ES2930654T3

ES2930654T3 - Terapia de combinación que involucra anticuerpos contra claudina 18.2 para el tratamiento del cáncer

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Publication number: ES2930654T3
Application number: ES14707647T
Authority: ES
Inventors: Ugur Sahin; Özlem Türeci; Rita Mitnacht-Kraus; Stefan Wöll; Stefan Jacobs; Cornelia Heinz
Original assignee: TRON Translationale Onkologie an der Universitaetsmedizin der Johannes Gutenberg Universitaet Mainz gGmbH; Astellas Pharma Inc
Current assignee: TRON Translationale Onkologie an der Universitaetsmedizin der Johannes Gutenberg Universitaet Mainz gGmbH; Astellas Pharma Inc
Priority date: 2013-02-20
Filing date: 2014-02-18
Publication date: 2022-12-20
Anticipated expiration: 2034-02-18
Also published as: AU2014221035A1; WO2014127906A1; CA2899754A1; AU2014221035B2; KR20230143186A; CN105073777B; HK1213925A1; US20150374789A1; CN115282269A; MX2020011783A; IL239981A0; US20180000900A1; AR094849A1; IL302093A; WO2014127785A1; JP7299369B2; DK2958945T3; US20210023177A1; KR102385872B1; JP2016510721A

Abstract

La presente invención proporciona una terapia de combinación para tratar y/o prevenir eficazmente enfermedades asociadas con células que expresan CLDN18.2, incluidas enfermedades cancerosas tales como cáncer de páncreas y sus metástasis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia de combinación que involucra anticuerpos contra claudina 18.2 para el tratamiento del cáncer

El cáncer de páncreas es uno de los cánceres más letales. La mortalidad se acerca al 100 % debido a la propensión a la diseminación metastásica temprana y porque la enfermedad es muy resistente a la radiación y la quimioterapia. Dado que cada año se diagnostican 27,000 nuevos casos en América del Norte y 68,000 en Europa, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas estrategias de tratamiento para reducir la mortalidad de los pacientes con cáncer de páncreas.

La molécula de unión estrecha, la variante 2 de empalme de Claudina 18 (Claudina 18.2 (CLDN18.2)) es un miembro de la familia de las claudinas de proteínas de unión estrecha. CLDN18.2 es una proteína transmembrana de 27.8 kDa que comprende cuatro dominios que atraviesan la membrana con dos pequeños bucles extracelulares. En tejidos normales no hay expresión detectable de CLDN18.2 por RT-PCR con excepción del estómago. La inmunohistoquímica con anticuerpos específicos de CLDN18.2 revela que el estómago es el único tejido positivo. CLDN18.2 es un antígeno de linaje gástrico altamente selectivo que se expresa exclusivamente en células epiteliales gástricas diferenciadas de vida corta. CLDN18.2 se mantiene en el curso de la transformación maligna y, por lo tanto, se muestra con frecuencia en la superficie de las células de cáncer gástrico humano. Además, este antígeno pantumoral se activa ectópicamente a niveles significativos en los adenocarcinomas de esófago, páncreas y pulmón.

El anticuerpo quimérico IgG1 IMAB362 que está dirigido contra CLDN18.2 ha sido desarrollado por Ganymed Pharmaceuticals AG. El anticuerpo IMAB362 se ha descrito en detalle en documentos del estado de la técnica WO2007/059997 y WO2008/145338. IMAB362 reconoce el primer dominio extracelular (ECD1) de CLDN18.2 con alta afinidad y especificidad. IMAB362 no se une a ningún otro miembro de la familia de las claudinas, incluyendo la variante de empalme 1 estrechamente relacionada de Claudina 18 (CLDN18.1). IMAB362 muestra una especificidad de célula tumoral precisa y agrupa cuatro mecanismos de acción independientes muy potentes. Tras la unión a la diana, IMAB362 media la muerte celular por ADCC, CDC y la inducción de la apoptosis inducida por el entrecruzamiento del diana en la superficie de la célula tumoral y la inhibición directa de la proliferación. Por lo tanto, IMAB362 lisa de manera eficiente las células positivas para CLDN18.2, incluidas las líneas celulares de cáncer gástrico humano in vitro e in vivo.

El perfil de toxicidad y PK/TK de IMAB362 se ha examinado minuciosamente en ratones y monos cangrejeros, incluidos estudios de búsqueda de intervalo de dosis, estudios de toxicidad de dosis repetidas de 28 días en cangrejeros y un estudio de toxicidad de dosis repetidas de 3 meses en ratones. Tanto en ratones (administración semanal de mayor duración del tratamiento durante 3 meses, niveles de dosis más altos de 400 mg/kg) como en monos cangrejeros (hasta 5 aplicaciones semanales de hasta 100 mg/kg) dosis repetidas de IMAB362 ivson bien toleradas. No se inducen signos de toxicidad sistémica o local. Específicamente, no se ha observado toxicidad gástrica en ningún estudio de toxicidad. IMAB362 no induce la activación inmunitaria ni la liberación de citoquinas. No se registraron efectos adversos en los órganos reproductores masculinos o femeninos. IMAB362 no se une a los tejidos que carecen del diana. Los estudios de biodistribución en ratones indican que el motivo de la falta de toxicidad gástrica es muy probablemente la compartimentación de las uniones estrechas en el sitio luminal en epitelios gástricos sanos, lo que parece afectar profundamente la accesibilidad del epítopo IMAB362.

IMAB362 se encuentra en las primeras pruebas clínicas. Se ha realizado un estudio clínico de fase I en humanos. Cinco cohortes de dosis (33 mg/m2, 100 mg/m2, 300 mg/m2, 600 mg/m2, 1000 mg/m2) de 3 pacientes cada uno recibió una única administración intravenosa de IMAB362 y se observaron durante 28 días. IMAB362 fue muy bien tolerado, sin observación de seguridad relevante en los pacientes. En un paciente, todos los marcadores tumorales medidos disminuyeron significativamente dentro de las 4 semanas posteriores al tratamiento. En un estudio clínico de fase IIa en curso, IMAB362 se administra de manera repetitiva.

El cáncer de páncreas responde mal a la mayoría de los agentes quimioterapéuticos (Vincent et al., 2011). El tratamiento del cáncer de páncreas con gemcitabina se describe, por ejemplo, en el documento de la técnica anterior Vincent et al. 2011. El documento del estado de la técnica Cartwright et al., 2008 describe la terapia de combinación del cáncer de páncreas con gemcitabina y, por ejemplo, cetuximab, un anticuerpo monoclonal dirigido al receptor del factor de crecimiento epidérmico humano o bevacizumab, un anticuerpo monoclonal dirigido al factor de crecimiento endotelial vascular. Cartwright et al., 2008 menciona la falta de demostración de una ventaja clínicamente significativa de la terapia de combinación con cetuximab sobre la monoterapia con gemcitabina. Cartwright et al., 2008 menciona además una falta de mejora en la supervivencia de los pacientes después de la terapia de combinación con bevacizumab en comparación con la monoterapia con gemcitabina.

En este documento se presentan datos que demuestran que los agentes quimioterapéuticos pueden estabilizar o aumentar la expresión de CLDN18.2 en la superficie de las células de cáncer de páncreas, lo que da como resultado una capacidad farmacológica mejorada de CLDN18.2 por un anticuerpo anti-CLDN18.2 tal como IMAB362. Se observó un efecto sinérgico de un anticuerpo anti-CLDN18.2 tal como IMAB362 con regímenes quimioterapéuticos particulares, en particular regímenes quimioterapéuticos usados para el tratamiento del cáncer de páncreas. Las células cancerosas humanas pretratadas con quimioterapia son más susceptibles a la muerte específica de la diana inducida por anticuerpos. En modelos de tumores en ratones, el control del tumor con un anticuerpo anti-CLDN18.2 más quimioterapia es superior al que se obtiene con un anticuerpo anti-CLDN18.2 como agente único.

Resumen

La presente enseñanza generalmente proporciona una terapia de combinación para tratar y/o prevenir eficazmente enfermedades asociadas con células que expresan CLDN18.2, incluidas enfermedades cancerosas tales como cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón tales como cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de vesícula biliar y sus metástasis, en particular metástasis de cáncer gástrico tales como tumores de Krukenberg, metástasis peritoneal y metástasis de ganglios linfáticos. Las enfermedades cancerosas particularmente preferidas son el cáncer de páncreas y sus metástasis.

En un aspecto, la presente enseñanza proporciona un método para tratar o prevenir el cáncer de páncreas en un paciente que comprende administrar al paciente (i) un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 y (ii) un agente que estabiliza o aumenta la expresión, es decir el nivel, de CLDN18.2. La expresión de CLDN18.2 es preferiblemente en la superficie celular de una célula cancerosa. El agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2 puede administrarse antes, simultáneamente o después de la administración del anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2, o una combinación de los mismos.

El agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2 puede ser un agente citotóxico y/o citostático. En una realización, el agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2 comprende un agente que induce una detención del ciclo celular o una acumulación de células en una o más fases del ciclo celular, preferiblemente en una o más fases del ciclo celular distintas de la fase G1 tal como la fase S, la fase G2 o una combinación de las mismas o una combinación de la fase S o la fase G2 con la fase G1. El agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2 puede comprender un agente seleccionado del grupo que consiste en análogos de nucleósidos, compuestos de platino, análogos de camptotecina y taxanos, profármacos de los mismos, sales de los mismos y combinaciones de los mismos. El análogo de nucleósido se puede seleccionar del grupo que consiste en gemcitabina, 5-fluorouracilo, profármacos de los mismos y sales de los mismos. El compuesto de platino puede seleccionarse del grupo que consiste en oxaliplatino, cisplatino, profármacos de los mismos y sales de los mismos. El análogo de camptotecina se puede seleccionar del grupo que consiste en irinotecano, topotecano, profármacos de los mismos y sales de los mismos. El taxano se puede seleccionar del grupo que consiste en paclitaxel, docetaxel, profármacos de los mismos y sales de los mismos. El agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2 puede comprender un agente seleccionado del grupo que consiste en gemcitabina, 5-fluorouracilo, oxaliplatino, irinotecano, paclitaxel, profármacos de los mismos, sales de los mismos y combinaciones de los mismos. El agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2 puede comprender una combinación de oxaliplatino y 5-fluorouracilo o profármacos de los mismos, una combinación de cisplatino y 5-fluorouracilo o profármacos de los mismos, una combinación de al menos un taxano y oxaliplatino, una combinación de al menos un taxano y cisplatino, una combinación de al menos un taxano y 5-fluorouracilo o profármacos de los mismos, o una combinación de al menos un análogo de camptotecina y 5-fluorouracilo o profármacos de los mismos. El agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2 puede comprender una combinación de gemcitabina y oxaliplatino, una combinación de gemcitabina y cisplatino, una combinación de gemcitabina y carboplatino o una combinación de oxaliplatino, 5-fluorouracilo o profármacos de los mismos e irinotecano. Por consiguiente, el método de la enseñanza puede comprender administrar una combinación de gemcitabina y oxaliplatino, una combinación de gemcitabina y cisplatino, una combinación de gemcitabina y carboplatino o una combinación de oxaliplatino, 5-fluorouracilo o profármacos de los mismos e irinotecano. En una realización, el método de la enseñanza comprende administrar ácido folínico, 5-fluorouracilo o profármacos de los mismos, irinotecano y oxaliplatino. El agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2 puede comprender un agente que induce la muerte celular inmunogénica. El agente que induce la muerte celular inmunogénica puede comprender oxaliplatino.

En otro aspecto, la presente enseñanza proporciona un método para tratar o prevenir el cáncer en un paciente que comprende administrar al paciente (i) un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 y (ii) gemcitabina. En una realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vesícula biliar y metástasis de los mismos. La enfermedad cancerosa puede ser un tumor de Krukenberg, una metástasis peritoneal y/o una metástasis en los ganglios linfáticos. En una realización, el cáncer es un adenocarcinoma, en particular un adenocarcinoma avanzado. En una realización, el cáncer es cáncer de páncreas.

En una realización, el método de la enseñanza comprende además administrar un agente que estimula las células T Y5. En una realización, las células T ^y§ son células T V^y9V52. En una realización, el agente que estimula las células T y6 es un bisfosfonato tal como un bisfosfonato que contiene nitrógeno (aminobisfosfonato). En una realización, el agente que estimula las células T ^y§ se selecciona del grupo que consiste en ácido zoledrónico, ácido clodrónico, ácido ibandrónico, ácido pamidrónico, ácido risedrónico, ácido minodrónico, ácido olpadrónico, ácido alendrónico, ácido incadrónico y sales de los mismos. En una realización, el agente que estimula las células T y§ se administra en combinación con interleucina-2.

El método de la enseñanza puede comprender además administrar al menos un agente quimioterapéutico adicional que puede ser un agente citotóxico.

El anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 puede unirse a epítopos nativos de CLDN18.2 presentes en la superficie de las células vivas. En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 se une al primer bucle extracelular de CLDN18.2. En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 media en la destrucción celular mediante una o más de la lisis mediada por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), lisis mediada por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), inducción de apoptosis e inhibición de la proliferación. En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es un anticuerpo monoclonal, quimérico o humanizado, o un fragmento de un anticuerpo. En una realización, el anticuerpo media en la muerte celular cuando se une a CLDN18.2 celular, en particular a CLDN18.2 expresado por células en su superficie celular, siendo las células preferiblemente células cancerosas, tales como células de los cánceres descritos en este documento. En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en (i) un anticuerpo producido y/u obtenible a partir de un clon depositado con el n.° de acceso DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809, o DSM ACC2810, (ii) un anticuerpo que es, una forma quimerizada o humanizada del anticuerpo de acuerdo con (i), (iii) un anticuerpo que tiene la especificidad del anticuerpo de acuerdo con (i) y (iv) un anticuerpo que comprende la porción de unión al antígeno o el sitio de unión al antígeno, en particular la región variable, del anticuerpo de acuerdo con (i) y preferiblemente que tenga la especificidad del anticuerpo de acuerdo con (i). En una realización, el anticuerpo se acopla a un agente terapéutico tal como una toxina, un radioisótopo, un fármaco o un agente citotóxico.

En una realización, el método de la enseñanza comprende administrar el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 a una dosis de hasta 1000 mg/m2 En una realización, el método de la enseñanza comprende administrar el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 repetidamente a una dosis de 300 a 600 mg/m2.

De acuerdo con la enseñanza, CLDN18.2 tiene preferiblemente la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.

En una realización, el cáncer descrito en el presente documento es positivo para CLDN18.2. En una realización, las células cancerosas del cáncer descrito en el presente documento son positivas para CLDN18.2. En una realización, las células cancerosas del cáncer descrito en el presente documento expresan CLDN18.2 en su superficie celular.

En una realización, el cáncer de páncreas descrito en el presente documento comprende cáncer primario, cáncer avanzado o cáncer metastásico, o una combinación de los mismos, tal como una combinación de cáncer primario de páncreas y cáncer metastásico. En una realización, los métodos de la enseñanza son para el tratamiento simultáneo de cáncer primario y cáncer metastásico tal como cáncer primario de páncreas y cáncer metastásico de páncreas. En una realización, el cáncer metastásico comprende metástasis en los ganglios linfáticos, ovario, hígado o pulmón, o una combinación de los mismos. En una realización, el cáncer de páncreas comprende cáncer del conducto pancreático. En una realización, el cáncer de páncreas comprende un adenocarcinoma o carcinoma, o una combinación de los mismos. En una realización, el cáncer de páncreas comprende un adenocarcinoma ductal, un adenocarcinoma mucinoso, un carcinoma neuroendocrino o un carcinoma de células acinares, o una combinación de los mismos. En una realización, el cáncer de páncreas es parcial o completamente refractario al tratamiento con gemcitabina, tal como la monoterapia con gemcitabina. En una realización, la prevención del cáncer de páncreas comprende la prevención de la recurrencia del cáncer de páncreas.

En una realización, el paciente a tratar de acuerdo con la enseñanza se sometió a una cirugía por cáncer de páncreas. En una realización, el paciente tiene una lesión pancreática precancerosa, en particular una lesión pancreática precancerosa que comprende un cambio histológico maligno inicial en los conductos pancreáticos. En estas realizaciones, los métodos de la enseñanza apuntan preferiblemente a prevenir el desarrollo de cáncer de páncreas maligno.

En otro aspecto, la presente enseñanza proporciona una preparación médica para tratar o prevenir el cáncer de páncreas que comprende (i) un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 y (ii) un agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2. La preparación médica de la presente enseñanza puede comprender además un agente que estimula las células T ^y§. El anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 y el agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2, y opcionalmente el agente que estimula las células T y§, pueden estar presentes en la preparación médica en una mezcla o separados entre sí. La preparación médica puede estar presente en forma de un kit que comprende un primer contenedor que incluye el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 y un segundo contenedor que incluye el agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2, y opcionalmente un contenedor que incluye el agente estimulante de las células T ^y§. La preparación médica puede incluir además instrucciones impresas para el uso de la preparación para el tratamiento o prevención del cáncer de páncreas, en particular para el uso de la preparación en un método de enseñanza. Diferentes realizaciones de la preparación médica y, en particular, del anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2, el agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2 y el agente que estimula las células T y§ son como se describe anteriormente para los métodos de la enseñanza.

En un aspecto particular, la presente enseñanza proporciona una preparación médica que comprende (i) un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 y (ii) gemcitabina. La preparación médica de la presente enseñanza puede comprender además un agente que estimula las células T y§. El anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 y gemcitabina, y opcionalmente el agente que estimula las células T y§, pueden estar presentes en la preparación médica en una mezcla o separados entre sí. La preparación médica puede ser para tratar o prevenir el cáncer tal como el cáncer de páncreas. La preparación médica puede estar presente en forma de un kit que comprende un primer contenedor que incluye el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 y un segundo contenedor que incluye gemcitabina, y opcionalmente un contenedor que incluye el agente que estimula las células T y§. La preparación médica puede incluir además instrucciones impresas para el uso de la preparación para el tratamiento o la prevención del cáncer, tal como el cáncer de páncreas, en particular para el uso de la preparación en un método de la enseñanza. Diferentes realizaciones de la preparación médica y, en particular, del anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2, el agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2 y el agente que estimula las células T ^y6 son como se describió anteriormente para los métodos de la enseñanza.

La presente enseñanza también proporciona los agentes descritos en este documento, tales como el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 y/o el agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2 para usar en los métodos descritos en este documento. Por ejemplo, la presente enseñanza también proporciona el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 para administración junto con un agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2 tal como gemcitabina y, opcionalmente, un agente que estimula las células T ^y§.

Otras características y ventajas de la presente enseñanza serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Vector lentiviral utilizado para la transducción de líneas celulares de cáncer de páncreas. Se clonó CLDN18.2 humano secuencia abajo del promotor EF1a. El casete de expresión está integrado entre las repeticiones terminales largas (LTR 5' y 3') que permiten el empaquetamiento y la transcripción inversa del ARNm viral. RSV: el virus del sarcoma de Rous permite la producción independiente de Tat de ARNm viral. Amp: Gen de resistencia a la ampicilina. PGKp: Promotor de blasticidina. WPRE: elemento regulador postranscripcional de la marmota; mejora la expresión transgénica. LTR: repetición terminal larga, permite el empaquetamiento viral. SV40A permite la terminación transcripcional y la poliadenilación del ARNm. pUC: cadena principal del vector bacteriano. Bla: promotor de la ampicilina.

Figura 2. Análisis de metástasis de células pancreáticas en pulmón de ratón. Esquema de disección de pulmones de ratón después de inyección iv de ratones con células de cáncer de páncreas.

Figura 3. Expresión de CLDN18.2 en tejidos pancreáticos normales y cancerosos. Tinción de tejido de páncreas normal fijado en formalina incluido en parafina (FFPE) (A) y tejido de adenocarcinoma de páncreas (B) con el anticuerpo monoclonal murino 35-22A (0.2 pg/mL). Contratinción con hematoxilina (2:00 min). Aumento 200x.

Figura 4. Expresión de CLDN18.2 en tejidos pancreáticos normales y precancerosos. Tinción con 43-14A de varias estructuras precancerosas (A) normal y PanINI; (B) PanIN2; (C) PanIN3. Aumento 200x.

Figura 5. Estudio piloto - Correlación entre la intensidad de la señal de CLDN18.2 y la cantidad de células tumorales positivas para los tumores primarios de páncreas analizados. Cada punto representa un caso de cáncer primario de páncreas analizado mediante la tinción de secciones de FFPE utilizando el anticuerpo monoclonal murino 35-22A (0.2 pg/mL). La línea discontinua marca el valor del 10 %.

Figura 6. Estudio piloto - Expresión de CLDN18.2 en tejido tumoral pancreático primario y metastásico. Tinción de secciones de tejido de FFPE (3 pm) usando el anticuerpo monoclonal murino 35-22A de (A) tumor primario de adenocarcinoma y (B) metástasis de ganglios linfáticos. Hematoxilina (Mayers) contrastada.

Figura 7. Estudio principal: Correlación entre la intensidad de la señal de CLDN18.2 y la cantidad de células tumorales positivas para los tumores primarios de páncreas analizados. Cada punto representa un caso de tumor primario de adenocarcinoma ductal pancreático (círculo lleno) o un caso de tumor primario neuroendocrino (círculo vacío) analizado mediante la tinción de secciones de FFPE con anticuerpo monoclonal murino 43-14A (0.2 pg/mL).

Figura 8. Correlación entre la intensidad de la señal de CLDN18.2 y la cantidad de células tumorales positivas para las metástasis de páncreas analizadas. Cada punto representa un caso de metástasis en los ganglios linfáticos pancreáticos (círculo lleno) o en el hígado (círculo vacío) analizado mediante la tinción de secciones de FFPE utilizando el anticuerpo monoclonal murino 43-14A (0.2 pg/mL). La línea discontinua marca el valor del 10 %.

Figura 9. Expresión de CLDN18.2 en tejido tumoral pancreático primario y metastásico. Tinción de secciones de tejido de FFPE (3 pm) utilizando el anticuerpo monoclonal murino 43-14A en tumor primario de adenocarcinoma (A, C, E) y metástasis en ganglios linfáticos (B, D, F). Las secciones se contratiñeron utilizando Hematoxilina Mayers.

Figura 10. Análisis gráfico - Expresión de CLDN18.2 en tumor primario de páncreas y tejidos metastásicos de ganglios linfáticos coincidentes.

Figura 11. Expresión de CLDN18.2 en tumor primario de páncreas y tejidos metastásicos. Tinción de secciones de tejido de FFPE (3 |jm) de (A) adenocarcinoma primario, (B) metástasis hepática y (C) metástasis de ganglio linfático, utilizando el anticuerpo monoclonal murino 43-14A. Las secciones se contratiñeron utilizando Hematoxilina de Mayers. Aumento 200x.

Figura 12. Niveles de ARNm de CLDN18.2 en líneas celulares de carcinoma de páncreas. (A) Análisis de expresión por Q-PCR de diferentes líneas celulares de CA de páncreas, las líneas celulares transducidas lentiviralmente (LVT) (barras grises), la línea celular de cáncer de estómago KATO-III (control positivo) y la línea celular de cáncer de mama SKBR-3 (control negativo). Las transcripciones de CLDN18.2 se amplificaron utilizando cebadores específicos de genes. Líneas celulares endógenas que muestran un nivel de expresión relativo superior a 1 * 105se calificaron como positivas para CLDN18.2 (barras rayadas). NTC: Muestra de control de H2O. Barras de error: Media DE. (B-D) Análisis de expresión de CLDN18.2 dependientes del etapa en Patu8988S (B), Panc05.04 (C) y las líneas celulares LVT indicadas (D). El número de pase se indica debajo de cada barra.

Figura 13. Niveles de proteína CLDN18.2 en lisados celulares de líneas celulares de carcinoma pancreático. Las proteínas se separaron en SDS-PAGE al 12.5 %. El análisis de transferencia Western se realizó usando un anticuerpo CLDN18 que detecta el terminal C de CLDN18.1 y CLDN18.2 (Zymed-MID) y usando un anticuerpo de control de carga que detecta p-actina. Se utilizaron tiempos de exposición de 140 segundos (Pierce SuperSignal West Dura) y 20 segundos (Pierce SuperSignal West Pico) respectivamente. (A) Detección de CLDN18 en lisados de líneas celulares de páncreas, el control positivo (HEK293-p740) y los lisados de células de control negativo (SKBR-3). (B) Expresión de CLDN18.2 comparada entre lisados de células parentales no transducidas y lisados de líneas celulares transducidas lentiviralmente (LVT). Se agregaron Patu8988S y SKBR-3 como control positivo y negativo, respectivamente.

Figura 14. Detección y localización celular de la expresión de CLDN18 en líneas celulares de cáncer de páncreas. Tinción de líneas celulares de cáncer de páncreas cultivadas en cubreobjetos. Anticuerpo: 35-22A (aumento 20x, el tiempo de exposición se indica debajo de cada imagen). Se usó DAPI para teñir los núcleos (azul). (A: AsPC1; B: BxPC3; C: CFPAC; D: DANG; E: HPAF-II; F: HUP-T3; G: HUP-T4; H: KCl-MOH; I: Panel; J: Panc05.04; K: Panc02.04; L: Panc04.03; M: Patu8902; N: Patu8988S; O: Su86.86: P: Suit-2; P: SW-1990; R: YAPC; S: línea celular de control de cáncer gástrico KATO-III).

Figura 15. Detección y localización celular de la expresión de CLDN18 en líneas celulares de cáncer de páncreas transducidas con CLDN18.2. Detección de CLDN18 en líneas celulares de cáncer de páncreas transducidas lentiviralmente (LVT) usando el anticuerpo 35-22A después de la fijación y permeabilización. Para la detección se utilizaron anticuerpos secundarios marcados con Alexa488 o Alexa555. A: BxPC3-LVT; B: CAPAN1-LVT; C: DANG-LVT; D: HPAC-LVT; E: MiaPaCa2-LVT; F: Patu8902-LVT; G: Suit-2-LVT; H: YAPC-LVT.

Figura 16. Unión de IMAB362 a la superficie celular de líneas celulares CA de páncreas positivas para CLDN18.2 (Pharmacodynamics). Análisis IF de líneas celulares de cáncer de páncreas (A,B,D,E), líneas celulares de páncreas transducidas lentiviralmente (G-L) y células de control de cáncer gástrico KATO-III (C, F) que expresan CLDN18.2. Las células se tiñeron con IMAB362 en condiciones nativas (D-E) y para comparación con 35-22A después de la fijación y permeabilización de las células (A-C). Se usó DAPI para teñir los núcleos. Los tiempos de exposición se indican en cada panel. G: BxPC3-LVT; H: CAPAN1-LVT; I: DANG-LVT; J: MiaPaCa2-LVT; K: Patu8902-LVT; L: Suit2-LVT.

Figura 17. Expresión de CLDN18.2 en tumores xenoinjertados de diferentes líneas celulares. Expresión de CLDN18.2 en tumores xenoinjertados CAPAN1-LVT (A, B), BxPC3-LVT (C, D), PATU8988S-LVT (E, F), MiaPaCa2-LVT (G, H), YAPC-LVT (J, K) y DANG-LVT (L, M). La tinción de tejidos se realizó con anticuerpo Zymed-MID. Lente de aumento 10x (A, C, E, G, J, L) y 20x (B, D, F, H, K, M).

Figura 18. Comprobación del injerto de las líneas celulares de cáncer de páncreas Suit-2 y MiaPaCa2. Las células se inyectaron en la vena de la cola de ratones desnudos. Los animales se sacrificaron 45 (A), 52 (B), 59 (C) días después de la aplicación de Suit-2 (A-C) o 59 (D), 66 (E), 73 (F) días después de la inyección de MiaPaCa2(D-F). Los pulmones se prepararon y se tiñeron con anticuerpos del MHC de clase I (MHC I antihumano, clon EPR1394Y) para detectar las células humanas en tejidos de ratón.

Figura 19. Análisis de injerto de metástasis de Patu8988S. Las células Patu8988S se inyectaron iv con 1 * 106 o 2 * 106 las células en ratones Nu/Nu y los pulmones (A) y los hígados (B) de los ratones se aislaron en diferentes momentos, como se indica debajo del eje x. Para calcular el % de ADN humano presente en cada preparación de tejido, se preparó una curva estándar mezclando ADN humano y de ratón y preparando diluciones de 7 x 5 que resultaron en ADN humano 100 % (1) - 0.0064 % (7).

Figura 20. Análisis IHC de metástasis de Patu8988S en tejidos pulmonares de ratón. Los ratones inyectados en las venas de la cola con células Patu8988S se sacrificaron en diferentes momentos (A-D = 70 días, E-H = 86 días) y los tejidos pulmonares se aislaron y tiñeron con un anticuerpo del MHC-I (EPR1394Y) (A, B, E, F) diluido 1:1000 o con anti-Claudina18 (Zymed-Mid) (C, D, G, H) a razón de 0.2 pg/mL. Aumentos: A, C, E, G = 10x y B, D, F, H = 20x.

Figura 21. Apoptosis mediada por IMAB362 de células tumorales de páncreas tratadas con gemcitabina. Apoptosis inducida por entrecruzamiento de CLDN18.2 en BxPC3~CLDN18 después de 48 horas. BxPC3~CLDN18 se cultivaron en medio o medio 100 ng/mL de gemcitabina. La fracción de células apoptóticas de las células mononucleares se desplazó. Se obtuvieron desplazamientos similares mediante la incubación de células tumorales con camptotecina.

Figura 22. Potencia de la actividad ADCC inducida por IMAB362 en células de cáncer de páncreas. (A) ADCC realizado con líneas celulares de cáncer de páncreas positivas para CLDN18.2 usando PBMC de diferentes donantes. (B-F) ADCC realizado con líneas celulares de páncreas LVT que expresan ectópicamente CLDN18.2 y las células parentales correspondientes. (G) Diagrama de puntos.

Figura 23. Potencia de la actividad de CDC inducida por IMAB362 en células de cáncer de páncreas. (A) CDC realizado con reserva de suero humano sano como fuente de complemento, IMAB362 y células de control CDOK1-p740 de páncreas positivas para CLDN18.2 en 4 experimentos independientes. (B) ^cD^crealizado con líneas celulares de páncreas positivas para CLDN18.2 (Patu8988S, DANG, Panc05.04) y negativas para CLDN18.2 (CAPAN1, Suit2, BxPC3, YAPC). (C) CDC con líneas celulares LVT que se expresan ectópicamente. (D) Gráfico de puntos que muestra la concentración de IMAB362 que causa la mitad de las tasas de lisis máximas (EC50) en líneas celulares de cáncer de páncreas. (E) Tasas máximas de muerte obtenidas con IMAB362 en líneas celulares de cáncer de páncreas.

Figura 24. Efecto del tratamiento con IMAB362 en xenoinjertos subcutáneos MiaPaCa2-LVT. Se inocularon tumores de xenoinjerto MiaPaCa2-LVT mediante inyección subcutánea de 1e7 células MiaPaCa2-LVT en el costado de 15 ratones hembra Hsd: Foxnlnu desnudos atímicos para cada grupo de tratamiento. Al tercer día después de la inyección de células tumorales, se inició el tratamiento con 200 pg de IMAB362 o controles respectivamente. El tratamiento se continuó dos veces por semana alternando inyección ip e iv hasta que los animales fueron sacrificados. (A) Efecto del tratamiento con IMAB362 sobre el crecimiento tumoral. El tamaño de los tumores sc se midieron dos veces por semana (media SEM). (B) Gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier. Los ratones fueron sacrificados, cuando el tumor alcanzó un volumen de 1400 mm3 o el tumor se volvió ulceroso.

Figura 25. Tratamiento con IMAB362 de xenoinjertos subcutáneos de BxPC3-LVT. Se inocularon tumores de xenoinjerto BxPC3-LVT mediante inyección subcutánea de 1e7 células BxPC3-LVT en el costado de 15 ratones hembra Hsd: Foxnlnu desnudos atímicos para cada grupo de tratamiento. Al tercer día después de la inyección de células tumorales, se inició el tratamiento con 200 pg de IMAB362 o controles respectivamente. El tratamiento se continuó dos veces por semana alternando inyección ip e iv hasta que los animales fueron sacrificados. (A) Efecto del tratamiento con IMAB362 sobre el crecimiento tumoral. El tamaño de los tumores sc se midió dos veces por semana (media SEM, * p<0.05). (B) Gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier. Los ratones fueron sacrificados, cuando el tumor alcanzó un volumen de 1400 mm3 o el tumor se volvió ulceroso.

Figura 26. Efecto del tratamiento con IMAB362 sobre el crecimiento de la metástasis pancreática Suit2-LVT. Se inyectaron 2*10® células tumorales Suit2-LVT por vía intravenosa en la vena de la cola de 12 ratones hembra Hsd: -Foxnlnu desnudos atímicos por grupo de tratamiento. Al tercer día después de la inyección de células tumorales, se iniciaron los tratamientos con 200 pg de IMAB362, 200 pg de control de isotipo o con un volumen igual de PBS. Los animales se sacrificaron el día 42 después del injerto. (A) Análisis por qPCR (media de 2-4 reacciones por muestra) que determina el porcentaje de ADN humano presente en las muestras de pulmón de ratón. (B) El porcentaje de células humanas que cubren la superficie del pulmón del ratón se determinó mediante planimetría. Las células humanas se tiñeron inmunohistoquímicamente en secciones de tejido con anticuerpos anti-MHC de clase I humanos. * p<0.05 (prueba de Kruskal-Wallis). Barras de error: media ± DE.

Figura 27. Análisis por Q-PCR e IHC de metástasis pulmonar de Patu8988S. Se inyectaron 2*10® células Patu8988S por ratón. Los animales se sacrificaron después de 65 días. Círculos abiertos: ratones sacrificados después de 63 días. (A) Los ratones se trataron con 200 pg de IMAB362 dos veces por semana o control de solución salina. Cantidad de ADN humano (ng) detectado con Q-PCR, que se calculó a partir de los valores de Ct. (B) Repetir el experimento de Q-PCR como se describe en A. En el presente documento, el porcentaje de ADN humano presente en el ADN de ratón se calculó a partir de los valores de Ct. (C) Los ratones se trataron con IMAB362 y anticuerpo de control de isotipo (rituximab). El porcentaje de ADN humano presente en los pulmones del ratón se calculó a partir de los valores de Ct. Para el grupo IMAB3®2, se detectó un valor atípico (triángulo vacío). La importancia se indica incluyendo o excluyendo los valores atípicos. (D/E) mismo experimento que en C. Aquí se determinó la superficie de la metástasis utilizando el programa Image J. Los diagramas de puntos muestran la importancia de la inhibición de IMAB362 incluyendo (D) o excluyendo (E) el valor atípico. Valor p: prueba t no pareada. Barras de error ± DE.

Figura 28. Curvas de respuesta a la dosis para gemcitabina. Las líneas celulares de cáncer de páncreas muestran una sensibilidad muy diferente a la gemcitabina. Las líneas celulares se expusieron durante 4 días a diferentes concentraciones de gemcitabina y se analizó la inhibición de la proliferación mediante un ensayo de viabilidad.

Figura 29. Curvas de respuesta a la dosis para oxaliplatino. Las líneas celulares de cáncer de páncreas muestran una sensibilidad muy diferente al oxaliplatino. Las líneas celulares se expusieron durante 4 días a diferentes concentraciones de oxaliplatino y se analizó la inhibición de la proliferación mediante un ensayo de viabilidad.

Figura 30. Efecto del tratamiento con agentes quimioterapéuticas sobre la expresión de CLDN18.2 (ARN). ARN de células DANG no tratadas, pretratadas con Gem (1 ng/mL) o GemOx (Gem 1 ng/mL Ox 10 ng/mL) (2 días) (A) o Patu8988S (B) 3 días pretratadas con Gem (10 ng/mL ) o GemOx (Gem 10 ng/mL Ox 100 ng/mL)). El ARN se convirtió en ADNc y el nivel de transcripción de CLDN18.2 se analizó en PCR cuantitativa en tiempo real. Los resultados se muestran como unidades relativas en comparación con el nivel de transcripción del gen HPRT de mantenimiento.

Figura 31. Efecto de la quimioterapia sobre el nivel de proteína CLDN18.2 en células de carcinoma de páncreas. Proteína de lisados de células totales de células DANG no tratadas (med), pretratadas con Gem (1 ng/mL) o GemOx (Gem 1 ng/mL Ox 10 ng/mL)). (A) o Patu8988S (B) fue analizada para determinar la expresión de CLDN18.2 detectada con antisueros policlonales Zymed del terminal C. Se usó actina para mostrar una carga igual de proteínas.

Figura 32. Análisis FACS de la expresión en la superficie celular de CLDN18.2. La expresión de CLDN18 (histograma relleno) de Patu8988S cultivado en medio (izquierda) y tratado con Gem (derecha) se muestra en una superposición en comparación con Isotyp Co. Las Patu8988S se tratan con gemcitabina (10 ng/mL) durante 3 días.

Figura 33. Análisis del ciclo celular de células DANG tratadas o no con gemcitabina (Gem; 2 ng/mL) o gemcitabina oxaliplatino (GemOx; 1 ng/mL 10 ng/mL) durante dos días. (A) El tratamiento con gemcitabina conduce a la detención del ciclo celular de las células en fase S. El área de cada barra se divide para indicar el porcentaje de células en fase G0/G1, S y G2. (B) Los análisis de transferencia Western mostraron una sobrerregulación de CLDN18 después del tratamiento con Gem.

Figura 34. Influencia de la gemcitabina en el ciclo celular (A) y la expresión de CLDN18.2 (B, C) en células Patu8988S. Las células Patu8988S no se trataron o se trataron con gemcitabina (10 ng/mL) durante 2 días. (A) El área de cada barra se divide para indicar el porcentaje de células en fase G0/G1, S y G2. La densidad de CLDN18.2 (eje x) se representó frente al número de células (eje y). (B) Se transfiere la expresión de CLDN18.2 no tratadas (línea de puntos) frente a las tratadas con Gem (línea continua). (C) Se muestra la expresión de CLDN18.2 de células Patu8988S tratadas con Gem en fase G0/G1 (línea discontinua) frente a células en fase S (línea continua).

Figura 35. Efecto de la quimioterapia en las células de cáncer gástrico. El cultivo de células Kato III durante 96 horas conduce a una detención del ciclo celular en la fase G0/G1 (a) y subregulación de CLDN18.2 (c). Los compuestos citostáticos que dan como resultado una detención del ciclo celular en diferentes fases del ciclo celular, estabilizan la expresión de CLDN18.2 (c).

Figura 36. Efecto de la quimioterapia en las células de cáncer gástrico. Compuestos citostáticos que dan como resultado una detención del ciclo celular en diferentes fases del ciclo celular (fase S/G2 (irinotecano) o fase G2 (docetaxel)). El área de cada barra se divide para indicar el porcentaje de células en fase G0/G1, S y G2.

Figura 37. Curvas de respuesta a la dosis para ADCC mediada por IMAB362 después del tratamiento de quimioterapia de DANG. (A) Curvas de respuesta a la dosis de un donante representativo después del pretratamiento de células de cáncer de páncreas DANG con Gem o GemOx durante 40 h. (B) Valores de EC50 (media) para ADCC mediada por IMAB362. Valores p: prueba t no pareada.

Figura 38. Efecto de la quimioterapia en las células de cáncer gástrico. a: Las células tratadas con irinotecano, docetaxel o cisplatino muestran un nivel más bajo de células viables en comparación con las células diana cultivadas en medio. b: La expresión de CLDN18.2 en células tratadas con irinotecano, docetaxel o cisplatino aumenta en comparación con las células cultivadas en medio. c/d: El tratamiento de células con irinotecano, docetaxel o cisplatino aumenta la potencia de IMAB362 para inducir ADCC.

Figura 39. Influencia de agentes quimioterapéuticos en la CDC mediada por IMAB362 de células MiaPaCa2-LVT. Curvas de respuesta a la dosis de 2 ensayos independientes. Se cultivaron MiaPaCa2-LVT en medio, Gem (10 ng/mL) o GemOx (10 ng/mL de Gem 100 ng/mL de Ox) durante 70 h.

Figura 40. Efectos de la quimioterapia en la CDC inducida por IMAB362

Figura 41. Efecto del tratamiento con IMAB362 combinado con Gem o GemOx en xenoinjertos de BxPC3-LVT. Se inocularon tumores de xenoinjerto de BxPC3-LVT mediante inyección subcutánea de 8.5e6 células BxPC3-LVT en el costado de 10 ratones hembra Hsd: Foxnlnu desnudos atímicos para cada grupo de tratamiento. Al tercer día después de la inyección de células tumorales, se inició el tratamiento con quimioterapia (50 mg/kg de gemcitabina ip, respectivamente 50 mg/kg de gemcitabina más 5 mg/kg de oxaliplatino ip) y se continuó semanalmente durante seis semanas. 24 h después de la inyección de agentes quimioterapéuticos, se aplicaron 800 |jg de IMAB362 o controles por vía intravenosa en la vena de la cola. El tratamiento con IMAB362 se continuó semanalmente hasta que se sacrificaron los ratones. (A) Curvas de crecimiento de xenoinjertos subcutáneos de BxPC3-LVT. El tamaño de tumores sc se midió dos veces por semana (medio SEM). (B) Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron un volumen de 1400 mm3 o los tumores se volvieron ulcerosos.

Figura 42. Mejora de la eficacia antitumoral mediante la combinación del régimen de gemcitabina con IMAB362. Se inocularon tumores de xenoinjerto BxPC3-LVT mediante inyección subcutánea de 8.5e6 células BxPC3-LVT en los costados de 10 ratones hembra Hsd:Foxnlnu desnudos atímicos para cada grupo de tratamiento. Al tercer día después de la inyección de células tumorales, los tratamientos se iniciaron con quimioterapia (100 mg/kg de gemcitabina ip o 100 mg/kg de gemcitabina más 5 mg/kg de oxaliplatino ip) y se continuaron semanalmente durante seis semanas. Veinticuatro horas después de la inyección de agentes quimioterapéuticos, se aplicaron 200 |jg (1/2 dosis) o 400 |jg (dosis completa) de IMAB362 por vía intravenosa en la vena de la cola. El tratamiento con IMAB362 se continuó dos veces por semana con ip e iv alternando las inyecciones hasta que se sacrificaron los ratones. (A) Curvas de crecimiento de xenoinjertos subcutáneos de BxPC3-LVT. El tamaño de los tumores sc se midieron dos veces por semana (media SEM). (B) Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier. Los ratones fueron sacrificados, cuando los tumores alcanzaron un volumen de 1400 mm3 o los tumores se volvieron ulcerosos.

Figura 43. Efecto del tratamiento con IMAB362 combinado con gemcitabina en xenoinjertos de MiaPaCa2-LVT. Se inocularon tumores de xenoinjerto de MiaPaCa2-LVT mediante inyección subcutánea de 5e6 células MiaPaCa2-LVT en el costado de 10 ratones hembra Hsd:Foxnlnu desnudos atímicos para cada grupo de tratamiento. Cuatro días después de la inyección de células tumorales, se inició el tratamiento con quimioterapia (50 mg/kg de gemcitabina ip) y se continuó semanalmente durante seis semanas. Veinticuatro horas después de la inyección de agentes quimioterapéuticos, se aplicaron 200 jg de IMAB362 o controles por vía intravenosa en la vena de la cola. El tratamiento con IMAB362 se continuó dos veces por semana con inyecciones ip e iv alternándolas hasta que se sacrificaron los ratones. (A) Crecimiento de xenoinjertos subcutáneos. El tamaño de los tumores se midió dos veces por semana (media SEM). (B) Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier. Los ratones fueron sacrificados, cuando los tumores alcanzaron un volumen de 1400 mm3 o los tumores se volvieron ulcerosos.

Figura 44. Efecto del tratamiento con IMAB362 combinado con gemcitabina en tumores de xenoinjerto de MiaPaCa2-LVT establecidos. Se inocularon tumores de xenoinjerto de MiaPaCa2-LVT mediante inyección subcutánea de 1e7 células MiaPaCa2-LVT en el costado de ratones hembras Hsd: Foxn1nu desnudos atímicos. Nueve días después de la inoculación subcutánea del tumor, los ratones portadores del tumor se reorganizaron en grupos de tratamiento homogéneos con 8 animales por grupo y se inició el tratamiento. Los ratones se trataron con 150 mg/kg de gemcitabina dos veces por semana durante 4 semanas. Veinticuatro horas después de la inyección de gemcitabina, se aplicaron 200 jg de IMAB362 o controles por vía intravenosa en la vena de la cola. El tratamiento con 200 jg de IMAB362 se continuó dos veces por semana con inyecciones ip e iv alternándolas hasta que se sacrificaron los ratones. (A) El tamaño de los tumores subcutáneos se midió dos veces por semana (media SEM; **=p<0.01). (B) Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier. Los ratones fueron sacrificados, cuando el tumor alcanzó un volumen de 1400 mm3 o el tumor se volvió ulceroso (prueba de intervalo logarítmico (Mantel-Cox); **=p<0.01).

Figura 45. Efecto de IMAB362 en combinación con gemcitabina en metástasis de pulmón en el modelo de xenoinjerto de Patu8988S. Se inyectaron 2*10® células tumorales Patu8988S por vía intravenosa en la vena de la cola de 12 ratones hembra Hsd: Foxn1nu desnudos atímicos por grupo de tratamiento. Dos semanas después de la inyección intravenosa de células tumorales, se inició el tratamiento con tratamiento de mantenimiento de 200 jg de IMAB362 dos veces por semana (iv/ip) combinado con la administración de 100 mg/kg de gemcitabina ip dos veces por semana durante 4 semanas. El grupo de control se trató con 200 jg de anticuerpo de control de isotipo combinado con 100 mg/kg de gemcitabina dos veces por semana. Los animales se sacrificaron el día 70 después del injerto. (A) Análisis PCR cuantitativo (media de 3 reacciones por muestra) de ADN humano en muestras de pulmón de ratones tratados con IMAB362 y anticuerpos de isotipo. Diferencia significativa (P = 0.0035, prueba de Mann Whitney) frente al control de isotipo. (B) El porcentaje de células humanas teñidas que cubrían la superficie del pulmón del ratón se determinó mediante análisis informático. La tinción inmunohistológica se realizó con anticuerpo anti MHC-I humano (clon EPR1394Y) en tejidos pulmonares embebidos en parafina (media ± SEM; P = 0.0003, prueba de Mann Whitney). C y D: Ejemplos de tinciones inmunohistológicas con anticuerpo anti MHC-I en metástasis pulmonares de Patu8988s en ratones tratados con IMAB362 gemcitabina (C) o anticuerpo de isotipo gemcitabina (D).

Descripción detallada

Aunque la presente enseñanza se describe en detalle a continuación, debe entenderse que esta enseñanza no se limita a las metodologías, protocolos y reactivos particulares descritos en este documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente, y no pretende limitar el alcance de la presente enseñanza que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende comúnmente un experto en la materia.

A continuación, se describirán los elementos de la presente enseñanza. Estos elementos se enumeran con realizaciones específicas, sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear realizaciones adicionales. Los ejemplos descritos de diversas formas y las realizaciones preferidas no deben interpretarse como una limitación de la presente enseñanza únicamente a las realizaciones descritas explícitamente. Debe entenderse que esta descripción respalda y abarca realizaciones que combinan las realizaciones descritas explícitamente con cualquier número de los elementos descritos y/o preferidos. Además, cualquier permutación y combinación de todos los elementos descritos en esta solicitud debe considerarse divulgada por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto indique lo contrario.

Preferiblemente, los términos utilizados en este documento se definen como se describe en " A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel y H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza, (1995).

La práctica de la presente enseñanza empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, biología celular, inmunología y técnicas de ADN recombinante que se explican en la literatura en el campo (véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a edición, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprende" y variaciones tales como "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un miembro, número entero o etapa o grupo indicado de miembros, números enteros o etapas, pero no la exclusión de ningún otro miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas, aunque en algunas realizaciones puede excluirse dicho otro miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas, es decir la materia consiste en la inclusión de un miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas. Los términos "un" y "uno, una" y "el, la" y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la enseñanza (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en este documento o claramente contradicho por el contexto. La enumeración de intervalos de valores en este documento tiene la intención de servir simplemente como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo. A menos que se indique lo contrario en este documento, cada valor individual se incorpora a la especificación como si se mencionara individualmente en este documento. Todos los métodos descritos en este documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en este documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o ejemplo de expresión (por ejemplo, "tal como"), que se proporciona en este documento tiene la intención de ilustrar mejor la enseñanza y no representa una limitación en el alcance de la enseñanza reivindicada. Ninguna expresión en la especificación debe interpretarse como una indicación de cualquier elemento esencial no reivindicado para la práctica de la enseñanza.

El término "CLDN18" se relaciona con Claudina 18 e incluye cualquier variante, incluida la variante de empalme 1 de claudina 18 (claudina 18.1 (CLDN18.1)) y la variante de empalme 2 de claudina 18 (claudina 18.2 (CLDN18.2)).

El término "CLDN18.2" se refiere preferiblemente a CLDN18.2 humana y, en particular, a una proteína que comprende, preferiblemente que consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.

El término "CLDN18.1" se refiere preferiblemente a CLDN18.1 humana y, en particular, a una proteína que comprende, preferiblemente que consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.

El término "variante" de acuerdo con la enseñanza se refiere, en particular, a mutantes, variantes de empalme, conformaciones, isoformas, variantes alélicas, variantes de especies y homólogos de especies, en particular aquellos que están naturalmente presentes. Una variante alélica se relaciona con una alteración en la secuencia normal de un gen, cuyo significado a menudo no está claro. La secuenciación completa del gen a menudo identifica numerosas variantes alélicas para un gen dado. Un homólogo de especie es un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos con una especie de origen diferente a la de un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos dada. El término "variante" abarcará cualquier variante modificada postraduccionalmente y variantes de conformación.

De acuerdo con la enseñanza, el término "cáncer positivo para CLDN18.2" significa un cáncer que involucra células cancerosas que expresan CLDN18.2, preferiblemente en la superficie de dichas células cancerosas.

"Superficie celular" se usa de acuerdo con su significado normal en la técnica y, por lo tanto, incluye el exterior de la célula que es accesible para la unión por proteínas y otras moléculas. Por ejemplo, se considera que una proteína transmembrana que tiene una o más porciones extracelulares se expresa en la superficie celular.

CLDN18.2 se expresa en la superficie de las células si está ubicado en la superficie de dichas células y es accesible para unirse mediante anticuerpos específicos de CLDN18.2 añadidos a las células.

De acuerdo con la enseñanza, CLDN18.2 no se expresa sustancialmente en una célula si el nivel de expresión es más bajo en comparación con la expresión en células estomacales o tejido estomacal. Preferiblemente, el nivel de expresión es inferior al 10 %, preferiblemente inferior al 5 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.5 %, 0.1 % o 0.05 % de la expresión en células estomacales o tejido estomacal o incluso inferior. Preferiblemente, CLDN18.2 no se expresa sustancialmente en una célula si el nivel de expresión excede el nivel de expresión en tejido no canceroso que no sea el estómago en no más de 2 veces, preferiblemente 1,5 veces, y preferiblemente no excede el nivel de expresión en dicho tejido no canceroso. Preferiblemente, CLDN18.2 no se expresa sustancialmente en una célula si el nivel de expresión está por debajo del límite de detección y/o si el nivel de expresión es demasiado bajo para permitir la unión por anticuerpos específicos de CLDN18.2 añadidos a las células.

De acuerdo con la enseñanza, CLDN18.2 se expresa en una célula si el nivel de expresión excede el nivel de expresión en tejido no canceroso distinto del estómago preferiblemente en más de 2 veces, preferiblemente 10 veces, 100 veces, 1000 veces, o 10000 veces. Preferiblemente, CLDN18.2 se expresa en una célula si el nivel de expresión está por encima del límite de detección y/o si el nivel de expresión es suficientemente alto para permitir la unión por anticuerpos específicos de CLDN18.2 añadidos a las células. Preferiblemente, CLDN18.2 expresado en una célula se expresa o expone en la superficie de dicha célula.

De acuerdo con la enseñanza, el término "enfermedad" se refiere a cualquier estado patológico, incluido el cáncer, en particular aquellas formas de cáncer descritas en el presente documento. Cualquier referencia en el presente documento a cáncer o formas particulares de cáncer también incluye metástasis de cáncer de los mismos. En una realización preferida, una enfermedad a tratar de acuerdo con la presente solicitud implica células que expresan CLDN18.2.

"Enfermedades asociadas con células que expresan CLDN18.2" o expresiones similares significa de acuerdo con la enseñanza que CLDN18.2 se expresa en células de un tejido u órgano enfermo. En una realización, la expresión de CLDN18.2 en células de un tejido u órgano enfermo aumenta en comparación con el estado en un tejido u órgano sano. Por aumento se entiende un aumento de al menos un 10 %, en particular de al menos un 20 %, al menos un 50 %, al menos un 100 %, al menos un 200 %, al menos un 500 %, al menos un 1000 %, al menos un 10000 % o incluso más. En una realización, la expresión solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano correspondiente está reprimida. Por ejemplo, CLDN18.2 se expresa en tejido de cáncer de páncreas mientras que la expresión no es detectable en tejido de páncreas no canceroso. De acuerdo con la enseñanza, las enfermedades asociadas con células que expresan CLDN18.2 incluyen enfermedades cancerosas. Además, de acuerdo con la enseñanza, las enfermedades cancerosas son preferiblemente aquellas en las que las células cancerosas expresan CLDN18.2.

Como se usa en el presente documento, una "enfermedad cancerosa" o "cáncer" incluye una enfermedad caracterizada por un crecimiento, proliferación, diferenciación, adhesión y/o migración celular regulados de forma anómala. Por "célula cancerosa" se entiende una célula anormal que crece mediante una proliferación celular rápida e incontrolada y continúa creciendo después de que cesan los estímulos que iniciaron el nuevo crecimiento. Preferiblemente, una "enfermedad cancerosa" se caracteriza por células que expresan CLDN18.2 y una célula cancerosa que expresa CLDN18.2. Una célula que expresa CLDN18.2 preferiblemente es una célula cancerosa, preferiblemente de los cánceres descritos en el presente documento.

De acuerdo con la enseñanza, un "carcinoma" es un tumor maligno derivado de células epiteliales.

El "adenocarcinoma" es un cáncer que se origina en el tejido glandular. Este tejido también forma parte de una categoría de tejido más grande conocida como tejido epitelial. El tejido epitelial incluye piel, glándulas y una variedad de otros tejidos que recubren las cavidades y órganos del cuerpo. El epitelio se deriva embriológicamente del ectodermo, endodermo y mesodermo. Para clasificarse como adenocarcinoma, no es necesario que las células formen parte de una glándula, siempre que tengan propiedades secretoras. Esta forma de carcinoma puede ocurrir en algunos mamíferos superiores, incluidos los humanos. Los adenocarcinomas bien diferenciados tienden a parecerse al tejido glandular del que se derivan, mientras que los poco diferenciados pueden no hacerlo. Al teñir las células de una biopsia, un patólogo determinará si el tumor es un adenocarcinoma o algún otro tipo de cáncer. Los adenocarcinomas pueden surgir en muchos tejidos del cuerpo debido a la naturaleza ubicua de las glándulas dentro del cuerpo. Si bien es posible que cada glándula no secrete la misma sustancia, siempre que la célula tenga una función exocrina, se considera glandular y, por lo tanto, su forma maligna se denomina adenocarcinoma. Los adenocarcinomas malignos invaden otros tejidos y, a menudo, hacen metástasis si se les da el tiempo suficiente para hacerlo.

El páncreas, un órgano de derivación endodérmica, es el regulador clave de la digestión de proteínas y carbohidratos y de la homeostasis de la glucosa. El páncreas exocrino (80 % de la masa de tejido del órgano) está compuesto por una red ramificada de células acinares y de conductos que producen y distribuyen enzimas digestivas en el tracto gastrointestinal. Las células acinares, que se organizan en unidades funcionales a lo largo de la red de conductos, sintetizan y secretan enzimas en el lumen ductal en respuesta a señales del estómago y el duodeno. Dentro de las unidades acinares cerca de los conductos se encuentran las células centroacinares. El páncreas endocrino, que regula el metabolismo y la homeostasis de la glucosa a través de la secreción de hormonas en el torrente sanguíneo, está compuesto por cuatro tipos de células endocrinas especializadas reunidas en grupos llamados islotes de Langerhans.

El cáncer de páncreas es una neoplasia maligna que se origina a partir de células transformadas que surgen en los tejidos que forman el páncreas. El cáncer de páncreas es la cuarta causa más común de muerte relacionada con el cáncer en los Estados Unidos y la octava en todo el mundo. El cáncer de páncreas temprano a menudo no causa síntomas y los síntomas posteriores suelen ser inespecíficos y variados. Por lo tanto, el cáncer de páncreas a menudo no se diagnostica hasta que está avanzado. El cáncer de páncreas tiene un mal pronóstico: para todos los estadios combinados, las tasas de supervivencia relativas a 1 y 5 años son del 25 % y el 6 %, respectivamente. Para la enfermedad local, la supervivencia a 5 años es de aproximadamente el 20 %, mientras que la mediana de supervivencia para la enfermedad metastásica y localmente avanzada, que en conjunto representan más del 80 % de los individuos, es de aproximadamente 10 y 6 meses, respectivamente.

El cáncer de páncreas incluye adenocarcinomas (tumores que exhiben una arquitectura glandular) que surgen dentro del componente exocrino del páncreas y carcinomas neuroendocrinos que surgen de las células de los islotes.

La forma más común de cáncer de páncreas, adenocarcinoma ductal, se caracteriza típicamente por estructuras glandulares moderadamente diferenciadas en el examen microscópico. El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) comúnmente surge en la cabeza del páncreas con infiltración en los tejidos circundantes, incluidos los linfáticos, el bazo y la cavidad peritoneal, y con metástasis en el hígado y los pulmones. PDAC exhibe principalmente un patrón glandular con estructuras similares a conductos y diversos grados de atipia y diferenciación celular. Los subtipos menos comunes de PDAC incluyen histología coloide, adenoescamosa o sarcomatoide. A menudo, dentro de un tumor individual, existen diferencias regionales en la histología, el grado del tumor y el grado de diferenciación. Incluso las lesiones primarias más pequeñas suelen presentar invasión perineural y linfovascular, lo que sugiere una propensión a la diseminación temprana a distancia.

El segundo tipo más común de cáncer de páncreas exocrino es el mucinoso. El adenocarcinoma mucinoso produce un gran volumen de mucina que da como resultado una apariencia quística en los estudios de imágenes.

Los tumores neuroendocrinos pancreáticos se forman en las células productoras de hormonas (células de los islotes) del páncreas. Las neoplasias de células acinares surgen de las células acinares del páncreas.

De acuerdo con la enseñanza, el término "cáncer" también incluye metástasis de cáncer de un tumor primario tal como cáncer primario de páncreas. Así, si se hace referencia, por ejemplo, al cáncer de páncreas, esto también incluye la metástasis del cáncer de páncreas, por ejemplo, la metástasis en el pulmón, el hígado y/o los ganglios linfáticos.

Por "metástasis" se entiende la propagación de células cancerosas desde su sitio original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende del desprendimiento de células malignas del tumor primario, la invasión de la matriz extracelular, la penetración de las membranas basales endoteliales para ingresar a la cavidad corporal y los vasos, y luego, después de ser transportado por la sangre, infiltración de órganos diana. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor en el sitio diana depende de la angiogénesis. La metástasis tumoral a menudo se produce incluso después de la extirpación del tumor primario porque las células o los componentes tumorales pueden permanecer y desarrollar un potencial metastásico. En una realización, el término "metástasis" de acuerdo con la enseñanza se refiere a "metástasis a distancia" que se refiere a una metástasis que está alejada del tumor primario y del sistema de ganglios linfáticos regionales. En una realización, el término "metástasis" de acuerdo con la enseñanza se refiere a la metástasis en los ganglios linfáticos. Una forma particular de metástasis que es tratable usando la terapia de la enseñanza es la metástasis que se origina en el cáncer de páncreas como sitio primario. En realizaciones preferidas, dicha metástasis de cáncer de páncreas es metástasis en ganglios linfáticos, metástasis en pulmón y/o metástasis en hígado.

El tumor de Krukenberg es un tumor metastásico poco común del ovario que representa del 1 % al 2 % de todos los tumores de ovario. El tumor de Krukenberg es un adenocarcinoma metastásico de células en anillo de sello del ovario. El estómago es el sitio primario en la mayoría de los casos de tumor de Krukenberg (70 %). Los carcinomas de colon, apéndice y mama (principalmente carcinoma lobular invasivo) son los siguientes sitios primarios más comunes. Se han notificado casos raros de tumor de Krukenberg originados en carcinomas de la vesícula biliar, las vías biliares, el páncreas, el intestino delgado, la ampolla de Vater, el cuello uterino y la vejiga urinaria/uraco.

Un cáncer refractario es una neoplasia maligna para la cual un tratamiento particular es ineficaz, que inicialmente no responde al tratamiento o que deja de responder con el tiempo.

Por "tratar" se entiende administrar un compuesto o composición o una combinación de compuestos o composiciones a un sujeto para prevenir o eliminar una enfermedad, incluida la reducción del tamaño de un tumor o el número de tumores en un sujeto; detener o retrasar una enfermedad en un sujeto; inhibir o retardar el desarrollo de una nueva enfermedad en un sujeto; disminuir la frecuencia o severidad de los síntomas y/o recurrencias en un sujeto que actualmente tiene o que ha tenido previamente una enfermedad; y/o prolongar, es decir, aumentar la vida útil del sujeto.

En particular, el término "tratamiento de una enfermedad" incluye curar, acortar la duración, mejorar, prevenir, ralentizar o inhibir la progresión o el empeoramiento, o prevenir o retrasar la aparición de una enfermedad o sus síntomas.

El término "paciente" significa, de acuerdo con la enseñanza, un sujeto a tratar, en particular un sujeto enfermo, incluidos seres humanos, primates no humanos u otros animales, en particular mamíferos tales como vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores tales como ratones y ratas. En una realización particularmente preferida, un paciente es un ser humano.

El término "agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2" se refiere a un agente o una combinación de agentes cuya provisión a las células da como resultado un aumento de los niveles de ARN y/o proteína de CLDN18.2 en dichas células, preferiblemente un aumento de los niveles de proteína CLDN18.2 en la superficie celular, en comparación con la situación en la que las células no reciben el agente o la combinación de agentes. Preferiblemente, las células son células cancerosas, en particular células cancerosas que expresan CLDN18.2 y, por lo tanto, son una diana para anticuerpos que se unen a CLDN18.2, tales como células de los tipos de cáncer descritos en el presente documento, en particular cáncer de páncreas. El término "agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2" se refiere, en particular, a un agente o una combinación de agentes cuya provisión a las células da como resultado una mayor densidad de CLDN18.2 en la superficie de dichas células en comparación con la situación en la que las células no están provistas del agente o la combinación de agentes. "Estabilizar la expresión de CLDN18.2" incluye, en particular, la situación en la que el agente o la combinación de agentes evita una disminución o reduce una disminución en la expresión de CLDN18.2, por ejemplo, la expresión de CLDN18.2 disminuiría sin la provisión del agente o la combinación de agentes y la provisión del agente o la combinación de agentes evita dicha disminución o reduce dicha disminución de la expresión de CLDN18.2. "Expresión creciente de CLDN18.2" incluye, en particular, la situación en la que el agente o la combinación de agentes aumenta la expresión de CLDN18.2, por ejemplo, la expresión de CLDN18.2 disminuiría, permanecería esencialmente constante o aumentaría sin la provisión del agente o la combinación de agentes y la provisión del agente o la combinación de agentes aumenta la expresión de CLDN18.2 en comparación con la situación sin la provisión del agente o la combinación de agentes de modo que la expresión resultante sea mayor en comparación con la situación en la que la expresión de CLDN18.2 disminuiría, permanecería esencialmente constante o aumentaría sin la provisión del agente o la combinación de agentes.

De acuerdo con la enseñanza, el término "agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2" incluye agentes quimioterapéuticos o combinaciones de agentes quimioterapéuticos tales como agentes citostáticos. Los agentes quimioterapéuticos pueden afectar las células de una de las siguientes maneras: (1) dañar el ADN de las células para que ya no puedan reproducirse, (2) inhibir la síntesis de nuevas cadenas de ADN para que no sea posible la replicación celular, (3) detener los procesos mitóticos de las células para que las células no puedan dividirse en dos células.

De acuerdo con la enseñanza, el término "agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2" se refiere preferiblemente a un agente o una combinación de agentes tales como un compuesto citostático o una combinación de compuestos citostáticos cuya provisión para las células, en particular las células cancerosas, da como resultado que las células se detengan o se acumulen en una o más fases del ciclo celular, preferiblemente en una o más fases del ciclo celular distintas de las fases G1 y GO, preferiblemente distintas de la fase G1, preferiblemente en una o más de la fase G2 o S del ciclo celular tal como la fase G1/G2, S/G2, G2 o S del ciclo celular. El término "células que se detienen o se acumulan en una o más fases del ciclo celular" significa que aumenta el porcentaje de células que se encuentran en dicha una o más fases del ciclo celular. Cada célula pasa por un ciclo que comprende cuatro fases para replicarse. La primera fase llamada G1 es cuando la célula se prepara para replicar sus cromosomas. La segunda etapa se llama S, y en esta fase ocurre la síntesis de ADN y el ADN se duplica. La siguiente fase es la fase G2, cuando el ARN y la proteína se duplican. La etapa final es la etapa M, que es la etapa de la división celular real. En esta etapa final, el ADN y el ARN duplicados se dividen y se mueven a extremos separados de la célula, y la célula en realidad se divide en dos células funcionales idénticas. Los agentes quimioterapéuticos que son agentes que dañan el ADN normalmente dan como resultado una acumulación de células en la fase G1 y/o G2. Los agentes quimioterapéuticos que bloquean el crecimiento celular al interferir con la síntesis de ADN, tal como los antimetabolitos, generalmente dan como resultado una acumulación de células en la fase S. Ejemplos de estos fármacos son gemcitabina, 6-mercaptopurina y 5-fluorouracilo.

De acuerdo con la enseñanza, el término "agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2" incluye análogos de nucleósidos tales como gemcitabina, 5-fluorouracilo o profármacos de los mismos, compuestos de platino tales como oxaliplatino y cisplatino, taxanos tales como paclitaxel y docetaxel y análogos de camptotecina tales como irinotecano y topotecano, y combinaciones de fármacos tales como combinaciones de fármacos que comprenden uno o más de gemcitabina, oxaliplatino y 5-fluorouracilo tales como una combinación de fármacos que comprenden gemcitabina y oxaliplatino, gemcitabina y 5-fluorouracilo, oxaliplatino y 5-fluorouracilo u otras combinaciones de fármacos descritas en el presente documento. De acuerdo con la enseñanza, una referencia a un agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2, tal como una referencia a un análogo de nucleósido, un compuesto de platino, un análogo de camptotecina o un taxano, por ejemplo, una referencia a gemcitabina, 5-fluorouracilo, oxaliplatino, irinotecano o paclitaxel debe incluir cualquier profármaco tal como éster, sal o derivado tal como un conjugado de dicho agente. Los ejemplos son conjugados de dicho agente con una sustancia portadora, por ejemplo, paclitaxel unido a proteína tal como paclitaxel unido a albúmina. Preferiblemente, las sales de dicho agente son farmacéuticamente aceptables.

En una realización preferida, un "agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2" es o comprende un "agente que induce la muerte celular inmunogénica".

En circunstancias específicas, las células cancerosas pueden entrar en una vía de estrés letal vinculada a la emisión de una combinación de señales definida espaciotemporalmente que es decodificada por el sistema inmunitario para activar respuestas inmunitarias específicas del tumor (Zitvogel L. et al., (2010) Cell 140: 798-804). En tal escenario, las células cancerosas se activan para emitir señales que son detectadas por efectores inmunitarios innatos, tal como las células dendríticas, para desencadenar una respuesta inmunitaria afín que involucra a las células T CD8+ y la señalización de IFN-y para que la muerte de las células tumorales pueda provocar una respuesta inmunitaria anticancerígena productiva. Estas señales incluyen la exposición preapoptótica del chaperón calreticulina (CRT) del retículo endoplásmico (ER) en la superficie celular, la secreción preapoptótica de ATP y la liberación postapoptótica de la proteína nuclear HMGB1. Juntos, estos procesos constituyen los determinantes moleculares de la muerte celular inmunogénica (ICD). Las antraciclinas, el oxaliplatino y la irradiación ^yson capaces de inducir todas las señales que definen el ICD, mientras que el cisplatino, por ejemplo, que es deficiente para inducir la translocación de CRT desde el ER a la superficie de las células moribundas - un proceso que requiere estrés del ER - requiere complementación con Thapsigargina, un inductor de estrés del ER.

De acuerdo con la enseñanza, el término "agente que induce la muerte celular inmunogénica" se refiere a un agente o una combinación de agentes que, cuando se administra a las células, en particular a las células cancerosas, es capaz de inducir a las células a entrar en una ruta de estrés letal que finalmente da como resultado respuestas inmunitarias específicas de tumores. En particular, un agente que induce la muerte celular inmunogénica cuando se administra a las células induce a las células a emitir una combinación de señales definida espaciotemporalmente, incluida, en particular, la exposición preapoptótica del chaperón calreticulina (CRT) del retículo endoplásmico (ER) en la superficie de la célula, la secreción preapoptótica de ATP y la liberación postapoptótica de la proteína nuclear HMGB1.

De acuerdo con la enseñanza, el término "agente que induce la muerte celular inmunogénica" incluye antraciclinas y oxaliplatino.

El término "análogo de nucleósido" se refiere a un análogo estructural de un nucleósido, una categoría que incluye tanto análogos de purina como análogos de pirimidina.

El término "gemcitabina" es un compuesto que es un análogo de nucleósido de la siguiente fórmula:

En particular, el término se refiere al compuesto 4-amino-1-(2-desoxi-2,2-difluoro-p-D-eritropentofuranosil)pirimidin-2(lH)-ona o 4-amino-1-[(2R,4R,5R)-3,3-difluoro-4-hidroxi-5-(hidroximetil)oxolan-2-il]-1,2-dihidropirimidin-2-ona.

De acuerdo con la enseñanza, la gemcitabina se administra preferiblemente por vía intravenosa. Preferiblemente, la gemcitabina se administra en intervalos de dosis de 0.5 a 2 g/m2, preferiblemente de 0.8 a 1.5 g/m2, más preferiblemente de 1 a 1.2 g/m2 de superficie corporal. Por ejemplo, la gemcitabina se puede administrar a una dosis de 1000 mg por metro cuadrado semanalmente durante 7 de 8 semanas y luego semanalmente durante 3 de 4 semanas.

El término "análogo de nucleósido" incluye derivados de fluoropirimidina tales como fluorouracilo y profármacos de los mismos. El término "fluorouracilo" o "5-fluorouracilo" (5-FU o f5U) (vendido bajo las marcas Adrucil, Carac, Efudix, Efudex y Fluoroplex) es un compuesto que es un análogo de pirimidina de la siguiente fórmula:

En particular, el término se refiere al compuesto 5-fluoro-1H-pirimidin-2,4-diona.

El término "capecitabina" (Xeloda, Roche) se refiere a un agente quimioterapéutico que es un profármaco que se convierte en 5-FU en los tejidos. La capecitabina, que puede administrarse por vía oral, tiene la siguiente fórmula:

En particular, el término se refiere al compuesto [1-(3,4-dihidroxi-5-metiltetrahidrofuran-2-il)-5-fluoro-2-oxo-1H-pirimidin-4-il] carbamato de pentilo.

De acuerdo con la enseñanza, el término "compuesto de platino" se refiere a compuestos que contienen platino en su estructura tales como complejos de platino e incluye compuestos tales como cisplatino, carboplatino y oxaliplatino.

El término "cisplatino" se refiere al compuesto c/'s-diaminodidoroplatino(N) (CDDP) de la fórmula siguiente:

a " „ n * * NH‘

CK ^NH,

El término "carboplatino" se refiere al compuesto cis-diamino(1,1-cidobutanodicarboxilato)platino(N) de la siguiente fórmula:

El término "oxaliplatino" se refiere a un compuesto que es un compuesto de platino que forma un complejo con un ligando portador de diaminociclohexano de la siguiente fórmula:

En particular, el término "oxaliplatino" se refiere al compuesto [(1R,2R)-ciclohexano-1,2-diamina](etanodioato-O,O')platino(II). El oxaliplatino para inyección también se comercializa con el nombre comercial Eloxatina.

Los taxanos son una clase de compuestos diterpénicos que primero se derivaron de fuentes naturales como las plantas del género Taxus, pero algunos se han sintetizado artificialmente. El principal mecanismo de acción de la clase de fármacos taxanos es la interrupción de la función de los microtúbulos, lo que inhibe el proceso de división celular. Los taxanos incluyen docetaxel (Taxotere) y paclitaxel (Taxol).

De acuerdo con la enseñanza, el término "docetaxel" se refiere a un compuesto que tiene la siguiente fórmula:

En particular, el término "docetaxel" se refiere al compuesto 13-{(2R,3S)-3-[(tert-butoxicarbonil)-amino]-2-hidroxi-3-fenilpropanoato} de 4-acetato 2-benzoato de 1,7p,10p-trihidroxi-9-oxo-5p,20-epoxitax-11-ene-2a,4,13a-triilo.

De acuerdo con la enseñanza, el término "paclitaxel" se refiere a un compuesto que tiene la siguiente fórmula:

En particular, el término "paclitaxel" se refiere al compuesto (2a,4a,5p,7p,10p,13a)-4,10-bis-(acetiloxi)-13-{[(2R,3S)-3-(benzoilamino)-2-hidroxi-3-fenilpropanoil]oxi}-1,7-dihidroxi-9-oxo-5,20-epoxitax-11 -en-2-il benzoato.

De acuerdo con la enseñanza, el término "análogo de camptotecina" se refiere a los derivados del compuesto camptotecina (CPT; (S)-4-etil-4-hidroxi-1H-pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-3,14-(4H,12H)-diona). Preferible mente, el término "análogo de camptotecina" se refiere a compuestos que comprenden la siguiente estructura:

De acuerdo con la enseñanza, los análogos de camptotecina preferidos son inhibidores de la enzima topoisomerasa I (topo I) del ADN. Los análogos de camptotecina preferidos de acuerdo con las enseñanzas son irinotecano y topotecano.

El irinotecano es un fármaco que impide que el ADN se desenrolle mediante la inhibición de la topoisomerasa I. En términos químicos, es un análogo semisintético del alcaloide natural camptotecina que tiene la siguiente fórmula:

En particular, el término "irinotecano" se refiere al compuesto (S)-4,11 -dietil-3,4,12,14-tetrahidro-4-hidroxi-3,14-dioxo1H-pirano[3',4': 6,7]-indolizino[1,2-b]quinolin-9-il-[1,4'-bipiperidina]-1'-carboxilato.

El topotecano es un inhibidor de la topoisomerasa de fórmula:

En particular, el término "topotecano" se refiere al compuesto monoclorhidrato de (S)-10-[(dimetilamino)metil]-4-etil-4,9-dihidroxi-1H-pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-3,14(4H,12H)-diona.

Las antraciclinas son una clase de fármacos comúnmente utilizados en la quimioterapia del cáncer que también son antibióticos. Estructuralmente, todas las antraciclinas comparten una estructura común de 7,8,9,10-tetra hidrotetraceno-5,12-quinona de cuatro anillos y generalmente requieren glicosilación en sitios específicos.

Las antraciclinas provocan preferiblemente uno o más de los siguientes mecanismos de acción: 1. Inhibir la síntesis de ADN y ARN mediante la intercalación entre los pares de bases de la cadena de ADN/ARN, evitando así la replicación de las células cancerosas de rápido crecimiento. 2. Inhibir la enzima topoisomerasa II, previniendo la relajación del ADN superenrollado y bloqueando así la transcripción y replicación del ADN. 3. Crear radicales libres de oxígeno mediados por hierro que dañan el ADN y las membranas celulares.

De acuerdo con la enseñanza, el término "antraciclina" se refiere preferiblemente a un agente, preferiblemente un agente anticanceroso para inducir la apoptosis, preferiblemente mediante la inhibición de la nueva unión del ADN en la topoisomerasa II.

Preferiblemente, de acuerdo con la enseñanza, el término "antraciclina" generalmente se refiere a una clase de compuestos que tienen la siguiente estructura de anillo

incluyendo análogos y derivados, sales farmacéuticas, hidratos, ésteres, conjugados y profármacos de los mismos. Los ejemplos de antraciclinas y análogos de antraciclina incluyen, entre otros, daunorrubicina (daunomicina), doxorrubicina (adriamicina), epirrubicina, idarrubicina, rodomicina, pirarrubicina, valrubicina, doxorrubicina-14-valerato de N-trifluoro acetilo, aclacinomicina, morfolinodoxorrubicina (morfolino-DOX), cianomorfolino-doxorrubicina (cianomorfolino-DOX), 2-pirrolino-doxorrubicina (2-PDOX), 5-iminodaunomicina, mitoxantrona y aclacinomicina A (aclarrubicina). La mitoxantrona es un miembro de la clase de compuestos de antracendiona, que son análogos de antraciclina que carecen de la fracción de azúcar de las antraciclinas, pero conservan la estructura de anillo aromático policíclico plano que permite la intercalación en el ADN.

Particularmente preferido como antraciclina de acuerdo con la enseñanza es un compuesto de la siguiente fórmula:

donde

R1 se selecciona del grupo que consiste en H y OH, R2 se selecciona del grupo que consiste en H y OMe, R3 se selecciona del grupo que consiste en H y OH, y R4 se selecciona del grupo que consiste en H y OH.

En una realización, R1 es H, R2 es OMe, R3 es H, y R4 es OH. En otra realización, R1 es OH, R2 es OMe, R3 es H, y R4 es OH. En otra realización, Ri es OH, R2 es OMe, R3 es OH, y R4 es H. En otra realización, Ri es H, R2 es H, R3 es H, y R4 es OH.

La epirrubicina se contempla específicamente como antraciclina en el contexto de la presente enseñanza. La epirrubicina es un fármaco de antraciclina que tiene la siguiente fórmula:

y se comercializa bajo el nombre comercial Ellence en los Estados Unidos y Farmorrubicina o Epirrubicina Ebewe en otros lugares. En particular, el término "epirrubicina" se refiere al compuesto (8R,10S)-10-[(2S,4S,5R,6S)-4-amino-5-hidroxi-6-metil-oxan-2-il]oxi-6,11-dihidroxi-8-(2-hidroxiacetil)-1-metoxi-8-metil-9,10-dihidro-7H-tetracen-5,12-diona. La epirrubicina se prefiere a la doxorrubicina, la antraciclina más popular, en algunos regímenes de quimioterapia, ya que parece causar menos efectos secundarios.

De acuerdo con la enseñanza, un agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2 puede ser un agente quimioterapéutico, en particular un agente quimioterapéutico establecido en el tratamiento del cáncer y puede ser parte de una combinación de fármacos tal como una combinación de fármacos establecidos para su uso en el tratamiento de cáncer. Tal combinación de fármacos puede ser una combinación de fármacos utilizada en quimioterapia y puede ser una combinación de fármacos como se usa en el régimen quimioterapéutico de FOLFIRINOX.

La combinación de fármacos utilizada en la quimioterapia con FOLFIRINOX comprende leucovorina, fluorouracilo, irinotecano (como el clorhidrato de irinotecano) y oxaliplatino. El oxaliplatino puede administrarse a razón de 85 mg por metro cuadrado de superficie corporal; irinotecano a razón de 180 mg por metro cuadrado; leucovorina a razón de 400 mg por metro cuadrado; y fluorouracilo a razón de 400 mg por metro cuadrado administrado como bolo seguido de 5-fluorouracilo a razón de 2400 mg por metro cuadrado administrado como una infusión continua de preferiblemente 46 horas, preferiblemente cada 2 semanas).

El término "ácido folínico" o "leucovorina" se refiere a un compuesto útil en combinación sinérgica con el agente de quimioterapia 5-fluorouracilo. Por lo tanto, si en el presente documento se hace referencia a la administración de 5-fluorouracilo o un profármaco del mismo, dicha administración en una realización puede comprender una administración junto con ácido folínico. El ácido folínico tiene la siguiente fórmula:

En particular, el término se refiere al compuesto ácido (2S)-2-{[4-[(2-amino-5-formil-4-oxo-5,6,7,8-tetrahidro-1H-pteridin-6-il)metilamino]benzoil]amino}pentanodioico.

Las células T ^y8 (células T gamma delta) representan un pequeño subconjunto de células T que poseen un receptor de células T distinto (TCR) en su superficie. La mayoría de las células T tienen un TCR compuesto por dos cadenas de glicoproteínas denominadas cadenas del TCR a y p. Por el contrario, en las células T y8, el TCR se compone de una cadena y y una cadena 8. Este grupo de células T suele ser mucho menos común que las células T ap. Las células T ^y8 humanas desempeñan un papel importante en las respuestas de vigilancia del estrés, como las enfermedades infecciosas y la autoinmunidad. También se sugiere que los cambios inducidos por la transformación en los tumores provocan respuestas de vigilancia del estrés mediadas por células T y8 y mejoran la inmunidad antitumoral. Es importante destacar que, después de la interacción con el antígeno, las células T y8 activadas en los sitios lesionados proporcionan citoquinas (por ejemplo, INFy, TNFa) y/o quimioquinas que median en el reclutamiento de otras células efectoras y muestran funciones efectoras inmediatas tales como citotoxicidad (a través del receptor de muerte y vías de gránulos citolíticos) y ADCC.

La mayoría de las células T ^y8 en sangre periférica expresan el receptor de células T V^y9V82 (TCR^y8). Las células T V^y9V82 son exclusivas de los humanos y los primates y se supone que desempeñan un papel temprano y esencial en la detección del "peligro" por los patógenos invasores, ya que se expanden drásticamente en muchas infecciones agudas y pueden superar a todos los demás linfocitos en unos pocos días, por ejemplo, en tuberculosis, salmonelosis, ehrlichiosis, brucelosis, tularemia, listeriosis, toxoplasmosis y malaria.

Las células T ^y8 responden a pequeños antígenos fosforilados no peptídicos (fosfoantígenos), tales como los pirofosfatos sintetizados en bacterias y el pirofosfato de isopentenilo (IPP) producido en células de mamíferos a través de la vía del mevalonato. Mientras que la producción de IPP en las células normales no es suficiente para la activación de las células T ^y8, la desregulación de la vía del mevalonato en las células tumorales conduce a la acumulación de IPP y la activación de las células T ^y8. Los IPP también pueden incrementarse terapéuticamente con aminobifosfonatos, que inhiben la enzima farnesil pirofosfato sintasa (FPPS) de la vía del mevalonato. Entre otros, el ácido zoledrónico (ZA, zoledronato, ZometaMC, Novartis) representa un aminobifosfonato de este tipo, que ya se administra clínicamente a pacientes para el tratamiento de la osteoporosis y la enfermedad ósea metastásica. Tras el tratamiento de las PBMC in vitro, ZA es captado especialmente por los monocitos. IPP se acumula en los monocitos y se diferencian a células presentadoras de antígenos estimulando el desarrollo de células T y8. En este contexto, se prefiere la adición de interleucina-2 (IL-2) como factor de crecimiento y supervivencia para las células T ^y8 activadas. Finalmente, se ha descrito que ciertas aminas alquiladas activan las células T Vy9V82 in vitro, sin embargo, solo en concentraciones milimolares.

De acuerdo con la enseñanza, el término "agente estimulante de las células T y8" se refiere a compuestos que estimulan el desarrollo de las células T ^y8, en particular las células T V^y9V82, in vitro y/o in vivo, en particular mediante la inducción de la activación y expansión de las células T y8. Preferiblemente, el término se refiere a compuestos que in vitro y/o in vivo aumentan el pirofosfato de isopentenilo (IPP) producido en células de mamífero, preferiblemente mediante la inhibición de la enzima farnesil pirofosfato sintasa (FPPS) de la ruta del mevalonato.

Un grupo particular de compuestos que estimulan las células T y8 son los bisfosfonatos, en particular los bisfosfonatos que contienen nitrógeno (N-bisfosfonatos; aminobisfosfonatos).

Por ejemplo, los bisfosfonatos adecuados para usar en la enseñanza pueden incluir uno o más de los siguientes compuestos, incluidos análogos y derivados, sales farmacéuticas, hidratos, ésteres, conjugados y profármacos de los mismos:

[1-hidroxi-2-(1H-imidazol-1-il)etano-1,1-diil]bis(ácido fosfónico), ácido zoledrónico, por ejemplo, zoledronato; ácido (dicloro-fosfono-metil)fosfónico, por ejemplo, clodronato;

{1-hidroxi-3-[metil(pentil)amino]propano-1,1-diil}bis(ácido fosfónico), ácido ibandrónico, por ejemplo, ibandronato; (3-amino-1-hidroxipropano-1,1-diil)bis (ácido fosfónico), ácido pamidrónico, por ejemplo, pamidronato;

ácido (1 -hidroxi-1 -fosfono-2-piridin-3-il-etil)fosfónico, ácido risedrónico, por ejemplo, risedronato;

ácido (l-hidroxi-2-imidazo[1,2-a]piridin-3-il-1-fosfonoetil)fosfónico, ácido minodrónico;

[3-(dimetilamino)-1-hidroxipropano-1,1-diil]bis(ácido fosfónico), ácido olpadrónico;

ácido [4-amino-1-hidroxi-1-(hidroxi-oxido-fosforil)-butil]fosfónico, ácido alendrónico, por ejemplo, alendronato;

[(cicloheptilamino)metileno]bis(ácido fosfónico), ácido incadrónico;

(l-hidroxietan-1,1-diil)bis(ácido fosfónico), ácido etidrónico, por ejemplo, etidronato; y

{[(4-clorofenil)tio]metileno}bis(ácido fosfónico), ácido tiludrónico.

De acuerdo con la enseñanza, el ácido zoledrónico (INN) o zoledronato (comercializado por Novartis con los nombres comerciales Zometa, Zomera, Aclasta y Reclast) es un bisfosfonato particularmente preferido. Zometa se utiliza para prevenir fracturas esqueléticas en pacientes con cánceres como el mieloma múltiple y el cáncer de próstata, así como para tratar la osteoporosis. También se puede usar para tratar la hipercalcemia de tumores malignos y puede ser útil para tratar el dolor de las metástasis óseas.

En una realización particularmente preferida, un agente que estimula las células T y§ de acuerdo con la enseñanza se administra en combinación con IL-2. Se ha demostrado que dicha combinación es particularmente eficaz para mediar en la expansión y activación de las células T y982.

La interleucina-2 (IL-2) es una interleucina, un tipo de molécula de señalización de citocinas en el sistema inmunitario. Es una proteína que atrae a los linfocitos y es parte de la respuesta natural del cuerpo a la infección microbiana, y en la discriminación entre lo extraño (no propio) y lo propio. La IL-2 media sus efectos uniéndose a los receptores de IL-2, que son expresados por los linfocitos.

La IL-2 usada de acuerdo con la enseñanza puede ser cualquier IL-2 que soporte o permita la estimulación de células T y6 y puede derivarse de cualquier especie, preferiblemente humana. La IL-2 puede ser IL-2 aislada, producida de forma recombinante o sintética y puede ser IL-2 de origen natural o modificada.

El término "antígeno" se refiere a un agente tal como una proteína o un péptido que comprende un epítopo contra el que se dirige y/o se va a dirigir una respuesta inmunitaria. En una realización preferida, un antígeno es un antígeno asociado a un tumor, tal como CLDN18.2, es decir, un componente de las células cancerosas que puede derivarse del citoplasma, la superficie celular y el núcleo celular, en particular aquellos antígenos que se producen, preferiblemente en grandes cantidades, intracelulares o como antígenos de superficie en células cancerosas.

En el contexto de la presente enseñanza, el término "antígeno asociado a tumor" se refiere preferiblemente a proteínas que, en condiciones normales, se expresan específicamente en un número limitado de tejidos y/u órganos o en etapas de desarrollo específicas y se expresan o se expresan de manera aberrante en uno o más tejidos tumorales o cancerosos. En el contexto de la presente enseñanza, el antígeno asociado a un tumor se asocia preferiblemente con la superficie celular de una célula cancerosa y preferiblemente no se expresa o se expresa raramente en tejidos normales.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico en una molécula, es decir, a la parte de una molécula que es reconocida por el sistema inmunitario, por ejemplo, que es reconocida por un anticuerpo. Por ejemplo, los epítopos son los sitios tridimensionales discretos en un antígeno, que son reconocidos por el sistema inmunitario. Los epítopos suelen consistir en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión a los primeros, pero no a los últimos se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. Un epítopo de una proteína tal como CLDN18.2 comprende preferiblemente una porción continua o discontinua de dicha proteína y tiene preferiblemente entre 5 y 100, preferiblemente entre 5 y 50, más preferiblemente entre 8 y 30, lo más preferiblemente entre 10 y 25 aminoácidos en longitud, por ejemplo, el epítopo puede tener preferiblemente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos de longitud.

El término "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, e incluye cualquier molécula que comprende una porción de unión a antígeno de la misma. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales y fragmentos o derivados de anticuerpos, incluidos, entre otros, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, por ejemplo, fragmentos de scFv y anticuerpos de unión a antígeno tales como fragmentos Fab y Fab' y también incluye todas las formas recombinantes de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos expresados en procariotas, anticuerpos no glicosilados y cualquier fragmento y derivado de anticuerpo de unión a antígeno como se describe en este documento. Cada cadena pesada se compone de una región variable de cadena pesada (abreviada en este documento como VH) y una región constante de cadena pesada. Cada cadena ligera se compone de una región variable de cadena ligera (abreviada en este documento como VL) y una región constante de cadena ligera. Las regiones VH y VL se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (^cD^r), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestos desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, incluidas varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico.

Los anticuerpos descritos en este documento pueden ser anticuerpos humanos. El término "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos descritos en este documento pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o por mutación somática in vivo).

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula que tiene un sitio de unión al antígeno que se deriva sustancialmente de una inmunoglobulina de una especie no humana, donde la estructura restante de la inmunoglobulina de la molécula se basa en la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión al antígeno puede comprender dominios variables completos fusionados en dominios constantes o solo las regiones determinantes de complementariedad (CDR) injertadas en regiones marco apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión al antígeno pueden ser de tipo silvestre o modificados por una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, modificados para parecerse más a las inmunoglobulinas humanas. Algunas formas de anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias de CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que contiene las seis CDR del anticuerpo de ratón). Otras formas tienen una o más CDR que están alteradas con respecto al anticuerpo original.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a aquellos anticuerpos en los que una porción de cada una de las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera es homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie en particular o que pertenecen a una clase en particular, mientras que el segmento restante de la cadena es homólogo a las secuencias correspondientes en otra. Normalmente, la región variable de las cadenas ligera y pesada imita las regiones variables de los anticuerpos derivados de una especie de mamíferos, mientras que las porciones constantes son homólogas a las secuencias de los anticuerpos derivados de otras. Una clara ventaja de tales formas quiméricas es que la región variable puede derivarse convenientemente de fuentes actualmente conocidas usando células B fácilmente disponibles o hibridomas de organismos huéspedes no humanos en combinación con regiones constantes derivadas de, por ejemplo, preparaciones de células humanas. Si bien la región variable tiene la ventaja de la facilidad de preparación y la especificidad no se ve afectada por la fuente, la región constante, que es humana, tiene menos probabilidades de provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto humano cuando se inyectan los anticuerpos que la región constante de una fuente no humana. Sin embargo, la definición no se limita a este ejemplo particular.

Los términos "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de unión") o "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "fragmento de unión") o términos similares se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión incluidos en el término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes que consisten en los dominios VL, VH, CL y CH; (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) fragmentos Fd que consisten en los dominios VH y CH; (iv) fragmentos Fv que consisten en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) fragmentos dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consisten en un dominio VH; (vi) regiones determinantes de complementariedad (CDR) aisladas, y (vii) combinaciones de dos o más CDR aisladas que pueden unirse opcionalmente mediante un enlazador sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse mediante métodos recombinantes mediante un enlazador sintético que les permite formar una única cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al., (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Dichos anticuerpos de cadena sencilla también pretenden estar incluidos en el término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo. Otro ejemplo son las proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión que comprenden (i) un polipéptido de dominio de unión que se fusiona con un polipéptido de región bisagra de inmunoglobulina, (ii) una región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada con la región bisagra y (iii) una región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada con la región constante CH2. El polipéptido del dominio de unión puede ser una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera. Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión se divulgan adicionalmente en los documentos US 2003/0118592 y US 2003/0133939. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se seleccionan para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

El término "molécula biespecífica" pretende incluir cualquier agente, por ejemplo, una proteína, un péptido o un complejo de proteína o péptido, que tiene dos especificidades de unión diferentes. Por ejemplo, la molécula puede unirse o interactuar con (a) un antígeno de superficie celular y (b) un receptor Fc en la superficie de una célula efectora. El término "molécula multiespecífica" o "molécula heteroespecífica" pretende incluir cualquier agente, por ejemplo, una proteína, péptido o complejo de proteína o péptido, que tiene más de dos especificidades de unión diferentes. Por ejemplo, la molécula puede unirse o interactuar con (a) un antígeno de superficie celular, (b) un receptor Fc en la superficie de una célula efectora y (c) al menos otro componente. Por consiguiente, la enseñanza incluye, pero no se limita a, moléculas biespecíficas, triespecíficas, tetraespecíficas y otras multiespecíficas que están dirigidas a CLDN18.2 y a otras dianas, tales como receptores Fc en células efectoras. El término "anticuerpos biespecíficos" también incluye diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes y biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena polipeptídica, pero utilizan un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, lo que obliga a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y la creación de dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, RJ, et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).

Un anticuerpo puede conjugarse con una fracción o agente terapéutico, tal como una citotoxina, un fármaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o un radioisótopo. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células y, en particular, células asesinas. Los ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos adecuados para formar conjugados de anticuerpos incluyen, entre otros, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). En una realización preferida, el agente terapéutico es un agente citotóxico o un agente radiotóxico. En otra realización, el agente terapéutico es un inmunosupresor. En otra realización más, el agente terapéutico es GM-CSF. En una realización preferida, el agente terapéutico es doxorrubicina, cisplatino, bleomicina, sulfato, carmustina, clorambucilo, ciclofosfamida o ricina A.

Los anticuerpos también se pueden conjugar con un radioisótopo, por ejemplo, yodo-131, itrio-90 o indio-111, para generar radiofármacos citotóxicos.

Los conjugados de anticuerpos de la enseñanza se pueden usar para modificar una respuesta biológica dada, y la fracción de fármaco no debe interpretarse como limitada a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la fracción de fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o un fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina diftérica; una proteína tal como factor de necrosis tumoral o interferón-y; o modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos ("GM-CSF"), factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF") u otros factores de crecimiento.

Las técnicas para conjugar dicha fracción terapéutica con anticuerpos son bien conocidas, véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds. ), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).

Como se usa en este documento, un anticuerpo se "deriva de" una secuencia de línea germinal particular si el anticuerpo se obtiene de un sistema al inmunizar un animal o al seleccionar una biblioteca de genes de inmunoglobulina, y donde el anticuerpo seleccionado es al menos el 90 %, más preferiblemente al menos 95 %, incluso más preferiblemente al menos 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico en secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal. Por lo general, un anticuerpo derivado de una secuencia de línea germinal particular mostrará no más de 10 diferencias de aminoácidos, más preferiblemente, no más de 5, o incluso más preferiblemente, no más de 4, 3, 2 o 1 diferencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal.

Como se usa en el presente documento, el término "heteroanticuerpos" se refiere a dos o más anticuerpos, derivados de los mismos o regiones de unión a antígeno unidas entre sí, al menos dos de los cuales tienen especificidades diferentes. Estas diferentes especificidades incluyen una especificidad de unión para un receptor Fc en una célula efectora y una especificidad de unión para un antígeno o epítopo en una célula diana, por ejemplo, una célula tumoral.

Los anticuerpos descritos en este documento pueden ser anticuerpos monoclonales. El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Un anticuerpo monoclonal muestra una sola especificidad y afinidad de unión. En una realización, los anticuerpos monoclonales son producidos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano, por ejemplo, un ratón, fusionada con una célula inmortalizada.

Los anticuerpos descritos en este documento pueden ser anticuerpos recombinantes. El término "anticuerpo recombinante", como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico con respecto a los genes de inmunoglobulina o un hibridoma preparado a partir de los mismos, (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos combinatorios recombinantes, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina con otras secuencias de ADN.

Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden derivarse de diferentes especies, incluidas, entre otras, ratón, rata, conejo, conejillo de indias y humanos.

Los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales e incluyen anticuerpos IgA tales como IgA1 o IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM e IgD. En varias realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, más particularmente un isotipo IgG1, kappa o IgG1, lambda (es decir, IgG1, k, A), un anticuerpo IgG2a (por ejemplo, IgG2a, k, A), un anticuerpo IgG2b (por ejemplo, IgG2b, k, A), un anticuerpo IgG3 (por ejemplo, IgG3, k, A) o un anticuerpo IgG4 (por ejemplo, IgG4, k, A).

El término "transfectoma", como se usa en este documento, incluye células huésped eucariotas recombinantes que expresan un anticuerpo, tales como células CHO, células NS/0, células HEK293, células HEK293T, células vegetales u hongos, incluidas células de levadura.

Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo heterólogo" se define en relación con un organismo transgénico que produce tal anticuerpo. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico codificante correspondiente a la que se encuentra en un organismo que no consiste en el organismo transgénico y que generalmente se deriva de una especie distinta del organismo transgénico.

Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo heterohíbrido" se refiere a un anticuerpo que tiene cadenas ligeras y pesadas de diferentes orígenes orgánicos. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una cadena pesada humana asociada con una cadena ligera murina es un anticuerpo heterohíbrido.

La enseñanza incluye todos los anticuerpos y derivados de anticuerpos como se describe en el presente documento que, para los fines de la enseñanza, están abarcados por el término "anticuerpo". El término "derivados de anticuerpos" se refiere a cualquier forma modificada de un anticuerpo, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo.

Los anticuerpos descritos en el presente documento se aíslan preferiblemente. Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a CLDN18.2 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a otros antígenos diferentes de CLDN18.2). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, isoforma o variante de CLDN18.2 humana puede tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (por ejemplo, homólogos de especies de CLDN18.2). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos. En una realización de la enseñanza, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" se refiere a anticuerpos que tienen diferentes especificidades y que se combinan en una composición o mezcla bien definida.

El término "unión" de acuerdo con la enseñanza se refiere preferiblemente a una unión específica.

De acuerdo con la presente enseñanza, un anticuerpo es capaz de unirse a una diana predeterminada si tiene una afinidad significativa por dicha diana predeterminada y se une a dicha diana predeterminada en ensayos estándar. La "afinidad" o "afinidad de unión" a menudo se mide por la constante de disociación de equilibrio (K^d). Preferiblemente, el término "afinidad significativa" se refiere a la unión a una diana predeterminada con una constante de disociación (K^d) de 10-5 M o inferior, 10-6 M o inferior, 10-7 M o inferior, 10-8 M o inferior, 10-9 M o inferior, 10-10 M o inferior, 10-11 M o inferior, o 10-12 M o inferior.

Un anticuerpo no es (sustancialmente) capaz de unirse a una diana si no tiene una afinidad significativa por dicha diana y no se une significativamente, en particular, no se une de forma detectable, a dicha diana en ensayos estándar. Preferiblemente, el anticuerpo no se une de forma detectable a dicha diana si está presente en una concentración de hasta 2, preferiblemente 10, más preferiblemente 20, en particular 50 o 100 pg/mL o superior. Preferiblemente, un anticuerpo no tiene una afinidad significativa por una diana si se une a dicha diana con una K^dque es al menos 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, o 106 veces superior que la Kd para unirse a la diana predeterminada a la que el anticuerpo es capaz de unirse. Por ejemplo, si la Kd para la unión de un anticuerpo a la diana a la que el anticuerpo es capaz de unirse es 10-7 M, la K^dpara unirse a una diana por la cual el anticuerpo no tiene una afinidad significativa sería de al menos 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M, o 10-1 M.

Un anticuerpo es específico para una diana predeterminada si es capaz de unirse a dicha diana predeterminada mientras que no es capaz de unirse a otras dianas, es decir, no tiene una afinidad significativa por otras dianas y no se une significativamente a otras dianas en ensayos estándar. De acuerdo con la enseñanza, un anticuerpo es específico para CLDN18.2 si es capaz de unirse a CLDN18.2 pero no es (sustancialmente) capaz de unirse a otras dianas. Preferiblemente, un anticuerpo es específico para CLDN18.2 si la afinidad y la unión a tales otras dianas no exceden significativamente la afinidad o la unión a proteínas no relacionadas con CLDN18.2, tales como albúmina de suero bovino (BSA), caseína, albúmina de suero humano (HSA) o proteínas transmembrana diferentes de claudina tales como moléculas del MHC o receptor de transferrina o cualquier otro polipéptido especificado. Preferiblemente, un anticuerpo es específico para una diana predeterminada si se une a dicha diana con una Kd que es al menos 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, o 106 veces inferior que la Kd para la unión a una diana para la que no es específica. Por ejemplo, si la K^dpara la unión de un anticuerpo a la diana para la que es específica es 10-7

La unión de un anticuerpo a una diana puede determinarse experimentalmente utilizando cualquier método adecuado; véase, por ejemplo, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" en Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y, (1992), y los métodos descritos en este documento. Las afinidades pueden determinarse fácilmente usando técnicas convencionales, tales como por diálisis de equilibrio; utilizando el instrumento BIAcore 2000, siguiendo los procedimientos generales descritos por el fabricante; por radioinmunoensayo utilizando antígeno diana radiomarcado;

o por otro método conocido por el experto en la materia. Los datos de afinidad pueden analizarse, por ejemplo, por el método de Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949). La afinidad medida de una interacción antígenoanticuerpo particular puede variar si se mide en diferentes condiciones, por ejemplo, concentración de sal, pH. Por lo tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión a antígeno, por ejemplo, K^d, IC⁵⁰, se preparan preferiblemente con soluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno, y un tampón estandarizado.

Como se usa en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que está codificado por los genes de la región constante de la cadena pesada.

Como se usa en el presente documento, "cambio de isotipo" se refiere al fenómeno por el cual la clase, o isotipo, de un anticuerpo cambia de una clase de Ig a una de las otras clases de Ig.

El término "de origen natural", tal como se usa en el presente documento como se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (incluidos los virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionadamente por el hombre en el laboratorio es de origen natural.

El término "reordenado" como se usa en el presente documento se refiere a una configuración de un locus de inmunoglobulina de cadena pesada o de cadena ligera donde un segmento V se coloca inmediatamente adyacente a un segmento D-J o J en una conformación que codifica esencialmente un dominio VH o VL completo, respectivamente.

Un locus del gen de la inmunoglobulina (anticuerpo) reordenado puede identificarse por comparación con el ADN de la línea germinal; un locus reordenado tendrá al menos un elemento de homología heptámero/nonámero recombinado.

El término "sin reordenar" o "configuración de la línea germinal", como se usa en el presente documento en referencia a un segmento V, se refiere a la configuración en la que el segmento V no se recombina para estar inmediatamente adyacente a un segmento D o J.

De acuerdo con la enseñanza, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo presente en CLDN18.2, preferiblemente un epítopo ubicado dentro de los dominios extracelulares de CLDN18.2, en particular el primer dominio extracelular, preferiblemente las posiciones de aminoácidos 29 a 78 de CLDN18.2. En realizaciones particulares, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es un anticuerpo capaz de unirse a (i) un epítopo en CLDN18.2 que no está presente en CLDN18.1, preferiblemente las SEQ ID NOS:

3, 4 y 5, (ii) un epítopo localizado en el bucle 1 de CLDN18.2, preferiblemente la SEQ ID NO: 8, (iii) un epítopo localizado en el bucle 2 de CLDN18.2, preferiblemente la SEQ ID NO: 10, (iv) un epítopo localizado en el bucle D3 CLDN18.2, preferiblemente la SEQ ID No : 11, (v) un epítopo, que abarca el bucle 1 de CLDN18.2 y el bucle D3 de CLDN18.2, o (vi) un epítopo no glicosilado localizado en el bucle D3 de CLDN18.2, preferiblemente la SEQ ID NO: 9.

De acuerdo con la enseñanza, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es preferiblemente un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 pero no a CLDN18.1. Preferiblemente, un anticuerpo que tenga la capacidad de unirse a CLDN18.2 es específico para CLDN18.2. Preferiblemente, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es preferiblemente un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 expresado en la superficie celular. En realizaciones particularmente preferidas, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 se une a epítopos nativos de CLDN18.2 presentes en la superficie de las células vivas.

Preferiblemente, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 se une a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1, 3-11, 44, 46 y 48-50. Preferiblemente, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es específico para las proteínas, péptidos o fragmentos inmunogénicos o derivados de los mismos mencionados anteriormente. Se puede obtener un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 mediante un método que comprende la etapa de inmunizar a un animal con una proteína o un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de las SEQ ID NOS: 1, 3

11, 44, 46 y 48-50, o un ácido nucleico o una célula huésped que expresa dicha proteína o péptido. Preferiblemente, el anticuerpo se une a células cancerosas, en particular células de los tipos de cáncer mencionados anteriormente y, preferiblemente, no se une sustancialmente a células no cancerosas.

Preferiblemente, la unión de un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 a células que expresan CLDN18.2 induce o media en la destrucción de células que expresan CLDN18.2. Las células que expresan CLDN18.2 son preferiblemente células cancerosas y se seleccionan, en particular, del grupo que consiste en células tumorigénicas gástricas, esofágicas, pancreáticas, pulmonares, ováricas, de colon, hepáticas, de cabeza-cuello y de vesícula biliar. Preferiblemente, el anticuerpo induce o media en la destrucción de células induciendo uno o más de

lisis mediada por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), lisis mediada por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), apoptosis e inhibición de la proliferación de células que expresan CLDN18.2. Preferiblemente, la lisis de células mediada por ADCC tiene lugar en presencia de células efectoras, que en realizaciones particulares se seleccionan del grupo que consiste en monocitos, células mononucleares, células NK y PMN. La inhibición de la proliferación de células puede medirse in vitro determinando la proliferación de células en un ensayo usando bromodesoxiuridina (5-bromo-2-desoxiuridina, BrdU). BrdU es un nucleósido sintético que es un análogo de la timidina y puede incorporarse al ADN recién sintetizado de las células en replicación (durante la fase S del ciclo celular), en sustitución de la timidina durante la replicación del ADN. La detección de la sustancia química incorporada usando, por ejemplo, anticuerpos específicos para BrdU indica que las células estaban replicando activamente su ADN.

En realizaciones preferidas, los anticuerpos descritos en este documento se pueden caracterizar por una o más de las siguientes propiedades:

a) especificidad por CLDN18.2;

b) una afinidad de unión a CLDN18.2 de aproximadamente 100 nMo menos, preferiblemente aproximadamente 5-10 nM o menos y, más preferiblemente, aproximadamente 1-3 nM o menos,

c) la capacidad de inducir o mediar CDC en células positivas para CLDN18.2;

d) la capacidad de inducir o mediar ADCC en células positivas para CLDN18.2;

e) la capacidad de inhibir el crecimiento de células positivas para CLDN18.2;

f) la capacidad de inducir la apoptosis de células positivas para CLDN18.2.

En una realización particularmente preferida, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es producido por un hibridoma depositado en DSMZ (Mascheroder Weg 1b, 31824 Braunschweig, Alemania; nueva dirección Inhoffenstr. 7B, 31824 Braunschweig, Alemania) y que tiene la siguiente designación y número de registro:

a. 182-D1106-055, número de acceso DSM ACC2737, depositado el 19 de octubre de 2005

b. 182-D1106-056, número de acceso DSM ACC2738, depositado el 19 de octubre de 2005

c. 182-D 1106-057, número de acceso DSM ACC2739, depositado el 19 de octubre de 2005

d. 182-D1106-058, número de acceso DSM ACC2740, depositado el 19 de octubre de 2005

e. 182-D1106-059, número de acceso DSM ACC2741, depositado el 19 de octubre de 2005

f. 182-D1106-062, número de acceso DSM ACC2742, depositado el 19 de octubre de 2005,

g. 182-D1106-067, número de acceso DSM ACC2743, depositado el 19 de octubre de 2005

h. 182-D758-035, número de acceso DSM ACC2745, depositado el 17 de noviembre de 2005

i. 182-D758-036, número de acceso DSM ACC2746, depositado el 17 de noviembre de 2005

j. 182-D758-040, número de acceso DSM ACC2747, depositado el 17 de noviembre de 2005

k. 182-D1106-061, número de acceso DSM ACC2748, depositado el 17 de noviembre de 2005

l. 182-D 1106-279, número de acceso DSM ACC2808, depositado el 26 de octubre de 2006

m. 182-D1106-294, número de acceso DSM ACC2809, depositado el 26 de octubre de 2006

n. 182-D1106-362, número de acceso DSM ACC2810, depositado el 26 de octubre de 2006.

Los anticuerpos preferidos de acuerdo con la enseñanza son los producidos y obtenibles a partir de los hibridomas descritos anteriormente; es decir, 37G11 en el caso de 182-D1106-055, 37H8 en el caso de 182-D1106-056, 38G5 en el caso de 182-D1106-057, 38H3 en el caso de 182-D1106-058, 39F11 en el caso de 182-D1106-059, 43A11 en el caso de 182-D1106-062, 61C2 en el caso de 182-D1106-067, 26B5 en el caso de 182-D758-035, 26D12 en el caso de 182-D758-036, 28D10 en el caso de 182-D758-040, 42E12 en el caso de 182-D1106-061, 125E1 en el caso de 182-D1106-279, 163E12 en el caso de 182-D1106-294 y 175D10 en el caso de 182-D1106-362; y las formas quimerizadas y humanizadas de los mismos.

Los anticuerpos quimerizados preferidos y sus secuencias se muestran en la siguiente tabla.

En realizaciones preferidas, los anticuerpos, en particular las formas quimerizadas de anticuerpos de acuerdo con la enseñanza, incluyen anticuerpos que comprenden una región constante de cadena pesada (CH) que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una región constante de cadena pesada humana tal como la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 13 o un fragmento de la misma. En realizaciones preferidas adicionales, los anticuerpos, en particular la formas quimerizadas de anticuerpos de acuerdo con la enseñanza incluyen anticuerpos que comprenden una región constante de cadena ligera (CL) que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una región constante de cadena ligera humana tal como la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 12 o un fragmento de la misma. En una realización preferida particular, los anticuerpos, en particular las formas quimerizadas de anticuerpos de acuerdo con la enseñanza, incluyen anticuerpos que comprenden una CH que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una CH humana tal como la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 13 o un fragmento de la misma y que comprenden una CL que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una CL humana tal como la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 12 o un fragmento de la misma.

En una realización, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es un anticuerpo monoclonal IgG1 quimérico de ratón/humano que comprende una cadena ligera variable murina kappa, una región constante de cadena ligera kappa humana, alotipo Km(3), una región variable de cadena pesada murina, una región constante IgG1 humana, alotipo Glm(3).

En ciertas realizaciones preferidas, las formas quimerizadas de anticuerpos incluyen anticuerpos que comprenden una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NOS: 14, 15, 16, 17, 18, 19, y un fragmento de las mismas y/o que comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 y un fragmento de las mismas.

En ciertas realizaciones preferidas, las formas quimerizadas de anticuerpos incluyen anticuerpos que comprenden una combinación de cadenas pesadas y cadenas ligeras seleccionadas de las siguientes posibilidades (i) a (ix):

(i) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 14 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 21 o un fragmento de la misma,

(ii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 15 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 20 o un fragmento de la misma,

(iii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 16 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 22 o un fragmento de la misma,

(iv) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 18 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 25 o un fragmento de la misma,

(v) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 17 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 24 o un fragmento de la misma,

(vi) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 19 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 23 o un fragmento de la misma,

(vii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 19 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 26 o un fragmento de la misma,

(viii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 19 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 27 o un fragmento de la misma, y

(ix) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 19 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 28 o un fragmento de la misma.

"Fragmento" o "fragmento de una secuencia de aminoácidos", tal como se usó anteriormente, se refiere a una parte de una secuencia de anticuerpo, es decir, una secuencia que representa la secuencia de anticuerpo acortada en el extremo terminal N y/o C, que cuando reemplaza dicha secuencia de anticuerpo en un anticuerpo retiene la unión de dicho anticuerpo a CLDN18.2 y preferiblemente la función de dicho anticuerpo como se describe en el presente documento, por ejemplo, lisis mediada por CDC o lisis mediada por ADCC. Preferiblemente, un fragmento de una secuencia de aminoácidos comprende al menos el 80 %, preferiblemente al menos el 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de los residuos de aminoácidos de dicha secuencia de aminoácidos. Un fragmento de una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consta de las SEQ ID NOS: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28 se refiere preferiblemente a dicha secuencia en la que se eliminan los aminoácidos 17, 18, 19, 20, 21,22 o 23 en el extremo terminal N.

En una realización preferida, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 29, 30, 31, 32, 33, 34 y un fragmento de las mismas.

En una realización preferida, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43 y un fragmento de las mismas.

En ciertas realizaciones preferidas, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende una combinación de región variable de cadena pesada (VH) y región variable de cadena ligera (VL) seleccionada de las siguientes posibilidades (i) a (ix):

(i) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 29 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 36 o un fragmento de la misma, (ii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 30 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 35 o un fragmento de la misma, (iii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 31 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 37 o un fragmento de la misma, (iv) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 33 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 40 o un fragmento de la misma, (v) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 32 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 39 o un fragmento de la misma, (vi) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 34 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 38 o un fragmento de la misma, (vii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 34 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 41 o un fragmento de la misma, (viii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 34 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 42 o un fragmento de la misma, (ix) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 34 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 43 o un fragmento de la misma.

En una realización preferida, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende una VH que comprende un conjunto de regiones determinantes de complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 seleccionadas de las siguientes realizaciones (i) a (vi):

(i) CDR1: posiciones 45-52 de la SEQ ID NO: 14, CDR2: posiciones 70-77 de la SEQ ID NO: 14, CDR3: posiciones 116-125 de la SEQ ID NO: 14,

(ii) CDR1: posiciones 45-52 de la SEQ ID NO: 15, CDR2: posiciones 70-77 de la SEQ ID NO: 15, CDR3: posiciones 116-126 de la SEQ ID NO: 15,

(iii) CDR1: posiciones 45-52 de la SEQ ID NO: 16, CDR2: posiciones 70-77 de la SEQ ID NO: 16, CDR3: posiciones 116-124 de la SEQ ID NO: 16,

(iv) CDR1: posiciones 45-52 de la SEQ ID NO: 17, CDR2: posiciones 70-77 de la SEQ ID NO: 17, CDR3: posiciones 116-126 de la SEQ ID NO: 17,

(v) CDR1: posiciones 44-51 de la SEQ ID NO: 18, CDR2: posiciones 69-76 de la SEQ ID NO: 18, CDR3: posiciones 115-125 de la SEQ ID NO: 18, y

(vi) CDR1: posiciones 45-53 de la SEQ ID NO: 19, CDR2: posiciones 71-78 de la SEQ ID NO: 19, CDR3: posiciones 117-128 de la SEQ ID NO: 19

En una realización preferida, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende una VL que comprende un conjunto de regiones determinantes de complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 seleccionadas de las siguientes realizaciones (i) a (ix):

(i) CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 20, CDR2: posiciones 76-78 de la SEQ ID NO: 20, CDR3: posiciones 115-123 de la SEQ ID NO: 20,

(ii) CDR1: posiciones 49-53 de la SEQ ID NO: 21, CDR2: posiciones 71-73 de la SEQ ID NO: 21, CDR3: posiciones 110-118 de la SEQ ID NO: 21,

(iii) CDR1: posiciones 47-52 de la SEQ ID NO: 22, CDR2: posiciones 70-72 de la SEQ ID NO: 22, CDR3: posiciones 109-117 de la SEQ ID NO: 22,

(iv) CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 23, CDR2: posiciones 76-78 de la SEQ ID NO: 23, CDR3: posiciones 115-123 de la SEQ ID NO: 23,

(v) CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 24, CDR2: posiciones 76-78 de la SEQ ID NO: 24, CDR3: posiciones 115-123 de la SEQ ID NO: 24,

(vi) CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 25, CDR2: posiciones 76-78 de la SEQ ID NO: 25, CDR3: posiciones 115-122 de la SEQ ID NO: 25,

(vii) CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 26, CDR2: posiciones 76-78 de la SEQ ID NO: 26, CDR3: posiciones 115-123 de la SEQ ID NO: 26,

(viii) CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 27, CDR2: posiciones 76-78 de la SEQ ID NO: 27, CDR3: posiciones 115- 123 de la SEQ ID NO: 27, y

(ix) CDR1: posiciones 47-52 de la SEQ ID NO: 28, CDR2: posiciones 70-72 de la SEQ ID NO: 28, CDR3: posiciones 109-117 de la SEQ ID NO: 28

En una realización preferida, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende una combinación de VH y VL, cada una de los cuales comprende un conjunto de regiones determinantes de complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 seleccionadas de las siguientes realizaciones (i) a (ix):

(i) VH: CDR1: posiciones 45-52 de la SEQ ID NO: 14, CDR2: posiciones 70-77 de la SEQ ID NO: 14, CDR3: posiciones 116- 125 de la SEQ ID NO: 14, VL: CDR1: posiciones 49-53 de la SEQ ID NO: 21, CDR2: posiciones 71-73 de la SEQ ID NO: 21, CDR3: posiciones 110-118 de la SEQ ID NO: 21,

(ii) VH: CDR1: posiciones 45-52 de la SEQ ID NO: 15, CDR2: posiciones 70-77 de la SEQ ID NO: 15, CDR3: posiciones 116-126 de la SEQ ID NO: 15, VL: CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 20, CDR2: posiciones 76-78 de la SEQ ID NO: 20, CDR3: posiciones 115-123 de la SEQ ID NO: 20,

(iii) VH: CDR1: posiciones 45-52 de la SEQ ID NO: 16, CDR2: posiciones 70-77 de la SEQ ID NO: 16, CDR3: posiciones 116-124 de la SEQ ID NO: 16, VL: CDR1: posiciones 47-52 de la SEQ ID NO: 22, CDR2: posiciones 70 72 de la SEQ ID NO: 22, CDR3: posiciones 109-117 de la SEQ ID NO: 22,

(iv) VH: CDR1: posiciones 44-51 de la SEQ ID NO: 18, CDR2: posiciones 69-76 de la SEQ ID NO: 18, CDR3: posiciones 115-125 de la SEQ ID NO: 18, VL: CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 25, CDR2: posiciones 76 78 de la SEQ ID NO: 25, CDR3: posiciones 115-122 de la SEQ ID NO: 25,

(v) VH: CDR1: posiciones 45-52 de la SEQ ID NO: 17, CDR2: posiciones 70-77 de la SEQ ID NO: 17, CDR3: posiciones 116-126 de la SEQ ID NO: 17, VL: CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 24, CDR2: posiciones 76-78 de la SEQ ID NO: 24, CDR3: posiciones 115-123 de la SEQ ID NO: 24,

(vi) VH: CDR1: posiciones 45-53 de la SEQ ID NO: 19, CDR2: posiciones 71-78 de la SEQ ID NO: 19, CDR3: posiciones 117-128 de la SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 23, CDR2: posiciones 76 78 de la SEQ ID NO: 23, CDR3: posiciones 115-123 de la SEQ ID NO: 23,

(vii) VH: CDR1: posiciones 45-53 de la SEQ ID NO: 19, CDR2: posiciones 71-78 de la SEQ ID NO: 19, CDR3: posiciones 117-128 de la SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 26, CDR2: posiciones 76 78 de la SEQ ID NO: 26, CDR3: posiciones 115-123 de la SEQ ID NO: 26,

(viii) VH: CDR1: posiciones 45-53 de la SEQ ID NO: 19, CDR2: posiciones 71-78 de la SEQ ID NO: 19, CDR3: posiciones 117-128 de la SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: posiciones 47-58 de la SEQ ID NO: 27, CDR2: posiciones 76 78 de la SEQ ID NO: 27, CDR3: posiciones 115-123 de la SEQ ID NO: 27, y

(ix) VH: CDR1: posiciones 45-53 de la SEQ ID NO: 19, CDR2: posiciones 71-78 de la SEQ ID NO: 19, CDR3: posiciones 117-128 de la SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: posiciones 47-52 de la SEQ ID NO: 28, CDR2: posiciones 70 72 de la SEQ ID NO: 28, CDR3: posiciones 109-117 de la SEQ ID NO: 28

En realizaciones preferidas adicionales, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende preferiblemente una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), preferiblemente al menos la región variable CDR3, de la región variable de cadena pesada (VH) y/o de la región variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal contra CLDN18.2, preferiblemente de un anticuerpo monoclonal contra CLDN18.2 descrito en el presente documento, y preferiblemente comprende una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), preferiblemente al menos la región variable CDR3, de las regiones variables de cadena pesada (VH) y/o regiones variables de cadena ligera (VL) descritas en el presente documento. En una realización, dichas una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se seleccionan de un conjunto de regiones determinantes de complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 descritas en el presente documento. En una realización particularmente preferida, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende preferiblemente las regiones determinantes de complementariedad ^cDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada (VH) y/o de la región variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal contra CLDN18.2, preferiblemente de un anticuerpo monoclonal contra CLDN18.2 descrito en el presente documento, y comprende preferiblemente las regiones determinantes de complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 de las regiones variables de cadena pesada (VH) y/o regiones variables de cadena ligera (VL) descritas en el presente documento.

En una realización, un anticuerpo que comprende una o más CDR, un conjunto de CDR o una combinación de conjuntos de CDR como se describe en el presente documento comprende dichas CDR junto con sus regiones marco intermedias. Preferiblemente, la porción también incluirá al menos aproximadamente el 50 % de una o ambas de la primera y cuarta regiones marco, siendo el 50 % el 50 % del extremo terminal C de la primera región marco y el 50 % del extremo terminal N de la cuarta región marco. La construcción de anticuerpos elaborados mediante técnicas de ADN recombinante puede dar lugar a la introducción de residuos del extremo terminal N o C en las regiones variables codificadas por enlazadores introducidos para facilitar la clonación u otras etapas de manipulación, incluida la introducción de enlazadores para unir regiones variables de la enseñanza para otras secuencias de proteínas que incluyen cadenas pesadas de inmunoglobulina, otros dominios variables (por ejemplo, en la producción de diacuerpos) o etiquetas de proteínas.

En una realización, un anticuerpo que comprende una o más CDR, un conjunto de CDR o una combinación de conjuntos de CDR como se describe en el presente documento comprende dichas CDR en un marco de anticuerpo humano.

La referencia en el presente documento a un anticuerpo que comprende con respecto a la cadena pesada del mismo una cadena particular, o una región o secuencia particular, preferiblemente se refiere a la situación en la que todas las cadenas pesadas de dicho anticuerpo comprenden dicha cadena, región o secuencia particular. Esto se aplica correspondientemente a la cadena ligera de un anticuerpo.

El término "ácido nucleico", como se usa en el presente documento, pretende incluir ADN y ARN. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario, pero preferiblemente es ADN bicatenario.

De acuerdo con la enseñanza, el término "expresión" se usa en su significado más general y comprende la producción de ARN o de ARN y proteína/péptido. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede llevarse a cabo de forma transitoria o estable.

La enseñanza dada en este documento con respecto a secuencias de aminoácidos específicas, por ejemplo, las que se muestran en la lista de secuencias, debe interpretarse de modo que también se relacione con variantes de dichas secuencias específicas que dan como resultado secuencias que son funcionalmente equivalentes a dichas secuencias específicas, por ejemplo, secuencias de aminoácidos que presentan propiedades idénticas o similares a las de las secuencias de aminoácidos específicas. Una propiedad importante es retener la unión de un anticuerpo a su diana o mantener las funciones efectoras de un anticuerpo. Preferiblemente, una secuencia que es una variante con respecto a una secuencia específica, cuando reemplaza la secuencia específica en un anticuerpo retiene la unión de dicho anticuerpo a CLDN18.2 y preferiblemente funciona con dicho anticuerpo como se describe en el presente documento, por ejemplo, lisis mediada por CDC o lisis mediada por ADCC.

Los expertos en la técnica apreciarán que, en particular, las secuencias de las CDR, regiones hipervariable y variable pueden modificarse sin perder la capacidad de unirse a CLDN18.2. Por ejemplo, las regiones CDR serán idénticas o altamente homólogas a las regiones de los anticuerpos especificados en el presente documento. Por "altamente homólogo" se contempla que se pueden realizar de 1 a 5, preferiblemente de 1 a 4, tales como 1 a 3 o 1 o 2 sustituciones en las c Dr . Además, las regiones hipervariables y variables pueden modificarse para que muestren una homología sustancial con las regiones de anticuerpos divulgadas específicamente en el presente documento.

Para los fines de la presente enseñanza, las "variantes" de una secuencia de aminoácidos comprenden variantes de inserción de aminoácidos, variantes de adición de aminoácidos, variantes de eliminación de aminoácidos y/o variantes de sustitución de aminoácidos. Las variantes de eliminación de aminoácidos que comprenden la eliminación en el extremo terminal N y/o el extremo terminal C de la proteína también se denominan variantes de truncamiento del extremo terminal N y/o el extremo terminal C.

Las variantes de inserción de aminoácidos comprenden inserciones de uno o dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos particular. En el caso de las variantes de la secuencia de aminoácidos que tienen una inserción, se insertan uno o más residuos de aminoácidos en un sitio particular en una secuencia de aminoácidos, aunque también es posible la inserción aleatoria con la selección apropiada del producto resultante.

Las variantes de adición de aminoácidos comprenden fusiones en los extremos terminales amino y/o carboxilo de uno o más aminoácidos, tales como 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 o más aminoácidos.

Las variantes de eliminación de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia, tal como mediante la eliminación de 1,2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 o más aminoácidos. Las eliminaciones pueden estar en cualquier posición de la proteína.

Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de al menos un residuo de la secuencia y la inserción de otro residuo en su lugar. Se da preferencia a que las modificaciones estén en posiciones de la secuencia de aminoácidos que no se conservan entre proteínas o péptidos homólogos y/o a la sustitución de aminoácidos por otros que tengan propiedades similares. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos en las variantes de proteínas son cambios de aminoácidos conservadores, es decir, sustituciones de aminoácidos cargados o no cargados de manera similar. Un cambio conservador de aminoácido implica la sustitución de uno de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos naturales generalmente se dividen en cuatro familias: aminoácidos ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos.

Preferiblemente, el grado de similitud, preferiblemente de identidad entre una secuencia de aminoácidos dada y una secuencia de aminoácidos que es una variante de dicha secuencia de aminoácidos dada será al menos aproximadamente del 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 %. El grado de similitud o identidad se da preferiblemente para una región de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 % %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 100 % de la longitud total de la secuencia de aminoácidos de referencia. Por ejemplo, si la secuencia de aminoácidos de referencia consta de 200 aminoácidos, el grado de similitud o identidad se proporciona preferiblemente para al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 160, al menos aproximadamente 180 o aproximadamente 200 aminoácidos, preferiblemente aminoácidos continuos. En realizaciones preferidas, el grado de similitud o identidad se da para la longitud total de la secuencia de aminoácidos de referencia. La alineación para determinar la similitud de la secuencia, preferiblemente la identidad de la secuencia, se puede realizar con herramientas conocidas en la técnica, preferiblemente usando la mejor alineación de la secuencia, por ejemplo, usando Align, utilizando configuraciones estándar, preferiblemente EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, apertura de hueco 10.0, extensión de hueco 0.5.

La "similitud de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones conservadoras de aminoácidos. La "identidad de secuencia" entre dos secuencias de aminoácidos indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias.

El término "identidad porcentual" pretende indicar un porcentaje de residuos de aminoácidos que son idénticos entre las dos secuencias a comparar, obtenido después de la mejor alineación, siendo este porcentaje puramente estadístico y las diferencias entre las dos secuencias se distribuyen aleatoriamente y sobre toda su longitud. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos se realizan convencionalmente comparando estas secuencias después de haberlas alineado óptimamente, realizándose dicha comparación por segmento o por "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. El alineamiento óptimo de las secuencias para comparación puede realizarse, además de manualmente, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, mediante el algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci USA 85, 2444, o mediante programas informáticos que utilizan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, en Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas entre las dos secuencias que se comparan, dividiendo este número por el número de posiciones comparadas y multiplicando el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.

El término "animal transgénico" se refiere a un animal que tiene un genoma que comprende uno o más transgenes, preferiblemente transgenes de cadena pesada y/o ligera, o transcromosomas (integrados o no integrados en el ADN genómico natural del animal) y que preferiblemente es capaz de expresar los transgenes. Por ejemplo, un ratón transgénico puede tener un transgén de cadena ligera humana y un transgén de cadena pesada humana o un transcromosoma de cadena pesada humana, de modo que el ratón produzca anticuerpos humanos anti-CLDN18.2 cuando se inmunice con el antígeno CLDN18.2 y/o las células que expresan CLDN18.2. El transgén de la cadena pesada humana puede integrarse en el ADN cromosómico del ratón, como es el caso de los ratones transgénicos, por ejemplo, ratones HuMAb, tales como los ratones HCo7 o HCol2, o el transgén de la cadena pesada humana puede mantenerse extracromosómicamente, como es el caso de ratones transcromosómicos (por ejemplo, KM) como se describe en el documento WO 02/43478. Dichos ratones transgénicos y transcromosómicos pueden ser capaces de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos contra CLDN18.2 (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgE) mediante recombinación V-D-J y cambio de isotipo.

"Reducir", "disminuir" o "inhibir" como se usa en el presente documento significa una disminución general o la capacidad de causar una disminución general, preferiblemente del 5 % o más, del 10 % o más, del 20 % o más, más preferiblemente del 50 % o más, y lo más preferiblemente del 75 % o más, en el nivel, por ejemplo, en el nivel de expresión o en el nivel de proliferación de células.

Términos tales como "aumentar" o "mejorar" se refieren preferiblemente a un aumento o mejora de aproximadamente al menos un 10 %, preferiblemente al menos un 20 %, preferiblemente al menos un 30 %, más preferiblemente al menos un 40 %, más preferiblemente al menos un 50 %, incluso más preferiblemente al menos un 80 %, y lo más preferiblemente al menos un 100 %, al menos un 200 %, al menos un 500 %, al menos un 1000 %, al menos un 10000 % o incluso más.

Mecanismos de acción de mAb

Aunque lo siguiente proporciona consideraciones con respecto al mecanismo subyacente a la eficacia terapéutica de los anticuerpos de la enseñanza, no debe considerarse como limitante de la enseñanza de ningún modo.

Los anticuerpos descritos en el presente documento interactúan preferiblemente con componentes del sistema inmunológico, preferiblemente a través de ADCC o CDC. Los anticuerpos descritos en este documento también se pueden usar para atacar cargas útiles (por ejemplo, radioisótopos, fármacos o toxinas) para eliminar directamente las células tumorales o se pueden usar de forma sinérgica con agentes quimioterapéuticos tradicionales, atacando tumores a través de mecanismos de acción complementarios que pueden incluir respuestas inmunitarias antitumorales que pueden haberse visto comprometidas debido a los efectos secundarios citotóxicos de un compuesto quimioterapéutico en los linfocitos T. Sin embargo, los anticuerpos descritos en este documento también pueden ejercer un efecto simplemente uniéndose a CLDN18.2 en la superficie celular, por lo tanto, por ejemplo, bloqueando la proliferación de las células.

Citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos

La ADCC describe la capacidad de destrucción de células de las células efectoras como se describe en el presente documento, en particular los linfocitos, lo que preferiblemente requiere que la célula diana esté marcada por un anticuerpo.

La ADCC ocurre preferiblemente cuando los anticuerpos se unen a los antígenos en las células tumorales y los dominios Fc del anticuerpo se acoplan a los receptores Fc (FcR) en la superficie de las células efectoras inmunitarias. Se han identificado varias familias de receptores Fc, y poblaciones celulares específicas que expresan característicamente receptores Fc definidos. La ADCC puede verse como un mecanismo para inducir directamente un grado variable de destrucción tumoral inmediata que conduce a la presentación de antígenos y la inducción de respuestas de células T dirigidas al tumor. Preferiblemente, la inducción in vivo de ADCC conducirá a respuestas de células T dirigidas al tumor y respuestas de anticuerpos derivadas del huésped.

Citotoxicidad dependiente del complemento

CDC es otro método de eliminación de células que puede ser dirigido por anticuerpos. IgM es el isotipo más eficaz para la activación del complemento. IgG1 e IgG3 también son muy eficaces para dirigir CDC a través de la vía clásica de activación del complemento. Preferiblemente, en esta cascada, la formación de complejos antígeno-anticuerpo da como resultado el descubrimiento de múltiples sitios de unión de Clq muy próximos en los dominios Ch2 de moléculas de anticuerpos participantes, tales como moléculas de IgG (Clq es uno de los tres subcomponentes del complemento C1). Preferiblemente, estos sitios de unión C1q descubiertos convierten la interacción C1q-IgG de baja afinidad previa en una de alta avidez, lo que desencadena una cascada de eventos que involucran una serie de otras proteínas del complemento y conduce a la liberación proteolítica de los agentes C3a y C5a quimiotácticos/activadores de células efectoras. Preferiblemente, la cascada del complemento termina en la formación de un complejo de ataque a la membrana, que crea poros en la membrana celular que facilitan el libre paso de agua y solutos dentro y fuera de la célula.

Producción y prueba de anticuerpos.

Los anticuerpos descritos en este documento se pueden producir mediante una variedad de técnicas, incluida la metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la técnica estándar de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975). Aunque se prefieren los procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B o técnicas de presentación en fagos usando bibliotecas de genes de anticuerpos.

El sistema animal preferido para preparar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión son conocidos en la técnica. También se conocen compañeros de fusión (por ejemplo, células de mieloma murino) y procedimientos de fusión.

Otros sistemas animales preferidos para preparar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales son el sistema de rata y conejo (por ejemplo, descrito en Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9348 (1995), véase también Rossi et al., Am. J. Clin. Patol. 124: 295 (2005)).

En otra realización preferida adicional, los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema del ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones conocidos como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y se denominan colectivamente en el presente documento como "ratones transgénicos". La producción de anticuerpos humanos en tales ratones transgénicos se puede realizar como se describe en detalle para CD20 en el documento WO2004035607.

Otra estrategia más para generar anticuerpos monoclonales es aislar directamente genes que codifican anticuerpos de linfocitos que producen anticuerpos de especificidad definida, por ejemplo, vease Babcock et al., 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities. Para obtener detalles sobre la modificación de anticuerpos recombinantes, véase también Welschof y Kraus, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 y Benny KC. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.

Para generar anticuerpos, los ratones pueden inmunizarse con péptidos conjugados con portadores derivados de la secuencia del antígeno, es decir, la secuencia contra la que se dirigen los anticuerpos, una preparación enriquecida de antígeno expresado de forma recombinante o fragmentos del mismo y/o células que expresan el antígeno, como se describió. Alternativamente, los ratones pueden inmunizarse con ADN que codifica el antígeno o fragmentos del mismo. En el caso de que las inmunizaciones que utilizan una preparación purificada o enriquecida del antígeno no den como resultado anticuerpos, los ratones también pueden inmunizarse con células que expresan el antígeno, por ejemplo, una línea celular, para promover respuestas inmunitarias.

La respuesta inmunitaria se puede controlar durante el transcurso del protocolo de inmunización con muestras de plasma y suero que se obtienen mediante sangrado de la vena de la cola o retroorbital. Para las fusiones se pueden utilizar ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina. Los ratones se pueden reforzar por vía intraperitoneal o intravenosa con células que expresan antígenos 3 días antes del sacrificio y la extracción del bazo para aumentar la tasa de hibridomas secretores de anticuerpos específicos.

Para generar hibridomas que produzcan anticuerpos monoclonales, pueden aislarse esplenocitos y células de ganglios linfáticos de ratones inmunizados y fusionarse con una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. A continuación, los hibridomas resultantes pueden examinarse para la producción de anticuerpos específicos de antígeno. A continuación, los pocillos individuales pueden examinarse mediante ELISA para detectar hibridomas secretores de anticuerpos. Mediante análisis de inmunofluorescencia y FACS utilizando células que expresan antígenos, se pueden identificar anticuerpos con especificidad para el antígeno. Los hibridomas secretores de anticuerpos se pueden volver a sembrar en placa, examinar de nuevo y, si siguen siendo positivos para anticuerpos monoclonales, se pueden subclonar mediante dilución limitante. A continuación, los subclones estables se pueden cultivar in vitro para generar anticuerpos en medio de cultivo de tejidos para su caracterización.

Los anticuerpos también se pueden producir en un transfectoma de células huésped usando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección de genes como se conocen en la técnica (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

Por ejemplo, en una realización, el gen o genes de interés, por ejemplo, genes de anticuerpos, se pueden ligar en un vector de expresión, tal como un plásmido de expresión eucariota, tal como el utilizado por el sistema de expresión génica GS divulgado en los documentos WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338 841 u otros sistemas de expresión bien conocidos en la técnica. El plásmido purificado con los genes de anticuerpos clonados se puede introducir en células huésped eucariotas tales como células CHO, células NS/0, células HEK293T o células HEK293 o alternativamente en otras células eucariotas tal como células derivadas de plantas, células fúngicas o de levadura. El método utilizado para introducir estos genes pueden ser los métodos descritos en la técnica tales como electroporación, lipofectina, lipofectamina u otros. Después de la introducción de estos genes de anticuerpos en las células huésped, las células que expresan el anticuerpo pueden identificarse y seleccionarse.

Estas células representan los transfectomas que luego pueden amplificarse para su nivel de expresión y aumentarse para producir anticuerpos. Los anticuerpos recombinantes se pueden aislar y purificar a partir de estos sobrenadantes y/o células de cultivo.

Alternativamente, los genes de anticuerpos clonados se pueden expresar en otros sistemas de expresión, incluidas las células procarióticas, tales como microorganismos, por ejemplo, E. coli. Además, los anticuerpos se pueden producir en animales no humanos transgénicos, tal como en la leche de oveja y conejo o en huevos de gallina, o en plantas transgénicas; véase por ejemplo Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al., (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; y Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.

Quimerización

Los anticuerpos monoclonales murinos se pueden usar como anticuerpos terapéuticos en humanos cuando se marcan con toxinas o isótopos radiactivos. Los anticuerpos murinos no marcados son altamente inmunogénicos en el hombre cuando se aplican repetidamente, lo que conduce a una reducción del efecto terapéutico. La inmunogenicidad principal está mediada por las regiones constantes de cadena pesada. La inmunogenicidad de los anticuerpos murinos en el hombre puede reducirse o evitarse por completo si los anticuerpos respectivos se quimerizan o humanizan. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos, cuyas diferentes partes se derivan de diferentes especies animales, como los que tienen una región variable derivada de un anticuerpo murino y una región constante de inmunoglobulina humana. La quimerización de anticuerpos se logra mediante la unión de las regiones variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo murino con la región constante de la cadena pesada y ligera humana (por ejemplo, como se describe en Kraus et al., en Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8). En una realización preferida, los anticuerpos quiméricos se generan uniendo la región constante de la cadena ligera kappa humana a la región variable de la cadena ligera murina. En una realización también preferida, se pueden generar anticuerpos quiméricos uniendo la región constante de la cadena ligera lambda humana a la región variable de la cadena ligera murina. Las regiones constantes de cadena pesada preferidas para la generación de anticuerpos quiméricos son IgG1, IgG3 e IgG4. Otras regiones constantes de cadena pesada preferidas para la generación de anticuerpos quiméricos son IgG2, IgA, IgD e IgM.

Humanización

Los anticuerpos interactúan con los antígenos diana predominantemente a través de residuos de aminoácidos que se encuentran en las seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las cadenas pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias de la CDR son responsables de la mayoría de las interacciones antígeno-anticuerpo, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imiten las propiedades de anticuerpos naturales específicos mediante la construcción de vectores de expresión que incluyen secuencias de la CDR del anticuerpo natural específico injertado en secuencias marco de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (véase, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; y Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 10029-10033). Dichas secuencias marco se pueden obtener de bases de datos de ADN públicas que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de línea germinal. Estas secuencias de línea germinal diferirán de las secuencias de genes de anticuerpos maduros porque no incluirán genes variables completamente ensamblados, que se forman mediante la unión de V (D) J durante la maduración de las células B. Las secuencias de genes de la línea germinal también diferirán de las secuencias de un anticuerpo de repertorio secundario de alta afinidad en el individuo de manera uniforme en toda la región variable.

La capacidad de los anticuerpos para unirse a un antígeno se puede determinar usando ensayos de unión estándar (por ejemplo, ELISA, transferencia Western, inmunofluorescencia y análisis de citometría de flujo).

Para purificar anticuerpos, los hibridomas seleccionados se pueden cultivar en matraces giratorios de dos litros para la purificación de anticuerpos monoclonales. Alternativamente, los anticuerpos se pueden producir en biorreactores basados en diálisis. Los sobrenadantes se pueden filtrar y, si es necesario, concentrar antes de la cromatografía de afinidad con proteína G-sefarosa o proteína A-sefarosa. La IgG eluida se puede comprobar mediante electroforesis en gel y cromatografía líquida de alta resolución para garantizar la pureza. La solución tampón se puede cambiar a PBS y la concentración se puede determinar mediante OD280 utilizando un coeficiente de inactivación de 1.43. Los anticuerpos monoclonales se pueden dividir en alícuotas y almacenar a -80 °C.

Para determinar si los anticuerpos monoclonales seleccionados se unen a epítopos únicos, se puede usar mutagénesis dirigida al sitio o dirigida a múltiples sitios.

Para determinar el isotipo de anticuerpos, se pueden realizar ELISA de isotipo con varios kits comerciales (por ejemplo, Zymed, Roche Diagnostics). Los pocillos de las placas de microtitulación se pueden recubrir con Ig anti-ratón. Después del bloqueo, las placas se hacen reaccionar con anticuerpos monoclonales o controles de isotipo purificados, a temperatura ambiente durante dos horas. A continuación, los pocillos se pueden hacer reaccionar con sondas conjugadas con peroxidasa específicas de IgG1, IgG2a, IgG2b o IgG3, IgA o IgM de ratón. Después del lavado, las placas pueden revelarse con sustrato ABTS (1 mg/mL) y analizarse a una DO de 405-650. Como alternativa, el kit de isotipado de anticuerpos monoclonales de ratón IsoStrip (Roche, cat. N° 1493027) se puede utilizar de acuerdo con lo descrito por el fabricante.

[Para demostrar la presencia de anticuerpos en sueros de ratones inmunizados o la unión de anticuerpos monoclonales a células vivas que expresan antígeno, se puede utilizar la citometría de flujo. Las líneas celulares que expresan antígeno de forma natural o después de la transfección y los controles negativos que carecen de expresión de antígeno (cultivados en condiciones de crecimiento estándar) se pueden mezclar con diversas concentraciones de anticuerpos monoclonales en sobrenadantes de hibridoma o en PBS que contiene 1 % de FBS, y se pueden incubar a 4 °C durante 30 minutos. Después del lavado, el anticuerpo anti IgG marcado con APC o Alexa647 puede unirse al anticuerpo monoclonal unido al antígeno en las mismas condiciones que la tinción del anticuerpo primario. Las muestras se pueden analizar mediante citometría de flujo con un instrumento FACS utilizando propiedades de dispersión lateral y de luz para seleccionar células vivas individuales. Para distinguir los anticuerpos monoclonales específicos de antígeno de los aglutinantes no específicos en una sola medición, se puede emplear el método de cotransfección. Las células transfectadas transitoriamente con plásmidos que codifican antígeno y un marcador fluorescente pueden teñirse como se describió anteriormente. Las células transfectadas se pueden detectar en un canal de fluorescencia diferente al de las células teñidas con anticuerpos. Como la mayoría de las células transfectadas expresan ambos transgenes, los anticuerpos monoclonales específicos de antígeno se unen preferiblemente a las células que expresan marcadores de fluorescencia, mientras que los anticuerpos no específicos se unen en una proporción comparable a las células no transfectadas. Se puede usar un ensayo alternativo que utiliza microscopía de fluorescencia además o en lugar del ensayo de citometría de flujo. Las células pueden teñirse exactamente como se describió anteriormente y examinarse mediante microscopía de fluorescencia.

Para demostrar la presencia de anticuerpos en sueros de ratones inmunizados o la unión de anticuerpos monoclonales a células vivas que expresan antígeno, se puede utilizar análisis de microscopía de inmunofluorescencia. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan antígeno de forma espontánea o después de la transfección y los controles negativos que carecen de expresión de antígeno se cultivan en portaobjetos de cámara en condiciones de crecimiento estándar en medio DMEM/F12, suplementado con suero bovino fetal (FCS) al 10 %, L-glutamina 2 mM, 100 UI/mL de penicilina y 100 |jg/mL de estreptomicina. A continuación, las células pueden fijarse con metanol o paraformaldehído o dejarse sin tratar. A continuación, las células pueden reaccionar con anticuerpos monoclonales contra el antígeno durante 30 min a 25 °C. Después del lavado, las células pueden reaccionar con un anticuerpo secundario IgG anti-ratón marcado con Alexa555 (Molecular Probes) en las mismas condiciones. A continuación, las células se pueden examinar mediante microscopía de fluorescencia.

Se pueden preparar extractos celulares de células que expresan antígeno y controles negativos apropiados y someterlos a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS). Después de la electroforesis, los antígenos separados se transferirán a membranas de nitrocelulosa, se bloquearán y se sondearán con los anticuerpos monoclonales que se analizarán. La unión de IgG se puede detectar utilizando peroxidasa anti-IgG de ratón y se revela con sustrato ECL.

Los anticuerpos pueden someterse a pruebas adicionales de reactividad con el antígeno mediante inmunohistoquímica de una manera bien conocida por el experto en la materia, por ejemplo, utilizando paraformaldehído o criosecciones fijadas con acetona o secciones de tejido incrustadas en parafina fijadas con paraformaldehído de tejido no canceroso o muestras de tejido no canceroso o de tejido canceroso obtenidas de pacientes durante procedimientos quirúrgicos de la rutina o de ratones portadores de tumores xenoinjertados inoculados con líneas celulares que se expresan espontáneamente o después del antígeno de transfección. Para la inmunotinción, los anticuerpos reactivos al antígeno se pueden incubar seguidos de anticuerpos de cabra anti-ratón o de cabra anti-conejo (DAKO) conjugados con peroxidasa de rábano picante de acuerdo con las instrucciones del proveedor.

Los anticuerpos pueden analizarse en cuanto a su capacidad para mediar en la fagocitosis y la destrucción de células que expresan CLDN18.2. La prueba de la actividad de los anticuerpos monoclonales in vitro proporcionará una evaluación inicial antes de probar los modelos in vivo.

Citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC)

Brevemente, las células polimorfonucleares (PMN), las células NK, los monocitos, las células mononucleares u otras células efectoras de donantes sanos pueden purificarse mediante centrifugación de densidad con Ficoll Hypaque, seguida de la lisis de los eritrocitos contaminantes. Las células efectoras lavadas se pueden suspender en RPMI suplementado con suero de ternero fetal al 10 % inactivado por calor o, alternativamente, con suero humano al 5 % inactivado por calor y mezclado con células diana marcadas con 51Cr que expresan CLDN18.2, en diversas proporciones de células efectoras a células diana. Alternativamente, las células diana pueden marcarse con un ligando potenciador de la fluorescencia (BATDA). Un quelato altamente fluorescente de europio con el ligando potenciador que se libera de las células muertas se puede medir con un fluorómetro. Otra técnica alternativa puede utilizar la transfección de células diana con luciferasa. El amarillo lucifer añadido puede entonces ser oxidado únicamente por células viables. A continuación, se pueden añadir IgG anti-CLDN18.2 purificadas en diversas concentraciones. La IgG humana irrelevante se puede utilizar como control negativo. Los ensayos pueden llevarse a cabo durante 4 a 20 horas a 37 °C dependiendo del tipo de célula efectora utilizada. Las muestras se pueden ensayar para citólisis midiendo la liberación de 51Cr o la presencia del quelato EuTDAen el sobrenadante del cultivo. Alternativamente, la luminiscencia resultante de la oxidación del amarillo lucifer puede ser una medida de células viables. Los anticuerpos monoclonales anti-CLDN18.2 también se pueden analizar en varias combinaciones para determinar si la citólisis mejora con múltiples anticuerpos monoclonales.

Citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)

Los anticuerpos monoclonales anti-CLDN18.2 pueden analizarse para determinar su capacidad para mediar la CDC usando una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, el suero para el complemento se puede obtener de la sangre de una manera conocida por el experto en la materia. Para determinar la actividad de la CDC de los mAb, se pueden usar diferentes métodos. La liberación de 51Cr se puede medir, por ejemplo, o se puede evaluar la permeabilidad elevada de la membrana usando un ensayo de exclusión de yoduro de propidio (PI). Brevemente, las células diana se pueden lavar y se pueden incubar 5 * 105/mL con varias concentraciones de mAb durante 10-30 min a temperatura ambiente o a 37 °C. A continuación, se puede añadir suero o plasma hasta una concentración final del 20 % (v/v) y las células se incuban a 37 °C durante 20-30 min. Todas las células de cada muestra se pueden agregar a la solución de PI en un tubo FACS. A continuación, la mezcla puede analizarse inmediatamente mediante análisis de citometría de flujo utilizando FACSArray.

En un ensayo alternativo, la inducción de CDC puede determinarse en células adherentes. En una realización de este ensayo, las células se siembran 24 h antes del ensayo con una densidad de 3 * 104/pocillo en placas de microtitulación de fondo plano para cultivo de tejidos. Al día siguiente se retira el medio de crecimiento y las células se incuban por triplicado con anticuerpos. Las células de control se incuban con medio de crecimiento o medio de crecimiento que contiene saponina al 0.2 % para la determinación de la lisis de fondo y la lisis máxima, respectivamente. Después de la incubación durante 20 min a temperatura ambiente se retira el sobrenadante y se añade a las células plasma o suero humano al 20 % (v/v) en DMEM (precalentado a 37 °C) y se incuban durante otros 20 min a 37 °C. Todas las células de cada muestra se añaden a una solución de yoduro de propidio (10 pg/mL). Luego, los sobrenadantes se reemplazan por PBS que contiene 2.5 pg/mL de bromuro de etidio y la emisión de fluorescencia tras la excitación a 520 nm se mide a 600 nm usando un Tecan Safire. El porcentaje de lisis específica se calcula de la siguiente manera: % de lisis específica = (muestra de fluorescencia - fondo de fluorescencia)/(lisis máxima de fluorescencia - fondo de fluorescencia) * 100.

Inducción de apoptosis e inhibición de la proliferación celular por anticuerpos monoclonales

Para probar la capacidad de iniciar la apoptosis, los anticuerpos monoclonales anti-CLDN18.2 pueden, por ejemplo, incubarse con células tumorales positivas para CLDN18.2, por ejemplo, células tumorales transfectadas con SNU-16, DAN-G, KATO-III o CLDN18.2 a 37 °C durante unas 20 horas. Las células se pueden recolectar, lavar en tampón de unión de anexina-V (BD Biosciences) e incubar con anexina V conjugada con FITC o APC (BD Biosciences) durante 15 min en la oscuridad. Todas las células de cada muestra pueden agregarse a la solución de PI (10 pg/mL en PBS) en un tubo FACS y evaluarse inmediatamente mediante citometría de flujo (como se indicó anteriormente). Alternativamente, se puede detectar una inhibición general de la proliferación celular por anticuerpos monoclonales con kits disponibles en el mercado. El kit de proliferación celular DELFIA (Perkin-Elmer, cat. No. AD0200) es un inmunoensayo no isotópico basado en la medición de la incorporación de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) durante la síntesis de ADN de células en proliferación en microplacas. La BrdU incorporada se detecta utilizando un anticuerpo monoclonal marcado con europio. Para permitir la detección de anticuerpos, las células se fijan y el ADN se desnaturaliza con la solución Fix. El anticuerpo no unido se elimina por lavado y se agrega el inductor DELFIA para disociar los iones de europio del anticuerpo marcado en la solución, donde forman quelatos altamente fluorescentes con los componentes del inductor DELFIA. La fluorescencia medida, utilizando fluorometría resuelta en el tiempo en la detección, es proporcional a la síntesis de ADN en la célula de cada pocillo.

Estudios preclínicos

Los anticuerpos monoclonales que se unen a CLDN18.2 también se pueden probar en un modelo in vivo (por ejemplo, en ratones inmunodeficientes portadores de tumores xenoinjertados inoculados con líneas celulares que expresan CLDN18.2, por ejemplo, DAN-G, SNU-16 o KATO-III, o después de la transfección, por ejemplo, HEK293) para determinar su eficacia en el control del crecimiento de células tumorales que expresan CLDN18.2.

Los estudios in vivo después del xenoinjerto de células tumorales que expresan CLDN18.2 en ratones inmunocomprometidos u otros animales se pueden realizar usando los anticuerpos descritos en este documento. Los anticuerpos pueden administrarse a ratones libres de tumores seguidos de una inyección de células tumorales para medir los efectos de los anticuerpos para prevenir la formación de tumores o síntomas relacionados con tumores. Los anticuerpos se pueden administrar a ratones portadores de tumores para determinar la eficacia terapéutica de los respectivos anticuerpos para reducir el crecimiento del tumor, la metástasis o los síntomas relacionados con el tumor. La aplicación de anticuerpos se puede combinar con la aplicación de otras sustancias como fármacos cistostáticos, inhibidores del factor de crecimiento, bloqueadores del ciclo celular, inhibidores de la angiogénesis u otros anticuerpos para determinar la eficacia sinérgica y la toxicidad potencial de las combinaciones. Para analizar los efectos secundarios tóxicos mediados por anticuerpos, los animales pueden inocularse con anticuerpos o reactivos de control e investigarse minuciosamente en busca de síntomas posiblemente relacionados con la terapia con anticuerpos CLDN18.2. Los posibles efectos secundarios de la aplicación in vivo de anticuerpos CLDN18.2 incluyen particularmente toxicidad en los tejidos que expresan CLDN18.2, incluido el estómago. Anticuerpos que reconocen CLDN18.2 en humanos y en otras especies, por ejemplo, ratones, son particularmente útiles para predecir posibles efectos secundarios mediados por la aplicación de anticuerpos monoclonales CLDN18.2 en humanos.

El mapeo de epítopos reconocidos por anticuerpos se puede realizar como se describe en detalle en "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) por Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 y en "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 por Olwyn MR Westwood, Frank C. Hay.

Los compuestos y agentes descritos en el presente documento pueden administrarse en forma de cualquier composición farmacéutica adecuada.

Las composiciones farmacéuticas normalmente se proporcionan en una forma de dosificación uniforme y se pueden preparar de una manera ya conocida. Una composición farmacéutica puede, por ejemplo, estar en forma de solución o suspensión.

Una composición farmacéutica puede comprender sales, sustancias tampón, conservantes, vehículos, diluyentes y/o excipientes, todos los cuales son preferiblemente farmacéuticamente aceptables. El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a la no toxicidad de un material que no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica.

Las sales que no son farmacéuticamente aceptables pueden usarse para preparar sales farmacéuticamente aceptables y se incluyen en la enseñanza. Las sales farmacéuticamente aceptables de este tipo comprenden de manera no limitativa las preparadas a partir de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables también se pueden preparar como sales de metales alcalinos o sales de metales alcalinotérreos, tales como sales de sodio, sales de potasio o sales de calcio.

Sustancias tampón adecuadas para usar en una composición farmacéutica incluyen ácido acético en una sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en una sal y ácido fosfórico en una sal.

Los conservantes adecuados para usar en una composición farmacéutica incluyen cloruro de benzalconio, clorobutanol, parabeno y timerosal.

Una formulación inyectable puede comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable como Lactato de Ringer.

El término "vehículo" se refiere a un componente orgánico o inorgánico, de naturaleza natural o sintética, en el que el componente activo se combina para facilitar, mejorar o permitir la aplicación. De acuerdo con la enseñanza, el término "vehículo" también incluye uno o más rellenos, diluyentes o sustancias encapsulantes sólidas o líquidas compatibles, que son adecuadas para la administración a un paciente.

Sustancias portadoras posibles para administración parenteral son, por ejemplo, agua estéril, Ringer, lactato de Ringer, solución de cloruro de sodio estéril, polialquilenglicoles, naftalenos hidrogenados y, en particular, polímeros de lactida biocompatibles, copolímeros de lactida/glicólido o copolímeros de polioxietileno/polioxipropileno.

El término "excipiente", cuando se usa en este documento, pretende indicar todas las sustancias que pueden estar presentes en una composición farmacéutica y que no son ingredientes activos tales como, por ejemplo, vehículos, aglutinantes, lubricantes, espesantes, agentes tensioactivos, conservantes, emulsionantes, tampones, agentes saborizantes o colorantes.

Los agentes y composiciones descritos en el presente documento se pueden administrar por cualquier vía convencional, como por ejemplo por administración parenteral, incluida la inyección o la infusión. La administración es preferiblemente por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, intraarterial, subcutánea, intradérmica o intramuscular.

Las composiciones adecuadas para la administración parenteral normalmente comprenden una preparación acuosa o no acuosa estéril del compuesto activo, que es preferiblemente isotónica con la sangre del receptor. Ejemplos de vehículos y disolventes compatibles son la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, normalmente se utilizan aceites fijos estériles como solución o medio de suspensión.

Los agentes y composiciones descritos en el presente documento se administran en cantidades eficaces. Una "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado solo o junto con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad particular o de una condición particular, la reacción deseada preferiblemente se relaciona con la inhibición del curso de la enfermedad. Esto comprende ralentizar el progreso de la enfermedad y, en particular, interrumpir o revertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en el tratamiento de una enfermedad o de una afección también puede ser el retraso de la aparición o la prevención de la aparición de dicha enfermedad o dicha afección.

Una cantidad efectiva de un agente o composición descrita en este documento dependerá de la condición a tratar, la severidad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, incluyendo edad, condición fisiológica, tamaño y peso, la duración del tratamiento, el tipo de una terapia de acompañamiento (si está presente), la vía específica de administración y factores similares. En consecuencia, las dosis administradas de los agentes descritos en el presente documento pueden depender de varios de dichos parámetros. En el caso de que una reacción en un paciente sea insuficiente con una dosis inicial, se pueden usar dosis más altas (o dosis efectivamente más altas alcanzadas por una vía de administración diferente y más localizada).

Los agentes y composiciones descritos en este documento se pueden administrar a pacientes, por ejemplo, in vivo, para tratar o prevenir una variedad de trastornos como los descritos en este documento. Los pacientes preferidos incluyen pacientes humanos que tienen trastornos que pueden corregirse o mejorarse mediante la administración de los agentes y composiciones descritos en el presente documento. Esto incluye trastornos que involucran células caracterizadas por un patrón de expresión alterado de CLDN18.2.

Por ejemplo, en una realización, los anticuerpos descritos en este documento se pueden usar para tratar a un paciente con una enfermedad cancerosa, por ejemplo, una enfermedad cancerosa como la descrita en este documento caracterizada por la presencia de células cancerosas que expresan CLDN18.2.

Las composiciones farmacéuticas y los métodos de tratamiento descritos de acuerdo con la enseñanza también pueden usarse para inmunización o vacunación para prevenir una enfermedad descrita en el presente documento. La presente enseñanza se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitativos del alcance de la enseñanza.

Ejemplos

Ejemplo 1: Material y métodos

1. Anticuerpos

Tabla 1: Anticuerpos usados en el presente documento

2. Inmunohistoquímica (IHC)

Las secciones de tejido (4 pm de espesor) se almacenaron a 2-8 °C hasta su uso.

Antes del proceso de desparafinado, las secciones se incubaron a 58-60 °C en un horno de secado durante 1 hora para derretir la parafina y eliminar cuantitativamente el agua, mejorando así la adherencia de los tejidos a los portaobjetos de vidrio ("horneado").

Desparafinado

Después de fundir y secar, los portaobjetos se desparafinizaron usando dos etapas de xilol (5 minutos) y se rehidrataron usando una matriz descendente de alcohol (a una temperatura ambiente de 20-27 °C):

5 (±1) minutos en baño de xileno;

este etapa se repitió una vez en un baño fresco;

exceso de líquido;

5 (±1) minutos en etanol absoluto;

repetir este etapa una vez con un baño fresco;

eliminar el exceso de líquido;

5 (±1) minutos en etanol al 96 %;

repetir este etapa una vez con un baño fresco;

eliminar el exceso de líquido;

5 (±1) minutos en etanol al 80 %;

• eliminar el exceso de líquido;

• 5 (±1) minutos en etanol al 70 %;

• eliminar el exceso de líquido;

• 5 minutos en agua destilada o desionizada.

Recuperación e inactivación de epítopos

Después de la eliminación de la parafina, los epítopos diana se recuperaron utilizando un procedimiento de recuperación de epítopos inducido por calor. Por lo tanto, los portaobjetos se colocaron en frascos de tinción llenos con 200 mL de tampón de recuperación (tampón cítrico 10 mM; Tween-20 al 0.05 %; pH 6) y se incubaron en una olla a presión (PASCAL, Dako) a 120 °C durante 10 minutos. Posteriormente, los frascos se retiraron de la olla y se dejaron enfriar en la solución de recuperación de epítopos durante 10 (±1) min a temperatura ambiente. Los portaobjetos se enjuagaron con tampón de lavado (PBS 1x).

Después de enfriar, las secciones se trasladaron a frascos de tinción llenos con 200 mL de solución de inactivación (peroxidasa al 0,3 % en PBS 1x) y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente, seguido de 2 etapas de lavado de 5 minutos en tampón de lavado fresco.

Bloqueo e incubación de anticuerpos.

Se eliminó el exceso de tampón de lavado, los portaobjetos se cubrieron con 200 pL de tampón de bloqueo (suero de cabra al 10 % en PBS 1x) y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. El tampón de bloqueo se eliminó y se reemplazó por 200 pL de solución de anticuerpo diluida (dilución en tampón de bloqueo). Los portaobjetos se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 2-8 °C:

Tabla 2: Dilución de anticuerpos primarios para análisis histológicos - concentración patrón y concentración final de los anticuerpos utilizados en los ensa os histoló icos

Al día siguiente, se eliminó la solución de anticuerpo primario y las secciones se lavaron durante 5 min 3x con tampón de lavado. A continuación, se eliminó el exceso de tampón de lavado y se añadieron 200 pL de la solución de anticuerpo secundario lista para usar (Power Vision HRP goat-a-mouse; Immunologic; LN). Los portaobjetos se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Se eliminó el exceso de líquido y se lavaron los portaobjetos durante 5 min 3x en tampón de lavado nuevo.

Reacción del sustrato y contratinción

Después de eliminar el exceso de tampón de lavado, las secciones se cubrieron con aproximadamente 50-150 pl de la solución de sustrato-cromógeno recién preparada (VectorRed; Vector Labs) durante 2 min. Se eliminó el exceso de sustrato y los portaobjetos se incubaron en frascos con agua desionizada durante 1-5 min.

Posteriormente, se realizó una contratinción del tejido sumergiendo las secciones en frascos que contenían 200 mL de hematoxilina de Mayer durante 2 min. Posteriormente las secciones se colocaron en agua del grifo durante 5-10 min para el azulado de los núcleos.

Deshidratación y montaje

Después de realizar la contratinción, las secciones se deshidrataron utilizando una matriz de alcohol ascendente:

inmersión en etanol al 70 % (aproximadamente 5-10 s)

inmersión en etanol al 80 % (aproximadamente 5-10 s)

inmersión en etanol al 96 % (aproximadamente 5-10 s)

inmersión en etanol absoluto (aproximadamente 5-10 s)

5 min en xileno

Para el montaje de las muestras se utilizó un medio de montaje no acuoso (X-TRA-Kit, Medite). Los portaobjetos se montaron directamente desde el último frasco lleno de xileno y se secaron al aire a temperatura ambiente.

Tabla 3: Microarreglos de tejidos para análisis histológicos

3. Cultivo de células

Todas las líneas celulares de cáncer de páncreas y las líneas celulares de control adicionales utilizadas para los experimentos presentados en este documento se cultivan en medios de acuerdo con las fichas de datos de origen y siguiendo los procedimientos estándar de cultivo de tejidos. Las condiciones se resumen en la Tabla 4. Para todas las líneas celulares recién obtenidas, se analizó la contaminación por micoplasma y se preparó un banco maestro de células.

Tabla 4. Condiciones de cultivo de células para el cáncer de páncreas humano líneas celulares de control

4. Transfección de luciferasa de líneas celulares de páncreas

Para los ensayos de ADCC, las líneas celulares de cáncer de páncreas se transfectaron transitoriamente con ARN de luciferasa. Este ARN de luciferasa (vector pSTl-luc2mut-2hBgUTR-A121-EciI (pST1-109)) se produjo con una tapa ARCA y se disolvió en H2O. El ARN se almacenó en alícuotas de 22 pL a -80 °C. Para todas las líneas celulares de páncreas, se determinaron las condiciones óptimas de electroporación, lo que dio como resultado tasas de transfección y viabilidad más altas de las células. En cada ensayo, las células se separaron con PBS/EDTA 5 mM y se mezclaron 2.5 x 106 células disueltas en 250 pL de X-Vivo en cubetas heladas con 10 pg de ARN. Las células se electroporaron inmediatamente (GenePulser Xcell, Biorad) y se resuspendieron en medio de ensayo precalentado ajustando las células a razón de 5x105 células/mL. Las condiciones de electroporación probadas fueron para todas las líneas celulares:

La viabilidad de las células se determinó directamente después de la electroporación usando CASY o tiñendo las células con azul tripano y determinando el porcentaje de células muertas en la cámara de Neubauer. Las células se sembraron por cuadruplicado en placas blancas de 96 pocillos (2.5 x 104 células/pocillo) y se incubaron durante 24 h. Posteriormente, la actividad de luciferasa se midió en un luminómetro (Tecan Infinite200) después de la adición de la mezcla de luciferina durante 90 min. La transfección fue exitosa y, en consecuencia, ADCC medible, si se obtuvieron valores de RLU > 1.000.

5. PCR cuantitativa en tiempo real (Q-PCR)

Para el aislamiento de ARN de líneas celulares de cáncer de páncreas, las células se sembraron en placas de 10 cm y se cultivaron durante 2-3 días hasta una confluencia del 80 %. El ARN se aisló de acuerdo con las instrucciones proporcionadas con el RNeasy® Mini Kit (Qiagen). La preparación del ADNc se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante proporcionadas con el SuperScript® III First Strand Kit (Invitrogen). Las muestras de ARN y ADNc se almacenaron a -80 °C.

El análisis cuantitativo de los transcritos de CLDN18.2 se realizó mediante la amplificación de ADNc cebados con oligo(dT) en una reacción de PCR de 40 ciclos usando los cebadores de PCR #5054s (5'-AGAGAGCTCTGGCTTCACCGAGTG-3') y #5060as (5'-CCAGAAGTTAGTCACCAGCATGTTGG-3') diferenciando entre las isoformas CLDN18.1 y CLDN18.2. La reacción se preparó con SYBR Green (QuantiTect SYBR Green PCR Kit, Qiagen), que se intercala en ADN de doble cadena. Las reacciones y mediciones se realizaron utilizando el instrumento y el software ABI-PRISM7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems).

Los niveles de expresión relativos de los transcritos de CLDN18 se calcularon utilizando el cálculo de AACT con respecto al gen de mantenimiento HPRT.

6. Análisis de transferencia Western

Para el aislamiento de proteínas de líneas celulares de cáncer de páncreas, las células se sembraron en placas de 10 cm y se cultivaron durante 2-3 días hasta una confluencia del 80 %. Las células se lisaron mediante la adición de 800 |jL de tampón de muestra SDS 4x (glicina al 34 %, Tris 250 mM pH 6.8, p-mercaptoetanol al 5 %, SDS al 8.2 %). Para desintegrar el ADN genómico, las muestras de proteínas se sonicaron en las siguientes condiciones: Control de salida: nivel 1, ciclo de trabajo: 70 % durante 20-25 seg. La concentración de proteína se midió en un espectrofotómetro (absorción a 280 nm) y las muestras se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Para detectar la expresión de CLDN18.2 en transferencias Western, se preparó un gel de poliacrilamida al 12.5 % para la separación (para 2 geles pequeños 4.1 mL, acrilamida/bis-acrilamida 29:1, 100 jL de SDS al 10 %, 2.5 mL de Tris pH 8.8, 3.2 mL de H2O, 100 jL de APS, 10 jL de TEMED) entre dos placas de vidrio fijas. Después de la polimerización, el gel se cubrió con un gel de acumulación (1.5 mL de acrilamida/bisacrilamida 29:1, 100 jL de SDS al 10 %, 2.5 mL de Tris pH 6.8, 5.8 mL de H2O, 100 jL de APS, 10 jL de TEMED) y se colocó un peine de gel entre las placas de vidrio. Después de la polimerización, el gel se cargó con 75 jg de cada muestra de proteína preparada mediante la adición de tampón de muestra de SDS 4x (1:20) (Tris-HCL 250 mM, glicerina al 34 %, SDS al 8.2 %, pH 6.8) y 7.5 jL de un mezcla de marcador de tamaño (1.,5 jL de Magic Mark XP Western Standard mezclado con 6 jL de SeaBlue Plus2 Prestained Standard). Los geles se corrieron en tampón de proceso de SDS 1x (Tris 25 mM, glicina 0.192 M, SDS al 0.1 %) a 80 V durante 30 min y 180 V durante 60 min. Se realizó una transferencia semiseca del gel sobre una membrana de nitrocelulosa durante 90 min a 160 mA en tampón de transferencia 1x (Tris 25 mM, glicina 0.192 mM, MeOH al 20 %). Las transferencias se bloquearon primero en leche en polvo al 5 %/PBS y se añadieron anticuerpos primarios (0.25 jg/m L de anti-Claudinl8 (terminal C) o 0.1 jg/m L de anti-p-actina) en una solución de leche en polvo al 1 %/PBS. Las transferencias se incubaron durante la noche a 4 °C, se lavaron 3 veces durante 10 min en PBS 1x/Tween20 al 0.05 % y luego se incubaron durante 1 h con anticuerpos secundarios marcados a temperatura ambiente en leche en polvo al 1 %/PBS (IgG de cabra anticonejo (FC) diluido 1:1000). Las transferencias se lavaron nuevamente 3 veces durante 10 minutos en PBS 1x/Tween20 al 0.05 % y la detección se realizó mediante la adición de 1 a 3 mL de solución de detección (Pico and Dura Detection System (Pierce)) durante 1 minuto y el escaneo de las transferencias en un caja de detección LAS-3000 (Incremento: 10 segundos, tiempo de intervalo: 10 segundos, Sensibilidad: alta) de acuerdo con GA_056_chemolumineszenzentwickler LAS3000.

7. Citometría de flujo (FACS)

Las células se recogieron con PBS/EDTA 5 mM o tripsina/EDTA de un cultivo en crecimiento exponencial con una confluencia del 70-85 %. Se contaron las células, se centrifugaron durante 5 min (468 g) y el sedimento se resuspendió en tampón FACS (FCS al 2 %, azida sódica al 0.1 % en PBS) ajustando la concentración a 2x106/mL. Se sembraron 100 jL de células en placas de 96 pocillos de fondo redondo y se centrifugaron de nuevo (5 min, 468 g). IMAB362 (o Rituximab de control de isotipo) se diluyó en serie de 0.1 -200 jg/m L (11 etapas de dilución sin control de anticuerpo) en 50 jL de tampón FACS y se añadió a las células durante 30 min a 4 °C. A continuación, se añadieron 200 jL de tampón FACS a cada pocillo y las placas se centrifugaron (5 min, 468 g). Se eliminó el sobrenadante y se repitió el lavado. Se diluyeron (1:100) anticuerpos antihumanos de cabra secundarios (específicos de FC, F(ab')2 conjugados con APC (Dianova)) en tampón FACS y se añadieron 30 jL a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 30 min a 4 °C. Después de la incubación, las placas se lavaron de nuevo dos veces con 200 jL de tampón FACS y el sedimento finalmente se resuspendió en 100 jL de tampón FACS para medición en un FACS Array Bioanalyzer (BD) de acuerdo con GA_018_BD fAc S Array Bioanalyzer.

8. Transducción lentiviral

Construcción de vectores lentivirales: Los lentivirus pertenecen a los virus de ARN, que se integran de manera estable en el ADN genómico humano de células en división y que no se dividen. Se utilizó el vector pLenti6.4 (Invitrogen) como columna vertebral. Contiene un gen de blasticidina para la selección de células transducidas positivamente. CLDN18.2 fusionado con el promotor EF1a se clonó en la región de recombinación del vector que genera pL64B42E (EF1ahCLaudin18.2)-blasticidina (Figura 1).

Selección de líneas celulares: Las líneas celulares se seleccionaron de acuerdo con los datos de la literatura o, que se probaron previamente in vivo. Los criterios de selección incluyeron crecimiento subcutáneo homogéneo en ratones desnudos y una ventana terapéutica de 20 - 100 días. Se integraron tres líneas celulares (DANG, YAPC y BxPC3) que ya mostraban expresión débil de ARNm de CLDN18.2 y tres (MiaPaCa-2, Patu8902 y Suit-2) que son capaces de hacer metástasis de acuerdo con la literatura. Otras dos líneas celulares (que se sabe que crecen como tumores subcutáneos homogéneos in vivo) fueron seleccionados al azar (HPAC, CAPAN1).

Determinación de las condiciones de selección de blasticidina: Para todas las líneas celulares, la concentración de blasticidina requerida para la selección de células después de la transducción lentiviral se determinó antes de realizar la transducción. Las células de cáncer de páncreas se sembraron en placas de 6 pocillos a alta densidad, dando como resultado una confluencia del 80-90 % después de 24 horas. Se añadió blasticidina (Patrón: 10 mg/mL, Invitrogen) a los pocillos en concentraciones crecientes que oscilan entre 0.5 y 12 jg/m L (5 etapas de dilución sin control de blasticidina). El medio se cambió cada 3-4 días y las células se analizaron en un microscopio antes de retirar el medio. Se documentó la cantidad de células muertas y el estado de las células vivas. Las células se cultivaron durante 14 días. Se prefirió la concentración más baja de blasticidina que provocaba el 100 % de células apoptóticas después de 14 días para la selección de células transducidas lentiviralmente. Las concentraciones de blasticidina requeridas para cada una de las líneas celulares LVT establecidas se indican en la Tabla 4.

Selección de la envoltura: Para la transducción lentiviral, el vector de control lentiviral GFP pL64B42E-(EF1a-GFP)-blasticidina se empaquetó en diferentes partículas de envoltura (VSV-G, GALV, RD114, Mokola-G y Rabia-G). Dependiendo de las proteínas presentes en la envoltura y de la composición de la membrana celular, la unión a las células cancerosas diana es más o menos eficaz. Para todas las líneas celulares de cáncer de páncreas, la envoltura de VSV-G mostró la mayor eficiencia de transducción (68.5 - 91.2 %) (Tabla 5). En consecuencia, el vector pL64B42E de expresión de CLDN18.2 (EF1a-hCLaudin18.2)-blasticidina se empacó en envolturas de VSV-G. Las células productoras se infectaron y los virus se aislaron del medio a títulos altos (3.86 * 107 partículas/mL). Los sobrenadantes virales se almacenaron a -80 °C.

Tabla 5: Generación de líneas celulares de cáncer de páncreas que sobreexpresan CLDN18.2 mediante transducción lentiviral

Transducción lentiviral de líneas celulares de cáncer de páncreas: Para la infección de las líneas celulares diana del cáncer de páncreas, se recubrió una placa de 24 pocillos con 200 pL de retronectina® 1x (20 pg/mL, Takara Inc.) y la placa se selló con Parafilm® y se incubó durante 3-16 horas a 4 °C. Las placas se lavaron con 200 mL de PBS y se bloquearon con PBS/BSA al 2 % durante 30 min a temperatura ambiente. Las placas se lavaron nuevamente y se cargaron con 300 pL de sobrenadante viral mediante centrifugación durante 25 min a 2500 rpm a 15 °C. Se eliminó el sobrenadante y se repitió la carga 3 veces. Finalmente, las placas se lavaron una vez con PBS y se sembraron en cada pocillo células diana de pocos pases. Para todas las líneas celulares de cáncer de páncreas, se sembraron 5*105 - 1*107 células en 24 pocillos. Las placas se incubaron durante 2 días a 37 °C. Posteriormente, las células se separaron y la eficiencia de transducción se determinó mediante FACS usando un anticuerpo IMAB362 marcado con FITC. Se expandieron las células y se preparó un banco de células maestras para cada línea celular.

9. Ensayo de ADCC

Las células diana del cáncer de páncreas se sembraron dos días antes en matraces para obtener cultivos confluentes al 80-90 % el día que comenzó la ADCC. Las células de cáncer de páncreas se transfectaron con ARN de luciferasa y se sembraron en placas blancas de 96 pocillos a una densidad de 1 * 104 células por pocillo en 50 pL de medio de ensayo (medio de cultivo como se describe en la Tabla 4 con HEPES 20 mM). Se sembraron además células NUGC-4 sub 10cH11 subE10 Luci#2 (8000 células/pocillo) como controles positivos en todos los ensayos. Las células se cultivaron durante 4-6 h antes de la adición del anticuerpo y las PBMC purificadas.

Las PBMC se prepararon a partir de una capa leucocítica humana fresca obtenida de donantes sanos. Se diluyeron aproximadamente 20-25 mL 3x (1:2) con PBS y se colocaron cuidadosamente en capas sobre 15 mL 4x de Ficol-Paque Plus (GE Healthcare) en tubos Falcon de 50 mL. Los gradientes se centrifugaron (25 min, 700 g). Después de la centrifugación, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se recolectaron de la interfase, se lavaron en PBS/EDTA 2 mM, se centrifugaron (5 min, 468 g), se resuspendieron nuevamente en PBS/EDTA 2 mM y se centrifugaron (10 min, 208 g) para eliminar las plaquetas. Los sedimentos se resuspendieron en 50 mL de PBS/EDTA mM y se contaron las células. Las PBMC se centrifugaron (5 min, 468 g) y se resuspendieron en medio de cultivo X-Vivo-15 a una concentración de 1.6 * 107 células/mL para la adición a las células del páncreas y 1.28 * 107 células/mL para la adición a las células NUGC-4 sub 10cH11 subE10 Luci#2.

Los anticuerpos (IMAB362 y el anticuerpo de control de isotipo ch78H11 1H6) se diluyeron en serie (4.5 veces) 10 veces dando como resultado un intervalo de concentración de 200 pg/mL - 0.26 ng/mL. De cada dilución, se añadieron 5 pL por cuadruplicado a las células diana. Se añadió PBS sin anticuerpos en el medio y en los pocillos de control de lisis. Posteriormente, se añadieron 25 pL de PBMC a cada pocillo (proporción E:T = 40:1) y las placas se incubaron durante 24 h ± 1 h a 37 °C, 5 % de CO2.

Al día siguiente, se añadieron 10 pL de solución de Tritón X100 al 8 %/PBS a los pocilios de control de lisis y 10 pL de PBS en todos los demás pocillos. Finalmente, se añadieron 50 pL de solución patrón de luciferina recién preparada (HEPES 160 mM, PBS 1x, 3,84 mg/mL de D-Luciferina (BD Biosciences)) a cada pocillo y las placas se incubaron durante 80 min a temperatura ambiente en la oscuridad. La luminiscencia resultante de la oxidación del amarillo lucifer por la luciferasa de células viables se midió utilizando un lector de microplacas (Infinite200, Tecan, Suiza). El porcentaje de citotoxicidad celular se calculó utilizando la siguiente fórmula:

Muerte específica (%) _ 100 -[(RLUmuestra - RLUtriton)/(RLUcontrol del medio - RLUtriton) x 10°]

10. CDC

La CDC se realizó de la siguiente manera.

Se sembraron células diana (CHO-K1 p740 MACS/FACS (24H5) p3151 Luci#2A5) en 50 pL de medio de ensayo en placas de ensayo blancas de 96 pocillos (10,000 células/pocillo) y se cultivaron durante 24 h 20 min a 37 °C, 7.5 % CO2 y 95 % de humedad relativa antes de la adición de las muestras. Cada placa de ensayo de 96 pocillos comprendía un número total de 3 controles negativos diferentes (suero inactivado por calor, suero con y sin IMAB362 y suero con un anticuerpo de control de isotipo (Rituximab)) y un control positivo de reunión de suero humano sano (lote n.° 31032011) con 500 ng/mL de IMAB362. Se generó un control positivo adicional al final de la reacción mediante la adición de Triton X100 al 0.8 % a un segundo pocillo de control del medio que provocó la lisis total. Una de las placas de ensayo de 96 pocillos comprendía un control positivo funcional generado por 7 diluciones seriadas de 3.16 veces de IMAB362 (10,000 - 31.8 ng/mL). Este control dio como resultado una lisis sigmoidea dependiente de la dosis de las células diana. Todas las muestras se prepararon (200 pL cada una) al mismo tiempo en una placa de dilución de pocillos profundos de 96 pocillos. Se tomaron muestras 3 veces de cada pocillo mediante pipeteo inverso para generar los triplicados en las placas de ensayo. Después de añadir 50 pL de cada elemento de prueba y de control a las placas de ensayo, las placas se incubaron durante 80 5 min a 37 °C, 7.5 % de CO2 y 95 % de humedad relativa.

A cada pocillo se añadieron 10 pL de PBS, excepto en los pocillos de control de lisis con Triton. A cada pocillo de control de lisis con Triton, se le añadió una solución de 10 pL Triton al 0.8 %/PBS. Se preparó una solución de sustrato de luciferina (6,114 pL de agua bidestilada, 2,496 pL de HEPES (1M), 1,998 pL de DPBS 1x, 4,992 pL de solución patrón de D-luciferina (12 mg/mL)). A cada pocillo se le añadió una solución de 50 pL de sustrato de luciferina. Las placas se incubaron a 37 °C, 7.5 % de CO2 y 95 % de humedad relativa durante 45 min. Las placas se medirán en un lector de microplacas.

• La lisis dependiente del complemento se calculó mediante la fórmula:

Lisis específica ( %) = 100 - [(RLUmuestra - RLUtriton)/(RLUHSCM - RLUtriton) x 100)]

Modificaciones para probar las líneas celulares de cáncer de páncreas:

• Las células de cáncer de páncreas se transfectaron con ARN de luciferasa utilizando condiciones optimizadas.

Para cada línea celular analizada, se sembraron 1.5 x 104 células por pocillo.

• Dado que la mayoría de las líneas celulares de cáncer de páncreas son difíciles de separar y singularizar, se usó tripsina el día 1.

• Las células de cáncer de páncreas en placas de ensayo se cultivaron a 37 °C, 5 % de CO2.

• Los ensayos de CDC con células pretratadas con agentes quimioterapéuticos se realizaron con las siguientes concentraciones de anticuerpo IMAB362 o como anticuerpo de control de isotipo ch78H11 1H6: 640000, 160000, 40000, 10000, 2500, 625, 156 y 39 ng/mL.

11. Inhibición de la proliferación

Para analizar las curvas de respuesta a la dosis de cada agente quimioterapéutico, se realizó un ensayo de proliferación.

Tabla 6: Líneas celulares de cáncer de páncreas para analizar la eficacia de emcitabina u oxaliplatino

Las células se sembraron en placas de 96 pocilios y después de 4-6 horas se añadió gemcitabina u oxaliplatino en las siguientes concentraciones: 1000, 500, 250, 100 y 20 ng/mL. El ensayo de proliferación se incubó durante 4 días a 37 °C y 5 % de CO2. Se añadieron 50 pL de reactivo completo de XTT (50 partes de XTT mezcladas con 1 parte de reactivo de acoplamiento) y se incubaron a 37 °C. La medida de la absorbancia (células más sobrenadante) se realizó con el Tecan Safire a las 3 h y 4 h. La inhibición de la proliferación se calculó en comparación con valores medios establecidos como 100 %. Los valores de EC50 de gemcitabina y oxaliplatino se calcularon en el programa GraphPad Prism.

12. Cultivo de líneas celulares de cáncer de páncreas con fármacos quimioterapéuticos para ADCC o CDC

Para DANG se sembraron 4 a 6E+06, células y se cultivaron durante 2 días en medio o medio 1 ng/mL de gemcitabina o 1 ng/mL de gemcitabina 10 ng/mL de oxaliplatino. Se sembraron 1-1.4E+07 Patu8988S y cultivaron sin o con 10 ng/mL de gemcitabina o 10 ng/mL de gemcitabina en combinación con oxaliplatino 100 ng/mL.

El día que comenzó la ADCC, se siguió el protocolo descrito anteriormente y se determinó la expresión de CLDN18 en la superficie celular en análisis de FACS como se describió anteriormente.

13. Análisis del ciclo celular

Las células se sembraron en placas de seis pocillos y 5-6 horas más tarde se añadieron agentes quimioterapéuticos durante 24 h, 48 h o 3 días. Las células que flotaban en el medio se combinaron con la capa de células adherentes, que se tripsinizó. Se lavaron las células. El análisis del ciclo celular se inició directamente o la tinción de la superficie celular se realizó antes como se describió anteriormente. Las células se resuspenden en 1 mL de PBS y se añaden a 3 mL de PFA al 4 %. Después de 15 min de fijación de las células a temperatura ambiente, las células se sedimentan y se lavan. Para el tratamiento con ARNasa, las células se resuspendieron en 200 pL de ARNasa (10000 U/mL) más Triton X-100 al 0.05 % y se incubaron durante 30 min a 37 °C. Se añadió 1 mL de p Bs y las muestras se centrifugaron y resuspendieron en 200 pL de PBS/PJ 50 de pg/mL. Al menos 30 minutos después, las muestras estaban listas para ser analizadas por citometría de flujo. La distribución de fases del ciclo celular se determinó utilizando el software FlowJo para analizar los histogramas de contenido de ADN.

14. Ensayo de apoptosis

Después de los tratamientos indicados, se midió la apoptosis mediante la unión de anexina V (kit de detección I) o mediante un ensayo de fragmentación de ADN (Apo-Direct) de acuerdo con lo recomendado por el fabricante (PharMingen, San Diego, CA). Brevemente, las células que flotaban en el sobrenadante se combinaron con la fracción adherente, que se tripsinizó y luego se lavó. Se incubó una alícuota de 5E+05 células con anexina V-APC y PI durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Las células se analizaron inmediatamente por citometría de flujo. Las células viables excluyen tanto la anexina V-APC como la PI. Las células apoptóticas tempranas son positivas para anexina V-APC y negativas para PI, mientras que las células que ya no son viables debido a la muerte celular apoptótica o necrótica se tiñen positivamente tanto con anexina V como con PI. El porcentaje de células teñidas en cada cuadrante se cuantificó utilizando el software FlowJo (BD Biosciences, Franklin Lakes, Nj).

El ensayo apoptótico basado en la fragmentación del ADN se realizó como sigue. Las células tratadas (adherentes y flotantes) se fijaron en EtOH helado al 70 % durante la noche. Después del lavado, se incubaron 106 células fijadas con la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y FITC-dUTP durante 90 min a 37 °C para marcar los rompimientos del ADN. Las células se enjuagaron, se incubaron en RNasa A/yoduro de propidio en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente para teñir el ADN total y luego se analizaron por citometría de flujo. Los dobletes y grupos de células se eliminaron del análisis mediante selección.

15. Estudios in vivo

Todos los experimentos in vivo se llevaron a cabo de conformidad con las normas nacionales y las pautas éticas para estudios con animales de experimentación.

15.1 Tratamiento de xenoinjertos

Se inocularon tumores de xenoinjerto mediante inyección subcutánea de células tumorales en 200 pL de PBS en los flancos de ratones hembras Hsd: Foxn1nu desnudos atímicos. Los ratones portadores de tumores se trataron con 0 pg, 200 pg, 400 pg u 800 pg de anticuerpo inyectados iv semanalmente o alternando iv/ip dos veces por semana. Los agentes quimioterapéuticos se aplicaron ip semanalmente o dos veces por semana. Los tamaños de los tumores y la salud de los animales se monitorearon dos veces por semana. Al final del tratamiento de quimioterapia, se continuaron las aplicaciones de anticuerpos hasta que los tumores alcanzaron un volumen de >1400 mm3 o hasta que los tumores se volvieron ulcerosos. Las muestras tumorales se crioconservaron o se fijaron en formalina al 4 % para su posterior análisis.

15.2 Ensayo de metástasis

En primer lugar, se analizaron diferentes líneas celulares de cáncer de páncreas en cuanto a su capacidad para formar metástasis después de la aplicación iv de las células en ratones desnudos. Para estos análisis de injerto, se inyectó un grupo de 5-10 ratones con 1*10® y/o 2*10® células y los ratones individuales se sacrificaron en diferentes puntos de tiempo para encontrar el momento de injerto y crecimiento de metástasis.

Los tratamientos de metástasis se realizaron con 10-12 ratones Hsd: Foxn1nu desnudos atímicos por grupo de tratamiento. Fueron inyectados con 2*10® células (Patu8988S o Suit2-LVT) por vía intravenosa. Todos los ratones se sacrificaron en el mismo momento, tan pronto como aparecieron los primeros síntomas de la enfermedad de metástasis (pérdida de peso, debilidad, dificultad para respirar) o murió el primer ratón.

Preparación del tejido: Para los estudios de injerto, los ratones se sacrificaron en diferentes momentos, o tan pronto como los ratones mostraron signos fisiológicos claros de enfermedad metastásica (pérdida de peso, debilidad, dificultad para respirar). Todos sus órganos fueron analizados macroscópicamente en busca de metástasis. Solo para las células Patu8988S y Suit-2, los pulmones y los pulmones/hígados mostraron metástasis visibles macroscópicamente, respectivamente. Estos órganos se diseccionaron en 4 partes iguales, dos (pulmón: lóbulo superior derecho e inferior izquierdo), que se almacenaron para el aislamiento del ADN genómico. Las otras dos partes se fijaron con formalina y se almacenaron para el análisis de IHC (Figura 2).

Preparación de ADN genómico y estrategia de Q-PCR: El ADN genómico se extrajo de tejido pulmonar o hepático. Como controles, también se aisló ADN genómico de células de cáncer de páncreas humano Patu8988S, así como de un ratón de control negativo no inyectado.

La estrategia de Q-PCR se basa en la amplificación del ADN humano presente en las metástasis. El nivel relativo de detección de ADN humano en la muestra de pulmón de ratón se correlaciona directamente con la cantidad y/o el tamaño de las metástasis. Dado que este método está sesgado por el hecho de que las metástasis no se propagan uniformemente en el pulmón y, a veces, un lóbulo se ve más afectado que el otro, se mezclaron dos regiones diferentes de los pulmones en una preparación de ADN (Figura 2).

La reacción de Q-PCR se realizó con el par de cebadores #58®1 5'-GGGATAATTTCAGCTGACTAAACAG-3' y #58®2 5'-TTCCGTTTAGTTAGGTGCAGTTATC-3' que amplifican específicamente el ADN satélite alfa presente en el cromosoma 17 humano, pero no en el ADN de ratón. Para generar una curva estándar y como control positivo, se mezcló ADN de Patu8988S con ADN de ratón y se prepararon diluciones de 5 veces, lo que resultó en 100 %, 20 %, 4 %, 0.8 %, 0.1® %, 0.032 % y 0.0064 % de A ^dN humano en el ADN de ratón. La curva se usó para calcular (regresión lineal) la cantidad de ADN de metástasis humana presente en tejido pulmonar de ratón. Las reacciones de Q-PCR se realizaron en un volumen final de 50 pL compuesto por 20 pL (200 ng) de ADN de pulmón de ratón, 25 pL de Sybr Green (Qiagen), 1.® pL de cebador sentido (10 pM) y 1.® pL de cebador antisentido y 1.8 pL de H2O

Ejemplo 2: Expresión de CLDN18.2 en tejidos de páncreas humanos normales y neoplásicos

Para analizar el nivel de expresión y el patrón de CLDN18.2 en tejidos tumorales pancreáticos y normales, se llevó a cabo la tinción histológica de secciones de FFPE con dos reactivos de anticuerpos monoclonales murinos (Figura 3).

Se realizaron experimentos piloto exploratorios utilizando el anticuerpo prototipo 35-22A en microarreglos de tejido (TMA). Una desventaja importante de los TMA es la calidad variable de los tejidos manchados y el tamaño pequeño y, por lo tanto, el carácter no representativo de las muestras. Esto, junto con el protocolo de tinción no completamente optimizado, puede haber resultado en una subestimación de los casos positivos.

Los principales experimentos se realizaron con el anticuerpo 43-14A. Estas tinciones se realizaron en secciones de tejido, que (en comparación con los TMA) eran más grandes y se evaluaron previamente para detectar la presencia de células tumorales.

Las lesiones precancerosas, cuyo origen se encuentra en los conductos del páncreas, pueden clasificarse de acuerdo con el sistema internacional de neoplasias intraepiteliales del páncreas (PanlN) (PanlN subtipo 1A, 1B, 2, 3).

Las lesiones de PanIN-1 (Figura 4A) son planas, compuestas por células columnares altas con núcleos ubicados en la base y abundante mucina supranuclear. Los núcleos son pequeños y de forma redondeada a ovalada y están orientados perpendicularmente a la membrana basal. Existe superposición histológica entre lesiones hiperplásicas planas no neoplásicas y lesiones neoplásicas planas sin atipia.

Las lesiones del subtipo PanIN-1B tienen una arquitectura papilar, micropapilar o seudoestratificada basalmente y, por lo demás, son idénticas a PanIN-1A (Hruban et al., Am J Surg Pathol., mayo 2001; 25(5): 579-86).

Las lesiones PanIN-2 (Figura 4B) son planas o papilares, tienen anomalías nucleares típicas, que incluyen cierta pérdida de polaridad, apiñamiento nuclear, núcleos agrandados, pseudoestratificación e hipercromatismo. Las mitosis son raras, pero cuando están presentes no son luminales (no apicales) ni atípicas (Hruban et al. Am J Surg Pathol. mayo de 2001; 25(5):579-86).

Las lesiones PanIN-3 (Figura 4C) suelen ser papilares o micropapilares, sin embargo, rara vez pueden ser planas. La verdadera formación de cribas, el brote de pequeños grupos de células epiteliales en el lumen y la necrosis luminal sugieren el diagnóstico de PanIN-3. Las lesiones se caracterizan por una pérdida de polaridad nuclear, células caliciformes distróficas (células caliciformes con núcleos orientados hacia el lumen y citoplasma mucinoso orientado hacia la membrana basal), mitosis que ocasionalmente pueden ser anormales, irregularidades nucleares y nucléolos prominentes (macro) (Hruban et al. Am J Surg Pathol., mayo 2001; 25(5): 579-86).

La expresión de CLDN18.2 en tejidos precancerosos se analizó con el anticuerpo 43-14A usando muestras de tejido de varias fuentes.

CLDN18.2 se detectó con frecuencia en estructuras PanIN de los subtipos PanIN-1, PanIN-2 y PanIN-3 demostrando una expresión temprana de CLDN18.2 en lesiones precancerosas (Figura 4), que se conserva en etapas posteriores. Por el contrario, no se observó expresión en muestras de tejido de páncreas normales, incluidas las estructuras ductales del páncreas.

En conclusión, CLDN18.2 es un marcador temprano del comienzo de cambios histológicos malignos en los conductos pancreáticos.

Se realizaron dos estudios para evaluar la expresión de CLDN18.2 en el cáncer primario de páncreas. Para el estudio piloto, se tiñeron varios TMA con un total de 141 casos de cáncer primario de páncreas con el anticuerpo específico monoclonal CLDNA18.2 35-22A. La calidad general del TMA analizado no fue satisfactoria. Muchos puntos se perdieron parcialmente durante la recuperación y la contratinción no homogénea con hematoxilina sugirió un procesamiento de tejido subóptima de tejidos FFPE.

En general, > 48.9 % de los casos teñidos fueron positivos para CLDN18.2, incluido el 49.2 % (65/132) de adenocarcinomas ductales, el 50 % (1/2) de carcinoma de células acínicas y 3 de 7 carcinomas neuroendocrinos (Tabla 7). La membrana de la célula tumoral se tiñó sin antecedentes sobre otros tipos de células (Figura 6).

Además, observamos una correlación entre la intensidad de expresión de CLDN18:2 y la fracción de células tumorales teñidas dentro del tumor (Tabla 8, Figura 5).

Tabla 7: Estudio piloto: Número de casos positivos de CLDN18.2 divididos en los subtipos de cáncer de páncreas. Los tejidos se tiñeron utilizando el anticuerpo monoclonal murino 35-22A (0,2 pg/mL) y se revisaron en busca de células tumorales positivas para CLDN18.2.

Tabla 8: Estudio piloto: Correlación entre la intensidad de la señal de CLDN18.2 y la cantidad de células tumorales positivas para los tumores primarios de páncreas analizados. Porcentaje de casos positivos de tumor primario correlacionados con la intensidad de la tinción. Los casos se agruparon en seis fracciones en función de la cantidad de células tumorales positivas para una meor visualización.

Tabla 9: Estudio piloto: Clasificación de los casos de tumores positivos para CLDN18.2. La clasificación de las células tumorales describe la apariencia celular y el nivel de diferenciación celular. Donde el grado 1 describe células bien diferenciadas; rado 2 células moderadamente diferenciadas rado 3 poco diferenciadas.

Se realizó un segundo estudio con un protocolo de tinción optimizado con el anticuerpo altamente sensible 43-14A utilizando secciones de tejido de calidad controlada.

Tabla 10: Estudio principal - número de casos positivos para CLDN18.2 agrupados en subtipos de cáncer de páncreas. Los tejidos se tiñeron usando el anticuerpo monoclonal murino 43-14A (0.2 pg/mL) y revisado para células tumorales ositivas ara CLDN18.2

Tabla A

Tabla B

En total, se analizaron 42 muestras de cáncer de páncreas ductal primario. Alrededor del 90 % (38 de 42 casos) de estos fueron positivos para CLDN18.2 (Tabla 10), la mayoría de los cuales (>60 %) mostraron una fuerte intensidad de señal de ++ (Figura 7, Tabla 11). También en este documento se observó una correlación entre el nivel de expresión de CLDN18.2 y la fracción de células tumorales positivas. La mayoría de los casos analizados (62 %) fueron tumores de grado 3 (tabla 12).

Tabla 11: Estudio principal: Correlación entre la intensidad de la señal de CLDN18.2 y la cantidad de células tumorales positivas para los tumores primarios de páncreas analizados. Porcentaje de casos positivos de tumor primario correlacionados con la intensidad de la tinción. Los casos se agruparon en seis fracciones en función de la cantidad de células tumorales positivas para una meor visualización.

Tabla 12: Estudio principal - Clasificación de los casos de tumores positivos para CLDN18.2. Para la mayoría de los casos tumorales analizados se dispuso de una clasificación realizada por el patólogo correspondiente. La clasificación de las células tumorales mide la apariencia celular y el nivel de diferenciación celular. Donde el grado 1 describe células bien diferenciadas; rado 2 células moderadamente diferenciadas rado 3 pobremente diferenciadas.

El cáncer de páncreas se diagnostica en la mayoría de los pacientes en un estadio avanzado. Los tumores de los pacientes ya han hecho metástasis en los ganglios linfáticos y otros órganos, en particular en el hígado. En el estudio principal, se analizaron 79 muestras de tejido FFPE de ganglios linfáticos y metástasis en hígado de cáncer de páncreas en un ensayo inmunohistoquímico, utilizando el anticuerpo 43-14A específico de CLDN18.2. El 70.5 % de las metástasis en los ganglios linfáticos (31/44 casos) y el 68.6 % de las metástasis en el hígado a distancia (24/35 casos) demostraron una tinción de células tumorales claras para CLDN18.2 (Tabla 13). El patrón de tinción de las células tumorales positivas fue membranoso, en algunos casos con señales citoplasmáticas más débiles adicionales (Figura 9). De acuerdo con los resultados del análisis del tumor primario, se encontró una correlación entre el nivel de expresión de CLDN18.2 y la fracción de células tumorales positivas para CLDN18.2 en las muestras metastásicas (Figura 8).

No se encontró correlación entre la clasificación de los tumores analizados y el nivel de expresión de CLDN18.2 o la fracción de células tumorales positivas.

Tabla 13: Número de casos de metástasis positivas para CLDN18.2 agrupados por órgano diana. Los tejidos se tiñeron utilizando el anticuerpo monoclonal murino 43-14A (0.2 pg/mL) y se revisaron en busca de células tumorales positivas para CLDN18.2.

Para probar si la expresión de CLDN18.2 de casos de tumor primario positivo se conserva en metástasis del mismo paciente, se seleccionaron dobletes de metástasis de ganglios linfáticos/cáncer primario emparejados utilizando el anticuerpo 43-14A.

Tabla 14: Expresión de CLDN18.2 en muestras de tumores metastásicos de ganglios linfáticos y primarios de páncreas emparejados - Se analizaron muestras emparejadas de adenocarcinoma primario y metástasis de ganglios linfáticos LN para determinar la expresión de CLDN18.2 en células tumorales.

En 25 (92.5 %) de los 27 casos emparejados analizados, tanto el tumor primario como los ganglios linfáticos fueron positivos para CLDN18.2. En un solo caso ambos tejidos fueron negativos y en otro caso el tumor primario fue positivo para CLDN18.2, mientras que la metástasis fue negativa.

En 21 de 26 (80.7 %) dobletes analizados positivos, la intensidad de la señal del tumor primario y las células tumorales metastásicas fue idéntica. En 5 casos la intensidad de la señal disminuyó de ++ a +. En 11 de 25 (44 %) tejidos emparejados, el número de células tumorales positivas fue menor en las metástasis en comparación con el tumor primario (Tabla 14).

En resumen, la expresión de CLDN18.2 parece conservarse cuando las células tumorales primarias avanzan a la etapa metastásica. La intensidad global y la fracción de células tumorales positivas en las metástasis de los ganglios linfáticos fue sólo ligeramente inferior en comparación con el tumor primario (Figura 10).

Para un pequeño número de pacientes, se disponía de muestras de tejido derivadas del tumor primario, la metástasis en los ganglios linfáticos y la metástasis en el hígado. Estos tripletes coincidentes se tiñeron para probar la conservación de la expresión de CLDN18.2 en metástasis a distancia. Se analizaron seis tripletes emparejados con el anticuerpo 43-14A.

Tabla 15: Expresión de CLDN18.2 en muestras de tumores primarios y metastásicos de páncreas emparejados - Se analizaron muestras emparejadas de adenocarcinoma primario, metástasis en hígado y metástasis en ganglios linfáticos (LN) para determinar la expresión de CLDN18.2 en células tumorales.

En 3 de 6 tripletes, las muestras de los tres tejidos fueron comparables con respecto a su puntuación de positividad para CLDN18.2 (Figura 11). En tres casos, una fracción de las células tumorales fue positiva para CLDN18.2 en la lesión primaria, mientras que las lesiones metastásicas no mostraron tinción de CLDN18.2 (Tabla 15).

Ejemplo 3: Expresión diana en líneas celulares de cáncer de páncreas humano utilizadas para modelos in vitro e in vivo y modelos de cáncer de páncreas

Fuente de líneas celulares

Un objetivo principal de este estudio de evaluación preclínica fue analizar los efectos inhibitorios del tratamiento con IMAB362 en sistemas modelo adecuados. Para identificar líneas celulares positivas para CLDN18.2 que se pueden usar para caracterización in vitro e in vivo de los efectos de IMAB362, se seleccionó un conjunto de 26 líneas celulares de cáncer de páncreas comercialmente disponibles para determinar la expresión de CLDN18.2 y se caracterizó en detalle. Inmediatamente después de la llegada se preparó un banco de células para uso experimental para cada una de las líneas celulares. Se derivaron de adenocarcinomas pancreáticos primarios (10 de los cuales 6 eran adenocarcinomas mucinosos), carcinomas primarios (4), metástasis de adenocarcinomas pancreáticos en el hígado (5) o de bazo (1), o aislados de ascitis (5) (véase la Tabla 16). Varias de estas líneas celulares (8) se transdujeron lentiviralmente para expresar CLDN18.2.

Expresión del transcrito de CLDN18.2 en líneas celulares de cáncer de páncreas humano

Para identificar las líneas celulares de páncreas que expresan CLDN18.2, los niveles de transcriptos se determinaron con PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) utilizando un cebador directo que se une al exón 1 de CLDN18.2 y un cebador inverso que se une al exón 3 de CLDN18. La línea celular de carcinoma gástrico humano KATO-III que expresa endógenamente CLDN18.2 y la línea celular de cáncer de mama negativa para CLDN18.2 SKBR-3 se incluyeron como controles positivo y negativo, respectivamente. La RT-PCR reveló una clara expresión endógena de CLDN18.2 en las líneas celulares de cáncer de páncreas DANG, Panc03.27, Panc05.04, Patu8988S y YAPC con niveles relativos superiores a 1*105. Curiosamente, las células Patu8988S mostraron niveles de expresión de CLDN18.2 (~1*108) comparables a las células estomacales CA KATO-III (Figura 12A). En conclusión, detectamos una expresión robusta de CLDN18.2 en 5 de las 22 líneas celulares de cáncer de páncreas.

Además de las líneas celulares endógenas, las líneas celulares LVT que expresan ectópicamente CLDN18.2 se analizaron a nivel del transcrito (Figura 12A). Para 6 de 8 líneas celulares lVt , niveles de expresión relativos de CLDN18.2 de más de 1 * 108 fueron detectados. Solo en células HAPC-LVT y Suit2-LVT, el nivel de expresión fue superior a 1 * 105

Investigamos si la expresión de CLDN18.2 es estable durante el cultivo in vitro. Las células Patu8988S, Panc05.04 y las líneas celulares Suit2-LVT, MiaPaCa2-LVT y Patu8902-LVT transducidas lentiviralmente se pasaron hasta 15 veces y se analizó el transcrito CLDN18.2 (Figura 12B-D). Observamos la pérdida de expresión de CLDN18.2 tanto en células endógenas como transducidas con un mayor número de pases. La pérdida de expresión fue máxima en las células transducidas. Por lo tanto, se usaron pases tempranos, siempre que fue posible para los experimentos in vitro y la expresión de CLDN18.2 en xenoinjertos tumorales se verificó en los siguientes experimentos de injerto.

Expresión de la proteína CLDN18.2 en líneas celulares de cáncer de páncreas humano

Detección de CLDN18.2 en lisados celulares totales

Además de los análisis de los transcritos, se analizó la expresión de CLDN18.2 a nivel de proteína mediante transferencia Western e IF. Para el análisis de transferencia Western, los lisados celulares de las 26 líneas celulares de cáncer de páncreas se investigaron mediante transferencia Western (WB) usando el anticuerpo específico CLDN18 anti-Claudinl8 (terminal C). Los lisados de células SKBR-3 se utilizaron de nuevo como control negativo, mientras que los lisados de células HEK293 transfectadas de forma estable con CLDN18.2 (HEK293-p740) se utilizaron como control positivo. En este documento, detectamos una alta expresión de proteínas en las células Patu8988S, DANG y Panc05.04, lo que confirma los datos de ARN. Se detectaron bandas débiles en los lisados de células Panc03.27 y BxPC3. Las células YAPC, que se identificaron como positivas a nivel de ARN, mostraron una banda tenue de menor tamaño en las transferencias Western. Todas las demás líneas celulares fueron negativas (Figura 13).

Expresión celular de CLDN18 en células de cáncer de páncreas

Para obtener datos de expresión de proteínas de apoyo, las líneas celulares de carcinoma pancreático se investigaron mediante inmunofluorescencia (IF) después de la fijación y permeabilización de las células y utilizando el anticuerpo 35-22A para la detección. Los análisis de IF confirmaron los datos previos de ARN y proteínas que muestran que la mayoría de las líneas celulares de cáncer de páncreas son negativas para la tinción de CLDN18.2 (Figura 14). En algunas líneas celulares (como AsPCl, DANG, HUP-T3, HUP-T4, Panc01) se observaron puntos nucleares, que muy probablemente representan artefactos de tinción. Las células DANG, Panc03.27 y BxPC3 que se identificaron con CLDN18.2 bajo en el nivel de ARN y/o proteína, fueron negativas en el análisis de IF, que tiene una menor sensibilidad de detección. Por el contrario, las membranas y el citoplasma de las células de control de carcinoma gástrico Panc05.04, Patu8988S y KATO-III se tiñeron fuertemente positivas para CLDN18.2. La intensidad de la tinción fue diferente para cada célula y también se detectaron células negativas dentro de la población (Figura 14J y N). En las líneas celulares LVT encontramos una fuerte tinción de membrana en más del 80 % de todas las células.

Confirmación de la expresión de CLDN18.2 en células de cáncer de páncreas

Para confirmar la expresión de CLDN18.2 y evaluar la cantidad de esta diana en la superficie celular, las líneas celulares endógenas Panc05.04 y Patu8988S, así como las líneas celulares LVT, se tiñeron con IMAB362 usando un protocolo de tinción nativo. Aunque la tinción de las células de control de cáncer gástrico Patu8988S, Panc05.04 y KATO-III con IMAB362 fue menos intensa y el porcentaje de células positivas se redujo en comparación con las células teñidas con 35-22A (Figura 16A-F), el análisis de IF confirmó que CLDN18.2 se expresa en la superficie de las células de cáncer de páncreas. Para las 8 líneas celulares de cáncer de páncreas LVT que expresan ectópicamente CLDN18.2, se observó tinción de membrana transparente en casi todas las células (como se muestra para 6 líneas celulares LVT en la Figura 16G-L).

En conclusión, los análisis de expresión de CLDN18.2 dieron como resultado la identificación de líneas celulares de cáncer de páncreas de expresión endógena Panc05.04 y Patu8988S y las 8 líneas celulares transducidas lentiviralmente BxPC3-LVT, CAPAN1-LVT, DANG-LVT, MiaPaCa-2-LVT, Suit -2-LVT, Patu8902-LVT y YAPC-LVT como sistemas modelo adecuados de células positivas para CLDN18.2.

Desarrollo de modelos de metástasis y xenoinjertos de cáncer de páncreas

Estudios de injertos para la identificación de modelos tumorales adecuados de cáncer de páncreas subcutáneo

Se realizaron un total de 37 estudios de injerto con diferentes líneas celulares de cáncer de páncreas para identificar modelos de xenoinjerto subcutáneo adecuados para la prueba de eficacia in vivo de IMAB362. De todas las líneas celulares analizadas, las líneas celulares BxPC3-LVT, CAPAN1-LVT, MiaPaCa-2-LVT, HPAC-LVT, DANG-LVT y YAPC-LVT con expresión ectópica de CLDN18.2 se seleccionaron para modelos de xenoinjerto subcutáneo, mostrando altas tasas de injertos y crecimiento tumoral homogéneo. Además, se seleccionaron modelos de xenoinjertos subcutáneos con líneas celulares Patu8988S y DANG que expresan endógenamente CLDN18.2 para probar la eficacia de IMAB362 in vivo. La inyección sc de células Panc05.04 no dio como resultado la formación de tumores subcutáneos.

Tabla 17: Resumen de las condiciones de injerto probadas para el desarrollo de modelos de xenoinjerto s.c. para el cáncer de páncreas.

Estudios de injerto para la identificación de modelos adecuados de metástasis

Para estudiar los efectos de IMAB362 en la formación de metástasis, se establecieron modelos de cáncer metastásico en ratones desnudos. Las líneas celulares de cáncer de páncreas se analizaron en cuanto a su capacidad para hacer metástasis tras aplicación iv. Se inyectaron células CAPAN1-LVT, MiaPaCa-2, Patu8988S, Patu8902 y Suit-2 en las venas de la cola de ratones desnudos como lo describen Mohanty y Xu 2010. Para determinar el momento del injerto de metástasis y la tasa de crecimiento, los ratones se sacrificaron en diferentes puntos de tiempo (Tabla 18).

Tabla 18: Análisis de inerto de metástasis de líneas celulares de cáncer de páncreas

El análisis de injerto de células Patu8902 y CAPAN1-LVT no fue factible, ya que la mayoría de los ratones murieron casi de inmediato. En los pulmones e hígados de 5 ratones supervivientes desafiados con células CAPAN-LVT no se detectaron metástasis macroscópicamente visibles después de 72 días. Las inyecciones de células Suit-2 y MiaPaCa2, por el contrario, fueron bien toleradas. Los tejidos pulmonares de estos ratones se analizaron en análisis de IHC en diferentes momentos después de la inyección. En ratones desafiados con células MiaPaCa-2 no se detectaron metástasis en los pulmones después de hasta 73 días y, por lo tanto, esta línea celular no se seleccionó como modelo de tratamiento con IMAB362. Las células cancerosas Suit-2 hicieron metástasis en los pulmones de los ratones. Se detectaron múltiples focos en todo el tejido. Por lo tanto, la línea celular Suit-2-LVT transducida lentiviralmente con CLDN18.2 se seleccionó como un sistema modelo para analizar los efectos del tratamiento con IMAB362 en la formación de metástasis.

Además de Suit-2, también se analizó la capacidad de las células Patu8988S que expresan endógenamente CLDN18.2 para formar metástasis. Los controles de injerto se realizaron con 2 números de células diferentes (1 * 106, 2 * 106) inyectadas en forma iv por ratón. Los pulmones y los hígados se aislaron en diferentes puntos de tiempo como se indica en la Tabla 18. En primer lugar, los diferentes tejidos obtenidos se analizaron mediante Q-PCR. Los pulmones y los hígados obtenidos hasta el día 70 se analizaron mediante amplificación de ADN satélite a humano del cromosoma 17. Los resultados de los pulmones muestran un claro aumento en el porcentaje de ADN humano en los pulmones de los ratones a lo largo del tiempo, que no dependía del número de células inyectadas. Por aplicación iv de 1*106 o 2*106 células se pudieron detectar 5.8 % y 3.7 % de ADN humano después de 70 días, respectivamente (Figura 19). En los hígados, apenas se amplificó ADN humano. Después de 70 días, el porcentaje aumentó ligeramente, pero todavía por debajo del 0.005 %.

Para verificar la expresión de CLDN18.2 en la metástasis de Patu8988S, los tejidos pulmonares se tiñeron inmunohistoquímicamente utilizando anticuerpos anti-MHC de clase I humanos para la detección de células humanas en tejido de ratón, así como el anticuerpo anti-Claudinl8 (Mid). La tinción de MHC-I mostró que eran detectables focos de metástasis claros en secciones de tejido pulmonar de ratón, pero no en secciones de hígado (Figura 20). Además, las membranas de las células en estos focos se tiñeron con el anticuerpo anti-Claudinl8 (Mid) que muestra una expresión clara de la proteína diana IMAB362 en estas células. Por lo tanto, además del modelo Suit2-LVT, se seleccionó este modelo de metástasis endógena para la investigación del tratamiento con IMAB362.

Ejemplo 4: Efectos de muerte celular mediados por IMAB362

El entrecruzamiento con IMAB362 induce apoptosis eficiente

La unión de anticuerpos a un diana de la superficie celular puede iniciar una señalización aberrante que da como resultado directamente la muerte celular. Dichos eventos de señalización pueden depender del epítopo diana, la valencia de la unión y si la unión está asociada con el entrecruzamiento de la diana. Para varias líneas celulares de linfoma positivas para CD20, por ejemplo, la inducción de apoptosis por rituximab solo se observa en condiciones de entrecruzamiento. Tal entrecruzamiento puede tener lugar in vivo cuando las células inmunitarias positivas para el receptor Fc de alta afinidad interactúan con las células tumorales recubiertas de anticuerpos.

El entrecruzamiento de IMAB362 induce la apoptosis directa dentro de las 18 a 42 horas en células de cáncer gástrico humano NUGC-4 y KATO-III de acuerdo con lo medido por el ensayo TUNEL. La magnitud de la apoptosis se correlaciona con la dosis del anticuerpo y el nivel de expresión diana en la célula cancerosa. El tratamiento con gemcitabina conduce a la detención del ciclo celular de las células tumorales seguida de muerte celular apoptótica. La apoptosis de células tumorales de páncreas tratadas con gemcitabina se muestra en la Figura 21.

Actividad de ADCC mediada por IMAB362 contra células de cáncer de páncreas

IMAB362 es muy potente para reclutar y activar células efectoras inmunitarias positivas para el receptor Fcy, tal como las células asesinas naturales. La unión de IMAB362 a las células diana induce citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) por granzimas y perforinas secretadas por las células efectoras tras la unión de sus receptores Fcy al anticuerpo. El impacto de este mecanismo de acción se mostró previamente para células de CA de estómago positivas para luciferasa y CLDN18.2 (como NUGC-4 y KATO-III) mediante incubación con IMAB362 durante 24 horas en presencia de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) (relación de efector a diana = 40:1). La aplicación de hasta 200 pg/mL de IMAB362 dio como resultado tasas de lisis máximas del 80-100 %.

En el presente documento, determinamos la actividad de ADCC de IMAB362 contra líneas celulares de cáncer de páncreas. Se incubaron concentraciones crecientes de IMAB362 con las diferentes líneas celulares en una relación E:T de 40:1. Se agregaron PBMC de diferentes donantes en cada experimento. Los resultados de todas las líneas celulares se resumen en la Tabla 19. De las 5 líneas celulares de páncreas positivas para CLDN18.2 inicialmente identificadas, solo Patu8988S, Panc05.04 y DANG se eliminaron de manera eficiente mediante la adición de IMAB362 y PBMC (Figura 22A). Aunque la expresión superficial de CLDN18.2 no fue detectable en FACS para Panc05.04 y DANG, el nivel de expresión es lo suficientemente significativo como para causar la destrucción dependiente de células efectoras (EC50: Patu8988S: 0.01 - 1.4 pg/mL, DANG/Pan05.04: 0.1 - 38 pg/mL). A partir de estos datos se puede concluir que solo las células que expresan niveles relativos de ARN > 5.5*105 son lisadas eficientemente.

También se realizaron análisis de ADCC con líneas celulares de cáncer de páncreas LVT y sus correspondientes líneas celulares parentales (Figura 22B-F). La ADCC depende estrictamente de la unión específica de IMAB362 a la diana, ya que IMAB362 y PBMC solo destruyen las células diana positivas para CLDN18.2. La mitad de las tasas máximas de eliminación y de eliminación máxima inducidas en células de cáncer de páncreas humano por IMAB362 variaron entre donantes de PBMC y también dependieron del número de pases de las células que afectan el nivel de expresión de CLDN18.2

En la Figura 22G-H se muestran las concentraciones de IMAB362 que provocan la mitad de las tasas máximas de muerte de las células diana, así como las tasas máximas de muerte. Las líneas celulares de CA de páncreas LVT se eliminaron tras la adición de pequeñas cantidades de anticuerpo a altas tasas, mientras que para DANG y Panc05 se requieren concentraciones de anticuerpos más altas para alcanzar una tasa máxima de eliminación de ~50 %. Para Panc05.04, los resultados obtenidos con el subclón 15D3 (clon positivo para CLDN18.2 seleccionado por dilución limitada de Panc05.04 y FACS) se incluyen en la figura que muestra tasas de lisis de ADCC comparables con las líneas celulares LVT. Desafortunadamente, la expresión de CLDN18.2 en este clon se silencia rápidamente in vitro después de subcultivar las células y, por lo tanto, este clon no se usó para otros experimentos.

Actividad de CDC mediada por IMAB362 contra células de cáncer de páncreas

Las células de cáncer de páncreas, que se eliminaron con IMAB362 en los ensayos de ADCC, se analizaron en cuanto a su sensibilidad hacia la actividad lítica dependiente del complemento de IMAB362. Además, las líneas celulares LVT y las cepas parentales se analizaron en c Dc .

La actividad de CDC se activa por complejos de antígeno y anticuerpos IgM o IgG (vía clásica) o por superficies microbianas (vía alternativa). En la vía clásica, el complemento C5 se convierte en C5b. Las anafilatoxinas C3a, C4a y C5b se liberan y se forma un complejo de ataque a la membrana (MAC) por la unión secuencial de C5b, C7, C8 y C9. Esta vía es inhibida por proteínas solubles, pero también unidas a la membrana (por ejemplo, CR1, DAF, MCP, CD59, CD55, CD46) que protegen los tejidos propios.

Se usaron células CHO-K1 transfectadas de manera estable con CLDN18.2 (p740) y luciferasa como controles positivos de ensayo en cada ensayo (Figura 23A). Las líneas celulares DANG, BxPc3, YAPC, Patu8988S, Panc05.04, CAPAN1 y Suit2 no fueron lisadas por IMAB362 y la adición de un grupo de suero humano sano (Figura 23B). Aunque las células DANG, Patu8988S y Panc05.04 son positivas para CLDN18.2 como se muestra en todos los experimentos anteriores, estas células no se lisaron de manera dependiente del complemento. Lo más probable es que esto se deba al hecho de que las células neoplásicas sobreexpresan una o más proteínas inhibidoras del complemento unidas a la membrana (por ejemplo, CD46, CD55 y CD59) (Geis et al., Curr Cancer Drug Targets, 2010, 10: 922-931). Sin embargo, si la expresión de estas proteínas inhibidoras en las células tumorales afecta el resultado clínico de una terapia con anticuerpos, sigue siendo contradictorio. (Dzietczenia et al. Med. Oncol. 2010, 27: 743-6; Weng y Levy et al., Blood 2001 98:1352-7).

Además de las líneas celulares endógenas, todas las líneas celulares LVT se analizaron en ensayos de CDC. Como se muestra en la Figura 23, IMAB362 y la adición de suero a MiaPaCa-2-LVT, Suit2-LVT y CAPAN1-LVT dieron como resultado una lisis dependiente de la dosis con valores de EC50 que oscilan entre 0.3 y 2.6 pg/mL.

Descripción general de la expresión de CLDN18.2 en líneas celulares de cáncer de páncreas humano

Ejemplo 5: Eficacia de IMAB362 en modelos de xenoinjerto de cáncer de páncreas

Se eligieron 10 de los 41 modelos de xenoinjerto de cáncer de páncreas probados para investigar la eficacia de IMAB362 in vivo. Usando modelos de xenoinjerto pancreático con alta expresión de CLDN18.2, el tratamiento con IMAB362 mostró un alto efecto antitumoral. Esto se investigó mediante el tratamiento de ratones que portaban xenoinjertos BxPC3-LVT o MiaPaCa-2-LVT subcutáneos en el costado izquierdo. El tratamiento se inició 3 días después de la inoculación del tumor con inyecciones de 200 |jg de IMAB362 dos veces por semana. Los ratones tratados con IMAB362 mostraron un crecimiento tumoral significativamente inhibido en comparación con los ratones tratados con el control de solución salina. Además, la supresión del crecimiento tumoral de los ratones tratados con IMAB362 dio como resultado una mediana de supervivencia prolongada (Figura 24 y Figura 25). La eficacia de IMAB362 se correlaciona con la duración del tratamiento. El inicio del tratamiento con IMAB362 en puntos temporales tempranos tuvo un mayor efecto sobre la inhibición del crecimiento tumoral que el inicio tardío del tratamiento para examinar el efecto sobre los tumores establecidos. Además, el efecto antitumoral de IMAB362 dependía de la cantidad de expresión diana de CLDN18.2. La inhibición del crecimiento mediada por IMAB362 de tumores que expresan bajo CLDN18.2 como los xenoinjertos DANG y Patu8988S se redujo en comparación con la inhibición del crecimiento tumoral usando tumores de xenoinjerto que expresan alto CLDN18.2.

Ejemplo 6: Tratamiento de modelos de ratón con metástasis pancreática

Tabla 20: Resumen de tratamientos para probar la eficacia de IMAB362 en la metástasis del cáncer de páncreas

Modelo de metástasis con Suit2-LVT:

Los ratones fueron inyectados por vía intravenosa con 2 * 106 células Suit2-LVT y se trataron con 200 jg de IMAB362, anticuerpo de control de isotipo (IMAB027) o con PBS como se indica en la Tabla 20. Después de 35 días, murió el primer ratón (grupo de control de isotipo). En consecuencia, todos los ratones se sacrificaron el día 42 y se tomaron pulmones e hígados para análisis de IHC y Q-PCR.

El análisis por Q-PCR de ADN humano en los pulmones de ratones se repitió al menos dos veces por triplicado. El cálculo del porcentaje de ADN humano con los valores de Ct obtenidos reveló una disminución significativa (P<0.05) en las metástasis de Suit2-LVT detectadas en los pulmones, si los ratones se trataban con IMAB362 (Figura 26A) en comparación con tratamientos con PBS y control de isotipo. Para confirmar estos resultados, se prepararon secciones de tejido de las muestras de pulmón y se tiñeron usando anticuerpos MHC-I. La superficie de las células teñidas positivamente en las secciones de pulmón se calculó utilizando el programa ImageJ. Para el tratamiento con IMAB362 se observó una inhibición significativa (P<0.05) en comparación con el tratamiento con PBS, lo que confirma los resultados obtenidos con Q-PCR. Sin embargo, para el anticuerpo de control de isotipo, las diferencias no fueron significativas (Figura 26B). Lo más probable es que esta discrepancia se deba a diferencias en el procesamiento de los tejidos: el procesamiento IHC de secciones de tejido solo proporciona información sobre una sección muy pequeña del pulmón en comparación con el análisis por Q-PCr , para el cual el ADN genómico se extrae de la mitad del tejido.

Además del procesamiento del tejido, es posible que el resultado represente efectos inhibidores inesperados del anticuerpo de control de isotipo dirigido a CLDN6. Para investigar esta opción, se analizaron las células Suit2-LVT para la expresión de CLDN6 y la unión de IMAB027 en FACS. La adición de 200 jg/m L de IMAB362 a las células Suit2-LVT confirmó una fuerte unión a las células, mientras que la adición de 200 jg/m L de IMAB027 resultó en una unión débil del anticuerpo a estas células diana, lo que indica que CLDN6 realmente se expresa débilmente en estas células. Estos resultados sugieren que al menos dos factores (procesamiento de tejidos e inhibición débil de IMAB027) dieron como resultado las discrepancias observadas con el anticuerpo de control de isotipo.

Modelo de metástasis con Patu8988S

Para analizar el efecto del tratamiento con IMAB362 en el desarrollo y crecimiento de la metástasis con Patu8988S in vivo, 10 ratones por grupo fueron inyectados con 2 x 106 células Patu8988S. El primer experimento se realizó comparando el tratamiento con IMAB362 con ratones tratados con PBS. En cada grupo, 1 ratón murió inmediatamente después de la inyección de las células. En los otros 18 ratones, la metástasis se desarrolló muy rápidamente en comparación con los experimentos de injerto. Después de 63 días, los 2 primeros ratones del grupo de PBS se sacrificaron debido a las malas condiciones de salud. Todos los demás ratones se sacrificaron después de 65 días. El análisis óptico de los pulmones reveló grandes metástasis en todos los tejidos pulmonares. La cantidad de metástasis se analizó en experimentos de Q-PCR (Figura 27). Los resultados muestran que IMAB362 inhibe el crecimiento de metástasis en el tejido pulmonar.

Se realizó un segundo experimento con 11 ratones por grupo comparando el tratamiento con IMAB362 con el tratamiento de control de isotipo (Rituximab). En este experimento, la metástasis se desarrolló lentamente como se observa en los injertos. No obstante, por motivos de comparabilidad, este segundo experimento se terminó después de 65 días. Nuevamente, los tejidos pulmonares se analizaron en Q-PCR y nuevamente IMAB362 redujo el crecimiento de la metástasis. Un ratón del grupo IMAB362 se identificó como atípico y la exclusión de este atípico dio como resultado una inhibición casi significativa (P = 0.0588). Estos datos se verificaron mediante análisis de superficie IHC como se describe para el experimento de metástasis con Suit2-LVT. En este documento se pudo identificar el mismo valor atípico, y omitiendo este valor en la prueba t, la inhibición de IMAB362 también está en el borde de ser significativa (P = 0.0691), que los valores del mismo ratón.

Ejemplo 7: Farmacodinamia primaria de IMAB362 en combinación con quimioterapia

Sensibilidad de las células del carcinoma de páncreas a la gemcitabina y al oxaliplatino

Se usaron líneas celulares de cáncer de páncreas que expresan constitutivamente CLDN18.2 (DANG, Patu8988S) y células transducidas de manera estable con CLDN18.2 (MiaPaCa-2-LVT, BxPC3-LVT) para investigar los modos de acción de IMAB362 en combinación con los agentes quimioterapéuticos oxaliplatino o gemcitabina.

Químicamente, la gemcitabina (Gemzar, comercializada por Eli Lilly & Co) es un análogo de nucleósido. Al igual que con el 5-fluorouracilo (5-FU) y otros análogos de las pirimidinas, el análogo trifosfato de la gemcitabina reemplaza uno de los componentes básicos de los ácidos nucleicos durante la replicación del ADN. El proceso detiene el crecimiento del tumor, ya que solo se puede unir un nucleósido adicional al nucleósido "defectuoso", lo que da como resultado la apoptosis.

[0340] El oxaliplatino funciona formando enlaces cruzados tanto entre como dentro de la cadena en el ADN. Los enlaces cruzados en el ADN impiden la replicación y la transcripción del ADN, lo que provoca la muerte celular (Graham, Joanne; Mushin, Mohamed; Kirk Patrick, Peter (enero de 2004). "Oxaliplatin". Nature Reviews Drug Discovery 3 (1): 11-2.)

Las curvas de respuesta a la dosis de gemcitabina y oxaliplatino mostraron diferentes sensibilidades de las líneas celulares de tumor pancreático analizadas (Figura 28 y Figura 29).

Tabla 21: Valores de IC50 de emcitabina oxaliplatino para líneas celulares de carcinoma de páncreas.

Para inhibir la proliferación celular de Patu8988S son necesarias altas concentraciones de gemcitabina (IC50 > 100 ng/mL) u oxaliplatino (IC50 > 500 ng/mL). DANG y BxPC3-LVT reaccionan de forma muy sensible a la gemcitabina, pero no al oxaliplatino. Las células MiaPaCa-2-LVT reaccionan de manera más sensible al oxaliplatino, pero menos sensible al tratamiento con gemcitabina (Figura 28, Figura 29 y Tabla 21).

Efecto de los agentes quimioterapéuticos sobre la expresión de CLDN18.2 en líneas celulares de carcinoma de páncreas

El modo de acción desencadenado por la unión de IMAB362 depende estrictamente de la presencia y la densidad de la superficie celular de su CLDN18.2 diana. El pretratamiento de las células DANG y Patu8988S con gemcitabina (Gem) y gemcitabina en combinación con oxaliplatino (GemOx) resultó en un aumento de los niveles de proteína y ARNm de CLDN18.2 mostrados por análisis de RT-PCR (Figura 30) y transferencia Western (Figura 31) de células no tratadas y pretratadas con quimioterapia. En consecuencia, la cantidad de proteína CLDN18.2 a la que se puede dirigir IMAB362 en la superficie de las líneas celulares de cáncer de páncreas pretratadas con Gem o GemOx aumentó como se muestra en la citometría de flujo (Figura 32).

El tratamiento de DANG y Patu8988S con gemcitabina conduce a una sobrerregulación de CLDN18.2. Patu8988S muestra una fuerte sobrerregulación de CLDN18.2 con Gem y una sobrerregulación más baja con GemOx.

Efecto de los compuestos quimioterapéuticos sobre el ciclo celular y la expresión de CLDN18.2

La progresión del ciclo celular se refiere a la secuencia de eventos entre una división mitótica y otra en una célula. Una fase de reposo (G0/G1) es seguida por una fase de síntesis de ADN (S), luego por una fase de agrandamiento celular (G2) y la replicación de ADN (M) es seguida por una división de la célula en dos células de progenie. Cualquier interferencia con la maquinaria celular puede inhibir toda la progresión del ciclo en cualquier fase del ciclo celular. Por ejemplo, los agentes quimioterapéuticos específicos pueden bloquear la progresión en G2 o M o tanto en G2 como en M (G2/M).

El tratamiento con gemcitabina de DANG o Patu8988S conduce a la detención del ciclo celular en la fase S (Figura 33, Figura 34). Se analizaron Patu8988S cultivadas con Gem. El tratamiento con gemcitabina no solo conduce a la detención del ciclo celular, sino que también cambia la expresión de CLDN18.2 (Figura 34B). El cambio de la densidad de CLDN18.2 después del tratamiento con gemcitabina es aún mayor cuando se comparan las células en proliferación en la fase S con las células en reposo en la fase G0/G1 (Figura 34C). En las células Patu8988S, CLDN18.2 se expresa en todas las fases del ciclo celular. Tras el tratamiento con gemcitabina, su expresión incluso aumenta, encontrándose los niveles más altos de CLDN18.2 por célula en la población de células en fase S.

Esta perturbación del fenotipo de las células tumorales tiene un impacto significativo en la eficacia biológica de los anticuerpos terapéuticos. ADCC y CDC están relacionados con la dosis y, por lo tanto, un aumento de CLDN18.2 en la estructura diana proporciona un beneficio sinérgico a los regímenes quimioterapéuticos estándar.

Se cultivaron células Kato III, una línea celular de tumor gástrico humano, en medio RPMI 1640 (Invitrogen) que contenía FCS al 20 % (Perbio) y Glutamax 2 mM (Invitrogen) a 37 °C y 5 % de CO2, con o sin compuestos citostáticos. El 5-FU (Neofluor de NeoCorp AG) se probó a una concentración de 10 o 100 ng/mL, y el oxaliplatino (Hospira) se probó a una concentración de 50 o 500 ng/mL. Se cultivaron 8*105 células Kato III durante 96 horas sin cambio de medio o durante 72 horas seguidas de 24 horas de cultivo en medio estándar para liberar las células de la detención del ciclo celular en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos a 37 °C, 5 % de CO2. Las células se recogieron con EDTA/tripsina, se lavaron y analizaron.

Para la detección extracelular de CLDN18.2, las células se tiñeron con el anticuerpo monoclonal anti-CLDN18.2 IMAB362 (Ganymed) o un anticuerpo de control con el mismo isotipo (Ganymed). Como reactivo secundario se utilizó anti-huIgG-APC de cabra de Dianova.

Las etapas del ciclo celular se determinaron con base en la medición del contenido de ADN celular. Esto permite discriminar entre células en la fase G1, S o G2 del ciclo celular. En la fase S se produce la duplicación del ADN, mientras que en la fase G2 las células crecen y se preparan para la mitosis. El análisis del ciclo celular se realizó utilizando el kit de reactivos de ADN CycleTEST PLUS de BD Biosciences siguiendo el protocolo del fabricante. La adquisición y el análisis de citometría de flujo se realizaron utilizando el software BD FACS CantoII (BD Biosciences) y FlowJo (Tree Star).

Las columnas de la Figura 35a y b muestran el porcentaje respectivo de células en la fase G1, S o G2 del ciclo celular. Las células Kato III cultivadas en medio muestran una detención del ciclo celular predominantemente en la fase G1. Las células tratadas con 5-FU se bloquean predominantemente en la fase S. Las células Kato III tratadas con oxaliplatino muestran un enriquecimiento de células predominantemente en las fases G1 y G2. Como se puede ver en la Figura 35c, una detención del ciclo celular en la fase S o la fase G2 da como resultado la estabilización o sobrerregulación de CLDN18.2. Tan pronto como las células se liberan de cualquier fase del ciclo celular (Figura 35b), la expresión de CLDN18.2 en la superficie celular de las células Kato III se sobrerregula (Figura 35d).

Las células Kato III se trataron previamente durante 4 días con irinotecano o docetaxel y se analizaron para determinar la expresión de CLDN18.2 y la detención del ciclo celular. El tratamiento de las células con irinotecano dio como resultado una inhibición dependiente de la dosis del crecimiento celular y una detención del ciclo celular en la fase S/G2 (Figura 36). El tratamiento de las células con docetaxel dio como resultado una inhibición dependiente de la dosis del crecimiento celular y una detención del ciclo celular en la fase G2 (Figura 36).

Efecto de la quimioterapia sobre la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) inducida por IMAB362 Se realizaron una serie de experimentos con las líneas celulares de cáncer de páncreas que expresan constitutivamente CLDN18.2, Patu8988S y DANG. Para investigar los efectos de gemcitabina (Gem) o gemcitabina oxaliplatino (GemOx) sobre la ADCC mediada por IMAB362, se compararon las curvas de respuesta a la dosis para la lisis de células mediada por IMAB362 de células pretratadas con el medio cultivado.

Las curvas de respuesta a la dosis de DANG pretratadas con Gem (1 ng/mL) o GemOx (Gem 1 ng/mL Ox 10 ng/mL), (2 días) se desplazan hacia arriba y hacia la izquierda en comparación con las células diana no tratadas (Figura 37A). El tratamiento de células tumorales con Gem o GemOx conduce a una sobrerregulación de CLDN18.2 y una mayor susceptibilidad a la ADCC mediada por IMAB362. Pudimos observar una disminución de los valores de EC50 y lisados celulares máximos más altos para ADCC mediada por IMAB362 (Figura 37B) en células DANG después del tratamiento con agentes quimioterapéuticos.

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), incluidas las células NK, los monocitos, las células mononucleares u otras células efectoras de donantes humanos sanos, se purificaron mediante centrifugación de densidad con Ficoll Hypaque. Las células efectoras lavadas se sembraron en medio X-Vivo. Las células Kato III que expresan CLDN18.2 endógenamente y son de origen gástrico se usaron como células diana en este contexto. Las células diana expresaron de forma estable luciferasa, amarillo lucifer, que se oxida únicamente por células viables. Se añadió anticuerpo IMAB362 purificado anti-CLDN18.2 a varias concentraciones y como anticuerpo de control de isotipo se usó un anticuerpo chim huIgG1 irrelevante. Se analizó la citólisis de las muestras midiendo la luminiscencia resultante de la oxidación del amarillo lucifer, que es un valor para la cantidad de células viables que quedan después de la citotoxicidad inducida por IMAB362. Kato III pretratadas durante 3 días con irinotecano (1000 ng/mL), docetaxel (5 ng/mL) o cisplatino (2000 ng/mL) se compararon con células diana cultivadas en medio sin tratar y se cuantificó la ADCC inducida por IMAB362.

Las células Kato III pretratadas durante 3 días con irinotecano, docetaxel o cisplatino exhibieron un nivel más bajo de células viables en comparación con las células diana cultivadas en medio (Figura 38a) y la expresión de claudinl8.2 en las células pretratadas con irinotecano, docetaxel o cisplatino aumentó en comparación con las células cultivadas en medio (Figura 38b).

Además, el pretratamiento de células Kato III con irinotecano, docetaxel o cisplatino aumentó la potencia de IMAB362 para inducir ADCC (Figura 38c, d).

Efecto de la quimioterapia en CDC inducida por IMAB362

La potencia de CDC de IMAB362 se ha caracterizado por incubación con células diana en presencia de suero humano como fuente de complemento.

MiaPaCa-2-LVT cultivada en medio mostro valores de EC50 para lisados específicos de IMAB362 de 7665 ng/mL. El tratamiento con Gem conduce a una disminución de EC50 a 4677 ng/mL en comparación con el aumento de lisis máxima (Figura 39).

Los efectos de los agentes quimioterapéuticos sobre la CDC inducida por IMAB362 se analizaron tratando previamente células de cáncer gástrico KATO III con 10 ng/mL de 5-FU y 500 ng/mL de oxaliplatino (5-FU OX) durante 48 horas. En la Figura 40 se muestran curvas de respuesta a las dosis representativas de CDC inducida por IMAB362 usando células KATO III tratadas previamente con agentes quimioterapéuticos. El tratamiento previo de las células tumorales durante 48 horas aumentó la potencia de IMAB362 para inducir CDC, lo que resultó en una mayor lisis celular máxima de las células tumorales tratadas previamente en comparación con las células no tratadas.

Ejemplo 8: Eficacia de IMAB362 en combinación con quimioterapia en modelos de tumores de ratón

La actividad antitumoral de IMAB362 en combinación con Gem o GemOx se examinó en modelos de xenoinjerto de carcinoma pancreático subcutáneo, que se utilizaron para probar la eficacia de IMAB362 como agente único anteriormente.

Los ratones desnudos con tumores BxPC3-LVT o MiaPaCa-2-LVT tratados con IMAB362 mostraron un retraso significativo en el crecimiento del tumor en comparación con los ratones de control tratados con control de solución salina. La quimioterapia con hasta 100 mg/kg de gemcitabina sin tratamiento adicional con IMAB362 no mostró ningún efecto terapéutico significativo en el xenoinjerto de BxPC3-LVT o MiaPaCa-2-LVT. Por el contrario, el tratamiento combinado con 50-100 mg/kg de gemcitabina más IMAB362 dio como resultado una inhibición del crecimiento tumoral significativamente mayor y una supervivencia prolongada de los ratones con tumores en comparación con los ratones tratados con quimioterapia únicamente (Figura 41, Figura 42, Figura 43). Estas observaciones indican la existencia de efectos terapéuticos sinérgicos por combinación de inmunoterapia con gemcitabina e IMAB362.

Cuando se usan dosis altas de gemcitabina con 150 mg/kg 2x por semana, los tumores de xenoinjerto MiaPaCa-2-LVT establecidos se inhiben fuertemente en el crecimiento tumoral independientemente del tratamiento con IMAB362 (Figura 44A). Sin embargo, los ratones tratados con la terapia combinada de IMAB362 y gemcitabina mostraron una supervivencia prolongada muy significativa en comparación con los ratones tratados con gemcitabina como agente único (Figura 44B).

Ejemplo 9: El tratamiento con ZA/IL-2 da como resultado la expansión de grandes cantidades de células T Vy9V82

Las PBMC se cultivaron durante 14 días en medio RPMI complementado con 300 U/mL de IL-2 y con o sin ácido zoledrónico (ZA) 1 pM. El porcentaje de células T V^y9+V82+ dentro de la población de linfocitos CD3+ y el porcentaje de células CD16+ dentro de la población de células T CD3+V^y9+V82 se determinó mediante FACS multicolor el día 0 y el día 14.

Se requiere la adición de IL-2 en los cultivos de PBMC para la supervivencia y el crecimiento de los linfocitos. Se expanden eficientemente en cultivos suministrados con 300 U/mL de IL-2. El análisis de FACS usando anticuerpos específicos contra Vy9 y V82 revela que la adición de ZA/IL-2 induce específicamente la acumulación de células T V^y9V52. Después de 14 días, la población de linfocitos CD3+ puede comprender hasta el 80 % de las células T Vy9V52. Una parte de las células T Vy9V82 expresa CD16, mientras que el enriquecimiento de estas células dentro de la población de linfocitos CD3+ es de 10 a 700 veces, dependiendo del donante. El enriquecimiento de las células T CD16+Vy9+V52 en los cultivos es de 10 a 600 veces superior en comparación con los cultivos desarrollados sin ZA. Concluimos que el tratamiento de PBMC con ZA/IL-2 in vitro da como resultado la sobrerregulación del receptor CD16 FcyIII mediador de ADCC en una proporción significativa de células T y§.

Al igual que las células NK, las células T Vy9V82 expandidas con ZA/IL-2 son positivas para CD16, el receptor FcyRIII a través del cual un anticuerpo unido a la célula desencadena la ADCC. Para evaluar si las células T V^y9V82 son capaces de inducir ADCC potente junto con IMAB362, se ha realizado una serie de experimentos.

Las PBMC derivadas de 2 donantes diferentes (#1 y #2) se cultivaron en medio con 300 U/mL de IL-2 y con o sin ZA 1 pM. Después de 14 días, las células se recogieron y se añadieron con concentraciones crecientes (0.26 ng/mL-200 pg/mL) de IMAB362 a células NUGC-4 que expresaban CLDN18.2. La muerte específica se determinó en ensayos con luciferasa. Los ensayos de ADCC se realizaron con 27 donantes cultivados en 300 U/mL de IL-2 y con o sin ZA en los que NUGC-4 sirvió como células diana. Para cada donante, los valores de EC50 calculados a partir de las curvas de respuesta a la dosis y la tasa de muerte específica máxima a una dosis de 200 pg/mL de IMAB362 se puntuaron en los diagramas de dispersión.

Se observó una fuerte actividad de ADCC dependiente de IMAB362 contra células NUGC-4 positivas para CLDN18.2 utilizando PBMC cultivadas durante 14 días con ZA/IL-2. Usando cultivos de PBMC tratados con z A/IL-2, la ADCC depende de la presencia de células T Vy9V52. Si las células se cultivan sin ZA, la actividad de ADCC se reduce para la mayoría de los donantes. En estos cultivos, la actividad de ADCC residual depende de las células NK. Al analizar más de 20 donantes, los ensayos de ADCC revelan que el tratamiento con ZA/IL-2 de PBMC mejora la EC50 y las tasas de muerte específica máximas en comparación con PBMC cultivadas solo con IL-2.

Ejemplo 10: Eficacia de IMAB362 en combinación con gemcitabina en modelo de metástasis de ratón:

Para analizar el efecto de IMAB362 en combinación con el tratamiento con gemcitabina en metástasis pulmonares con Patu8988S in vivo, se trataron 12 ratones Hsd: Foxn1nu desnudos atímicos por grupo con una inyección intravenosa de 2x106 células Patu8988S en la vena de la cola. Catorce días después de la inyección de células tumorales, los ratones se trataron con 200 pg de IMAB362 o PBS como control (iv/ip) dos veces por semana más una dosis semanal de 100 mg/kg de gemcitabina ip por 4 semanas El tratamiento con IMAB362 o ^pB^sse mantuvo hasta que los ratones se sacrificaron el día 70 después de la inyección de células tumorales. El análisis de la carga tumoral xenoinjertada en los pulmones se realizó mediante QPCR de ADN humano en los pulmones preparados y mediante un análisis óptico de una tinción inmunohistológica con un anticuerpo anti-MHC-I humano (clon EPR1394Y). Los resultados muestran que los ratones tratados con IMAB362 más gemcitabina tienen una cantidad significativamente reducida de ADN humano en sus pulmones (Figura 45A) y que la superficie de los cortes de pulmón teñidos contra el complejo MHC-I humano es significativamente más pequeña que en los pulmones de los ratones tratados con un anticuerpo irrelevante más gemcitabina (Figura 45B). Ambos métodos revelan una carga tumoral reducida de xenoinjertos de Patu8988s en los pulmones de ratones tratados con IMAB362 más gemcitabina, lo que demuestra que la combinación con IMAB362 es significativamente superior a una monoterapia con gemcitabina.

IN D IC A C IO N E S R E L A T IV A S A L D E P Ó S IT O D E U N M IC R O O R G A N IS M O

O D E O T R O M A T E R IA L B IO L Ó G IC O

(Regla 13Z>¿Hdel PCT)

Formulario PCT/RO/134 (lulio 1998; reimpresión Enero 2004)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo para usar en un método para tratar o prevenir el cáncer de páncreas caracterizado por células de cáncer de páncreas que expresan CLDN18.2, comprendiendo dicho método administrar a un paciente (i) el anticuerpo y (ii) un agente que estabiliza o aumenta la expresión de CLDN18.2, en el que

(a) el anticuerpo se une a CLDN18.2 y media en la destrucción de células que expresan CLDN18.2, en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 32 y una cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 39, y

(b) el agente es un agente quimioterapéutico seleccionado del grupo que consiste en gemcitabina y un profármaco o una de sus sales, en el que el profármaco es un éster,

en el que, opcionalmente, el método comprende además administrar al menos un agente quimioterapéutico adicional.

2. El anticuerpo para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el método comprende administrar una combinación de gemcitabina y oxaliplatino, una combinación de gemcitabina y cisplatino, una combinación de gemcitabina y carboplatino o una combinación de oxaliplatino, 5-fluorouracilo e irinotecano.

3. El anticuerpo para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el método comprende administrar ácido folínico, oxaliplatino, 5-fluorouracilo e irinotecano.

4. El anticuerpo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 17 y la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 24.

5. El anticuerpo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el método comprende además administrar un agente que estimula las células T y§, en el que las células T y§ son preferiblemente células T Y^y9V52 y dicho agente que estimula las células T ^y§ es preferiblemente un bisfosfonato, y más preferiblemente un bisfosfonato que contiene nitrógeno (aminobisfosfonato).

6. El anticuerpo para el uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el agente estimulante de las células T y§ se selecciona del grupo que consiste en ácido zoledrónico, ácido clodrónico, ácido ibandrónico, ácido pamidrónico, ácido risedrónico, ácido minodrónico, ácido olpadrónico, ácido alendrónico, ácido incadrónico y sales de los mismos.

7. El anticuerpo para el uso de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en el que el agente que estimula las células T ^y§ se administra en combinación con interleucina-2.

8. El anticuerpo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo media la muerte celular mediante una o más lisis mediada por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y lisis mediada por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC).

9. El anticuerpo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en (i) un anticuerpo producido y/u obtenible a partir de un clon depositado con el número de acceso DSM ACC2810, (ii) un anticuerpo que es una forma quimerizada o humanizada del anticuerpo bajo (i), y (iii) un anticuerpo que comprende la porción de unión al antígeno o el sitio de unión al antígeno, en particular la región variable, del anticuerpo bajo (i).

10. El anticuerpo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el método comprende administrar el anticuerpo a una dosis de hasta 1000 mg/m2 o repetidamente a una dosis de 300 a 600 mg/m2.

11. El anticuerpo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el cáncer de páncreas comprende cáncer primario, cáncer avanzado o cáncer metastásico, o una combinación de los mismos, tal como una combinación de cáncer primario de páncreas y cáncer metastásico.

12. El anticuerpo para el uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el cáncer metastásico comprende metástasis en los ganglios linfáticos, ovario, hígado o pulmón, o una combinación de los mismos.

13. El anticuerpo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el cáncer de páncreas comprende un cáncer del conducto pancreático.

14. El anticuerpo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el cáncer de páncreas comprende un adenocarcinoma o carcinoma, o una combinación de los mismos.

15. El anticuerpo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el cáncer de páncreas comprende un adenocarcinoma ductal, un adenocarcinoma mucinoso, un carcinoma neuroendocrino o un carcinoma de células acinares, o una combinación de los mismos.

16. El anticuerpo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el cáncer de páncreas es parcial o completamente refractario al tratamiento con gemcitabina, tal como la monoterapia con gemcitabina.

17. El anticuerpo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que la prevención del cáncer de páncreas comprende la prevención de una recurrencia del cáncer de páncreas.

18. El anticuerpo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que el paciente se sometió a una cirugía por cáncer de páncreas.

19. El anticuerpo para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que el paciente tiene una lesión pancreática precancerosa, en particular una lesión pancreática precancerosa que comprende un cambio histológico maligno inicial en los conductos pancreáticos.

20. Una preparación médica para usar en el tratamiento o la prevención del cáncer de páncreas, comprendiendo dicha preparación médica (i) un anticuerpo que se une a CLDN18.2 y media en la muerte de células que expresan CLDN18.2, en la que el anticuerpo comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos representado por la SEQ ID NO: 32 y una cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 39 y (ii) gemcitabina.

21. La preparación médica para el uso de acuerdo con la reivindicación 20, que se presenta en forma de un kit que comprende un primer contenedor que incluye el anticuerpo y un segundo contenedor que incluye gemcitabina.