UA118664C2 - Комбінована терапія з використанням антитіла проти клаудину 18.2 та гемцитабіну для лікування раку підшлункової залози - Google Patents

Комбінована терапія з використанням антитіла проти клаудину 18.2 та гемцитабіну для лікування раку підшлункової залози Download PDF

Info

Publication number
UA118664C2
UA118664C2 UAA201508994A UAA201508994A UA118664C2 UA 118664 C2 UA118664 C2 UA 118664C2 UA A201508994 A UAA201508994 A UA A201508994A UA A201508994 A UAA201508994 A UA A201508994A UA 118664 C2 UA118664 C2 UA 118664C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
cells
antibody
shi
still
sho
Prior art date
Application number
UAA201508994A
Other languages
English (en)
Inventor
Уґур Сахін
Езлем Тюречі
Ріта Мітнахт-Краус
Штефан Воль
Штефан ЯКОБС
Корнелія Хайнц
Original Assignee
Ґанімед Фармасьютікалз Аґ
Трон - Транслаціонале Онколоґі Ан Дер Універзітетсмедіцін Дер Йоханнес Ґутенберґ-Універзітет Майнц Ґемайннютціґе Ґмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ґанімед Фармасьютікалз Аґ, Трон - Транслаціонале Онколоґі Ан Дер Універзітетсмедіцін Дер Йоханнес Ґутенберґ-Універзітет Майнц Ґемайннютціґе Ґмбх filed Critical Ґанімед Фармасьютікалз Аґ
Publication of UA118664C2 publication Critical patent/UA118664C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/662—Phosphorus acids or esters thereof having P—C bonds, e.g. foscarnet, trichlorfon
    • A61K31/663—Compounds having two or more phosphorus acid groups or esters thereof, e.g. clodronic acid, pamidronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Винахід стосується застосування антитіла, яке зв’язується з CLDN18.2 у комбінації з гемцитабіном для лікування раку підшлункової залози.

Description

Винахід стосується застосування антитіла, яке зв'язується з С1ОМ18.2 у комбінації з гемцитабіном для лікування раку підшлункової залози.
Рівень техніки
Рак підшлункової залози є одним із самих летальних видів раку. Смертність досягає 100 90 через схильність до раннього утворення метастаз й внаслідок того, що хвороба є дуже стійкою до променевої й хіміотерапії. Враховуючи, що щороку діагностується 27 000 нових випадків у
Північній Америці й 68 000 у Європі, існує постійна потреба в розробці нових стратегій лікування для зниження смертності хворих на рак підшлункової залози.
Сплайс-варіант 2 молекули щільних контактів клаудину 18 (сіацдіп 18.2, або СІ ОМ18.2) входить до родини білків щільних контактів - клаудинів. СІ ОМ18.2 - трансмембранний білок в 27,8 кДа, який містить чотири трансмембранні домени із двома невеликими позаклітинними петлями. У нормальних тканинах експресія СГОМ18.2 методом ЗТ-ПЛР не виявлена, за винятком шлунка. Імуногістохімія за допомогою специфічних до СІ ОМ18.2 антитіл показала, що позитивну реакцію дає єдина тканина - шлунок. СГОМ18.2 є досить вибірковим антигеном шлункової лінії яка експресується винятково в короткоживучих диференційованих епітеліальних клітинах шлунка. СІ ОМ18.2 зберігається при злоякісній трансформації й тому часто виступає на поверхні ракових клітин шлунка людини. Крім того, цей пан-пухлинний антиген активується ектопічно на істотному рівні в клітинах аденокарциноми стравоходу, підшлункової залози й легенів.
Фірмою Сапутей Рпаптасешісаїє АС було розроблено химерне антитіло ІМАВЗ362 типу
ІЧО1, спрямоване проти СІ ОМ18.2. ІМАВЗ62 розпізнає перший позаклітинний домен (ЕСО1)
СІГОМ18.2 з високою спорідненістю й специфічністю. ІМАВЗб2 не зв'язується з іншими представниками родини, включаючи близькоспоріднений сплайс-варіант 1 клаудину 18 (СГОМ18.1). ІМАВЗ362 проявляє сильну специфічність до пухлинних клітин і в ньому сполучаються чотири незалежні високоактивні механізми дії. Після зв'язування з мішенню
ІМАВЗ362 опосередковує знищення клітин за допомогою АЮСС, СОС та індукції апоптоза, спричиненого перехресними зшивками мішені на поверхні пухлинних клітин і безпосереднім інгібуванням проліферації. При цьому ІМАВЗ362 ефективно спричиняє лізис СІ ОМ18.2- позитивних клітин, у тому числі клітин ракових ліній шлунка людини іп міїго і іп мімо.
Токсичність і РК/ТК-профіль ІМАВ362 ретельно досліджувалися на мишах і яванських макаках, включаючи дослідження з виявлення дозового діапазону, 28-денні дослідження з токсичності повторних доз на макаках і З-місячні дослідження з токсичності повторних доз на мишах. Як миші (найбільша тривалість обробки при щотижневому введенні - З місяці, максимальний рівень доз - 400 мг/кг), так і яванські макаки (до 5 щотижневих уведень аж до 100 мг/кг) добре переносили повторні дози ІМАВЗ62 в/в. Не відзначалося ніяких ознак системної або місцевої токсичності. Зокрема, у жодному дослідженні з токсичності не відзначалося шлункової токсичності. ІМАВЗ362 не викликає імунної активації й вивільнення цитокінів. Не відзначалося ніяких негативних ефектів на репродуктивні органи в самців або самок. ІМАВЗ62 не зв'язується з тими тканинами, у яких відсутні мішені. Дослідження з біорозподілення на мишах показали, що відсутність шлункової токсичності, швидше за все, обумовлена компартменталізацією щільних контактів на люмінальній стороні нормального епітелію шлунка, що сильно ускладнює доступ до епітопів ІМАВЗ62.
Клінічні дослідження ІМАВ362 перебувають на початковій стадії. Проводилася | фаза клінічних випробувань на людях. По З пацієнти в 5 дозових групах (33 мг/м?, 100 мг/м, 300 мг/м, 600 мг/м, 1000 мг/м") одержували внутрішньовенно одноразові дози ІМАВЗ362 і знаходились під спостереженням протягом 28 днів. ІМАВ362 дуже добре переносився, при цьому не було істотних зауважень щодо безпеки в пацієнтів. В одного пацієнта всі вимірювані пухлинні маркери значно зменшувалися протягом 4 тижнів після лікування. У поточній фазі Па клінічних випробувань ІМАВЗ62 уводиться неодноразово.
Далі тут наводяться дані, які свідчать про те, що хіміотерапевтичні засоби можуть стабілізувати або підсилювати експресію СІ ОМ18.2 на поверхні ракових клітин підшлункової залози, приводячи до підвищення доступності СІ ОМ18.2 для антитіл проти СГ ОМ18.2 типу
ІМАВЗ362. Спостерігалася синергійна дія антитіл проти СІ ОМ18.2 типу ІМАВ362 з певними хіміотерапевтичними препаратами, зокрема, з хіміотерапевтичними препаратами, які використовуються для лікування раку підшлункової залози. При хіміотерапевтичній обробці ракові клітини людини стають більш сприйнятливими до індукованого антитілами мішень- специфічного знищення. На моделях пухлин у мишей контроль пухлин за допомогою антитіл проти СГОМ18.2 плюс хіміотерапії перевершує такий контроль за допомогою одних лише антитіл проти СІ ОМ18.2 як єдиного засобу.
Сутність винаходу
Даним винаходом у загальному передбачена комбінована терапія для ефективного бо лікування й/або профілактики захворювань, пов'язаних із клітинами, які експресують СІ ОМ18.2,
включаючи такі ракові захворювання, як рак шлунка, рак стравоходу, рак підшлункової залози, рак легенів типу недрібноклітинного раку легенів (М5СІ С), рак яєчників, рак товстої кишки, рак печінки, рак голови й шиї й рак жовчного міхура, а також їх метастазів, зокрема метастазів рака шлунка типу пухлин Крукенберга, метастазів в очеревині й метастазів у лімфатичних вузлах.
Переважно раковими захворюваннями є рак підшлункової залози та його метастази.
В одному аспекті даного винаходу передбачений спосіб лікування або профілактики раку підшлункової залози в пацієнтів, який передбачає введення пацієнтам (ї) антитіла, яке має здатність зв'язуватись з СІ ОМ18.2, та (ії) засобу, який стабілізує або посилює експресію, тобто рівень СГОМ18.2. Експресія СІ ОМ18.2 переважно відбувається на клітинній поверхні ракових клітин. Засіб, який стабілізує або посилює експресію СІ ОМ18.2, може вводитися до, одночасно з або після введення антитіла, яке має здатність зв'язуватись з СІ ОМ18.2, або в комбінації з ним.
Засіб, який стабілізує або посилює експресію СІ ОМ18.2, може бути цитотоксичним і/або цитостатичним засобом. В одному втіленні засіб, який стабілізує або посилює експресію
СІ ОМ18.2, включає засіб, який індукує зупинку клітинного циклу або нагромадження клітин в одній або декількох фазах клітинного циклу, бажано в одній або декількох фазах клітинного циклу, відмінних від фази 1, типу фази 5, фази 2 або їх комбінації або комбінації фази 5 або фази 02 з фазою С1. Засіб, який стабілізує або посилює експресію СІ ОМ18.2, може включати засіб, обраний із групи, яка складається з аналогів нуклеозидів, сполук платини, аналогів камптотецину й таксанів, їх форм проліків, солей і комбінацій. Аналоги нуклеозидів можна вибирати із групи, яка складається з гемцитабіну, 5-фторурацилу, їх форм проліків і солей.
Сполуки платини можна вибирати із групи, яка складається з оксаліплатину, цисплатину, їх форм проліків і солей. Аналоги камптотецину можна вибирати із групи, яка складається з іринотекану, топотекану, їх форм проліків і солей. Таксани можна вибирати із групи, яка складається з паклітакселю, доцетакселю, їх форм проліків і солей. Засіб, який стабілізує або посилює експресію СІ ОМ18.2, може включати засіб, обраний із групи, яка складається з гемцитабіну, 5-фторурацилу, оксаліплатину, іринотекану, паклітакселю, їх форм проліків, солей і комбінацій. Засіб, який стабілізує або посилює експресію СІ ОМ18.2, може включати комбінацію з оксаліплатину й 5-фторурацилу або їх форм проліків, комбінацію із цисплатину й 5- фторурацилу або їх форм проліків, комбінацію із щонайменше одного токсану й оксаліплатину,
Зо комбінацію із щонайменше одного токсану й цисплатину, комбінацію із щонайменше одного токсану й 5-фторурацилу або його форм проліків, або комбінацію із щонайменше одного аналога камптотецину й 5-фторурацилу або його форм проліків. Засіб, який стабілізує або посилює експресію СІ ОМ18.2, може включати комбінацію з гемцитабіну й оксаліплатину, комбінацію з гемцитабіну й цисплатину, комбінацію з гемцитабіну й карбоплатину або комбінацію з оксаліплатину, 5-фторурацилу або його форм проліків і іринотекану. Відповідно, спосіб запропонований винаходом може включати введення комбінації з гемцитабіну й оксаліплатину, комбінації з гемцитабіну й цисплатину, комбінації з гемцитабіну й карбоплатину або комбінації з оксаліплатину, 5-фторурацилу або його форм проліків і іринотекану. В одному втіленні спосіб запропонований винаходом передбачає введення фолінової кислоти, 5- фторурацилу або його форм проліків, іринотекану й оксаліплатину. Засіб, який стабілізує або посилює експресію СІ ОМ18.2, може включати засіб, який індукує імуногенну загибель клітин.
Засіб, який індукує імуногенну загибель клітин, може включати оксаліплатин.
У наступному аспекті даного винаходу передбачений спосіб лікування або профілактики раку в пацієнтів, який передбачає введення пацієнтам (ї) антитіла, яке має здатність зв'язуватись з СІ ОМ18.2, і (ії) гемцитабіну. В одному втіленні рак вибирають із групи, яка складається з раку шлунка, рака стравоходу, рака підшлункової залози, рака легенів, рака яєчників, рака товстої кишки, рака печінки, рака голови й шиї, рака жовчного міхура і їх метастазів. Ракове захворювання може бути презентовано пухлиною Крукенберга, метастазами в очеревині й/або метастазами в лімфатичних вузлах. В одному втіленні рак представлений аденокарциномою, зокрема, пізньою стадією аденокарциноми. В одному втіленні рак представлений раком підшлункової залози.
В одному втіленні спосіб запропонований винаходом додатково включає введення засобу, який стимулює Т-клітини уб. В одному втіленні Т-клітини уб представлені Т-клітинами МуЗМб62. В одному втіленні засіб, який стимулює Т-клітини уб, представлений бісфонатом типу азотовмісного бісфоната (амінобісфоната). В одному втіленні засіб, який стимулює Т-клітини уб, вибирається із групи, яка складається із золедронової кислоти, клодронової кислоти, ібандронової кислоти, памідронової кислоти, ризедронової кислоти, мінодронової кислоти, олпадронової кислоти, алендронової кислоти, інкадронової кислоти та їх солей. В одному втіленні засіб, який стимулює Т-клітини уб, уводиться в комбінації з інтерлейкіном-2. 60 Спосіб запропонований винаходом може додатково передбачати введення щонайменше ще одного хіміотерапевтичного засобу, який може бути цитотоксичним засобом.
Антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, може зв'язуватися з нативними епітопами СІ ОМ18.2, які перебувають на поверхні живих клітин. В одному втіленні антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, зв'язується з першою позаклітинною петлею СІ ОМ18.2.
В одному втіленні антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, опосередковує знищення клітин за одним або кількома механізмами із числа опосередкованого комплементзалежною цитотоксичністю (СОС) лізису, опосередкованого антитілозалежною клітинною цитотоксичністю (АЮСС) лізису, індукції апоптоза й інгібування проліферації. В одному втіленні антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, є моноклональним, химерним або гуманізованим антитілом або фрагментом антитіла. В одному втіленні антитіло опосередковує знищення клітин при зв'язуванні із клітинним СІ ОМ18.2, зокрема, з СІ ОМ18.2, який експресується клітинами на їхній клітинній поверхні, причому клітини бажано представлені раковими клітинами описаних тут типів ракових клітин. В одному втіленні антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, є антитілом, обраним із групи, яка складається з (ї) антитіл, вироблених і/або отриманих із клону, депонованого під номером доступу ОМ АСС2737, О5М
АСС2г738, О5М АСС2739, ОМ АСОС2740, ОМ АСС2741, ОМ АСОС2742, ОМ АСОС2743, ОМ
АСС2745, ОМ АСС2746, О5М АСС2747, ОМ АСС2748, О5М АСС2808, О5М АСС2809 або
О5М АСС2810, (ії) антитіл, що представляють собою химеризовані або гуманізовані форми антитіл за п. (і), (ії) антитіл, які проявляють специфічність антитіл за п. (і), і (м) антитіл, які містять антигензв'язувальну ділянку або антигензв'язувальний сайт, зокрема, варіабельну область антитіл за п. (ї), і бажано антитіл, які проявляють специфічність, за п. (). В одному втіленні антитіло кон'юЮгтоване з терапевтичним засобом, як то токсином, радіоізотопом, лікарським препаратом або цитотоксичним засобом.
В одному втіленні спосіб запропонований винаходом передбачає введення антитіла, яке має здатність зв'язуватись з СІ ОМ18.2, у дозі аж до 1000 мг/м. В одному втіленні спосіб запропонований винаходом передбачає кількаразове введення антитіла, яке має здатність зв'язуватись з СІ ОМ18.2, у дозі від 300 до 600 мг/м.
Відповідно до винаходу, СІ ОМ18.2 бажано має амінокислотну послідовність згідно 5ЕО ІЮ
МО: 1.
Зо В одному втіленні описаний тут рак є СІ ОМ18.2-позитивним. В одному втіленні ракові клітини описаного тут раку є СГОМ18.2-позитивними. В одному втіленні ракові клітини описаного тут раку експресують СГ ОМІ18.2 на своїй клітинній поверхні.
В одному втіленні описаний тут рак підшлункової залози включає первинний рак, рак на пізніх стадіях або метастатичний рак або їх комбінації типу комбінації первинного раку підшлункової залози й метастатичного раку. В одному втіленні способи запропоновані винаходом призначені для одночасного лікування первинного раку й рака здатного утворювати метастази, як то первинного раку підшлункової залози й метастатичного раку підшлункової залози. В одному втіленні рак здатний утворювати метастази включає метастази в лімфатичних вузлах, яєчниках, печінці або легенях або їх комбінації. В одному втіленні рак підшлункової залози включає рак проток підшлункової залози. В одному втіленні рак підшлункової залози включає аденокарциному або карциному або їх комбінацію. В одному втіленні рак підшлункової залози включає аденокарциному проток, аденокарциному слизової, нейроендокринну карциному або ацинозно-клітинну карциному або їх комбінації. В одному втіленні рак підшлункової залози частково або повністю не піддається лікуванню гемцитабіном типу монотерапії гемцитабіном. В одному втіленні профілактика раку підшлункової залози включає запобігання рецидиву рака підшлункової залози.
В одному втіленні у пацієнта, що підлягає лікуванню відповідно до винаходу, була операція із приводу раку підшлункової залози. В одному втіленні в пацієнта є передракові ураження підшлункової залози, зокрема, передракові ураження підшлункової залози, які включають виникнення злоякісних гістологічних змін у протоках підшлункової залози. У цих втіленнях способи запропоновані винаходом бажано спрямовані на запобігання розвитку злоякісного раку підшлункової залози.
У наступному аспекті даного винаходу передбачені лікарські препарати для лікування або профілактики раку підшлункової залози, які включають: (ії) антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, і (ії) засіб, який стабілізує або посилює експресію СІ ОМ18.2. Лікарські препарати даного винаходу можуть додатково містити засіб, який стимулює Т-клітини уб.
Антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, і засіб, який стабілізує або посилює експресію СІ ОМ18.2, а також, необов'язково, засіб, який стимулює Т-клітини уб, можуть перебувати в лікарському препараті у вигляді суміші або окремо один від одного. Лікарський бо препарат може бути представлений у вигляді набору, що включає перший контейнер, який містить антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, і другий контейнер, який містить засіб, який стабілізує або посилює експресію СІ ОМ18.2, а також, необов'язково, контейнер, який містить засіб, який стимулює Т-клітини уб. Лікарський препарат може додатково супроводжуватися друкованими інструкціями щодо застосування препарату для лікування або профілактики раку підшлункової залози, зокрема, щодо застосування препарату способом запропонованим винаходом. Різні втілення лікарських препаратів, зокрема, антитіл, які мають здатність зв'язуватись з СІ ОМ18.2, засобів, що стабілізують або посилюють експресію
СІОМ18.2, і засобів, що стимулюють Т-клітини уб, уже описані вище для способів запропонованих винаходом.
В окремому аспекті даного винаходу передбачені лікарські препарати, що включають: (Її) антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, і (її) гемцитабін. Лікарські препарати даного винаходу можуть додатково містити засіб, який стимулює Т-клітини уб. Антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, і гемцитабін, а також, необов'язково, засіб, який стимулює Т- клітини уб, можуть перебувати в лікарському препараті у вигляді суміші або окремо один від одного. Лікарський препарат може слугувати для лікування або профілактики раку, як то рак підшлункової залози. Лікарський препарат може бути представлений у вигляді набору, який включає перший контейнер, який містить антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ! ОМ18.2, і другий контейнер, який містить гемцитабін, а також, необов'язково, контейнер, який містить засіб, який стимулює Т-клітини уб. Лікарський препарат може додатково супроводжуватися друкованими інструкціями із застосування препарату для лікування або профілактики раку типу рака підшлункової залози, зокрема, щодо застосування препарату способом запропонованим винаходом. Різні втілення лікарських препаратів, зокрема, антитіл, які мають здатність зв'язуватись з СІ ОМ18.2, засобів, що стабілізують або посилюють експресію СІ ОМ18.2, і засобів, що стимулюють Т-клітини уб, уже описані вище для способів запропонованих винаходом.
Даним винаходом також передбачені описані тут засоби, такі як антитіла, які мають здатність зв'язуватись з СІ ОМ18.2, і/або засоби, що стабілізують або посилюють експресію
СІГОМ18.2, для застосування в описаних тут способах. Наприклад, даним винаходом також передбачені антитіла, які мають здатність зв'язуватись з СІ ОМ18.2, для введення в комбінації із
Зо засобом типу гемцитабіну, що стабілізують або посилюють експресію СІ ОМ18.2, а також, необов'язково, засобом, який стимулює Т-клітини уб.
Інші особливості й переваги даного винаходу стануть зрозумілими з наступного докладного опису й формули винаходу.
Короткий опис фігур
Фіг. 1. Лентивірусний вектор, який використовують для трансдукції клітин ракових ліній підшлункової залози. СІ ОМ18.2 людини клонували нижче промотору ЕЕТа. Експресійну касету вставляли між довгими кінцевими повторами (5' і 3-І ТЕ), які сприяють упаковуванню й зворотній транскрипції вірусної МРНК. КМ: вірус саркоми Кои5 забезпечує Таї-незалежне одержання вірусної мРНК. Атр: ген стійкості до ампіциліну. РОеКр: промотор бластицидіну. УМУРРЕ: посттранскрипційний регуляторний елемент мжмооасписк; підвищує експресію трансгена. ТЕ: довгий кінцевий повтор, сприяє упаковуванню вірусу. 5М40А сприяє термінації транскрипції й поліаденілюванню мРНК. рос: скелет бактеріального вектора. Віа: промотор ампіциліну.
Фіг. 2. Аналіз утворення метастаз клітин підшлункової залози в легенях миші. Схема розтину легенів у мишей після в/в уведення їм ракових клітин підшлункової залози.
Фіг. 3. Експресія СІГОМ18.2 у нормальних і ракових тканинах підшлункової залози.
Фарбування фіксованої формаліном і залитої в парафін (БЕРЕ) нормальної тканини підшлункової залози (А) і тканини аденокарциноми підшлункової залози (В) за допомогою моноклонального антитіла 35-22А миші (0,2 мкг/мл). Контрастне фарбування гематоксиліном (2:00 хв.). Збільшення х 200.
Фіг. 4. Експресія СІОМ18.2 у нормальних й передракових тканинах підшлункової залози.
Фарбування за допомогою 43-14А різних передракових структур у нормі (А) і Рапім1; Рапіма (В);
РапімМ3 (С). Збільшення х 200.
Фіг. 5. Пілотне дослідження. Кореляція між інтенсивністю сигналу СІ ОМ18.2 ї кількістю позитивних пухлинних клітин при аналізі первинних пухлин підшлункової залози. Кожна точка представляє випадок первинного раку підшлункової залози при аналізі шляхом фарбування
ЕЕРЕ-зрізів за допомогою моноклонального антитіла 35-22А миші (0,2 мкг/мл). Пунктирною лінією відзначене значення в 10 95.
Фіг. 6. Пілотне дослідження. Експресія СІ ОМ18.2 у тканинах первинних і метастатичних пухлин підшлункової залози. Фарбування РЕРЕ-зрізів тканини (3 мкм) за допомогою бо моноклонального антитіла 35-22А миші в первинній пухлині аденокарциноми (А) і метастазах у лімфатичних вузлах (В). Контрастне фарбування гематоксиліном (Мауегв).
Фіг. 7. Основне дослідження. Кореляція між інтенсивністю сигналу СГ ОМ18.2 ї кількістю позитивних пухлинних клітин при аналізі первинних пухлин підшлункової залози. Кожна точка представляє випадок первинної пухлини аденокарциноми проток підшлункової залози (чорні кружечки) або первинної нейроендокринної пухлини (світлі кружечки) при аналізі шляхом фарбування ЕРЕРЕ-зрізів за допомогою моноклонального антитіла 43-14А миші (0,2 мкг/мл).
Фіг. 8. Кореляція між інтенсивністю сигналу СІ ОМ18.2 і кількістю позитивних пухлинних клітин при аналізі метастазів підшлункової залози. Кожна точка представляє випадок метастазів рака підшлункової залози в лімфатичних вузлах (чорні кружечки) або печінки (світлі кружечки) при аналізі шляхом фарбування ЕГЕРЕ-зрізів за допомогою моноклонального антитіла 43-14А миші (0,2 мкг/мл). Пунктирною лінією відзначене значення в 10 95.
Фіг. 9. Експресія СГОМ18.2 у тканинах первинних і метастатичних пухлин підшлункової залози. Фарбування ЕЕРЕ-зрізів тканини (3 мкм) за допомогою моноклонального антитіла 43- 14А миші в первинних пухлинах аденокарциноми (А, С, Е) і їх метастазах у лімфатичних вузлах (В, 0, РЕ). Контрастне фарбування зрізів гематоксиліном (Мауег5).
Фіг. 10. Графічний аналіз. Експресія СОМ18.2 у тканинах первинних пухлин підшлункової залози й відповідних метастазів у лімфатичних вузлах.
Фіг. 11. Експресія СІ ОМ18.2 у тканинах первинних пухлин підшлункової залози й відповідних метастазів. Фарбування ЕЕРЕ-зрізів тканини (3 мкм) з первинної аденокарциноми (А), метастазів у печінці (В) і метастазів у лімфатичних вузлах (С) за допомогою моноклонального антитіла 43-14А миші. Контрастне фарбування зрізів гематоксиліном (Мауег5). Збільшення х200.
Фіг. 12. Рівень мРНК СІ ОМ18.2 у клітинних лініях карциноми підшлункової залози. (А) Аналіз експресії методом кількісної ПЛР у різних лініях клітин СА підшлункової залози, трансдукованих лентивірусом (ІМТ) лініях клітин (сірі стовпчики), лінії клітин рака шлунка КАТО-ІПЇ (позитивний контроль) і лінії клітин рака молочної залози 5КВК-3 (негативний контроль). Транскрипти
СІГОМ18.2 ампліфікували за допомогою геноспецифічних праймерів. Ендогенні лінії клітин, що дають відносний рівень експресії більш ніж 1 х 10», оцінювали як СІ ОМ18.2-позитивні (заштриховані стовпчики). МТС: контрольний зразок з Нг2О. Планки похибок: середнє ж 50. (8-0)
Зо Аналіз залежної від пасажу експресії СГОМ18.2 у клітинах Раїшв9885 (В), Рапсо5.04 (С) і зазначених лініях І МТ-клітин (0). Номер пасажу зазначений під кожним стовпчиком.
Фіг. 13. Рівень білка СГ ОМ18.2 у клітинних лізатах ліній клітин карциноми підшлункової залози. Білки розділяли на 12,5 95 50О5-РАСЕ. Вестерн-блотинг проводили за допомогою антитіла СГ ОМ18, що розпізнає С-кінцеву ділянку СГОМ18.1 і СІ ОМ18.2 (Хутеа-МІЮ), ї за допомогою контрольного антитіла, що розпізнає ДрВ-актин. Час експозиції - 140 с (Ріегсе з"ирегзідпа! Ууезі Оига) і 20 с (Рієгсе З,уирегзідпа! Умеві Рісо), відповідно. (А) Виявлення СІ ОМ18 у лізатах клітинних ліній підшлункової залози, лізатах клітин позитивного контролю (НЕК293-р740) і негативного контролю (5КВК-3). (В) Порівняння експресії СІОМ18.2 між лізатами нетрансдукованих вихідних клітин і лізатами трансдукованих лентивірусом (МТ) клітинних ліній.
Як позитивний й негативний контроль, відповідно, додавали клітини Раїйи89885 і БКВА-3.
Фіг. 14. Виявлення й клітинна локалізація експресії СГОМ18 у клітинах ракових ліній підшлункової залози. Фарбування клітин ракових ліній підшлункової залози, вирощених на покривних скельцях. Антитіло: 35-22А (збільшення х 20, час експозиції зазначений під кожним знімком). Для фарбування ядер використовували ОАРІ (сині). А: А5РС1; В: ВХРОЗ; С: СЕРАС; 0:
БАМаИ; Е: НРАР-ІЇ; Е: НОР-Т3; б: НОР-ТА4; Н.І: КСІ-М3; І: Рапсі1; У: РапсОо5.04; К: РапсОо2.04; |:
Рапс0о4.03; М: Раїшв9е902; М: Раїш89885; 0: 5,ци86.86; Р: Бий-2, 0: 5МУ-1990; В: МАРС; 5: контрольна лінія ракових клітин шлунка КАТО-ПІ.
Фіг. 15. Виявлення й клітинна локалізація експресії СГОМ18 у трансдукованих СІ ОМ18.2 клітинах ракових ліній підшлункової залози. Детектування СІОМ18 у трансдукованих лентивірусом (МТ) клітинах ракових ліній підшлункової залози за допомогою антитіла 35-22А після фіксації й пермеабілізації Для детектування використовували мічені АЇеха488 або
АІеха555 вторинні антитіла. А: ВХхРОЗ3-І МТ; В: САРАМІ1-Ї МТ; С: ЮВАМО-І МТ; 0: НРАС-Ї МТ; Е:
МіаРасСа?2-ІЇ МТ; Е: Раїшвоб2-Ї МТ; с: Зий-2-СКО; Н: МАРС-Ї МТ.
Фіг. 16. Зв'язування ІМАВЗ62 із клітинною поверхнею СІ ОМ18.2-позитивних ліній клітин СА підшлункової залози (фармакодинаміка). ІР-аналіз клітин ракових ліній підшлункової залози (А,
В, р, Е), трансдукованих лентивірусом клітинних ліній підшлункової залози (І) і контрольних ракових клітин шлунка КАТО-П (С, Е), які експресують СІ ОМ18.2. Клітини фарбували ІМАВЗ362 за нативних умов (О-Е), а для порівняння - 35-22А після фіксації й пермеабілізації клітин (А-0).
Для фарбування ядер використовували САРІ. Час експозиції зазначений на кожній панелі. (з: 60 ВхРОЗ-Ї МТ; Н: САРАМІ1-І МТ; І: ОАМИ-Ї МТ; У: МіаРаСаг-ІЇ МТ; К: Рашшв902-І МТ І: Бийе-І МТ.
Фіг. 17. Експресія СГ ОМ18.2 у привитих пухлинах з різних клітинних ліній. Експресія
СІ ОМ18.2 у привитих пухлинах САРАМТІ-Ї МТ (А, В), ВхРОЗ-І МТ (С, Б), РАТО89885-І МТ (Е, Б),
МіаРаСа2-І МТ (С, Н), МАРС-І МТ (У, К) ії ОАМО-Ї МТ (І, М). Проводили фарбування тканин за допомогою антитіла 2утеа-МІО. Збільшення об'єктива х10 (А, С,Е, 5,9, 1)3іх20(8,0, БЕ, Н, К,
М).
Фіг. 18. Перевірка приживання клітин ракових ліній 5ий-2 і МіаРаСа2 підшлункової залози.
Клітини вводили у хвостову вену мишей пиде. Тварин забивали через 45 (А), 52 (В), 59 (С) днів після введення Зий-2 (А-С) або через 59 (0), 66 (Е), 73 (Е) днів після введення МіаРаСа? (0-РЕ).
Легені препарували й фарбували за допомогою антитіл до МНС класу І (проти МНС І людини, клон ЕРК1394У) для виявлення клітин людини в тканинах миші.
Фіг. 19. Аналіз приживання метастазів Раїш89885. Клітини Раїш89885 уводили мишам Ми/Ми внутрішньовенно по 1х105 або 2х105 клітин і в різні моменти часу в мишей видаляли легені (А) і печінку (В), як зазначено під віссю х. Для обчислення 95 присутності ДНК людини в кожному препараті тканини будували стандартну криву, змішуючи ДНК людини й миші й роблячи 7х5- разових розведень, одержуючи від 100 95 (1) до 0,0064 95 (7) ДНК людини.
Фіг. 20. Аналіз методом ІНС метастазів Раїшв9885 у тканинах легенів миші. Мишам уводили у хвостову вену клітини Раїи89885, а через різні проміжки часу (А-О - 70 днів, Б-Н - 86 днів) їх забивали, виділяли тканини легенів і фарбували за допомогою антитіла до МНСО-ІЇ (ЕРА1394У) (А, В, Е, Е) у розведенні 1:1000 або проти клаудину 18 (Хутеа-МІЮ) (С, 0, б, Н) при 0,2 мкг/мл.
Збільшення: А, С,Е, З - х1018, 0, Е, Н - х20.
Фіг. 21. Опосередкований ІМАВ362 апоптоз оброблених гемцитабіном ракових клітин підшлункової залози. Апоптоз індукували зшиванням СІ ОМ18.2 на клітинах ВХРС3-СІ ОМ18 через 48 годин. Клітини ВХхХРС3-СІ ОМ18 культивували в середовищі без або ї- 100 нг/мл гемцитабіну. Частка апоптозних клітин у фракції мононуклеарних клітин зміщалася. Аналогічний зсув спостерігався при інкубації пухлинних клітин з камптотецином.
Фіг. 22. Виразність ІМАВ 362-індукованої АОСС -активності на ракових клітинах підшлункової залози. (АХ АОСС проводили з СІ 0ОМ18.2-позитивними клітинами ракових ліній підшлункової залози, використовуючи РВМС від різних донорів. (В-Е) АОСС проводили з І МТ-лініями ракових клітин підшлункової залози, які ектопічно експресують СІ ОМ18.2, і відповідними вихідними
Зо клітинами (0): точковий графік.
Фіг. 23. Виразність ІМАВ 362-індукованої СОС -активності на ракових клітинах підшлункової залози. (А) СОС проводили зі збірною сироваткою здорової людини як джерела комплементу,
ІМАВЗ62 і СГОМ18.2-позитивними контрольними клітинами СЮОК1-р740 підшлункової залози в 4-х незалежних експериментах. (ВХУ СОС проводили з СГ ОМ18.2-позитивними (Раїш89885,
САМО, РапсОо5.04) ії СІ 0ОМ18.2-негативними (САРАМІ, Бий2, ВхРСЗ, МАРС) лініями клітин підшлункової залози. (С) СОС проводили з лініями клітин, які ектопічно експресують ІМТ. (0)
Точковий графік, який показує концентрації ІМАВЗ62, що викликають напівмаксимальний ступінь лізису (ЕСво) клітин ракових ліній підшлункової залози. (ЕЕ) Максимальний ступінь знищення клітин, отриманий з ІМАВЗ62 на клітинах ракових ліній підшлункової залози.
Фіг. 24. Вплив обробки ІМАВЗ362 на підшкірні ксенотрансплантати МіаРаСа2-ІЇ МТ. Пухлини- ксенотрансплантати МіаРаСа2-Ї МТ прищеплювали шляхом ін'єкції 1х107 клітин МіаРаСа2-І МТ підшкірно в бік 15 самкам безтімусних мишей пиде Нза:Рохп1і"" на кожну групу обробки. На третій день після введення ракових клітин починали обробку по 200 мкг ІМАВЗ62 або контролів, відповідно. Обробку продовжували по 2 рази на тиждень, чергуючи в/о і в/в уведення аж до забою тварин. (А) Вплив обробки ІМАВЗ362 на ріст пухлин. Розмір п/ш пухлин вимірювали 2 рази на тиждень (середнє ї- ЗЕМ). (В) Графіки виживання Каріап-Меїєег. Мишей забивали, коли об'єм пухлин досягав 1400 мм3 або ж на пухлинах утворювались виразки.
Фі. 25. Обробка ІМАВЗ362 підшкірних ксенотрансплантатів ВХхХРСЗ-Ї МТ.Пухлини-
Ксенотрансплантати ВхРС3-ЇМТ прищеплювали шляхом ін'єкції 1х107 клітин ВхХРСОЗ-Ї МТ підшкірно в бік 15 самкам безтімусних мишей пиде Нза:Рохпі"" на кожну групу обробки. На третій день після введення ракових клітин починали обробку по 200 мкг ІМАВЗ62 або контролів, відповідно. Обробку продовжували по 2 рази на тиждень, чергуючи в/о і в/в уведення аж до вибою тварин. (А) Вплив обробки ІМАВЗ62 на ріст пухлин. Розмір п/ш пухлин вимірювали 2 рази на тиждень (середнє ї- ЗЕМ). (В) Графіки виживання Каріап-Меїєег. Мишей забивали, коли об'єм пухлин досягав 1400 мм3 або ж на пухлинах з'являлись виразки.
Фіг. 26. Вплив обробки ІМАВЗ362 на ріст панкреатичних метастазів 5ий2-ІМТ. По 2х105 ракових клітин Зий2-Ї МТ уводили внутрішньовенно у хвостову вену 12 самкам безтімусних мишей пиде Нза:Рохп1"ч на кожну групу обробки. На третій день після введення ракових клітин починали обробку по 200 мкг ІМАВЗ362, 200 мкг ізотипного контролю або рівним об'ємом РВ5. бо Тварин забивали на 42-й день після трансплантації. (А) Аналіз методом кількісної ПЛР (середнє з 2-4 реакцій на 1 зразок) для визначення процентного вмісту ДНК людини в зразках легенів у мишей. (В) Відсоток покритої клітинами людини поверхні легенів у мишей за даними планіметрії. Імуногістохімічне фарбування клітин людини на зрізах тканин за допомогою антитіла проти МНС класу І людини. " р «0,05 (тест КтгизКаІ-УМайій5). Планки похибок: середнє ж
ЗО.
Фіг. 27. Аналіз методами кількісної ПЛР ії ІНС метастазів Раїш89885 у легенях. Мишам уводили по 2х105 клітин Раїш89885 на мишу. Через 65 днів тварин забивали. Світлі кружечки: мишей забивали через 63 дня. (А) Мишей обробляли по 2 рази на тиждень 200 мкг ІМАВЗ362 або контрольним фізрозчином. Кількість ДНК людини (нг) при визначенні методом кількісної ПЛР розраховували за значеннями СІ. (В) Повтор експерименту по к-ПЛР, як описано в А. При цьому процентний вміст ДНК людини в ДНК миші розраховували за значеннями СІ. (С) Мишей обробляли ІМАВЗ362 і контрольним антитілом того ж ізотипу (ритуксимаб). Процентний вміст
ДНК людини в легенях мишей розраховували за значеннями СІ. У групи ІМАВЗ62 виявився один викид (світлий трикутник). Значимість приводиться як із включенням, так і з виключенням значень викиду. (0/Е) Такий же експеримент, як і в С. При цьому площа метастазів визначали за допомогою програми Ітаде 9. На точкових графіках значимість інгібування ІМАВЗ362 представлена як із включенням (0), так і з виключенням (Е) значення викиду. Значення р: непарний і-критерій. Планки похибок: середнє х 50.
Фіг. 28. Криві доза-відповідь для гемцитабіну. Клітини ракових ліній підшлункової залози проявляють дуже великі відмінності в чутливості до гемцитабіну. Клітинні лінії піддавали впливу різних концентрацій гемцитабіну протягом 4 днів і визначали інгібування проліферації за допомогою аналізу на життєздатність.
Фіг. 29. Криві доза-відповідь для оксаліплатину. Клітини ракових ліній підшлункової залози проявляють дуже суттєві відмінності щодо чутливості до оксаліплатину. Клітинні лінії піддавали впливу різних концентрацій оксаліплатину протягом 4 днів і визначали інгібування проліферації за допомогою аналізу на життєздатність.
Фіг. 30. Вплив обробки хіміотерапевтичними засобами на експресію СІ ОМ18.2 (РНК). РНК у необроблених і попередньо оброблених Сет (1 нг/мл) або зетох (Сет 1 нг/мл «ж Ох 10 нг/мл) клітин САМО (2 дні) (А) або Раїш89885 (В) при обробці протягом З днів Сет (10 нг/мл або
Зо бетоОх (Сет 10 нг/мл ї- Ох 100 нг/мл). РНК перетворювали на кДНК і визначали рівень транскриптів СГОМ18.2 кількісним методом ПЛР у реальному часі. Результати представлені у відносних одиницях у порівнянні з рівнем транскрипта гена домашнього господарства НРЕТ.
Фіг. 31. Вплив хіміотерапії на рівень білка С ОМ18.2 у клітинах карциноми підшлункової залози. Аналізу на експресію СІ ОМ18.2 піддавали загальний білок із клітинних лізатів необроблених (тес) і попередньо оброблених Сет (1 нг/мл) або бетох (СЕМ 1 нг/мл ж Ох 10 нг/мл) клітин САМО (А) або Раїш89885 (В) при детектуванні за допомогою поліклональної антисироватки 2утей С-їепт. Для перевірки однакового нанесення білків використовували актин.
Фіг. 32. Аналіз методом РАС5 експресії СГ ОМ18.2 на клітинній поверхні. Експресія СІ ОМ18 (темна гістограмма) при культивуванні Раїш89885 у середовищі (ліворуч) і обробці Сет (праворуч) представлена у вигляді накладення на ізотипний контроль. Клітини Раїш89885 обробляли гемцитабіном (10 нг/мл) протягом З днів.
Фіг. 33. Аналіз клітинного циклу в клітин ЮШАМОС, оброблених або не оброблених гемцитабіном (СЕМ; 2 нг/мл) або гемцитабіном ж оксаліплатином (сетох; 1 нг/мл « 10 нг/мл) протягом двох днів. (А) Обробка гемцитабіном приводить до зупинки клітинного циклу клітин у фазі 5. Площа кожного стовпчика розділена для того, щоб показати відсоток клітин у фазах (50/01, 5 і 2. (В) Вестерн-блотинг показав позитивну регуляцію СІ ОМ18 після обробки сет.
Фіг. 34. Вплив гемцитабіну на клітинний цикл (А) і експресію СГ ОМ18.2 (В, С) у клітинах
Раїш89885. Клітини Раїш89885 обробляли або не обробляли гемцитабіном (10 нг/мл) протягом 2 днів. (АХ Площа кожного стовпчика розділена для того, щоб показати відсоток клітин у фазах 0/1, 5 і 52. На графіку представлена щільність СІ ОМ18.2 (по осі х) відносно кількості клітин (по осі у). (В) Експресія СІОМ18.2 за відсутності обробки (пунктирна лінія) у порівнянні з обробкою Сет (суцільна лінія). (С) Експресія СІ ОМ18.2 в оброблених Сет клітинах Раїш89885 у фазі 50/01 (пунктирна лінія) у порівнянні із клітинами у фазі 5 (суцільна лінія).
Фіг. 35. Вплив хіміотерапії на ракові клітини шлунка. Культивування клітин КАТО-ЇЇ протягом 96 год. приводить до зупинки клітинного циклу у фазі (30/51 (а) і негативної регуляції СІ ОМ18.2 (с). Цитостатичні сполуки, що викликають зупинку клітинного циклу в різних фазах клітинного циклу, стабілізують експресію СІ ОМ18.2 (с).
Фіг. 36. Вплив хіміотерапії на ракові клітини шлунка. Цитостатичні сполуки, які викликають бо зупинку клітинного циклу в різних фазах клітинного циклу: фазі 5/52 (іринотекан) або фазі 52
(доцетаксель). Площа кожного стовпчика розділена для того, щоб показати відсоток клітин у фазах 0/1, 5 і 62.
Фіг. 37. Криві доза-відповідь для опосередкованої ІМАВЗ362 АОСС після хіміотерапевтичної обробки клітин ЮАМО. (А) Криві доза-відповідь в одного репрезентативного донора після попередньої обробки ракових клітин ПОАМО підшлункової залози за допомогою Сет або бетох протягом 40 год. (В) Значення ЕСво (середні) для опосередкованої ІМАВЗ362 АОСС. Значення р: непарний і-критерій.
Фіг. 38. Вплив хіміотерапії на ракові клітини шлунка. а: Клітини, оброблені іринотеканом, доцетакселем або цисплатином, проявляють більш низький рівень життєздатних клітин у порівнянні з культивованими в середовищі клітинами мішені. с/4: Експресія СІ ОМ18.2 у клітинах, оброблених іринотеканом, доцетакселем або цисплатином, підвищувалася в порівнянні із клітинами, культивованими в середовищі. с/і: Обробка клітин іринотеканом, доцетакселем або цисплатином посилює здатність ІМАВЗ62 індукувати АОСС.
Фіг. 39. Вплив хіміотерапевтичних засобів на опосередковану ІМАВ362 СОС у клітин
МіаРасСа?2-ІЇ МТ. Криві доза-відповідь за 2 незалежними дослідами. МіаРаСа2-І| МТ культивували або в середовищі з Сет (10 нг/мл) або в середовищі з бетох (10 нг/мл бет « 100 нг/мл Ох) протягом 70 год.
Фіг. 40. Вплив хіміотерапії на індуковану ІМАВЗ362 СОС.
Фіг. 41. Вплив обробки ІМАВЗ362 у комбінації з Сет або бетоОх на ксенотрансплантати
ВхХРОЗ-ІЇ МТ. Пухлини-ксенотрансплантати ВхРС3-І МТ прищеплювали шляхом ін'єкції 8,5х105 клітин ВХРОЗ-Ї МТ підшкірно в бік 10 самкам безтімусних мишей пиде Нза:Рохпі"ч на кожну групу обробки. На третій день після введення ракових клітин починали застосування хіміотерапії (50 мг/кг гемцитабіну в/о або 50 мг/кг гемцитабіну плюс 5 мг/кг оксаліплатину в/о, відповідно) і продовжували її раз на тиждень протягом 6 тижнів. Через 24 год. після введення хіміотерапевтичних засобів уводили внутрішньовенно у хвостову вену 800 мкг ІМАВЗ362 або контролю. Обробку ІМАВЗ362 продовжували раз на тиждень аж до забивання мишей. (А) Криві росту підшкірних ксенотрансплантатів ВХРОЗ-І МТ. Розмір п/ш пухлин вимірювали два рази на тиждень (середнє ї- ЗЕМ). (В) Криві виживання Каріап-Меїег. Мишей забивали, коли об'єм пухлин досягав 1400 мм3 або ж на пухлинах утворювались виразки.
Зо Фіг. 42. Підвищення протипухлинної ефективності при комбінуванні гемцитабіну з ІМАВЗ362.
Пухлини-ксенотрансплантати ВХРОЗ-І МТ прищеплювали шляхом ін'єкції 8,5х109 клітин ВХРОЗ-
ЇМТ підшкірно в бік 10 самкам безтімусних мишей пиде Нза:Рохп1"ч на кожну групу обробки. На третій день після введення ракових клітин починали застосування хіміотерапії (100 мг/кг гемцитабіну в/о або 100 мг/кг гемцитабіну плюс 5 мг/кг оксаліплатину в/о, відповідно) і продовжували її раз на тиждень протягом б тижнів. Через 24 год. після введення хіміотерапевтичних засобів уводили внутрішньовенно у хвостову вену 200 мкг (1/2 дози) або 400 мкг (повна доза) ІМАВЗ362. Обробку ІМАВЗ362 продовжували по 2 рази на тиждень, чергуючи в/о і в/в уведення аж до забивання мишей. (А) Криві росту підшкірних ксенотрансплантатів ВХРОС3-
Ї МТ. Розмір п/ш пухлин вимірювали два рази на тиждень (середнє ї- ЗЕМ). (В) Криві виживання
Каріап-Меїег. Мишей забивали, коли об'єм пухлин досягав 1400 мм" або ж на пухлинах утворювались виразки.
Фіг. 43. Вплив обробки ІМАВ362 у комбінації з гемцитабіном на ксенотрансплантати
МіаРаСа2-ІЇ МТ. Пухлини-ксенотрансплантати МіаРаСа2-Ї МТ прищеплювали шляхом (ін'єкції 5х106 клітин МіаРаСа2-Ї МТ підшкірно в бік 10 самкам безтімусних мишей пиде Нза:Рохпі"» на кожну групу обробки. Через 4 дня після введення ракових клітин починали застосування хіміотерапії (50 мг/кг гемцитабіну в/о) і продовжували її раз на тиждень протягом 6 тижнів. Через 24 год. після введення хіміотерапевтичних засобів уводили внутрішньовенно у хвостову вену 200 мкг ІМАВ362 або контролю. Обробку ІМАВ362 продовжували по 2 рази на тиждень, чергуючи в/о і в/в уведення аж до забивання мишей. (А) Ріст підшкірних ксенотрансплантатів.
Розмір пухлин вимірювали два рази на тиждень (середнє ї- ЗЕМ). (В) Криві виживання Каріап-
Меїег. Мишей забивали, коли об'єм пухлин досягав 1400 мм3 або ж на пухлинах утворювались виразки.
Фіг. 44. Вплив обробки ІМАВЗ62 у комбінації з гемцитабіном на привиті пухлини- ксенотрансплантати МіаРасСа?2-їЇ МТ. Пухлини-ксенотрансплантати МіаРаСа2-І! МТ прищеплювали шляхом ін'єкції 1х107 клітин МіаРаСа2-ІЇ МТ підшкірно в бік самкам безтімусних мишей пиде Нза:Рохпі"ч, Через 9 днів після підшкірної інокуляції мишей, які мали пухлини, розбивали на однорідні групи обробки по 8 тварин у групі й починали обробку. Мишам уводили 150 мг/кг гемцитабіну в/о по 2 рази на тиждень протягом 4 тижнів. Через 24 год. після введення гемцитабіну вводили внутрішньовенно у хвостову вену 200 мкг ІМАВЗ362 або контролю. Обробку бо ІМАВЗ362 продовжували по 2 рази на тиждень, чергуючи в/о і в/в уведення аж до забивання мишей. (А) Розмір підшкірних пухлин вимірювали два рази на тиждень (середнє ї- ЗЕМ; - р «0,01). (В) Криві виживання Каріап-Меїег. Мишей забивали, коли об'єм пухлин досягав 1400 мм або ж на пухлинах утворювались виразки (лог-ранговий критерій МапієІ-Сох; 7" - р «0,01).
Фіг. 45. Вплив ІМАВ362 у комбінації з гемцитабіном на метастази в легенях на моделі ксенотрансплантації Раїш89885. Уводили внутрішньовенно 2х105 ракових клітин Раїш89885 у хвостову вену 12 самкам безтімусних мишей пиде Нза:Рохп1"ч" на кожну групу обробки. Через 2 тижні після внутрішньовенного введення ракових клітин починали обробку 200 мкг ІМАВЗ62 по 2 рази на тиждень (чергуючи в/в - в/о) у комбінації із уведенням 100 мг/кг гемцитабіну в/о по 2 рази на тиждень протягом 4 тижнів. Контрольна група одержувала по 200 мкг контрольного антитіла того ж ізотипа в комбінації з 100 мг/кг гемцитабіну по 2 рази на тиждень. Тварин забивали на 70-й день після трансплантації. (А) Кількісне визначення методом ПЛР (середнє з З реакцій на 1 зразок) ДНК людини в зразках легенів в, що одержували ІМАВЗ62 та ізотипне антитіло мишей. (В) Відсоток покритої клітинами людини поверхні легенів у мишей визначали на основі комп'ютерного аналізу. Проводили імуногістохімічне фарбування за допомогою антитіла проти МНО-Ї людини (клон ЕРК1394У) залитих у парафіні тканинах легенів (середнє я ЗЕМ; р - 0,0003, критерій Мапп-У/піпеу). С і ОЮ: Приклади імуногістохімічного фарбування за допомогою антитіла проти МНО-Ї людини метастазів Раїш89885 у легенях у мишей, які одержували
ІМАВЗ362 - гемцитабін (С) або ізотипне антитіло «т гемцитабін (0).
Розкриття сутності винаходу
Незважаючи на те, що даний винахід докладно описаний нижче, слід мати на увазі, що він не обмежується конкретними методами, методиками й реагентами, описаними тут, оскільки вони можуть варіюватися. Також слід мати на увазі, що термінологія, яка тут використовується служить тільки для опису конкретних втілень і не повинна обмежувати об'єм даного винаходу, який обмежується лише прикладеною формулою винаходу. Якщо не зазначено іншого, усі технічні й наукові терміни, які тут використовується, мають такі значення, які широко відомі пересічним фахівцям у даній галузі.
Далі будуть описані всі елементи даного винаходу. Ці елементи приводяться разом з конкретними втіленнями, однак слід мати на увазі, що їх можна комбінувати будь-яким способом і в будь-якій кількості для створення додаткових втілень. Наведені приклади й кращі втілення не повинні розглядатися як такі, що обмежують даний винахід тільки явно описаними втіленнями. Такий опис слід розуміти як такий, що підтримує та охоплює такі втілення, у яких явно описані втілення комбінуються з будь-якою кількістю наведених і/або кращих елементів.
Більше того, будь-які перестановки й комбінації всіх описаних елементів у даній заявці слід розглядати як такі, що розкриваються описом даної заявки, якщо з контексту не випливає іншого.
Переважно терміни, які тут використовується, визначаються так, як описано в "А тиШіпдиаї діоззагу ої ріотесппо!іодіса! Тепт5: (ОРАС Кесоптітепааїййоп5)", Н.М. І енепрегдег, В. Мадеї, апа
Н. КОЇБІ, Ед5., Неїмеїіса Спітіса Асіа, СН-4010 Вазеї, Зулїгепапа (1995).
При практичному застосуванні даного винаходу повинні застосовуватися, якщо не зазначено іншого, стандартні методи хімії, біохімії, клітинної біології, імунології й технології рекомбінантної
ДНК, які описані в літературі у даній галузі (наприклад, див. МоїІесшаг Сіопіпд: А Гарогаїюгу
Мапиаї, 2па Еайіоп, У. Ззатрьгоок еї аї., еав., Соїд 5ріїпд Нагбог І арогаїюгу Ргев55, Соїй Бргіпд
Наброг, 1989).
По всьому описі й наведеній далі формулі винаходу, якщо з контексту не випливає іншого, слово "включати" і такі його варіанти, як "включає" і "який включає", слід розуміти як такі, що означають включення зазначеного елемента, числа або стадії або групи елементів, чисел або стадій, але не виключення будь-якого іншого елемента, числа або стадії або групи елементів, чисел або стадій, хоча в якихось втіленнях такі елементи, числа або стадії або групи елементів, чисел або стадій можуть виключатися, тобто це питання полягає у включенні зазначеного
БО елемента, числа або стадії або групи елементів, чисел або стадій. Форми однини при описі винаходу (особливо в контексті формули) слід розуміти як такі, що охоплюють і однину, і множину, якщо інакше не зазначене прямо або явно суперечить контексту. Вказування діапазонів значень тут усього лише служить коротким способом конкретного переліку всіх окремих значень, які охоплюються цим діапазоном. Якщо не зазначено інакшого, кожне окреме значення включається до опису так, ніби воно було вказане окремо. Усі описані тут методи можуть виконуватися в будь-якому придатному порядку, якщо не зазначено інакшого або ж це явно суперечить контексту. Використання яких б то не було прикладів або типових виразів (наприклад, "такий як"), наведених тут, служить тільки лиш для кращого розкриття винаходу й не обмежує обсягу винаходу, заявленого у формулі. Ніякі вирази в описі не слід розуміти як такі, бо що указують на який-небудь незаявлений елемент, необхідний для практичного застосування винаходу.
У тексті даного опису приводяться деякі документи. Кожний з наведених тут документів (включаючи всі патенти, патентні заявки, наукові публікації, специфікації виробника, інструкції тощо), будь-то вище або нижче, тим самим включаються тут у всій повноті як посилання. При цьому ніщо не повинне тлумачитися як допущення того, що винахід не може передбачати такого опису через винаходи, які йому передують.
Термін "СГОМ18" відноситься до клаудину 18 і включає будь-які варіанти, включаючи сплайсинг-варіант 1 клаудину 18 (клаудин 18.1 (СГ ОМ18.1)) і сплайсинг-варіант 2 клаудину 18 (клаудин 18.2 (СГОМ18.2)).
Термін "СІ ОМ18.2" переважно відноситься до СІ ОМ18.2 людини, зокрема, до білка, який містить, бажано складається з амінокислотної послідовності за 5ЕО ІЮ МО: 1 з переліку послідовностей або варіанта даної амінокислотної послідовності.
Термін "СІ ОМ18.1" переважно відноситься до СІ ОМ18.1 людини, зокрема, до білка, який містить, бажано складається з амінокислотної послідовності за 5ЕО ІЮ МО: 2 з переліку послідовностей або варіанта даної амінокислотної послідовності.
Термін "варіант" відповідно до винаходу відноситься, зокрема, до мутантів, сплайс-варіантів, конформацій, ізоформ, алельних варіантів, видових варіантів і видових гомологів, зокрема тих, які зустрічаються в природі. Алельний варіант означає таку зміну в нормальній послідовності гена, значення якої найчастіше є неясним. При повному секвенуванні гена часто ідентифікуються численні алельні варіанти даного гена. Видовий гомолог позначає те, що джерелом походження нуклеотидної або амінокислотної послідовності є інший вид, ніж у даної нуклеотидної або амінокислотної послідовності. Термін "варіант" також охоплює будь-які варіанти, які зазнали посттрансляційної модифікації й конформаційні варіанти.
Відповідно до винаходу, термін "С ОМ18.2-позитивний рак" означає рак за участю ракових клітин, які експресують СІ ОМ18.2, бажано на поверхні даних ракових клітин.
Вираз "клітинна поверхня" використовується відповідно до свого звичайного значення у даній галузі, так що він позначає зовнішню поверхню клітини, яка доступна для зв'язування з білками й іншими молекулами. Наприклад, трансмембранний білок, який має одну або кілька позаклітинних ділянок, вважається таким, що експресуються на клітинній поверхні.
Зо СГОМ18.2 експресується на клітинній поверхні, якщо він розташовується на поверхні даних клітин і доступний для зв'язування з СІ 0ОМ18.2-специфічними антитілами при додаванні їх до клітин.
Відповідно до винаходу, СІ ОМ18.2 практично не експресується в клітинах, якщо його рівень експресії нижче в порівнянні з експресією в клітинах шлунка або тканині шлунка. Бажано рівень експресії становить менше 10 95, бажано менше 5 95, З 95, 2 95, 1 95, 0,5 95, 0,1 95 або 0,05 95 від рівня експресії в клітинах шлунка або тканині шлунка або ще нижче. Бажано СІ ОМ18.2 практично не експресується в клітинах, якщо його рівень експресії перевищує рівень експресії в іншій нераковій тканині, крім шлунка, не більше ніж в 2 рази, бажано в 1,5 рази, а краще не перевищує рівня експресії в даній нераковій тканині. Бажано СІОМ18.2 практично не експресується в клітинах, якщо його рівень експресії нижче від межі виявлення й/або якщо рівень експресії буде занадто низьким для зв'язування СІ ОМ18.2-специфічних антитіл при додаванні їх до клітин.
Відповідно до винаходу, СІ ОМ18.2 експресується в клітинах, якщо його рівень експресії перевищує рівень експресії в іншій нераковій тканині, крім шлунка, переважно більше ніж в 2 рази, бажано в 10 разів, 100 разів, 1000 разів або 10000 разів. Бажано СІ ОМ18.2 експресується в клітинах, якщо його рівень експресії вище від межі виявлення й/або якщо рівень експресії буде достатньо високим для зв'язування СІ 0ОМ18.2-специфічних антитіл при додаванні їх до клітин.
Бажано при експресуванні СГОМ18.2 у клітинах він експресується або виступає на поверхні даних клітин.
Відповідно до винаходу термін "захворювання" позначає будь-який патологічний стан, у тому числі рак, зокрема форми рака, описані тут. Будь-які згадування раку або певних форм раку також включають і їх метастази. У кращому втіленні в захворюванні, що підлягає лікуванню відповідно до даної заявки, беруть участь клітини, які експресують СІ ОМ18.2. "Захворювання, пов'язані із клітинами, які експресують СІ ОМ18.2" або аналогічні вирази означають відповідно до винаходу, що в клітинах уражених тканин або органів експресується
СІГОМ18.2. В одному втіленні експресія СОМ18.2 у клітинах уражених тканин або органів зростає в порівнянні зі здоровою тканиною або органом. Зростання означає підвищення щонайменше на 10 95, зокрема, щонайменше на 20 95, на 50 95, на 100 95, на 200 95, на 500 95, на 1000 95, на 10000 95 або ще більше. В одному втіленні експресія відбувається тільки в бо ураженій тканині, тоді як у відповідній здоровій тканині експресія пригнічується. Наприклад,
СІГОМ18.2 експресується в раковій тканині підшлункової залози, але він не виявляється в нераковій тканині підшлункової залози. Відповідно до винаходу, захворювання, пов'язані із клітинами, які експресують СІ ОМ18.2, включають ракові захворювання. Крім того, відповідно до винаходу, ракові захворювання переважно представлені тими, при яких у ракових клітинах експресується СІ ОМ18.2.
У даному винаході "ракове захворювання" або "рак включає такі захворювання, які характеризуються аномальною регуляцією росту, проліферації, диференціювання, адгезії й/або міграції клітин. Під "раковими клітинами" розуміють аномальні клітини, які ростуть у процесі швидкої, неконтрольованої проліферації клітин і продовжують рости після припинення тих стимулів, які викликали ріст новоутворення. Бажано "ракове захворювання" характеризується наявністю клітин, які експресують СГ ОМ18.2, причому ракові клітини експресують СІ ОМ18.2.
Клітини, які експресують СІ ОМ18.2, бажано є раковими клітинами, бажано описаних тут видів раку.
Відповідно до винаходу, "карцинома" означає злоякісну пухлину, яка походить з епітеліальних клітин. "Аденокарцинома" означає такий рак, який виникає в залозистій тканині. Такі тканини також входять до більшої категорії тканин, відомих як епітеліальні тканини. Епітеліальні тканини включають шкіру, залози й цілий ряд інших тканин, що вистилають порожнини й органи тіла.
Ембріологічно епітелій походить із ектодерми, ендодерми й мезодерми. Для класифікування як аденокарциноми клітини не обов'язково повинні бути частиною залози, якщо лише вони мають секреторні властивості. Ця форма карциноми може виникати в деяких вищих ссавців, включаючи людину. Добре диференційована аденокарцинома звичайно подібна до тієї залозистої тканини, з якої вона походить, тоді як погано диференційована може й не мати подібності. За фарбуванням клітин з біопсії патологоанатом повинен визначити, чи є пухлина аденокарциномою або належить до якогось іншого типу раку. Аденокарцинома може виникати в багатьох тканинах організму внаслідок повсюдної наявності залоз в організмі. Хоча не кожна залоза може секретувати ту саме речовину, однак, якщо клітини виконують екзокринні функції, то вони вважаються залозистими, а їх злоякісні форми при цьому називаються аденокарциномами. Злоякісні аденокарциноми проникають в інші тканини й найчастіше дають
Зо метастази, якщо в них буде досить часу для цього.
Підшлункова залоза - орган ендодермального походження, вона є ключовим регулятором розщеплення білків і вуглеводів і гомеостазу глюкози. Екзокринна частина підшлункової залози (80 95 від маси всього органа) складається з розгалуженої мережі ацинарних клітин і клітин протоків, які виробляють і доставляють травні ферменти в шлунково-кишковий тракт. Ацинарні клітини, які утворюють функціональні одиниці уздовж мережі протоків, синтезують і секретують ферменти в просвіт протоків у відповідь на сигнали зі шлунка й дванадцятипалої кишки. В ацинарних ланках поблизу протоків перебувають центроацинарні клітини. Ендокринна частина підшлункової залози, яка регулює метаболізм і гомеостаз глюкози за допомогою виділення гормонів у кров, складається із чотирьох спеціалізованих типів ендокринних клітин, зібраних у кластери, які називаються острівцями Лангерганса.
Рак підшлункової залози є злоякісним новоутворенням, яке походить із трансформованих клітин, які виникають у тканинах, що складають підшлункову залозу. Рак підшлункової залози посідає четверте місце за смертністю від раку в США, а в усьому світі - восьме. Спочатку рак підшлункової залози найчастіше не викликає симптомів, а більш пізні симптоми, як правило, неспецифічні й різноманітні. Тому рак підшлункової залози часто не виявляється аж до пізніх стадій. Рак підшлункової залози має поганий прогноз: на всіх стадіях разом коефіцієнт виживання до 1 ріку і до 5 років становить 25 905 і б 95, відповідно. При локалізованому захворюванні виживання до 5 років становить приблизно 20 95, тоді як середнє виживання при локалізованому запущеному й при метастатичному захворюванні, які в сукупності складають
БО більше 80 95 хворих, - близько 10 і 6 місяців, відповідно.
Рак підшлункової залози включає аденокарциноми (пухлини, що проявляють залозисту архітектуру), що виникають в екзокринної частини підшлункової залози, і нейроендокринні карциноми, що виникають із острівкових клітин.
Найпоширеніша форма раку підшлункової залози - аденокарцинома протоків, як правило, характеризується помірно або слабо диференційованими залозистими структурами при мікроскопічному дослідженні. Аденокарцинома протоків підшлункової залози (РОАС) звичайно виникає в голівці підшлункової залози з інфільтрацією в навколишні тканини, у тому числі лімфатичні вузли, селезінку й черевну порожнину, а також з метастазами в печінці й легенях.
РОАС головним чином проявляє залозистий профіль із протокоподібними структурами й різним бо ступенем атипії й диференціювання клітин. Менше поширені підтипи РОАС включають колоїдну,
залозисто-плоскоклітинну або саркоматоїдну гістологію. Найчастіше в окремій пухлині існують регіональні відмінності гістології, ступеню злоякісності й ступеню диференціювання. Навіть дрібні первинні ураження звичайно проявляють периневральне й лімфо-судинне інвазіювання, що свідчить про схильність до раннього й далекого поширення.
Другим за поширеністю типом рака екзокринної підшлункової залози є слизуватий.
Слизувата аденокарцинома виробляє великий об'єм муцину, що призводить до кистозного виду при томографії.
Нейроендокринні пухлини підшлункової залози утворюються з клітин, які виробляють гормони (острівкових клітин) підшлункової залози. Ацинозно-клітинні новоутворення виникають із ацинарних клітин підшлункової залози.
Відповідно до винаходу, термін "рак" також включає метастази раку з первинних пухлин типу первинного раку підшлункової залози. Так, якщо, наприклад, згадується рак підшлункової залози, то це також включає метастази раку підшлункової залози, наприклад, метастази в легені, печінку й/або лімфатичні вузли.
Під "утворенням метастаз" розуміють поширення ракових клітин зі свого вихідного місця в інші частини тіла. Утворення метастаз є дуже складним процесом і залежить від відділення злоякісних клітин з первинної пухлини, інвазії в позаклітинний матрикс, проникнення через базальні мембрани ендотелію для потрапляння в порожнину тіла й судини, а потім, після перенесення із кров'ю, інфільтрації в органи-мішені. Нарешті, ріст нових пухлин на місці мішені залежить від ангіогенеза. Утворення метастаз пухлин часто відбувається навіть після видалення первинної пухлини, оскільки пухлинні клітини або їх компоненти можуть залишатися й створювати метастатичний потенціал. В одному втіленні термін "утворення метастаз" відповідно до винаходу відноситься до "віддалених метастазів',7) що означає метастази, віддалені від первинної пухлини й регіональної системи лімфатичних вузлів. В одному втіленні термін "метастази", відповідно до винаходу, відноситься до метастаз у лімфатичних вузлах.
Один конкретний вид метастазів, який можна лікувати за допомогою терапії по винаходу, представлений метастазами, які походять з раку підшлункової залози як первинного сайту. У кращих втіленнях такі метастази рака підшлункової залози представлені метастазами в лімфатичних вузлах, метастазами в легенях і/або метастазами в печінці.
Зо Пухлина Крукенберга - метастатична пухлина яєчників, яка рідко зустрічається і яка складає від 1 95 до 2 95 усіх пухлин яєчників. Пухлина Крукенберга є метастатичною аденокарциномою перснеподібних клітин яєчників. У більшості випадків пухлин Крукенберга (70 95) первинною ділянкою є шлунок. Наступними за поширеністю первинними ділянками є карциноми товстої кишки, апендикса й молочної залози (в основному інвазивна долькова карцинома). Відзначені рідкі випадки пухлин Крукенберга, які походять з карциноми жовчного міхура, жовчовивідних шляхів, підшлункової залози, тонкої кишки, фатерової ампули, шийки матки й сечового міхура/сечової протоки.
Рефрактерним є таке ракове захворювання, для якого певне лікування не є ефективним, причому воно або початково не піддається лікуванню, або перестає піддаватися лікуванню згодом.
Під "лікуванням" розуміють введення суб'єктові сполуки або композиції або комбінації сполук або композицій для запобігання або усунення захворювання, включаючи зменшення розміру пухлини або кількості пухлин у суб'єкта; припинення або уповільнення хвороби в суб'єкта; пригнічення або уповільнення розвитку нового захворювання в суб'єкта; зменшення частоти або тяжкості симптомів і/або рецидивів у суб'єкта, у якого зараз або раніше було захворювання; і/або продовження, тобто збільшення тривалості життя в суб'єкта.
Зокрема, термін "лікування захворювання" включає лікування, скорочення тривалості, ослаблення, запобігання, уповільнення або пригнічення розвитку або погіршення або запобігання або затримку виникнення захворювання або його симптомів.
Термін "пацієнт", відповідно до винаходу, позначає суб'єкта, який підлягає лікуванню, зокрема хворих суб'єктів, включаючи людей, приматів або інших тварин, особливо таких ссавців, як корови, коні, свині, вівці, кози, собаки, кішки або такі гризуни, як миші й пацюки. В найкращому втіленні пацієнтом є людина.
Термін "засіб, який стабілізує або підвищує експресію СІ ОМ18.2" відноситься до таких засобів або комбінацій засобів, надходження яких до клітин призводить до підвищення рівня
РНК ії/або білка СІ ОМ18.2 у даних клітинах, бажано до підвищення рівня білка СІ ОМ18.2 на поверхні клітин у порівнянні із ситуацією, коли клітини не одержують цього засобу або комбінації засобів. Бажано клітини представлені раковими клітинами, зокрема раковими клітинами, які експресують СІ ОМ18.2, тому вони є мішенню для антитіл, які зв'язують СІ ОМ18.2, як то клітини 60 описаних тут типів рака, зокрема, рака підшлункової залози. Термін "засіб, який стабілізує або підвищує експресію СІ ОМ18.2", зокрема, відноситься до таких засобів або комбінацій засобів, надходження яких до клітин призводить до підвищення щільності СІ ОМ18.2 на поверхні даних клітин у порівнянні із ситуацією, коли клітини не одержують цього засобу або комбінації засобів. "Стабілізація експресії СІ ОМ18.2", зокрема, включає ситуації, коли засіб або комбінація засобів запобігає зниженню або зменшує зниження експресії СІ ОМ18.2, наприклад, експресія СІ ОМ18.2 буде знижуватися без застосування засобу або комбінації засобів, а застосування засобу або комбінації засобів запобігає такому зниженню або зменшує таке зниження експресії СІ ОМ18.2. "Підвищення експресії СІ ОМ18.2", зокрема, включає ситуації, коли засіб або комбінація засобів підвищує експресію СІ ОМ18.2, наприклад, експресія СІ ОМ18.2 буде знижуватися, залишатися практично постійною або підвищуватися без застосування засобу або комбінації засобів, а застосування засобу або комбінації засобів підвищує експресію СІ ОМ18.2 у порівнянні із ситуацією без застосування засобу або комбінації засобів, у результаті чого експресія буде вищою в порівнянні із ситуацією, коли експресія СІ ОМ18.2 могла б знижуватися, залишатися практично постійною або підвищуватися без застосування засобу або комбінації засобів.
Відповідно до винаходу, термін "засіб, який стабілізує або підвищує експресію СІ ОМ18.2" включає хіміотерапевтичні засоби або комбінації таких хіміотерапевтичних засобів, як цитостатики. Хіміотерапевтичні засоби можуть впливати на клітини одним з наступних способів: (1) пошкоджувати ДНК у клітинах, так що вони більше не можуть відтворюватися, (2) інгібувати синтез нових ланцюжків ДНК, так що реплікація клітин стає неможливою, (3) зупиняти мітотичні процеси в клітинах, так що клітини не можуть ділитися на дві клітини.
Відповідно до винаходу, термін "засіб, який стабілізує або підвищує експресію СІ ОМ18.2" бажано відноситься до таких засобів або комбінацій засобів, як цитостатичні сполуки або комбінації цитостатичних сполук, надходження яких до клітин, зокрема раковим клітинам, призводить до того, що клітини зупиняються або накопичуються в одній або декількох фазах клітинного циклу, бажано в одній або декількох інших фазах клітинного циклу, ніж фази С1 і 0, бажано інакших, ніж фаза 1, бажано в одній або декількох з фаз 02 або 5 клітинного циклу, як то фази с1/52, 5/052, (52 або 5 клітинного циклу. Термін "клітини зупиняються або накопичуються в одній або декількох фазах клітинного циклу" означає те, що зростає відсоток клітин, які перебувають в одній або декількох фазах клітинного циклу. Кожна клітина в процесі
Зо свого відтворення проходить цикл, який складається із чотирьох фаз. Перша фаза називається
СТ, і в ній клітина готується до відтворення своїх хромосом. Другий етап називається 5, і в цій фазі відбувається синтез ДНК і дуплікація ДНК. Наступна фаза - фаза с2, коли відбувається дуплікація РНК і білків. Заключна стадія - стадія М, яка полягає в реальному поділі клітин. На цій заключній стадії, ДНК і РНК, які пройшли дуплікацію, розділяються й рухаються до різних полюсів клітини, а клітина насправді ділиться на дві однакові функціональні клітини.
Хіміотерапевтичні засоби, які викликають пошкодження ДНК, звичайно приводять до нагромадження клітин у фазі 1 і/або 52. Хіміотерапевтичні засоби, які блокують ріст клітин, перешкоджаючи синтезу ДНК, типу антиметаболітів, звичайно викликають нагромадження клітин у фазі 5. Прикладами таких препаратів є гемцитабін, б-меркаптопурин і 5-фторурацил.
Відповідно до винаходу, термін "засіб, який стабілізує або підвищує експресію СІ ОМ18.2" включає аналоги нуклеозидів, такі як гемцитабін, 5-фторурацил або їх форми проліків, сполуки платини, такі як цисплатин і оксаліплатин, таксани, такі як паклітаксель і доцетаксель, і аналоги камптотецину, такі як іринотекан і топотекан, і комбіновані препарати, як то комбіновані препарати, які включають один або кілька з поміж гемцитабіну, оксаліплатину й 5-фторурацилу, як то комбіновані препарати, які містять гемцитабін і оксаліплатин, гемцитабін і 5-фторурацил, оксаліплатин і 5-фторурацил або інші описані тут комбінації препаратів. Відповідно до винаходу, посилання на засіб, який стабілізує або підвищує експресію СГОМ18.2, як то посилання на аналог нуклеозида, сполуки платини або аналог камптотецину або таксан, наприклад, посилання на гемцитабін, 5-фторурацил, оксаліплатин, іринотекан або паклітаксель, повинні включати і їх форми проліків, такі як складні ефіри, солі або похідні типу кон'югатів даних засобів. Прикладами їх є кон'югати даних засобів з речовинами-носіями, наприклад, пов'язаний з білком паклітаксель типу пов'язаного з альбуміном паклітакселю. Бажано солі даних засобів є фармацевтично прийнятними.
В одному кращому втіленні "засіб, який стабілізує або підвищує експресію СГ ОМ18.2" є або містить "засіб, який індукує імуногенну загибель клітин".
За певних обставин ракові клітини можуть вступати на летальний стресовий шлях, пов'язаний з подачею заданої в просторі й часі комбінації сигналів, яка декодується імунною системою для активації пухлиноспецифічних імунних відповідей (2їмодеї Її... еї аї. (2010) СеїІ 140: 798-804). За таким сценарієм ракові клітини активуються й подають сигнали, які сприймаються бо вродженими імунними ефекторами типу дендритних клітин і запускають когнатну імунну відповідь, яка включає Т-клітини СО8-- і сигналізацію ІЕМ-у для того, щоб загибель ракових клітин могла викликати продуктивну протиракову імунну відповідь. Ці сигнали включають преапоптотичний вплив на шаперон ендоплазматичного ретикулума (ЕК) - кальретикулін (СКТ) на клітинній поверхні, преапоптотичну секрецію АТФ і постапоптотичне вивільнення ядерного білка НМОВІ. У цілому ці процеси становлять молекулярні детермінанти імуногенної загибелі клітин (СО). Антрацикліни, оксаліплатин, і у-опромінення здатні індукувати усі сигнали, які визначають ІСО, тоді як для цисплатину, наприклад, який не здатний індукувати транслокацію
СКТ з ЕК на поверхню клітин, що гинуть, тобто процес, що вимагає ЕК-стресу, необхідне сприяння тапсигаргіну, індуктора ЕК-стресу.
Відповідно до винаходу, термін "засіб, який індукує імуногенну загибель клітин" відноситься до таких засобів або комбінацій засобів, які при надходженні їх до клітин, зокрема ракових клітин, здатні індукувати вступ клітин на летальний стресовий шлях, який в остаточному підсумку викликає пухлиноспецифічні імунні відповіді. Зокрема, засоби, які індукують імуногенну загибель клітин, при надходженні їх до клітин викликають подачу клітинами заданої в просторі й часі комбінації сигналів, що включають, зокрема, преапоптотичний вплив на шаперон ендоплазматичного ретикулума (ЕК) - кальретикулін (СКТ) на клітинній поверхні, преапоптотичну секрецію АТФ і постапоптотичне вивільнення ядерного білка НМОВІ1.
Відповідно до винаходу, термін "засіб, який індукує імуногенну загибель клітин", охоплює антрацикліни й оксаліплатин.
Термін "аналог нуклеозида" відноситься до структурних аналогів нуклеозидів - категорії, яка включає й аналоги пуринів, і аналоги піримідинів.
Термін "тгемцитабін" позначає сполуку, яка є аналогом нуклеозида згідно наступної формули:
МН» іт ом
Е
9 ах
Зокрема, цей термін позначає сполуку 4-аміно-1-(2-дезокси-2,2-дифтор-В-ЮО-еритро- пентофуранозил)піримідин-2(1Н)-он або 4-аміно-1-(28,48,5Н)-3,3-дифтор-4-гідрокси-5- (гідроксиметил)оксолан-2-іл|-1,2-дигідропіримідин-2-он.
Відповідно до винаходу, гемцитабін переважно вводиться внутрішньовенно. Бажано гемцитабін уводиться в дозах від 0,5 до 2 г/м-, бажано від 0,8 до 1,5 г/м, краще від 1 до 1,2 г/м? площі поверхні тіла. Наприклад, гемцитабін можна вводити в дозі 1000 мг на квадратний метр
Зо раз на тиждень протягом 7 із 8 тижнів, а потім раз на тиждень протягом З із 4 тижнів.
Термін "аналог нуклеозида" включає такі похідні фторпіримідинів, як фторурацил і його форми проліків. Термін "фторурацил" або " 5-фторурацил" (5-РО або 15) (у продажу під торговельними марками Аагисії, Сагас, Еїидіх, ЕТидех і РІпогоріех) означає сполуку, яка є аналогом піримідину згідно наступної формули:
Н нк й о "ще
Р .
Зокрема, цей термін відноситься до сполуки 5-фтор-1Н-піримідин-2,4-діон.
Термін "капецитабін" (Хеіода, Коспе) відноситься до хіміотерапевтичного засобу, який є проліками, які в тканинах перетворюється на 5-БО. Капецитабін, який можна вводити перорально, має наступну формулу:
но ін! (0);
Н се с
З о у. о
Хо М
Н
Е
Зокрема, цей термін відноситься до сполуки пентил-(1-(3,4-дигідрокси-5- метилтетрагідрофуран-2-іл)-5-фтор-2-оксо-1Н-піримідин-4-іл|карбамат.
Відповідно до винаходу, термін "сполука платини" відноситься до сполук, які у своїй структурі містять платину, типу комплексів платини, і включає такі сполуки, як цисплатин, карбоплатин і оксаліплатин.
Термін "цисплатин' або "цисплатина" відноситься до сполуки цис-диамінхлорплатини(і!) (СОБОР) наступної формули: с, «МН,» ве кт
СІ МН,
Термін "карбоплатин" відноситься до сполуки цис-диамін-(1,1- циклобутандикарбоксилато)платиниції) наступної фору
НзіМ о и р
Нам о);
Ф); !
Термін "оксаліплатин' відноситься до сполуки, яка є сполукою платини, яка утворює комплекс із лігандом, який несе диаміноциклогексан згідно наступної формули:
Мор ра жк "Го
Но о 15 .
Зокрема, термін "оксаліплатин' відноситься до сполуки (((1К,2К)-циклогексан-1,2- діамін|(етандіоато-О,О0)платини(ІІ). Оксаліплатин для ін'єкцій також надходить у продаж під торговельною назвою ЕЇІохаїіпе.
Таксани представляють клас дитерпенових сполук, які були вперше отримані з таких 20 природних джерел, як рослини роду Тахи5, але деякі були синтезовані штучно. Основним механізмом дії препаратів класу таксанів є порушення функції мікротрубочок, що інгібує процес поділу клітин. Таксани включають доцетаксель (Тахоїеге) і паклітаксель (Тахої).
Відповідно до винаходу, термін "доцетаксель" відноситься до сполуки, яка має наступну формулу:
сна
Но о но он
Нас о) Но ра нос (в) МН (6) : - В : о) : ох : : : РЕ он о о зр
Зокрема, термін "доцетаксель" відноситься до сполуки 1,7р8,1Ор-тригідрокси-9-оксо-5р,20- епокситакс-11-ен-2а,4,1За-триїл-4-ацетат-2-бензоат-13-(28,35)-3-Ктрет- 5 бутоксикарбоніл)аміно|-2-гідрокси-3-фенілпропаноат).
Відповідно до винаходу, термін "паклітаксель" відноситься до сполуки, яка має наступну формулу:
Бо о СН» о о ц о 2 Но о7оМмноо з СН о он сп неме
ОН: ГО снУ 05,0 Це 5 і
Зокрема, термін "паклітаксель" відноситься до сполуки (гама, 58,78,108,13а)-4,10-біс- (ацетилокси)-13-(28,35)-3-(бензоіламіно)-2-гідрокси-3-фенілпропаноїл|окси)-1,7-дигідрокси-9- оксо-5,20-епокситакс-11-ен-2-іл-бензоат.
Відповідно до винаходу, термін "аналог камптотецину відноситься до похідних сполуки камптотецину (СРТ; (5)-4-етил-4-гідрокси-1Н-пірано(/3"4"76,7|індолізино-(1,2-5| хінолін-3,14- (4Н.12Н)-діон). Бажано термін "аналог камптотецину відноситься до сполук, які містять наступну структуру: о щш- М /, м / в,
М
Н Сбоу (Ф) 3-77 он
Відповідно до винаходу, кращими аналогами камптотецину є інгібітори ферменту ДНК- топоїзомерази І (оро І). Кращими аналогами камптотецину відповідно до винаходу є іринотекан і топотекан.
Іринотекан - препарат, який перешкоджає розкручуванню ДНК шляхом інгібування топоїзомерази І. З хімічної точки зору, він є напівсинтетичним аналогом природного алкалоїду камптотецину, який має наступну формулу:
о си ах ле
М М Х нн. у о
Но
Зокрема, термін "іринотекан" відноситься до сполуки (5)-4,11-диетил-3,4,12,14-тетрагідро-4- гідрокси-3,14-диоксо-1Н-піраної/3"4"76,7|індолізино|1,2-БІхінолін-9-іл-(1,4"-біпіперидин|-1"- карбоксилат.
Топотекан є інгібітором топоізомерази відповідно до формули:
Й нс : М
М - Іо
На 7, х
М о но но
Нзо
Зокрема, термін "топотекан'" відноситься до сполуки (5)-10-((диметиламіно)метил|-4-етил- 4,9-дигідрокси-1 Н-пірано/3",4"76,7|індолізиної|1,2-Б)хінолін-3,14(4Н,12Н)-діон моногідрохлорид.
Антрацикліни представляють клас лікарських препаратів, які широко застосовуються при хіміотерапії раку, а також є антибіотиками. За структурою всі антрацикліни містять загальну 4- кільцеву структуру 7,8,9,10-тетрагідротетрацен-5,12-хінону й зазвичай вимагають глікозилювання за певними сайтами.
Антрацикліни переважно діють за одним або кількома з поміж наступних механізмів дії: 1) інгібування синтезу ДНК і РНК шляхом інтеркаляції між парами основ у нитці ДНК/РНК, тим самим запобігаючи реплікації швидкозростаючих ракових клітин; 2) інгібування ферменту топоіїзомерази Ії, що запобігає розкручуванню суперспіральної ДНК і тим самим блокує транскрипцію й реплікацію ДНК; 3) опосередкована залізом генерація вільних радикалів кисню, які пошкоджують ДНК і клітинні мембрани.
Відповідно до винаходу, термін "антрациклін' переважно відноситься до таких засобів, бажано протиракових засобів, які індукують апоптоз, бажано шляхом інгібування розкручування
ДНК топоізомеразою І.
Бажано, згідно з винаходом, термін "антрациклін" взагалі відноситься до класу сполук, які мають наступну кільцеву структуру (6) Он (6) Он включаючи їх аналоги й похідні, фармацевтичні солі, гідрати, ефіри, кон'югати й форми проліків.
Приклади антрациклінів і аналогів антрациклінів включають, без обмеження, даунорубіцин (дауноміцин), доксорубіцин (адриаміцин), епірубіцин, ідарубіцин, родоміцин, пірарубіцин, вальрубіцин, М-трифтор-ацетил-доксорубіцин-14-валерат, аклациноміцин,
Зо морфолінодоксорубіцин (морфоліно-0ОХ), ціаноморфолінодоксорубіцин (ціаноморфоліно- роОХ), 2г-піролінодоксорубіцин (2-РООХ), 5-імінодауноміцин, мітоксантрон і аклациноміцин (акларубіцин). Мітоксантрон є представником класу сполук антрацендіонів, які є аналогами антрацикліну, що не містять сахаридної частини антрациклінів, але зберігають планарну структуру поліциклічного ароматичного кільця, яка дозволяє інтеркаляцію в ДНК.
Кращими антрациклінами запропонованими винаходом є сполуки наступної формули:
о он ко А. оф Й
Во (в) он (в) МН» в) Аз
В,
СНеЗ де: Кі: обраний із групи, яка складається з Н і ОН, Є» - із групи, яка складається з Н і ОМе, Кз - із групи, яка складається з Н і ОН, а Ка - із групи, яка складається з Н і ОН.
В одному втіленні Кі означає Н, Е» - ОМе, Вз - Н, а Ка - ОН. В іншому втіленні Кі означає
ОН, Е» - ОМе, Вз - Н, а Ка - ОН. В іншому втіленні К: означає ОН, ЕЕ» - ОМе, Вз - ОН, а Кк. - Н. В іншому втіленні К: означає Н, Ех» - Н, Ез - Н, а Ка - ОН.
Особливо кращим антрацикліном у даному винаході є епірубіцин - антрацикліновий препарат, який має наступну формулу: о но онН-ОоН
Ех о
І ї о о оно, 0. СНУ
Не "он
Мне і надходить у продаж під торговельною маркою ЕПепсе у США й Ріагтогибісіп або Ерігибрісіп
Ереже в інших країнах. Зокрема, термін "епірубіцин' відноситься до сполуки (8К,105)-10-
К25,45,58,65)-4-аміно-5-гідрокси-6-метил-оксан-2-іл|окси-6,11-дигідрокси-8-(2-гідроксиацетил)- 1-метокси-8-метил-9,10-дигідро-7Н-тетрацен-5,12-діон. Епірубіцин у деяких схемах хіміотерапії кращий від доксорубіцину, найбільш популярного антрацикліну, оскільки він спричиняє менше побічних ефектів.
Відповідно до винаходу, засіб, який стабілізує або підвищує експресію СІ ОМ18.2, може бути хіміотерапевтичним засобом, зокрема, хіміотерапевтичним засобом, призначеним для лікування раку, який може входити в комбінації препаратів типу комбінацій препаратів, призначених для застосування при лікуванні раку. Такі комбінації препаратів можуть бути комбінацією препаратів, які використовуються в хіміотерапії, як то комбінації препаратів, які застосовуються в режимі хіміотерапії РОЇ РІКІМОХ.
Комбінація препаратів, яка використовується при хіміотерапії БОЇ РІКІМОХ, включає лейковорин, фторурацил, іринотекан (як то іринотекан гідрохлорид) і оксаліплатин.
Оксаліплатин може вводитися в дозі 85 мг/м? площі поверхні тіла; іринотекан у дозі 180 мг/м; лейковорин у дозі 400 мг/ме; і фторурацил у дозі 400 мг/м? у вигляді болюса з подальшим уведенням 5-фторурацилу в дозі 2400 мг/м? у вигляді безперервної інфузії бажано протягом 46 год., бажано кожних 2 тижні.
Термін "фолінова кислота" або "лейковорин" відноситься до сполуки, яка застосовується в синергійній комбінації з хіміотерапевтичним засобом 5-фторурацилом. Так, якщо тут згадується
Зо введення 5-фторурацилу або його форми проліків, то таке введення в одному втіленні може включати введення в комбінації з фоліновою кислотою. Фолінова кислота має наступну формулу:
0) о о 7 | МН воно ув; о ном Ї Ї ОН
Фін
Зокрема, цей термін відноситься до сполуки (25)-2-Ц4-(2-аміно-5-форміл-4-оксо-5,6,7,8- тетрагідро-1Н-птеридин-6б-іл)уметиламіно|бензоиліаміно) пентадіонова кислота.
Т-клітини уб (Т-клітини гамма-дельта) становлять невелику підмножину Т-клітин, які мають особливі Т-клітинні рецептори (ТСЕ) на своїй поверхні. У більшості Т-клітин ТСЕ. складаються із двох глікопротеїдних ланцюгів, які називаються а- і Д-ланцюгами ТОК. На противагу цьому, у Т- клітин уб ТСК складаються з одного у-ланцюга й одного б-ланцюга. Ця група Т-клітин звичайно набагато менш поширена, ніж Т-клітини «В. Т-клітини уб людини відіграють важливу роль у реакціях стресового нагляду типу інфекційних захворювань і аутоїмунітета. Також передбачається, що викликані трансформацією зміни в пухлинах викликають реакції стресового нагляду, опосередковані Т-клітинами уб, і підсилюють протипухлинний імунітет. Важливо відзначити, що активовані після впливу антигену Т-клітини уб у вогнищі ушкодження забезпечують цитокіни (наприклад, ІМЕу, ТМЕо) і/або хемокіни, які опосередковують залучення (рекрутмент) інших ефекторних клітин, і проявляють безпосередні ефекторні функції, такі як цитотоксичність (через рецептори смерті й шляхи цитолітичних гранул) і АОС.
Більшість Т-клітин уб у периферійній крові експресують Т-клітинний рецептор УуЗмб2 (ТСКУуб). Т-клітини Му9Мб2 унікальні для людини й приматів і передбачається, що вони відіграють ранню й найважливішу роль у сприйнятті "небезпеки" при вторгненні патогенів, оскільки їхня кількість сильно зростає при багатьох гострих інфекціях і за кілька днів може перевищити всі інші лімфоцити, наприклад, при туберкульозі, сальмонельозі, ерліхіозі, бруцельозі, туляремії, лістеріозі, токсоплазмозі й малярії.
Т-клітини уб реагують на невеликі непептидні фосфорильовані антигени (фосфоантигени) типу пірофосфатів, які синтезуються в бактеріях, і ізопентеніл-пірофосфатів (ІРР) ссавців, які виробляються в клітинах, через мевалонатний шлях. У той час, як продукування ІРР у нормальних клітинах є недостатнім для активації Т-клітин уб, порушення регуляції мевалонатного шляху в пухлинних клітинах призводить до нагромадження ІРР і активації Т- клітин уб. Рівень ІРР» також може й терапевтично підвищуватися амінобісфонатами, які інгібують фермент мевалонатного шляху - фарнезил-пірофосфатсинтазу (ЕРРБ). Серед іншого, такі амінобісфонати представлені золедроновою кислотою (72А, золедронат, 7отеїа"м, Момапгіів),
Зо яка вже застосовується клінічно на пацієнтах для лікування остеопорозу й метастатичних захворювань кісток. Після обробки РВМСз іп міго 2А особливо поглинається моноцитами. ІРР накопичуються в моноцитах, які диференціюються в антиген-презентуючі клітини, що стимулюють розвиток Т-клітин уб. При цьому бажаним є додавання інтерлейкіну-2 (І/-2) як фактора росту й виживання для активованих Т-клітин уб. Нарешті, були описані деякі алкільовані аміни, які активують Т-клітини Му9Мб2 іп мйго, але тільки в мілімолярних концентраціях.
Відповідно до винаходу, термін "засіб, який стимулює Т-клітини уб" відноситься до сполук, які стимулюють розвиток Т-клітин уб, зокрема Т-клітин Му9Мб2, іп міїго і/або іп мімо, зокрема, викликаючи активацію й експансію Т-клітин уб. Бажано цей термін відноситься до сполук, які іп мійго і/або іп омімо підвищують продукцію ізопентенил-пірофосфатів (ІРР) ссавців, які виробляються в клітинах, переважно шляхом інгібування ферменту мевалонатного шляху - фарнезил-пірофосфатсинтази (ЕРРБ).
Однією із кращих груп сполук, які стимулюють Т-клітини уб, є бісфонати, особливо азотовмісні бісфонати (М-бісфонати; амінобісфонати).
Наприклад, придатними бісфонатами для застосування у винаході можуть бути одна або кілька з поміж наступних сполук, включаючи їх аналоги й похідні, фармацевтичні солі, гідрати, ефіри, кон'югати й форми проліків:
П-гідрокси-2-(1Н-імідазол-1-іл)етан-1,1-диїл|біс(фосфонова кислота), тобто золедронова кислота, наприклад, золедронат; (дихлорфосфоно-метилуфосфонова кислота, наприклад, клодронат;
П-гідрокси-3-(метил(пентил)аміно|пропан-1,1-диїл)біс(фосфонова кислота), тобто ібандронова кислота, наприклад, ібандронат; (З-аміно-1-гідроксипропан-1,1-диїл)біс(фосфонова кислота), тобто памідронова кислота, наприклад, памідронат; (1-гідрокси-1-фосфоно-2-піридин-3-іл-етилуфосфонова кислота, тобто ризедронова кислота, наприклад, ризедронат; (1-гідрокси-2-імідазо|1,2-а|піридин-3-іл-1-фосфоноетил)фосфонова кислота, тобто мінодронова кислота;
ІЗ-(диметиламіно)-1-гідроксипропан-1,1-диїл|біс(фосфонова кислота), тобто олпадронова кислота;
І4-аміно-1-гідрокси-1-(гідрокси-оксидофосфорил)бутил|фосфонова кислота, тобто алендронова кислота, наприклад, алендронат; (циклогептиламіно) метиленібіс(фосфонова кислота), тобто інкадронова кислота; (1-гідроксиетан-1,1-диїл/бис(фосфонова кислота), тобто етидронова кислота, наприклад, етидронат; та ((4-хлорфеніл)тіоїметиленібіс(фосфонова кислота), тобто тилудронова кислота.
Відповідно до винаходу, найкращим бісфонатом є золедронова кислота (ІММ) або золедронат (продається фірмою Момагіз під торговельними марками 7отега, 2отега, Асіавзіа і
Весіаві). 7отеїа застосовується для запобігання скелетним переломам у хворих на рак типу множинної мієломи й рак простати, а також для лікування остеопорозу. Вона також може застосовуватися для лікування гіперкальціємії при раку й може бути корисною для лікування болю при метастазах у кістках.
В одному з найкращих втілень, засіб, який стимулює Т-клітини уб відповідно до винаходу, уводиться в комбінації з 1/-2. Така комбінація, як було показано, особливо ефективно опосередковує експансію й активацію Т-клітин у962.
Інтерлейкін-2 (І/-2) є інтерлейкіном, сигнальною молекулою цитокінівого типу в імунній системі. Це білок, який залучає лімфоцити і є частиною природної відповіді організму на мікробні інфекції, а також бере участь у розрізненні чужих (не своїх) і власних антигенів. 1-2 опосередковує свої ефекти шляхом зв'язування з рецепторами 1І/-2, які експресуються
Зо лімфоцитами.
При застосуванні відповідно до винаходу 1-2 може бути будь-яким 1ІІ--2, який підтримує або сприяє стимуляції Т-клітин уб, і може походити з будь-якого виду, бажано людини. 1-2 може бути виділеним, отриманим рекомбінантно або синтетичним ІІ--2, а також може бути природного походження або модифікованим ЇЇ -2.
Термін "антиген" відноситься до таких речовин, як білки або пептиди, які містять епітоп, проти якого спрямована і/або повинна бути спрямована імунна відповідь. У кращому втіленні антиген є пухлинним антигеном типу СІ ОМ18.2, тобто компонентом ракових клітин, який може походити із цитоплазми, клітинної поверхні або клітинного ядра, зокрема, таким антигеном, який виробляється, бажано у великій кількості, усередині клітини або як поверхневий антиген на ракових клітинах.
У даному винаході термін "асоційований з пухлиною (пухлинний) антиген' бажано відноситься до таких білків, які за нормальних умов специфічно експресуються в обмеженій кількості тканин і/або органів або на певних етапах онтогенезу й експресуються або аномально експресуються в одній або декількох пухлинних або ракових тканинах. У даному винаході пухлинні антигени бажано пов'язані із клітинною поверхнею ракових клітин і бажано не експресуються або рідко експресуються в нормальних тканинах.
Термін "епітоп" відноситься до антигенних детермінантів у молекулах, тобто тієї частини молекул, яка розпізнається імунною системою, наприклад, розпізнається антитілом. Наприклад, епітопи є дискретними, тривимірними сайтами на антигенах, які розпізнаються імунною системою. Як правило, епітопи складаються з хімічно активних поверхневих груп молекул типу амінокислот або бічних ланцюгів цукрів і звичайно мають специфічні тривимірні структурні характеристики, а також специфічні характеристики зарядів. Конформаційні й неконформаційні епітопи відрізняються тим, що зв'язування з першими, але не з останніми втрачається в присутності денатуруючих розчинників. Епітопи таких білків, як С ОМ18.2, бажано включають безперервну або переривчасту ділянку даного білка довжиною бажано від 5 до 100, бажано від 5 до 50, краще від 8 до 30, найкраще від 10 до 25 амінокислот, наприклад, епітоп може мати довжину бажано 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 або 25 амінокислот.
Термін "антитіло" відноситься до глікопротеїнів, які містять щонайменше два важкі (Н) ланцюги й два легкі (І) ланцюги, зв'язані між собою дисульфідними зв'язками, і включає будь-які бо молекули, які містять антигензв'язувальні ділянки. Термін "антитіло" включає моноклональні антитіла й фрагменти або похідні антитіл, у тому числі, без обмеження, людські антитіла, гуманізовані антитіла, химерні антитіла, одноланцюгові антитіла, наприклад, 5сСЕм, і антиген- зв'язувальні фрагменти антитіл, такі як фрагменти Раб і Раб", а також включає всі рекомбінантні форми антитіл, наприклад, антитіла, експресовані в прокаріотах, неглікозильовані антитіла, а також будь-які антигензв'язувальні фрагменти й похідні антитіл, як описано тут. Кожний важкий ланцюг складається з варіабельної області важкого ланцюга (скорочено Мн) і константної області важкого ланцюга. Кожний легкий ланцюг складається з варіабельної області легкого ланцюга (скорочено Мі) і константної області легкого ланцюга. Області Мн і М. можуть ще далі підрозділятися на ділянки гіперваріабельності, які називаються ділянками, які визначають комплементарність (СОМ), які перемежовуються з більш консервативними ділянками, які називаються каркасними ділянками (ЕК). Кожна область Мн і Мі складається із трьох СОК і чотирьох ЕК, які розташовуються від М-кінця до С-кінця в наступному порядку: ЕК1, СОКІ, ЕКЗ,
СОК2, ЕКЗ, СОКЗ, ЕКА4. Варіабельні області важкого й легкого ланцюгів містять зв'язувальний домен, який взаємодіє з антигеном. Константні області антитіл можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну із тканинами або факторами хазяїна, включаючи різні клітини імунної системи (наприклад, ефекторні клітини) і перший компонент (Сід) класичної системи комплементу.
Описані тут антитіла можуть бути людськими антитілами. Термін "людське антитіло" у даному винаході позначає антитіла, які мають варіабельні й константні області, що походять з послідовностей імуноглобулінів людини зародкової лінії. Описані тут людські антитіла можуть містити залишки амінокислот, не кодованих послідовностями імуноглобулінів людини зародкової лінії (наприклад, мутації, введені випадковим чином або методом сайт-специфічного мутагенезу іп міго або за допомогою соматичної мутації іп мімо).
Термін "туманізоване антитіло" відноситься до молекул, у яких антигензв'язувальні сайти в основному походять із імуноглобулінів інших видів, крім людини, тоді як в основі іншої імуноглобулінової структури молекули знаходиться структура й/або послідовность імуноглобуліну людини. Антигензв'язувальні сайти можуть або містити повні варіабельні домени, вбудовані в константні домени, або тільки гіперваріабельні ділянки (СОК), вбудовані у відповідні каркасні ділянки варіабельних доменів. Антигензв'язувальні ділянки можуть бути дикого типу або модифіковані заміною однієї або декількох амінокислот, наприклад, модифіковані так, щоб бути більш подібними до імуноглобулінів людини. У деяких форм гуманізованних антитіл зберігаються всі послідовності СОР. (наприклад, гуманізоване антитіло миші, яке містить усі шість СОК з антитіла миші). В інших форм одна або кілька ділянок СОМ зазнали змін у порівнянні з вихідним антитілом.
Термін "химерне антитіло" відноситься до таких антитіл, у яких одна частина кожної з амінокислотних послідовностей важких і легких ланцюгів гомологічна до відповідних послідовностей антитіл, які походять з певного виду або належать до певного класу, а інші сегменти ланцюга гомологічні до відповідних послідовностей в інших. Як правило, варіабельні області легких і важких ланцюгів відтворюють варіабельні області антитіл, які походять від одного виду ссавців, а константні області гомологічні до послідовності антитіл, які походять від інших. Однією з очевидних переваг таких химерних форм є те, що варіабельна область може бути легко отримана з відомих на даний час джерел за допомогою легкодоступних В-клітин або гібридом з інших організмів, крім людей, у комбінації з константними областями, отриманими, наприклад, із препаратів клітин людини. У той час, як варіабельна область має перевагу в легкості одержання, а специфічність її не залежить від джерела, то константна область, отримана від людини, з меншою ймовірністю буде викликати імунну відповідь у суб'єкта-людини при введенні антитіл, ніж якби константна область походила з іншого із джерела, крім людини.
Однак це визначення не обмежується даним конкретним прикладом.
Терміни "антигензв'язувальна частина" антитіла (або просто "зв'язувальна частина") або "антигензв'язувальний фрагмент" антитіла (або просто "зв'язувальний фрагмент") або подібні терміни відносяться до одного або декількох фрагментів, які зберігають здатність антитіла до специфічного зв'язування з антигеном. Було показано, що антигензв'язувальна функція антитіл може виконуватися фрагментами повнорозмірних антитіл. Приклади зв'язувальних фрагментів, охоплені терміном "антигензв'язувальна частина" антитіла, включають: (ї) Рар-фрагменти, моновалентні фрагменти, які складаються із доменів Мі, Мн, Сі ї Сн; (ії) Е(аб)2-фрагменти, бівалентні фрагменти, які містять два двовалентні Бар-фрагменти, з'єднаних дисульфідним містком у шарнірній області; (ії) Ба-фрагменти, які складаються із доменів Мн і Сн; (ім) Емх- фрагменти, які складаються із доменів Мі і Мн на одному плечі антитіла; (м) аАБ-фрагменти (Улага єї а. (1989) Маїшгте 341: 544-546), які складаються з домена Мн; (мі) виділені ділянки, які бо визначають комплементарність (СОК); і (мії) комбінації із двох або декількох виділених СОК, які необов'язково можуть з'єднуватися через синтетичний лінкер. Крім того, хоча два домена Ем- фрагмента, Мі і Мн, кодуються окремими генами, їх можна з'єднати, рекомбінантними методами, за допомогою синтетичного лінкера, який дозволяє їм утворювати один білковий ланцюг, у якому поєднуються області Мі і Мн з утворенням моновалентних молекул (відомих як одноланцюговий Ем (5сЕм), наприклад, див, Віга еї аї. (1988) Зсіеєпсе 242: 423-426; і Ни5юп еї аї. (1988) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 85: 5879-5883). Такі одноланцюгові антитіла теж охоплюються терміном "антигензв'язувальний фрагмент" антитіла. Наступний приклад - злиті білки зв'язувального домена імуноглобуліну, які включають: (ї) поліпептид зв'язувального домена, злитий з поліпептидом шарнірної ділянки імуноглобуліну, (її) константну область Сн2 важкого ланцюга імуноглобуліну, злиту із шарнірною ділянкою, і (ії) константну область Сн3 важкого ланцюга імуноглобуліну, злиту з константною областю Сн2. Поліпептид зв'язувального домена може бути варіабельною областю важкого ланцюга або варіабельною областю легкого ланцюга. Злиті білки зв'язувального домена імуноглобуліну більш докладно розкриті в 05 2003/0118592 ї 005 2003/0133939. Ці фрагменти антитіл одержують стандартними методами, відомими фахівцям у даній галузі, і фрагменти піддають скринінгу щодо можливості застосування у такий же спосіб, як і інтактні антитіла.
Термін "біспецифічні молекули" служить для позначення таких агентів, наприклад, білків, пептидів або білкових чи пептидних комплексів, які мають дві різні специфічності зв'язування.
Наприклад, молекула може зв'язуватися або взаємодіяти з (а) антигеном на клітинній поверхні й (5) Ес-рецептором на поверхні ефекторної клітини. Термін "поліспецифічна молекула" або "гетероспецифічна молекула" служить для позначення таких агентів, наприклад, білків, пептидів або білкових або пептидних комплексів, які мають більше двох різних специфічностей зв'язування. Наприклад, молекула може зв'язуватися або взаємодіяти з (а) антигеном на клітинній поверхні, (Б) Ес-рецептором на поверхні ефекторної клітини й (с) щонайменше ще з одним компонентом. Відповідно, винахід включає, без обмеження, біспецифічні, триспецифічні, тетраспецифічні й інші мультиспецифічні молекули, які спрямовані на СГ ОМ18.2 та інші мішені, як то Ес-рецептори на ефекторних клітинах. Термін "біспецифічні антитіла" також включає діатіла. Діатіла є бівалентними біспецифічними антитілами, у яких домени Мн і М експресуються на одному й тому ж поліпептидному ланцюзі, але за допомогою такого лінкера,
Зо який занадто короткий для утворення зв'язку між двома доменами на одному і тому ж ланцюзі, що змушує домени зв'язуватися з комплементарними доменами на іншому ланцюзі, утворюючи два антигензв'язувальних сайти (наприклад, див. Ноїїдег Р. еї аІ. (1993) Ргос. Май. Асай. збі.
ИБА 90: 6444-6448; РоЦак В... еї аї. (1994) Бтисішге 2: 1121-1123).
Антитіло можна кон'югувати із терапевтичною молекулою або засобом, як то цитотоксином, лікарським препаратом (наприклад, імунодепресантом) або радіоїзотопом. Цитотоксини або цитотоксичні засоби включають будь-які засоби, які приносять шкода й, зокрема, убивають клітини. Приклади включають таксол, цитохалазин В, граміцидин 0, етидію бромід, еметин, митоміцин, етопозид, вінкристин, тенопозид, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксиантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин 0, 1-дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин та їх аналоги або гомологи. Придатні терапевтичні засоби для одержання кон'югатів антитіл включають, без обмеження, антиметаболіти (наприклад, метотрексат, б-меркаптопурин, 6-тіогуанін, цитарабін, флударабін, 5-фторурацил, дакарбазин), алкилюючі засоби (наприклад, мехлоретамін, тіоепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (В5МІО) і ломустин (ССМО), циклофосфамід, бусульфан, дибромманітол, стрептозотоцин, митоміцин С і цис-дихлордиамінплатинації) (ОР, цисплатин), антрацикліни (наприклад, даунорубіцин (раніше дауноміцин) і доксорубіцин), антибіотики (наприклад, дактиноміцин (раніше актиноміцин), блеоміцин, митраміцин і антраміцин (АМС) і анти-мітотичні засоби (наприклад, вінкристин і вінбластин). У кращому втіленні терапевтичний засіб представлений цитотоксичним засобом або радіотоксичним засобом. В іншому втіленні терапевтичний засіб представлений імунодепресантом. У наступному втіленні терапевтичний засіб представлений СЗМ-С5Е. У кращому втіленні терапевтичним засобом служить доксорубіцин, цисплатин, блеоміцин сульфат, кармустин, хлорамбуцил, циклофосфамід або рицин А.
Антитіла також можна кон'югувати із радіоіїзотопами, наприклад, з йодом-131, ітрієм-90 або індієм-111, одержуючи цитотоксичні радіофармпрепарати.
Кон'югати антитіл запропонованих винаходом можуть застосовуватися для модифікації заданої біологічної відповіді, а молекули лікарських засобів не повинні обмежуватися класичними хімічними терапевтичними засобами. Наприклад, молекула лікарського засобу може бути білком або поліпептидом, яка має необхідну біологічну активність. Такі білюи можуть бо включати, наприклад, ферментативно активні токсини або їх активні фрагменти, як то абрин,
рицин А, екзотоксин Рзхендотопах або дифтерійний токсин; такі білки, як фактор некрозу пухлин або у-інтерферон; або модифікатори біологічних відповідей, такі, наприклад, як лімфокіни, інтерлейкін-ї (І -173, інтерлейкін-2 (7-27), інтерлейкін-б6 (1-67, гранулоцитарно- макрофагальний колонієстимулюючий фактор (СОМ-С5У,, гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор ("5-С5Е") або інші фактори росту.
Методи кон'югування таких терапевтичних молекул з антитілами добре відомі, наприклад, див. Атоп еї аї., "Мопосіопа! апібодіеб5 їТог іттипоїагдейпоу ої агидб5 іп сапсег (Пегару", іп
Мопосіопа! Апіїродієє апа Сапсег Тнегару, НеївієЇй еї аї. (ед5.), рр. 243-56 (Аїап В. І ів5, Іпс. 1985); Неїїбігот еї аї., "Апіїбоадіев тог агид аеїїмегу", іп Сопігоїїей Огид Оеїїмегу (2па Еа.), Кобріпзоп еїаї. (єд5.), рр. 623-53 (Магсеї! ОеккКетг, Іпс. 1987); ТПпогре, "Апібоду сагтіег5 ої суюохіс адепів іп сапсег ІШегару: а геміем/, іп Мопосіопа! Апіібодіе5 "84: ВіоіодісаІ апа Сіїпіса! Арріїсабопв,
РіпсНегаєї аї. (едв.), рр. 475-506 (1985); "Апаїувзів, гез!ції5, апа їшиге ргозресіїме ої те Тегарешіс изе ої гадіоіареїейа апіїбодіє5 іп сапсег ІПегару", іп Мопосіопа! Апіїрбодіе5 тог Сапсег Оеїесійоп апа
ТНегару, Ваїдм/п еї аї. (еад5.), рр. 303-16 (Асадетіс Ргез55 1985), і Тпогре еї аї., "Пе Ргерагайоп апа суюїйохіс ргорепіез ої апіїбоду-юхіп сопіддасез", Іттипої. Кем., 62: 119-58 (1982).
У даному винаході антитіло "походить від" певної послідовності зародкової лінії, якщо воно отримане із системи шляхом імунізації тварини або скринінга бібліотеки імуноглобулінових генів, причому обране антитіло за амінокислотною послідовністю щонайменше на 90 95, краще 95 956, ще краще щонайменше на 96 95, 97 90, 98 95 або на 99 95 є ідентичним до амінокислотної послідовності, яка кодується імуноглобуліновим геном зародкової лінії. Як правило, антитіло, яке походить від певної послідовності зародкової лінії, повинне проявляти відмінності не більше ніж за 10 амінокислотами, краще не більше ніж за 5 або ще краще не більше ніж за 4, 3, 2 або за 1 амінокислотою від амінокислотної послідовності, яка кодується імуноглобуліновим геном зародкової лінії.
У даному винаході термін "гетероантитіла" відноситься до з'єднаних одне з одним двох або декількох антитіл, їх похідних або антигензв'язувальних ділянок, причому принаймні два з них мають різні специфічності. Ці різні специфічності включають специфічність зв'язування для Ес- рецепторів на ефекторних клітинах і специфічність зв'язування з антигеном або епітопом на клітинах мішені, наприклад, пухлинних клітинах.
Зо Описані тут антитіла можуть бути моноклональними антитілами. Термін "моноклональне антитіло" у даному винаході відноситься до препаратів молекул антитіл одного молекулярного складу. Моноклональне антитіло проявляє лише одну специфічність зв'язування й спорідненість. В одному втіленні моноклональні антитіла виробляються гібридомою, яка включає В-клітини, отримані від тварини, а не людини, наприклад, миші, злиті з іморталізованими клітинами.
Описані тут антитіла можуть бути рекомбінантними антитілами. Термін "рекомбінантне антитіло" у даному винаході включає всі антитіла, які отримані, експресовані, створені або виділені рекомбінантними методами, як то (а) антитіла, виділені з таких тварин (наприклад, мишей), які є трансгенними або трансхромосомними відносноо генів імуноглобулінів або гібридоми, з якої вони отримані, (б) антитіла, виділені із клітин хазяїна, трансформованих для експресії антитіл, наприклад, із трансфектоми, (с) антитіла, виділені з рекомбінантної або комбінаторної бібліотеки антитіл, і (4) антитіла, отримані, експресовані, створені або виділені будь-якими іншими методами, які включають сплайсинг послідовностей генів імуноглобулінів з іншими послідовностями ДНК.
Описані тут антитіла можуть походити від різних видів, у тому числі, без обмеження, мишей, пацюків, кроликів, морських свинок і людини.
Описані тут антитіла включають поліклональні й моноклональні антитіла й охоплюють антитіла типу ІдА, як то ІДА1 або ІдАг, ІдДС1, Ідс2, ІдсеЗ, Ідс4, ІЧЗЕ, ІоМ і до. У різних втіленнях антитіла є антитілами типу ІДО1, краще антитілами типу Ідс1 ізотипа каппа або лямбда (тобто
ІДС1, к, А), антитілами типу ІдсСга (наприклад, Ідсга, к, ЛХ), антитілами типу Іде25 (наприклад,
ІЧО2Б, к, А), антитілами типу ЇдоЗ (наприклад, Ідсз, к, А) або антитілами типу Ідеї (наприклад,
ІЧ4, Кк, А).
Термін "трансфектома" у даному винаході охоплює рекомбінантні еукаріотичні клітини хазяїна, які експресують антитіла, як то клітини СНО, клітини М5/О, клітини НЕК293, клітини
НЕК29З3Т, рослинні або грибкові клітини, у тому числі дріжджові клітини.
У даному винаході термін "гетерологічне антитіло" визначається стосовно трансгенних організмів, які виробляють такі антитіла. Цей термін відноситься до антитіл, у яких амінокислотна послідовність або, кодуюча послідовність нуклеїнової кислоти відповідає тій, яка перебуває в організмі, який не є трансгенним, і звичайно походить від іншого виду, ніж бо трансгенний організм.
У даному винаході "гетерогібридне антитіло" означає таке антитіло, у якого легкі й важкі ланцюги походять із різних організмів. Наприклад, антитіло, у якого важкий ланцюг людини пов'язаний з легким ланцюгом миші, є гетерогібридним антитілом.
Винахід охоплює всі описані тут антитіла й похідні антитіл, які для цілей даного винаходу охоплюються терміном "антитіло". Термін "похідні" антитіл відноситься до будь-яких модифікованих форм антитіл, наприклад, кон'югатів антитіл з іншими молекулами або антитілами або фрагментами антитіл.
Описані тут антитіла бажано є виділеними. Термін "виділене антитіло" у даному винаході служить для позначення таких антитіл, які практично вільні від інших антитіл, які мають іншу антигенну специфічність (наприклад, виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з СІ ОМ18.2, практично вільне від антитіл, які специфічно зв'язуються з іншими антигенами, ніж СІ ОМ18.2).
Однак виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з епітопом, ізоформою або варіантом
СІГОМ18.2 людини, може мати перехресну реактивність із іншими спорідненими антигенами, наприклад, з іншого виду (наприклад, з видовими гомологами СІ ОМ18.2). Більше того, виділене антитіло може бути практично вільним від іншого клітинного матеріалу й/або хімічних речовин. В одному втіленні винаходу комбінація "виділених" моноклональних антитіл відноситься до антитіл, які мають різну специфічність й об'єднані у чітко визначені композиції або суміші.
Термін "зв'язування" відповідно до винаходу бажано відноситься до специфічного зв'язування.
Відповідно до даного винаходу, антитіло здатне зв'язуватися із заданою мішенню, якщо воно має значну спорідненість до цієї заданої мішені й зв'язується з нею у стандартних аналізах. "Спорідненість" або "спорідненість зв'язування" часто визначається рівноважною константою дисоціації (Ко). Бажано термін "істотна спорідненість" означає зв'язування із заданою мішенню з константою дисоціації (Ко) 105 М або менше, 105 М або менше, 10-77 М або менше, 108 М або менше, 109 М або менше, 10-9 М або менше, 10-! М або менше або 10-2 М або менше.
Антитіло (практично) не здатне зв'язуватися з мішенню, якщо воно не має істотної спорідненості до даної мішені й практично не зв'язується, зокрема, зв'язування з даною мішенню не виявляється стандартними аналізами. Бажано, зв'язування антитіла з даною
Зо мішенню не виявляється, якщо воно присутнє в концентрації аж до 2, бажано 10, краще 20, зокрема, 50 або 100 мкг/мл або більше. Бажано антитіло не має істотної спорідненості до мішені, якщо воно зв'язується з даною мішенню з Ко, який щонайменше в 10 разів, 100 разів, 103 разів, 102 разів, 105 разів або 105 разів вищий, ніж Ко зв'язування з такою мішенню, з якою антитіло здатне зв'язуватися. Наприклад, якщо Ко зв'язування антитіла з такою мішенню, з якою антитіло здатне зв'язуватися, становить 10-7 М, то Ко зв'язування з мішенню, до якої антитіло не має істотної спорідненості, буде становити не менше 105 М, 105 М, 102 М, 103 М, 102 М або 10- 1М.
Антитіло є специфічним для заданої мішені, якщо воно здатне зв'язуватися із цією заданою мішенню, але не здатне зв'язуватися з іншими мішенями, тобто не має істотної спорідненості з іншими мішенями і не зв'язується з іншими мішенями суттєво в стандартних аналізах.
Відповідно до винаходу, антитіло є специфічним для СІ ОМ18.2, якщо воно здатне зв'язуватися з СГОМ18.2, але (практично) не здатне зв'язуватися з іншими мішенями. Бажано антитіло є специфічним для СІ ОМ18.2, якщо спорідненість або здатність до зв'язування з такими іншими мішенями суттєво не перевищує спорідненості або здатності до зв'язування з неспорідненими
СІ ОМ18.2 білками, такими як бичачий сироватковий альбумін (В5А), казеїн, сироватковий альбумін людини (НБЗА), або ж з трансмембранними білками відмінними, від клаудину, типу молекул МНС або рецепторів трансферину, або з будь-якими іншими такими поліпептидами.
Бажано антитіло є специфічним для заданої мішені, якщо воно зв'язується з даною мішенню з
Ко, який щонайменше в 10 разів, 100 разів, 103 разів, 107 разів, 105 раз або 105 раз нижчий, ніж
Ко зв'язування з такою мішенню, для якої воно не є специфічним. Наприклад, якщо Ко зв'язування антитіла з такою мішенню, для якої воно є специфічним, становить 10- М, то Ко зв'язування з мішенню, для якої воно не є специфічним, буде становити не менше 105 М, 1079
М, 102 М, 103 М, 102 М або 107 М.
Зв'язування антитіла з мішенню можна визначити експериментально будь-яким придатним методом, наприклад, див. Вег2ої5Ку еї аї., "Апібоду-Апідеп Іпіегасіопе" іп ЕРипдатепіаї
Іттипоіоду, Раш! МУ.Е., вд., Намеп Ргев55, Мем Моїк, МУ (1984); Кибу 48 дапів, Іттипоїіоду, М.Н.
Егеетап апа Сотрапу, Мем/ Могк, МУ (1992); а також описаними тут методами. Спорідненість легко визначається стандартними методами, такими як метод рівноважного діалізу; за допомогою приладу Віасоге 2000, використовуючи загальні процедури, викладені виробником; бо методом радіоїмуноаналіза з використанням радіоактивного антигену-мішені; або іншим методом, відомим фахівцям у даній галузі. Дані щодо спорідненості можна аналізувати, наприклад, методом зсаїснага еї аї., Апп М.У. Асай. зсі, 51:660 (1949). Визначена спорідненість конкретної взаємодії антитіло-антигсен може змінюватися при вимірюванні за різних умов, наприклад, концентрації солі, рН. Тому вимірювання спорідненості й інших параметрів зв'язування з антигеном, наприклад, КО, ІСхо, бажано проводяться зі стандартними розчинами антитіла й антигену й стандартизованим буфером.
У даному винаході термін "ізотип" позначає клас антитіл (наприклад, (ДМ або Ідс1), який кодується генами константної області важкого ланцюга.
У даному винаході термін "перемикання ізотипа" відноситься до явища, при якому клас або ізотип антитіла міняється з одного класу Ід на один з інших класів Ід.
Термін "який зустрічається в природі" або "природний" у даному винаході стосовно об'єкта означає те, що об'єкт зустрічається в природі. Наприклад, послідовність поліпептиду або полінуклеотида, яка присутня в організмі (включаючи віруси) і яка може бути виділеною із природного джерела й не була штучно модифікована людиною в лабораторії, є природною.
Термін "перестановка" у даному винаході відноситься до такої конфігурації локусу важкого ланцюга або легкого ланцюга імуноглобуліну, при якому М-сегмент розташовується безпосередньо поруч із сегментом О-) або У у конформації, що кодує практично повний домен
Мн або Мі, відповідно. Перебудова локусу гена імуноглобуліну (антитіла) виявляється при співрозмірні із зародковою ДНК; при перебудові локус буде містити принаймні один рекомбінований елемент гомології типу гептамера/нонамера.
Термін "неперебудована" або "зародкова конфігурація" у даному винаході щодо М-сегменту відноситься до такої конфігурації, при якій М-сегмент не зазнав рекомбінації й тому не перебуває безпосередньо поруч із сегментом 0 або ..
Відповідно до винаходу антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, представлене антитілом, здатним зв'язуватися з епітопом, присутнім в СІГОМ18.2, бажано з епітопом, розташованим у позаклітинних доменах СІ ОМ18.2, зокрема, у першому позаклітинному домені, бажано в положенні амінокислот від 29 до 78 в СІ ОМ18.2. В окремих втіленнях антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, представлене антитілом, здатним зв'язуватися з (Її) таким епітопом на СІ ОМ18.2, якого немає на СГОМ18.1, бажано 5ЕО ІЮО МО: 3, 4 і 5, (ії)
Ко) епітопом, розташованим на петлі 1 СІОМ18.2, бажано 5БО ІЮ МО: 8, (ії) епітопом, розташованим на петлі 2 СГ ОМ18.2, бажано 5ЕО ІЮ МО: 10, (ім) епітопом, розташованим на петлі ОЗ СГ ОМ18.2, бажано ЗЕО ІЮ МО: 11, (м) епітопом, який охоплює петлю 1 СІ ОМ18.2 і петлю ОЗ СІ ОМ18.2, або (мі) неглікозильованим епітопом, розташованим на петлі ОЗ СІ ОМ18.2, бажано ЗЕО ІЮ МО: 9.
Відповідно до винаходу антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, бажано представлене антитілом, яке має здатність зв'язуватись з СІ ОМ18.2, але не СІ ОМ18.1. Бажано антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СГ ОМ18.2, є специфічним до СГОМ18.2. Бажано антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, представлене антитілом, яке має здатність до зв'язування з СІ ОМ18.2, експресованім на клітинній поверхні. В найкращих втіленнях антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, зв'язується з нативними епітопами
СІГОМ18.2, присутніми на поверхні живих клітин. Бажано антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, зв'язується з одним або декількома пептидами, обраними із групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МоО5: 1, 3-11, 44, 46, 48-50. Бажано антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, є специфічним до вищезгаданих білків, пептидів або їх імуногенних фрагментів або похідних. Антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, може бути отримане способом, який передбачає стадію імунізації тварини білком або пептидом, які містять амінокислотну послідовність, обрану із групи, яка складається з ЗЕО ІЮ МО5: 1, 3-11, 44, 46 і 48- 50, або нуклеїновою кислотою або клітинами хазяїна, які експресують даний білок або пептид.
Бажано антитіло зв'язується з раковими клітинами, зокрема клітинами наведених вище типів рака, і бажано практично не зв'язується з нераковими клітинами.
Бажано зв'язування антитіла, яке має здатність зв'язуватись з СІ ОМ18.2, із клітинами, які експресують СІ ОМ18.2, індукує або опосередковує знищення клітин, які експресують СІ ЮМ18.2.
Клітини, які експресують СІ ОМ18.2, бажано представлені раковими клітинами, зокрема, обраними із групи, яка складається з пухлинних клітин раку шлунка, стравоходу, підшлункової залози, легенів, яєчників, товстої кишки, печінки, голови й шиї й жовчного міхура. Бажано антитіло індукує або опосередковує знищення клітин шляхом індукції одного або декількох із числа опосередкованого комплементзалежною цитотоксичністю (сре) лізису, опосередкованого антитілозалежною клітинної цитотоксичністю (АЮСС) лізису, апоптоза й інгібування проліферації клітин, які експресують СІ ОМ18.2. Бажано опосередкований АЮОСС бо лізис клітин відбувається в присутності ефекторних клітин, які в окремих втіленнях вибирають із групи, яка складається з моноцитів, мононуклеаров, МК-клітин і РММ5. Інгібування проліферації клітин можна вимірювати іп мійго шляхом визначення проліферації клітин методом з використанням бромдезоксиуридину (5-бром-2-дезоксиуридину, ВгаШ). ВІЯО - синтетичний нуклеозид, який є аналогом тимідину й може включатися в новосинтезовану ДНК при реплікації клітин (під час фази 5 клітинного циклу) замість тимідину під час реплікації ДНК. Виявлення його включення, наприклад, за допомогою антитіл, специфічних до Вга|, указує на те, що в клітинах відбувалася активна реплікація ДНК.
У кращих втіленнях описані тут антитіла характеризуються одним або декількома з наступних властивостей: а) специфічність до СІ ОМ18.2; р) спорідненість зв'язування з СІ ОМ18.2 становить близько 100 нм або менше, бажано 5-10
НМ або менше, краще 1-3 нМ або менше; с) здатність індукувати або опосередковувати СОС на СІ ОМ18.2-позитивних клітинах; а) здатність індукувати або опосередковувати АЮОСС на СІ ОМ18.2-позитивних клітинах; е) здатність інгібувати ріст СІ ОМ18.2-позитивних клітин;
І) здатність індукувати апоптоз СІ ОМ18.2-позитивних клітин.
В найкращому втіленні антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ 0ОМ18.2, виробляється гібридомою, депонованою в 05М2 (Мазспегодег Умед 16, 31824 Вгашпоспуеід, Німеччина; нова адреса: ІппобПепвіг. 7В, 31824 Вгашп5спмеїйд, Німеччина), яка має наступне позначення й номер доступу: а). 182-01106-055, номер доступу ОБМ АСС2737, депоновано 19 жовтня 2005 р., р). 182-01106-056, номер доступу ОБМ АСС2738, депоновано 19 жовтня 2005 р., с). 182-01106-057, номер доступу ОБМ АСС2739, депоновано 19 жовтня 2005 р., а). 182-01106-058, номер доступу ОБМ АСС2740, депоновано 19 жовтня 2005 р., е). 182-01106-059, номер доступу ОБМ АСС2741, депоновано 19 жовтня 2005 р., 1). 182-01106-062, номер доступу ОБМ АСС2742, депоновано 19 жовтня 2005 р., 4). 182-01106-067, номер доступу ОБМ АСС2743, депоновано 19 жовтня 2005 р., п). 182-0758-035, номер доступу ОБМ АСС2745, депоновано 17 листопада 2005 р., їз. 182-0758-036, номер доступу ОБМ АСС2746, депоновано 17 листопада 2005 р.,
Ї)- 182-0758-040, номер доступу ОБМ АСС2747, депоновано 17 листопада 2005 р.,
К). 182-01106-061, номер доступу ОБМ АСС2748, депоновано 17 листопада 2005 р.,
І). 182-01106-279, номер доступу ОБМ АСС2808, депоновано 26 жовтня 2006 р., т). 182-01106-294, номер доступу ОМ АСС2809, депоновано 26 жовтня 2006 р., п). 182-01106-362, номер доступу ОБМ АСС2810, депоновано 26 жовтня 2006 р.
Кращими антитілами запропонованими винаходом є антитіла, які виробляються та їх одержують із вищеописаних гібридом, тобто 37511 у випадку 182-01106-055, 37Н8 у випадку 182-01106-056, 3805 у випадку 182-01106-057, З8НЗ у випадку 182-01106-058, 39Е11 у випадку 182-01106-059, 43А11 у випадку 182-01106-062, 6102 у випадку 182-01106-067, 2685 в випадку 182-0758-035, 26012 у випадку 182-0758-036, 28010 у випадку 182-0758-040, 42Е12 у випадку 182-01106-061, 125Е1 у випадку 182-01106-279, 163Е12 у випадку 182-01106-294 і 175010 у випадку 182-01106-362; та їх химерні й гуманізовані форми.
Кращі химерні антитіла і їх послідовності представлені в наступній таблиці.
Таблиця т вин р Денне область
Важкий ланцюг
Легкий ланцюг
У кращих втіленнях антитіла, зокрема химеризовані форми антитіл запропонованих винаходом, включають антитіла, які містять константну область важкого ланцюга (Сн) амінокислотну послідовність, що містить, відбувається з константної області важкого ланцюга людини, як то амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО: 13, або її фрагмент. В інших кращих втіленнях антитіла, зокрема химеризовані форми антитіл запропонованих винаходом, включають антитіла, які містять константну область легкого ланцюга (Сі) амінокислотну послідовність, що містить, відбувається з константної області легкого ланцюга людини, як то амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮО МО: 12, або її фрагмент. В найкращому втіленні антитіла, зокрема химеризовані форми антитіл запропонованих винаходом, включають антитіла, які містять Сн амінокислотну послідовність, що містить, відбувається з Сн людини, як то амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО: 13, або її фрагмент, а також містять Сі амінокислотну послідовність, що містить, відбувається з Сі людини, як то амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО: 12, або її фрагмент.
В одному втіленні антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, представлене химерним моноклональним антитілом миші/людини типу ІдДС1, що включають варіабельну область легкої каппа-ланцюги миші, константну область легкої каппа-ланцюги алотипа Кт (3) людини, варіабельну область важкого ланцюга миші, і константну область ЇДС1 алотипа С1іт (3) людини.
У деяких кращих втіленнях химеризовані форми антитіл включають антитіла, які містять важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, обрану із групи, яка складається з БЕО
ІО МОЗ: 14, 15, 16, 17, 18, 19 та їх фрагментів, і/або ті, які містять легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, обрану із групи, яка складається з ЗЕО ІЮ МО: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 і їхніх фрагментів.
У деяких кращих втіленнях химеризовані форми антитіл включають антитіла, які містять комбінацію важких ланцюгів і легких ланцюгів, обрану з наступних можливих варіантів від (ії) до (їх): () важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО: 14, або її
Зо фрагмент, а легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮО МО: 21, або її фрагмент, (ії) важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮО МО: 15, або її фрагмент, а легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮО МО: 20, або її фрагмент, (ії) важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮ МО: 16, або її фрагмент, а легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену БЕО ІЮО МО: 22, або її фрагмент, (ім) важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮО МО: 18, або її фрагмент, а легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮ МО: 25, або її фрагмент, (м) важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮО МО: 17, або її фрагмент, а легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮО МО: 24, або її фрагмент, (м) важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮ МО: 19, або її фрагмент, а легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮО МО: 23, або її фрагмент, (мі) важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІО МО: 19, або її фрагмент, а легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮО МО: 26, або її фрагмент, (мії) важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО: 19, або її ррагмент, а легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮО МО: 27, або її фрагмент, і (їх) важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮО МО: 19, або її фрагмент, а легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮО МО: 28, або її фрагмент. "Фрагмент" або "фрагмент амінокислотної послідовності", що приводяться вище, відносяться до частини послідовності антитіла, тобто послідовності, яка є послідовність антитіла, укорочену на М- і/або С-кінці, у якої, коли вона заміняє дану послідовність в антитіла, зберігається зв'язування даного антитіла з СІ ОМ18.2 і бажано зберігаються функції даного антитіла, описані тут, наприклад, опосередкованого СОС лізису або опосередкованого АЮОСС лізису. Бажано фрагмент амінокислотної послідовності містить щонайменше 80 95, бажано щонайменше 90 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95 або 99 95 амінокислотних залишків з даної амінокислотної послідовності.
Фрагмент амінокислотної послідовності, обраної із групи, яка складається з ЗЕО ІЮ МО5: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 і 28, бажано означає те, що з даної послідовності вилучено 17, 18, 19, 20, 21, 22 або 23 амінокислоти на М-кінці.
У кращому втіленні антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІОМ18.2, містить варіабельну область важкого ланцюга (Мн) амінокислотну послідовність, що містить, обрану із групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 29, 30, 31, 32, 33, 34 і їх фрагментів.
У кращому втіленні антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІОМ18.2, містить варіабельну область легкого ланцюга (Мі) амінокислотну послідовність, що містить, обрану із
Ко) групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 і їх фрагментів.
У деяких кращих втіленнях антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, містить комбінацію варіабельної області важкому ланцюга (Мн) і варіабельної області легкого ланцюга (Му, обрану з наступних можливих варіантів від (ї) до (їх): (І) Мн містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО: 29, або її фрагмент, а
Мі містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮО МО: 36, або її фрагмент, (ї) Мн містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮ МО: 30, або її фрагмент, а
Мі містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮО МО: 35, або її фрагмент, (ії) Мн містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО: 31, або її фрагмент, а
Мі містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮО МО: 37, або її фрагмент, (м) Мн містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО: 33, або її фрагмент, а
Мі містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО: 40, або її фрагмент, (у) Мн містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮО МО: 32, або її фрагмент, а
Мі містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮО МО: 39, або її фрагмент, (мі) Мн містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО: 34, або її фрагмент, а
Мі містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮО МО: 38, або її фрагмент, (мії) Мн містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІО МО: 34, або її фрагмент, а
Мі містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО: 41, або її фрагмент, (мії) Мн містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІО МО: 34, або її фрагмент, а Мі містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮ МО: 42, або її фрагмент, і
БО (їх) Мн містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО: 34, або її фрагмент, а
Мі містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮО МО: 43, або її фрагмент.
У кращому втіленні антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, містить область Мн, що включає комплект визначальних комплементарність ділянок СОКІ, СОК2 і СОКЗ, обраний з наступних варіантів від (ї) до (мі): () СОКІ: положення 45-52 в 5БЕО ІО МО: 14, СОК2: положення 70-77 в 5ЕО ІЮО МО: 14,
СОК3: положення 116-125 в 5ЕО ІЮО МО: 14, (її) СОВІТ: положення 45-52 в ЗЕО ІЮ МО: 15, СОМК2: положення 70-77 в ЗЕО ІЮО МО: 15,
СОК3: положення 116-126 в 5ЕО І МО: 15, (ій) СОК1: положення 45-52 в 5ЕО ІЮО МО: 16, СОК2: положення 70-77 в 5ЕО ІО МО: 16, 60 СОК3: положення 116-124 в 5ЕО ІО МО: 16,
(м) СОКІ1: положення 45-52 в 5БЕО ІЮ МО: 17, СОК2: положення 70-77 в 5ЕО ІЮО МО: 17,
СОК3: положення 116-126 в 5ЕО ІЮО МО: 17, (м) СОКТ: положення 44-51 в 5ЕО ІЮ МО: 18, СОК2: положення 69-76 в 5ЕО ІЮ МО: 18,
СОВ3: положення 115-125 в 5ЕО ІЮО МО: 18, і (м) СОКІ1: положення 45-53 в 5ЕО ІЮ МО: 19, СОК2: положення 71-78 в 5ЕО ІЮО МО: 19,
СО: положення 117-128 в ЗЕО ІЮО МО: 19.
У кращому втіленні антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, містить область Мі, що включає комплект визначальних комплементарність ділянок СОКІ, СОК2 і СОКЗ, обраних з наступних варіантів від (ї) до (їх): () СОК1: положення 47-58 в 5ЕО ІО МО: 20, СОК2: положення 76-78 в 5БЕО ІЮО МО: 20,
СОК3: положення 115-123 в 5ЕО ІЮО МО: 20, (ії) СОКІ: положення 49-53 в 5ЕО ІЮ МО: 21, СОК2: положення 71-73 в 5ЕО ІЮО МО: 21,
СОМ3: положення 110-118 в 5ЕО ІЮО МО: 21, (ій) СОК1: положення 47-52 в 5ЕО ІО МО: 22, СОК2: положення 70-72 в 5ЕО ІЮО МО: 22,
СОК3: положення 109-117 в 5ЕО ІЮО МО: 22, (мМ) СОК1: положення 47-58 в 5ЕО ІЮ МО: 23, СОК2: положення 76-78 в 5ЕО ІЮ МО: 23,
СОК3: положення 115-123 в 5ЕО ІО МО: 23, (м) СОКТ: положення 47-58 в 5ЕО ІЮ МО: 24, СОК2: положення 76-78 в 5ЕО ІЮ МО: 24,
СОК3: положення 115-123 в 5ЕО ІЮО МО: 24, (м) СОКІ1: положення 47-58 в 5ЕО ІЮ МО: 25, СОК2: положення 76-78 в 5ЕО ІЮО МО: 25,
СОМ: положення 115-122 в 5ЕО ІЮО МО: 25, (мі) СОКІТ: положення 47-58 в 5ЕО ІЮ МО: 26, СОК2: положення 76-78 в 5ЕО ІЮО МО: 26,
СОК3: положення 115-123 в 5ЕО ІЮО МО: 26, (мії) СОКІ: положення 47-58 в 5ЕО ІЮ МО: 27, СОК2: положення 76-78 в 5ЕБЕО ІЮ МО: 27,
СОВ3: положення 115-123 в 5ЕО ІЮО МО: 27, і (іх) СОКІ1: положення 47-52 в 5БЕО ІЮ МО: 28, СОК2: положення 70-72 в 5ЕО ІЮО МО: 28,
СО: положення 109-117 в ЗЕО ІО МО: 28.
У кращому втіленні антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, містить комбінацію
Мн і Мі, яка включає комплект визначальних комплементарність ділянок СОКІ, СОК2 і СОКЗ,
Зо обраний з наступних втілень від (ії) до (їх): () Мн: СОКТ: положення 45-52 в БЕО ІЮ МО: 14, СОК2: положення 70-77 в 5ЕО ІЮО МО: 14,
СОКЗ: положення 116-125 в 5БЕО ІЮ МО: 14; Мі: СОКІ1: положення 49-53 в БЕО ІЮ МО: 21, СОКО: положення 71-73 в ЗЕО ІЮО МО: 21, СОКЗ: положення 110-118 в 5ЕО ІЮО МО: 21; (ії) Мн: СОКІ1: положення 45-52 в 5ЕО ІЮ МО: 15, СОК2: положення 70-77 в 5ЕО ІЮ МО: 15,
СО: положення 116-126 в 5ЕО ІЮ МО: 15; Мі: СОК1: положення 47-58 в 5ЕО ІЮО МО: 20, СОКО: положення 76-78 в ЗЕО ІЮ МО: 20, СОКЗ: положення 115-123 в 5ЕО ІЮО МО: 20; (її) Мн: СОКІ1: положення 45-52 в 5ЕО ІО МО: 16, СОК2: положення 70-77 в ЗЕО ІЮО МО: 16,
СО: положення 116-124 в 5ЕО ІЮ МО: 16; Мі: СОВІ1: положення 47-52 в 5ЕО ІО МО: 22, СОКО: положення 70-72 в ЗЕО ІЮО МО: 22, СОКЗ: положення 109-117 в 5ЕО ІЮО МО: 22; (м) Мн: СОКТ: положення 44-51 в БЕО ІЮ МО: 18, СОК2: положення 69-76 в 5ЕО ІО МО: 18,
СОКЗ: положення 115-125 в 5БЕО ІЮ МО: 18; Мі: СОКІ1: положення 47-58 в БЕО ІЮ МО: 25, СОМКО: положення 76-78 в ЗЕО ІЮ МО: 25, СЮОКЗ: положення 115-122 в 5ЕО ІЮО МО: 25; (м) Мн: СОКТ: положення 45-52 в 5ЕО ІЮО МО: 17, СОК2: положення 70-77 в 5ЕО ІЮ МО: 17,
СОКЗ: положення 116-126 в 5ЕО ІЮ МО: 17; Мі: СОКІ1: положення 47-58 в БЕО ІЮ МО: 24, СОМКО: положення 76-78 в ЗЕО ІЮО МО: 24, СОКЗ: положення 115-123 в 5ЕО ІЮО МО: 24; (мі) Мн: СОКТ: положення 45-53 в 5ЕО ІЮ МО: 19, СОК2: положення 71-78 в ЗЕО ІО МО: 19,
СОКЗ: положення 117-128 в 5ЗЕО ІЮ МО: 19; Мі: СОКІ1: положення 47-58 в ЗЕО ІЮ МО: 23, СОМКО: положення 76-78 в ЗЕО ІЮ МО: 23, СОКЗ: положення 115-123 в 5ЕО ІЮО МО: 23; (мі) Мн: СОКІ1: положення 45-53 в БЕО ІЮ МО: 19, СОК2: положення 71-78 в 5ЕО ІЮ МО: 19,
БО СОМ: положення 117-128 в 5ЕО ІЮ МО: 19; М: СОК1: положення 47-58 в 5ЕО ІЮ МО: 26, СОВ2: положення 76-78 в ЗЕО ІЮ МО: 26, СОКЗ: положення 115-123 в 5ЕО ІЮО МО: 26; (мії) Мн: СОКІ: положення 45-53 в БЕО ІЮ МО: 19, СОК2: положення 71-78 в ЗЕО ІЮ МО: 19,
СОМ: положення 117-128 в 5ЕО ІЮ МО: 19; М: СОК1: положення 47-58 в 5ЕО ІЮ МО: 27, СОВ2: положення 76-78 в ЗЕО ІЮО МО: 27, СОКЗ: положення 115-123 в 5ЕО ІЮО МО: 27; і (їх) Мн: СОКТ: положення 45-53 в 5ЕО ІЮ МО: 19, СОК2: положення 71-78 в ЗЕО ІО МО: 19,
СОМ: положення 117-128 в 5ЕО ІЮ МО: 19; М: СОК1: положення 47-52 в 5ЕО ІЮО МО: 28, СОВ2: положення 70-72 в ЗЕО ІЮ МО: 28, СОКЗ: положення 109-117 в 5ЕО ІЮО МО: 28.
В інших кращих втіленнях антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, бажано містить одну або кілька ділянок, що визначають комплементарність (СОК), бажано принаймні 60 ділянка СОКЗ з варіабельної області важкого ланцюга (Мн) і/або варіабельної області легкого ланцюга (М) моноклонального антитіла проти СІОМ18.2, бажано описаного тут моноклонального антитіла проти СІГОМ18.2, а бажано воно містить одну або кілька визначальних комплементарність ділянок (СОК), бажано принаймні ділянка СОМКЗ з описаних тут варіабельних областей важкого ланцюга (Мн) і/або варіабельних областей легкого ланцюга (Му. В одному втіленні дані одна або кілька ділянок, що визначають комплементарність (СОМ), вибирають із описаного тут комплекту визначальних комплементарність ділянок СОМК1, СОК2 і
СОКЗ. В найкращому втіленні антитіло, яке має здатність зв'язуватися з СІ ОМ18.2, бажано містить визначальні комплементарність ділянки СОКІ, СОМК2 і СОКЗ з варіабельної області важкого ланцюга (Мн) і/або варіабельної області легкого ланцюга (Мі) моноклонального антитіла проти СГ ОМ18.2, бажано описаного тут моноклонального антитіла проти СІ ОМ18.2, а бажано воно містить визначальні комплементарність ділянки СОКІ, СОК2 ії СОКЗ з описаних тут варіабельних областей важкого ланцюга (Мн) і/або варіабельних областей легкого ланцюга (Мі).
В одному втіленні антитіло, що містить одну або кілька ділянок СОК, комплект СОК або комбінацію комплектів СОК, як описано тут, містить дані СОК5 разом з перемежованими з ними каркасними ділянками. Бажано ця частина також повинна включати щонайменше 50 9о однієї з каркасних ділянок - першої та четвертої або обох, причому ці 50 95 становлять С-кінцеві 50 90 першої каркасної ділянки й М-кінцеві 50 95 четвертої каркасної ділянки. Конструювання антитіл методами рекомбінантної ДНК може привести до включення залишків з боку М- або С-кінця у варіабельні області, які кодуються лінкерами, уведеними для полегшення клонування або інших стадій обробки, включаючи введення лінкерів для сполуки варіабельних областей відповідно до винаходу з послідовностями інших білків, у тому числі важких ланцюгів імуноглобулінів, інших варіабельних доменів (наприклад, при одержанні диатіл) або білкових міток.
В одному втіленні антитіло, що містить одну або кілька ділянок СОК, комплект СОК або комбінацію комплектів СОК, як описано тут, містить дані СОК5 у каркасі людського антитіла.
Згадування тут антитіл, що містять стосовно свого важкого ланцюга певний ланцюг або певну область або послідовність, бажано відноситься до такої ситуації, коли всі важкі ланцюги даного антитіла містять даний конкретний ланцюг, область або послідовність. Це також відноситься й до легкого ланцюга антитіл, відповідно.
Термін "нуклеїнова кислота" у даному винаході служить для позначення ДНК і РНК.
Зо Нуклеїнова кислота може бути одноланцюговою або дволанцюговою, але бажано це дволанцюгова ДНК.
Відповідно до винаходу, термін "експресія" застосовується в його самому загальнім значенні й включає продукцію РНК або РНК і білка/пептиду. Він також включає часткову експресію нуклеїнових кислот. Крім того, експресія може здійснюватися тимчасово або стабільно.
Наведені тут відомості у відношенні певних амінокислотних послідовностей, наприклад, представлених у переліку послідовностей, слід розуміти так, що вони також відносяться й до таких варіантів даних конкретних послідовностей, у яких послідовності функціонально еквівалентні даної конкретної послідовності, наприклад, їхні амінокислотні послідовності проявляють властивості, ідентичні або близькі таким у певних амінокислотних послідовностей.
Одним з важливих властивостей є збереження зв'язування антитіла зі своєю мішенню або підтримка ефекторних функцій антитіла. Бажано послідовність, яка є варіантом стосовно певної послідовності, коли вона заміняє цю конкретну послідовність в антитіла, зберігає зв'язування даного антитіла з С ОМ18.2 і бажано функції даного антитіла, як описано тут, наприклад, опосередкований СОС лізис або опосередкований АОСС лізис.
Фахівцям повинне бути відомо те, зокрема, що послідовності ділянок СОК, гіперваріабельних і варіабельних областей можна модифікувати без втрати здатності до зв'язування з СІ ОМ18.2. Наприклад, ділянки СОМ повинні бути або ідентичними, або сильно гомологічними наведеним тут ділянкам антитіл. Під "високої гомологічностью" мається на увазі те, що в СОК може бути від 1 до 5, бажано від 1 до 4, як то від 1 до З або 1 або 2 заміни. Крім того, гіперваріабельні й варіабельні області можна модифікувати так, щоб вони проявляли істотну гомологію з конкретними наведеними тут ділянками антитіл.
У даному винаході "варіанти" амінокислотної послідовності включають варіанти із вставкою амінокислот, варіанти з додаванням амінокислот, варіанти з делецією амінокислот і/або варіанти із заміною амінокислот. Варіанти з делецією амінокислот, що включають делеції на М- кінці й/або С-кінці білка, також називаються М-кінцевими й/або С-кінцевими усіченими варіантами.
Варіанти із вставкою амінокислот включають вставки однієї або двох або декількох амінокислот у певній амінокислотній послідовності. У випадку варіантів амінокислотної послідовності із вставками в певне місце в амінокислотній послідовності вставляється один або 60 кілька амінокислотних залишків, хоча також можливі й випадкові вставки з відповідним
Зо скринінгом отриманого продукту.
Варіанти з додаванням амінокислот включають приєднання по М- і/або С-кінцям однієї або декількох амінокислот, як то 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 або більше амінокислот.
Варіанти з делецією амінокислот характеризуються видаленням з послідовності однієї або декількох амінокислот, як то видаленням 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 або більше амінокислот.
Делеції можуть бути в будь-якому положенні білка.
Варіанти із заміною амінокислот характеризуються тим, що щонайменше один залишок у послідовності віддаляється, а на його місце вставляється інший залишок. Перевага віддається модифікаціям, що доводяться на такі положення в амінокислотній послідовності, які не зберігаються між гомологічними білками або пептидами, і/або замінам амінокислот на інші з аналогічними властивостями. Бажано заміни амінокислот у білкових варіантах є консервативними замінами, тобто це заміни аналогічних заряджених або незаряджених амінокислот. Консервативні амінокислотні заміни включають заміни в рамках одного родини амінокислот, подібних по своїх бічних ланцюгах. амінокислоти, що зустрічаються в природі, звичайно підрозділяються на чотири родини: кислі (аспартат, глутамат), основні (лізин, аргінін, гістидін), неполярні (аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан) і незаряджені полярні (гліцин, аспарагін, глутамін, цистеїн, серин, треонін, тирозин) амінокислоти. Фенілаланін, триптофан і тирозин іноді класифікуються в сукупності як ароматичні амінокислоти.
Бажано ступінь подібності, бажано ідентичності між даною амінокислотною послідовністю й амінокислотною послідовністю, яка є варіантом даної амінокислотної послідовності, повинна становити щонайменше 60 95, 65 95, 70 95, 80 95, 81 95, 82 905, 83 95, 84 95, 85 95, 86 95, 87 95, 88 со, 89 90, 90 95, 91 Уо, 92 95, 93 905, 94 95, 95 95, 96 90, 97 95, 98 95 або 99 95. Ступінь подібності або ідентичності бажано приводиться для амінокислотної ділянки, що становить щонайменше 10 95, щонайменше 20 95, щонайменше 30 95, щонайменше 40 956, щонайменше 50 96, щонайменше 60 до, щонайменше 70 95, щонайменше 80 95, щонайменше 90 95 або близько 100 95 від усієї довжини контрольної амінокислотної послідовності. Наприклад, якщо контрольна амінокислотна послідовність складається з 200 амінокислот, то ступінь подібності або ідентичності бажано приводиться щонайменше для 20, щонайменше 40, щонайменше 60, щонайменше 80,
Зо щонайменше 100, щонайменше 120, щонайменше 140, щонайменше 160, щонайменше 180 або близько 200 амінокислот, бажано безперервних амінокислот. У кращому втіленні ступінь подібності або ідентичності приводиться для всієї довжини контрольної амінокислотної послідовності. Сполучення послідовностей для визначення подібності, бажано ідентичності послідовностей проводиться за допомогою відомих інструментів, бажано методом найкращого сполучення послідовностей, наприклад, за допомогою АЇйдп, використовуючи стандартні настроювання, бажано ЕМВО55:пееаіе, Маїгіх: Віохитб2, Сар Ореп 10.0, Сар Ехіепа 0.5. "Подібність послідовностей" означає відсоток амінокислот, які або ідентичні, або представляють консервативні заміни амінокислот. "Ідентичність послідовностей" між двома амінокислотними послідовностями означає відсоток амінокислот, ідентичних між цими послідовностями.
Термін "ступінь ідентичності" служить для позначення відсотка ідентичних амінокислотних залишків між двома порівнюваними послідовностями, отриманого після найкращого вирівнювання, причому цей відсоток є чисто статистичним, а відмінності між двома послідовностями розподіляються випадковим чином і по всій довжині. Порівняння послідовностей між двома амінокислотними послідовностями звичайно проводиться шляхом порівняння цих послідовностей після їхнього оптимального вирівнювання, причому таке порівняння проводиться по сегментах або по "вікнах порівняння" з метою виявлення й порівняння локальних ділянок подібності послідовностей. Оптимальне вирівнювання послідовностей для їхнього порівняння може проводитися вручну або ж за допомогою алгоритму локальної гомології 5тіїйп апа Умаїептап, 1981, Ааз. Арр. май. 2, 482, за допомогою алгоритму локальної гомології МедаІетап апа Му/йп5сп, 1970, 9У. Мої. ВіоЇ. 48, 443, методом пошуку подібності Реагзоп апа Гіртап, 1988, Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 85, 2444, або за допомогою комп'ютерних програм, у яких використовуються ці алгоритми (ЗАР, ВЕ5ТРЇІТ,
ЕАБЗТА, ВІ АБТР, ВГАЗТМ і ТЕАЗТА у пакеті програм Умізсопзіп Сепеїїс5 Зоїймаге РасКаде, Сепеїйсвз ботриїег Сспоир, 575 Зсіепсе Огіме, Мадізоп, МУ/ів.).
Ступінь ідентичності обчислюється шляхом визначення числа ідентичних положень між двома порівнюваними послідовностями, розподілу цієї кількості на число порівнюваних положень і множення отриманого результату на 100, одержуючи відсоток ідентичності між цими двома послідовностями. бо Термін "трансгенна тварина" відноситься до таких тварин, у яких геном містить один або кілька трансгенів, бажано трансгенів важких і/або легких ланцюгів або трансхромосом (вбудованих або не вбудованих у природну геномну ДНК тварини), які бажано здатні експресувати ці трансгени. Наприклад, трансгена миша може містити трансген легкого ланцюга людини й або трансген важкому ланцюга людини, або трансхромосому важкому ланцюга людини, так що миша буде виробляти людські антитіла проти СІ ОМ18.2 при імунізації антигеном СІ ОМ18.2 і/або клітинами, які експресують СІ 0ОМ18.2. Трансген важкому ланцюга людини може бути вбудований у хромосомну ДНК миші, як у випадку трансгенних мишей, наприклад, мишей НитАр, як то мишей Нсо7 або Нсоі2, або ж трансген важкому ланцюга людини може втримуватися поза хромосомами, як у випадку трансхромосомних мишей (наприклад, мишей КМ), як описано в УМО 02/43478. Такі трансгенні й трансхромосомні миші можуть виробляти трохи ізотипов людських моноклональних антитіл до СІ ОМ18.2 (наприклад,
Ід, Іда і/або Іде) шляхом проходження через рекомбінацію МУ-О-) і перемикання ізотипа. "Зменшення", "зниження" або "інгібування" у даному винаході означає загальне зниження або здатність викликати загальне зниження рівня, бажано на 5 95 або більше, 10 95 або більше, 95 або більше, краще на 50 95 або більше й найбільше бажано на 75 95 або більше, наприклад, рівня експресії або рівня проліферації клітин.
Терміни типу "підвищення" або "збільшення" краще означають підвищення або збільшення щонайменше на 10 95, бажано щонайменше на 20 95, бажано щонайменше на 30 95, краще щонайменше на 40 95, краще щонайменше на 50 956, ще краще щонайменше на 80 95 і 20 найбільше бажано щонайменше на 100 95, на 200 95, на 500 95, на 1000 95, на 10000 95 або ще більше.
Механізми дії тАр
Хоча далі представлені міркування щодо механізму, що лежить в основі терапевтичної ефективності антитіл запропонованих винаходом, однак це жодним чином не слід розглядати як обмеження винаходу.
Описані тут антитіла бажано взаємодіють із компонентами імунної системи, бажано через
АрСС або СОС. Описані тут антитіла також можуть застосовуватися для спрямованої доставки корисних вантажів (наприклад, радіоіїзотопів, лікарських препаратів або токсинів) для безпосереднього знищення пухлинних клітин або ж можуть застосовуватися синергично із
Зо традиційними хіміотерапевтичними засобами, що атакують пухлини через додаткові механізми дії які можуть включати протипухлинні імунні відповіді, оказавшиеся порушеними через цитотоксичних побічних ефектів хіміотерапевтичних препаратів на Т-Лімфоцити. Однак описані тут антитіла також можуть виявляти дія проста шляхом зв'язування з СІ ОМ18.2 на клітинній поверхні, тим самим, наприклад, блокуючи проліферацію клітин.
Антитілозалежна клітинна цитотоксичність (АЮОСС)
АрСС означає здатність до знищення клітин в ефекторних клітин, як описано тут, зокрема, у лімфоцитів, для чого бажано потрібно, щоб клітини мішені були позначені антитілом.
АрСС бажано відбувається тоді, коли антитіла зв'язуються з антигенами на пухлинних клітинах, а Ес-Домени антитіл задіють Ес-Рецептори (Есг) на поверхні імунних ефекторних клітин. Ідентифіковано кілька родин Ес-Рецепторів, причому певні популяції клітин експресують характерні для них Ес-Рецептори. АЮОСС може розглядатися як механізм безпосередньої індукції в різному ступені негайного руйнування пухлини, що приводить до презентації антигену й індукції спрямованих на пухлину и-клітинних відповідей. Бажано індукція АОСС іп мімо повинна викликати спрямовані на пухлину и-клітинні відповіді й відповіді антитіл організму.
Комплементзалежна цитотоксичність (СОС)
СОС є ще одним методом знищення клітин, який запускається антитілами. Найбільш ефективним ізотипом для активації комплементу є Ідт. Також Ідс1 і Ї43 обоє дуже ефективно запускають СОС по класичному шляхові активації комплементу. Бажано в цьому каскаді утвір комплексів антиген-антитіло приводить до демаскування декількох найближчих сайтів зв'язування С14 на доменах Сн2 задіяних молекул антитіл типу молекул до (С14 є одним із трьох субкомпонентів комплементу С1). Бажано ці демасковані сайти зв'язування Ста перетворюють колись низкоафінна взаємодія С1д-Ідс у взаємодії з високою спорідненістю, яка запускає каскад подій за участю ряду інших білків комплементу й приводить до протеолітичному вивільненню хемотаксичних/, що активують ефекторні клітини молекул ЗЗа й З5а. Бажано каскад комплементу закінчується утвором мембраноатакующего комплексу, який створює пори в клітинній мембрані, що сприяють вільному проходженню води й розчинених речовин у клітину й із клітини.
Одержання й тестування антитіл
Описані тут антитіла можуть бути отримані різними способами, включаючи стандартні 60 методи моноклональних антитіл, наприклад, стандартний метод гібридизації соматичних клітин
Копіег апа Міївівїп, Майиге 256: 495 (1975). Хоча методи гібридизації соматичних клітин і кращі, однак у принципі можна використовувати й інші методи одержання моноклональних антитіл, наприклад, вірусної або онкогенної трансформації В-лімфоцитів або методи фагового дисплея з використанням бібліотек генів антитіл.
Кращою тваринною системою для одержання гібридом, секретуючих моноклональні антитіла, є мишача система. Одержання гібридом на мишах є дуже добре розробленою процедурою. Відомі методики імунізації й методи виділення імунізованих спленоцитов для злиття. Також відомі партнери для злиття (наприклад, мієломні клітини миші) і процедури злиття.
Іншими кращими системами она тварин для одержання гібридом, секретуючих моноклональні антитіла, є системи на пацюках і кроликах (наприклад, описані в ЗріеКег-Роїеї єї а!., Ргос. Маї!. Асад. Зсі. ОБА 92:9348 (1995), також див. Кобвб5і еї аї., Ат. у. Сііп. Раїйої. 124: 295 (2005)).
У ще одному кращому втіленні моноклональні антитіла людини можуть бути отримані з використанням трансгенних або трансхромосомних мишей, що несуть частини імунної системи людини, а не системи миші. Ці трансгенні й трансхромосомні миші включають мишей, відомих як миші НитАбБ і КМ миші, відповідно, і собирательно іменуються тут як "трансгенні миші".
Одержання людських антитіл у таких трансгенних мишах може проводитися, як описано докладно для СО2О в УМО 2004/035607.
Ще одна стратегія для одержання моноклональних антитіл полягає в тому, щоб безпосередньо виділити гени, що кодують антитіла, з лімфоцитів, що виробляють антитіла певної специфічності, наприклад, див., ВарсосК еї аіІ., 1996: А поме! 5ігаїеду їог депегайіпд топосіопаї апіїродієв їтот віпадіє, ізоїаїейд Іутрпосуїез ргодисіпд апіїродієв ої аеїіпей 5ресіїісйіев.
Докладно про конструювання рекомбінантних антитіл див. також МУуУеібспоОї апа Кгац»,
Весотбіпапі апіїродієє ог сапсег Шегару: І5ВМ-0-89603-918-8; і Веппу К.С. Го, Апіїроду
Епдіпеетіпод: ІЗВМ 1-58829-092-1.
Для одержання антитіл можна імунізувати мишей кон'югованими з носіями пептидами, отриманими з послідовності антигену, тобто послідовності, проти якої повинні бути спрямовані антитіла, збагаченим препаратом рекомбінантно експресованого антигену або його фрагментів
Зо ілабо клітинами, які експресують антиген, як описано. З іншого боку, можна імунізувати мишей
ДНК, що кодує антиген або його фрагменти. У тому випадку, коли імунізація очищеним або збагаченим препаратом антигену не приводить до утворення антитіл, мишей також можна імунізувати клітинами, які експресують антиген, наприклад, клітинної лінії, щоб підсилити імунні відповіді.
Імунна відповідь можна відслідковувати по ходу імунізації за допомогою зразків плазми й сироватки, отриманих із хвостової вени або заочноямкових проб крові. Мишей з достатнім титром імуноглобуліну можна використовувати для злиття. Для підвищення відсотка гібридом, секретуючих певне антитіло, мишей можна ревакцинувати внутрішньоочеревинно або внутрішньовенно клітинами, які експресують антиген, за З доби до забою й видалення селезінки.
Для одержання гібридом, які продукують моноклональні антитіла, можна виділити спленоцити й клітини лімфатичних вузлів з імунізованих мишей і злити їх з відповідної іморталізованою лінією клітин типу лінії клітин мієломи миші. Отримані гібридоми можна потім піддати скринінгу на вироблення антиген-специфічних антитіл. Потім можна провести скринінг індивідуальних комірок методом ЕГІЗА на предмет гібридом, які секретують антитіла.
Використовуючи клітини, які експресують антиген, можна ідентифікувати антитіла зі специфічністю до антигену по імунофлуоресценції й методом ЕГАС5. Секретуючі антитіла гібридоми можна пересіяти, знову провести скринінг і, якщо вони як і раніше будуть позитивними на наявність моноклональних антитіл, субклонировать методом серійних розведень. Потім можна культивувати стабільні субклони іп міго, щоб одержати антитіла в середовищі для культури тканини для вивчення.
Антитіла також можна одержати в клітинах трансфектоми, наприклад, комбінацією методів рекомбінантної ДНК і методів генної трансфекції, які добре відомі в даній області (Моггізоп 5. (1985) Зсієпсе 229: 1202).
Наприклад, в одному втіленні, потрібні гени, наприклад, гени антитіла, можна лігувати в експресійний вектор типу експресуючої плазміди для еукаріот типу тієї, що використовується в системі експресії генів з5, розкритої в УМО 87/04462, МО 89/01036 і ЕР 338 841, або іншої системи експресії, добре відомої в даній галузі. Очищену плазміду із клонованими генами антитіла можна ввести в еукаріотичні клітини хазяїна, як то клітини СНО, клітини М5/0, клітини бо НЕК293Т або клітини НЕК293 або ж в інші еукаріотичні клітини типу рослинних клітин, грибкових або дріжджових клітин. Для введення цих генів можна використовувати вже описані методи, такі як електропорация, липофекция, липофектамін або інші. Після введення цих генів антитіла в клітини хазяїна можна ідентифікувати й відібрати клітини, які експресують антитіло. Ці клітини є трансфектоми, які можна потім розмножити до потрібного рівня експресії й одержання антитіл.
Із супернатантов цих культур і/або клітин можна виділити й очистити рекомбінантні антитіла.
З іншого боку, клоновані гени антитіла можна експресувати в інших системах експресії, включаючи прокариотичні клітини типу мікроорганізмів, наприклад, Е. соїї. Більше того, антитіла можна одержувати й у трансгенних тварин, наприклад, у молоці з овець і кроликів або в яйцях з курей, або в трансгенних рослинах; наприклад, див. Мегта К. еї аї. (1998) У. Іттипої. Мей. 216: 165-181; РоїоскК еї аї. (1999) 9. Іттипої. Меїй. 231: 147-157; і РізсНег В. еї аї. (1999) 3. ВіоЇ. Спет. 380: 825-839.
Химеризація
Мишачі моноклональні антитіла можна використовувати як терапевтичні антитіла для людини, якщо позначити їх токсинами або радіоактивними ізотопами. Немічені мишачі антитіла є сильно імуногенними для людини, що при повторному застосуванні веде до зниження терапевтичного ефекту. В основному імуногенность опосередкована константними областями важкого ланцюга. Імуногенность мишачих антитіл для людини можна зменшити або повністю усунути, якщо відповідні антитіла піддати химеризації або гуманізації. Химерні антитіла - це такі антитіла, різні частини яких походять від різних видів тварин, як то варіабельна область походить із антитіла миші, а константна область - з імуноглобуліну людини. Химеризація антитіл здійснюється шляхом приєднання варіабельних областей важкому й легкого ланцюга мишачого антитіла до константної області важкого й легкого ланцюга людини (наприклад, як описано
Кташив еї аї., іп Меїпоадз5 іп МоїІесшаг Віоіоду 5егіе5, Несотбіпапі апііїродієв ог сапсег Шегару
ІЗВМ-0-89603-918-8). У кращому втіленні химерні антитіла одержують шляхом сполуки константної області легкої каппа-ланцюги людини з варіабельною областю легкого ланцюга миші. В іншому кращому втіленні химерні антитіла можна одержати шляхом поєднання константної області легкого лямбда-ланцюга людини з варіабельною областю легкого ланцюга миші. Для одержання химерних антитіл кращі константні області важкого ланцюга типу Ідс1,
ІЧОЗ і Ід04. Інші кращі константні області важкого ланцюга для одержання химерних антитіл -
Зо ІЧо2, ІДА, ІдО і дм.
Гуманізація
Антитіла взаємодіють із антигенами мішені бажано через ті амінокислотні залишки, які перебувають у шести визначальних комплементарність ділянках (СОК) важкому й легкому ланцюга. Із цієї причини амінокислотні послідовності в межах СОК більш різноманітні між окремими антитілами, чому послідовності поза СОК. Оскільки послідовності СОК відповідальні за більшу частину взаємодій антитіло-антиген, те можна експресувати рекомбінантні антитіла, що імітують властивості певних природних антитіл, шляхом конструювання які експресують векторів, що включають послідовності СОК з даного природного антитіла, привиті на каркасні послідовності з іншого антитіла з іншими властивостями (наприклад, див. Кіесптапп 1. еї аї. (1998) Маїште 332: 323-327; допе5 Р. єї аї. (1986) Машге 321: 522-525; і СОцееп С. еї аї. (1989)
Ргос. Маї. Асад. сі. ОБА 86:10029-10033). Такі каркасні послідовності можна одержати із загальнодоступних баз даних по ДНК послідовності, що містять, генів антитіл зародкової лінії. Ці послідовності зародкової лінії будуть відрізнятися від зрілих послідовностей генів антитіл, тому що вони не включають повністю зібрані гени варіабельної області, які утворюються при з'єднанні М-(О0)-У у процесі дозрівання В-клітин. Послідовності зародкової лінії генів також відрізняються від послідовностей антитіл з високою спорідненістю із вторинного репертуару за окремими точками рівномірно по всій варіабельній області.
Здатність антитіл до зв'язування з антигеном можна визначити стандартними методами аналізу зв'язування (наприклад, методами ЕГІ5А, Вестерн-Блот, імунофлуоресценції й проточної цитометрії).
Для очищення антитіл можна вирощувати відібрані гібридоми у дволітрових обертових колбах для очищення моноклональних антитіл. З іншого боку, антитіла можна одержувати в диализних биореакторах. Супернатанти фільтрують, а при необхідності й концентрують перед проведенням афінної хроматографії на сефарозі з білком Сб або сефарозі з білком А.
Елюйований ІдсС піддають перевірці на чистоту методами гель-електрофореза й високоефективної рідинної хроматографії. Буферний розчин міняють на РВ5, а концентрацію визначають по ОЮгво, використовуючи коефіцієнт екстинкції 1,43. Моноклональні антитіла розділяють на порції й зберігають при -80 "С.
Щоб визначити, чи зв'язуються обрані моноклональні антитіла з унікальними епітопами, бо можна використовувати сайт-спрямований або множинний сайт-спрямований мутагенез.
Для визначення ізотипа антитіл можна провести ЕГІБА на ізотип за допомогою різних комерційних наборів (наприклад, 7утей, Коспе Оіадповіїіс5). Комірки мікропланшета покривають антитілом проти Ід миші. Після блокування планшет піддають реакції з моноклональними антитілами або очищеними контролями на ізотип, за кімнатної температури протягом двох годин. Потім комірки піддають реакції з кон'югованими з пероксидазой зондами, специфічними до ІДС1, Ідога, Ідс26р або ІдсСЗ миші, ІДА або ДМ миші. Після відмивання планшет проявляють за допомогою субстрату АВТ5 (1 мг/мл) і аналізують по ОЮло05-65хо. З іншого боку, можна використовувати набір Ізозігір Моизе Мопосіопа! Апіібоду Ізоїуріпуд Кії (Коспе, кат. Мо 1493027), як описано виробником.
Для того, щоб показати наявність антитіл у сироватці імунізованих мишей або зв'язування моноклональних антитіл з живими клітинами, які експресують антиген, можна використовувати проточну цитометрію. Клітинні лінії, які експресують антиген природно або після трансфекції, і негативні контролі, не які експресують антиген (вирощені в стандартних умовах росту), змішують із різними концентраціями моноклональних антитіл у супернатантах гібридом або в
РВ5, що містить 1 95 ЕВ5, і інкубують при 4 "С протягом 30 хв. Після відмивання проводять зв'язування мічених Арс або АїЇехаб47 антитіл проти Ідс 3, що зв'язався 3 антигеном моноклональним антитілом у такі ж умовах, як і при зв'язуванні первинного антитіла. Зразки аналізують методом проточної цитометрії на приладі ГЕАС5 з настроюванням каналу на одиночні живі клітини по властивостях прямого й бічного світлорозсіювання. Для того, щоб відрізнити антиген-специфічні моноклональні антитіла від неспецифічного зв'язування при одиничному вимірі, можна використовувати метод котрансфекції. Клітини, що пройшли тимчасову трансфекцию плазмідами, що кодують антиген і флуоресцентний маркер, піддають фарбуванню, як описано вище. Трансфіковані клітини детектують на іншому каналі флуоресценції, ніж пофарбовані антитілом клітини. Оскільки більшість трансфікованих клітин експресують обидва трансгени, те антиген-специфічні моноклональні антитіла бажано зв'язуються із клітинами, які експресують флуоресцентний маркер, тоді як неспецифічні антитіла зв'язуються в співрозмірному співвідношенні з не-трансфікованими клітинами. Поряд з методом проточної цитометрії або замість нього можна використовувати альтернативний метод з використанням флуоресцентної мікроскопії. Клітини піддають фарбуванню точно так само, як
Зо описано вище, і аналізують за допомогою флуоресцентної мікроскопії.
Для того, щоб показати наявність антитіл у сироватці імунізованих мишей або зв'язування моноклональних антитіл з живими клітинами, які експресують антиген, можна використовувати метод імунофлуоресцентної мікроскопії. Наприклад, лінії клітин, які експресують антиген спонтанно або після трансфекції, і негативні контролі, не які експресують антиген, культивують на предметних скельцях з комірками в стандартних умовах росту в середовищі ОМЕМ/Е12 з додаванням 10 95 ембріональної телячої сироватки (ЕС5), 2 мМ І-глутаміну, 100 МО/мл пеніциліну й 100 мкг/мл стрептоміцину. Потім клітини фіксують у метанолі або параформальдегіді або залишають необробленими. Потім клітини піддають реакції з моноклональними антитілами проти антигену протягом 30 хв. при 25 "С. Після відмивання клітини піддають реакції з міченим АІехаб555 вторинним антитілом проти дО миші (Моїесшіаг
Ргорез) за тих же умов. Потім клітини досліджують методом флуоресцентної мікроскопії.
Можна приготувати клітинні екстракти із клітин, які експресують антиген і відповідних негативних контролів, і піддати їх електрофорезу в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (505). Після електрофореза розділені антигени переносять на нітроцелюлозні мембрани, блокують і зондують моноклональними антитілами, що підлягають тестуванню.
Зв'язування з ЇдДоО детектують за допомогою кон'югованого з пероксидазою антитіла проти дО миші й проявляють за допомогою субстрату ЕСІ.
Антитіла також можна тестувати на реактивність із антигеном методом імуногістохімії, добре відомим фахівцям, наприклад, використовуючи фіксовані параформальдегідом або ацетоном криосрези або ув'язнені в парафін і фіксовані параформальдегідом зрізи тканин зі зразків неракової тканини або ракової тканини, отриманих від пацієнтів при рутинних хірургічних процедурах або з мишей, що несуть привиті пухлини із клітинних ліній, які експресують антиген спонтанно або після трансфекції. Для імуноокрашивания їх інкубують з реагуючими з антигеном антитілами, а потім з кон'югованими з пероксидазою хріну козячими антитілами проти миші або козячими антитілами проти кролика (БАКО) відповідно до інструкцій виробника.
Антитіла можна протестувати на їхню здатність опосередковувати фагоцитоз і знищення клітин, які експресують СІ ОМ18.2. Тестування активності моноклональних антитіл іп мійго забезпечує первісний скринінг перед тестуванням на моделях іп мімо.
Антитілозалежна клітинна цитотоксичність (АЮОСС) бо Коротко, поліморфноядерні клітини (РММ5), МК-клітини, моноцити, мононуклеари або інші ефекторні клітини від здорових донорів піддають очищенню за допомогою центрифугування в градієнті щільності Рісоїї! Нурадшне з наступним лізисом сумішей еритроцитів. Промиті ефекторні клітини суспендують у середовищі КРМІ з додаванням 10 95 інактивованої нагріванням ембріональної телячої сироватки або 5 95 інактивованої нагріванням людської сироватки й змішують із міченими Сг клітинами мішені, які експресують СІГОМ18.2, при різних співвідношеннях ефекторних клітин і клітин мішені. Як альтернативи клітини мішені можна позначити посилюючим флуоресценцію лігандом (ВАТОА). Сильно флуоресціюючий хелат європію посилюють лігандом, який вивільняється з мертвих клітин, вимірюють на флуориметрі.
В іншому альтернативному методі застосовується трансфекція клітин мішені люциферазою.
При додаванні І исітег МеїПЙОм/ він може бути окиснений тільки життєздатними клітинами. Потім додають очищений Ідс проти СІГОМ18.2 у різних концентраціях. Як негативний контроль використовують сторонній ДО людини. Аналізи проводяться протягом 4-20 годин при 37 "С залежно від типу використовуваних ефекторних клітин. Зразки досліджують на цитоліз по вимірюванням вивільнення г'Стг або присутності хелата Ешда у супернатанті культури. З іншого боку, заходом життєздатних клітин може служити люмінесценція в результаті окиснення І исігег
Уепом.
Моноклональні антитіла проти СІ ОМ18.2 також можна протестувати в різних комбінаціях, щоб визначити, чи буде підсилюватися цитоліз при декількох моноклональних антитілах.
Комплементзалежна цитотоксичність (СОС)
Моноклональні антитіла проти СІГОМ18.2 можна протестувати на їхню здатність опосередковувати СОС різними відомими методами. Наприклад, можна одержати сироватку для комплементу із крові відомим фахівцям способом. Для визначення СЮОС-активності тАбе можна використовувати різні методи. Наприклад, можна вимірювати вивільнення г'Сг або підвищення проникності мембрани методом аналізу виключення пропідію йодиду (РІ). Коротко, клітини мішені промивають і інкубують при 5х105/мл з різними концентраціями тАБб протягом 10-
ЗО хв. за кімнатної температури або при 37 "С. Потім додають сироватку або плазму до кінцевої концентрації 20 95 (об./об.) і інкубують клітини при 37 "С протягом 20-30 хв. Усі клітини з кожного зразка вносять у розчин РІ у пробірці для ЕАС5. Потім суміш відразу ж піддають аналізу методом проточної цитометрії з використанням ЕАСЗА!гтау.
Зо В альтернативному методі визначається індукція СОС на адгезивних клітинах. В одному втіленні цього методу клітини висівають за 24 год. до аналізу при 3х10"/комірку в плоскодонні мікропланшети для тканинних культур. Наступного дня середовище росту видаляють, а клітини інкубують у трьох повторах з антитілами. Контрольні клітини інкубують у середовищі росту або ростовому середовищі, що містить 0,2 9о сапоніну, для визначення фонового лізису й максимального лізису, відповідно. Після інкубації 20 хв. за кімнатної температури супернатант видаляють, а до клітин додають 20 95 (0об./06.) плазми або сироватки людини в ОМЕМ (нагрітої до 37 "С) та інкубують ще 20 хв. при 37 "С. Усі клітини з кожного зразка вносять у розчин пропідію йодиду (10 мкг/мл). Потім супернатанти заміняють на РВ5, що містить 2,5 мкг/мл етидію броміду, і вимірюють флуоресценцію при 600 нм із порушенням при 520 нм на приладі
Тесап Заїйге. Специфічний лізис у відсотках розраховують у такий спосіб: специфічний лізис (95) - (флуоресценція зразка - фонова флуоресценція)хфлуоресценція при максимальному лізисі - фонова флуоресценція) х100.
Індукція апоптоза й інгібування клітинної проліферації моноклональними антитілами
Для тестування на здатність запускати апоптоз моноклональні антитіла проти СІ ОМ18.2 можна, наприклад, інкубувати із СІ ОМ18.2-позитивними раковими клітинами, наприклад, трансфікованими СІ ОМ18.2 раковими клітинами 5МО-16, САМО або КАТО-ЇШШ, при 37" протягом зразкових 20 годин. Клітини збирають, промивають у буфері для зв'язування з
Аппехіп-М (ВО Віозсіепсе5) і інкубують з Аппехіп М, кон'юЮгованим з РІТС або АРС (ВО
Віозсіепсе5), протягом 15 хв. у темряві. Усі клітини з кожного зразка вносять у розчин РІ (10 мкг/мл в РВ5) у пробірці для ЕАС5З і відразу ж оцінюють методом проточної цитометрії (як описано вище). З іншого боку, можна детектувати загальне інгібування проліферації клітин моноклональними антитілами за допомогою комерційно доступних наборів. Набір ОЕЇ РІА СеїЇ
Ргоїїїегайоп Кії (РеКіп-ЕІтег, кат. Ме АЮБО200) є неізотопний імуноаналіз на основі вимірювання включення 5-бром-2'-дезоксиуридину (Вга)) під час синтезу ДНК у проліферуючих клітинах на мікропланшетах. Включення ВгЯО визначається за допомогою мічених /європієм моноклональних антитіл. Для детектування антитіл клітини фіксують і денатурують ДНК за допомогою розчину Ріх. Незв'язані антитіла вимиваються й додається ОЕЇГГРІА Іпаисег, який витісняє іони європію з міченого антитіла в розчин, де вони утворюють сильнофлуоресціюючі хелати з компонентами ОЕЇРІА Іпдисег. Вимірюють флуоресценцію методом флуорометрії з бо розрізненням часу, яке пропорційне до синтезу ДНК у клітинах за кожною лункою.
Доклінічні дослідження
Моноклональні антитіла, які зв'язуються з СІ ОМ18.2, також можна протестувати на моделі іп мімо (наприклад, на імунодефицитних мишах, що несуть привиті пухлини із клітинних ліній, які експресують СІ ОМ18.2, наприклад, САМО, ЗМО-16 або КАТО-ЇЇЇЇ, або після трансфекції, наприклад, НЕК293), щоб визначити їхня ефективність у контролюванні росту пухлинних клітин, які експресують СІ ОМ18.2.
Дослідження іп мімо після ксенотрансплантації які експресують СГОМ18.2 пухлинних клітин мишам або іншим тваринам з ослабленим імунітетом можуть проводитися з використанням описаних тут антитіл. Антитіла можна вводити позбавленим пухлин мишам з наступним уведенням пухлинних клітин, щоб виміряти ефекти антитіл у запобіганні утворення пухлин або пов'язаних з ними симптомів. Антитіла можна вводити несучим пухлини мишам, щоб визначити терапевтичну ефективність відповідних антитіл у зменшенні росту, утворення метастаз пухлин або пов'язаних з ними симптомів. Застосування антитіл можна поєднувати із застосуванням інших речовин типу цитостатичних препаратів, інгібіторів факторів росту, блокаторів клітинного циклу, інгібіторів ангіогенеза або інших антитіл, щоб визначити синергійну ефективність і потенційну токсичність комбінацій. Для аналізу токсичних побічних ефектів, опосередкованих антитілами, можна інокулювати тваринам антитіла або контрольні реагенти й ретельно досліджувати на наявність симптомів, можливо пов'язаних з терапією антитілами до СІ ОМ18.2.
Можливі побічні ефекти застосування іп мімо антитіл до СІ ОМ18.2 включають, зокрема, токсичність в тканинах, які експресують СІГОМ18.2, включаючи шлунок. Антитіла, що розпізнають СІ ОМ18.2 у людини й інших видів, наприклад, миші, особливо полезни для прогнозування можливих побічних ефектів, опосередкованих застосуванням моноклональних антитіл до СІ ОМ18.2 на людях.
Картування епітопів, які розпізнаються антитілами, може проводитися так, як докладно описано в "Ерйоре Марріпуд Ргоїосоїв" (Меїпоаз іп Моїесшіаг Віоіюду) Бу Сієпп Е. Моїті5, ІЗВМ- 089603-375-9, і в "Ерйоре Марріпод: А Ргасіїса! Арргоасі" іп Ргасіїса! Арргоасп Зегіев, 248 ру
Оїмуп М.А. УУезпмооад, Егапк с. Нау.
Описані тут сполуки й засоби можна вводити у вигляді будь-якої придатної фармацевтичної композиції.
Зо Фармацевтичні композиції звичайно представлені в стандартній дозовій формі й можуть бути отримані відомими рег 5е способами. Фармацевтичні композиції, наприклад, можуть бути у вигляді розчину або суспензії.
Фармацевтичні композиції можуть містити солі, буферні речовини, консерванти, носії, розріджувачі й/або наповнювачі, які всі бажано є фармацевтично прийнятними. Термін "фармацевтично прийнятний" означає відсутність токсичності в матеріалу, який не впливає на дію активного компонента фармацевтичної композиції.
Солі, які не є фармацевтично прийнятними, можуть застосовуватися для одержання фармацевтично прийнятних солей і включені у винахід. Фармацевтично прийнятні солі такого типу включають, без обмеження, солі, отримані з наступних кислот: соляної, бромистоводневої, сірчаної, азотної, фосфорної, малеїнової, оцтової, саліцилової, лимонної, мурашиної, малонової, бурштинової кислоти й ін. Фармацевтично прийнятні солі також можуть бути отримані у вигляді солей лужних металів або солей лужноземельних металів, як то солей натрію, солей калію або солей кальцію.
Придатні буферні речовини для застосування у фармацевтичних композиціях включають оцтову кислоту у вигляді солі, лимонну кислоту у вигляді солі, борну кислоту у вигляді солі й фосфорну кислоту у вигляді солі.
Придатними консервантами для застосування у фармацевтичних композиціях є бензалконію хлорид, парабен, хлорбутанол і тимеросал.
Форми для ін'єкцій можуть містити фармацевтично прийнятні наповнювачі типу лактата для
Рінгера.
Термін "носій" відноситься до таких органічних або неорганічних компонентів, природного або синтетичного походження, з якими сполучається активний компонент для того, щоб полегшити, підсилити або уможливити застосування. Відповідно до винаходу, термін "носій" також включає один або кілька сумісних твердих або рідких наповнювачів, розріджувачів або інкапсулюючих речовин, придатних для введення пацієнтам.
Можливими речовинами-носіями для парентерального введення є, наприклад, стерильна вода, розчин Рінгера, розчин Рінгера з лактатом, стерильний розчин хлориду натрію, поліалкіленгліколі, гідрогенізовані нафталіни й особливо біосумісні полімери лактидів, співполімери лактидів/гліколідів або співполімери поліоксиетилена/поліоксипропілена. бо Термін "наповнювач" у даному винаході служить для позначення всіх речовин, які можуть бути присутніми у фармацевтичній композиції, але не є активними інгредієнтами, таких, наприклад, як носії, зв'язувальні речовини, що змазують речовини, загущувачі, поверхнево- активні речовини, консерванти, емульгатори, буфери, ароматизатори або барвники.
Описані тут засоби й композиції можуть уводитися будь-яким стандартним способом, як то за допомогою парентерального введення, у тому числі за допомогою ін'єкцій або інфузій.
Кращим є парентеральноеє введення, наприклад, внутрішньовенно, внутрішньоартеріально, підшкірно, внутрішньошкірно або внутрішньом'язово.
Композиції, що підходять для парентерального введення, звичайно містять стерильний водний або неводний препарат активної сполуки, який бажано є ізотонічним для крові реципієнта. Прикладами сумісних носіїв і розчинників служать розчин Рінгера й ізотонічний розчин хлориду натрію. Крім того, як середовища для розчинів або суспензій використовують нелетучі масла, звичайно стерильні.
Описані тут засоби й композиції вводяться в ефективних кількостях. Термін "ефективна кількість" означає таку кількість, яка викликає потрібну реакцію або необхідний ефект сама окремо або разом з наступними дозами. У випадку лікування певного захворювання або стану бажана реакція переважно означає уповільнення розвитку захворювання. Це включає уповільнення розвитку захворювання, зокрема, припинення або зворотнє прогресування захворювання. При лікуванні захворювання або стану бажаною реакцією може бути затримка виникнення або запобігання виникнення даного захворювання або стану.
Ефективна кількість описаного тут засобу або композиції буде залежати від типу захворювання, яке потрібно лікувати, ступеню тяжкості захворювання, індивідуальних параметрів пацієнта, таких як вік, фізіологічний стан, розмір і вага, тривалості лікування, типу попутної терапії (якщо вона є), конкретного способу введення й подібних факторів. Відповідно, дози описаних тут засобів, які вводяться, можуть залежати від цих різних параметрів. У випадку, коли реакція пацієнта недостатня при початковій дозі, можна застосовувати більш високі дози (або ефективно більш високі дози, що досягаються іншим, більш локалізованим способом уведення).
Описані тут засоби й композиції можна вводити пацієнтам, наприклад, іп мімо, для лікування або профілактики різних захворювань типу тих, що описані тут. Кращими пацієнтами є хворі
Зо люди з такими захворюваннями, які можуть бути виправлені або полегшені при введенні описаних тут засобів і композицій. Це включає захворювання за участю клітин, що характеризуються зміною профілю експресії СІ ОМ18.2.
Наприклад, в одному втіленні описані тут антитіла можуть застосовуватися для лікування хворих на ракові захворювання, наприклад, ракові захворювання типу описаних тут, які характеризуються наявністю ракових клітин, які експресують СІ ОМ18.2.
Фармацевтичні композиції й способи лікування, описані відповідно до винаходу, також можуть застосовуватися при імунізації або вакцинації для запобігання описаних тут захворювань.
Далі даний винахід розкривається на наступних прикладах, які не повинні сприйматися як такі, що обмежують обсяг винаходу.
Приклади
Приклад 1. Матеріали й методи 1. Антитіла
Таблиця 1
Використані антитіла ян ее нин Іов нентннь| ви | ЯЕКУ. нтитіло Мішень ' Клональність (кат. Мо) зв'язування вання . химер | АОСС, проти клаудину 7утеа яЗ38- СІ ОМ18.1 | С-кінець а.к. . проти клаудину 7утеа яЗ38- СІ ОМ18.1 | С-кінець а.к. :
Гані Е-- ЛИ НЕ СИС СС людини опіїпе людини (проти В-актину |Зідта |актин. | - |моноклон. |миша | МВ зу 2. Імуногістохімія (ІНС)
Зрізи тканин (товщиною 4 мкм) зберігали при 2-8 "С до використання.
Перед процесом депарафінізації зрізи інкубували при 58-60 "С у сушильній шафі протягом 1 години, щоб розплавити парафін і кількісно вилучити воду, тим самим поліпшуючи адгезію тканин до скелець (пропікання").
Депарафінізація
Після розплавлювання й висушування скло піддавали депарафінізації ксилолом у дві стадії (по 5 хв.) і регідратації з використанням спадаючого ряду розчинів спирту (за температури навколишнього середовища 20-27 7): - 5 (11) хв. у ксилоловій ванні; "- ще раз у свіжій ксилоловій ванні; "- вилучити зайву рідину; - 5 (31) хв. в абсолютному етанолі; "- ще раз у свіжій ванні; "- вилучити зайву рідину; - 5 (11) хв. в 96 95 етанолі; "- ще раз у свіжій ванні; "- вилучити зайву рідину; "- 5 (11) хв. в 80 95 етанолі; "- вилучити зайву рідину; " 5 (11) хв. в 70 95 етанолі; "- вилучити зайву рідину; "- 5 хв. у дистильованій або деїіонізованій воді.
Відтворення епітопів і гасіння
Після видалення парафіну проводили видалення епітопів мішені за методикою термоіндукуванного видалення епітопів. Для цього скельця поміщали в посуд для фарбування, заповнений 200 мл буфера для відтворення (10 мМ цитратний буфер, 0,05 95 Тим'ееп-20, р 6), і
Зо інкубували в скороварці (РАЗСАЇГ,, БакКо) при 120 "С протягом 10 хв. Після цього посуд виймали зі скороварки й залишали охолоджуватися в розчині для відтворення епітопів на 10 (51) хв. за кімнатної температури. Скло промивали промивним буфером (1хРВ5).
Після охолодження зрізи поміщали в посуд для фарбування, заповнений 200 мл розчину, що гасить (0,3 95 пероксидази в 1х РВ5), і інкубували 15 хв. за кімнатної температури, а потім промивали 2х5 хв. свіжим промивним буфером.
Блокування й інкубація антитіл
Видаляли надлишок промивного буфера, покривали скельця 200 мкл блокувального буфера (10 95 козячої сироватки в 1хРВ5) і інкубували за кімнатної температури протягом 30 хв.
Блокувальний буфер видаляли й заміняли на 200 мкл розведеного розчину антитіла (розведення в блокувальному буфері). Предметні скельця інкубували з первинним антитілом протягом ночі при 2-8 С:
Таблиця 2
Розведення первинних антитіл для гістології - вихідна й кінцева концентрація антитіл, які використовуються при гістологічному аналізі
Розведення первинних антитіл
Сі ОоМ18
Наступного дня видаляли розчин первинного антитіла й промивали зрізи 3х5 хв. пПромИВНИМ буфером. Після цього надлишок промивного буфера видаляли й додавали 200 мкл готового до використання розчину вторинного антитіла (Роуег Мізіоп козяче-проти-миші з НЕР; Іттипоїодіс,
М). Предметні скельця інкубували 30 хв. за кімнатної температури. Надлишок рідини видаляли, а скельця промивали 3х5 хв. свіжим промивним буфером.
Реакція із субстратом і контрастне фарбування
Після видалення надлишку промивного буфера зрізи покривали біля 50-150 мкл свіжоприготовленого розчину субстрату-хромогену (Месіотей; Месіог їаб5) протягом 2 хв.
Надлишок субстрату видаляли, а предметні скельця інкубували в посудинах з деіонізованою водою протягом 1-5 хв.
Після цього проводили контрастне фарбування зануренням зрізів у судини, що містять по 200 мл гематоксиліну Мауєг, на 2 хв. Після цього зрізи поміщали у водопровідну воду на 5-10 хв. для підсинювання ядер.
Зневоднювання й фіксація препаратів
Після контрастного фарбування зрізи збезводнювали за допомогою зростаючого ряду розчинів спирту: "«- занурення в 70 95-й етанол (на 5-10 с); "- занурення в 80 9Фо-й етанол (на 5-10 с); "- занурення в 96 95-й етанол (на 5-10 с); "- занурення в 96 95-й етанол (на 5-10 с); "- занурення в абсолютний етанол (на 5-10 с); - 5 хв. у ксилолі; "- 5 хв. у ксилолі.
Для фіксації препаратів використовували неводне заливне середовище (Х-ТНА-КІї, Медіїе).
Предметні скельця заливали прямо відразу після останнього заповненого ксилолом посудини й сушили на повітрі за кімнатної температури.
Таблиця З
Мікроматриці тканин для гістологічного аналізу зразків проб проб текенененнняне ни | хв Ген вже й нормальні тканини
РАФ8О02; множинні тканини карциноми підшлункової залози, по 1 пробі на Віосаї 78 1,5 мм 5 мкм зразок тканини підшлункової залози
Коо) 3. Культивування клітин
Усі ракові лінії клітин підшлункової залози й додаткові контрольні лінії клітин, що використовувалися для представлених тут експериментів, культивували в середовищах згідно з вихідними специфікаціями й відповідно до стандартних методик для тканинних культур. Умови наведено в таблиці 4. Для всіх знову отриманих клітинних ліній перевіряли клітини на забруднення мікоплазмою й готували майстер-банк клітин.
Таблиця 4
Умови культивування для ракових ліній клітин підшлункової залози й контрольних клітин
Клітинна | Колби о серодовище інкубація лінія! чашки реловил ми
А5РО-1 Тт150 ВРМІ -- 10 95 ЕС5 56 СО», 37
ВХРСЗ ВРМІ «5 10 мМ НЕРЕ5ч41 мМ (АТСС) Т150 пірувата натріюча4,5 г/л глюкози | 595 СбО2,37С| 8х106 7х106 (всього) ж 10 95 ЕС сої
ЕРМІ 5 10 мМ НЕРЕЗ «5 1 мМ
Й пірувата натрію» 1х бікарбонат
ЕСАСС т15О натрію «4,5 г/л глюкози я 1096 | 595 СО», 372 | 1х107. | В8х106
ЕСЗ5 я 1 95 пен./стрепт. - 0,5 мкг/мл (свіжий) бластицидіну
ЕРМІ 5 10 мМ НЕРЕЗ5 «ж 1мММ
ВХРСЗ- піруват натрію 1х бікарбонат й натрію -- 4,5 г/л глюкози я 10 90 о о 7 в
ГК отаве Т150 ЕС я 1 95 пен./стрепт. я 0,5 БовСО,37С| 1х10 8х10 мкг/мл бластицидіну (свіжий) 40 мкг/мл гігроміцину (свіжий)
САРАМІ Тт150 ВРМІ -- 20 95 ЕС5 56 СО», 37
ВРМІ 4.20 95 ЕО5 4-1 95
Се АМІ:1тч5о пен./стрепт. я 2,5 мкг/мл БеСО»,372с| 1х107 | вх106 бластицидіну (свіжий)
ВРМІ 4.20 95 ЕО5 4-1 95
САРАМІ1- пен./стрепт. ях 2,5 мкг/мл о о 7 в
ІМТ по бластицидіну (свіжий) з 40 збо | 10 8вх1о мкг/мл гігроміцину
Ссно-
Ктр74о0 ОМЕМ:Е12 « 1 95 пен./стрепт. Ж 75о»СО
МАС5/ЕАС | 15 див 10 95 ЕС5 1,5 мг/мл 37 с » 1,6х106 тх105 зЗ(24Н5) генетицину (5-418)
І исіж2А5
СЕРАС-1 | Т150 Івсоме"5 МОМ 10 95 ЕС5 56 СО», 37 рАМаОа ЕРМІ «5 1 95 пен./стрепт. ж 10 95 о о в в 1СБЕ? 15 див Есе Бо СО»,37"С| 4х10 2х10
ОАМС ЕРМІ «- 1 95 пен./стрепт. ж 10 90 15 див ЕС5 4-1 мкг/мл бластицидіну 5950С0О2,37"С| 4х105 2х106 1Сб5г21І МТ м (свіжий)
ОМЕМ:Е12 5 1 95 пен./стрепт. ж о
АВ | бдиво | 1096 РОБ я 1,5мг/Мл древо» вх106 | 5х106 генетицину (05-418
ОМЕМ:Е12 415 мм НЕРЕЗ х
НРАС Тт150 0,002 мг/мл інсуліну челове ка ж | 595 0О»,37"С| бх105 4х106 нг/мл ЕСЕ «з 5 95 ЕС5
ОМЕМ:Е12 415 мм НЕРЕЗ х 0,002 мг/мл інсуліну челове ка х
НРАС-АЇМТ | Т150 10 нг/мл ЕСЕ ях 5 95 ЕС5 1 965 Б9У6СО»,37"С| 6бх106 4х106 пен./стрепт. ях 3,5 мкг/мл бластицидіну (свіжий)
НРАР-ЇЇ Тт150 МЕМ -- 10 95 ЕС5 56 СО», 37 ї МЕМ «з 1х МЕМ МЕАА 5 1 мМ о о в в
НОИР-ТЗ Т150 пірувата натрію «з 10 95 ЕСЗ Бо СО»,37"С| 6х10 3х10 ї МЕМ «з 1х МЕМ МЕАА 5 1 мМ о о в в
НиИР-Т4 Т150 пірувата натрію «з 20 95 ЕСЗ Бо СО»,37"С| 6х10 4х10
Продовження Таблиці 4
КАТО-ІЇ
ЕРМІ «- 1 95 пен./стрепт. 44 ММ | 7,5 95 СО»
ЕСЕ-ВР Т150 в " 8х106 5х106 тег адт» Б вішатах (усього) х 20 6 ГО да | вчи | вчи
Тт150 ВРМІ -- 10 95 ЕС5 56 СО», 37
МіаРаса-2 | Т150 МЕМ -- 10 95 ЕС5 56 СО», 37 . МЕМ 4-10 95 РО5 4-1 95 маса т15О пен./стрепт. я 1,5 мкг/мл БеСО»,372с| 1х107 | вх106 бластицидіну
МмОас-4 зир10сн11 ЕРМІ х 1 95 пен./стрепт. ж 10 9о о о в в вибе10 Т150 Есе БовСО»,37"С| 8х10 5х10
Г исій2
Т150 ОМЕМ -- 10 95 ЕС5 Б ов СО», 37 С
ЕРМІ 5 10 мМ НЕРЕЗ «5 1 мМ пірувата натрію -- 4,5 г/л о о в в
Рапсо3.27 | Т150 глюкози - 0,01мг/мл інсуліну я Бо СО»,37"С| 6х10 4х10 95 ЕС5
ЕРМІ 5 10 мМ НЕРЕЗ «5 1 мМ пірувата натрію «з 4,5г/л глюкози о о в в
Рапсо5.04 | Т150 я 0,01 мг/мл інсуліну я 15 95 Бо СО»,37"С| 6х10 4х10
ЕС5
ЕРМІ 5 10 мМ НЕРЕЗ «5 1 мМ
Субклони пірувата натрію -- 4,5 г/л о о в в
Рапсо5.04 т150 глюкози «т 0,01 мг/мл інсуліну ж 56 СО», З то 510 15 95 ЕС5
Раїш8902 Т150 ОМЕМ»-.- 10 95 ЕС5 5 У СО», 37
Рашв902- ОМЕМ»-.- 10 95 ЕС5 4-1 95
УТ Тт150 пен./стрепт. т 9 мкг/мл 596 СО», 377 5х105 4х106 бластицидіну (свіжий уж 7
Рашвевет | тіБО | Ме чнської сироватки | ве; СО», 37 С
ОМЕМ «я 5 95 кінської сироватки | 5-7,5 95 СО», 7 7
Раїш89885 | Т150 Бе СВ 372с 1,5х10 1х10
ЕРМІ 5 10 мМ НЕРЕЗ «5 1 мМ зи86.86 150 пірувата натрію ч 4,5 г/л 595002,37"С| 5х106 3х105 глюкози - 10 95 ЕС5
ВРМІ 4-10 95 ЕС5 зий-2 Т150 (використовувати нову колбу БУ СО»,37 С | 1,5х107 | 1,2х107 для кожного відсівання)
ВРМІ 4-10 95 РО5 4-1 95 пен./стрепт. ї 5 мкг/мл зЗМий-е-ІМТ | Т150 бластицидіну (свіжий) БУ СбО»,37 С | 1,5х107 | 1,2х107 (використовувати нову колбу для кожного відсівання) 51990 Тт150 І еіроміг'5 1-15 10 95 ЕС5 35х106
УАРС Тт150 ВРМІ -- 10 95 ЕС5 Сюоїа 56 СО», 37 С | 1,5х107
ВРМІ 4-10 95 ЕС5 соїа я 1 95
МАРС-ЇМТ | Т150 пен./стрепт. - 0,5 мкг/мл 595 СО»,37 С | 1,5х107 1х107 бластицидіну (свіжий
ТІМ - лінії клітин, стабільно трансдуковані лентивірусом для експресії СІ ОМ18.2 2 щільність посіву в даній колбі або чашці для культивування клітин протягом 2 або З днів
З адт: клітини рекультивували з підшкірних пухлин. 4. Трансфекція люциферазою клітинних ліній підшлункової залози
Для аналізу АЮОСС клітини ракових ліній підшлункової залози трансфікували РНК люциферази. РНК люциферази (вектор РбзИ-Іис2ти-2прашіг-а1 21-ЄЕсії (ре11-109)) одержували з кепом АКСА і розчиняли в НгО. Цю РНК зберігали порціями по 22 мкл при -80 "С. Для всіх клітинних ліній підшлункової залози визначали оптимальні умови електропорації, що дають найвищі показники трансфекції й життєздатності клітин. При кожному аналізі клітини відокремлювали за допомогою РВ5З/5 мМ ЕДТА, розчиняли 2,5х105 клітин в 250 мкл Х-Мімо і змішували в охолоджуваних льодом кюветах з 10 мкг РНК. Клітини відразу ж піддавали електропорації (Сепериізег Хсеїї, Віогад) і ресуспендували в підігрітому середовищі для аналізу, доводячи їх концентрацію до 5х105 клітин/імл. Перевірені умови електропорації для всіх клітинних ліній були такі:
ЕР: 250 В, 475 мкФ
ЕР2: 200 В, 300 мкФ
ЕРЗ: 150 В, 300 мкФ
ЕРА: 200 В, 400 мкФ
ЕРБ: 250 В, 950 мкФ контроль: 0 В, 0 мкФ.
Життєздатність клітин визначали відразу після електропорації за допомогою САБУ або фарбуванням клітин трипановим синім і визначенням відсотка мертвих клітин у камері
Мешбацмцег. Клітини висівали в чотирьох повторах у білі 96-коміркові планшети (2,5х107 клітин на комірку) і інкубували протягом 24 год. Після цього вимірювали люциферазну активність у лимінометрі (Тесап Іпіпйе200) після додавання суміші люциферина протягом 90 хв.
Трансфекція була успішної, а АОСС вимірної, якщо значення КІ Ш становили »1000. 5. Кількісна реакція ПЛР у реальному часі (кількісна ПЛР)
Для виділення РНК із клітин ракових ліній підшлункової залози клітини висівали в чашки на 10 див і культивували 2-3 дня, до 80 90-ї конфлюентності. РНК виділяли відповідно до інструкцій, прикладених до набору КпеазуФ Міпі Ки (Оіадеп). Одержання кКДНК проводили відповідно до інструкцій виробника, що входять у набір Зирегесгіркю І Рігї бігапа Кії (Іпийгодеп). Зразки РНК і кДНК зберігали при -80 "С.
Кількісний аналіз транскриптів СГОМ18.2 проводили шляхом ампліфікації оліго(аю- примірованної кКкДНК у реакції ПЛР на 40 циклів з використанням ПЛР-праймерів 50545 (5 --
Зо АдадаХастотаасСсТСАССадата-3 і Ж506б0аз5 (5 -ССАПААсСТТАаТСАССАаСАТИаТттаа-3у, що відрізняють ізоформи СІ ОМ18.1 і СІ ОМ18.2. Реакційну суміш готовили з барвником ЗУВК
ОСгеєп (Очапійесі ЗУВК ОСгееп РОК Кії, Оіадеп), який інтеркалює у дволанцюгову ДНК. Реакції й вимірювання проводили на приладі АВІ-РКІЗМ7900 Зедиепсе Оеїгесіоп Зузіет з використанням програмного забезпечення (Арріїєйа Віозувіетв).
Відносні рівні експресії транскриптів С ОМ18 обчислювали за значеннями ЛАСТ щодо гена домашнього господарства НРКТ. 6. Аналіз методом Вестерн-блот
Для виділення білків із клітин ракових ліній підшлункової залози клітини висівали в чашки на 10 див і культивували 2-3 дня, до 80 95-ї конфлюентності. Клітини лізирували додаванням 800 мкл 4хбуфера з 5О5 для зразків (34 95 гліцину, 250 мМ трис рі 6,8, 5 95 В-меркаптоетанола, 8,2 до 505). Для руйнування геномної ДНК зразки білка обробляли ультразвуком при наступних умовах: вихідна потужність: Іеме!1, робочий цикл: 70 95 протягом 20-25 сек. Концентрацію білка вимірювали на спектрофотометрі (поглинання при 280 нм), а зразки зберігали при -80 "С до використання.
Для виявлення експресії СІ ОМ18.2 на вестерн-блотах готовили 12,5 95 поліакриламідний гель для поділу (для 2 невеликих гелів: 4,1 мл суміші акриламід/бісакриламід 29:1, 100 мкл 10 95
ЗО5, 2,5 мл трис рН 8,8, 3,2 мл Н2О, 100 мкл АРБ5, 10 мкл ТЕМЕБО) між двома фіксованими скляними пластинами. Після полімеризації на цей гель нашаровували концентруючий гель (1,5 мл суміші акриламід/бісакриламід 29:1, 100 мкл 10 95 505, 2,5 мл трис рН 6,8, 5,8 мл НО, 100 мкл АРБЗ, 10 мкл ТЕМЕЮО) і між скляними пластинами вставляли в нього гребінку. Після полімеризації на гель наносили по 75 мкг кожного зразка білка, приготовленого додаванням (1:20) 4хбуфера з 505 для зразків (250 мМ трис-Нсї, 34 95 гліцерину, 8,2 95 505, рН 6,8) і 7,5 мкл суміші маркерів розміру (1,5 мкл Мадіс Маг ХР Уезіет 5іапаага разом з 6 мкл Зеарішце
Ріиз2 Ргезіаіпед еїапаага). Гелі розганяли в їх робочому буфері з 505 (25 мМ трис, 0,192 М гліцину, 0,1 956 505) по 30 хв. при 80 У і 60 хв. при 180 В. Напівсухий блотинг гелю на нітроцелюлозну мембрану проводили протягом 90 хв. при 160 мА в 1х буфері для переносу (25
ММ трис, 0,192 мМ гліцину, 20 95 метанолу). Блоти спочатку блокували в 5 95 розчині сухого молока в РВ5, а потім додавали первинні антитіла (0,25 мкг/мл проти клаудину 18 (С-кінець) або 0,1 мкг/мл проти В-актину) в 1 95 розчині сухого молока в РВ5. Блоти інкубували протягом бо ночі при 4 "С, промивали З рази по 10 хв. в їхРВ5/0,05 95 Туееп 20, а потім інкубували 1 годину з міченими вторинними антитілами за кімнатної температури в 1 95 розчині сухого молока в РВ5 (козячі проти дО кролика (ЕС) у розведенні 1:1000). Блоти знову промивали З рази по 10 хв. в 1х РВБЗ/0,05 956 Тмееп 20, а потім проводили детектування додаванням 1-3 мл розчину для детектування (Рісо апа Юига Оеїесіоп бБувзієт (Ріегсе) на 1 хв. і скануванням блотів у детекторній камері ГА5Б-3000 (інкремент: 10 с, інтервальний час: 10 с, чутливість: висока) відповідно до ЗА 056 Спетоїішптпіпе572еп7епімісКіег І АЗЗ3000. 7. Проточна цитометрія (ЕАС5)
Клітини з експоненціально зростаючої культури при конфлюентності 70-85 95 збирали за допомогою РВ5 з 5 мМ ЕДТА або трипсину з ЕДТА. Клітини підраховували, центрифугували 5 хв. (468х9), а осад ресуспендували в буфері ЕАСЗ (2 95 ЕС5, 0,1 95 азиду натрію в РВ5), доводячи концентрацію до 2х10б/мл. По 100 мкл клітин висівали в круглодонні 96-коміркові планшети й знову центрифугували (5 хв., 468х9). Робили серійні розведення ІМАВЗ362 (або ізотипового контролю - ритуксимаб) від 0,1 до 200 мкг/мл (11 ступенів розведення ж контроль без антитіл) в 50 мкл буфера ЕАС5 і додавали до клітин на 30 хв. при 4 "С. Потім у кожну комірку додавали 200 мкл буфера ЕГАСЗ5З і центрифугували планшети (5 хв., 468х9д9). Видаляли супернатанти й повторювали промивання. Вторинні козячі антитіла проти людини (Ес- специфічні, Е(аб)»2, кон'юговані з АРС (Оіапома)) розбавляли 1:100 у буфері ЕАСЗ і додавали по 30 мкл у кожну комірку. Планшети інкубували 30 хв. при 4 "С. Після інкубації планшети знову двічі промивали по 200 мкл буфера РАС5, а осад остаточно ресуспендували в 100 мкл буфера
ЕАС5 для вимірювання на РАС5 Аітау Віоапаїулег (ВО) відповідно до СА 018 ВО ЕГАСЗ5 Аїттау
Віоапаїугег. 8. Лентивірусна трансдукція
Конструювання лентивірусного вектора. Лентивіруси відносяться до РнНкК-вірусів, які стабільно вбудовуються в геномну ДНК людини, як тих клітин, що діляться, так і тих, які не діляться . За основу був прийнятий вектор ріепіїб.4 (Іпмігодеп). Він містить ген бластицидіну для відбору позитивно трансдукованих клітин. У рекомбінантну область вектора клонували
СГОМ18.2, злитий із промотором ЕЕТа, одержуючи ріб4842Е (ЕЕТа-псіацаіп18.2)-Віавіісідіп (Фіг. 1).
Вибір клітинних ліній. Клітинні лінії вибирали за даними літератури або з тих, що
Зо тестувалися раніше іп мімо. Критерії відбору включали однорідний підшкірний ріст у мишей пиде і терапевтичне вікно в 20-100 днів. Були включені три клітинні лінії (ОАМО, МАРС і ВхРСЗ), які вже показали слабку експресію мРНК СІ ОМ18.2, і ще три (МіаРасСа-2, Раїшв8902 і Бий-2), здатні до утворення метастаз за даними літератури. Дві інші клітинні лінії (які ростуть у вигляді однорідних підшкірних пухлин іп мімо) були обрані випадковим чином (НРАС, САРАМТІ).
Визначення умов відбору за бластицидіном. Для всіх клітинних ліній перед трансдукцією визначали, яка концентрація бластицидіну необхідна для відбору клітин після лентивірусної трансдукції. Ракові клітини підшлункової залози висівали в б-коміркові планшети при високій щільності, що дає конфлюентність в 80-90 95 через 24 години. У комірки додавали бластицидін (початково: 10 мг/мл, Іпмігодеп) у зростаючих концентраціях від 0,5 до 12 мкг/мл (5 ступенів розведення ж контроль без бластицидіну). Середовище міняли кожні 3-4 дні, а клітини аналізували під мікроскопом перед видаленням середовища. Відзначали кількість мертвих клітин і стан живих клітин. Клітини культивували протягом 14 днів. Для відбору трансдукованих лентивірусом клітин використовували найменшу концентрацію бластицидіну, яка викликає 100
Фо-й апоптоз клітин через 14 днів. Необхідні концентрації бластицидіну для кожної з отриманих | МТ-ліній клітин наведено в таблиці 4.
Вибір оболонки. Для лентивірусної трансдукції контрольний ОЕР-лентивірусний вектор рі 64842Е-(ЕЕта-СЕР)-Бріазі упаковували в частки з різними оболонками (УЗМ-с, СА М, ВО114,
МокКоїа-С і Кабіе5-5). Залежно від білків, які присутні в оболонці, і складу клітинної мембрани, прикріплення до ракових клітин мішені було білош-менше ефективним. Для всіх ракових ліній клітин підшлункової залози оболонка М5У-З давала найвищу ефективність трансдукції (68,5- 91,2 95) (таблиця 5). Тому вектор, який експресує СІ ОМ18.2 ріб4842Е (ЕЕТа-Ннсіацаіп18.2)-
Віавіїсідіп упаковували в оболонки У5МУ-О. Інфікували клітини-продуценти й виділяли вірус із середовища при високому титрі (3,86х107 часток/мл). Вірусні супернатанти зберігали при -80 "С.
Таблиця 5
Одержання гіперекспресуючих СІ ОМТ18.2 ліній ракових клітин підшлункової залози за допомогою лентивірусної трансдукції
Ефективність
УБУ-а | ВАМ вО114а МоКоїа-С: | Набієб-с | рі 64842Е (ЕРТа-
НС ацаіп18.2)! 1 Ефективність при упакуванні вектора в частки з оболонкою УЗМУ-О при вимірі через 2 дня після трансдукції.
Лентивірусна трансдукція клітин ракових ліній підшлункової залози. Для інфікування клітин намічених ракових ліній підшлункової залози 24-комірковий планшет покривали 200 мкл
ТхгеігопесіїпФ (20 мкг/мл, ТаКага Іпс.), щільно закривали його парафільмом і інкубували 3-16 год. при 4 "С. Планшети промивали 200 мл РВЗ і блокували РВ5З/2 95 ВЗА протягом 30 хв. за кімнатної температури. Планшети знову промивали й наносили по 300 мкл вірусного супернатанта із центрифугуванням 25 хв. при 2500 об./хв. при 15 "С. Супернатант видаляли й повторювали нанесення З рази. Нарешті планшети промивали один раз РВЗ і в кожну комірку висівали намічені клітини з низькою кількістю пересівань. Для всіх ліній ракових клітин підшлункової залози висівали по 5х105-1х107 клітин у кожну з 24 комірок. Планшети інкубували 2 дні при 37 "С. Після цього клітини відокремлювали й визначали ефективність трансдукції методом ЕАСЗ з використанням міченого РІТС антитіла ІМАВЗ62. Клітини піддавали експансії й для кожної клітинної лінії готовили майстер-банк клітин. 9. Аналіз АОСС
Намічені ракові клітини підшлункової залози висівали в колби заздалегідь за два дні, щоб одержати конфлюентні на 80-90 95 культури в день початку АОСС. Ракові клітини підшлункової залози трансфікували РНК люциферази й висівали в білі 96-коміркові планшети при щільності 1х102 клітин на комірку в 50 мкл середовища визначення (культуральне середовище, наведено в таблиці 4, з 20 мМ НЕРЕФЗ). Крім того, висівали клітини МОСС-4 вуБ1Осн11 5,ире10 І исій2 (8000 клітин на комірку) як позитивного контролю при всіх аналізах. Клітини культивували 4-6 год. перед додаванням антитіл і очищених РВМС 5.
РВМС5 одержували зі свіжої лейкоцитної плівки людини, отриманої від здорових донорів.
Три порції крові по 20-25 мл розбавляли РВ5 (1:2) і обережно нашаровували на 4 порції по 15 мл РісоІ-Радне Ріиз5 (СЕ Неаїйсаге) у пробірках Раїсоп на 50 мл. Градієнти центрифугували (25 хв., 700х4). Після центрифугування з інтерфази збирали мононуклеарні клітини периферійної крові (РВМС), промивали в РВЗ5 з 2 мМ ЕДТА, центрифугували (5 хв., 468х9), знову суспендували в РВ5 з 2 ММ ЕДТА й центрифугували (10 хв., 208х9), щоб вилучити тромбоцити.
Опади ресуспендували в 50 мл РВ5 з 2 мМ ЕДТА й проводили підрахунок клітин. РВМС
Зо центрифугували (5 хв., 468х9) і ресуспендували в культуральному середовищі Х-Мімо-15 при концентрації 1,6х107 клітин/імл для додавання до клітин підшлункової залози або 1,28х107 клітин/мл для додавання до клітин МОС3С-4 ву 10сНІ11 5!ЦБб Е10 І исій2.
Антитіла (ІМАВЗ62 і антитіло сп78Н11-1Н6 з ізотипового контролю) піддавали серійному (4,5-разовому) розведенню по 10 разів, одержуючи концентрації від 200 мкг/мл до 0,26 нг/мл. З кожного розведення по 25 мкл додавали в чотирьох повторах до намічених клітин. У комірки з контролем на середовище й на лізис додавали РВ5 без антитіл. Після цього в кожну комірку додавали 25 мкл РВМС (співвідношення Е:Т - 40:1) і інкубували планшети протягом 24 год. 1 год. при 37 "С, 5 95 СО».
Наступного дня в комірки з контролем на лізис додавали по 10 мкл 8 95 розчину Тгйоп
Х100/РВ5, а в усі інші комірки - по 10 мкл РВ5. Нарешті, у кожну комірку додавали 50 мкл свіжоприготовленого розчину люциферина (160 мм НЕРЕ5, 1хРВ5, 3,84 мг/мл О-Люциферина (ВО Віозсіепсев)) і інкубували планшети 80 хв. за кімнатної температури в темряві. Вимірювали люмінесценцію в результаті окиснення І исіїег МеПйомж/ люциферазою життєздатних клітин на зчитувальному обладнанні для мікропланшетів (Іп'їпйе20О0, Тесап, Швейцарія). Ступінь клітинному цитотоксичності розраховували по наступній формулі: специфічне знищення (в) ж 100-(АЇ Опроба- ВІ Отиюоп)/ (ВІЇ Оконтр, на серед- НІ Отпюп) Х100). 10. СОС
Аналіз СОС проводили в такий спосіб.
Намічені клітини (СНО-КІ р7/40 МАСЗ/ЕБАС5З (24Н5) р3151 І исіжЖ2А5) висівали в 50 мкл середовища визначення в білі 96-коміркові планшети для аналізу (10 000 клітин на комірку) і культивували протягом 24 год. ж 20 хв. при 37 "С, 7,5 95 СО» за відносної вологості 95 95 перед додаванням зразків. Кожний 96б-комірковий планшет містив у цілому З різних негативних контролі (інактивована нагріванням сироватка, сироватка з ІМАВЗ62 і без нього й сироватка з антитілом з ізотипового контролю (Кйихітар)) і позитивний контроль зі збірної сироватки здорової людини (Ії 31032011) з 500 нг/мл ІМАВЗ362. Додатковий позитивний контроль одержували по закінченню реакції додаванням 0,8 95 Тгійоп Х100 у другу комірку контролю на середовище, що викликає повний лізис. Один з 96-коміркових планшетів містив функціональний позитивний контроль, отриманий шляхом 7 серійних 3, 16-разових розведеннях ІМАВЗ62 (від 10 000 до 31,8 нг/мл). Цей контроль давав сигмовидну залежність лізису клітин від дози. Усі зразки готовили (по 200 мкл) у той саме час в 96-комірковому планшеті з поглибленими комірками для розведення. З кожної комірки брали проби по З рази піпеткою, щоб одержати по три повтори в планшетах для аналізу. Після внесення по 50 мкл досліджуваних і контрольних проб у планшети для аналізу їх інкубували протягом 805 хв. при 37 "С, 7,5 95 СО» за відносної вологості 95 90.
У кожну комірку додавали по 10 мкл РВ5, за винятком комірок контролю на лізис із тритоном. У кожну комірку контролю на лізис із тритоном додавали по 10 мкл 0,8 95 розчину
Тйоп/РВ5. Готовили розчин субстрату - лоюоциферина (6114 мкл бідист. води, 2496 мкл НЕРЕЗ
Зо (ІМ), 1998 мкл 1хОРВ5Б, 4992 мкл вихідного розчину О-люциферину (12 мг/мл)). У кожну комірку додавали 50 мкл розчину субстрату - лоциферину. Планшети інкубували при 37 "С, 7,5 95 СО» за відносної вологості 95 906 протягом 45 хв. Планшети вимірювали на зчитувальному обладнанні для мікропланшетів.
Комплемент-залежний лізис розраховували за наступною формулою: специфічний лізис (95) - 100-(ВАВІЇ Опроса - ВІШОПІИ ВІ ОНЗСМ- КіІшнйоп) х100)
Модифікації для тестування ракових ліній клітин підшлункової залози: " ракові клітини підшлункової залози трансфікували РНК люциферази за оптимізованих умов; для кожної тестованої клітинної лінії висівали по 1,5х10- клітин на комірку; " оскільки більшість ракових ліній клітин підшлункової залози із труднощами відділяються й утворюють одиночні клітини, то в 1-й день використовували трипсин; " ракові клітини підшлункової залози культивували в планшетах для аналізу при 37 "С, 5 90
Со»; " аналіз СОС із передобробкою клітин хіміотерапевтичними засобами проводили при наступних концентраціях ІМАВЗ62 або як ізотиповий контроль - антитіла СпП78НІ11 1Нб: 640 000, 160 000, 40 000, 10 000, 2 500, 625, 156 і 39 нг/мл. 11. Інгібування проліферації
Для аналізу кривих доза-відповідь для кожного хіміотерапевтичного засобу проводили аналіз проліферації. Аналізували інгібування проліферації після застосування гемцитабіну або оксаліплатину в різних концентраціях для кожної лінії ракових клітин підшлункової залози.
Таблиця 6
Ракові лінії клітин підшлункової залози при аналізі ефективності гемцитабіну або оксаліплатину
Клітини висівали в 96б-коміркові планшети й через 4-6 годин додавали гемцитабін або оксаліплатин у наступних концентраціях: 1000, 500, 250, 100 і 20 нг/мл. Для аналізу проліферації клітини інкубували 4 дня при 37 "С і 5 95 СО». Додавали 50 мкл повного реагенту
ХТТ (50 частин ХТТ «1 частина реагенту, що зшиває) і інкубували при 37 "С. Через З год. і 4 год. проводили вимір поглинання (клітини плюс супернатант) на Тесап Заїйге. Розраховували інгібування проліферації в порівнянні з контролем на середовище, прийнятим за 100 95.
Значення ЕСбзо для гемцитабіну й оксаліплатину розраховували в програмі Ссгарпрай Ргізт. 12. Культивування клітин ракових ліній підшлункової залози з хіміотерапевтичними препаратами для АОСС або СОС
Лінія ОАМО: висівали 4-6х105 клітин і культивували 2 дня в середовищі або в середовищі -- 1 нг/мл гемцитабіну або 1 нг/мл гемцитабіну - 10 нг/мл оксаліплатину. Лінія Раїш89885: висівали 1-1,4х107 клітин і культивували під час відсутності або в присутності 10 нг/мл гемцитабіну або 10 нг/мл гемцитабіну в комбінації з 100 нг/мл оксаліплатину.
У день початку АЮСС додержувалися вищеописаній методики й визначали експресію
СІГОМІ18 на клітинній поверхні методом ЕРАС5, як описано вище. 13. Аналіз клітинного циклу
Клітини засівали в 6б-коміркові планшети й через 5-6 годин додавали хіміотерапевтичні засоби на 24 год, 48 год. або З дня. Вільноплаваючі в середовищі клітини поєднували із клітинами адгезійного шару, який піддавали трипсинизації. Клітини промивали. Аналіз клітинного циклу або починали відразу ж, або спочатку проводили фарбування клітинної поверхні, як описано вище. Клітини ресуспендували в 1 мл РВ5 і вносили в З мл 4 95 РЕА. Після фіксації клітин 15 хв. за кімнатної температури клітини осаджували й промивали. Для обробки
РНКазою клітини ресуспендували в 200 мкл РНКази (10000 Од./мл) плюс 0,05 95 Т"йоп Х-100 і інкубували 30 хв. при 37 "С. Додавали 1 мл РВ5, зразки центрифугували й ресуспендували в 200 мкл РВ5 з 50 мкг/мл Ру. Уже через 30 хвилин зразки були готові для аналізу методом проточної цитометрії. Розподіл фаз клітинного циклу визначали за допомогою програмного забезпечення Ріом/о у вигляді гістограмм вмісту ДНК.
Зо 14. Аналіз апоптоза
Після зазначених процедур вимірювали апоптоз за зв'язуванням анексину М (набір для виявлення І) або по фрагментації ДНК (Аро-Оігесі) згідно з рекомендаціями виготовлювача (Рпагтіпдеп, зап Оівдо, СА). Коротко, вільноплаваючі в супернатанті клітини поєднували із клітинами адгезійного шару, який піддавали трипсинизації, а потім промивали. Порції по 5х105 клітин інкубували з анексином У-АРС і РІ протягом 15 хв. за кімнатної температури в темряві.
Клітини відразу ж аналізували методом проточної цитометрії. Життєздатні клітини не містять ні анексину М-АРС, ні РІ. У ранній стадії апоптоза клітини позитивні на анексин У-АРС і негативні на РІ, тоді як клітини, що втратили життєздатність внаслідок апоптотичної або некротичної смерті клітин, дають позитивне фарбування й на анексин М, і на РІ. Відсоток пофарбованих клітин у кожному квадранті кількісно визначали за допомогою програмного забезпечення ЕіІоу/|о (ВО Віозсіепсев, ЕгапкКіїп І аКев, МУ).
Аналіз апоптоза за фрагментацією ДНК проводили в такий спосіб. Оброблені клітини (прикріплені й плаваючі) фіксували в 70 96 крижаному етанолі протягом ночі. Після промивання інкубували 105 фіксованих клітин з ферментом термінальна дезоксинуклеотиділтрансфераза (тат) ії РІТС-аШТР протягом 90 хв. при 37 "С, щоб позначити розриви ДНК. Клітини промивали,
інкубували із РНКазою А і йодидом пропідію в темряві 30 хв. за кімнатної температури для фарбування тотальної ДНК, а потім аналізували методом проточної цитометрії. Подвійні й злиплі клітини виключалися з аналізу при настроюванні каналів. 15. Дослідження іп мімо
Усі експерименти іп мімо проводилися відповідно до національних правил і етичних принципів для експериментальних досліджень на тваринах. 15.1. Обробка ксенотрансплантатів
Ксенотрансплантати пухлин прищеплювали шляхом підшкірної ін'єкції ракових клітин в 200 мкл РВ5 у бік самкам безтімусних мишей пиде Нза:Рохп1"ч, Несучі пухлини миші одержували 0 мкг, 200 мкг, 400 мкг або 800 мкг антитіл шляхом в/в ін'єкції раз на тиждень або ж чергуючи в/в і в/о уведення 2 рази на тиждень. Хіміотерапевтичні засоби вводили в/о раз на тиждень або 2 рази на тиждень. Розмір пухлин і стан тварин відслідковували по 2 рази на тиждень. По закінченню хіміотерапії введення антитіл тривало доти, поки розмір пухлин не досягав »1400 мм або ж на пухлинах утворювались виразки. Зразки пухлин зберігали замороженими або фіксованими в 4 95 формаліні для наступного аналізу. 15.2. Аналіз утворення метастаз
Різні лінії ракових клітин підшлункової залози спочатку піддавали аналізу на їхню здатність до утворення метастазів після внутрішньовенного введення цих клітин мишам пиде. Для аналізу їх приживання групам з 5-10 мишей уводили 1х105 і/або 2х105 клітин і в різні моменти часу забивали по одній миші, щоб знайти моменти часу приживання й росту метастазів.
Обробку метастазів проводили на 10-12 безтімусних мишах пиде Нза:Рохпі"ч в 1 групі обробки. Їм уводили по 2х105 клітин (Раїш89885 або 5ий2г-І МТ) внутрішньовенно. Усіх мишей забивали в той самий час, як тільки з'являлися перші симптоми утворення метастаз (втрата ваги, слабість, задишка) або ж гинула перша миша.
Препарування тканин. При дослідженні приживання мишей забивали в різні моменти часу або як тільки в них з'являлися чіткі фізіологічні ознаки утворення метастаз (втрата ваги, слабість, задишка). Усі органі в них піддавали макроскопічному аналізу на метастази. Тільки при клітинах Раїш89885 і 5ий-2 у легенів і легенів/печінки проявлялися макроскопічно помітні метастази, відповідно. Ці органі висікали на 4 рівних шматочка, з яких два (легені: верхня права
Зо й нижня ліва частки) зберігали для виділення геномної ДНК. Два інших шматочка фіксували у формаліні й зберігали для ІНС-аналізу (Фіг. 2).
Одержання геномної ДНК і стратегія кількісної ПЛР. Геномну ДНК екстрагували із тканини легенів або печінки. Як контроль геномну ДНК також виділяли з ракових клітин підшлункової залози Раїш89885 людини, а також із мишей негативного контролю, які не одержували ін'єкцій.
Стратегія кількісної ПЛР грунтується на ампліфікації ДНК людини, яка присутня у метастазах. Відносний рівень ДНК людини, виявленої в зразках легенів миші, прямо корелює з кількістю й/або розміром метастазів. Оскільки цей метод може мати зсув тому, що метастази в легенях розподіляються нерівномірно й іноді одна частина уражена більше, ніж інша, то для одного препарату ДНК змішували дві різні ділянки легенів (Фіг. 2).
Реакції кількісної ПЛР проводили З парою праймерів 5861: 5- ааспАТААТТТСАасСтТаАСТАААСАСІ-3 і 5862: 5- поса тАаттАватасСАатТТАТО-3, які специфічно ампліфікують альфа-сателітну ДНК, яка присутня в 17-й хромосомі людини, але не в ДНК миші. Для складання стандартної кривої й як позитивного контролю ДНК Раїш89885 змішували із ДНК миші й готували 5-разові розведення, одержуючи 100 95, 20 95, 4 95, 0,8 95, 0,16 95, 0,032 95 і 0,0064 95 ДНК людини в ДНК миші. Цю криву використовували для обчислення (лінійна регресія) кількості ДНК метастазів людини в тканині легенів миші. Реакції кількісної ПЛР проводили в кінцевому обсязі 50 мкл, що містить 20 мкл (200 нг) ДНК легенів миші, 25 мкл ЗУВЕ
Огееп (Оіадеп), 1,6 мкл значеннєвого праймера (10 мкм) і 1,6 мкл антизначеннєвого праймера й 1,8 мкл Н2О.
Приклад 2. Експресія СІ ОМ18.2 у нормальних і пухлинних тканинах підшлункової залози людини
Для аналізу рівня й профілю експресії СІОМ18.2 у нормальних і пухлинних тканинах підшлункової залози проводили гістологічне фарбування ЕЕРЕ-зрізів за допомогою двох мишачих моноклональних антитіл (Фіг. 3).
Пошукові пілотні експерименти проводили з використанням первісного антитіла 35-22А на мікроматрицях тканин (Тта5). Головним недоліком Ттав є варіабельна якість нанесених тканин і малий розмір плям, тобто нерепрезентативність проб. Поряд з не повністю оптимізованою методикою фарбування, це могло приводити до недооцінки позитивних випадків.
Основні експерименти проводили з антитілом 43-14А. При цьому фарбування проводили на бо зрізах тканин, які (у порівнянні з Тта5) були крупнішими й зазнавали попередньої оцінки на наявність пухлинних клітин.
Передракові вогнища ураження, які походять із протоків підшлункової залози, можна ранжувати відповідно до міжнародної системи інтраеєпітеліальної неоплазії підшлункової залози (рапсгеаз іпігаерйпеїа! пеоріазіа, РапіМ) (підтипи РапіМм-тА, -18, -2, -3).
Вогнища типу РапімМ-1 (Фіг. 4А) плоскі, складаються з високих стовпчастих клітин з базально розташованими ядрами й рясним супрануклеарним муцином. Ядра маленькі й круглої або овальної форми, орієнтовані перпендикулярно до базальної мембрани. Існує гістологічне перекривання між плоскими непухлинними гіперпластичними вогнищами й плоскими пухлинними вогнищами без атипії.
Вогнища підтипу РапіМм-1В мають папілярну, мікропапілярну або базальну псевдобагатошарову архітектуру й в іншому ідентичні до РапіМм-1А (Нгибап еї аЇ., Ат ) Би"
Раїнпої. 2001, 25(5):579-86).
Вогнища типу Рапім-2 (Фіг. 48) плоскі або папілярні, мають характерні ядерні аномалії, включаючи деяку втрату полярності, ущільнення, збільшення розмірів, псевдостратифікацію й гіперхроматизм ядер. Мітози зустрічаються рідко, але якщо вони є, то не люмінальні (не апікальні) і не атипові (Нгибап еї а!., Ат .) Зи!игу Раїйпої. 2001, 25(5):579-86).
Вогнища типу Рапім-3 (Фіг. 4С) звичайно папілярні або микропапілярні, однак зрідка вони можуть бути плоскими. Дійсна решітчатість, відбрунькування невеликих кластерів епітеліальних клітин у просвіт і люмінальний некроз свідчать про діагноз Рапім-3. Вогнища характеризуються втратою полярності ядер, дистрофічними бокаловидними клітинами (бокаловидні клітини з ядрами, орієнтованими в просвіт, і мукоїдною цитоплазмою, орієнтованою до базальної мембрани), мітозами, які іноді можуть бути аномальними, неоднорідністю ядер, що й виділяються (макро)-ядерцями (Нгибап еї аї., Ат У Зигу Раїйпої. 2001, 25(5):579-86).
Експресію СГ ОМ18.2 у передракових тканинах аналізували за допомогою антитіла 43-14А на зразках тканин з різних джерел. СІ ОМ18.2 часто виявлявся в структурах РапіМм підтипів РапімМ-1, -2 і -3, що свідчить про ранню експресію СІ ОМ18.2 у передракових вогнищах (Фіг. 4), яка зберігається й на більш пізніх стадіях. Напроти, експресія не спостерігалася в зразках нормальних тканин підшлункової залози, включаючи протоки підшлункової залози. Таким чином, СІГОМ18.2 є раннім маркером початку злоякісних гістологічних змін у протоках підшлункової залози.
Для оцінки експресії СІ ОМ18.2 при первинному раку підшлункової залози проводилися два дослідження. У пілотному дослідженні кілька тканинних мікроматриць (Ттаб5), що включають у цілому 141 випадок первинного раку підшлункової залози, піддавали фарбуванню специфічним до СГОМА18.2 моноклональним антитілом 35-22А. У цілому якість аналізованих Тма5 була незадовільною. Багато плям були частково загублені під час відтворення епітопів, а неоднорідне контрастне фарбування гематоксиліном свідчить про субоптимальну ЕЕРЕ- обробку тканин.
У цілому х48,9 95 випадків фарбування були позитивними на СІ ОМ18.2, у тому числі 49,2 95 (65/132) аденокарцином проток, 50 95 (1/2) ацинозно-клітинних карцином і З з 7 нейроендокринних карцином (таблиця 7). Мембрани пухлинних клітин фарбувалися без якого- небудь тла на інших типах клітин (Фіг. б). Більше того, спостерігалася кореляція між інтенсивністю експресії СІ ОМ18.2 і вмістом пофарбованих пухлинних клітин у пухлині (таблиця 8, фіг. 5).
Таблиця 7
Пілотне дослідження: розбивка СІ ОМ18.2-позитивних випадків за підтипами раку підшлункової залози. Проводили фарбування тканин за допомогою моноклонального мишачого антитіла 35-22А (0,2 мкг/мл) і оглядали їх на наявність СІ ОМ18.2-позитивних пухлинних клітин підшлункової залози 21 9о (Фо становить 22 (Обі
Ацинозно-клітинна
Нейроендокринна
Таблиця 8
Пілотне дослідження: кореляція між інтенсивністю сигналу СІ ОМ18.2 і кількістю позитивних пухлинних клітин при аналізі первинних пухлин підшлункової залози. Відсоток позитивних серед первинних пухлин корелює з інтенсивністю фарбування. Випадки згруповані на шість фракцій залежно від кількості позитивних пухлинних клітин для наочності о позит. клітин усього 1777777117711111117111111124 77711738 17171176
З |42,8 6 (25,0 10 (14,5 10-39 965 2 (28,6 6 (25,0 5(15,2 13 118,8 40-49 95 07171110 1126 | пп4 50-59 96 0 | 3125 60-69 Зо 77701... 21851 | 5 (18,2 710,2 70-100 95 2 (28,6 7 29,2 24 І63,1 33 (47,8
Таблиця 9
Пілотне дослідження: градація СІ ОМ18.2-позитивних випадків пухлин. Градація пухлинних клітин проводиться за зовнішнім виглядом й ступенем диференціювання клітин. При цьому 1-й ступінь означає добре диференційовані клітини, 2-й ступінь - помірно диференційовані й 3-й ступінь - погано диференційовані клітини
Ступінь Усього Частка позитивних становить Інтенсивність фарбування
У 21 96 (95) становить х2-- (95) 13 86,7 12 180,0 39 (54,9 36 (50,7 9 (25,7 7 |20,0
Друге дослідження проводили за оптимізованою методикою фарбування з високочутливим антитілом 43-14А, використовуючи перевірені на якість зрізи тканин.
Таблиця 10
Основне дослідження: розбивка СІ ОМ18.2-позитивних випадків за підтипами раку підшлункової залози. Проводили фарбування тканин за допомогою моноклонального мишачого антитіла 43-14 А (0,2 мкг/мл) і оглядали їх на наявність СІ ОМ18.2-позитивних пухлинних клітин
Первинний рак Усього Частка позитивних Інтенсивність фарбування підшлункової залози становить 21 95 (95) становить 22 (Обі 40 (65,6 39 (63,9
Аденокарцинома протоків (РОАС) 42 38 (90,5) 37 88,11
Ацинозно-клітинна 4 карцинома
Нейроендокринна 211 21 карцинома
Таблиця А (холангиокарцинома.ї 77771115 17777771798 1111 Ї77771717171711716ссСсСс2шС
Таблиця В
У цілому проаналізували 42 зразка первинного раку протоків підшлункової залози. Близько 90 95 (38 з 42 випадків) з них були позитивними на СІ ОМ18.2 (таблиця 10), причому більшість 5О0
(60 95) проявляло більшу інтенсивність сигналу ж-- (фіг. 7, таблиця 11). При цьому також спостерігалася кореляція між рівнем експресії СІ ОМ18.2 і вмістом позитивних пухлинних клітин.
Більшість аналізованих випадків (62 95) становили пухлини 3-й ступені (таблиця 12).
Таблиця 11
Основне дослідження: кореляція між інтенсивністю сигналу СІ ОМТ18.2 і кількістю позитивних пухлинних клітин при аналізі первинних пухлин підшлункової залози. Відсоток позитивних серед первинних пухлин корелює з інтенсивністю фарбування. Випадки згруповані на шість фракцій залежно від кількості позитивних пухлинних клітин для наочності о позитивних клітин 1 1о-3996.77177717171717110111111111111 32301 | 4п5А | 7750 40499610 2пя 12 | 4пової 50ОБЯЄ 17777770 2пвя | 45 | бо 60699610 2п5я| | 138 | 35 ото 1777717171101117171711117112п5а| | лаб | 1435961 Щ
Таблиця 12
Основне дослідження: градація СІ ОМ18.2-позитивних випадків пухлин. Для більшої частини проаналізованих пухлин була доступна градація, проведена відповідним патоморфологом.
Градація пухлинних клітин проводиться за зовнішнім виглядом й ступенем диференціювання клітин. При цьому 1-й ступінь означає добре диференційовані клітини, 2-й ступінь - помірно диференційовані й 3-й ступінь - погано диференційовані клітини 21 905 (бо становить 22 (Обі
У більшості пацієнтів рак підшлункової залози діагностується на пізній стадії. Пухлини в пацієнтів уже дали метастази в лімфатичні вузли й інші органі, зокрема, у печінку. В основному дослідженні піддавали аналізу 79 ЕЕРЕ-зразків тканин лімфатичних вузлів і печінки з метастазами раку підшлункової залози методом імуногістохімії, використовуючи специфічне до
СІ ОМ18.2 антитіло 43-14А.
В 70,5 95 метастазів у лімфатичних вузлах (31/44 випадків) і 68,6 95 віддалених метастазів у печінці (24/35 випадків) проявлялося чітке фарбування пухлинних клітин на СІ ОМ18.2 (таблиця 13). Профіль фарбування в позитивних пухлинних клітин був мембранним, у деяких випадках з додатковими слабкими цитоплазматичними сигналами (Фіг. 9). Відповідно до результатів аналізу первинних пухлин була виявлена кореляція між рівнем експресії СІ ОМ18.2 і вмістом
СІ ОМ18.2-позитивних пухлинних клітин у зразках метастазів (Фіг. 8).
Не було виявлено ніякої кореляції між градацією аналізованих пухлин і рівнем експресії
СІГОМІ18.2 або вмістом позитивних пухлинних клітин.
Таблиця 13
Кількість СІ ОМ18.2-позитивних випадків метастазів з розбивкою по уражених органах.
Проводили фарбування тканин за допомогою моноклонального мишачого антитіла 43-14А (0,2 мкг/мл) і оглядали їх на наявність СІ ОМ18.2-позитивних пухлинних клітин становить 21 90 (90 становить 22 |Фо
З підшлункової в
Щоб перевірити, чи зберігається експресія СІ ОМ18.2 у метастазах з позитивних первинних пухлин у того ж пацієнта, проводили скринінг парних зразків первинного раку й метастазів у лімфатичних вузлах за допомогою антитіла 43-14А.
Таблиця 14
Експресія СІ ОМ18.2 у парних зразках первинних пухлин підшлункової залози і їх метастазів у лімфатичних вузлах. Парні зразки первинної аденокарциноми й метастазів у лімфатичних вузлах піддавали аналізу на експресію СІ ОМ18.2 у пухлинних клітинах нігоовлговаврава777777771Ї11117171лсвннгя) Її нігоотладорвсяєТ СГ!
В 25 (92,5 95) з 27 проаналізованих випадків і первинна пухлина, і парні до неї лімфатичні вузли були позитивними за СІ ОМ18.2. В одному випадку обидві тканини були негативними, а в одному іншому випадку первинна пухлина була позитивною на СІ ОМ18.2, тоді як метастази були негативними.
В 21 (80,7 95) з 26 позитивних парних зразків інтенсивність сигналу в первинної пухлини й метастатичних пухлинних клітин була однаковою. В 5 випадках інтенсивність сигналу знижувалася з ж---- до ж-. В 11 (44 95) з 25 парних зразків тканин число позитивних пухлинних клітин у метастазах було менше, чим у первинної пухлини (таблиця 14).
Таким чином, експресія СІ 0ОМ18.2 зберігається при переході клітин первинної пухлини в метастазуючу стадію. Загальна інтенсивність і частка позитивних пухлинних клітин у метастазів у лімфатичних вузлах була лише небагато менше, чим у первинної пухлини (Фіг. 10).
У невеликої кількості пацієнтів були доступні зразки тканин, отримані з первинної пухлини, метастазів у лімфатичних вузлах і метастазів у печінці. Ці потрійні пари піддавали фарбуванню для перевірки схоронності експресії СІ ОМ18.2 у віддалених метастазах. Шість таких потрійних пар піддавали аналізу за допомогою антитіла 43-14 А.
Таблиця 15
Експресія СГОМ18.2 у парних зразках первинних пухлин підшлункової залози і їх метастазів.
Парні зразки первинної аденокарциноми, метастазів у печінці й метастазів у лімфатичних вузлах піддавали аналізу на експресію СІ ОМ18.2 у пухлинних клітинах . Метастази в лімф. о, нНіготоЛ4296ХА 77777111 я) 77711111 н/гооагЗ5О8 МІВ /7777777111711лня(409) ЇЇ н/го11/3590-Ш55-МИС 58 017111 яж-(209) 77711111
В З з 6 потрійних пар усі три зразки тканини були співрозмірними щодо їх позитивності за
СІГОМ18.2 (Фіг. 11). У трьох випадках частина пухлинних клітин у первинній пухлині була позитивною на СІ ОМ18.2, тоді як метастатичні вогнища не проявляли фарбування на СІ ОМ18.2 (таблиця 15).
Приклад 3. Експресія мішені в клітинах ракових ліній підшлункової залози людини, що використовувалися для моделей іп міїго і іп мімо і моделей раку підшлункової залози
Джерела клітинних ліній
Головною метою даного доклінічного дослідження був аналіз інгібуючих ефектів застосування ІМАВЗ362 на придатних модельних системах. Для ідентифікації СГОМ18.2- позитивних клітинних ліній, які можуть використовуватися для характеристики ефектів ІМАВЗ362 іп омійго і іп мімо, проводили скринінг комплекту з 26 комерційно доступних ракових ліній підшлункової залози на експресію СІ ОМ18.2 і їх докладну характеристику. Для кожної лінії клітин відразу після прибуття готовили банк клітин для експериментального використання. Вони походили з первинних аденокарцином підшлункової залози (10, з них б - слизуваті аденокарциноми), первинних карцином (4), метастазів аденокарциноми підшлункової залози в печінці (5) або селезінці (1), або були виділені з асцитної рідини (5) (див. таблицю 16). Деякі із цих клітинних ліній (8) зазнали лентивірусної трансдукції для експресії СІ ОМ18.2.
Таблиця 16
Відомості про походження й характеристики клітинних ліній підшлункової залози
Поход:
Поста- 2 . . г, й ження Додаткова Клітинні
Лінія клітин| чаль- : п/к пух- мета- Я й З Посилання те Ж ЕЕ т | ло ВИШ дж пен
А5РС1 АТСС | АБ, так тільки орто- СЕА, Спеп М/Н 6ї
АОСА після топічно: раковий а|., п Міо орто- метастази в | антиген 18:24-34 топічної кишечнику, підшлун- (1982); Тап транс- нирках і кової апа Спи єв а). плантації | очеревині; в | залози, Титог Віої або селезінці: специ- 6:89-98 (1985) ін'єкції в | метастази в | фічний селезінку | печінці антиген в ЗСІО і підшлун-
МО кової залози, муцин
ВхХРОЗ АТСС РТ, так тільки негативна за | СЕА, Тап МН ес аї.,
АОСА після транс- раковий Сапсег Іпмеві. ін'єкції в | мембранним | антиген 4115-23 (1986); селезінку | регулятором | підшлун- | Зйцетіг?и еї аї., в МО, провідності | кової Іпі. У. Опсої. аленев )/ типу залози, 31:741 (2007)
Ми/Ми кистозного специ- або МОБ/ | фіброзу фічний
ЗСІр (СЕТВ) антиген підшлун- кової залози, муцин
ВхХРОЗ ЕСАСС | РТ, так онкогенна муцин, Тап МН ес аї., (ЕСАСС) АРСА на мишах СЕА, Сапсег Іпмеві. пиде, раковий 4:15-23 (1986) утворює антиген помірно або | підшлун- погано кової диферент- залози, ційовані специ- пухлини, фічний співрозмірні | антиген з первинною | підшлун- адено- кової карциномою | залози
САРАМІ 05М2И |ІМ,0- | так після позитивна Еодн еї а!., 9.
АОСА ін'єкції в | за транс- Маї!. Сапсег селезінку | мембранним Іпві. 58: 209- в МОЄ регулятором 214 (1977); провідності Зйетіги еї аї., типу Іпї. У. Опсої. кистозного 31:741 (2007) фіброзу (СЕТВ); стійка до 5- ви
Продовження Таблиці 16
СЕРАСІ1 АТОСС |ІМ,0- | так після експресує СЕА, зЗспоштасне"г
АОСА, орто- продукт гена | карцино- | ВА егїаї., Ргос кис-то3- топічної СЕ (кистоз- | феталь- Маї!. Асаай 5сі. ний транс- ний фіброз), | ний ИБА 87:4012- фіброз плантації | клітини антиген, 4016 (1990); в Ми/Ми мають пов'я- І еє еіаї., найпоши- заний з Опсодепе ренішу аденокар- | 2010, 29:56- форму циномою | 67; ТПнауег єї мутації СЕ; антиген, а!., Маїшйге не діють САТ19-9, 2003 425:851 агоністи епітет- цАМФ, ліальні стимулятори | кератини аденил- циклази або інгібітори фосфо- диестерази; реагує на
Са-- іонофори; чутлива до капеци- табіну й цикло- паміну
ВБИВ БЕН ННЯ Би ПОН ПОН БАНЯ публікацій
НРАНІЇ АТСС | АБ, так слабо позитивна муцин їі | Кіт УМУ еї аї.,
АОСА утворює | по 11. 22-85 муцин 4 Рапстєав5 мета- (інгібує дія 4:353-362 стази МК-клітин (1989); Сита єї після через І 10 і а!., Сііп. Ехр. орто- такьв-В1) Іттипо)ї. 168 топічної (2012) транс- плантації в СІЮ
Продовження Таблиці 16
НРАС АТСС | АОСА | так слабо отримана з | ЕСЕ, Сюомег МУ еї утворює | голівки функціо- а!., Іп міго Сеї! мета- підшлун- нальний ЮОєм Віо! стази кової глюКо- ЗОА:151-161 після залози; корти- (1994) орто- пухлини в коїдний топічної мишей пиде | рецептор, транс- гістологічно | кератин, плантації | подібні маркер в ЗСІОЮ вихідної епітелію пухлини; проток ріст стиму- підшлун- люється кової інсуліном, залози
ІСЕ-І, ЕСЕ ї | (ВПО-РАМ-
ТОБ; ріст 2), пригні- антигени чується (НМЕСІ, дексаме- АШАТ), тазоном і ракові глюкокорти- | антигени коїдами (СЕА, СА- 125,
СА19-9
НОР-ТЗ 0О5М2И | А5, СА з погано невеликі Мізпітига єї дифе- кількості а!., и. у. ренційо- СЕА, Рапстгеайо! ваної АОСА | Таг-р2 13:31-41 1993
НОР-Т4 0О5М2И | А5, СА з добре більші Мізпітига єї дифе- кількості а! ий. у. ренційо- СЕА і Рапстгеайо! ваної САТ19-9, 13:31-41 папіло- такв-р2 (1993); тубулярної ЗсПііпдеп-
АОСА вівереп еї аї.,
Апіізепзе
Рпатгта Стр
КСІ-МОН | О5М72 | РТ- так отримана з | цито- Мопаттаад єї
АРСА | (5СІВ) голівки кератини | аї., Рапстєа5 підшлун- 16: 19-25 кової (1998) залози; помірно дифе- ренційо- вана, трубчаста
Продовження Таблиці 16
КР-2 свв р- Так (міні- помірно Ікеда еї аї.,
АРСА мально) | дифе- Сапсег Вев. ренційо- 81:987-993 вана; при (1990) транс- плантації мишам пиде гістологічно подібні вихідної пухлини; утворює метастази мінімально
КР-4 свв 0О-СА так сильно пептид, Мівпі еї аї., иї. родинний | .). Опсої. 5: 33- парат- 39 (1994) гормону
РІйто
МіаРасСа? | "СВАВ РТ-СА | так немає недифе- Мигпів еї аї., Іпї. ренційо- У. Сапсег 19: вана, 218-235 (1977) чутлива до аспара- гінази
Рапсої АТСС РТ,0- | так так, після Зйетіги еї аї.,
Е-СА (МОб/ ін'єкції в Іпі. У. Опсої.
ЗСІО, селезінку 31: 741 (2007) ма в МОЄ
Рапс02.03 | АТОС | РТ, так отримана з | цито- Уаневє еїаї.,
АОСА | (пидв/ голівки кератини | Сапсег У. зЗсі.
ЗОВ) підшлун- Ат. 4: 194-203 кової (1998) залози; онкогенна мутація К- гав
Рапсо3.27 | АТОС |РТ, так отримана з | цито- Уанеєвє еї а!.,
АОСА | (пидв/ голівки кератини | Сапсег У. зЗсі.
ЗОВ) підшлун- Ат. 4: 194-203 кової (1998) залози; К- газ дикого типу
Рапс04.03| АТОС |РТ, так отримана з | цито- Уанеєвє еї а!.,
АОСА | (пидв/ голівки кератини | Сапсег У. зЗсі.
ЗОВ) підшлун- Ат. 4: 194-203 кової (1998) залози; онкогенна мутація К- гав
Продовження Таблиці 16
Рапсо5.04 | АТОС РТ, тільки отримана з | цито- Уаневє евї аї.,
АРСА | при голівки кератини | Сапсег .). 5сі. транс- підшлун- Ат. 4: 194-203 план- кової (1998); Тнауєг! тації в залози; еї а!., Маїшге матри- онкогенна 2003 425:851 гелі мутація К- габ; п/ш пухлини чутливі до циклопаміну
Раїшв8902 | О5М2 | РТ,О- | так так стадія ІЇ секретує ЕІзаззег евї аї.,
АРСА про- Мікспому5 Агсп теїнази й | В Сеї| Раїйої! катепсин | Іс! Мої Раїної,
В, експре- | 64: 201 (1993) сує ТОЕ- 2
Раїш8988 | АТОС |1ІМ, так тільки в недифе- цито- ЕІзаззег евї аї.,
З АРСА легенях ренційовані | кератини, | Мієспом/5 Агсп тверді а муцина | В Сеї| Раїно! пухлини в немає Іпс! Мої Раїної мишей 61:295-306 1992
Раїш8988Т| АТОС | ІМ, так немає дифе- сильна ЕІвзаззег вії аї.,
АРСА ренційовані | секреція Мікспому5 Агсп пухлини в муцина, В Сеї! Раїної мишей із цито- Іпс! Мої Раїної трубчастими | кератини | 61:295-306 структурами (1992) (це сестрина лінія
Раїшв89885); не утворює метастази у мишей зий-2 НЗАВВІ ЇМ, Т- | так сильно помірно СЕА, Ужматига Т. єї
АРСА дифе- СА19-9 а. ренційо- вана, трубчаста, епітеліо- подібна; сильно утворює метастази у мишей пиде 5и86.86 АТОСС |ІМ,0- | так клітини СЕА ЮписКег ВУ єї
АОРСА | (орто- можуть а!., Іп міго Сеї! топічно) лізуватися Оєм Віо!. 24:
І ак- 1179-1187 клітинами в (1988) присутності
ІІ -2, але не
МК-клі- тинами
Продовження Таблиці 16 5Му1990 АТСС |5М, так стадія Ії, муцин, Кутіагів АР єї
АРСА отримана з | СЕА а!І., Сапсег екзокринної Везв. 43:4393- частини під- 4401 (1983) шлункової залози, епіте- ліальна, пухлини в мишей пиде подібні до вихідної пухлини, морфологія типу протоків
УРАС 0О5М2 | АБ, СА | так так утворює секретує | Матада вї аї., пухлини в запальні ЇІпї У Сапсег, мишей пиде | цитокіни, | 76:141, (1998) з функціо- Ша нальними (ауто- характер- кринно), ристиками І -6,/ 8 вихідної пухлини т АТОС: Атеїісап Туре Сипиге СоїПесіоп; НВВАВ: Неайй 5сівепсе Незвєагсй Незоигсез Вапк;
ОМ: Оешвспе Ззаттішипд моп Мікгоогдапівтеп ипа 2еїїКийигеп 2 РТ: первинна пухлина; А5: асцити; І М: метастази в печінці; ЗМ: метастази в селезінці;
АБСА: аденокарцинома; 0: проток; Т: трубчаста; Е: епітеліоїдна; СА: карцинома підшлункової залози
З СЕА: карциноембріональний антиген; СА: вуглеводний антиген; ІГ: інтерлейкін.
Експресія транскрипта СІ ОМ18.2 у ракових лініях клітин підшлункової залози людини
Для ідентифікації які експресують СІ ОМ18.2 ліній клітин підшлункової залози визначали рівні транскриптів методом кількісної ПЛР у реальному часі (КТ-РСК), використовуючи прямий праймер, що зв'язується з екзоном-1 СІ ОМ18.2, і зворотний праймер, що зв'язується з екзоном-
З СГОМІ18. Як позитивний й негативний контроль, відповідно, включали лінію клітин карциноми шлунка людини КАТО-ПЇ, яка ендогенно експресує СІ ОМ18.2 і негативну за СГ ОМ18.2 лінію ракових клітин молочної залози 5КВК-3. ПЛР у реальному часі показав чітку ендогенну експресію СІ ОМ18.2 у ракових лініях клітин підшлункової залози ОАМО, Рапсо3.27, Рапсо5.04,
Раїш89885 і МАРС, при цьому відносний рівень перевищував 1х105. Цікаво, що клітини
Раїш8в9885 проявляли рівень експресії СІ ОМ18.2 (-1х108), порівняний із клітинами СА шлунка
КАТО-ІЇ (Фіг. 12А). Таким чином, ми виявили сильну експресію СІ ОМ18.2 в 5 з 22 ліній ракових клітин підшлункової залози.
Поряд з ендогенними лініями клітин, аналізували на рівні транскрипта ІМт-лінії клітин, ектопічно які експресують СІ ОМ18.2 (Фіг. 12А). В 6 з 8 І МТ-ліній клітин відносні рівні експресії
СІГОМ18.2 становили більш 1х108. Тільки в клітинах НАРС-Ї МТ і Бий2-І МТ рівень експресії був вище 1х105.
Далі досліджували, чи буде експресія СІ ОМ18.2 стабільною при культивуванні іп міїго.
Клітини Раїш89885, Рапсо5.04 і трансдуковані лентивірусом лінії клітин З!ий2-І МТ, МіаРаСа2-
ЇМ ї Рашв8902-| МТ пересеивали аж до 15 раз і проводили аналіз на траскрипти СІ ОМ18.2 (Фіг. 128-0). При великій кількості пересівань як в ендогенних, так і в трансдукованих клітинах спостерігалася втрата експресії СІ ОМ18.2. Втрата експресії була найвищою в трансдукованих клітинах. Тому для експериментів іп міго використовували ранні пересівання, де це можливо, а в наведених нижче експериментах з приживлення перевіряли експресію СІ ОМ18.2 у привитих пухлинах.
Експресія білка СІ ОМ18.2 у ракових лініях клітин підшлункової залози людини
Виявлення СІ ОМ18.2 у лізатах клітин
На додачу до аналізу транскриптів, аналізували експресію СІ ОМ18.2 на рівні білка методами вестерн-блотинга й ІГ. При вестерн-блотингу досліджували клітинні лізати 26 ліній клітин підшлункової залози методом вестерн-блотинга (МУВ) з використанням специфічного до
СІГОМ18 антитіла проти клаудину 18 (С-кінець)і Знову ж як негативного контролю використовували лізати клітин 5КВК-3, а як позитивний контроль - лізати клітин НЕК293, стабільно трансфікованих СІ ОМ18.2 (НЕК293-р740). При цьому відзначалася сильна експресія білка в клітинах Раїшве9885, САМО і РапсОо5.04, що підтверджує дані по РНК. У лізатах клітин
Рапсо3.27 і ВХРОЗ проявлялися слабкі смуги. Клітини МАРС, які були позитивними на рівні РНК, проявляли слабку смугу меншого розміру на вестерн-блотах. Усі інші клітинні лінії були негативними (Фіг. 13).
Клітинна експресія СІ ОМ18 у ракових клітинах підшлункової залози
Для одержання даних, що підтверджують експресію білка, клітинні лінії карциноми підшлункової залози досліджували методом імунофлуоресценції (ІБ) після фіксації й пермеабілізації клітин, використовуючи для детектування антитіло 35-22А. Аналіз методом ІГ підтвердив колишні дані по РНК і білку, що показують, що більшість ракових ліній клітин підшлункової залози негативні по фарбуванню на СІ ОМ18.2 (Фіг. 14). У деяких клітинних лініях (типу АБРС1, ОАМО, НОР-ТЗ3, Т4-НОИР, Рапсої1) спостерігалися цятки в ядрах, які, швидше за все, є артефактами фарбування. Клітини ОАМО, Рапсо3.27 і ВхХРСЗ, які проявляли низькі рівні
СІГОМ18.2 на рівні РНК і/або білка, були негативними й при ІР-аналізі, який має меншу чутливість. Напроти, у контрольних клітин карциноми шлунка РапсОо5.04, Раїш89885 і КАТО-1ІЇ мембрани й цитоплазма давали сильне позитивне фарбування на СІ ОМ18.2. Інтенсивність фарбування була різної в різних клітин, а в популяції також відзначалися негативні клітини (Фіг. 14) і М). В Ї МТ-ліній клітин сильне фарбування мембран відзначалося в більш ніж 80 95 клітин.
Підтвердження експресії СІ ОМ18.2 у ракових клітинах підшлункової залози
Для підтвердження експресії СГ ОМІ18.2 їі оцінки кількості цієї мішені на клітинній поверхні, ендогенні лінії клітин РапсОо5.04 і Раїш89885, а також І МТ-лінії клітин піддавали фарбуванню за допомогою ІМАВЗ362 по нативної методиці фарбування. Хоча фарбування ІМАВЗ362 контрольних
Зо ракових клітин шлунка Раїш89885, РапсОо5.04 і КАТО-ІП було менш інтенсивним і відсоток позитивних клітин знижувався в порівнянні з фарбуванням клітин 35-22А (Фіг. 16А-Е), аналіз методом ІЕ підтвердив, що СГ ОМ18.2 експресується на поверхні ракових клітин підшлункової залози. В 8 І МТ-ліній ракових клітин підшлункової залози, ектопічно які експресують СІ ОМ18.2, спостерігалося чітке фарбування мембран майже на всіх клітинах (як це видно в 6 ІМТтТ-ліній клітин на Фіг. 160-Ї).
Таким чином, аналіз експресії СІ ОМ18.2 привів до ідентифікації ліній ракових клітин підшлункової залози, які ендогенно експресують Рапсо5.04 і Раїш89885 і всіх 8 трансдукованих лентивірусом клітинних ліній ВХРСЗ3-І МТ, САРАМІ1-І МТ, ОАМО-І МТ, МіаРасСа-2-І МТ, 5ий2-І МТ,
Раїн8902-І МТ і УАРС-ІЇ МТ як придатних для моделювання систем СІ ОМ18.2-позитивних клітин.
Розробка моделей ксенотрансплантації й утворення метастазів рака підшлункової залози
Дослідження із приживання для ідентифікації придатних моделей підшкірних пухлин при раку підшлункової залози
У цілому проводили 37 досліджень із приживлення з різними лініями ракових клітин підшлункової залози для ідентифікації придатних підшкірних моделей ксенотрансплантації для тестування ефективності ІМАВЗ62 іп мімо. Із усіх досліджених клітинних ліній для підшкірних моделей ксенотрансплантації були відібрані лінії клітин ВХРОЗ3-І МТ, САРАМ1-Г МТ, МіаРасСа-2-
ЇМТ, НРАС-ІЇМТ, ОАМа-ІМТ ї МАРС-ЇМТ з ектопічною експресією СІ ОМ18.2, що проявляють високий ступінь приживання й однорідний ріст пухлин. Крім того, для тестування ефективності
ІМАВЗ362 іп мімо були обрані підшкірні моделі ксенотрансплантації з ендогенно які експресують
СІГОМ18.2 лініями клітин Раїш89885 і БАМО. Підшкірне введення клітин РапсОо5.04 не призводило до утворення підшкірних пухлин. бо
Таблиця 17
Зведення із тестування умов приживання для розробки підшкірних моделей ксенотрансплантації рака підшлункової залози
Перевірка п с, й остановка й
Лінія клітин | приживання Дата Результати Примітки лееютн тнрени | дяе | ШЕКАИТУ | пеня | пан
ВхХРОЗ ЕС1 ВхХРОЗ 22.03.2010 | 1х107 клітин приживання 40 )/) не рекомен-
АТОСС АТОСС підшкірно в лівий Фо; тривалість дується бік 5 самкам мишей | життя в
Нзасрр: ММВІ- середньому 56
Еохпі"и днів
ВхХРОЗ ЕС2 ВхХРОЗ 23.03.2010 | 1х107 клітин приживання 100 | придатні
ЕСАСС ЕСАСС підшкірно в лівий о; тривалість умови для бік 5 самкам мишей /| життя в підшкірної
Нзасрр: ММВІ- середньому 63 | ксенотранс-
Еохпіг"ч дня плантації
ВхРОЗ3-ІМТ| ЕСЗ С179 25.03.2011 | 1х107 клітин приживання 90 | придатні підшкірно в лівий до; тривалість умови для бік 10 самкам життя в підшкірної мишей Нзасрр: середньому 64 | ксенотранс-
ММАЇІ-Рохпї по дня плантації
САРАМІ ЕСІ САРАМІ | 26.03.2010 | 1х107 клітин приживання 100 | придатні підшкірно в лівий до; тривалість умови для бік 5 самкам мишей /| життя в підшкірної
Нзасрр: ММВІ- середньому 52 | ксенотранс-
Еохпі"и дня плантації
САРАМІ1- ЕСІ С186 09.08.2011 | аналіз утворення немає не рекомен-
Гм метастаз: 1-2х106 метастазів у дується клітин в РВ5З в/в 10 | легенів і самкам мишей печінки; аналіз
Нзасрр: ММВІ- через 72 дня
Еохпіг"ч після введення ракових клітин
САРАМ2 ЕС1 САРАМАО | 06.04.2010 |) 1х107 клітин приживання 100 | придатні підшкірно в лівий до; тривалість умови для бік 5 самкам мишей /| життя в підшкірної
Нзасрр: ММВІ- середньому 100 | ксенотранс-
Еохпі"и днів плантації рАМО ЕСЗ С2 08.02.2007 | 1х107 клітин приживання 100 | неадекватні підшкірно в лівий до; дуже умови для бік З безтімусним агресивний ріст | моделі мишам пухлин; ксенотранс- тривалість плантації життя в середньому 18 днів рАМО ЕС4А С2 10.10.2007 | 5х105-1х107 клітин приживання 100 | неадекватні підшкірно в лівий до; дуже умови для бік25 безтімусним | агресивний ріст | моделі мишам пухлин; ксенотранс- тривалість плантації життя 16-23 дня
Продовження Таблиці 17 рАМаОа ЕС5 С2 01.06.2010 | 2,5х105 клітин приживання 100 | не рекомен- субклон підшкірно в лівий до; кахексія в дується 1С5Бг2 бік 5 самкам мишей | мишей з через
Нзасрр: ММВІ- пухлинами; ракову
Еохпі"ч тривалість кахексію життя в середньому 17 днів рАМаОа ЕСб С2 10.02.2011 | 5х102-2х105 клітин | 5х107 - 40 95 не рекомен- субклон підшкірно в лівий приживання; дується 1С5Е2 бік 15 самкам 1х105,2х105 - через мишей Нзасрр: 100 Фо ракову
ММАЇІ-Рохпї по приживання; кахексію тривалість життя 26-39 днів рАМаОа ЕС7 С2 02.04.2011 | 2х105 клітин приживання 100 | не рекомен- субклон підшкірно в лівий до; кахексія в дується 1С5Бг2 бік 5 самкам і 5 мишей з через самцям мишей пухлинами; ракову
Нзасрр: ММВІ- тривалість кахексію
Еохпіг"ч: кінетика життя в ваги середньому 29 днів рАМа-ІМТ | ЕС С180 21.03.2011 | 5х106 клітин приживання 100 | не рекомен- підшкірно в лівий до; кахексія в дується бік 10 самкам мишей з через мишей Нзасрр: пухлинами; ракову
ММВАЇІ-Рохп1 пз тривалість кахексію життя в середньому 28 днів
Раїнв902 ЕСІ1 С197 25.07.2011 | 1х107 клітин приживання 100 | придатні підшкірно в лівий Фо; швидкий ріст | умови для бік 10 самкам пухлин; моделі мишей Нзасрр: тривалість ксенотранс-
ММВАЇІ-Рохп1 пз Життя в плантації середньому 21 день
Раїш8902 ЕС2 С197 25.07.2011 | експери- немає не рекомен- ментальний аналіз | метастазів у дується для метастазів: в/в тканинах аналізу уведення 1-2х106 легенів і метастазів клітин 10 самкам печінки; 8 мишей Нзасрр: мишей умерло
ММАЇІ-Рохп1"е після введення ракових клітин
Раїш89885 | ЕСІТ С178 15.03.2011 | 1х107 клітин приживання 100 | не рекомен- підшкірно в лівий бо; дується бік 10 самкам неоднорідний мишей Нзасрр: ріст пухлин;
ММВАЇІ-Рохп1 пз виразка пухлин; тривалість життя в середньому 55 днів
Продовження Таблиці 17
Раїш89885 | ЕС2 С178 05.04.2011 | експери- дуже повільна придатна ментальний аналіз | модель модель для метастазів: в/в метастазів; аналізу уведення 1-2х106 аналіз через 70 | метастазів у клітин 10 самкам днів легенях мишей Нзасрр:
ММВАІ-Рохп1 7»
Раїш89885 | ЕСЗ С178 10.06.2011 | 2,5х105-1,5х107 неоднорідний не рекомен- клітин підшкірно в ріст пухлин; дується лівий бік 15 самкам | повільний ріст мишей Нзасрр: пухлин; виразка
ММАЇІ-Рохпї по пухлин; тривалість життя в середньому 95,5 днів
Раїш89885 | ЕСІТ С202 11.08.2011 | 5х105 клітин неоднорідний не рекомен- (рекульт.) підшкірно в лівий ріст пухлин; дується бік 5 самкам мишей | повільний ріст
Нзасрр: ММВІ- пухлин; виразка
Еохпіг"ч пухлин; тривалість життя в середньому 88 днів
Раїш89885 | ЕСІТ С214 28.11.2011 | 5х106 клітин неоднорідний не рекомен- субклон 17 підшкірно в лівий ріст пухлин; дується бік 5 самкам мишей | повільний ріст
Нзасрр: ММВІ- пухлин; виразка
Еохпіг"ч пухлин; тривалість життя в середньому 54 дня
Раїш89885 | ЕС1Т С215 28.11.2011 | 5х105 клітин приживання 100 | не рекомен- субклон 22 підшкірно в лівий до; неодно- дується бік 5 самкам мишей | рідний ріст через
Нзасрр: ММВІ- пухлин; неоднорідні
Еохпі"ч повільний ріст сть і пухлин; виразка | виразки пухлин; пухлин; тривалість найкращі
Життя в криві росту середньому 47 | із усіх днів субклонів
Раїш89885
Раїш89885 | ЕС1Т С216 28.11.2011 | 5х105 клітин неоднорідний не рекомен- субклон 30 підшкірно в лівий ріст пухлин; дується бік 5 самкам мишей | повільний ріст
Нзасрр: ММВІ- пухлин; виразка
Еохпі"ч пухлин; тривалість життя в середньому 35 днів
Продовження Таблиці 17
Раїн89885 | ЕС1 С217 28.11.2011 | 5х106 клітин неоднорідний не рекомен- субклон 34 підшкірно в лівий ріст пухлин; дується бік 5 самкам мишей | повільний ріст
Нзасрр: ММВІ- пухлин; виразка
Еохпіг"ч пухлин; тривалість життя в середньому 49 днів
Раїш89885 | ЕСІТ С218 28.11.2011 | 5х106 клітин неоднорідний не рекомен- субклон 41 підшкірно в лівий ріст пухлин; дується бік 5 самкам мишей | повільний ріст
Нзасрр: ММВІ- пухлин; виразка
Еохпі"ч пухлин; тривалість життя в середньому 108 днів
Раїш89885 | ЕС1 С237 06.02.2012 | 5х105 клітин повільний ріст прийнятна субклон підшкірно в лівий пухлин; криваві | модель для адйти З бік 5 самкам мишей | кісти, але без підшкірної
Нзасрр: ММВІ- виразки; ксенотранс-
Еохпі"ч тривалість плантації життя в середньому 73 дня
Раїш89885 | ЕСІТ С238 06.02.2012 | 5х105 клітин неоднорідний не рекомен- субклон підшкірно в лівий ріст пухлин; дується айдтя19 бік 5 самкам мишей | повільний ріст
Нзасрр: ММВІ- пухлин; виразка
Еохпіг"ч пухлин; тривалість життя в середньому 42 дня
Раїш89885 | ЕСІТ С239 13.02.2012 | 5х105 клітин неоднорідний не рекомен- субклон підшкірно в лівий ріст пухлин; дується адтяи бік 5 самкам мишей | повільний ріст
Нзасрр: ММВІ- пухлин; виразка
Еохпі"ч пухлин; тривалість життя в середньому 77 днів
Раїш89885 | ЕС1Т С240 13.02.2012 | 5х105 клітин повільний ріст прийнятна субклон підшкірно в лівий пухлин; криваві | модель для адти16 бік 5 самкам мишей | кісти, але без підшкірної
Нзасрр: ММВІ- виразки; ксенотранс-
Еохпі"ч тривалість плантації життя в середньому 66 дня
Продовження Таблиці 17
Раїш89885 | ЕС1Т С241 13.02.2012 | 5х105 клітин повільний ріст прийнятна субклон підшкірно в лівий пухлин; криваві | модель для адтя9 бік 5 самкам мишей | кісти, але без підшкірної
Нзасрр: ММВІ- виразки; ксенотранс-
Еохпі"ч тривалість плантації життя в середньому 59 днів ий ЕСІ С196 25.07.2011 | 1х107 клітин приживання 100 | не рекомен- підшкірно в лівий Фо; швидкий ріст | дується бік 5 самкам мишей | пухлин; виразка
Нзасрр: ММВІ- пухлин;
Еохпі"ч тривалість життя в середньому 35 днів вий ЕС2 С196 25.07.2011 | експери- метастази в придатна ментальний аналіз | легенів, печінки | модель для метастазів: в/в й м'язах аналізу уведення 2х105 метастазів у клітин 10 самкам легенях мишей Нзасрр:
ММАЇІ-Рохпї по
Рапс02.03 | ЕС1 Рапс 12.05.2010 | 1х107 клітин приживання 100 | придатні 02.03 підшкірно в лівий до; тривалість умови для бік 5 самкам мишей /| життя в моделі
Нзасрр: ММВІ- середньому 54 | підшкірної
Еохпі"ч дня ксенотранс- плантації
Рапс0о3.27 | ЕС2 Рапс 12.05.2010 | 1х107 клітин приживання 100 | придатні 03.27 підшкірно в лівий до; тривалість умови для бік 5 самкам мишей /| життя в моделі
Нзасрр: ММВІ- середньому 91 підшкірної
Еохпі"ч день ксено- трансп- лантації
Рапс04.03 | ЕСЗ Рапс 17.06.2010 | 1х107 клітин приживання 100 | придатні 04.03 підшкірно в лівий до; тривалість умови для бік 5 самкам мишей /| життя в моделі
Нзасрр: ММВІ- середньому 39 | підшкірної
Еохпі"ч днів ксенотранс- плантації
Рапс0о5.04 | ЕСА Рапс 18.06.2010 | 1х107 клітин не відзначене не рекомен- 05.04 підшкірно в лівий росту дується бік 5 самкам мишей | підшкірних
Нзасрр: ММВІ- пухлин
Еохпіг"ч
Рапс0о5.04 | ЕС5 Рапс 09.05.2011 | 2х107 клітин в ЕРМІ | не відзначене не рекомен- 05.04 підшкірно в лівий росту дується бік 5 самкам мишей | підшкірних
Нзасрр: ММВІ- пухлин
Еохпі"и
Продовження Таблиці 17
МіаРаСа?2 | ЕС1Т С195 25.07.2011 | 1х107 клітин приживання 100 | придатні підшкірно в лівий до; тривалість умови для бік 5 самкам мишей /| життя в моделі
Нзасрр: ММВІ- середньому 42 | підшкірної
Еохпіг"ч дня ксенотранс- плантації
МіаРаСа2- | ЕСТ 0219 18.11.2011 | 5х105 або 1х107 приживання 100 | придатні
ІМТ клітин підшкірно в до; тривалість умови для лівий бік 10 самкам | життя в моделі мишей Нзасрр: середньому 40 | підшкірної
ММАЇІ-Рохпї по днів ксенотранс- плантації
МіаРаСа?2 | ЕС2 С195 25.07.2011 | експери- метастази в придатна ментальний аналіз | легенів, печінки | модель для метастазів: в/в й лімфатичних | аналізу уведення 2х106 вузлах метастазів у клітин 10 самкам легенях мишей Нзасрр:
ММАЇІ-Рохп1 "9
НРАС ЕС1 НРАС 19.04.2010 | 1,5х107 клітин приживання 100 | придатні підшкірно в лівий до; тривалість умови для бік 5 самкам мишей /| життя в моделі
Нзасрр: ММВІ- середньому 29 | підшкірної
Еохпі"ч днів ксенотранс- плантації
УАРС ЕС1І ХАРС 10.05.2010 | 1х107 клітин приживання 100 | обмежена підшкірно в лівий до; дуже модель бік 5 самкам мишей | агресивний ріст | ксенотранс-
Нзасрр: ММВІ- пухлин; плантації
Еохпіг"ч однорідний ріст пухлин; виразка пухлин; тривалість життя в середньому 28 днів
МАРС-ЇМТ | ЕС2 МАРС 10.05.2010 | 5х105-7,5х105 клітин | приживання 100 | обмежена підшкірно в лівий до; дуже модель бік 20 самкам агресивний ріст | ксенотранс- мишей Нзасрр: пухлин; плантації
ММАЇІ-Рохпї по однорідний ріст пухлин; виразка пухлин; тривалість життя в середньому 27 днів
Дослідження із приживання для ідентифікації придатних моделей утворення метастазів
Для вивчення ефектів ІМАВЗ362 на утворення метастаз були поставлені моделі утворення метастаз рака на мишах пиае. Клітини ракових ліній підшлункової залози піддавали аналізу на їхню здатність до утворення метастаз після в/в уведення. Клітини САРАМ1-І МТ, МіаРасСа-2,
Раїш89885, Раїшв902 і 5ий-2 уводили у хвостову вену мишей пиаеє, як описано в Мопапу апа Хи, 2010. Для визначення моменту часу приживання й швидкості росту метастазів мишей забивали в різні моменти часу (таблиця 18).
Таблиця 18
Аналіз приживання метастазів з ракових ліній клітин підшлункової залози
Лінія клітин й мише . ще гинули миші . клітин - аналіз мишей (кіл-ть) : виділяли стази
Й (кіл-ть) оРашВЯ02 їх 5 | (Мк - 10010940) внз немає оРашВЯ02 2106 | 5 | (ГР - 1 10010150) внз немає " 34, 51, 59, 66, 70, 86, легені й ремееве тм) 7 0000 лечща улееняє 34, А1, 51, 59,66, 70, легені й оремвеве |з! в вт 007000 печін |у легенях ! легені й | у легенях печінка т3(2 печінка
Аналіз приживання клітин Раїшв8902 і САРАМІ1-І| МТ був неможливий, тому що більшість мишей гинула майже відразу. У легенях і печінці 5 мишей, що вижили, які одержували клітини
САРАМ-ЇМТ, через 72 дні не було виявлено макроскопічно видимих метастазів. Напроти, уведення клітин Зий-2 і МіаРаСа-2 добре переносилося. Тканини легень цих мишей піддавали аналізу методом ІНС у різні моменти часу після ін'єкції. У мишей, що одержували клітини
МіаРаса-2, не відзначалося метастазів у легенях і через 73 дня, тому ця лінія клітин не була обрана як модель для обробки ІМАВЗ362. Ракові клітини Зий-2 давали метастази в легені мишей. Відзначалися множинні вогнища по всій тканині. Саме тому трансдукована лентивірусним СІ ОМТ18.2 лінія клітин Зий-2-Ї МТ була обраний як модельної системи для аналізу ефектів застосування ІМАВЗ62 на утворення метастаз.
Поряд з Бий-2, також аналізували здатність до утворення метастазів у клітин Раїй89885, ендогенно які експресують СІ ОМ18.2. Перевірку на приживання проводили при внутрішньовенному уведенні мишам 2 різних кількостей клітин (1х106, 2х106). У різні моменти часу виділяли легені й печінку, як зазначено в таблиці 18. Спочатку різні отримані тканини піддавали аналізу методом к-ПЛР. Легені й печінку, отримані до 70-го дня, аналізували шляхом ампліфікації а-сателітної ДНК із хромосоми 17 людини. Результати на легенях показали чітке зростання вмісту ДНК людини в легенях миші за часом, який не залежав від кількості введених клітин. При внутрішньовенному уведенні 1х105 або 2х105 клітин через 70 днів відзначалося 5,8
Фо і 3,7 96 ДНК людини, відповідно (Фіг. 19). У печінці ДНК людини майже не амліфікувалась.
Через 70 днів її вміст злегка підвищувався, але усе ще було менше 0,005 95.
Для перевірки експресії СГОМ18.2 у метастазах Раїш89885 піддавали тканини легенів імуногістохімічному фарбуванню за допомогою антитіл проти МНС класу І людини для виявлення клітин людини в тканинах миші, а також антитіла проти клаудину 18 (Міа).
Фарбування на МНО-Ї показало, що в мишей відзначаються чіткі вогнища метастазів на зрізах тканини легенів, але не на зрізах печінки (Фіг. 20). Більше того, мембрани клітин у цих вогнищах фарбувалися антитілом проти клаудину 18 (Мід), що чітко свідчить про експресію білка мішені
ІМАВЗ62 у цих клітинах. Тому ця модель ендогенних метастазів була обрана для дослідження застосування ІМАВЗ62 поряд з моделлю Зий2-І МТ.
Зо Приклад 4. Опосередковані ІМАВЗ62 ефекти знищення клітин
Перехресне зшивання ІМАВЗ62 викликає ефективний апоптоз
Зв'язування антитіл із клітинною поверхнею мішені може запускати аномальну передачу сигналів, що приводить безпосередньо до загибелі клітин. Такі сигнальні події можуть залежати від епітопа мішені, валентності зв'язування й того, чи асоційоване зв'язування з перехресним зшиванням мішені. Наприклад, індукція апоптоза ритуксимабом у декількох СЮО 20-позитивних клітинних ліній лімфоми спостерігається тільки за умови перехресного зшивання. Таке зшивання може відбуватися іп мімо при високоафінній взаємодії позитивних за Ес-рецепторами імунних клітин з покритими антитілом пухлинними клітинами.
Перехресне зшивання ІМАВЗ362 викликає апоптоз прямо в межах 18-42 годин у ракових клітинах шлунка людини МОСС-4 і КАТО-ПЇ при визначенні методом ТОМЕГ. Ступінь апоптоза корелює з дозою антитіла й рівнем експресії мішені в ракових клітинах. Обробка гемцитабіном приводить до зупинки клітинного циклу ракових клітин з наступним апоптозом клітин. Апоптоз оброблених гемцитабіном пухлинних клітин підшлункової залози представлений на Фіг. 21.
Опосередкована ІМАВЗ62 активність АОСС проти ракових клітин підшлункової залози
ІМАВЗ362 дуже дієво викликає рекрутинг і активацію позитивних по Есу-Рецептору імунних ефекторних клітин, таких як клітини нормальних кілерів. Зв'язування ІМАВЗ62 із клітинами мішені викликає антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АЮСС) під дією гранзимів і перфоринів, секретуємих ефекторними клітинами при зв'язуванні їх Есу-Рецепторів з антитілом.
Раніше був показаний вплив цього механізму дії на позитивні за люциферазою й СІ ОМ18.2 клітини СА шлунка (типу МООС-4 і КАТО-ІЇ) при інкубації з ІМАВ362 протягом 24 годин у присутності мононуклеарів периферійної крові людини (РВМС) (співвідношення ефектор:мішень т 40:1). Застосування до 200 мкг/мл ІМАВЗ362 давало максимальний ступінь лізису в 80-100 95.
Тут ми визначали АОСс-активність ІМАВЗ62 проти ракових ліній клітин підшлункової залози.
ІМАВЗ362 у зростаючих концентраціях інкубували з різними лініями клітин при співвідношенні Е:Т - 40:11. У кожному експерименті додавали РВМСО5 від різних донорів. Результати для всіх клітинних ліній наведено в таблиці 19. З 5 спочатку виявлених СІ ОМ18.2-позитивних ліній клітин підшлункової залози тільки Раїш89885, Рапсо5.04 і ЮАМО ефективно гинули при додаванні
ІМАВЗ362 і РВМСз5 (Фіг. 22А). Хоча поверхнева експресія СІ ОМ18.2 в Рапсо5.04 і САМО не виявлялася методом ЕАС5, рівень експресії був досить значним, щоб викликати залежне від ефекторних клітин знищення (ЕСво: Раїш89885: 0,01-1,4 мкг/мл, ПОАМО/Рапо5.04: 0,1-38 мкг/мл).
Із цих даних можна зробити висновок, що ефективно лізуються тільки клітини, які експресують
РНК на відносному рівні »5,5х105.
Аналіз АЮСС також проводили з ІМТ-лініями ракових клітин підшлункової залози й відповідними вихідними лініями клітин (Фіг. 228-Е). АОСС строго залежить від специфічного зв'язування ІМАВЗ62 з мішенню, тому що тільки СІ ОМ18.2-позитивні клітини мішені знищуються
ІМАВЗ62 і РВМСО5. Напівмаксимальне знищення й максимальний ступінь знищення ракових клітин підшлункової залози людини під дією ІМАВЗ62 варіювалася між донорами РВМС, а також залежала від кількості пересівань клітин, що впливає на рівень експресії СІ ОМ18.2.
Концентрації ІМАВЗ62, що викликають напівмаксимальне знищення клітин мішені, а також
Зо максимальний ступінь знищення представлені на Фіг. 220-Н.І МТ-лінії клітин СА підшлункової залози гинули при додаванні невеликих кількостей антитіла у великому ступені, тоді як для рАМОС і Рапсо5 потрібні найвищі концентрації антитіла для досягнення ступеня знищення -«-50 95 від максимальної. На фігурі також представлені результати для РапсОо5.04, отримані із субклоном 1503 (СІ ОМ18.2-позитивний клон, відібраний методом серійних розведень
Рапсо5.04 і ЕАС5), який проявляв порівнянну з І МТ-лініями клітин ступінь викликаного АОСС лізису. На жаль, експресія СІ ОМ18.2 у цього клону швидко затихала іп міго після пересівання клітин, тому цей клон не використовувався для подальших експериментів.
Опосередкована ІМАВЗ62 активність СОС проти ракових клітин підшлункової залози
Ракові клітини підшлункової залози, які знищувалися ІМАВЗ62 при аналізі АОСС, піддавали аналізу на їхню чутливість до комплементзалежною літичної активності ІМАВЗб2. Крім того, тестували на СОС і | МтТ-лінії клітин і їх вихідні штами.
Активність СОС активується комплексами антигену з антитілами типу Ідт або Ід (класичний шлях) або поверхнями мікроорганізмів (альтернативний шлях). У класичному шляху комплемент ІЗ5 перетворюється в С5р. При послідовнім зв'язуванні С5Б, С7, С8 їі Сс9 вивільняються анафілотоксини СЗа, С4а і С5Б і утворюється мембраноатакующий комплекс (МАС). Цей шлях пригнічується як розчинними, так і мембранозв'язаними білками (наприклад,
СА, БАР, МСР, СО59, 055, 046), що захищають свої тканини.
Як позитивних контролів при кожному аналізі використовували клітини СНО-К1, стабільно трансфіковані СІ ОМ18.2 (р740) і люциферазою (Фіг. 23А). Лінії клітин ОАМО, ВХРОСЗ, МАРС,
Раїшв9885, Рапсо5.04, САРАМІ і бий-2 не зазнали лізису при додаванні ІМАВЗ362 і збірні сироватки здорової людини (Фіг. 23В). Хоча клітини ОАМО, Раїш89885 і РапсОо5.04 є СІ ОМ18.2- позитивними, як було показано у всіх попередніх експериментах, однак вони не лізуються комплементзалежним чином. Швидше за все, це пов'язане з тим, що ракові клітини гіперекспресують один або кілька білків, які інгібують мембранозв'язаний комплемент (наприклад, СО46, СО55 і СО59) (Сеїз5 єї аІ., Си Сапсег Огид Тагдеї5 2010, 10:922-931). Однак усе ще залишається неясним, чи впливає експресія цих інгібіторних білків у пухлинних клітинах на клінічний результат терапії антитілами (О7ієїс7епіа єї аІ., Мей. Опсої. 2010, 27:743-6; Мепд апа І ему вії аї., Віоса 2001, 98:1352-7).
Поряд з ендогенними лініями клітин, тестували на СОС і всі І МТ-лінії клітин. Як видно з Фіг. 60 23, додавання ІМАВ362 і сироватки до клітин МіаРаСа-2-ІМТ, 5ий2-ІЇМТ і САРАМ1-ІЇ МТ викликало дозозалежний лізис зі значеннями ЕсСозо від 0,3 до 2,6 мкг/мл.
Зведення по експресії СІ ОМ18.2 у клітинах ракових ліній підшлункової залози людини
Таблиця 19
Отримані іп міїго і іп мімо характеристики ракових ліній клітин підшлункової залози : По-
Рівень й .
МРНК | білка | еко | лока для дослідів
Лінія СОМ | сом пресія | лізація Макс. | єс Макс. | ЕСво | з застосу- клітин 18.2 18 СОМ СОМ лізис / лізис | (нг/ а (ВТ- (во) (нг/мл) (об) мл) ванням
ПЛР) (Мув) 18.2. | 18.2 (ІР)З ІМАВЗб2
ЕАС5Б): цито-
А5РСІ | 2,0х10! Ома | плазма |на, | на. немає плями в ядрі
Ессе Не НИ С СН У С С клітини прижи- ваються, можна
ВхРОЗ с/ | ЦИТО- Н.3.- використо- (ЕСАСС) 210, х 0,90 зе плазма )/) 60 Н.з. вувати після
ЇМТ для застосу- вання іп мімо клітини прижи- ваються, їх цито. можна
ВхХРОЗ- в1х107 44 плазма | 90,6 | 47,7 ї нЗ нЗ використо-
МТ ' т мем- 64 19,1 т Що брана вувати для застосу- вання іп мімо клітини прижи- ваються, можна
САРАМІ | 8,0х102 0,54 95 | негатив? | н.3... | н.з. н.3. | наз.) Використо- вувати після
ЇМТ для застосу- вання іп мімо клітини прижи- ваються, їх
САРАМІ плазма | 92,6 65,0 х можна пут 5105) ян мем. БЕ 8384 |79М 0) 9701 | використо- вувати для брана застосу- вання іп мімо
СЕРАСІ | Т,5х107| - |0,5595)| негатив. | 0-1,5 | н... |нв. |н.в. |немає
Продовження Таблиці 19 клітини прижи- ваються, їх цито 4976,5 викори ; використо- рАМО 4,9х1095 ня 1,19 95 плазма Заря в Н.З. Н.3. вувати для ядрі В ' 41254 застосу- вання іп мімо (недолік: кахексія) клітини прижи- цито- ваються, їх
ФАМО- | вх108|Ї з плазмаж|85ож 523Ж що використо-
Гм ' мем- 11,7. 27,7 т т брана вувати для застосу- вання іп мімо не вдається відібрати
НРАБИ | 4,2х103 10,00 95| негатив. | н.3....) н.3. окремі клони (недолік: кахексія) клітини прижи- ваються, можна й о Н.3.- використо-
НРАС 3,6х10 0,81 96 0-22,2 495,6 вувати після
ЇМТ для застосу- вання іп мімо клітини прижи- цито- ваються, їх
НРАС- | 0х105Ї з плазма |76б2х 116б,8жх,, що використо-
Гм ' нмем- 19,4 105,4 т т брана вувати для застосу- вання іп мімо пктотик, совки Шо орви или, совюх дит те очок ре ядрі
ДЕ си Не ЕН СУ С
КР2 | 1 1 - |0,5495)| негатив. | н.в. | нв. | нв. | нв. немає
ОКР-4 | вв. | - |нв. |нв. |нв. |нв. |нв. |н.в. |немає
Продовження Таблиці 19 клітини прижи- ваються, можна
МіаРаСа? 0,22 96 | негатив. | 47. | на. н.з. н.з. | Використо- 8,1 вувати після
ЇМТ для застосу- вання іп мімо клітини прижи- ваються, їх
Міагаса?- плазма | 781 234 можна ше 1,7х108| з мем. 60 128. 784 340 | використо- вувати для брана застосу- вання іп мімо
ВЕНИ БЕЗ НАСЕ ВНЗ СНИ СУМИ СИ ЄВ о Рапс02.03| н.в.. | - | нв. |негатив2| н.3. |нз. |нв. |н.в. немає клітини прижи- ваються, відзна-
Рапсо3.27|2,7х105| | 7,30 96 | ЧИТО- н.з. | наз. чається плазма деяке фарбування на СОМ 18.2
Сена я еВ С С с не вдається відібрати окремі цито- 57288 клони,
Рапсоб.04|12х105| з |зБозь| плазма |621Ж| ж |на наз, | літини не мем- 6,8 прижи- 44351 брана ваються (за стан- дартною методикою) клітини прижи- ваються, можна
Раїшв8902 |1,7х103 0,39 95 | негатив. о н.з. н.3. | н.з. | Використо- ; вувати після
ЇМТ для застосу- вання іп мімо
Продовження Таблиці 19 клітини прижи- ваються цито- п/ш, можна використо-
Гагввох 1,6х108| мем в бо 76,7. | 291,0 | вувати для брана щеплення метастазів, миші гинуть після в/в уведення клітини прижи- ваються, утворюють неоднорідні цито- пухлини/ кісти, можна раю 3,9х105| з во мем о ве Н.З3. Н.З3. використо- брана вувати для застосу- вання іп мімо (для підшкірних пухлин і метастазів) таяжтлзк сооох НЕ Де тен клітини прижи- ваються, можна
Бий? 1,0х107 0,41 95 | негатив. | н.з. н.3. н.3. н.з. | Використо- вувати після
МІ для дослід- ження метастазів клітини прижи- цито- ваються п/ш, можна вийо-і Мт |2,0х108). 44 плазма и пи на. | на. використо- брана ' ' вувати для дослід- ження метастазів о Н.3.- Н.3.- жна запо ин ння 5 ре (ееорню оБУМУТ990 Ц|ї,вх10'| - |2,53965| негатив. | н.3. |нз. |нв. |н.в. |немає
Продовження Таблиці 19 клітини прижи- ваються, можна
УРАС 1,5х105| (4) |0,2395 негатив. | н.3.. н.з. н.3. н.з. | Використо- вувати після
ЇМТ для застосу- вання іп мімо клітини прижи- ваються, їх цито: можна
УАРС- 2,5х108| з плазма || 295,3 н.з використо-
МТ ' нмем- 6,3 15,7 т Що брана вувати для застосу- вання іп мімо 1 з використанням антитіла проти клаудину 18 (С-кін.) (7утеа) 2 при фарбуванні 2х105 клітин на 100 мкл за допомогою 50 мкг/мл ІМАВЗб2 з з використанням антитіла 35-22А на фіксовані й пермеабілізованих клітинах я результати отримані як мінімум з 2 донорами; н.3. - не знайдено; н.в. - не визначали.
Приклад 5. Ефективність ІМАВ362 на моделях ксенотрансплантації рака підшлункової залози
Для дослідження ефективності ІМАВЗ362 іп мімо було обрано 10 з 41 перевіреної моделі ксенотрансплантації рака підшлункової залози. На моделях ксенотрансплантатів підшлункової залози з високою експресією СІ 0ОМ18.2, обробка ІМАВ362 показала високий протипухлинний ефект. Його досліджували шляхом обробки мишей, що несуть у лівому боці підшкірні ксенотрансплантати ВХхРОС3-ІМТ або МіаРаСа-2-ЇМТ. Обробку починали через 3 дня після щеплення пухлин уведенням 200 мкг ІМАВЗ62 по 2 рази на тиждень. Миші, що одержували
ІМАВЗ62 проявляли істотне інгібування росту пухлин у порівнянні з мишами, що одержували контрольний сольовий розчин. Крім того, пригнічення росту пухлин у мишей, які одержували
ІМАВЗ362 приводило до подовження середньої тривалості життя (Фіг. 24 і Фіг. 25). Ефективність
ІМАВЗ362 корелює із тривалістю обробки. Якщо обробка ІМАВ362 починається в ранніх тимчасових точках, то інгібування росту пухлин підвищується більше, чим при пізньому початку обробки для дослідження дії на пухлини, що прижилися. Більше того, протипухлинний ефект
ІМАВ362 залежав від ступеня експресії СІ ОМ18.2 у мішені. У пухлин з низькою експресією
СІГОМ18.2 типу ксенотрансплантатів ОАМО і Раїшв9885 опосередковане ІМАВЗ62 інгібування росту знижувалося в порівнянні з інгібуванням росту пухлин при ксенотрансплантації пухлин з високою експресією СІ ОМ18.2.
Приклад 6. Обробка на моделях метастазів рака підшлункової залози в мишей
Таблиця 20
Зведення із обробки при тестуванні ефективності ІМАВЗ362 на метастази раку підшлункової залози .. . Ме (дата) о. зМий2-І МТ ЕТ2 С220 1. п-:15; 200 мкг ІМАВЗ362 по 2 | - ін'єкція 2х105 клітин в/в у (22.11.2011) рази на тиждень в/в-в/о хвостову вену самкам 2. пЕ15; 200 мкг ізотипового безтімусних мишей пиде Нза: контролю по 2 рази на тиждень | охп1"ч в/в-в/о - початок обробки через З дня 3. п-15; РВ5 по 2 рази на після введення ракових клітин тиждень в/в-в/о
Раїш89885 ЕТІ С178 1. п-10; 200 мкг ІМАВЗ362 по 2 |- ін'єкція 2х105 клітин в/в у (24.05.2011) рази на тиждень в/в-в/о хвостову вену самкам 2. п10; РВ5 по 2 рази на безтімусних мишей пиде Нза: тиждень в/в-в/о Еохпіг"ч - початок обробки через З дня після введення ракових клітин
Раїш89885 ЕТІ С1785 1. п-:15; 200 мкг ІМАВЗ362 по 2 | - ін'єкція 2х105 клітин в/в у (03.06.2011) рази на тиждень в/в-в/о хвостову вену самкам 2. пЕ15; контроль на ізотип по 2| безтімусних мишей пиде Нвза: рази на тиждень в/в-в/о Еохпі"ч - початок обробки через З дня після введення ракових клітин
Модель метастазів 5ий2-ІЇ МТ
Мишам уводили внутрішньовенно 2х105 клітин 5ий2-Ї МТ і обробляли 200 мкг ІМАВЗ362, антитіла з ізотипового контролю (ІМАВО27) або РВ5, як зазначено в таблиці 20. Через 35 днів померла перша миша (група ізотипового контролю). Після цього всіх мишей забивали на 42-й день і видаляли легені й печінку для аналізу методами ІНС і кількісної ПЛР.
Аналіз ДНК людини в легенях мишей методом кількісної ПЛР повторювали щонайменше двічі в трьох повторах. Розрахунки вмісту ДНК людини за отриманими значеннямя Сі показали значне зниження (р «0,05) метастазів З!ий2-| МТ, виявлених у легенях, при обробці мишей
ІМАВЗ62 (Фіг. 26А) у порівнянні з обробкою РВЗ і ізотипичним контролем. Для перевірки цих результатів готовили зрізи зі зразків тканини легенів і проводили фарбування за допомогою антитіл до МНО-Ї. Розраховували площу поверхні позитивно пофарбованих клітин на зрізах легенів за допомогою програми Ітадеї. При обробці ІМАВЗ362 спостерігалося значне інгібування (р «0,05) у порівнянні з обробкою РВ5, підтверджуючи результати, отримані методом к-ПЛР.
Однак у випадку антитіла з ізотипового контролю відмінності не були значимі (Фіг. 268). Ця розбіжність, швидше за все, викликана відмінностями в обробці тканин: обробка зрізів тканин для ІНС забезпечує доступ тільки в дуже невелику ділянку легенів у порівнянні з методом к-
ПЛР, для якого екстрагується геномна ДНК із половини тканини.
Поряд з обробкою тканин, можливо, що цей результат представляє несподівані інгібуючі ефекти антитіла з ізотипового контролю проти СІ ОМб. Для дослідження цієї можливості клітини
Зий2-| МТ піддавали аналізу на експресію СГ ОМб і зв'язування ІМАВО27 методом ЕАС5. При додаванні 200 мкг/мл ІМАВЗ362 до клітин Зий2-ЇМТ проявлялося сильне зв'язування із клітинами, тоді як додавання 200 мкг/мл ІМАВО27 давало слабке зв'язування антитіла із цими клітинами мішені, указуючи на те, що СГ ОМб дійсно слабо експресується в цих клітинах. Ці результати свідчать, що щонайменше два фактори (обробка тканини й слабке інгібування
ІМАВО27) призвели, до спостережуваних розбіжностей з антитілом з ізотипового контролю.
Модель метастазів Раїш89885
Для аналізу ефекту обробки ІМАВЗ62 на розвиток і ріст метастазів Раїйи89885 іп мімо групам
Зо по 10 мишей уводили 2х105 клітин Раїш89885. Перший експеримент проводили шляхом порівняння обробки ІМАВЗ362 з обробкою мишей РВ5. У кожній групі 1 миша вмирала відразу ж після ін'єкції клітин. В інших 18 мишей метастази виникали дуже швидко в порівнянні з експериментами по приживленню. Через 63 дня забивали перших 2 мишей у групі РВ5 через поганий стан здоров'я. Усіх інших мишей забивали через 65 днів. Оптичний аналіз легенів показав великі метастази по всій тканині легенів. Ступінь утворення метастаз аналізували методом кількісної ПЛР (Фіг. 27). Результати показують, що ІМАВЗ62 інгібує ріст метастазів у тканині легенів.
Другий експеримент по 11 мишей у кожній групі проводили шляхом порівняння обробки
ІМАВЗ362 з обробкою ізотипичним контролем (ритуксимаб). У цьому експерименті метастази розвивалися повільно, як це спостерігалося при приживленні. Проте, для порівнянності даних цей другий експеримент теж припиняли через 65 днів. Знову проводили аналіз тканин легенів методом кількісної ПЛР і знову ІМАВЗ62 знижував ріст метастазів. Одна миша із групи ІМАВЗ362 була встановлена як викид, і виключення цього викиду давало майже значиме (р - 0,0588) інгібування. Ці дані перевіряли по площі поверхні методом ІНС, як описано для експерименту з метастазами Зий2-ЇМТ. При цьому проявлявся той же самий викид, і при пропуску цього значення при перевірці Р за і-критерієм інгібування ІМАВ362 також виявилося на грані значимості (р-0,0691), як і значення цієї миші.
Приклад 7. Первинна фармакодинаміка ІМАВЗ62 у комбінації з хіміотерапією
Чутливість клітин карциноми підшлункової залози до гемцитабіну й оксаліплатину
Для вивчення механізмів дії ІМАВЗ362 у комбінації з хіміотерапевтичними засобами оксаліплатином або гемцитабіном використовували клітини ракових ліній підшлункової залози, конституїтивно експресуючі С ОМ18.2 (САМО, Раїши89885), і клітини, стабільно трансдуковані
СІ ОМ18.2 (МіаРаСа-2-ІЇ МТ, ВхХхРОЗ-І МТ).
У хімічному відношенні гемцитабін (Септ?лаг, випускається фірмою Еїї І Шу 5 Со) є аналогом нуклеозидів. Як і 5-фторурацил (5-3) і інші аналоги піримідинів, трифосфатний аналог гемцитабіну заміняє собою один з будівельних блоків нуклеїнових кислот при реплікації ДНК.
Цей процес зупиняє ріст пухлин, тому що до "неправильного" нуклеозиду може приєднуватися тільки ще один нуклеозид, що приводить до апоптозу.
Оксаліплатин функціонує шляхом утворення міжланцюгових і внутрішньоланцюгових перехресних зшивок у ДНК. Перехресні зшивки в ДНК запобігають реплікації й транскрипцію
ДНК, що призводить до загибелі клітин (сгапат .)., Михйіп М., КігКраїгіск Р. (2004) "Охаїїріакіп"
Маїшиге Немієже Огид Оібвсомегу З(1): 11-2).
Криві доза-відповідь у сгемцитабіну й оксаліплатину свідчать про різну чутливість
Зо досліджуваних ракових ліній клітин підшлункової залози (Фіг. 28 і Фіг. 29).
Таблиця 21
Значення ІСво гемцитабіну й оксаліплатину для ракових ліній клітин підшлункової залози
Для інгібування проліферації клітин Раїш89885 необхідні високі концентрації гемцитабіну (ІСво 2100 нг/мл) або оксаліплатину (ІСво 2500 нг/мл). Клітини ОАМО і ВхРОСЗ3-ІЇ МТ дуже чутливі до гемцитабіну, але не до оксаліплатину. Клітини МіаРаСа-2-ІМТ найбільш чутливі до оксаліплатину, але менше чутливі до обробки гемцитабіном (Фіг. 28, Фіг. 29 і таблиця 21).
Вплив хіміотерапевтичних засобів на експресію СІ ОМ18.2 у клітинних лініях карциноми підшлункової залози
Спосіб дії, що запускається зв'язуванням ІМАВЗ362, строго залежить від наявності й щільності на поверхні клітин його мішені - СІ ОМ18.2. Попередня обробка клітин САМО і
Раїшв9885 гемцитабіном (СЕМ), а також гемцитабіном у комбінації з оксаліплатином (сетох), приводила до підвищення рівнів мРНК і білка СІ ОМ18.2 по даним аналізу методом ЗТ-ПЛР (фіг. 30) і вестерн-блотинга (Фіг. 31) клітин без обробки й клітин з попередньою хіміотерапією. Отже, кількість білка СІ ОМ18.2, доступного для ІМАВЗ362 на поверхні попередньо оброблених Сет або СетоОх клітин ракових ліній підшлункової залози, зростало, як показала проточна цитометрія (Фіг. 32).
Обробка САМО і Раїшв89885 гемцитабіном приводить до підвищення рівня СІ ОМ18.2.
Раїш89885 проявляє сильну підвищувальну регуляцію СГОМ18.2 при впливі Сет і меншу при впливі сетох.
Вплив хіміотерапевтичних препаратів на клітинний цикл і експресію СІ ОМ18.2
Проходження клітинного циклу відноситься до послідовності подій від одного мітотичного розподілу до іншого в клітині. За фазою спокою ((30/051) випливає фаза синтезу ДНК (5), а потім фаза росту клітин (2) і реплікації ДНК (М) з наступним розподілом клітини на дві дочірні клітини. Усяке втручання в клітинну машину може перешкоджати проходженню всього циклу в будь-якій фазі клітинного циклу. Наприклад, певні хіміотерапевтичні засоби можуть блокувати його у фазі С2 або М або одночасно в С2 і М (2/М).
Обробка гемцитабіном клітин ПОАМО або Раїш89885 приводить до зупинки клітинного циклу у фазі 5 (Фіг. 33, Фіг. 34). Проводили аналіз Раїшво885 при культивуванні з Сет. Обробка гемцитабіном не тільки приводить до зупинки клітинного циклу, але також змінює експресію
СІГОМ18.2 (Фіг. 348). Зміна щільності СІ ОМ18.2 після обробки гемцитабіном було ще вище, якщо порівнювати проліферуючі клітини у фазі 5 і спочиваючі клітини у фазі (30/51 (Фіг. 34С). У клітинах Раїш89885 СІ ОМ18.2 експресується на всіх фазах клітинного циклу. Після обробки гемцитабіном його експресія ще підвищується, а найвищі рівні СІ ОМ18.2 у клітинах відзначаються в популяції клітин фази 5.
Таке викривлення фенотипу пухлинних клітин значно впливає на біологічну ефективність терапевтичних антитіл. АОСС і СОС залежать від дози, тому зростання рівня мішені - С ОМ18.2 забезпечує синергійну користь при стандартних режимах хіміотерапії.
Клітини КАТО-ІІЇ, лінії ракових клітин шлунка людини, культивували в середовищі КРМІ 1640 (Іпмігодеп), що містить 20 956 ЕС5 (Регбіо) і 2 мМ Сішатах (Іпмігодеп) при 37 "Сі 5 95 Со», з додаванням або без цитостатичних сполук. 5-БО (МеоПййог фірми Меосогр АС) тестували в концентрації 10 або 100 нг/мл, а оксаліплатин (Нозріга) тестували в концентрації 50 або 500 нг/мл. Культивували 8х105 клітин КАТО- протягом 96 годин без заміни середовища або 72 годин з наступним культивуванням ще 24 години на стандартному середовищі, щоб зняти зупинку клітинного циклу, в б6-комірковому планшеті для культивування тканин при 37 "С, 5 9о
СО». Клітини збирали за допомогою трипсину/ЕОТА, промивали й аналізували.
Для позаклітинного виявлення СІ ОМ18.2 проводили фарбування клітин за допомогою моноклонального антитіла ІМАВЗ62 проти СІ ОМ18.2 (сапутеа) або контрольного антитіла того ж ізотипа (Сапутед). Як вторинний реагент використовували козяче антитіло проти пиЇдсвс-АРС
Зо фірми Оіапома.
Стадії клітинного циклу визначали вимірюючи вміст ДНК у клітинах. Це дозволяє розрізняти клітини у фазі 1, 5 або 2 клітинного циклу. У фазі 5 відбувається подвоєння ДНК, тоді як у фазі 2 клітини ростуть і готуються до мітозу. Аналіз клітинного циклу проводили за допомогою набору Сусіеїе5і Ріи5 ОМА Кеадепі Киї фірми ВО Віозсіепсе5 за методикою виробника.
Одержання й аналіз даних проточної цитометрії проводили на установці ВО ГАС5 Сапіоїї (ВО
Віозсіепсе5) за допомогою програми Ріом/о (Тгее іа).
На Фіг. З5а й р стовпчики показують відсоток клітин у фазі 21, 5 або 2 клітинного циклу, відповідно. При культивуванні клітин КАТО-П у середовищі відбувається зупинка клітинного циклу, бажано у фазі 51. При обробці клітин 5-ЕЮОЮ вони блокуються бажано у фазі 5. При обробці клітин КАТО-ІІЇ оксаліплатином відбувається збагачення клітинами бажано у фазах С1 і 02. Як видно з Фіг. 3З5с, зупинка клітинного циклу у фазі 5 або фазі 2 призводить до стабілізації або підвищення рівня СІ ОМ18.2. Як тільки клітини виходять із якої-небудь фази клітинного циклу (Фіг. 355), експресія СІ ОМ18.2 на поверхні клітин КАТО-П підсилюється (Фіг.
З5а).
Клітини КАТО-ПІІ піддавали попередній обробці іринотеканом або доцетакселем протягом 4 днів і проводили аналіз на експресію СІ ОМ18.2 і зупинку клітинного циклу. Обробка клітин іринотеканом приводила до дозозалежного інгібування росту клітин і зупинки клітинного циклу у фазі 5/52 (Фіг. 36). Обробка клітин доцетакселем приводила до дозозалежному інгібування росту клітин і зупинці клітинного циклу у фазі 2 (Фіг. 36).
Вплив хіміотерапії на індуковану ІМАВЗ62 антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АОСС)
Проводили ряд експериментів конститутивно які експресують СГ ОМ18.2 клітинами ракових ліній підшлункової залози Раїш89885 і ОАМО для дослідження ефектів гемцитабіну (сет) або гемцитабіну т оксаліплатину (сетоОх) на ІМАВ 362-опосередковану АОСС. Порівнювали криві доза-відповідь для опосередкованого ІМАВЗ62 лізису клітин при попередній обробці клітин і при культивуванні в середовищі.
Криві доза-відповідь у попередньо оброблених Сет (1 нг/мл) або Сетох (Сет 1 нг/мл ж Ох 10 нг/мл) клітин ЮАМО (2 дня) зміщалися нагору й уліво в порівнянні з необробленими клітинами мішені (Фіг. 37А). Обробка ракових клітин Сет або бетох приводила до підвищення рівня СІ ОМ18.2 і більшої схильності ІМАВ 362-опосередкованої АЮСС. Після обробки 60 хіміотерапевтичними засобами в клітин ЮАМО спостерігалося зниження значень ЕсС»бо і підвищення максимального лізису клітин при ІМАВ 362-опосередкованої АОСС (Фіг. 37 В).
Очищали мононуклеарні клітини периферійної крові (РВМСОС), включаючи МК-клітини, моноцити, мононуклеари або інші ефекторні клітини від здорових донорів, центрифугуванням у градієнті щільності Рісоїї Нурадиеє. Промиті ефекторні клітини висівали в середовище Х-Мімо.
При цьому як клітини мішені використовували клітини КАТО-ІЇ, які ендогенно експресують
СІГОМ18.2, і які походять зі шлунка. Клітини мішені стабільно експресували люциферазу, а
Гисіїег жовтий окисниться тільки життєздатними клітинами. Додавали очищене антитіло
ІМАВЗ362 проти СІ ОМ18.2 у різних концентраціях, а як антитіло для ізотипового контролю використовували стороннє химерне антитіло проти пиЇдс1. Зразки аналізували на цитоліз вимірюючи люмінесценцію в результаті окиснення ІГисіїєг жовтого, яка є заходом кількості життєздатних клітин, що залишилися після індукованої ІМАВЗ362 цитотоксичності. КАТО-ПІЇ, попередньо оброблені протягом З днів іринотеканом (1000 нг/мл), доцетакселем (5 нг/мл) або цисплатином (2000 нг/мл), порівнювали з необробленими клітинами мішені, що культивувалися в середовищі, і проводили кількісне визначення ІМАВ 362-індукованої АОСОС.
При попередній обробці протягом З днів іринотеканом, доцетакселем або цисплатином клітини КАТО-ІШ проявляли зниження рівня життєздатних клітин у порівнянні із клітинами мішені, що культивувалися в середовищі (Фіг. Зва), а експресія клаудину 18.2 у клітинах при попередній обробці іринотеканом, доцетакселем або цисплатином підвищувалася в порівнянні із клітинами, що культивувалися в середовищі (Фіг. 385).
Крім того, попередня обробка клітин КАТО-ІЇ іринотеканом, доцетакселем або цисплатином підсилювала здатність ІМАВЗ62 індукувать АОСС (Фіг. Звс, а).
Вплив хіміотерапії на ІМАВ 362-індуковану СОС
Дія ІМАВ362 на СОС досліджували шляхом інкубації із клітинами мішені в присутності сироватки людини як джерела комплементу, клітини, що культивувалися в середовищі, МіаРаСа-2-І МТ проявляли значення ЕСво для
ІМАВ 362-специфічного лізису в 7665 нг/мл. Обробка Сет приводила до зниження ЕСзхо до 4677 мл/мл поряд з підвищенням максимального ступеня лізису (Фіг. 39).
Дія хіміотерапевтичних засобів на ІМАВ 362-індуковану СОС аналізували при попередній обробці ракових клітин шлунка КАТО-Ї з 10 нг/мл 5-РШ їі 500 нг/мл оксаліплатину (Х-ЕШ-ОХ) протягом 48 годин. Репрезентативні криві доза-відповідь за ІМАВ 362-індукованою СОС при попередній хіміотерапевтичній обробці клітин КАТО-П представлені на Фіг. 40. Попередня обробка ракових клітин протягом 48 годин підсилювала здатність ІМАВЗ62 індукувати АОСС, що приводило до підвищення максимального ступеня лізису в попередньо оброблених ракових клітин у порівнянні з необробленими клітинами.
Приклад 8. Ефективність ІМАВЗ62 у комбінації з хіміотерапією на моделях пухлин у мишей
Досліджували протипухлинну активність ІМАВ362 у комбінації з Сет або Сетох на підшкірних моделях ксенотрансплантації карциноми підшлункової залози, які раніше використовувалися для тестування ефективності ІМАВЗ62 як єдиного засобу.
В оброблених ІМАВ362 мишей пиде с пухлинами ВхРСЗ3-ЇМТ або МіаРасСа-2-І МТ проявлялося значне вповільнення росту пухлин у порівнянні з контрольними мишами, які одержували контрольний сольовий розчин. Хіміотерапія гемцитабіном аж до 100 мг/кг без додаткової обробки ІМАВ36б2 не виявляла істотного терапевтичного впливу на ксенотрансплантати ВХРОЗ-І МТ або МіаРаСа-2-І МТ. Напроти, комбінована обробка 50-100 мг/кг гемцитабіну плюс ІМАВ362 приводила до значного посилення інгібування росту пухлин і продовженню строку життя в мишей з пухлинами в порівнянні з мишами, які одержували тільки хіміотерапію (Фіг. 41, Фіг. 42, Фіг. 43). Ці спостереження вказують на існування синергійних терапевтичних ефектів при комбінуванні гемцитабіну й імунотерапії ІМАВЗ362.
При використанні високих доз гемцитабіну 2х150 мг/кг у тиждень у привитих ксенотрансплантатів пухлин МіаРаСа-2-ІМТ сильно інгібувався ріст пухлин незалежно від обробки ІМАВЗ362 (Фіг. 44А). Однак миші, що одержували комбіновану терапію ІМАВЗ362 і гемцитабіном, проявляли значно більш тривалий тривалість життя в порівнянні з мишами, які одержували гемцитабін як єдиний засіб (Фіг. 44В).
Приклад 9. Обробка 2АЛІ-2 приводить до експансії великої кількості Т-клітин МуУ9Уб2
РВМСз культивували протягом 14 днів у середовищі ЕРМІ з додаванням 300 Од./мл ІІ -2 і 1 мкм золедронової кислоти (2А) або без неї. У день 0 і день 14 визначали відсоток Т-клітин
МуЗа-Мб2- у популяції лімфоцитів СОЗ- і відсоток клітин СО1б- у популяції Т-клітин сОз3-мууднуб2 багатобарвним методом ЕАС5.
Для виживання й росту лімфоцитів потрібне додавання ІЇ-2 у культури РВМСО5. Вони ефективно експандують у культурах при додаванні 300 Од./мл 1І/-2. Методом ЕАС5 з бо використанням специфічних до МуЗ9 і Мб2 антитіл показали, що додавання 2АЛІ--2 специфічно індукує нагромадження Т-клітин Му9Мб2. Через 14 днів популяція лімфоцитів СЮОЗя- може містити до 80 95 Т-клітин МуУ9Уб2. Частина Т-клітин МуУ9уб2 експресує СО16, причому збагачення цими клітинами в популяції лімфоцитів СОЮЗ. становить 10-700 разів, залежно від донора.
Збагачення Т-клітинами СО16б-МуЗ-Мб2- у культурах становить 10-600 раз у порівнянні з культурами, які ростуть без 7А. Робимо висновок, що обробка РВМСО5 іп міго за допомогою 2АЛІ-2 приводить до підвищувальної регуляції ЕсуПІ-рецептора СО16, який опосередковує
АОС у значної частини Т-клітин уб.
Подібно до МкК-клітин, при викликаній 2АЛІ-2 експансії Т-клітини МуЗМб2 будуть позитивними за СО16 - рецептором Есугпії, через який пов'язане із клітинами антитіло запускає
АрСС. Щоб визначити, будуть чи Т-клітини МуУЗ9Уб2 здатні індукувати сильну АОСС у комбінації з ІМАВЗ62, проводили ряд експериментів.
РВМС»5, отримані від 2 різних донорів (41 і 22), культивували в середовищі з 300 Од./мл І! -2 і 1 мкМ 2А або без неї. Через 14 днів клітини збирали й додавали при зростаючих їх концентраціях (0,26 нг/мл - 200 мкг/мл) ІМАВЗ62 до клітин МОСОС-4, які експресують СІ ОМ18.2.
Визначали специфічну загибель клітин люциферазним методом. Проводили аналіз АОСС з 27 донорами при культивуванні в присутності 300 Од./мл 1-2 з 2А або без неї, при цьому клітини
МИОС3-4 служили як мішені. Для кожного донора обчислювали значення ЕСбо із кривих доза- відповідь і оцінювали максимальний ступінь специфічної загибелі при дозі в 200 мкг/мл ІМАВ362 на точкових графіках.
При використанні РВМСО»5, що культивувалися 14 днів з 2АЛІ -2, спостерігалася сильна ІМАВ
З362-залежна активність АОСС проти СГОМ18.2-позитивних клітин МООС-4. При використанні оброблених 2А/ЛІ--2 культур РВМСз» активність АОСС залежить від присутності Т-клітин МуУ9Уб2.
При культивуванні клітин без 2А активність АЮСС знижується в більшості донорів. У цих культурах залишкова активність АОСС залежить від МК-клітин. При тестуванні більш 20 донорів аналіз АОСС показує, що обробка РВМОС5 за допомогою 2АЛІ-2 поліпшує значення ЕсСобзо і максимальному ступеня специфічної загибелі в порівнянні з культивуванням РВМС5 тільки з одним 1-2.
Приклад 10. Ефективність ІМАВЗ362 у комбінації з гемцитабіном на моделі метастазів у мишей
Зо Для аналізу впливу обробки ІМАВЗ62 у комбінації з гемцитабіном на метастази Раїш89885 у легенів іп мімо, по 12 безтімусних мишей пиде Нева: БРохпі" на групу одержували внутрішньовенну ін'єкцію 2х105 клітин Раїш89885 у хвостову вену. Через 14 днів після введення пухлинних клітин миші одержували 200 мкг ІМАВЗ62 або РВ5 як контролю (в/в-в/о) по 2 рази на тиждень плюс раз на тиждень дозу в 100 мг/кг гемцитабіну в/о протягом 4 тижнів. Обробку
ІМАВЗ362 або РВ5 продовжували до забивання мишей на 70-й день після введення пухлинних клітин. Проводили аналіз навантаження легенів ксенотрансплантованими пухлинами методом кількісної ПЛР на ДНК людини в препаратах легенів і оптичним методом імуногістологічного фарбування за допомогою антитіла проти МНСОС-І людини (клон ЕРК1394У). Результати показують, що в мишей, що одержували ІМАВ362 плюс гемцитабін, значно знижувалася кількість ДНК людини в легенів (Фіг. 45А), а площа поверхні, пофарбованої комплексом проти
МНО-Ї людини на зрізах легенів, була значно менше, чим у легенях у мишей, що одержували стороннє антитіло плюс гемцитабін (Фіг. 458). Обидва методи показали зниження навантаження ксенотрансплантатами пухлин Раїш89885 у легенях у мишей, які одержували ІМАВЗ362 плюс гемцитабін, свідчачи, що комбінування з ІМАВЗ362 значно перевершує монотерапію гемцитабіном.
Геєстраційний номер заявника або довіреної Міжнародна заява Мо
ВІДОМОСТІ ПРО ДЕПОНОВАНІ МІКРООРГАНІЗМИ АБО ІНШИЙ БІОЛОГІЧНИЙ МАТЕРІАЛ
(Договір про патентну кооперацію (РСТ), правило 13рі5)
А. Відомості, надані нижче, відносяться до депонованих мікроорганізмів або іншого біологічного матеріалу, згаданого в описі на сторінці 49, рядок З
В.Ідентифікація депонованого матеріалу Інші депоновані матеріали вказані на додатковому аркуші Їх!
Назва органу по депонуванню рЗМ2-бешвспе заттіипд моп Міктоогдапівтеп ипа 2ейКийигтеп Сітьн
Адреса органу по депонуванню (включаючи поштовий індекс і назву країни)
Машеродер Вег 16 38124 Брауншвейг
Німеччина
Дата реєстрації депонованого матеріалу Реєстраційний номер 19 жовтня 2005 ОМ АСС2737
С. ДОДАТКОВІ ВІДОМОСТІ (залишити Продовження на додатковому аркуші о порожнім, якщо не застосовується) - Мишача (Мих Мизсціц5) мієлома РЗ х 63А980.1 схрещена з мишачими (Мих Мизсии5) спленоцитами - Гібридома, що продукує антитіла до людського білка клаудин-18А2 р. КРАЇНИ, ДЛЯ ЯКИХ НАДАНО ВІДОМОСТІ (якщо відомості не для всіх зазначених держав) н"?"ЄЬ6ОШІІЇЙІШИИИИННННТТТТннннншш
Е. ДОДАТКОВІ ВІДОМОСТІ (залишити порожнім, якщо не застосовується)
Відомості, надані нижче, будуть представлені в Міжнародне бюро пізніше (вказати загальну кількість відомостей, наприклад, "Реєстраційний Номер Депонованого Матеріалу")
Тільки для використання Тільки для використання Міжнародним бюро приймаючоюустановою о Цей аркуш був одержанийіз міжнародною о Цей аркуш був одержаний Міжнародним й Бюро (дата): заявою:
Форма РСТ /КО/134 (липень 1998 року; передруковано в січні 2004 року)
Нова Міжнародна Заява на Патент "Ганімед Фармасьютікалс АГ" (запутей Рпаптасешііса!5 АС) та ін. "ТЕРАПІЯ З ВИКОРИСТАННЯМ АНТИТІЛ ДО ЛЮДСЬКОГО БІЛКА КЛАУДИН 18,2 ДЛЯ
ЛІКУВАННЯ РАКУ"
Наш вих. Мо: 342-73 РСТ (Договір про патентну кооперацію)
Додатковий Лист Для Біологічного Матеріалу
Відомості про наступні депоновані матеріали: 1) Назва та адреса установи по депонуванню для депонованих матеріалів (О5М АСС2738,
ОМ АСС2739,
ОМ АСС2740, О5М АСС2741, Ю5М АСС2742, О5М АСС2743, О5М АСС-2745, Ю5М
АСС2746, О5М АСС2747,
ОМ АСС2748): рЗМ2-бешвспе заттіипд моп Міктоогдапівтеп ипа 2ейКийигтеп Сітьн
Машеродер Вег 16 38124 Брауншвейг
РЕ
2) Назва та адреса установи по депонуванню для депонованих матеріалів (О5М АСС2808,
ОМ АСС2809,
ОМ АСС2810): рЗМ2-бешвспе заттіипд моп Міктоогдапівтеп ипа 2ейКийигтеп Сітьн
Інхоффенштр. 7 Б 38124 Брауншвейг
РЕ
Відомості, надані нижче, матеріалу мікроорганізму в описі на наступній сторінці(ках)
Додаткові відомості для всіх згаданих вище депонованих матеріалів: - Мишача (Ми5 Ми5сши5) мієлома РЗ х 63Ад80.1 схрещена з мишачими (Ми5 Мизсшив5) спленоцитами - Гібридома, що продукує антитіла до людського білка клаудин-18А2
Депозитор:
Всі згадані вище депозитарії були зроблені:
Ганімед Фармасьютікалс АГ" (Ссапутей РпагтасеціїсаІ5 АС)
Фрайлігратштр. 12 55131 Майнц
РЕ
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«МО» ГАНІМЕД ФАРМАСЬКТІКАЛЗ АГ «120: КОМБІНОВАНА ТЕРАПІЯ З БИКОРИСТАННЯМ АНТИТІЛ ПРОТИ КЛАУДИНУ і18.2 ДЛЯ ЛІКУВАННЯ РАКУ «ЗО» 342-738 вст «1505 ВСт/ЕР2ОЗИЮЮ5О «15їх 2013-02-80 «16505 54 «120» патентована версія 3.5 «іх 1 «11» 251 «Киї2з ВВТ (група захисної, радикал тванслокації) «213» Ножо зарівпя Слюдинао «00» 1 меє дід маї твгоАїа Суз сій бБіу сабо біу Ре УДІ Уві 5ег ів її 1 5 10 15 іїіу Жіе АТа сіу тТіє їі АіВ8 АВ ТТГ ОСУ5 МК Абробіп тТкроб5еє ТВг 70 ях 30 бів дерен тує Ахп Аа го УВІ Те Аїд Уа вве Ача туго вій бу
Ай 45 ів ТгроАгу бегобух Уві Аг бів Зек о беговіу вве тб бів Су Ага
Б) Ко Бо сіу Тук пе тк обецорео пі ев обго АЇа Мекобев сій АТа Уві Аго 65 70 75 о
Аза грец мет їі маї ціх тів маії іео Б5іу Аїд тів бі рез о цец ха! 85 о 35 5ег їі РВе Аїа бен о іух сСуз Хе дго їів біу его Меї СТ Аврозог ма 105 То
Аїва ух Аїй Аза оМеї ТВгоїву ТР обек сім їТе Мек оба їі мзі 5ег і115 120 125 б1у сечо Сух АЇз ті Аївойіу Уа! Жег оУаї Ве А1В АБ меж гей ма 130 115 іо
ТВЕ Ахп ВВЕ Тер оМеї Яеє ТВКОАїд Аха Меї Тук Тк осіу мМек біу 01у 145 150 155 їво
Ммеї уаї бій тТвВеоуаї біп тТвВе аг тує тТвк о йбе біу діа діа ву а 165 1270 Туз
Уві біу теромаї Аа соіу біу ей отвигоїем тів сіу бРу мві Меї мех 180 155 о сСух 1 Аа Сух дгЯ біу ува Аїд обго біз біз ТВгоАБи туго ух АТ 15 ми 205 маї хаг о туг ніз дія Зеб біу ніб бЗег о уаї АЇв туго фух го пі СТУ 210 215 гг
Ре цу Аа баг тик біу ве біу Баг дя ТВг обу дЕпоцух Муз Ів 225 2 235 4
Тут ах О1іу бі АЇЗ Ага тб обі Аброаіц ав пів ог туго вго Заг 245 а 255
Су Ні дер отук мазі 250 «8105 «211» бі «212» вЕтТ (група захисної/радикал транслоканії) «її» ною зарівпя Слюдина) «Ох 2
Меї баг ТВготВеотве бух бій хУаї уаї Аід ве ген бен бек КТ рец ї 5 10 15
Ту вч Аїа сіу Суз хі Аїа Аза тнг обіу Меї Азромет ТекроЯег Таг 20 23 30 оп Азроівн туг АзроАЗп вго маї ТВго5ег о маї вве бій тує 510 Ту 35 30 45
Ме тер Ага его суч Уа! дк біп бег о беб бфу рве їпк обі бух Аг 5й 55 бо
Бгто тує Ве тТвВе о їТе рев о біу беб овго АТа Ме сен обіп Аїд Уді го 55 7 5 ВО
Аа рев мет жів Уді біу тів Уді тен с1іу Ата їіє бу Бей оїев Уа 55 що ЗУ зег хіе Ре аАїЇа цей о кух Сух ІТФ Аг ІТе біу его омек біб азр о зек 100 105 Мо
АТа ку5 Аїд Азп Мей ТВгоїецй ТВгоЗег сіу Хе меї рпе тів Ууді 5ег 120 125 біУу без Сух діз Хі Аїа сіу Уа баб оуді вне Аа Ач Мет івєч ха 130 155 135
ТвгоАхп вне тТкроМей Зег о ТВгоАЇїВ Аап Мет тує ТВб біу Меї о1у біу 145 150 155 1650 мес Уа! сія твг ові 21й ТВг Ага тТук ТВг оРБе сіу Аа АХ геч Рева 155 170 175 чаї Бі тгРроУуві Аїа сіу біу реф тн во Хі Біу біх уд? мес мех 180 І85 150
Суб тіє дів суб ака сім сен дів во сі) бів Те аяча тує дже А1В 135 00 205 уві бек туп Ні ія Збг обіх із зве Ві АР Ту бух вра ту пу
ЯКЕ 215 228 вне руб Аїд Заг стиг сі ре піу зер дай Ве був АБ скух уж Ше 225 23 3 зав
ТуК а5ро пі ші Аіа аг тт Ор Аз Сі Уві бій обеєв тТук ра дет га 258 255 бує ніз АхО тує Уді з5О «вій З «іх 30 «йо» вт труйа захисної, радакал.і гравейвканії) «13 пові зві йе СлюдинаЗ «Я00х 3 дв оБій теробеб ТВе бій ав сей тТук дев 1 5 й «ій» 4 «її «21» ваї (група захисної, радикал транслокації) «АІЯх нНопо заріенмне СЛюДИНО) «з 4 алБи ачповВгосУуВі НЕ АВ ота вав Аа тує БІВ 1 5 38 «Вії «кій» ВАТ Серуйпа захиснеї радикал транслонанії 213 оте озартейе Спюдина
ОМ ееЯ
Заг тТвгобій й5ро бен тує Ази дп во У твнгодтя ді вва 1 5 то «ій» 6 «ії 1 хаїйх ВТ теру пЛВ звкиснотивадикав: транесакацяі «213» Ното 5арієпв спюдима «ЗНіх. б
ТКРоАЗВ о бНе Тр мех че тТвК Аїа Ав Мет Тугє те щу 1 5 їв «ах и «ІА 13 «Війх ЕТ Скрупа захисна радикви транслокації «иіїх мето 5аріейе «людина
«НМ и
Азр ває Аа руб діа дяй Меї тк овен тВе Зак обу тів 1 а 10 «бійх В «Кіїх 55 «ій» ВТ (група захисні радикал трансванації) «13 нНошео «арієпя слюдина) «М» В мет дв біп їгрозеаг твгосіяй аБО Беу туг деп оди го УдД! ТБгоАЇ 1 У Зо І чаї Ре Ап туго сій біу зей о тгроаАго Хеє бух уаї ага щі баг очек сію вва о тве сіб суч Аг обіу Туг вве о твг грец ін сім реп оре Аа
Б а
Меї баз 5іпй Аїв ха! дсо АїВ «210» З «ії 24 «21й» вит Сгрупа захисноаї/радикал транслакаці і к1їх ноте «двізнє Слюдина) «МК З
РНе Аїда іви їув Сух Ті Аагу їі 0іу Бек о меї біб дер о Зег діа губ їй 5 10 15
АТВ Ахп о Меї тик обам ТВи бок О1У 20 кві» 10 «вії» 40 «2125 вКЕтТ (група захисної рзалдикал транслокації «?13х ното зарієпе Слюдива) «М ЛО
Аа Ахп мет ецч Уа ТВгодей Ре Ткор о Меб бек ТвК Аїа Аа Меї Тут 1 т 10 15
ТВгоБіу мет сім біу Меї уаі біп ТвгоУд|ф бій тве Ага тує ТВг ов 20 25 30 сту Аза АЇВв ів пе Уді біу тгр 35 40 «21 11 «211 153 «ха12з ВВТ (грула закисноі дадикай транслокації «а1їх нот 5арієпе слюданаі «0 11
Меї А5р о біп Тгтрочвк Твкобіп Ар обво тТуг Ап Аа вго маі тНк діа їі 5 10 і5
УВІ вве ази Ту шій біу без їгр ага бег суч Маї Ак обіц баг о бег 20 КІ 30 сі ве твгоєіз Суб Аг Біу ТУує Ра тнг обео бец біу ів РКО Аа ї5 40 45 меї бен біп А1їя Уаї Аго АТа гей має їі узі О1у Т1іе уУуаї бецч 1у 50 55 що
АТа те піу їв івц УЩаф дес їів рве Аїда сем о їуз СХ тів ака 112
Бо 7 5 КІВ
Оіу Заг Меї цій Ахрочог АіЗ8 ух вів Ап Мей тТВгоїєеч; Те Зак о біху
З з5 ї1е меї Не їів мі бегоБіМ сен Сух АЇЯ їв Аїв о біу Уді хвго ма 100 105 мо не АїЯ АЗИ Меж Гей о Уді тТвгодев Ве отр Мет зер ТВг Аїа Ап чех 115 120 125
Тур Тк о БІУу Мет о біу біу Меї таі бів ТпгоУуаї бій ТР оАгО Тук ТВг 130 135 140 виг піу Аїв АЇв сем во хв! біу Тер 145 1583 «205 12 «21їх КЕ «ід» РН (група звкиснатїнідекал тровнелокаці їі «21їх Щщтучна гнУуслідавнієсть «Ру» «23» Опис штуУчНОї послідовностістраневнція ПЛР продукту «А. ТІ 0 ік 1 2
Аго Твгома1 Аїа аів вго чЗег о Ууді Ре ті Ре го Рго Бек ор сш 3 із 10 15 сів фей о Кубз его біу ТВгоАїа чего уаї ді Суб бец гвв Аза Ай РНе 2 25 Кт
Тув о РгО Ага бій дій їз за! бів їгрорув маії азродяп ів сен бій
Зо 45 его біу А5позек бів Є пек ха) твВеобів Оій Ахрояек о гух ахробеє з 55 Б
Твготуг бар орец хек бек Те ред БК Сез баг о гу Аа Аа тує б 65 го М й ув ніз ув уд Туг АЇа Суб б о мві тигонія біп о сіу ей бек беб 85 чо 5 ко чаї Тк огуз Баг Ре Ап Ага бІу сі Суз 1600 нь
«10» 13 «81Е: 396 «йї12У вет (група захисної радикал транслокації) киїії» штучна послідовність «вх «ЕаЗ» Опис штучної послідовмості:трансляція ПАБ продукту «Зх 13 сіу рго заг оуаї ве Рго ву Аїд оРГО 5агобек цу его тТвг обог Фу 1 У А. 15 сіу твг АТ о АТа тез діу сСу5 це ма! фу АзротТує вне го бід Вго за 2 зо чаї тТвгоуаї Зако тер Ап Зав о ФіУ Аїв цей тТвго5ек пт Уді НЯ тн 4
Ре го Афіша чаї їі бів жає бек обіу сею о тук ек ве) Зоб оЗеає мВ
Б! 55 БО заз твеоУа! вро ек чек зав орец бі тн бій тек тує 115 Сує ДЕЙ
З 70 75 В;
Уваї деп нів вух рРгОо Бег Аза ТК ої ух Уді Аврорув гу уві бін Рго ще що З ух Берг о сУ5 АБроОвБУх ТйгОнНіЗ Таб оСуб вго РКО Сух вго Аза РГО БІЙ тва 10 115 іши мец оту бБіу Рго 5егоуаї Рпеб Бей рве Бго вго їуз Бго ру АЗр
М 129 5
ТВгорец о мМеб їів бег о Агу Те овго бів ма1ї тб осЄу» ма УдДі мві Ахр 130 135 140
Ууаї Бек нів Бім Азоровго сії Удаї ух вве Ахп Тго о Туг мВ) Ахросіїу і45 158 155 155 ма1ї біз Уа нів Ачп АЇїа суб Те обуб рРгО Аге біо шій бій тук Ай 155 170 175 зекотвгоТук ага уаї Уяі его узі вец тВг о Уді греч о ніз сій Ахротер 150 155 390 і«б дз БІіУ рух бів тує губ бух суч Уві Жег о АБп бух АЇй Бем о ВКо 15 200 205
Аїа вго їі сій Суб пвготіє 5егобужх АТЯ цу» СТУ бій Бго Ага о 21й кб в2
РгОо бій ува туго тТВгореи го РгО 5вК АК Ахр бій іец Тк о Буя Аж 225 230 235 240
Чіп Уві 5жегоіецй ТВгоСух без уні іу5 Бі вве Туг вВго бЗег Абр їв ча за 255
Ав Уді іш ТгроБіу бер Ап о біу біп бго бір Аа АВ Туг Був Те
ЕК; 267 27а
ТвРорва вго Уві ей Аярочек дв обіМ 5ебо вна вне цец тує вар ув 275 280 255
Мво тпгоУуаї Авроруз 5еб Ага тгробівй бів с1у Ап уаї вве беє Су 290 235 300 зак ма! меж ні 10 Аїд сец нів да Ні Тує Те оБій бує 5 бе 305 310 315 320 чек іви Зек го біу вує 325 «їй: 185 «Ті» ЯБб «218 вит (група захисноїирпадикал тизнолокації) «713» Штучна паслідовність «йдйх «йї» Опис штучної послідовності; химерні моноклаональні знтитіла «400: 14 ме Бій Тероїйке Ткромаї вйе бе вна вва їен век уаї Те дів оту ї 5 та 15
Ууді ні Зег бій уаї бій цен біп бів зЗег оїу Аїд бів бе Меб рух зо З КВ вео сбіу дів Зегомаї СУ 115 щег сух суб Аа пе Б1у тує тве вне
Зег бен тує ТевоТе біб Тгроуаї бує Біб ака Бго Бім нія біж ев 5
Сі) тгрожхіе ту бії тів би о вго піу его біу жЖвг отТнг Ап отує Ап 655 йо 75 Во ім ух Ре цу біу Суб Аза ТВгОрйе ТВО АТа деротвг его бек Ап 85 в Зх
ТтТВг о Аїа Тур Мек стій ів 5ег зак вей Те ек бій Ар о зек дія Ма чо 105 о
Тук туго Суб АТа Ак ТБ Аза Туг рРгОо ТРО Рез Аїд тує теру вію Бій 115 120 125 еіу тк окец уаї твг оУчі его Ааій Аїа бек тп цу Ту вгО зеркотді 130 135 140 вйе вко цец Аїв вго Зеб барв Бує 5еб Твек обес біу бу ТВг АВ ОАЇа 145 150 155 ї650
Бенц аіу Суб ре) ча! Бук АжЖротує рвав овго сім бго Уа тве фа Зек 165 І7о 175
Тер одхлп о багобпіу дід рем тйгоЗег о бту Уа нія ТНК оРНе вго слів Уді 186 185 130 рей бій баг оЗегб сбіу сецотук Бе Бенц ве дес уві Ууді ТВкРомаії го 195 200 205 бек бак хек бе біу таб обій твВготує тів Суб Аблоуаї Аа нія вух 210 215 220
Рго чего Ази ТНг обу Уа! Аяробув ух Уві 010 бга Ку вакосСує АВК 845 830 35 240 муз Тег онія таб Суб вра свого Суб Вера Аїа во сів Каб реву діу сту 245 За 25 вго хек ма)! Ре рей Ве вго Рго ух вгОо сує дер тк о реви мех Ктв 250 255 870 зак одка тТВеовго бін ха! те Суб чаї Уа! мві АБ оУді Зеб нів 1; 275 зва ТЗ
Аха ого бі уд? руб вве ач тер отує Уа! Або бу Уа бі уві ніх 230 295 30
Азв о АЇїа ух ТгОовМ5 о рго Ага бі бін сіп Тук Ач зЗего тн тТук АК 305 зо 315 320
Мі Уа! хе маі се тТвгомаї Сей нія бій Або їкй ев АхА су ух 325 330 335 сій туго їУх Сузх суб ма! зег дп обу АЇа гей орга діа вго тТе б зао 145 350 цу5 Те Те баг вуз АТя губ біу бій Ро Ако бі Бго бів уаї Туг 355 з 3655
ТКг бе вяго реа бек ода Аз обі бео те оБу5 АБИ бій Уаї бек оїво 370 375 зво
Тни Су сем уді їу5 біу пе отук рго бек АЗр о тіе Ай Ууаї сію тер
ЗК5 390 35 Дю біб авг деп біу бів Ра бій Аза Ай тує бує Те о тТвне вто бго уді 05 по 415
Бен Ахр жег Абросі Як вро Ре бео Тує Зегобух ген о ТВгоУаї дзо 425 430 іує кап Ага тРроб1й іп сіу Ай уаї РНа бак бує Зего ма) Мей ні 435 ч4а 4345 біб Аїй їец ніх да нів тує тб об! й Бух бЗегоцей ве рецопек рей 50 455 ло ім ім 455 «БМх 15 «211» 467 «212» ВВТ (група захисної/радикал транслокації) «ФАЗ» Щщтучна послідовність «ах «ЙаЯ» Опис штучної послідовності: химевні чоноклонайьні антитіла «00х 15
Мет Ахо Тероіву Тер ода беу бен ве це) меж о АЇТВ АТА вія бій бек і 5 10 15 тів сій Аа а1я їі сій цец Узі бій бег обіу РРО бїшШ грец їуб5 іх 2 зо
Рго бі Її тТвгоуа) суб хів Бек був бу аід зав обі тТуг Тс вве
НО 45
ТАгодеп туго біу Мет аби їгроумаї бух Та Аа вро оту бух бу Сен ба буз Тер Мет обіу тРо жів дп ТвР оаба те о офу Тв вго Те отує АВ.
З лі а Во сію сії вне уч біу Абу ве Аа РБе Зег бе сфи ТвВгохеє АВ 5ег 85 Зо 95
Твгодіа тує сен сій жів Аа АБ іев оку Ай бів дер о тНг АТ твг що 105 по
Тут Рне сСуз Аза Агуд Гец о сіу пе сіу Ап Аза Мет Ар Туг теру 115 125 125 біп біу тб о5вк ма! Твгомаї Чек бек о АТа бек о твеогу5 бБіу Вробег 138 135 140
Уа1 вве вго сеча Аза вес чок бек бух чес тн ожек бу БІіУ ТвгоАїа 145 158 155 150
Аїа сей сім Суб рем маї зу АБО Ту вне вго бів бко ма! Твгомаї 165 170 175 жає тТгроавй об біу АТа веб тпгочак Оу а! ні Тве о Рве рго лів іо їх 190
Уаі Кен са1іп бек бек біу ей тує ек гей бек бек уві маї тб жд 195 вай 205 рго 5ек чек обзек рев бі твг осів твеотує ЇЇ6 Су5 АБ уУді ай нів 210 215 220 ув ВгОо баб да Тпгосух уд дров ує бух Уді шій бго сус хег Су» 725 230 255 о
Авр бує ТВгОНіВ ЇвгоСух вгоОо вро бу» Ре АЇВ вгОо бім ве їв сту 245 РА) 15 бі Бка бег Ууді РВе Сей вне рго вго Бу вгРО Бу АЮ о тТвкК обеу Ммеє зво "55 во
Іїв бак АГРО тТВБовгОо біб мя тТвКосСух Узі уаї У) А5рохаї бак нів 875 780 285 сій Або о вгоа сої Уві уз ВМе Ачпотео тТук о хуаї Ар оіу уаї бін уд!
І 295 Зо
Ні деп А1а губ ТВг о їух РгОосАгбЯ Оіц б10 бі туго АЯа ве отВг отже за5 10 315 328
Ага уві Ууйі бЗегоуві їеу те Уві Без нія бі? др откр ген ай Ту 325 Зо 335 цу а тує бу Суб гу ма? Зоб Аший бує дія грец орга Аїа с врРОо де за 345 35 піч цу таб оїтТе баб оруУуб АТа губ бі бій бго Ага бів ско бів ма 355 360 3655
Туг тиг Сей оРго вго вк дру Ар ОСТ грец тб обу А5п бій У ет 370 375 зво іо тТнгоСсув сво омаї ув бі рРае тТук обо зве дез їі Аїа уді 1 355 за за 0 тер аб баг Ап оїу бій РКО бі АвпоАЧИ ту ЦУує ТНК тв рек Вер 405 зо щ15
Уаї їви двробак АБО біу Заковне вве о бец тує чекогуч ер о твк о Ууді 420 ях 50
Ар о цу5 чего Аг тТгтробій бів сі Аби о Уаї вне бегосСую зай уаї Мет
АЗ3х 40 445 ніж 5іш Аїа сей ні АбпоНів Тує тТве обій Ух бекоївиа бегогви час ахо 455 БО вго у губ 355 «М» 16 «11 4655 «їй» РЕТ (група захисної надикало транслокації «в1ї» штучна послідовність «гай»
«ййХж опис шнтучнеї йпослідовннєті: химерні веноквомальні античіла «МН» б
Мет пім Тр о їТє Тер ТтТе ее ген овне Тіє рей зве обі тТВРоАта біу 1 5 10 їв
Ууаї нія бек біп маі біп Без бій біп о зегодіу лів іч цем Аїа аг 20 Ка 30
Бгто біу діа баб уві рух ге бек Суз уз АЇа хат обіу Ту тТвкК вве 15 40 5 тТВигоАяр о Тук Ту Ї16 АБа їгрота! Куб бій Агсу тТвеоЄТУ бів обіу сво
Зї цо бів тго їі біу бїш зЗЇе туговго піу зеб обі ай ве тує Тук дай 5 70 75 ко бій їух Рйе сух біу ух Аа тТвгоїва тк оАівн Азрогув бебоЗег щег 85 0 25
Те АТа Туг мет бій іец баг чего сви ТНК озЗек біб Ав о Зеє дій Уа 300 105 п7о тує Рва Сух Аїд аку бек о Тує б1у дія РМНе лав тує їгроєїу іа бІУу
М 129 125
ТвВготТнРоїец отне уаї бер бвг Аа зве ТНР огує біу РгаобЗеє уді рве 130 115 140
Ро їем АЇа бго 5ек лес рух чає ТК чего біу біу тТАг о АТа дія ев 145 150 155 КЕ) с1у Суб сецомаї вуз Ар отТує вве овго біз бко Уві Те оуаі Яве тТга 165 170 17
Ав о бег бі Аїа фев ТНК о бег обіу ма! НіЗз їВг вне рка Аа Уві і ем 180 185 195 сій зак зебр біу сви ТУ бек оіей зако Зеє уві ха! твеомаї Бгсо чес 195 га НИ ек оба рев осотфу Тв обів те тує Ті суб Аби Уа) Ап нів кує рго 0 215 220 зег Аха ТВгову5 Уаї Ар бух мух ма! бів Рка вуз Бек бух Арі ух а 230 235 240 тТВгеоні5 о тТвРоОСух вВео вро Сух бго Аа вра бів сецобєв б1Уу шіу с РгОо ах 250 255 зак уаї вве рен вве вгорі ух Рг фу АБ тТнРорви ме ї1о 5ег 250 265 Бо
Ага те овго сім о уаі твгбоСух хваі Узі ма! Ахротаї Зає нія СТЮ вв
275 "80 285 вго їй маї бує пе Ах тро тує АТ АБО шіу мя! б Уді нізоАви 290 ах Зо
Аїа куб тик Суб РРО АгОо бів бі б1іп туб деп баб Тйг туго Ага ма!
ЗОа5 30 315 320 ма! бег уві цец ТВгомаї без нік бів АБО ТРробец о ахп біу бу зі 325 З 335
Туг був бух Дуб Уді бегоазй бух АТа цей вго Аїа вго їі сова Бу 340 45 50
ЖвРОохтТв баг оїуз ів суб біу біп Рго Ага бі ве бія а тує тве 355 зва 3655 цец вга Рго баг Ага Азрові сеш Тс руч Аб5побівп о УВ бебосео Те 370 375 Зо су бен уйі ух біу вп Тугорго вк Ар оїт1іе Ав Уві сіб тгробін 185 ха 395 00 хек дп Ф1у біпорРго б Аза Ахп туго огух ТВ отТВг о вго Бго уд! се 405 410 4315 дво чего Ав бі Бек гне випа реву тТук беєг бух ред тик Уві Аз Огух 428 25 430 ет аАга Тгробіп бів Єїу дп уві пе бек оСуз Чегоуві Мах ніх бу 435 440 445 дій гео ніз дха нія тує Тробій бух бак оїео Зеб сем обег орга б1у 450 455 450 вух 4855 «ха 17 «24їз 467 «аї2» РТ група захисної радикал транклакації) «213» Штучна постідбвнієть «Я «аййахМ (пис штучної послідовнаєтії химерні моноклональні антитіва «00 17 ме о1у Ткробек Су Те ї1ае бей вне гай жа! дів тк оАТа тве осі1у ї 5 10 15 маї ніх зек осів маї бій сей сій Бій Рго су АТ СТО їжа Уві Аго 5 зо
Вко біу Аіа Зег ма! суч сеу чек Ку вуз АЇй Беє БіУ Ту Твг вна я тТвгоеє тує тр о жів дза теромаї ух біп Агу вго зіу бій СТУ се 50 55 БО біо тер тів біу дха її туго вро чаг о Ажробар о туг ТВКоде тує яви 65 70 75 ко сіп бух вне вуз АзросУук АТа тк ої тб оУаТ Ар вух Зегобег Баг 5. що 95
ТВг оАїа Тут Мех бій без бегобек ко ТК век ста вер обег Ах У 100 105 Мо туго тТуг Сух ТНК ОАКО бек тер Агц ші Ап баб ве АвротТуєс тер і 15 120 125 сіп б1у тТвРОожвг овен о тВе маі бек о бег Аїв о Яве ТВгобух о б1іу Вго ев
ІЗ 155 140 чаї вне вго їец АТЯ ре бек зек орує зер отТвйг очЗев біу біу так АТа 145 150 135 150
Аїа їеу б1У Суб це маї уз АБр тує Рв РКО Сім во ма! ткР Уві 1655 170 177
Зег Тгр Аа яег сію АТа се о твг зеб о біу ат нія Те ее вго АїК 150 1855 юЮ чаіїеоз бій чЗегоЗег бім іо тує бак о вец зве загс уді Уді твге Уді 195 200 205 го Зен бер о чеб ів Б1у ТК обій ТВе отТук її Су аа Ууді деп ні 215 АЖ
Суб РгОо ек адап тг ру чаї дев о су5 мя чаї 513 РКО БУуб Чег Сук й БВ) А рез
Азробуз тТВгонівз тТВг бух вго Бгто Суз Рг Аїх во оц бе) бер о1у 245 23 РА п1іу вро Зекомаї вБе феї вве вго Рго рух го цух АхротТВг сви мат 2655 7 тів зако одко твеобгеа бір уві тВгб Суб мв) уві У Ахромаії Законів 7 ко 285 бій Ар ого Ям Ма) уз Ре Ай тиротує уаі авробім Уа бій ма йо 795 БІ) мі Ап АЇа ру ТНК осух го Ага 10 ОБ піп тує Ап чоб тВгс тує 305 зо ща їх
Ага Ма) маї зас ма? рей отиг ма! сен ня бій АВ о Тбровви дей б1у 325 330 їх іїуз бій тугоїу5 Сух буз ма! бег АбЗпоїуз лій Се) вко АЇв Бго ї1е 340 345 350 бі цух ТВР отІТе бег о іух аія рух Зіу бБіповго Абфобоіц вго біт Уві 355 350 365 тук тйг їв га вго чего АгЯ Ав обі Бей тнє бує Ав бій Уа! ЗВГ 370 375 15 вецй о твг Сух ан ма! зу5 сбіу БВе туго вра 5ег о Ахр її Аа маї бу 385 3ча 9 а
ТвРр бів чЗег аби біу сій Бго аім Аа оАаяй туго гух Тк отТвговго РКО 405 аа 315 уаї бек Ачр ак Ар о сіу 5ег вп РІВ Бей тує чего вух себ Те уд 420 475 430 дер ув ек Ага тктробіпосій б1іу Аа У вНЄ 5ек Су 5егомаї мет 435 440 А45 ні біц Аїя ів Ні Ай нів Туг Твгобій рух беб рен бек це бе 450 455 400
Рго у Гуз аб5 «ВМ 18 «211 456 «вах ВИТ група захисної радикал товнслакації) «13» Штучна послідовність «ах «И3» Опис штучнаї послідвненості: химерні монвзкленальні антитіла «00 18 мех іш тгр Ага їв вне без Ре їіє цеу Зеб б1у ТР о АТа ти ма ії 5 10 15 нія Ба" біп узі віп о сец оп бій ве обі РеО бів їеи маі су РКО бу Аїя зак оуа! ух Меж Зег Сує ух Аза бебоб1у Тук о тве вве те ах
Аби отукохуа! же шег о теромаї бу сій дсо твгобіу біт Б1Уу вео Бін
За а БО тер Ме бу с1ч Х1і6 тук овго С1у век ос1у бак отВготук тТук ат бїч ва 70 75 ЩО
Гу Рйпе ух бі Був Аза тВгосеу тег АТВ о АяВ вуз чего завод тв 85 чо 5
АтТа тує меж сіп ей бек бег осво ТйгочЗек Бі АБО ЗекК Аїа оман! Туг то 105 110 вве Су Аза аго Біу уаї баз осей Агу Аза Мет дяв тує тер осту віп 115 ро 125 ттРу тнговег Уарф т уаі хаб бего діа 5ег тТйгозуУх СТУ вго хе ома 130 135 140
Рпє ргб фен А1а РКО бек обетє цу5 чок отв бак осіу б1іу ТАК ОАТа А1У 145 ї5о 155 160 ей бу був гей ма) уз й5ротТуг ве вгз бі Рго мії ТАК Уві 5ав 165 170 175 тТгроАазп веб біУу АТя бе таб обер осі худі ні те вве о вго АЇЗ ха 1855 1230 їер бій баг бев пі рем о туг бебі о чеє заб уві Уаї Те Узі РКО 125 200 215
ЗекобБегозак рев спі Те сій тТбеотук тів сухо Ав отУаї Аа Ні тує 210 215 280 вго БегоАБи тн вуз ха! Ар овуз ух ма! шШім о вга цув бек Сузх Авр 225 230 235 зап
Ку Тс оніх Те сСух Р вгОо суч вро Аа гг он сечо Бей бу оту 245 250 255 го взекотуа)і ВНе гео вве Ве) Рго бух Рро бух ахВ ТВге сем мет ще 250 2655 о
Бег Аго ТВе его Ти маі ТвРоСує Ууаі Уаї маї Ар ма! его ні5 Ой
Ме 28 тях
АБрвовго бів Уаї у вве деп Тгротує уві Азробіу Уві бі УВІ нів 250 295 00 дви АТа ру ТВгогу5 РКО Аг біз бій бів отуг Аєп озог ТВ отуг Арго 05 310 315 Зо чаї Маї баб Уа! їез Тк Ома! сеу ні біп АхротТгвоцеу Ахп с1у рух 325 330 335 біц тує був Су ух уйі бег Ап Муб АТа свз его АТа вго 116 и 345 35
Був Тс тів Зекоруч Ав губ йіу іп око Аг бів вго обій та туг 355 360 365
Тег оїео вко Рго его АК Ар ост Бен їВг вух Ак дій ма Зак обец 370 375 380
ТвВе Су5 гей ма! губ (М рве Тук ркоа зак АБИ Т1е Аїа ха МоОтгр 85 330 335 що ав бек одбп б1у бій рго оіб АБпоАВАи туго цу ТВ оте бі РгО УВІ 405 410 415 іеи азробає Ав бу бегорре Ве гео Тук Бек осуз Кец ти уві Авр а80 425 430. їуа 5Зег Ага Тер бів біп біу Аж Уві Ре бек осух бек уд! с меї ніх 435 440 45 сіб Аїа ви Ні А5понія тує Твкобів бух баб орен беєб рев о беб го 450 5 450
СОУ Ку 485 «105 19 «їз яв «й1йх РЕЖ (трупа захисної радикал транслокації «?13» цЦітучна послідовність «ей «Фй3» спис штучної послідовнесті: химерні момоклональні актитіва «Ох 19 мет А5р тр оїїе тер тів меж сей ні цео овео дів Аїд АТ тиК ОБі1у
І а 10 15 ті бій бек осій маї Ні рев бій бій беб сі 5еб бій ве) Ага бек вБго с1у чего Зег Уа! Куб5 ва 5зег Су» Сух й Ве Ар обек о ма оо. 45 ве РРО Не Аїа туго меє бег о Тгрої1а АК бій уз Рго бі нт оіу о 55 по впе бів тТгроште б1у Азрої1Те реп бго бекоїів СТУ Аг Те Ів тТук 7 75 во бу сій Ку» вна ств Ар осув Аа твг сен АВ АТа Апротнт Уаі бег 85 ЕІ 95
Ах ТВг Аїд тує це бів ви дБ зей реа тб Зеб б Ар чек АТА 100 105 іо
Ії1е туго туго ос А1а Ага сім б у тує сту Аїа трРровне АТа туг 115 ТО 1535 тТеросіх бій Біу тик огви та! те оуаі бек дій А1а Зек о твнг вуз іх 130 135 То
Бго хаб ума)! Ре рго їв АТ Бго зб озег бух закотнк его су с1у 145 150 55 160
ЖКг о Аіа Аїя ів біу Суз ев мві Був Азр отує вва о веа сш рго ха ї155 ТВ 175
ТЕМА беготка Аа? ог Б1іУу АїЗ Мец тег о хет бу Маїс нів їв вва 155 155 що
Рг АТа ма) це бій 5ве собак бі Бей тує заг обо бееобег ба ха 195 РАЗ 205
Твг узі вго 5ег о 5ег заго оре сі те обста зве оту Бі бує дет млі 510 ів аа
Ази Ні. бух Рг бего АБИ Тйб осуз чаї вар бух ух Уді біб Бко ув 225 230 25 зай ваг су АВ ух ТВгОНТя ТВ Суб бба Ра суховто діа вто Боги 245 25 235 іа РУ ші вго ЗебоУДІ Ра рез ей вро Рг СУ бро бух АФО ТАг
Бо вх Ей іїіви Мах бів Зеб ага та ого Бій суді ївгосув я) УЗ ма! Ар Уві зх 280 з85
Зег нів бів др Бгто іо ма! руб вве Ап Тгротугє ма! ахробіх уві 290 235 Зо іш маї Ні5 деп Ата вух ТБ о Суб с вро АК обі сі ОТ туго АЙ БАК 305 31б 15 о
ТВботТугсАга Уа) УЖ Зегоуаі гей тв оУді сво нт сій Абротга ве 325 350 5 авпоріу ЖЖ бій туго су Суб сук УТ явгоАВа вує Дія Сем оба 18 що зах Зо веб ші піц суб ТВ о Хів его суз аїа бує ту Бій рго ака о Рг
Зх 350 зва зів: жа Тує Тк обец веб оБгОо БегоАКе Ач ОО Се твеогруз два бій 370 375 ЗО «Зі Жак веб те су пев узі бух ім РН тує вчу бек вв її КІВ 385 390 395 яю
Уві біб тер бін его оазп бі біпобко Фі аби дя тує бух ТВ ОТВЕ
Я05 410 315 ча Бго Уа! фен'аер чег АБВобБІУ зе РВа Ва ім Ту ва ух ей 420 425 430
ТиеоУді Ар уз бек о ако теробів осів о1у Аза УВІ ВНе бек Су бег 415 Я З уві мекв нів сій діях веб нів яп Мія тує таб 5 ух вк овей деЕ
50 455 4050 їец бек го біу Гуз «Ме 20 хй1їїі» я «їй» РЕТ (група захисної радикая товнолокації «13 Щтучна песпідовність ка2йх «ййї» Опис штучнеї послідовності; химерні момокленальні антиттлв. «КН о мек бій 5ег бі" тТвеоб1ій Уві вец Меї его ген оїбеу бе тер ожаї 5ег 1 5 іб 15 біу те бух біу Аа їі Узі мех тТвае бій 5еєб Бго чего бек оре тВг а й за
Ууаі ТВгоАія бі сів вуз уаї ТВг Ме бер Су уз чет хаб біп бер
Ка 40 аа цец бе дбп о 5ег біх АБли біп Кук А5лотуг рей ТК отгОо Ту біп бій 50 5 йо мух вго пі бій вго Рго бух рес о вей жів тує ТероАЇд его ТВгоАгоа 55 та Та Що січ бек обіу узі рго АзроАгба вве тс оБіу чего біу бек осіу тйг Ар 53 щи з5 епе тик оїво тТве те бог обет уаї бій Ав сої Ав осв лід У! Тук й 105 Зо туго Сув біп Ай Ахротук баг тТукобко їез ївг вне біу вій біу Тв їх 125
Гуз мбеи бі ев бух ага тТвгоУді АЇВ Аа вро его Уа) вве о їїв вне 130 135 130
Вго пга 5ег АБО БІБ біп оре вух чего бБіу ТВ оАіа бегоуУуаї маї Суб і45 ї5оа 155 160 іец цей Аж Азп ов Туг Рго Агу біб Аа уз ува! біп тгробуєх ма 165 170 175
АЗроАБп АТа сец бій зегобіу дей озег сій біз его ма! тне отв сій 150 185 150
АВ жег бух Ар ошекг Твг оту его рай бек баб ТвВкофец тв оре чо 135 200 205 їуч АЇВ Азротує сіро гу ні уз ма! Туг діа сух аб маї тНгоніз 210 215 КВ;
атп обі» ей бак хеє вго ма! твеокух чек вне Аза Акад бі сім Су 2725 23 235 гАЙ «21йх 21 «ііз 235 «212» РТ Струпа захисної йЗвдикал транслокації) «2135 Штучна послідоввість
ЖиТОх «223» Опис штучної послідовності: химерні мононлональні антитіла ка» хі
Ммек ні Рне біа Уді бІп о Тів Ре беговбе їеб цей тів бек АТа Зег ї З 1 15 чаї ліє меї бер оавер е1У бій їі Уа? реє тб бій б5ебоРго Ала їв 20 ва зо
Меї бег АЇз Заг орго сію бів бух Ма отв" Хі ТвгосСує беє лів кат 35 А 45 баг обек уйі Зег тТук Меї ніх ТгроеНе сія біпобух РгО бі Твгобег ща 55 б
Рго Сух бец Тгроїіа Тує беє тб ЗегоА5п без Аїа беб біу хді вго 65 70 їх яо
Аїа дго РмМе 5ег о с1у Зег біу Бегосіу тик обег Тук баг цей тве дів 55 чо зе
Зег Ага мек Бій Аїа б1цоАБроАТВ АТа тВг тує тТукє Сух бій обій Агу 00 125 110 зег Бек Тук вВге рго тиговве біу оту Бі Твгобуз бен бів її ву 120 125
Ага так оуяі діз Аза вро бегоуа| Ре тів вве вро го ес Ах Ти 138 135 140 бій сени вух звк о Фіу тик о Аза его ома) уві Су меу ем дп айви вйР 145 50 ї55 ібо тук вВго АКа біз Аа уч уві сій тТеробу5 ха)! Ахр АБ АТВ гео їй 1655 170 175 ек біу Ап баб бій бій 5егоуа! тР осі бів АБ озЗекогуч Ачрощес 180 185 190
ТР отуг аб цец бЗеговбег ТВК ве) ТНК ово его суз Аа дв тус Бо 135 ОО 2 бух Ні бух уві Тут А1з Сух бі ді Тнг нів бій бфУу во бек чес "ій ті5 ий вго ма1ї таг рук Зак оеве АБп АКа бі бід о сСух 230 235
«М ий «ії 234 «12» ВЕтТ (трупа захисної вВадикал транслокації) «213 Штучна послідовність «вВОх «кої» Опис штучної послідовності: химерні моноклональні вититіла «АН: 22 мех біч вне бів твйгобіп Уді рве ма! Бе Ууді во без тб вед бер 1 5 10 15
Зіу ді А«робім або Те Улі Ме таб обі бек бів вух рве Мефб Заг 20 Ка КО тТигоБаг уді біу Ар оАКо Уді яаг рів твгоСу5 Бу АТд о 5ег о бій Ах 35 КУ 5
Уа! Ага ТвгоАїз хі Аза тгіз туго біб бій о гбуз вго й1у 61 бек о вго 50 З Б ух АЇВ їжу їв туго цей А1іВ Зег Ап Аго нів Тег осіу Ма! во Ар 65 70 23 Же
Ага вне ївгобіу Бек обіу бегобіу ТВгоАхровйе ТВгокец Таб тів щег 85 о 35
Ап уаї 1 чес сій Ар орец АТ Ар отТуг вве о сСух сем бій нів Тер 3180 105 по
Ах туго Вго цец ТВНе Ре біу діу біу тТВгобух сем бій їів бує Ага 115 120 155
Тег омаї АЇВ АТа о бко 5агома1ї вне їі вве о вко обго бак оахр сів ст 135 140 івм ух Заг обсіу Тег оАів Заг оуді маї Су«є бен овбвей А5ап доп вне Тут 145 155 з 160
РгГО Аго бій АЇа уз узі бів Ткробуз УЗ! АБроАха АЇВ Бей бій бег 155 170 175 біу АбБп Зеє бів бі чего оуді їй біб бій Ар о Зег о їу5 АБрробеє Твр 18о 185 що
Хуг Жег цен бер о бег ТВг обем Те Бео бег о бух АЇй АВ тує ЄЇН ув 135 200 205 нів це ма! тує АТа Суб сій УЮ Твгеоніх бій біу ев хек хег го 240 215 20
Уаї ТВгоіух Зег вна Ап АгО Біу 010 сух 225 230 «10» 23
«ох 20 «кій: ВНТ (група захисної, радикал тиавнсояскації) «213» штучна песлідовкість «ее» «Ра3» (тис штучної послідовності: химерні моноклональні дититіяд «00» 23
Ммек о Ахр зег сій дів сбіп мафї без о мекб сец рей о їко без Тгромаї бе 1 5 Ні 15 соіУу тт Су 0іУ Аероїів маф меї его бій чеє га бак яв вам АВ га 7 за
Уві бег маї бі біц уз мві тн оМек хег о сСув бух вк обег бій ваг
Кі Зо 45
Сен іео Тує Заг озек Ач біп осях Ап отує рео Аа тра тує іа сій 5 що ішж5 рго біу ій Заг оБгОо рух сео зуеи о жіЄ Туб Ткродід Зв ТВг о АгО п ТО 7 5 атїа бак обіу заї вто АБО древа твгобіУ хвб біу чего бі Те АЗИ що зх ве тТипгорви тТвг їі бек озеаб Ууді рух Ав біб АБр ген АВ о Уді тує і 105 11 тТук Су сій 61 туго Тугб баб Тує вро іву Тк оРВе б1у А1Я біу твг 3115 150 125 куж їм піц вен суб дк тик ома! АЇв Аїд орг) чає мні вна тіє РБе тю 135 140 вго вто чего олер біб біп оре бує Зак о оіУ ТНе Аїа Бак оУуді Уав сСух 145 130 15 161 рей оіец АшВ Ап Ве о Туг РгО Ага сіц Аїа бук Уді Оп ТРИ ву» Уві 1655 170 175
Азв АЗИ Аїа івоа щі баг осіу Ачп зве бій бін Зек о уді тво бін бій і18а 185 1
Авробег цу А5ВроБаг Те тує Бак їв 5ак ог ТВеовенотвг о семознау 125 МТ й
Ми АЇїа два тує бів кух ні ух Узі тує АЇВ осСує сін Уді тТвгоНіх 210 215 20
Оів б1у фев ек баб вко худі Вк обу его Бе Ап Ак Ж Бр Ку 725 230 235 ІА «20 24 «й11з 340 «гії» рВТ група захисної задикди транслокації)
«13 штучна песлідояність «Р: «й бпиє штУчнаї послідовності: химерні моноклональні антитіла «ННІ» 24 мех бін зве обі тТве оба за? ів мекозек їжи о ївр Ве Тер оуаї бек 1 З 10 15 пі ТВгоСузх с0іу Азрої1е уУуз| Меї так бій бок о Бго бек ожек о цец Ве зо ма1ї ТВг Аїа 1 піц їух Уа! ТНК Мет Заг сСуз ув бек бек дій бек мБец овец Аза бег біу АБ біп о ує ап о Тук Мем ТВ о Твротук бів сій
Бо муз бго біу біп его Рго бух се) сей їі тує Тер оаіяз ес Тр о АКо 55 70 а о бів зек біу Уаї Рго Ар оАга вВйе ївВгобіу пев обіу зако осі тТвК Ар
З й; ЗУ
На твгосем те те 5есозег ма! біб Аїд бів Азробем азів охУаї тек зо 105 116 тус Су ЇЙ АБИ Ар оТуг Заг оТуг бра вва тйгб о вле біу 5еб біу ТВ 115 а 125 суб бец біз їїа фу АКЯ твгоУДІіІ АТЯ діа вро еко оУуді вва різ РКе 130 135 140 біз вго бег Ар ої бій ів гу зекосіу тб Аїд зеко уві уд! був 145 ї50 155 ї6О і ви АБа АБ Ре туго ргОо АКОобів Аа су уві бій терору Уві 165 170 175 азроаел Аїа їв біп бег біу аа Звбобіп осі) Зеб уві тк обід сій 1850 185 їмо
АВ заг о їУух Ар ошет Тк оТуг Зег оре бак о Зес тк Бе тТвВг вам бог 155 ро 05 мух аЇв Ар отТук біб мух нів бух уйі Туг ліз Су» бі маі Таб Ні 210 Ж ги сій Біу сви заг об5ебовго Ууді ТВгогу5 бег Рв Ай Аго біу біб сСу5 285 230 215 ей «Рі» 25 ка1ї» 235 «вій ВТ (група захисної, радикал транслокації) «а3» Штучна послідовність «Радх
«гйї пис штучНОЇ песвідовнокті: химерні меноваснальні антитійа «00» 5 меї дор ощек біз Аа бій омуаі сен ТТЄ сен осСец сви се) їв оУуаї Зве 1 З 10 15 сіУу тТвВгосСух біу АЗр о їі Уаї маї бегбобій Зегбовго зек его бен Аїд о 25 30 чаї бек оадіа біу біб ух Мді тб оМеї бек Су» Гу его Заг обій 5ег їх 40 45
Кен цей ап Заг АгЯ ТВгоАга сук ай ТУ бай АЇТа тго тує б1п сій
ЗО 55 Бо цу5 вка біу віп бе о вго ех рер осей жів тує тгроАТа ек тик Аго 05 7а 75 о бів чего біу Уві Бко Ар оАгОо РАе ТВгобіу ЗегоБіУ бебойіу ТіК АЗо 85 ча Зх ве тТВгоїец Тве Хі бек обег ма! піп АЇїя біз або дез Аа ма) тує
Мо 105 по
Тук Ку» Суб Бій бак тує Ахп о іео тує Твб РМ: біу б1іу БІУ ТАК оїух 115 120 125 бей обі же їх Ага твгоУці Аз Аза вго Заг оуді БВа о вфів віе рРго о 135 140
Рго 5зег о Ахробій біп бево бух Зег о біу ТК о Аїд баг ожві ді Су грец 145 150 155 160
КеЦц АЗП ОАЗп Ре Туг Рг Агофім Аій бух маї йій Теросув ма) А5р 1655 у 175 деп АТа без біп бег біу Ап оЗес бів бін Заг омуаї їйг сб 1 Ар 1850 185 ю баг обу АБО бе? Твг о тує баб орец о баеговеє тб ово тТвВгорев его гм 195 220 205 дід Ав о тТуУк біч Куз ні вуз а! Туг о лаін Суз бій хв) вне ні дій 210 215 223 ім ей озвгошеє Бго уві Тйгобубє 5ег вве Аба Ага біу сти Су» 225 230 Бах «210» 26 хз 2 «2і2» РТ Сбсруйпв звзхисвнотирадикал транслокації) кКії3з штучна послідовність «ах кає» бпнс штучнаї послідовності: химерні моноклональні антитіла «аййх 725
Мех АБр ЗБго Бій АТ БІЙ УВІ сво Меї бай офіви о гбво сем тер ові ек 1 З 30 ІЗ сіу те сук бі Ажо зів маї мес его обій зи вро яве як реє Аа 20 25 30 чаї зак уді ім о ув ма ТВг оМеї бек о сСує ук бас оба бій зас 3 З 45 іч ви Тут хего5ег Аби бів вув'явий Ту уез діа тт тує бій бів 5 5
Бу вго сі бій бек Бгз груз ву ею іє Тук о тсроАТа бег ТВе АгО те Кк щі бі веб бі Узі Рго Азр о Агу вВе Те Біу ее оїу бек дій Рг дЯр 85 ца 25 рн от ее ТвВгоїів ес зегс уді ОТ дія бію деросви Аїд дер тує тою 103 о ні сух біж бів ЗТУ Тук баг о Тук Рг тує ТИР Овйе Єту біу Бу тв
ВЕНУ 129 її вує мер бін ї3в'їух ар тис маф Аїя дів свго звгожмал вве їЛе вве ї30 135 140 вгаоргОо Бер ар ій бів огбец вух бер обі ТВе АТ Заг о ущі Уві Сук 145 АБО ї55 1650
Бей їецп ази ака ве тує вка ага сі АЛ СУК УЖ Та стер о гу ма 165 170 5 зв АВ а1а ївц сів Забудова 1 Од бег охаї те су він 150 155 30
Ах» авг гу АБО Бек тиготує Берорвн веб 5ег твг о вем ТК ОБе) Веб 195 и 205 муб аа АБО Тур сім рух ніх Бу5 Ма! ТУб Аа бух он ма! тб ніз
ТК 215 220 зЗій бБіу цен бек бегорго Ууді табору» чего РВе ази ака піу ба Сух 2У5 23 а гай «АЦЕ 27 «ії. вд «Фіг РЕТ (тупа зЗакисної йадекай транказнаціїі «її» гучна послідовні єть «ей «ЯЗ. ОПИС штучні послідовності: жимейті маноклондльні антитіл «ЗНух 57
Ммек ахр зег біп Аіз стій маї Кевомеж без бен ей ей тгроУдт заг ї У Що 15 сб1іу тк осСух біу Азр оті Уа) Мет бЗегобій 5еровго явгоЗег о їец АЇВ о 25 КТ
УДІ ЗйК Уа) бі бі вуб мн ТнгомМеї его Су5 рух заг озег стй хат 35 40 45 їви ем Ту 5ег о Зег Аза бій Бу АЗп оту цер АЇВ Тгротує щ1й бів
Бо іїУу5 рго біу піп Бег вго цу5 ву йеб ї115 Туг ТК Аїх баб ТНК Ага
Бі 7 а що бі) бек обіу Ууаї вго АвроАга ве отпє бі бвг обіу 5егобіу тТвкК о а5р 5 Зі З ви тик фер тве о ї1е баб озер оуа)| їв АЇа бій Абротеу Аа Ууаї Туг 100 їп05 110
Туг Суб іп пій Ту тТук беготуг вго іео тТвВсб РБвобБіу аїа бі тТБе 115 120 155
Вуз вве сід ем СУБ Ага твгома|ї діа лід вгоа о5аероужі вве ї1е вБе 130 135 140 вго вВго 5Зег Аяробію біповем бух чек обіу тнгоАаїа явгоуаї ма) Сух 145 їх 155 1655 їв іїец Ач Ап рве о тУк Бго Аг обій АТа фу Уді сів тро огух Уді 155 170 175
Азр Ап А1з рез бій Звег о Ббіу А5й Заг оБів бід бег о чав отг біз о1п 180 185 1 леробеаргогбув Азробек ТК о Тук его рен обаробек ТВГ овен ТНК офецу бе 135 а ще іїу5 АВ Ав о тук БІ Гуз нів рух Уді Туг дід Сух бін уді їйконі
КЕ) 215 во сі сіу ей бак бергоРКгОо хар тн ру» щек вне Аа ага пік ів сСух 235 233 235 2438 «10» 8 «ії» 238 «212» ВВТ (група захисєнотирадикал транслокації «21Їх штучна послідовністю «их «иа» Опис втучної послідовності: хвмерні монокаональні дититіла «00 8 має біо Зекойій тат офео уаї Бе тів бек тік рем о гжО Тгроїец тує
У 5 10 15
ОіУ А1З АБО Обіу Ап їі Уві меї Тк обій зак овго руз бог Мет Заг
Мет бег Уа! сіу Бі Ага уаї твгоцев ТВб оСух бух а его піц дей т 40 45
Уа Уаї тТВе туго Ууді зегоїкр оту біт бій уз Рго сід бія хаб его 35 Во
Гувівм цен тів Ту бБіу Аїа бек Аза Агу тує ТВгоЄЇїу маф вго Ав ца 7а й до ака ве пи біуУу яве о ру зако Аа тик АВ вне тйг обево тт Ів бек зо 35
Хегома! уз АТа сів Авровец АТя Узі тТукотук сухо бій Бій Тук тує 100 305 цо авг Ту вра ей тег оРнв РУ АТа біу ТК оБух Бей бів се) уз Ака 115 щ120 12
ТвгоуУаї АТЗ АТА ВгО бег оуаї ве Т16 рве бро вБго Зек авр сін сів 130 135 140 їви рух бег біу ТНК оАїа Зеб Уаф о маї Су вен рев Ази АЗаА пе тує 1 ї50 155. 150
Ргро де січ Аа су ма! сій тер обує Уа Аяродхп Аза сво ій 5ес 155 170 175 сім деп оЗег о біпобіс его Ууді ТВ бій бів ар обек бух др о беготне 150 185 зо туг баг о гем ек зек тег осв) тТВг бе бег овув АТа АБО тує би рух 195 20й КБ
МНІ5 ух ма! ТУК АТа Су біц ма! ТНгоНіз сій бфу ре Звк Звг во юю 215 Р кі тб оїув бак вне Ав Ака біу бі суб яв 3 «Їх 29 «2312» ВВТ (група захиснот/радикал транслокації) «аї3ЗУ штучна послідовність «вах «ФаЗ» Опис штУчнОЇї послідовнесті: трансляція й продукту «ах З бів оуат сій мед бій біп зак пі Азз бів бен омек бух Бго біу дід ії і) 10 15 зЗег о уаї їу« Ї1Е зей сСуз у АЇВ таг с1у тує Тс оВНе Заг Явротує 20 75 за тер жів біч Ткроув) бу5 оп Ага рго віу нія біу бе біб тер о їів 35 ЗО 45 сіу бів її4 гей вро с(їу Зако осіу бак отТВг о Ача Туг Ап 1 ру пе 55 бо іу5 сіу вуб дід тпг вве тнг АЇВ Ар о ТВг о хег о бегодеп тик дія туг ба ТО 75 а
Меї біп бен обег Заг огву твгобзего сій АЗО бег лів Уа Ту Тук Сух 55 Зо 5
Аа агу тс Авротує вс три еп АЇд тує Тгробіу бів сіу ТВб обов
КТ 135 110
УВІ тВгоУаї зег Аа 315 «302 0 «21їх 18 «їй» ВЕтТ (група захисної радинал трансловації) «й1їх штучна послідовність «а» «ВЗ» пис штучної послідовнасєті:транеслячія ЯР продукту «ННіх За сій їіе сій ва Уві бій бекосіу вго сім таб рук вух вро сіу бій 1 5 10 15
Твгома! суб їв зеє Суб ув АТа Зег обі Тує Те ОРЕ Тве Ах Туг о 25 З сік мет А5потТгроУді Суб сів Ага ко біу У БіУу сво їх тТкр мех біу тер тів аа тТвг оди ТВгобіу сіб вВго Тк тує діва сім сбім вре за 5 БО) бух біУ АгЯ віх Аа вве бек обец бів тТвб о5ег Аїа баб Тве АЇЯ тує га 75 о іга бів їі АЗпоА5поіви губ Аза бір АЗротнг Аїд тТАг о Тук Ре бух що зо 5
Аіз Аго іви аіу вне сіу ав АЇва Мет Ахротує тТгродіу бій б1у ТВе 100 105 ЦО
Зегоуа! Те оуві 5ег Зв 11 «из 3 «211 415 «хиїаз вЕТ (група захисної радикая транслокації «213» штучна кіл ідокністе «их
«Вей» ОйИиЄ штУуянОоїт пОослІДОВНОСТІІТринелиція ПЛе продукту «З00х 3 бій уза бів сео бій біп озек 01у АТа бів вес дій дку вро шім Аїд 1 і: 10 35 ек тА Бук їви бек Сув гу Аа засобі ТУЮ тик ВНе тв аЗротук 2 25 хо туг дів Ап тгтв Уві кузов ага твгосіу дій бі певи біз їко 31 35 Кові Як бій біз іє тує о вко біу беб біу Ай ТК отук ТУК ах Біб Кух ВН зі 15 БО ух ім вух АЇВ Трої тТве АЇЗ АЗо бух его Беб бек Таб дід тує в 2 75 ща неї бій бецозеє ес ву Тбеб 5еб бів ар обер аАзїв о Уді їук рне Сух 55 що ах аїз Ага зак отує біу Аіа вне азоту тро ді ота жіуУ ТВ твЕ ев
ЦО 305 й тТВг уві Жегобег 315 «ех З «АВМ А «тій вятТ (група захиснезраднинзя травслекаціїі «їх штучна послідовність
ЕК
«вай ОлиЄ штучної Беслідебвності: транесявція ПЛ продукту «НН
Чіп Уі біт сви сія бій овго оіу вів бій бви ха! йко бго СТУ АТа
Х 5 зо їх зегомаї уз фей Зевсу ув Аїд Зек Біу тТУуК ТЕ вне тТнНеоЗеє тує о 25 БНО)
Тгрожів Ах тро ма! вух бівоаго вго біковій бік рей пів тво їїа
Зх Ст, 45 піу дп оті туговга звгодер о бегє Ту БОГ оАхап ТУР АКА сів БУХ РНВ за ЗИ йо уз Ах дух аАТа тв" вот ві дер гу ре ок о беє ТВ АТ те 55 70 з ЩО мех сів ібн бек ек око тв охев бін Ар бек АТА УВІ Тує Тут Су за п
ЖВке аку ес тгроаАгу біу дяй Бак бів яв о тук Тгропіу Фів оту тв 100 10» мо
ТВгорже їйкоуві беб 5ес «із 13 -«й1їз 115 «212» ЕТ сгрува захисної, радикал транслокації «213» штучна псідовність «аа «Й23х Опис штучної йпослідовнеасті:трансяяція ПАР продукту «400» 3 іп уві 41іа без бій бій звк обі го біб веб Уві буд го біу Аа н. 5 10 15 зав уві вує мекозаг бух м Аїя его біу туг ТР ОРВА ТВг о Аяротув 20 25 зо
Уа тів бек тера! уз біб Ага те О01у бів сіу емо бім терор 35 30 45 сіу бій їіТ6 Туг о Рго біу Зеб обіу бвготТВе туго Туг Аха боб їхув5 вве 50 55 60 ув ЗІУ ух Аїа тТвгоїео тв Аа азроіує аг обек Аа їВе ОАїВ тує бо 70 75 КВ) мет бБіп сан обЗагк бег ген тк о зег о Оіц Ав озакоАїа Уа ТУугб рве сСух 85 З З5
Аїв ага біу маї йен іец аАгЯ аїа Ммекоаяр туго Тер обі бій біу тик 100 ї1а5 ло зако оуаї те ові бег баг 115 «210» 34 «В1і1з 130 «212» РЕТ (група захисної, радикал транслокації «її штучна послідовність ках «223з Фпиє птучнНОЇ послідовності:трансвнуція Лю продукту «ах соів ха! нія цец бів бів 5егобїу Заг ойпіц греч дру оЗвговго сіу хат 1 5 10 15 чего маї бух речі зве Су ГУ Ар оРве АЗо бег обі) маї вве вйго РНе 20 их 30 дід ТУР Мет Заг Тер оїіє аг бій Буб Рго єіу Ні б1іу вве бів Тке
КІ 30 45 їТе йіУу Ар їі без Рго Зеб їі біу АгО те ї1128 Туг діу оц іх 6
Ре іш Абробух ав о твгБобеой Ар оАЇВ АЗо тТвгомні б5вб Ач ТВг Аїд
70 75 ко туго бем бін ев дзий 5аеб осей твг бек сі дер о зег дія Тіфв туго Туг 55 чо з
Суб АД АК сіУу сіб біу туго біу Аза тро оеке лів тує ткр о офу бій 100 105 що
Оу Твгоїбецз о Уді ївг ув! 5ек Аа 115 120 «210: 35 кй1їз 113 «213» вЕТ (група захесноїирадикал транслокації) «213» ШТУЧНА послідовність «й» «223» Опис штучної послідовності: трансляція ПА продукту «4005 35
Азр о ї1тє ма)! меї Тигб осій зеко обро беробпек гцєм тТвгома!ї Те Аїа ох 1 5 10 15 бів вбу« маї тигоМет его бу» ру его озЗег о біп зак орец їв дей 5ег
Зіу Азп бій груз Ап отуг цей тВг отеротує сія бів суб вро біу іп 3 чо 45 го вго Буб рез о фец Ті тує тТгродід бек о ТвкБ оАгЯ бів бек осі ма що
Ро АхроАко пе отит обіу 5еб обіуУ его біу ТвгбоАвровНе тб о бецд тег 05 70 75 дО їі бвег о зЗег ува! бій Аів біо Ахроїен Аїа маї Туг Туг о Суз 01 дай 5 МІЙ Зх
АВ тр век тує ргОо Бей ївковйе офУу Аї о біу Тож раб бін вен 100 105 ла
Гу «210 36 «2115 106 «Рі?» ВТ СЄсрупа захисної радикал транслокації «21ї5 штучна послідовніств «220» «23 пис втучнОої пОосліІДОВНОСТі: трансляція пле продукту «400 36 іп хів маї цен о тВгосія зек орг АТа їїа меї ек дія 5еб о рео Ту 1 5 10 15 іш о буз ма1і Те хів тТВгоСж5 чего Аїд бек ожог баг уві Боб Тук Має 20 25 за нів тгровне сій бій суб вко сі тТвВбочевх его куб ве тРротіє тує 15 ЗО 45 «аг тк о хак абп сво Аїв бек обіу Уа! Бей атй Ако вБе чек о біу Заг 55 БО біжу бек б1у тег баг тугожак Єви тТагОЇТВ ек Агро мес сій діа обі
Ба 750 75 Во яра АВ тТВг туго Тугс суб сій бів го бек ог Ту вте вВРОСТЬе 85 Зо 5 вне віу іу Бі тТвгобув і бі жів уз 100 105 «хх 37 «115 07 «аї2» Вт єгрупа звхиснеївВадикал транслокації) «Її» втузна послідовність «ле иа пис штучної послідОовнасті: трансляція ПЛР пудУКТУ «МНЕ ОХ дар їв мат меж їнк обіпобек Бій су Бе Мекожес ТБ бек оуаї Оу 1 5 10 15
Аза АгО Уві бег тів тВг сут вул вія хег бій ах Уві Аг тйпг Аа
МІУ: 25 30 за! Аїа Тгтротує бів біл овує БгообіУ ід Зав о рго ух Аза гео Ще тує Бей Аія жег Аза ага ні твбобіу уаі вро Ар о АБО ве отвт сту о 55 в хе біу баг обіу те о Аяровіа Таб рей тНЄ тіє его дз уві бій зет 65 70 У5 во іш Азробву АТЖ Аяротук НЄ бух сво біб ні Тер оАбАи Тукобго мен 85 І Зх
Тео вне біу шіу бі ТВг о буз це біо їв вух 100. Ме ев ЗВ хіх 13 «їй РЕТ (група захисноз радикал трамсвоканії) «КІЗ» Штучна лослідевність «тех кйеїз пис штучної пноглідовнеєтіс трансляція ПЛР тродукту «00 х. ЗВ.
АБр ої маї меї Зерг сій бегорго баг озер цец ія маї бегоуаї Фу
У 5 10 15 бів уз аії ТВгоОмМеу 5аг Су ку Баг одек Бін Зк о реу їец о ТукК БЕ 2 25 БІ; кег о ачп бів уз деп отут во діа тТеротує ів біл огбув вра оціу бій
Я 45 об Рг бух Цой Бе ЖІ тує тео АЛВ ЗБК ОТВгОАса Бір як о сіу ха 50 55 БО
Рг рагу вне тво бТу зеб кшіу зак Бі тТВео А вве ТвК о бевц о твге
БУ 7 Я я тів 5Зек бек оуаї бух Ав сі Абв'сей АТа ха) тТук Тук Суб ФО він 45 чо 5 тує гук зак оту вч вен о їйг вве оБІУ аідж аіїу ТВ о рув век ве 105 15 113
Му «їх 33 хиїїх 13 «ей» ВКТ сгрупа захисної радикал транслокації «1» Штучна послідовність ких «ЯЗ» йис штучнеї послідовності: трансляція плЛе продукту «ЯОйх 38 ахр її маї мек тк бій Зег о Вго ве обегоїже їйг ма! тво лів бу 1ї 5 то ї5 бів уз Уді тТпРОМеЖХ Чек гУу« рух ок зе Бій ог гемо ец ка ек
З З
Зі АБ сія МУу5 Аа їЖкК рено твк їро тую сів сіб рук вго оту їв 35 рРгОсРКа УЮ зероїви їіє тує Тер оаїв зак отв овке сн озер 61у ма 58 35 їй
РГО АБО АБО вне ївгосіу зак обофу зе бі; тв ода еБе твк оре ТВ 5 7 5 Ко їїа чес бак уві бій дія бін аз сей АТа уд туг тує Су віп дай 5 за 5
Ащо) ТК 5еготує вгоОо РВЕ тВе вне ві зЗеб бу їтвкоБух мец є1и лів з та5 лій ух «405 Я «аг І кжїй» вит Струпа захисноїурадикал трансяокаці «155 штучна поса ідовнієть «гедх ка2йх Опис штучЗНЕЙ песпідовностістравсявція ПЛВ продуєту «00» Я0 лвр.оїів Уа меї зве шій бер оргосчеє баг оре) АЇВ хві Беболія щ1у
А 5 Ів ка бій уз Уді тб ме баг Суб суб его 5егобів лег ви гео Ал Зак а 25 За
АгЕ ОТВК Ака СУЯ АБ тик реу діа тт тує Єїп ата бує вгОосБІУ СТВ 35 Я: 5 зерорко ух сенсівної1ів тує тгроаія бек Те АБО бів Зек ТУ ув!
Кі; 55 50 ргосАБр ото вне тТИиг Оу бессбту зве бу ТБ Ажв вне т о Бео тТве 65 78 75 во ї1е чек бек ма! біп АТа бій Ачв ово АТя омаї тук туго осув руб с1я 85 За а зекотУє дей гео тує ВК бно Бі БЮ ТУ тв ух рено Ті ук ще 105 Мо «Війх 81 «вії І «12» ВКї (група захисної радикал транслокації «ії» Штучна послідовність кеедх «йййх ОЙНС штучна пюклідовност трансляція пл вродуУнту «щюз Я1 даротіів Ууді меж бег сій зекорко Зекобак ваг АТа Уа хек омці б1у 3 5 40 5 сів вух уді їй Меї Чет бух руз бег бек Бій Зегоіец о вец отут ее
Кі) 25 о его Ахп Є! вуз дей туго іа АТЯ Тер оту 16 шів буд овго бі 16 35 40 45 бар вро Бук вд Бен жів тує їгроАЇВ веб оте ага СІ бек О1у уві 5о у по вго ар оаго вв тн б1іу хек Бі Зеровіа тв Аяр вна В Сейотве 70 7 80 хтів 5ег шег мі Бій Аа держ ред АТЯ аБротує нів Ст БіУ «ій 5 ЗО ее
СУ тує фа" Ту вго Тукотвк ве сту оіх єїу ту ру» вен остц хів 1по ЕХ 118 мух «0 42 «М 113 «йї2х РАТ (трупи захисної вадиная транслокації «23» штучна пеаслідовність «а «ийам пис штучної песпідовностістранесянянцтя ПЛ. продукту «ННІ: а
АБО ої1е Уді мех бегосійп 5ек о Бго бек Зег фев ява Уві хеє а) б1У ї 5 Іо ї5 іч уз Уаі тВгомек г оСух Бу ес 5 бів зве бе Сем тує зе га Ко Зп
Жабо дхп сій Куб Аза о тТуУЄ ви Аа То Ту бів біб зіує Вко слу бій
ЗО й ве вро пуб ей вве іє їук ТервоАТЕ 5єг ТР оАгО с вес УЖ що ї5 БО его ахройго Ре таб овіу зекобіу хег обу ТР оаБо Ве же вен тА
Бо о У ке 118 бег бек хаї бух АТЯ біц яв цем АТ Уві тук о тТук бух бів бів вх о 5 ту тує бек тує вго ши отит вне Біу АВ сі те беж рем бій ре
МО 105 це ух киі0»: Я «23» 307 хіх РЕТ (група захисної; радикааз транслокації к?Іі3З» Штучна послідовність «ай» «КО» пис штУчнаї послідовна тістрансвзяція пов придуєту «ВУ. 43 дян тів Ууаії мМеб тТпРоБІй бековго ру бек о Меї ак омМеєровеагоуві сту ї 5 їй 15
Сі оАга Мат їВк о сеа Тс осує був аа 5ег обі зп оУуві Мі ТВ ОтТув є на За
Уві беєотев тує Бій бі уз Кто біб бів бек вго губ осец бец жів 35 й ЕІ
Ту іу вів дер Аа АБ оту тв сім маі вгоб а5рв ака вве те 1у
БО
Бег о біу бек А18 ТВг о АВОо вне Тр обец ту 16 бебс бек Ма! Ух АЇТй
65 ТО 75 хо
Зі азр бан АЇв Уві тує тук сСу5 Бій оБій Тут Тут арк лу рей сви яв до 5
Тнг вп сіу ктів бі. ТВг вух бра я бен оїже що 105 «МЕ й ха1їз 15 «із РВТ (група захисне, радикал трвислокації) «ВІЗ» штучна посяїлайнєть «ва ий ЕПпітай «В0Ойх «4 меї ар ія тт чес те бів дароіємн Тур Ай Ай РКО Фа таРг
Ї 5 10 15 «30» аа «Ії 15 хід» РЕ Сгрупа захисної, радикал трансвахації) «Я» штучна пося лених «ах «ве ЕпЯТаВ «нт 45 зег їВгобій АВ вен тТуг Ай ав орКо Уві ТНК Віа хі вне ААУ 4 5 10 15 «вій» че чаї» 15 кій ВВ Серупа захисної радикая транслокації «Ух штучна посптдовність «ЕТО» «ЯМ ЕпіТОН
Ох зе тук Авпоазй го Уяі ТВг ОА Узі БОБ охо туго бій оіу ец 1 5 ІВ 15 «їй У «ії 15 «212з ВТ (групи захисної, радикал транспокаціїЗ хиїЇї» штучна пОослЛІДОМІН СТЬ сей» хай ЕТітТай «Ой» 47
Рг Уа! ТВгоАта уд! Ре ляп тує бів біУ ем тгройко бег сСуз 1 п 10 їз хе 8 «жі» 15 «ій ВИТ їпрупа захисної овадикат твимслокації «ре Вітучнй послідовність «Й «ийам Кп той
«00» 45 ма ва Або Туг біт біу ен тро оаго бе був хі ага бід чес ї 5 та 15 «2105 49 хатім 5 «йїй» КІ (гпува захиснаїурадикай тванелеюцу і каї1їЯ» ШтУчНна песлідовністів «ий це «Ай» втіТтОоВ «НУ я сті Біу еп тво ага его Суб ха! Аа біч век беб бію вне СтТВе 1 З 130 рх ках: 5 ееіїх 15 «й вит сгожпа захисної радикал трансвокаціїі иа штучна послідовність «232 «ах. БАТРОЙ «00» ЗО
Аку Зак Сук уаї Ага сім бек ояек сту вве тв ОТО сУух Аку сту ї 5 юю 15 «їй 5 «а 24 «ій дик «І» дтучна песлідоннІєть «ох «лаїх плігонуклоеотид
Ох. я ядачасстст ооссткаєсо агро 3 «210» 55 «Аїїз -б «виз ДНК «иї35 штучна послідовність «ий «ал бліконуквестяй «Ні Б скадвайЕка чЕсСаосВося ТС 26 «ка УЖ «РМ 25 хаїс» ДНК «213» штучна послідовність хаб сей3» Олігонуклаевотид «ОМ 3 чозакватет свостозста. ас ї5 «81» 584 хаиїїх 5 «їй» ДНЕ
«йІї» штучна послідовність «ах «ей3» батрсенуУваеттий, «а» 54 ттссатткно став КОВАЄ 25

Claims (7)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Застосування антитіла, яке зв'язується з СІ ОМ18.2 для лікування раку підшлункової залози, яке характеризується тим, що ракові клітини підшлункової залози експресують СІ ОМ18.2, де вказане застосування передбачає введення пацієнтові (ї) антитіла, і (ії) засобу, який стабілізує або посилює експресію СІ ОМ18.2, де (а) антитіло зв'язується з СІОМ18.2 і опосередковує знищення клітин, що експресують СІГОМ18.2, де антитіло містить важкий ланцюг антитіла, що містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІО МО: 32, і легкий ланцюг антитіла, що містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІО МО: 39, і (Б) засіб, вибраний з групи, що складається з гемцитабіну, його проліків або їх солей.
2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що експресія СІ ОМ18.2 відбувається на клітинній поверхні ракових клітин.
3. Застосування за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що введення засобу, який стабілізує або посилює експресію СІ ОМ18.2, також включає додатковий засіб, який індукує зупинку клітинного циклу або нагромадження клітин в одній або декількох фазах клітинного циклу, бажано в одній або декількох фазах клітинного циклу, відмінних від фази 1, краще у фазі 2 і/або фазі 5.
4. Застосування за будь-яким з пп. 1-3, яке відрізняється тим, що введення засобу, який стабілізує або посилює експресію СІ ОМ18.2, також включає додатковий засіб, вибраний із групи, яка складається з аналогів нуклеозидів, сполук платини, аналогів камптотецину, таксанів, їх форм проліків, солей і комбінацій.
5. Застосування за будь-яким з пп. 1-4, яке відрізняється тим, що введення засобу, який стабілізує або посилює експресію СІ ОМ18.2, також включає додатковий засіб, вибраний із групи, яка складається із 5-фторурацилу, оксаліплатину, іринотекану, паклітакселю, пов'язаного з альбуміном паклітакселю, їх форм проліків, солей і комбінацій.
6. Застосування за будь-яким з пп. 1-5, яке відрізняється тим, що введення засобу, який стабілізує або посилює експресію СІ ОМ18.2, також включає додатково засіб, який індукує імуногенну загибель клітин.
7. Застосування за п. 6, яке відрізняється тим, що засіб, який індукує імуногенну загибель клітин, включає оксаліплатин.
8. Застосування за будь-яким з пп. 1-7, яке відрізняється тим, що застосування передбачає введення комбінації з гемцитабіну й оксаліплатину, комбінації з гемцитабіну й цисплатину, комбінації з гемцитабіну й карбоплатину або комбінації з оксаліплатину, 5-фторурацилу або його форм проліків і іринотекану.
9. Застосування за будь-яким з пп. 1-8, яке відрізняється тим, що застосування передбачає введення фолінової кислоти, оксаліплатину, 5-фторурацилу або його форм проліків і іринотекану.
10. Застосування за будь-яким з пп.1-9, яке відрізняється тим, що важкий ланцюг антитіла, представлений ЗЕО ІЮ МО: 32, містить амінокислотну послідовність, представлену БЕО ІЮ МО: 17, і легкий ланцюг антитіла, представлений 5ЕБЕО ІО МО: 39, містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО: 24.
11. Застосування за будь-яким з пп. 1-11, яке відрізняється тим, що застосування додатково включає введення засобу, що стимулює Т-клітини уб, причому Т-клітини уб бажано представлені Т-клітинами УуЗмба2, і вказаний засіб, який уб стимулює Т-клітини уб, переважно представлений бісфосфонатом і прийнятніше представлений азотовмісним бісфосфонатом (амінобісфосфонатом).
12. Застосування за п. 11, яке відрізняється тим, що засіб, який стимулює Т-клітини уб, вибирається із групи, яка складається із золедронової кислоти, клодронової кислоти, ібандронової кислоти, памідронової кислоти, ризедронової кислоти, мінодронової кислоти, олпадронової кислоти, алендронової кислоти, інкадронової кислоти та їх солей.
13. Застосування за будь-яким з пп. 11-12, яке відрізняється тим, що засіб, який стимулює Т- клітини уб, уводиться в комбінації з інтерлейкіном-2.
14. Застосування за будь-яким з пп. 1-13, яке відрізняється тим, що антитіло опосередковує знищення клітин за одним або декількома із-поміж опосередкованого комплементзалежною цитотоксичністю (СОС) лізису, опосередкованого антитілозалежною клітинною цитотоксичністю (АрСС) лізису, індукції апоптозу й інгібування проліферації.
15. Застосування за будь-яким з пп. 1-14, яке відрізняється тим, що антитіло вибране із групи, яка складається з (ї) антитіла, виробленого й/або одержаного із клону, депонованого під номером доступу ОБМ АСС2810, (ії) антитіла, яке являє собою химеризовану або гуманізовану форму антитіла за п. (і), (ії) антитіла, яке має специфічність антитіла за п. (1), і (м) антитіла, що містить антигензв'язувальну частину або антигензв'язувальний сайт, зокрема варіабельну область антитіла за п. (ї) та антитіла, яке бажано має специфічність, за п. (1).
16. Застосування за будь-яким з пп. 1-15, яке відрізняється тим, що застосування передбачає введення антитіла у дозі аж до 1000 мг/м: або в дозі від З00 до 600 мг/м.
17. Застосування за будь-яким з пп. 1-16, яке відрізняється тим, що рак підшлункової залози включає первинний рак, рак на пізніх стадіях або метастатичний рак або їх комбінації типу комбінації первинного раку й метастатичного раку підшлункової залози.
18. Застосування за п. 17, яке відрізняється тим, що метастатичний рак включає метастази в лімфатичних вузлах, яєчниках, печінці або легенів або їх комбінації.
19. Застосування за будь-яким з пп. 1-18, яке відрізняється тим, що рак підшлункової залози включає рак проток підшлункової залози.
20. Застосування за будь-яким з пп. 1-19, яке відрізняється тим, що рак підшлункової залози включає аденокарциному або карциному або їх комбінації.
21. Застосування за будь-яким з пп. 1-20, яке відрізняється тим, що рак підшлункової залози включає аденокарциному проток, слизувату аденокарциному, нейроендокринну карциному або ацинозно-клітинну карциному або їх комбінації.
22. Застосування за будь-яким з пп. 1-21, яке відрізняється тим, що рак підшлункової залози частково або повністю не піддається лікуванню гемцитабіном типу монотерапії гемцитабіном.
23. Застосування за будь-яким з пп. 1-22, яке відрізняється тим, що профілактика раку Зо підшлункової залози включає запобігання рецидиву рака підшлункової залози.
24. Застосування за будь-яким з пп. 1-23, яке відрізняється тим, що пацієнт переніс операцію із приводу раку підшлункової залози.
25. Застосування за будь-яким з пп. 1-24, яке відрізняється тим, що пацієнт має передракові ураження підшлункової залози, зокрема передракові ураження підшлункової залози, що включають виникнення злоякісних гістологічних змін у протоках підшлункової залози.
вив. чаду Н Клаудинї шпуном БГЕДОО ух Й ПейтМетию ОБУ 00000 Ха й одьтоєл айс Мітлкох (ЗВ, Ко у 17 и ЛУвАЕ Кол я ху я ж р тек зво 0/7 ак ро: к-т всю) БЕЛіВазої я шо с в сит, й р дит ЗИВСТУМИДНМИ Прометер БЕТА 0 і: ос вх сі Й сп-на - У 0000 4Я5НаМ УЗ апа й и 7 вчАО РА ер в зі БВ ав 13-пкляудюніЯ.2)- Бластичиди» З 0 вною Ук ЗЗР по р: тк З і вв ч ч а ш-щ . і Я ау Мтмостор ція вк спот хе й й й ква" ши Ше че чт й й Сдввнзвраі ЗТ й " тку, Ат квУти рі о Й ВЖУ-р . вис »м Фіг 1 тод) Га Хі вя олов Пра ний - З а зр част Е онх " « хо Зі й а Зк ще оо. З КУЗ й ж. ІК З ОК а 8 5 За З СХ ОХ І КЗ МОЖЕ З ке ПКУ хх с ЕК о. КОХ З о. В В " Й . тоо " й ре і с - й та ч й с о о. част бронх і о .-
ік. їх но о ху З УК ЩО о. М дя ка т. - лм: г о В с о Ах с веон ГУ о З с а о ЗХ и ЕХ КК М СЕ Зх же Я дя С З 5 ОХ ОК с о ОЙ хе В с ТУ СХ о. КЕБВа З її. о а сах щ пло : пон с що З ай й Же ІЗ х в с. о. днк нн. у т с ХК сх Ж с -, я ЯК . Й З З ЕЕ хх ОКХ Я о се поз бай у о. 5 і яко с о же о о : Фі ше о о. ХХ о. а о . пек в ІС 2 й в : С КОХ с С С М ХХВх ох о Ох ЗО І
0 о. с п о. о а 5 Со о о. ОКУ с о БО о о. о. о є ш ме п о п. . . о з І с ОО З І Зх ох о ЗАКО -
о. . о с ОВ Ох я о с с о. дак ще оо хх о. СЕ І ІК Зх З о З о. ЗУ З ХХХ о МК С х о хе ОХ Сх ОЗ ок, ВО Ме ХУ о с. Не сах ке СКУ о. зх о о. МКК ОХ щЕ . ох до ЯЗ Зх Ех . Ва У МОХ ха Ох Хо МК о. С У ЗК с ЕХ СХ ХХ охо о. о ЗЄ З КЕ о З о. З КЗ СК х В. Бе ж Ко іх . КВ щ-. КУ ще З х щКХ ТУ ХО ще а В ХК З о З Кт ОО ЗВ ев МК Б З КО х о СКК МЕ в с КОЗУ п. п. їй о За са ОХ о М ПОЗ о КЗ 0 Б о: ОО сх Ах СК ХУ о ща КЕ с ака ВЕ ОЗ о. ВОК Зх ОО хх ЗК ї що о УМО ох КОХ хе о й що ОАЕ З х ОУБХ ОКХ що Оея ш- ско Ех хх о СО ЗКУ Зк що о . і Б ; с п. 1 о що . па 0. й х Зх - Сех ЗХ Ж В З УКХ У Ке М о ня АТ УКХ Ух З щ і о ОО п. У о 3 За У века МН о. КЕ Я: о х 0. З ЕК ПОВ Кок: МУ | БК зх 5 я Ом 5 о. г КК СХ ЗО КАХ ОХ ще ее о В о ло Ок о УЖ хе св МАК ЗОЗ ЗО ХЕ А ех я СУ ок 1 Ос що же хх Зх и ОКХ ОК ВОЗ З . УЗ Я ж ах хх в Ж КЕ З КВ Х о о М 6. ши о. . о - : о. Го ЗХ Же С ХХ АХ Ух ОКХ Ян й СО С У сах що ЩЕ ХУ ДУ хо х она, С с КО п Се с т 5 сх о п х хх КУ ж Зх КО х со о ОК Х У Зх Ух Я КЗ о с о тех що о о У п. о. ще М що З п. ХО о Зх КЕ: п о о | Б ? п. ях с ще ОК їх х Со х х р п - З У х КО ХХ У Ко о. АХ З ЗК ОК | о пе ке 0.
Е о. . о п 5 жу ж х ХУ и. З 35 с ОО УК У ЗО КО що М ЩЕ М МО хонй о СОУ З зх З о. ОХ о. й : х, о о г о с 1 по Бо Ме пох о. Ох хх Бе х 1. пиде п я п с о 5 їв В, 5 ща ПУ о. 5 У ЗХ З ТВ п 0 же Щ- я ОВУ СУ о. п. З 0 З її 0 Бе пив
: о. с . . о в жо п ТЕ в ще шо Я . п а с : о. о. о 5 їй о в З ОВО Ж ЗО АК д о о. в пт ПТ о ПВ - що х Ко В о. о. и н Б п. в с . г БО о с ще пе ще о МОХ ж о. о. п з що поко ен г Як їх ОХ х що ХХ о 3 ОХ п Ба їх За Ох й» МК зх ПЕК ох М п». п х БУ іх, сх о М. со ПЕ пк ХХ во С г 0! в Ж ще КУ З ЗО Со ще о КО Мих За ЛК т о ях а Ко ОХ п - Не Ох Зх ВОЗ УКХ ПО о и п Е З ох Шк ПІВ. їх ЗУ: о Тх . ХК о п МЕ о МУ о й НО : ІВ! ря ПК ж п 0 З СУК ЗУ ще с хКЯ ІЕ Но МЕ, се й о п і : : Х : п і пло ПП ї г п г і х а о п і ке її п и: : й оо с ЗЕ у, же я ХХ У ККЗ Кт их МОЗ нон | п о. Е о о ОЙ -к шт о. що є я ве ока ток Ки ше ск ЗУ ше УНК як о Бах МОХ : т Кн сх соя Я ОК ТУЯ п о ВХ Ел о БІ Ай ВО п пи З Те п ви т й й ІЛю У ї дк я Ж. І І З 6 ДИМ ох Ж» То «ЕЛ КПІ Ми ПЕ вх ко 7 и сен й не Іл п шк о . пот о Вк що Й м с. і шу о. ап пл Ох ПО Нк ша Зх ТІ КМ о ве ШЕ й Х х З Во я: ВИ" Й а З Ух Й Я; Я по х Б З і 4 Щ С ШІ ше В ши
1005 а ваьА зе : ге жав дввакака Ікажну х х 80 З завкьаьа К З : ве же що ОО як вАвАв З ; щ : вив жк ж ; 5 ; х: х 5 ; Е ; е я ж Би ; й З З со як ь У зежнжкиакфккнжктенююютєкюткю вані екектюесютенжхек оте юдівекюеєех З г г Інтенсивність сигналу ки Б
Фіг. 5 КК КК ОК В КК КК ВК В В я я нн о УХА М КК КІ НМ І НН ЗОН с о о хх п ОО В В ММ В ММ ММ Є СА З ОМ М В Я ПО ОБ В Б о КО в В УВО М п ЗО ен НН М В ЗК ОКО ОА В ЕК Во ОО КЕ ОКУ ОК М М и ОО о ПЕК ОО М ВОК ЗК ОО В ВО Пн о о и І ОВ ОО М ВЕ ОК М В МО ММК М М ММ М 5 а о а в ОО М о ЗМО у УМХ ОО ОК ОХ
3. о ОО в В КК В ОМ ОВ Б ох ЗКУ а пи а о В п с ЩО ЗОМ М І МО КУМ и ПОВ х х ДК Ох МОВ ЕВ ОО 5 ше о. ще о. З ши и М М: ВОМ СУ А Ох ис дик д
Фіг. В сту хе 1005 в Єлях І: і вевева - » - і ВО ее 5 : В З ж ! о ва Ку і в 0 з Ф м 5 РУ і 5 |: за а сх В ж і 5 ва -г Ж і їх Е: Еї р - » ж і З ж з -- |: ве мк 5 А теж ж ВОЮ Ж елилю ЯК т чув пкт чк З ти дк дксве тю ТАЖ жов ЧЕ ЗК жі лю пк дж З ЖД Чи зх ж ж му люк сю ; з 2 в. я ек як Інтенсмвиєть сигналу Фіг 7 яе 100 2 его де ; с Я лети х і вжовюосе Ж ї х З к 80 зо восе - я М і м і і оОжа» х у й х а 6505 г і щ. ; ва зо хх ї ро у ря й гу аа | І Ге - у - В ХЕ : в ФІ |: їй а ; У З г-3 як г ї з Дкосмеюєтт оєжтя ог жижь ок жу дк аб ж» де зоек ок мою, ек ою ок вк ех панни МІЙ : з : ав о о в ! бо . З шк ер. інтансивністі сигналу
Фіг. 8 соками ВИМОННХ Кн НАМ. п ЦК КОХ ОК ОКУ МК КК ХК Ко в УВУ НК їх 7 МОМ КК п о МК шо, ОК х МО КЕ Мих КІ СК ЩО Ах ОО КН ух ОО п а МЕ ЗК В ОМ и М М Ио А КК КК Ж ОМ В в. СИ ОО я У хх ПО ПЕН я о ОМ а КК В М З З я ШОН ЗУ і ПОМ 5-Х ІК ММК ОККО ОКХ с М в КСВ зо снмннннн Бон с у ин УМО - СОМ АТ ВИК УХ хх ММ МН МО М А ОО ОБО СО ЗМО У Бо З. В І МО ЗК Бе ВК НК ЗХ ви ОН во в ща о ОО о ОО В ПО и ЗУ ще КВК і. ва ве о ВН В ОК В КО во сн нм у а и МИ М В КИ ж Е НТ о. З І зе 7 ОМ ОМ ЕК хх Е Зх ОМ М ММ же х. У З с щі с . ПО І ОХ ОТО З де и в БЕН Мем ни КЕ ПН МО де с ПУХУ ОК Му ОМ МО ж МУК ОКО сш о іс ПО ОК У ОХ . ОО Є БО о с ОО о КО В І ОО В х ВО ОО УА МО Х и ОО в НЕ ПОН Фіг З а по Є : їх ; ЩО Пеоовинна пухлина : і шк і СТЕ Метастази ка ; ДНУ зання - 35 ВО і ГНЕ: ДО і ! В ПИТИ Е ; т-- ОТТИНИ х - |: ПИ їх х ПКТ ї т |; ПЕНЯ ; д 30 ПЕС - ; ШИ й Го ; ДО ; Я ; ПЕН х - | ПИИШЕИИД ї пн и ее я ше я Інтенсивність ситна Фіг 10 ТУКА ХУ Ах З МК 5 ОМ ОО І М М М А Я УК О ОКО МВ М М І ММ М М М Я с с Ох МО М М М І М М М М В ВО ОК ООН В, БО УМ ОУМОМ ВОМ МОМ ОМ ОККО ЗМ МОМ ПЕВ І МОМ М ОХ М М КО ЦИМИ КК МІК ХХ ОКУ УЖ ВМО М КО и ОО ПОМ М ОО 6. З МІЕМОММ нн МІ В М М МО ОМ В ОХ ЗО ОМ ДИКІ В хо МКК КК ОМ МОУ ОО ЗМ ОХ ОО М М ОХ А ОК ОМ НА М І ВО М ХО ОО У а ММ В ЛКК Е ХО ВВ КК Он В у: КУ НВ ВХ Е КК КК КК КК Ка ООН КВК ОО ВХ ОО ХОМ хх ххх КК на нах І ЗМК с і МИИХ КК У: ОО о в В 5 ОО МО и МОМ КЕ о ОО я Е о Є Е ОО З ОКО В КК М М и МОМ М М ОБО ОН КК МО ЗОМ о МО ОМ М ОМ МНН ММ М А М І МОМ М В М В ОІООІОО М ОМ М І ПП М М М М ОБО М ІІІ І МІ І ОК, КО КО ОО І М М ПМ М В М ОО о ММ ХХ ОН Е ОО я ООН ОХ ОО о М М І М МН І МІ Є М М М ММ М І М І, ПО М Є З
3. о о ОО КК х МО М и КВ М НН М М МОН М М и МИ НА А М М М В М МЕ, МО А М М М а ОО М В о и в БО М В ЕК МАВ КК ОО М МВ НН и М ТЕ ОХ УК о ОХ ОО М М ПО М М М І М І М М В о КЕ КК КК КК Мк М М А М В В М В МК , НН М М ММ М М М КК КВН КК М С ЗХ В В В ОХ ХХ ЗО УМ В ОО СОКІВ ХХ УВК ОКО ОО МНН 5 ОХ КК КК КО ХМК В ММ ХХ ЗО о, ОО по п. КК ОКО щей ше ОК З х ОО ОМ ММ М МН ММ ІМ М М М У ОХ ОХ і: МОМ М ОКУ ОМ БК о КК Зх с В М МОМ ОХ ХО ОККО Сх ОВ ОК я щ чзрвовиниа дет ухр за ж кислі ; прдариз ї Первинна Метастази в печінці Метастази у гі 5 дл т пімфатичних вузпах Фіг 1 тах
1.ох1ох І: СМ захо КЗ г є т Н Ух Я Ж ошео мохом о | ! шо З | З 5 о . щ | ії: о- хо пенні пехняхнжуюхутикняхко ник ще Кф енеєтннннснь Ді Я. Ж шо. ї ЖІ Ко ї г щ- іх : ; . о . й . по ІК З | Ох НЕ В ! О Б охо І. ЕЕ. о | : В ОФозїох1о ! . . ШІ 1. и НК ве ке ви Бк КУ Е КО і г іо ГІ ШІ СБК похо Я о вині, З яж ук туп ОК Ножі же: з ; щш РоБОобоКУрно БЕБІ рудих хвою шо Зо ж в В Ов, 8х опи Жов ЗШ м є ністю ее ЗВ й чо щи шо всшвОовашм Ос ки и шижа З мМ ще я Сех ех о шах пі Фіг 172 се їхня с дірки В. тка 5 Я хх ях 8 -е ох воеюоч т шо оту ко 5 С хх В. 0 Ж 1 кВ ви МИ . З сх запив 55 В. Сам щ ща щі" ве 85 щ Тако с М З Е я і ща Ной дек п - 5 З ш 2. г ж шив жннви ЩО с Е й щ-- "ЧЕ с. хів Ве ще се ї- я ща ВО заг Не Х Км Я ВВ В ку ак ша 5 5 ок чдеЕ дО Ва Ех Р З ща Б 5 ня ІВЕ В Х 5 Ф й я Б Б Не 4 ши вро у К "но ВО жов Го» ЩЕ с ППП он зво пу 5 бло ше Ш Ш шШИшШи и шнни ш ІВ не ен Ш ж ше ОО З блінюї 3: що явна іш ж ши ше: ва
З д.а -Я ДЗ ж ЕДЩНЕ не Женик Ввеик Веиик Е555 ЗБ шов 5 дв в УМ ми й т - г ї ко ово х Ракова рення Б Коен вна Вадебч 04 За Мерасеє Рами й МЕ УТ -МТ х й ж
ФІГ. 12 (продовження)
чо й Я бо з то ї- Х от т ї з ве вче ее 558 юлей е Й кт ре о Я У Ба «ПИ 59Уа- ооо ово вх дво ЕвЕсЕссггобавідвовВ в чк каса ск поевухихХхохоосооьо живи Гх я т продов ояи ВХ Я прот авяв виг зві: Зх денна ШИ у «нки шшн и ОП а вок я ШУ я ра не Шах щі й не НН.
З їй Зсув им ВК се ВЕ Кі ія З Ти щ Ж о о еВ 8? ую лох ОН В а вн пове ВИ НН с а ДАК кош ! ав види пічне дв і1,зїх в; звивин зн ннциевКкЬВАИВХ їни а є 5 ГІ 5 Є на 5 Ба ре тот Фо ж м т 8 У ви В в ж З 2 б» 5 чт т ж а З З сти ж 5 Ше з НЕ З НК - Мк п й в а хх 5 в ж хх хх ж 5 ах пон: ше ше ше ше ж и шк В У ШЕ жк і й я Я шк ше - щі ж Б ж тек ще я ж шк ШЕ Ще ще З ве дже У 5 Б Б Ж в ; ані йшесься вста сов я З ШЕ Я СС сйннвьнннй і і як як й -к ДеЕТИН пав я х хх Б.Я « З. х в » 18 М щ- п 1 15 зо ЗЕ 16 їй хх те Фи 13
АК, В с ен я є Я ї Ї ; нь ! " т « - ; : й д і Е - м Ї шк М, ' хіх д вола зинавния Й Е ни и с тк х | 7 | -Жк : Гн з 7 ах. 7 х - С їм є. «4 щ в я т й » ШЕ: - х я їй м. я Ма х і | г в ! Ся Га М ще чо в й 7 їх і ст : у Кк . Ії - Я у гав а Кк 5 є : т дин Фіг. 14 . ВЕ ВО ПО и МО я щ с 000000 шЕШ с НІ ОЯЗЇСЇЇдЇдЇдЇдЇ7Ї Ведннмвнунвнювня нене ою ння: понос вен і: І. ї- ОК я вк ОО ОО ВО КК ОО МО ва опо, пплпллПППППІШШОШШШШЩШФЄЄПФЄЄШЦШШЛІЛШІШФІШШШШЦШШШШТЛЛШШЦШФШЦОЛШІШПШФПШШШПШШФЦШШШШПІІШОШЯЙ ца у о оо о ДНО в о оо ВООНКН ДОНО 5 НОВ Вк ЗОБОВ в В В ВХ БВ В в В в в ОКО ВК В В В в я 53 що
33. Фіг 15
Єзгивав85 РапсОо5 04 КкАтТО-НІ д В с « | щ- щ ! Гі ж я -ч - т й і я : в я ж ї: 7 пло в -а х ща і : 3 -х й Е Во стик ї ше ! ЕФ) в мли Е КЕ . ПЕК У ! : - й й. ж й в о ; ї та : я ТУ «в пл з т : - : я і є, з Я і. д хх В є ж і 16 1МтТ-лінії ючтин і ге ж жо Е н ск й ха З р чи я й ся ой м . і н м ли я: кЯКк шен 3, З с Какно; я ш Я пЕшив сет й З як х і що ЕЕ З ! т КО : п. ОО їз | А Я ; | к- о с па їх дин ия ; | ; ; ! со - Соонкоек | ї В ПЕВ ще же ВВ а я шщ--ши ї дно м
Фіг. 16 (продовження
МОБ со о о. і. вай с КВ з ж : ес Б В ЗОВ ях ШК СО ККУ ХІМ ОХ о че МКК ХХ ПМК с ЕС її. М ї їх с о ЕЕ я . - я ж ВЕК с шо с с т скен о. с ОКХ КК ох КОС кекх ОКХ - М З: с с ШЕ в. р п с б о. ЖЕ МУ созсвзво 1 с ВОНО 23 ЗЕ ТОКМАК, ЗК г же г с с за с КО МОСК ХУ о о. ек оокя х 0. х с ЕК, ЕЕ о с 0 о. о а. ЗО ММ У с ї КЕ а с СОМ ОО КО МКК То КК ОН С Ме Є Я КОКО я ЗО ОВ У пе ВО ЗК ОО ОО о. А ОО ПЕК ОХ ях ОО З що о о тх КОХ ЕКО КОХ ХК ОО У ОХ ОК НК с о с М: ОО с Я с : Е й Во ОО с ЗВ с пор У НК КО ХК с 5 ПЕК СХ ХВ с о. пор з ОКО У ЗХ КК УМ ОК М А ОХ с се о І КО с ОО ОВУ п. КО о: о. ЕЕ ще ОЗ с с ЗКУ с ЗВ х с я с ж ОО ОКО ща ОО о. ЖК: с в. її | г ММК КО Б с КО 0 с С джкевам ТЕ с оо. ОК ОКУ 3, я КО о. гі ВО ХХ ОО Же ох ОКХ и їх ОК й ХМ с с с СЯ о. КК ох . ах ЗХ МЕЖ. с око с ЗА УЖ пе МЕ о. с. ОО Я шо с У я ОО ОО х ММ КК Х ПОКИ І КОХ ЛИХ ще ШИ ОО оо: ОО Зо ОКУ ХХ КОНЯ ЗОМ ХХХ г Смс с я с З шо : с о с З с с ВО: ; Я с ще АВ ххх ОО ЗМ СКОЯ с ЗХ ОК ХК же ХЕ ОК КОВО КУ А о.
с . с с ї КК ХК ОВ х і. о с З с с с о А ев КОХ Х КОКО ПЕК о ПУ МК ЗО КК З ОКУ ТЯ с ОО ХК ОО с ях с о с Ех ОО . З Я с с г ВК о. : с Х с х с С свавовв: жк: ОК с о о | її ВК МОЯ ОО о ОКО МИМО МИ ХИМК ОЗ ОО КОКОКо ОХ У п о . С с КОН З о. КК с ! . . с з ти не с. ХО ХЕ ЕК ОК ек с а Кк тя : с Ко КМ ОХ КОНЯ г КЗ СХ СКК С УК ОХ 5 5 У КО «5 Ох дО ОК сов УКВ ОК ЩЕ "кове І 0 о . о с п. я МАК ОО ЗДІЙ З 5. МКК УКХ ХХХ ОО МКУ ЗК ХХ З Я Ес 5 пе вх . 1 ВО ХХ Уа ХУ -- ОХ З м МОКІЯ Я СКК КК З МК ОХ КОХ Я МК НО ЗК й : о Зх о. хх МУ ОО ХК хх ОХ хо ОККО КВК СОЯ Е У З ПО ЕК ЗО КК ЗХ ах ХО е г . . | - п. . . о У сх ша ОХ м Ж ОХ ХК. Кк КО У с 0 ЗО о ЗЕ о ОН о о ОКА З с ООН МК У с. г с с х с п хх Б КК х С с с с що х: У ПМ ех Ух ХК ОХ КО КОХ ЗХ СКК ХХ ЗХ п п ще ОХ ОО З УМА СМ УКХ ОС ЗК КАК КУ ПК я ХК с ОКХ ЯК КК КО ЗО Ж: ХХХ УЖЕ ОХ хо ОКХ в с З с о о. . в х Ох КОХ ОХ о З ОВ КОХ СУЯ
- о. с ЗХ КК о 0 о е КЕ ХХХ КК ОХ МЕ ККУ МК Б: с п. о. . о ОБ СХ КОХ З ОХ КО ОО щи х х СКК В КК ХОСОЗУ де ОК ех фФ 1, ОК с ЕК М КА 5 з «в шо. йо Я з За й . х и ХУ В дих хе Б хе В З : й КУ ДН ДИВ . ХО яеВА у питх, с о ЗЕ Б ЗК 5 ж той р шо же ї Й св ка ай м Ки у як я ОО ОК З / КА 5 хх я: і ОК Ко Ки ще ох КЕ ОК: хе КО ОХ ЗКУ жо дах ЗНУ, ХЕ ХУ що ОЗ З З Ма М ОЖУК Я ЗМК ех НА Ве ЕХОК Я о КЗ СЕ уаеек мч ХХ Пен ї: й і ши МО ОМ. ти ВО во ВОК КИ Кон У Б ко й Я ЗКУ З Й ММ Кі . ї Ши В ОО т й . ж Го. в ІК в; що й КО и КУ « » с С хе КК до . І Б ОКА шко хе ен Я Й | й ще У Я ТОЖ СЕ х я м - : ак з Я - - : «В і ее Ох щ о Й В ж пк В ОЗ Й а с кХ МЕЗО ХО ОК Ку ЗА і я. х хе ОБ Око - М КК хай МО С й п ОО Мо ЕК ЗУ СОИМНУМ КУ М у г ШО ОХ ХО ї ще КК ОКО ЕКОН 5 реа і Мн МО 5 ОО ох «ОХ до У Я о х -Х а а ЗОН М Я з З КЗ ОО жо МК х ХК ХО ОК хе о: В в й і о. я "В ООН ОА х : і ЕВ ОХ УКХ. Ух Є ОЗ і шо ЩО й 4 о а . Ь. У ЗМО у КОХ М У о Ь во я і о. І її. , ! п ОКЕАН КО ЗИ КУ . З о: УС у ЗХ Ж ; Я М в. в ; х Оу З й У Ко В й М ; СУМ я З У З Фіг 15 і зооче - і жеечу. Я ВВ к З ; я еВ. З | 5 ЗОМ п зи і , ш ; й Ж. ї (Як ик Я Я Вик Я ще. З Я ім ТЯ Зк дн Як Я ще ; ше КЕ а пи ее Ва : - Я КЗ і ЩЕ Ян дк Як Ще ох щк де Кк ще де В Ж ща ; хе Бі Я 5-5 ЯНЕ ЯН ЯК ЯК Як ЯК ЯК х в Ж о. ОКО : Ме І І Ка КЕ і
Же . с - і йк Горе Же З ще Як Ж Ж я и: яв Єеттутуух Я ши І КВК сонет я Б що Й й хаВшжЖиЕкЕие Лі боже ЖУК МО ЖК о «ЕЕ Дві хат ХВ ВЕД ЖЕО сеї Як сла я У Ех и лом КО У КАК Я ОН Й НВ МК ЕК : ок КК ВВ ВВ ДО КН ОН ОМ М М ВО ЗК ОК ОН и п ОК В а о В ОВ ОВК КН НН ОК КН ВЕ: ,Оу ОК Я ОХ КК «В о КН Х ВХ ПУ КВ ПА ОК КК
З п. ВК Я а Ух ХЕ Вей в З КО ОВ п ВЕК НК КК У ОМ КО В Ма с п КВ: ВВ г ВО ми КК Ка ще КК и В НК ОК М ПЕНЯ МКК В цк . Ж Кк МК 5 ох о іх В КК ВК ОО и ММ ОО КК КК Но с а о В ВСУ 5 ОКХ ОО я ОКУНЯ ЕН ЕВ я В ЕХ ОО С ПОП НК В ОК В В В Я ОК В ОВ УК ВИН ПО: МУ Б о ОКА ПОЕМУ КН Вк хх КАХ Б. УС КК КК ОМ ОВ о у М ОК КК 0 ОО о В ОО я ПИВ ЗКНЯ о КОМ т КК ВВ ОКХ МКУ Х ОО - і Шин а о Он СУДИНИ КККХ СОМ ОК КО НА еВ ОО КВ ОХ пам се Б а он НН о ЕЕ ПИ КК КК МКК В в й ПАЙ Я ПММ ЕТ ККУ УМ : ОО ПН ОК М КВ о ВВ КІ ЕК ВК УИКИНЮя ПК ЗК В о о ВО в ВО ме и Ох с п МК З Ох дн МИ ПоКоНо Х Б: ХО АК Ми ОХ КК ИН ПІ я о. о ЗЕ ох ОК НН Б я ОО ММ ох ОКО ПО СОУ М ВО КК с -х шо ХО З ВО пов КОТОМ 5. г ОКО МОХ ОКО Ж В М ОО В х хх ОМ М КОН М кое ХК ЗХ УК м ж АК ОООУ Ох ОК А и МК ОО В ВО в ОО В ОК МВ НК ЗВО АК ПММ То КК. МАК ПАМ ММ ОК СЯ КО Км с: ОО В я ОО В В ПУЕ ОХ КІ МКК ХК ОН Бо ОКХ КОХ В Х МОМ ХО М У КО В КК ДК УК КХ УКВ КК Он УКХ ОХ КОХ ОХ ОБ ОО ОЗ КК ОВ КВ М КК ,
о. ж З с 5 З ся ОХ ща о ї п ХХ т А М А СО ВК М М В МИХ ОКХ ХХ З ОО З КК ОХ ШК ж Кох КУ УСС КК І ОХ КТК МО я В МОСК ОМ и Ми КК КОВО СЕ ОК з КК ОКХ о АК М М ОО В В п. с п о. ПЕК КЕ ОО М м І КК СХ ОО НМ МКМ ХА КЕ ОЕМ ООН КК ОК ЗК КК ОК о ОК КК а п вм ВК КК М ВЕК З ОА ХО. В В У В в в о со
Фіг. 20 Ж - не вок Всесвазничиа : їх Тк З оег Гея КЕ ЯК КА злак СВ г ТА Ж зу ЩО - ЗБ сн р Ва ЕсЯ шк КЕ же ЩЕ В у Ух ПЕТ ще ВОК В В ях ЩІК се Е ЯЯВВе Овен ш КНННКЕ КВ с. Кх КЕ «и ролвву ЩО пе Кл Де МИТ зе гКсг ТК І Кт рт ЯВНУ ше: Клин Ку Пи сто писк во ЗНй КИТЕ У ЛВС. ЯН щем пкт ЛК КІ ї'ї5хк й нн а. В . ПЕК КО Н : 5 : |З т Н Я З Я ї ї ї ж 2 Ж ех Я . Е ї вк ЗБ роя ром ро ! Н ; Н ик, ї К 5. ї ї обои: Кепьши а УВА Колмви з яку ж ї РОБКИ: Купимня а ВНІ Кульки з ІМАВЯВИ: Сатр Фіг 21 МК «і
7 В дню Зої Е у ка ок і БУ Ох що а кі й. х Х шо вжи т. і є Я" в и ай ЗБ: ди БУ я Мохве МК ЗВО АМКУ Я Бе і 1 . х свои вк рев, дк х ї т ч ХЕ хом КЕ р ДАК вв її и 5 ЩЕ ШК й вн Ак х ї ЕВ ЕЕ ях: КОТ К ВК В х КЕ и Ж СХ З дона вад Юда ОВ У М Зквиух Му лев т ПВ Й нах ше ЗК пай МОСК З щі БІЙ как НЕВо ЦВЯ, БЕ.
Да ув аа А Зк З кій ке МЕДУ ВВ г - їж ЕТ Ай сДови ме НЕ.
НА жі во ЕМ ПРЕ УВЕК, В ї Бех г; г З квов ме ДВ ОА скжжжикжи За й лек ВК ХК КВ У я ;. КА 5. 73. у : « не НН Яся поне плов МЕЗО КРОНИ КУ КК З У Е що й р з ВИ МК й.
ТАКЕ фінти шок ї ще ще че є НААНУ НЄ ВНТ І п Ж ох - в ! ух киш ше й ще одн п УШИЩ З бхижх Й жі Ьс УК Я пе в. 1 т дев ово ІСАВАМКИЙ в «МТК У ж дою незе: КоАКАНКЕ УТ В Ай Е 5, - ЧЕ з денов нена САВА в Б г ків й ме Шу : дека ВКМ ІВАНУ В БК Шк ій х Мей зе аце ря У ож Ж мови НК свя хво ШКО ОА Доджи їх дет ре БЕЖ ан и ЕЕ ЩІ «ложе ві ОА УЮ ни ши ше: Поки МКОФІ ПОАБАЮЧЯ, Вл т йезенаве Мереєт хі в пече ЯКНСАРАКН Я в То аденрнеава Ме ! Мих В - ж дк ве МЖЕБАНН М ! ж х ден е В К Зх чок жх ст х їх. з та Ті нано ши : Еш в ЗАКОНИ Питні Зх Не: тек коор ЗБ Весна м ж НО НЕ КАВУ Пивні х, ж й а Тех Б яд ета о - Й ой З щ т х ї Ж ї ж в ві иа а і м я ВИНИ фе ввновиюе що Ей г БУ до Ї ХЕ я ОККОЮ вальс уя дк 4 КИ са З і ж ДИ зако ук 8 щу Сян їх 5 ії з пов ов дев шк у ві г ШЕ ШК Ше Ух з г: т бПомю кивншмиа и жо х х де ке щи КК 5 Дащ пеннноя У ші те Доу ЗК БВ ІВНЯЕНУТ з ! й ро - х ОКО пенні й 4 зво мен КО Ту. - ї 5 дошк МУ ще й.
Я - Мен І У й в ек УА Ме ВН Не 3 і З ДК ЗВО ВУ ОТ --- в (Ж Я т денне зх Я ее ся ру ве -3 я дики на ІНВ) 7 х ті З. сени ІК суку ех : ще пос ВИАВІБУ нтмгі : ке шк Но ее шошюоже» , ШО ом Ж до я зд 2 і; Ж Зк о Ж ср ШЕ о дві яко САУ ож я й ДК як я «Ов Е ЩО шо Ж шо ж а С ща |У В Ще, КА їй ШКО Б в ж у ен ше Я ЯК. ст ;. я сжаю У ОО ще з а око ж Ж ШО ше жа Я ши 5 Ши и НАШ са ши щі М Ні Ж БЕ ей В: Ж жа ж 7 ку У і ех ОХ р і я як о и НН З сдкодіж вік ВК ох КОЖ ю Кв ве ки ви сн ЗМ і хи в зп вве ви да ши о Я й ко ДАВ є ; ? я : ее КО А У ОВК УА ш- ОН щу С и дм и в З СК АХ ох ша у еф ит ев ак а яю : ск о еВ, а у Ку Фе кеш Ку сок, Ук АХ же Ка « й КО з КЗ 7 ери лу дове в Фк са (продовження!
А щк фідвфнновь | з Ж ї і ї ! Ї ! вах з бАМЗ я ЕЕ ек " бяжа У аросі г Я ст ї ; ЩЕ о Її : 5 | мл
5. . ж снокеомНня ОКО хо санях ш в Ж Ї а шо КІН ве як я душ 0 я ГІ е соки КО00ЯК й уж З 15 сх ще че ча ! Я ЕЗ я 5 й з че ча вв НААНУ ГнгьнВ а Пила (ними Хе бує
Фіг. 23 ме ТОЮ п ца що: Шк Ж У і З че з - йон Р т ве й, хо мор Б я» - Б. я З ет: нс нн З у
Е ж. ї я ВЕСТ ж Я ее а щоООЯ Щ « ПВКНОЯ с ж БЕ ; Бо і ни со Е ЩІ ША ше м я Шен я ї ї ж Ва Я ж й Ж жо ж За фону : : : й -еКииии- я о з жк А вк знов ж з ши я є а ще о Ка -й х в Шо и; Б: І щ-й : се КО а Ех ІИАВОУВО тт Я ши і 23 продовження) т Й оо т Н | «ех Комар фони с т що «в іздтипений король щ ЗИ дв дОЗо що | я певне ; ража ке І. у і і їх 5 щи її ск С жввах Кене в де Екркння дінкчкчиннсу бю В ри дів дрннннтннтнннтнінх 8 Ц в 5 б 5 жо ж ин и ав ке ча Днів після цутчення Днів лієта врплення Фіг 24 де зво ффрнененентреютювьнияк Щ ЦЕ Ж ще т : Гбеенеку Мк се КогвуретввУ Ве ювня в: ШИ кв - НЕ я» Мкуийічний кою а ! я ВО КЖх Я ж й и дих т, ек МЕНІ Ка Дкх ве КУ Ме Я о ще ще те ія і Я зе кед Ж їх хе і: ро шк пже Ви
Е. ле ек й х ІВ СИ рено ТО зв КО ОВК, "дефйх І со ьо, ; і в Кен ММ ЧИННИЙ в 4 8 ж їв ж в жа Якоб 80 жбб о 320 Днів щеплення Дне кое щеплення т. е З Фіг а А е в ок ве фронтит ет зв) п ЩЕ ШИ » Ба» Хо г - ЖЕ я ШЕ ШЕ. БЕ ше " ОЗ жо Ж МК ее а що З і Б Рол | ЖЕ : ЖЕО | й х ' и ШИ ! и и ШИ ише ах Н Н КЕ мери Ї ж Ж рому ЕН Фо за зе : св в і : сій є Я о НО ни НИК пот ї ї я з ; скіни к Ф х, х З 8. й ку ї ж Дика що т. Н він ВВ ож ПЕК За г ши з и ді "ох ф а жа Ук «че БЕ у Фе Ед ха я шо ЕН ОЯ реж 58 2 к ро -
Фіг. 26 ВеЬНЯ?
:. щи вих шо З І | З еп -ВЕОЛЮВІ в М з ле ха до» З - х ; З " Бон Її Б й ші ? гЗ в Б і ІЗ е яр ооо пеннатнненннох Сея із в ВМО ТЕ ж КЕ зе Же ЖЕ г дк» З х що з Я Ка ! Фе в! ШИ зе р в ач ах 5 Шк БЕ І Ж Бо пеня т-тдЕт о - ЧЕ мо ще» й ДА 5 ре ве й ха Б. ЕЕ ш ЇЇ ь же Зк де як Фе ей 4 - ! се Ф С Фіг 27
С х викид без вихВАу зе, еВ, НЕсВ ОН, щ І а Й пон ШК к я ЖЕ да й ; ї по Е їй ! а ж перех жк я й а м ща Ж її й а й тк " ж ож ОД я - ще і о, Бо х й ВО ї й ше Кт ще ха. я «Е Ко Не ке ще З р Ба Е ве пебдва: 5 пон фе ЖАТИ Ее ! : й а , й ов .
ИЙ . ов еВ з хе . вх з т: Ж. ! ВоЖе сере» | : що : яння В і мой виш зи т 1 Й Ж пнів вони ро я Ж я, ж Ки Гей «й шк КЗ ка і «ее ФІ Й (продовження)
ЗО х КЗ КІ ї а ; гя НЕ шо -- ОО ох ч точка й ох Е «ак Пн рик у а х ДИВО З ЮЮВ я ії ча пень ревраЯ СНМ В ря і їх ши ше в о Кен нн пн ння нн зни а З 5 їй 25 5 че
Кон. гемцитовіну нелагі
Фіг. 28 зо а Н бод. й а що ї я не в Е зач ет ї се й о ч Е що з ще ч йо і Кн "а с п ВК Я КИ В пи | жк Ек - ! пенне рать КВ ВВ Я Код Я х х У, о їочо у ЕОБОЛЕЯ хх зи : Ей І ; нн й з ще ле еВ У ІЗ 5 с ча ра ва ее Е і "ь ч : й в і ! ; тка мерів ас ІВНИя ах А - ще р Е - і уд, гу ! й ж ; геЖ нн 8 23 че 25 Б кю Кові, севацитобіну Гнгалі.
Фіг. 29 вд я і Й ДО яЕНя я Вже я т І В т док і кох по ЗВЖжНи З ї і З У : я ш ї що ВАК ї я п заокнм З Кі Е шк ол МАЯЕКВ І ї ї зок З ШИ щ зосвюх 0 ЩЕ ши З щш щ ее і ; яке ї яЩКкнок її ВЕ ще п як В В в пваєню м ШЕ охенко ЯКО я г Кая ши М НИ є ШЕ Ше й я Кй в І я й Фіг 30 Озпо Раса в З Е; о я Б ЕЕ Ж ЕЕ Е тб Ф а ГУ -4 щу Зав Ззааиоо Й Ж обои ух зако, ПЕПИИВЕНННИИ ОІД о В: з "БИВСЯ пт СВ Я ШИНИ: АВ ЗХ п: й но АЗК Ко. п ї с з : НН ще Ме ще : Фіг З в ие (о |. ши і й | ж й КЕ | КЕ І; о а 0 : В ши ше 000000 Б " чеше Кк " щ щД(ЄН"' | ві З кош со фр ХРО че с зраесиь: жк не ін : вл ШАаьй; ше КВ са пращ а зе» о м в. шу НевА КН ВАС ДеБА СНІ ВАС Фі 32
Зо з В : Ку хх: геЗ ще Ії ЯК зн 5 с в.
х. М. Знав їх їх - п ся шк сне 0 ОВО ПО І без а ЖЕВЕНЕ ча ше З ПІВ х Як ще 3 ОБ ак ек У ; о ш- Фев дон іанннвннннанн заз ща же ОЗ З ж жі 0 Февово 2 і сн, Я. ДН ЗЕ КЕ х
КЗ . Ж сх Фіг З ЗА, А й ; ї ї в У і : Я ї Е ТЯ В 5 і Ж - її З здссвсареся, МОЖЕ: г 8 : Еш Б. в Еш ї ОН дення В Бе ї ї Ж ї Ва ЕКО 5 Кай 34 х І те Я 7 о Ук В ЕК АВ ККЙ 7 Ї Ї долав. з : 5 ве її | й ї -е С ОМ те ї ЕК; їі щ ї ОБ п. ї Ко. Ка: я ІЗ и К. пт ле р; зе ВЕ : в де зв яде зей сов ПЕТЛІ ПІМЕКЯ ск ее он КЕ Я щу ЕЕ що я ші з Боонаа І і ума я ар - В : же и Ка АС СОМ АР т | шщщ ШЕ Б й З ТІ СВ . . у а ; Б І їх Я а заз ОБа : ; : сх І ПОВ б г. ! пе Е ши ше « У ГО ЕЕ: 5 . і З НН: з В зе 1 е і ах За я 34. я ! ОВ в я в : ЕЕ КЕ ї 14
З М. ТІ ов 1 В Кк 1 же ї ВН БВ : Пе «Ві Я я ОЙ ї ЕЕ: : : гошоя ї і В х я ОТОЕт ВВ Я і . ха : ї с ПВ їх ІЗ -. І х п М я аоне нео ов омжетет якоякь Как ва СОМ АРО Фіг
Коїтинняй цики що ; дужий ух ух уза: кких ух а Каюн ОВ ех во каві Жийгенокй цик ев СИ у г канти и сухоти 1 КЕ. Й ре Кн ук х ки кн І | ШЕ ЗО є ВщНкиВ звання і СИ: ЩЕ: 5 І ПИИПИИНТ, З ! КЕ: ї З : : : ях й З у. ЗВ ЖЕ: Ж Н ПН Коооо з ; З ИН З Ж з ї ще ше нене ЩЕ: ще У ПЕ Мов 9: Я же - ї не ЗВ анннн КК щ Денне ППП В Ж Не НКУ 4 п м ї ППП 7 й ї 1 ЗЕ ВН ання ГІ Яащая ПЕКИ : з в , ЩІ я ; і ЩЕ ЗВ Її ВН ов й З Е и ж :. Щи ПК ПІШЕТОЙ Шо в КО ї У ВН» ех их - кое щовще ши Б Х І не пд ШЕ де т БНО З у й ще Ж їх ОВ са Ь 1 3 кан ее ; КЕ Кс зва ; -Е ЕЕ я Не з: ЮК ЕВ По п о з ЯН ї КУ Я а ї ОЯНННННЯ ПТ ТТИх. Е х : С ау «шх КУ КОШИЦЕ Ж пп щі ї ще З КЕДИ ЗВ Бека : ВЩЕ ПЕ ПИЛИ шо щи ще їж же ПЕВ Ж они у ЕНН и шах ПИШНІ ДНА Е п ше в и ше що р ово т т З 3 Зоя - Кап Кс : Я тт : Яни у ї Яке Я се за і ання ПИ Сени 1 Ве ян синнвнн ї де ПИТ ЕНН п ї Ж ШЕ Ех у З ПИТ ЛИПИ ПИТ І її о ЖЕ ЩЕ о х Жди й й ПІ .; ПИТИ т КОТ. Я. т ПТ ще х. ї: вл и ще ПИ ПИ ДОКИ и ЗННи ї: : Я ПІ Би М Я і ЩЕ З В ще Янка ї ще ї ї сно 1 ВВ її ск НН ЩЕ 5 ТИ СЕ до Б Ва ТО ВЕ ее І НЕ За ї : у Я денне Ши ве ї ще ден Я ване по ПИШЕ к А и ЕЕ що оБая сера? щ Жкежк Ї о Декітадююєююєююєвкіккнни ве ьо ик У НИ ОТЕООЕсе В а с пешн гу ху НК у НАНЕ о М ЗІ ї. їх й тек сни Я ля с На рошаши Я ут пеки па Її ВЖОКНВКНЕ ХОБІ В скол Баш ро У МУ: нах я ВЕ МЕ рокнкувов З ія ооо зе ки каси Іа У БОЛИННН аа У МЕЖ ! ЕК ї х ї кАхеЖА ДИКА длляжккя и їх хе сок 1 Горе АЛАНА пон нлтялня хо Бей ї КО і к кіз МПА З плтлллня няння о в ання й х М... і її зв ХМ ше і З о о че щей ї Сех ВН ох КДКА Ве КК ав не о Я КО нання вк їй ть З ення з. є і НН он і ї Я Я
Фіг. 35 дня ; 580 мгймжи Середовище ТО нема БК зисапняизтнну Зб тод, зви ЗА год. ЗБ.
ВЖК. дет Ми тт щодо и ; ї їх 5 і 4. ; ї ; їх ї що й : М і ЕЕ ї Є ше й і ши лиш ши ши ї й З ї Ї хе Н ї 7. Я шо. З Зк М ї що Зк і її в: З Е КО ів К. Ї Н і ща і Е і ж 1 ях : 5 1 Н Ї ІЗ ЯК: ЕЕ ї ЕЕ: ЗВ | Н ТЕ ЗВ: 3 гї І: їй і ТВ ї і а їх Є ВВ, НЕ: і Н ХК
У Б. ї зд ! і Н й х і нання Е ча 5 і г Я ї в ії іа ї т тУЩа Б БЕ: Я Вот е с В вл ІОВ З : Мана: в ла НИ В ес: Ен ваванокнни Не ощек лах они ще козак мк зок ле з мк и пе оне ДЕКАН ЛНВ Вени оцінив кЕКА ОЦК ВАЄ й г й вк БО ними
Мед. 190 нгіма БО окозпшлатнну ско во АЖ дея ; ев ее ти Од год, ТИ Ода д. ти пд еоВ. ї ї і В Ї : з Е : А: що У: хх: й її Е як Її В: якої й у "Я - і ЕЕ і ї й НЕ: ї ї С: БЕ В й | і Б ві гз Ї В КЗ ї ї ой: ОО о: Ж «1 І : з ті Я: с кшшш ке 1 Ін. ЗЕ ї ої р МНЕ: х Ті ЕК: ЗА ЖЕ 1 ЗНвиннннвння І ї і М а: х С ЕК: (БІ їх АН: ЩО Белей А Ду о ОН ЩЕ Біде ВК ВНИ ово: ЗР оце пе оне ще Мк КМ жи век коня Меовм ще НЕК УКХ ке ТОНЕ ВВА КВЧ ВК вкщаовх ЩЕ ще за Є пісок
Фу. 35 іпродовженняї ТЕЙ ш. " У шк опо ЖННКи ПИИЦИНИЙ. Суровасію ТИПИ ВОД дн З КН Кс ня ШО ОО ОО о ще І ВЕБ я ПО Не я що за і З Ї З Я; т ПЕ чес я сс ВИЩИЙ ж схопвия шви ши шо " в З пхажа я СВІ «Ж Я ПИПИХО ННЯ ПИТ ПИТИ ПИТИ з Ї! ве; ПИПЛИЛИСЯ ПИШЕ КЕ СОУ сощмої. їх ! То СО ваннах ПЕК ОВО 7 баз В ї Пп ПИ ол ПИШКОО них Й о - Х й ПИ ПИ ПІ ПППНсЦИЙ ПИПИ щ я що а кВ ЯН а; ШЕ В в база МО М і ще нена ее Шо я Ї ще ТТН ше: що ІЕЕ ЕВ ше й з Я ШОК ПЕ І, в "ЗВ у. ПИПИПИНИЙ ПІП ех не тин що п в-я що ща ши: : см ТЕТ дон Я МО соннднях що слевенняй ях В ян й 5 їн З ШУ Я г Ку Же щ У же яко «й Й й КІ я «В «й в що КО я «Я я и чи «й : х З що що де БОС еко . «і стен сн НН в Бей і ЕІ р сжриа у хх с ох з, і щ і Специфічна загибель ГІ ве ШО Х Ж щ о й хе ВЕ шк жо же же ше Я а оо 5 Е Б БУ ЖЕ В Б. З ре щ. ОЗ: ян я но іо сх З й : Е як : жк : 1 Й Я Пай ше ш- В кара: 7- : ре ее я | ке еВ, СЯ Й и в Н Ко т Ве а ! Го яу Ж ее їм р. і КОХ ЩЕ В ве Ох і В Я КО й Ор М. Кк 3 Ох На ще Ша ж КО Зк з Її" й й (З ЖК МОСК а жж Ко
Що. ЩО ж и ї МОВО ян ре руд тетеентитеоєюесеенесенктсно шо К»УЯ х й ПИМЛИИОЯ ПИШИ щ 1 що ППП ПОШИ щік ТИ ПИТ ПИШИ С Шкнне ше шен ин ви че Н : ЕЕ ах В я В і- М.В я Свовниние Веекувнююм МКхретакювня 0 Дике Середонище | ірннотекан "Добетаксель исплатин, я Я й о щ їх х. й х й | СН ї є ТО : р ШЕ ві КК і я ї ЕН , Е су й ша і ! ше | боях ШІ ще Гджай у З З з У за їі - З З Же І х й ія х і М ЗД: з В Що вианшннння й Хей Мосс кмоттттерьть КО фено шк 5 де сх печи. 3 домо що о зов З зе Ве кої йо Нео зво оце й х і Кекс ї У зу ст КЗ Я Ве Ооще Во СщЕ Оце ще мк НАОМІ НЬЯРК Мей: Ста ВОАС ВАК Бара ОКМмьо. фе ЕК Фіг, 38 є КЕН й Я З Мк ож ї и Фо90 й у й к ік ше й щі Ї Ки оч я Й Й ше ши шк «й Соц конц. ГНУйми ж Совадовнще іпаБЗах е іно ее ее ЄСхеюа нащо ж Як ік?
Фіг. 38 (продовження)
ІМАВЗБО: ЕС. при АОСС 3500. пря Зо ШІ поссеко ХЕ Й Я 2000 --. ема і су : : " зр 1000 З о о. ш о а ШІ 5 й | й Середовище ігіпЮ Посе Є «ФН ЗО (продовження) кі м і як Е ен ї я Е ди т ї СНИ ОО ди як Ж 5 осшнннх а ЕС - ї Ж гом Е сах Ка ША і - Ка ий о щЕ ї дк т ! Я ее ОО З і ок Жов ще ж с ЩЕ Я я що шк ХО т г А ТЕ : їх ж я і» я Би мк КЕ, й Н СВ Я х. ЩА - Мих БАХ 7 5 де У е пиши ще . ї- я Її . пені й шия кове ши ди а перо Те Не я сн пн М а НШ поси я що ЗБх МУ КН І Б ще ще т? зе й для й - шо о що ІМАБЗВО вел ЛАВУ ІНпН
Фіг. 39
UAA201508994A 2013-02-20 2014-02-18 Комбінована терапія з використанням антитіла проти клаудину 18.2 та гемцитабіну для лікування раку підшлункової залози UA118664C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2013/000505 WO2014127785A1 (en) 2013-02-20 2013-02-20 Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
PCT/EP2014/000433 WO2014127906A1 (en) 2013-02-20 2014-02-18 Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA118664C2 true UA118664C2 (uk) 2019-02-25

Family

ID=47843230

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201508994A UA118664C2 (uk) 2013-02-20 2014-02-18 Комбінована терапія з використанням антитіла проти клаудину 18.2 та гемцитабіну для лікування раку підшлункової залози

Country Status (23)

Country Link
US (5) US9770487B2 (uk)
JP (5) JP6389478B2 (uk)
KR (3) KR102385872B1 (uk)
CN (3) CN105073777B (uk)
AR (1) AR094849A1 (uk)
AU (1) AU2014221035B2 (uk)
BR (1) BR112015019995A2 (uk)
CA (1) CA2899754C (uk)
DK (1) DK2958945T3 (uk)
ES (1) ES2930654T3 (uk)
HK (1) HK1213925A1 (uk)
HU (1) HUE060192T2 (uk)
IL (2) IL302093A (uk)
LT (1) LT2958945T (uk)
MX (3) MX2015010724A (uk)
MY (1) MY184332A (uk)
PL (1) PL2958945T3 (uk)
PT (1) PT2958945T (uk)
RU (1) RU2699549C2 (uk)
SA (1) SA515360926B1 (uk)
SG (2) SG10201610412YA (uk)
UA (1) UA118664C2 (uk)
WO (2) WO2014127785A1 (uk)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10254601A1 (de) 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
DE102004024617A1 (de) 2004-05-18 2005-12-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
WO2013174404A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
RU2678127C2 (ru) 2012-11-13 2019-01-23 Бионтех Аг Агенты для лечения экспрессирующих клаудин раковых заболеваний
WO2014127785A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014146672A1 (en) 2013-03-18 2014-09-25 Ganymed Pharmaceuticals Ag Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
BR112019000327A8 (pt) * 2016-07-08 2022-10-18 Carsgen Therapeutics Co Ltd Anticorpo para anticlaudina 18a2 e uso do mesmo
TWI710574B (zh) * 2017-05-16 2020-11-21 荷蘭商拜恩迪斯公司 抗訊號調節蛋白α（ＳＩＲＰα）抗體
MX2020009326A (es) * 2018-03-08 2020-10-08 Phanes Therapeutics Inc Anticuerpos anti-claudina 18.2 y usos de los mismos.
CN110577597B (zh) * 2018-06-11 2021-10-22 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种阻断CD47和SIRPα相互作用的抗体
CN112513093A (zh) * 2018-07-18 2021-03-16 奥美药业有限公司 一种新型抗体及其制备方法和应用
CN110862454B (zh) * 2018-08-27 2022-12-30 南京圣和药业股份有限公司 一种抗Claudin18_2抗体及其应用
KR20210072027A (ko) * 2018-09-30 2021-06-16 카파 테라퓨틱스 리미티드 Cldn18의 항체 및 화학요법 약물의 병용 요법
CN109402075A (zh) * 2018-11-28 2019-03-01 深圳先进技术研究院 一种用于清除氧自由基的小分子蛋白质及其应用
JP2022515487A (ja) * 2018-12-28 2022-02-18 ナンジン、ジェンスクリプト、バイオテック、カンパニー、リミテッド クローディン１８．２結合部分およびその利用
KR20210111792A (ko) * 2018-12-28 2021-09-13 스팍스 테라퓨틱스 인크. 암 및 다른 질환을 치료하기 위한 클라우딘 18.2에 특이적인 결합 분자, 이의 조성물 및 방법
US20220152101A1 (en) * 2019-01-07 2022-05-19 Carsgen Therapeutics Co., Ltd. Cellular immunotherapy combination
CN109762067B (zh) * 2019-01-17 2020-02-28 北京天广实生物技术股份有限公司 结合人Claudin 18.2的抗体及其用途
AU2020217012A1 (en) 2019-02-01 2021-08-19 Novarock Biotherapeutics, Ltd. Anti-claudin 18 antibodies and methods of use thereof
US20220372112A1 (en) * 2019-04-19 2022-11-24 Keymed Biosciences Co., Ltd. Tumor therapeutic agent and use thereof
WO2020228806A1 (zh) * 2019-05-16 2020-11-19 齐鲁制药有限公司 针对密蛋白18a2的抗体及其应用
CN111944048B (zh) * 2019-05-16 2023-10-03 启愈生物技术(上海)有限公司 抗cldn抗体及其药物组合物和检测方法
EP3929214A4 (en) * 2019-05-30 2022-06-22 Shandong Boan Biotechnology Co., Ltd. ANTIBODY OR CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR TARGETING CLAUDIN 18.2
WO2021024020A1 (en) * 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
CA3149406A1 (en) * 2019-08-20 2021-02-25 Xueming Qian Novel anti-cldn18.2 antibodies
TW202124442A (zh) * 2019-09-13 2021-07-01 大陸商北京軒義醫藥科技有限公司 人源化抗ｃｌｄｎ１８．２抗體、編碼其的核酸分子、其產生方法、包含其的組合物、試劑盒及其用途
WO2021111003A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 SOTIO a.s. Humanized cldn18.2 antibodies
CN114761433A (zh) * 2019-12-11 2022-07-15 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 一种抗Claudin18.2单克隆抗体、其制备方法及用途
KR20220119117A (ko) 2019-12-23 2022-08-26 소티오 바이오테크 에이.에스. 종양 특이적 claudin 18.2 항체
JP2023513400A (ja) * 2020-02-10 2023-03-30 上海詩健生物科技有限公司 Ｃｌｄｎ１８．２抗体及びその使用
CN113854234B (zh) * 2020-06-30 2023-09-08 江苏奥赛康生物医药有限公司 一种小鼠胰腺癌模型及其构建方法和应用
CA3194771A1 (en) 2020-09-16 2022-03-24 Amgen Inc. Methods for administering therapeutic doses of bispecific t-cell engaging molecules for the treatment of cancer
WO2022100590A1 (zh) * 2020-11-10 2022-05-19 齐鲁制药有限公司 针对密蛋白18a2的adcc增强型人源化抗体及其应用
WO2022122709A1 (en) 2020-12-07 2022-06-16 Sotio Biotech A.S. Antibody-drug conjugates based on humanized cldn18.2 antibodies
IL302894A (en) 2020-12-23 2023-07-01 Sotio Biotech A S CLAUDIN 18.2 tumor-specific antibody-drug conjugates
WO2023161457A1 (en) 2022-02-27 2023-08-31 Evobright Gmbh Bispecific antibodies against cd277 and a tumor-antigen
CN116536274B (zh) * 2023-06-20 2023-09-19 上海精翰生物科技有限公司 Claudin18.2表达稳转细胞株、制备方法及应用

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
WO2000078961A1 (en) 1999-06-23 2000-12-28 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
EP1144629A3 (en) 1998-09-01 2001-11-28 Genentech, Inc. Further pro polypeptides and sequences thereof
NZ531664A (en) 1998-09-01 2005-07-29 Genentech Inc Pro1317 polypeptides and sequences thereof with homology to the semaphorin B glycoprotein family
JP2002524103A (ja) 1998-09-16 2002-08-06 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド 胃ポリペプチドｚｓｉｇ２８
EP1119620A2 (en) 1998-10-06 2001-08-01 Curagen Corporation Polynucleotides coding for secreted polypeptides. some having similarity to syncollin or claudin or cytokine. their therapeutic uses
US6146304A (en) 1998-12-22 2000-11-14 Caterpillar Inc. Vehicle differential
CZ20012321A3 (cs) 1998-12-23 2002-10-16 G. D. Searle & Co. Léčivo s obsahem inhibitoru cyklooxygenázy-2 a inhibitoru matricové metaloproteinázy pro kombinační terapii při léčení neoplasie
JP2004507202A (ja) 1999-03-31 2004-03-11 キュラジェン　コーポレイション ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸；「ｏｒｆｘ」
EP1208202A2 (en) 1999-09-01 2002-05-29 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6493119B1 (en) 1999-09-07 2002-12-10 Chien-Yu Kuo Scalable DWDM network switch architecture with wavelength tunable sources
US6380362B1 (en) 1999-12-23 2002-04-30 Genesis Research & Development Corporation Ltd. Polynucleotides, polypeptides expressed by the polynucleotides and methods for their use
DE10003939A1 (de) 2000-01-29 2001-08-02 Cognis Deutschland Gmbh Verfahren zur Herstellung radikalisch nachvernetzter Polymere unter Einsatz von reaktiven Anhydriden
EP1252185A1 (en) 2000-01-31 2002-10-30 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001055309A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001055326A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
AU2001237958A1 (en) 2000-01-31 2001-08-07 Human Genome Sciences, Inc. 22 human secreted proteins
AU6802801A (en) 2000-03-01 2001-09-24 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
AU2001260847A1 (en) 2000-05-24 2001-12-03 Genesis Research And Development Corporation Limited Compositions isolated from skin cells and methods for their use
JP2004519215A (ja) 2000-08-15 2004-07-02 イミュネックス・コーポレーション クローディンポリペプチド
WO2002018576A2 (en) 2000-08-28 2002-03-07 Diadexus, Inc. Compositions and methods relating to lung specific genes
CA2419979A1 (en) 2000-09-08 2002-03-14 Schering Corporation Mammalian genes; related reagents and methods
TWI313299B (en) 2000-11-30 2009-08-11 Medarex Inc Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CN1703243B (zh) * 2002-10-10 2011-05-04 默克专利有限公司 针对erb-b1受体的药物组合物
CN101928344B (zh) 2002-10-17 2014-08-13 根马布股份公司 抗cd20的人单克隆抗体
DE10254601A1 (de) 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
WO2004063355A2 (en) 2003-01-10 2004-07-29 Protein Design Labs, Inc. Novel methods of diagnosis of metastatic cancer, compositions and methods of screening for modulators of matastatic cancer
DE102004024617A1 (de) 2004-05-18 2005-12-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
DE102004042822A1 (de) 2004-08-31 2006-03-16 Technische Universität Dresden Verbindungen und Methoden zur Behandlung, Diagnose und Prognose bei Pankreaserkrankungen
EP1929003A4 (en) 2005-08-31 2009-04-29 Cell Signaling Technology Inc REAGENTS FOR DETECTION OF PROTEIN PHOSPORYLATION IN CARCINOMA SIGNALING PATHWAYS
BRPI0616211A2 (pt) 2005-09-19 2011-06-14 Veridex Llc mÉtodos para o diagnàstico de cÂncer pancreÁtico
EP1790664A1 (en) 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
WO2008013948A2 (en) 2006-07-27 2008-01-31 Cell Signaling Technology, Inc. Tyrosine phosphorylation sites
US20100021886A1 (en) 2007-02-01 2010-01-28 Yixin Wang Methods and Materials for Identifying the Origin of a Carcinoma of Unknown Primary Origin
EP1983002A3 (en) 2007-04-19 2009-03-11 Peter Hornbeck Tyrosine phosphorylation sites and antibodies specific for them
EP1997832A1 (en) 2007-05-29 2008-12-03 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer
JPWO2008152822A1 (ja) 2007-06-15 2010-08-26 株式会社メディネット 医薬
EP2036987A1 (en) 2007-09-17 2009-03-18 Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Molecular markers for tumor cell content in tissue samples
WO2010141093A2 (en) * 2009-06-04 2010-12-09 The University Of Maryland, Baltimore Co-signaling methods for treating cancers
WO2013167153A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies useful in cancer diagnosis
WO2013174403A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2013174404A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014127785A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
AU2014221035A1 (en) 2015-09-10
WO2014127906A1 (en) 2014-08-28
CA2899754A1 (en) 2014-08-28
AU2014221035B2 (en) 2018-10-04
KR20230143186A (ko) 2023-10-11
CN105073777B (zh) 2022-07-01
HK1213925A1 (zh) 2016-07-15
US20150374789A1 (en) 2015-12-31
CN115282269A (zh) 2022-11-04
MX2020011783A (es) 2020-11-24
IL239981A0 (en) 2015-08-31
US20180000900A1 (en) 2018-01-04
AR094849A1 (es) 2015-09-02
IL302093A (en) 2023-06-01
WO2014127785A1 (en) 2014-08-28
JP7299369B2 (ja) 2023-06-27
DK2958945T3 (da) 2022-11-07
US20210023177A1 (en) 2021-01-28
KR102385872B1 (ko) 2022-04-12
JP2016510721A (ja) 2016-04-11
JP2023123596A (ja) 2023-09-05
US9770487B2 (en) 2017-09-26
SG10201610412YA (en) 2017-02-27
CA2899754C (en) 2023-06-27
PT2958945T (pt) 2022-11-09
ES2930654T3 (es) 2022-12-20
IL239981B1 (en) 2023-05-01
MX2015010724A (es) 2016-04-11
CN105073777A (zh) 2015-11-18
JP6694926B2 (ja) 2020-05-20
JP2018197260A (ja) 2018-12-13
US10946069B2 (en) 2021-03-16
JP2020125329A (ja) 2020-08-20
BR112015019995A2 (pt) 2017-08-29
RU2015139901A (ru) 2017-03-24
SG11201506317PA (en) 2015-09-29
HUE060192T2 (hu) 2023-02-28
CN115177733A (zh) 2022-10-14
US10314890B2 (en) 2019-06-11
JP6389478B2 (ja) 2018-09-12
IL239981B2 (en) 2023-09-01
RU2019124332A (ru) 2019-10-04
KR20220050230A (ko) 2022-04-22
US20190298803A1 (en) 2019-10-03
US20240091312A1 (en) 2024-03-21
LT2958945T (lt) 2022-11-25
JP7051931B2 (ja) 2022-04-11
JP2022088550A (ja) 2022-06-14
MY184332A (en) 2021-04-01
SA515360926B1 (ar) 2018-10-08
NZ711060A (en) 2021-03-26
US11826402B2 (en) 2023-11-28
PL2958945T3 (pl) 2023-01-09
RU2699549C2 (ru) 2019-09-06
KR20150120994A (ko) 2015-10-28
MX2020011772A (es) 2020-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA118664C2 (uk) Комбінована терапія з використанням антитіла проти клаудину 18.2 та гемцитабіну для лікування раку підшлункової залози
KR102233344B1 (ko) 암의 치료에 클라우딘 18.2에 대한 항체를 이용하는 조합 요법
KR102188001B1 (ko) 암의 치료에 클라우딘 18.2에 대한 항체를 이용하는 조합 요법
UA120753C2 (uk) Біспецифічне антитіло до сd3 та cd20
EP3791896B1 (en) Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
EP2958945B1 (en) Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
EP2852409B1 (en) Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
RU2792932C2 (ru) Комбинированная терапия с использованием антител против клаудина 18.2 для лечения рака
NZ711060B2 (en) Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer