PT2852408T - Terapia de combinação que envolve anticorpos contra claudina 18.2 para tratamento de cancro - Google Patents

Description

DESCRIgAO "TERAPIA DE COMBINAQÁO QUE ENVOLVE ANTICORPOS CONTRA CLAÜDINA 18.2 PARA TRATAMENTO DE CANCRO"

Os cancros do estomago e do esófago (gastroesofágico; GE) estao entre as malignidades com a maior necessidade médica nao atendida. 0 cancro gástrico é a segunda causa principal de morte por cancro em todo o mundo. A incidencia de cancro esofágico tem aumentado ñas últimas décadas, coincidindo com um deslocamento em tipo histológico e localizagáo de tumor primário. 0 adenocarcinoma do esófago é agora mais predominante que o carcinoma de célula escamosa nos Estados Unidos e Europa Ocidental, com a maioria dos tumores situada no esófago distal. A taxa geral de sobrevivencia de cinco anos para cancro GE é de 20 a 25%, apesar da agressividade do tratamento padrao estabelecido associado a efeitos secundários substanciáis. A maioria dos pacientes apresenta a doenga metastática ou localmente avangada e tem que ser submetida á quimioterapia de primeira linha. Os regimes de tratamento sao baseados numa cadeia principal de derivados de fluoropirimidina e platina principalmente combinados com um terceiro composto (por exemplo, taxanos ou antraciclinas). Aínda assim, a sobrevivencia livre de progressáo mediana de 5 a 7 meses e sobrevivencia total mediana de 9 a 11 meses sao o melhor que se pode esperar. A falta de um beneficio maior dos diversos regimes de quimioterapia de combinagao da geragáo mais recente para esses cancros tem estimulado a pesquisa sobre o uso de agentes direcionados. Recentemente, para cancros gastroesofágico positivos para HeR2 /neu, o Trastuzumab foi aprovado. No entanto, apenas ~20% dos pacientes expressam o alvo e sao elegíveis para este tratamento, assim, a necessidade médica aínda é alta. Vários documentos da técnica anterior sugerem urna terapia de combinagao de anticorpos e agentes citotóxicos. Por exemplo, o documento da técnica anterior n° W02011/090005 descreve o tratamento de pacientes que sofrem de um cancro colorretal com urna combinagao de irinotecano e um anticorpo contra A33, urna proteína de membrana do tipo I e marcador tumoral. 0 documento da técnica anterior n° W02010/009794 descreve o tratamento de células de cancro esofágico-gástrico com anticorpos contra EGFR em combinagao com epirubicina, cisplatina e capecitabina. 0 documento da técnica anterior Kobunai et al. 2011 (Anticancer Res. 31: 3691-3696) descreve a utilizagao de anticorpos dirigidos a EGFR em combinagao com 5-FU. A molécula de jungao firme variante de splicing 2 de Claudina 18 (Claudina 18.2 (CLDN18.2)) é um membro da familia de claudina de proteínas de jungao firme. CLDN18.2 é urna proteína transmembranar de 27,8 kDa que compreende quatro dominios de expansao de membrana com duas algas extracelulares pequeñas.

Em tecidos normáis, nao há expressao detetável de CLDN18.2 por RT-PCR com a excegao do estomago. A imuno-histoquímica com anticorpos específicos de CLDN18.2 revela o estomago como o único tecido positivo. CLDN18.2 é um antigénio de linhagem gástrica altamente seletivo expresso exclusivamente em células epiteliais gástricas diferenciadas de vida curta. CLDN18.2 é mantido no curso da transformagao maligna e, assim, frequentemente exibido sobre a superficie de células de cancro gástrico humanas. Ademáis, este antigénio pan-tumoral é ectopicamente ativado em niveis significativos em adenocarcinomas esofágicos, pancreáticos e do pulmao. A proteina CLDN18.2 também está localizada em metástases de ganglio linfático de adenocarcinomas de cancro gástrico e em metástases distantes especialmente no ovário (chamados de tumores e Krukenberg). 0 anticorpo IgGl quimérico IMAB362 que é dirigido contra CLDN18.2 foi desenvolvido por Ganymed Pharmaceuticals AG. IMAB362 reconhece o primeiro dominio extracelular (ECD1) de CLDN18.2 com alta afinidade e especificidade. IMAB362 nao se liga a qualquer outro membro da familia de claudina incluindo a variante de splicing 1 estritamente relacionada de Claudina 18 (CLDN18.1). IMAB362 mostra especificidade de célula tumoral precisa e agrupa quatro mecanismos de agáo independentes altamente potentes. Mediante a ligagáo alvo, IMAB362 media o exterminio de célula por ADCC, CDC e indugao de apoptose induzida por reticulagáo do alvo na superficie de célula tumoral e dirige a inibigáo de proliferagao. Dessa forma, IMAB362 lisa de modo eficaz células positivas para CLDN18.2, incluindo linhagens de células de cancro gástrico humanas in vi tro e in vivo. Os murganhos contendo linhagens de células de cancro positivas para CLDN18.2 tém um beneficio de sobrevivencia e até 40% dos murganhos mostram regressáo de seu tumor quando tratados com IMAB362. A toxicidade e perfil de PK/TK de IMAB362 foram cuidadosamente examinados em murganhos e macacos cinomolgos incluindo estudos de determinagáo das doses, estudos de toxicidade de dose repetida de 28 dias em cinomolgos e um estudo de toxicidade de dose repetida 3 meses em murganhos. As doses repetidas de IMAB362 i.v. tanto de murganhos (administragáo semanal de duragáo de tratamento mais longa por 3 meses, niveis de dose mais altos 400 mg/kg) como de macacos cinomolgos (até 5 aplicagóes semanais de até 100 mg/kg) foram bem toleradas. Nenhum sinal de toxicidade sistémica ou local é induzido. Específicamente, nenhuma toxicidade gástrica foi observada em qualquer estudo de toxicidade. IMAB362 nao induz a ativagáo imunológica e libertagáo de citocina. Nenhum efeito adverso em órgáos reprodutores masculinos ou femininos foi registrado. IMAB362 nao se liga a tecidos desprovidos do alvo. Os estudos de biodistribuigáo em murganhos indicam que a razáo da falta de toxicidade gástrica é mais provavelmente a compartimentalizagáo de jungóes firmes no sitio luminal em epitélios gástricos saudáveis, que parece prejudicar profundamente a acessibilidade do epítopo de IMAB362. Esta compartimentalizagáo é perdida mediante a transíormagáo maligna que torna o epítopo adequado num fármaco por IMAB362. IMAB362 encontra-se nos primeiros testes clínicos. Um estudo clínico de fase I foi conduzido em ser humano. 5 coortes de dose (33 mg/m2, 100 mg/m2, 300 mg/m2, 600 mg/m2, 1000 mg/m2) de 3 pacientes, cada, receberam urna única administragáo intravenosa de IMAB362 e foram observados durante 28 dias. IMAB362 foi muito bem tolerado, com nenhuma observagáo de seguranga relevante nos pacientes. Num paciente, todos os marcadores tumorais medidos diminuíram significativamente dentro de 4 semanas após o tratamento. Num estudo clínico de fase lia em andamento, o IMAB362 é dado repetitivamente.

Aquí, apresentam-se dados que demonstram que os agentes quimioterapéuticos podem estabilizar ou aumentar a expressáo de CLDN18.2 sobre a superficie de células de cancro resultando numa suscetibilidade a fármaco intensificada de CLDN18.2 por um anticorpo anti-CLDN18.2, como IMAB362. Um efeito sinérgico de um anticorpo anti-CLDNl8.2, como IMAB362, como regimes guimioterapéuticos, em particular, regimes guimioterapéuticos utilizados para o tratamento de cancro gástrico ou tratamento de cancros sólidos humanos foi observado. As células de cancro humanas pré-tratadas com quimioterapia sao mais suscetiveis ao exterminio especifico de alvo induzido por anticorpo. Em modelos de tumor do murganho, o controlo de tumor com um anticorpo anti-CLDN18.2 mais quimioterapia é superior áquele com um anticorpo anti-CLDNl 8. 2 como único agente.

Adicionalmente, os dados apresentados no presente documento indicam que os bisfosfonatos, como ácido zoledrónico (ZA) , em particular, quando administrados em conjunto com interleucina-2 recombinante (IL-2), aumentam ainda mais a atividade de um anticorpo anti-CLDN18.2, como IMAB362. 0 mecanismo subjacente é a ativagáo e expansáo de urna populagáo de células imunes altamente citotóxicas (células T γ9δ2).

SUMARIO DA INVENQÁO A presente invengáo fornece, em geral, urna terapia de combinagáo para tratar e/ou prevenir de modo eficaz doengas associadas a células que expressam CLDN18.2, incluindo doengas de cancro, como cancro gástrico, cancro esofágico, cancro pancreático, cancro do pulmáo, como cancro do pulmáo de célula nao pequeña (NSCLC), cancro dos ovários, cancro do colon, cancro hepático, cancro da cabega e pescogo e cancro da vesícula biliar e metástases dos mesmos, em particular, metástase de cancro gástrico, como tumores de Krukenberg, metástases peritoneal metástase de ganglio linfático. As doengas de cancro particularmente preferenciais sao adenocarcinomas do estomago, do esófago, do duto pancreático, dos dutos biliares, do pulmáo e doa ovários.

Num aspeto, a presente instrugáo fornece um método para tratamento ou prevengáo de urna doenga de cancro que compreende administrar a um paciente um anticorpo que tem a capacidade de se ligar a CLDN18.2 em combinaqáo com um agente que estabiliza ou aumenta a expressáo de CLDN18.2. A expressáo de CLDN18.2 é, de preferencia, na superficie celular de urna célula de cancro. 0 agente que estabiliza ou aumenta a expressáo de CLDN18.2 pode ser administrado antes de, simultáneamente com ou após a administragao do anticorpo que tem a capacidade de se ligar a CLDN18.2, ou urna combinagáo dos mesmos. 0 agente que estabiliza ou aumenta a expressáo de CLDN18.2 pode ser um agente citotóxico e/ou citostático. Numa modalidade, o agente que estabiliza ou aumenta a expressáo de CLDN18.2 compreende um agente que induz urna interrupgáo do ciclo celular ou urna acumulagáo de células numa ou mais fases do ciclo celular, de preferencia, numa ou mais fases do ciclo celular além da fase G1. 0 agente que estabiliza ou aumenta a expressáo de CLDN18.2 pode compreender um agente selecionado do grupo que consiste em antraciclinas, compostos de platina, análogos de nucleósido, taxanos e análogos de camptotecina, ou pró-fármacos dos mesmos, e combinagóes dos mesmos. 0 agente que estabiliza ou aumenta a expressáo de CLDN18.2 pode compreender um agente selecionado do grupo que consiste em epirubicina, oxaliplatina, cisplatina, 5-fluorouracilo ou pró-fármacos dos mesmos, como capecitabina, docetaxel, irinotecano e combinagóes dos mesmos. 0 agente que estabiliza ou aumenta a expressao de CLDN18.2 pode compreender urna combinagao de oxaliplatina e 5-fluorouracilo ou pró-fármacos dos mesmos, urna combinagao de cisplatina e 5-fluorouracilo ou pró-fármacos dos mesmos, urna combinagao de pelo menos urna antraciclina e oxaliplatina, urna combinagao de pelo menos urna antraciclina e cisplatina, urna combinagao de pelo menos urna antraciclina e 5-fluorouracilo ou pró-fármacos dos mesmos, urna combinagao de pelo menos um taxano e oxaliplatina, urna combinagao de pelo menos um taxano e cisplatina, urna combinagao de pelo menos um taxano e 5-fluorouracilo ou pró-fármacos dos mesmos, ou urna combinagao de pelo menos um análogo de camptotecina e 5-fluorouracilo ou pró-fármacos dos mesmos. 0 agente que estabiliza ou aumenta a expressao de CLDN18.2 pode ser um agente que induz a morte celular imunogénica. 0 agente que induz a morte celular imunogénica pode compreender um agente selecionado do grupo que consiste em antraciclinas, oxaliplatina e combinagóes das mesmas. 0 agente que estabiliza ou aumenta a expressao de CLDN18.2 pode compreender urna combinagao de epirubicina e oxaliplatina. Numa modalidade, o método da invengáo compreende administrar pelo menos urna antraciclina, pelo menos um composto de platina e pelo menos um de 5-fluorouracilo e pró-fármacos dos mesmos. A antraciclina pode ser selecionada do grupo que consiste em epirubicina, doxorubicina, daunorubicina, idarubicina e valrubicina. De preferencia, a antraciclina é epirubicina. 0 composto de platina pode ser selecionado do grupo que consiste em oxaliplatina e cisplatina. 0 análogo de nucleósido pode ser selecionado do grupo que consiste em 5-fluorouracilo e pró-fármacos do mesmo. 0 taxano pode ser selecionado do grupo que consiste em docetaxel e paclitaxel. 0 análogo de camptotecina pode ser selecionado do grupo que consiste em irinotecano e topotecano. Numa modalidade, o método da invengáo compreende administrar (i) epirubicina, oxaliplatina e 5-fluorouracilo, (ü) epirubicina, oxaliplatina e capecitabina, (iii) epirubicina, cisplatina e 5-fluorouracilo, (iv) epirubicina, cisplatina e capecitabina ou (v) ácido folinico, oxaliplatina e 5-fluorouracilo.

Numa modalidade, o método descrito no presente documento compreende adicionalmente administrar um agente que estimula células T γδ. Numa modalidade, as células T y5 sao células T Vy9V52. Numa modalidade, o agente que estimula células T γδ é um bisfosfonato, como um bisfosfonato que contém nitrogénio (aminobisfosfonato). Numa modalidade, o agente que estimula células T γδ é selecionado do grupo que consiste em ácido zoledrónico, ácido clodrónico, ácido ibandrónico, ácido pamidrónico, ácido risedrónico, ácido minodrónico, ácido olpadrónico, ácido alendrónico, ácido incadrónico e sais dos mesmos. Numa modalidade, o agente que estimula células T γδ é administrado em combinagao com a interleucina-2. 0 método descrito no presente documento pode compreender adicionalmente administrar pelo menos um agente quimioterapéutico adicional que pode ser um agente citotóxico. 0 anticorpo que tem a capacidade de se ligar a CLDN18.2 pode ligar-se a epitopos nativos de CLDN18.2 presentes sobre a superficie de células vivas. Numa modalidade, o anticorpo que tem a capacidade de se ligar a CLDN18.2 liga-se á primeira alga extracelular de CLDN18.2. Numa modalidade, o anticorpo que tem a capacidade de se ligar a CLDN18.2 media o exterminio celular por meio de um ou mais lises mediados por citotoxicidade dependente de complemento (CDC), lise mediada por citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), indugáo de apoptose e inibigáo de proliferagáo. Numa modalidade, o anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2 é um anticorpo monoclonal, quimérico ou humanizado, ou um fragmento de um anticorpo. Numa modalidade, o anticorpo que tem a capacidade de se ligar a CLDN18.2 é um anticorpo selecionado do grupo que consiste em (i) um anticorpo produzido por meio de e/ou obtenivel a partir de um clone depositado sob o n° de acesso DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 ou DSM ACC2810, (ii) um anticorpo que é urna forma quimerizada ou humanizada do anticorpo sob (i), (iii) um anticorpo que tem a especificidade do anticorpo sob (i) e (iv) um anticorpo que compreende a porgao de ligagao ao antigénio ou sitio de ligagao ao antigénio, em particular, a regiao variável, do anticorpo sob (i) e, de preferencia, que tem a especificidade do anticorpo sob (i). Numa modalidade, o anticorpo é acoplado a um agente terapéutico, como urna toxina, um radioisótopo, um fármaco ou um agente citotóxico.

Numa modalidade, o método da invengáo compreende administrar o anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2 a urna dose de até 1000 mg/m2. Numa modalidade, o método da invengáo compreende administrar o anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2 repetidamente a urna dose de 300 a 600 mg/m2.

Numa modalidade, o cancro é positivo para CLDN18.2. Numa modalidade, a doenga de cancro é selecionada do grupo que consiste em cancro gástrico, cancro esofágico, cancro pancreático, cancro do pulmáo, cancro dos ovários, cancro do colon, cancro hepático, cancro da cabega e pescogo, cancro da vesícula biliar e a metástase dos mesmos. A doenga de cancro pode ser um tumor de Krukenberg, metástase peritoneal e/ou metástase de ganglio linfático. Numa modalidade, o cancro é um adenocarcinoma, em particular, um adenocarcinoma avangado. Numa modalidade, o cancro é selecionado do grupo que consiste em cancro do estomago, cancro do esófago, em particular, do esófago inferior, cancro da jungáo esogástrica e cancro gastroesofágico. 0 paciente pode ser um paciente negativo para HER2 /neu ou um paciente com status positivo para HER2 /neu, mas nao elegível para a terapia de trastuzumab.

De acordo com a invengao, CLDN18.2 tem, de preferencia, a sequéncia de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 1.

Num aspeto adicional, a presente instrugáo fornece urna preparagáo médica que compreende um anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2 e um agente que estabiliza ou aumenta a expressáo de CLDN18.2. A preparagáo médica da presente instrugáo pode compreender adicionalmente um agente que estimula células T γδ. 0 anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2 e o agente que estabiliza ou aumenta a expressáo de CLDN18.2, e opcionalmente o agente que estimula células T γδ, podem estar presentes na preparagáo médica numa mistura ou separados um do outro. A preparagáo médica pode ser um kit que compreende um primeiro recipiente que incluí o anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2 e um recipiente que incluí o agente que estabiliza ou aumenta a expressáo de CLDN18.2, e opcionalmente um recipiente que incluí o agente que estimula as células T γδ. A preparagao médica pode incluir, aínda, instrugóes impressas para a utilizagao da preparagao para o tratamento de cancro, em particular para a utilizagao da preparagao num método da invengao. As modalidades diferentes da preparagao médica e, em particular, do agente que estabiliza ou aumenta a expressao de CLDN18.2 e o agente que estimula as células T γδ sao conforme descrito acima para o método da instrugao. A presente instrugao também fornece os agentes descritos no presente documento, como o anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2 para utilizagao nos métodos descritos no presente documento, por exemplo, para a administragao em combinagao com um agente que estabiliza ou aumenta a expressao de CLDN18.2 e opcionalmente um agente que estimula as células T γδ.

Outros recursos e vantagens da presente invengao seráo evidentes a partir da descrigao detalhada e reivindicagóes a seguir.

BREVE DESCRIQAO DOS DESENHOS

Figura 1. Efeito de quimioterapia em células de cancro gástrico. A cultivagáo de células KatoIII durante 96 horas leva a urna interrupgao do ciclo celular na fase G0/G1 e regulagáo descendente de CLDN18.2. Os compostos citostáticos que resultam numa interrupgao do ciclo celular em fases diferentes do ciclo celular (fase S (5-FU) ou fase G2 (epirubicina)) estabilizam a expressao de CLDN18.2.

Figura 2. Efeito de quimioterapia em células de cancro gástrico, a/b: Efeito de quimioterapia em niveis de proteina e transcrigáo de CLDN18.2 em células de cancro gástrico, c: Citometria de fluxo de ligaqáo de IMAB362 extracelular em células de cancro gástrico tratadas com agentes quimioterapéuticos.

Figura 3. Efeito de quimioterapia em células de cancro gástrico. Os compostos citostáticos que resultam numa interrupgáo do ciclo celular em fases diferentes do ciclo celular (fase S/G2 (irinotecano) ou fase G2 (docetaxel)).

Figura 4. Exterminio mediado por ADCC induzida por IMAB362 de células de cancro gástrico após pré-tratamento com agentes quimioterapéuticos.

Figura 5. Efeito de quimioterapia em células de cancro gástrico, a: As células tratadas com irinotecano, Docetaxel ou Cisplatina exibem um nivel mais baixo de células viáveis em comparagáo com as células-alvo cultivadas em meio. b: A expressáo de CLDN18.2 em células tratadas com Irinotecano, Docetaxel ou Cisplatina é aumentada em comparagáo com as células cultivadas em meio. c/d: 0 tratamento de células com Irinotecano, Docetaxel ou Cisplatina aumenta a potencia de IMAB362 para induzir ADCC.

Figura 6. Efeitos da quimioterapia em CDC induzida por IMAB362.

Figura 7. Efeitos da quimioterapia em células efetoras.

Figura 8. Expansáo de PBMCs em culturas suplementadas com ZA/IL-2.

Figura 9. Enriquecimento de células T Vy9V52 em culturas de PBMC suplementadas com ZA/IL-2.

Figura 10. Enriquecimento de células T Vy9V52 em meio suplementado com ZA e urna dose crescente de IL-2.

Figura 11. Expansao e atividade citotóxica de células T Vy9V52 mediante a coincubagáo com monócitos pulsados por ZA e células de cancro humanas.

Figura 12. Desenvolvimento dependente de ZA de diferentes tipos de célula em culturas de PBMC.

Figura 13. Exibigáo de marcadores de superficie em células T Vy9V52 após tratamento com ZA/IL-2.

Figura 14. Atividade de ADCC de células T Vy9V52 com IMAB362 em células de cancro gástrico NUGC-4 positivas para CLDN18.2.

Figura 15. ADCC de IMAB362 com a utilizagáo de células T Vy9V52 como células efetoras.

Figura 16. Efeitos de ZA na localizagáo de superficie de CLDN18.2 em células-alvo.

Figura 17. Efeitos da quimioterapia e tratamento com ZA/IL-2 em células efetoras.

Figura 18. Estudos de biodistribuigáo com anticorpos conjugados em murganhos.

Figura 19. Tratamento precoce de xenoenxertos de tumor ΗΕΚ2 93~CLDN18.2.

Figura 20. Tratamento de xenoenxertos de tumor HEK2 93~CLDN18.2 avangado.

Figura 21. Efeito de IMAB362 em crescimento de tumor subcutáneo de xenoenxertos de cancro gástrico.

Figura 22. Efeitos da imunoterapia com IMAB362 em xenoenxertos de carcinoma gástrico NCI-N87~CLDN18.2.

Figura 23. Efeitos da terapia de combinagáo com regime de EOF e IMAB362 em xenoenxertos NCI-N87~CLDN18.2.

Figura 24. Efeitos da terapia de combinagáo com regime de EOF e IMAB362 em xenoenxertos NUGC-4~CLDN18.2.

Figura 25. Efeito de células T Vy9V52 induzidas por ZA/IL-2 em controlo de tumores macroscópicos por IMAB362 em murganhos NSG.

Figura 26. Efeitos da terapia de combinagáo com regime de EOF e IMAB362 em tumores de aloenxerto CLS-103~cldnl8.2.

DESCRigÁO DETALHADA DA INVENQÁO

Embora a presente instrugáo seja descrita detalhadamente a seguir, deve-se compreender que esta instrugáo nao se limita ás metodologías, protocolos e reagentes particulares descritos no presente documento, na medida em que estes podem variar. Deve-se compreender também que a terminología utilizada no presente documento é para o propósito de descrever as modalidades particulares apenas e nao se destina a limitar o ámbito da presente instrugáo que será limitado apenas pelas reivindicagbes anexas. Salvo definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente documento tém os mesmos significados como entendido comumente por urna pessoa de habilidade comum na técnica. A seguir, os elementos da presente instrugáo seráo descritos. Estes elementos sao listados com modalidades específicas, no entanto, deve-se compreender que os mesmos podem ser combinados de qualquer maneira e em qualquer número para criar modalidades adicionáis. As modalidades preferenciais e exemplos descritos de maneira variada nao deveriam ser interpretados para limitar a presente instrugáo a apenas as modalidades explícitamente descritas. Esta descrigáo deve ser entendida como suportando e abrangendo modalidades que combinam as modalidades explícitamente descritas com qualquer número dos elementos revelados e/ou preferenciais. Adicionalmente, quaisquer permutagóes e combinagóes de todos os elementos descritos neste pedido deveriam ser consideradas reveladas pela descrigáo do presente pedido, exceto onde o contexto indica em contrário.

De preferencia, os termos utilizados no presente documento sao definidos conforme descrito em "A multilingual glossary of biotechnological terms: (Recomendagóes da IUPAC)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel e H. Kólbl, editores, Helvética Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suíga, (1995).

A prática da presente instrugáo irá empregar, exceto onde indicado em contrário, métodos convencionais de química, bioquímica, biología celular, imunologia e técnicas de ADN recombinantes que sao explicadas na literatura no campo (confira-se, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edigáo, J. Sambrook et al. editores, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor 1989).

Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicagoes que se seguem, exceto onde o contexto exija o contrário, a palavra "compreender", e variagóes da mesma, como "compreende" e "compreendendo", será compreendida como implicando a inclusáo de um membro, número inteiro ou etapa ou grupo de membros, números inteiros ou etapas mencionado, mas nao a exclusáo de qualquer outro membro, número inteiro ou etapa ou grupo de membros, números inteiros ou etapas, embora em algumas modalidades tal outro membro, número inteiro ou etapa ou grupo de membros, números inteiros ou etapas pode ser excluido, isto é, o assunto consiste na inclusáo de um membro, número inteiro ou etapa ou grupo de membros, números inteiros ou etapas mencionado. Os termos "um" e "urna" e "o" e "a" e referencia semelhante utilizada no contexto de descrever a invengáo (especialmente no contexto das reivindicagoes) devem ser interpretados como abrangendo tanto o singular como o plural, exceto onde indicado em contrário no presente documento ou claramente contradito pelo contexto. A recitagáo de faixas de valores no presente documento é meramente destinada a servir como um método de estenografía para referir-se individualmente a cada valor separado incluido na faixa. Exceto onde indicado em contrário no presente documento, cada valor individual é incorporado no relatório descritivo como se fosse individualmente citado no presente documento. Todos os métodos descritos no presente documento podem ser realizados em qualquer ordem adequada, exceto onde indicado em contrário no presente documento ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. A utilizagáo de todo e qualquer exemplo ou linguagem exemplificadora (por exemplo, "como") fornecida no presente documento é destinada meramente a ilustrar melhor a invengao e nao impor urna limitagao no escopo da invengao de outro modo reivindicado. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deveria ser interpretada como indicando qualquer elemento nao reivindicado essencial para a prática da invengao. 0 termo "CLDN18" refere-se a claudina 18 e incluí quaisquer variantes, incluindo variante de splicing 1 de claudina 18 (claudina 18.1 (CLDN18.1)) variante de splicing 2 de claudina 18 (claudina 18.2 (CLDN18.2)). 0 termo "CLDN18.2" refere-se, de preferencia, a CLDN18.2 humana e, em particular, a urna proteína que compreende, de preferencia, que consiste na sequéncia de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 1 da listagem de sequéncias ou urna variante da referida sequéncia de aminoácidos. 0 termo "CLDN18.1" refere-se, de preferencia, a CLDN18.1 humana e, em particular, a urna proteína que compreende, de preferencia, que consiste na sequéncia de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 2 da listagem de sequéncias ou urna variante da referida sequéncia de aminoácidos. 0 termo "variante", de acordo com a invengao, refere-se, em particular, a mutantes, variantes de splicing, conformagóes, isoformas, variantes alélicas, variantes de espécies e homólogos de espécies, em particular, aquelas que estáo presentes naturalmente. Urna variante alélica refere-se a urna alteragao na sequéncia normal de um gene, cujo significado é muitas vezes pouco claro. A sequenciagáo de genes completa muitas vezes identifica inúmeras variantes alélicas para um determinado gene. Um homólogo de espécie é urna sequéncia de ácidos nucleicos ou aminoácidos com urna espécie de origem diferente daquela de urna determinada sequéncia de ácidos nucleicos ou aminoácidos. 0 termo "variante" deve abranger qualquer variante modificada de maneira pós-traducional e variantes de conformagáo.

De acordo com a instrugáo, o termo "cancro positivo para CLDN18.2" significa um cancro que envolve células de cancro que expressam CLDN18.2, de preferencia, sobre a superficie das referidas células de cancro. "Superficie celular" é utilizada de acordo com seu significado normal na técnica e, dessa forma, incluí o lado externo da célula que é acessível á ligagao por proteínas e outras moléculas. CLDN18.2 é expresso sobre a superficie de células se estiver situado na superficie das referidas células e for acessível á ligagao por anticorpos específicos de CLDN18.2 adicionados as células.

De acordo com a instrugáo, CLDN18.2 nao é substancialmente expresso numa célula se o nivel de expressao for mais baixo em comparagáo com a expressao em células do estómago ou tecido do estómago. De preferencia, o nivel de expressao é menor que 10%, de preferencia, menor que 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% ou 0,05% da expressao em células do estómago ou tecido do estómago ou até mais baixo. De preferencia, CLDN18.2 nao é substancialmente expresso numa célula se o nivel de expressao exceder o nivel de expressao em tecido nao canceroso diferente do estómago em nao mais que 2 vezes, de preferencia, 1,5 vezes, e de preferencia nao excede o nivel de expressao no referido tecido nao canceroso. De preferencia, CLDN18.2 nao é substancialmente expresso numa célula se o nivel de expressao estiver abaixo do limite de detegao e/ou se o nivel de expressao for baixo demais para permitir a ligagao por anticorpos especificos de CLDN18.2 adicionados as células.

De acordo com a instrugao, CLDN18.2 é expresso numa célula se o nivel de expressao exceder o nivel de expressao em tecido nao canceroso diferente de estomago, de preferencia, em mais de 2 vezes, de preferencia, 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes ou 10000 vezes. De preferencia, CLDN18.2 é expresso numa célula se o nivel de expressao estiver acima do limite de detegao e/ou se o nivel de expressao for alto o suficiente para permitir a ligagao por anticorpos especificos de CLDN18.2 adicionados ás células. De preferencia, CLDN18.2 expresso numa célula é expresso ou exposto sobre a superficie da referida célula.

De acordo com a instrugao, o termo "doenga" refere-se a qualquer estado patológico, incluindo cancro, em particular, aquelas formas de cancro descritas no presente documento. Qualquer referencia no presente documento a cancro ou formas particulares de cancro incluí também metástase de cancro dos mesmos. Numa modalidade preferencial, urna doenga a ser tratada de acordo com o presente pedido envolve células que expressam CLDN18.2. "Doengas associadas a células que expressam CLDN18.2" ou expressóes semelhantes significa de acordo com a invengao que CLDN18.2 é expresso em células de um órgao ou tecido doente. Numa modalidade, a expressao de CLDN18.2 em células de um órgao ou tecido doente é aumentada em comparagáo com o estado num órgao ou tecido saudável. Um aumento refere-se a um aumento em pelo menos 10%, em particular pelo menos 20%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 500%, pelo menos 1000%, pelo menos 10000% ou até maior. Numa modalidade, a expressao é encontrada apenas num tecido doente, enquanto que a expressao num tecido saudável é reprimida. De acordo com a invengáo, as doengas associadas a células que expressam CLDN18.2 incluem doengas de cancro. Adicionalmente, de acordo com a invengáo, as doengas de cancro sao, de preferencia, aquelas em que as células de cancro expressam CLDN18.2.

Para utilizagáo no presente documento, urna "doenga de cancro" ou "cancro" inclui urna doenga distinguida pelo crescimento celular, proliferagáo, diferenciagáo, adesáo e/ou migragao regulada de maneira anormal. O termo "célula de cancro" significa urna célula anormal que cresce por meio de urna proliferagáo celular descontrolada e rápida e continua a crescer depois que os estímulos que iniciaram o novo crescimento cessam. De preferencia, urna "doenga de cancro" é caracterizada por células que expressam CLDN18.2 e urna célula de cancro expressa CLDN18.2. Urna célula que expressa CLDN18.2 é, de preferencia, urna célula de cancro, de preferencia, dos cancros descritos no presente documento. "Adenocarcinoma" é um cancro que se origina em tecido glandular. Este tecido também é parte de urna categoría de tecido maior conhecida como tecido epitelial. O tecido epitelial inclui pele, glándulas e urna variedade de outros tecidos que revestem as cavidades e órgáos do corpo. O epitélio é derivado de maneira embriológica a partir do ectoderma, endoderma e mesoderma. Para serem classificadas como adenocarcinoma, as células nao necessariamente precisam ser parte de urna glándula, contanto que tenham propriedades secretoras. Esta forma de carcinoma pode ocorrer em alguns mamíferos superiores, incluindo seres humanos. Os adenocarcinomas bem diferenciados tendem a assemelhar-se ao tecido glandular que os mesmos derivaram, enquanto que os diferenciados de maneira insatisfatória nao. Mediante a coloragáo das células a partir de urna biópsia, um patologista irá determinar se o tumor é um adenocarcinoma ou algum outro tipo de cancro. Os adenocarcinomas podem surgir em muitos tecidos do corpo devido á natureza ubíqua de glándulas dentro do corpo. Embora cada glándula possa nao estar a secretar a mesma substáncia, contanto que exista urna fungáo exócrina para a célula, é considerada glandular e sua forma maligna é, portanto, chamada de adenocarcinoma. Os adenocarcinomas malignos invadem outros tecidos e murtas vezes sofrem metástase dado tempo suficiente para o mesmo. 0 adenocarcinoma de ovário é o tipo mais comum de carcinoma de ovário. Incluí os adenocarcinomas serosos e mucinosos, o adenocarcinoma de célula transparente e o adenocarcinoma endometrioide. 0 termo "metástase" significa o espalhamento de células de cancro a partir de seu sitio original para urna outra parte do corpo. A formagáo de metástase é um processo muito complexo e depende do descolamento de células malignas do tumor primário, invasao da matriz extracelular, penetragao das membranas basais endoteliais para entrar nos vasos e cavidades do corpo e, entáo, após serem transportadas pelo sangue, infiltragáo de órgáos-alvo. Finalmente, o crescimento de um novo tumor no sitio alvo depende da angiogénese. A metástase de tumor muitas vezes ocorre até após a remogáo do tumor primário devido ao facto de componentes ou células tumorais poderem permanecer e desenvolver potencial metastático. Numa modalidade, o termo "metástase" de acordo com a invengáo refere-se a "metástase distante" que se refere a urna metástase que é afastada do tumor primário e do sistema de ganglios linfáticos regional. Numa modalidade, o termo "metástase" de acordo com a invengáo refere-se a metástase de ganglios linfáticos. Urna forma particular de metástase que é tratável com a utilizagáo da terapia da invengáo é a metástase que se origina do cancro gástrico como sitio primário. Em modalidades preferenciais, tal metástase de cancro gástrico é tumores de Krukenberg, metástase peritoneal e/ou metástase de ganglios linfáticos. 0 tumor de Krukenberg é um tumor metastático incomum dos ovários que responde por 1% a 2% de todos os tumores dos ovários. 0 prognóstico de tumor de Krukenberg aínda é muito insatisfatório e nao existe tratamento estabelecido para tumores de Krukenberg. 0 tumor de Krukenberg é um adenocarcinoma metastático de célula em anel de sinete do ovário. 0 estomago é o sitio primário na maioria dos casos de tumor de Krukenberg (70%) . Os carcinomas do colon, apéndice e mama (principalmente carcinoma lobular invasivo) sao os próximos sitios primários mais comuns. Os casos raros de tumor de Krukenberg que se originam de carcinomas da vesícula biliar, trato biliar, páncreas, intestino delgado, ampola de Vater, colo uterino e bexiga urinária/úrico tém sido relatados. O intervalo entre o diagnóstico de um carcinoma primário e a descoberta subsequente de envolvimento do ovário é normalmente de 6 meses ou menos, mas períodos mais longos tém sido relatados. Em muitos casos, o tumor primário é muito pequeño e pode escapar da detegáo. Um histórico de um carcinoma anterior do estomago ou um outro órgáo pode ser obtido em apenas 20% a 30% dos casos. O tumor de Krukenberg é um exemplo do espalhamento seletivo de cancros, mais comunmente no eixo estómago-ovários. Este eixo de espalhamento de tumor tem históricamente atraido a atengáo de muitos patologistas, especialmente quando foi constatado que os neoplasmas gástricos sofrem metástase seletivamente para os ovários sem envolvimento de outros tecidos. A rota de metástase de carcinoma gástrico até aos ovários foi um mistério durante muito tempo, mas agora é evidente que o espalhamento linfático retrógrado é a rota mais provável de metástase.

As mulheres com tumores de Krukenberg tendem a ser extraordinariamente jovens para pacientes com carcinoma metastático, á medida que estáo típicamente na quinta década de suas vidas, com urna idade média de 45 anos. Esta idade jovem de distribuigáo pode estar relacionada em parte com a frequéncia aumentada de carcinomas gástricos de célula em anel de sinete em mulheres jovens. Os síntomas comuns apresentados estáo normalmente relacionados com o envolvimento dos ovários, dos quais o mais comum é dor abdominal e distensáo (principalmente devido as massas do ovário normalmente bilaterais e muitas vezes grandes). Os pacientes restantes tém síntomas gastrointestinais nao específicos ou sao assintomáticos. Além disso, o tumor de Krukenberg está supostamente associado á virilizagao que resulta da produgáo de hormonas pelo estroma de ovário. As ascites estáo presentes em 50% dos casos e normalmente revelam células malignas.

Os tumores de Krukenberg sao bilaterais em mais de 80% dos casos relatados. Os ovários sao normalmente ampliados de maneira assimétrica com um contorno com saliéncias. As superficies em secgao sao amarelas ou brancas; sao normalmente sólidas, embora sejam ocasionalmente cisticas. De forma importante, a superficie capsular dos ovários com tumores de Krukenberg é típicamente lisa e isenta de adesdes ou depósitos perifoneáis. É de destacar que outros tumores metastáticos para o ovário tendem a estar associados a implantes de superficie. Isto pode explicar porque a morfología bruta do tumor de Krukenberg pode aparecer enganosamente como um tumor de ovário primário. No entanto, o bilateralismo em tumor de Krukenberg é consistente com sua natureza metastática.

Os pacientes com tumores de Krukenberg tém urna taxa de mortalidade total que é significativamente alta. A maioria dos pacientes morre dentro de 2 anos (sobrevivencia mediana, 14 meses). Vários estudos mostram que o prognóstico é insatisfatório quando o tumor primário é identificado depois de a metástase para o ovário ser descoberta, e o prognóstico se torna pior se o tumor primário permanecer encoberto.

Nenhuma estratégia de tratamento ideal para tumores de Krukenberg tem sido claramente estabelecida na literatura. A probabilidade de urna ressecgáo cirúrgica ser realizada aínda nao foi adequadamente tratada. A quimioterapia ou radioterapia nao tem efeito significativo no prognóstico de pacientes com tumores de Krukenberg. 0 termo "tratar" significa administrar um composto ou composigao ou urna combinagao de compostos ou composigóes a um individuo a fim de prevenir ou eliminar urna doenga, incluindo reduzir o tamanho de um tumor ou o número de tumores num individuo; interromper ou desacelerar urna doenga num individuo; inibir ou desacelerar o desenvolvimento de urna nova doenga num individuo; diminuir a frequéncia ou gravidade de síntomas e/ou recorréncias num individuo que tem atualmente ou que anteriormente teve urna doenga; e/ou prolongar, isto é, aumentar o tempo de vida do individuo.

Em particular, o termo "tratamento de urna doenga" incluí curar, reduzir a duragao, melhorar, prevenir, desacelerar ou inibir a progressao ou piora, ou prevenir ou retardar o inicio de urna doenga ou os síntomas da mesma. 0 termo "paciente" significa, de acordo com a invengao, um individuo para o tratamento, em particular um individuo doente, incluindo seres humanos, primatas nao humanos ou outros animáis, em particular mamíferos, como vacas, cávalos, porcos, carneiros, cabras, caes, gatos ou roedores, como murganhos e ratos. Numa modalidade particularmente preferencial, um paciente é um ser humano. 0 termo "agente que estabiliza ou aumenta a expressao de CLDN18.2" refere-se a um agente ou a urna combinagao de agentes cujo fornecimento para as células resulta em níveis aumentados de ARN e/ou proteína de CLDN18.2, de preferencia, em níveis aumentados de proteína de CLDN18.2 na superficie celular, em comparagao com a situagao em que as células nao sao dotadas do agente ou da combinagao de agentes. De preferencia, a célula é urna célula de cancro, em particular urna célula de cancro que expressa CLDN18.2, como urna célula dos tipos de cancro descritos no presente documento. 0 termo "agente que estabiliza ou aumenta a expressao de CLDN18.2" refere-se, em particular, a um agente ou a urna combinagao de agentes cujo fornecimento para as células resulta numa densidade mais alta de CLDN18.2 na superficie das referidas células, em comparagao com a situagao em que as células nao sao dotadas do agente ou da combinagao de agentes. "Estabilizagao da expressao de CLDN18.2" incluí, em particular, a situagao em que o agente ou a combinagao de agentes impede urna diminuigao ou reduz a diminuigao na expressao de CLDN18.2, por exemplo, a expressao de CLDN18.2 diminuiría sem o fornecimento do agente ou da combinagao de agentes e o fornecimento do agente ou da combinagao de agentes impede a referida diminuigao ou reduz a referida diminuigao da expressao de CLDN18.2. "Aumento da expressao de CLDN18.2" incluí, em particular, a situagao em que o agente ou a combinagao de agentes aumenta a expressao de CLDN18.2, por exemplo, a expressao de CLDN18.2 iría diminuir, permanecer essencialmente constante ou aumentar sem o fornecimento do agente ou da combinagao de agentes e o fornecimento do agente ou da combinagao de agentes aumenta a expressao de CLDN18.2 em comparagao com a situagao sem o fornecimento do agente ou da combinagao de agentes, de modo que a expressao resultante seja maior se comparada á situagao em que a expressao de CLDN18.2 iría diminuir, permanecer essencialmente constante ou aumentar sem o fornecimento do agente ou da combinagao de agentes. 0 termo "agente que estabiliza ou aumenta a expressao de CLDN18.2" incluí agentes quimioterapéuticos ou combinagóes de agentes quimioterapéutigos, como agentes citostáticos. Os agentes quimioterapéuticos podem afetar células numa das seguintes maneiras: (1) Danificar o ADN das células de modo a que nao possam reproduzir-se mais, (2) Inibir a síntese de novas fitas de ADN de modo que nenhuma replicagao celular seja possível, (3) Parar os processos mitóticos das células de modo a que as células nao se possam dividir em duas células. O termo "agente que estabiliza ou aumenta a expressao de CLDN18.2" refere-se, de preferencia, a um agente ou urna combinagáo de agentes, como um composto citostático ou urna combinagáo de compostos citostáticos cujo fornecimento para as células, em particular, células de cancro, resulta na interrupgao das células ou na sua acumulagao numa ou mais fases do ciclo celular, de preferencia, numa ou mais fases do ciclo celular diferente das fases G1 e GO, de preferencia, diferentes da fase Gl, de preferencia, numa ou mais da fase G2 ou S do ciclo celular, como a fase G1/G2, S/G2, G2 ou S do ciclo celular. 0 termo "células que sao interrompidas ou acumuladas numa ou mais fases do ciclo celular" significa que a percentagem de células que estao na referida urna ou mais fases do ciclo celular aumenta. Cada célula passa por um ciclo que compreende quatro fases a fim de se replicar. A primeira fase chamada de Gl é quando a célula se prepara para replicar os seus cromossomos. 0 segundo estágio é chamado de S e nesta fase ocorre a sintese de ADN e o ADN é duplicado. A próxima fase é a fase G2, quando o ARN e a proteina se duplicam. 0 estágio final é o estágio M, que é o estágio da divisáo celular real. Neste estágio final, o ADN e ARN duplicados dividem-se e movem-se para extremidades separadas da célula, e a célula divide-se realmente em duas células funcionáis idénticas. Os agentes quimioterapéuticos que sao agentes de daño ao ADN normalmente resultam numa acumulagáo de células na fase Gl e/ou G2. Os agentes quimioterapéuticos que bloqueiam o crescimento celular por meio da interferencia com a sintese de ADN, como antimetabólitos, normalmente resultam numa acumulagáo de células na fase S. Os exemplos destes fármacos sao 6-mercaptopurina e 5-fluorouracilo. 0 termo "agente que estabiliza ou aumenta a expressao de CLDN18.2" incluí antraciclinas, como epirubicina, compostos de platina, como oxaliplatina e cisplatina, análogos de nucleósido, como 5-fluorouracilo ou pró-fármacos dos mesmos, taxanos, como docetaxel, e análogos de camptotecina, como irinotecano e topotecano, e combinagóes de fármacos, como combinagóes de fármacos que compreendem urna ou mais das antraciclinas, como epirubicina, oxaliplatina e 5-fluorouracilo, como urna combinagáo de fármacos que compreende oxaliplatina e 5-fluorouracilo ou outras combinagóes de fármacos descritas no presente documento.

Numa modalidade preferencial, um "agente que estabiliza ou aumenta a expressáo de CLDN18.2" é um "agente que induz a morte celular imunogénica".

Em circunstancias específicas, as células de cancro podem entrar numa via de tensao letal ligada á emissáo de urna combinagáo de sinais definida no espago e no tempo que é decodificada pelo sistema imunológico para ativar respostas imunológicas específicas de tumor (Zitvogel L. et al. (2010) Cell 140: 798-804). Em tal cenário, as células de cancro sao disparadas para emitir sinais que sao detetados por efetores imunes inatos, como células dendríticas, para disparar urna resposta imunológica cognata que envolve células CD8+ T e sinalizagáo de IFN-γ de modo a que a morte de célula tumoral possa elicitar urna resposta imunológica anticancro produtiva. Estes sinais incluem a exposigáo pré-apoptótica da chaperona calreticulina (CRT) de retículo endoplásmico (ER) na superficie celular, a secregáo pré-apoptótica de ATP e a libertagáo pós-apoptótica da proteína nuclear HMGB1. Em conjunto, estes processos constituem os determinantes moleculares de morte celular imunogénica (ICD). As antraciclinas, oxaliplatina e irradiagáo γ tém capacidade para induzir todos os sinais que definem ICD, enquanto que cisplatina, por exemplo, que é deficiente na indugáo de translocagáo de CRT do ER para a superficie de células agonizantes - um processo que exige stresse de ER - exige a complementando por tapsigargina, um indutor de stresse de ER. 0 termo "agente que induz morte celular imunogénica" refere-se a um agente ou a urna combinagáo de agentes que, quando fornecida para as células, em particular, células de cancro, tem capacidade para induzir as células a entrarem numa via de stresse letal que finalmente resulta em respostas imunológicas especificas de tumor. Em particular, um agente que induz morte celular imunogénica quando fornecido para as células induz as células a emitirem urna combinagáo de sinais definida no espago e no tempo, incluindo, em particular, a exposigao pré-apoptótica da chaperona calreticulina (CRT) de retículo endoplásmico (ER) na superficie celular, a secregao pré-apoptótica de ATP e a libertagao pós-apoptótica da proteina nuclear HMGB1. 0 termo "agente que induz morte celular imunogénica" incluí antraciclinas e oxaliplatina.

As antraciclinas sao urna classe de fármacos comummente utilizados em quimioterapia para cancro que sao também antibióticos. Estruturalmente, todas as antraciclinas compartilham urna estrutura comum de 7,8,9,10- tetraidrotetraceno-5,12-quinona de quatro anéis e normalmente exigem a glicosilagáo em sitios específicos.

As antraciclinas promovem, de preferencia, um ou mais dos seguintes mecanismos de agáo: 1. Inibigáo da síntese de ADN e ARN por meio da intercalagáo entre pares de bases da fita de ADN/ARN, prevenindo, assim, a replicagao de células de cancro com crescimento rápido. 2. Inibigao de enzima topoisomerase II, prevenindo a relaxagáo de ADN superenrolado e bloqueando, assim, a replicagao e transcrigáo de ADN. 3. Criagáo de radicáis de oxigénio livres mediados por ferro que danificam o ADN e membranas celulares.

De acordo com a presente instrugáo, o termo "antraciclina" refere-se, de preferencia, a um agente, de preferencia, um agente anticancro para induzir a apoptose, de preferencia, mediante a inibigao da religagáo de ADN em topoisomerase II.

De preferencia, de acordo com a instrugáo, o termo "antraciclina" refere-se, em geral, a urna classe de compostos que tém a seguinte estrutura de anel

incluindo análogos e derivados, sais farmacéuticos, hidratos, ésteres, conjugados e pró-fármacos dos mesmos.

Os exemplos de antraciclinas e análogos de antraciclina incluem, mas nao se limitam a, daunorubicina (daunomicina), doxorubicina (adriamicina), epirubicina, idarubicina, rodomicina, pirarubicina, valrubicina, N-trifluoro-acetil doxorubicin-14-valerato, aclacinomicina, morfolinodoxorubicina (morfolino-DOX) , cianomorfolino- doxorubicina (cianomorfolino-DOX), 2-pirrolino-doxorubicina (2-PDOX), 5-iminodaunomicina, mitoxantrona e aclacinomicina A (aclarubicina). A mitoxantrona é um membro da classe de compostos de antracendiona, que sao análogos de antraciclina que sao desprovidos da parte de agúcar das antraciclinas, mas retém a estrutura de anel aromático policiclico plano que permite a intercalagáo em ADN. É particularmente preferencial como antraciclina, de acordo com a invengáo, um composto com a seguinte fórmula:

em que,

Ri é selecionado do grupo que consiste em H e OH, R2 é selecionado do grupo que consiste em H e OMe, R3 é selecionado do grupo que consiste em H e OH, e R4 é selecionado do grupo que consiste em H e OH.

Numa modalidade, Ri é H, R2 é OMe, R3 é H e R4 é OH. Numa outra modalidade, Ri é OH, R2 é OMe, R3 é H e R4 é OH. Numa outra modalidade, Ri é OH, R2 é OMe, R3 é OH e R4 é H. Numa outra modalidade, Ri é H, R2 é H, R3 é H e R4 é OH. É específicamente contemplada como antraciclina, no contexto da presente invengáo, epirubicina. A epirubicina é um fármaco de antraciclina que tem a seguinte fórmula:

e está disponível sob o nome comercial Ellence nos EUA e Pharmorubicin ou Epirubicin Ebewe em outro lugar. Em particular, o termo "epirubicina" refere-se ao composto (8R,IOS)-10-[(2S,4S,5R,6S)-4-amino-5-hidroxi-6-metil-oxan-2-il]oxi-6,ll-di-hidroxi-8-(2-hidroxiacetil)-l-metoxi-8-metil-9,10-di-hidro-7H-tetracen-5,12-diona. A epirubicina é favorecida em relagáo á doxorubicina, a antraciclina mais popular, em alguns regimes de quimioterapia, porque parece causar menos efeitos secundários.

De acordo com a instrugáo, o termo "composto de platina" refere-se a compostos que contém platina em sua estrutura, como complexos de platina e incluí compostos, como cisplatina, carboplatina e oxaliplatina. O termo "cisplatina" ou "cisplatinum" refere-se ao composto cis-diaminadicloroplatina(II) (CDDP) da seguinte fórmula:

O termo "carboplatina" refere-se ao composto cis-diamina(1,1-ciclobutanodicarboxilato)platina(II) da seguinte fórmula:

0 termo "oxaliplatina" refere-se a um composto que é um composto de platina que é complexado num ligante transportador de diaminociclo-hexano da seguinte fórmula:

Em particular, o termo "oxaliplatina" refere-se ao composto [(IR,2R)-ciclo-hexano-1,2-diamina](etanodioato- 0,0'Jplatina (II) . A oxaliplatina para injegáo também está disponivel sob o nome comercial Eloxatine. 0 termo "análogo de nucleósido" refere-se a um análogo estrutural de um nucleósido, urna categoría que incluí tanto análogos de purina como análogos de pirimidina. Em particular, o termo "análogo de nucleósido" refere-se a derivados de fluoropirimidina que incluí fluorouracilo e pró-fármacos do mesmo. 0 termo "fluorouracilo" ou "5-fluorouracilo" (5-FU ou f5U) (vendido sob os nomes comerciáis Adrucil, Carac, Efudix, Efudex e Fluoroplex) é um composto que é um análogo de pirimidina da seguinte fórmula:

Em particular, o termo refere-se ao composto 5-fluoro-lH-pirimidina-2,4-diona. 0 termo "capecitabina" (Xeloda, Roche) refere-se a um agente quimioterapéutico que é um pró-fármaco que é convertido em 5-FU nos tecidos. A capecitabina que pode ser oralmente administrada tem a seguinte fórmula:

Em particular, o termo refere-se ao composto pentil [1-(3,4-di-hidroxi-5-metiltetraidrofuran-2-il)-5-fluoro-2-oxo-lH-pirimidin-4-il]carbamato.

Os taxanos sao urna classe de compostos de diterpeno que foram primeiramente derivados de fontes naturais, como plantas do género Taxus, mas alguns foram sintetizados artificialmente. 0 principal mecanismo de agáo da classe de fármacos de taxano é a rutura da fungáo de microtúbulo, inibindo, assim, o processo de divisáo celular. Os taxanos incluem docetaxel (Taxotere) e paclitaxel (Taxol).

De acordo com a instrugao, o termo "docetaxel" refere-se a um composto que tem a seguinte fórmula:

De acordo com a instrugáo, o termo "paclitaxel" refere-se a um composto que tem a seguinte fórmula:

De acordo com a instrugáo, o termo "análogo de camptotecina" refere-se a derivados do composto camptotecina (CPT; (S)—4— etil-4-hidroxi-lH-pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b] quinolina-3,14-(4H,12H)-diona). De preferencia, o termo "análogo de camptotecina" refere-se a compostos que compreendem a seguinte estrutura:

De acordo com a instrugáo, os análogos de camptotecina preferenciais sao inibidores da enzima de ADN topoisomerase I (topo I) . Os análogos de camptotecina preferenciais de acordo com a instrugáo sao irinotecano e topotecano. 0 irinotecano é um fármaco que impede que o ADN se desenrole mediante a inibigáo da topoisomerase I. Em termos químicos, é um análogo semissintético da camptotecina alcaloide natural que tem a seguinte fórmula:

Em particular, o termo "irinotecano" refere-se ao composto (S)-4,ll-dietil-3,4,12,14-tetraidro-4-hidroxi-3,14-dioxo lH-pirano[3',4':6,7]-indolizino[1,2-b]quinolin-9-il-[1,4'bipiperidina]-1'-carboxilato . 0 topotecano é um inibidor de topoisomerase da fórmula:

Em particular, o termo "topotecano" refere-se ao composto de monocloridrato de (S)-10-[(dimetilamino)metil]-4-etil-4,9-di-hidroxi-lH-pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-3,14 (4H,12H)-diona.

De acordo com a presente instrugáo, um agente que estabiliza ou aumenta a expressao de CLDN18.2 pode ser um agente quimioterapéutico, em particular, um agente quimioterapéutico estabelecido no tratamento para cancro e pode ser parte de urna combinagáo de fármacos, como urna combinagáo de fármacos estabelecidos para o uso em tratamentos para cancro. Tal combinagáo de fármacos pode ser urna combinagáo de fármacos utilizada em quimioterapia, e pode ser urna combinagáo de fármacos conforme utilizado num regime quimioterapéutico selecionado do grupo que consiste em quimioterapia EOX, quimioterapia ECF, quimioterapia ECX, quimioterapia EOF, quimioterapia FLO, quimioterapia FOLFOX, quimioterapia FOLFIRI, quimioterapia DCF e quimioterapia FLOT. A combinagao de fármacos utilizada em quimioterapia EOX compreende epirubicina, oxaliplatina e capecitabina. A combinagao de fármacos utilizada em quimioterapia ECF compreende epirubicina, cisplatina e 5-fluorouracilo. A combinagao de fármacos utilizada em quimioterapia ECX compreende epirubicina, cisplatina e capecitabina. A combinagao de fármacos utilizada em quimioterapia EOF compreende epirubicina, oxaliplatina e 5-fluorouracilo. A epirubicina é normalmente dada em doses de 50 mg/m2, cisplatina de 60 mg/m2, oxaliplatina de 130 mg/m2, infusao venosa prolongada de 5-fluorouracilo de 200 mg/m2/dia e capecitabina oral de 625 mg/m2 duas vezes ao día, durante um total de oito ciclos de 3 semanas. A combinagao de fármacos utilizada em quimioterapia FLO compreende 5-fluorouracilo, ácido folinico e oxaliplatina (normalmente 5-fluorouracilo a 2.600 mg/m2 em infusao por 24 h, ácido folinico a 200 mg/m2 e oxaliplatina 85 mg/m2, a cada 2 semanas). FOLFOX é um regime de quimioterapia composto de ácido folinico (leucovorina), 5-fluorouracilo e oxaliplatina. O cronograma de doses recomendadas dado a cada duas semanas é conforme exposto a seguir: Dia 1: Oxaliplatina a 85 mg/m2 por infusao IV e leucovorina a 200 mg/m2 por infusao IV, seguido de 5-FU a 400 mg/m2 por bolus IV, seguido de 5-FU a 600 mg/m2 por infusao IV como urna infusao continua de 22 horas; Dia 2: Leucovorina a 200 mg/m2 por infusao IV durante 120 minutos, seguido de 5-FU 400 mg/m2 por bolus IV dados durante 2 a 4 minutos, seguido de 5-FU a 600 mg/m2 por infusao IV como urna infusao continua de 22 horas. A combinagáo de fármacos utilizada em quimioterapia FOLFIRI compreende 5-fluorouracilo, leucovorina e irinotecano. A combinagáo de fármacos utilizada em quimioterapia DCF compreende docetaxel, cisplatina e 5-fluorouracilo. A combinagáo de fármacos utilizada em quimioterapia FLOT compreende docetaxel, oxaliplatina, 5-fluorouracilo e ácido folinico. O termo "ácido folinico" ou "leucovorina" refere-se a um composto útil em combinagáo sinérgica com o agente quimioterapéutico 5-fluorouracilo. O ácido folinico tem a seguinte fórmula:

Em particular, o termo refere-se ao composto ácido (2S)-2-{[4-[(2-amino-5-formil-4-oxo-5,6,7,8-tetraidro-lH-pteridin-6-il)metilamíno]benzoil]amino}pentanodioico.

As células T γδ (células T gama delta) representam um subconjunto pequeño de células T que possui um recetor de célula T distinto (TCR) na sua superficie. Urna maioria de células T tem um TCR composto de duas cadeias de glicoproteina chamadas cadeias a e β-TCR. Em contrapartida, ñas células T γδ, o TCR é composto de urna cadeia γ e urna cadeia δ. Este grupo de células T é normalmente muito menos comum que as células T αβ. As células T γδ humanas desempenham um papel importante em respostas de vigilancia de stresse como doengas infeciosas e autoimunidade. Também é sugerido que as alteragóes induzidas por transformagao em tumores causem respostas de vigilancia de stresse mediadas por células T γδ e intensifiquem a imunidade antitumor. Significativamente, após a participagao de antigénio, as células T γδ ativadas em sitios de lesao fornecem citocinas (por exemplo, ΙΝΕγ, TNFa) e/ou quimiocinas que mediam o recrutamento de outras células efetoras e mostram fungóes efetoras imediatas, como citotoxicidade (através de vías de granulos citolíticos o recetor de morte) e ADCC. A maior parte das células T γδ no sangue periférico expressa o recetor de células T νγ9νδ2 (^Εγδ) . As células T νγ9νδ2 sao exclusivas para seres humanos e primatas e supóe-se que desempenham urna fungao precoce e essencial na detegao de "perigo" por meio da invasao de patógenos, á medida que expandem drásticamente em muitas infegóes agudas e podem exceder todos os outros linfócitos dentro de poucos dias, por exemplo, em tuberculose, salmonelose, erliquiose, brucelose, tularemia, listeriose, toxoplasmose e malária.

As células T γδ respondem a antigénios fosforilados nao peptídicos pequeños (fosfoantigénios), como pirofosfatos sintetizados em bactérias e pirofosfato de isopentenilo (IPP) produzido em células de mamífero através da vía de mevalonato. Enquanto que a produgao de IPP em células normáis nao é suficiente para a ativagao de células T γδ, a desregulagao da via de mevalonato em células tumorais leva á acumulagao de IPP e ativagao de células T γδ. Os IPPs também podem ser terapéuticamente aumentados por aminobisfosfonatos, que inibem a enzima da via de mevalonato farnesil pirofosfato sintase (FPPS). Entre outros, o ácido zoledrónico (ZA, zoledronato, Zometa™, Novartis) representa tal aminobifosfonato, que já é clínicamente administrado a pacientes para o tratamento de osteoporose e doenga óssea metastática. Mediante o tratamento de PBMCs in vitro, ZA é absorvido especialmente por monócitos. IPP acumula-se nos monócitos e diferenciam-se em células apresentadoras de antigénio que estimulam o desenvolvimento de células T γδ. Neste ambiente, a adigáo de interleucina-2 (IL-2) é preferencial como fator de crescimento e sobrevivencia para células T γδ ativadas. Finalmente, certas aminas alquiladas tém sido descritas para ativar células T Vy9V62 in vitro, no entanto, apenas em concentragóes milimolares.

De acordo com a presente instrugao, o termo "agente que estimula células T γδ" refere-se a compostos que estimulam o desenvolvimento de células T γδ, em particular células T νγ9νδ2, in vitro e/ou in vivo, em particular, por meio da indugao da ativagao e expansao de células T γδ. De preferencia, o termo refere-se a compostos que in vitro e/ou in vivo aumentam pirofosfato de isopentenilo (IPP) produzido em células de mamífero, de preferencia, por meio da inibigao da enzima da via de mevalonato farnesil pirofosfato sintase (FPPS).

Um grupo particular de compostos que estimulam as células T γδ sao bisfosfonatos, em particular bisfosfonatos que contém nitrogénio (N-bisfosfonatos; aminobisfosfonatos).

Por exemplo, os bisfosfonatos adequados para utilizagáo na invengáo podem incluir um ou mais dos seguintes compostos que incluem análogos e derivados, sais farmacéuticos, hidratos, ásteres, conjugados e pró-fármacos dos mesmos: [l-hidroxi-2-(lH-imidazol-l-il)etano-1,l-diil]bis(ácido fosfónico), ácido zoledrónico, por exemplo, zoledronato; ácido (dicloro-fosfono-metil)fosfónico, por exemplo, clodronato {l-hidroxi-3-[metil(pentil)amino]propano-1,1-diil}bis(ácido fosfónico), ácido ibandrónico, por exemplo, ibandronato (3-amino-l-hidroxipropano-l,1-diil)bis (ácido fosfónico), ácido pamidrónico, por exemplo, pamidronato; ácido (l-hidroxi-l-fosfono-2-piridin-3-il-etil)fosfónico, ácido risedrónico, por exemplo, risedronato; ácido (l-hidroxi-2-imidazo[1,2-a]piridin-3-il-l- fosfonoetil)fosfónico, ácido minodrónico; [3-(dimetilamino)-1-hidroxipropano-l,l-diil]bis(ácido fosfónico), ácido olpadrónico. ácido [4-amino-l-hidroxi-l-(hidroxi-oxido-fosforil)- butil]fosfónico, ácido alendrónico, por exemplo, alendronato; [(Ciclo-heptilamino)metileno]bis(ácido fosfónico), ácido incadrónico; (1-hidroxietan-l,1-diil)bis(ácido fosfónico), ácido etidrónico, por exemplo, etidronato; e {[(4-clorofenil)fio]metileno}bis(ácido fosfónico), ácido tiludrónico.

De acordo com a instrugáo, o ácido zoledrónico (INN) ou zoledronato (disponivel comercialmente junto á Novartis sob os nomes comerciáis de Zometa, Zomera, Aclasta e Reclast) é um bisfosfonato particularmente preferencial. Zometa é utilizado para prevenir fraturas esqueléticas em pacientes com cancros, como mieloma múltiplo e cancro da próstata, bem como para tratar osteoporose. Também pode ser utilizado para tratar hipercalcemia da malignidade e pode ser útil para o tratamento de dor a partir de metástases ósseas.

Numa modalidade particularmente preferencial, um agente que estimula células T γδ, de acordo com a invengáo, é administrado em combinagáo com IL-2. Tal combinagáo tem sido mostrada como sendo particularmente eficaz na mediagáo da expansáo e ativagáo de células T γ9δ2. A interleucina-2 (IL-2) é urna interleucina, um tipo de molécula de sinalizagao de citocina no sistema imunológico. É urna proteina que atrai linfócitos e é parte da resposta natural do corpo á infegáo microbiana, e na discriminagáo entre estranho (diferente de si mesma) e si mesma. IL-2 media seus efeitos por meio da ligagáo a recetores de IL-2, que sao expressos por linfócitos. A IL-2 utilizada de acordo com a invengáo pode ser qualquer IL-2 que suporta ou possibilita a estimulagao de células T γδ e possa ser derivada de qualquer espécie, de preferencia, ser humano. 11-2 pode ser isolado, produzido de maneira recombinante ou IL-2 sintética pode ser IL-2 de ocorréncia natural ou modificada.

Numa modalidade da presente instrugao, a quimioterapia padrao, de acordo com o regime EOX em combinagao com um anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2, em particular IMAB362, é administrada por no máximo 8 ciclos. As doses e cronogramas podem ser conforme exposto a seguir: • 50 mg/m2 de Epirubicina seráo administrados i.v. como infusáo de 15 minutos no día 1 de cada ciclo durante a fase de EOX. • 130 mg/m2 de Oxaliplatina seráo administrados i.v. como infusáo de 2 h no dia 1 de cada ciclo durante a fase de EOX. • 625 mg/m2 de Capecitabina sáo tomados v.o. duas vezes ao dia durante 21 dias de manhá e á norte, comegando com a norte do dia 1 de cada ciclo durante a fase EOX. • 1000 mg/m2 de anticorpo seráo administrados i.v. como infusáo de 2 h no dia 1 do ciclo 1. Posteriormente, 600 mg/m2 de anticorpo seráo administrados i.v. como infusáo de 2 h no dia 1 de cada ciclo depois que a infusáo de Oxaliplatina é concluida. • Após o término da quimioterapia, o paciente irá continuar com 600 mg/m2 de anticorpo como infusao de 2 h a cada 3 ou 4 semanas.

Numa modalidade da presente instrugao, a quimioterapia padráo, de acordo com o regime EOX em combinagáo com ZA/IL-2 e um anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2, em particular IMAB362, é administrada por até 8 ciclos (24 semanas). O termo "antigénio" refere-se a um agente, como urna proteína ou peptídeo que compreende um epítopo contra o qual urna resposta imunológica é dirigida e/ou deve ser dirigida. Numa modalidade preferencial, um antigénio é um antigénio associado a tumor, como CLDN18.2, isto é, um constituinte de células de cancro que pode ser derivado do citoplasma, da superficie celular e do núcleo celular, em particular aqueles antigénios que sao produzidos, de preferencia, em grande quantidade, intracelulares ou como antigénios de superficie em células de cancro.

No contexto da presente instrugao, o termo "antigénio associado a tumor" refere-se, de preferencia, a proteínas que sao, sob condigoes normáis, específicamente expressas num número limitado de tecidos e/ou órgáos ou em estágios de desenvolvimento específicos e sao expressas ou anormalmente expressas num ou mais tecidos de cancro ou tumor. No contexto da presente instrugao, o antigénio associado a tumor é, de preferencia, associado á superficie celular de urna célula de cancro e nao é, de preferencia, ou é apenas raramente expresso em tecidos normáis. O termo "epítopo" refere-se a um determinante antigénico numa molécula, isto é, para a parte numa molécula que é reconhecida pelo sistema imunológico, por exemplo, que é reconhecida por um anticorpo. Por exemplo, os epitopos sao os sitios tridimensionais discretos num antigénio, que sao reconhecidos pelo sistema imunológico. Os epitopos normalmente consistem em agrupamentos de moléculas de superficie químicamente ativa, como caderas laterais de agúcar ou aminoácidos e normalmente tém características estruturais tridimensionais especificas, bem como características de carga especificas. Os epitopos conformacionais e nao conformacionais sao distinguidos pelo facto de que a ligagáo ao primeiro, mas nao ao segundo, é perdida na presenga de solventes de desnaturagao. Um epítopo de urna proteína, como CLDN18.2 compreende, de preferencia, urna porgáo continua ou descontinua da referida proteína e tem, de preferencia, entre 5 e 100, de preferencia, entre 5 e 50, com mais preferencia, entre 8 e 30, com a máxima preferencia, entre 10 e 25 aminoácidos de comprimento, por exemplo, o epítopo pode ter, de preferencia, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos de comprimento. O termo "anticorpo" refere-se a urna glicoproteína que compreende pelo menos duas caderas pesadas (H) e duas caderas leves (L) interconectadas por ligagóes de dissulfeto, e incluí qualquer molécula que compreende urna porgáo de ligagáo ao antigénio da mesma. o termo "anticorpo" incluí anticorpos monoclonais e fragmentos ou derivados de anticorpos, incluindo, sem limitagáo, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia única, por exemplo, scFv's e fragmentos de anticorpo de ligagáo ao antigénio, como fragmentos Fab e Fab' e incluí também todas as formas recombinantes de anticorpos, por exemplo, anticorpos expressos em procariotas, anticorpos nao glicosilados, e quaisquer fragmentos de anticorpo de ligagáo ao antigénio e derivados conforme descrito no presente documento. Cada cadeia pesada é compreendida de urna regiao variável de cadeia pesada (abreviada no presente documento como VH) e urna regiao constante de cadeia pesada. Cada cadeia leve é compreendida de urna regiao variável de cadeia leve (abreviada no presente documento como VL) e urna regiao constante de cadeia leve. As regióes VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regióes de hipervariabilidade, denominadas regióes determinantes de complementaridade (CDRs), intercaladas com regióes que sao mais conservadas, denominadas regióes de estrutura (FR) . Cada VH e VL é compreendida de tres CDRs e quatro FRs, dispostas da terminagáo amino á terminagáo carboxi na seguinte ordem: FRi , CDR1 , FR2 , CDR2 , FR3 , CDR3 , FR4 . As regióes variáveis das cadeias pesada e leve contém um dominio de ligagáo que interage com um antigénio. As regióes constantes dos anticorpos podem mediar a ligagáo da imunoglobulina a tecidos ou fatores de hospedeiro, incluindo diversas células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema complementar clássico.

Os anticorpos descritos no presente documento podem ser anticorpos humanos. 0 termo "anticorpo humano", para utilizagáo na presente invengáo, é destinado a incluir anticorpos que tém regióes variáveis e constantes derivadas de sequéncias de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos descritos no presente documento podem incluir residuos de aminoácidos nao codificados por sequéncias de imunoglobulinas de linhagem germinativa humana (por exemplo, mutagóes introduzidas por mutagénese especifica de sitio ou aleatoria in vitro ou por mutagáo somática in vivo). 0 termo "anticorpo humanizado" refere-se a urna molécula que tem um sitio de ligagáo ao antigénio que é substancialmente derivado de urna imunoglobulina de urna espécie nao humana, em que a estrutura de imunoglobulina restante da molécula é baseada na estrutura e/ou sequéncia de urna imunoglobulina humana. 0 sitio de ligagáo ao antigénio pode compreender dominios variáveis completos fundidos em dominios constantes ou apenas as regióes determinantes de complementaridade (CDRs) enxertadas em regióes de estrutura adequadas nos dominios variáveis. Os sitios de ligagáo ao antigénio podem ser do tipo selvagem ou modificados por urna ou mais substituigóes de aminoácidos, por exemplo, modificados para assemelhar-se a imunoglobulinas humanas mais estritamente. Algumas formas de anticorpos humanizados preservam todas as sequéncias de CDR (por exemplo, um anticorpo de murganho humanizado que contém todas as seis CDRs a partir do anticorpo de murganho). Outras formas tém urna ou mais CDRs que sao alteradas em relagáo ao anticorpo original. 0 termo "anticorpo quimérico" refere-se áqueles anticorpos em que urna porgáo de cada urna das sequéncias de aminoácidos de cadeias pesada e leve é homologa a sequéncias correspondentes em anticorpos derivados de urna espécie particular ou que pertencem a urna classe particular, enquanto que o segmento restante da cadeia é homólogo ás sequéncias correspondentes em outro. Típicamente, a regiáo variável tanto da cadeia pesada como leve imita as regióes variáveis de anticorpos derivados de urna espécie de mamíferos, enquanto que as porgóes constantes sao homologas a sequéncias de anticorpos derivados de outra. Urna vantagem evidente para tais formas quiméricas é o facto de que a regiáo variável pode ser convenientemente derivada de fontes conhecidas atualmente com a utilizagáo de células B ou hibridomas prontamente disponiveis a partir de organismos hospedeiros nao humanos em combinagáo com regióes constantes derivadas de, por exemplo, preparagóes celulares humanas. Embora a regiao variável tenha a vantagem de facilidade de preparagáo e a especificidade nao seja afetada pela fonte, a regiao constante sendo humana, é menos propensa a elicitar urna resposta imunológica a partir de um individuo humano quando os anticorpos sao injetados em relagáo á regiao constante a partir de urna fonte nao humana. No entanto, a definigáo nao se limita a este exemplo particular.

Os termos "porgáo de ligagáo ao antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "porgao de ligagáo") ou "fragmento de ligagáo ao antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "fragmento de ligagao") ou termos semelhantes referem-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de ligar-se específicamente a um antigénio. Foi mostrado que a fungao de ligagao ao antigénio de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Os exemplos de fragmentos de ligagáo abrangidos pelo termo "porgáo de ligagáo ao antigénio" de um anticorpo incluem (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes que consistem nos dominios VL, VH, CL e CH; (i i) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes que compreendem dois fragmentos Fab ligados por urna ponte de dissulfeto na regiáo de dobradiga; (iii) fragmentos Fd que consistem nos dominios VH e CH; (iv) fragmentos Fv que consistem nos dominios VL e VH de um único brago de um anticorpo, (v) fragmentos dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consistem num dominio VH; (vi) regióes determinantes de complementaridade (CDRs) isoladas e (vii) combinagóes de duas ou mais CDRs isoladas que podem ser opcionalmente unidas por um ligante sintético. Adicionalmente, embora os dois dominios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, podem ser unidos, utilizando-se métodos recombinantes, por um ligante sintético que possibilita que os mesmos sejam produzidos como urna única cadeia de proteina em que as regióes VL e VH emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); veja-se, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426 ; e Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85: 5879-5883). Tais anticorpos de cadeia única também sao destinados a serem abrangidos pelo termo "fragmento de ligagao ao antigénio" de um anticorpo. Um exemplo adicional consiste ñas proteínas de fusao de imunoglobulina de dominio de ligagao que compreendem (i) um polipéptido de dominio de ligagao que é fundido a um polipéptido de regiao de dobradiga de imunoglobulina, (i i) urna regiao constante Ch2 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida a regiao de dobradiga e (iii) urna regiao constante CH3 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida á regiao constante Ch2 . 0 polipéptido de dominio de ligagao pode ser urna regiao variável de cadeia pesada ou urna regiao variável de cadeia leve. As proteínas de fusao de imunoglobulina de dominio de ligagao sao adicionalmente reveladas nos documentos sob os nos US 2003/0118592 e US 2003/0133939. Estes fragmentos de anticorpo sao obtidos com a utilizagao de técnicas convencionais conhecidas pelos peritos na especialidade, e os fragmentos sao submetidos á triagem acerca da utilidade da mesma maneira que sao os anticorpos intatos. O termo "molécula biespecífica" destina-se a incluir qualquer agente, por exemplo, urna proteína, péptido, ou complexo de proteína ou péptido, que tem duas especificidades diferentes. Por exemplo, a molécula pode ligar-se a ou interagir com (a) um antigénio de superficie celular e (b) um recetor Fe sobre a superficie de urna célula efetora. 0 termo "molécula multiespecífica" ou "molécula heteroespecífica" destina-se a incluir qualquer agente, por exemplo, urna proteína, péptido, ou complexo de proteína ou péptido, que tem mais de duas especificidades diferentes. Por exemplo, a molécula pode ligar-se a ou interagir com (a) um antigénio de superficie celular, (b) um recetor Fe sobre a superficie de urna célula efetora e (c) pelo menos um outro componente. Consequentemente, a invengáo inclui, porém sem limitagáo, moléculas biespecíficas, triespecíficas, tetraespecíficas e outras moléculas multiespecíficas que sao dirigidas a CLDN18.2, e a outros alvos, como recetores Fe em células efetoras. 0 termo "anticorpos biespecíficos" inclui também diacorpos. Os diacorpos sao anticorpos biespecíficos bivalentes em que os dominios VH e VL sao expressos numa única cadeia de polipéptido, mas que utiliza um ligante que é curto demais para permitir o emparelhamento entre os dois dominios na mesma cadeia, forgando, assim, os dominios a emparelhar com dominios complementares de urna outra cadeia e criando-se dois sitios de ligagao ao antigénio (veja-se, por exemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: 6444 a 6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121 a 1123).

Um anticorpo pode ser conjugado a um agente ou parte terapéutica, como urna citotoxina, um fármaco (por exemplo, um imunossupressor) ou um radioisótopo. Urna citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que se ja prejudicial para e, em particular, exterminar células. Os exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vimblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, diona de antracina di-hidroxi, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterono, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos. Os agentes terapéuticos adequados para a formagao de conjugados de anticorpo incluem, porém sem limitagáo, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo decarbazina) , agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) e doxorubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), blemiissima, mitramicina e antraciclina (AMC), e agentes antimitóticos (por exemplo, vincristina e vimblastina). Numa modalidade preferencial, o agente terapéutico é um agente citotóxico ou um agente radiotóxico. Numa outra modalidade, o agente terapéutico é um imunossupressor. Em ainda outra modalidade, o agente terapéutico é GM-CSF. Numa modalidade preferencial, o agente terapéutico é doxorubicina, cisplatina, bleomicina, sulfato, carmustina, clorambucil, ciclofosfamida ou ricina A.

Os anticorpos também podem ser conjugados a um radioisótopo, por exemplo, iodo-131, itrio-90 ou indio-111, para gerar produtos radiofarmacéuticos citotóxicos.

Os conjugados de anticorpo da instrugáo podem ser utilizados para modificar urna determinada resposta biológica, e a parte de fármaco nao deve ser interpretada como limitada aos agentes terapéuticos químicos clássicos. Por exemplo, a parte de fármaco pode ser urna proteína ou polipéptido que possui urna atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, urna toxina enzimaticamente ativa, ou fragmento ativo da mesma, como abrina, ricina A, endotoxina de Pseudomonas, ou toxina da difteria; urna proteína, como fator de necrose tumoral ou interferáo-γ; ou modificadores de resposta biológica, como, por exemplo, linfoquinas, interleucina-1 ("IL-l"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator estimulante de colonias de macrófagos e granulócitos ("GM-CSF"), fator estimulante de colonias de granulócitos ("G-CSF") ou outros fatores de crescimento.

As técnicas para conjugagáo de tal parte terapéutica a anticorpos sao bem conhecidas, veja-se, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al. (editores), páginas 243 a 256 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2a edigáo), Robinson et al. (editores), páginas 623 a 653 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pincheraet al. (editores), páginas 475 a 506 (1985); " Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (editores), páginas 303 a 316 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of anticorpo-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119 a 158 (1982).

Para utilizagáo no presente documento, um anticorpo é "derivado de" urna sequéncia de linhagens germinativas particular se o anticorpo for obtido a partir de um sistema por meio da imunizagao de um animal ou por triagem de urna biblioteca de genes de imunoglobulina, e em que o anticorpo selecionado é pelo menos 90%, mais preferencialmente, pelo menos 95%, aínda mais preferencialmente, pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idéntico em sequéncia de aminoácidos á sequéncia de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linhagem germinativa. Típicamente, um anticorpo derivado de urna sequéncia de linhagens germinativas particular irá exibir nao mais do que 10 diferengas de aminoácidos, mais preferencialmente, nao mais do que 5, aínda mais preferencialmente, nao mais do que 4, 3, 2 ou 1 diferenga de aminoácido da sequéncia de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linhagem germinativa.

Para utilizagao na presente invengáo, o termo "heteroanticorpos" refere-se a dois ou mais anticorpos, derivados dos mesmos, ou regióes de ligagáo ao antigénio ligadas juntas, em que pelo menos dois tém especificidades diferentes. Estas especificidades diferentes incluem urna especificidade de ligagáo para um recetor Fe numa célula efetora, e urna especificidade de ligagáo para um antigénio ou epítopo numa célula alvo, por exemplo, urna célula tumoral.

Os anticorpos descritos no presente documento podem ser anticorpos monoclonais. 0 termo "anticorpo monoclonal", para utilizagáo na presente invengáo, refere-se a urna preparagáo de moléculas de anticorpo de composigao molecular única. Um anticorpo monoclonal exibe urna única afinidade e especificidade de ligagao. Numa modalidade, os anticorpos monoclonais sao produzidos por um hibridoma que incluí urna célula B obtida a partir de um animal nao humano, por exemplo, murganho, fundida a urna célula imortalizada.

Os anticorpos descritos no presente documento podem ser anticorpos recombinantes. 0 termo "anticorpo recombinante", para utilizagáo na presente invengáo, incluí todos os anticorpos que sao preparados, expressos, criados ou isolados por meros recombinantes, como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um murganho) que é transgénico ou transcromossómico em relagao aos genes de imunoglobulina ou um hibridoma preparado a partir dos mesmos, (b) anticorpos isolados a partir de urna célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, a partir de urna transíectoma, (c) anticorpos isolados a partir de urna biblioteca de anticorpos combinatorios recombinantes e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem splicing de sequéncias de genes de imunoglobulina em outras sequéncias de ADN.

Os anticorpos descritos no presente documento podem ser derivados de espécies diferentes, incluindo, porém sem limitagao, murganho, rato, coelho, porquinho da india e ser humano.

Os anticorpos descritos no presente documento incluem anticorpos monoclonais e policlonais e incluem IgA, como anticorpos de IgAl or IgA2, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM e IgD. Em diversas modalidades, o anticorpo é um anticorpo de IgGl, mais particularmente, urna IgGl, kappa ou IgGl, isotipo lambda (isto é, IgGl, κ, λ) , um anticorpo de IgG2a (por exemplo, IgG2a, κ, λ) , um anticorpo de IgG2b (por exemplo, IgG2b, κ, λ) , um anticorpo de IgG3 (por exemplo, IgG3, κ, λ) ou um anticorpo de IgG4 (por exemplo, IgG4, κ, λ) . 0 termo "transfectoma", para utilizagao na presente invengao, incluí células hospedeiras eucarióticas recombinantes que expressam um anticorpo, como células CHO, células NS/0, células HEK293, células HEK293T, células de planta ou fungos, incluindo células de levedura.

Para utilizagao na presente invengao, um "anticorpo heterólogo" é definido em relagao a um organismo transgénico que produz tal anticorpo. Este termo refere-se a um anticorpo que tem urna sequéncia de aminoácidos ou urna sequéncia de ácidos nucleicos de codificagáo que corresponde áquela encontrada num organismo que nao consiste no organismo transgénico, e que é geralmente derivada de urna espécie diferente do organismo transgénico.

Para utilizagao na presente invengao, um "anticorpo hetero-híbrido" refere-se a um anticorpo que tem cadeias leves e pesadas de origens de organismo diferentes. Por exemplo, um anticorpo que tem urna cadeia pesada humana associada a urna cadeia leve murina é um anticorpo hetero-híbrido. A instrugáo incluí todos os anticorpos e derivados de anticorpos, conforme descrito no presente documento, que para os propósitos da instrugáo sao abrangidos pelo termo "anticorpo". 0 termo "derivados de anticorpo" refere-se a qualquer forma modificada de um anticorpo, por exemplo, um conjugado do anticorpo e um outro agente ou anticorpo, ou um fragmento de anticorpo.

Os anticorpos descritos no presente documento sao, preferencialmente, isolados. Um "anticorpo isolado", para utilizagao na presente invengao, destina-se a referir a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos que tém especificidades antigénicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especifreamente a CLDN18.2 é substancialmente isento de anticorpos que ligam especificamente antigénios diferentes de CLDN18.2). Um anticorpo isolado que se liga específicamente a um epítopo, isoforma ou variante de CLDN18.2 humana pode, no entanto, ter reatividade cruzada com outros antigénios relacionados, por exemplo, a partir de outras espécies (por exemplo, homólogos de espécie de CLDN18.2). Ademáis, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outro material celular e/ou produtos químicos. Numa modalidade, urna combinagáo de anticorpos monoclonais "isolados" refere-se a anticorpos que tém especificidades diferentes e que sao combinados numa mistura ou composigao bem definida. 0 termo "ligagao", de acordo com a instrugao, refere-se preferencialmente, a urna ligagao especifica.

De acordo com a presente instrugao, um anticorpo tem capacidade de ligar-se a um alvo predeterminado se tiver urna afinidade significativa para o referido alvo predeterminado e ligar-se ao referido alvo predeterminado em ensaios-padrao. "Afinidade" ou "afinidade de ligagao" é muitas vezes medida pela constante de dissociagao de equilibrio (KD) . De preferencia, o termo "afinidade significativa" refere-se á ligagao a um alvo predeterminado com urna constante de dissociagáo (KD) de ΙΟ-5 M ou menor, 10~6 M ou menor, 10-7 M ou menor, ΙΟ-8 M ou menor, ΙΟ-9 M ou menor, ΙΟ-10 M ou menor, 10~n M ou menor ou 10~12 M ou menor.

Um anticorpo nao tem (substancialmente) capacidade de ligarse a um alvo se nao tiver afinidade significativa para o referido alvo e nao se ligar significativamente, em particular, nao se ligar de modo detetável, ao referido alvo em ensaios-padrao. De preferencia, o anticorpo nao se liga de modo detetável ao referido alvo se estiver presente numa concentragáo de até 2, de preferencia, 10, com mais preferencia, 20, em particular 50 ou 100 yg/ml ou maior. De preferencia, um anticorpo nao tem afinidade significativa para um alvo se ligar ao referido alvo com urna KD que é pelo menos 10 vezes, 100 vezes, 103 vezes, 104 vezes, 105 vezes ou 106 vezes maior que a KD para a ligagao ao alvo predeterminado ao qual o anticorpo tem capacidade de ligar-se. Por exemplo, se a KD para a ligagao de um anticorpo ao alvo, ao qual o anticorpo tem capacidade de ligar-se, de ΙΟ-7 M a KD para a ligagao a um alvo para qual o anticorpo nao tem afinidade significativa seria de pelo menos ΙΟ-6 Μ, 10-5 Μ, ΙΟ-4 Μ, 10~3 M, 10“2 M ou ΙΟ”1 M.

Um anticorpo é especifico para um alvo predeterminado se tiver capacidade de ligar-se ao referido alvo predeterminado, ao mesmo tempo em que nao tem capacidade de ligar-se a outros alvos, isto é, nao tem afinidade significativa para outros alvos e nao se liga significativamente a outros alvos em ensaios-padrao. De acordo com a invengáo, um anticorpo é especifico para CLDN18.2 se tiver capacidade de ligar-se a CLDN18.2, mas nao ter (substancialmente) capacidade de ligar-se a outros alvos. De preferencia, um anticorpo é especifico para CLDN18.2 se a afinidade para e a ligagao a tais outros alvos nao excederem significativamente a afinidade para ou ligagao a proteínas nao relacionadas com CLDN18.2, como albúmina sérica bovina (BSA), caseína, albúmina sérica humana (HSA) ou proteínas transmembranares diferentes de claudina, como moléculas de MHC ou recetor de transíerrina, ou qualquer outro polipéptido especificado. De preferencia, um anticorpo é específico para um alvo predeterminado se ligar-se ao referido alvo com urna KD que é pelo menos 10 vezes, 100 vezes, 103 vezes, 104 vezes, 105 vezes ou 106 vezes menor que a KD para a ligagao a um alvo ao qual o anticorpo nao é específico. Por exemplo, se a KD para ligagao de um anticorpo ao alvo, ao qual o mesmo é específico, for de ΙΟ-7 M, a KD para a ligagao a um alvo ao qual nao é específico seria de pelo menos ΙΟ"6 Μ, ΙΟ"5 Μ, 10~4 Μ, ΙΟ’3 Μ, 10“2 M ou ΙΟ’1 M. A ligagao de um anticorpo a um alvo pode ser determinada experimentalmente com a utilizagao de qualquer método adequado; veja-se, por exemplo, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" em Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman e Company New York, N Y (1992), e métodos descritos no presente documento. As afinidades podem ser prontamente determinadas com a utilizagao de técnicas convencionais, como por diálise de equilibrio; com utilizagao do instrumento BIAcore 2000, com a utilizagao de procedimentos gerais descritos pelo fabricante; por radioimunoensaio com a utilizagao de antigénio alvo radiomarcado; ou por meio de um outro método conhecido pelo perito na especialidade. Os dados de afinidade podem ser analisados, por exemplo, pelo método de Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949). A afinidade medida de urna interagao de anticorpo-antigénio particular pode variar se medida sob condigdes diferentes, por exemplo, concentragáo de sal, pH. Dessa forma, as medigóes de afinidade e outros parámetros de ligagáo ao antigénio, por exemplo, KD, IC50, sao, de preferencia, feitas com solugóes padronizadas de anticorpo e antigénio e um tampáo padronizado.

Para utilizagao na presente invengáo, "isotipo" refere-se á classe de anticorpo (por exemplo, IgM ou IgGl) que é codificada por genes de regiáo constante de cadeia pesada.

Para utilizagao na presente invengáo, "comutagáo de isotipo" refere-se ao fenómeno através do qual a classe, ou isotipo, de um anticorpo se altera de urna classe de Ig para urna das outras classes de Ig. 0 termo "de ocorréncia natural", para utilizagao na presente invengáo, conforme aplicado a um objeto, refere-se ao facto de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, urna sequéncia de polipéptidos ou polinucleótidos que está presente num organismo (incluindo virus) que pode ser isolada de urna fonte na natureza e que nao foi intencionalmente modificada pelo homem no laboratorio é de ocorréncia natural. 0 termo "redisposto", para utilizagao na presente invengáo, refere-se a urna configuragáo de um locus de imunoglobulina de cadeia pesada ou cadeia leve em que um segmento V é posicionado imediatamente adjacente a um segmento D-J ou J numa conformagao que codifica essencialmente um dominio VH ou VL completo, respetivamente. Um locus de gene de imunoglobulina (anticorpo) redisposto pode ser identificado mediante a comparagáo com ADN de linhagem germinativa; um locus redisposto terá pelo menos um elemento de homología de

Heptámeron/nonámero recombinado. o termo "nao redisposto" ou "configuragáo de linhagem germinativa", para utilizagao na presente invengáo, com referencia a um segmento V, refere-se á configuragáo em que o segmento V nao é recombinado para que se ja imediatamente adjacente a um segmento D ou J.

De acordo com a instrugao, um anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2 é um anticorpo com capacidade de ligar-se a um epítopo presente em CLDN18.2, de preferencia, um epitopo situado dentro dos dominios extracelulares de CLDN18.2, em particular, o primeiro dominio extracelular, de preferencia, posigóes de aminoácido 29 a 78 de CLDN18.2. Em modalidades particulares, um anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2 é um anticorpo com capacidade de ligar-se a (i) um epitopo em CLDN18.2 que nao está presente em CLDN18.1, de preferencia, SEQ ID NO: 3, 4 e 5, (i i) um epitopo localizado no CLDN18.2-loopl, de preferencia, SEQ ID NO: 8, (iii) um epitopo localizado no CLDN18.2-loop2, de preferencia, SEQ ID NO: 10, (iv) um epitopo localizado no CLDN18.2-loopD3, de preferencia, SEQ ID NO: 11, (v) um epítopo que abrange CLDN18.2-loopl e CLDN18.2-loopD3, ou (vi) um epitopo nao glicósido localizado no CLDN18.2-loopD3, de preferencia, SEQ ID NO: 9.

De acordo com a instrugao, um anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2 é, de preferencia, um anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2, mas nao a CLDN18.1. De preferencia, um anticorpo que tem a capacidade de ligarse a CLDN18.2 é específica para CLDN18.2. De preferencia, um anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2 é, de preferencia, um anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2 expresso na superficie celular. Em modalidades preferenciais particulares, um anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2 liga-se a epítopos nativos de CLDN18.2 presentes sobre a superficie de células vivas. De preferencia, um anticorpo que tem a capacidade de ligarse a CLDN18.2 se liga a um ou mais péptidos selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 3 a 11, 44, 46 e 48 a 50. De preferencia, um anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2 é especifico para as proteínas, péptidos ou fragmentos imunogénicos anteriormente mencionados ou derivados dos mesmos. Um anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2 pode ser obtido por um método que compreende a etapa de imunizar um animal com urna proteína ou péptido que compreende urna sequéncia de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 3 a 11, 44, 46 e 48 a 50, ou um ácido nucleico ou célula hospedeira que expressa a referida proteína ou péptido. De preferencia, o anticorpo liga se a células de cancro, em particular, células dos tipos de cancro mencionados acima e, de preferencia, nao se ligam substancialmente a células nao cancerosas.

De preferencia, a ligagáo de um anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2 a células que expressam CLDN18.2 induz ou media o exterminio de células que expressam CLDN18.2. As células que expressam CLDN18.2 sao, de preferencia, células de cancro e sao, em particular, selecionadas do grupo que consiste em células tumorgénicas gástricas, esofágicas, pancreáticas, de pulmáo, ovário, colon, hepáticas, cabega e pescogo e células de cancro de vesícula biliar. De preferencia, o anticorpo induz ou media o exterminio de células por meio da indugao de urna ou mais de lise mediada por citotoxicidade dependente de complemento (CDC), lise mediada por citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), apoptose e inibigáo de proliferagao de células que expressam CLDN18.2. De preferencia, a lise mediada por ADCC de células ocorre na presenga de células efetoras que, em modalidades particulares, sao selecionadas do grupo que consiste em monócitos, células mononucleares, células NK e PMNs. A inibigáo da proliferagao de células pode ser medida in vitro por meio da determinagao da proliferagao de células num ensaio com a utilizagao de bromodesoxiuridina (5-bromo-2-desoxiuridina, BrdU). BrdU é um nucleósido sintético que é um análogo de timidina e pode ser incorporado no ADN recém-sintetizado de células de replicagáo (durante a fase S do ciclo celular), substituindo por timidina durante a replicagáo de ADN. A detegáo do produto químico incorporado com a utilizagao de, por exemplo, anticorpos específicos para BrdU indica células que estavam ativamente a replicar o seu ADN.

Em modalidades preferenciais, os anticorpos descritos no presente documento podem ser caracterizados por urna ou mais das seguintes propriedades: a) especificidade para CLDN18.2; b) urna afinidade de ligagao a CLDN18.2 de cerca de 100 nM ou menos, de preferencia, cerca de 5 a 10 nM ou menos e, com mais preferencia, cerca de 1 a 3 nM ou menos, c) a capacidade para induzir ou mediar CDC em células positivas para CLDN18.2; d) a capacidade para induzir ou mediar ADCC em células positivas para CLDN18.2; e) a capacidade para inibir o crescimento de células positivas para CLDN18.2; f) a capacidade para induzir apoptose de células positivas para CLDN18.2.

Numa modalidade particularmente preferencial, um anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2 é produzido por um hibridoma depositado no DSMZ (Mascheroder Weg Ib, 31824 Braunschweig, Alemanha; novo enderego: Inhoffenstr. 7B, 31824 Braunschweig, Alemanha) e que tem a seguinte designagao e número de acesso: a. 182-D1106-055, n° de acesso DSM ACC2737, depositado em 19 de outubro de 2005 b. 182-D1106-056, n° de acesso DSM ACC2738, depositado em 19 de outubro de 2005 c. 182-D1106-057, n° de acesso DSM ACC2739, depositado em 19 de outubro de 2005 d. 182-D1106-058, n° de acesso DSM ACC2740, depositado em 19 de outubro de 2005 e. 182-D1106-059, n° de acesso DSM ACC2741, depositado em 19 de outubro de 2005 f. 182-D1106-062, n° de acesso DSM ACC2742, depositado em 19 de outubro de 2005 g. 182-D1106-067, n° de acesso DSM ACC2743, depositado em 19 de outubro de 2005 h. 182-D758-035, n° de acesso DSM ACC2745, depositado em 17 de novembro de 2005 i. 182-D758-036, n° de acesso DSM ACC2746, depositado em 17 de novembro de 2005 j. 182-D758-040, n° de acesso DSM ACC2747, depositado em 17 de novembro de 2005 k. 182-D1106-061, n° de acesso DSM ACC2748, depositado em 17 de novembro de 2005 l. 182-D1106-279, n° de acesso DSM ACC2808, depositado em 26 de outubro de 2006 m. 182-DI106-294, n° de acesso DSM ACC2809, depositado em 26 de outubro de 2006 n. 182-D1106-362, n° de acesso DSM ACC2810, depositado em 26 de outubro de 2006

Os anticorpos preferenciais de acordo com a instrugao sao aqueles produzidos por e obtidos a partir dos hibridomas descritos acima; isto é, 37G11 no caso de 182-D1106-055, 37H8 no caso de 182-D1106-056, 38G5 no caso de 182-D1106- 057, 38H3 no caso de 182-D1106-058, 39F11 no caso de 182-D1106-059, 43A11 no caso de 182-D1106-062, 61C2 no caso de 182-D1106-067, 26B5 no caso de 182-D758-035, 26D12 no caso de 182-D758-036, 28D10 no caso de 182-D758-040, 42E12 no caso de 182-D1106-061, 125E1 no caso de 182-D1106-279, 163E12 no caso de 182-D1106-294 e 175D10 no caso de 182-D1106-362; e as formas humanizadas e quimerizadas dos mesmos.

Os anticorpos quimerizados preferenciais e suas sequéncias sao mostrados na Tabela a seguir.

Em modalidades preferenciais, os anticorpos, em particular as formas quimerizadas de anticorpos, de acordo com a invengao, incluem anticorpos que compreendem urna regiao constante de cadeia pesada (CH) que compreende urna sequéncia de aminoácidos derivada de urna regiao constante de cadeia pesada humana, como a sequéncia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 13 ou um fragmento da mesma. Em modalidades preferenciais adicionáis, os anticorpos, em particular as formas quimerizadas de anticorpos, de acordo com a invengao, incluem anticorpos que compreendem urna regiao constante de cadeia leve (CL) que compreende urna sequéncia de aminoácidos derivada de urna regiao constante de cadeia leve humana, como a sequéncia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12 ou um fragmento da mesma. Numa modalidade preferencial particular, os anticorpos, em particular as formas quimerizadas de anticorpos, de acordo com a invengáo, incluem anticorpos que compreendem urna CH que compreende urna sequéncia de aminoácidos derivada de urna CH humana, como a sequéncia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 13 ou um fragmento da mesma e que compreende urna CL que compreende urna sequéncia de aminoácidos derivada de urna CL humana, como a sequéncia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12 ou um fragmento da mesma.

Em urna modalidade, um anticorpo que tem a capacidade para ligar-se ao CLDN18.2 é um anticorpo monoclonal de IgGl de murganho/humano quimérico que compreende cadeia leve variável kappa murina, alotipo de regiao constante de cadeia leve kappa humana Km(3), regiao variável de cadeia pesada murina, regiao constante de IgGl humana, alotipo Glm(3).

Em determinadas modalidades preferenciais, formas quimerizadas de anticorpos incluem anticorpos que compreendem urna cadeia pesada que compreende urna sequéncia de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18, 19, e um fragmento da mesma e/ou que compreendem urna cadeia leve que compreende urna sequéncia de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, e um fragmento da mesma.

Em determinadas modalidades preferenciais, formas quimerizadas de anticorpos incluem anticorpos que compreendem urna combinagáo de cadeias pesadas e cadeias leves selecionada dentre as possibilidades (i) a (ix) a seguir: (i) a cadeia pesada compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 14 ou um fragmento da mesma e a cadeia leve compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 21 ou um fragmento da mesma, (ii) a cadeia pesada compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 15 ou um fragmento da mesma e a cadeia leve compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 20 ou um fragmento da mesma, (iii) a cadeia pesada compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 16 ou um fragmento da mesma e a cadeia leve compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 22 ou um fragmento da mesma, (iv) a cadeia pesada compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 18 ou um fragmento da mesma e a cadeia leve compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 25 ou um fragmento da mesma, (v) a cadeia pesada compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 17 ou um fragmento da mesma e a cadeia leve compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 24 ou um fragmento da mesma, (vi) a cadeia pesada compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 19 ou um fragmento da mesma e a cadeia leve compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 23 ou um fragmento da mesma, (vii) a cadeia pesada compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 19 ou um fragmento da mesma e a cadeia leve compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 26 ou um fragmento da mesma, (viii) a cadeia pesada compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 19 ou um fragmento da mesma e a cadeia leve compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 27 ou um fragmento da mesma, e (ix) a cadeia pesada compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 19 ou um fragmento da mesma e a cadeia leve compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 28 ou um fragmento da mesma. "Fragmento" ou "fragmento de urna sequéncia de aminoácidos", conforme utilizado acima, refere-se a urna parte de urna sequéncia de anticorpos, isto é, urna sequéncia que representa a sequéncia de anticorpos encurtada na terminagáo N e/ou C, que quando substituí a referida sequéncia de anticorpo num anticorpo retém a ligagao do referido anticorpo ao CLDN18.2 e, de preferencia, as fungóes do referido anticorpo, conforme descrito no presente documento, por exemplo, lise mediada por CDC ou lise mediada por ADCC. De preferéncia, um fragmento de urna sequéncia de aminoácidos compreende pelo menos 80%, de preferéncia, pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos residuos de aminoácido da referida sequéncia de aminoácidos. Um fragmento de urna sequéncia de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 e 28, de preferéncia, refere-se á referida sequéncia em que 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 aminoácidos na terminagáo N sao removidos.

Numa modalidade preferencial, um anticorpo que tem a capacidade para ligar-se ao CLDN18.2 compreende urna regiao variável de cadeia pesada (VH) que compreende urna sequéncia de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33, 34, e um fragmento da mesma.

Numa modalidade preferencial, um anticorpo que tem a capacidade para ligar-se ao CLDN18.2 compreende urna regiao variável de cadeia leve (VL) que compreende urna sequéncia de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, e um fragmento da mesma.

Em determinadas modalidades preferenciais, um anticorpo que tem a capacidade para ligar-se ao CLDN18.2 compreende urna combinagao de regiao variável de cadeia pesada (VH) e regiao variável de cadeia leve (VL) selecionada a partir das seguintes possibilidades (i) a (ix): (i) a VH compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 9 ou um fragmento da mesma e a VL compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 36 ou um fragmento da mesma, (ii) a VH compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30 ou um fragmento da mesma e a VL compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 35 ou um fragmento da mesma, (iii) a VH compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 31 ou um fragmento da mesma e a VL compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 37 ou um fragmento da mesma, (iv) a VH compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 33 ou um fragmento da mesma e a VL compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 40 ou um fragmento da mesma, (v) a VH compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 32 ou um fragmento da mesma e a VL compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 ou um fragmento da mesma, (vi) a VH compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 34 ou um fragmento da mesma e a VL compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 38 ou um fragmento da mesma, (vii) a VH compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 34 ou um fragmento da mesma e a VL compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 41 ou um fragmento da mesma, (viii) a VH compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 34 ou um fragmento da mesma e a VL compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 42 ou um fragmento da mesma, (ix) a VH compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 34 ou um fragmento da mesma e a VL compreende urna sequéncia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 43 ou um fragmento da mesma.

Numa modalidade preferencial, um anticorpo que tem a capacidade para ligar-se ao CLDN18.2 compreende urna VH que compreende um conjunto de regióes de determinagao de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 selecionado a partir das modalidades (i) a (vi) a seguir: (i) CDR1: posigóes 45 a 52 de SEQ ID NO: 14, CDR2: posigóes 70 a 77 de SEQ ID NO: 14, CDR3: posigóes 116 a 125 de SEQ ID NO: 14, (ii) CDR1: posigóes 45 a 52 de SEQ ID NO: 15, CDR2: posigóes 70 a 77 de SEQ ID NO: 15, CDR3: posigóes 116 a 126 de SEQ ID NO: 15, (iii) CDR1: posigdes 45 a 52 de SEQ ID NO: 16, CDR2 : posigdes 70 a 77 de SEQ ID NO: 16, CDR3: posigdes 116 a 124 de SEQ ID NO: 16, (iv) CDR1: posigdes 45 a 52 de SEQ ID NO: 17, CDR2: posigdes 70 a 77 de SEQ ID NO: 17, CDR3: posigdes 116 a 126 de SEQ ID NO: 17, (v) CDR1: posigdes 44 a 51 de SEQ ID NO: 18, CDR2: posigdes 69 a 76 de SEQ ID NO: 18, CDR3: posigdes 115 a 125 de SEQ ID NO: 18, e (vi) CDR1: posigdes 45 a 53 de SEQ ID NO: 19, CDR2: posigdes 71 a 78 de SEQ ID NO: 19, CDR3: posigdes 117 a 128 de SEQ ID NO: 19.

Numa modalidade preferencial, um anticorpo que tem a capacidade para ligar-se ao CLDN18.2 compreende urna VL que compreende um conjunto de regioes de determinagao de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 selecionado a partir das modalidades (i) a (ix) a seguir: (i) CDR1: posigdes 47 a 58 de SEQ ID NO: 20, CDR2: posigdes 76 a 78 de SEQ ID NO: 20, CDR3: posigdes 115 a 123 de SEQ ID NO: 20, (ii) CDR1: posigdes 49 a 53 de SEQ ID NO: 21, CDR2: posigdes 71 a 73 de SEQ ID NO: 21, CDR3: posigdes 110 a 118 de SEQ ID NO: 21, (iii) CDR1: posigdes 47 a 52 de SEQ ID NO: 22, CDR2: posigdes 70 a 72 de SEQ ID NO: 22, CDR3: posigdes 109 a 117 de SEQ ID NO: 22, (iv) CDR1: posigóes 47 a 58 de SEQ ID NO: 23, CDR2: posigóes 76 a 78 de SEQ ID NO: 23, CDR3: posigóes 115 a 123 de SEQ ID NO: 23, (v) CDR1: posigóes 47 a 58 de SEQ ID NO: 24, CDR2: posigóes 76 a 78 de SEQ ID NO: 24, CDR3: posigóes 115 a 123 de SEQ ID NO: 24, (vi) CDR1: posigóes 47 a 58 de SEQ ID NO: 25, CDR2: posigóes 76 a 78 de SEQ ID NO: 25, CDR3: posigóes 115 a 122 de SEQ ID NO: 25,

(vi i) CDR1: posigóes 47 a 58 de SEQ ID NO: 26, CDR2 : posigóes 76 a 78 de SEQ ID NO: 26, CDR3: posigóes 115 a 123 de SEQ ID NO: 2 6, (vi i i) CDR1: posigóes 47 a 58 de SEQ ID NO: 27, CDR2: posigóes 76 a 78 de SEQ ID NO: 27, CDR3: posigóes 115 a 123 de SEQ ID NO: 27, e (ix) CDR1: posigóes 47 a 52 de SEQ ID NO: 28, CDR2: posigóes 70 a 72 de SEQ ID NO: 28, CDR3: posigóes 109 a 117 de SEQ ID NO: 28.

Numa modalidade preferencial, um anticorpo que tem a capacidade para ligar-se ao CLDN18.2 compreende urna combinagao de VH e VL, em que cada urna compreende um conjunto de regióes de determinagao de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 selecionado a partir das modalidades (i) a (ix) a seguir: (i) VH: CDR1: posigóes 45 a 52 de SEQ ID NO: 14, CDR2: posigdes 70 a 77 de SEQ ID NO: 14, CDR3: posigdes 116 a 125 de SEQ ID NO: 14, VL: CDR1: posigdes 49 a 53 de SEQ ID NO: 21, CDR2: posigdes 71 a 73 de SEQ ID NO: 21, CDR3: posigdes 110 a 118 de SEQ ID NO: 21, (ii) VH: CDR1 : posigdes 45 a 52 de SEQ ID NO: 15, CDR2: posigdes 70 a 77 de SEQ ID NO: 15, CDR3: posigdes 116 a 126 de SEQ ID NO: 15, VL: CDR1: posigdes 47 a 58 de SEQ ID NO: 20, CDR2: posigdes 76 a 78 de SEQ ID NO: 20, CDR3: posigdes 115 a 123 de SEQ ID NO: 20, (i i i) VH: CDR1: posigdes 45 a 52 de SEQ ID NO: 16, CDR2: posigdes 70 a 77 de SEQ ID NO: 16, CDR3: posigdes 116 a 124 de SEQ ID NO: 16, VL: CDR1: posigdes 47 a 52 de SEQ ID NO: 22, CDR2: posigdes 70 a 72 de SEQ ID NO: 22, CDR3: posigdes 109 a 117 de SEQ ID NO: 22, (iv) VH: CDR1 : posigdes 44 a 51 de SEQ ID NO: 18, CDR2: posigdes 69 a 76 de SEQ ID NO: 18, CDR3: posigdes 115 a 125 de SEQ ID NO: 18, VL: CDR1: posigdes 47 a 58 de SEQ ID NO: 25, CDR2: posigdes 76 a 78 de SEQ ID NO: 25, CDR3: posigdes 115 a 122 de SEQ ID NO: 25, (v) VH: CDR1: posigdes 45 a 52 de SEQ ID NO: 17, CDR2: posigdes 70 a 77 de SEQ ID NO: 17, CDR3: posigdes 116 a 126 de SEQ ID NO: 17, VL: CDR1: posigdes 47 a 58 de SEQ ID NO: 24, CDR2: posigdes 76 a 78 de SEQ ID NO: 24, CDR3: posigdes 115 a 123 de SEQ ID NO: 24, (vi) VH: CDR1 : posigdes 45 a 53 de SEQ ID NO: 19, CDR2: posigdes 71 a 78 de SEQ ID NO: 19, CDR3: posigdes 117 a 128 de SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: posigdes 47 a 58 de SEQ ID NO: 23, CDR2: posigdes 76 a 78 de SEQ ID NO: 23, CDR3: posigdes 115 a 123 de SEQ ID NO: 23, (vii) VH: CDR1: posigóes 45 a 53 de SEQ ID NO: 19, CDR2: posigóes 71 a 78 de SEQ ID NO: 19, CDR3: posigóes 117 a 128 de SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: posigóes 47 a 58 de SEQ ID NO: 26, CDR2: posigóes 76 a 78 de SEQ ID NO: 26, CDR3: posigóes 115 a 123 de SEQ ID NO: 26, (vi i i) VH: CDR1: posigóes 45 a 53 de SEQ ID NO: 19, CDR2: posigóes 71 a 78 de SEQ ID NO: 19, CDR3: posigóes 117 a 128 de SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: posigóes 47 a 58 de SEQ ID NO: 27, CDR2: posigóes 76 a 78 de SEQ ID NO: 27, CDR3: posigóes 115 a 123 de SEQ ID NO: 27, e (ix) VH: CDR1 : posigóes 45 a 53 de SEQ ID NO: 19, CDR2: posigóes 71 a 78 de SEQ ID NO: 19, CDR3: posigóes 117 a 128 de SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: posigóes 47 a 52 de SEQ ID NO: 28, CDR2: posigóes 70 a 72 de SEQ ID NO: 28, CDR3: posigóes 109 a 117 de SEQ ID NO: 28.

Em modalidades adicionalmente preferenciais, um anticorpo que tem a capacidade para ligar-se ao CLDN18.2, compreende, de preferencia, urna ou mais das regióes de determinagao de complementaridade (CDRs), de preferencia, pelo menos a regiao variável CDR3, da regiao variável de cadeia pesada (VH) e/ou da regiao variável de cadeia leve (VL) de um anticorpo monoclonal contra CLDN18.2, de preferencia, de um anticorpo monoclonal contra o CLDN18.2 descrito no presente documento e, compreende, de preferencia, urna ou mais das regióes de determinagao de complementaridade (CDRs), de preferencia, pelo menos a regiao variável CDR3, das regióes variáveis de cadeia pesada (VH) e/ou regióes variáveis de cadeia leve (VL) descritas no presente documento. Em urna modalidade, urna ou mais das regióes de determinagao de complementaridade referidas(CDRs) sao selecionadas a partir de um conjunto de regióes de determinagao de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 descritas no presente documento. Numa modalidade particularmente preferencial, um anticorpo que tem a capacidade para ligar-se ao CLDN18.2, compreende, de preferencia, as regioes de determinagao de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 da regiao variável de cadeia pesada (VH) e/ou da regiao variável de cadera leve (VL) de um anticorpo monoclonal contra CLDN18.2, de preferencia, de um anticorpo monoclonal contra o CLDN18.2 descrito no presente documento e compreende, de preferencia, as regióes de determinagao de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 das regióes variáveis de cadeia pesada (VH) e/ou regióes variáveis de cadeia leve (VL) descritas no presente documento.

Em urna modalidade, um anticorpo que compreende urna ou mais CDRs, um conjunto de CDRs ou urna combinagáo de conjuntos de CDRs, conforme descrito no presente documento, compreende as referidas CDRs juntamente com suas regióes estruturais intervenientes. De preferencia, a porgáo também incluirá pelo menos cerca de 50% de urna ou tanto da primeira quanto da quarta regióes estruturais, em que os 50% sao os 50% C-terminal da primeira regiao estrutural e os 50% N-terminal da quarta reqiáo estrutural. A construgáo de anticorpos realizada por técnicas de ADN recombinante pode resultar na introdugáo de residuos N ou C-terminal ñas regióes variáveis codificadas por ligantes introduzidos para facilitar a clonagem ou outras etapas de manipulagáo, incluindo a introdugáo de ligantes para unir as regióes variáveis descritas no presente documento a sequéncias de proteínas adicionáis, incluindo cadeias pesadas de imunoglobulina, outros dominios variáveis (por exemplo, na produgao de diacorpos) ou identificagóes de proteina.

Em urna modalidade, um anticorpo que compreende urna ou mais CDRs, um conjunto de CDRs ou urna combinagao de conjuntos de CDRs conforme descrito no presente documento compreende as referidas CDRs numa estrutura de anticorpo humano. A referencia no presente documento a um anticorpo que compreende, em relagao á cadeia pesada do mesmo, urna cadeia particular, ou urna regiao ou sequéncia particular, refere-se, de preferencia, á situagao em que todas as cadeias pesadas do referido anticorpo compreendem a referida cadeia de regiao ou sequéncia particular. Correspondentemente, isso aplica-se á cadeia leve de um anticorpo. 0 termo "ácido nucleico", conforme utilizado no presente documento, destina-se a incluir ADN e ARN. Um ácido nucleico pode ser um ADN com fita simples ou fita dupla, mas, de preferencia, é um ADN com fita dupla.

De acordo com as instrugóes, o termo "expressao" é utilizado em seu significado mais geral e compreende a produgáo de ARN ou de ARN e proteina/péptido. 0 mesmo também compreende a expressao parcial de ácidos nucleicos. Além disso, a expressao pode ser realizada de maneira temporária ou estável.

As instrugóes fornecidas no presente documento em relagao as sequéncias de aminoácidos especificas, por exemplo, aquelas mostradas na listagem de sequéncias, devem ser interpretadas de modo a também estarem relacionadas com variantes das referidas sequéncias especificas que resultam em sequéncias que sao funcionalmente equivalentes as referidas sequéncias especificas, por exemplo, as sequéncias de aminoácidos que exibem propriedades idénticas ou semelhantes aquelas das sequéncias de aminoácidos especificas. Urna propriedade importante é reter a ligagao de um anticorpo a seu alvo ou sustentar as fungóes efetoras de um anticorpo. De preferencia, urna sequéncia que é urna variante em relagáo a urna sequéncia especifica, quando a mesma substituí a sequéncia especifica num anticorpo, retém a ligagáo do referido anticorpo ao CLDN18.2 e, de preferéncia, as fungóes do referido anticorpo, conforme descrito no presente documento, por exemplo, lise mediada por CDC ou lise mediada por ADCC.

Será entendido pelos individuos versados na técnica que, em particular, as sequéncias das regióes CDR, hipervariáveis e variáveis podem ser modificadas sem a perda da capacidade para ligar-se ao CLDN18.2. Por exemplo, as regióes CDR seráo idénticas ou altamente homologas ás regióes de anticorpos especificados no presente documento. Por "altamente homologa" contempla-se que de 1 a 5, de preferéncia, de 1 a 4, tal como de 1 a 3 ou de 1 a 2 substituigóes podem ser feitas ñas CDRs. Além disso, as regióes hipervariáveis e variáveis podem ser modificadas de modo que as mesmas mostrem homología substancial com as regióes de anticorpos específicamente revelados no presente documento.

Para o propósito da presente invengáo, "variantes" de urna sequéncia de aminoácidos compreendem variantes de insergáo de aminoácidos, variantes de adigáo de aminoácidos, variantes de exclusáo de aminoácidos e/ou variantes de substituigáo de aminoácidos. As variantes de exclusáo de aminoácidos que compreendem a exclusáo na extremidade N- terminal e/ou C-terminal da proteína também sao chamadas variantes de truncamento N-terminal e/ou C-terminal.

As variantes de insergáo de aminoácidos compreendem insergóes de um ou dois ou mais aminoácidos numa sequéncia de aminoácidos particular. No caso de variantes de sequéncia de aminoácidos que tém urna insergáo, um ou mais residuos de aminoácido sao inseridos num sitio particular numa sequéncia de aminoácidos, embora a insergáo aleatoria com a triagem apropriada do produto resultante também seja possível.

As variantes de adigáo de aminoácidos compreendem fusóes amino e/ou carboxi-terminal de um ou mais aminoácidos, tais como 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ou mais aminoácidos.

As variantes de delegáo de aminoácidos sao caracterizadas pela remogao de um ou mais aminoácidos da sequéncia, tal como pela remogao de 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ou mais aminoácidos. As delegdes podem ocorrer em qualquer posigao da proteína.

As variantes de substituigáo de aminoácidos sao caracterizadas por pelo menos um residuo na sequéncia que é removido e outro residuo que é inserido no seu lugar. A preferéncia é dada as modificagóes que ocorrem ñas posigóes na sequéncia de aminoácidos que nao sao conservadas entre proteínas ou péptidos homólogos e/ou á substituigáo de aminoácidos por outros aminoácidos que tém propriedades semelhantes. De preferéncia, alteragóes de aminoácidos em proteína variantes sao alteragóes de aminoácidos conservativas, isto é, substituigóes de aminoácidos semelhantemente carregados ou nao carregados. Urna alteragao de aminoácido conservativa envolve a substituigáo de um aminoácido de urna familia de aminoácidos que sao relacionados em suas cadeias laterais. Os aminoácidos de ocorréncia natural sao, em geral, divididos em quatro familias: aminoácidos ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), nao polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano) e polares nao carregados (glicina, asparagina, glutamina, cisterna, serina, treonina, tirosina). A fenilalanina, o triptofano e a tirosina sao, algumas vezes, classificados conjuntamente como aminoácidos aromáticos.

De preferencia, o grau de similaridade, de preferencia, de identidade entre urna dada sequéncia de aminoácidos e urna sequéncia de aminoácidos que é urna variante da referida dada sequéncia de aminoácidos será pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. O grau de semelhanga ou identidade é dado, de preferencia, para urna regiáo de aminoácido que é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 100% de todo o comprimento da sequéncia de aminoácidos de referéncia. Por exemplo, caso a sequéncia de aminoácidos de referéncia consista em 200 aminoácidos, o grau de similaridade ou identidade é dado, de preferéncia, para pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 80, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 120, pelo menos cerca de 140, pelo menos cerca de 160, pelo menos cerca de 180 ou cerca de 200 aminoácidos, de preferéncia, aminoácidos continuos. Em modalidades preferenciais, o grau de semelhanga ou identidade é dado para todo o comprimento da sequéncia de aminoácidos de referencia. 0 alinhamento para determinar a semelhanga de sequéncia, de preferencia, a identidade de sequéncia, pode ser realizado com ferramentas conhecidas na técnica, de preferéncia, com a utilizagáo do melhor alinhamento de sequéncia, por exemplo, com a utilizagáo de Align, com a utilizagáo de configuragóes padráo, de preferéncia, EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5. "Semelhanga de sequéncia" indica a percentagem de aminoácidos que sao idénticos ou que representam substituigóes de aminoácidos conservativas. "Identidade de sequéncia" entre duas sequéncias de aminoácidos indica a percentagem de aminoácidos que sao idénticos entre as sequéncias. O termo "percentagem de identidade" destina-se a denotar urna percentagem de residuos de aminoácido que sao idénticos entre as duas sequéncias a serem comparadas, obtida após o melhor alinhamento, em que essa percentagem é puramente estatistica e em que as diferengas entre as duas sequéncias sao distribuidas aleatoriamente e ao longo de todo o seu comprimento. As comparagbes de sequéncia entre duas sequéncias de aminoácidos sao convencionalmente realizadas comparando-se essas sequéncias após terem sido idealmente alinhadas, sendo que a referida comparagáo é realizada por segmento ou por "janela de comparagáo" a fim de identificar e comparar regióes locáis de semelhanga de sequéncia. O alinhamento ideal das sequéncias para comparagáo pode ser produzido, além de manualmente, por meio do algoritmo de homología local de Smith e Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, por meio do algoritmo de homología local de Neddleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por meio do método de busca de semelhanga de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Nati Acad. Sci. EUA 85, 2.444, ou por meio de programas de computador que utilizam esses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N e TFASTA em Pacote de Software de Genética de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin). A percentagem de identidade é calculada determinando-se o número de posigóes idénticas entre as duas sequéncias a serem comparadas, dividindo-se esse número pelo número de posigóes comparadas e multiplicando-se o resultado obtido por 100 de modo a obter a percentagem de identidade entre essas duas sequéncias. O termo "animal transgénico" refere-se a um animal que tem um genoma que compreende um ou mais transgenes, de preferencia, transgenes de cadeia pesada e/ou leve, ou transcromossomas (integrados ou nao integrados no ADN genómico natural do animal) e que tem, de preferencia, capacidade para expressar os transgenes. Por exemplo, um murganho transgénico pode ter um transgene de cadeia leve humano e um transgene de cadeia pesada humano ou transcromossoma de cadeia pesada humano, de modo que o murganho produza anticorpos anti-CLDN18.2 humanos quando imunizado com antigénio CLDN18.2 e/ou células que expressam CLDN18.2. O transgene de cadeia pesada humano pode ser integrado no ADN cromossómico do murganho, como é o caso de murganhos transgénicos, por exemplo, murganhos HuMAb, tais como murganhos HCo7 ou HCol2, ou o transgene de cadeia pesada humano pode ser mantido de maneira extracromossómica, como é o caso para murganhos transcromossómicos (por exemplo, KM), conforme descrito no documento n£ WO 02/43478. Tais murganhos transgénicos e transcromossómicos podem ter capacidade para produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos para CLDN18.2 (por exemplo, IgG, IgA e/ou IgE) submetendo-se á recombinagáo V-D-J e comutagáo de isotipo. "Reduzir", "diminuir" ou "inibir", conforme utilizado no presente documento, significa urna diminuigao total ou a capacidade para provocar urna diminuigao total, de preferencia, de 5% ou mais, 10% ou mais, 20% ou mais, com mais preferencia, de 50% ou mais e, com aínda mais preferencia, de 75% ou mais no nivel, por exemplo no nivel de expressao ou no nivel de proliferagao de células.

Termos tais como "aumentar" ou "intensificar" referem-se, de preferencia, a um aumento ou intensificagao em cerca de pelo menos 10%, de preferencia, pelo menos 20%, de preferencia, pelo menos 30%, com mais preferencia, pelo menos 40%, com mais preferencia, pelo menos 50%, com aínda mais preferencia, pelo menos 80% e, com aínda mais preferencia, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 500%, pelo menos 1,000%, pelo menos 10,000% ou aínda mais.

Mecanismos de agáo de mAb

Os anticorpos descritos no presente documento interagem, de preferencia, com componentes do sistema imunológico, de preferencia, através de ADCC ou CDC. Os anticorpos descritos no presente documento também podem ser utilizados para direcionar cargas úteis (por exemplo, radioisótopos, fármacos ou toxinas) para exterminar diretamente células tumorais ou podem ser utilizados de maneira sinérgica com agentes quimioterapéuticos tradicionais, que atacam tumores através de mecanismos de agao complementares que podem incluir respostas imunológicas antitumorais que podem ter sido comprometidas devido a efeitos secundários citotóxicos quimioterapéuticos em linfócitos T. No entanto, os anticorpos descritos no presente documento também podem exercer um efeito simplesmente de ligagao ao CLDN18.2 na superficie celular e assim, por exemplo, podem bloquear a proliferagao das células.

Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos A ADCC descreve a capacidade de exterminio de células de células efetoras, conforme descrito no presente documento, em particular, linfócitos que, de preferencia, exigem que a célula alvo seja marcada por um anticorpo. A ADCC ocorre, de preferencia, quando os anticorpos se ligam aos antigénios em células tumorais e os dominios de Fe de anticorpo engatam recetores Fe (FcR) na superficie de células efetoras imunológicas. Diversas familias de recetores Fe foram identificadas e populagóes de células especificas característicamente expressam recetores Fe definidos. A ADCC pode ser observada como um mecanismo para induzir diretamente um grau variável de destruigao tumoral imediata que conduz á apresentagao de antigénio e á indugao de respostas de células T dirigidas ao tumor. De preferencia, a indugao in vivo de ADCC conduzirá a respostas de células T dirigidas ao tumor e respostas de anticorpo derivadas de hospedeiro.

Citotoxicidade dependente de complemento A CDC é outro método de exterminio de células que pode ser dirigido por anticorpos. IgM é o isotipo mais eficaz para ativagao de complemento. IgGl e IgG3 também sao, ambas, muito eficazes para dirigir a CDC por meio da via de ativagáo de complemento clássico. De preferencia, nessa cascata, a formagáo de complexos antigénio-anticorpo resulta na desobstrugáo de múltiplos sitios de ligagao de Clq em estreita proximidade nos dominios Ch2 de moléculas de anticorpo participantes, tais como moléculas de IgG (Clq é um dos tres subcomponentes de complemento Cl). De preferencia, esses sitios de ligagao de Clq desobstruidos convertem a interagao Clq-IgG anteriormente de baixa afinidade num de alta avidez, que desencadeia urna cascata de eventos que envolvem urna série de outras proteínas de complemento e conduz á libertagao proteolítica dos agentes quimiotáticos/ativadores de células efetoras C3a e C5a. De preferencia, a cascata de complementos termina na formagáo de um complexo de ataque de membrana, que cria poros na membrana celular que facilitam a livre passagem de água e solutos para dentro e para fora da célula.

Os anticorpos descritos no presente documento podem ser produzidos por urna variedade de técnicas, incluindo metodología de anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, a técnica padrao de hibridizagao de células somáticas de Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975). Embora procedimientos de hibridizagao de células somáticas sejam preferenciais, em principio, outras técnicas para produzir anticorpos monoclonais podem ser empregues, por exemplo, transíormagao viral ou oncogénica de linfócitos B ou técnicas de exibigáo de fagos com a utilizagáo de bibliotecas de genes de anticorpo. 0 sistema animal preferencial para preparar hibridomas que secretam anticorpos monoclonais é o sistema murino. A produgao de hibridoma no murganho é um procedimento muito bem estabelecido. Os protocolos e técnicas de imunizagao para isolamento de esplenócitos imunizados para fusao sao conhecidos na técnica. Parceiros de fusao (por exemplo, células de mieloma murinas) e procedimentos de fusao também sao conhecidos.

Outros sistemas animáis preferenciais para preparar hibridomas que secretam anticorpos monoclonais sao o sistema de ratos e de coelhos (por exemplo, descrito em Spieker-Polet et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 92:9.348 (1995), veja-se também Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)) .

Em aínda outra modalidade preferencial, os anticorpos monoclonais humanos podem ser gerados com a utilizagao de murganhos transgénicos ou transcromossómicos que transportam partes do sistema imunológico humano em vez do sistema de murganho. Esses murganhos transgénicos e transcromossómicos incluem murganhos conhecidos como murganhos HuMAb e murganhos KM, respetivamente, e sao coletivamente denominados no presente documento como "murganhos transgénicos". A produgao de anticorpos humanos em tais murganhos transgénicos pode ser realizada conforme descrito em detalhes para CD20 no documento n° W02004 035607 Aínda outra estratégia para gerar anticorpos monoclonais é isolar diretamente os genes que codificam anticorpos dos linfócitos que produzem anticorpos de especificidade definida, por exemplo, veja-se Babcock et al., 1996; urna estratégia inovadora para gerar anticorpos monoclonais a partir de linfócitos isolados únicos que produzem anticorpos de especificidades definidas. Para detalhes de manipulagao de anticorpo recombinante, veja-se também Welschof e Kraus,

Recombinant antibodies for cáncer therapy ISBN-0-89603-918-8 e Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.

Para gerar anticorpos, os murganhos podem ser imunizados com péptidos conjugados por veículo derivados da sequéncia de antigénios, isto é, a sequéncia contra a qual os anticorpos devem ser dirigidos, urna preparagao enriquecida de antigénios expressos de maneira recombinante ou fragmentos dos mesmos e/ou células que expressam o antigénio, conforme descrito. Alternativamente, os murganhos podem ser imunizados com o ADN que codifica o antigénio ou fragmentos do mesmo. No evento em que as imunizagóes que utilizam urna preparagao purificada ou enriquecida do antigénio nao resultam em anticorpos, os murganhos também podem ser imunizados com células que expressam o antigénio, por exemplo, urna linhagem celular, para promover respostas imunológicas. A resposta imunológica pode ser monitorizada ao longo do curso do protocolo de imunizagao com amostras de plasma e soro que sao obtidas por veia da cauda ou sangramentos retro-orbitários. Os murganhos com titulagbes suficientes de imunoglobulina podem ser utilizados para fusóes. Os murganhos podem ser reforgados de maneira intraperitoneal ou intravenosa com células que expressam antigénio 3 dias antes do sacrificio e da remogao do bago para aumentar a taxa de hibridomas que secretam anticorpos específicos.

Para gerar hibridomas que produzem anticorpos monoclonais, esplenócitos e células de ganglio linfático de murganhos imunizados podem ser isolados e fundidos a urna linhagem celular imortalizada apropriada, tal como urna linhagem celular de mieloma de murganho. Os hibridomas resultantes podem, entao, ser triados para a produgao de anticorpos de antigénio específico. Pogos individuáis podem, entao, ser triados por ELISA para hibridomas que secretam anticorpos. Através de análise de imunofluorescéncia e FACS com a utilizagao de células que expressam antigénio, os anticorpos com especificidade para o antigénio podem ser identificados. Os hibridomas que secretam anticorpos podem ser recolocados em placa, triados novamente e, caso aínda sejam positivos para anticorpos monoclonais, podem ser subclonados por diluigáo limitativa. Os subclones estáveis podem, entao, ser cultivados in vitro para gerar o anticorpo no meio de cultura de tecido para caracterizagao.

Os anticorpos também podem ser produzidos num transfetoma de célula hospedeira com a utilizagao, por exemplo, de urna combinagao de técnicas de ADN recombinante e métodos de transfegao de genes conforme sao bem conhecidos na técnica (Morrison, S. (1985) Science 229: 1.202).

Por exemplo, em urna modalidade, o gene (ou genes) de interesse, por exemplo, genes de anticorpo, pode ser ligado a um vetor de expressao, tal como um plasmídeo de expressao eucariótico, tal como utilizado pelo sistema de expressao de genes GS revelado nos documentos n° WO 87/04462, n° WO 89/01036 e n£ EP 338 841 ou outros sistemas de expressao bem conhecidos na técnica. O plasmídeo purificado com os genes de anticorpo clonados pode ser introduzido em células hospedeiras eucarióticas, tais como células CHO, células NS/0, células HEK293T ou células HEK293 ou, alternativamente, outras células eucarióticas como células derivadas de planta, fúngicas ou células de levedura. O método utilizado para introduzir esses genes pode ser os métodos descritos na técnica, tais como eletroporagao, lipofectina, lipofectamina ou outros. Após a introdugáo desses genes de anticorpo ñas células hospedeiras, as células que expressam o anticorpo podem ser identificadas e selecionadas. Essas células representam os transfetomas que podem, entao, ser amplificados para seu nivel de expressao e aumentados em escala para produzir anticorpos. Os anticorpos recombinantes podem ser isolados e purificados a partir desses sobrenadantes e/ou células de cultura.

Alternativamente, os genes de anticorpo clonados podem ser expressos em outros sistemas de expressao, incluindo células procarióticas, tais como micro-organismos, por exemplo, E. coli. Além disso, os anticorpos podem ser produzidos em animáis nao humanos transgénicos, tal como em leite de ovelhas e coelhos ou em ovos de galinhas, ou em plantas transgénicas; veja-se, por exemplo, Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165 a 181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147 a 157; e Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825 a 839.

Quimerizagao

Os anticorpos monoclonais murinos podem ser utilizados como anticorpos terapéuticos em seres humanos quando identificados com toxinas ou isótopos radioativos. Anticorpos murinos nao identificados sao altamente imunogénicos no homem quando aplicados repetidamente, o que conduz á redugao do efeito terapéutico. A imunogenicidade principal é mediada pelas regióes constantes de cadeia pesada. A imunogenicidade de anticorpos murinos no homem pode ser reduzida ou completamente evitada caso os respetivos anticorpos sejam quimerizados ou humanizados. Os anticorpos quiméricos sao anticorpos cujas porgóes diferentes sao derivadas de espécies animáis diferentes, tais como aquelas que tém urna regiao variável derivada de um anticorpo murino e urna regiao constante de imunoglobulina humana. A quimerizagao de anticorpos é alcangada unindo-se as regides variáveis da cadeia pesada e leve de anticorpo murino com a regiao constante de cadeia pesada e leve humana (por exemplo, conforme descrito por Kraus et al., em Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cáncer therapy ISBN-0-89603-918-8). Numa modalidade preferencial, os anticorpos quiméricos sao gerados unindo-se a regiao constante de cadeia leve kappa humana á regiao variável de cadeia leve murina. Numa modalidade também preferencial, os anticorpos quiméricos podem ser gerados unindo-se a regiao constante de cadeia leve lambda humana á regiao variável de cadeia leve murina. As regides constantes de cadeia pesada preferenciais para a geragáo de anticorpos quiméricos sao IgGl, IgG3 e IgG4. Outras regides constantes de cadeia pesada preferenciais para a geragáo de anticorpos quiméricos sao IgG2, IgA, IgD e IgM.

Humanizagáo

Os anticorpos interagem com antigénios-alvo predominantemente através de residuos de aminoácido que estao localizados ñas seis regides de determinagao de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada e leve. Por esse motivo, as sequéncias de aminoácidos dentro das CDRs sao mais diversas entre anticorpos individuáis que as sequéncias fora das CDRs. Visto que as sequéncias de CDR sao responsáveis pela maioria das interagoes anticorpo-antigénio, é possivel expressar anticorpos recombinantes que imitam as propriedades de anticorpos de ocorréncia natural específicos construindo-se os vetores de expressáo que incluem as sequéncias de CDR do anticorpo de ocorréncia natural especifico enxertado em sequéncias estruturais de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (veja-se, por exemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323 a 327 ; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522 a 525 ; e Queen, C. et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA; 86: 10.029 a 10.033). Tais sequéncias estruturais podem ser obtidas a partir de bases de dados de ADN públicos que incluem sequéncia de genes de anticorpo germinal. Essas sequéncias germináis diferirao de sequéncias de genes de anticorpo maduras visto que as mesmas nao incluirao genes variáveis completamente montados, que sao formados unindo-se V (D) J durante a maturagao de célula B. As sequéncias de genes germináis também diferirao das sequéncias de um anticorpo de repertorio secundário de alta afinidade no individuo de forma uniforme em toda a regiao variável. A capacidade de os anticorpos ligarem-se a um antigénio pode ser determinada com a utilizagao de ensaios de ligagao padrao (por exemplo, ELISA, Western Blot, Imunofluorescéncia e análise de citometria de fluxo).

Para purificar os anticorpos, os hibridomas selecionados podem ser desenvolvidos em frascos de centrifugagao de dois litros para purificagao de anticorpo monoclonal. Alternativamente, os anticorpos podem ser produzidos em biorreatores com base em diálise. Os sobrenadantes podem ser filtrados e, caso necessários, concentrados antes da cromatografía de afinidade com proteína G-sefarose ou proteína A-sefaróse. A IgG eluída pode ser verificada por eletroforese em gel e cromatografía líquida de alto desempenho para assegurar a pureza. A solugao tampao pode ser trocada em PBS e a concentragao pode ser determinada por OD280 com a utilizagáo de coeficiente de extingáo 1.43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80 °C.

Para determinar se os anticorpos monoclonais selecionados ligam-se a epitopos exclusivos, a mutagénese sitio-dirigida ou multi sitio-dirigida pode ser utilizada.

Para determinar o isotipo de anticorpos, ELISAs de isotipo com vários kits comerciáis (por exemplo, Zymed, Roche Diagnostics) podem ser realizados. Os pogos de placas de microtitulagao podem ser revestidos com anti-Ig de murganho. Após o bloqueio, as placas sao reagidas com anticorpos monoclonais ou controlos de isotipo purificados, a temperatura ambiente durante duas horas. Os pogos podem, entao, ser reagidos com IgGl, IgG2a, IgG2b ou IgG3 de murganho, IgA ou sondas conjugadas com peroxidase de IgM especifico de murganho. Após a lavagem, as placas podem ser desenvolvidas com substrato de ABTS (1 mg/ml) e analisadas em OD de 405 a 650. Alternativamente, o Kit de Isotipagem de Anticorpo Monoclonal de Murganho IsoStrip (Roche, Número de catálogo 1493027) pode ser utilizado conforme descrito pelo fabricante. A fim de demonstrar a presenga de anticorpos em soros de murganhos imunizados ou a ligagao de anticorpos monoclonais ás células vivas que expressam antigénio, urna citometria de fluxo pode ser utilizada. As linhagens celulares que expressam o antigénio naturalmente ou após a transfegáo e os controlos negativos que carecem de expressáo de antigénio (desenvolvidos sob condigóes de crescimento padráo) podem ser misturadas com várias concentragóes de anticorpos monoclonais em sobrenadantes de hibridoma ou em PBS que contém 1% de FBS, e podem ser incubadas a 4°C durante 30 min. Após a lavagem, o anticorpo anti-IgG identificado por APC ou Alexa647 pode ligar-se ao anticorpo monoclonal ligado ao antigénio sob as mesmas condigóes como a coloragao de anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas por citometria de fluxo com um instrumento FACS com a utilizagao de propriedades de dispersao lateral e leve para entrada em células vivas únicas. A fim de distinguir anticorpos monoclonais de antigénio especifico de ligantes nao específicos numa única medigáo, o método de co-transfegáo pode ser empregue. As células transfetadas temporariamente com plasmídeos que codificam antigénio e um marcador fluorescente podem ser manchados conforme descrito acima. As células transfetadas podem ser detetadas num canal de fluorescencia diferente das células manchadas com anticorpo. Visto que a maioria das células transfetadas expressam ambos os transgenes, os anticorpos monoclonais de antigénio específico ligam-se preferencialmente as células que expressam o marcador de fluorescencia, enquanto anticorpos nao específicos ligam-se numa razao comparável as células nao transfetadas. Um ensaio alternativo que utiliza microscopía de fluorescencia pode ser utilizado além de ou em vez do ensaio de citometria de fluxo. As células podem ser manchadas exatamente conforme descrito acima e examinadas por microscopía de fluorescencia. A fim de demonstrar a presenga de anticorpos em soros de murganhos imunizados ou a ligagao de anticorpos monoclonais as células vivas que expressam antigénio, a análise por microscopía de imunofluorescéncia pode ser utilizada. Por exemplo, as linhagens celulares que expressam o antigénio espontáneamente ou após a transfegao e os controlos negativos que carecem de expressao de antigénio sao desenvolvidas em láminas de cámara sob condigóes de crescimento padráo em meio DMEM/F12, suplementadas com 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 2 mM de L-glutamina, 100 IU/ml de penicilina e 100 yg/ml de estreptomicina. As células podem, entáo, ser fixadas com metanol ou paraformaldeido ou nao tratadas. As células podem, entáo, ser reagidas com anticorpos monoclonais contra o antigénio durante 30 min. a 25 °C. Após a lavagem, as células podem ser reagidas com um anticorpo secundário anti-IgG de murganho identificado por Alexa555 (Sondas Moleculares) sobe as mesmas condigóes. As células podem, entáo, ser examinadas por microscopía de fluorescencia.

Os extratos celulares gue expressam antigénio e controlos negativos apropriados podem ser preparados e submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS). Após a eletroforese, os antigénios separados seráo transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados e sondados com os anticorpos monoclonais a serem testados. A ligagáo de IgG pode ser detetada com a utilizagáo de peroxidase de anti-IgG de murganho e desenvolvida com substrato de ECL.

Os anticorpos podem ser adicionalmente testados para reatividade com antigénio por imuno-histoquímica de maneira bem conhecida pelo individuo versado na técnica, por exemplo, com a utilizagáo de criossecgóes fixadas com paraformaldeido ou acetona ou secgóes de tecidos embebidos em parafina fixadas com paraformaldeído de amostras de tecido náo canceroso ou de tecido canceroso obtidas a partir de pacientes durante procedimentos cirúrgicos de rotina ou de murganhos que transportam tumores xenoenxertados inoculados com linhagens celulares que expressam o antigénio espontáneamente ou após a transfegáo. Para a imunocoloragáo, os anticorpos reativos ao antigénio podem ser incubados seguido por anticorpos antimurganho de cabra ou anticoelho de cabra conjugados por peroxidase de raiz-forte (DAKO) de acordo com as instrugóes dos fornecedores.

Os anticorpos podem ser testados quanto á sua capacidade para mediar a fagocitose e ao exterminio de células que expressam CLDN18.2. 0 teste de atividade de anticorpo monoclonal in vitro fornecerá urna triagem inicial antes de testar modelos in vivo.

Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) :

Resumidamente, células polimorfonucleares (PMNs), células NK, monócitos, células mononucleares ou outras células efetoras provenientes de dadores saudáveis podem ser purificadas através da centrifugagáo por densidade de Ficoll Hypaque, seguida por lise de eritrocitos contaminantes. As células efetoras lavadas podem ser suspensas em RPMI suplementado com 10% de soro fetal de vitelo inativado por calor ou, alternativamente, com 5% de soro humano inativado por calor e misturadas com células-alvo identificadas com 51Cr que expressam CLDN18.2, em várias razóes entre células efetoras e células-alvo. Alternativamente, as células-alvo podem ser identificadas com um ligante de intensificagao de fluorescencia (BATDA). Um quelato altamente fluorescente de Europio com o ligante de intensificagao que é libertado de células mortas pode ser medido por um fluorómetro. Outra técnica alternativa pode utilizar a transfegao de células-alvo com luciferase. A luciferase amarela adicionada pode, entao, ser oxidada apenas por células viáveis. IgGs de anti-CLDN18.2 purificadas podem, entao, ser adicionadas em várias concentragóes. A IgG humana irrelevante pode ser utilizada como controlo negativo. Os ensaios podem ser realizados durante 4 a 20 horas a 37 °C dependendo do tipo de célula efetora utilizado. As amostras podem ser ensaladas para citólise medindo-se a libertagáo de 51Cr ou a presenga do quelato EuTDA no sobrenadante de cultura. Alternativamente, a luminescéncia que resulta da oxidagao de luciferase amarela pode ser urna medida de células viáveis.

Os anticorpos monoclonais anti-CLDNl8.2 também podem ser testados em várias combinagbes para determinar se a citólise é intensificada com múltiplos anticorpos monoclonais.

Citotoxicidade dependente de complemento (CDC):

Os anticorpos anti-CLDN18.2 monoclonais podem ser testados quanto á sua capacidade para mediar a CDC com a utilizagáo de urna variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, o soro para o complemento pode ser obtido a partir do sangue de maneira conhecida pelo individuo versado na técnica. Para determinar a atividade de CDC de mAbs, métodos diferentes podem ser utilizados. A libertagáo de 51Cr pode, por exemplo, ser medida ou a permeabilidade de membrana elevada pode ser avallada com a utilizagáo de um ensaio de exclusao de iodeto de propideo (PI). Resumidamente, as células-alvo podem ser lavadas e 5 x 105/ml podem ser incubados com várias concentragóes de mAb durante 10 a 30 min. á temperatura ambiente ou a 37 °C. 0 soro ou plasma pode, entáo, ser adicionado a urna concentragáo final de 20% (v/v) e as células incubadas a 37 °C durante 20 a 30 min. Todas as células de cada amostra podem ser adicionadas á solugáo de PI num tubo FACS. A mistura pode, entáo, ser imediatamente analisada por análise de citometria de fluxo com a utilizagáo de FACSArray.

Num ensaio alternativo, a indugao de CDC pode ser determinada em células aderentes. Em urna modalidade desse ensaio, as células sao semeadas 24 h antes do ensaio com urna densidade de 3 x lOVpogo em placas de microtitulagao de fundo plano para cultura de tecido. No día seguinte, o meio de crescimento é removido e as células sao incubadas em triplicado com anticorpos. As células de controlo sao incubadas com meio de crescimento ou meio de crescimento que contém 0,2% de saponina para a determinagáo de lise antecedente e lise máxima, respetivamente. Após a incubagáo durante 20 min. á temperatura ambiente, o sobrenadante é removido e 20% (v/v) de plasma ou soro humano em DMEM (pré-aquecido a 37 °C) é adicionado as células e incubado durante mais 20 min. a 37 °C. Todas as células de cada amostra sao adicionadas á solugáo de iodeto de propideo (10 pg/ml). Entao, os sobrenadantes sao substituidos por PBS que contém 2,5 pg/ml de brometo de etideo e a emissáo de fluorescencia mediante a excitagáo a 520 nm é medida a 600 nm com a utilizagáo de um Tecan Safire. A percentagem de lise especifica é calculada da seguinte forma: % de lise especifica = (amostra de fluorescencia - fundo de fluorescencia) / (lise máxima de fluorescencia - fundo de fluorescencia) x 100.

Indugao de apoptose e inibigao de proliferagao celular por anticorpos monoclonais:

Para testar a capacidade para iniciar a apoptose, os anticorpos anti-CLDNl8.2 monoclonais podem, por exemplo, ser incubados com células tumorais positivas CLDN18.2, por exemplo, células tumorais transfetadas SNU-16, DAN-G, KATO-III ou CLDN18.2, a 37 °C durante cerca de 20 horas. As células podem ser colhidas, lavadas em tampao de ligagao Anexina-V (BD biosciences) e incubadas com Anexina-V conjugada com FITC ou APC (BD biosciences) durante 15 min. no escuro. Todas as células de cada amostra podem ser adicionadas á solugáo de PI (10 yg/ml em PBS) num tubo FACS e avalladas imediatamente por citometria de fluxo (conforme acima). Alternativamente, urna inibigao geral da proliferagao celular por anticorpos monoclonais pode ser detetada com kits comercialmente disponiveis. O Kit de Proliferagao Celular DELFIA (Perkin-Elmer, Número de catálogo AD0200) é um imunoensaio nao isotópico com base na medigáo de incorporagáo de 5-bromo-2'-deoxiuridina (BrdU) durante a sintese de ADN de células em proliferagao em microplacas. A BrdU incorporada é detetada com a utilizagao de anticorpo monoclonal identificado com europio. Para permitir a detegao de anticorpo, as células sao fixadas e o ADN desnaturado com a utilizagao de solugáo Fix. O anticorpo nao ligado é eliminado por lavagem e o indutor DELFIA é adicionado para dissociar ióes de europio do anticorpo identificado em solugao, onde os mesmos formam quelatos altamente fluorescentes com componentes do indutor DELFIA. A fluorescencia medida - com a utilizagao de fluorometria de resolugao temporal na detegao - é proporcional á sintese de ADN na célula de cada pogo.

Estudos Pré-clínicos

Os anticorpos monoclonais que se ligam ao CLDN18.2 também podem ser testados num modelo in vivo (por exemplo, em murganhos imunodeficientes que transportam tumores xenoenxertados inoculados com linhagens celulares que expressam CLDN18.2, por exemplo, DAN-G, SNU-16 ou KATO-III, ou após a transfegáo, por exemplo, HEK293) para determinar sua eficácia no controlo de crescimento de células tumorais que expressam CLDN18.2.

Estudos in vivo após o xenoenxerto de células tumorais que expressam CLDN18.2 em murganhos imunocomprometidos ou outros animáis podem ser realizados com a utilizagáo dos anticorpos descritos no presente documento. Os anticorpos podem ser administrados aos murganhos livres de tumor seguido por injegáo de células tumorais para medir os efeitos dos anticorpos para impedir a formagáo de tumores ou sintomas relacionados com tumores. Os anticorpos podem ser administrados aos murganhos que contém tumor para determinar a eficácia terapéutica dos respetivos anticorpos para reduzir o crescimento de tumor, a metástase ou os sintomas relacionados com tumor. A aplicagao de anticorpo pode ser combinada com a aplicagao de outras substancias, como fármacos citostáticos, inibidores de fator de crescimento, bloqueadores de ciclo celular, inibidores de angiogénese ou outros anticorpos para determinar a eficácia sinérgica e a toxicidade potencial de combinagbes. Para analisar efeitos secundários tóxicos mediados por anticorpos, os animáis podem ser inoculados com anticorpos ou reagentes de controlo e investigados minuciosamente para síntomas possivelmente relacionados com a terapia com anticorpo CLDN18.2. Efeitos secundários possíveis de aplicagao in vivo de anticorpos CLDN18.2 incluem, particularmente, toxicidade em tecidos que expressam CLDN18.2, incluindo o estómago. Os anticorpos que reconhecem CLDN18.2 em seres humanos e em outras espécies, por exemplo, murganhos, sao particularmente úteis para prever efeitos secundários potenciáis mediados por aplicagao de anticorpos CLDN18.2 monoclonais em seres humanos. 0 mapeamento de epítopos reconhecidos por anticorpos pode ser realizado conforme descrito em detalhes em "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology)" de Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 e em "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 de Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay.

Os compostos e agentes descritos no presente documento podem ser administrados na forma de qualquer composigao farmacéutica adequada.

As composigóes farmacéuticas sao normalmente fornecidas numa forma de dosagem uniforme e podem ser preparadas numa maneira conhecida por si só. Urna composigao farmacéutica pode, por exemplo, estar na forma de urna solugao ou suspensao.

Urna composigao farmacéutica pode compreender sais, substancias tampao, conservantes, veiculos, diluentes e/ou excipientes, todos os quais sao, de preferencia, farmacéuticamente aceitáveis. 0 termo "farmacéuticamente aceitável" refere-se á nao toxicidade de um material que nao interage com a agao do componente ativo da composigao farmacéutica.

Os sais que nao sao farmacéuticamente aceitáveis podem ser utilizados para preparar sais farmacéuticamente aceitáveis e sao incluidos ñas instrugóes. Os sais farmacéuticamente aceitáveis desse tipo compreendem, numa forma nao limitante, aqueles preparados a partir dos seguintes ácidos: ácidos cloridricos, bromidricos, sulfúricos, nítricos, fosfóricos, maleicos, acéticos, salicilicos, cítricos, fórmicos, malónicos e succinicos. Os sais farmacéuticamente aceitável também podem ser preparados como sais de metal alcalino ou sais de metal alcalinoterroso, tais como sais de sodio, sais de potássio ou sais de cálcio.

Substancias tampáo adequadas para utilizagáo numa composigáo farmacéutica incluem ácido acético num sal, ácido cítrico num sal, ácido bórico num sal e ácido fosfórico num sal.

Conservantes adequados para utilizagáo numa composigáo farmacéutica incluem cloreto de benzalcónio, clorobutanol, parabeno e timerosal.

Urna formulagáo injetável pode compreender um excipiente farmacéuticamente aceitável, tal como Lactato de Ringer. 0 termo "veiculo" refere-se a um componente orgánico ou inorgánico, de urna natureza natural ou sintética, no qual o componente ativo é combinado a fim de facilitar, intensificar ou possibilitar a aplicagao. De acordo com as instrugoes, o termo "veiculo" também incluí urna ou mais substancias de encapsulamento, diluentes ou carga sólidas ou líquidas compatíveis, que sao adequadas para a administragáo a um paciente.

Substáncias-veículo possíveis para administragáo parentérica sao, por exemplo, água estéril, Ringer, lactato de Ringer, solugáo de cloreto de sodio estéril, polialquilenoglicóis, naftalenos hidrogenados e, em particular, polímeros de lactida biocompatíveis, copolímeros de lactida/glicolida ou copolímeros de polioxietileno/polioxipropileno. 0 termo "excipiente", quando utilizado no presente documento, destina-se a indicar todas as substancias que podem estar presentes numa composigáo farmacéutica e que nao sao ingredientes ativos, tais como, por exemplo, veículos, ligantes, lubrificantes, espessantes, agentes ativos de superficie, conservantes, emulsificantes, tampóes, agentes aromatizantes ou corantes.

Os agentes e composigóes descritos no presente documento podem ser administrados por meio de qualquer rota convencional, tal como por administragao parentérica, incluindo por injegao ou infusáo. A administragao é, de preferencia, parentérica, por exemplo, de maneira intravenosa, intra-arterial, subcutánea, intradérmica ou intramuscular.

As composigóes adequadas para a administragao parentérica normalmente compreendem urna preparagáo aquosa ou nao aquosa estéril do composto ativo, que é, de preferencia, isotónica para o sangue do destinatário. Exemplos de veículos e solventes compatíveis sao solugao de Ringer e solugao de cloreto de sodio isotónica. Além disso, óleos fixos normalmente estéreis sao utilizados como meio de solugao ou suspensáo.

Os agentes e composigóes descritos no presente documento sao administrados em quantidades eficazes. Urna "quantidade eficaz" refere-se á quantidade que alcanga urna reagao desejada ou um efeito desejado sozinha ou juntamente com outras doses. No caso de tratamento de urna doenga particular ou de urna afegáo particular, a reagao desejada, de preferencia, refere-se á inibigáo do curso da doenga. Isso compreende retardar o progresso da doenga e, em particular, interromper ou reverter o progresso da doenga. A reagao desejada num tratamento de urna doenga ou de urna afegáo também pode ser o atraso do principio ou urna prevengao do principio da referida doenga ou referida afegáo.

Urna quantidade eficaz de um agente ou composigáo descrito no presente documento dependerá da afegáo a ser tratada, da gravidade da doenga, dos parámetros individuáis do paciente, incluindo idade, condigáo fisiológica, tamanho e peso, da duragáo de tratamento, do tipo de urna terapia de acompanhamento (se houver), da rota especifica de administragáo e de fatores similares. Consequentemente, as doses administradas dos agentes descritos no presente documento podem depender de vários de tais parámetros. No caso em que urna reagáo num paciente é insuficiente com urna dose inicial, doses mais altas (ou doses eficazmente mais altas alcanzadas por urna rota de administragáo mais localizada diferente) podem ser utilizadas.

Os agentes e composigóes descritos no presente documento podem ser administrados aos pacientes, por exemplo, in vivo, para tratar ou prevenir urna variedade de distúrbios, tais como aqueles descritos no presente documento. Pacientes preferenciais incluem pacientes humanos que tém distúrbios que podem ser corrigidos ou melhorados administrando-se os agentes e composigóes descritos no presente documento. Isso incluí distúrbios que envolvem células caracterizadas por um padráo de expressáo alterado de CLDN18.2.

Por exemplo, em urna modalidade, os anticorpos descritos no presente documento podem ser utilizados para tratar um paciente com urna doenga cancerosa, por exemplo, urna doenga cancerosa tal como descrita no presente documento, caracterizada pela presenga de células cancerosas que expressam CLDN18.2.

As composigóes farmacéuticas e os métodos de tratamento descritos de acordo com as instrugóes também podem ser utilizados para imunizagáo ou vacinagáo para prevenir urna doenga descrita no presente documento. A presente instrugao é ilustrada, aínda, pelos exemplos a seguir:

EXEMPLOS

Exemplo 1: Expressao de CLDN18.2 de linhagens celulares de cancro gástrico humano é estabilizada por tratamento in vitro com agentes guimioterápicos Células KatoIII, urna linhagem celular de tumor gástrico humano, foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) que contém 20% de FCS (Perbio) e 2 mM de Glutamax (Invitrogen) a 37 °C e 5% de CO2, com ou sem compostos citostáticos. Epirrubicina (Pfizer) foi testada a urna concentragáo de 10 ou 100 ng/ml, 5-FU (Neofluor da NeoCorp AG) foi testado a urna concentragáo de 10 ou 100 ng/ml e oxaliplatina (Hospira) foi testada a urna concentragáo de 50 ou 500 ng/ml. Urna combinagáo de todos os 3 compostos (EOF; epirrubicina a 10 ng/ml, oxaliplatina a 500 ng/ml, 5-FU a 10 ng/ml) também foi utilizada. 8xl05 de células KatoIII foram cultivados durante 96 horas sem alteragáo de meio ou durante 72 horas seguidas por 24 horas de cultivo em meio padráo para libertar as células provenientes da interrupgáo do ciclo celular numa placa de cultura de tecido de 6 pogos a 37°C, 5% de C02. As células foram colhidas com EDTA/tripsina, lavadas e analisadas.

Para detegáo extracelular de CLDN18.2, as células foram coradas com o anticorpo anti-CLDN18.2 monoclonal IMAB362 (Ganymed) ou um anticorpo de controlo correspondente ao isotipo (Ganymed). 0 anti-huIgG-APC de cabra da Dianova foi utilizado como um reagente secundário.

Os estágios de ciclo celular foram determinados com base em medigáo de teor de ADN celular. Isso permite que se discrimine entre células na fase Gl, S ou G2 do ciclo celular. Na fase S, a duplicagáo de ADN ocorre, enquanto na fase G2 as células desenvolvem-se e preparam-se para mitose. A análise de ciclo celular foi realizada com a utilizagáo do Kit de Reagente de ADN CycleTEST PLUS da BD Biosciences, seguindo o protocolo do fabricante. A aquisigao e a análise de citometria de fluxo foram realizadas com a utilizagáo de BD FACS CantoII (BD Biosciences) e software FlowJo (Tree Star).

As colunas na Figura la e Ib mostram a respetiva percentagem de células na fase, Gl, S ou G2 do ciclo celular. As células KatoIII cultivadas em meio mostram urna interrupgáo do ciclo celular predominantemente na fase Gl. As células tratadas com 5-FU sao bloqueadas predominantemente na fase S. As células KatoIII tratadas com epirrubicina ou EOF mostram urna interrupgáo do ciclo celular predominantemente na fase G2. As células KatoIII tratadas com oxaliplatina mostram enriquecimento de células predominantemente ñas fases Gl e G2 . Conforme pode ser observado na Figura le, urna interrupgáo do ciclo celular na fase S ou fase G2 resulta na estabilizagáo ou regulagáo ascendente de CLDN18.2. Assim que as células sáo libertadas de qualquer fase do ciclo celular (Figura Ib), a expressáo de CLDN18.2 na superficie celular de células KatoIII é regulada de modo ascendente (Figura Id) .

As células NUGC-4 e KATO III foram tratadas com 5-FU + OX (10 ng/ml de 5-FU e 500 ng/ml de oxaliplatina) , EOF (10 ng/ml de epirrubicina, 500 ng/ml de oxaliplatina e 10 ng/ml de 5-FU) ou FLO (10 ng/ml de 5-FU, 50 ng/ml de ácido folinico e 500 ng/ml de oxaliplatina) durante 96 horas. O RNA de células NUGC-4 e KATO III tratadas com quimioterapia foi isolado e convertido em cDNA. O nivel de transcrigáo de CLDN18.2 foi analisado em PCR quantitativa em tempo real. Os resultados sao mostrados na Figura 2a como a expressáo relativa em comparagáo com o nivel de transcrigáo do gene de manutengáo HPRT. A Figura 2b mostra um Western blot de CLDN18.2 e o controlo de carga de actina de células NUGC-4 nao tratadas e tratadas. A intensidade do sinal de luminescéncia é mostrada em relagáo ao percentual de actina. O pré-tratamento de células NUGC-4 e KATO III com EOF, FLO, assim como quimioterapias de combinagao de 5-FU + OX, resulta no aumento dos niveis de RNA e proteina de CLDN18.2, conforme mostrado por PCR quantitativa em tempo real (Figura 2a) e Western blot (Figura 2b).

Foi analisada a ligagáo de IMAB362 em células gástricas cancerosas NUGC-4 e KATO III tratadas com EOF (10 ng/ml de epirrubicina, 500 ng/ml de oxaliplatina e 10 ng/ml de 5-FU) ou FLO (10 ng/ml de 5-FU, 50 ng/ml de ácido folinico e 500 ng/ml de oxaliplatina) durante 96 horas por citometria de fluxo. A quantidade de proteina de CLDN18.2 direcionável por IMAB362 na superficie de linhagens celulares de cancro gástrico é aumentada, conforme mostrado na Figura 2c. Esse efeito foi mais proeminente em células pré-tratadas com EOF ou FLO.

As células KatoIII foram pré-tratadas durante 4 dias com

Irinotecano ou Docetaxel e analisadas para expressao de CLDN18.2 e interrupgáo do ciclo celular. 0 tratamento de células com Irinotecano resultou numa inibigao dependente de dose do crescimento celular e numa interrupgáo do ciclo celular na fase S/G2 (Figura 3). 0 tratamento de células com Docetaxel resultou numa inibigao dependente de dose do crescimento celular e numa interrupgáo do ciclo celular na fase G2 (Figura 3).

Exemplo 2: Pré-tratamento de células gástricas cancerosas humanas com quimioterápicos resulta na eficácia mais alta de ADCC mediada por IMAB362 A ADCC mediada por IMAB362 foi investigada com a utilizagáo de células gástricas cancerosas NUGC-4 como alvo, que foram pré-tratadas com 10 ng/ml de 5-FU e 500 ng/ml de oxaliplatina (5-FU + OX), 10 ng/ml de epirrubicina, 500 ng/ml de oxaliplatina e 10 ng/ml de 5-FU (EOF) ou 10 ng/ml de 5-FU, 50 ng/ml de ácido folinico e 500 ng/ml de oxaliplatina (FLO) durante 96 horas (razáo efetora:alvo de 40:1) ou nao tratadas. Os valores de ECso foram obtidos a partir de 7 dadores saudáveis para células NUGC-4 nao tratadas e pré-tratadas com EOF, FLO ou 5-FU + OX.

Conforme mostrado na Figura 4a, as curvas de dose/resposta em células pré-tratadas deslocaram-se para cima e para a esquerda em comparagáo com as células-alvo nao tratadas. Isso resultou numa lise máxima mais alta e numa diminuigáo dos valores de ECso para um tergo das células nao tratadas (Figura 4b).

As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs), que incluem células NK, monócitos, células mononucleares ou outras células efetoras de dadores humanos saudáveis, foram purificadas através de centrifugagáo por densidade de Ficoll Hypaque. As células efetoras lavadas foram semeadas em meio X-Vivo. As células KatoIII que expressam CLDN18.2 endógenamente e sao de origem gástrica foram utilizadas como células-alvo nessa configuragao. As células-alvo expressaram de maneira estável a luciferase, luciferase amarela, que é oxidada apenas por células viáveis. 0 anticorpo anti-CLDN18.2 purificado IMAB362 foi adicionado em várias concentragóes e, como um anticorpo de controlo de isotipo, um anticorpo Chim huIgGl irrelevante foi utilizado. As amostras foram ensaladas para citólise medindo-se a luminescéncia que resulta da oxidagáo de luciferase amarela que é um valor para a quantidade de células viáveis deixada após a citotoxicidade induzida por IMAB362. As KatoIII pré-tratadas durante 3 dias com Irinotecano (1.000 ng/ml), Docetaxel (5 ng/ml) ou Cisplatina (2.000 ng/ml) foram comparadas ás células-alvo cultivadas em meio nao tratado e a ADCC induzida por IMAB362 foi quantificada.

As células KatoIII pré-tratadas durante 3 dias com Irinotecano, Docetaxel ou Cisplatina exibiram um nivel mais baixo de células viáveis em comparagáo com as células-alvo cultivadas em meio (Figura 5a) e a expressao de claudina 18.2 em células pré-tratadas com Irinotecano, Docetaxel ou Cisplatina foi aumentada em comparagao com as células cultivadas em meio (Figura 5b).

Além disso, o pré-tratamento de células KatoIII com Irinotecano, Docetaxel ou Cisplatina aumentou a potencia de IMAB362 para induzir a ADCC (Figura 5c, 5d).

Exemplo 3: Quimioterapia resultou em eficácia mais alta de CDC induzida por IMAB362

Os efeitos de agentes quimioterápicos em CDC induzida por IMAB362 foram analisados através de pré-tratamento de células gástricas cancerosas KATO III com 10 ng/ml de 5-FU e 500 ng/ml de oxaliplatina (5-FU + OX) durante 48 horas. As curvas de resposta á dose representativas de CDC induzida por IMAB362 com a utilizagáo de células KATO III pré-tratadas com quimioterápicos sao mostradas na Figura 6. O pré-tratamento de células tumorais durante 48 horas aumentou a potencia de IMAB362 para induzir a CDC, o que resultou em lise celular máxima mais alta de células tumorais pré-tratadas em comparagáo com as células nao tratadas.

Exemplo 4: Capacidade de células efetoras imunológicas para executar ADCC mediada por IMAB362 nao é comprometida pelo tratamento com quimioterápicos

Os agentes quimioterápicos utilizados em regime de EOF ou FLO sao altamente potentes na inibigáo de proliferagáo de célula alvo. Para investigar efeitos adversos de quimioterapia em células efetoras, as PBMCs provenientes de dadores saudáveis foram tratadas com 10 ng/ml de epirrubicina, 500 ng/ml de oxaliplatina e 10 ng/ml de 5-FU (EOF) ou 10 ng/ml de 5-FU, 50 ng/ml de ácido folínico e 500 ng/ml de oxaliplatina (FLO) durante 72 horas antes da aplicagáo em ensaios de ADCC. A Figura 7a mostra valores de ECso de 4 dadores saudáveis e a Figura 7b mostra curvas de dose/resposta representativas de ADCC induzida por IMAB362 com a utilizagáo de células efetoras pré-tratadas com EOF ou FLO. A ADCC induzida por IMAB362 de células de carcinoma gástrico NUGC-4 nao é comprometida devido a quimioterapias com EOF ou FLO.

Exemplo 5: Urna combinagao de tratamento com ZA/IL-2 resulta em expansao otimizada de culturas de células mononucleares de sanque periférico (PBMC) 0 efeito de ZA/IL-2 na proliferagáo de culturas de PBMC foi avallado in vitro. As PBMCs foram colhidas de dadores humanos saudáveis e as culturas foram tratadas com urna dose única de ZA. IL-2 foi adicionado a cada 3 a 4 dias. Específicamente, as PBMCs derivadas de 3 dadores humanos saudáveis diferentes (#1, #2, #3) foram cultivadas em meio de RPMI (lxlO6 células/ml) durante 14 dias com 1 μΜ de ZA mais doses altas (300 U/ml) ou baixas (25 U/ml) de IL-2; confira-se a Figura 8a. As PBMCs dos mesmos dadores foram cultivadas adicionalmente em meio de RPMI durante 14 dias com 300 U/ml de IL-2 mais ZA ou sem ZA; confira-se a Figura 8b. O aumento ñas quantidades de célula foi determinado contando-se as células vivas nos dias 6, 8, 11 e 14.

Em meio abastecido com urna dose alta de IL-2, cerca de 2 a 5 vezes mais células expandiram-se em comparagáo com as culturas abastecidas com urna dose baixa de IL-2 (Figura 8a). A expansao de células em meio sem ZA foi aproximadamente 2 vezes mais baixa em comparagáo com as células desenvolvidas em meio com ZA (Figura 8b). Esses dados mostram a necessidade de aplicar tanto compostos ZA quanto IL-2 em combinagao para assegurar a expansao apropriada das células.

Exemplo 6: Tratamento com ZA/IL-2 resulta na expansao de quantidades altas de células T Υγ9νδ2 em culturas de PBMC

As PBMCs foram cultivadas durante 14 dias em meio de RPMI suplementado com 300 U/ml de IL-2 e com ou sem 1 μΜ de ZA. A percentagem de células T Vy9+V52+ dentro da populagao de linfócitos CD3+ (Figura 9a) e a percentagem de células CD16+ dentro da populagao de células T CD3+Vy9+V52+ (Figura 9b) foram determinadas por FACS de múltiplas cores no dia 0 e no día 14. Os resultados foram pontuados para cada doador na plotagem de dispersáo. A Figura 9c mostra urna plotagem de dispersao que exibe o aumento ao longo do tempo (enriquecimento) na quantidade de células T CD3+ Vy9+V52+ e CD3+CD16+ Vy9+V52+ dentro da populagao de linfócitos. A quantidade de células semeadas no dia 0 e a quantidade de células colhidas no dia 14 foram levadas em consideragao. A adigao de IL-2 ñas culturas de PBMC é exigida para sobrevivencia e crescimento de linfócitos. Os mesmos expandem-se de modo eficaz em culturas abastecidas com 300 U/ml de IL-2. A análise de FACS com a utilizagao de anticorpos específicos Vy9 V52 revela que a adigao de ZA/IL-2 induz, específicamente, a acumulagao de células T Vy9V52 (Figura 9a) . Após 14 dias, a populagao de linfócitos CD3 + pode compreender até 80% de células T Vy9V52. Urna porgao de células T Vy9V52 expressa CD16, enquanto o enriquecimento dessas células dentro da populagao de linfócitos CD3+ é de 10 a 700 vezes, dependendo do doador (Figuras 9b e 9c) . O enriquecimento das células T CD16+Vy9+V52+ ñas culturas é 10 a 600 vezes mais alto em comparagao com as culturas desenvolvidas sem ZA (Figura 9c). Conclui-se que o tratamento com ZA/IL-2 de PBMCs in vitro resulta na regulagao ascendente do recetor de FcylII CD16 que medeia a ADCC numa proporgao significativa de células T γδ.

Exemplo 7: IL-2 afeta a expansao de células T Vy9V52 T de urna maneira dependente de dose A adigáo de ZA ñas culturas é o fator mais importante para induzir o desenvolvimento de células T Vy9V52 . É bem conhecido que IL-2 é exigido para o crescimento e a sobrevivencia de células T.

As PBMCs foram cultivadas durante 14 dias em meio de RPMI suplementado com 1 μΜ de ZA e concentragóes de IL-2 crescentes. IL-2 foi adicionado no dia 0 e no dia 4. 0 enriquecimento de células T CD16+Vy9+V52+ dentro da populagao de linfócitos CD3+ foi determinado por coloragao de FACS de múltiplas cores no dia 0 e no dia 14. Para comparar os dadores diferentes, a quantidade de células T CD16+Vy9+V52+ colhidas após o cultivo com 600 U/ml de IL-2 foi definida para 100%; confira-se a Figura 10, á esquerda. Além disso, a atividade de ADCC das culturas isoladas desenvolvidas durante 14 dias em concentragóes crescentes de IL-2 foi testada; confira-se a Figura 10, á direita.

Confirmou-se através de análise de resposta á dose que IL-2 também estimula o crescimento e a sobrevivencia do subconjunto de células T Vy9V52. Adicionando-se baixas concentragóes de IL-2 no meio, verificou-se urna correlagao entre a dose de IL-2 e a percentagem de células T CD16+Vy9V52 T dentro da populagao de linfócitos CD3+ (Figura 10, á esquerda). A atividade de ADCC das células desenvolvidas em concentragóes de IL-2 mais altas (150 a 600 U/ml) é aprimorada em comparagao com as células desenvolvidas em baixas concentragóes de IL-2 (Figura 10, á direita).

Exemplo 8: ZA induz a produgao de IPP em monócitos e células cancerosas que estimulam a expansao de células T Vy9Vó2

As culturas de PBMCs frescas (Exp. #1) ou de células T Vy9V52 estimuladas por ZA/IL-2 por 14 dias (Exp. #2 a 5) foram incubadas sem monócitos (razao efetora:monócito de 1:0), com 0,2 vezes (4:1) ou 5 vezes (razao 1:4) a quantidade de monócitos ± 1 μΜ de ZA. O enriquecimento de células T Vy9V52 T ñas coculturas após 14 dias foi determinado por FACS de múltiplas cores, enquanto a expansao da cultura foi considerada no cálculo. O fator de enriquecimento de células T Vy9V52 cultivadas com monócitos numa razao de 1:4 foi definido para 100% para cada experiencia. O aumento de monócitos na cultura resultou num enriquecimento de células T Vy9V52 maior do que 10 vezes. Esse efeito foi claramente dependente de ZA; confira-se a Figura lia.

Além disso, células de cancro de estómago humanas (NUGC-4-luciferase) e células de cancro de estómago murinas (CLS103 - corada com calceina) foram pré-tratadas com ou sem 5 μΜ de ZA durante 2 dias. As células T Vy9V52 humanas foram purificadas por MACS (día 14) e cocultivadas com as células cancerosas durante 24 h. A citotoxicidade de células T Vy9V52 para células-alvo nao tratadas e tratadas com ZA foi determinada medindo-se a atividade de luciferase remanescente ou fluorescencia de calceina; confira-se a Figura 11b. As células-alvo (NUGC-4 e CLS103) foram pré-tratadas com ou sem 5 μΜ de ZA durante 2 dias e, subsequentemente, incubadas durante 4 h com mitomicina c (50 MI) para interromper a proliferagao. As células T Vy9V52 humanas em repouso há mais de 14 dias purificadas por MACS e 3H-timidina foram adicionadas as células-alvo e as coculturas foram incubadas durante 48 h a 37 °C. A proliferagao foi determinada medindo-se a incorporagao de 3H-timidina no ADN com a utilizagao de um contador de cintilagao MicroBeta. A proliferagáo de células-alvo nao tratadas com ZA e sem células T Vy9V52 T foi definida para 100%; confira-se a Figura 11c.

Conforme mostrado ñas Figuras 11b e 11c, as células cancerosas humanas pulsadas com ZA ativaram as células T Vy9V52 em temos de citotoxicidade (5 a 10 vezes) e de proliferagao (1,4 a 1,8 vezes), enquanto a linhagem celular de cancro murino CLS103 falhou em obter esses efeitos em células T Vy9V52.

Exemplo 9: Tratamento com ZA/IL-2 afeta a composigao de culturas de PBMC O crescimento e a diferenciagao de tipos de célula específicos em culturas de PBMC dependem da presenga de citocinas. Esses componentes sao adicionados ao meio (por exemplo, fatores de crescimento presentes no soro, IL-2) ou secretados pelas próprias células imunológicas. O tipo de células que evoluem também depende da composigao inicial das PBMCs e das dotagóes genéticas. Para analisar o aumento total em células efetoras (células NK e células T Vy9V52), as PBMCs de 10 dadores diferentes foram desenvolvidas na presenga de 300 U/ml de IL-2 e com ou sem 1 μΜ de ZA durante 14 dias. A quantidade de células efetoras dentro da populagao de linfócitos foi identificada por coloragao de FACS de múltiplas cores com a utilizagao de anticorpos CD3, CD16, CD56, Vy9 e V52. As células CD3-CD56+CD16+ representam as células NK e CD3+Vy9+V52+ representam as células T Vy9V52. A análise de FACS de múltiplas cores revelou que mediante o tratamento com IL-2, desenvolveram-se principalmente células NK, enquanto em culturas tratadas com ZA/IL-2, as células T Vy9V52 sao predominantemente expandidas (Figura 12).

Exemplo 10: Tratamento com ZA/IL-2 gera células T de memoria efetoras Vy9V52+

As subpopulagoes de linfócitos T podem ser delineadas com o auxilio de dois marcadores de superficie, da isoforma de alto peso molecular do antigénio de linfócito comum CD45RA e do recetor de quimiocina CCR7. Células T virgens e de memoria central (CM) CCR7+ sao caracterizadas pela capacidade para circular repetidamente nos ganglios linfáticos e encontrar o antigénio. Em contrapartida, os linfócitos T de memoria efetora (EM) e efetores RA+ (TEMRA) regulam de modo descendente CCR7 e parecem especializados na migragáo para tecidos nao linfoides periféricos, por exemplo, para sitios infetados ou tumorais. As células de EM podem, aínda, ser subdivididas com base na expressao diferencial entre CD27 e CD28. A perda progressiva de expressao de superficie de CD28 e CD27 é concomitante com a regulagáo ascendente da capacidade citolítica das células. Além disso, o nivel de CD57 correlaciona-se com a expressao de granzimas e perforinas e, assim, representa um terceiro marcador que exibe maturagáo de citotoxicidade/célula.

As PBMCs foram cultivadas com ou sem μΜ de ZA e 300 U/ml de IL-2 durante 14 dias. A expressao dos marcadores de superficie diferentes foi determinada através de análise de FACS de múltiplas cores no día 0 (PBMCs) e no dia 14. As células virgens sao CD45RA+CCR7+, as células de memoria central (CM) sao CD45RA-CCR7 + , TEMRA sao CD45RA+CCR7- e as células de memoria efetora (EM) sao negativas para ambos os marcadores; confira-se a Figura 13a. Além disso, a atividade citolítica das células T Vy9V52 foi determinada através de coloragáo para os marcadores CD27 e CD57; confira-se a Figura 13b,c. Além disso, o desenvolvimento de características do tipo célula NK importante para a atividade de ADCC foi analisado através de colocagao de células CD3+ com CD16 (ligagao ao anticorpo) e CD56 (adesao); confira-se a Figura 13d. A análise de FACS de múltiplas cores das células T Vy9V52 revelou que o tratamento com ZA/IL-2 claramente estimulou o desenvolvimento de células T Vy9V52 do tipo EM que sao CD27-e CD57+ (Figuras 13b a 13c). Além da atividade citolítica intensificada, um aumento no nivel de CD16 e CD56, que sao conhecidos das células NK (CD3-CD16+CD56+) a serem envolvidas em ADCC, foi observado na populagao de CD3+ (Figura 13d).

Tomados em conjunto, esses dados implicam que o tratamento com ZA de PBMCs resulta no desenvolvimento de células T de memoria efetora CD16+Vy9+V52+, que tém capacidade para migrar para tecidos nao linfoides periféricos e que exibem marcadores de alta atividade citolítica. Em combinagao com o anticorpo de direcionamento ao tumor IMAB362, essas células sao extremamente bem aproveitadas para migrar, direcionar e exterminar células tumorais.

Exemplo 11: Células T Vy9V52 expandidas por ZA/IL-2 sao efetores potentes para ADCC dependente de CLDN18.2 mediada por IMAB362

Similares as células NK, as células T Vy9V52 expandidas por ZA/IL-2 sao positivas para CD16 (veja-se as Figuras 9 e 13), o recetor FcyRIII por meio do qual um anticorpo ligado á célula desencadeia a ADCC. Para avaliar se as células T Vy9V52 tém capacidade para induzir a ADCC potente em conjunto com IMAB362, urna série de experiencias foram realizadas.

As PBMCs derivadas de 2 dadores diferentes (#1 e #2) foram cultivadas em meio com 300 U/ml de IL-2 e com ou sem 1 μΜ de ZA. Após 14 dias, as células foram colhidas e adicionadas com concentragóes crescentes (0,26 ng/ml a 200 yg/ml) de IMAB362 as células NUGC-4 que expressam CLDN18.2. O exterminio especifico foi determinado em ensaios de luciferase; confira-se a Figura 14a. As Figuras 14b, 14c fornecem urna visao geral de ensaios de ADCC realizados com 27 dadores desenvolvidos em 300 U/ml de IL-2 e com ou sem ZA. NUGC-4 serviu como células-alvo. Para cada doador, os valores de ECso (b) calculados a partir das curvas de resposta á dose e a taxa de exterminio especifica máxima numa dose de 200 yg/ml de IMAB362 (c) foram pontuados ñas plotagens de dispersao.

Urna forte atividade de ADCC dependente de IMAB362 foi observada contra células NUGC-4 de CLDN18.2 positivo com a utilizagáo de PBMCs cultivadas durante 14 dias com ZA/IL-2 (Figura 14a). Com a utilizagáo de culturas de PBMC tratadas com ZA/IL-2, a ADCC depende da presenga de células T Vy9V52 (Figuras 12 e 15). Caso as células sejam cultivadas sem ZA, a atividade de ADCC é reduzida para a maioria dos dadores. Nessas culturas, a atividade de ADCC residual é dependente de célula NK (Figuras 11 e 14) . Testando-se mais de 20 dadores, os ensaios de ADCC revelam que o tratamento com ZA/IL-2 de PBMCs aprimora as taxas de exterminio especificas máximas e EC50 em comparagáo com as PBMCs cultivadas apenas com IL-2.

Além disso, as PBMCs de dois dadores diferentes (#1 + #2) foram cultivadas com 1 μΜ de ZA e 300 U/ml de IL-2. Essas culturas de células efetoras foram utilizadas em ensaios de ADCC com linhagens de células-alvo humanas de CLDN18.2 positivo (NUGC-4, RATO III) e negativo (SK-BR-3) (razáo E:T de 40:1). Quantidades crescentes (0,26 ng/ml a 200 yg/ml) de anticorpo IMAB362 foram adicionadas. A ADCC foi medida em ensaios de luciferase; confira-se a Figura 15a. A mesma experiencia, conforme descrito em (a) , foi realizada com células-alvo NUGC-4 e células efetoras colhidas de culturas tratadas com ZA/IL-2 em pontos de tempo diferentes; confira-se a Figura 15b. A mesma experiencia, conforme descrito em (a) , foi realizada com a utilizagao de NUGC-4 como as células-alvo; confira-se a Figura 15c. As células expandidas por ZA/IL-2 foram utilizadas diretamente ou as células T Vy9V52 foram purificadas a partir das culturas com a utilizagáo de classificagáo por MACS de TCRyó (Miltenyi Biotech). Urna pureza superior a 97,0% de células T Vy9V52 em linfócitos foi obtida.

Foi observada urna forte atividade de ADCC contra linhagens celulares de tumor humano CLDN18.2 positivo, mas nao de CLDN18.2 negativo (Figura 15a). Além disso, nenhuma atividade de ADCC é obtida com anticorpos de controlo de isotipo (nao mostrado). No curso do tratamento com ZA/IL-2, a atividade litica de ADCC aumenta ao longo do tempo para urna fragáo de dadores (Figura 15b) . A curva de dose/efeito de IMAB362 desloca-se para cima e para a esquerda, o que mostra valores de EC50 e taxas de lise máximas aprimoradas ao longo do tempo. Em comparagáo com a PBMC incondicionada, as células T efetoras Vy9V52 enriquecidas por tratamento com ZA/IL-2 tém capacidade para alcangar urna taxa de exterminio máxima mais alta de células alvo CLDN18.2 positivo e as mesmas exigem concentragoes mais baixas de IMAB362 para a mesma taxa de exterminio.

Para confirmar que as células T Vy9V52 sao o reservatório para a atividade litica, essas células foram isoladas com > 97% de pureza por classificagao de célula magnética de populagóes de PBMCs cultivadas com ZA/IL-2 no dia 14. A atividade de ADCC em conjunto com IMAB362 é retida e parcialmente aprimorada devido á pureza mais alta. Esses dados confirmam que as células T Vy9V52 sao responsáveis, principalmente, pela atividade de ADCC observada com culturas de PBMC de mais de 14 dias (Figura 15c).

Exemplo 12: Tratamento de linhagens de célula alvo com ZA/IL-2 nao afeta a expressao de superficie de CLDN18.2

Os modos de agáo desencadeados por IMAB362 sao estritamente dependentes da presenga e da quantidade de CLDN18.2 detetável extracelular. Portanto, foi realizada a influencia de tratamento com ZA/IL-2 em densidade de superficie de CLDN18.2 foi analisada por citometria de fluxo com a utilizagao de linhagens celulares NUGC-4 e RATO III que expressam CLDN18.2 endógeno. Específicamente, a análise de citometria de fluxo de ligagáo ao IMAB362 em células gástricas cancerosas NUGC-4 nao permeabilizadas pré-tratadas com ZA/IL-2 ou ZA/IL-2+EOF ou ZA/IL-2+5-FU/OX durante 72 horas. O tratamento com ZA/IL-2 in vitro nao revela alteragáo na quantidade de localizagáo de superficie de CLDN18.2; confira-se a Figura 16.

Exemplo 13: Aumento de ADCC mediada por IMAB362 através de tratamento com ZA/IL-2 de PBMCs nao é comprometido por pré-tratamento com EOF

Os agentes quimioterápicos comprometem a proliferagao celular. Em contrapartida, o tratamento com ZA/IL-2 desencadeia a expansao de células T Vy9V52. Para analisar as influencias dessas interagoes opostas em células efetoras, as PBMCs de 6 dadores saudáveis foram cultivadas com ZA/IL-2 ou ZA/IL-2+E0F durante 8 dias antes da aplicagáo em ensaios de ADCC (razao E:T de 15:1) . Foram determinadas as concentragóes de IMAB362 que resultam em 50% de lise mediada por ADCC de células-alvo NUGC-4 nao tratadas (EC50 ) . O aumento de ADCC induzida por IMAB362 de células NUGC-4 devido ao tratamento de PBMC com ZA/IL-2 nao é significativamente alterado por tratamento de PBMCs combinado com EOF (Figura 17).

Exemplo 14: Direcionamento in vivo de IMAB362 a tumores de CLDN18.2 positivo e efeitos antitumorais de IMAB362 em xenoenxertos de células tumorais humanas em murganhos sem pelo

Para investigar o direcionamento de células tumorais in vivo de IMAB362, foram administrados 80 yg de anticorpo identificado com Dyelight® 680 de maneira intravenosa a murganhos sem pelo que foram xenoenxertados com a linhagem celular de cancro gástrico humano NUGC-4. As células NUGC-4 exibem expressao de superficie de CLDN18.2 assim como de HER2/neu (alvo de trastuzumabe), mas sao negativas para CD20. Foram conduzidos estudos de controlo que injetam grupos enxertados com NUGC-4 de murganhos com trastuzumabe identificado com Dyelight 680 (grupo de controlo positivo) ou rituximabe identificado com Dyelight® 680 (controlo negativo). O ΙΜΔΒ362 acumula-se forte e exclusivamente nos xenoenxertos de tumor, conforme demonstrado por imagiologia ao vivo de murganhos com a utilizagao de um sistema de imagiologia de fluorescencia Xenogen® 24 horas após a injegáo intravenosa de anticorpos (Figura 18). IMAB362 é retido de modo eficaz no tumor alvo-positivo e detetável em intensidade comparável mesmo após 120 horas (Figura 18). O trastuzumabe também é detetado exclusivamente nos xenoenxertos 24 horas após a injegáo. O sinal de trastuzumabe é rápidamente lavado dentro de 120 horas após a injegáo. Nenhum sinal é detetado com rituximabe.

Além disso, IMAB362 foi utilizado para tratar murganhos sem pelo que contém tumores de xenoenxerto de CLDN18.2 positivo. Foram conduzidos estudos de modelo de tratamento precoce (com administragóes de IMAB362 tao cedo quanto 3 dias após a inoculagao de células tumorais). Além disso, foram iniciadas experiencias de tratamento de tumor avangado até 9 dias após a inoculagao de célula tumoral, quando os tumores tinham alcangado volumes de cerca de 60 a 120 mm3.

Os murganhos sem pelo foram inoculados de maneira subcutánea com lxlO7 de transíetantes HEK293~CLDN18.2. O tratamento de 10 murganhos por grupo iniciou-se 3 dias após a inoculagao de tumor. Os murganhos foram tratados com 200 μg de IMAB362, infliximabe como controlo de isotipo e PBS duas vezes por semana durante 6 semanas, alternando-se as rotas de aplicagáo entre intravenosa e intraperitoneal. Embora todos os murganhos nos grupos tratados com PBS ou controlo de isotipo tenham morrido dentro de 70 a 80 dias, os animáis tratados com IMAB362 tiveram um beneficio de sobrevivencia (Figura 19). Nao só o tempo até a morte foi prolongado, mas 4 de 10 murganhos sobreviveram todo o periodo de observagáo de 210 dias. O tratamento de 9 a 10 murganhos por grupo foi iniciado quando os volumes médios de tumor alcangaram 88 mm3(62 a 126 mm3). Antes do tratamento, os murganhos foram estratificados em grupos de teste para assegurar tamanhos de tumor comparáveis em todos os grupos. Os murganhos foram tratados com 200 pg de IMAB362, controlo de isotipo ou PBS duas vezes por semana durante 6 semanas, alternando-se as rotas de aplicagáo entre intravenosa e intraperitoneal. Todos os murganhos nos grupos tratados com PBS ou controlo de isotipo morreram dentro de 50 a 100 dias. Os animáis tratados com IMAB362 tiveram um beneficio de sobrevivencia, com aproximadamente o dobro de tempo médio de sobrevivencia (47 versus 25 dias). Tres desses murganhos sobreviveram todo o periodo de observagáo (Figura 20) . Sobretudo, a eficácia antitumoral in vivo depende da presenga do alvo ñas células tumorais. Nenhum efeito antitumoral de tratamento com IMAB362 foi observado em murganhos enxertados com células tumorais HEK293 de CLDN18.2 negativo. O modelo de tumor gástrico de NUGC-4 foi utilizado para investigar a eficácia de IMAB362 contra células cancerosas com expressáo endógena de CLDN18.2. As células NUGC-4 desenvolvem-se agressivamente em murganhos sem pelo.

Foram injetados lxlO7 de células gástricas cancerosas NUGC- 4 de maneira subcutánea no flanco esquerdo de murganhos sem pelo atímicos (n = 9 para grupo de ΙΜΔΒ362; n = 8 para grupos de controlo) . IMAB362 (200 yg por injegáo) e controlos foram aplicados duas vezes por semana, alternando-se entre intravenoso e intraperitoneal, com inicio 6 dias após a inoculagáo de tumor com injegáo intravenosa. Os tamanhos de tumor foram monitorizados duas vezes por semana. Os dados apresentados na Figura 21a sao valores médios com SEM. O crescimento de tumor de murganhos tratados com ΙΜΔΒ362 foi significativamente inibido em comparagao com os murganhos tratados com controlos (* p<0,05) . A Figura 21b mostra os volumes de tumor no día 21 após a inoculagáo de tumor. Os volumes de tumor de murganhos tratados com IMAB362 foram significativamente menores do que os tumores de murganhos de controlo (* p<0,05).

Quando lxlO7 de células tumorais sao inoculados em murganhos, o tempo médio de sobrevivencia de murganhos nao tratados nao é maior do que 25 dias. O tratamento com IMAB362, cetuximabe, trastuzumabe ou controlos de isotipo e tampáo foi iniciado quando os volumes de tumor alcangaram um tamanho médio de cerca de 109 mm3(63 a 135 mm3) . Os murganhos foram estratificados de maneira dependente de tamanho em grupos de tratamento (Figura 21). Mostrou-se que o IMAB362 reduz significativamente a taxa de crescimento de tumor. Nenhuma redugáo significativa de crescimento de tumor em comparagáo com os controlos salinos ou de anticorpo foi observada para esses modelos de tumor em desenvolvimento agressivo. O atraso no crescimento de tumor foi associado a um aumento nao significativo do tempo médio de sobrevivencia de murganhos tratados com IMAB362 (31 dias versus 25 dias). A atividade antitumoral de IMAB362 foi examinada com dois modelos de xenoenxerto de carcinoma gástrico humano com a utilizagáo de células NCI-N87 ou NUGC-4 com transdugáo lentiviral de CLDN18.2 alvo de IMAB362 (NCI-N87-CLDN18.2 e NUGC-4-CLDN18.2).

Os tumores de xenoenxerto de NCI-N87~CLDN18.2 foram inoculados através de injegáo de lxlO7 de células NCI-N87~CLDN18.2 no flanco de 8 murganhos sem pelo (fémeas, 6 semanas de idade) por grupo de tratamento. O tratamento comegou 5 dias após a inoculagao de tumor por injegáo intravenosa de 800 μρ de IMAB362 ou com 200 μΐ de NaCl a 0,9% para o grupo de controlo salino. A administragao intravenosa foi continuada semanalmente durante todo o tempo de observagao. O tamanho de tumor e a saúde do animal foram monitorizados quase semanalmente. A Figura 22a mostra os efeitos de tratamento com IMAB362 no crescimento de tumor. O tamanho de tumores de medula espinal foi medido duas vezes por semana (valor médio + SEM, ***p<0,001) . A Figura 22b mostra plotagens de sobrevivencia de Kaplan-Meier. Os murganhos foram sacrificados quando o tumor alcangou um volume de 1.400 mm3.

Assim, o tratamento continuo com IMAB362 inibiu o crescimento tumoral de maneira altamente significativa (p<0,001) de xenoenxertos de carcinoma gástrico de NCI-N87~CLDN18.2 (Figura 22a). O atraso no crescimento de tumor foi associado a um tempo de sobrevivencia significativamente mais longo (p<0,05) de murganhos tratados com IMAB362 (Figura 22b). A imunoterapia com IMAB362 de xenoenxertos de NUGC-4~CLDN18.2 de crescimento rápido resultou em tamanhos de tumor significativamente menores (p<0,05) no dia 14 do tratamento. Após as primeiras duas semanas de tratamento com IMAB362, a progressao de tumor de NUGC-4~CLDN18.2 foi muito agressiva. No entanto, a inibigao de crescimento de tumor de NUGC-4~CLDN18.2 até o día 14 do tratamento resultou em sobrevivencia significativamente mais longa (p < 0,05) de murganhos tratados com IMAB362.

Em suma, IMAB362 foi altamente eficaz no tratamento de xenoenxertos de carcinoma gástrico, mostrando retardagáo significativa de progressao de tumor, e prolongou a sobrevivencia em modelos de tumor de CLDN18.2 positivo endógenos. Em sistemas de modelo de tumor muito agressivos, esses efeitos antitumorais de IMAB362 sao menos proeminentes, mas, nao obstantes, significativos, o que enfatiza a forte capacidade antitumoral de IMAB362.

Exemplo 15: Efeitos antitumorais de IMAB362 combinado com quimioterapia em modelos de tumor de murganho

In vitro, a ADCC mediada por IMAB362 é mais eficaz em células gástricas cancerosas humanas pré-tratadas com combinagóes de agentes quimioterápicos, incluindo o EOF e 5-FU + OX. Portanto, o impacto antitumoral da combinagáo desses compostos com IMAB362 foi investigado in vivo em modelos de tumor de murganho.

Os tumores de xenoenxerto de NCI-N87~CLDN18.2 foram inoculados por injegáo de lxlO7 de células NCI-N87~CLDN18.2 de maneira subcutánea no flanco de 9 murganhos para cada grupo de tratamento. Os murganhos que contém tumor foram tratados de acordo com o regime de EOF com 1,25 mg/kg de epirrubicina, 3,25 mg/kg de oxaliplatina e 56,25 mg/kg de 5- fluorouracil intraperitoneal no día 4, 11, 18 e 25 após a inoculagáo de tumor, seguida por injegáo intravenosa de 800 yg de IMAB362 24 horas após a administragáo de quimioterapia. O tratamento com IMAB362 foi continuado semanalmente. O tamanho de tumor e a saúde do animal foram monitorizados quase semanalmente. A Figura 23a mostra os efeitos de tratamento combinado no crescimento de tumor. O tamanho de tumores de medula espinal foi medido duas vezes por semana (valor médio + SEM; * p<0,05) . A Figura 23b mostra plotagens de sobrevivencia de Kaplan-Meier. Os murganhos foram sacrificados quando o tumor alcangou um volume de 1.400 mm3.

Murganhos sem pelo que contém tumor de NCI-N87~CLDN18.2 tratados com regime de IMAB362 ou EOF mostraram crescimento de tumor suprimido de maneira altamente significativa em comparagao com os murganhos de controlo. O tratamento com IMAB362 adicional em combinagao com quimioterapia com EOF resultou na inibigao de crescimento de tumor significativamente mais alta (p<0,05) do que o tratamento apenas com regime de EOF regime (Figura 23a) . A sobrevivencia média de murganhos no grupo de controlo salino foi de 59 dias. O tratamento semanal com IMAB362 de murganhos prolongou significativamente a sobrevivencia média para 76 dias, similar á sobrevivencia de murganhos no grupo de EOF com urna sobrevivencia média de 76 dias, também. Mas o tratamento combinado com IMAB362 e EOF aumentou a sobrevivencia média para 81 dias (Figura 23b).

Os tumores de xenoenxerto foram inoculados por injegao de lxlO7 de células NUGC-4~CLDN18.2 de maneira subcutánea no flanco de 10 murganhos sem pelo (fémeas, seis semanas de idade) por grupo de tratamento. Os murganhos foram tratados no dia 3, 10, 17 e 24 com agentes quimioterápicos. O tratamento com IMAB362 foi continuado semanalmente. A Figura 24a mostra as curvas de crescimento de tumor de xenoenxertos de NUGC-4~CLDN18.2 de medula espinal (valor médio + SEM). A Figura 24b mostra plotagens de sobrevivencia de Kaplan-Meier (Teste de Log-rank (Mantel-Cox), **p<0,01).

Os tumores de xenoenxerto de NUGC-4~CLDN18.2 subcutáneos desenvolvem-se muito agressivamente. No entanto, o tratamento com IMAB362 de murganhos sem pelo que contém tumor inibiu significativamente o crescimento de tumor em comparagáo com o grupo de controlo tratado com solugáo salina. Na terapia combinada com EOF, os efeitos de IMAB362 em crescimento de tumor de NUGC-4~CLDN18.2 foram mascarados pela inibigáo do crescimento devido ao tratamento com EOF, mostrando nenhum aumento de inibigáo de crescimento de tumor em comparagáo com o tratamento apenas com EOF (Figura 24a). No entanto, a sobrevivencia média de murganhos tratados com regime de IMAB362 EOF foi prolongada de maneira altamente significativa (p<0,01) em comparagáo com a sobrevivencia de murganhos tratados apenas com EOF (Figura 24b).

Exemplo 16: Células T Υγ9νδ2 expandidas por ZA/IL-2 aprimoram o controlo mediado por IMAB362 de tumores avangados in vivo

Para investigar a atividade combinada de células T γδ geradas por IMAB362 e ZA/IL-2 em sistemas de murganho, recorreu-se a murganhos NSG. Os murganhos NSG carecem de células T maduras, células B, células exterminadoras naturais (NK) , múltiplas vias de sinalizagáo de citocina, e os mesmos tém muitos defeitos na imunidade inata, enguanto os nichos nos tecidos imunológicos primários e secundários sao permissivos para a colonizagao por células imunológicas humanas.

Os murganhos NSG foram inoculados de maneira subcutánea com 1 x 107 de células HEK293 transfetadas por CLDN18.2. No mesmo dia, os murganhos receberam 8xl06 de PBMCs humanas enriquecidas para células T Vy9V52, que foram cultivadas durante 14 dias em meio suplementado com ZA. Além disso, os murganhos foram injetados com 50 yg/kg de ZA e 5.000 U de IL-2 (Proleucina). Para manter as células T humanas funcionáis, IL-2 foi administrado quase semanalmente e ZA semanalmente. Quando os tumores de HEK293~CLDN18.2 tornaram-se visiveis macroscópicamente, o tratamento quase semanal com 200 yg de IMAB362 foi iniciado. Além dos 9 murganhos tratados conforme descrito, dois grupos de controlo de murganhos foram estabelecidos. Um grupo nao recebeu células T γδ humanas, o outro grupo foi tratado com um anticorpo de controlo de isotipo em vez de com IMAB362. A excrescencia de tumores de CLDN18.2 positivo em murganhos tratados com IMAB362 na presenga de células T γδ humanas e ZA foi significativamente inibida e quase eliminada, enquanto em murganhos tratados com um anticorpo de controlo de isotipo ou que carecem de efetores de célula T humana, os tumores cresceram agressivamente e os murganhos tiveram que ser prematuramente exterminados (Figura 25).

Exemplo 17: Efeitos antitumorais de IMAB362 combinado com quimioterapia em modelos de tumor de murganho A atividade antitumoral de IMAB362 em combinagáo com quimioterapia foi examinada em aloenxertos de carcinoma gástrico subcutáneos em murganhos NMRI nao consanguíneos imunocompetentes com a utilizagáo de células CLS-103 com transdugáo lentiviral de cldnl8.2 murino (CLS-103~cldnl8.2).

Os tumores de aloenxerto de CLS-103~cldnl8.2 foram inoculados por injegáo de lxlO6 de células CLS-103~cldnl8.2 de maneira subcutánea no flanco de 10 murganhos NMRI para cada grupo de tratamento. Os murganhos que contém tumor foram tratados com 1,25 mg/kg de epirrubicina, 3,25 mg/kg de oxaliplatina e 56,25 mg/kg de 5-fluorouracil (EOF) intraperitoneal no dia 3, 10, 17 e 24 após a inoculagao de tumor, seguida por injegao intravenosa de 800 yg de IMAB362 24 horas após cada administragao de quimioterapia. IL-2 foi administrado quase semanalmente por injegao subcutánea de 3.000 IE. Após o fim da quimioterapia, o tratamento com IMAB362 e IL-2 foi continuado durante todo o periodo de observagáo. O tamanho de tumor e a saúde do animal foram monitorizados quase semanalmente. Os murganhos foram sacrificados quando o tumor alcangou um volume de 1.400 mm3 ou os tumores tornaram-se ulcerosos.

Conforme pode ser observado na Figura 26, murganhos NMRI que contém tumor de CLS-103~cldnl8.2 tratados com IMAB362 ou apenas EOF mostraram nenhuma inibigao de crescimento de tumor significativa em comparagao com o grupo de controlo salino. Em contrapartida, a combinagáo de quimioterapia com EOF e tratamento com IMAB362 resultou em inibigao de crescimento de tumor significativamente mais alta e prolongou a sobrevivencia de murganhos que contém tumor. Essas observagóes indicam a existencia de efeitos terapéuticos aditivos ou até mesmo sinérgicos através da combinagáo de quimioterapia com EOF e imunoterapia com IMAB362. O tratamento com IL-2 nao mostrou nenhum efeito no crescimento de tumor.

LISTAGEM DE SEQUÉNCIA

<110> Ganymed Pharmaceuticals AG

<120> COMBINAgAO DE TERAPIA QUE ENVOLVE ANTICORPOS CONTRA CLAUDINA 18.2 PARA TRATAMENTO DE CANCRO

<130> 342-71 PCT <150> PCT/EP2012/002210 <151> 23-05-2012 <160> 50 <170> Patentln versao 3.5

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Glu ser Gly val Pro asp Arg Phe Thr Gly ser Gly ser Gly Thr Asp 85 SO' 95

Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser val Gln Ala Glu Asp Leu Ala val Tyr 100 105 110

Tyr Cys Lys Gln ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 1Í5 120 125

Leu Glu lie Lys Arg Thr val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro 130 135 140 pro Ser Asp slu Gln Leu Lys ser Gly Thr Ala ser val val cys Leu 145 150 155 160

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys val Asp 165 170 175

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser val Thr Glu Gln Asp 180 185 190

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr leu ser Lys 195 200 205

Ala Asp Tyr Glu lys His Lys val Tyr Ala Cys Glu val Thr His Gln 210 213 220

Gly Leu ser ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu cys 225 230 235 <210> 26 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Descrigao de sequéncia artificial: anticorpo monoclonal quimérico <400> 26

Asp ser cln Ala Sin val Leu Met Leu Leu Leu Leu Tro val ser 1 5 10 15

Cl/ Tíir Cys Gly Asp lie val Met Ser Gl« ser Pro Ser Ser Lew Ala 20 25 30 val ser val Gly Glu Lys Val Thr Met ser cys Lys Ser ser Glu Ser 35 40 45

Leu Leu Tyr ser Ser Asn Gln Lys aso Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln sin 50 55 60 tp Pro 01 y 61 n ser pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

«5 70 75 SO 6lu ser 61 y val Pro Asp Arg Phe Thr Gly ser Gly ser Ala Thr Asp 85 90 95

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100 IOS ÜO m*s Cys Gly sin Gly Tyr ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr XXS 120 125

Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser val Phe lie Phe 130 135 140 pro pro Ser Asp Glu 61« Leu Lys Ser Gly Thr Ala ser val val cys 145 150 155 160

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr pro Arg Glu Ala Lys val Glrt Trp Lys val 165 170 175 ASp Asé Ala Leu Gln Ser Gly Asn ser Gln Glu ser Val Thr Glu Gln 180 185 190 aso ser tys Asp ser Thr Tyr ser Leu ser ser Thr Leu Thr Lew ser 195 200 205

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Hís Lys Val Tyr Ala cys Glu val Thr His 210 215 220

Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu cy$ 225 230 235 240 <210> 27 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Descrigao de sequéncia artificial: anticorpo monoclonal quimérico <400> 27 mt .Asp ser Gln Ala <31 n val Leu Met Leu Leu Leu Leu rrp val ser 1 5 10 15

Gly Thr tys Gly Asp lie val «et Ser 61n Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 val ser val 6ly Glu tys val Thr mt Ser cys lys Ser Ser Gln Ser 35 40 ' 45

Leu Leu Tyr ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Ley Ala Trp Tyr Gln Gln

Lys Pro 61 y 6ln Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Aro m 70 75 80

Glu Ser si y val pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Glv Thr aso 85 90

Phe Thr Leu Thr He Ser Ser val Lys Ala Glu asp Leu Ala Val Tvr 100 105 lio

Tyr cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr phe Gly Ala Gly Thr 120 125

Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr val Ala Ala Pro ser val phe lie phe 130 13 S 1^0 pro Pro Ser aso g1u Gln Leu Lys ser Gly Thr Ala Ser val Val Cys 145 150 155 160

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys val Gln Trp Lys val 165 170 175 aso Asn Ala Leu el o ser Gly Asn ser Gln Glu ser val Thr Glu Gln ISO 1β5 190 aso Ser Lys Asp ser Thr tyr Ser Leu ser ser Thr Leu Thr Leu ser K ll5 ' ' 200 205

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys val Tyr Ala Cys slu val Thr hís 210 ‘ 215 220

Gln Gly leu ser Ser Pro val Thr Lys ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 <210> 28 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Descrigao de sequéncia artificial: anticorpo monoclonal quimérico <400> 28 mt si a Ser sin Thr Leu val Phe lie ser lie Leu Leu Trp Leu Tyr 1 S 10 15 si y Ala Asp Gly Asrt lie val Hat Thr sin ser Pro tys ser net ser 20 25 30

Met ser val Gly Glu Arg val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn 35 40 45 val Val Thr Tyr val ser Trp Tyr sin sin Lys Pro Glu Gln Ser Pro SO 55 60

Lys Leu Leu He Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly val Pro Asp

65 70 75 SO

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95 ser val Lys Ala Glu Asp leu Ala val Tyr Tyr cys Gln Gln Tyr Tyr 100 105 2.10 ser Tyr pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg lis 120 125

Thr val Ala Ala Pro ser Val Phe lie Phe pro pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140

Leu tys ser Gly Thr Ala ser val val cys Leu Leu Aso aso Phe Tyr 145 150 '155 260 pro Ara Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp aso Ala Leu Gln ser 165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp ser Thr ISO 285 100

Tyr ser Leu ser ser Thr Leu Thr Leu ser Lys Ala aso Tyr Glu Lys 195 200 205

Nls Lys val Tyr Ala Cys Glu val Thr His Gln Gly Leu ser Ser Pro 210 215 220 val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 29 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

<223> Descrigáo de sequéncia artificial: Tradugao de produto de PCR <400> 29

Gln Val Gln Ley Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys lie Ser Cys Lvs Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 2$ 30

Trp lie Gly rrp val Lys Gln Aro Pro Gly hís Gly Leu Glu Trp He 35 40 45

Gly Gly lie Leu Pro Gly Ser Gly ser Thr Aso Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr ser ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 SO

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Ala Arg Tyr Asp Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Glv Thr Leu 100 105 110 val Thr val ser Ala 115 <210> 30 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

<223> Descrigao de sequéncia artificial: Tradugao de produto de PCR <400> 30 6ln He Gln teu val ele Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys pro Gly elu

1 5 10 1S T'hr val Lys ile sor cys Lys Ala ser el y Tyr Thr Phé Thr As π Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Hat 35 40 45

Gly Trp lie Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe ser Leu Glu Thr ser Ala ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 teu Gln He Asn Asn teu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 8$ 90 95

Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met asp Tyr Trp Glv Gln Glv Thr ico ios ' no

Ser Val Thr val ser ser 115 <210> 31 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Descrigáo de sequéncia artificial: Tradugao de produto

de PCR <4O0> 31

Gln val Cln Leu cln Glrs Ser <s]y Ala Glu Leu Ala Ar9 P1*® o]y Ala

1 5 10 1S

Ser val Lys Leu ser cys tys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 tyr lie Aso Trp Val Lys Gln¡ Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie 35 40' 4$

Gly cío lie Tyr Pro Gly ser Gly asp Thr Tyr Tyr aso Glu tys Phe

W Til» * -Jr * VA W 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu xhr Ala Asp Lys Ser ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 SO mt ¡Sin Ley Ser Ser Leu Thr ser Glu Asp ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 m 95

Ala Aro ser Tyr el y Ala Phe Asp Tyr rrp Gly Gln Gly Thr Thr Leu IDO 105 110

Thr Val Ser Ser lis <210> 32 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Descrigáo de sequéncia artificial: Tradugao de produto de PCR <400> 32 eln val Gln Leu Gln <S1 nt Pro el y Ala Glu Leu val Arg Pro el y Ala 1 5 10 15 ser val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr ser Tyr 20 25 30

Trp ile aso Trp val Lys Gln Arg Pro Glv el o Gly Leu Glu Trp lie 35 40 * 45

Gly Asn lie Tyr pro Ser Asp ser Tyr Thr Asn Tyr Asn filo Lys Phe 50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr val Asp Lys ser ser ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 wet Gln Leu ser ser Pro Thr ser Glu as» ser Ala val tvt tvt Cvs 85 90 95

Thr Arg ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Tro Gly Gln Gly Thr 100 105 lio

Thr Leu Thr val Ser ser 115 <210> 33 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Descrigáo de sequéncia artificial: Tradugao de produto de PCR <400> 33

Glr* val Gln leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu val lys pro Gly Ala 1 S 10 I*

Ser Val Lys Met ser cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 val lie Ser Trp val Lys Gln Aro Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie 35 40

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Ala Arg Gly val Leu leu Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glo Gly 100 105 110

Ser Val Thr val ser ser lis <210> 34 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

<223> Descrigáo de sequéncia artificial: Tradugao de P de PCR <400> 34

Glrt val His Ley clrt Gln Ser Gly Ser Glu Leu Arg Ser Pro Gly Ser 1 5 10 15'

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65 ?0 ?S SO ryr ceu Glu Leu Asn Ser Leu Thr ser Glu Asp Ser Ala lie Tyr Tyr 35 90 95 cys Ala Arg Gly Glu Gly Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Glrt 100 105 110

Gly Thr Leu val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 35 <2H> 113 <212> PRT <2l3> Artificial <220>

<223> Descrigáo de sequéncia artificial: Tradugao de produto de PCR <400> 35 aso ile val Met Thr Gln ser pr© ser ser teu Thr val Thr Ala Gly

X 5 10 1S elu Lys Val Thr set Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu aso ser 20 25 30 el y Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr xrp T yr Gln Gln Lys Pro Gly (Sin 35 40 45 pro Pro tvs Leu Leu lie Tyr xrp Ala ser Thr Ar§ Glu ser Gly val

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Asp Tyr ser Tyr pro Leu Thr phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 <210> 36 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

<223> Descrigáo de sequéncia artificial: Traduqao de produto de PCR <400> 36

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Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Pro Thr 85 90 95 ¡Phe Gly Gly Gly Thr Lys leu Glu lie Lys 100 105 <210> 37 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

<223> Descrigáo de sequéncia artificial: Tradugao de produto de PCR <400> 37

Asp ile val Net Thr Gln ser Gln Lys Phe Het ser Thr ser val G’ty 1 S 10 15

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65 70 75 SO g1u Asp Ley Ala Asp Tyr phe cys Leo sin hís Trp Asn Tyr pro Leu 85 ' 90 95

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<223> Descrigáo de sequéncia artificial: Tradugao de produto de PCR <400> 38

Asp lie val Síet Ser Gln Ser Pro ser ser Leu Ala Val Ser val Gly 2 5 10 15 slii lvs val Thr Met ser cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Ang Glu Ser Gly val SO 55 60

Pro Aso Arg Phe Thr Gly Ser Gly ser Gly Thr as» Phe Thr Leu Thr

65 70 75 SO lie Ser Ser Val Lvs Ala Glu Aso Leu Ala Val Tyr Tyr cys Gln Gln 85 m 95

Tyr Tyr ser Tyr pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 <210> 39 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Descrigáo de sequéncia artificial: Tradugao de produto

de PCR <400> 39

Asp He val He* Thr Gln ser Pro ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 S ío 15

Glu Lys Val Thr Met Ser cvs Lvs Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Gly Asn Gln Lys asn Tyr teu Thr Trp ryr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 pro Pro Lys Leu Leu lie jyr Trp Ala ser Thr Arg Glu ser Gly val 50 55 60 pro Asp Arg Phe Thr Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 ®0 lie Ser Ser val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95

Asp Tyr ser Tyr pro phe Thr Phe Gly ser Gly Thr Lys Leu Glu lie 100 105 110

Lys <210> 40 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Descrigáo de sequéncia artificial: Tradugao de produto de PCR <400> 40

Asp ile val Met ser Glo ser Pro ser ser ueu Ala val ser Ala Gly 1 ' S ' 10

Gly Lys val Thr Het Ser cys Lys ser ser Gln Ser Ley Leu Asn Ser 20 25 30

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Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 pro Asp Arg phs Thr Gly ser Gly Ser Gly Thr Asp phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser val Glrt Ala Glu Asp Leu Ala val Tyr Tyr Cys Lys Sin 85 90 95

Ser Tyr Aso Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gly lie Lys 100 IOS 110 <210> 41 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

<223> Descrigáo de sequéncia artificial: Tradugao de produto de PCR <400> 41

Asp ile val m&amp;t ser Cln ser pro Ser Ser teu Ala val ser val Gly 15 10 15

Glu Lys val Thr Met Ser cys Lys ser ser cln ser Leu Leu Tyr ser 20 25 30 ser Asn cln Lys Asm Tyr Leu Ala Trp Tyr Cln Cln Lys Pro ely Cln 35 40 45

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ñ¡ ** η·/Ί 3 E SO 55 60

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6S 70 75 SO

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Lys <210> 42 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Descrigáo de sequéncia artificial: Tradugao de produto de PCR <400> 42 aso ile val wet ser Gln ser Pro ser ser Leu Ala val ser val Gly 1 S 10 15

Slu Lys val Thr Net Ser Cys tys Ser Ser Gln Ser Lee Leu tyr Ser 20 25 30

Ser Asrt Gln Lys aso Tyr Leu Ala rrp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala ser Thr Arg Glu ser Gly val SO S5 60

Pro Aso Arg Pfte Thr Gly Ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 7$ 80 lie ser ser val Lys Ala Glu Asp Leu Ala val Tyr Tyr Cys Gln Gln SS 90 95

Tyr Tyr ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 UO

Lys <210> 43 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Descrigao de sequéncia artificial: Tradugao de produto de PCR <400> 43

Asn ile val Met rfir ei« Ser Pro Sfir Met Ser ser ν|Ί i $ 10 15 61u Arg val Thr Leu rhr Cys Lys Ala Ser clu Asn val val Thr Tyr ¿o 2$ 30 val Ser Trp Tyr elrí Glb *-ν® prü Glu Cln Ser Pro Lys Ley Leu lie 35 40 45

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Leu Tyr As» Asn Pro Val Thr Ala val Phe Asn Tyr Gln si y Leu 15 10 15 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Epitopo <400> 47

Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys 1 S 10 15 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Epítopo <400> 48

Val Phe Asn Tyr Gln G'íy Leu Trp Arg ser Cy$ val Arg Glu Ser 1 S 10 15 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Epitopo <400> 49

Gln Gly Leu Trp .Arg Ser Cys Va'] Arg Glu Ser ser Gly Phe Thr 1 S 10 15 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Epítopo <400> 50

Aro ser Cys Val Aro Glu Ser Ser Glv Phe Thr Glu Cys Arg Gly 15 10 15

Lisboa,

Claims (18)

1. REIVINDICALES

   1. Anticorpo para utilizagáo num método para tratamento ou prevengáo de urna doenga de cancro, sendo que o referido método é caracterizado por compreender administrar o anticorpo em combinagao com um agente, em que (a) o anticorpo liga-se a CLDN18.2 e media o exterminio de células que expressam CLDN18.2 por ADCC e/ou CDC, em que o anticorpo compreende urna cadeia pesada de anticorpo que compreende a sequéncia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 32 e urna cadeia leve de anticorpo que compreende a sequéncia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 39, e (b) o agente é um agente que estabiliza ou aumenta a expressáo de CLDN18.2, sendo que o referido agente é selecionado do grupo que consiste em (i) oxaliplatina e 5-fluorouracilo, (ii) epirubicina, oxaliplatina e 5-fluorouracilo; (iii) 5-fluorouracilo, ácido folinico e oxaliplatina, (iv) Irinotecano, (v) Docetaxel e (vi) Cisplatina, e pró-fármacos dos mesmos.
2. 2. Anticorpo para utilizagáo, de acordo com a reivindicagáo 1, caracterizado por a cadeia pesada de anticorpo compreender a sequéncia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 17 e a cadeia leve de anticorpo compreender a sequéncia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 24.
3. 3. Anticorpo para utilizagáo, de acordo com a reivindicagáo 1 ou 2, caracterizado por o método compreender adicionalmente administrar um agente que estimula células T γδ, em que o referido agente é um bisfosfonato ou um agente selecionado do grupo que consiste em ácido zoledrónico, ácido clodrónico, ácido ibandrónico, ácido pamidrónico, ácido risedrónico, ácido minodrónico, ácido olpadrónico, ácido alendrónico, ácido incadrónico e sais dos mesmos.
4. 4. Anticorpo para utilizagao, de acordo com a reivindicagao 3, caracterizado por as células T γδ serem células T Vy9V62.
5. 5. Anticorpo para utilizagao, de acordo com a reivindicagao 3 ou 4, caracterizado por o bisfosfonato ser um bisfosfonato que contém nitrogénio (aminobisfosfonato).
6. 6. Anticorpo para utilizagao, de acordo com qualquer urna das reivindicagóes 3 a 5, caracterizado por o agente que estimula células T γδ ser administrado em combinagao com interleucina-2.
7. 7. Anticorpo para utilizagao, de acordo com qualquer urna das reivindicagóes 1 a 6, caracterizado por o método compreender administrar o anticorpo a urna dose de até 1.000 mg/m2.
8. 8. Anticorpo para utilizagao, de acordo com qualquer urna das reivindicagóes 1 a 7, caracterizado por o método compreender administrar o anticorpo repetidamente a urna dose de 300 a 600 mg/m2.
9. 9. Anticorpo para utilizagao, de acordo com qualquer urna das reivindicagóes 1 a 8, caracterizado por o cancro ser positivo para CLDN18.2.
10. 10. Anticorpo para utilizagao, de acordo com qualquer urna das reivindicagóes 1 a 9, caracterizado por o cancro ser um adenocarcinoma, em particular, um adenocarcinoma avangado.
11. 11. Anticorpo para utilizagao, de acordo com qualquer urna das reivindicagóes 1 a 10, caracterizado por o cancro ser selecionado do grupo que consiste em cancro do estomago, cancro do esófago, em particular, do esófago inferior, cancro da jungáo esogástrica e cancro gastroesofágico.
12. 12. Anticorpo para utilizagao, de acordo com qualquer urna das reivindicagóes 1 a 11, caracterizado por o paciente ser um paciente negativo para HER2 /neu ou um paciente com status positivo para HER2 /neu, mas nao elegivel para a terapia de trastuzumab.
13. 13. Anticorpo para utilizagao, de acordo com qualquer urna das reivindicagóes 1 a 12, caracterizado por CLDN18.2 ter a sequéncia de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 1.
14. 14. Preparagao médica caracterizada por compreender um anticorpo e um agente, em que (a) o anticorpo liga-se a CLDN18.2 e media o exterminio de células que expressam CLDN18.2 por ADCC e/ou CDC, em que o anticorpo compreende urna cadera pesada de anticorpo que compreende a sequéncia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 32 e urna cadera leve de anticorpo que compreende a sequéncia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 39, e (b) o agente é um agente que estabiliza ou aumenta a expressáo de CLDN18.2, sendo que o referido agente é selecionado do grupo que consiste em (i) oxaliplatina e 5-fluorouracilo, (ii) epirubicina, oxaliplatina e 5-fluorouracilo; (i i i) 5-fluorouracilo, ácido folinico e oxaliplatina, (iv) Irinotecano, (v) Docetaxel e (vi) Cisplatina e pró-fármacos dos mesmos.
15. 15. Preparagáo médica, de acordo com a reivindicagáo 14, caracterizada por a cadeia pesada de anticorpo compreender a sequéncia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 17 e a cadeia leve de anticorpo compreender a sequéncia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 24.
16. 16. Preparagáo médica, de acordo com a reivindicagáo 14 ou 15, caracterizada por compreender adicionalmente um agente que estimula células T γδ, em que o referido agente é um bisfosfonato ou um agente selecionado do grupo que consiste em ácido zoledrónico, ácido clodrónico, ácido ibandrónico, ácido pamidrónico, ácido risedrónico, ácido minodrónico, ácido olpadrónico, ácido alendrónico, ácido incadrónico e sais dos mesmos.
17. 17. Preparagáo médica, de acordo com qualquer urna das reivindicagoes 14 a 16, caracterizada por ser um kit que compreende um primeiro recipiente que incluí o anticorpo que tem a capacidade de ligar-se a CLDN18.2 e um recipiente que incluí o agente que estabiliza ou aumenta a expressao de CLDN18.2 e, opcionalmente, um recipiente que incluí o agente que estimula células T γδ.
18. 18. Preparagáo médica, de acordo com qualquer urna das reivindicagóes 14 a 17, caracterizada por incluir adicionalmente instrugóes impressas para utilizagáo da preparagáo para o tratamento de cancro. Lisboa,