CN1681845B - 血管紧张素-ⅱⅰ型受体单克隆抗体的治疗性用途 - Google Patents
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Abstract
提供了用于治疗癌及血管平滑肌细胞增殖的针对血管紧张素-II I型受体的单克隆抗体的用途。特别的，提供了肽的单克隆抗体或其片段在制备治疗癌的药物或制备治疗血管平滑肌(VSM)细胞增殖的药物中的用途，所述肽包含通过序列MILNSSTEDG IKRIQDDCPK AGRHNYIFVMIPTLYSIIFV VGIFG定义的血管紧张素-III型受体N端部分或其片段。
Description
本发明涉及血管紧张素-II I型受体单克隆抗体的治疗性用途，特别是在治疗癌及血管平滑肌细胞增殖中的用途。
血管紧张素-II在哺乳动物电解质平衡及血压控制中起重要作用(Peach Physiol.Rev 57 313-370(1977)；Vinson等人“The AdrenalCortex”，Prentice Hall，Englefield Heights(1992))。已认识到两种主要类型的称为1型及2型(AT1及AT)的血管紧张素-II受体，但血管紧张素-II多数公知的作用是通过AT1亚型发生的(Herblin等人，Am.J.Hypertens.4 299S-302S(1991)；Ouali等人，J.Steroid.Biochem.Mol.Biol.43271-280(1992))。
AT1受体亚型单克隆抗体6313/G2(Barker等人，J.Mol.Endocrinol.11241-245(1993))用于研究受体的分布(Vinson等人，Mol.Med.Today135-38(1995))。建议将该单克隆抗体用作控制血管收缩，例如用于治疗高血压或子宫收缩的治疗剂。
抗体在多种组织如喉癌(Marsigliante等人，Cancer Letters 110 19-27(1996))、肾(Harrison-Bernard等人Am.J.Physio.42F170-F177(1997)；Cheng等人，Am.J.Physio.43 F10-F17(1998))及脑(Yang等人，J.Neuroscience 17 1660-1669(1997))中用作特异显象剂。显示所述抗体可阻断经血管紧张素-II诱导的AT1受体内化及PKC激活作用，但相反地促进钙反应(Kapas等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.204 1292-1298(1994；Vinson等人，J.Endocrinol.141 R5-R9(1994))。据报道乳腺癌中存在的AT1及AT2受体局部产生血管紧张素(Inwang等人，Brit.J.Cancer75 1279-1283(1997)；Tahmasebi等人，Eur.J.Cancer 34 1777-1782(1998))。
单克隆抗体6313/G2是根据布达佩斯条约于1993年7月21日保藏在大不列颠联合王国Porton Down的欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)，保藏号为93072117的杂交瘤细胞系分泌的。所述保藏物是伦敦E1 4NS，Mile End路，Queen Mary & Westfield学院生物化学系的Gavin P Vinson博士和Stewart Barker博士制备的。保藏人授予本申请人在申请书中引用经保藏材料并根据欧洲专利协议28(1)(d)条法则，无保留并不可取消地同意公众可获得经保藏材料。
杂交瘤细胞系产生与大鼠血管平滑肌AT1受体第8至17位氨基酸残基特异结合的抗体，在人及牛细胞的AT1受体中也发现所述氨基酸残基序列。表位序列如下：
EDGIKRIQDD
或备选地表示为，
NH2-Glu-Asp-Gly-Ile-Lys-Arg-Ile-Gln-Asp-Asp-COOH
现在令人惊讶地发现针对包含血管紧张素-II I型受体N端序列的肽序列的单克隆抗体在某些医学疾病中具有其它治疗性用途，这些用途以前没有被暗示或显示。此外，发现这些治疗性作用为在有关医学疾病中所述单克隆抗体能阻断血管紧张素-II的有害作用而保留该分子的有益作用。现在认识到了完整的N端序列对功能性方面的重要作用。
根据本发明的第一方面，提供了针对下述肽的单克隆抗体或其片段在制备用于癌治疗的药物中的用途，所述肽包含通过序列
MILNSSTEDG IKRIQDDCPK AGRHNYIFVM IPTLYSIIFV
VGIFG
定义的血管紧张素-III型受体N端部分或其片段。
在以上及在本说明书中，氨基酸残基通过一般的IUPAC单字母命名法进行命名。单字母命名法可如以下与传统的三个字母命名相对应：
A＝Ala G＝Gly M＝Met S＝Ser
C＝Cys H＝His N＝Asn T＝Thr
D＝Asp I＝Ile P＝Pro V＝Val
E＝Glu K＝Lys Q＝Gln W＝Trp
F＝Phe L＝Leu R＝Arg Y＝Tyr
如文中应用的，术语“肽”包含寡肽或多肽，并且这些术语可互换使用。
肽应具有赋予抗原性所需的至少最小大小，一般它应具有至少六个或七个残基，但可具有任何适当长度，可达到例如20个氨基酸残基。优选的，它可具有或9个或10个残基。最好的肽可预计对应于天然血管紧张素-II I型受体分子的拓扑学表面特征，即这些特征具有一些三维特征，突出自或延伸到受体的周围表面水平。优选的肽对应于1至45位区域，优选对应于8至17位残基。
大概最简单的保证至少部分分子抗原性等同于所述肽的方法是对于分子的那部分包含与肽相同或构象相似的氨基酸残基序列。然而，可应用任何其它产生抗原性等同物的任何方法：一个实例为应用抗独特型抗体或其(甚至非蛋白质的)类似物。
因此本发明包含针对与血管紧张素-II I型受体具有结构同源性的短肽(优选10个氨基酸残基或更少，但一般至少4或5个氨基酸残基，例如6至8个残基，或7至9个残基)的单克隆抗体的用途。
在一个优选的实施方案中，因此本发明包含针对含有氨基酸序列：
EDGIKRIQDD
的肽序列或其活性片段和/或其保守性突变体的单克隆抗体的用途。此序列取自大鼠血管紧张素-II I型受体序列，为第8至17位残基。此片段的保守性替代为用D替代E，用E替代D，用A替代G、L或I，用R替代K，用K替代R，用N替代Q，或其组合。
序列EDGIKRIQDD在人、黑猩猩、鼠(AT1b)及(AT1b)、牛、犬、羊、兔、大鼠(AT1b)中完全100％保守。在第8位残基处有变化，豚鼠为Q，大鼠(AT1a)为D且沙鼠为D。对N端序列的1至45位残基区域，这些物种序列同源性在图9显示。
因此，对应于血管紧张素-II I型受体第8至17位残基的肽的优选共有序列具有结构：
EDGIKRIQDD
每一下列残基可独立地为：残基8可为E、D或Q，残基9可为D或E，残基10可为G或A，残基11可为I或A，残基12可为K或R，残基13可为R或K，残基14可为I或A，残基15可为Q或N，且残基16和17每个可为D或E。
肽一般具有抗原性并能刺激产生抗体，当施用时所述抗体可用于治疗癌。
如以上阐述的，特定序列的活性亚片段可如定义的进行应用。活性亚片段可由五肽组成或包括五肽，其包括一个或多个：
TEDGI
EDGIK
DGIKR
GIKRI
IKRIQ
KRIQD
RIQDD
IQDDC
活性亚片段也可由六肽组成或包括六肽，其包括一个或多个：
STEDGI
TEDGIK
EDGIKR
DGIKRI
GIKRIQ
IKRIQD
KRIQDD
RIQDDC
IQDDCP
活性亚片段可备选地由七肽组成或包括七肽，其包括一个或多个：
SSTEDGI
STEDGIK
TEDGIKR
EDGIKRI
DGIKRIQ
GIKRIQD
IKRIQDD
KRIQDDC
RIQDDCP
IQDDCPK
此外，活性亚片段可由八肽组成或包括八肽，其包括：
NSSTEDGI
SSTEDGIK
STEDGIKR
TEDGIKRI
EDGIKRIQ
DGIKRIQD
GIKRIQDD
IKRIQDDC
KRIQDDCP
RIQDDCPK
IQDDCPKA
此外，活性亚片段可由九肽组成或包括九肽，其包括：
LNSSTEDGI
NSSTEDGIK
SSTEDGIKR
STEDGIKRI
TEDGIKRIQ
EDGIKRIQD
DGIKRIQDD
GIKRIQDDC
IKRIQDDCP
KRIQDDCPK
RIQDDCPKA
IQDDCPKAG
此外，活性亚片段可由十肽组成或包括十肽，其包括：
ILNSSTEDGI
LNSSTEDGIK
NSSTEDGIKR
SSTEDGIKRI
STEDGIKRIQ
TEDGIKRIQD
EDGIKRIQDD
DGIKRIQDDC
GIKRIQDDCP
IKRIQDDCPK
KRIQDDCPKA
RIQDDCPKAG
IQDDCPKAGR
优选的片段包括那些包含序列EDGIKRIQDD中的一些残基例如至少四个残基的片段。
应当注意可应用一个以上上述序列的组合。
根据本发明用于制备用于应用的单克隆抗体的肽和其它分子可表现抗原性或以多种方式呈递。优选地，本发明分子中的抗原性区(如肽片段或亚片段)包含与载体肽或蛋白质结合的经选择氨基酸序列。一般优选具有与载体结合的多个例如5至10个拷贝的肽序列(例如一个或多个以上序列)。载体有益的一般可为大蛋白质，所述蛋白质在材料方面为惰性物质并衍生自与天然生长激素相关的不同种或属。载体的实例包括白蛋白，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白及卵清蛋白(虽然可能极少肽能由卵清蛋白携带)。备选地，可用匙孔血蓝蛋白。载体一般优选来自基于片段的不同物种。
以上描述的肽序列不必与白蛋白结合：它们可与其它大分子，如β-半乳糖苷酶，特别是细菌源的半乳糖苷酶结合。
本发明包含针对上述肽或与上述肽具有实质上的(例如30％、50％或甚至70％以上，适当的80％、85％、90％或95％以上)序列同源性的肽区这样的分子的单克隆抗体的用途。同样地，保守性氨基酸替代可不降低肽的免疫原性或抗原性。因此抗原性相似的同系物可引起抗体产生，所述抗体在如以上定义肽的同一区域与血管紧张素-II I型受体结合。应用同系物是避开“自身”耐受的方法是公知的。因此，在本发明中应用来自其它物种的对应序列是有益的。
制备针对分子的单克隆抗体是备选可能的，所述分子是或者包含如以上描述序列的聚合物的肽。适当的序列可通过两个半胱氨酸残基的交联以形成二硫键或通过用外部化学偶合剂(如碳二亚胺、戊二醛或其它二醛或二-(或聚-)官能羧酸。作为其它备选，可用重组DNA技术产生肽聚合物。
应当注意化学偶联(例如可通过赖氨酸残基参与发生)及二硫键的形成不限于当偶联残基位于序列末端时：内部残基也可是合适的。偶联残基例如半胱氨酸残基可根据需要进行添加。
可以发现将任何以上描述的序列与外部肽偶联不是必要的。它们自身可具有抗原性。在此种情况下，可建议选择特定佐剂如DEAE葡聚糖及Merck 7426。
根据本发明用于应用的单克隆抗体可通过Kohler & Milstein的标准技术(Nature 256 495-497(1975))免疫近交系小鼠进行制备。对应于以上描述表位序列的肽可通过任何常规化学或生物学途径进行合成，然后所述合成的肽与牛血清白蛋白(BSA)或其它适当分子偶联，并然后用于免疫小鼠。在肽-BSA偶联物加强注射后，将小鼠的脾取出，并将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合。然后经混合的骨髓瘤-淋巴细胞杂交体通过在适当的细胞培养基中在次黄嘌呤、胸苷及氨喋呤中生长以抑制非融合骨髓瘤细胞及骨髓瘤细胞杂交体的增殖而筛选。
杂交瘤细胞可用Engvall等人Immunochem.8，871(1991)描述的技术使用血管紧张素-II I型受体通过ELISA对表位反应性进行筛选。备选地，可用Beckmann等人J.Immunol.144，4212(1990)描述的抗体捕获技术。阳性杂交瘤细胞可腹膜内注射到同系Balb/c小鼠以产生包含高浓度针对以上描述的来自血管紧张素-II I型受体N端序列表位的抗体的腹水。备选地，杂交瘤细胞可在细胞瓶中或转瓶中通过多种技术体外生长。小鼠腹水产生的单克隆抗体可通过硫酸铵沉淀，接着通过凝胶排阻层析进行纯化。备选地，可用基于抗体与蛋白A或蛋白G结合的亲和层析，也能基于与产生单克隆抗体的表位进行结合的亲和层析。单克隆抗体6313/G2如Barker等人J.Mol.Endocrinol.11，241-245(1993)描述的进行制备。抗体在治疗高血压及控制子宫收缩的用途在WO-A-9509186中进行了描述。然而，在其它潜在治疗性领域没有任何更广泛用途的建议。
大鼠血管紧张素-II I型受体在Murphy等人，Nature 351，233-236(1992)中进行了描述并且经鉴定至少包含8至17位残基的以氨基酸序列DGIKRIQDD表示的胞外结构域。来自以上描述的血管紧张素-II I型受体N端1至45位，优选8至17位残基序列的表位通过氨基酸替代、和/或插入、和/或缺失可发生变化以致表位整体形状和/或构象仍具有抗原性。
在本发明优选的实施方案中，单克隆抗体为6313/G2。单克隆抗体6313/G2是通过杂交瘤细胞系分泌的，所述杂交瘤细胞系根据布达佩斯条约，于1993年7月21日保藏在大不列颠联合王国Porton Down的欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)，保藏号为93072117。杂交瘤细胞系可适当地按标准条件进行培养。
在本发明的用途中，癌的治疗可包括但不限于抑制转移、抑制与肿瘤细胞基质蛋白结合、抑制肿瘤细胞的侵袭及抑制肿瘤细胞增殖。对此种治疗敏感的癌性肿瘤实例包括但不限于乳腺癌及前列腺癌。
在本发明的第二方面，提供了针对肽的单克隆抗体或其片段在制备治疗血管平滑肌(VSM)细胞增殖药物中的用途，所述肽包含通过序列
MILNSSTEDG IKRIQDDCPK AGRHNYIFVM IPTLYSIIFV
VGIFG
定义的血管紧张素-II I型受体N-端部分或其片段。
治疗血管平滑肌细胞增殖可包括治疗动脉硬化症，所述动脉硬化症显示为与VSM细胞增殖相关的复杂痰病。
因此本发明的第一方面也延伸到用于治疗癌的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗量的针对包含通过以上描述氨基酸序列所定义血管紧张素-II I型受体N端部分的肽或其片段的单克隆抗体或其片段。
因此本发明的第二方面也延伸到用于治疗血管平滑肌细胞增殖的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗量的针对包含通过以上描述氨基酸序列所定义血管紧张素-II I型受体N端部分的肽或其片段的单克隆抗体或其片段。
根据本发明应用的抗体可用适当的可药用佐剂和/或稀释剂制剂以用于静脉内注射。注射可为静脉内、肌内、腹膜内，包括皮下注射。不排除其它施用方式，如通过脂质体、肠包衣胶囊经口施用等。
适当地，根据本发明应用的抗体可如US 4,816,567及WO 94/10332中描述的为人源化抗体；或如WO 94/09817中描述的为微体；或如GB-A-2272440中描述的为转基因抗体。此类合成构建体包括嵌合分子。因此例如，人源化(或灵长类源化(primatised))抗体或其衍生物的用途在本发明的范围内。人源化抗体的实例为具有人构架区，但具有啮齿类高变区的抗体。
除了完整抗体外，本发明包括如以上定义的单克隆抗体衍生物的用途，所述单克隆抗体衍生物能结合选自如以上描述的血管紧张素-II I型受体N端区的表位。因此，本发明也包括抗体片段的用途。Dougall等人，Tibtech12，372-379(1994)给出了抗体片段的实例。
抗体片段包括例如Fab、F(ab′)2及Fv片段(Roitt等人，“Immunology”，第二版(1989)，Churchill Livingstone，伦敦)。可将Fv片段进行修饰以产生已知为单链Fv(scFv)分子aaaaaaaaaaa的合成构建体。所述分子包括有助于该分子稳定性的共价结合Vh及Vl区的肽接头。
其它合成构建体包括CDR肽。CDR肽是包含抗原结合决定簇的合成肽。也可用肽模拟物。这些分子通常为模拟CDR环结构并包括抗原相互作用侧链的构象限制型有机环。因此能结合目的表位的此类分子的用途也在本发明的范围内。
本发明的第三方面提供了肽序列或其片段在制备治疗癌的药物中的用途，所述肽序列包含通过序列
MILNSSTEDG IKRIQDDCPK AGRHNYIFVM IPTLYSIIFV
VGIFG
定义的血管紧张素-II I型受体N端区。
本发明的第四方面提供了包含肽序列或其片段的疫苗组合物，所述肽序列包含通过序列
MILNSSTEDG IKRIQDDCPK AGRHNYIFVM IPTLYSIIFV
VGIFG
定义的血管紧张素-II I型受体N端区。疫苗组合物可包含以上序列的多肽或如以上定义的抗原性片段，它们任选地与载体蛋白相结合。产生此类蛋白质或肽抗原性的方法在与本发明前述方面相关的部分进行了定义。例如，载体蛋白可为白蛋白，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白及卵清蛋白。备选地，可用匙孔蛋白质(有时也称匙孔血蓝蛋白)。载体一般来自与片段基于的物种不同的物种。疫苗组合物中也可存在其它佐剂，例如皂甙佐剂，例如Quillaja皂甙或其衍生物。
在一个特别优选的实施方案中提供了用于抑制癌细胞生长、粘附和侵袭的方法，其包括：
(1)将任选地与载体肽或蛋白质结合的单克隆抗体和其片段制剂在合适的可药用佐剂和/或稀释剂中，如用于静脉内注射，其中所述单克隆抗体和其片段为针对包含如以上定义的血管紧张素-II I型受体N端部分的肽。
(2)任选地，进一步将(1)的单克隆抗体制品制剂为脂质体或肠包衣胶囊剂型。
(3)对体外癌细胞群或癌患者施用制剂(1)或(2)。
备选地，本实施方案也可只包含步骤(1)和(2)。
此实施方案延伸到此种制剂在制备治疗癌例如前列腺癌、乳腺癌(包括乳腺癌细胞粘附或侵袭)的药物的用途。
在另一优选的实施方案中提供了用于抑制平滑肌细胞增殖的方法，所述方法为对已作必要修正的以上描述步骤(1)至(3)进行重复。
用于本发明第二及后来方面的优选特征为如已作必要修正的第一方面。
现在本发明通过参考以下实施例及附图的方式进行进一步描述，所述实施例及附图只为了进行阐述，并不用于限制本发明。在所涉及的图中：
图1显示抗体对PNT1a细胞增殖的作用。
图2通过测定摄入的含氚胸苷，显示抗体对动脉平滑肌细胞增殖的作用。
图3显示MCF-7细胞对细胞外基质蛋白的细胞粘附测定结果。
图4显示MCF-7细胞对细胞外基质蛋白的化学侵袭(chemoinvasion)测定结果。
图5显示在乳腺癌细胞中整联蛋白α-3及β-1表达测定中Western印迹结果。
图6显示在MCF-7细胞中抗体6313/G2刺激的钙反应。
图7显示在RASMC中抗体6313/G2刺激的钙反应。
图8显示血管紧张素-II作用的示意图，显示了单克隆抗体激活位点及单克隆抗体阻断位点。
图9显示来自不同物种的血管紧张素-II I型受体N端序列的序列同源性，其中“X”表示缺失的残基，“-”表示相同的残基。
实施例1：抗体6313/G2抑制前列腺PNT1A细胞增殖
四唑盐，溴化3-(4，5二甲基噻唑-2-某基)-2，5-二苯基四唑(MTT)广泛用作用于细胞氧化代谢活性的指示剂。MTT还原形成深色的甲产物，所述产物可用比色法进行测定并因此常用作细胞活力及增殖的定量评估。
将前列腺上皮细胞系PNT1a以每孔1000个细胞浓度接种到96孔培养板。细胞在添加有2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、2％青霉素和链霉素及1mM丙酮酸钠、10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中生长两天，并接着在无血清RPMI 1640培养基(200μl/孔)中静止孵育24小时。然后加入适当浓度刺激物并孵育24小时及96小时。孵育结束前4小时，将20μl经过滤(0.2μm孔径)的5mg/ml MTT溶液(在RPMI培养基中溶解)加入到每孔并于37℃继续孵育。在适当的时间点将200μl DMSO，接着将25μl Sorensen’s甘氨酸缓冲液(0.1M甘氨酸、0.1M NaCl，用1M NaOH调整至pH 10.5)加入到每孔，充分混合。5分钟后，于545nm测定吸光度。
图1显示了结果，在其中经纯化抗体(ab)加入到培养的PNT1a细胞。抗体浓度为(1∶1600)100nmol/l、(1∶160)1μmol/l、(1∶16)10μmol/l。在应用的所有抗体浓度下对增殖的抑制作用是显著的(P＜0.05或更低)。
实施例2：在血管平滑肌细胞中抗体6313/G2抑制细胞增殖
通过血管中膜外植块法(media explant method)自大鼠胸及腹动脉(RASMC)和牛大动脉(BASMC)分离ASMCs并培养几代以上。通过自经杀死大鼠中仔细解剖获得大鼠腹动脉及胸动脉节段。大动脉节段获自麻醉状态下的牛。将大动脉节段置于包含组织培养基的倾斜玻片上，然后在解剖显微镜下，将每个节段的外膜及外部部分仔细去除。将剩余组织的内部部分及内膜转移到单独的解剖皿中并用新鲜培养基洗几次。这时将每个节段切成大约1mm2并置于25cm2组织培养瓶中。将瓶的帽拧松并置于加湿的CO2孵箱中。两小时后，将添加有100单位/毫升青霉素、100μg/ml链霉素、4μmol/L L-谷氨酰胺及20％FBS的4ml RPMI-1640培养基仔细加入到瓶中，而不使组织飘浮。一周后将样本的培养基换成新鲜培养基。来自外植块的细胞在大约2周内很大程度上长成单层。然后将它们用PBS漂洗，并然后用PBS配制的具有0.125％胰蛋白酶及0.02％EDTA的溶液于37℃进行消化1-2分钟。将得到的细胞悬液加入到包含10ml培养基的75cm2组织培养瓶中并如以上进行孵育。用传3-5代的细胞进行实验。
在实验的第一天，用添加20％FBS的RPMI-1640制备RASMC悬液(105个细胞/毫升)。将1ml此细胞悬液分装到24-孔多孔板的每孔中。传代24小时后，将培养基用RPMI-1640培养基进行替换。休眠细胞(血清衍生的)或血清充满的细胞与适当的实验培养基孵育48小时，每组4孔。将10μl 3H-甲基胸苷(0.1mCi/ml)加入到每孔(1ml培养基/孔)。加入放射性胸苷后24小时，将培养基进行吹打并将培养细胞用冷PBS洗3次。然后将细胞溶解于0.5ml的0.1N NaOH并将0.3ml与3.5ml闪烁液混合，于室温过夜后，在液体闪烁计数器上分析氚含量。
结果在图2进行显示，其中增殖通过10nmol/l血管紧张素-II进行刺激并通过6313/G2(10μmol/L，＊＊P＜0.01)进行抑制。
实施例3：乳腺癌细胞中抗体6313/G2抑制细胞的增殖
将MCF-7细胞(获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA 20108，美国)以每孔5000个细胞密度接种到24孔板并在包含5％胎牛血清(FBS)的Eagles’s最低基础培养基(MEM)中生长24小时。然后将细胞在无血清培养基中再孵育24小时。接着，细胞仅在无血清培养基(对照孔)或在实验孔中仅添加血管紧张素-II(1-10nM)或添加有抗体6313/G2的无血清培养基中生长。每个处理进行四次重复。然后将细胞培养24小时。20小时后，将氚化胸苷加入到每孔中(Amersham PharmaciaBiotech，Amersham，大不列颠联合王国，50μCi/ml，比活性5Ci/mmol)并将细胞继续培养4小时。此阶段结束后，将培养基进行吹打并将培养细胞用冰冷缓冲溶液(50mM Tris-HCl，pH 7.4)洗三次。然后将细胞溶解于1ml 0.1N NaOH中，并将0.5ml此溶液与3.5ml闪烁混合液(甲苯闪烁剂，Packard Bioscience B.V.Groningen，荷兰)混合并对氚含量进行分析。
实施例4：抗体6313抑制乳腺癌细胞粘附
进行了MCF-7细胞在细胞外基质蛋白上的细胞粘附测定研究。细胞培养(平底)96孔板用定量的经纯化人基质蛋白即胶原蛋白IV型(50μg/孔)进行包被。将它们于室温在层流柜过夜以蒸发水分。
将MCF-7细胞(获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)Manassas，VA 20108，美国)用6163/G2抗体处理48小时。对照不进行处理。在应用前，每孔用BSA(200μg/ml)处理以去除非特异结合。
将细胞培养液(DMEM)中500个MCF-7细胞加入到每孔中并于37℃在5％CO2环境中孵育1小时。然后将孔用无血清DMEM洗3次并用Diff-quick fix(7秒)、Diff quick I(7秒)及Diff quick II(10秒)染色，并用水洗一次。
在显微镜下观察每孔，对粘附细胞进行计数。抗体6313/G2显著降低了细胞粘附(P＜0.05)。用或不用抗体6313处理而粘附到胶原蛋白(50μg/孔)的MCF-7细胞数的结果在图3显示。
实施例5：抗体6313抑制乳腺癌细胞侵袭
进行了MCF-7细胞对细胞外基质蛋白的化学侵袭测定研究。用经纯化人胶原蛋白IV基质蛋白包被8μm滤膜插入物并于室温在层流柜中过夜干燥。MCF-7细胞用6163/G2抗体(杂交瘤上清)处理48小时。对照细胞不进行处理。
在应用前，将BSA(100μg/ml)加入每孔作用1小时。通过与3T3成纤维细胞孵育进行预处理的DMEM用作化学吸引剂。将经包被插入物置于每孔中以形成上层及下层区室。将10,000个MCF-7细胞加入到上层区室并加入无血清DMEM。经处理3T3细胞培养基置于下层区室。将板封盖并于37℃在潮湿的5％CO2环境中孵育24小时。
孵育后，将滤膜上表面剩余的细胞完全去除并且对透过胶原蛋白并附着在滤膜下表面的细胞用Diff-Quik染色并计数。结果在表4显示，显示了用及不用抗体6313处理而通过胶原蛋白(50微克/孔)侵袭的MCF-7细胞数。抗体6313显著抑制细胞侵袭(P＞0.01)。
实施例6：乳腺癌细胞中抗体6313对整联蛋白表达的作用
研究了抗体6313/G2对整联蛋白表达的作用。结果显示抗体6313显著降低整联蛋白α3及β1在乳腺癌细胞的表达。
MCF-7细胞系用抗体6313/G2处理48小时，对照不进行处理。制备细胞膜级分并通过非还原8％SDS-PAGE凝胶进行分离。
然后将蛋白质于4℃，30V过夜转移到硝酸纤维膜。用已建立的Western印迹法将整联蛋白α3及β1的第一抗体及第二抗体用于检测硝酸纤维膜上的组分。将膜在增强化学发光(ECL)western印迹检测试剂中孵育1分钟，通过hyper film ECL曝光对发光条带进行显影。结果在图5进行显示，其中C＝对照，A＝受试抗体，其它泳道(M)为分子量标记。
实施例7：在MCF-7细胞及RASMC中抗体6313对钙反应的作用
在MCF-7细胞及RASMC中抗体6313对钙反应的作用进行了研究。发现抗体6313刺激MCF-7细胞及RASMC的钙反应。
对于钙离子([Ca2+])的测定，将细胞在改良的Krebs-Ringer碳酸氢盐溶液(3.6mM K+，1.2mM Ca2+，0.5mM Mg2+，5mM Hepes和20mMHCO-)中装入1μM fura-2于37℃作用30分钟。为了同时测定fura-2的荧光，将置于盖玻片上的在经改良Krebs-Ringer碳酸氢盐溶液中的细胞放置在倒置显微镜(Zeiss)的载物台上。激发波长为340nm及380nm，并于510nm检测光的发射。自激发波长为340nm及380nm所产生的荧光强度比率对钙离子浓度([Ca2+])进行计算。
在MCF-7细胞及在RASMC中的结果在图6显示。垂直箭头表示抗体6313/G2应用的点。荧光强度比率增加与细胞内钙离子浓度是成比例的。
与保藏的微生物有关的声明
(PCT细则第13条之2)
A.以下声明涉及说明书第2页第1-7行和第8页第21-24行的微生物。
B.保藏鉴定
保藏机构名称：欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)
保藏机构地址：疫苗研究和生产实验室
公共健康实验部门
应用微生物学和研究中心
Porton Down，Salisbury
Willshire SP4 0JG，UK
保藏日期：1993年7月21日
保藏号：93072117
Claims (2)
1.由以保藏号93072117保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心的杂交瘤细胞系产生的6313/G2单克隆抗体用于制备治疗表达血管紧张素-II I型受体的癌的药物的用途。
2.权利要求1所述的用途，其中所述癌是前列腺癌或乳腺癌。
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