CN103613660A - 一种血管紧张素完全抗原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血管紧张素完全抗原的制备方法，以血管紧张素为原料，包括以下步骤：（1）将血管紧张素溶于0.1mol/L盐酸，载体蛋白溶于0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，分别制备抗原溶液和载体蛋白溶液；（2）将浓度为1mol/L NaNO2缓慢滴入抗原溶液，常温震荡反应20分钟；（3）将重氮化溶液边震荡边滴入载体蛋白溶液，4℃震荡反应4小时；（4）反应混合物通过超滤、透析或者脱盐柱处理除去反应混合物中未偶联的小分子物质，缓冲液采用pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液，得偶联物E。本发明的优点是提供一种制备方法简单、生产周期短，生产成本低的用于去甲肾上腺素抗体制备和免疫学检测的完全抗原。
Description
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，具体的是一种血管紧张素完全抗原的制备方法。
背景技术
血管紧张素(Angiotensin)，亦称血管收缩素、血管张力素，是一种寡肽类激素，是肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system)的重要组成部分。血管紧张素能引起血管收缩，升高血压；促进肾上腺皮质释放醛固酮(Aldosterone)。它也具有很强的致渴作用。血管紧张素Ⅰ能刺激肾上腺髓质分泌肾上腺素，它直接收缩血管的作用不明显；血管紧张素Ⅱ能使全身小动脉收缩而升高血压，此外，还可促进肾上腺皮质分泌醛固酮，醛固酮作用于肾小管，起保钠、保水、排钾作用，从而引起血量增多，血压升高；血管紧张素Ⅲ的缩血管作用较弱，只有血管紧张素Ⅱ的1/5，但促进醛固酮分泌的作用却强于血管紧张素Ⅱ。
检测血浆中肾素活性（PRA，即血管紧张素Ⅰ4℃/37℃血浆浓度）、血管紧张素Ⅱ（AⅡ）和醛固酮（ALD）已成为原发性和继发性高血压分型诊断、治疗及研究的重要指标。目前，用于临床诊断的人体血浆血管紧张素分析方法主要是放射免疫法和化学发光法等。建立高效的免疫学检测方法的关键是需要高品质的抗体和完全抗原。而众所周知，血管紧张素是小分子结构，激发不了动物机体产生抗体，也无法直接应用于免疫检测。因此，需要研究人员提供一种简单可靠的方法，以获得一种高效的完全抗原。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种制备方法简单、生产周期短，生产成本低的用于血管紧张素免疫学检测免疫原性强的完全抗原。
技术方案包括下述步骤：
一种血管紧张素完全抗原的制备方法，以血管紧张素为原料，包括以下步骤：
（1）将血管紧张素溶于0.1mol/L盐酸，载体蛋白溶于0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液，分别制备抗原溶液和载体蛋白溶液；
（2）将浓度为1mol/L NaNO2缓慢滴入抗原溶液A，常温震荡反应20分钟，得重氮化溶液；
（3）将重氮化溶液边震荡边滴入载体蛋白溶液中，4℃震荡反应4小时，得反应混合物；
（4）反应混合物通过超滤、透析或者脱盐柱处理除去反应混合物中未偶联的小分子物质，缓冲液采用pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液，得偶联物；
得到偶联物后采用紫外分光光度计对载体蛋白、未偶联的小分子物质、偶联物在150-400nm之间进行扫描，观察200-300nm之间的特征峰，在同坐标下进行图形比对，在偶联物和载体蛋白对照浓度相同的情况下，偶联物的特征峰与载体特征峰相比发生明显偏移，偶联成功。
进一步，所述血管紧张素为血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、血管紧张素Ⅲ或血管紧张素1-7中的任一种，血管紧张素1-7是血管紧张素II脱掉最后一个氨基酸（Phe，苯丙氨酸）的产物。
进一步，所述步骤（1）中载体蛋白为含有游离氨基的生物大分子，生物大分子为牛血清白蛋白BSA或者卵清蛋白或者牛丙种球蛋白或者钥孔血蓝蛋白KLH。
进一步，所述步骤（3）中，重氮化溶液中血管紧张素与载体蛋白摩尔比10-20:1。
进一步，所述步骤（1）中，制备抗原溶液A为1mg/ml，载体蛋白溶液为5mg/ml。进一步，浓度为1mol/L NaNO2加入摩尔量与步骤（1）中加入的0.1mol/L盐酸相等0.1mol/L的盐酸相等，边加边震荡，滴加完成后常温震荡20分钟，得重氮化溶液。
进一步，所述步骤（3）将重氮化溶液缓慢滴加到载体蛋白溶液中，边滴边震荡，滴加完成后4℃持续震荡，反应4小时，得到反应混合液。
将浓度为1mol/L NaNO2缓慢滴入抗原溶液，常温震荡反应20分钟，得重氮化溶液；脂肪族、芳族和杂环的一级胺和亚硝酸作用（在强酸介质下）生成重氮盐的反应标为重氮化（一般在低温下进行，伯胺和酸的摩尔比是：1：2.5），一级胺常称重氮组分，亚硝酸为重氮化剂，因为亚硝酸不稳定，通常使用亚硝酸钠和盐酸或硫酸使反应时生成的亚硝酸立即与芳伯胺反应，避免亚硝酸的分解，重氮化反应后生成重氮盐。重氮化反应可用反应式表示为：
Ar-NH2+2HX+NaNO2--—Ar-N2X+NaX+2H20
附图说明：
图1偶联物通过分光光度计扫描鉴定图
1、未偶联血管紧张素Ⅰ小分子特征峰 2、载体蛋白BSA特征峰
3、偶联血管紧张素Ⅰ样品1特征峰 4、偶联血管紧张素Ⅰ样品2特征峰
具体实施方式：
实施实例1：血管紧张素Ⅰ与载体蛋白BSA偶联
（1）将1mg血管紧张素Ⅰ样品1和样品2分别溶于0.1mol/L盐酸，5mg载体蛋白BSA溶于0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液，分别制备1mg/ml血管紧张素Ⅰ溶液和5mg/ml载体蛋白BSA溶液；
（2）将浓度为1mol/L NaNO250ul缓慢滴入血管紧张素Ⅰ样品1和样品2溶液，常温震荡反应20分钟，得重氮化溶液；
（3）将重氮化溶液边震荡边滴入载体蛋白BSA溶液中，4℃震荡反应4小时，得反应混合物；
（4）反应混合物通过超滤处理除去反应混合物中未偶联的小分子物质，缓冲液采用pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液，得偶联物；
得到偶联物后采用紫外分光光度计对载体蛋白BSA、未偶联的小分子物质、偶联物在200-400nm之间进行扫描，在同坐标下进行图形比对，在偶联物和载体蛋白BSA对照浓度相同的情况下，偶联物的特征峰与载体蛋白BSA特征峰相比发生明显偏移，偶联成功。
实施实例2：血管紧张素Ⅱ与载体蛋白卵清蛋白偶联
（1）将1mg血管紧张素Ⅱ溶于0.1mol/L盐酸，5mg载体蛋白卵清蛋白溶于0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液，分别制备1mg/ml血管紧张素Ⅱ溶液和5mg/ml载体蛋白卵清蛋白溶液;
（2）将浓度为1mol/L NaNO2缓慢滴入血管紧张素Ⅱ溶液，常温震荡反应20分钟，得重氮化溶液；
（3）将重氮化溶液边震荡边滴入载体蛋白卵清蛋白溶液中，4℃震荡反应4小时，得反应混合物；
（4）反应混合物通过超滤处理除去反应混合物中未偶联的小分子物质，缓冲液采用pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液，得偶联物；
得到偶联物后采用紫外分光光度计对载体蛋白卵清蛋白、未偶联的小分子物质、偶联物在200-400nm之间进行扫描，在同坐标下进行图形比对，在偶联物和载体蛋白卵清蛋白对照浓度相同的情况下，偶联物的特征峰与载体蛋白卵清蛋白特征峰相比发生明显偏移，偶联成功。
实施实例3：血管紧张素Ⅲ与载体蛋白钥孔血蓝蛋白偶联
（1）将1mg血管紧张素Ⅲ溶于0.1mol/L盐酸，5mg载体蛋白KLH溶于0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液，分别制备1mg/ml血管紧张素Ⅲ溶液和5mg/ml载体蛋白钥孔血蓝蛋白溶液;
（2）将浓度为1mol/L NaNO2缓慢滴入血管紧张素Ⅲ溶液，常温震荡反应20分钟，得重氮化溶液；
（3）将重氮化溶液边震荡边滴入载体蛋白KLH溶液中，4℃震荡反应4小时，得反应混合物；
（4）反应混合物通过超滤处理除去反应混合物中未偶联的小分子物质，缓冲液采用pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液，得偶联物；
得到偶联物后采用紫外分光光度计对载体蛋白KLH、未偶联的小分子物质、偶联物在200-400nm之间进行扫描，在同坐标下进行图形比对，在偶联物和载体蛋白KLH对照浓度相同的情况下，偶联物的特征峰与载体蛋白KLH特征峰相比发生明显偏移，偶联成功。
Claims (8)
1.一种血管紧张素完全抗原的制备方法，其特征在于，以血管紧张素为原料，包括以下步骤：
（1）将血管紧张素溶于0.1mol/L盐酸，载体蛋白溶于0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液，分别制备抗原溶液和载体蛋白溶液；
（2）将浓度为1mol/LNaNO2缓慢滴入抗原溶液，常温震荡反应20分钟，得重氮化溶液；
（3）将重氮化溶液边震荡边滴入载体蛋白溶液中，4℃震荡反应4小时，得反应混合物；
（4）反应混合物通过超滤、透析或者脱盐柱处理除去反应混合物中未偶联的小分子物质，缓冲液采用pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液，得偶联物。
2.如权利要求1所述的血管紧张素完全抗原的制备方法，其特征在于，所述血管紧张素为血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、血管紧张素Ⅲ或血管紧张素1-7中的任一种。
3.如权利要求1所述的血管紧张素完全抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中载体蛋白为含有游离氨基的生物大分子。
4.如权利要求1所述的血管紧张素完全抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，制备抗原溶液为1mg/ml，载体蛋白溶液为5mg/ml。
5.如权利要求1所述的血管紧张素完全抗原制备方法，其特征在于，所述步骤（2）浓度为1mol/L NaNO2加入摩尔量与步骤（1）中加入的0.1mol/L盐酸相等，边加边震荡，滴加完成后常温震荡20分钟，得重氮化溶液。
6.如权利要求1所述的血管紧张素完全抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，重氮化溶液中血管紧张素与载体蛋白摩尔比10-20:1。
7.如权利要求3所述的血管紧张素完全抗原的制备方法，其特征在于，所述生物大分子为牛血清白蛋白或者卵清蛋白或者牛丙种球蛋白或者钥孔血蓝蛋白。
8.如权利要求1所述的血管紧张素完全抗原制备方法，其特征在于所述步骤（3）将重氮化溶液缓慢滴加到载体蛋白溶液中，边滴边震荡，滴加完成后4℃持续震荡，反应4小时，得到反应混合液。
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