ES2713057T3 - Usos terapéuticos de anticuerpos monoclonales frente al receptor de la angiotensina II tipo 1 - Google Patents

Usos terapéuticos de anticuerpos monoclonales frente al receptor de la angiotensina II tipo 1 Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que se une al péptido que consiste en la secuencia EDGIKRIQDD para su uso en el tratamiento de la proliferación de células del músculo liso vascular (MLV).

Description

DESCRIPCION
Usos terapeuticos de anticuerpos monoclonales frente al receptor de la angiotensina II tipo 1
La presente invencion se refiere a usos terapeuticos de anticuerpos monoclonales frente al receptor de la angiotensina II tipo I, en particular en el tratamiento de la proliferacion de celulas del musculo liso vascular.
La angiotensina II desempena un papel esencial en la homeostasis de electrolitos en los mairnferos y en el control de la tension arterial (Peach Physiol. Rev 57313-370 (1977); Vinson et al "The Adrenal Cortex", Prentice Hall, Englefield Heights (1992)). Se han reconocido dos tipos principales de receptores de angiotensina II, designados tipos 1 y 2 (AT1 y AT2), pero la mayona de las acciones bien conocidas de la angiotensina II se producen a traves del subtipo AT1 (Herblin et al Am. J. Hypertens. 4299S-302S (1991); Ouali et al J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 43271-280 (1992)).
Se ha utilizado el anticuerpo monoclonal 6313/G2 para el subtipo de receptor AT 1 (Barker et al J. Mol. Endocrinol. 11 241-245 (1993)) para estudiar la distribucion del receptor (Vinson et al Mol. Med. Today 135-38 (1995)). El anticuerpo monoclonal se ha sugerido para su uso como agente terapeutico para controlar la vasoconstriccion, por ejemplo, en el tratamiento de la hipertension o las contracciones uterinas.
El anticuerpo se ha utilizado como un agente espedfico para la obtencion de imagenes en diversos tejidos, por ejemplo en el cancer de laringe (Marsigliante et al Cancer Letters 110 19-27 (1996)), rinon (Harrison-Bernard et al Am. J. Physiol. 42 F170-F177 (1997); Cheng et al Am. J. Physiol. 43 F10-F17 (1998)) y cerebro (Yang et al J. Neuroscience 17 1660-1669 (1997)). Se ha demostrado que el anticuerpo bloquea la internalizacion del receptor AT1 inducida por angiotensina II y la activacion de la PKC, pero que, por el contrario, estimula la respuesta de calcio (Kapas et al Biochem. Biophys. Res. Comm. 2041292-1298 (1994; Vinson et al J. Endocrinol. 141 R5-R9 (1994)). Se ha informado la presencia de receptores AT1 y At2 en tumores de mama con produccion local de angiotensina (Inwang et al Brit. J. Cancer 751279-1283 (1997); Tahmasebi et al Eur. J. Cancer 341777-1782 (1998)).
El anticuerpo monoclonal 6313/G2 es secretado por una lmea celular de hibridoma depositada el 21 de julio de 1993 en la Coleccion Europea de Cultivos Celulares Animales (ECACC, forma siglada de European Collection of Animal Cell Cultures), Porton Down, Reino Unido, bajo el Tratado de Budapest, y designada por el n.° de referencia 93072117. El deposito los realizaron el Dr Gavin P Vinson y el Dr Stewart Barker, Department of Biochemistry, Queen Mary & Westfield College, Mile End Road, Londres E1 4NS. El depositante ha autorizado al solicitante a referirse al material depositado en la solicitud y ha dado su consentimiento sin reservas e irrevocable para que el material depositado se ponga a disposicion del publico en conformidad con la Regla 28 (1)(d) del Convenio Europeo de Patentes.
La lmea celular de hibridoma produce un anticuerpo que se une espedficamente a los restos de aminoacido 8 a 17 del receptor AT1 del musculo liso vascular de rata, cuya secuencia tambien se encuentra en el receptor AT 1 de celulas humanas y bovinas. La secuencia del epftopo es la siguiente: EDGIKRIQDD
O, se expresa alternativamente como,
NH2-Glu-Asp-Gly-Ile-Lys-Arg-Ile-Gln-Asp-Asp-COOH.
Ahora se ha descubierto, sorprendentemente, que los anticuerpos monoclonales para la secuencia peptfdica que comprende la secuencia N-terminal del receptor de la angiotensina II tipo 1 tienen usos terapeuticos adicionales en determinadas afecciones medicas, donde tales usos no se habfan sugerido o mostrado previamente. Adicionalmente, estos efectos terapeuticos se observan en la capacidad de los anticuerpos monoclonales para bloquear las acciones daninas de la angiotensina II en las afecciones medicas correspondientes, mientras se conservan las acciones beneficiosas de la molecula. Se ha realizado ahora un papel funcional importante para toda la secuencia N-terminal.
Los aspectos de la invencion para la que se busca proteccion son como se definen en las reivindicaciones adjuntas. De acuerdo con un primer aspecto de la invencion, se proporciona el uso de un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo para un peptido que consiste en la secuencia
EDGIKRIQDD
para su uso en el tratamiento de la proliferacion de celulas del musculo liso vascular (MLV).
En lo anterior, y a lo largo de la presente memoria descriptiva, los restos de aminoacido se designan mediante la nomenclatura usual de una sola letra de la IUPAC. Las designaciones de una sola letra pueden correlacionarse con las designaciones clasicas de tres letras de los restos de aminoacido, de la siguiente manera:
A=Ala G = Gly M = Met S = Ser
C=Cys H = His N = Asn T = Thr
D = Asp I = Ile P=Pro V = Val
E=Glu K = Lys Q = Gln W = Trp
F = Phe L = Leu R=Arg Y=Tyr
Como se usa en el presente documento, el termino "peptido" incluye oligopeptido o polipeptido y estos terminos pueden usarse indistintamente.
En una realizacion preferente, la invencion abarca, por lo tanto, el uso de un anticuerpo monoclonal contra una secuencia peptfdica que consiste en la secuencia de aminoacidos:
EDGIKRIQDD.
Esta secuencia se toma de la secuencia del receptor de la angiotensina II tipo 1 de rata, restos 8 a 17. Las sustituciones conservativas en este fragmento senan D por E, E por D, A por G, L por I, R por K, K por R, N por Q, o cualquier combinacion de estas.
La secuencia EDGIKRIQDD esta completamente 100 % conservada entre las especies humana, de chimpance, murinas (AT1b) y (AT1b), bovina, canina, ovina, de conejo y rata (AT1b). Se observan variaciones en el resto 8 para cobaya que tiene Q, rata (AT1a) que tiene D y gerbo que tiene D. Las homologfas de secuencia para estas especies para la region 1 a 45 completa de la secuencia N-terminal se muestran en la Figura 9.
Por consiguiente, una secuencia de consenso preferente para el peptido correspondiente a los restos 8 a 17 del receptor de angiotensina II tipo 1 tiene la estructura:
EDGIKRIQDD
donde los siguientes restos pueden ser cada uno independientemente como sigue: el resto 8 pueden ser E, D o Q, el resto 9 pueden ser D o E, el resto 10 pueden ser D o A, el resto 11 pueden ser I o A, el resto 12 pueden ser K o R, el resto 13 pueden ser R o K, el resto 14 pueden ser I o A, el resto 15 pueden ser Q o N y los restos 16 y 17 pueden ser cada uno D o E.
El peptido, generalmente, sera antigenico y tendra la capacidad de estimular la produccion de anticuerpos que, cuando se administran, se pueden utilizar en el tratamiento del cancer.
Los subfragmentos activos alternativamente pueden consistir en o incluir heptapeptidos, incluyendo uno o mas de:
SSTEDGI
STEDGIK
TEDGIKR
EDGKRI
DGKRIQ
GDCRIQD
IKRIQDD
KRIQDDC
RIQDDCP
IQDDCPK
Adicionalmente, los subfragmentos activos pueden consistir en o incluir octapeptidos, incluyendo:
NSSTEDGI
SSTEDGK
STEDGIKR
TEDGIKRI
EDGIKRIQ
DGIKRIQD
GIKRIQDD
IKRIQDDC
KRIQDDCP
RIQDDCPK
IQDDCPKA
Adicionalmente, los subfragmentos activos pueden consistir en o incluir nonapeptidos, incluyendo:
LNSSTEDGI
NSSTEDGK
SSTEDGIKR
STEDGIKRI
TEDGKRIQ
EDGIKRIQD
DGEKRIQDD
GKRIQDDC
KRIQDDCP
KRIQDDCPK
RIQDDCPKA
IQDDCPKAG
Adicionalmente, los subfragmentos activos pueden consistir en o incluir decapeptidos, incluyendo:
ILNSSTEDGI
LNSSTEDGK
NSSTEDGKR
SSTEDGKRI
STEDGIKRIQ
TEDGKRIQD
EDGKRIQDD
DGKRIQDDC
GKRIQDDCP
KRIQDDCPK
KRIQDDCPKA
RIQDDCPKAG
IQDDCPKAGR
Los fragmentos preferentes incluyen los que contienen algunos, por ejemplo, al menos cuatro, restos de la secuencia EDGIKRIQDD.
Cabe destacar que pueden usarse combinaciones de mas de una de las secuencias anteriores.
Los peptidos y otras moleculas utilizadas para preparar anticuerpos monoclonales para su uso en conformidad con la invencion pueden volverse antigenicos, o presentarse, en una diversidad de modos. Por preferencia, una region antigenica (tal como un fragmento o subfragmento peptidico) en una molecula en conformidad con la invencion contendra la secuencia de aminoacidos de eleccion unida a un peptido o protema soporte. Generalmente, es preferente tener una pluralidad, por ejemplo, 5 a 10, de copias de una secuencia peptfdica (por ejemplo, una o mas de las secuencias anteriores) unidas al soporte. El soporte puede ser, por conveniencia, una protema en general grande, que sea inerte en aspectos materiales, y que procede de una especie o genero distinto del asociado con la hormona de crecimiento natural. Los ejemplos de vehmulos incluyen albuminas tales como seroalbumina humana, seroalbumina bovina y ovoalbumina (aunque en este ultimo caso es probable que no se puedan transportar tantos peptidos). Como alternativa, se puede usar hemocianina de lapa californiana. Generalmente, el soporte provendra preferentemente de una especie distinta de aquella en la que se basa el fragmento.
No es esencial que las secuencias peptfdicas como se describen anteriormente esten unidas a albuminas: puede estar unidas a otras macromoleculas, tales como p-galactosidasa, especialmente de origen bacteriano.
En el presente documento tambien se describe el uso de anticuerpos monoclonales para moleculas que son peptidos o que tienen regiones peptfdicas que comparten una homologfa de secuencia sustancial (por ejemplo, mayor que el 30 %, 50 % o incluso 70 %, adecuadamente, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %) con los peptidos anteriores. De forma similar, las sustituciones de aminoacidos conservativas pueden no disminuir la inmunogenicidad o antigenicidad de los peptidos. Por lo tanto, homologos antigenicamente similares suscitaran anticuerpos que se unen a los receptores de la angiotensina II tipo 1 en la misma region que definen los peptidos anteriores. Se sabe bien que el uso de homologos puede ser un medio para eludir la "auto" tolerancia. Por lo tanto, el uso de las secuencias correspondientes procedentes de otras especies puede ser ventajoso en la presente invencion.
Alternativamente, es posible que los anticuerpos monoclonales se preparen contra moleculas que son o que comprenden peptidos para que sean o incluyan polfmeros de secuencias como se describe anteriormente. Las secuencias apropiadas se pueden polimerizar mediante reticulacion de dos restos de cistema para formar enlaces disulfuro o mediante el uso de agentes de acoplamiento qmmico externos (tales como carbodiimida, glutaraldetudo u otros dialdetudos, o acidos di- (o poli-) carboxflicos funcionales. Como alternativa adicional, se podnan usar tecnicas de ADN recombinante para producir un polfmero peptfdico.
Cabe destacar que el acoplamiento qmmico (que podna tener lugar, por ejemplo, mediante restos de lisina) y la formacion de enlaces disulfuro no se limitan a cuando los restos de acoplamiento estan en el extremo de la secuencia: los restos internos tambien podnan ser apropiados. Los restos de acoplamiento, por ejemplo, los restos de cistema, pueden anadirse segun se desee.
Se puede encontrar que no sea necesario acoplar ninguna de las secuencias descritas anteriormente con peptidos externos. Pueden ser antigenicas por sf mismas. En dicho caso, puede ser aconsejable seleccionar adyuvantes particulares tales como DEAE dextrano y Merck 7426.
Los anticuerpos monoclonales para usar de acuerdo con la presente invencion se pueden preparar inmunizando ratones endogamicos mediante la tecnica tradicional de Kohler y Milstein (Nature 256 495-497 (1975)). Se puede sintetizar un peptido correspondiente a las secuencias de epftopos descritas anteriormente por cualquier via qmmica o biologica conveniente, el cual se conjuga despues con seroalbumina bovina (BSA), u otra molecula adecuada, y despues se usa para inmunizar a los ratones. Despues de una inyeccion de refuerzo del conjugado peptido-BSA, se extraen los bazos de los ratones y se combinan los esplenocitos con celulas de mieloma de raton. Los hforidos mixtos de mieloma-linfocito se pueden seleccionar despues por crecimiento en hipoxantina, timidina y aminopterina, en un medio de cultivo celular apropiado, para inhibir la proliferacion de las celulas de mieloma no fusionadas y de los hforidos de mieloma.
Las celulas de hibridoma se pueden explorar mediante ELISA por la reactividad contra al epftopo usado del receptor de la angiotensina II tipo 1, mediante adaptaciones de la tecnica descrita en Engvall et al Immunochem. 8871 (1991). Como alternativa, se puede usar la tecnica de captura por anticuerpos descrita en Beckmann et al J. Immunol. 144 4212 (1990). Las celulas de hibridoma positivas pueden inyectarse por via intraperitoneal en ratones Balb/c singenicos para producir ascitis que contengan altas concentraciones de los anticuerpos monoclonales generados contra el epftopo utilizado de la secuencia N-terminal del receptor de la angiotensina II tipo 1 descrito anteriormente. Como alternativa, las celulas de hibridoma se pueden cultivar in vitro en matraces o frascos rotativos mediante diversas tecnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en la ascitis del raton se pueden purificar por precipitacion con sulfato de amonio, seguido de cromatograffa de exclusion en gel. Como alternativa, se puede usar cromatograffa de afinidad basada en la union del anticuerpo a protema A o protema G, asf como cromatograffa de afinidad basada en la union al epftopo usado para generar el anticuerpo monoclonal. El anticuerpo monoclonal 6313/G2 se preparo como se describe en Barker et al J. Mol. Endocrinol. 11 241-245 (1993). Los usos del anticuerpo en el tratamiento de la hipertension y en el control de las contracciones uterinas se describieron en el documento WO-A-9509186. Sin embargo, no se sugirio ninguna utilidad mas amplia en otras areas terapeuticas potenciales.
El receptor de la angiotensina II tipo 1 de la rata se describe en Murphy et al Nature 351 233-236 (1992) y el dominio extracelular identificado como que contiene al menos los restos 8 a 17 esta representado por la secuencia de aminoacidos
EDGIKRIQDD.
Los epftopos de los restos 1 a 45 de la secuencia N-terminal, preferentemente, 8 a 17, del receptor de la angiotensina II tipo 1 descrito anteriormente pueden modificarse y variarse mediante la sustitucion, y/o insercion, y/o delecion de aminoacidos, de manera que la forma y/o la conformacion global del epftopo todavfa sea antigenica.
En realizaciones preferentes de la invencion, el anticuerpo monoclonal es 6313/G2. El anticuerpo monoclonal 6313/G2 es secretado por una lrnea celular de hibridoma depositada el 21 de julio de 1993 en la Coleccion Europea de Cultivos Celulares Animales (ECACC, forma siglada de European Collection of Animal Cell Cultures), Porton Down, Reino Unido, bajo el Tratado de Budapest, y designada por el n.° de referencia 93072117. La lrnea celular de hibridoma puede cultivarse adecuadamente en las condiciones normales.
La invencion tambien proporciona el uso de un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que se une a un peptido que consiste en la secuencia
EDGIKRIQDD
en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de la proliferacion de celulas del musculo liso vascular (MLV).
El tratamiento de la proliferacion de celulas de musculo liso vascular puede incluir el tratamiento de la ateroesclerosis, una enfermedad compleja que muestra una asociacion con la proliferacion de celulas del MLV.
Los anticuerpos utilizados en conformidad con la presente invencion pueden formularse para la inyeccion intravenosa usando adyuvantes y/o diluyentes farmaceuticamente aceptables apropiados. La inyeccion puede ser intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, incluyendo la inyeccion subcutanea. No estan excluidos otros modos de administracion, tales como, por ejemplo, por via oral a traves de liposomas, capsulas gastrorresistentes y similares.
De manera adecuada, los anticuerpos utilizados en conformidad con la presente invencion pueden ser anticuerpos humanizados, como se describe en los documentos US 4.816.567 y WO 94/10332; o microcuerpos, como se describe en el documento WO 94/09817; o anticuerpos transgenicos, como se describe en el documento GB-A-2272440. Dichas construcciones sinteticas incluyen moleculas quimericas. Por lo tanto, por ejemplo, los usos de los anticuerpos humanizados (o primatizados) o los derivados de los mismos estan dentro del ambito de la presente invencion. Un ejemplo de un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que tiene regiones marco conservadas humanas, pero tiene regiones hipervariables de roedor.
Ademas de los anticuerpos completes, la presente invencion incluye usos de derivados de los anticuerpos monoclonales definidos anteriormente que tienen la capacidad de unirse al epttopo seleccionado de la region N-terminal del receptor de la angiotensina II tipo 1 descrito anteriormente. Por lo tanto, la presente invencion tambien incluye usos de fragmentos de anticuerpos. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos se proporcionan en Dougall et al Tibtech 12372-379 (1994).
Los fragmentos de anticuerpo incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab, F(ab')2 y Fv (Roitt et al "Immunology", segunda edicion (1989), Churchill Livingstone, Londres). Los fragmentos Fv pueden modificarse para producir una construccion sintetica conocida como una molecula de Fv monocatenario (scFv). Esta incluye un enlazador peptfdico que une covalentemente las regiones Vh y V i, que contribuye a la estabilidad de la molecula.
Otras construcciones sinteticas incluyen peptidos CDR. Estos son peptidos sinteticos que comprenden determinantes de union a antigeno. Tambien se pueden usar peptidomimeticos. Estas moleculas son, habitualmente, anillos organicos conformacionalmente restringidos que imitan la estructura de un bucle de CDR y que incluyen cadenas laterales interactivas con el antfgeno. Los usos de tales moleculas capaces de unirse al epftopo deseado estan, por lo tanto, tambien dentro del ambito de la presente invencion.
Las caractensticas preferentes para los aspectos segundo y subsiguientes de la invencion son como para el primer aspecto, con los cambios que correspondan.
La invencion se describira adicionalmente ahora por medio de la referencia a los siguientes Ejemplos y Figuras, que se proporcionan solo con fines de ilustracion y no deben interpretarse como limitantes de la invencion. Se hace referencia a una serie de Figuras en las que:
La FIGURA 1 muestra los efectos del anticuerpo sobre la proliferacion de celulas PNTla.
La FIGURA 2 muestra los efectos del anticuerpo sobre la proliferacion de celulas del musculo liso aortico sometiendo a ensayo la captacion de timidina tritiada.
La FIGURA 3 muestra los resultados del ensayo de adhesion celular de celulas MCF-7 en protema de matriz extracelular.
La FIGURA 4 muestra los resultados del ensayo de quimioinvasion de celulas MCF-7 en protema de matriz extracelular.
La FIGURA 5 muestra los resultados de las transferencias de Western en el ensayo de expresion de integrinas alfa 3 y beta 1 en celulas de cancer de mama.
La FIGURA 6 muestra la estimulacion del anticuerpo 6313/G2 de las respuestas de calcio en celulas MCF-7.
La FIGURA 7 muestra la estimulacion del anticuerpo 6313/G2 de las respuestas de calcio en CMLAR.
La FIGURA 8 muestra un diagrama esquematico de las acciones de la angiotensina II, el sitio de activacion del anticuerpo monoclonal y el sitio de bloqueo del anticuerpo monoclonal.
La FIGURA 9 muestra las homologfas de secuencia para las secuencias N-terminales del receptor de la angiotensina II tipo 1 de distintas especies, donde "X" denota un resto ausente, y "-" denota un resto identico.
Ejemplo 1: El anticuerpo 6313/G2 inhibe la proliferacion celular en celulas de prostata PNT1A
La sal de tetrazolio, bromuro de 3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) se utiliza extensamente como un indicador de la actividad metabolica oxidativa celular. En la reduccion, el MTT forma un producto de formazan colorado de forma intensa, que se puede medir colorimetricamente y, por lo tanto, se usa a menudo para la evaluacion cuantitativa de la viabilidad y proliferacion celulares.
PNT1a, una Imea de celulas epiteliales de prostata, se sembro en una placa de cultivo de 96 pocillos a una concentracion de 1000 celulas por pocillo. Las celulas se cultivaron en presencia de medio RPM I 1640 complementado con L-glutamina 2 mM, aminoacidos no esenciales al 1 %, penicilina y estreptomicina al 2 % y piruvato de sodio 1 mM, suero fetal bovino al 10 %, durante dos dfas, y posteriormente se hicieron latentes mediante la incubacion en medio sin suero RPMI 1640 (200 pl/pocillo) durante 24 h. Despues se anadieron estimulantes a la concentracion apropiada y se incubaron durante 24 horas y 96 horas. Cuatro horas antes del final de la incubacion, se anadieron 20 pl de solucion (en medio RPMI) de MTT 5 mg/ml filtrada (tamano de poro de 0,2 pm) a cada pocillo y la incubacion continuo a 37 °C. En el momento apropiado, se anadieron a cada pocillo 200 pl de DMSO, seguido de 25 pl de tampon de glicina de Sorensen (glicina 0,1 M, NaCI 0,1 M ajustado a pH 10,5 con NaOH 1 M), se mezclo minuciosamente. Despues de 5 minutos, se leyo la absorbancia a 545 nm.
Los resultados se muestran en la Figura 1, en que se anadio anticuerpo (Ac) purificado a celulas PNT1a en cultivo. Las concentraciones de anticuerpo fueron (1:1600) 100 nmol/l, (1:160) 1 pmol/l, (1:16) 10 gmol/l. La inhibicion de la proliferacion fue significativa (P<0,05 o mejor) en todas las concentraciones de anticuerpo utilizadas.
Ejemplo 2: El anticuerpo 6313/G2 inhibe la proliferacion celular en celulas de musculo liso vascular
Se aislaron las CMLA de la arteria aortica toracica y abdominal de rata (CMLSR) y de aorta de bovino (CMLAB) mediante el metodo de explante en medio y se cultivaron durante varios pases. Se obtuvieron segmentos de aorta tanto abdominal como toracica de ratas mediante diseccion cuidadosa de ratas muertas. Se obtuvieron segmentos de aorta de terneros con anestesia. Los segmentos de aorta se colocaron en un portaobjetos excavado que contema medio de cultivo tisular, despues de lo cual la adventicia y la porcion externa de cada segmento se eliminaron cuidadosamente al microscopio de diseccion. La porcion interna restante del tejido y la mtima se retiraron a una placa de diseccion distinta y se lavaron varias veces con medio de cultivo recien preparado. En este punto, cada segmento se corto en cuadrados de aproximadamente 1 mm y se coloco en un matraz de cultivo de tejidos de 25 cm2. Los matraces se taparon sin apretar y se colocaron en una incubador de CO2 humidificado. Despues de dos horas, 4 ml de medio de cultivo RPMI-1640 complementado con 100 unidades/ml de penicilina, estreptomicina 100 pg/ml, L-glutamina 4 pmol/l y SFB al 20 %, se anadieron cuidadosamente a los matraces sin desplazar el tejido. Despues de una semana se anadio medio fresco a las muestras. Las celulas de los explantes estaban relativamente confluentes al cabo de un penodo de aproximadamente 2 semanas. Despues, se enjuagaron con PBS y posteriormente se trataron con tripsina, con una solucion de tripsina al 0,125 % y e Dt A al 0,02 % en PBS durante 1-2 minutos a 37 °C. La suspension de celulas resultante se pipeteo en matraces de cultivo de tejidos de 75 cm2 que conteman 10 ml de medio de cultivo y, se incubo como anteriormente. Los experimentos se realizaron con celulas de los pases 3-5.
Se preparo una suspension de CMLAR (105 celulas/ml) el primer dfa del experimento utilizando RPMI-1640 complementado con SFB al 20 %. Se distribuyo un ml de esta suspension celular a cada pocillo de una placa multipocillo de 24 pocillos. El medio se reemplazo 24 h despues del subcultivo con medio RPMI-1640. Las celulas latentes (sin suero) o repletas de suero se incubaron con los medios experimentales apropiados durante 48 horas, con 4 pocillos por grupo. Se anadio 10 pl de 3H-metiltimidina (0,1 mCi/ml) a cada pocillo (1 ml de medio/pocillo). 24 horas despues de la adicion de timidina radiactiva, se aspiro el medio y las celulas cultivadas se enjuagaron 3 veces con PBS fno. Las celulas se disolvieron despues en 0,5 ml de NaOH 0,1 N y se mezclo una almuota de 0,3 ml con 3,5 ml de lfquido de centelleo y, despues de dejar durante la noche a temperatura ambiente, se sometio a ensayo el contenido de tritio en un contador de centelleo lfquido.
Los resultados se muestran en la Figura 2, en que la proliferacion se estimulo con angiotensina II 10 nmol/l y se inhibio con 6313/G2 (10 pmol/l, **P<0,01).
Ejemplo 3: El anticuerpo 6313/G2 inhibe la proliferacion celular en celulas de cancer de mama
Se sembraron celulas MCF-7 (obtenidas de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC, forma siglada de American Type Culture Collection) Manassas, VA 20108, EE. UU.) en placas de 24 pocillos a una densidad de 5000 celulas por pocillo y se cultivaron durante 24 horas en Medio Esencial Mmimo de Eagles (MEM) que contema suero fetal bovino al 5% (SFB). Las celulas se incubaron a continuacion durante 24 horas adicionales en medio sin suero. Despues de esto, las celulas se cultivaron en medio sin suero solo (pocillos de control) o en medio sin de suero con adicion a los pocillos experimentales de angiotensina II sola (1-10 nM), o con el anticuerpo 6313/G2. Cada tratamiento se realizo por cuadruplicado. A continuacion, las celulas se cultivaron durante 24 horas. Despues de 20 horas, se anadio timidina tritiada a cada pocillo (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, RU, 50 pCi/ml, actividad esp.
5 Ci/mmol) y las celulas se cultivaron durante 4 horas adicionales. Al final de este penodo, el medio se aspiro y las celulas cultivadas se enjuagaron tres veces con una solucion de tampon enfriada en hielo (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4). Las celulas se disolvieron despues en 1 ml de NaOH 0,1 N y 0,5 ml de esta solucion se mezclaron con 3,5 ml de coctel de centelleo (centelleador de tolueno, Packard Bioscience B.V. Groningen, Pafses Bajos) y se analizo el contenido de tritio.
Ejemplo 4: El anticuerpo 6313 inhibe la adhesion de celulas de cancer de mama
Se llevo a cabo un ensayo de adhesion celular de celulas MCF-7 en protema de matriz extracelular para investigar. Se recubrieron placas de cultivo celular de 96 pocillos (de fondo plano) con cantidades graduadas de protema de matriz humana purificada, colageno tipo IV (50 pg/pocillo). Se dejaron toda la noche en una cabina de flujo laminar para evaporarse, a temperatura ambiente.
Se trataron celulas MCF-7 (obtenidas de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC) Manassas, VA 20108, USA) con anticuerpo 6163/G2 durante 48 horas. Los controles no estaban tratados. Antes de usarse, se trato cada pocillo con BSA (200 pg/ml) para eliminar la union no espedfica.
Se anadieron a cada pocillo 500 celulas MCF-7 en medio de cultivo celular (DMEM) y se incubaron a 37 °C en un ambiente de CO2 al 5 % durante 1 hora. Despues, los pocillos se lavaron 3 veces con DMEM sin suero y se tineron con Diff-quick fix (7 segundos), Diff quick I (7 segundos) y Diff quick II (10 segundos) y se lavaron una vez con agua.
Despues, los pocillos se observaron al microscopio y se conto el numero de celulas adheridas. El anticuerpo 6313/G2 redujo significativamente la adhesion celular (P <0,05). Los resultados se muestran en la Figura 3, como el numero de celulas MCF-7 adheridas a colageno (50 pg/pocillo) frente a los tratamientos con y sin anticuerpo 6313.
Ejemplo 5: El anticuerpo 6313 inhibe la invasion de celulas de cancer de mama
Se llevo a cabo un ensayo de quimioinvasion de celulas MCF-7 sobre protema de matriz extracelular para investigar. Se recubrieron insertos de filtro de 8 pm con protema de matriz colageno tipo IV humano purificado y se dejaron durante la noche en una cabina de flujo laminar para secar a temperatura ambiente. Las celulas MCF-7 se trataron con anticuerpo 6163/G2 (sobrenadante de hibridoma) durante 48 horas. Los controles de celulas no estaban tratados. Antes de usarse, Se anadio BSA (100 pg/ml) a cada pocillo durante 1 hora. Se utilizo como factor quimiotactico DMEM precondicionado por incubacion con fibroblastos 3T3. Los insertos recubiertos se colocaron en cada pocillo para formar una camara superior y una inferior. Se anadieron 10.000 celulas MCF-7 en la camara superior, con la adicion de DMEM sin suero. El medio de celulas 3T3 condicionado se coloco en el compartimento inferior. Las placas se cubrieron e incubaron a 37 °C en un ambiente humidificado con CO2 al 5 % durante 24 horas.
Despues de la incubacion, las celulas que permanedan en la superficie superior del filtro se retiraron por completo y las celulas que habfan atravesado el colageno y se habfan unido a la superficie inferior del filtro se tineron con Diff-Quik, y se contaron. Los resultados se muestran en la Figura 4, como el numero de celulas MCF-7 que invadieron el colageno (50 pu/pocillo) frente a los tratamientos con y sin anticuerpo 6313. El anticuerpo 6313 inhibio significativamente la invasion celular (P <0,01).
Ejemplo 6: Efecto del anticuerpo 6313 sobre la expresion de integrina en celulas de cancer de mama
Se investigo el efecto del anticuerpo 6313/G2 sobre la expresion de integrina. Los resultados muestran que el anticuerpo 6313 reduce significativamente la expresion de las integrinas alfa 3 y beta 1 en celulas de cancer de mama. Las lmeas celulares MCF-7 se trataron durante 48 horas con el anticuerpo 6313/G2, los controles no estaban tratados. Se prepararon fracciones de membranas celulares y se fracciono en gel de SDS-PAGE al 8 % no reducido.
Las protemas se transfirieron despues a una membrana de nitrocelulosa durante una noche, a 30 V a 4 °C.
Se utilizaron anticuerpos primarios y secundarios para las integrinas a3 y p1 para detectar estos componentes en las membranas de nitrocelulosa utilizando metodos establecidos para transferencia de Western. Las bandas luminiscentes se revelaron mediante la incubacion de la membrana en reactivos de deteccion de transferencias de Western de quimioluminiscencia potenciada (ECL) durante 1 minuto, mediante la exposicion a hyper film ECL. Los resultados se muestran en la figura 5, en que, C = control, A = anticuerpo analizado, los otra calles (M) son los marcador de peso molecular.
Ejemplo 7: Efecto del anticuerpo 6313 sobre las respuestas de calcio en celulas MCF-7 y en CMLAR
Se investigo el efecto del anticuerpo 6313 sobre las respuestas de calcio en celulas MCF-7 y en CMLAR. Se encontro en ambas que el anticuerpo 6313 estimulaba la respuesta de calcio.
Para la medicion del ion calcio ([Ca2+]), las celulas se cargaron con fura-2 1 pM durante 30 minutos en medio de solucion de bicarbonato de Ringer modificada por Krebs (K+ 3,6 mM, Ca2+ 1,2 mM, Mg2+ 0,5 mM, Hepes 5 mM y HCO' 20 mM ) a 37 °C. Para mediciones simultaneas de medicion de la fluorescencia de fura-2, las celulas sembradas en placa en cubreobjetos se montaron en la pletina de un microscopio invertido (Zeiss) en solucion de bicarbonato de Ringer modificada por Krebs. Las longitudes de onda de excitacion fueron 340 nm y 380 nm, y la emision se detecto a 510 nm. La concentracion del ion calcio ([Ca2+]) se calculo a partir de la relacion de intensidades de fluorescencia a las longitudes de onda de excitacion de 340 nm y 380 nm.
Los resultados se muestran en la Figura 6, en celulas MCF-7 y en CMLAR. La flecha vertical indica el punto de aplicacion de anticuerpo 6313/G2. El aumento de la relacion de intensidades de fluorescencia es proporcional a la concentracion de ion calcio intracelular.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que se une al peptido que consiste en la secuencia EDGIKRIQDD
para su uso en el tratamiento de la proliferacion de celulas del musculo liso vascular (MLV).
2. El uso de un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que se une al peptido que consiste en la secuencia EDGIKRIQDD
en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de la proliferacion de celulas del MLV.
3. El anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, o el uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en que el anticuerpo monoclonal se genera contra el peptido EDGIKRIQDD.
4. El anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 3, o el uso de acuerdo con la reivindicacion 2 o la reivindicacion 3, en que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado.
5. El anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 4, o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en que el anticuerpo monoclonal es 6313/G2 producido por la lmea celular de hibridoma designada por el n°. de referencia 93072117 de la Coleccion Europea de Cultivos Celulares Animales (ECACC) o un anticuerpo humanizado del mismo.
6. El anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 5, o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en que el fragmento es un fragmento Fab, F(ab')2 o Fv o una molecula de Fv monocatenario (scFv).
7. El anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 6, o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde dicho tratamiento de la proliferacion de celulas del MLV es para la ateroesclerosis.
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