤，我们也对分泌IL-17的Th17细胞进行了检测，未见有意义的分泌IL-17的Th17细胞的升高(结果未显示)。同时亦发现，疫苗免疫组脾脏淋巴细胞中分泌IL-4CD4⁺淋巴细胞的比例显著高于对照组，结果与外周血一致(结果未显示)。

取大鼠组织器官进行光镜观测，发现ATRQβ-001疫苗组Wistar大鼠组织器官(肺脏、心脏、肠系膜三级动脉、肾脏、肝脏及脾脏)病理显示无炎性细胞浸润，无免疫性损害，与阴性对照组无差别(图11)。肾脏电镜观测ATRQβ-001疫苗免疫组(图11-1)和对照组Wistar大鼠肾脏((图11-2)，未见明显病理变化，均未发现高电子密度免疫复合物在基底膜的沉积(图12)。

Claims (2)

1.一种血管紧张素II受体1型多肽-载体疫苗，其特征在于：使用异双功能交联剂Sulfo-SMC将短肽CGGAFHYESQ与载体Qβ-2aa噬菌体病毒颗粒进行耦联后制备成疫苗，其具体步骤是：

1)称取Sulfo-SMCC试剂2mg，400ul纯水完全溶解后加入至20mg Qβ-2aa病毒样颗粒10mg/ml中，混匀，室温放置30分钟；

2)将活化的载体加入至100K的TFF浓缩柱中，添加50mM PBS含1mM EDTA，pH7.2，5,000g离心3次，脱去游离的Sulfo-SMCC；所述的TFF浓缩柱由美国密理博公司提供；

3)称取短肽5mg，50mM PBS含1mM EDTA，pH7.21ml充分溶解加入活化的载体中，室温反应1小时，每隔20min轻轻振荡一次；

4)将疫苗混合物加入至100K的TFF浓缩柱，5,000g离心3次，脱除游离的未反应的该短肽；

所述载体Qβ-2aa病毒样颗粒，按以下方法制备：

1)将Qβ噬菌体CP蛋白基因终止密码子由TGA突变为强终止密码子TAA后，克隆至原核表达载体pET28a(+)中，得到编码CP蛋白质粒pETQβ-CP；

2)在Qβ噬菌体CP延伸蛋白基因中编码免疫优势决定区位置，即Qβ噬菌体CP延伸蛋白基因第72位至73位密码子间，插入编码赖氨酸和亮氨酸的核苷酸AAGCTT，并将CP蛋白基因终止密码子由TGA突变为GGA后克隆至原核表达载体PGEX4T-2中，得到编码A1蛋白质粒pGEXQβ-A1；

3)突变后编码Qβ噬菌体CP蛋白质粒与A1蛋白质粒共同转化大肠杆菌，诱导后表达得到的。

2.一种权利要求1所述的血管紧张素II受体1型多肽-载体疫苗在制备治疗原发性高血压药物中的应用。

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